口腔内レンサ球菌の測定方法
【課題】 ミュータンスレンサ球菌数を口腔内レンサ球菌数で除した値である齲蝕菌比率を求める際に必要になる、口腔内レンサ球菌を迅速簡便に測定する方法を提供すること。
【解決手段】 酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌とを接触させて、該酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌の結合物を形成させ、この酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌の結合物量を測定することで、迅速簡便に口腔内レンサ球菌を測定する方法。
【解決手段】 酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌とを接触させて、該酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌の結合物を形成させ、この酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌の結合物量を測定することで、迅速簡便に口腔内レンサ球菌を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔内に存在する微生物、具体的には口腔内レンサ球菌の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ミュータンスレンサ球菌と呼ばれる一群の乳酸発酵性細菌が、齲蝕発症に深く関わっていることが知られている。
【０００３】
これらミュータンスレンサ球菌群は、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ、血清型ａ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ、血清型ｂ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、血清型ｃ、ｅ、ｆ）、ストレプトコッカス・フェルス（Ｓ．ｆｅｒｕｓ、血清型ｃ）、ストレプトコッカス・マカカ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ、血清型ｃ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ、血清型ｄ、ｇ）、ストレプトコッカス・ドウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｙ、血清型ｈ）として、血清学的、遺伝学的に異なる７種の型に分類されている。
【０００４】
従来、これらミュータンスレンサ球菌の唾液中の濃度が１０５〜１０６個／ｍＬの場合には、齲蝕の危険あり、１０６個／ｍＬ以上の場合は特に危険であると言われており、人の口腔内におけるミュータンスレンサ球菌の存在量を知ることで、その人の齲蝕危険度の判定を行なうことが可能である。一般に、これらミュータンスレンサ球菌の濃度は、バシトラシンを入れた培地を用いて唾液中のミュータンスレンサ球菌を選択的に培養してコロニー数を調べることにより測定されている（そのための測定キットも市販されている）。そして、唾液中の各ミュータンスレンサ球菌の濃度についても、同様に培養を行なって得られたコロニーの中から各菌のコロニーを同定し、その数を調べることにより知ることができる。なお、同定の方法としては、糖発酵試験等の生化学的方法、ＤＮＡプローブを用いる遺伝学的方法、血清型特異的抗体を用いる免疫学的方法等が知られている。
【０００５】
近年、ミュータンスレンサ球菌の中でヒトの口腔に存在するのは主にストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスの２菌種であることが明らかとなった。特に、ストレプトコッカス・ミュータンスはヒト口腔から高頻度に分離され（９割以上の人から分離される）、齲蝕の発生に深く関連することが判明した。
【０００６】
現在、口腔内のミュータンスレンサ球菌の測定法としては培養法が広く実施されている。しかし、培養法は、培養操作が不可欠であること、更に分離したコロニーの形態からの菌種の同定には熟練した手技が必要であることから、検査時間および操作の煩雑さの点で問題があったが、近年、各種モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法が報告された。これらの方法は培養する必要が無く、検出に要する時間が大幅に短縮できるという利点がある（例えば非特許文献１参照）。
【０００７】
唾液中のミュータンスレンサ球菌数の測定結果は、唾液採取条件、唾液採取から測定までの保存条件等の影響を受ける。唾液中のミュータンスレンサ球菌数が同等であっても、唾液採取条件や保存条件を一定にしないと、ミュータンス菌数が変動してしまい、正確に齲蝕危険度の判定ができない場合がある。例えば、ミュータンスレンサ球菌測定に使用する被検体の採取は、通常はガム等の咀嚼物を口全体の歯をまんべんなく使って一定時間噛み、唾液を採取することで実施されるが、ガムを特定の部位のみで噛んでしまったり、ガムを噛む時間が短すぎたりすると、口腔内のミュータンスレンサ球菌が十分に採取できず本来のミュータンスレンサ球菌数より少ない菌数となる可能性がある。また、例えば、培養法で菌数を測定する場合は、唾液採取から測定までの保存条件によっては菌が死んでしまい、本来の菌数より少ない菌数となる可能性がある。
【０００８】
口腔内には、様々な細菌が存在しているが、最も多い菌群は、通性嫌気性菌のレンサ球菌で（以後、口腔内レンサ球菌と略す場合がある）、おおよそ全体の半分を占めているといわれている。口腔内レンサ球菌は多数の菌種の混合物であり、ミュータンスレンサ球菌も口腔内レンサ球菌に含まれる。これら口腔内レンサ球菌は、全ての人の口腔内に、一般的には唾液中に１０８個／ｍＬ程度存在すると言われている。
【０００９】
そこで、唾液中のミュータンスレンサ球菌数と口腔内レンサ球菌数とを測定し、ミュータンスレンサ球菌数を口腔内レンサ球菌数で除した値（以後齲蝕菌比率という場合がある）を算出することで、上記唾液採取や唾液保存による変動を補正する方法が知られている（例えば非特許文献２参照）。前記の理由等により、採取した唾液中のミュータンスレンサ球菌数が本来のミュータンスレンサ球菌数より少なくなってしまったとしても、口腔内レンサ球菌数も同様に減少するので、齲蝕菌比率を算出することで、サンプリング時の菌数のブレを補正することが可能である。この方法によれば、齲蝕菌比率が０．１〜１％の場合が齲蝕の危険小、１〜５％の場合が齲蝕の危険中、５％以上の場合が齲蝕の危険大というように、安定して齲蝕危険度を判定することが可能となるが、口腔内レンサ球菌は多種類の菌種の混合物であるため、迅速に測定できる免疫学的測定法で測定するためには、多数の抗体を準備する必要があるため非現実的であり、口腔内レンサ球菌の測定は、結果が判明するまで日数を要する培養法により実施されているという問題があった。迅速な口腔内レンサ球菌の測定方法が望まれていた。
【００１０】
【非特許文献１】大森かをる，私の愛すべき道具たち，デンタルダイヤモンド 第３１巻，２００６年，１１４−１１８
【非特許文献２】花田信弘監修，「ミュータンスレンサ球菌の臨床生物学」 第１版，クインセッテンス出版株式会社，２００３年，１５２−１６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、口腔内レンサ球菌を迅速簡便に測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は上記課題を解決するために、鋭意検討してきた。その結果、唾液中に存在する糖タンパク質であって、口腔内レンサ球菌に結合することが知られている酸性プロリンリッチタンパク（ａｃｉｄｉｃ Ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，以下ＰＲＰｓと略す場合がある）が、口腔内レンサ球菌に結合する性質を利用することで、口腔内レンサ球菌を迅速簡便に測定できることを見出した。そして、更に検討を進め、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明は、酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌とを接触させることで酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌の結合物を形成させ、該酸性プロリンリッチタンパクとレンサ球菌の結合物の量を測定することを特徴とする口腔内レンサ球菌の測定方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の口腔内レンサ球菌の測定方法により、迅速簡便に口腔内レンレンサ球菌を測定することが可能となり、例えば、ミュータンスレンサ球菌の迅速な測定法（例えば免疫学的測定法）と組合わせることで、迅速に齲蝕菌比率を算出することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の口腔内レンサ球菌の測定法では、唾液中の糖タンパク質である酸性プロリンリッチタンパク（ＰＲＰｓ）の口腔内レンサ球菌に結合する性質を利用して、口腔内レンサ球菌を測定する。
【００１６】
本発明における口腔内レンサ球菌とは、口腔内に存在する通性嫌気性のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌で、ミティス−サリバリウス培地（以下、ＭＳ培地と略す場合がある）で嫌気培養した場合に生育してくる細菌を指す。具体的には、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・フェルス（Ｓ．ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ、）、ストレプトコッカス・ドウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｙ）等のミュータンスレンサ球菌、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓ．ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）等が該当する。
【００１７】
本発明の口腔内レンサ球菌の測定方法で使用する被検体としては、上記口腔内レンサ球菌を含有するものであれば制限なく使用できる。例えば、微生物の培養液、微生物の懸濁液、食品およびその懸濁液、または、唾液、血漿、血清、尿等の体液、或いは歯垢等が挙げられる。齲蝕菌比率を検査する場合には、唾液、歯垢が特に好適に使用される。なお、唾液及び歯垢は、被検体中にそれぞれ単独で含まれていてもよいし、混合物として含まれていてもよい。
【００１８】
例えば歯垢のみを含む被検体は、口腔内をうがい等により洗浄し唾液成分を除去した後に採取した歯垢を用いて調製すればよい。歯垢の採取は、口腔内の特定部位の歯垢をつまようじ、綿棒、スパチュラ等の従来公知の方法で採取することも出来るし、口腔内より無作為に採取することも出来る。このように採取された歯垢を緩衝液等の液体に懸濁し被検体とすればよい。
【００１９】
例えば、歯垢と唾液の混合物を被検体とする場合は、パラフィンペレット、ガム等の咀嚼物を３０秒〜１０分間噛ませ、分泌された唾液を吐き出させることにより採取できる。また、唾液のみを含む被検体液は、例えば、スポイト、ピペット等の従来公知の方法で採取された唾液を用いて調製することが出来る。採取された唾液は、そのまま或いは、緩衝液等の液体で適宜希釈して被検体とすればよい。
【００２０】
本発明で使用するＰＲＰｓとは、唾液中に存在する糖タンパク質で、以下の３つの特徴を有するものを指す（例えば、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ；５６巻；１９８８年；４３９−４４５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；６８巻；１９８９年；１３０３−１３０７）。１）口腔内レンサ球菌の表面に存在するレセプターに結合する、２）分子中にプロリンを多く含む（プロリン含有量が１０％以上、好適には１５％以上）、３）酸性の等電点（ｐＨ２−５）を有する。
【００２１】
以下ＰＲＰｓの特徴の確認方法を具体的に説明する。
【００２２】
口腔内レンサ球菌への結合は、例えば、酵素免疫測定法（以下ＥＬＩＳＡ法と略す場合がある）により確認することができる。ＥＬＩＳＡ法は、例えば、新生化学実験講座１２ 分子免疫学ＩＩＩ（東京科学同人 １９９０年）８８−９９ページ記載の方法に従って実施できる。具体的手順を以下に説明する。まず、一定量の精製したＰＲＰｓ溶液を９６穴イムノプレートに添加し、一定時間放置することで、溶出画分に含まれる物質をイムノプレートに吸着させ、さらにブロッキングを行う。次いで、口腔内レンサ球菌（例えばストレプトコッカス・ミュータンス）を一定量ウェルに添加すると、ウェルに固定化されたＰＲＰｓ量に比例した量の菌体が結合する。次いで、口腔内レンサ球菌に対する抗体（例えば抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体）を添加後、酵素標識した二次抗体を添加し、酵素活性を測定することで、精製したＰＲＰｓの口腔内レンサ球菌への結合が確認できる。
【００２３】
