口内清浄剤
【課題】虫歯菌（う蝕原菌）に対して抗菌性が高い口内清浄剤を提供すること。
【解決手段】本発明の口内清浄剤は、アポラクトフェリンを含有し、該アポラクトフェリンの鉄結合度は５％以下であり、そして該アポラクトフェリンを１w/v％の濃度で含む水溶液を調製した場合に、該水溶液中の総陽イオン濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。虫歯菌（う蝕原菌）に対して高い抗菌性を示す。したがって、本発明の口内清浄剤は、虫歯予防、口臭予防などに有用である。
【解決手段】本発明の口内清浄剤は、アポラクトフェリンを含有し、該アポラクトフェリンの鉄結合度は５％以下であり、そして該アポラクトフェリンを１w/v％の濃度で含む水溶液を調製した場合に、該水溶液中の総陽イオン濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。虫歯菌（う蝕原菌）に対して高い抗菌性を示す。したがって、本発明の口内清浄剤は、虫歯予防、口臭予防などに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口内清浄剤に関する。より詳細には、抗菌性を有するアポラクトフェリンを含有する口内清浄剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
う蝕を引き起こす要因には、微生物、歯牙、および食物の３つがある。例えば、口腔細菌叢のう蝕誘発性が高い状態、歯質のう蝕感受性の高い状態、および食生活パターンのう蝕誘発性の高い状態により、う蝕が引き起こされる。う蝕発生のメカニズムは、まず虫歯菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）が、歯垢形成酵素であるグルコシルトランスフェラーゼ（GTase）を生産し、スクロースを基質として不溶性かつ粘着性の多糖であるグルカンを合成する。合成されたグルカンが虫歯菌とともに歯の表面に付着してプラークを形成し、プラークの中で乳酸菌（Lactococcus lactis subsp. lactis）が乳酸を産生して、エナメル質を脱灰する。
【０００３】
う蝕抑制効果、すなわち虫歯予防効果、を有する物質として、ラクトフェリンが病原菌付着阻止作用を有し、う蝕予防に対して効果的であることが報告されている（特許文献１）。さらに特許文献２には、ラクトフェリンを他の物質（ラクトパーオキシダーゼ、茶ポリフェノール、フッ素）と組み合わせてう蝕抑制効果を高めることが記載されている。
【０００４】
ラクトフェリンは、多くの哺乳動物の体液中、例えば、乳汁中に存在する。特に、母乳の初乳には、５〜１０ｇ／Ｌ含まれ、含有されている全蛋白の３０％〜７０％を占めることが知られている。ラクトフェリンは、乳児の健康維持および発育に重要な蛋白であると共に、近年、抗菌作用および抗バクテリア作用を有することが明らかになり、食品工業の他、様々な分野で利用されている。
【０００５】
ラクトフェリンは、１分子中に２個の鉄を結合している、分子量約８０，０００の鉄結合性の糖蛋白である。ラクトフェリンは、ｐＨ２のような酸性下で鉄を遊離し、アポラクトフェリンとなる。ラクトフェリンの静菌（制菌）作用に関して、以下のように考えられた。アポラクトフェリンのキレート作用によって、微生物の生育に必要とする鉄分が奪われ、その増殖が制限される。このため、生育の際に鉄分を強く要求する微生物が、ラクトフェリンの静菌（制菌）作用を受ける。このようなラクトフェリンの静菌（制菌）作用は、特に腸内環境において考察されている。このように、ラクトフェリンの静菌（制菌）作用に関してアポラクトフェリンのキレート作用が注目されている。しかし、アポラクトフェリン自体の性質については、まだ知られていない部分が多い。
【０００６】
特許文献３には、ラクトフェリンを酸で加水分解することにより、特に皮膚常在病原菌およびう蝕原菌に対する抗菌性が増大する傾向にあることが記載されている。より詳細には、ウシ由来のラクトフェリンをクエン酸でｐＨを３以下に調整した後に高温（９５℃）で５分〜３時間処理することにより、種々の鉄結合能の生成物を得、鉄結合能の低い生成物ほど皮膚常在病原菌およびう蝕原菌に対する抗菌効果が高かったことが記載されている
【特許文献１】特開平３−２２０１３０号公報
【特許文献２】特開平９−１０７９１７号公報
【特許文献３】特開平６−２７９３１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、虫歯菌（う蝕原菌）に対して抗菌性が高い口内清浄剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、アポラクトフェリンを含有する口内清浄剤を提供し、この口内清浄剤において、
該アポラクトフェリンの鉄結合度は５％以下であり、そして
該アポラクトフェリンを１w/v％の濃度で含む水溶液を調製した場合に、該水溶液中の総陽イオン濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、虫歯菌（う蝕原菌）に対して抗菌性が高い口内清浄剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（アポラクトフェリン）
本発明の口内清浄剤は、アポラクトフェリンを含有する。アポラクトフェリンとは、ラクフェリン分子中に結合されている鉄が遊離した糖蛋白分子である。本発明で使用するアポラクトフェリンは、以下の特性を有する限り、特に限定されない。
【００１１】
本発明におけるアポラクトフェリンは、その分子中の鉄結合度が５％以下、好ましくは４％以下、さらに好ましくは３％以下である。ここで、鉄結合度とは、アポラクトフェリンのモル数に対する鉄のモル数の割合をいう。鉄結合度は、分光分析によりアポラクトフェリンの吸光度を測定すること、あるいは原子吸光分析やＩＣＰ分光分析によりアポラクトフェリン中の鉄量を直接測定することによって決定され得る。本発明においては、鉄結合度は、アポラクトフェリン粉末を純水に溶解して１w/v％溶液とし、これを４７０ｎｍの吸光度で測定して求めたものをいう。
【００１２】
本発明におけるアポラクトフェリンは、１w/v％の濃度でアポラクトフェリンを含む水溶液を調製した場合に、該水溶液中の総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。総陽イオン濃度の決定は、アポラクトフェリン粉末を０．１Ｎ塩酸に溶解して０．１w/v％溶液を調製し、原子吸光光度法によって各陽イオン量を測定することにより各陽イオンの濃度を求め、これらを合算する。総陽イオン濃度は、アポラクトフェリン粉末に不純物として含有される塩（イオン）に相当し得る。上記の０．１Ｎ塩酸によって、ラクトフェリンに結合しているイオンではなく、その粉末に混入している塩のみが溶け出され得るためである。総陽イオン濃度は、好ましくは、３．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００１３】
アポラクトフェリンは、通常、ラクトフェリンを含有する水溶液のｐＨを、酸性側に調節して、ラクトフェリン分子が有する２価の鉄イオンを解離させることにより、製造され得る。
【００１４】
アポラクトフェリンの原料となるラクトフェリンは、乳汁（例えば、牛乳）などの哺乳動物の分泌液または脱脂乳、ホエイ（乳清）などの乳汁加工物からの分離精製（例えば、カチオン交換樹脂に吸着させた後、高濃度塩類溶液で脱離させる方法、電気泳動による分離法、アフィニティークロマトグラフィーによる分離法など）を利用することによって得られたものであってもよい。さらに遺伝子組換えにより得られる種々の細胞（微生物、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞などを含む）、植物、動物などにより産生されたものであってもよい。ラクトフェリンは、医薬品、試薬などとして市販されているものであってもよい。ラクトフェリンは、好ましくは、天然物に由来する。好ましくは、乳清由来のものである。牛乳または脱脂乳から乳製品（例えば、チーズ、カゼインなど）を製造する際に発生する副産物として得られるホエイは、ラクトフェリンの供給源として好適に用いられ得る。
