可溶性ＴＣＲ分子とその使用方法
本発明は、ＭＨＣ又はＨＬＡ複合体として存在するペプチド抗原を含む、細胞又は組織を検出するための組成物及び方法を開示するものである。本発明は、がん細胞を検出するための高感度な方法を提供することを含む幅広い適応を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、「可溶性ＴＣＲ分子とその使用方法」の名称で２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８，７９０号の優先権を主張するものであり、その全てを本明細書取り込む。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ＭＨＣ又はＨＬＡ複合体として存在するペプチド抗原を含む細胞又は組織を検出するための組成物及び方法を特徴とする。本発明は、がん細胞を検出するための感度の高い方法を提供することを含む広範な適用を有する。
【０００３】
（米国政府の権利に関する記載）
本発明は、米国立衛生研究所のグラント第１Ｒ４３ＣＡ８８６１５−０１号及び第１Ｒ４３ＣＡ１０５８１６−０１号に基づき、一部米国政府の助成を受けてなされたものであり、米国政府は本発明に関して所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
免疫療法は、がん治療のための有望な方法であるとの認識が増しており、インターロイキン２（ＩＬ−２）のようなサイトカインでの治療を含む様々な方法が提案されている。ＩＬ−２は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）及びＮＫ細胞を含む様々な免疫細胞種に影響を与えるものである。［文献１０及び４０参照］
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
効力を上げるために腫瘍部位にサイトカインを濃縮させることが提案されてきた。一般的な方法としては、サイトカイン又はそれをコードする遺伝子を腫瘍内へ直接注入すること、又はサイトカインを腫瘍抗原に特異的な抗体に融合させることによる標的化送達［文献２０参照］があるが、これらの方法には問題がある。
【０００６】
例えば、多くの直接注入法は、腫瘍が概して小さい（微小転移巣）特にがんの初期段階で使用するのが困難である。さらにこの方法は、治療の成功の見込みが殆どないにもかかわらず多大な労力を要するものである。当該方法による治療は、多くの患者にとって非実用的であり、費用の嵩むものである。
【０００７】
がんを治療する一つの方法として抗体とサイトカインの融合物が用いられてきたが、抗体の結合範囲には限りがあるため、当該方法も限られたものとなっている。すなわち、抗体は特定の細胞表面の抗原を認識することしかできないからである。残念乍ら、腫瘍抗原の多くは、抗体認識に都合よく提示されるわけではないので、抗体に基づく方法の可能性については限界がある。さらに、腫瘍に特異的な抗原の多くは、細胞型に特異的なタンパク質の異常発現に由来するとの報告があるが、これらは少数の腫瘍型にのみ存在するものである。当該問題は、抗体に基づいた治療の可能性をさらに限定するものである。
【０００８】
ｐ５３タンパク質は、細胞周期のＧ１／Ｓ期で異常細胞を拘束することにより作用することが報告されている、細胞内の腫瘍抑制因子である。そのタンパク質の過剰発現は、多くのヒト悪性腫瘍に対する重要な腫瘍マーカーであると信じられており、広い標的範囲を有する腫瘍免疫療法の良い標的であると認識されている。ｐ５３タンパク質は、通常、主要組織適合性複合体タンパク質（ＭＨＣ）として、細胞表面に提示される。このタンパク質複合体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲｓ）の結合標的であることが知られている。［文献４９参照］
【０００９】
ペプチドを含むＭＨＣ／ペプチド複合体を検出するために、ある種のＴＣＲｓを用いる試みがなされてきた（Epelら, 2002; Hollerら, 2003; Lebowitzら, 1999; Plaksinら, 1997; Watayaら, 2001; O'Herronら, 1997）が、これら、また、関連の方法には、重大な欠点がある。
【００１０】
例えば多くの方法において、おそらくは、ペプチド抗原のペプチド抗原に対する結合を人為的に促進するために、ＴＣＲ構築物を複合体化させる（すなわち、多様なＴＣＲコピーを持つようにデザインされる）ことが必要とされている。標的（抗原提示）細胞は一般に、比較的大量のペプチド抗原を発現するように操作されているが、ペプチド抗原の密度は、場合によっては、細胞当たりの複合体数が１０４〜１０５個と高くなる（Watayaら, 2001）。ペプチド抗原の密度が高いと、ＴＣＲでの結合及び検出が容易になると考えられているが、ペプチド抗原のこのようなレベルは人為的なものであり、腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）が存在するＭＨＣ／ペプチド複合体の通常のレベルよりは遙かに高くなっている。ＴＡＡｓによっては、ＨＬＡ／ペプチド複合体が一つの細胞当たり約５０未満しか存在しないものもある（Pascoloら, 2001; Schirleら, 2000）。従って、従来の方法は、全てではないにしても大部分のＴＡＡｓを検出するには感度が十分であるとは言えない、との認識がある。
【００１１】
ある種のＴＣＲｓを用いて特定のペプチド抗原を発現している細胞を検出する試みがなされてきたが、抗体に基づいた多くの方法と同様、これらの取り組みはペプチド抗原を検出するには感度が十分ではなかったか、又は抗原を完全には検出することができなかった。
【００１２】
例えば、Ｈｏｌｌｅｒら（２００３）は、ＭＨＣ／ペプチド複合体と反応することが報告されているある種の可溶性ＴＣＲｓの開発を報告した。そのＴＣＲｓは、人為的に抗原を「収容した（loaded）」細胞に於いては抗原を検出できたが、腫瘍細胞上の内因性の抗原を検出することはできなかった。Ｈｏｌｌｅｒらは、抗原が細胞当たり６００コピー未満の低い密度でしか存在しない場合には、ＴＣＲに基づいた方法は、抗原を検出する感度や信頼性が十分ではないと結論付けた。
【００１３】
ＴＣＲに基づいた特定の方法は、ＭＨＣ分子としてのウィルスペプチドを検出するために用いられてきた（Stromingerらの国際公開第９６１８１０５号公報）が、これら及び関連の方法には問題がある。例えば、ウィルス感染はしばしば例外的に、一つの細胞に通常１０００〜１０５個といった高い密度でＭＨＣ／ペプチド複合体を産生するものと一般的に認識されている。Ｈｅｒｂｅｒｔｓら（２００１）及びｖａｎ Ｅｌｓら（２０００）を参照されたい。他の多くのペプチド抗原の検出方法と同様に、これまでのＴＣＲに基づいたウィルス抗原を検出するための方法には、比較的多数の標的抗原が用いられてきた。
【００１４】
いくつかのＴＣＲに基づいた方法は比較的大量のペプチド抗原を検出するために用いられてきたが、サイトカイン、ＩｇＧ１のような免疫グロビン（immunoglobin）ドメイン、ビオチン、又はストレプトアビジンのようなその他の分子にＴＣＲが結合した場合に、その方法が機能するかどうかは、あまり確かではない。すなわち、特に低密度のＴＡＡを分析する必要がある場合に、その融合分子がＴＣＲペプチド結合溝に対してどのように影響するのかは明らかではない。ＴＣＲペプチド結合溝の小さな歪曲は、比較的多くのペプチド抗原を分析する際には必ずしも問題とはならないが、ＴＡＡ結合の特異性及び選択性を減少させている。ＴＣＲペプチド結合溝の機能に於けるわずかな変化でさえも、低密度のＴＡＡしか発現していないがん細胞の検出を危うくする可能性がある。
【００１５】
特に、ペプチド抗原が低密度にしか発現していない場合に、高感度で、選択性があり、再現性のあるＴＡＡｓを検出できる方法があれば、有用である。そのような方法がもし、検出可能な標識又はサイトカインに結合した分子を含む多様な可溶性ＴＣＲｓを用いるものであれば、特に有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、一般に、ＭＨＣ又はＨＬＡ複合体として細胞又は組織に存在しているペプチド抗原を含む細胞又は組織を検出するための方法に関する。ある態様に於いては、本発明は、以下の：
ａ）細胞又は組織を、存在しているペプチド抗原と可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が特異的な結合複合体を形成する条件下で、少なくとも一つの可溶性ＴＣＲ分子又はその機能性断片に接触させる、
ｂ）存在しているペプチド抗原に結合しなかったすべての可溶性ＴＣＲ分子又はその断片を取り除くのに適した条件下で、細胞又は組織を洗浄する、及び
ｃ）存在しているペプチド抗原を含む細胞又は組織の指標としての特異的な結合複合体を検出する、
工程のうち少なくとも一つ、好ましくはその全てを含む。
【００１７】
好ましい実施に於いて、本発明は、細胞又は組織上のペプチド抗原の量が、約１０００００コピーより少ない、好ましくは約１００から８００コピーのような１０００コピーより少ないものを検出するために利用される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の使用にはいくつかの利点があるが、例えば、本発明は、きわめて感度が高いので、内因性ペプチド、より特化すれば、操作されていない腫瘍細胞に存在する腫瘍関連ペプチド抗原を含む非常に低密度のＭＨＣ／ペプチド複合体を検出及び場合によっては定量するために利用される。一方、ＭＨＣ／ペプチド複合体を検出するための従来の方法は、相対的により高密度の複合体を検出できることが報告されている。
【００１９】
さらに、本発明は、例えば腫瘍組織アレイのような組織アレイに通常みられるような固定された細胞及び組織を検出及び場合によっては定量するために利用される。ＭＨＣ／ペプチド複合体を検出する能力（「染色」とも言う）は、特に患者から採取された細胞、組織又は他の生物学的試料の固定化が通常行われている臨床又はその他の医学的環境に於いて有用である。一方、非共有結合ペプチドは通常、組織を処理する工程で失われてしまうので、従来のＴＣＲに基づいた検出方法の多くは固定化された組織には適用できない。
【００２０】
本発明は、更なる利点を提供する。例えば、本発明の方法は、単量体及び／又は多量体の可溶性ＴＣＲ分子を使用する場合にも柔軟に適応されるものとなっている。従来の方法は残念乍ら、主に柔軟性と感度が限られている多量体のＴＣＲｓを使用するものであった。多量体のＴＣＲｓは特に、分解又は凝集能力、標的部位への到達性を欠くこと、免疫原性の増加びクリアランスのため、インビボ画像化に使用するのは難しい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の態様は、細胞の表面にＭＨＣ／ペプチド複合体として提示される内因性ペプチド抗原を検出する能力を提供することによって、当該分野で長らく待ち望まれてきたニーズに応えるものである。本発明の方法は、細胞の活性、病理、及び感染をモニターする助けとなる様々な重要な使用を有する。例えば、本発明による細胞又は組織の内因性腫瘍関連のペプチド抗原の検出は、がんの存在／存在範囲を検出及び及び場合によっては定量する方法を提供する。従来の態様に於いては、がん細胞の表面にあるタンパク質性抗原を検出する診断ツールとして抗体を利用してきたが、抗体は通常、細胞膜タンパク質の検出に限られたものとなっている。さらに、抗体による検出は、抗原が遊離する（shedding）又は抗原性タンパク質が循環系に分泌されるといった障害がある。抗体は又、標的の認識に限界がある。本発明の態様は、標的ペプチド抗原を検出するために可溶性ＴＣＲｓ及びその断片を使用する、高感度で信頼性のある検出方法を提供することによって、これら及び他の問題を回避するものである。
【００２２】
本発明のそのような使用及び利点は、インビボ（例えば、画像化又は診断法のような）又はインビトロ（例えば、組織アレイ又はＦＡＣＳ分析のような）を含む様々な状況に於いて、ペプチド抗原を検出するために用いることが可能である。
【００２３】
本発明のその他の態様は、下記考察の通りである。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
上記考察のように、本発明は一般に、ＭＨＣ複合体として細胞又は組織に提示されるペプチド抗原を含む細胞又は組織を検出するための方法を含む。ある態様では、本発明は、存在しているペプチド抗原と可溶性ＴＣＲ又はその断片が特異的に結合する複合体を形成する条件下で、少なくとも一つの可溶性ＴＣＲ分子又はその機能的断片と細胞又は組織を接触させること、存在しているペプチド抗原に結合しなかったすべての可溶性ＴＣＲ分子又はその断片を取り除くのに適した条件下で、細胞又は組織を洗浄すること、及び存在しているペプチド抗原を含む細胞又は組織の指標としての特異的な結合複合体を検出すること、を含む。
【００２５】
一般に、本可溶性ＴＣＲｓは、本明細書に開示されている手順及び認識されているＤＮＡ組み換え技術を用いての調製される。例えば、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡ切断、ＤＮＡの結紮、ＤＮＡの細胞内への導入、細胞の培養、並びに発現タンパク質の単離及び精製は、公知の技術である。一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. 1989)」；及びＡｕｓｕｂｅｌらの「Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York(1989)」を参照されたい。
【００２６】
様々な可溶性ＴＣＲ構築物の一般的な構造並びに同一物の作製及び使用の方法は、係属中の米国特許出願第０８／８１３，７８１号及び第０８／９４３，０８６号に開示されている。
【００２７】
例えば、特定の可溶性ＴＣＲは、少なくとも片方、好ましくは両方のＶ鎖に於いて膜貫通配列が除去されている異種二量体である。しかしながら便宜上、係属中の出願第０８／８１３，７８１号及び第０８／９４３，０８６号に報告されているように、一本鎖の（「ｓｃ−」）構築物を使うことが好まれる場合が多い。
【００２８】
簡潔に述べると、一本鎖の（「ｓｃ−」）ＴＣＲ分子は、適切なペプチドリンカー配列を介して共有結合しているＶ−α及びＶ−β鎖を含む。例えば、Ｖ−α鎖は、Ｖ−α鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末端に結合した適切なペプチドリンカー配列を介して、Ｖ−β鎖に共有結合できる。ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α及びＶ−β鎖は、一般にアミノ酸長が約２００から４００であり、好ましくはアミノ酸長が約３００から３５０であり、天然に存在するＴＣＲのＶ−α及びＶ−β鎖と、少なくとも９０％、好ましくは１００％同一である。「同一（identical）」という用語は、Ｖ−α又はＶ−β鎖のアミノ酸は、対応する天然に存在するＴＣＲのＶ−β又はＶ−α鎖と１００％相同（homologous）であることを意味する。
【００２９】
第０８／９４３，０８６号出願に開示されているように、ｓｃ−ＴＣＲ分子のＶ−α鎖はさらに、Ｖ−β鎖のＣ末端に結合したＣ−β鎖又はその断片を含むことができる。さらに、Ｖ−α鎖は、Ｖ−α鎖のＣ末端及びペプチドリンカー配列のＮ末端に、結合したＣ−α鎖又はその断片を含むことができる。一般に、Ｃ−β鎖断片を含む融合タンパク質に於いて、その断片はアミノ酸長が約５０から１３０であり、通常Ｃ−β鎖の最後のシステイン残基（マウスに於いては１２７位、ヒトに於いては１３１位）を含まない。Ｃ−α鎖を含む融合タンパク質では、その長さは、約１から９０アミノ酸（すなわち、最後のシステイン残基を含まないがそこまでのＣ−α鎖）の間で変化してもよい。例えば、ある態様に於いては、融合タンパク質は、１番目のアミノ酸から始まり７２番目までのアミノ酸長約１〜７２のＣ−α鎖断片を含む。別の態様に於いては、Ｃ−α鎖断片は、最初のアミノ酸から始まり２２番目（ロイシン）までのアミノ酸長約１〜２２である。Ｃ−α鎖断片は、通常、二つのシステイン残基を含んだＣα９０変異体及び一つのシステイン残基を含んだＣα７２変異体以外は、如何なるシステイン残基も含まない。Ｃα及びＣβ鎖長は、選択された特定のＶ鎖及び可溶性融合分子の使用目的を含むいくつかのパラメータを使用して選択される場合が多い。
【００３０】
さらに第０８／９４３，０８６号出願に開示されるように、本発明の追加のｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、Ｖ−α鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末端の間に最初のペプチドリンカー配列が結合する場合には、例えば、二つのペプチドリンカー配列を含む。Ｖ−β鎖のＣ末端は、Ｃ−β鎖断片のＮ末端に結合でき、そして２番目のペプチドリンカーは、Ｖ−β鎖又はＣ−β鎖断片のＣ末端又は、必要に応じて、以下に説明されるような標識分子に結合する。別の説明的な態様に於いては、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、Ｖ−β鎖又はそのＣ−β鎖断片のＣ末端と、Ｖ−α鎖のＮ末端を共有結合でつなぐ、適当なペプチドリンカーを介してＶ−β鎖をＶ−α鎖に結合することによって作製することができる。
【００３１】
本発明の可溶性ＴＣＲタンパク質は、一つ又はそれ以上の融合したタンパク質タグ（protain tag）を含むことができる。そのようなタグが「検出可能」である態様に於いて、可溶性ＴＣＲは、「検出可能に標識された」と言える。例えば、可溶性の融合タンパク質に関して、タンパク質タグは、ｓｃ−ＴＣＲのＶ−β鎖（又はＣ−β鎖断片）のＣ末端に結合可能である。必要に応じて、このような可溶性ＴＣＲタンパク質は、係属中の第０８／９４３，０８６号出願によって報告されているような、また、以下の実施例に於いてさらに説明されるような、免疫グロビン鎖に結合可能である。
【００３２】
本発明で使用される好ましい可溶性融合タンパク質は、完全に機能的で可溶性である。「完全に機能的」という用語又は同様の用語は、融合タンパク質が特異的にリガンドに結合することを意味する。このような特異的な結合を検出するためのアッセイは、本明細書に開示されており、また、ウェスタンブロットのような標準的なイムノブロット技術を含む。このような可溶性ＴＣＲｓの機能的断片は、ウェスタンブロットや表面プラズマ共鳴分析により決定される親和性で、対応する全長ＴＣＲの少なくとも７０％、好ましくは約８０から９０％、又はそれ以上で抗原に結合することができる。
【００３３】
適したＴＣＲ鎖の核酸及びタンパク質配列は、公開されている。例えば、「Fundamental Immunology,(1993)3ｒｄ Edi. W. Paul. Ed. Rsen Press Ltd. New York」；及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．らの「Sequences of Proteins of Immunological Interest (5ｔｈ Ed.) Public Health Services, National Institutes of Health(1991)」を参照されたい。又以下の実施例同様、係属中の第０８／８１３，７８１号及び第０８／９４３，０８６号出願を参照されたい。
【００３４】
本発明の特定の態様に於いて、本発明の方法はさらに細胞又は組織を少なくとも一つのブロッキング試薬に接触させることを含む。接触させる工程は、可溶性のＴＣＲ又はその断片と細胞との非特異的結合を減少させるため、工程ａ）の前、間、又は後、を含むどの時点で実施してもよい。本発明では、過酸化物、血清蛋白質、抗体又はその抗原結合断片のような、ほとんど全ての標準的ブロッキング試薬も利用できる。
【００３５】
ある態様に於いては、検出される細胞又は組織上のＭＨＣ複合体に対するＴＣＲの結合特異性を確定ことが有用である。その場合、本発明はさらに、複合体に結合できる可溶性ＴＣＲ又は断片に競合的及び特異的に結合する条件下で、特定の複合体（細胞又は組織上に存在する可溶性ＴＣＲとＭＨＣ複合体間に形成される）が、競合するＭＨＣ（又はＨＬＡ）分子若しくはその断片と接触させることを含む。様々な適応するＭＨＣ分子が公開されている。
【００３６】
本発明の方法の一つの態様では、競合ＭＨＣ分子又はその断片の添加により、可溶性ＴＣＲ又はその断片が競合ＭＨＣ分子又はその断片に結合して競合複合体を形成し、可溶性ＴＣＲ又はその断片の特異的な結合が減少、若しくは実質的に解消される。本発明の方法のある特定の態様に於いては、競合ＭＨＣ分子は、可溶性ＴＣＲに対する分子比率で０．０１〜１０００倍の濃度範囲、好ましくは１〜１００倍で添加される。他の態様では、競合ＭＨＣ分子は、可溶性ＴＣＲの特異的結合を減少させるのに十分な単一濃度（つまり、可溶性ＴＣＲに対する分子比率で１倍、１０倍、又は１００倍）で添加される。必要に応じて慣用的な方法の一つ又は何個かを組み合わせることにより、競合複合体を検出し、ＭＨＣ分子又は可溶性ＴＣＲの結合特異性を決定することができる。特定のＭＨＣ分子又はその断片は一本鎖であるが、多くの場合、米国特許第５，８６９，２７０号；第６，３０９，６４５号；及び係属中の出願第０９／８４８，１６４号に開示されているような、可溶性の異種二量体分子である。以下の実施例と同様、さらなる開示として国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号を参照されたい。典型的なＭＨＣ分子又はその断片は、ペプチド抗原を収容している。
【００３７】
本発明の実施に用いられるその他の可溶性ＴＣＲ及びＭＨＣ分子に関連する開示として、次の公開された米国特許出願「第２００２０１９８１４４号；第２００２００９１０７９号；第２００２００３４５１３号；第２００３０１７１５５２号；第２００３０１４４４７４号；第２００３００８２７１９号；及びそこに引用された参照文献」を参照されたい。
【００３８】
結合特異性を確定することが望まれる典型的な方法に於いて、ＴＣＲ分子又はその断片は、一つ又はそれ以上の標識で検出可能に標識される。適切な標識は、商業的に入手可能なモノクローナル抗体に特異的に結合されるＥＥ又はｍｙｃエピトープを含む。一般に、抗体、例えばモノクローナル抗体、によって特異的に結合できる様々なエピトープが、タンパク質タグとして供給される。他の適当な合成マトリクスは、その分子を特異的に結合できる結合抗体を有するものを含む。さらなる標識は、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、蛇毒（スネークヴェノム）又はトロンビン切断部位を有するものを含む。公開された国際特許出願ＷＯ９６／１３５９３を参照されたい。
【００３９】
ＴＣＲ分子又はその断片を検出可能に標識するための他の適当な標識は、ビオチン、ストレプトアビジン、例えばジフテリア毒素（ＤＴ）、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ポークウィード抗ウィルスタンパク質、又はゲロニンのような、例えば植物又は微生物を起源とする細胞毒を含む。そのような毒素の生物学的に活性な断片は当業者によく知られており、例えばＤＴのＡ鎖やリシンのＡ鎖を含む。さらに毒素は、例えばフォスフォリパーゼ酵素（例えばフォスフォリパーゼＣ）のような細胞表面で活性な試薬である。エフェクター又は標識を含むタンパク質を製造及び使用することに関連する公開として、Ｍｏｓｋａｕｇらの「J. Biol. Chem. 264, 15709 (1989)」； Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．らの「Cell 47, 641, 1986」; Pastanらの「Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem. 61, 331, (1992)」；「"Chimeric Toxins" Olsnes and Phil, Pharmac. Ther., 25, 355 (1982)」、「公開された国際特許出願ＷＯ ９４／２９３５０」；「公開された国際特許出願ＷＯ ９４／０４６８９」；及び「米国特許第５，６２０，９３９号」を参照されたい。ビオチン受容体の機能を有する標識の例は、Ｂｅｃｋｅｔｔ，Ｄ．らの「Protein Sci. 1999 Apr; 8(4):921-9」に記載されているように、ＢｉｒＡ標識である。以下の実施例にさらに述べられているように、ＢｉｒＡ標識の配列は、タンパク質のビオチン化を促進するためにＴＣＲ分子に含まれうる。さらに標識は、例えばビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、アドリアマイシン、ブレオマイシン、又はシスプラチンのような化学療法剤でありうる。
【００４０】
さらに標識は、診断又は画像化研究に適した、ヨウ素１３１、イットリウム９０、レニウム１８８、ヨウ素１２３、インジウム１１１、テクネチウム９９ｍ、ガリウム６７、タリウム２０１、又はビスマス２１２のような、放射性核種又はキレートであり得る。使用される放射性核種の中で、ガンマ放出体、陽電子放出体、Ｘ線放出体及び蛍光放出体は、局在のために適している、一方ベータ放出体やアルファ放出体も使用することができる。本発明の方法のための他の適当な放射性同位元素は、カドミウム１０９、アクチニウム２２５、アクチニウム２２７、アスタチン２１１、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３３、ジスプロジウム１６５、ジスプロジウム１６６、ビスマス２１２、ビスマス２１３、臭素７７、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０１、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀１０７、水銀２０３、レニウム１８６、レニウム１８８、テルリウム９９ｍ、テルリウム１２１ｍ、テルリウム１２２ｍ、テルリウム１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、フッ素１８、銀１１１、白金１９７、パラジウム１０９、銅６７、リン３２、リン３３、イットリウム９０、スカンジウム４７、サマリウム１５３、ルテニウム１７７、ロジウム１０５、プラセオジウム１４２、プラセオジウム１４３、プロメチウム１４９、テルビウム１６１、ホルミウム１６６、金１９８、金１９９、コバルト５７、コバルト５８、クロム５１、鉄５９、セレン７５、及びイッテルビウム１６９を含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、放射性同位元素は、１０から５０００ｋｅｖの範囲、より好ましくは、５０から１５００ｋｅｖ、最も好ましい場合は５０から５００ｋｅｖで放射するであろう。
【００４１】
適した陽電子放射体及び他の有用な放射性核種は、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、５１Ｍｎ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６２Ｚｎ、６３Ｚｎ、７０Ａｓ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、１１０Ｉｎ、１２０Ｉ、１２４Ｉ、１２２Ｘｅ、１２８Ｂａ、１３１Ｂａ、７Ｂｅ、２０４Ｂｉ、２０５Ｂｉ、２０６Ｂｉ、１４Ｃ、３６Ｃ、４８Ｃｒ、５１Ｃｒ、１５５Ｅｕ、１５３Ｇｄ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、３Ｈ、１１５ｍＩｎ、１８９Ｉｒ、１９１ｍＩｒ、１９２Ｉｒ、１９４Ｉｒ、５５Ｆｅ、５９Ｆｅ、１１９ｍＯｓ、４２Ｋ、２２６Ｒａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８２ｍＲｂ、４６Ｓｃ、４７Ｓｃ、７２Ｓｅ、１０５Ａｇ、２２Ｎａ、２４Ｎａ、８９Ｓｒ、３５Ｓ、３８Ｓ、１７７Ｔａ、９６Ｔｃ、２０１Ｔｌ、２０２Ｔｌ、１１３Ｓｎ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１６６Ｙｂ、１７４Ｙｂ、８８Ｙ、９０Ｙ、６２Ｚｎ及び６５Ｚｎを含むが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
適したキレートは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１−置換１，４，７−トリカルボキシメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン三酢酸（ＤＯ３Ａ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及び１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）を含むが、これらに限定されるものではない。更なるキレート配位子は、エチレンビス−（２−ヒドロキシ−フェニルグリシン）（ＥＨＰＧ）、及び５−Ｃ１−ＥＨＰＧ、５Ｂｒ−ＥＨＰＧ、５−Ｍｅ−ＥＨＰＧ、５ｔ−Ｂｕ−ＥＨＰＧ、及び５ｓｅｃ−Ｂｕ−ＥＨＰＧを含むその誘導体；ベンゾジエチレントリアミン五酢酸（ベンゾ−ＤＴＰＡ）及びジベンゾ−ＤＴＰＡ、フェニル−ＤＴＰＡ、ジフェニル−ＤＴＰＡ、ベンジル−ＤＴＰＡ、及びジベンジル−ＤＴＰＡを含むその誘導体；ビス−２（ヒドロキシベンジル）−エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）及びその誘導体；少なくとも３個の炭素原子、より好ましくは少なくとも６個、及び少なくとも２個のヘテロ原子（Ｏ及び／又はＮ）を含むマクロ環状化合物の種類であり、そのマクロ環状化合物は、単一環、又はヘテロ環要素とともに結合した、２個か３個の環、例えばベンゾ−ＤＯＴＡ、ジベンゾ−ＤＯＴＡ、及びベンゾ−ＮＯＴＡ（ここに於いて、ＮＯＴＡは、１，４，７−トリアザシクロノナンＮ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸である）、ベンゾ−ＴＥＴＡ、ベンゾ−ＤＯＴＭＡ（ここに於いて、ＤＯＴＭＡは１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチル四酢酸）である）、及びベンゾ−ＴＥＴＭＡ（ここに於いて、ＴＥＴＭＡは、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−（メチル四酢酸）である）；１，３−プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）及びトリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）の誘導体；１，５，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）−トリカテコレート（ＬＩＣＡＭ）及び１，３，５−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）アミノメチルベンゼン（ＭＥＣＡＭ）の誘導体を含むことができる；である。
【００４３】
他の適した標識は、ポリヒスチジン、蛍光標識、化学発光標識、核磁気共鳴活性標識、発色団標識、陽電子放射性断層撮影法（「ＰＥＴ」）による検出可能な陽電子放射性同位元素、β−ガラクトシダーゼや西洋わさびペルオキシダーゼを含むペルオキシダーゼのような酵素マーカー、ナノ粒子、常磁性金属イオン、造影剤、又は抗原性標識を含む。
【００４４】
適した蛍光標識は、１５２Ｅｕ標識、蛍光標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、オルトフタルアルデヒド標識、テキサスレッド標識、フルオレサミン標識、ランタナイドリン標識、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識のような蛍光タンパク質標識、又は量子ドット標識、を含みうるが、それらに限定されるものではない。化学発光標識の例は、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香性アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識、などを含む。
【００４５】
適した常磁性金属イオンは、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｇｄ３＋、Ｅｕ３＋、Ｄｙ３＋、Ｐｒ３＋、Ｃｒ３＋、Ｃｏ３＋、Ｆｅ３＋、Ｔｉ３＋、Ｔｂ３＋、Ｎｄ３＋、Ｓｍ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｐａ４＋、及びＥｕ２＋を含むが、それらに限定されるものではない。
【００４６】
使用できる酵素マーカーは、あらゆる容易に検出できる酵素活性又は酵素の基質を含む。そのような酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイド異性化酵素、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸異性化酵素、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、βガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェラーゼ、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００４７】
適したナノ粒子は、固体のコロイド状粒子、デンドリマー、リポソーム、ミセル、セラミック粒子、アルミナカプセル、乳化蝋又はＢｒｉｊ７２粒子、強磁性体粒子、金又は銀粒子、ポリ（ラクティック−コ−グリコリック）酸、ポリグリコリック酸、ポリＤ−又はＬ−乳酸、ポリカプロラクトン、又は血清アルブミンを含む生分解性粒子、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、又はポリ（ブチルシアノアクリレート）又はその誘導体を含む粒子、を含むが、それらに限定されるものではない。本発明のある出願に於いては、ポリエチレングリコール、多糖類、ポリペプチド、脂質、シリカ、などのような試薬で覆われたナノ粒子が、用いられうる。そのような覆われたナノ粒子は、吸収、バイオアベイラビリティ、組織分布、組織交差反応性、毒性、薬物動態／作用、又は腫瘍局在性を改善することができる。標的リガンドをナノ粒子に付着させる方法は、可溶性ＴＣＲをベースとした試薬に適用されうることが、記載されている（例えば、Ｎｏｂらの「J Pharm Sci.93:1980-92(2004)」を参照されたい）。