プロリン含有量は、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質ＩＩ（東京科学同人 １９９０年）２５−５３ページ記載の、タンパク質の組成分析法（アミノ酸分析法）に従って調べることができる。精製したＰＲＰｓを塩酸等で加水分解し、タンパク質中に含まれるアミノ酸を、逆相カラムクロマトグラフィー、またはイオン交換カラムクロマトグラフィーで分離定量することで、プロリン含量を求めれば良い。
【００２４】
ＰＲＰｓの等電点は、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質Ｉ（東京科学同人 １９９０年）３６１−３６４ページ記載の等電点電気泳動法により調べることができる。等電点電気泳動法はタンパク質の等電点により分画する方法なので、ＰＲＰｓと等電点マーカー（等電点既知の複数のタンパク質の混合物）を同時に等電点電気泳動法により分離し、電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルー等の色素でタンパク質を染色し、等電点マーカーとＰＲＰｓのタンパク質バンドの位置を確認することでＰＲＰｓの等電点を確認すれば良い。
【００２５】
ＰＲＰｓには、部分的にアミノ酸の置換、欠失、挿入等が生じた複数の分子種が存在することが知られている。従って、ＰＲＰｓは単一のアミノ酸配列を持つ糖タンパク質ではなく、前記１）〜３）の特徴を持つ複数の糖タンパク質の集団の総称であると言える。本発明のＰＲＰｓとしては、複数の分子種の混合物を用いても良いし、単一の分子種を用いても良い。
【００２６】
本発明で使用するＰＲＰｓは、例えば、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ；５６巻；１９８８年；４３９−４４５ページに記載されているように、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー等、タンパク質の精製で従来用いられているカラムクロマトグラフィー等の方法を組み合わせることで精製することができる。
【００２７】
上記公知の精製法で調製したＰＲＰｓは、通常、ＰＲＰｓに加えてＰＲＰｓ以外の唾液中に存在する成分（タンパク質等）を夾雑物として含有する場合が多い。ＰＲＰｓの精製に使用した唾液の種類、精製方法等により該夾雑物の種類、含量は変動するが、該夾雑物が、口腔内レンサ球菌に結合するというＰＲＰｓの作用を妨害することがない限り（具体的には、後述する口腔内レンサ球菌測定法に精製したＰＲＰｓを適応した場合に１０８個／ｍＬオーダーの口腔内レンサ球菌が検出可能であれば）唾液から精製したＰＲＰｓが夾雑物を含有していても、本発明のＰＲＰｓとして制限なく使用することができる。精製ＰＲＰｓ中の夾雑物が多いと、口腔内レンサ球菌の測定感度が低下する場合があるので、本発明に使用するＰＲＰｓは、ＰＲＰｓの含有率が５０％以上であることが望ましい。ＰＲＰｓの含有率が７０％以上であると、後述する固定化ＰＲＰｓ調製の容易さ等の理由から更に好適である。
【００２８】
精製ＰＲＰｓ中のＰＲＰｓ含有率は、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質Ｉ（東京科学同人 １９９０年）３５６−３８７ページ記載のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す場合がある）調べることができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは分子量により分画する方法なので、ＰＲＰｓ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、電気泳動後のゲル中のタンパク質をクマシーブリリアントブルー、アミドブラック等のタンパク質に結合する色素で染色し、全タンパク質バンドに対するＰＲＰｓバンドの占める割合を求めれば良い。一般的にＰＲＰｓの分子量は１万−３万であることが知られているので、全タンパク質バンドに対する分子量１万−３万のバンドの占める割合を求めれば良い。
【００２９】
以下、タンパク質に結合する色素による染色の具体的方法を、クマシーブリリアントブルーによる染色を例として説明する。電気泳動終了後のゲルを、タンパク質固定液（例えば、１０％トリクロロ酢酸、５０％メタノール−７％酢酸、等）に１０分〜２時間浸して、ゲル内のタンパク質を固定化する。次いで、ゲルを、タンパク質固定液にクマシーブリリアントブルーを０．１〜０．５％となるように溶解させた染色液中に１０分〜２時間浸しタンパク質を染色する。染色後のゲルを脱色液（例えば、５％メタノール−７％酢酸）に浸し、バックグランドの脱色を行なった後、タンパク質バンドを観察する。
【００３０】
電気泳動後のゲルの染色法としては、ＰＲＰｓは糖タンパク質であるので、上記のタンパク質に結合する色素による染色だけでなく、例えば、新生化学実験講座３ 糖質Ｉ（東京科学同人 １９９０年）７６３−７６７ページ記載の糖を染色する方法を採用しても良い。この場合、糖鎖を含有しないタンパク質は染色されないので、本染色法と上記タンパク質を染色する方法を組合わせることによって、タンパク質に糖鎖が含まれるかどうか（即ち糖タンパク質であるかどうか）を確認することができる。以下、代表的な糖鎖染色法である過ヨウ素酸シッフ染色（以下ＰＡＳ染色と略す場合がある）を例に、染色手順を具体的に説明する。電気泳動終了後のゲルを、タンパク質固定液（例えば、１０％トリクロロ酢酸、５０％メタノール−７％酢酸、等）に１０分〜２時間浸して、ゲル内のタンパク質を固定化する。次いで、ゲルを、酸化溶液（例えば、１％過ヨウ素酸水溶液）中に１０分〜１時間浸し、イオン交換水でゲルを洗浄する。次に、ゲルをシッフ試薬中に１０分〜１時間浸した後、還元溶液（例えば、０．５％メタ亜硫酸水素ナトリウム）中に１０分〜１時間浸す。最後にイオン交換水でゲルを洗浄し、糖鎖を含むタンパク質のバンドを観察する。ＰＡＳ染色で使用するシッフ試薬の代表的な調製方法を以下に示す。１ｇの塩基性フクシンを２００ｍＬの沸騰イオン交換水に溶解し、５０℃に冷却、濾過後、濾液に１Ｎ塩酸を２０ｍＬ添加し、２５℃にしてメタ亜硫酸水素ナトリウムを１ｇ添加、２４時間暗所に放置してから使用する。
【００３１】
夾雑物を含むＰＲＰｓ画分のプロリン含量を分析する目的でアミノ酸分析を行なう場合、夾雑物量が少なければ（例えば、前記ＰＲＰｓ含有率が９０％以上の場合）そのまま通法に従ってＰＲＰｓ画分を加水分解し、分析しても差し障りないが、夾雑物量が多い場合、ＰＲＰｓを更に精製し夾雑物を取り除いてからアミノ酸分析する必要がある。この場合は、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質ＩＩ（東京科学同人 １９９０年）２７−２８ページに記載されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＰＲＰｓと夾雑物を分離し、ゲルからＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した後、ＰＶＤＦ膜のＰＲＰｓのバンド部分のみを切り出し、加水分解後アミノ酸分析すれば良い。
【００３２】
以下、カラムクロマトグラフィーによる唾液からのＰＲＰｓの精製法を詳細に説明する。唾液は、例えば、ガム等の咀嚼物を噛ませ採取した刺激唾液が使用できる。最初に該唾液を遠心分離し不溶物を除去すると後のカラム操作が簡便になり好適である。次いでカラムクロマトグラフィーにより精製する。カラムクロマトグラフィーとしては、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質Ｉ（東京科学同人 １９９０年）１６１−３２７ページ記載の種々のカラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー等）が制限なく利用できる。これらカラムクロマトグラフィーは、原理の異なる方法を組み合わせて使用すると、ＰＲＰｓの純度が上がり好適である。ＰＲＰｓは前述したように等電点が酸性（ｐＨ２−５）で、分子量が１万−３万程度であるので、この性質を利用して精製すれば良く、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーとゲル濾過カラムクロマトグラフィーの組み合わせが好適である。
【００３３】
イオン交換カラムクロマトグラフィーには、例えば、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂等従来公知のイオン交換樹脂が制限なく使用することができる。イオン交換樹脂の具体例としては、ジエチルアミノエチル（以下ＤＥＡＥと略す場合がある）基、第四級アミノエチル基等のアニオン交換基、または、カルボキシメチル基、スルホプロピル基等のカチオン交換基を、セルロース、デキストラン、アガロース、親水性アクリルアミド系ポリマー、親水性ビニルポリマー等のクロマトグラフィー用樹脂に結合させたものを示すことができる。ＰＲＰｓの等電点が酸性であることから、アニオン交換樹脂を使用することが好適である。アニオン交換樹脂でも特にＤＥＡＥ基を有するアニオン交換樹脂を使うことが、ＰＲＰｓクロマトグラフィー操作の容易性、ＰＲＰｓの回収量の点から特に好適である。
【００３４】
ゲル濾過カラムクロマトグラフィーには、例えば、従来公知のゲル濾過用樹脂を制限なく使用することができる。ゲル濾過用樹脂を具体的に示すと、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、親水性アクリルアミド系ポリマー、親水性ビニルポリマー等が挙げられる。上述したようにＰＲＰｓの分子量は１万−３万なので、この範囲の分子量が分画範囲に含まれるゲル濾過用樹脂を選択すれば良い。
【００３５】
イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーの実施法は、従来公知の方法に従って実施すれば良い［例えば、新生化学実験講座１ タンパク質Ｉ（東京科学同人 １９９０年）１６９−１８４ページ、に記載の方法］。カラムクロマトグラフィーは、試料の安定性や、クロマトグラフィーの再現性の観点から、一定のｐＨで実施することが望ましく、この目的のために、カラム操作時には、緩衝液が使用されるのが一般的である。緩衝液としては、従来公知の緩衝液、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、重炭酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等、を制限なく使用することができる。緩衝液の濃度は、０．００１〜１Ｍの範囲が好適である。
【００３６】
イオン交換カラムクロマトグラフィーによるＰＲＰｓの精製法の具体例を以下に説明する。イオン交換樹脂を充填したカラムを開始緩衝液で平衡化する。開始緩衝液の濃度は、あまり高すぎるとＰＲＰｓのイオン交換樹脂への結合を阻害するので、０．００１〜０．２Ｍの範囲であることが好ましい。次いで、ＰＲＰｓを含有する試料をカラムを通過させ、ＰＲＰｓをイオン交換樹脂に結合させる。次いで、開始緩衝液をカラム容量の３〜２０倍程度流し、カラムを洗浄する。ＰＲＰｓの溶出は、カラムに流す緩衝液のｐＨ、塩濃度を変化させることにより実施する。塩濃度を変化させる方法は、ＰＲＰｓが変性する危険が少ないので、好適な方法である。開始緩衝液の緩衝物質（トリス、リン酸塩等）自身の濃度を上げても良いし、開始緩衝液に塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩を添加しても良い。このようにしてＰＲＰｓをカラムから溶出させて回収する。
【００３７】
溶出画分中のＰＲＰｓは、ＰＲＰｓが口腔内レンサ球菌に結合するという性質を利用して、従来公知の方法により、例えば、前述のＥＬＩＳＡ法により定量することができる。具体的手順を以下に説明する。まず、一定量の溶出画分を９６穴イムノプレートに添加し、一定時間放置することで、溶出画分に含まれる物質をイムノプレートに吸着させ、さらにブロッキングを行う。次いで、口腔内レンサ球菌（例えばストレプトコッカス・ミュータンス）を一定量ウェルに添加すると、ウェルに固定化されたＰＲＰｓ量に比例した量の菌体が結合する。次いで、口腔内レンサ球菌に対する抗体（例えば抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体）を添加後、酵素標識した二次抗体を添加し、酵素活性を測定することで、溶出画分内に存在するＰＲＰｓ量を評価することができる。
【００３８】
ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによるＰＲＰｓの精製法の具体例を以下に説明する。ゲル濾過用樹脂を充填したカラムを緩衝液で平衡化する。緩衝液の濃度が、あまり低すぎるとタンパク質のゲル濾過用樹脂への非特異的吸着が起こる場合があるので、緩衝液の濃度は０．０１〜１Ｍの範囲であることが好ましい。ＰＲＰｓを含有する試料をカラムを通過させ分画する。溶出画分中のＰＲＰｓ量は上記イオン交換カラムクロマトグラフィーの場合と同様に、例えばＥＬＩＳＡ法により、測定することができる。
【００３９】
イオン交換カラムクロマトグラフィーとゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行なう順番、回数等には特に制限はなく、唾液の量、種類、精製ＰＲＰｓの純度に応じて、適宜選択すれば良い。
【００４０】
イオン交換カラムクロマトグラフィーとゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより唾液から精製したＰＲＰｓは複数の分子種を含んでいる。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，２５５巻，１９８８年，１５−２１ページに記載されているように、カラムで精製したＰＲＰｓを等電点電気泳動法により精製すれば単一種のＰＲＰｓを調製することができる。