【００１５】
アポラクトフェリンは、好適には、例えば、ラクトフェリン含有液を限外濾過する際に該液に酸を添加し、ラクトフェリンに結合している鉄イオンを解離させることによって製造され得る。ここで用いられ得る酸としては、例えば、クエン酸、塩酸、リン酸、リンゴ酸、または（０．４Ｍ以上の）酢酸が挙げられるが、クエン酸が好ましい。あるいは、アポラクトフェリンは、例えば、カチオン交換膜とアニオン交換膜とが張り合わさった構造を有する複合イオン交換膜であるバイポーラ膜とカチオン交換膜とが交互に配列されて、これらの膜により仕切られた酸室と塩基室とを有する電気透析装置を使用することによっても、好適に製造され得る。この場合、酸としては、電気透析装置での製造工程の間に産生される塩酸が用いられる。
【００１６】
本発明におけるアポラクトフェリンの製造において、調節される酸性側のｐＨは、好ましくは０．５〜３．０であり、より好ましくは１．５〜２．５である。ｐＨが中性に近い場合（例えば、５．５）では、得られるアポラクトフェリンの抗菌性が弱くなることがある。ラクトフェリンを含有する水溶液のｐＨ調整剤としては、上記酸だけでなく、フタル酸、グリシンなども用いられ得る。これらのｐＨ調整剤は、ラクトフェリンを含有する水溶液に、そのｐＨを上記の値に調節するに適切な量で添加される。
【００１７】
ラクトフェリンを含有する水溶液のｐＨを酸性側へ調節する際の温度は、蛋白の変性を考慮すると高温でないほうが好ましい。通常５℃〜６０℃、より好ましくは１５℃〜３５℃であり、さらにより好ましくは室温である。
【００１８】
本発明におけるアポラクトフェリンの具体的な製造については、以下の調製例に詳述するが、アポラクトフェリンの製造方法はこれらに限定されない。本発明におけるアポラクトフェリンは、アポラクトフェリンとして市販されているものを上記の鉄結合度および総陽イオン濃度を有するように改質することによっても得られ得る。
【００１９】
アポラクトフェリンの製造の際に、通常、アポラクトフェリンは水溶液の形態で得られ得る。アポラクトフェリンを用いて本発明の口内清浄剤を調製する場合、水溶液の形態で用いても、あるいは溶媒を除去して粉末化した形態で用いてもよい。
【００２０】
（口内清浄剤）
本発明の口内清浄剤中のアポラクトフェリンの含有量については、剤形に応じて変わるため、特に制限はない。好ましくは０．０１質量％〜２０質量％であり、より好ましくは０．１質量％〜１０質量％であり、さらにより好ましくは１質量％〜５質量％である。
【００２１】
本発明の口内清浄剤は、口臭、う蝕、歯周病などの口腔内疾患の予防および治療を目的とする。本発明の口内清浄剤は、口腔内に適用可能である任意の形態をとり得る。本発明の外用剤の剤形としては、ローション剤、乳剤、スプレー剤、ゲル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤などが挙げられる。本発明の口内清浄剤は、医薬品、医薬部外品、トイレタリー用品、口腔用製剤などとして使用できる。より具体的には、歯磨剤、マウスウォッシュ、スプレー、トローチなどが挙げられる。
【００２２】
本発明の口内清浄剤は、上述したアポラクトフェリンに加えて、その目的、組成物の種類などに応じて、適切な成分を配合し得る。
【００２３】
例えば、通常の口腔内疾患の予防または治療に用いられる、殺菌剤、抗炎症剤、止血剤、組織賦活剤など、清涼化剤としての香料などが配合され得る。
【００２４】
また、溶剤、増粘剤、界面活性剤、研磨剤、甘味剤、防腐剤、色素などが配合され得る。
【００２５】
例えば、溶剤としては、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、マルチット、ラクチツトなどが挙げられる。増粘剤としては、カルボキシビニルポリマーおよび／またはその塩、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、モンモリナイト、ゼラチンなどが挙げられる。
【００２６】
界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、カチオン性界面活性剤が挙げられる。より具体的には、ラウリル硫酸ナトリウム、ショ糖脂肪酸エステル、ラクトース脂肪酸エステル、ラクチトール脂肪酸エステル、マルチトール脂肪酸エステル、ステアリン酸モノグリセライド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（１０、２０、４０、６０、８０、１００モル）硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンモノラウリルエステルなどのポリエチレンオキサイドと脂肪酸、アルキロールアマイド、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインなどが挙げられる。
【００２７】
研磨剤としては、沈降性シリカ、ジルコノシリケートなどのシリカ系研磨剤、リン酸カルシウム、水酸化アルミニウム、酸化アルミニウムなどが挙げられる。
【００２８】
甘味剤としては、サッカリンナトリウム、ステビオサイド、ステビアエキス、パラメトキシシンナミックアルデヒド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、ペリラルチン等、防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウムなどが挙げられる。着色剤としては、青色１号、黄色４号、二酸化チタンなどが挙げられる。
【００２９】
なお、これらの成分の配合量は、本発明における口内清浄効果を妨げない範囲で通常量とすることができる。
【００３０】
本発明の口内清浄剤は、必要に応じて、上述したような当業者が通常用いる成分を含有し、当業者が通常用いる方法に従って調製され得る。アポラクトフェリンは、口内清浄剤に、当業者が通常用いる手順によって添加、配合または含有され得る。例えば、水またはアルコールなどの溶媒に予め溶解後、他の配合成分と混合することによって、または粉末のまま他の配合成分と攪拌混合することによって、口内清浄剤中に添加、配合または含有させ得る。
【００３１】
本発明の口内清浄剤は、上記で説明したような形態とされ、その形態での投与または適用に通常用いられる手段（例えば、スプレー、うがい、口腔内での溶解）に従って、個体に投与または適用され得る。
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
（調製例１：種々の酸処理によるアポラクトフェリンの製造）
マイクローザＵＦラボテスト機（ＬＸ−２２００１；旭化成ケミカルズ株式会社））に、同社製のＵＦモジュールであるＬＯＶ（中空糸モジュール：膜内径０．８ｍｍ、有効膜面積４１ｍ２、膜素材：ポリアクリロニトリル、公称分画分子量：５０，０００）を組み込んだ限外濾過装置を用いて、以下のようにアポラクトフェリンを製造した。
【００３４】
５０ｍｇ／ｍＬのラクトフェリン（フォンテラ製；鉄結合度は約２０％）溶液を１０ｋｇ用いた。アポラクトフェリンの製造工程において、ラクトフェリンを以下のいずれかの酸で処理した：０．１Ｍクエン酸、０．１Ｍ乳酸、０．１Ｍ塩酸、０．１Ｍリンゴ酸、０．１Ｍ酢酸、または０．４Ｍ酢酸。まず、上記ラクトフェリン溶液を装置の供給タンクに投入し、１０分間循環させた後、５秒間逆方向に循環させて、溶液を濃縮した。このとき、ＵＦ膜の入口および出口の圧力、循環液流量を、それぞれ０．１２Ｍｐａ、０．０８Ｍｐａ、１５Ｌ／分と設定した。この操作を非透過の濃縮液が半減するまで繰り返した（これを１ラウンドとする）。次いで、ラクトフェリン溶液の代わりにクエン酸溶液をタンクに投入し、上と同様の操作を２ラウンド行った。次いで、８ＭΩ・ｃｍ以上の純水をタンクに投入し、上記の操作を５ラウンド行い、非透過の濃縮液中に残存する酸を除去した。なお、循環液の温度は、製造工程を通して１０〜２８℃の範囲内であり、ｐＨは２〜３であった。