【００４８】
本発明の可溶性ＴＣＲｓは、単量体及び多量体ＴＣＲｓを含む。多量体ＴＣＲ分子は、ＴＣＲタンパク質が多量化を誘発するポリペプチドドメイン又はタグに融合されているものを含む。そのようなドメインは、タンパク質の二量化を促進する、免疫グロビン、ロイシンジッパー、ヘリックス・ターン・ヘリックス、及びバレル・バレルモチーフを含む。このようなタグは、抗体結合エピトープ、ストレプトアビジン結合ペプチド、６ｘＨｉｓモチーフ、ビオチンリガーゼ標的モチーフ、及びその類似物を含む。多量体ＴＣＲ分子は又、化学的にクロスリンクしている反応性アミノ酸又は多糖類を介して産生されるものを含む。このようなアミノ酸（多糖類）は、ＴＣＲ分子の中に本来備わっていることもあるし、遺伝子改変によって加えられることもある。多量体ＴＣＲｓは又、ここに記載されるような検出可能な標識を含んでも含まなくてもよい、他の分子（分子群）に付着することで産生されるものを含む。そのような接着分子は、ここに記載されるストレプトアビジン、ビオチン、抗体、プロテインＡ、又は、タンパク質、脂質及び多糖で覆われるても覆われていなくてもよいビーズ、ナノ粒子、固相表面、アレイ、マトリックスを含む足場、を含む。例えば、検出可能な標識がビオチンである様々な実施例に於いては、さらに、方法はＴＣＲ分子を多量体化するためにＴＣＲ分子とストレプトアビジンと結合することを含む。
【００４９】
本発明で開示されたいずれの標識も、特に目的のペプチド抗原が発現している細胞又は組織を検出するために、本発明の方法で用いられる可溶性ＴＣＲを検出可能に標識するために用いられうることは、高く評価されるであろう。
【００５０】
細胞や組織を「固定」するために、十分な変性剤に接触させた細胞や組織を使用した、ペプチド抗原の検出方法を提供することは、本発明の目的である。そのような試薬の例は、当該技術分野では公知であるが、ホルムアルデヒド（ホルマリン）、グルタルアルデヒド、メタノール、プロパノール等のようなアルコール、ベンゼン及びキシレンのような有機溶剤を含む。考察されるように、本発明の方法は、細胞や組織が固定されている場合に於いても、細胞上のＭＨＣ分子と同起源のペプチド抗原との相互作用を実質的に阻害しないことが見出された。このように本発明は、固定された細胞又は組織上で使用でき、このことより、構造的な完全性を保存し、本発明の方法の信頼性を高めることに役立っている。
【００５１】
従って、ある態様に於いて、本発明はさらに、細胞又は組織を少なくとも一つの変性剤に接触させることを含む。このような接触は、工程ａ）の前や細胞又は組織を変性（固定）させるときを含むほとんどあらゆる時期に実施することができる。
【００５２】
また考察されるように、本発明は、当該技術分野で組織アレイと呼ばれるもののようなアレイに於いて、細胞や組織を使用することに適している。すなわち本発明は、反復的な方法に於いて（臨床で直面するような）細胞や組織試料を選別するために必要な感度と信頼性を有している。そのようなアレイの多くは、米国特許第６，４６６，６９０号；第４，３８４，１９３号；第６，６０２，６６１号；第６，５９４，４３２号；第６，５６６，０６３号；第６，４０６，８４０号；第６，２４６，７８５号及びその参照文献に記載されているように、当該技術分野公知である。
【００５３】
従って、ある態様に於いて、本発明の方法はさらに、アレイに複数の細胞や組織を搭載することを含む。好ましくは、そのような細胞又は組織は、腫瘍細胞を含む（又は、からなる）ことが知られているか又は想定されている。本発明の方法は、細胞又は組織を含むアレイのそれぞれの要素に於いて実施される。必要ならば、本発明の方法は、アレイのそれぞれの要素について実質的に同時に実施される。ある態様に於いては、本発明の方法の工程ｃ）はさらに、アレイをスキャンすること、及び特異的な結合複合体の存在を示す画像情報を発生させることを含む。必要ならば、その工程はさらに、その情報をリアルタイムで利用者に出力すること及び画像情報の保存画像に必要に応じて見出しをつけてもよい、を含む。
【００５４】
本発明は、腫瘍関連ペプチド抗原又はＴＡＡｓと呼ばれるものを含む幅広い様々なペプチド抗原を検出するために用いられる。細胞又は組織は、本発明の方法に従って、懸濁、半懸濁又は固定することができる。
【００５５】
考察されるように、可溶性ＴＣＲ分子又はその断片は、少なくとも一つの単一鎖ＴＣＲを含むことができる、又は膜貫通ドメインを取り除くように組み換え操作されたもののようなヘテロ二量体構築物であってもよい。以下の実施例と同様、係属中の出願第０８／８１３，７８１号及び第０８／９４３，０８６号を参照されたい。このような可溶性ＴＣＲ分子又はその断片は、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素又はその触媒活性を有する断片、放射性核種、又は蛍光、燐光、若しくは化学発光分子で標識することを含む、本発明の概略のような一つ又はいくつかの組み合わせからなる方法によって、検出可能に標識することができる。公知の緑色（又は赤色）の蛍光タンパク質又はその断片も、その例に含まれる。
【００５６】
ある態様に於いて、可溶性ＴＣＲは、その分子が少なくとも一つのサイトカインに共有結合している単一鎖のＴＣＲである。そのようなサイトカインの例は、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子、ＩＦＮγ、ＩＦＮ−α及び類似物を含むが、それらに限定されるものではない。例として、可溶性ＴＣＲ分子又はその断片は、少なくとも一つ及び好ましくはサイトカイン又はその断片に共有結合したものを含む単一鎖ＴＣＲである。
【００５７】
その他の異形に於いて、可溶性ＴＣＲは、少なくとも一つの免疫グロブリン（immunoglobulin）ドメイン又はその断片に共有結合したものを含む、単一鎖ＴＣＲ又はその断片である。ある態様に於いては、単一鎖ＴＣＲ又はその断片は、ＩｇＧ１ドメイン又はその断片を含む配列に結合している。
さらに他の態様に於いて、ＭＨＣ複合体はＨＬＡ−Ａ２限定性（restricted）である。
【００５８】
例えば、可溶性ＴＣＲ又はその断片とペプチド抗原を含まない細胞との如何なる結合をも検出するためには、通常、対照を用いる方法が有用である。
本発明で使用される特定のペプチド抗原は、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）又はｐ５３（ａａ２６４〜２７２）を含む。
本発明の方法は、インビボ、エキソビボ、又はインビトロで実施することができる。
【００５９】
例えば、ＨＬＡタイピング（例えば、Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓの「Cellular and Molecular Immunology, page 328(W.B.Saunders Co.1991)」を参照されたい）は、本発明で実施可能である。インビボ画像化に適用するために、可溶性ＴＣＲは、望ましくはＴＣＲ若しくはその断片の結合に対して、公知の方法によりスキャンされる哺乳動物及び患者に投与できる、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、９９Ｔｃ）又は他の検出可能な標識を含む。そのような哺乳動物の分析は、例えば、免疫系の疾患及びがんを伴う望ましくないＡＰＣの発現を含む多くの疾患の診断及び治療に於いて助けとなるであろう。
【００６０】
本発明は又、このような腫瘍を有している又はその疑いのある患者に於いて、腫瘍関連ペプチド抗原を保持している腫瘍のインビボ画像化のために用いることができる。本発明の方法の実施に於いて、腫瘍上でペプチド／ＭＨＣ複合体として腫瘍関連ペプチド抗原に特異的に結合する、検出可能に標識された可溶性ＴＣＲ分子又はその断片を含有する組成物が、患者に投与される。組成物は、腫瘍部位へ蓄積するのに十分な時間、インビボで投与される。蓄積された組成物は、その後、腫瘍を画像化するために検出される。
【００６１】
ＴＣＲからなる組成物は、非経口（経静脈的に、経筋肉的に、皮下に、腫瘍内に、など）でその部位に、及び／又は、目的の組織、器官又は細胞に接近する経路で投与される。他の適用では、ＴＣＲを含む組成物は、鼻腔内に、経口的に、又は経皮的に投与される。
【００６２】
可溶性ＴＣＲの蓄積した組成物は、様々な方法によって検出される。これらは、在来型のシンチレーションカメラ、ガンマカメラ、直線スキャナー、ＰＥＴスキャナー、ＳＰＥＣＴスキャナー、ＭＲＩスキャナー、ＮＭＲスキャナー、超音波機器、Ｘ線機器、発光画像化システム、及び蛍光画像化システムから、なる群から選択された検出器によって検出することを含む。
【００６３】
本発明の画像化の方法はさらに、ある適用に於いて、腫瘍細胞又は腫瘍組織の検出を改良する可能性のある、前もって標的化する方法を包含する。この方法は、マルチステップ・プロトコールを使用する。例えば、標的のＴＣＲはアビジン又はビオチンのどちらかに結合され、その後、例えば、目的の腫瘍に局在化するような部位への注入により、投与される。その後、ビオチン又はアビジンのいずれかは（標的化の抗体に結合しているものに依存する）、標識を保持しながら、注入され、アビジン又はビオチンそれぞれに結合することにより、一次抗体の部位へ局在化する。代わりに他の相互作用する分子のペアで、ビオチン／ストレプトアビジン分子を置換することができる。いくつかの前もって標的化する方法は、ＴＣＲに基づいた試薬を前もって標的化するために用いられる抗体（Ｃｈａｎｇらの「Mol. Cancer Therap.1:553−563(2002)」を参照されたい）を開発してきた。
【００６４】
本発明は又、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を含む適用で、実施可能である。ＦＡＣＳは、可溶性ＴＣＲｓ又はその断片と標的細胞の相互作用を検出するために用いられる。例えば、可溶性ＴＣＲは、標準的方法に従って、ビオチン化され、例えば、標識されたｓｃ−ＴＣＲ四量体を形成するために、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＰＥ）と結合される。しかしながら、前述したように、多量体化はあまり必要とされない。ＦＡＣＳは、可溶性ＴＣＲと、Ｔ２細胞及び腫瘍細胞株のような適当な標的細胞との相互作用を定性的に測定するために用いられる。
【００６５】
以下の実施例は、遺伝子的にヒトＩＬ−２に結合する、ｐ５３アミノ酸残基２６４〜２７２番にわたる未変異のｐ５３ペプチドを認識する、一本鎖の可溶性ＨＬＡ−Ａ２．１限定性のＴＣＲを含む新規融合タンパク質の構築及び特徴を示す。分子のＩＬ−２部分のＩＬ−２受容体特異的な結合能や生物活性と同様に、ペプチドが収容されているＨＬＡ−Ａ２と、分子のＴＣＲ部分のペプチド特異的な結合が検討された。実施例は、これらのタイプのＴＣＲベースの融合タンパク質が、抗体ベースの標的化腫瘍療法に代わるものとして、又は抗体ベースの免疫サイトカインのようなその他の標的化腫瘍療法への付加的なものとして提供されることを示す。腫瘍を標的化するための分離及び識別方法が、相加的又は相乗的な抗腫瘍効果を示す可能性がある。
【００６６】
実施例はさらに、ＨＬＡ−Ａ２．１としてヒトｐ５３ペプチド（ａａ２６４〜２７２）を認識する、３つのドメインからなる可溶性のマウスｓｃＴＣＲの構築及び発現を示す。３つのドメインからなるｓｃＴＣＲは、ヒトＩＬ−２に結合して、哺乳動物の細胞で高発現され分泌される可溶性２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を産生する。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＴＣＲ部分は、ＭＨＣ限定性であり、ペプチド特異的抗原を結合する特性があり、ＩＬ−２部分がＩＬ−２受容体に結合し、そして、生物学的に活性である。その上、実施例はさらに、この融合タンパク質が、標的細胞とエフェクター細胞を結合させ、マウス内で好ましい薬物動態を示し、標的腫瘍細胞に結合可能であり、抗腫瘍効果を持つことを示す。それゆえ、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、抗体ベースの免疫療法では認識不可能であった、標的化免疫療法に向けての抗原のその他のレパートリーへのアクセスを提供するものである。ＴＣＲベースの治療は、抗体ベースの治療に変わるものとして、又はその他の標的化腫瘍療法に対する有用な付加的な療法となる。
【００６７】
本発明には、可溶性ＴＣＲが、ペプチド抗原を良好に検出できる十分な親和性を有していることが開示されている。特に、２６４ｓｃＴＣＲの親和性は、遺伝子操作されていない腫瘍細胞に結合する、また、標的細胞とエフェクター細胞を効果的に結合させるのに十分な親和性を有している。
【００６８】
腫瘍を治療するためのサイトカインの全身性投与をめぐって報告された問題は、血清の半減期が短いことと、これらタンパク質の毒性である。重要なのは、本発明の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質は、約３時間の見かけ上の血清半減期を有し、血液中に原型のまま残存するということである。このように２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質は、効果的にＩＬ−２の半減期を増大させ、血液中に原型のまま残存させる。このことは、当該タンパク質が免疫修飾がん療法のための新しい試薬であることを示唆している。実施例で用いられたより高濃度の投与量で、本発明の融合タンパク質の血清の半減期は、増大し［文献３、２５、３７及び３８参照］、それによりさらにその分子の腫瘍に対する効果が改善される。
【００６９】
腫瘍部位に濃縮されたＩＬ−２は、他のＩＬ−２反応性細胞と同様に、局所Ｔ細胞を活性化し、それによりエフェクター細胞を腫瘍部位へ集めるとの認識がある。このように、腫瘍部位にＩＬ−２を濃縮させることにより、本発明のＴＣＲ融合分子は、生来の免疫系のＮＫ細胞又は他のメンバーの活性化と同様に、様々なＴ細胞クローンの活性化と増殖を含む明確な免疫応答を増強する可能性がある。そのような多面的な抗腫瘍応答は、遠隔転移と同様に初期の腫瘍の撲滅により効果的であろう。
【００７０】
データは、ＴＣＲ及びサイトカインを含む生物学的に活性な２機能性分子を構築することが可能であることを示す。この融合タンパク質は、腫瘍細胞に結合でき、標的細胞とエフェクター細胞の結合を仲介し、妥当な薬物動態特性を持つ。ｐ５３とは別に、アップレギュレーションされ、腫瘍又はウィルス感染細胞上にＭＨＣとして提示されるその他の遺伝子産物も、標的として本発明のＴＣＲベースの免疫療法に用いることができる。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、又はＩＦＮαのようなその他の免疫修飾分子は、ＴＣＲに結合され、抗腫瘍又は抗ウィルス応答のためにその他のエフェクター細胞を活性化する。これらの新規ＴＣＲ融合物は、がんやウィルス感染の治療のための免疫療法の新しい分類を形成する。
【００７１】
「特異的結合」という用語又は類似の用語は、本明細書に開示された分子が他の分子に結合し、それにより特異的な結合対を形成すること、を意味する。しかしながら、この分子は、例えばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、移動度シフトアッセイ、酵素免疫アッセイ、競合アッセイ、飽和アッセイ、又は他の当該技術部分野公知のタンパク質結合アッセイによって決定されるようなその他の分子を認識、結合しない。一般的に、例えば分子間の特異的結合を検出するための方法については、上記のＡｕｓｕｂｅｌらの文献、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅの「Antibodies: A Laboratory Manual (1988)」及びそこに引用された参考文献を参照されたい。
【００７２】
「完全に可溶性の」という用語又はその類似の用語は、ＴＣＲについて述べれば、例えば細胞の培地といった水溶性緩衝液で、低Ｇでの遠心分離によってで容易に沈殿しないことを意味する。さらに、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、低濃度のアニオン性又は非イオン性の界面活性剤の存在下及び非存在下、約５〜３７℃より高い温度かつ中性付近のｐＨで、水溶液のままでいるならば、可溶性である。これらの条件下、可溶性タンパク質はしばしば、例えば約１０〜５０スベドベリ単位より小さい低い沈降価を有する。本明細書で言及される水溶液は、通常ｐＨ約５〜９を確立する緩衝化合物を含み、イオン強度の範囲が約２ｍＭ〜５００ｍＭである。プロテアーゼ阻害剤又は穏やかな非イオン性界面活性剤が加えられてもよく、必要であれば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなキャリアタンパク質が、数ｍｇ／ｍＬまで加えられてもよい。水性緩衝液の例としては、標準的なリン酸緩衝液生理食塩水、トリス緩衝液生理食塩水、又はその他の公知の緩衝液及び細胞の培地製剤を含む。
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、何ら本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７３】
ＴＣＲ融合タンパク質構築物の産生
ヒトＩＬ−２に融合したｐ５３ペプチド抗原に特異的な、３つのドメインをもつ、ＨＬＡ−Ａ２．１限定性マウスＴＣＲを含む融合タンパク質を産生した。ＴＣＲ融合タンパク質構築物として、ヒトｐ５３ペプチド（ａａ２６４〜２７２）に特異的なＴＣＲｓを産生するマウスＴ細胞株から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによりＶα及びＶβ／Ｃβ領域（region）を産生した。ＴＣＲα鎖（Ｖα３）可変領域のカルボキシル末端は、ＴＣＲの抗原結合部分を産生するために、柔軟なリンカー（Ｇ４Ｓ）４［文献２１参照］を介して、Ｖβ（Ｖβ３）のＮ末端に結合した。Ｖβドメインに直接結合するＣβドメインは、一本鎖の可溶性ＴＣＲ分子を産生するために、最終システイン直前のアミノ酸残基で切断して膜貫通及び細胞質ドメインを除去した（図１Ａ及び１Ｂ）。ヒトＩＬ−２を、短いリンカー（アミノ酸配列 ＶＮＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶ；配列番号１）を介してＴＣＲ部分に融合した。ＥＥ標識（アミノ酸配列ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ；配列番号２）［文献１１参照］は、必要であれば、ＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を抗ＥＥ標識ｍＡｂによって検出可能にするために、融合分子のＩＬ−２部分のすぐ下流に挿入した。ＣＭＶプロモータによって哺乳動物細胞の発現を駆動し、抗体の軽鎖のリーダー配列によって分泌を方向付け、Ｇ４１８耐性にて選別した。
【００７４】
図１を、以下に、詳細に説明する。
図１Ａは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のドメイン構造を模式的に示すものである。
図１Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のアミノ酸配列である。
融合タンパク質のそれぞれのドメインのアミノ酸番号を図中に示す。
【実施例２】
【００７５】
哺乳動物細胞に於けるＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の発現
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の性状を検討するために、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２構築物を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に安定に形質転換した。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を分泌する安定な形質転換体は、材料と方法の欄に記載されるようにＥＬＩＳＡアッセイを用いて選択した。これらのＥＬＩＳＡに於ける陽性シグナルは、形質転換した細胞が、抗マウスＴＣＲ及び抗ヒトＩＬ−２抗体両方ともに認識される２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を分泌していることを示し、更に分泌された２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２が形質転換した細胞内で、適切に集合し、折りたたまれていること、及び細胞から分泌されたときに原型のままで存在すること、を示唆している。
【００７６】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質は、免疫親和性クロマトグラフィで上清１リットル当たり約１．８ｍｇの収量で細胞上清から精製した。精製し融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色した。還元又は非還元条件下、主として存在する染色バンドは、このタンパク質の予想分子量に一致する約６０ｋＤａ（図２）に移動し、このことは融合タンパク質が細胞から分泌されるときに、予期されない分子内ジスルフィド結合を形成することなく原型のままでいることを示している。非還元ゲルに於ける大きなバンドは、融合タンパク質の２量体である。この結論は、大きなバンドは見かけ上、融合タンパク質の分子量の約２倍の分子量を有していること、そしてこのバンドは還元条件下では融合タンパク質の大きさに減少するという観察に基づいている。データは、形質転換されたＣＨＯ細胞は、予想された分子量の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を産生すること、そして適切に折りたたまれ、集合し、可溶性融合タンパク質として分泌されることを示している。
【００７７】
図２を、以下に、詳細に説明する。
ＣＨＯ細胞を、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２発現ベクターで安定に形質転換した。分泌された融合タンパク質は、免疫親和性クロマトグラフィで精製し、図の上部に示されるように還元又は非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。
【実施例３】
【００７８】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＴＣＲ部分のＭＨＣ／ペプチド結合能
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のペプチドを収容したＭＨＣへの結合能をフローサイトメトリーで測定した。ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）又はｐ５３（ａａ１４９〜１５７）（対照）ペプチドを収容したＴ２細胞を、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質で染色した。ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）を収容した細胞は、抗ＴＣＲ ＣβｍＡｂ又は抗ＩＬ−２検出抗体のいずれかでの検出で、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２により陽性に染色された。ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）対照ペプチドを収容した細胞は、抗ＴＣＲ ＣβｍＡｂ又は抗ＩＬ−２検出抗体のいずれによっても染色されなかった。ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）を収容したＴ２細胞が染色されないのは、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチドがＨＬＡ−Ａ２に対し結合不能であるためではないことを証明するために、ペプチドを収容していないＴ２細胞、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチドを収容したＴ２細胞又はｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチドを収容したＴ２細胞をそれぞれＢＢ７．２αＨＬＡ−Ａ２モノクローナル抗体で染色した。何れのｐ５３ペプチドを収容した細胞も、ペプチドを収容しなかった細胞に比べて強く染色された。このことは、両ペプチドはＨＬＡ−Ａ２分子に結合可能であることを示した（図３Ｃ）。また、Ｔ２細胞をＩＬ−２受容体について調べるために染色したが、ＩＬ−２受容体を発現していないことが分かった。これらのデータは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の結合が、融合タンパク質のＴＣＲ部分によって仲介されていることを示している。Ｔ２細胞が対照ペプチドを収容している場合に融合タンパク質によって染色されなかったこともまた、染色がＴＣＲ部分を介してなされること、及び、染色が適切なペプチドに特異的であることを示している。これらのデータは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＴＣＲ部分がその特異的なペプチドをＨＬＡ−Ａ２として認識することが可能であることを示している。
【００７９】
図３を、以下に、詳細に説明する。ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチド（灰色の線）又はｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチド（黒い線）を収容したＴ２細胞は、
図３Ａ）２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質及び抗ＴＣＲ ＣβｍＡｂで染色されているか、又は
図３Ｂ）２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質及び抗ＩＬ−２ｍＡｂで染色されているかの何れかである。
図３Ｃ）ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチド（暗い灰色の線）を収容したＴ２細胞、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチド（明るい灰色の線）を収容したＴ２細胞、又はペプチドを収容していない（黒い線）Ｔ２細胞は、抗ＨＬＡ−Ａ２ ＢＢ７．２ｍＡｂで、次いでＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧで染色した。影をつけたピークは、染色されていないＴ２細胞である。
【実施例４】
【００８０】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分のＩＬ−２受容体結合能
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分のＩＬ−２受容体結合能は、フローサイトメトリーによって検討された。マウス初代脾臓細胞を単離し、Ｔ細胞芽細胞を産生するために、ｒＩＬ−２及び抗ＣＤ３で刺激した。ＩＬ−２受容体を発現する刺激した脾臓細胞は、ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）を収容したＨＬＡ−Ａ２四量体で、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在下でのみ陽性に染色された（図４Ａ）。同様に、ＣＴＬＬ−２マウス細胞傷害性のＴリンパ細胞は、恒常的にＩＬ−２受容体を発現しているが、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質により、陽性に染色されたが、２６４ｓｃＴＣＲ／κ融合タンパク質では染色されなかった（図４Ｂ）。ＣＴＬＬ−２細胞をα−ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体又はアイソタイプの対照抗体、次いで２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２とインキュベートすると、細胞をブロッキング抗体とインキュベートしたときには染色は実質的に減少したが、アイソタイプの対照抗体では減少しなかった。２６４ｓｃＴＣＲ／マウスκ鎖融合タンパク質又はＩＬ−２受容体ブロッキング抗体とインキュベートしたＣＴＬＬ−２細胞からシグナルが欠如したことは、これらの細胞の染色が２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分によって仲介されていることを示している。これらのデータは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分が、ＩＬ−２受容体に結合できることを示唆している。
【００８１】
図４を、以下に、詳細に説明する。
図４Ａ）マウス脾臓細胞を、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３εｍＡｂで刺激し、その後、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在下（灰色の線）又は非存在下（黒い線）でインキュベートした。結合した融合タンパク質は、ＰＥ標識したＨＬＡ−Ａ２ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）四量体で検出された。
図４Ｂ）ＣＴＬＬ−２細胞を、α−ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体又はアイソタイプの対照抗体、次いで２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２又は２６４ｓｃＴＣＲ／κ融合タンパク質とインキュベートした。結合した融合タンパク質は、ＰＥ標識したα−ＴＣＲ−Ｖβ３抗体で検出した。影のついたピークは、染色されていないＣＴＬＬ−２細胞である。
黒い線：２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２だけで染色したＣＴＬＬ−２細胞。
灰色の点線：対照抗体に次いで２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２で染色したＣＴＬＬ−２細胞。
明るい灰色の線：α−ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体、次いで２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２でインキュベートしたＣＴＬＬ−２細胞。
暗い灰色の線：２６４ｓｃＴＣＲ／κ融合タンパク質で染色したＣＴＬＬ−２細胞。
黒いダッシュの線：α−ＴＣＲ-Ｖβで染色したＣＴＬＬ−２細胞。
【実施例５】
【００８２】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の生物学的活性
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分の生物学的活性を実証するため、ＩＬ−２依存性のＣＴＬＬ−２細胞を、様々な濃度の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２又は組み換えＩＬ−２のいずれかと共に培養し、細胞の生存率をＷＳＴ−１を用いて評価した。図５Ａに示されるように、ｒＩＬ−２又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２のＣＴＬＬ−２細胞の増殖を支援する能力は、投与量依存性であり、ここに於いて、組み換えＩＬ−２又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２のいずれかをより高濃度にしたときに、より多くの細胞増殖がみられた。さらに、組み換えＩＬ−２又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２のいずれかを同等モル量を使用したとき、細胞の増殖は同様のレベルであった。特異性に対する更なる対照として、ＣＴＬＬ−２細胞を、α−ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体又はアイソタイプの対照とともに２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２とインキュベートした。培養物にブロッキング抗体が含まれた場合、増殖はブロッキング抗体の濃度の減少とともに実質的に減少したが、ＣＴＬＬ−２細胞の増殖は、いずれの濃度の対照抗体の影響も受けなかった（図５Ｂ）。このデータは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２のＩＬ−２部分がインビトロで組み換えＩＬ−２と同様な生物学的活性を有すること、及び融合タンパク質の増殖活性がその分子のＩＬ−２部分に依存していること、を示している。
【００８３】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の同起源のＭＨＣ／ペプチドに対する解離定数は、表面プラズモン共鳴検出法によって生理的な条件下で、約１０−７Ｍであることが分かった。
【００８４】
図５を、以下に、詳細に説明する。
図５Ａ）ＣＴＬＬ−２細胞を、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２（実線）又は組み換えＩＬ−２（点線）と共に、図の下段に示されるような様々な濃度で培養した。