【００４１】
上記のようにカラムクロマトグラフィー、等電点電気泳動等により調製したＰＲＰｓを含む溶液を、例えば、中性付近（ｐＨ６〜８）の緩衝液（トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等）に対し透析し、ＰＲＰｓ溶液とすれば良い。
【００４２】
本発明では、上記のようにして調製した被検体とＰＲＰｓを接触させ、ＰＲＰｓと口腔内レンサ球菌の結合物を形成させる。唾液、歯垢中の口腔内レンサ球菌は、表面が歯垢（不溶性多糖）で覆われていたり、また、唾液中のタンパク質等が菌体表面に結合している場合があるので、そのまま本発明の測定方法の被検体として使用すると、歯垢や唾液中のタンパク質等が妨害し、ＰＲＰｓと口腔内レンサ球菌の結合物が形成されない場合がある。このため、特に、被検体が唾液または歯垢である場合には、前処理を行い、歯垢及び／又は唾液中のタンパク質等を被検体中の口腔内レンサ球菌菌体表面から取り除く必要がある。
【００４３】
前処理は、一般的にタンパク質の変性方法や不溶性多糖の可溶化法として知られている方法により実施することができ、例えば、生化学実験講座４ 糖質の化学（上）（東京化学同人 第一版 １９７６年）８１−２５８ページに記載されている不溶性多糖の可溶化法（抽出法）に従って実施できる。具体例として、アルカリ処理、酸処理、界面活性剤処理、変性剤処理等が表示でき、具体的な操作方法として、アルカリ処理の場合には、０．０５〜５Ｍの水酸化ナトリウム、または水酸化カリウム溶液中で、酸処理としては０．１Ｍ〜５Ｍの塩酸、または酢酸溶液中で、界面活性剤処理の場合は、０．０１％〜１０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルコール酸ナトリウム等のイオン性界面活性剤、またはトリトンＸ−１００、ツイーン２０等の非イオン性界面活性剤の溶液中で、変性剤処理の場合は１〜８Ｍの塩酸グアニジン、または尿素溶液中で、４℃〜１２０℃にて５分〜２４時間放置するという方法等が例示できる。
【００４４】
上記の方法中、アルカリ処理、酸処理は、反応後、緩衝液、酸、アルカリ等を添加しｐＨを中性に調製するという操作を行なうだけで本発明の測定方法に供することができるので、特に好適である。例えば、アルカリ処理の場合は、反応後に、塩酸、酢酸、クエン酸等の酸を添加することでｐＨを６〜８程度に調整すれば良い。また、酸処理の場合には、反応後に、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を添加することでｐＨを６〜８程度に調整すればよい。
【００４５】
本発明の口腔内レンサ球菌の測定法では、前記のように調製したＰＲＰｓと口腔内レンサ球菌を含む被検体とを接触させ、ＰＲＰｓとレンサ球菌の結合物を形成させ、該ＰＲＰｓと口腔内レンサ球菌の結合物の量を測定することで、口腔内レンサ球菌の量を測定する。ＰＲＰｓと口腔内レンサ球菌の接触、ＰＲＰｓと口腔内レンサ球菌の結合物の測定は、従来公知の種々の免疫学的測定法に準じて実施することができる［例えば、新生化学実験講座１２ 分子免疫学III 抗原・抗体・補体（東京化学同人 第一版 １９９２年）３３−１２５ページ］。従来の免疫学的測定法において抗体を使用しているところをＰＲＰｓに置きかえれば、従来の免疫学的測定方法と同様に実施することができる。
【００４６】
以下好適な方法について説明する。
［遊離のＰＲＰｓを使用する方法］
該方法は、不溶性担体にＰＲＰｓを担持させることなく口腔内レンサ球菌を測定する方法である。具体例として、口腔内レンサ球菌を含む被検体と遊離ＰＲＰｓを混合し、口腔内レンサ球菌の凝集による濁度の変化で口腔内レンサ球菌を定量する方法（凝集法）、または、口腔内レンサ球菌を含む被検体と放射性物質、酵素、蛍光色素、色素等で標識したＰＲＰｓとを混合し、遠心分離により沈殿を回収することで、口腔内レンサ球菌に結合しなかった遊離の標識ＰＲＰｓを除去し、最終的に、口腔内レンサ球菌に結合した標識ＰＲＰｓの標識物の量、すなわち標識物質に由来する放射活性、酵素活性、蛍光強度、着色（色調の変化）等を測定することによって、被検体中の口腔内レンサ球菌を検出、定量する方法（標識ＰＲＰｓ法）等が挙げられる。遊離のＰＲＰｓを使用する方法で使用する好適なＰＲＰｓ量は、ＰＲＰｓと被検体と混合した後の懸濁液中の濃度が０．００１〜５ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００４７】
前記のように公知の精製法により調製したＰＲＰｓ画分は、通常ＰＲＰｓ以外の夾雑物を含有するため、ＰＲＰｓ画分のタンパク質量を測定しただけでは実際のＰＲＰｓ濃度が不明である。このような場合には、例えば、前述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより夾雑物の含有率を確認し、ＰＲＰｓ画分のタンパク質量と該夾雑物含有率からＰＲＰｓ画分中の実際のＰＲＰｓ濃度を算出し、このようにして算出した実際のＰＲＰｓの濃度が前記の好適な範囲になるようにＰＲＰｓ濃度を調整すれば良い。
［固定化ＰＲＰｓを使用する方法］
該方法は、不溶性担体にＰＲＰｓを担持させた固定化ＰＲＰｓを使用して口腔内レンサ球菌を測定する方法である。
【００４８】
不溶性担体としては、形状は、例えば、膜、粒子、プレート、試験管等の従来公知のものが特に制限なく使用できる。材質は、例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ラテックス、ゼラチン、金属コロイド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート等の従来公知のものが何ら制限なく使用できる。
【００４９】
固定化ＰＲＰｓは、一般的に、ＰＲＰｓが緩衝液等の水溶液に溶解しているＰＲＰｓ溶液と不溶性担体を一定時間接触させることにより、ＰＲＰｓを該不溶性担体に結合させることにより製造される。固定化ＰＲＰｓ製造時の溶液のｐＨは一定の範囲内に（例えば、ｐＨ６〜９）保つことが好ましく、この目的のために、緩衝液中でＰＲＰｓと不溶性担体を接触させることが好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が使用できる。具体的なＰＲＰｓと不溶性担体を接触させる方法として、例えば、ＰＲＰｓ溶液を調製し、該ＰＲＰｓ溶液と不溶性担体を４〜５６℃にて、２分以上接触させる、という方法を示すことができる。ＰＲＰｓの好適な濃度は、０．００１〜５ｍｇ／ｍLの範囲である。前記の［遊離のＰＲＰｓを使用する方法］で述べたように、唾液から精製したＰＲＰｓをＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で分析し、実際のＰＲＰｓ濃度を算出し、上記の好適な濃度範囲となるようにすれば良い。
【００５０】
固定化ＰＲＰｓを使用する具体的な方法として、例えば、ラテックス粒子にＰＲＰｓを担持させた固定化ＰＲＰｓ（以下、感作粒子という場合がある）と口腔内レンサ球菌を含む被検体を混合し、ラテックス粒子の凝集による濁度変化により口腔内レンサ球菌を測定するラテックス凝集法が挙げられる。
【００５１】
別の測定法として、例えば、標識ＰＲＰｓを使用する方法を示すことができる。該方法は固定化ＰＲＰｓと標識ＰＲＰｓを組合わせて、口腔内レンサ球菌を測定する方法である。標識物としては、遊離のＰＲＰｓを使用する方法で述べた、放射物質、酵素、蛍光色素、色素に加えて、着色粒子（金コロイド、炭素コロイド、着色ラテックス等）や標識物質（酵素、放射性物質等）を結合させたラテックス粒子等の不溶性担体も使用することができる。着色粒子や標識物質を結合させたラテックス粒子等にＰＲＰｓを担持させたものは、固定化ＰＲＰｓであると同時に標識ＰＲＰｓでもあると言える。
【００５２】
具体的な測定法としては、例えば、膜、イムノプレート等の不溶性担体にＰＲＰｓを担持させた固定化ＰＲＰｓに、被検体中の口腔内レンサ球菌を結合させ、次いで標識ＰＲＰｓを更に結合させて、固定化ＰＲＰｓ−口腔内レンサ球菌−標識ＰＲＰｓのサンドイッチ複合体を形成させて標識物の量を測定する方法を示すことが示すことができる。このような方法の更に具体的な例として、ニトロセルロース等の膜にＰＲＰｓを担持させた固定化ＰＲＰｓと、着色コロイドまたは各種着色粒子等にＰＲＰｓを担持させた標識ＰＲＰｓを使用し色調の変化により測定する方法［標識ＰＲＰｓクロマト法（免疫クロマト法に準じた方法）］を挙げることができる。
【００５３】
固定化ＰＲＰｓを使用する方法は、遊離ＰＲＰｓを使用する方法に比べて、感度が高い、操作が簡便等の特徴を持つので、より好適な実施形態であるといえる。固定化ＰＲＰｓを使用する方法の中でも、上記説明した標識ＰＲＰｓクロマト法、ラテックス凝集法は、高感度、簡便、迅速に測定できるという特徴があり、特に好ましい実施形態である。
【００５４】
本発明の口腔内レンサ球菌の測定法とミュータンスレンサ球菌の測定法とを組合わせて齲蝕菌比率を算出する場合は、例えば、ミュータンスレンサ球菌の測定に免疫学的測定法を採用すれば、培養する必要がなく、迅速簡便に齲蝕菌比率が算出でき特に好適である。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００５６】
実施例１［標識ＰＲＰｓクロマト法による口腔内レンサ球菌の測定］
（１）ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の作製
ブレインハートインフージョン（以下、「ＢＨＩ」と略することもある；ＤＩＦＣＯ社）３．７ｇを１００ｍｌの超純水に溶解後、オートクレーブ処理し、ＢＨＩ液体培地を調製し、Ｉｎｇｂｒｉｔｔ（ストレプトコッカス・ミュータンス）を３７℃、１８時間、嫌気条件下で培養した。培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１００ｍＬのリン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ＰＢＳ」と略すこともある）に懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。
【００５７】
菌体沈殿をＰＢＳに懸濁しＡ６００＝１．０に調整し、Ｉｎｇｂｒｉｔｔの菌体懸濁液を調製した。なお、該菌体懸濁液を超音波処理後、適宜希釈した後にＢＨＩ培地プレート上に添加し、生じたコロニー数を計数し菌体懸濁液の希釈倍率を乗じることで該菌体懸濁液の菌体濃度を求めたところ、約１×１０９個／ｍＬであった。
【００５８】
免疫は以下のように実施した。
【００５９】
第１週は菌体懸濁液０．５ｍＬを、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第２週は該菌体懸濁液１．０ｍＬを、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第３週は菌体懸濁液２．０ｍＬを、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第４週は第３週と同様に免疫した。力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度により確認後、最終免疫より１週間後に、定法に従い採血しストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清を得た。
【００６０】
ＢＨＩ培地にて、上記（１）と同様の方法でＣｈａｌｌｉｓ（ストレプトコッカス・ゴルドニイ）を培養した後、ＰＢＳで洗浄し２×１０１２個／ｍＬ含む菌体懸濁液３０ｍｌを調製した。次いで該菌体懸濁液と、抗血清０．５ｍＬを混合し４℃、６０分反応した。混合液を４０００ｇ、５分遠心処理後上清を分取し、０．２２μｍフィルターで濾過した。
【００６１】
次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍＬのプロテインＡ−セファロース（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を充填したカラムに上清試料を添加し、５ｍＬのＰＢＳでカラムを洗浄後、５ｍＬの０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出し、直ちに１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。ＩｇＧの溶出画分は、Ａ２８０を測定することで確認した。０．５ｍＬの抗血清より、約５ｍｇの抗ストレプトコッカス・ミュータンスポリクローナル抗体を回収した。
（２）ＰＲＰｓの精製
複数の被験者にガムを噛ませることで１５０ｍＬの刺激唾液を採取した。刺激唾液を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収し、０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）に対して透析した（４℃、４８時間）。透析後、再度遠心分離することで不溶物を除去した。１００ｍＬのＤＥ５２（ワットマン社）を充填したカラムを緩衝液Ａで平衡化し、緩衝液Ａに対して透析した唾液をカラムにアプライし、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。次いで、塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで、カラムに結合した成分を溶出した。溶出は塩化ナトリウム濃度を直線的に０Ｍから０．４Ｍへ増加させることにより実施した。溶出液を２０ｍＬずつ分画し、各フラクション中のＰＲＰｓ量を以下のように測定した。