【００３５】
上記製造工程により、４０ｋｇの濃縮液を得た。次いで、濃縮液を凍結乾燥し、９．５ｇの白色粉末を得た。
【００３６】
各酸処理により得られた粉末がアポラクトフェリンであることおよびアポラクトフェリンの純度を、粉末を純水に溶解後、BIOXYTECH（登録商標）Lacto f EIATM（OXIS International Inc. 米国・オレゴン）を用いて抗体定量を行うことにより決定した。アポラクトフェリンの純度はそれぞれ、以下の通りであった：０．１Ｍクエン酸では９３％、０．１Ｍ乳酸では９４％、０．１Ｍ塩酸では９６％、０．１Ｍリンゴ酸では９１％、０．１Ｍ酢酸では９１％、０．４Ｍ酢酸では９１％。
【００３７】
さらに、各酸処理により得られた粉末の鉄結合度を、粉末を純水に１w/v％の濃度になるように溶解し、次いで、アポラクトフェリンに結合している鉄量を４７０ｎｍの吸光度で測定することにより決定した。得られたアポラクトフェリンの鉄結合度をそれぞれ表１に示す。ここで、鉄結合度は、鉄結合度（％）＝（１w/v％溶液中の鉄モル数／１w/v％溶液中のアポラクトフェリンモル数）×１００によって算出した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
（調製例２：種々のクエン酸処理回数によるアポラクトフェリンの製造）
クエン酸処理回数を増減させたこと以外は、上記調製例１に記載の手順に従ってアポラクトフェリン粉末を製造し、鉄結合度を測定した。得られたアポラクトフェリンの鉄結合度を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
（実施例１：大腸菌を用いたアポラクトフェリン抗菌試験）
上記調製例１で製造した種々の酸処理によるアポラクトフェリン粉末について抗菌性を調べた。対照として、ラクトフェリン粉末（フォンテラ製）を用いた。
【００４２】
独立行政法人・製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）から購入した大腸菌（E. coli）（NBRC 3972）をＳＣＤブイヨン（日水製薬株式会社）５ｍＬ中に継代培養法（液体）で保存した。この保存された大腸菌液５０μＬをＳＣＤブイヨン５ｍＬ中に接種し、振盪水浴中で３０℃にて１６時間培養した（前培養）。前培養した菌液を滅菌水で希釈し、１０７倍までの１０倍段階希釈液を調製した。９６ウェル平底マイクロプレート（BD Falcon）の各ウェルに、アポラクトフェリンまたはラクトフェリン粉末を滅菌水に溶解し倍数希釈した系列を５０μＬ、２倍濃度のＳＣＤブイヨンを１００μＬ、および上記で調製した希釈液のうち１０５希釈の菌液を５０μＬ加えた。上記マイクロプレートを３５℃にて２４時間培養した。培養後、マイクロプレートはマイクロプレートリーダー（マルチスキャンJX：Thermo Labsystems）にて、６３０ｎｍの波長で濁度（吸光度）を測定し、抗菌作用を確認した。
【００４３】
図１は、各酸処理により得られたアポラクトフェリンまたはラクトフェリンを種々の濃度で添加した場合の大腸菌培養液における吸光度を示すグラフである。横軸は培養液中のアポラクトフェリンまたはラクトフェリン濃度（％）を示す。縦軸は吸光度を示し、吸光度が低いほど生菌数が少ない、すなわち抗菌活性が高いことを表す。図１から明らかなように、ラクトフェリンでは抗菌作用があまり見られないのに対し、アポラクトフェリンでは、添加濃度の増加と共に抗菌作用が見られた。特に、クエン酸処理によって得られたアポラクトフェリンの抗菌効果が最も優れていた。
【００４４】
（実施例２：大腸菌を用いたアポラクトフェリン抗菌試験における鉄結合度の影響）
上記調製例２で得られたアポラクトフェリン、市販のラクトフェリン（フォンテラ製）、および市販のアポラクトフェリン（タツア・デイリー製）を用いて、上記実施例１と同様にして大腸菌に対する抗菌性を調べた。ここで市販のラクトフェリンの鉄結合度は１９．８％であり、そして市販のアポラクトフェリンの鉄結合度は４．３９％であった。
【００４５】
図２は、種々の鉄結合度のアポラクトフェリンを種々の濃度で添加した場合の大腸菌培養液における吸光度を示すグラフである。横軸はアポラクトフェリン添加濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。吸光度が低いほど生菌数が少ない、すなわち抗菌活性が高いことを表す。図２から、鉄結合度が１９．８％であったラクトフェリンは吸光度が低下せず、抗菌作用が見られなかった。鉄結合度が５％以下のアポラクトフェリンでは、添加量の増大と共に吸光度が低下し、優れた抗菌作用が見られた。さらに、鉄結合度が約４％以下のアポラクトフェリン（鉄結合度４．０９％、鉄結合度２．９５％、鉄結合度２．２％、鉄結合度１．６６％、および鉄結合度１．０４％）では、５w/v％の濃度でアポラクトフェリン含む水溶液においても、十分な抗菌性が見られた。
【００４６】
（実施例３：大腸菌を用いたアポラクトフェリン抗菌試験における塩の影響）
上記実施例１の大腸菌の抗菌試験において、クエン酸処理アポラクトフェリンを用いて、塩の影響を調べた。１w/v％のクエン酸処理アポラクトフェリン溶液に種々のイオン濃度となるように塩化ナトリウムを加えたこと以外は、実施例１と同様の手順に従って抗菌性を調べた。
【００４７】
図３は、種々の濃度の塩化ナトリウムおよび２．０w/v％アポラクトフェリンを含む大腸菌培養液における吸光度を示すグラフである。横軸は、塩化ナトリウム濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）を示し、縦軸は吸光度を示す。吸光度が低いほど生菌数が少ない、すなわち抗菌活性が高いことを表す。図３では、塩添加濃度が増大するにつれて、抗菌作用が減少していた。したがって、アポラクトフェリン粉末に不純物として混在され得る塩の量が抗菌性に影響を与えると理解される。さらに、そのような塩の量は、アポラクトフェリンを１％溶液とした場合に、全イオンに対して５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが望ましいことが明らかとなった。
【００４８】
そこで、調製例２にて得た鉄結合度２．９５％のアポラクトフェリンの総陽イオン濃度を決定した。アポラクトフェリンの凍結乾燥粉末に０．１Ｎ塩酸を加え、０．１w/v％アポラクトフェリン溶液を調製し、原子吸光光度法によってＮａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、およびＣｕについて測定することにより、これらの各陽イオンの濃度を求め、合計したものを総陽イオン濃度とした。比較のために、市販のラクトフェリンおよびアポラクトフェリンの総陽イオン濃度も決定した。この結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
【００５０】
調製例２にて得た鉄結合度２．９５％のアポラクトフェリンは、総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であった。実施例２において、市販のアポラクトフェリン（タツア・デイリー製）では、鉄結合度が５％以下であったにも関わらず、吸光度は一定以上には低下しかった。このアポラクトフェリンは、本実施例に示されるように、総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌを上回る。したがって、アポラクトフェリン粉末の鉄結合度と総陽イオン濃度との両方が抗菌性に影響すると考えられた。
【００５１】
（実施例４：所定の鉄結合度および総陽イオン濃度を有するアポラクトフェリンの抗菌試験）