図５Ｂ）ＣＴＬＬ−２細胞を、図の下段に示されるような２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２及びα−ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体又はアイソタイプの対照抗体と共に、インキュベートした。細胞の生存率は、ＷＳＴ−１と共にインキュベートして測定し、吸光度は４５０ｎｍで測定した。
Ｃａｂ＋５：５μｇ対照抗体；Ｃａｂ＋５０：５０μｇ対照抗体；Ｂａｂ＋５：５μｇブロッキング抗体；Ｂａｂ＋５０：５０μｇブロッキング抗体
【実施例６】
【００８５】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質により仲介される細胞の結合
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の有用な特性は、そのＴＣＲ及びサイトカイン部分の各々により、標的細胞及びエフェクター細胞を結合させる能力にある。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質が細胞を効果的に結合させることができることを実証するために、Ｔ２細胞を、ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）又はｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチドのいずれかで収容し、その後ジヒドロエチジウム（ＨＥ）で標識した。ＣＴＬＬ−２細胞を、カルセインＡＭで標識し、二つの標識された細胞集団を、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在下又は非存在下で混合し、インキュベートした。試料を、フローサイトメトリーで分析した。二つの細胞集団を２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の非存在下でインキュベートした時（図６Ａ及び６Ｂ）、又はＴ２細胞に対照ペプチドを収容し、ＣＴＬＬ−２細胞と２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在下でインキュベートした時（図６Ｃ）、フローサイトメトリーヒストグラム上では、細胞群は二つの異なる集団に含まれたが、総集団の約４５％が各々（図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃの領域１及び３に）示されており、総集団の約０．４６％のみが、二重染色されたセルウィンドウ（図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃの領域２）に示された。しかしながら、Ｔ２細胞をｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチドを収容し、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在下で、ＣＴＬＬ−２細胞とインキュベートした場合（図６Ｄ）、２重染色された細胞集団は、全集団の４．１％（図６Ｄの領域２、結合細胞）であり、このことは、Ｔ２細胞が２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を介してＣＴＬＬ−２細胞に結合していることを示唆している。
【００８６】
図６を、以下に、詳細に説明する。
Ｔ２細胞を、ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）（図６Ｂ及び６Ｄ）又はｐ５３（ａａ１４９〜１５７）（対照）ペプチド（図６Ａ及び６Ｃ）のいずれかで収容し、その後ＨＥで標識した。ＣＴＬＬ−２細胞を、カルセインＡＭで標識した。標識された細胞を、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在下（図６Ｃ及び６Ｄ）又は非存在下（図６Ａ及び６Ｂ）で混合して、インキュベートし、次いで試料をフローサイトメトリーで分析した。収容に使用されたペプチド及び融合タンパク質の存在又は非存在といったアッセイ条件を、各ヒストグラムの下に示す。一重染色領域は、１及び３の番号で示され、２重染色された細胞集団は２番で示されている。
【実施例７】
【００８７】
マウスに於ける２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の薬物速度論
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の薬物速度論は、ＢＬＡＢ／ｃマウスを用いて測定した。薬物をマウスに、経静脈的に投与し、様々な経過時点での血清試料を回収した。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の血清レベルは、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＥＬＩＳＡ検出は、融合タンパク質がインビボで修飾されているか、又は切断されているかを決定するために、抗ＴＣＲｍＡｂ捕獲／抗ＩＬ−２Ａｂ検出（図７Ａ）、抗ＴＣＲｍＡｂ捕獲／抗ＴＣＲｍＡｂ検出（図７Ｂ）、又は抗ＩＬ−２ｍＡｂ捕獲／抗ＩＬ−２ポリクローナルＡｂ検出（図７Ｃ）を用いて実施した。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を注入されたマウスは、毒性の兆候をまったく示さなかった。これらのアッセイに於いて、使用したＥＬＩＳＡ形式により、見かけ上の血清中半減期が１．６〜３．０時間で、最大濃度０．７５〜２．５μｇ／ｍＬの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２が検出された（図７）。報告されているフリーのＩＬ−２の血清中半減期は、約５分であるので［文献６参照］、これらのデータは、融合タンパク質がインビボで切断されておらず、その代わり血液中で比較的長期間にわたり原型のまま残存することを示している。これらの検討で測定された２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の半減期に於ける小さなぶれは、多分に、ＥＬＩＳＡアッセイの感度の違いによるものである。
【００８８】
図７を、以下に、詳細に説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を注入し、血清試料を、注入後１５、３０分、１、４、８、２４時間後に集めた。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の血清濃度は、以下の形式を用いて、ＥＬＩＳＡにより測定した。
７Ａ）抗ＴＣＲｍＡｂ捕獲／抗ＩＬ−２Ａｂ検出；
７Ｂ）抗ＴＣＲｍＡｂ捕獲／抗ＴＣＲｍＡｂ検出；及び
７Ｃ）抗ＩＬ−２ｍＡｂ捕獲／抗ＩＬ−２Ａｂ検出
【実施例８】
【００８９】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２による腫瘍細胞の染色
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質が、標的の腫瘍細胞を認識し、結合できれば、有用である。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２が腫瘍細胞に結合することができるかどうかを試験するため、ＨＬＡ−Ａ２．１及びｐ５３の両方を発現している、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞を、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２又は無関係なＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質である３Ｃ８、のいずれかで染色した。融合タンパク質とインキュベートしていない細胞及び３Ｃ８とインキュベートした細胞は、Ｈ５７−５９７検出抗体により陽性に染色されないが、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２とインキュベートした細胞は検出抗体で陽性に染色された（図８）。この結果から、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質が、標的の腫瘍細胞を認識し、結合できること、そしてインビボ抗がん治療として役に立つことが示唆される。
【００９０】
図８を、以下に、詳細に説明する。
Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞を、融合タンパク質なし（黒いダッシュの線）、５μｇの３Ｃ８ＴＣＲ／ＩＬ−２融合たんぱく質（対照）（点線）、又は５μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質（黒い実線）とインキュベートし、次いで、Ｈ５７−５９７ｍＡｂで染色した。染色されなかった細胞は、影のついた領域で示す。
【実施例９】
【００９１】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の抗腫瘍効果
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質がインビボで抗腫瘍効果を持つかどうかを決定するために、実験的転移アッセイを実施した。メスの胸腺欠損ヌードマウスに、高転移性Ａ３７５ヒトメラノーマサブクローンであるＡ３７５−Ｃ１５Ｎを注入し、様々な投与量の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２又は組み換えＩＬ−２のいずれかで処置した。腫瘍細胞注入後４２日で、肺の小塊をカウントした。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２と組み換えＩＬ−２の両方とも、投与量依存的に肺転移を減少させた（図９）が、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の方が、全ての投与量に於いて、肺転移を大きく減少させた。このことは、サイトカインを腫瘍に標的化することは、がん治療として大きな効果をもたらすものであることが示唆される。
【００９２】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２又は組み換えＩＬ−２のいずれかで処理されたマウスは、目立った毒性の兆候を示さなかった。両治療はともに、結果的に肺転移を減少させたが、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２による治療は、全ての投与量に於いて、組み換えＩＬ−２による治療に較べより効果的であった。
【００９３】
図９を、以下に、詳細に説明する。
メスの胸腺欠損ヌードマウスに、高度に転移性のＡ３７５−Ｃ１５Ｎ細胞を注入し、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２、組み換えＩＬ−２、又はＰＢＳで処理した。腫瘍細胞の注入の４２日後、肺を摘出し、肺の小塊をカウントし、次いでＰＢＳ処理した対照群に対応する肺の小塊数の平均をプロットした。
【実施例１０】
【００９４】
単量体及び多量体の２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質による、ペプチドを収容したＴ２細胞の染色についてのフローサイトメトリー分析
様々な２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の単量体や多量体を調製し、それらのＴ２細胞に対する結合挙動を、以下のセクション１１及び１２に記載される方法で、フローサイトメトリーにより分析した。その結果、図１０に示されるように、２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容したＴ２細胞を、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）を収容した細胞より強く染色した（図１０Ａ、１０Ｂ）。図中では、染色されていないＴ２細胞は、Ｔ２ １４９非染色００１と表示されたヒストグラム中に示されている；第２の試薬（Ｈ５７−ＰＥ）で染色した、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）及びｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容したＴ２細胞は、それぞれ「Ｔ２ １４９ Ｈ５７．００２」及び「Ｔ２ ２６４ Ｈ５７．００９」と表示されたヒストグラム中に示されている；多量体の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１に次いでＨ５７−ＰＥで染色した、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）及びｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容したＴ２細胞は、それぞれ「Ｔ２ １４９ ＩｇＧ Ｈ５７．００３」及び「Ｔ２ ２６４ ＩｇＧ Ｈ５７．０１０」と表示されたヒストグラム中に示されている；２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２に次いでＨ５７−ＰＥで染色したｐ５３（ａａ１４９〜１５７）及びｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容したＴ２細胞は、それぞれ「Ｔ２ １４９ ＩＬ２ Ｈ５７．００４」及び「Ｔ２ ２６４ ＩＬ２ Ｈ５７．０１１」と表示されたヒストグラム中に示されている；単量体の２６４ｓｃＴＣＲ／ｔｒｕｎＩｇＧ１に次いでＨ５７−ＰＥで染色したｐ５３（ａａ１４９〜１５７）及びｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容したＴ２細胞は、それぞれ「Ｔ２ １４９ ｔｒｕｎ Ｈ５７．００５」及び「Ｔ２ ２６４ ｔｒｕｎ Ｈ５７．０１２」と表示されたヒストグラム中に示されている；そして単量体の２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡに次いでＨ５７−ＰＥで染色したｐ５３（ａａ１４９〜１５７）及びｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容したＴ２細胞は、それぞれ「Ｔ２ １４９ ｂｉｒＡ Ｈ５７．００６」及び「Ｔ２ ２６４ ｂｉｒＡ Ｈ５７．０１３」と表示されたヒストグラム中に示されている。この結果は、観察した染色がペプチド特異的であることを確証づけた。
【００９５】
単量体型２６４ｓｃＴＣＲは、ある程まで度染色することができた。例えば、２６４ｓｃＴＣＲ／ｔｒｕｎＩｇＧ型で染色したときの平均チャネル蛍光（ＭＣＦ）は、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）を収容した細胞では１０．９５であるのに対し、ｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容した細胞では５５．３４と増大した。同様に、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ型に対するＭＣＦは、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）を収容した細胞では１３．４１であったのに対し、ｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を保持した細胞では９５．１４と増大した。多量体の２６４ｓｃＴＣＲは、より顕著にペプチドを収容したＴ２細胞を特異的に染色できた。例えば、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１型で染色したときのＭＣＦは、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）を収容した細胞では１１９であったのに対し、ｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容した細胞では８６３と増大した。
【実施例１１】
【００９６】
２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質による腫瘍細胞の染色
２６４ｓｃＴＣＲ試薬が腫瘍細胞を染色する能力もまた試験された。培養したＡ３７５細胞を、１０ｍＭのＥＤＴＡを添加したＰＢＳ（ｐＨ７．４）で接着を剥がし、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。細胞染色は、４μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質を用いて、２３℃にて４５分間実行された。細胞を一回洗浄し、３μｇのＦＩＴＣ結合のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃのＦ（ａｂ’）２断片（抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣ）で染色した。２回洗浄した後、染色細胞を、再び縣濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎで分析した。抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体のみで染色したＡ３７５細胞を、対照として用いた
。
【００９７】
図１１Ａに示されるように、この分析の結果は、Ａ３７５腫瘍細胞が２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質で染色できることを示している。このパネル（図１１Ａ）に於いて、抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣのみで、又は抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣ／ＩｇＧ１に次いで抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣで染色したＡ３７５細胞は、それぞれ「３７５−ＦＩＴＣ．００５」及び「Ａ３７５−２６４．ＦＩＴＣ．００６」と表示されてヒストグラム内に示されている。Ａ３７５腫瘍細胞を用いた付加的な実験は、さらに最適な染色条件を特徴付けるために実施された。例えば、ＰＥ結合の抗ヒトＩｇＧ抗体（抗ＩｇＧ−ＰＥ）（図１１Ｂ）又はＰＥ結合のＨ５７ｍＡｂ（図１１Ｄ）は、ＦＩＴＣ結合抗体の代わりに二次試薬として用いられた。図１１Ｂに於いて、抗ＩｇＧ−ＰＥのみ、又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１に次いで抗ＩｇＧ−ＰＥで染色されたＡ３７５細胞は、それぞれ「Ａ３７５−ＰＥ．００７」及び「Ａ３７５−２６４．ＰＥ．００８」と表示されてヒストグラム内に示されている。図１１Ｄに於いて、Ｈ５７−ＰＥのみ、又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１に次いでＨ５７−ＰＥで染色されたＡ３７５細胞は、それぞれ「Ａ３７５−Ｈ５７ＰＥ．００９」及び「Ａ３７５−２６４．Ｈ５７ＰＥ．０１０」と表示されてヒストグラム内に示されている。それぞれの場合に於いて、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１は、Ａ３７５腫瘍細胞を染色した。ストレプトアビジン−ＰＥ（ＳＡ−ＰＥ）を用いて多量体化されたビオチン化２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡは又、Ａ３７５細胞を染色するために用いられ（図１１Ｃ）、そしてストレプトアビジン−ＰＥのみで染色された細胞と比べて、増大した染色を示した。図１１Ｃでは、ＳＡ−ＰＥのみ又はＳＡ−ＰＥで複合体化されたビオチン化２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡで染色されたＡ３７５細胞は、それぞれ「Ａ３７５−ＳＡＰＥ．００１」及び「Ａ３７５−２６４ＢｔｎＳａＰＥ．００２」と表示されてヒストグラム内に示されている。
【実施例１２】
【００９８】
フローサイトメトリーで検出される２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質により固定された細胞の染色
考察のように、保存又は「固定された」試料のＭＨＣ／ペプチド複合体を検出することは、特に患者から取得した細胞、組織、又は他の生物学的試料を固定するのが通常である臨床又は他の医学的環境に於いて、有用性がある。しかしながら、ＭＨＣ／ペプチド複合体は３つの分離したペプチド鎖からなる細胞表面抗原であるため、通常の固定化手順の後の可溶性ＴＣＲによる検出の際に、ＭＨＣ／ペプチド複合体の完全な構造が十分原型をとどめていられるかどうか定かではない。可溶性ＴＣＲの染色が、固定された細胞上で実施できたかどうかを評価するために、ペプチドを収容したＴ２細胞及び遺伝子操作がなされていないＡ３７５細胞を、フローサイトメトリーで分析した。培養細胞Ａ３７５は、１０ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で接着を剥がし、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。Ｔ２細胞は、５０μＭのｐ５３（ａａ２６４〜２７３）で３時間インキュベートし、その後洗浄用緩衝液で２回洗浄した。両方の細胞は、３．７％のホルムアルデヒドで５分間固定し、２回洗浄した。細胞染色は、４μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１又はＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質を用いて、２０μｇのＨＬＡ−Ａ２．１／ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）四量体の存在下又は非存在下、２３℃で４５分間実施した。細胞を一回洗浄し、３μｇのＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃのＦ（ａｂ’）２断片で染色した。染色された細胞は、２回洗浄した後、再縣濁して、ＦＡＣＳｃａｎで分析した。
【００９９】
図１２Ａに示されるように、その結果では、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質が、ホルムアルデヒド固定Ａ３７５細胞を陽性に染色した（ヒストグラムは「Ａ３７５Ｆ−２６４．００６」と表示されている）のに対して、ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１による染色はバックグラウンドを超えて検出されない（ヒストグラムは「Ａ３７５Ｆ−ＣＭＶ．００５」と表示されている）ことを、示していた。ＣＭＶペプチドはＡ３７５細胞上に存在しないので、ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１対照試薬の使用で、ＴＣＲ又はＩｇＧ１ドメインと腫瘍細胞間のあらゆる非特異的相互作用が測定できる。この方法は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質とＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１対照との腫瘍細胞染色に於ける違いを測定することにより、固定された腫瘍細胞試料の表面に存在する腫瘍抗原のレベルを直接測定可能にする。
【０１００】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質によるＡ３７５細胞染色がＴＣＲ特異的であることを確認するため、ＨＬＡ−Ａ２．１／ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）四量体をブロッキング試薬として用いた。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１によるＡ３７５細胞の染色度は、ＨＬＡ−Ａ２．１／ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）四量体ブロッキング試薬の添加により低減し（ヒストグラムは「Ａ３７５Ｆ−２６４ＴＥＴ．２６４．００８」と表示されている）、さらに２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１が特異的に腫瘍細胞に結合できることを示した。予想されたように、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１で染色したＡ３７５細胞にＨＬＡ−Ａ２．１／ｐＣＭＶ四量体試薬を添加しても、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１試薬の特異的な染色には何の影響も及ぼさなかった（ヒストグラムは「Ａ３７５Ｆ−２６４ＴＥＴ．ＣＭＶ．００７」と表示されている）。同様の結果は、ペプチドを収容したＴ２細胞に於いても見られた（図１２Ｂ）。
【０１０１】
これらの結果は、単量体及び多量体の可溶性ＴＣＲ試薬が、ＭＨＣ複合体としてペプチドを提示している細胞を特異的に染色できることを示している。さらに、可溶性ＴＣＲ試薬は、ＭＨＣ複合体として腫瘍抗原を提示している、固定されていない及び固定されている腫瘍細胞を特異的に染色できる。加えて、可溶性ＴＣＲ試薬による細胞の特異的な染色度は、可溶性ＴＣＲ試薬に結合する完全なＭＨＣ分子の添加によって低減される。対照染色反応に於いて、完全なＭＨＣ分子を、可溶性ＴＣＲ試薬に対し１〜１００倍モルの過剰量にて添加することは、可溶性ＴＣＲ染色の非特異的な結合の構成に対して特異的な結合の構成（すなわちペプチドＭＨＣに対する結合）を区別するのに、特に有用である。これにより、異なる細胞及び組織の染色を比較する場合に、非特異的及び特異的な可溶性ＴＣＲ結合の異なった程度を示すことができる。例えば、異なる試料（細胞又は組織）間に於ける可溶性ＴＣＲの非特異的な結合のばらつきは、対照染色反応に於いて適切な完全なＭＨＣ分子を使用しないで、特異的な可溶性ＴＣＲ結合の程度を決定することを極めて困難なものとする。
【実施例１３】
【０１０２】
免疫蛍光顕微鏡により検出される２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質による固定された細胞の染色
ＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３発現に於いて異なるいくつかの細胞株（すなわち、Ａ３７５、ＨＴ２９及びＳａｏｓ２）を、分析のために選び、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質又は対照の融合タンパク質ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１のいずれかで染色した。細胞を、カバースリップ上で２４時間培養し、その後３．７％のホルムアルデヒドで５分間固定し、次いで洗浄緩衝液（０．５％のＢＳＡ及び０．１％のアジ化ナトリウム入りＰＢＳ）で２回洗浄した。ＢＳＡは、非特異的なタンパク質結合を低減させるブロッキング試薬である。細胞を、５％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含む２００μＬのＰＢＳ中の１０μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１又はＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質で、２３℃にて４５分間染色した。ＮＧＳは、非特異的結合を低減させるブロッキング試薬である。細胞を２回洗浄し、３μｇのＦＩＴＣ結合のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃのＦ（ａｂ’）２断片（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）で染色した。細胞を、２回洗浄し、その後平衡化緩衝液（Molecular Probe, Eugene, OR）で１回洗浄した。カバースリップは、スライドガラス上に、グリセロール緩衝液中の色あせ防止試薬（Molecular Probe, Eugene, OR）でマウントし、ネイルオイルで密閉した。スライドを、ＳＰＯＴ ＲＴカメラを有したニコン社製のエピ蛍光顕微鏡（Nikon, Tokyo, Japan）及びＳＰＯＴ ＲＴソフトウェアｖ３．２（Diagnostic Instrument, Sterling Heights, MI）を用いて、記録した。
【０１０３】
ＨＬＡ−Ａ２染色用に、固定した細胞を、１０μｇのＢＢ７．２、マウス抗ヒトＨＬＡ−Ａ２抗体により、５％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含む２００μＬのＰＢＳ中で、２３℃にて４５分間染色した。細胞を２回洗浄し、４μｇのＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃのＦ（ａｂ’）２断片（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）で染色した。細胞を、２回洗浄し、その後平衡化緩衝液（Molecular Probe, Eugene, OR）で１回洗浄した。カバースリップはマウントされ、上記に述べられたように、記録された。
【０１０４】
ｐ５３染色用に、固定した細胞を、２０分間０．２％のトリトンＸ−１００で透過性にし、その後、１０μｇのＰＡｂ１２２、マウス抗ｐ５３抗体により、５％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含む２００μＬのＰＢＳ中で、２３℃にて４５分間染色した。細胞を２回洗浄し、４μｇのＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃのＦ（ａｂ’）２断片（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）で染色した。細胞を、２回洗浄し、その後平衡化緩衝液（Molecular Probe, Eugene, OR）で１回洗浄した。カバースリップはマウントされ、上記に述べられたように、記録された。
【０１０５】
図１３に示すように、Ａ３７５細胞をＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３用に陽性に染色、ＨＴ２９をＨＬＡ−Ａ２用ではなくｐ５３用に陽性に染色、及びＳａｏｓ２細胞をｐ５３用ではなくＨＬＡ−Ａ２用に陽性に染色した。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１を用いた免疫蛍光染色では、Ａ３７５細胞だけが検出され、ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１では、一つの細胞も陽性に染色されなかった。これらの結果は、２６４ｓｃＴＣＲ試薬による陽性染色にはＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３抗原の存在が必要であることを確認するものである。どの腫瘍細胞株に於いても、非特異的なＣＭＶｓｃＴＣＲ試薬では、バックグラウンド染色は見られず、又、ＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３抗原が発現していない場合は、２６４ｓｃＴＣＲ試薬にても、バックグラウンド染色は見られなかった。
【実施例１４】
【０１０６】
２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を用いた定量的染色
ペプチドを収容したＴ２細胞に結合できる２６４ｓｃＴＣＲ複合体の数が、測定された。Ｔ２細胞を、様々な量のｐ５３（ａａ２６４〜２７３）と共に３時間インキュベートし、その後、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。３．７μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ−ストレプトアビジン−ＰＥ四量体を用いて２３℃にて４５分間、細胞染色を実施した。２回洗浄後、染色された細胞を、再縣濁し、ＦＡＣＳｃａｎで分析した。一方、３．７６μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質を用いて２３℃にて４５分間、細胞染色を実施した。細胞を１回洗浄し、３μｇのＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ抗体で染色した。２回洗浄後、染色された細胞を、再縣濁し、ＦＡＣＳｃａｎで分析した。
【０１０７】
この分析結果は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体については図１４に、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１については図１５に示されている。２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体及び２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合物については共に、ｐ５３ペプチドの量が増大するに連れて、染色レベルの増大が観察された。細胞を染色する複合体の数を定量するために、染色細胞の蛍光強度のレベルを、ビーズ当たり既知量のＰＥ分子を持つ検量線用ビーズ（QuantiBRITE ＰＥビーズ；BD Biosciences）の蛍光強度と比較した。このようにフローサイトメーターを使用した、ＰＥ−染色細胞を定量する方法が提供された。