【００６２】
各フラクションを０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．０で１／２に希釈し、９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ社、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに０．０５ｍＬずつ添加し、４℃、１２時間放置し固定した後、イムノプレートから溶液を除去し、各ウェルを０．３ｍＬのＰＢＳで３回洗浄した。次いで、イムノプレートの各ウェルに、２％ＢＳＡ−０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を０．３ｍＬ添加し、３７℃、２時間放置した後、イムノプレートから２％ＢＳＡ−炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を除去し、０．３ｍＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次いで、１×１０８個／ｍＬに調整したＩｎｇｂｒｉｔｔのＰＢＳ懸濁液を各ウェルに０．０５ｍＬ添加し、３７℃で１時間放置した。イムノプレートから溶液を除去し、０．３ｍＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次いで、上記（１）で調製した抗ストレプトコッカス・ミュータンスポリクローナル抗体を１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて０．００１ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈し、イムノプレートの各ウェルに０．０５ｍＬ添加し、３７℃、１時間放置した後、イムノプレートから溶液を除去し、０．３ｍＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次いで、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体（ヤギ）（カッペル社）を、１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて０．０１ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈し、イムノプレートの各ウェルに０．０５ｍＬ添加し、３７℃、１時間放置した後、イムノプレートから溶液を除去し、０．３ｍＬ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次いで、発色基質溶液として、ｐ−ニトロフェニルリン酸の２−エタノールアミン水溶液（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社）を各ウェルに０．０５ｍＬずつ添加し、室温下２０分反応した。反応後、０．４ＭのＮａＯＨを各ウェルに０．０５ｍＬずつ添加し反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００６３】
上述の方法で各フラクション中のＰＲＰｓ量を測定し、ＰＲＰｓを含有するフラクションを回収し、緩衝液Ａで透析し、再度同様の条件にてＤＥ−５２カラム（５０ｍＬ）でイオン交換クロマトグラフィーを行ない、各フラクション（５ｍＬ）中のＰＲＰｓ量を測定し、ＰＲＰｓを含むフラクションを回収した。回収したフラクションをアミコンウルトラ−１５ １０ｋＤａ（ミリポア社）で１ｍＬに濃縮し、０．１Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．２で平衡化したセファクリルＳ−１００ ＨＲカラム（２ｃｍ×５０ｃｍ，ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）にアプライし、フラクションを分取した。各フラクション中のＰＲＰｓ量はイオン交換クロマトグラフィーの場合と同様の方法にて測定し、ＰＲＰｓを含有するフラクションを回収し、ＰＢＳに対し透析した後、アミコンウルトラ−１５で濃縮しＰＲＰｓ溶液を調製した。
（３）精製ＰＲＰｓの分析
（２）で調製したＰＲＰｓ溶液のＰＲＰｓ含量とプロリン含量、等電点を、それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、アミノ酸分析法、等電点電気泳動法により調べた。
【００６４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて実施した。３枚のゲルによりＰＲＰｓを電気泳動し、泳動後のゲルを、１枚はクマシーブリリアントブルーで染色し、１枚はＰＡＳ染色を行なった。残りの１枚は、後述するアミノ酸分析に使用した。クマシーブリリアントブルー染色の結果、全タンパク質バンドに対しＰＲＰｓのタンパク質バンド（分子量１０−３０ｋＤａ）の占める割合は９０％であることが分かった。ＰＡＳ染色の結果、分子量１０−３０ｋＤａのバンドはＰＡＳ染色陽性であり、糖鎖を含有することが分かった。
【００６５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜（イモビロン，ミリポア社）にゲルからタンパク質バンドを転写した。ＰＶＤＦ膜上の分子量１０−３０ｋＤａのタンパク質バンドを切り出し、イオン交換水でよく洗浄した。切り出したＰＶＤＦ膜中に含まれるタンパク質（ＰＲＰｓ）を塩酸で加水分解し、常法に従ってアミノ酸分析を行なったところ、プロリン含量は約２０％であった。
【００６６】
等電点電気泳動は、２％アンフォライン ｐＨ３．５〜１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を含む１０％ポリアクリルアミドゲルにより実施した。クマシーブリリアントブルー染色の結果、ＰＲＰｓの等電点はｐＨ２〜５の範囲内であることが確認できた。
【００６７】
上記（２）の精製過程での分析と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＰＡＳ染色）、アミノ酸分析、等電点電気泳動の結果から、今回精製したＰＲＰｓは、糖タンパク質であり、口腔内レンサ球菌に結合し、プロリン含有量が１０％以上、酸性の等電点を有していることが確認できた。
（４）口腔内レンサ球菌測定用標識ＰＲＰｓ法ストリップの作製
ａ）金コロイド標識ＰＲＰｓの調製
コロイド粒径が４０ｎｍの市販金コロイド溶液（Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）１０ｍＬに１００ｍＭＫ２ＣＯ３を８８μＬ添加し、ｐＨを９．０に調製後、０．２２μｍフィルター処理した。金コロイド溶液の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ５２０＝１．０であった。
【００６８】
次いで、ＰＲＰｓ濃度１ｍｇ／ｍＬに調整したＰＲＰｓ溶液６４μＬを、上記金コロイド溶液に撹拌しながら添加し、室温下５分放置した。次いで、１０％スキムミルク−２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１．１ｍＬ撹拌しながら添加し（スキムミルク終濃度１％）、室温下３０分放置した。次いで、反応溶液を１０℃、１００００ｇ、３０分遠心処理し、上清を除去後、２ｍＬの２ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、下層の金コロイド画分を再懸濁した。得られた金コロイド画分（以下、「金コロイド標識ＰＲＰｓ」と表記することもある）は、４℃にて保存した。
【００６９】
ｂ）標識ＰＲＰｓクロマト法ストリップの作製
ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＨＦ７５、２５ｍｍ×６ｍｍ）からなる展開メンブレン上の検出ライン上に、ＰＲＰｓ濃度２ｍｇ／ｍＬのＰＲＰｓ溶液１μＬをスポットし、インキュベーター内で３７℃、６０分乾燥しＰＲＰｓを固定化した。該ＰＲＰｓ固定化メンブレンを１％スキムミルク−０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００水溶液中で室温下、５分振とうした。次いで、該メンブレンを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温下、１０分振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。
【００７０】
また、コンジュゲートパッド（ミリポア社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。該コンジュゲートパッドにＡ５２０＝１．０に調整した金コロイド標識ＰＲＰｓを２５μＬ添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。更に、サンプルパッド（ミリポア社、１７ｍｍ×６ｍｍ）を１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。尚、吸収パッド（ミリポア社、２０ｍｍ×６ｍｍ）は未処理のまま用いた。
【００７１】
このように調製した、図１に示すような標識ＰＲＰｓクロマト法ストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図２に示すような標識ＰＲＰｓクロマト法ストリップを組み立てた。
（５）〔被検体の調製〕
被験者にガムを５分間噛ませ、分泌された唾液を採取し、２０秒間、６０Ｗで超音波処理することで被検体を得た。
（６）〔培養法による被検体中の口腔内レンサ球菌の測定〕
上記（５）の方法に従い得られた被検体を適宜希釈して、１００μＬをＭＳ固体培地上に添加し、３７℃、嫌気条件下、４８時間培養した。ＭＳ培地上に生じるコロニー数を計数し、被検体液の希釈率から、口腔内レンサ球菌濃度を個／ｍＬとして算出した。
（７）〔標識ＰＲＰｓクロマト法ストリップによる被検体中の口腔内レンサ球菌の測定〕
上記（４）にて作製した標識ＰＲＰｓクロマト法ストリップを用いて、被検体中の口腔内レンサ球菌数の測定を実施した。上記（６）で使用した被検体のそれぞれ０．１ｍＬに１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液を０．０１ｍＬ添加し、１０分間室温で放置した後、１．０Ｍ塩酸溶液を０．０１ｍＬ添加し中和した。この被検体全量を標識ＰＲＰｓクロマト法ストリップのサンプルパッドに滴下し、１５分後のスポット発色強度を、４段階（＋＋＋：強い陽性、＋＋：陽性、＋：弱い陽性、−：陰性）に識別した結果と、（６）の培養法により得られた口腔内レンサ球菌数とを比較した。結果を表１に示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】
表１に示したように、培養法により得られた口腔内レンサ球菌濃度と相関するスポット発色強度が得られた。本発明の口腔内レンサ球菌の測定法により、被検体中の口腔内レンサ球菌を迅速且つ濃度依存的に検出可能であった。
【００７４】
実施例２［ラテックス凝集法による口腔内レンサ球菌の測定］
（１）ＰＲＰｓ感作ラテックス粒子の調製
実施例１（２）で調製したＰＲＰｓ溶液を希釈し、ＰＲＰｓ濃度０．５ｍｇ／ｍＬに調整した。このＰＲＰｓ溶液１ｍＬに０．５％のポリスチレンラテックス粒子（ＪＳＲ社）１ｍＬを加え、室温で１時間放置し、次いで、１％ウシ血清アルブミン溶液を０．５ｍＬ添加し、室温で１時間放置した。遠心分離によりＰＲＰｓの結合したラテックス粒子を単離し、０．０５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（以下緩衝液Ｂとよぶ場合がある）で１回洗浄し、抗体固定化ラテックス粒子が０．５％となるように緩衝液Ｂで懸濁した。
（２）ＰＲＰｓ感作ラテックス粒子による口腔内レンサ球菌の測定
実施例１で使用した被検体を実施例１（７）と同様の方法により前処理を行なった。前処理済み被検体にＰＲＰｓ感作ラテックス粒子懸濁液を０．１ｍＬ添加、混合し、室温で３０分放置後、ラテックス粒子の凝集を目視で観察し、結果を４段階（＋＋＋：強い凝集、＋＋：やや強い凝集、＋：弱い凝集、−：凝集せず）に識別した結果を表２に示す。
【００７５】
【表２】
【００７６】
ＰＲＰｓ感作ラテックス粒子によるラテックス凝集法によっても、被検体中の口腔内レンサ球菌を迅速且つ濃度依存的に検出可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本図は、本発明の口腔内レンサ球菌測定法で使用する標識ＰＲＰｓクロマト法で使用するストリップの各部材の概略図である。
【図２】本図は、本発明の口腔内レンサ球菌測定法で使用する標識ＰＲＰｓクロマト法で使用するストリップの各部材の側面図である。
【符号の説明】
【００７８】
１・・・ストリップ
２・・・サンプルパッド
３・・・コンジュゲートパッド
４・・・展開メンブレン
５・・・吸収パッド
６・・・検出ライン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔内に存在する微生物、具体的には口腔内レンサ球菌の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、ミュータンスレンサ球菌と呼ばれる一群の乳酸発酵性細菌が、齲蝕発症に深く関わっていることが知られている。