上記実施例３の結果を考慮して、鉄結合度が５％以下であり、かつ総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるアポラクトフェリンの抗菌性についてさらに検討した。以下の３種のアポラクトフェリンを使用した：試料Ａ（市販のアポラクトフェリン：鉄結合度４．３９％、総陽イオン濃度１４．７ｍｍｏｌ／Ｌ）；試料Ｂ（試料Ａを調製例１の方法に従って温度２５±１℃、ｐＨ２．６にて再処理した：鉄結合度３．８９％、総陽イオン濃度４．５ｍｍｏｌ／Ｌ）；および試料Ｃ（上記調製例２にて得られたアポラクトフェリン：鉄結合度４．５６％、総陽イオン濃度４．４ｍｍｏｌ／Ｌ）。
【００５２】
抗菌性については、実施例１と同様の手順で行った。なお、アポラクトフェリンの最終濃度は２０ｍｇ／ｍＬとした。
【００５３】
試料Ａ、Ｂ、およびＣを添加した場合の大腸菌の培養液における吸光度を示すグラフを図４に示す。縦軸は吸光度を示し、吸光度が低いほど生菌数が少ない、すなわち抗菌活性が高いことを表す。鉄結合度が５％以下であるが総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌを上回る試料Ａでは、アポラクトフェリンを添加していない培養液と比較して吸光度にあまり差異は見られなかった。これに対して、鉄結合度が５％以下であり、かつ総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌである試料ＢおよびＣは、アポラクトフェリンを添加していない培養液と比較して吸光度が低く、良好な抗菌性を示した。
【００５４】
（実施例５：培養虫歯菌に対するアポラクトフェリンの効果）
上記調製例２にて得られた鉄結合度２．９５％のアポラクトフェリンについて、２種のストレプトコッカス・ミュータンス菌（エアブラウン株式会社より入手：25175株（S.mutans MT）および35668株（S.mutans XC））に対するその発育抑制効果を調べた。対照として、ラクトフェリン（鉄結合度約２０％；フォンテラ製）を使用した。
【００５５】
試験管中に入れたTodd Hewitt Broth（TH培地：関東化学株式会社製）５ｍＬにミュータンス菌を接種し、インキュベータ上で３７℃にて２４時間静置培養した。
【００５６】
アポラクトフェリン粉末およびラクトフェリン粉末を水に溶解して８w/v％水溶液とした。次いで、この８w/v％水溶液を希釈して、４w/v％、２w/v％、１w/v％、および０．５w/v％の各水溶液を作製した。これら各水溶液５０μＬおよび培養したミュータンス菌（１０４希釈）の菌液５０μＬ、さらにＴＨ培地１００μＬをマイクロプレートに入れ、３７℃にて２４時間培養した。培養後、マイクロプレートを５９５ｎｍで吸光度を測定して25175株の細菌濃度を測定し、６３０ｎｍで吸光度を測定して35668株の細菌濃度を測定した。
【００５７】
図５は、種々の濃度のアポラクトフェリン（Apo-Lfn）またはラクトフェリン（Lfn）を添加した場合の各ミュータンス菌培養液における吸光度を示すグラフである（Ａ：ミュータンス菌25175株、Ｂ：ミュータンス菌35668株）。横軸はアポラクトフェリンまたはラクトフェリン添加濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。吸光度が低いほど生菌数が少ない、すなわち抗菌活性が高いことを表す。Ａ：ミュータンス菌25175株およびＢ：ミュータンス菌35668株とも、図５に示すように、アポラクトフェリンの添加量の増大と共に吸光度が低下し、抗菌作用を示した。このことから、アポラクトフェリンは、強いミュータンス菌抑制作用を示すことがわかった。
【００５８】
（実施例６：ヒト口腔中のミュータンス菌数レベル試験）
健常ボランティアを２０名募集し、医師による健康診断を行い、本試験の試験基準に満たす者のみをエントリーした。以下のようにグループ分けし、処置を行った：
Ａグループ（７名）：１日目−無処置、２日目−アポラクトフェリン（ApoLfn）うがい、３日目−水うがい；
Ｂグループ（７名）：１日目−水うがい、２日目−無処置、３日目−ApoLfnうがい；および
Ｃグループ（６名）：１日目−ApoLfnうがい、２日目−水うがい、３日目−無処置。
【００５９】
ここで、「無処置」とは、一切の口内洗浄を行わないことをいい、「水うがい」とは、１５０ｍＬの水道水で３回に分けて、１回５秒間口腔内をうがいによって洗浄することをいい、そして「アポラクトフェリン（ApoLfn）うがい」とは、上記調製例１で製造されたアポラクトフェリン２w/v％水溶液１５０ｍＬを３回に分けて、１回５秒間で口腔内をうがいによって洗浄することをいう。
【００６０】
試験前日２１時以降は食事をせず、歯磨きを禁止した。試験当日の３時以降、飲水および喫煙も禁止した。さらに、前日より激しい運動を禁止した。朝７時に各グループのメンバーに対し、それぞれ記載の処置を行った。９時に集合し、リラックスした状態で、キット「オーラルテスター（登録商標）」（株式会社トクヤマデンタル）に含まれるガムを５分間噛んでもらった。唾液を容器に出してもらい、シリンジで０．５ｍＬ吸い取り、上記キットに含まれるシリンジフィルターを装着し、濾過した。次いで、上記キットに含まれる処理液１を全量吸い取り、再び濾過した。次いで、上記キットに含まれる処理液２を全量吸い取り、濾過し、そしてそのまま２分間放置した。次いで、上記キットに含まれる処理液３を全量吸い取り、そして上記キットに含まれる処理液トレーに全量排出した。回収した液（抗原）をミュータンス用スポイトを使用して、０．１ｍＬ吸い取り、クロマトデバイスのサンプル窓に全量添加した。添加１０〜２０分後に、判定用チャートを用いて、「少ない（スコア０）」、「やや多い（スコア１）」、「多い（スコア２）」、および「非常に多い（スコア３）」で判断した。２日目および３日目も、同様に試験した。したがって、同一被験者が、３通りの各処置を受けたことになる。結果は、処置毎にまとめ、被験者２０名（脱落者なし）の平均±S.D.で表した。
【００６１】
図６は、に対する水うがいおよびアポラクトフェリンうがいにおける口腔内のミュータンス菌数スコアを示すグラフである。図中、「Control群」は、無処置の結果をまとめた群であり、「水うがい群」は、水うがい処置の結果をまとめた群であり、「ApoLfnうがい群」は、アポラクトフェリンうがい処置の結果をまとめた群である。図６に示すように、アポラクトフェリンうがい群は、Control群に対して、口腔中のミュータンス菌が有意に減少した（ｐ＜0.01）。したがって、アポラクトフェリンでのうがいにより、口腔中のミュータンス菌が抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の口内清浄剤は、虫歯菌（う蝕原菌）に対して高い抗菌性を有する。また、安全性が高く副作用を引き起こし得ない。したがって、本発明の口内清浄剤は、虫歯予防、口臭予防などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】各酸処理により得られたアポラクトフェリンまたはラクトフェリンを種々の濃度で添加した場合の大腸菌培養液における吸光度を示すグラフである。
【図２】種々の濃度の塩化ナトリウムと共にアポラクトフェリンを添加した場合のE. coli培養液における吸光度を示すグラフである。
【図３】種々の鉄結合度のアポラクトフェリンを種々の濃度で添加した場合のE. coli培養液における吸光度を示すグラフである。
【図４】種々の鉄結合度および種々の総陽イオン濃度を有するアポラクトフェリンである試料Ａ、Ｂ、およびＣを添加した場合の大腸菌の培養液における吸光度を示すグラフである。
【図５】種々の濃度のアポラクトフェリンまたはラクトフェリンを添加した場合の各ミュータンス菌培養液における吸光度を示すグラフである
【図６】水うがいおよびアポラクトフェリンうがいにおける口腔内のミュータンス菌数スコアを示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口内清浄剤に関する。より詳細には、抗菌性を有するアポラクトフェリンを含有する口内清浄剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