【０１０８】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体及び２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合物について様々な濃度のペプチドとの複合体／細胞を算出した数が、図１６にプロットされている。その結果は、４００ｓｃＴＣＲ複合体と同じ位少ない結合が染色細胞上に検出できることを示している。加えて、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合物に次いでＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた染色は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体を用いたときに見られる染色に比べて、約４〜１０倍強い染色度を示した。この増加はおそらく、同じ２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合物と反応する抗体及び／又は多様性抗体群に対するＰＥの結合がより高いレベルであることの結果である。
【０１０９】
これまでの考察から、定量的にＴＣＲ結合を検出するための上記方法は、珍しい抗原の検出を最適化するのに有用である。その方法は、腫瘍細胞に結合する２６４ｓｃＴＣＲ試薬を検出することに適用された。細胞を記載のように調製し、様々な量の２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ−ストレプトアビジン−ＰＥ四量体で、２３℃にて４５分間染色した。２回洗浄後、染色された細胞を、再縣濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎで分析した。一方、細胞染色は、様々な量の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質を用いて、２３℃にて４５分間実施した。細胞を１回洗浄し、２．５μｇのＰＥ結合Ｈ５７抗体で染色した。２回洗浄後、染色された細胞を、再縣濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎで分析した。
【０１１０】
各場合に於いて、染色された細胞上の蛍光強度のレベルを、ビーズ当たり既知量のＰＥ分子を持つ検量線用ビーズの蛍光強度と比較することにより、細胞を染色する複合体の数を測定した。図１７Ａ及び１７Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ試薬量を増加したときのＡ３７５腫瘍細胞の染色度を示す。図１８及び１９はそれぞれ、３つの腫瘍細胞株（Ａ３７５、ＨＴ２９及びＳａｏｓ２）に於いて、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ及び２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１試薬量を増加したときに観察された、定量的な染色度を示す。ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３陽性のＡ３７５腫瘍細胞株は、両試薬で染色され、ＨＴ２９（ＨＬＡ−Ａ２陰性）及びＳａｏａ２（ｐ５３陰性）細胞株に比べて、２６４ｓｃＴＣＲ試薬に対し２．５倍多く結合した。さらに、２６４ｓｃＴＣＲ試薬の量が増えるにつれて、Ａ３７５細胞の特異的な染色度が増大した。５００程度に少ない染色複合体の差異の検出は、Ａ３７５細胞の染色を他の腫瘍細胞株のそれと比較することによって測定した。定量的染色についての検討の結果は、２６４ｓｃＴＣＲ試薬の細胞当たり３００〜５００程度に少ないＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体に対する特異的な結合を容易に検出できることを示している。加えて、これらの染色反応の感度は、異なるＴＣＲ及び二次試薬の使用により増強され、最適化される。
【実施例１５】
【０１１１】
２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質による操作されていない腫瘍組織の免疫組織化学染色
皮下腫瘍を産生するために、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞（１ｘ１０６）を、ヌードマウスの左肩に皮下注入した。腫瘍を、５００ｍｍ３まで成長させ、マウスは人道的に犠牲にした。腫瘍を、覆っている皮膚とともに摘出し、中性緩衝液ホルマリン中で一晩固定させた。転移性の肺小塊を産生するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１ｘ１０６）を、ヌードマウスの側部尾静脈に注入し、転移性の肺小塊を発達させた。１８日後、マウスを人道的に犠牲にして、肺を取り出し、次いで中性緩衝液ホルマリン中で固定した。固定された組織を、７０％、９０％、９５％、１００％（２回）エタノール中で連続的に３０分のインキュベーションし、次いでキシレン中で３０分間のインキュベーションを２回行い、脱水した。その後組織を、パラフィン中に包埋して、５μｍ切片を調製し、そして顕微鏡スライド上にマウントした。
【０１１２】
免疫組織化学染色のために、切片をキシレン中でそれぞれ５分間のリンスを２回行い、次いで１００％（２回）、９５％及び８５％のエタノール中でそれぞれ２分間、連続的にインキュベートし、再度水和した。ＰＢＳで５分間の洗浄を２回及び蒸留水による５分間の洗浄を１回行い、スライドを内因性のペルオキシダーゼを失活させるために３％の過酸化水素で５分間インキュベートし、その後蒸留水で５分間のインキュベートを１回行った。スライドを、抗原回復溶液（Ｄａｋｏ）中に置き、９７℃にて２０分間加熱した。スライドを、抗原回復溶液中で２０分間、室温になるまで冷やし、その後、ＰＢＳで５分間の洗浄を２回行った。
【０１１３】
非ＨＲＰで標識された二次試薬を用いる場合は、スライドをアビジン／ビオチンブロッキング溶液中でインキュベートし（それぞれの溶液で１０分）、次いでＰＢＳ中で５分間の洗浄を２回行う。スライドを、１％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含むＰＢＳ中で室温にて３０分間ブロッキングした。このブロッキング工程は、二次ヤギ抗体試薬の非特異的な相互作用によるバックグラウンド染色度を低減するために必要である。スライドはその後、１０μｇ（１％ＮＧＳ中１００μＬ当たり）の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質又は対照のＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質の存在下、又は非存在下で、室温にて４５分間インキュベートした。ＰＢＳ中で５分間の洗浄を２回行った後、スライドを、１．６μｇ（１％ＮＧＳ中２００μＬ当たり）のＨＲＰ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγのＦ（ａｂ’）２断片にて、室温で４５分間インキュベートした。スライドを、それぞれ５分間ＰＢＳで２回洗浄した。スライドを、ＤＡＢ溶液（Ｄａｋｏ）中でうすいバックグラウンドが現れるまで、インキュベートした。スライドを水道水でリンスし、ヘマトキシリンで１５秒間対比染色した。スライドを、水道水で洗浄後、１００％エタノールバスで３回、キシレンバスで３回、それぞれ３分間リンスし、その後パーマウント（Fisher）でマウントした。組織染色度のレベルを、光学顕微鏡で評価し、ＳＰＯＴ ＲＴカメラ及びＳＰＯＴ ＲＴソフトウェアｖ３．２（Diagnostic Instrument, Sterling Heights, MI）で記録した。
【０１１４】
Ａ３７５腫瘍切片を用いた典型的な免疫組織化学分析結果は、図２０及び２１に示される。その結果では、ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質又は二次抗体のみと比較して、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質でインキュベートしたとき、Ａ３７５組織切片は、より強く染色される（すなわち、より濃い色がついて見える）ことが示された。ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質を用いて観察されたバックグラウンド染色は、ヒトＩｇＧ１抗体に次いでＨＲＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体でインキュベートされたときに見えるものと同程度であり、このことはバックグラウンド染色がＩｇＧ１ドメインの組織切片との相互作用によるものらしいことを示している。さらに、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質によるマウス間質組織の染色は、Ａ３７５腫瘍組織の同じ切片に見られる染色よりかなり弱かった。これらの結果は、２６４ｓｃＴＣＲ試薬が、ヒト腫瘍試料を特定化するために通常使用される免疫組織化学的方法で、固定されたヒト組織切片を、特異的に染色できることを示している。
【実施例１６】
【０１１５】
２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質による腫瘍組織アレイの免疫組織化学的染色
ヒト腫瘍組織アレイは、商業的な供給元又はティッシュアレイリサーチプログラム（Tissue Array Research Program：ＮＣＩ）から得られる。染色のために、組織アレイのスライドを、それぞれキシレン中で５分間のリンスを２回行い、次いで１００％（２回）、９５％、及び８５％エタノールでそれぞれ２分間、連続的なインキュベーションにより、再度水和した。ＰＢＳによる５分間２回及び蒸留水による５分間１回の洗浄後、内因性のペルオキシダーゼを失活させるためにスライドを、３％の過酸化水素中で５分間インキュベートし、次いで蒸留水で５分間の洗浄を１回行った。スライドを、抗原回復溶液（Ｄａｋｏ）中に置き、９７℃にて２０分間加熱した。スライドを、抗原回復溶液中で２０分間室温まで冷却し、その後、ＰＢＳで５分間の洗浄を２回行った。非ＨＲＰで標識された二次試薬を用いる場合は、スライドをアビジン／ビオチンブロッキング溶液中でインキュベートし（それぞれの溶液で１０分）、次いでＰＢＳ中で５分間の洗浄を２回する。スライドを、１％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含むＰＢＳ中で室温にて３０分間ブロッキングし、その後、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質又はＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質（又は他の非結合ｓｃＴＣＲ試薬）の存在下、又は非存在下で室温にて４５分間インキュベートする。ＰＢＳ中で５分間の洗浄を２回行った後、スライドを、二次試薬（ＨＲＰ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ又はビオチン化された抗ＴＣＲＣβ抗体のいずれか）中、室温にて４５分間インキュベートする。スライドは、それぞれＰＢＳで５分間の洗浄を２回行う。
【０１１６】
非ＨＲＰ二次試薬を用いる場合は、スライドをストレプトアビジン・ペルオキシダーゼ溶液中で室温にて１５分間インキュベートし、次いでＰＢＳ中で５分間の洗浄を２回行う。一方、ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ−ストレプトアビジン・ペルオキシダーゼ試薬を、上記の試薬の代わりに染色試薬として用いてもよい。
【０１１７】
スライドは、ＤＡＢ溶液（Ｄａｋｏ）中でうすいバックグラウンドが現れるまで、インキュベートする。スライドは、水道水でリンスし、ヘマトキシリンで１５秒間、対比染色する。水道水で洗浄後、スライドを１００％エタノールで３回、キシレンで３回リンスし、その後パーマウント（Fisher）でマウントする。組織染色のレベルは、光学顕微鏡で評価し、例えばＳＰＯＴ ＲＴカメラ及びＳＰＯＴ ＲＴソフトウェアｖ３．２（Diagnostic Instrument, Sterling Heights, MI）で写真撮影する。
【０１１８】
ＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３を発現する腫瘍は、ＣＭＶｓｃＴＣＲ融合タンパク質と比較して、２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質でインキュベートされた場合、異なって染色されることが期待できる。組織アレイを融合タンパク質無しでインキュベートする場合、ほとんど又は全く染色されないことが予期される。さらに、ＨＬＡ−Ａ２及び／又はｐ５３に対して陰性の腫瘍組織は、ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３陽性の腫瘍組織と比べて、２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質により低減した染色度を示すことが期待される。これは、２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質により認識される腫瘍の型、その相対的な比率、についての有用な情報を与え、２６４ｓｃＴＣＲベースの治療により所定の型の腫瘍を治療する妥当性を決定する助けとなる。
【実施例１７】
【０１１９】
蛍光ＴＣＲ試薬によるインビボ腫瘍の画像化
発現ベクターは、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）又はＬｕｃ（ホタル・ルシフェラーゼ）に融合した２６４ｓｃＴＣＲを産生するために構築される。これらのベクターは、本明細書記載の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１発現ベクターから、ＩｇＧ１遺伝子断片をＧＦＰ又はＬｕｃをコードする配列に置き換えることにより、産生できる。これらのコード配列は、商業的に入手可能である（例えば、ＧＦＰ遺伝子に対してはｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Clontech）、Ｌｕｃ遺伝子に対してはｐＳＰ−Ｌｕｃ（Promega））。ベクターは、標準的なＰＣＲ法により適切なＤＮＡ配列を単離するための鋳型として用いられる。対照ＴＣＲ（すなわちＣＭＶｓｃＴＣＲ）のＧＦＰ及びＬｕｃへの融合物の発現ベクターは、同じ方法で産生可能である。ある適用では、これらの発現ベクターは、ＣＨＯ細胞のような形質転換細胞に使用できる。そして結果として発現するタンパク質は、本明細書に記載されているようにして精製される。
【０１２０】
これらの精製タンパク質は、インビボに於ける腫瘍の画像化に用いられる。ＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３発現に関して様々であるヒトの腫瘍細胞を、皮下又は静脈内のいずれかに注入し、腫瘍又は転移性の肺小塊は、上記実施例１５に記載されるように発達させる。ｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ融合物に関しては、マウスに、ｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ融合タンパク質の増加した量を経静脈的に注入する。融合タンパク質が全身に循環するのに必要な時間が経過した後に、マウスに、腹腔内にルシフェラーゼの基質であるＤ−ルシフェリン２．０ ｍｇ（１００μＬのＰＢＳ溶液）を注入し、その後、体重２０ｇ当たりキシラジン（３ｍｇ／ｍＬ）及びケタミン（７ｍｇ／ｍＬ）のＰＢＳ溶液１２０μＬで麻酔する。ｓｃＴＣＲ／ＧＦＰ融合のために、マウスに、経静脈的にｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ融合タンパク質の増加した量を注入する。融合タンパク質が全身に循環するのに必要な時間が経過した後に、マウスを、上記のようにキシラジン（３ｍｇ／ｍＬ）及びケタミン（７ｍｇ／ｍＬ）のＰＢＳ溶液で麻酔する。
【０１２１】
インビボでの腫瘍の検出に関して、麻酔されたマウスは、ＮｉｇｈｔＯｗｌ ＬＢ９８１ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｇｈｔ Ｉｍａｇｅｒの内に置く。画像化は、２段階の工程手順とＷｉｎＬｉｇｈｔソフトウェア（Berthold Technologies, Oak Ridge, TN）を使用して行う。はじめに、白黒の写真画像を、１５ｍｓの照射で得、次いで５分間のフォトン積算期のバックグラウンドの差し引きをして発光画像を入手する。発光画像は、発光強度を色づけするためにソフトウェアにより加工し、その後、提示用に白黒の写真画像の上に重ねる。マウスを犠牲にし、病理学的な評価を、腫瘍の大きさ、場所及び性質（すなわち、抗原陽性又は陰性）を決定するために実施する場合もある。
ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３陽性の腫瘍細胞を保持する腫瘍部位に於ける２６４ｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＧＦＰ試薬の、他の組織と比較して異なる検出を明らかにする画像化検討から得られる結果は、ｓｃＴＣＲ試薬が、インビボに於いて腫瘍を特異的に検出できることを示している。
【０１２２】
さらに、ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３陽性の腫瘍細胞を保持する腫瘍部位に於ける２６４ｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＧＦＰの、ＣＭＶｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ又はＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＧＦＰ（対照）試薬の検出と比較して、異なる検出を明らかにする結果は、それらのｓｃＴＣＲ試薬がインビボに於いて腫瘍をより特異的に検出できることを示している。ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３陽性の腫瘍細胞を保持する腫瘍部位に於ける２６４ｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＧＦＰの、ＨＬＡ−Ａ２陰性又はｐ５３陰性の腫瘍細胞を保持している腫瘍部位の結果と比較して、差別化された検出を明らかにする画像化の結果は、さらにそれらのｓｃＴＣＲ試薬がインビボに於いて腫瘍を特異的に検出できることを示している。
【実施例１８】
【０１２３】
放射標識ＴＣＲによるインビボ腫瘍の画像化
別の態様に於いて、２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、例えば、１３１Ｉによる直接のヨード化によって放射線標識される。ヨード化は、標準的な方法により実施される。ＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３発現に関して様々であるヒトの腫瘍細胞を、皮下又は静脈内のいずれかに注入し、腫瘍又は転移性の肺小塊を、記載されたように発達させる。マウスに放射線標識された２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を経静脈又は腹腔内投与し、放射線標識された２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を注入して、例えば、１、２、４、８、及び１２時間後、そして１から１４日後に、画像化する。全身スキャンするために、マウスを、ペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔して、例えばマイクロコンピュータと連結した、４ｍｍピンホールのコリメーターを有した大きな視野のＳｏｐｈａ ＤＳＸカメラで、画像化する。腫瘍部位に於ける放射線核種で標識された２６４ｓｃＴＣＲ試薬の、他の組織との比較により、差別化された検出を実践する画像化の検討から得られた結果は、それらの放射線標識されたｓｃＴＣＲ試薬がインビボに於いて腫瘍を特異的に検出するために有用であることを示唆するものである。
以下の材料及び方法は、実施例に概説された実験を実施するために必要に応じて用いられた。
【０１２４】
１．材料
Ａ２．１ ２６４ＣＴＬクローン＃５は、ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウス［文献４９参照］に於いて産生されたヒトｐ５３ ２６４〜２７２ペプチドに特異的なＣＴＬラインから限界希釈法［文献５０参照］により得られた。ＣＨＯ．Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣、ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球、ＣＴＬＬ−２マウス細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔ２ヒトリンパ芽球、Ａ３７５ヒトメラノーマ、Ｈ５７−５９７ハイブリドーマ、及びＢＢ７．２ハイブリドーマ細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ：Rockville, MD）から得られた。Ｔ２ヒトリンパ芽球細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１に対し陽性であるが、外来性ペプチドを収容することができる空のＭＨＣ分子を提示するための、ＴＡＰ１及び２タンパク質が欠損している［文献２参照］。Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞株は、本発明者らの研究室でＨＬＡ−Ａ２．１及びｐ５３に関して試験されて、両方の抗原に関して陽性であることが見出された。Ｈ５７−５９７ハイブリドーマは、マウスのＴＣＲβ定常領域に於けるエピトープを認識するモノクローナル抗体を産生し、ＢＢ７．２ハイブリドーマは、ＨＬＡ−Ａ２のα２ドメイン上のエピトープを特異的に認識するＢＢ７．２モノクローナル抗体を産生する。ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５の高度に転移性のサブクローン、Ａ３７５−Ｃ１５Ｎは、インビボに於ける転移性検討にしか使われないものであるが、以前に報告されたように維持された［文献５３参照］。薬物速度論検討に於けるＥＬＩＳＡに使用される、組み換えヒトＩＬ−２及びビオチン化抗ヒトＩＬ−２ポリクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Minneapolis, MN）から購入された。抗ＴＣＲ ＣβｍＡｂＨ５７−５９７、抗マウスＴＣＲ Ｖβ３ｍＡｂ、抗マウスＣＤ３εｍＡｂ、抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂ、抗ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体及びアイソタイプの対照抗体、及びＦＩＴＣ標識されたヤギ抗マウスＩｇＧは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（San Diego, CA）から得られた。すべての細胞培養培地及び添加物は、ＣｅｌｌＧｒｏ（Herndon, VA）から購入され、他に記されない限り、すべての細胞培養材料は、Ｎｕｎｃ（Rochester, NY）から購入された。すべてのマウスは、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓ（Indianapolis, IN）から購入された。
【０１２５】
２．細胞培養
すべての細胞株は、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１ ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（形質転換されたＣＨＯ細胞についてのみ）を添加されたＩＭＤＭを含む完全な培養培地中で、３７℃にて５％のＣＯ２下で維持された。ＣＴＬＬ−２細胞は、９Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−２を添加した同じ培地中で維持された。Ａ３７５−Ｃ１５Ｎ細胞は、１０％熱不活性化ＦＢＳ、ペニシリン及びストレプトマイシン（Life Technologies）を含むＲＰＭＩ−１６４０中で維持された。
【０１２６】
マウス脾臓細胞は、ＢＬＡＢ／ｃマウスから無菌的に解剖された脾臓を押しつぶして、ナイロンメッシュのスクリーンを通し、そして培養培地で洗浄することにより単離された。赤血球はＧｅｙ溶液で２分間溶解され、次いで溶解を停止するための培養培地が添加された。単一細胞のペレットは２回洗浄されて、培養培地中のｍＬ当たり２．５ｘ１０６細胞に再縣濁され、そして５０μＭの２−ＭＥ、１００ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−２、及び５０ｎｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３εｍＡｂを含む完全な培養培地で培養された。
【０１２７】
３．構築物
プライマー−オリゴヌクレオチドプライマーは、マウスＴ細胞受容体及びヒトＩＬ−２遺伝子に適合する又は相補する配列から合成された：
ＫＣ２２８：５’−ＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣ−３’；（配列番号３）
ＫＣ２２９：５’−ＧＡＧＧＴＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＧ−３’；（配列番号４）
ＰＲＩＢ４：５’−ＧＧＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＴＴＣＡＧＡＣＴＣ−３’；（配列番号５）
ＫＣ１７６：５’−ＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣ−３’；（配列番号６）
ＥＴ−ＴＣＲＦ１：５’−ＣＣＣＡＣＣＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣＣＣ−３’；（配列番号７）
ＫＣ−１７０：５’−ＧＴＧＧＡＧＴＴＣＧＡＡＡＡＧＧＴＧＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’；（配列番号８）
ＫＣ２３１：５’ＣＧＡＴＡＡＧＴＧＴＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＴＣＧＧＣＡＴＧＴＡＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＧ−３’；（配列番号９）
ＫＣ２０８：５’ＧＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡＴＡＡＧＴＧＴＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＴＣＣＧＧＡＧＴＴＡＡＣＧＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’；（配列番号１０）
ＫＣ３２７Ｂ：５’−ＴＡＧＧＴＧＴＣＣＧＧＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣ−３’；（配列番号１１）
ＫＣ３２８Ｂ：５’−ＴＡＧＧＴＧＴＣＧＣＧＡＡＧＴＴＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧ−３’；（配列番号１２）
ＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；（配列番号１３）
ＣαＨＹＢ：５’ＧＣＴＧＴＣＣＴＧＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＡＣＴＧ３’；（配列番号１４）
ＣβＨＹＢ：５’−ＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＴＣＴＧＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＧ−３’；（配列番号１５）
【０１２８】
ＴＣＲ遺伝子は、Ｔ細胞クローンＡ２．１ ２６４＃５からクローン化された。本発明者らは、このＴ細胞クローン２６４ｓｃＴＣＲから得られた一本鎖のＴＣＲを指定する。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ＭｉｃｒｏＦａｓｔ Ｔｒａｃｋキット（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて細胞から抽出され、二本鎖ｃＤＮＡが調製され、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Clontech, Palo Alto, CA）を用いて二本鎖のアダプターオリゴヌクレオチドに結合された。Ｖα及びＶβセグメント（segment)を同定するために、Ａ２．１ ２６４＃５ ｃＤＮＡ調製物、上記リストのＡＰ２プライマー（アダプターＤＮＡに特異的）、及びＣαＨＹＢ（α鎖の定常ドメインに特異的）又はＣβＨＹＢ（β鎖の定常ドメインに特異的）を用いて、５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲが実施された。ＰＣＲ断片は、ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いて、ｐＣＲ２．１ベクターにクローン化され、その配列は、Ｍ１３フォワード及びリバースプライマーを用いて決定された。Ｔ細胞受容体Ｖα鎖は、ＳｆｉＩ／ＳｐｅＩ断片を産生するためにＫＣ２２８及びＫＣ２２９プライマーを用いて増幅され、ＶβＣβ鎖は、ＸｈｏＩ／ＸｍａＩ断片を産生するためにＰＲＩＢ４及びＫＣ１７６プライマーを用いて増幅された。Ｃβ鎖は、全長Ｃβ鎖の１２７番目のアミノ酸残基システインの直前で切断された。ＳｆｉＩ／ＳｐｅＩ Ｖα鎖断片は、無関係なＴＣＲをコードするＥ．Ｃｏｌｉ発現ベクターであるｐＫＣ６０のＳｆｉＩ／ＳｐｅＩで消化されたものに、元来のＴＣＲインサートを置き換えることにより、サブクローン化された。ＸｈｏＩ／ＸｍａＩ ＶβＣβ断片は、その後、このベクターのＸｈｏＩ／ＸｍａＩ消化物に結合され、可溶性の３つのドメインの２６４ｓｃＴＣＲをコードするベクターを産生した。この構築物由来の３ドメインＴ細胞受容体は、ＥＴ−ＴＣＲＦ１及びＫＣ１７０プライマーを用いてＡｇｅＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片を産生するために増幅され、その断片はその後ＡｇｅＩ／ＨｐａＩ断片を産生するために、ＫＣ２３１及びＫＣ２０８プライマーを用いたＰＣＲの鋳型として用いられた。
【０１２９】
ヒトＩＬ−２をコードする配列は、Ｍｉｎｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡキット（Qiagen, Valencia CA）及びＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ（Qiagen, Valencia CA）を用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞から単離された全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによりクローン化された。逆転写は、ＫＣ３２８Ｂプライマーを用いて行われ、ＰＣＲはＢｓｐＥＩ／ＮｒｕＩヒトＩＬ−２断片を産生するために、ＫＣ３２７Ｂ及びＫＣ３２８Ｂプライマーを用いて実施された。ＢｓｐＥＩ／ＮｒｕＩ ＩＬ−２断片は、無関係なＴＣＲ／抗体融合タンパク質をコードするクローニングベクターであるＢｓｐＥＩ／ＮｒｕＩで消化されたｐ１４９Ｂ１ＳＰに、融合タンパク質の抗体部分を置き換えた。ＩＬ−２修飾ベクターは、ＡｇｅＩ及びＨｐａＩにより消化され、上述のＡｇｅＩ／ＨｐａＩ２６４ｓｃＴＣＲ断片はそれに結合された。最後に、ＡｇｅＩ／ＣｌａＩ２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質断片は、ＡｇｅＩ／ＢｓｔＢＩで消化された、ｓｃＴＣＲ／マウスκ融合ベクターであるｐＳＵＮ２７内にクローン化され、元来クローン化されていた無関係なＴＣＲを置き換え、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質発現ベクターであるｐＳＵＮ３８を産生した。フローサイトメトリー分析のいくつかに関して、陰性対照として用いられた２６４ｓｃＴＣＲ／κ融合物は、ＡｇｅＩ／ＢｓｔＢＩ２６４ｓｃＴＣＲ断片をＡｇｅＩ／ＢｓｔＢＩで消化されたｐＳＵＮ２７にクローン化して、元来のＴＣＲを置き換えることで産生された。
【０１３０】
哺乳動物細胞で融合タンパク質を産生することに関して、ＣＨＯ．Ｋ１細胞は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ・Ｇｅｎｅ・Ｐｕｌｓｅｒを用いてエレクトロポレーションされ、次いで限界希釈法によりクローン化されて、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む培地中で選択された。
【０１３１】
４．タンパク質精製