【０００３】
これらミュータンスレンサ球菌群は、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ、血清型ａ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ、血清型ｂ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、血清型ｃ、ｅ、ｆ）、ストレプトコッカス・フェルス（Ｓ．ｆｅｒｕｓ、血清型ｃ）、ストレプトコッカス・マカカ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ、血清型ｃ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ、血清型ｄ、ｇ）、ストレプトコッカス・ドウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｙ、血清型ｈ）として、血清学的、遺伝学的に異なる７種の型に分類されている。
【０００４】
従来、これらミュータンスレンサ球菌の唾液中の濃度が１０５〜１０６個／ｍＬの場合には、齲蝕の危険あり、１０６個／ｍＬ以上の場合は特に危険であると言われており、人の口腔内におけるミュータンスレンサ球菌の存在量を知ることで、その人の齲蝕危険度の判定を行なうことが可能である。一般に、これらミュータンスレンサ球菌の濃度は、バシトラシンを入れた培地を用いて唾液中のミュータンスレンサ球菌を選択的に培養してコロニー数を調べることにより測定されている（そのための測定キットも市販されている）。そして、唾液中の各ミュータンスレンサ球菌の濃度についても、同様に培養を行なって得られたコロニーの中から各菌のコロニーを同定し、その数を調べることにより知ることができる。なお、同定の方法としては、糖発酵試験等の生化学的方法、ＤＮＡプローブを用いる遺伝学的方法、血清型特異的抗体を用いる免疫学的方法等が知られている。
【０００５】
近年、ミュータンスレンサ球菌の中でヒトの口腔に存在するのは主にストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスの２菌種であることが明らかとなった。特に、ストレプトコッカス・ミュータンスはヒト口腔から高頻度に分離され（９割以上の人から分離される）、齲蝕の発生に深く関連することが判明した。
【０００６】
現在、口腔内のミュータンスレンサ球菌の測定法としては培養法が広く実施されている。しかし、培養法は、培養操作が不可欠であること、更に分離したコロニーの形態からの菌種の同定には熟練した手技が必要であることから、検査時間および操作の煩雑さの点で問題があったが、近年、各種モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法が報告された。これらの方法は培養する必要が無く、検出に要する時間が大幅に短縮できるという利点がある（例えば非特許文献１参照）。
【０００７】
唾液中のミュータンスレンサ球菌数の測定結果は、唾液採取条件、唾液採取から測定までの保存条件等の影響を受ける。唾液中のミュータンスレンサ球菌数が同等であっても、唾液採取条件や保存条件を一定にしないと、ミュータンス菌数が変動してしまい、正確に齲蝕危険度の判定ができない場合がある。例えば、ミュータンスレンサ球菌測定に使用する被検体の採取は、通常はガム等の咀嚼物を口全体の歯をまんべんなく使って一定時間噛み、唾液を採取することで実施されるが、ガムを特定の部位のみで噛んでしまったり、ガムを噛む時間が短すぎたりすると、口腔内のミュータンスレンサ球菌が十分に採取できず本来のミュータンスレンサ球菌数より少ない菌数となる可能性がある。また、例えば、培養法で菌数を測定する場合は、唾液採取から測定までの保存条件によっては菌が死んでしまい、本来の菌数より少ない菌数となる可能性がある。
【０００８】
口腔内には、様々な細菌が存在しているが、最も多い菌群は、通性嫌気性菌のレンサ球菌で（以後、口腔内レンサ球菌と略す場合がある）、おおよそ全体の半分を占めているといわれている。口腔内レンサ球菌は多数の菌種の混合物であり、ミュータンスレンサ球菌も口腔内レンサ球菌に含まれる。これら口腔内レンサ球菌は、全ての人の口腔内に、一般的には唾液中に１０８個／ｍＬ程度存在すると言われている。
【０００９】
そこで、唾液中のミュータンスレンサ球菌数と口腔内レンサ球菌数とを測定し、ミュータンスレンサ球菌数を口腔内レンサ球菌数で除した値（以後齲蝕菌比率という場合がある）を算出することで、上記唾液採取や唾液保存による変動を補正する方法が知られている（例えば非特許文献２参照）。前記の理由等により、採取した唾液中のミュータンスレンサ球菌数が本来のミュータンスレンサ球菌数より少なくなってしまったとしても、口腔内レンサ球菌数も同様に減少するので、齲蝕菌比率を算出することで、サンプリング時の菌数のブレを補正することが可能である。この方法によれば、齲蝕菌比率が０．１〜１％の場合が齲蝕の危険小、１〜５％の場合が齲蝕の危険中、５％以上の場合が齲蝕の危険大というように、安定して齲蝕危険度を判定することが可能となるが、口腔内レンサ球菌は多種類の菌種の混合物であるため、迅速に測定できる免疫学的測定法で測定するためには、多数の抗体を準備する必要があるため非現実的であり、口腔内レンサ球菌の測定は、結果が判明するまで日数を要する培養法により実施されているという問題があった。迅速な口腔内レンサ球菌の測定方法が望まれていた。
【００１０】
【非特許文献１】大森かをる，私の愛すべき道具たち，デンタルダイヤモンド 第３１巻，２００６年，１１４−１１８
【非特許文献２】花田信弘監修，「ミュータンスレンサ球菌の臨床生物学」 第１版，クインセッテンス出版株式会社，２００３年，１５２−１６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、口腔内レンサ球菌を迅速簡便に測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は上記課題を解決するために、鋭意検討してきた。その結果、唾液中に存在する糖タンパク質であって、口腔内レンサ球菌に結合することが知られている酸性プロリンリッチタンパク（ａｃｉｄｉｃ Ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，以下ＰＲＰｓと略す場合がある）が、口腔内レンサ球菌に結合する性質を利用することで、口腔内レンサ球菌を迅速簡便に測定できることを見出した。そして、更に検討を進め、本発明を完成するに至った。
【００１３】
即ち、本発明は、酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌とを接触させることで酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌の結合物を形成させ、該酸性プロリンリッチタンパクとレンサ球菌の結合物の量を測定することを特徴とする口腔内レンサ球菌の測定方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の口腔内レンサ球菌の測定方法により、迅速簡便に口腔内レンレンサ球菌を測定することが可能となり、例えば、ミュータンスレンサ球菌の迅速な測定法（例えば免疫学的測定法）と組合わせることで、迅速に齲蝕菌比率を算出することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の口腔内レンサ球菌の測定法では、唾液中の糖タンパク質である酸性プロリンリッチタンパク（ＰＲＰｓ）の口腔内レンサ球菌に結合する性質を利用して、口腔内レンサ球菌を測定する。
【００１６】
本発明における口腔内レンサ球菌とは、口腔内に存在する通性嫌気性のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌で、ミティス−サリバリウス培地（以下、ＭＳ培地と略す場合がある）で嫌気培養した場合に生育してくる細菌を指す。具体的には、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・フェルス（Ｓ．ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ、）、ストレプトコッカス・ドウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｙ）等のミュータンスレンサ球菌、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓ．ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）等が該当する。
【００１７】
本発明の口腔内レンサ球菌の測定方法で使用する被検体としては、上記口腔内レンサ球菌を含有するものであれば制限なく使用できる。例えば、微生物の培養液、微生物の懸濁液、食品およびその懸濁液、または、唾液、血漿、血清、尿等の体液、或いは歯垢等が挙げられる。齲蝕菌比率を検査する場合には、唾液、歯垢が特に好適に使用される。なお、唾液及び歯垢は、被検体中にそれぞれ単独で含まれていてもよいし、混合物として含まれていてもよい。
【００１８】
例えば歯垢のみを含む被検体は、口腔内をうがい等により洗浄し唾液成分を除去した後に採取した歯垢を用いて調製すればよい。歯垢の採取は、口腔内の特定部位の歯垢をつまようじ、綿棒、スパチュラ等の従来公知の方法で採取することも出来るし、口腔内より無作為に採取することも出来る。このように採取された歯垢を緩衝液等の液体に懸濁し被検体とすればよい。
【００１９】
例えば、歯垢と唾液の混合物を被検体とする場合は、パラフィンペレット、ガム等の咀嚼物を３０秒〜１０分間噛ませ、分泌された唾液を吐き出させることにより採取できる。また、唾液のみを含む被検体液は、例えば、スポイト、ピペット等の従来公知の方法で採取された唾液を用いて調製することが出来る。採取された唾液は、そのまま或いは、緩衝液等の液体で適宜希釈して被検体とすればよい。
【００２０】
本発明で使用するＰＲＰｓとは、唾液中に存在する糖タンパク質で、以下の３つの特徴を有するものを指す（例えば、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ；５６巻；１９８８年；４３９−４４５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；６８巻；１９８９年；１３０３−１３０７）。１）口腔内レンサ球菌の表面に存在するレセプターに結合する、２）分子中にプロリンを多く含む（プロリン含有量が１０％以上、好適には１５％以上）、３）酸性の等電点（ｐＨ２−５）を有する。
【００２１】
以下ＰＲＰｓの特徴の確認方法を具体的に説明する。
【００２２】
口腔内レンサ球菌への結合は、例えば、酵素免疫測定法（以下ＥＬＩＳＡ法と略す場合がある）により確認することができる。ＥＬＩＳＡ法は、例えば、新生化学実験講座１２ 分子免疫学ＩＩＩ（東京科学同人 １９９０年）８８−９９ページ記載の方法に従って実施できる。具体的手順を以下に説明する。まず、一定量の精製したＰＲＰｓ溶液を９６穴イムノプレートに添加し、一定時間放置することで、溶出画分に含まれる物質をイムノプレートに吸着させ、さらにブロッキングを行う。次いで、口腔内レンサ球菌（例えばストレプトコッカス・ミュータンス）を一定量ウェルに添加すると、ウェルに固定化されたＰＲＰｓ量に比例した量の菌体が結合する。次いで、口腔内レンサ球菌に対する抗体（例えば抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体）を添加後、酵素標識した二次抗体を添加し、酵素活性を測定することで、精製したＰＲＰｓの口腔内レンサ球菌への結合が確認できる。
【００２３】
プロリン含有量は、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質ＩＩ（東京科学同人 １９９０年）２５−５３ページ記載の、タンパク質の組成分析法（アミノ酸分析法）に従って調べることができる。精製したＰＲＰｓを塩酸等で加水分解し、タンパク質中に含まれるアミノ酸を、逆相カラムクロマトグラフィー、またはイオン交換カラムクロマトグラフィーで分離定量することで、プロリン含量を求めれば良い。
【００２４】
ＰＲＰｓの等電点は、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質Ｉ（東京科学同人 １９９０年）３６１−３６４ページ記載の等電点電気泳動法により調べることができる。等電点電気泳動法はタンパク質の等電点により分画する方法なので、ＰＲＰｓと等電点マーカー（等電点既知の複数のタンパク質の混合物）を同時に等電点電気泳動法により分離し、電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルー等の色素でタンパク質を染色し、等電点マーカーとＰＲＰｓのタンパク質バンドの位置を確認することでＰＲＰｓの等電点を確認すれば良い。
【００２５】
ＰＲＰｓには、部分的にアミノ酸の置換、欠失、挿入等が生じた複数の分子種が存在することが知られている。従って、ＰＲＰｓは単一のアミノ酸配列を持つ糖タンパク質ではなく、前記１）〜３）の特徴を持つ複数の糖タンパク質の集団の総称であると言える。本発明のＰＲＰｓとしては、複数の分子種の混合物を用いても良いし、単一の分子種を用いても良い。
【００２６】