う蝕を引き起こす要因には、微生物、歯牙、および食物の３つがある。例えば、口腔細菌叢のう蝕誘発性が高い状態、歯質のう蝕感受性の高い状態、および食生活パターンのう蝕誘発性の高い状態により、う蝕が引き起こされる。う蝕発生のメカニズムは、まず虫歯菌であるストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）が、歯垢形成酵素であるグルコシルトランスフェラーゼ（GTase）を生産し、スクロースを基質として不溶性かつ粘着性の多糖であるグルカンを合成する。合成されたグルカンが虫歯菌とともに歯の表面に付着してプラークを形成し、プラークの中で乳酸菌（Lactococcus lactis subsp. lactis）が乳酸を産生して、エナメル質を脱灰する。
【０００３】
う蝕抑制効果、すなわち虫歯予防効果、を有する物質として、ラクトフェリンが病原菌付着阻止作用を有し、う蝕予防に対して効果的であることが報告されている（特許文献１）。さらに特許文献２には、ラクトフェリンを他の物質（ラクトパーオキシダーゼ、茶ポリフェノール、フッ素）と組み合わせてう蝕抑制効果を高めることが記載されている。
【０００４】
ラクトフェリンは、多くの哺乳動物の体液中、例えば、乳汁中に存在する。特に、母乳の初乳には、５〜１０ｇ／Ｌ含まれ、含有されている全蛋白の３０％〜７０％を占めることが知られている。ラクトフェリンは、乳児の健康維持および発育に重要な蛋白であると共に、近年、抗菌作用および抗バクテリア作用を有することが明らかになり、食品工業の他、様々な分野で利用されている。
【０００５】
ラクトフェリンは、１分子中に２個の鉄を結合している、分子量約８０，０００の鉄結合性の糖蛋白である。ラクトフェリンは、ｐＨ２のような酸性下で鉄を遊離し、アポラクトフェリンとなる。ラクトフェリンの静菌（制菌）作用に関して、以下のように考えられた。アポラクトフェリンのキレート作用によって、微生物の生育に必要とする鉄分が奪われ、その増殖が制限される。このため、生育の際に鉄分を強く要求する微生物が、ラクトフェリンの静菌（制菌）作用を受ける。このようなラクトフェリンの静菌（制菌）作用は、特に腸内環境において考察されている。このように、ラクトフェリンの静菌（制菌）作用に関してアポラクトフェリンのキレート作用が注目されている。しかし、アポラクトフェリン自体の性質については、まだ知られていない部分が多い。
【０００６】
特許文献３には、ラクトフェリンを酸で加水分解することにより、特に皮膚常在病原菌およびう蝕原菌に対する抗菌性が増大する傾向にあることが記載されている。より詳細には、ウシ由来のラクトフェリンをクエン酸でｐＨを３以下に調整した後に高温（９５℃）で５分〜３時間処理することにより、種々の鉄結合能の生成物を得、鉄結合能の低い生成物ほど皮膚常在病原菌およびう蝕原菌に対する抗菌効果が高かったことが記載されている
【特許文献１】特開平３−２２０１３０号公報
【特許文献２】特開平９−１０７９１７号公報
【特許文献３】特開平６−２７９３１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、虫歯菌（う蝕原菌）に対して抗菌性が高い口内清浄剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、アポラクトフェリンを含有する口内清浄剤を提供し、この口内清浄剤において、
該アポラクトフェリンの鉄結合度は５％以下であり、そして
該アポラクトフェリンを１w/v％の濃度で含む水溶液を調製した場合に、該水溶液中の総陽イオン濃度は５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、虫歯菌（う蝕原菌）に対して抗菌性が高い口内清浄剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（アポラクトフェリン）
本発明の口内清浄剤は、アポラクトフェリンを含有する。アポラクトフェリンとは、ラクフェリン分子中に結合されている鉄が遊離した糖蛋白分子である。本発明で使用するアポラクトフェリンは、以下の特性を有する限り、特に限定されない。
【００１１】
本発明におけるアポラクトフェリンは、その分子中の鉄結合度が５％以下、好ましくは４％以下、さらに好ましくは３％以下である。ここで、鉄結合度とは、アポラクトフェリンのモル数に対する鉄のモル数の割合をいう。鉄結合度は、分光分析によりアポラクトフェリンの吸光度を測定すること、あるいは原子吸光分析やＩＣＰ分光分析によりアポラクトフェリン中の鉄量を直接測定することによって決定され得る。本発明においては、鉄結合度は、アポラクトフェリン粉末を純水に溶解して１w/v％溶液とし、これを４７０ｎｍの吸光度で測定して求めたものをいう。
【００１２】
本発明におけるアポラクトフェリンは、１w/v％の濃度でアポラクトフェリンを含む水溶液を調製した場合に、該水溶液中の総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。総陽イオン濃度の決定は、アポラクトフェリン粉末を０．１Ｎ塩酸に溶解して０．１w/v％溶液を調製し、原子吸光光度法によって各陽イオン量を測定することにより各陽イオンの濃度を求め、これらを合算する。総陽イオン濃度は、アポラクトフェリン粉末に不純物として含有される塩（イオン）に相当し得る。上記の０．１Ｎ塩酸によって、ラクトフェリンに結合しているイオンではなく、その粉末に混入している塩のみが溶け出され得るためである。総陽イオン濃度は、好ましくは、３．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００１３】
アポラクトフェリンは、通常、ラクトフェリンを含有する水溶液のｐＨを、酸性側に調節して、ラクトフェリン分子が有する２価の鉄イオンを解離させることにより、製造され得る。
【００１４】
アポラクトフェリンの原料となるラクトフェリンは、乳汁（例えば、牛乳）などの哺乳動物の分泌液または脱脂乳、ホエイ（乳清）などの乳汁加工物からの分離精製（例えば、カチオン交換樹脂に吸着させた後、高濃度塩類溶液で脱離させる方法、電気泳動による分離法、アフィニティークロマトグラフィーによる分離法など）を利用することによって得られたものであってもよい。さらに遺伝子組換えにより得られる種々の細胞（微生物、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞などを含む）、植物、動物などにより産生されたものであってもよい。ラクトフェリンは、医薬品、試薬などとして市販されているものであってもよい。ラクトフェリンは、好ましくは、天然物に由来する。好ましくは、乳清由来のものである。牛乳または脱脂乳から乳製品（例えば、チーズ、カゼインなど）を製造する際に発生する副産物として得られるホエイは、ラクトフェリンの供給源として好適に用いられ得る。
【００１５】
アポラクトフェリンは、好適には、例えば、ラクトフェリン含有液を限外濾過する際に該液に酸を添加し、ラクトフェリンに結合している鉄イオンを解離させることによって製造され得る。ここで用いられ得る酸としては、例えば、クエン酸、塩酸、リン酸、リンゴ酸、または（０．４Ｍ以上の）酢酸が挙げられるが、クエン酸が好ましい。あるいは、アポラクトフェリンは、例えば、カチオン交換膜とアニオン交換膜とが張り合わさった構造を有する複合イオン交換膜であるバイポーラ膜とカチオン交換膜とが交互に配列されて、これらの膜により仕切られた酸室と塩基室とを有する電気透析装置を使用することによっても、好適に製造され得る。この場合、酸としては、電気透析装置での製造工程の間に産生される塩酸が用いられる。
【００１６】
本発明におけるアポラクトフェリンの製造において、調節される酸性側のｐＨは、好ましくは０．５〜３．０であり、より好ましくは１．５〜２．５である。ｐＨが中性に近い場合（例えば、５．５）では、得られるアポラクトフェリンの抗菌性が弱くなることがある。ラクトフェリンを含有する水溶液のｐＨ調整剤としては、上記酸だけでなく、フタル酸、グリシンなども用いられ得る。これらのｐＨ調整剤は、ラクトフェリンを含有する水溶液に、そのｐＨを上記の値に調節するに適切な量で添加される。