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２は、抗マウスＴＣＲモノクローナル抗体Ｈ５７−５９７を用いた免疫親和性クロマトグラフィにより、細胞培養物の上清液から精製された。なお、この抗マウスＴＣＲモノクローナル抗体Ｈ５７−５９７は、ＴＣＲβ鎖の不変領域にあるエピトープを認識して、セファロース４Ｂカラム（Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ）に結合している。精製された試料は、その後、３０ｋＤａの分子量でカットオフする膜（Millipore, Bedford, MA）を有したＵｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心性フィルターを用いて、濃縮され、ＰＢＳに緩衝液交換された。ＴＣＲ融合タンパク質試料は、２〜８℃（短期間）又は−８０℃（長期間）で生化学的及び機能的分析のために保存された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥが、還元条件又は非還元条件のいずれかで、４〜１２％のＮｕ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル（Novex, San Diego, CA）及びＮｏｖｅｘ ＥＸ−Ｃｅｌｌ ＩＩシステムを用いて実施された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、クーマシーブルーで染色された。
【０１３２】
５．ＥＬＩＳＡ
すべてのＥＬＩＳＡは、１００〜２００ｎｇ／ｗｅｌｌの抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂ又は抗マウスＴＣＲ Ｖβ３ｍＡｂでコートされたＭａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルプレート（Nunc, Rochester, NY）を用いて行われた。融合タンパク質は、ビオチン化された抗マウスＴＣＲＨ５７ｍＡｂ、抗マウスＴＣＲＶβ３ｍＡｂ、又は抗ＩＬ−２ポリクローナル抗体、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）、ＴＭＢ基質、及び反応を停止させるための０．１８ＭのＨ２ＳＯ４（BioFx, Owings Mills, MD）で検出された。吸光度は、９６ウェルプレートリーダー（Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT）を用いて、４５０ｎｍで測定された。
【０１３３】
６．ＴＣＲ融合タンパク質による細胞染色
ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）又はｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチドのいずれかでパルスされたＴ２細胞は、１％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で、０．５μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質と室温にて３０分間インキュベートされた。細胞はその後、０．５μｇの抗ＩＬ−２Ａｂ又は０．５μｇのビオチン化抗ＴＣＲＨ５７−５９７ｍＡｂと、室温にて３０分間インキュベートされ、次いで１μｇの抗マウスκＰＥ又は５ｎｇのストレプトアビジン−ＰＥ（両方とも、Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ）とそれぞれインキュベートされた。試料は、ＦＡＣＳｃａｎ分析（Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ）の前に１％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で、洗浄された。両ｐ５３ペプチドがＨＬＡ−Ａ２に同様に結合するかどうかを決定するため、ペプチドを収容した細胞は、ＢＢ７．２を用いて室温にて３０分間染色され、次いでＦＩＴＣで標識されたヤギ抗マウスＩｇＧで染色され、そしてＦＡＣＳｃａｎ機器で分析された。
【０１３４】
ＣＴＬＬ−２細胞は、０．５μｇの融合タンパク質と室温にて３０分間インキュベートされた。結合した融合タンパク質を検出するために、０．５μｇのビオチン化抗ＴＣＲ Ｖβ３ｍＡｂが添加され、室温にて３０分間インキュベートされ、次いで、５ｎｇのストレプトアビジン−ＰＥでインキュベートされた、又は０．５μｇのＰＥで標識されたＨＬＡ−Ａ２．１ ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）四量体を３０分間用いることにより、そのタンパク質は検出された。ｐ５３ペプチドで収容され結合したＨＬＡ−Ａ２四量体は、以前に述べられたように、産生された［文献１参照］。試料は、ＦＡＣＳｃａｎ分析の前に１％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で洗浄された。ＩＬ−２受容体ブロッキング実験に関しては、ＣＴＬＬ−２細胞は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２又は２６４ｓｃＴＣＲ／κ融合タンパク質とインキュベートされる前に、αヒトＣＤ２５ブロッキング抗体又はアイソタイプの対照抗体と３０分間インキュベートされた。ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞染色に関しては、結合した融合タンパク質を検出するために、ＨＬＡ−Ａ２．１ ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）四量体を用いて、ＣＴＬＬ−２細胞に関して記載されたように染色を実施した。
【０１３５】
Ａ３７５細胞は、無酵素細胞解離緩衝液（Sigma, St. Louis, Mo）で回収された。５ｘ１０５細胞の試料は、１％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で洗浄され、融合タンパク質無し、５μｇの３Ｃ８（無関係なＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質）、又は５μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ ＩＬ−２と共に室温にて３０分間インキュベートされ、次いで、１μｇのビオチン化Ｈ５７−５９７ｍＡｂでインキュベートされた。細胞はその後、ＰＥ標識されたストレプトアビジンと室温にて１５分間インキュベートされ、洗浄され、そしてＦＡＣＳｃａｎにより分析された。
【０１３６】
７．細胞結合
ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチド又はｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチドのいずれかでパルスされたＴ２細胞は、７．８８ｎｇ／ｍｌのジヒドロエチジウム（ＨＥ）（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）で標識され、ＣＴＬＬ−２細胞は、５０ｎｇ／ｍｌのカルセインＡＭ（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）で標識された。洗浄後、標識された細胞の二つの集団は、１対１の比率で、２μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在又は非存在下で、室温にて２０分間一緒に混合された。細胞はその後、ＦＡＣＳｃａｎにより分析された。
【０１３７】
８．バイオアッセイ
ＣＴＬＬ−２細胞は、様々な濃度の組み換えＩＬ−２又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２のいずれかを含む１００μＬの培養培地中に、１ウェル当たり４ｘ１０３細胞で撒かれ、３７℃にて２１時間、５％ＣＯ２下でインキュベートされた。特異性についての対照として、ＣＴＬＬ−２細胞は、５又は５０μｇの抗ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体又はアイソタイプの対照抗体の存在又は非存在下で、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２と３７℃にて２１時間、５％ＣＯ２下でインキュベートされた。細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Roche Inc., Indianapolis, IN）が、１ウェル当たり２０μＬ添加され、３７℃にて４時間、５％ＣＯ２下でインキュベートされた。吸光度は、９６ウェルプレートリーダー上４５０ｎｍで測定された。
【０１３８】
９．マウスに於ける薬物速度論
動物に関するすべての実験に於いて、適用可能なところでは、特定の国内法令と同様、研究室に於ける動物配慮の原則（ＮＩＨ発行 Ｎｏ．８５〜２３，１９８５年改訂）に従った。メスのＢＡＬＢ／ｃマウスは、経静脈的に側部尾静脈を介して、１００μＬになるようにＰＢＳで希釈した、３２μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を注入した。血清は、バックグラウンドレベルを確立するために、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２を注入されていない一つのマウス集団から採取された。血清は、注入された集団から、１５分、３０分、１、２、４、８、及び２４時間後に、尾の出血で採取された。血液試料は、１４，０００ｘｇにて、４℃で１０分間遠心され、血清は回収され、そして使用されるまで−８０℃に保存された。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２濃度は、捕獲のため抗ＴＣＲＶβ３又は抗ＩＬ−２モノクローナル抗体、及びビオチン化抗ＴＣＲＨ５７モノクローナル又は抗ＩＬ−２モノクローナル抗体のいずれか、次いで、検出のためにストレプトアビジンＨＲＰを用いて、ＥＬＩＳＡにより決定された。
【０１３９】
１０．インビボ研究
メスの胸腺欠損ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）は、５．０ｘ１０５のＡ３７５−Ｃ１５Ｎ細胞を側部尾静脈を介して、注入された。動物は、様々な濃度の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２（全量１００μｌに３２、１０、３、１、又は０．１μｇ）又は組み換えヒトＩＬ−２（全量１００μｌに８、２．５、０．７５、０．２５、又は０．０２５μｇ）を、腫瘍細胞投与後１、２、３、４、７、１０、１４、１７、２１、２８、及び３５日に注入された。腫瘍細胞注入後４２日に、すべての動物は人道的に犠牲にされ、肺が取り出され、Ｂｏｕｉｎ溶液中で固定され、肺表面腫瘍小塊が数えられた。それぞれの肺の腫瘍小塊は、二人の観察者によって数えられ、平均数が記録された。
【０１４０】
１１．ＩｇＧ及びＢｉｒＡ標識配列を含むＴＣＲ構築物及び融合タンパク質
ＴＣＲ遺伝子は、記載されたようにＴ細胞クローンＡ２．１ ２６４＃５からクローン化された。このＴ細胞クローンから得られた一本鎖のＴＣＲは、２６４ｓｃＴＣＲと指定された。３ドメインの一本鎖２６４ｓｃＴＣＲは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質構築物を鋳型として用いて、増幅された。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１発現構築物を産生するために、一本鎖のＴＣＲ断片は、抗体重鎖発現ベクターに結紮されて、抗体の可変領域を置き換え、一本鎖のＴＣＲをヒトＩｇＧ１重鎖領域に結合させた。２６４ｓｃＴＣＲ／ｔｒｕｎＩｇＧ１を産生するために、ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域の前で切り取られたＩｇＧ１重鎖ドメインを含む発現ベクターに、ＴＣＲ断片が結紮された。
【０１４１】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ発現構築物を産生するために、標識配列が２６４ｓｃＴＣＲ分子のＣ末端での構造に発現されるような、ＢｉｒＡ標識配列（Beckett, D.ら Protein Sci. 1999 April; 8(4):921-9）を含む発現ベクターに、一本鎖のＴＣＲ断片が結紮された。
【０１４２】
サイトメガロウィルス一本鎖のＴＣＲ（ＣＭＶｓｃＴＣＲ）が、ＨＬＡ−Ａ２限定性ＣＭＶ−ｐｐ６５ペプチドで刺激されたＣＴＬｓからクローン化された。ＩｇＧ１断片は、ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１構築物を作るために、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１ ＤＮＡから増幅された。
【０１４３】
哺乳動物細胞に於ける融合タンパク質の産生のため、ＣＨＯ．Ｋ１細胞は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒにより、エレクトロポレーションされ、次いで、限界希釈法によりクローン化され、そして１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培養培地中で選択された。
【０１４４】
タンパク質精製は、以下のように実施された。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ及び２６４ｓｃＴＣＲ／ｔｒｕｎＩｇＧ１は、セファロース４Ｂカラム（Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ）に結合されたＨ５７−５９７モノクローナル抗体を用いた、免疫親和性クロマトグラフィにより、細胞培養上清から精製された。ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１は、セファロース４Ｂカラム（Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ）に結合されたＢＦ１モノクローナル抗体を用いた、免疫親和性クロマトグラフィにより、細胞培養上清から精製された。２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡは、業者により推奨された条件下で、ビオチン−タンパク質リガーゼ（Avidity）によりビオチン化された。
【０１４５】
１２．フローサイトメトリーを用いた２６４ｓｃＴＣＲ試薬による細胞染色の検出
２６４ｓｃＴＣＲ試薬が固定された及び固定されていない細胞を染色する能力は、いくつかの検討で特徴付けられた。細胞染色方法は、様々な検出可能ドメインを保持している２６４ｓｃＴＣＲ融合物の利用、及び様々な蛍光標識プローブでこれらの融合物の細胞レベルの相互作用を検出すること、を含む。いくつかの対照は、特異的な染色を評価するために用いられた。対照は、ｐ５３（ａａ２６４〜２７３）抗原を欠損している細胞を２６４ｓｃＴＣＲ試薬で染色すること、ｐ５３陽性細胞をＣＭＶｓｃＴＣＲ試薬で染色すること、ｐ５３陽性細胞を二次染色試薬だけで染色すること、及びｐ５３陽性細胞を可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３多量体のような競合的ブロッキング試薬の存在下及び非存在下に於いて２６４ｓｃＴＣＲ試薬で染色すること、を含んでいる。
【０１４６】
単量体又は多量体型２６４ｓｃＴＣＲの細胞は、特異的に染色する能力について試験された。Ｔ２細胞は、３７℃、２．５時間で１００μｇ／ｍｌのｐ５３（ａａ２６４〜２７３）又はｐ５３（ａａ１４９〜１５７）を収容した。過剰なペプチドを取り除く洗浄工程後、細胞は１２５ｐＭの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１、２６４ｓｃＴＣＲ／ｔｒＩｇＧ１又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ（ビオチン化無しで）と、３０〜４５分間インキュベートされた。還元及び非還元試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、２６４ｓｃＴＣＲ／ｔｒｕｎＩｇＧ１及び２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡタンパク質が単量体であること、及び２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１タンパク質が二量体であることを示していた。更に一回の洗浄工程の後、細胞は２．５μｇのＰＥ結合Ｈ５７ｍＡｂ（Ｈ５７−ＰＥ）と共に３０分間インキュベートされた。細胞は洗浄され、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー装置（BD Sciences, San Jose, CA）で、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（BD Sciences, San Jose, CA）を用いて分析された。非染色及びＨ５７−ＰＥで染色されたＴ２細胞はまた、バックグラウンド染色を確認するために分析された。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の模式的な構造（１Ａ）とアミノ酸配列（１Ｂ）を示す図である。
【図２】図２は、形質転換したＣＨＯ細胞に於ける２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の産生を示すサイズゲルを示すものである。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＴＣＲ部分のＭＨＣ／ペプチド結合能力を示すグラフである。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分のＩＬ−２受容体結合能力を示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の生物学的活性を示すグラフである。
【図６】図６Ａ〜Ｄは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質により仲介されるペプチドを収容したＴ２細胞とＣＴＬＬ−２細胞の結合を示すグラフである。
【図７】図７Ａ〜Ｃは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の血清半減期を示すグラフである。
【図８】図８は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を用いた腫瘍細胞染色を示すグラフである。
【図９】図９は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ試薬による、非特異的なｐ５３ペプチド（１０Ａ）又は特異的なｐ５３ペプチド（１０Ｂ）を収容したＴ２細胞の染色を示すグラフである。
【図１１】図１１Ａ〜Ｄは、様々な２６４ｓｃＴＣＲ試薬及び二次試薬による、腫瘍細胞の染色を示すグラフである。
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは、競合する可溶性ペプチドＭＨＣ分子（２６４−ＴＥＴ標識される）の添加あり及び無しで、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１及びＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１（対照）試薬を用いて、固定されたＡ３７５（図１２Ａ）又はＴ２細胞（図１２Ｂ）を染色したものを示すグラフである。
【図１３】図１３は、固定された腫瘍細胞型（Ａ３７５、ＨＴ２９及びＳａｏｓ２）の、Ａ２及びｐ５３抗原に関する、及び２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１及びＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質を用いた、染色パターンを示す連続的な顕微鏡写真である。
【図１４】図１４は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体と反応させたＴ２細胞の定量的染色を示すグラフである。
【図１５】図１５は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質と反応させたＴ２細胞の定量的染色を示すグラフである。
【図１６】図１６は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ融合物と反応させた細胞に関して、収容されたｐ５３ペプチドの増加する量と細胞あたりの複合体の数を示すグラフである。
【図１７】図１７Ａ〜Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体（図１７Ａ）又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質（図１７Ｂ）と反応させたＡ３７５腫瘍細胞の定量的染色を示すグラフである。
【図１８】図１８は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体と反応させた３つの腫瘍細胞株の定量的染色（細胞あたりの複合体の数）を示すグラフである。
【図１９】図１９は、図１８と同様に、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質と反応させた３つの腫瘍細胞株の定量的染色を示すグラフである。
【図２０】図２０は、二次抗体、ＣＶＭｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１（対照）又は２６４ＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質で染色されたＡ３７５腫瘍の固定された切片を示す３枚の倍率２００倍の顕微鏡写真である。
【図２１】図２１は、図２０と同様に、腫瘍切片を示す３枚の高倍率（４００倍）の顕微鏡写真である。
【０１４８】
参考文献
次の文献は、本発明の開示の全体を通して、（以下に示される番号によって）参照される。その各々は、参照して本明細書に取り込む。
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【０１４９】
ここに開示されたすべての参考文献は、参照して本明細書に取り込む。本発明は、それらのより好ましい態様を参照して記載するものである。しかしながら、当業者であれば、本開示を考慮の上、本発明の精神と範囲内で、修飾及び改良を加えることができるものと理解されたい。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、「可溶性ＴＣＲ分子とその使用方法」の名称で２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８，７９０号の優先権を主張するものであり、その全てを本明細書取り込む。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ＭＨＣ又はＨＬＡ複合体として存在するペプチド抗原を含む細胞又は組織を検出するための組成物及び方法を特徴とする。本発明は、がん細胞を検出するための感度の高い方法を提供することを含む広範な適用を有する。
【０００３】
（米国政府の権利に関する記載）
本発明は、米国立衛生研究所のグラント第１Ｒ４３ＣＡ８８６１５−０１号及び第１Ｒ４３ＣＡ１０５８１６−０１号に基づき、一部米国政府の助成を受けてなされたものであり、米国政府は本発明に関して所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
免疫療法は、がん治療のための有望な方法であるとの認識が増しており、インターロイキン２（ＩＬ−２）のようなサイトカインでの治療を含む様々な方法が提案されている。ＩＬ−２は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、リンフォカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）及びＮＫ細胞を含む様々な免疫細胞種に影響を与えるものである。［文献１０及び４０参照］
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
効力を上げるために腫瘍部位にサイトカインを濃縮させることが提案されてきた。一般的な方法としては、サイトカイン又はそれをコードする遺伝子を腫瘍内へ直接注入すること、又はサイトカインを腫瘍抗原に特異的な抗体に融合させることによる標的化送達［文献２０参照］があるが、これらの方法には問題がある。
【０００６】
例えば、多くの直接注入法は、腫瘍が概して小さい（微小転移巣）特にがんの初期段階で使用するのが困難である。さらにこの方法は、治療の成功の見込みが殆どないにもかかわらず多大な労力を要するものである。当該方法による治療は、多くの患者にとって非実用的であり、費用の嵩むものである。
【０００７】
がんを治療する一つの方法として抗体とサイトカインの融合物が用いられてきたが、抗体の結合範囲には限りがあるため、当該方法も限られたものとなっている。すなわち、抗体は特定の細胞表面の抗原を認識することしかできないからである。残念乍ら、腫瘍抗原の多くは、抗体認識に都合よく提示されるわけではないので、抗体に基づく方法の可能性については限界がある。さらに、腫瘍に特異的な抗原の多くは、細胞型に特異的なタンパク質の異常発現に由来するとの報告があるが、これらは少数の腫瘍型にのみ存在するものである。当該問題は、抗体に基づいた治療の可能性をさらに限定するものである。
【０００８】
ｐ５３タンパク質は、細胞周期のＧ１／Ｓ期で異常細胞を拘束することにより作用することが報告されている、細胞内の腫瘍抑制因子である。そのタンパク質の過剰発現は、多くのヒト悪性腫瘍に対する重要な腫瘍マーカーであると信じられており、広い標的範囲を有する腫瘍免疫療法の良い標的であると認識されている。ｐ５３タンパク質は、通常、主要組織適合性複合体タンパク質（ＭＨＣ）として、細胞表面に提示される。このタンパク質複合体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲｓ）の結合標的であることが知られている。［文献４９参照］
【０００９】
ペプチドを含むＭＨＣ／ペプチド複合体を検出するために、ある種のＴＣＲｓを用いる試みがなされてきた（Epelら, 2002; Hollerら, 2003; Lebowitzら, 1999; Plaksinら, 1997; Watayaら, 2001; O'Herronら, 1997）が、これら、また、関連の方法には、重大な欠点がある。
【００１０】
例えば多くの方法において、おそらくは、ペプチド抗原のペプチド抗原に対する結合を人為的に促進するために、ＴＣＲ構築物を複合体化させる（すなわち、多様なＴＣＲコピーを持つようにデザインされる）ことが必要とされている。標的（抗原提示）細胞は一般に、比較的大量のペプチド抗原を発現するように操作されているが、ペプチド抗原の密度は、場合によっては、細胞当たりの複合体数が１０４〜１０５個と高くなる（Watayaら, 2001）。ペプチド抗原の密度が高いと、ＴＣＲでの結合及び検出が容易になると考えられているが、ペプチド抗原のこのようなレベルは人為的なものであり、腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）が存在するＭＨＣ／ペプチド複合体の通常のレベルよりは遙かに高くなっている。ＴＡＡｓによっては、ＨＬＡ／ペプチド複合体が一つの細胞当たり約５０未満しか存在しないものもある（Pascoloら, 2001; Schirleら, 2000）。従って、従来の方法は、全てではないにしても大部分のＴＡＡｓを検出するには感度が十分であるとは言えない、との認識がある。
【００１１】
ある種のＴＣＲｓを用いて特定のペプチド抗原を発現している細胞を検出する試みがなされてきたが、抗体に基づいた多くの方法と同様、これらの取り組みはペプチド抗原を検出するには感度が十分ではなかったか、又は抗原を完全には検出することができなかった。
【００１２】
例えば、Ｈｏｌｌｅｒら（２００３）は、ＭＨＣ／ペプチド複合体と反応することが報告されているある種の可溶性ＴＣＲｓの開発を報告した。そのＴＣＲｓは、人為的に抗原を「収容した（loaded）」細胞に於いては抗原を検出できたが、腫瘍細胞上の内因性の抗原を検出することはできなかった。Ｈｏｌｌｅｒらは、抗原が細胞当たり６００コピー未満の低い密度でしか存在しない場合には、ＴＣＲに基づいた方法は、抗原を検出する感度や信頼性が十分ではないと結論付けた。
【００１３】
ＴＣＲに基づいた特定の方法は、ＭＨＣ分子としてのウィルスペプチドを検出するために用いられてきた（Stromingerらの国際公開第９６１８１０５号公報）が、これら及び関連の方法には問題がある。例えば、ウィルス感染はしばしば例外的に、一つの細胞に通常１０００〜１０５個といった高い密度でＭＨＣ／ペプチド複合体を産生するものと一般的に認識されている。Ｈｅｒｂｅｒｔｓら（２００１）及びｖａｎ Ｅｌｓら（２０００）を参照されたい。他の多くのペプチド抗原の検出方法と同様に、これまでのＴＣＲに基づいたウィルス抗原を検出するための方法には、比較的多数の標的抗原が用いられてきた。
【００１４】
いくつかのＴＣＲに基づいた方法は比較的大量のペプチド抗原を検出するために用いられてきたが、サイトカイン、ＩｇＧ１のような免疫グロビン（immunoglobin）ドメイン、ビオチン、又はストレプトアビジンのようなその他の分子にＴＣＲが結合した場合に、その方法が機能するかどうかは、あまり確かではない。すなわち、特に低密度のＴＡＡを分析する必要がある場合に、その融合分子がＴＣＲペプチド結合溝に対してどのように影響するのかは明らかではない。ＴＣＲペプチド結合溝の小さな歪曲は、比較的多くのペプチド抗原を分析する際には必ずしも問題とはならないが、ＴＡＡ結合の特異性及び選択性を減少させている。ＴＣＲペプチド結合溝の機能に於けるわずかな変化でさえも、低密度のＴＡＡしか発現していないがん細胞の検出を危うくする可能性がある。
【００１５】
特に、ペプチド抗原が低密度にしか発現していない場合に、高感度で、選択性があり、再現性のあるＴＡＡｓを検出できる方法があれば、有用である。そのような方法がもし、検出可能な標識又はサイトカインに結合した分子を含む多様な可溶性ＴＣＲｓを用いるものであれば、特に有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、一般に、ＭＨＣ又はＨＬＡ複合体として細胞又は組織に存在しているペプチド抗原を含む細胞又は組織を検出するための方法に関する。ある態様に於いては、本発明は、以下の：
ａ）細胞又は組織を、存在しているペプチド抗原と可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が特異的な結合複合体を形成する条件下で、少なくとも一つの可溶性ＴＣＲ分子又はその機能性断片に接触させる、
ｂ）存在しているペプチド抗原に結合しなかったすべての可溶性ＴＣＲ分子又はその断片を取り除くのに適した条件下で、細胞又は組織を洗浄する、及び
ｃ）存在しているペプチド抗原を含む細胞又は組織の指標としての特異的な結合複合体を検出する、
工程のうち少なくとも一つ、好ましくはその全てを含む。
【００１７】
好ましい実施に於いて、本発明は、細胞又は組織上のペプチド抗原の量が、約１０００００コピーより少ない、好ましくは約１００から８００コピーのような１０００コピーより少ないものを検出するために利用される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の使用にはいくつかの利点があるが、例えば、本発明は、きわめて感度が高いので、内因性ペプチド、より特化すれば、操作されていない腫瘍細胞に存在する腫瘍関連ペプチド抗原を含む非常に低密度のＭＨＣ／ペプチド複合体を検出及び場合によっては定量するために利用される。一方、ＭＨＣ／ペプチド複合体を検出するための従来の方法は、相対的により高密度の複合体を検出できることが報告されている。
【００１９】
さらに、本発明は、例えば腫瘍組織アレイのような組織アレイに通常みられるような固定された細胞及び組織を検出及び場合によっては定量するために利用される。ＭＨＣ／ペプチド複合体を検出する能力（「染色」とも言う）は、特に患者から採取された細胞、組織又は他の生物学的試料の固定化が通常行われている臨床又はその他の医学的環境に於いて有用である。一方、非共有結合ペプチドは通常、組織を処理する工程で失われてしまうので、従来のＴＣＲに基づいた検出方法の多くは固定化された組織には適用できない。
【００２０】
本発明は、更なる利点を提供する。例えば、本発明の方法は、単量体及び／又は多量体の可溶性ＴＣＲ分子を使用する場合にも柔軟に適応されるものとなっている。従来の方法は残念乍ら、主に柔軟性と感度が限られている多量体のＴＣＲｓを使用するものであった。多量体のＴＣＲｓは特に、分解又は凝集能力、標的部位への到達性を欠くこと、免疫原性の増加びクリアランスのため、インビボ画像化に使用するのは難しい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の態様は、細胞の表面にＭＨＣ／ペプチド複合体として提示される内因性ペプチド抗原を検出する能力を提供することによって、当該分野で長らく待ち望まれてきたニーズに応えるものである。本発明の方法は、細胞の活性、病理、及び感染をモニターする助けとなる様々な重要な使用を有する。例えば、本発明による細胞又は組織の内因性腫瘍関連のペプチド抗原の検出は、がんの存在／存在範囲を検出及び及び場合によっては定量する方法を提供する。従来の態様に於いては、がん細胞の表面にあるタンパク質性抗原を検出する診断ツールとして抗体を利用してきたが、抗体は通常、細胞膜タンパク質の検出に限られたものとなっている。さらに、抗体による検出は、抗原が遊離する（shedding）又は抗原性タンパク質が循環系に分泌されるといった障害がある。抗体は又、標的の認識に限界がある。本発明の態様は、標的ペプチド抗原を検出するために可溶性ＴＣＲｓ及びその断片を使用する、高感度で信頼性のある検出方法を提供することによって、これら及び他の問題を回避するものである。
【００２２】
本発明のそのような使用及び利点は、インビボ（例えば、画像化又は診断法のような）又はインビトロ（例えば、組織アレイ又はＦＡＣＳ分析のような）を含む様々な状況に於いて、ペプチド抗原を検出するために用いることが可能である。
【００２３】