本発明で使用するＰＲＰｓは、例えば、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ；５６巻；１９８８年；４３９−４４５ページに記載されているように、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー等、タンパク質の精製で従来用いられているカラムクロマトグラフィー等の方法を組み合わせることで精製することができる。
【００２７】
上記公知の精製法で調製したＰＲＰｓは、通常、ＰＲＰｓに加えてＰＲＰｓ以外の唾液中に存在する成分（タンパク質等）を夾雑物として含有する場合が多い。ＰＲＰｓの精製に使用した唾液の種類、精製方法等により該夾雑物の種類、含量は変動するが、該夾雑物が、口腔内レンサ球菌に結合するというＰＲＰｓの作用を妨害することがない限り（具体的には、後述する口腔内レンサ球菌測定法に精製したＰＲＰｓを適応した場合に１０８個／ｍＬオーダーの口腔内レンサ球菌が検出可能であれば）唾液から精製したＰＲＰｓが夾雑物を含有していても、本発明のＰＲＰｓとして制限なく使用することができる。精製ＰＲＰｓ中の夾雑物が多いと、口腔内レンサ球菌の測定感度が低下する場合があるので、本発明に使用するＰＲＰｓは、ＰＲＰｓの含有率が５０％以上であることが望ましい。ＰＲＰｓの含有率が７０％以上であると、後述する固定化ＰＲＰｓ調製の容易さ等の理由から更に好適である。
【００２８】
精製ＰＲＰｓ中のＰＲＰｓ含有率は、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質Ｉ（東京科学同人 １９９０年）３５６−３８７ページ記載のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す場合がある）調べることができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは分子量により分画する方法なので、ＰＲＰｓ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、電気泳動後のゲル中のタンパク質をクマシーブリリアントブルー、アミドブラック等のタンパク質に結合する色素で染色し、全タンパク質バンドに対するＰＲＰｓバンドの占める割合を求めれば良い。一般的にＰＲＰｓの分子量は１万−３万であることが知られているので、全タンパク質バンドに対する分子量１万−３万のバンドの占める割合を求めれば良い。
【００２９】
以下、タンパク質に結合する色素による染色の具体的方法を、クマシーブリリアントブルーによる染色を例として説明する。電気泳動終了後のゲルを、タンパク質固定液（例えば、１０％トリクロロ酢酸、５０％メタノール−７％酢酸、等）に１０分〜２時間浸して、ゲル内のタンパク質を固定化する。次いで、ゲルを、タンパク質固定液にクマシーブリリアントブルーを０．１〜０．５％となるように溶解させた染色液中に１０分〜２時間浸しタンパク質を染色する。染色後のゲルを脱色液（例えば、５％メタノール−７％酢酸）に浸し、バックグランドの脱色を行なった後、タンパク質バンドを観察する。
【００３０】
電気泳動後のゲルの染色法としては、ＰＲＰｓは糖タンパク質であるので、上記のタンパク質に結合する色素による染色だけでなく、例えば、新生化学実験講座３ 糖質Ｉ（東京科学同人 １９９０年）７６３−７６７ページ記載の糖を染色する方法を採用しても良い。この場合、糖鎖を含有しないタンパク質は染色されないので、本染色法と上記タンパク質を染色する方法を組合わせることによって、タンパク質に糖鎖が含まれるかどうか（即ち糖タンパク質であるかどうか）を確認することができる。以下、代表的な糖鎖染色法である過ヨウ素酸シッフ染色（以下ＰＡＳ染色と略す場合がある）を例に、染色手順を具体的に説明する。電気泳動終了後のゲルを、タンパク質固定液（例えば、１０％トリクロロ酢酸、５０％メタノール−７％酢酸、等）に１０分〜２時間浸して、ゲル内のタンパク質を固定化する。次いで、ゲルを、酸化溶液（例えば、１％過ヨウ素酸水溶液）中に１０分〜１時間浸し、イオン交換水でゲルを洗浄する。次に、ゲルをシッフ試薬中に１０分〜１時間浸した後、還元溶液（例えば、０．５％メタ亜硫酸水素ナトリウム）中に１０分〜１時間浸す。最後にイオン交換水でゲルを洗浄し、糖鎖を含むタンパク質のバンドを観察する。ＰＡＳ染色で使用するシッフ試薬の代表的な調製方法を以下に示す。１ｇの塩基性フクシンを２００ｍＬの沸騰イオン交換水に溶解し、５０℃に冷却、濾過後、濾液に１Ｎ塩酸を２０ｍＬ添加し、２５℃にしてメタ亜硫酸水素ナトリウムを１ｇ添加、２４時間暗所に放置してから使用する。
【００３１】
夾雑物を含むＰＲＰｓ画分のプロリン含量を分析する目的でアミノ酸分析を行なう場合、夾雑物量が少なければ（例えば、前記ＰＲＰｓ含有率が９０％以上の場合）そのまま通法に従ってＰＲＰｓ画分を加水分解し、分析しても差し障りないが、夾雑物量が多い場合、ＰＲＰｓを更に精製し夾雑物を取り除いてからアミノ酸分析する必要がある。この場合は、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質ＩＩ（東京科学同人 １９９０年）２７−２８ページに記載されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＰＲＰｓと夾雑物を分離し、ゲルからＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した後、ＰＶＤＦ膜のＰＲＰｓのバンド部分のみを切り出し、加水分解後アミノ酸分析すれば良い。
【００３２】
以下、カラムクロマトグラフィーによる唾液からのＰＲＰｓの精製法を詳細に説明する。唾液は、例えば、ガム等の咀嚼物を噛ませ採取した刺激唾液が使用できる。最初に該唾液を遠心分離し不溶物を除去すると後のカラム操作が簡便になり好適である。次いでカラムクロマトグラフィーにより精製する。カラムクロマトグラフィーとしては、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質Ｉ（東京科学同人 １９９０年）１６１−３２７ページ記載の種々のカラムクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー等）が制限なく利用できる。これらカラムクロマトグラフィーは、原理の異なる方法を組み合わせて使用すると、ＰＲＰｓの純度が上がり好適である。ＰＲＰｓは前述したように等電点が酸性（ｐＨ２−５）で、分子量が１万−３万程度であるので、この性質を利用して精製すれば良く、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーとゲル濾過カラムクロマトグラフィーの組み合わせが好適である。
【００３３】
イオン交換カラムクロマトグラフィーには、例えば、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂等従来公知のイオン交換樹脂が制限なく使用することができる。イオン交換樹脂の具体例としては、ジエチルアミノエチル（以下ＤＥＡＥと略す場合がある）基、第四級アミノエチル基等のアニオン交換基、または、カルボキシメチル基、スルホプロピル基等のカチオン交換基を、セルロース、デキストラン、アガロース、親水性アクリルアミド系ポリマー、親水性ビニルポリマー等のクロマトグラフィー用樹脂に結合させたものを示すことができる。ＰＲＰｓの等電点が酸性であることから、アニオン交換樹脂を使用することが好適である。アニオン交換樹脂でも特にＤＥＡＥ基を有するアニオン交換樹脂を使うことが、ＰＲＰｓクロマトグラフィー操作の容易性、ＰＲＰｓの回収量の点から特に好適である。
【００３４】
ゲル濾過カラムクロマトグラフィーには、例えば、従来公知のゲル濾過用樹脂を制限なく使用することができる。ゲル濾過用樹脂を具体的に示すと、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、親水性アクリルアミド系ポリマー、親水性ビニルポリマー等が挙げられる。上述したようにＰＲＰｓの分子量は１万−３万なので、この範囲の分子量が分画範囲に含まれるゲル濾過用樹脂を選択すれば良い。
【００３５】
イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーの実施法は、従来公知の方法に従って実施すれば良い［例えば、新生化学実験講座１ タンパク質Ｉ（東京科学同人 １９９０年）１６９−１８４ページ、に記載の方法］。カラムクロマトグラフィーは、試料の安定性や、クロマトグラフィーの再現性の観点から、一定のｐＨで実施することが望ましく、この目的のために、カラム操作時には、緩衝液が使用されるのが一般的である。緩衝液としては、従来公知の緩衝液、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、重炭酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等、を制限なく使用することができる。緩衝液の濃度は、０．００１〜１Ｍの範囲が好適である。
【００３６】
イオン交換カラムクロマトグラフィーによるＰＲＰｓの精製法の具体例を以下に説明する。イオン交換樹脂を充填したカラムを開始緩衝液で平衡化する。開始緩衝液の濃度は、あまり高すぎるとＰＲＰｓのイオン交換樹脂への結合を阻害するので、０．００１〜０．２Ｍの範囲であることが好ましい。次いで、ＰＲＰｓを含有する試料をカラムを通過させ、ＰＲＰｓをイオン交換樹脂に結合させる。次いで、開始緩衝液をカラム容量の３〜２０倍程度流し、カラムを洗浄する。ＰＲＰｓの溶出は、カラムに流す緩衝液のｐＨ、塩濃度を変化させることにより実施する。塩濃度を変化させる方法は、ＰＲＰｓが変性する危険が少ないので、好適な方法である。開始緩衝液の緩衝物質（トリス、リン酸塩等）自身の濃度を上げても良いし、開始緩衝液に塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩を添加しても良い。このようにしてＰＲＰｓをカラムから溶出させて回収する。
【００３７】
溶出画分中のＰＲＰｓは、ＰＲＰｓが口腔内レンサ球菌に結合するという性質を利用して、従来公知の方法により、例えば、前述のＥＬＩＳＡ法により定量することができる。具体的手順を以下に説明する。まず、一定量の溶出画分を９６穴イムノプレートに添加し、一定時間放置することで、溶出画分に含まれる物質をイムノプレートに吸着させ、さらにブロッキングを行う。次いで、口腔内レンサ球菌（例えばストレプトコッカス・ミュータンス）を一定量ウェルに添加すると、ウェルに固定化されたＰＲＰｓ量に比例した量の菌体が結合する。次いで、口腔内レンサ球菌に対する抗体（例えば抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体）を添加後、酵素標識した二次抗体を添加し、酵素活性を測定することで、溶出画分内に存在するＰＲＰｓ量を評価することができる。
【００３８】
ゲル濾過カラムクロマトグラフィーによるＰＲＰｓの精製法の具体例を以下に説明する。ゲル濾過用樹脂を充填したカラムを緩衝液で平衡化する。緩衝液の濃度が、あまり低すぎるとタンパク質のゲル濾過用樹脂への非特異的吸着が起こる場合があるので、緩衝液の濃度は０．０１〜１Ｍの範囲であることが好ましい。ＰＲＰｓを含有する試料をカラムを通過させ分画する。溶出画分中のＰＲＰｓ量は上記イオン交換カラムクロマトグラフィーの場合と同様に、例えばＥＬＩＳＡ法により、測定することができる。
【００３９】
イオン交換カラムクロマトグラフィーとゲル濾過カラムクロマトグラフィーを行なう順番、回数等には特に制限はなく、唾液の量、種類、精製ＰＲＰｓの純度に応じて、適宜選択すれば良い。
【００４０】
イオン交換カラムクロマトグラフィーとゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより唾液から精製したＰＲＰｓは複数の分子種を含んでいる。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，２５５巻，１９８８年，１５−２１ページに記載されているように、カラムで精製したＰＲＰｓを等電点電気泳動法により精製すれば単一種のＰＲＰｓを調製することができる。
【００４１】
上記のようにカラムクロマトグラフィー、等電点電気泳動等により調製したＰＲＰｓを含む溶液を、例えば、中性付近（ｐＨ６〜８）の緩衝液（トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等）に対し透析し、ＰＲＰｓ溶液とすれば良い。
【００４２】
本発明では、上記のようにして調製した被検体とＰＲＰｓを接触させ、ＰＲＰｓと口腔内レンサ球菌の結合物を形成させる。唾液、歯垢中の口腔内レンサ球菌は、表面が歯垢（不溶性多糖）で覆われていたり、また、唾液中のタンパク質等が菌体表面に結合している場合があるので、そのまま本発明の測定方法の被検体として使用すると、歯垢や唾液中のタンパク質等が妨害し、ＰＲＰｓと口腔内レンサ球菌の結合物が形成されない場合がある。このため、特に、被検体が唾液または歯垢である場合には、前処理を行い、歯垢及び／又は唾液中のタンパク質等を被検体中の口腔内レンサ球菌菌体表面から取り除く必要がある。
【００４３】
前処理は、一般的にタンパク質の変性方法や不溶性多糖の可溶化法として知られている方法により実施することができ、例えば、生化学実験講座４ 糖質の化学（上）（東京化学同人 第一版 １９７６年）８１−２５８ページに記載されている不溶性多糖の可溶化法（抽出法）に従って実施できる。具体例として、アルカリ処理、酸処理、界面活性剤処理、変性剤処理等が表示でき、具体的な操作方法として、アルカリ処理の場合には、０．０５〜５Ｍの水酸化ナトリウム、または水酸化カリウム溶液中で、酸処理としては０．１Ｍ〜５Ｍの塩酸、または酢酸溶液中で、界面活性剤処理の場合は、０．０１％〜１０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルコール酸ナトリウム等のイオン性界面活性剤、またはトリトンＸ−１００、ツイーン２０等の非イオン性界面活性剤の溶液中で、変性剤処理の場合は１〜８Ｍの塩酸グアニジン、または尿素溶液中で、４℃〜１２０℃にて５分〜２４時間放置するという方法等が例示できる。