【００１７】
ラクトフェリンを含有する水溶液のｐＨを酸性側へ調節する際の温度は、蛋白の変性を考慮すると高温でないほうが好ましい。通常５℃〜６０℃、より好ましくは１５℃〜３５℃であり、さらにより好ましくは室温である。
【００１８】
本発明におけるアポラクトフェリンの具体的な製造については、以下の調製例に詳述するが、アポラクトフェリンの製造方法はこれらに限定されない。本発明におけるアポラクトフェリンは、アポラクトフェリンとして市販されているものを上記の鉄結合度および総陽イオン濃度を有するように改質することによっても得られ得る。
【００１９】
アポラクトフェリンの製造の際に、通常、アポラクトフェリンは水溶液の形態で得られ得る。アポラクトフェリンを用いて本発明の口内清浄剤を調製する場合、水溶液の形態で用いても、あるいは溶媒を除去して粉末化した形態で用いてもよい。
【００２０】
（口内清浄剤）
本発明の口内清浄剤中のアポラクトフェリンの含有量については、剤形に応じて変わるため、特に制限はない。好ましくは０．０１質量％〜２０質量％であり、より好ましくは０．１質量％〜１０質量％であり、さらにより好ましくは１質量％〜５質量％である。
【００２１】
本発明の口内清浄剤は、口臭、う蝕、歯周病などの口腔内疾患の予防および治療を目的とする。本発明の口内清浄剤は、口腔内に適用可能である任意の形態をとり得る。本発明の外用剤の剤形としては、ローション剤、乳剤、スプレー剤、ゲル剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤などが挙げられる。本発明の口内清浄剤は、医薬品、医薬部外品、トイレタリー用品、口腔用製剤などとして使用できる。より具体的には、歯磨剤、マウスウォッシュ、スプレー、トローチなどが挙げられる。
【００２２】
本発明の口内清浄剤は、上述したアポラクトフェリンに加えて、その目的、組成物の種類などに応じて、適切な成分を配合し得る。
【００２３】
例えば、通常の口腔内疾患の予防または治療に用いられる、殺菌剤、抗炎症剤、止血剤、組織賦活剤など、清涼化剤としての香料などが配合され得る。
【００２４】
また、溶剤、増粘剤、界面活性剤、研磨剤、甘味剤、防腐剤、色素などが配合され得る。
【００２５】
例えば、溶剤としては、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、マルチット、ラクチツトなどが挙げられる。増粘剤としては、カルボキシビニルポリマーおよび／またはその塩、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、カラギーナン、モンモリナイト、ゼラチンなどが挙げられる。
【００２６】
界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、カチオン性界面活性剤が挙げられる。より具体的には、ラウリル硫酸ナトリウム、ショ糖脂肪酸エステル、ラクトース脂肪酸エステル、ラクチトール脂肪酸エステル、マルチトール脂肪酸エステル、ステアリン酸モノグリセライド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（１０、２０、４０、６０、８０、１００モル）硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンモノラウリルエステルなどのポリエチレンオキサイドと脂肪酸、アルキロールアマイド、２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタインなどが挙げられる。
【００２７】
研磨剤としては、沈降性シリカ、ジルコノシリケートなどのシリカ系研磨剤、リン酸カルシウム、水酸化アルミニウム、酸化アルミニウムなどが挙げられる。
【００２８】
甘味剤としては、サッカリンナトリウム、ステビオサイド、ステビアエキス、パラメトキシシンナミックアルデヒド、ネオヘスペリジルジヒドロカルコン、ペリラルチン等、防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナトリウムなどが挙げられる。着色剤としては、青色１号、黄色４号、二酸化チタンなどが挙げられる。
【００２９】
なお、これらの成分の配合量は、本発明における口内清浄効果を妨げない範囲で通常量とすることができる。
【００３０】
本発明の口内清浄剤は、必要に応じて、上述したような当業者が通常用いる成分を含有し、当業者が通常用いる方法に従って調製され得る。アポラクトフェリンは、口内清浄剤に、当業者が通常用いる手順によって添加、配合または含有され得る。例えば、水またはアルコールなどの溶媒に予め溶解後、他の配合成分と混合することによって、または粉末のまま他の配合成分と攪拌混合することによって、口内清浄剤中に添加、配合または含有させ得る。
【００３１】
本発明の口内清浄剤は、上記で説明したような形態とされ、その形態での投与または適用に通常用いられる手段（例えば、スプレー、うがい、口腔内での溶解）に従って、個体に投与または適用され得る。
【００３２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
（調製例１：種々の酸処理によるアポラクトフェリンの製造）
マイクローザＵＦラボテスト機（ＬＸ−２２００１；旭化成ケミカルズ株式会社））に、同社製のＵＦモジュールであるＬＯＶ（中空糸モジュール：膜内径０．８ｍｍ、有効膜面積４１ｍ２、膜素材：ポリアクリロニトリル、公称分画分子量：５０，０００）を組み込んだ限外濾過装置を用いて、以下のようにアポラクトフェリンを製造した。
【００３４】
５０ｍｇ／ｍＬのラクトフェリン（フォンテラ製；鉄結合度は約２０％）溶液を１０ｋｇ用いた。アポラクトフェリンの製造工程において、ラクトフェリンを以下のいずれかの酸で処理した：０．１Ｍクエン酸、０．１Ｍ乳酸、０．１Ｍ塩酸、０．１Ｍリンゴ酸、０．１Ｍ酢酸、または０．４Ｍ酢酸。まず、上記ラクトフェリン溶液を装置の供給タンクに投入し、１０分間循環させた後、５秒間逆方向に循環させて、溶液を濃縮した。このとき、ＵＦ膜の入口および出口の圧力、循環液流量を、それぞれ０．１２Ｍｐａ、０．０８Ｍｐａ、１５Ｌ／分と設定した。この操作を非透過の濃縮液が半減するまで繰り返した（これを１ラウンドとする）。次いで、ラクトフェリン溶液の代わりにクエン酸溶液をタンクに投入し、上と同様の操作を２ラウンド行った。次いで、８ＭΩ・ｃｍ以上の純水をタンクに投入し、上記の操作を５ラウンド行い、非透過の濃縮液中に残存する酸を除去した。なお、循環液の温度は、製造工程を通して１０〜２８℃の範囲内であり、ｐＨは２〜３であった。
【００３５】
上記製造工程により、４０ｋｇの濃縮液を得た。次いで、濃縮液を凍結乾燥し、９．５ｇの白色粉末を得た。
【００３６】
各酸処理により得られた粉末がアポラクトフェリンであることおよびアポラクトフェリンの純度を、粉末を純水に溶解後、BIOXYTECH（登録商標）Lacto f EIATM（OXIS International Inc. 米国・オレゴン）を用いて抗体定量を行うことにより決定した。アポラクトフェリンの純度はそれぞれ、以下の通りであった：０．１Ｍクエン酸では９３％、０．１Ｍ乳酸では９４％、０．１Ｍ塩酸では９６％、０．１Ｍリンゴ酸では９１％、０．１Ｍ酢酸では９１％、０．４Ｍ酢酸では９１％。
【００３７】
さらに、各酸処理により得られた粉末の鉄結合度を、粉末を純水に１w/v％の濃度になるように溶解し、次いで、アポラクトフェリンに結合している鉄量を４７０ｎｍの吸光度で測定することにより決定した。得られたアポラクトフェリンの鉄結合度をそれぞれ表１に示す。ここで、鉄結合度は、鉄結合度（％）＝（１w/v％溶液中の鉄モル数／１w/v％溶液中のアポラクトフェリンモル数）×１００によって算出した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