本発明のその他の態様は、下記考察の通りである。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
上記考察のように、本発明は一般に、ＭＨＣ複合体として細胞又は組織に提示されるペプチド抗原を含む細胞又は組織を検出するための方法を含む。ある態様では、本発明は、存在しているペプチド抗原と可溶性ＴＣＲ又はその断片が特異的に結合する複合体を形成する条件下で、少なくとも一つの可溶性ＴＣＲ分子又はその機能的断片と細胞又は組織を接触させること、存在しているペプチド抗原に結合しなかったすべての可溶性ＴＣＲ分子又はその断片を取り除くのに適した条件下で、細胞又は組織を洗浄すること、及び存在しているペプチド抗原を含む細胞又は組織の指標としての特異的な結合複合体を検出すること、を含む。
【００２５】
一般に、本可溶性ＴＣＲｓは、本明細書に開示されている手順及び認識されているＤＮＡ組み換え技術を用いての調製される。例えば、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡ切断、ＤＮＡの結紮、ＤＮＡの細胞内への導入、細胞の培養、並びに発現タンパク質の単離及び精製は、公知の技術である。一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. 1989)」；及びＡｕｓｕｂｅｌらの「Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York(1989)」を参照されたい。
【００２６】
様々な可溶性ＴＣＲ構築物の一般的な構造並びに同一物の作製及び使用の方法は、係属中の米国特許出願第０８／８１３，７８１号及び第０８／９４３，０８６号に開示されている。
【００２７】
例えば、特定の可溶性ＴＣＲは、少なくとも片方、好ましくは両方のＶ鎖に於いて膜貫通配列が除去されている異種二量体である。しかしながら便宜上、係属中の出願第０８／８１３，７８１号及び第０８／９４３，０８６号に報告されているように、一本鎖の（「ｓｃ−」）構築物を使うことが好まれる場合が多い。
【００２８】
簡潔に述べると、一本鎖の（「ｓｃ−」）ＴＣＲ分子は、適切なペプチドリンカー配列を介して共有結合しているＶ−α及びＶ−β鎖を含む。例えば、Ｖ−α鎖は、Ｖ−α鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末端に結合した適切なペプチドリンカー配列を介して、Ｖ−β鎖に共有結合できる。ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α及びＶ−β鎖は、一般にアミノ酸長が約２００から４００であり、好ましくはアミノ酸長が約３００から３５０であり、天然に存在するＴＣＲのＶ−α及びＶ−β鎖と、少なくとも９０％、好ましくは１００％同一である。「同一（identical）」という用語は、Ｖ−α又はＶ−β鎖のアミノ酸は、対応する天然に存在するＴＣＲのＶ−β又はＶ−α鎖と１００％相同（homologous）であることを意味する。
【００２９】
第０８／９４３，０８６号出願に開示されているように、ｓｃ−ＴＣＲ分子のＶ−α鎖はさらに、Ｖ−β鎖のＣ末端に結合したＣ−β鎖又はその断片を含むことができる。さらに、Ｖ−α鎖は、Ｖ−α鎖のＣ末端及びペプチドリンカー配列のＮ末端に、結合したＣ−α鎖又はその断片を含むことができる。一般に、Ｃ−β鎖断片を含む融合タンパク質に於いて、その断片はアミノ酸長が約５０から１３０であり、通常Ｃ−β鎖の最後のシステイン残基（マウスに於いては１２７位、ヒトに於いては１３１位）を含まない。Ｃ−α鎖を含む融合タンパク質では、その長さは、約１から９０アミノ酸（すなわち、最後のシステイン残基を含まないがそこまでのＣ−α鎖）の間で変化してもよい。例えば、ある態様に於いては、融合タンパク質は、１番目のアミノ酸から始まり７２番目までのアミノ酸長約１〜７２のＣ−α鎖断片を含む。別の態様に於いては、Ｃ−α鎖断片は、最初のアミノ酸から始まり２２番目（ロイシン）までのアミノ酸長約１〜２２である。Ｃ−α鎖断片は、通常、二つのシステイン残基を含んだＣα９０変異体及び一つのシステイン残基を含んだＣα７２変異体以外は、如何なるシステイン残基も含まない。Ｃα及びＣβ鎖長は、選択された特定のＶ鎖及び可溶性融合分子の使用目的を含むいくつかのパラメータを使用して選択される場合が多い。
【００３０】
さらに第０８／９４３，０８６号出願に開示されるように、本発明の追加のｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、Ｖ−α鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末端の間に最初のペプチドリンカー配列が結合する場合には、例えば、二つのペプチドリンカー配列を含む。Ｖ−β鎖のＣ末端は、Ｃ−β鎖断片のＮ末端に結合でき、そして２番目のペプチドリンカーは、Ｖ−β鎖又はＣ−β鎖断片のＣ末端又は、必要に応じて、以下に説明されるような標識分子に結合する。別の説明的な態様に於いては、ｓｃ−ＴＣＲタンパク質は、Ｖ−β鎖又はそのＣ−β鎖断片のＣ末端と、Ｖ−α鎖のＮ末端を共有結合でつなぐ、適当なペプチドリンカーを介してＶ−β鎖をＶ−α鎖に結合することによって作製することができる。
【００３１】
本発明の可溶性ＴＣＲタンパク質は、一つ又はそれ以上の融合したタンパク質タグ（protain tag）を含むことができる。そのようなタグが「検出可能」である態様に於いて、可溶性ＴＣＲは、「検出可能に標識された」と言える。例えば、可溶性の融合タンパク質に関して、タンパク質タグは、ｓｃ−ＴＣＲのＶ−β鎖（又はＣ−β鎖断片）のＣ末端に結合可能である。必要に応じて、このような可溶性ＴＣＲタンパク質は、係属中の第０８／９４３，０８６号出願によって報告されているような、また、以下の実施例に於いてさらに説明されるような、免疫グロビン鎖に結合可能である。
【００３２】
本発明で使用される好ましい可溶性融合タンパク質は、完全に機能的で可溶性である。「完全に機能的」という用語又は同様の用語は、融合タンパク質が特異的にリガンドに結合することを意味する。このような特異的な結合を検出するためのアッセイは、本明細書に開示されており、また、ウェスタンブロットのような標準的なイムノブロット技術を含む。このような可溶性ＴＣＲｓの機能的断片は、ウェスタンブロットや表面プラズマ共鳴分析により決定される親和性で、対応する全長ＴＣＲの少なくとも７０％、好ましくは約８０から９０％、又はそれ以上で抗原に結合することができる。
【００３３】
適したＴＣＲ鎖の核酸及びタンパク質配列は、公開されている。例えば、「Fundamental Immunology,(1993)3ｒｄ Edi. W. Paul. Ed. Rsen Press Ltd. New York」；及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．らの「Sequences of Proteins of Immunological Interest (5ｔｈ Ed.) Public Health Services, National Institutes of Health(1991)」を参照されたい。又以下の実施例同様、係属中の第０８／８１３，７８１号及び第０８／９４３，０８６号出願を参照されたい。
【００３４】
本発明の特定の態様に於いて、本発明の方法はさらに細胞又は組織を少なくとも一つのブロッキング試薬に接触させることを含む。接触させる工程は、可溶性のＴＣＲ又はその断片と細胞との非特異的結合を減少させるため、工程ａ）の前、間、又は後、を含むどの時点で実施してもよい。本発明では、過酸化物、血清蛋白質、抗体又はその抗原結合断片のような、ほとんど全ての標準的ブロッキング試薬も利用できる。
【００３５】
ある態様に於いては、検出される細胞又は組織上のＭＨＣ複合体に対するＴＣＲの結合特異性を確定ことが有用である。その場合、本発明はさらに、複合体に結合できる可溶性ＴＣＲ又は断片に競合的及び特異的に結合する条件下で、特定の複合体（細胞又は組織上に存在する可溶性ＴＣＲとＭＨＣ複合体間に形成される）が、競合するＭＨＣ（又はＨＬＡ）分子若しくはその断片と接触させることを含む。様々な適応するＭＨＣ分子が公開されている。
【００３６】
本発明の方法の一つの態様では、競合ＭＨＣ分子又はその断片の添加により、可溶性ＴＣＲ又はその断片が競合ＭＨＣ分子又はその断片に結合して競合複合体を形成し、可溶性ＴＣＲ又はその断片の特異的な結合が減少、若しくは実質的に解消される。本発明の方法のある特定の態様に於いては、競合ＭＨＣ分子は、可溶性ＴＣＲに対する分子比率で０．０１〜１０００倍の濃度範囲、好ましくは１〜１００倍で添加される。他の態様では、競合ＭＨＣ分子は、可溶性ＴＣＲの特異的結合を減少させるのに十分な単一濃度（つまり、可溶性ＴＣＲに対する分子比率で１倍、１０倍、又は１００倍）で添加される。必要に応じて慣用的な方法の一つ又は何個かを組み合わせることにより、競合複合体を検出し、ＭＨＣ分子又は可溶性ＴＣＲの結合特異性を決定することができる。特定のＭＨＣ分子又はその断片は一本鎖であるが、多くの場合、米国特許第５，８６９，２７０号；第６，３０９，６４５号；及び係属中の出願第０９／８４８，１６４号に開示されているような、可溶性の異種二量体分子である。以下の実施例と同様、さらなる開示として国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６号を参照されたい。典型的なＭＨＣ分子又はその断片は、ペプチド抗原を収容している。
【００３７】
本発明の実施に用いられるその他の可溶性ＴＣＲ及びＭＨＣ分子に関連する開示として、次の公開された米国特許出願「第２００２０１９８１４４号；第２００２００９１０７９号；第２００２００３４５１３号；第２００３０１７１５５２号；第２００３０１４４４７４号；第２００３００８２７１９号；及びそこに引用された参照文献」を参照されたい。
【００３８】
結合特異性を確定することが望まれる典型的な方法に於いて、ＴＣＲ分子又はその断片は、一つ又はそれ以上の標識で検出可能に標識される。適切な標識は、商業的に入手可能なモノクローナル抗体に特異的に結合されるＥＥ又はｍｙｃエピトープを含む。一般に、抗体、例えばモノクローナル抗体、によって特異的に結合できる様々なエピトープが、タンパク質タグとして供給される。他の適当な合成マトリクスは、その分子を特異的に結合できる結合抗体を有するものを含む。さらなる標識は、エンテロキナーゼ、ファクターＸａ、蛇毒（スネークヴェノム）又はトロンビン切断部位を有するものを含む。公開された国際特許出願ＷＯ９６／１３５９３を参照されたい。
【００３９】
ＴＣＲ分子又はその断片を検出可能に標識するための他の適当な標識は、ビオチン、ストレプトアビジン、例えばジフテリア毒素（ＤＴ）、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ポークウィード抗ウィルスタンパク質、又はゲロニンのような、例えば植物又は微生物を起源とする細胞毒を含む。そのような毒素の生物学的に活性な断片は当業者によく知られており、例えばＤＴのＡ鎖やリシンのＡ鎖を含む。さらに毒素は、例えばフォスフォリパーゼ酵素（例えばフォスフォリパーゼＣ）のような細胞表面で活性な試薬である。エフェクター又は標識を含むタンパク質を製造及び使用することに関連する公開として、Ｍｏｓｋａｕｇらの「J. Biol. Chem. 264, 15709 (1989)」； Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．らの「Cell 47, 641, 1986」; Pastanらの「Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem. 61, 331, (1992)」；「"Chimeric Toxins" Olsnes and Phil, Pharmac. Ther., 25, 355 (1982)」、「公開された国際特許出願ＷＯ ９４／２９３５０」；「公開された国際特許出願ＷＯ ９４／０４６８９」；及び「米国特許第５，６２０，９３９号」を参照されたい。ビオチン受容体の機能を有する標識の例は、Ｂｅｃｋｅｔｔ，Ｄ．らの「Protein Sci. 1999 Apr; 8(4):921-9」に記載されているように、ＢｉｒＡ標識である。以下の実施例にさらに述べられているように、ＢｉｒＡ標識の配列は、タンパク質のビオチン化を促進するためにＴＣＲ分子に含まれうる。さらに標識は、例えばビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、アドリアマイシン、ブレオマイシン、又はシスプラチンのような化学療法剤でありうる。
【００４０】
さらに標識は、診断又は画像化研究に適した、ヨウ素１３１、イットリウム９０、レニウム１８８、ヨウ素１２３、インジウム１１１、テクネチウム９９ｍ、ガリウム６７、タリウム２０１、又はビスマス２１２のような、放射性核種又はキレートであり得る。使用される放射性核種の中で、ガンマ放出体、陽電子放出体、Ｘ線放出体及び蛍光放出体は、局在のために適している、一方ベータ放出体やアルファ放出体も使用することができる。本発明の方法のための他の適当な放射性同位元素は、カドミウム１０９、アクチニウム２２５、アクチニウム２２７、アスタチン２１１、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３３、ジスプロジウム１６５、ジスプロジウム１６６、ビスマス２１２、ビスマス２１３、臭素７７、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０１、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀１０７、水銀２０３、レニウム１８６、レニウム１８８、テルリウム９９ｍ、テルリウム１２１ｍ、テルリウム１２２ｍ、テルリウム１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、フッ素１８、銀１１１、白金１９７、パラジウム１０９、銅６７、リン３２、リン３３、イットリウム９０、スカンジウム４７、サマリウム１５３、ルテニウム１７７、ロジウム１０５、プラセオジウム１４２、プラセオジウム１４３、プロメチウム１４９、テルビウム１６１、ホルミウム１６６、金１９８、金１９９、コバルト５７、コバルト５８、クロム５１、鉄５９、セレン７５、及びイッテルビウム１６９を含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、放射性同位元素は、１０から５０００ｋｅｖの範囲、より好ましくは、５０から１５００ｋｅｖ、最も好ましい場合は５０から５００ｋｅｖで放射するであろう。
【００４１】
適した陽電子放射体及び他の有用な放射性核種は、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、５１Ｍｎ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６２Ｚｎ、６３Ｚｎ、７０Ａｓ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、１１０Ｉｎ、１２０Ｉ、１２４Ｉ、１２２Ｘｅ、１２８Ｂａ、１３１Ｂａ、７Ｂｅ、２０４Ｂｉ、２０５Ｂｉ、２０６Ｂｉ、１４Ｃ、３６Ｃ、４８Ｃｒ、５１Ｃｒ、１５５Ｅｕ、１５３Ｇｄ、６６Ｇａ、７２Ｇａ、３Ｈ、１１５ｍＩｎ、１８９Ｉｒ、１９１ｍＩｒ、１９２Ｉｒ、１９４Ｉｒ、５５Ｆｅ、５９Ｆｅ、１１９ｍＯｓ、４２Ｋ、２２６Ｒａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、８２ｍＲｂ、４６Ｓｃ、４７Ｓｃ、７２Ｓｅ、１０５Ａｇ、２２Ｎａ、２４Ｎａ、８９Ｓｒ、３５Ｓ、３８Ｓ、１７７Ｔａ、９６Ｔｃ、２０１Ｔｌ、２０２Ｔｌ、１１３Ｓｎ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１６６Ｙｂ、１７４Ｙｂ、８８Ｙ、９０Ｙ、６２Ｚｎ及び６５Ｚｎを含むが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
適したキレートは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１−置換１，４，７−トリカルボキシメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン三酢酸（ＤＯ３Ａ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及び１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）を含むが、これらに限定されるものではない。更なるキレート配位子は、エチレンビス−（２−ヒドロキシ−フェニルグリシン）（ＥＨＰＧ）、及び５−Ｃ１−ＥＨＰＧ、５Ｂｒ−ＥＨＰＧ、５−Ｍｅ−ＥＨＰＧ、５ｔ−Ｂｕ−ＥＨＰＧ、及び５ｓｅｃ−Ｂｕ−ＥＨＰＧを含むその誘導体；ベンゾジエチレントリアミン五酢酸（ベンゾ−ＤＴＰＡ）及びジベンゾ−ＤＴＰＡ、フェニル−ＤＴＰＡ、ジフェニル−ＤＴＰＡ、ベンジル−ＤＴＰＡ、及びジベンジル−ＤＴＰＡを含むその誘導体；ビス−２（ヒドロキシベンジル）−エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）及びその誘導体；少なくとも３個の炭素原子、より好ましくは少なくとも６個、及び少なくとも２個のヘテロ原子（Ｏ及び／又はＮ）を含むマクロ環状化合物の種類であり、そのマクロ環状化合物は、単一環、又はヘテロ環要素とともに結合した、２個か３個の環、例えばベンゾ−ＤＯＴＡ、ジベンゾ−ＤＯＴＡ、及びベンゾ−ＮＯＴＡ（ここに於いて、ＮＯＴＡは、１，４，７−トリアザシクロノナンＮ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸である）、ベンゾ−ＴＥＴＡ、ベンゾ−ＤＯＴＭＡ（ここに於いて、ＤＯＴＭＡは１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチル四酢酸）である）、及びベンゾ−ＴＥＴＭＡ（ここに於いて、ＴＥＴＭＡは、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−（メチル四酢酸）である）；１，３−プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）及びトリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）の誘導体；１，５，１０−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）−トリカテコレート（ＬＩＣＡＭ）及び１，３，５−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（２，３−ジヒドロキシベンゾイル）アミノメチルベンゼン（ＭＥＣＡＭ）の誘導体を含むことができる；である。
【００４３】
他の適した標識は、ポリヒスチジン、蛍光標識、化学発光標識、核磁気共鳴活性標識、発色団標識、陽電子放射性断層撮影法（「ＰＥＴ」）による検出可能な陽電子放射性同位元素、β−ガラクトシダーゼや西洋わさびペルオキシダーゼを含むペルオキシダーゼのような酵素マーカー、ナノ粒子、常磁性金属イオン、造影剤、又は抗原性標識を含む。
【００４４】
適した蛍光標識は、１５２Ｅｕ標識、蛍光標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリスリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、オルトフタルアルデヒド標識、テキサスレッド標識、フルオレサミン標識、ランタナイドリン標識、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）標識のような蛍光タンパク質標識、又は量子ドット標識、を含みうるが、それらに限定されるものではない。化学発光標識の例は、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香性アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識、などを含む。
【００４５】
適した常磁性金属イオンは、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｇｄ３＋、Ｅｕ３＋、Ｄｙ３＋、Ｐｒ３＋、Ｃｒ３＋、Ｃｏ３＋、Ｆｅ３＋、Ｔｉ３＋、Ｔｂ３＋、Ｎｄ３＋、Ｓｍ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｐａ４＋、及びＥｕ２＋を含むが、それらに限定されるものではない。
【００４６】
使用できる酵素マーカーは、あらゆる容易に検出できる酵素活性又は酵素の基質を含む。そのような酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイド異性化酵素、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸異性化酵素、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、βガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェラーゼ、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００４７】
適したナノ粒子は、固体のコロイド状粒子、デンドリマー、リポソーム、ミセル、セラミック粒子、アルミナカプセル、乳化蝋又はＢｒｉｊ７２粒子、強磁性体粒子、金又は銀粒子、ポリ（ラクティック−コ−グリコリック）酸、ポリグリコリック酸、ポリＤ−又はＬ−乳酸、ポリカプロラクトン、又は血清アルブミンを含む生分解性粒子、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、又はポリ（ブチルシアノアクリレート）又はその誘導体を含む粒子、を含むが、それらに限定されるものではない。本発明のある出願に於いては、ポリエチレングリコール、多糖類、ポリペプチド、脂質、シリカ、などのような試薬で覆われたナノ粒子が、用いられうる。そのような覆われたナノ粒子は、吸収、バイオアベイラビリティ、組織分布、組織交差反応性、毒性、薬物動態／作用、又は腫瘍局在性を改善することができる。標的リガンドをナノ粒子に付着させる方法は、可溶性ＴＣＲをベースとした試薬に適用されうることが、記載されている（例えば、Ｎｏｂらの「J Pharm Sci.93:1980-92(2004)」を参照されたい）。
【００４８】
本発明の可溶性ＴＣＲｓは、単量体及び多量体ＴＣＲｓを含む。多量体ＴＣＲ分子は、ＴＣＲタンパク質が多量化を誘発するポリペプチドドメイン又はタグに融合されているものを含む。そのようなドメインは、タンパク質の二量化を促進する、免疫グロビン、ロイシンジッパー、ヘリックス・ターン・ヘリックス、及びバレル・バレルモチーフを含む。このようなタグは、抗体結合エピトープ、ストレプトアビジン結合ペプチド、６ｘＨｉｓモチーフ、ビオチンリガーゼ標的モチーフ、及びその類似物を含む。多量体ＴＣＲ分子は又、化学的にクロスリンクしている反応性アミノ酸又は多糖類を介して産生されるものを含む。このようなアミノ酸（多糖類）は、ＴＣＲ分子の中に本来備わっていることもあるし、遺伝子改変によって加えられることもある。多量体ＴＣＲｓは又、ここに記載されるような検出可能な標識を含んでも含まなくてもよい、他の分子（分子群）に付着することで産生されるものを含む。そのような接着分子は、ここに記載されるストレプトアビジン、ビオチン、抗体、プロテインＡ、又は、タンパク質、脂質及び多糖で覆われるても覆われていなくてもよいビーズ、ナノ粒子、固相表面、アレイ、マトリックスを含む足場、を含む。例えば、検出可能な標識がビオチンである様々な実施例に於いては、さらに、方法はＴＣＲ分子を多量体化するためにＴＣＲ分子とストレプトアビジンと結合することを含む。
【００４９】
本発明で開示されたいずれの標識も、特に目的のペプチド抗原が発現している細胞又は組織を検出するために、本発明の方法で用いられる可溶性ＴＣＲを検出可能に標識するために用いられうることは、高く評価されるであろう。
【００５０】
細胞や組織を「固定」するために、十分な変性剤に接触させた細胞や組織を使用した、ペプチド抗原の検出方法を提供することは、本発明の目的である。そのような試薬の例は、当該技術分野では公知であるが、ホルムアルデヒド（ホルマリン）、グルタルアルデヒド、メタノール、プロパノール等のようなアルコール、ベンゼン及びキシレンのような有機溶剤を含む。考察されるように、本発明の方法は、細胞や組織が固定されている場合に於いても、細胞上のＭＨＣ分子と同起源のペプチド抗原との相互作用を実質的に阻害しないことが見出された。このように本発明は、固定された細胞又は組織上で使用でき、このことより、構造的な完全性を保存し、本発明の方法の信頼性を高めることに役立っている。
【００５１】
従って、ある態様に於いて、本発明はさらに、細胞又は組織を少なくとも一つの変性剤に接触させることを含む。このような接触は、工程ａ）の前や細胞又は組織を変性（固定）させるときを含むほとんどあらゆる時期に実施することができる。
【００５２】
また考察されるように、本発明は、当該技術分野で組織アレイと呼ばれるもののようなアレイに於いて、細胞や組織を使用することに適している。すなわち本発明は、反復的な方法に於いて（臨床で直面するような）細胞や組織試料を選別するために必要な感度と信頼性を有している。そのようなアレイの多くは、米国特許第６，４６６，６９０号；第４，３８４，１９３号；第６，６０２，６６１号；第６，５９４，４３２号；第６，５６６，０６３号；第６，４０６，８４０号；第６，２４６，７８５号及びその参照文献に記載されているように、当該技術分野公知である。
【００５３】
従って、ある態様に於いて、本発明の方法はさらに、アレイに複数の細胞や組織を搭載することを含む。好ましくは、そのような細胞又は組織は、腫瘍細胞を含む（又は、からなる）ことが知られているか又は想定されている。本発明の方法は、細胞又は組織を含むアレイのそれぞれの要素に於いて実施される。必要ならば、本発明の方法は、アレイのそれぞれの要素について実質的に同時に実施される。ある態様に於いては、本発明の方法の工程ｃ）はさらに、アレイをスキャンすること、及び特異的な結合複合体の存在を示す画像情報を発生させることを含む。必要ならば、その工程はさらに、その情報をリアルタイムで利用者に出力すること及び画像情報の保存画像に必要に応じて見出しをつけてもよい、を含む。
【００５４】
本発明は、腫瘍関連ペプチド抗原又はＴＡＡｓと呼ばれるものを含む幅広い様々なペプチド抗原を検出するために用いられる。細胞又は組織は、本発明の方法に従って、懸濁、半懸濁又は固定することができる。
【００５５】
考察されるように、可溶性ＴＣＲ分子又はその断片は、少なくとも一つの単一鎖ＴＣＲを含むことができる、又は膜貫通ドメインを取り除くように組み換え操作されたもののようなヘテロ二量体構築物であってもよい。以下の実施例と同様、係属中の出願第０８／８１３，７８１号及び第０８／９４３，０８６号を参照されたい。このような可溶性ＴＣＲ分子又はその断片は、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素又はその触媒活性を有する断片、放射性核種、又は蛍光、燐光、若しくは化学発光分子で標識することを含む、本発明の概略のような一つ又はいくつかの組み合わせからなる方法によって、検出可能に標識することができる。公知の緑色（又は赤色）の蛍光タンパク質又はその断片も、その例に含まれる。
【００５６】
ある態様に於いて、可溶性ＴＣＲは、その分子が少なくとも一つのサイトカインに共有結合している単一鎖のＴＣＲである。そのようなサイトカインの例は、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦのようなコロニー刺激因子、ＩＦＮγ、ＩＦＮ−α及び類似物を含むが、それらに限定されるものではない。例として、可溶性ＴＣＲ分子又はその断片は、少なくとも一つ及び好ましくはサイトカイン又はその断片に共有結合したものを含む単一鎖ＴＣＲである。
【００５７】
その他の異形に於いて、可溶性ＴＣＲは、少なくとも一つの免疫グロブリン（immunoglobulin）ドメイン又はその断片に共有結合したものを含む、単一鎖ＴＣＲ又はその断片である。ある態様に於いては、単一鎖ＴＣＲ又はその断片は、ＩｇＧ１ドメイン又はその断片を含む配列に結合している。
さらに他の態様に於いて、ＭＨＣ複合体はＨＬＡ−Ａ２限定性（restricted）である。
【００５８】
例えば、可溶性ＴＣＲ又はその断片とペプチド抗原を含まない細胞との如何なる結合をも検出するためには、通常、対照を用いる方法が有用である。
本発明で使用される特定のペプチド抗原は、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）又はｐ５３（ａａ２６４〜２７２）を含む。
本発明の方法は、インビボ、エキソビボ、又はインビトロで実施することができる。
【００５９】
例えば、ＨＬＡタイピング（例えば、Ａ．Ｋ．Ａｂｂａｓの「Cellular and Molecular Immunology, page 328(W.B.Saunders Co.1991)」を参照されたい）は、本発明で実施可能である。インビボ画像化に適用するために、可溶性ＴＣＲは、望ましくはＴＣＲ若しくはその断片の結合に対して、公知の方法によりスキャンされる哺乳動物及び患者に投与できる、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、９９Ｔｃ）又は他の検出可能な標識を含む。そのような哺乳動物の分析は、例えば、免疫系の疾患及びがんを伴う望ましくないＡＰＣの発現を含む多くの疾患の診断及び治療に於いて助けとなるであろう。
【００６０】
本発明は又、このような腫瘍を有している又はその疑いのある患者に於いて、腫瘍関連ペプチド抗原を保持している腫瘍のインビボ画像化のために用いることができる。本発明の方法の実施に於いて、腫瘍上でペプチド／ＭＨＣ複合体として腫瘍関連ペプチド抗原に特異的に結合する、検出可能に標識された可溶性ＴＣＲ分子又はその断片を含有する組成物が、患者に投与される。組成物は、腫瘍部位へ蓄積するのに十分な時間、インビボで投与される。蓄積された組成物は、その後、腫瘍を画像化するために検出される。
【００６１】
ＴＣＲからなる組成物は、非経口（経静脈的に、経筋肉的に、皮下に、腫瘍内に、など）でその部位に、及び／又は、目的の組織、器官又は細胞に接近する経路で投与される。他の適用では、ＴＣＲを含む組成物は、鼻腔内に、経口的に、又は経皮的に投与される。
【００６２】
可溶性ＴＣＲの蓄積した組成物は、様々な方法によって検出される。これらは、在来型のシンチレーションカメラ、ガンマカメラ、直線スキャナー、ＰＥＴスキャナー、ＳＰＥＣＴスキャナー、ＭＲＩスキャナー、ＮＭＲスキャナー、超音波機器、Ｘ線機器、発光画像化システム、及び蛍光画像化システムから、なる群から選択された検出器によって検出することを含む。
【００６３】
本発明の画像化の方法はさらに、ある適用に於いて、腫瘍細胞又は腫瘍組織の検出を改良する可能性のある、前もって標的化する方法を包含する。この方法は、マルチステップ・プロトコールを使用する。例えば、標的のＴＣＲはアビジン又はビオチンのどちらかに結合され、その後、例えば、目的の腫瘍に局在化するような部位への注入により、投与される。その後、ビオチン又はアビジンのいずれかは（標的化の抗体に結合しているものに依存する）、標識を保持しながら、注入され、アビジン又はビオチンそれぞれに結合することにより、一次抗体の部位へ局在化する。代わりに他の相互作用する分子のペアで、ビオチン／ストレプトアビジン分子を置換することができる。いくつかの前もって標的化する方法は、ＴＣＲに基づいた試薬を前もって標的化するために用いられる抗体（Ｃｈａｎｇらの「Mol. Cancer Therap.1:553−563(2002)」を参照されたい）を開発してきた。
【００６４】
本発明は又、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を含む適用で、実施可能である。ＦＡＣＳは、可溶性ＴＣＲｓ又はその断片と標的細胞の相互作用を検出するために用いられる。例えば、可溶性ＴＣＲは、標準的方法に従って、ビオチン化され、例えば、標識されたｓｃ−ＴＣＲ四量体を形成するために、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＰＥ）と結合される。しかしながら、前述したように、多量体化はあまり必要とされない。ＦＡＣＳは、可溶性ＴＣＲと、Ｔ２細胞及び腫瘍細胞株のような適当な標的細胞との相互作用を定性的に測定するために用いられる。
【００６５】
以下の実施例は、遺伝子的にヒトＩＬ−２に結合する、ｐ５３アミノ酸残基２６４〜２７２番にわたる未変異のｐ５３ペプチドを認識する、一本鎖の可溶性ＨＬＡ−Ａ２．１限定性のＴＣＲを含む新規融合タンパク質の構築及び特徴を示す。分子のＩＬ−２部分のＩＬ−２受容体特異的な結合能や生物活性と同様に、ペプチドが収容されているＨＬＡ−Ａ２と、分子のＴＣＲ部分のペプチド特異的な結合が検討された。実施例は、これらのタイプのＴＣＲベースの融合タンパク質が、抗体ベースの標的化腫瘍療法に代わるものとして、又は抗体ベースの免疫サイトカインのようなその他の標的化腫瘍療法への付加的なものとして提供されることを示す。腫瘍を標的化するための分離及び識別方法が、相加的又は相乗的な抗腫瘍効果を示す可能性がある。
【００６６】
実施例はさらに、ＨＬＡ−Ａ２．１としてヒトｐ５３ペプチド（ａａ２６４〜２７２）を認識する、３つのドメインからなる可溶性のマウスｓｃＴＣＲの構築及び発現を示す。３つのドメインからなるｓｃＴＣＲは、ヒトＩＬ−２に結合して、哺乳動物の細胞で高発現され分泌される可溶性２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を産生する。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＴＣＲ部分は、ＭＨＣ限定性であり、ペプチド特異的抗原を結合する特性があり、ＩＬ−２部分がＩＬ−２受容体に結合し、そして、生物学的に活性である。その上、実施例はさらに、この融合タンパク質が、標的細胞とエフェクター細胞を結合させ、マウス内で好ましい薬物動態を示し、標的腫瘍細胞に結合可能であり、抗腫瘍効果を持つことを示す。それゆえ、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、抗体ベースの免疫療法では認識不可能であった、標的化免疫療法に向けての抗原のその他のレパートリーへのアクセスを提供するものである。ＴＣＲベースの治療は、抗体ベースの治療に変わるものとして、又はその他の標的化腫瘍療法に対する有用な付加的な療法となる。