【００４４】
上記の方法中、アルカリ処理、酸処理は、反応後、緩衝液、酸、アルカリ等を添加しｐＨを中性に調製するという操作を行なうだけで本発明の測定方法に供することができるので、特に好適である。例えば、アルカリ処理の場合は、反応後に、塩酸、酢酸、クエン酸等の酸を添加することでｐＨを６〜８程度に調整すれば良い。また、酸処理の場合には、反応後に、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を添加することでｐＨを６〜８程度に調整すればよい。
【００４５】
本発明の口腔内レンサ球菌の測定法では、前記のように調製したＰＲＰｓと口腔内レンサ球菌を含む被検体とを接触させ、ＰＲＰｓとレンサ球菌の結合物を形成させ、該ＰＲＰｓと口腔内レンサ球菌の結合物の量を測定することで、口腔内レンサ球菌の量を測定する。ＰＲＰｓと口腔内レンサ球菌の接触、ＰＲＰｓと口腔内レンサ球菌の結合物の測定は、従来公知の種々の免疫学的測定法に準じて実施することができる［例えば、新生化学実験講座１２ 分子免疫学III 抗原・抗体・補体（東京化学同人 第一版 １９９２年）３３−１２５ページ］。従来の免疫学的測定法において抗体を使用しているところをＰＲＰｓに置きかえれば、従来の免疫学的測定方法と同様に実施することができる。
【００４６】
以下好適な方法について説明する。
［遊離のＰＲＰｓを使用する方法］
該方法は、不溶性担体にＰＲＰｓを担持させることなく口腔内レンサ球菌を測定する方法である。具体例として、口腔内レンサ球菌を含む被検体と遊離ＰＲＰｓを混合し、口腔内レンサ球菌の凝集による濁度の変化で口腔内レンサ球菌を定量する方法（凝集法）、または、口腔内レンサ球菌を含む被検体と放射性物質、酵素、蛍光色素、色素等で標識したＰＲＰｓとを混合し、遠心分離により沈殿を回収することで、口腔内レンサ球菌に結合しなかった遊離の標識ＰＲＰｓを除去し、最終的に、口腔内レンサ球菌に結合した標識ＰＲＰｓの標識物の量、すなわち標識物質に由来する放射活性、酵素活性、蛍光強度、着色（色調の変化）等を測定することによって、被検体中の口腔内レンサ球菌を検出、定量する方法（標識ＰＲＰｓ法）等が挙げられる。遊離のＰＲＰｓを使用する方法で使用する好適なＰＲＰｓ量は、ＰＲＰｓと被検体と混合した後の懸濁液中の濃度が０．００１〜５ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００４７】
前記のように公知の精製法により調製したＰＲＰｓ画分は、通常ＰＲＰｓ以外の夾雑物を含有するため、ＰＲＰｓ画分のタンパク質量を測定しただけでは実際のＰＲＰｓ濃度が不明である。このような場合には、例えば、前述のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより夾雑物の含有率を確認し、ＰＲＰｓ画分のタンパク質量と該夾雑物含有率からＰＲＰｓ画分中の実際のＰＲＰｓ濃度を算出し、このようにして算出した実際のＰＲＰｓの濃度が前記の好適な範囲になるようにＰＲＰｓ濃度を調整すれば良い。
［固定化ＰＲＰｓを使用する方法］
該方法は、不溶性担体にＰＲＰｓを担持させた固定化ＰＲＰｓを使用して口腔内レンサ球菌を測定する方法である。
【００４８】
不溶性担体としては、形状は、例えば、膜、粒子、プレート、試験管等の従来公知のものが特に制限なく使用できる。材質は、例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ラテックス、ゼラチン、金属コロイド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート等の従来公知のものが何ら制限なく使用できる。
【００４９】
固定化ＰＲＰｓは、一般的に、ＰＲＰｓが緩衝液等の水溶液に溶解しているＰＲＰｓ溶液と不溶性担体を一定時間接触させることにより、ＰＲＰｓを該不溶性担体に結合させることにより製造される。固定化ＰＲＰｓ製造時の溶液のｐＨは一定の範囲内に（例えば、ｐＨ６〜９）保つことが好ましく、この目的のために、緩衝液中でＰＲＰｓと不溶性担体を接触させることが好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が使用できる。具体的なＰＲＰｓと不溶性担体を接触させる方法として、例えば、ＰＲＰｓ溶液を調製し、該ＰＲＰｓ溶液と不溶性担体を４〜５６℃にて、２分以上接触させる、という方法を示すことができる。ＰＲＰｓの好適な濃度は、０．００１〜５ｍｇ／ｍLの範囲である。前記の［遊離のＰＲＰｓを使用する方法］で述べたように、唾液から精製したＰＲＰｓをＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で分析し、実際のＰＲＰｓ濃度を算出し、上記の好適な濃度範囲となるようにすれば良い。
【００５０】
固定化ＰＲＰｓを使用する具体的な方法として、例えば、ラテックス粒子にＰＲＰｓを担持させた固定化ＰＲＰｓ（以下、感作粒子という場合がある）と口腔内レンサ球菌を含む被検体を混合し、ラテックス粒子の凝集による濁度変化により口腔内レンサ球菌を測定するラテックス凝集法が挙げられる。
【００５１】
別の測定法として、例えば、標識ＰＲＰｓを使用する方法を示すことができる。該方法は固定化ＰＲＰｓと標識ＰＲＰｓを組合わせて、口腔内レンサ球菌を測定する方法である。標識物としては、遊離のＰＲＰｓを使用する方法で述べた、放射物質、酵素、蛍光色素、色素に加えて、着色粒子（金コロイド、炭素コロイド、着色ラテックス等）や標識物質（酵素、放射性物質等）を結合させたラテックス粒子等の不溶性担体も使用することができる。着色粒子や標識物質を結合させたラテックス粒子等にＰＲＰｓを担持させたものは、固定化ＰＲＰｓであると同時に標識ＰＲＰｓでもあると言える。
【００５２】
具体的な測定法としては、例えば、膜、イムノプレート等の不溶性担体にＰＲＰｓを担持させた固定化ＰＲＰｓに、被検体中の口腔内レンサ球菌を結合させ、次いで標識ＰＲＰｓを更に結合させて、固定化ＰＲＰｓ−口腔内レンサ球菌−標識ＰＲＰｓのサンドイッチ複合体を形成させて標識物の量を測定する方法を示すことが示すことができる。このような方法の更に具体的な例として、ニトロセルロース等の膜にＰＲＰｓを担持させた固定化ＰＲＰｓと、着色コロイドまたは各種着色粒子等にＰＲＰｓを担持させた標識ＰＲＰｓを使用し色調の変化により測定する方法［標識ＰＲＰｓクロマト法（免疫クロマト法に準じた方法）］を挙げることができる。
【００５３】
固定化ＰＲＰｓを使用する方法は、遊離ＰＲＰｓを使用する方法に比べて、感度が高い、操作が簡便等の特徴を持つので、より好適な実施形態であるといえる。固定化ＰＲＰｓを使用する方法の中でも、上記説明した標識ＰＲＰｓクロマト法、ラテックス凝集法は、高感度、簡便、迅速に測定できるという特徴があり、特に好ましい実施形態である。
【００５４】
本発明の口腔内レンサ球菌の測定法とミュータンスレンサ球菌の測定法とを組合わせて齲蝕菌比率を算出する場合は、例えば、ミュータンスレンサ球菌の測定に免疫学的測定法を採用すれば、培養する必要がなく、迅速簡便に齲蝕菌比率が算出でき特に好適である。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００５６】
実施例１［標識ＰＲＰｓクロマト法による口腔内レンサ球菌の測定］
（１）ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の作製
ブレインハートインフージョン（以下、「ＢＨＩ」と略することもある；ＤＩＦＣＯ社）３．７ｇを１００ｍｌの超純水に溶解後、オートクレーブ処理し、ＢＨＩ液体培地を調製し、Ｉｎｇｂｒｉｔｔ（ストレプトコッカス・ミュータンス）を３７℃、１８時間、嫌気条件下で培養した。培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１００ｍＬのリン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ＰＢＳ」と略すこともある）に懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。
【００５７】
菌体沈殿をＰＢＳに懸濁しＡ６００＝１．０に調整し、Ｉｎｇｂｒｉｔｔの菌体懸濁液を調製した。なお、該菌体懸濁液を超音波処理後、適宜希釈した後にＢＨＩ培地プレート上に添加し、生じたコロニー数を計数し菌体懸濁液の希釈倍率を乗じることで該菌体懸濁液の菌体濃度を求めたところ、約１×１０９個／ｍＬであった。
【００５８】
免疫は以下のように実施した。
【００５９】
第１週は菌体懸濁液０．５ｍＬを、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第２週は該菌体懸濁液１．０ｍＬを、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第３週は菌体懸濁液２．０ｍＬを、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第４週は第３週と同様に免疫した。力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度により確認後、最終免疫より１週間後に、定法に従い採血しストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清を得た。
【００６０】
ＢＨＩ培地にて、上記（１）と同様の方法でＣｈａｌｌｉｓ（ストレプトコッカス・ゴルドニイ）を培養した後、ＰＢＳで洗浄し２×１０１２個／ｍＬ含む菌体懸濁液３０ｍｌを調製した。次いで該菌体懸濁液と、抗血清０．５ｍＬを混合し４℃、６０分反応した。混合液を４０００ｇ、５分遠心処理後上清を分取し、０．２２μｍフィルターで濾過した。
【００６１】
次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍＬのプロテインＡ−セファロース（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を充填したカラムに上清試料を添加し、５ｍＬのＰＢＳでカラムを洗浄後、５ｍＬの０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出し、直ちに１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。ＩｇＧの溶出画分は、Ａ２８０を測定することで確認した。０．５ｍＬの抗血清より、約５ｍｇの抗ストレプトコッカス・ミュータンスポリクローナル抗体を回収した。
（２）ＰＲＰｓの精製
複数の被験者にガムを噛ませることで１５０ｍＬの刺激唾液を採取した。刺激唾液を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収し、０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）に対して透析した（４℃、４８時間）。透析後、再度遠心分離することで不溶物を除去した。１００ｍＬのＤＥ５２（ワットマン社）を充填したカラムを緩衝液Ａで平衡化し、緩衝液Ａに対して透析した唾液をカラムにアプライし、カラムを緩衝液Ａで洗浄した。次いで、塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａで、カラムに結合した成分を溶出した。溶出は塩化ナトリウム濃度を直線的に０Ｍから０．４Ｍへ増加させることにより実施した。溶出液を２０ｍＬずつ分画し、各フラクション中のＰＲＰｓ量を以下のように測定した。
【００６２】
各フラクションを０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．０で１／２に希釈し、９６穴イムノプレート（Ｎｕｎｃ社、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに０．０５ｍＬずつ添加し、４℃、１２時間放置し固定した後、イムノプレートから溶液を除去し、各ウェルを０．３ｍＬのＰＢＳで３回洗浄した。次いで、イムノプレートの各ウェルに、２％ＢＳＡ−０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を０．３ｍＬ添加し、３７℃、２時間放置した後、イムノプレートから２％ＢＳＡ−炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を除去し、０．３ｍＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次いで、１×１０８個／ｍＬに調整したＩｎｇｂｒｉｔｔのＰＢＳ懸濁液を各ウェルに０．０５ｍＬ添加し、３７℃で１時間放置した。イムノプレートから溶液を除去し、０．３ｍＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次いで、上記（１）で調製した抗ストレプトコッカス・ミュータンスポリクローナル抗体を１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて０．００１ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈し、イムノプレートの各ウェルに０．０５ｍＬ添加し、３７℃、１時間放置した後、イムノプレートから溶液を除去し、０．３ｍＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次いで、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）ポリクローナル抗体（ヤギ）（カッペル社）を、１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて０．０１ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈し、イムノプレートの各ウェルに０．０５ｍＬ添加し、３７℃、１時間放置した後、イムノプレートから溶液を除去し、０．３ｍＬ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次いで、発色基質溶液として、ｐ−ニトロフェニルリン酸の２−エタノールアミン水溶液（バイオ・ラッド ラボラトリーズ社）を各ウェルに０．０５ｍＬずつ添加し、室温下２０分反応した。反応後、０．４ＭのＮａＯＨを各ウェルに０．０５ｍＬずつ添加し反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００６３】