（調製例２：種々のクエン酸処理回数によるアポラクトフェリンの製造）
クエン酸処理回数を増減させたこと以外は、上記調製例１に記載の手順に従ってアポラクトフェリン粉末を製造し、鉄結合度を測定した。得られたアポラクトフェリンの鉄結合度を表２に示す。
【００４０】
【表２】
【００４１】
（実施例１：大腸菌を用いたアポラクトフェリン抗菌試験）
上記調製例１で製造した種々の酸処理によるアポラクトフェリン粉末について抗菌性を調べた。対照として、ラクトフェリン粉末（フォンテラ製）を用いた。
【００４２】
独立行政法人・製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）から購入した大腸菌（E. coli）（NBRC 3972）をＳＣＤブイヨン（日水製薬株式会社）５ｍＬ中に継代培養法（液体）で保存した。この保存された大腸菌液５０μＬをＳＣＤブイヨン５ｍＬ中に接種し、振盪水浴中で３０℃にて１６時間培養した（前培養）。前培養した菌液を滅菌水で希釈し、１０７倍までの１０倍段階希釈液を調製した。９６ウェル平底マイクロプレート（BD Falcon）の各ウェルに、アポラクトフェリンまたはラクトフェリン粉末を滅菌水に溶解し倍数希釈した系列を５０μＬ、２倍濃度のＳＣＤブイヨンを１００μＬ、および上記で調製した希釈液のうち１０５希釈の菌液を５０μＬ加えた。上記マイクロプレートを３５℃にて２４時間培養した。培養後、マイクロプレートはマイクロプレートリーダー（マルチスキャンJX：Thermo Labsystems）にて、６３０ｎｍの波長で濁度（吸光度）を測定し、抗菌作用を確認した。
【００４３】
図１は、各酸処理により得られたアポラクトフェリンまたはラクトフェリンを種々の濃度で添加した場合の大腸菌培養液における吸光度を示すグラフである。横軸は培養液中のアポラクトフェリンまたはラクトフェリン濃度（％）を示す。縦軸は吸光度を示し、吸光度が低いほど生菌数が少ない、すなわち抗菌活性が高いことを表す。図１から明らかなように、ラクトフェリンでは抗菌作用があまり見られないのに対し、アポラクトフェリンでは、添加濃度の増加と共に抗菌作用が見られた。特に、クエン酸処理によって得られたアポラクトフェリンの抗菌効果が最も優れていた。
【００４４】
（実施例２：大腸菌を用いたアポラクトフェリン抗菌試験における鉄結合度の影響）
上記調製例２で得られたアポラクトフェリン、市販のラクトフェリン（フォンテラ製）、および市販のアポラクトフェリン（タツア・デイリー製）を用いて、上記実施例１と同様にして大腸菌に対する抗菌性を調べた。ここで市販のラクトフェリンの鉄結合度は１９．８％であり、そして市販のアポラクトフェリンの鉄結合度は４．３９％であった。
【００４５】
図２は、種々の鉄結合度のアポラクトフェリンを種々の濃度で添加した場合の大腸菌培養液における吸光度を示すグラフである。横軸はアポラクトフェリン添加濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。吸光度が低いほど生菌数が少ない、すなわち抗菌活性が高いことを表す。図２から、鉄結合度が１９．８％であったラクトフェリンは吸光度が低下せず、抗菌作用が見られなかった。鉄結合度が５％以下のアポラクトフェリンでは、添加量の増大と共に吸光度が低下し、優れた抗菌作用が見られた。さらに、鉄結合度が約４％以下のアポラクトフェリン（鉄結合度４．０９％、鉄結合度２．９５％、鉄結合度２．２％、鉄結合度１．６６％、および鉄結合度１．０４％）では、５w/v％の濃度でアポラクトフェリン含む水溶液においても、十分な抗菌性が見られた。
【００４６】
（実施例３：大腸菌を用いたアポラクトフェリン抗菌試験における塩の影響）
上記実施例１の大腸菌の抗菌試験において、クエン酸処理アポラクトフェリンを用いて、塩の影響を調べた。１w/v％のクエン酸処理アポラクトフェリン溶液に種々のイオン濃度となるように塩化ナトリウムを加えたこと以外は、実施例１と同様の手順に従って抗菌性を調べた。
【００４７】
図３は、種々の濃度の塩化ナトリウムおよび２．０w/v％アポラクトフェリンを含む大腸菌培養液における吸光度を示すグラフである。横軸は、塩化ナトリウム濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）を示し、縦軸は吸光度を示す。吸光度が低いほど生菌数が少ない、すなわち抗菌活性が高いことを表す。図３では、塩添加濃度が増大するにつれて、抗菌作用が減少していた。したがって、アポラクトフェリン粉末に不純物として混在され得る塩の量が抗菌性に影響を与えると理解される。さらに、そのような塩の量は、アポラクトフェリンを１％溶液とした場合に、全イオンに対して５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが望ましいことが明らかとなった。
【００４８】
そこで、調製例２にて得た鉄結合度２．９５％のアポラクトフェリンの総陽イオン濃度を決定した。アポラクトフェリンの凍結乾燥粉末に０．１Ｎ塩酸を加え、０．１w/v％アポラクトフェリン溶液を調製し、原子吸光光度法によってＮａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、およびＣｕについて測定することにより、これらの各陽イオンの濃度を求め、合計したものを総陽イオン濃度とした。比較のために、市販のラクトフェリンおよびアポラクトフェリンの総陽イオン濃度も決定した。この結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
【００５０】
調製例２にて得た鉄結合度２．９５％のアポラクトフェリンは、総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であった。実施例２において、市販のアポラクトフェリン（タツア・デイリー製）では、鉄結合度が５％以下であったにも関わらず、吸光度は一定以上には低下しかった。このアポラクトフェリンは、本実施例に示されるように、総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌを上回る。したがって、アポラクトフェリン粉末の鉄結合度と総陽イオン濃度との両方が抗菌性に影響すると考えられた。
【００５１】
（実施例４：所定の鉄結合度および総陽イオン濃度を有するアポラクトフェリンの抗菌試験）
上記実施例３の結果を考慮して、鉄結合度が５％以下であり、かつ総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であるアポラクトフェリンの抗菌性についてさらに検討した。以下の３種のアポラクトフェリンを使用した：試料Ａ（市販のアポラクトフェリン：鉄結合度４．３９％、総陽イオン濃度１４．７ｍｍｏｌ／Ｌ）；試料Ｂ（試料Ａを調製例１の方法に従って温度２５±１℃、ｐＨ２．６にて再処理した：鉄結合度３．８９％、総陽イオン濃度４．５ｍｍｏｌ／Ｌ）；および試料Ｃ（上記調製例２にて得られたアポラクトフェリン：鉄結合度４．５６％、総陽イオン濃度４．４ｍｍｏｌ／Ｌ）。
【００５２】
抗菌性については、実施例１と同様の手順で行った。なお、アポラクトフェリンの最終濃度は２０ｍｇ／ｍＬとした。
【００５３】
試料Ａ、Ｂ、およびＣを添加した場合の大腸菌の培養液における吸光度を示すグラフを図４に示す。縦軸は吸光度を示し、吸光度が低いほど生菌数が少ない、すなわち抗菌活性が高いことを表す。鉄結合度が５％以下であるが総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌを上回る試料Ａでは、アポラクトフェリンを添加していない培養液と比較して吸光度にあまり差異は見られなかった。これに対して、鉄結合度が５％以下であり、かつ総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌである試料ＢおよびＣは、アポラクトフェリンを添加していない培養液と比較して吸光度が低く、良好な抗菌性を示した。