【００６７】
本発明には、可溶性ＴＣＲが、ペプチド抗原を良好に検出できる十分な親和性を有していることが開示されている。特に、２６４ｓｃＴＣＲの親和性は、遺伝子操作されていない腫瘍細胞に結合する、また、標的細胞とエフェクター細胞を効果的に結合させるのに十分な親和性を有している。
【００６８】
腫瘍を治療するためのサイトカインの全身性投与をめぐって報告された問題は、血清の半減期が短いことと、これらタンパク質の毒性である。重要なのは、本発明の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質は、約３時間の見かけ上の血清半減期を有し、血液中に原型のまま残存するということである。このように２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質は、効果的にＩＬ−２の半減期を増大させ、血液中に原型のまま残存させる。このことは、当該タンパク質が免疫修飾がん療法のための新しい試薬であることを示唆している。実施例で用いられたより高濃度の投与量で、本発明の融合タンパク質の血清の半減期は、増大し［文献３、２５、３７及び３８参照］、それによりさらにその分子の腫瘍に対する効果が改善される。
【００６９】
腫瘍部位に濃縮されたＩＬ−２は、他のＩＬ−２反応性細胞と同様に、局所Ｔ細胞を活性化し、それによりエフェクター細胞を腫瘍部位へ集めるとの認識がある。このように、腫瘍部位にＩＬ−２を濃縮させることにより、本発明のＴＣＲ融合分子は、生来の免疫系のＮＫ細胞又は他のメンバーの活性化と同様に、様々なＴ細胞クローンの活性化と増殖を含む明確な免疫応答を増強する可能性がある。そのような多面的な抗腫瘍応答は、遠隔転移と同様に初期の腫瘍の撲滅により効果的であろう。
【００７０】
データは、ＴＣＲ及びサイトカインを含む生物学的に活性な２機能性分子を構築することが可能であることを示す。この融合タンパク質は、腫瘍細胞に結合でき、標的細胞とエフェクター細胞の結合を仲介し、妥当な薬物動態特性を持つ。ｐ５３とは別に、アップレギュレーションされ、腫瘍又はウィルス感染細胞上にＭＨＣとして提示されるその他の遺伝子産物も、標的として本発明のＴＣＲベースの免疫療法に用いることができる。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、又はＩＦＮαのようなその他の免疫修飾分子は、ＴＣＲに結合され、抗腫瘍又は抗ウィルス応答のためにその他のエフェクター細胞を活性化する。これらの新規ＴＣＲ融合物は、がんやウィルス感染の治療のための免疫療法の新しい分類を形成する。
【００７１】
「特異的結合」という用語又は類似の用語は、本明細書に開示された分子が他の分子に結合し、それにより特異的な結合対を形成すること、を意味する。しかしながら、この分子は、例えばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、移動度シフトアッセイ、酵素免疫アッセイ、競合アッセイ、飽和アッセイ、又は他の当該技術部分野公知のタンパク質結合アッセイによって決定されるようなその他の分子を認識、結合しない。一般的に、例えば分子間の特異的結合を検出するための方法については、上記のＡｕｓｕｂｅｌらの文献、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅの「Antibodies: A Laboratory Manual (1988)」及びそこに引用された参考文献を参照されたい。
【００７２】
「完全に可溶性の」という用語又はその類似の用語は、ＴＣＲについて述べれば、例えば細胞の培地といった水溶性緩衝液で、低Ｇでの遠心分離によってで容易に沈殿しないことを意味する。さらに、ｓｃ−ＴＣＲ融合タンパク質は、低濃度のアニオン性又は非イオン性の界面活性剤の存在下及び非存在下、約５〜３７℃より高い温度かつ中性付近のｐＨで、水溶液のままでいるならば、可溶性である。これらの条件下、可溶性タンパク質はしばしば、例えば約１０〜５０スベドベリ単位より小さい低い沈降価を有する。本明細書で言及される水溶液は、通常ｐＨ約５〜９を確立する緩衝化合物を含み、イオン強度の範囲が約２ｍＭ〜５００ｍＭである。プロテアーゼ阻害剤又は穏やかな非イオン性界面活性剤が加えられてもよく、必要であれば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなキャリアタンパク質が、数ｍｇ／ｍＬまで加えられてもよい。水性緩衝液の例としては、標準的なリン酸緩衝液生理食塩水、トリス緩衝液生理食塩水、又はその他の公知の緩衝液及び細胞の培地製剤を含む。
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、何ら本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７３】
ＴＣＲ融合タンパク質構築物の産生
ヒトＩＬ−２に融合したｐ５３ペプチド抗原に特異的な、３つのドメインをもつ、ＨＬＡ−Ａ２．１限定性マウスＴＣＲを含む融合タンパク質を産生した。ＴＣＲ融合タンパク質構築物として、ヒトｐ５３ペプチド（ａａ２６４〜２７２）に特異的なＴＣＲｓを産生するマウスＴ細胞株から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによりＶα及びＶβ／Ｃβ領域（region）を産生した。ＴＣＲα鎖（Ｖα３）可変領域のカルボキシル末端は、ＴＣＲの抗原結合部分を産生するために、柔軟なリンカー（Ｇ４Ｓ）４［文献２１参照］を介して、Ｖβ（Ｖβ３）のＮ末端に結合した。Ｖβドメインに直接結合するＣβドメインは、一本鎖の可溶性ＴＣＲ分子を産生するために、最終システイン直前のアミノ酸残基で切断して膜貫通及び細胞質ドメインを除去した（図１Ａ及び１Ｂ）。ヒトＩＬ−２を、短いリンカー（アミノ酸配列 ＶＮＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶ；配列番号１）を介してＴＣＲ部分に融合した。ＥＥ標識（アミノ酸配列ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ；配列番号２）［文献１１参照］は、必要であれば、ＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を抗ＥＥ標識ｍＡｂによって検出可能にするために、融合分子のＩＬ−２部分のすぐ下流に挿入した。ＣＭＶプロモータによって哺乳動物細胞の発現を駆動し、抗体の軽鎖のリーダー配列によって分泌を方向付け、Ｇ４１８耐性にて選別した。
【００７４】
図１を、以下に、詳細に説明する。
図１Ａは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のドメイン構造を模式的に示すものである。
図１Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のアミノ酸配列である。
融合タンパク質のそれぞれのドメインのアミノ酸番号を図中に示す。
【実施例２】
【００７５】
哺乳動物細胞に於けるＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の発現
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の性状を検討するために、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２構築物を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に安定に形質転換した。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を分泌する安定な形質転換体は、材料と方法の欄に記載されるようにＥＬＩＳＡアッセイを用いて選択した。これらのＥＬＩＳＡに於ける陽性シグナルは、形質転換した細胞が、抗マウスＴＣＲ及び抗ヒトＩＬ−２抗体両方ともに認識される２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を分泌していることを示し、更に分泌された２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２が形質転換した細胞内で、適切に集合し、折りたたまれていること、及び細胞から分泌されたときに原型のままで存在すること、を示唆している。
【００７６】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質は、免疫親和性クロマトグラフィで上清１リットル当たり約１．８ｍｇの収量で細胞上清から精製した。精製し融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色した。還元又は非還元条件下、主として存在する染色バンドは、このタンパク質の予想分子量に一致する約６０ｋＤａ（図２）に移動し、このことは融合タンパク質が細胞から分泌されるときに、予期されない分子内ジスルフィド結合を形成することなく原型のままでいることを示している。非還元ゲルに於ける大きなバンドは、融合タンパク質の２量体である。この結論は、大きなバンドは見かけ上、融合タンパク質の分子量の約２倍の分子量を有していること、そしてこのバンドは還元条件下では融合タンパク質の大きさに減少するという観察に基づいている。データは、形質転換されたＣＨＯ細胞は、予想された分子量の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を産生すること、そして適切に折りたたまれ、集合し、可溶性融合タンパク質として分泌されることを示している。
【００７７】
図２を、以下に、詳細に説明する。
ＣＨＯ細胞を、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２発現ベクターで安定に形質転換した。分泌された融合タンパク質は、免疫親和性クロマトグラフィで精製し、図の上部に示されるように還元又は非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、クーマシーブリリアントブルーで染色した。
【実施例３】
【００７８】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＴＣＲ部分のＭＨＣ／ペプチド結合能
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のペプチドを収容したＭＨＣへの結合能をフローサイトメトリーで測定した。ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）又はｐ５３（ａａ１４９〜１５７）（対照）ペプチドを収容したＴ２細胞を、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質で染色した。ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）を収容した細胞は、抗ＴＣＲ ＣβｍＡｂ又は抗ＩＬ−２検出抗体のいずれかでの検出で、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２により陽性に染色された。ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）対照ペプチドを収容した細胞は、抗ＴＣＲ ＣβｍＡｂ又は抗ＩＬ−２検出抗体のいずれによっても染色されなかった。ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）を収容したＴ２細胞が染色されないのは、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチドがＨＬＡ−Ａ２に対し結合不能であるためではないことを証明するために、ペプチドを収容していないＴ２細胞、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチドを収容したＴ２細胞又はｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチドを収容したＴ２細胞をそれぞれＢＢ７．２αＨＬＡ−Ａ２モノクローナル抗体で染色した。何れのｐ５３ペプチドを収容した細胞も、ペプチドを収容しなかった細胞に比べて強く染色された。このことは、両ペプチドはＨＬＡ−Ａ２分子に結合可能であることを示した（図３Ｃ）。また、Ｔ２細胞をＩＬ−２受容体について調べるために染色したが、ＩＬ−２受容体を発現していないことが分かった。これらのデータは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の結合が、融合タンパク質のＴＣＲ部分によって仲介されていることを示している。Ｔ２細胞が対照ペプチドを収容している場合に融合タンパク質によって染色されなかったこともまた、染色がＴＣＲ部分を介してなされること、及び、染色が適切なペプチドに特異的であることを示している。これらのデータは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＴＣＲ部分がその特異的なペプチドをＨＬＡ−Ａ２として認識することが可能であることを示している。
【００７９】
図３を、以下に、詳細に説明する。ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチド（灰色の線）又はｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチド（黒い線）を収容したＴ２細胞は、
図３Ａ）２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質及び抗ＴＣＲ ＣβｍＡｂで染色されているか、又は
図３Ｂ）２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質及び抗ＩＬ−２ｍＡｂで染色されているかの何れかである。
図３Ｃ）ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチド（暗い灰色の線）を収容したＴ２細胞、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチド（明るい灰色の線）を収容したＴ２細胞、又はペプチドを収容していない（黒い線）Ｔ２細胞は、抗ＨＬＡ−Ａ２ ＢＢ７．２ｍＡｂで、次いでＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧで染色した。影をつけたピークは、染色されていないＴ２細胞である。
【実施例４】
【００８０】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分のＩＬ−２受容体結合能
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分のＩＬ−２受容体結合能は、フローサイトメトリーによって検討された。マウス初代脾臓細胞を単離し、Ｔ細胞芽細胞を産生するために、ｒＩＬ−２及び抗ＣＤ３で刺激した。ＩＬ−２受容体を発現する刺激した脾臓細胞は、ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）を収容したＨＬＡ−Ａ２四量体で、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在下でのみ陽性に染色された（図４Ａ）。同様に、ＣＴＬＬ−２マウス細胞傷害性のＴリンパ細胞は、恒常的にＩＬ−２受容体を発現しているが、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質により、陽性に染色されたが、２６４ｓｃＴＣＲ／κ融合タンパク質では染色されなかった（図４Ｂ）。ＣＴＬＬ−２細胞をα−ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体又はアイソタイプの対照抗体、次いで２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２とインキュベートすると、細胞をブロッキング抗体とインキュベートしたときには染色は実質的に減少したが、アイソタイプの対照抗体では減少しなかった。２６４ｓｃＴＣＲ／マウスκ鎖融合タンパク質又はＩＬ−２受容体ブロッキング抗体とインキュベートしたＣＴＬＬ−２細胞からシグナルが欠如したことは、これらの細胞の染色が２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分によって仲介されていることを示している。これらのデータは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分が、ＩＬ−２受容体に結合できることを示唆している。
【００８１】
図４を、以下に、詳細に説明する。
図４Ａ）マウス脾臓細胞を、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３εｍＡｂで刺激し、その後、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在下（灰色の線）又は非存在下（黒い線）でインキュベートした。結合した融合タンパク質は、ＰＥ標識したＨＬＡ−Ａ２ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）四量体で検出された。
図４Ｂ）ＣＴＬＬ−２細胞を、α−ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体又はアイソタイプの対照抗体、次いで２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２又は２６４ｓｃＴＣＲ／κ融合タンパク質とインキュベートした。結合した融合タンパク質は、ＰＥ標識したα−ＴＣＲ−Ｖβ３抗体で検出した。影のついたピークは、染色されていないＣＴＬＬ−２細胞である。
黒い線：２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２だけで染色したＣＴＬＬ−２細胞。
灰色の点線：対照抗体に次いで２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２で染色したＣＴＬＬ−２細胞。
明るい灰色の線：α−ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体、次いで２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２でインキュベートしたＣＴＬＬ−２細胞。
暗い灰色の線：２６４ｓｃＴＣＲ／κ融合タンパク質で染色したＣＴＬＬ−２細胞。
黒いダッシュの線：α−ＴＣＲ-Ｖβで染色したＣＴＬＬ−２細胞。
【実施例５】
【００８２】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の生物学的活性
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分の生物学的活性を実証するため、ＩＬ−２依存性のＣＴＬＬ−２細胞を、様々な濃度の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２又は組み換えＩＬ−２のいずれかと共に培養し、細胞の生存率をＷＳＴ−１を用いて評価した。図５Ａに示されるように、ｒＩＬ−２又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２のＣＴＬＬ−２細胞の増殖を支援する能力は、投与量依存性であり、ここに於いて、組み換えＩＬ−２又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２のいずれかをより高濃度にしたときに、より多くの細胞増殖がみられた。さらに、組み換えＩＬ−２又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２のいずれかを同等モル量を使用したとき、細胞の増殖は同様のレベルであった。特異性に対する更なる対照として、ＣＴＬＬ−２細胞を、α−ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体又はアイソタイプの対照とともに２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２とインキュベートした。培養物にブロッキング抗体が含まれた場合、増殖はブロッキング抗体の濃度の減少とともに実質的に減少したが、ＣＴＬＬ−２細胞の増殖は、いずれの濃度の対照抗体の影響も受けなかった（図５Ｂ）。このデータは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２のＩＬ−２部分がインビトロで組み換えＩＬ−２と同様な生物学的活性を有すること、及び融合タンパク質の増殖活性がその分子のＩＬ−２部分に依存していること、を示している。
【００８３】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の同起源のＭＨＣ／ペプチドに対する解離定数は、表面プラズモン共鳴検出法によって生理的な条件下で、約１０−７Ｍであることが分かった。
【００８４】
図５を、以下に、詳細に説明する。
図５Ａ）ＣＴＬＬ−２細胞を、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２（実線）又は組み換えＩＬ−２（点線）と共に、図の下段に示されるような様々な濃度で培養した。
図５Ｂ）ＣＴＬＬ−２細胞を、図の下段に示されるような２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２及びα−ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体又はアイソタイプの対照抗体と共に、インキュベートした。細胞の生存率は、ＷＳＴ−１と共にインキュベートして測定し、吸光度は４５０ｎｍで測定した。
Ｃａｂ＋５：５μｇ対照抗体；Ｃａｂ＋５０：５０μｇ対照抗体；Ｂａｂ＋５：５μｇブロッキング抗体；Ｂａｂ＋５０：５０μｇブロッキング抗体
【実施例６】
【００８５】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質により仲介される細胞の結合
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の有用な特性は、そのＴＣＲ及びサイトカイン部分の各々により、標的細胞及びエフェクター細胞を結合させる能力にある。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質が細胞を効果的に結合させることができることを実証するために、Ｔ２細胞を、ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）又はｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチドのいずれかで収容し、その後ジヒドロエチジウム（ＨＥ）で標識した。ＣＴＬＬ−２細胞を、カルセインＡＭで標識し、二つの標識された細胞集団を、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在下又は非存在下で混合し、インキュベートした。試料を、フローサイトメトリーで分析した。二つの細胞集団を２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の非存在下でインキュベートした時（図６Ａ及び６Ｂ）、又はＴ２細胞に対照ペプチドを収容し、ＣＴＬＬ−２細胞と２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在下でインキュベートした時（図６Ｃ）、フローサイトメトリーヒストグラム上では、細胞群は二つの異なる集団に含まれたが、総集団の約４５％が各々（図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃの領域１及び３に）示されており、総集団の約０．４６％のみが、二重染色されたセルウィンドウ（図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃの領域２）に示された。しかしながら、Ｔ２細胞をｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチドを収容し、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在下で、ＣＴＬＬ−２細胞とインキュベートした場合（図６Ｄ）、２重染色された細胞集団は、全集団の４．１％（図６Ｄの領域２、結合細胞）であり、このことは、Ｔ２細胞が２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を介してＣＴＬＬ−２細胞に結合していることを示唆している。
【００８６】
図６を、以下に、詳細に説明する。
Ｔ２細胞を、ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）（図６Ｂ及び６Ｄ）又はｐ５３（ａａ１４９〜１５７）（対照）ペプチド（図６Ａ及び６Ｃ）のいずれかで収容し、その後ＨＥで標識した。ＣＴＬＬ−２細胞を、カルセインＡＭで標識した。標識された細胞を、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在下（図６Ｃ及び６Ｄ）又は非存在下（図６Ａ及び６Ｂ）で混合して、インキュベートし、次いで試料をフローサイトメトリーで分析した。収容に使用されたペプチド及び融合タンパク質の存在又は非存在といったアッセイ条件を、各ヒストグラムの下に示す。一重染色領域は、１及び３の番号で示され、２重染色された細胞集団は２番で示されている。
【実施例７】
【００８７】
マウスに於ける２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の薬物速度論
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の薬物速度論は、ＢＬＡＢ／ｃマウスを用いて測定した。薬物をマウスに、経静脈的に投与し、様々な経過時点での血清試料を回収した。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の血清レベルは、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＥＬＩＳＡ検出は、融合タンパク質がインビボで修飾されているか、又は切断されているかを決定するために、抗ＴＣＲｍＡｂ捕獲／抗ＩＬ−２Ａｂ検出（図７Ａ）、抗ＴＣＲｍＡｂ捕獲／抗ＴＣＲｍＡｂ検出（図７Ｂ）、又は抗ＩＬ−２ｍＡｂ捕獲／抗ＩＬ−２ポリクローナルＡｂ検出（図７Ｃ）を用いて実施した。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を注入されたマウスは、毒性の兆候をまったく示さなかった。これらのアッセイに於いて、使用したＥＬＩＳＡ形式により、見かけ上の血清中半減期が１．６〜３．０時間で、最大濃度０．７５〜２．５μｇ／ｍＬの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２が検出された（図７）。報告されているフリーのＩＬ−２の血清中半減期は、約５分であるので［文献６参照］、これらのデータは、融合タンパク質がインビボで切断されておらず、その代わり血液中で比較的長期間にわたり原型のまま残存することを示している。これらの検討で測定された２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の半減期に於ける小さなぶれは、多分に、ＥＬＩＳＡアッセイの感度の違いによるものである。
【００８８】
図７を、以下に、詳細に説明する。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を注入し、血清試料を、注入後１５、３０分、１、４、８、２４時間後に集めた。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２の血清濃度は、以下の形式を用いて、ＥＬＩＳＡにより測定した。
７Ａ）抗ＴＣＲｍＡｂ捕獲／抗ＩＬ−２Ａｂ検出；
７Ｂ）抗ＴＣＲｍＡｂ捕獲／抗ＴＣＲｍＡｂ検出；及び
７Ｃ）抗ＩＬ−２ｍＡｂ捕獲／抗ＩＬ−２Ａｂ検出
【実施例８】
【００８９】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２による腫瘍細胞の染色
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質が、標的の腫瘍細胞を認識し、結合できれば、有用である。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２が腫瘍細胞に結合することができるかどうかを試験するため、ＨＬＡ−Ａ２．１及びｐ５３の両方を発現している、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞を、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２又は無関係なＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質である３Ｃ８、のいずれかで染色した。融合タンパク質とインキュベートしていない細胞及び３Ｃ８とインキュベートした細胞は、Ｈ５７−５９７検出抗体により陽性に染色されないが、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２とインキュベートした細胞は検出抗体で陽性に染色された（図８）。この結果から、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質が、標的の腫瘍細胞を認識し、結合できること、そしてインビボ抗がん治療として役に立つことが示唆される。
【００９０】
図８を、以下に、詳細に説明する。
Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞を、融合タンパク質なし（黒いダッシュの線）、５μｇの３Ｃ８ＴＣＲ／ＩＬ−２融合たんぱく質（対照）（点線）、又は５μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質（黒い実線）とインキュベートし、次いで、Ｈ５７−５９７ｍＡｂで染色した。染色されなかった細胞は、影のついた領域で示す。
【実施例９】
【００９１】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の抗腫瘍効果
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質がインビボで抗腫瘍効果を持つかどうかを決定するために、実験的転移アッセイを実施した。メスの胸腺欠損ヌードマウスに、高転移性Ａ３７５ヒトメラノーマサブクローンであるＡ３７５−Ｃ１５Ｎを注入し、様々な投与量の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２又は組み換えＩＬ−２のいずれかで処置した。腫瘍細胞注入後４２日で、肺の小塊をカウントした。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２と組み換えＩＬ−２の両方とも、投与量依存的に肺転移を減少させた（図９）が、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の方が、全ての投与量に於いて、肺転移を大きく減少させた。このことは、サイトカインを腫瘍に標的化することは、がん治療として大きな効果をもたらすものであることが示唆される。
【００９２】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２又は組み換えＩＬ−２のいずれかで処理されたマウスは、目立った毒性の兆候を示さなかった。両治療はともに、結果的に肺転移を減少させたが、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２による治療は、全ての投与量に於いて、組み換えＩＬ−２による治療に較べより効果的であった。
【００９３】
図９を、以下に、詳細に説明する。
メスの胸腺欠損ヌードマウスに、高度に転移性のＡ３７５−Ｃ１５Ｎ細胞を注入し、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２、組み換えＩＬ−２、又はＰＢＳで処理した。腫瘍細胞の注入の４２日後、肺を摘出し、肺の小塊をカウントし、次いでＰＢＳ処理した対照群に対応する肺の小塊数の平均をプロットした。
【実施例１０】
【００９４】
単量体及び多量体の２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質による、ペプチドを収容したＴ２細胞の染色についてのフローサイトメトリー分析