上述の方法で各フラクション中のＰＲＰｓ量を測定し、ＰＲＰｓを含有するフラクションを回収し、緩衝液Ａで透析し、再度同様の条件にてＤＥ−５２カラム（５０ｍＬ）でイオン交換クロマトグラフィーを行ない、各フラクション（５ｍＬ）中のＰＲＰｓ量を測定し、ＰＲＰｓを含むフラクションを回収した。回収したフラクションをアミコンウルトラ−１５ １０ｋＤａ（ミリポア社）で１ｍＬに濃縮し、０．１Ｍ 塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．２で平衡化したセファクリルＳ−１００ ＨＲカラム（２ｃｍ×５０ｃｍ，ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）にアプライし、フラクションを分取した。各フラクション中のＰＲＰｓ量はイオン交換クロマトグラフィーの場合と同様の方法にて測定し、ＰＲＰｓを含有するフラクションを回収し、ＰＢＳに対し透析した後、アミコンウルトラ−１５で濃縮しＰＲＰｓ溶液を調製した。
（３）精製ＰＲＰｓの分析
（２）で調製したＰＲＰｓ溶液のＰＲＰｓ含量とプロリン含量、等電点を、それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、アミノ酸分析法、等電点電気泳動法により調べた。
【００６４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて実施した。３枚のゲルによりＰＲＰｓを電気泳動し、泳動後のゲルを、１枚はクマシーブリリアントブルーで染色し、１枚はＰＡＳ染色を行なった。残りの１枚は、後述するアミノ酸分析に使用した。クマシーブリリアントブルー染色の結果、全タンパク質バンドに対しＰＲＰｓのタンパク質バンド（分子量１０−３０ｋＤａ）の占める割合は９０％であることが分かった。ＰＡＳ染色の結果、分子量１０−３０ｋＤａのバンドはＰＡＳ染色陽性であり、糖鎖を含有することが分かった。
【００６５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜（イモビロン，ミリポア社）にゲルからタンパク質バンドを転写した。ＰＶＤＦ膜上の分子量１０−３０ｋＤａのタンパク質バンドを切り出し、イオン交換水でよく洗浄した。切り出したＰＶＤＦ膜中に含まれるタンパク質（ＰＲＰｓ）を塩酸で加水分解し、常法に従ってアミノ酸分析を行なったところ、プロリン含量は約２０％であった。
【００６６】
等電点電気泳動は、２％アンフォライン ｐＨ３．５〜１０（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社）を含む１０％ポリアクリルアミドゲルにより実施した。クマシーブリリアントブルー染色の結果、ＰＲＰｓの等電点はｐＨ２〜５の範囲内であることが確認できた。
【００６７】
上記（２）の精製過程での分析と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＰＡＳ染色）、アミノ酸分析、等電点電気泳動の結果から、今回精製したＰＲＰｓは、糖タンパク質であり、口腔内レンサ球菌に結合し、プロリン含有量が１０％以上、酸性の等電点を有していることが確認できた。
（４）口腔内レンサ球菌測定用標識ＰＲＰｓ法ストリップの作製
ａ）金コロイド標識ＰＲＰｓの調製
コロイド粒径が４０ｎｍの市販金コロイド溶液（Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）１０ｍＬに１００ｍＭＫ２ＣＯ３を８８μＬ添加し、ｐＨを９．０に調製後、０．２２μｍフィルター処理した。金コロイド溶液の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ５２０＝１．０であった。
【００６８】
次いで、ＰＲＰｓ濃度１ｍｇ／ｍＬに調整したＰＲＰｓ溶液６４μＬを、上記金コロイド溶液に撹拌しながら添加し、室温下５分放置した。次いで、１０％スキムミルク−２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１．１ｍＬ撹拌しながら添加し（スキムミルク終濃度１％）、室温下３０分放置した。次いで、反応溶液を１０℃、１００００ｇ、３０分遠心処理し、上清を除去後、２ｍＬの２ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、下層の金コロイド画分を再懸濁した。得られた金コロイド画分（以下、「金コロイド標識ＰＲＰｓ」と表記することもある）は、４℃にて保存した。
【００６９】
ｂ）標識ＰＲＰｓクロマト法ストリップの作製
ニトロセルロースメンブレン（ミリポア社、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＨＦ７５、２５ｍｍ×６ｍｍ）からなる展開メンブレン上の検出ライン上に、ＰＲＰｓ濃度２ｍｇ／ｍＬのＰＲＰｓ溶液１μＬをスポットし、インキュベーター内で３７℃、６０分乾燥しＰＲＰｓを固定化した。該ＰＲＰｓ固定化メンブレンを１％スキムミルク−０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００水溶液中で室温下、５分振とうした。次いで、該メンブレンを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温下、１０分振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。
【００７０】
また、コンジュゲートパッド（ミリポア社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。該コンジュゲートパッドにＡ５２０＝１．０に調整した金コロイド標識ＰＲＰｓを２５μＬ添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。更に、サンプルパッド（ミリポア社、１７ｍｍ×６ｍｍ）を１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。尚、吸収パッド（ミリポア社、２０ｍｍ×６ｍｍ）は未処理のまま用いた。
【００７１】
このように調製した、図１に示すような標識ＰＲＰｓクロマト法ストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図２に示すような標識ＰＲＰｓクロマト法ストリップを組み立てた。
（５）〔被検体の調製〕
被験者にガムを５分間噛ませ、分泌された唾液を採取し、２０秒間、６０Ｗで超音波処理することで被検体を得た。
（６）〔培養法による被検体中の口腔内レンサ球菌の測定〕
上記（５）の方法に従い得られた被検体を適宜希釈して、１００μＬをＭＳ固体培地上に添加し、３７℃、嫌気条件下、４８時間培養した。ＭＳ培地上に生じるコロニー数を計数し、被検体液の希釈率から、口腔内レンサ球菌濃度を個／ｍＬとして算出した。
（７）〔標識ＰＲＰｓクロマト法ストリップによる被検体中の口腔内レンサ球菌の測定〕
上記（４）にて作製した標識ＰＲＰｓクロマト法ストリップを用いて、被検体中の口腔内レンサ球菌数の測定を実施した。上記（６）で使用した被検体のそれぞれ０．１ｍＬに１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液を０．０１ｍＬ添加し、１０分間室温で放置した後、１．０Ｍ塩酸溶液を０．０１ｍＬ添加し中和した。この被検体全量を標識ＰＲＰｓクロマト法ストリップのサンプルパッドに滴下し、１５分後のスポット発色強度を、４段階（＋＋＋：強い陽性、＋＋：陽性、＋：弱い陽性、−：陰性）に識別した結果と、（６）の培養法により得られた口腔内レンサ球菌数とを比較した。結果を表１に示す。
【００７２】
【表１】
【００７３】
表１に示したように、培養法により得られた口腔内レンサ球菌濃度と相関するスポット発色強度が得られた。本発明の口腔内レンサ球菌の測定法により、被検体中の口腔内レンサ球菌を迅速且つ濃度依存的に検出可能であった。
【００７４】
実施例２［ラテックス凝集法による口腔内レンサ球菌の測定］
（１）ＰＲＰｓ感作ラテックス粒子の調製
実施例１（２）で調製したＰＲＰｓ溶液を希釈し、ＰＲＰｓ濃度０．５ｍｇ／ｍＬに調整した。このＰＲＰｓ溶液１ｍＬに０．５％のポリスチレンラテックス粒子（ＪＳＲ社）１ｍＬを加え、室温で１時間放置し、次いで、１％ウシ血清アルブミン溶液を０．５ｍＬ添加し、室温で１時間放置した。遠心分離によりＰＲＰｓの結合したラテックス粒子を単離し、０．０５Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（以下緩衝液Ｂとよぶ場合がある）で１回洗浄し、抗体固定化ラテックス粒子が０．５％となるように緩衝液Ｂで懸濁した。
（２）ＰＲＰｓ感作ラテックス粒子による口腔内レンサ球菌の測定
実施例１で使用した被検体を実施例１（７）と同様の方法により前処理を行なった。前処理済み被検体にＰＲＰｓ感作ラテックス粒子懸濁液を０．１ｍＬ添加、混合し、室温で３０分放置後、ラテックス粒子の凝集を目視で観察し、結果を４段階（＋＋＋：強い凝集、＋＋：やや強い凝集、＋：弱い凝集、−：凝集せず）に識別した結果を表２に示す。
【００７５】
【表２】
【００７６】
ＰＲＰｓ感作ラテックス粒子によるラテックス凝集法によっても、被検体中の口腔内レンサ球菌を迅速且つ濃度依存的に検出可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本図は、本発明の口腔内レンサ球菌測定法で使用する標識ＰＲＰｓクロマト法で使用するストリップの各部材の概略図である。
【図２】本図は、本発明の口腔内レンサ球菌測定法で使用する標識ＰＲＰｓクロマト法で使用するストリップの各部材の側面図である。
【符号の説明】
【００７８】
１・・・ストリップ
２・・・サンプルパッド
３・・・コンジュゲートパッド
４・・・展開メンブレン
５・・・吸収パッド
６・・・検出ライン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌とを接触させることで酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌の結合物を形成させ、該酸性プロリンリッチタンパクとレンサ球菌の結合物の量を測定することを特徴とする口腔内レンサ球菌の測定方法。
【請求項２】
不溶性担体に酸性プロリンリッチタンパクを担持させた固定化酸性プロリンリッチタンパクを使用することを特徴とする請求項１記載の口腔内レンサ球菌の測定方法。
【請求項３】
酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌の結合物量を、濁度または色調の変化で測定することを特徴とする請求項１または２記載の口腔内レンサ球菌の測定方法。
【請求項１】
酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌とを接触させることで酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌の結合物を形成させ、該酸性プロリンリッチタンパクとレンサ球菌の結合物の量を測定することを特徴とする口腔内レンサ球菌の測定方法。
【請求項２】
不溶性担体に酸性プロリンリッチタンパクを担持させた固定化酸性プロリンリッチタンパクを使用することを特徴とする請求項１記載の口腔内レンサ球菌の測定方法。
【請求項３】
酸性プロリンリッチタンパクと口腔内レンサ球菌の結合物量を、濁度または色調の変化で測定することを特徴とする請求項１または２記載の口腔内レンサ球菌の測定方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−１９５１９５（Ｐ２００９−１９５１９５Ａ）
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−４１７２８（Ｐ２００８−４１７２８）
【出願日】平成２０年２月２２日（２００８．２．２２）
【出願人】（３９１００３５７６）株式会社トクヤマデンタル (222)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２２日（２００８．２．２２）
【出願人】（３９１００３５７６）株式会社トクヤマデンタル (222)
【Ｆターム（参考）】
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