【００５４】
（実施例５：培養虫歯菌に対するアポラクトフェリンの効果）
上記調製例２にて得られた鉄結合度２．９５％のアポラクトフェリンについて、２種のストレプトコッカス・ミュータンス菌（エアブラウン株式会社より入手：25175株（S.mutans MT）および35668株（S.mutans XC））に対するその発育抑制効果を調べた。対照として、ラクトフェリン（鉄結合度約２０％；フォンテラ製）を使用した。
【００５５】
試験管中に入れたTodd Hewitt Broth（TH培地：関東化学株式会社製）５ｍＬにミュータンス菌を接種し、インキュベータ上で３７℃にて２４時間静置培養した。
【００５６】
アポラクトフェリン粉末およびラクトフェリン粉末を水に溶解して８w/v％水溶液とした。次いで、この８w/v％水溶液を希釈して、４w/v％、２w/v％、１w/v％、および０．５w/v％の各水溶液を作製した。これら各水溶液５０μＬおよび培養したミュータンス菌（１０４希釈）の菌液５０μＬ、さらにＴＨ培地１００μＬをマイクロプレートに入れ、３７℃にて２４時間培養した。培養後、マイクロプレートを５９５ｎｍで吸光度を測定して25175株の細菌濃度を測定し、６３０ｎｍで吸光度を測定して35668株の細菌濃度を測定した。
【００５７】
図５は、種々の濃度のアポラクトフェリン（Apo-Lfn）またはラクトフェリン（Lfn）を添加した場合の各ミュータンス菌培養液における吸光度を示すグラフである（Ａ：ミュータンス菌25175株、Ｂ：ミュータンス菌35668株）。横軸はアポラクトフェリンまたはラクトフェリン添加濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。吸光度が低いほど生菌数が少ない、すなわち抗菌活性が高いことを表す。Ａ：ミュータンス菌25175株およびＢ：ミュータンス菌35668株とも、図５に示すように、アポラクトフェリンの添加量の増大と共に吸光度が低下し、抗菌作用を示した。このことから、アポラクトフェリンは、強いミュータンス菌抑制作用を示すことがわかった。
【００５８】
（実施例６：ヒト口腔中のミュータンス菌数レベル試験）
健常ボランティアを２０名募集し、医師による健康診断を行い、本試験の試験基準に満たす者のみをエントリーした。以下のようにグループ分けし、処置を行った：
Ａグループ（７名）：１日目−無処置、２日目−アポラクトフェリン（ApoLfn）うがい、３日目−水うがい；
Ｂグループ（７名）：１日目−水うがい、２日目−無処置、３日目−ApoLfnうがい；および
Ｃグループ（６名）：１日目−ApoLfnうがい、２日目−水うがい、３日目−無処置。
【００５９】
ここで、「無処置」とは、一切の口内洗浄を行わないことをいい、「水うがい」とは、１５０ｍＬの水道水で３回に分けて、１回５秒間口腔内をうがいによって洗浄することをいい、そして「アポラクトフェリン（ApoLfn）うがい」とは、上記調製例１で製造されたアポラクトフェリン２w/v％水溶液１５０ｍＬを３回に分けて、１回５秒間で口腔内をうがいによって洗浄することをいう。
【００６０】
試験前日２１時以降は食事をせず、歯磨きを禁止した。試験当日の３時以降、飲水および喫煙も禁止した。さらに、前日より激しい運動を禁止した。朝７時に各グループのメンバーに対し、それぞれ記載の処置を行った。９時に集合し、リラックスした状態で、キット「オーラルテスター（登録商標）」（株式会社トクヤマデンタル）に含まれるガムを５分間噛んでもらった。唾液を容器に出してもらい、シリンジで０．５ｍＬ吸い取り、上記キットに含まれるシリンジフィルターを装着し、濾過した。次いで、上記キットに含まれる処理液１を全量吸い取り、再び濾過した。次いで、上記キットに含まれる処理液２を全量吸い取り、濾過し、そしてそのまま２分間放置した。次いで、上記キットに含まれる処理液３を全量吸い取り、そして上記キットに含まれる処理液トレーに全量排出した。回収した液（抗原）をミュータンス用スポイトを使用して、０．１ｍＬ吸い取り、クロマトデバイスのサンプル窓に全量添加した。添加１０〜２０分後に、判定用チャートを用いて、「少ない（スコア０）」、「やや多い（スコア１）」、「多い（スコア２）」、および「非常に多い（スコア３）」で判断した。２日目および３日目も、同様に試験した。したがって、同一被験者が、３通りの各処置を受けたことになる。結果は、処置毎にまとめ、被験者２０名（脱落者なし）の平均±S.D.で表した。
【００６１】
図６は、に対する水うがいおよびアポラクトフェリンうがいにおける口腔内のミュータンス菌数スコアを示すグラフである。図中、「Control群」は、無処置の結果をまとめた群であり、「水うがい群」は、水うがい処置の結果をまとめた群であり、「ApoLfnうがい群」は、アポラクトフェリンうがい処置の結果をまとめた群である。図６に示すように、アポラクトフェリンうがい群は、Control群に対して、口腔中のミュータンス菌が有意に減少した（ｐ＜0.01）。したがって、アポラクトフェリンでのうがいにより、口腔中のミュータンス菌が抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の口内清浄剤は、虫歯菌（う蝕原菌）に対して高い抗菌性を有する。また、安全性が高く副作用を引き起こし得ない。したがって、本発明の口内清浄剤は、虫歯予防、口臭予防などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】各酸処理により得られたアポラクトフェリンまたはラクトフェリンを種々の濃度で添加した場合の大腸菌培養液における吸光度を示すグラフである。
【図２】種々の濃度の塩化ナトリウムと共にアポラクトフェリンを添加した場合のE. coli培養液における吸光度を示すグラフである。
【図３】種々の鉄結合度のアポラクトフェリンを種々の濃度で添加した場合のE. coli培養液における吸光度を示すグラフである。
【図４】種々の鉄結合度および種々の総陽イオン濃度を有するアポラクトフェリンである試料Ａ、Ｂ、およびＣを添加した場合の大腸菌の培養液における吸光度を示すグラフである。
【図５】種々の濃度のアポラクトフェリンまたはラクトフェリンを添加した場合の各ミュータンス菌培養液における吸光度を示すグラフである
【図６】水うがいおよびアポラクトフェリンうがいにおける口腔内のミュータンス菌数スコアを示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポラクトフェリンを含有する口内清浄剤であって、
該アポラクトフェリンの鉄結合度が５％以下であり、そして
該アポラクトフェリンを１w/v％の濃度で含む水溶液を調製した場合に、該水溶液中の総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、
口内清浄剤。
【請求項１】
アポラクトフェリンを含有する口内清浄剤であって、
該アポラクトフェリンの鉄結合度が５％以下であり、そして
該アポラクトフェリンを１w/v％の濃度で含む水溶液を調製した場合に、該水溶液中の総陽イオン濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、
口内清浄剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−６３３０３（Ｐ２００８−６３３０３Ａ）
【公開日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２４５１５８（Ｐ２００６−２４５１５８）
【出願日】平成１８年９月１１日（２００６．９．１１）
【出願人】（５０６３０７８０９）株式会社アップウェル (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１１日（２００６．９．１１）
【出願人】（５０６３０７８０９）株式会社アップウェル (9)
【Ｆターム（参考）】
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