様々な２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の単量体や多量体を調製し、それらのＴ２細胞に対する結合挙動を、以下のセクション１１及び１２に記載される方法で、フローサイトメトリーにより分析した。その結果、図１０に示されるように、２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容したＴ２細胞を、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）を収容した細胞より強く染色した（図１０Ａ、１０Ｂ）。図中では、染色されていないＴ２細胞は、Ｔ２ １４９非染色００１と表示されたヒストグラム中に示されている；第２の試薬（Ｈ５７−ＰＥ）で染色した、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）及びｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容したＴ２細胞は、それぞれ「Ｔ２ １４９ Ｈ５７．００２」及び「Ｔ２ ２６４ Ｈ５７．００９」と表示されたヒストグラム中に示されている；多量体の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１に次いでＨ５７−ＰＥで染色した、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）及びｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容したＴ２細胞は、それぞれ「Ｔ２ １４９ ＩｇＧ Ｈ５７．００３」及び「Ｔ２ ２６４ ＩｇＧ Ｈ５７．０１０」と表示されたヒストグラム中に示されている；２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２に次いでＨ５７−ＰＥで染色したｐ５３（ａａ１４９〜１５７）及びｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容したＴ２細胞は、それぞれ「Ｔ２ １４９ ＩＬ２ Ｈ５７．００４」及び「Ｔ２ ２６４ ＩＬ２ Ｈ５７．０１１」と表示されたヒストグラム中に示されている；単量体の２６４ｓｃＴＣＲ／ｔｒｕｎＩｇＧ１に次いでＨ５７−ＰＥで染色したｐ５３（ａａ１４９〜１５７）及びｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容したＴ２細胞は、それぞれ「Ｔ２ １４９ ｔｒｕｎ Ｈ５７．００５」及び「Ｔ２ ２６４ ｔｒｕｎ Ｈ５７．０１２」と表示されたヒストグラム中に示されている；そして単量体の２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡに次いでＨ５７−ＰＥで染色したｐ５３（ａａ１４９〜１５７）及びｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容したＴ２細胞は、それぞれ「Ｔ２ １４９ ｂｉｒＡ Ｈ５７．００６」及び「Ｔ２ ２６４ ｂｉｒＡ Ｈ５７．０１３」と表示されたヒストグラム中に示されている。この結果は、観察した染色がペプチド特異的であることを確証づけた。
【００９５】
単量体型２６４ｓｃＴＣＲは、ある程まで度染色することができた。例えば、２６４ｓｃＴＣＲ／ｔｒｕｎＩｇＧ型で染色したときの平均チャネル蛍光（ＭＣＦ）は、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）を収容した細胞では１０．９５であるのに対し、ｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容した細胞では５５．３４と増大した。同様に、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ型に対するＭＣＦは、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）を収容した細胞では１３．４１であったのに対し、ｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を保持した細胞では９５．１４と増大した。多量体の２６４ｓｃＴＣＲは、より顕著にペプチドを収容したＴ２細胞を特異的に染色できた。例えば、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１型で染色したときのＭＣＦは、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）を収容した細胞では１１９であったのに対し、ｐ５３（ａａ２６４〜２７３）を収容した細胞では８６３と増大した。
【実施例１１】
【００９６】
２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質による腫瘍細胞の染色
２６４ｓｃＴＣＲ試薬が腫瘍細胞を染色する能力もまた試験された。培養したＡ３７５細胞を、１０ｍＭのＥＤＴＡを添加したＰＢＳ（ｐＨ７．４）で接着を剥がし、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。細胞染色は、４μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質を用いて、２３℃にて４５分間実行された。細胞を一回洗浄し、３μｇのＦＩＴＣ結合のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃのＦ（ａｂ’）２断片（抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣ）で染色した。２回洗浄した後、染色細胞を、再び縣濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎで分析した。抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣ抗体のみで染色したＡ３７５細胞を、対照として用いた
。
【００９７】
図１１Ａに示されるように、この分析の結果は、Ａ３７５腫瘍細胞が２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質で染色できることを示している。このパネル（図１１Ａ）に於いて、抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣのみで、又は抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣ／ＩｇＧ１に次いで抗ＩｇＧ−ＦＩＴＣで染色したＡ３７５細胞は、それぞれ「３７５−ＦＩＴＣ．００５」及び「Ａ３７５−２６４．ＦＩＴＣ．００６」と表示されてヒストグラム内に示されている。Ａ３７５腫瘍細胞を用いた付加的な実験は、さらに最適な染色条件を特徴付けるために実施された。例えば、ＰＥ結合の抗ヒトＩｇＧ抗体（抗ＩｇＧ−ＰＥ）（図１１Ｂ）又はＰＥ結合のＨ５７ｍＡｂ（図１１Ｄ）は、ＦＩＴＣ結合抗体の代わりに二次試薬として用いられた。図１１Ｂに於いて、抗ＩｇＧ−ＰＥのみ、又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１に次いで抗ＩｇＧ−ＰＥで染色されたＡ３７５細胞は、それぞれ「Ａ３７５−ＰＥ．００７」及び「Ａ３７５−２６４．ＰＥ．００８」と表示されてヒストグラム内に示されている。図１１Ｄに於いて、Ｈ５７−ＰＥのみ、又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１に次いでＨ５７−ＰＥで染色されたＡ３７５細胞は、それぞれ「Ａ３７５−Ｈ５７ＰＥ．００９」及び「Ａ３７５−２６４．Ｈ５７ＰＥ．０１０」と表示されてヒストグラム内に示されている。それぞれの場合に於いて、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１は、Ａ３７５腫瘍細胞を染色した。ストレプトアビジン−ＰＥ（ＳＡ−ＰＥ）を用いて多量体化されたビオチン化２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡは又、Ａ３７５細胞を染色するために用いられ（図１１Ｃ）、そしてストレプトアビジン−ＰＥのみで染色された細胞と比べて、増大した染色を示した。図１１Ｃでは、ＳＡ−ＰＥのみ又はＳＡ−ＰＥで複合体化されたビオチン化２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡで染色されたＡ３７５細胞は、それぞれ「Ａ３７５−ＳＡＰＥ．００１」及び「Ａ３７５−２６４ＢｔｎＳａＰＥ．００２」と表示されてヒストグラム内に示されている。
【実施例１２】
【００９８】
フローサイトメトリーで検出される２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質により固定された細胞の染色
考察のように、保存又は「固定された」試料のＭＨＣ／ペプチド複合体を検出することは、特に患者から取得した細胞、組織、又は他の生物学的試料を固定するのが通常である臨床又は他の医学的環境に於いて、有用性がある。しかしながら、ＭＨＣ／ペプチド複合体は３つの分離したペプチド鎖からなる細胞表面抗原であるため、通常の固定化手順の後の可溶性ＴＣＲによる検出の際に、ＭＨＣ／ペプチド複合体の完全な構造が十分原型をとどめていられるかどうか定かではない。可溶性ＴＣＲの染色が、固定された細胞上で実施できたかどうかを評価するために、ペプチドを収容したＴ２細胞及び遺伝子操作がなされていないＡ３７５細胞を、フローサイトメトリーで分析した。培養細胞Ａ３７５は、１０ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で接着を剥がし、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。Ｔ２細胞は、５０μＭのｐ５３（ａａ２６４〜２７３）で３時間インキュベートし、その後洗浄用緩衝液で２回洗浄した。両方の細胞は、３．７％のホルムアルデヒドで５分間固定し、２回洗浄した。細胞染色は、４μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１又はＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質を用いて、２０μｇのＨＬＡ−Ａ２．１／ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）四量体の存在下又は非存在下、２３℃で４５分間実施した。細胞を一回洗浄し、３μｇのＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃのＦ（ａｂ’）２断片で染色した。染色された細胞は、２回洗浄した後、再縣濁して、ＦＡＣＳｃａｎで分析した。
【００９９】
図１２Ａに示されるように、その結果では、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質が、ホルムアルデヒド固定Ａ３７５細胞を陽性に染色した（ヒストグラムは「Ａ３７５Ｆ−２６４．００６」と表示されている）のに対して、ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１による染色はバックグラウンドを超えて検出されない（ヒストグラムは「Ａ３７５Ｆ−ＣＭＶ．００５」と表示されている）ことを、示していた。ＣＭＶペプチドはＡ３７５細胞上に存在しないので、ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１対照試薬の使用で、ＴＣＲ又はＩｇＧ１ドメインと腫瘍細胞間のあらゆる非特異的相互作用が測定できる。この方法は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質とＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１対照との腫瘍細胞染色に於ける違いを測定することにより、固定された腫瘍細胞試料の表面に存在する腫瘍抗原のレベルを直接測定可能にする。
【０１００】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質によるＡ３７５細胞染色がＴＣＲ特異的であることを確認するため、ＨＬＡ−Ａ２．１／ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）四量体をブロッキング試薬として用いた。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１によるＡ３７５細胞の染色度は、ＨＬＡ−Ａ２．１／ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）四量体ブロッキング試薬の添加により低減し（ヒストグラムは「Ａ３７５Ｆ−２６４ＴＥＴ．２６４．００８」と表示されている）、さらに２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１が特異的に腫瘍細胞に結合できることを示した。予想されたように、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１で染色したＡ３７５細胞にＨＬＡ−Ａ２．１／ｐＣＭＶ四量体試薬を添加しても、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１試薬の特異的な染色には何の影響も及ぼさなかった（ヒストグラムは「Ａ３７５Ｆ−２６４ＴＥＴ．ＣＭＶ．００７」と表示されている）。同様の結果は、ペプチドを収容したＴ２細胞に於いても見られた（図１２Ｂ）。
【０１０１】
これらの結果は、単量体及び多量体の可溶性ＴＣＲ試薬が、ＭＨＣ複合体としてペプチドを提示している細胞を特異的に染色できることを示している。さらに、可溶性ＴＣＲ試薬は、ＭＨＣ複合体として腫瘍抗原を提示している、固定されていない及び固定されている腫瘍細胞を特異的に染色できる。加えて、可溶性ＴＣＲ試薬による細胞の特異的な染色度は、可溶性ＴＣＲ試薬に結合する完全なＭＨＣ分子の添加によって低減される。対照染色反応に於いて、完全なＭＨＣ分子を、可溶性ＴＣＲ試薬に対し１〜１００倍モルの過剰量にて添加することは、可溶性ＴＣＲ染色の非特異的な結合の構成に対して特異的な結合の構成（すなわちペプチドＭＨＣに対する結合）を区別するのに、特に有用である。これにより、異なる細胞及び組織の染色を比較する場合に、非特異的及び特異的な可溶性ＴＣＲ結合の異なった程度を示すことができる。例えば、異なる試料（細胞又は組織）間に於ける可溶性ＴＣＲの非特異的な結合のばらつきは、対照染色反応に於いて適切な完全なＭＨＣ分子を使用しないで、特異的な可溶性ＴＣＲ結合の程度を決定することを極めて困難なものとする。
【実施例１３】
【０１０２】
免疫蛍光顕微鏡により検出される２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質による固定された細胞の染色
ＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３発現に於いて異なるいくつかの細胞株（すなわち、Ａ３７５、ＨＴ２９及びＳａｏｓ２）を、分析のために選び、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質又は対照の融合タンパク質ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１のいずれかで染色した。細胞を、カバースリップ上で２４時間培養し、その後３．７％のホルムアルデヒドで５分間固定し、次いで洗浄緩衝液（０．５％のＢＳＡ及び０．１％のアジ化ナトリウム入りＰＢＳ）で２回洗浄した。ＢＳＡは、非特異的なタンパク質結合を低減させるブロッキング試薬である。細胞を、５％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含む２００μＬのＰＢＳ中の１０μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１又はＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質で、２３℃にて４５分間染色した。ＮＧＳは、非特異的結合を低減させるブロッキング試薬である。細胞を２回洗浄し、３μｇのＦＩＴＣ結合のヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃのＦ（ａｂ’）２断片（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）で染色した。細胞を、２回洗浄し、その後平衡化緩衝液（Molecular Probe, Eugene, OR）で１回洗浄した。カバースリップは、スライドガラス上に、グリセロール緩衝液中の色あせ防止試薬（Molecular Probe, Eugene, OR）でマウントし、ネイルオイルで密閉した。スライドを、ＳＰＯＴ ＲＴカメラを有したニコン社製のエピ蛍光顕微鏡（Nikon, Tokyo, Japan）及びＳＰＯＴ ＲＴソフトウェアｖ３．２（Diagnostic Instrument, Sterling Heights, MI）を用いて、記録した。
【０１０３】
ＨＬＡ−Ａ２染色用に、固定した細胞を、１０μｇのＢＢ７．２、マウス抗ヒトＨＬＡ−Ａ２抗体により、５％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含む２００μＬのＰＢＳ中で、２３℃にて４５分間染色した。細胞を２回洗浄し、４μｇのＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃのＦ（ａｂ’）２断片（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）で染色した。細胞を、２回洗浄し、その後平衡化緩衝液（Molecular Probe, Eugene, OR）で１回洗浄した。カバースリップはマウントされ、上記に述べられたように、記録された。
【０１０４】
ｐ５３染色用に、固定した細胞を、２０分間０．２％のトリトンＸ−１００で透過性にし、その後、１０μｇのＰＡｂ１２２、マウス抗ｐ５３抗体により、５％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含む２００μＬのＰＢＳ中で、２３℃にて４５分間染色した。細胞を２回洗浄し、４μｇのＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃのＦ（ａｂ’）２断片（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）で染色した。細胞を、２回洗浄し、その後平衡化緩衝液（Molecular Probe, Eugene, OR）で１回洗浄した。カバースリップはマウントされ、上記に述べられたように、記録された。
【０１０５】
図１３に示すように、Ａ３７５細胞をＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３用に陽性に染色、ＨＴ２９をＨＬＡ−Ａ２用ではなくｐ５３用に陽性に染色、及びＳａｏｓ２細胞をｐ５３用ではなくＨＬＡ−Ａ２用に陽性に染色した。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１を用いた免疫蛍光染色では、Ａ３７５細胞だけが検出され、ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１では、一つの細胞も陽性に染色されなかった。これらの結果は、２６４ｓｃＴＣＲ試薬による陽性染色にはＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３抗原の存在が必要であることを確認するものである。どの腫瘍細胞株に於いても、非特異的なＣＭＶｓｃＴＣＲ試薬では、バックグラウンド染色は見られず、又、ＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３抗原が発現していない場合は、２６４ｓｃＴＣＲ試薬にても、バックグラウンド染色は見られなかった。
【実施例１４】
【０１０６】
２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を用いた定量的染色
ペプチドを収容したＴ２細胞に結合できる２６４ｓｃＴＣＲ複合体の数が、測定された。Ｔ２細胞を、様々な量のｐ５３（ａａ２６４〜２７３）と共に３時間インキュベートし、その後、洗浄用緩衝液で２回洗浄した。３．７μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ−ストレプトアビジン−ＰＥ四量体を用いて２３℃にて４５分間、細胞染色を実施した。２回洗浄後、染色された細胞を、再縣濁し、ＦＡＣＳｃａｎで分析した。一方、３．７６μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質を用いて２３℃にて４５分間、細胞染色を実施した。細胞を１回洗浄し、３μｇのＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ抗体で染色した。２回洗浄後、染色された細胞を、再縣濁し、ＦＡＣＳｃａｎで分析した。
【０１０７】
この分析結果は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体については図１４に、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１については図１５に示されている。２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体及び２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合物については共に、ｐ５３ペプチドの量が増大するに連れて、染色レベルの増大が観察された。細胞を染色する複合体の数を定量するために、染色細胞の蛍光強度のレベルを、ビーズ当たり既知量のＰＥ分子を持つ検量線用ビーズ（QuantiBRITE ＰＥビーズ；BD Biosciences）の蛍光強度と比較した。このようにフローサイトメーターを使用した、ＰＥ−染色細胞を定量する方法が提供された。
【０１０８】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体及び２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合物について様々な濃度のペプチドとの複合体／細胞を算出した数が、図１６にプロットされている。その結果は、４００ｓｃＴＣＲ複合体と同じ位少ない結合が染色細胞上に検出できることを示している。加えて、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合物に次いでＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた染色は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体を用いたときに見られる染色に比べて、約４〜１０倍強い染色度を示した。この増加はおそらく、同じ２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合物と反応する抗体及び／又は多様性抗体群に対するＰＥの結合がより高いレベルであることの結果である。
【０１０９】
これまでの考察から、定量的にＴＣＲ結合を検出するための上記方法は、珍しい抗原の検出を最適化するのに有用である。その方法は、腫瘍細胞に結合する２６４ｓｃＴＣＲ試薬を検出することに適用された。細胞を記載のように調製し、様々な量の２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ−ストレプトアビジン−ＰＥ四量体で、２３℃にて４５分間染色した。２回洗浄後、染色された細胞を、再縣濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎで分析した。一方、細胞染色は、様々な量の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質を用いて、２３℃にて４５分間実施した。細胞を１回洗浄し、２．５μｇのＰＥ結合Ｈ５７抗体で染色した。２回洗浄後、染色された細胞を、再縣濁し、次いでＦＡＣＳｃａｎで分析した。
【０１１０】
各場合に於いて、染色された細胞上の蛍光強度のレベルを、ビーズ当たり既知量のＰＥ分子を持つ検量線用ビーズの蛍光強度と比較することにより、細胞を染色する複合体の数を測定した。図１７Ａ及び１７Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ試薬量を増加したときのＡ３７５腫瘍細胞の染色度を示す。図１８及び１９はそれぞれ、３つの腫瘍細胞株（Ａ３７５、ＨＴ２９及びＳａｏｓ２）に於いて、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ及び２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１試薬量を増加したときに観察された、定量的な染色度を示す。ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３陽性のＡ３７５腫瘍細胞株は、両試薬で染色され、ＨＴ２９（ＨＬＡ−Ａ２陰性）及びＳａｏａ２（ｐ５３陰性）細胞株に比べて、２６４ｓｃＴＣＲ試薬に対し２．５倍多く結合した。さらに、２６４ｓｃＴＣＲ試薬の量が増えるにつれて、Ａ３７５細胞の特異的な染色度が増大した。５００程度に少ない染色複合体の差異の検出は、Ａ３７５細胞の染色を他の腫瘍細胞株のそれと比較することによって測定した。定量的染色についての検討の結果は、２６４ｓｃＴＣＲ試薬の細胞当たり３００〜５００程度に少ないＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体に対する特異的な結合を容易に検出できることを示している。加えて、これらの染色反応の感度は、異なるＴＣＲ及び二次試薬の使用により増強され、最適化される。
【実施例１５】
【０１１１】
２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質による操作されていない腫瘍組織の免疫組織化学染色
皮下腫瘍を産生するために、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞（１ｘ１０６）を、ヌードマウスの左肩に皮下注入した。腫瘍を、５００ｍｍ３まで成長させ、マウスは人道的に犠牲にした。腫瘍を、覆っている皮膚とともに摘出し、中性緩衝液ホルマリン中で一晩固定させた。転移性の肺小塊を産生するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１ｘ１０６）を、ヌードマウスの側部尾静脈に注入し、転移性の肺小塊を発達させた。１８日後、マウスを人道的に犠牲にして、肺を取り出し、次いで中性緩衝液ホルマリン中で固定した。固定された組織を、７０％、９０％、９５％、１００％（２回）エタノール中で連続的に３０分のインキュベーションし、次いでキシレン中で３０分間のインキュベーションを２回行い、脱水した。その後組織を、パラフィン中に包埋して、５μｍ切片を調製し、そして顕微鏡スライド上にマウントした。
【０１１２】
免疫組織化学染色のために、切片をキシレン中でそれぞれ５分間のリンスを２回行い、次いで１００％（２回）、９５％及び８５％のエタノール中でそれぞれ２分間、連続的にインキュベートし、再度水和した。ＰＢＳで５分間の洗浄を２回及び蒸留水による５分間の洗浄を１回行い、スライドを内因性のペルオキシダーゼを失活させるために３％の過酸化水素で５分間インキュベートし、その後蒸留水で５分間のインキュベートを１回行った。スライドを、抗原回復溶液（Ｄａｋｏ）中に置き、９７℃にて２０分間加熱した。スライドを、抗原回復溶液中で２０分間、室温になるまで冷やし、その後、ＰＢＳで５分間の洗浄を２回行った。
【０１１３】
非ＨＲＰで標識された二次試薬を用いる場合は、スライドをアビジン／ビオチンブロッキング溶液中でインキュベートし（それぞれの溶液で１０分）、次いでＰＢＳ中で５分間の洗浄を２回行う。スライドを、１％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含むＰＢＳ中で室温にて３０分間ブロッキングした。このブロッキング工程は、二次ヤギ抗体試薬の非特異的な相互作用によるバックグラウンド染色度を低減するために必要である。スライドはその後、１０μｇ（１％ＮＧＳ中１００μＬ当たり）の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質又は対照のＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質の存在下、又は非存在下で、室温にて４５分間インキュベートした。ＰＢＳ中で５分間の洗浄を２回行った後、スライドを、１．６μｇ（１％ＮＧＳ中２００μＬ当たり）のＨＲＰ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγのＦ（ａｂ’）２断片にて、室温で４５分間インキュベートした。スライドを、それぞれ５分間ＰＢＳで２回洗浄した。スライドを、ＤＡＢ溶液（Ｄａｋｏ）中でうすいバックグラウンドが現れるまで、インキュベートした。スライドを水道水でリンスし、ヘマトキシリンで１５秒間対比染色した。スライドを、水道水で洗浄後、１００％エタノールバスで３回、キシレンバスで３回、それぞれ３分間リンスし、その後パーマウント（Fisher）でマウントした。組織染色度のレベルを、光学顕微鏡で評価し、ＳＰＯＴ ＲＴカメラ及びＳＰＯＴ ＲＴソフトウェアｖ３．２（Diagnostic Instrument, Sterling Heights, MI）で記録した。
【０１１４】
Ａ３７５腫瘍切片を用いた典型的な免疫組織化学分析結果は、図２０及び２１に示される。その結果では、ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質又は二次抗体のみと比較して、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質でインキュベートしたとき、Ａ３７５組織切片は、より強く染色される（すなわち、より濃い色がついて見える）ことが示された。ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質を用いて観察されたバックグラウンド染色は、ヒトＩｇＧ１抗体に次いでＨＲＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体でインキュベートされたときに見えるものと同程度であり、このことはバックグラウンド染色がＩｇＧ１ドメインの組織切片との相互作用によるものらしいことを示している。さらに、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質によるマウス間質組織の染色は、Ａ３７５腫瘍組織の同じ切片に見られる染色よりかなり弱かった。これらの結果は、２６４ｓｃＴＣＲ試薬が、ヒト腫瘍試料を特定化するために通常使用される免疫組織化学的方法で、固定されたヒト組織切片を、特異的に染色できることを示している。
【実施例１６】
【０１１５】
２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質による腫瘍組織アレイの免疫組織化学的染色
ヒト腫瘍組織アレイは、商業的な供給元又はティッシュアレイリサーチプログラム（Tissue Array Research Program：ＮＣＩ）から得られる。染色のために、組織アレイのスライドを、それぞれキシレン中で５分間のリンスを２回行い、次いで１００％（２回）、９５％、及び８５％エタノールでそれぞれ２分間、連続的なインキュベーションにより、再度水和した。ＰＢＳによる５分間２回及び蒸留水による５分間１回の洗浄後、内因性のペルオキシダーゼを失活させるためにスライドを、３％の過酸化水素中で５分間インキュベートし、次いで蒸留水で５分間の洗浄を１回行った。スライドを、抗原回復溶液（Ｄａｋｏ）中に置き、９７℃にて２０分間加熱した。スライドを、抗原回復溶液中で２０分間室温まで冷却し、その後、ＰＢＳで５分間の洗浄を２回行った。非ＨＲＰで標識された二次試薬を用いる場合は、スライドをアビジン／ビオチンブロッキング溶液中でインキュベートし（それぞれの溶液で１０分）、次いでＰＢＳ中で５分間の洗浄を２回する。スライドを、１％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含むＰＢＳ中で室温にて３０分間ブロッキングし、その後、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質又はＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質（又は他の非結合ｓｃＴＣＲ試薬）の存在下、又は非存在下で室温にて４５分間インキュベートする。ＰＢＳ中で５分間の洗浄を２回行った後、スライドを、二次試薬（ＨＲＰ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ又はビオチン化された抗ＴＣＲＣβ抗体のいずれか）中、室温にて４５分間インキュベートする。スライドは、それぞれＰＢＳで５分間の洗浄を２回行う。
【０１１６】
非ＨＲＰ二次試薬を用いる場合は、スライドをストレプトアビジン・ペルオキシダーゼ溶液中で室温にて１５分間インキュベートし、次いでＰＢＳ中で５分間の洗浄を２回行う。一方、ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ−ストレプトアビジン・ペルオキシダーゼ試薬を、上記の試薬の代わりに染色試薬として用いてもよい。
【０１１７】
スライドは、ＤＡＢ溶液（Ｄａｋｏ）中でうすいバックグラウンドが現れるまで、インキュベートする。スライドは、水道水でリンスし、ヘマトキシリンで１５秒間、対比染色する。水道水で洗浄後、スライドを１００％エタノールで３回、キシレンで３回リンスし、その後パーマウント（Fisher）でマウントする。組織染色のレベルは、光学顕微鏡で評価し、例えばＳＰＯＴ ＲＴカメラ及びＳＰＯＴ ＲＴソフトウェアｖ３．２（Diagnostic Instrument, Sterling Heights, MI）で写真撮影する。
【０１１８】
ＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３を発現する腫瘍は、ＣＭＶｓｃＴＣＲ融合タンパク質と比較して、２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質でインキュベートされた場合、異なって染色されることが期待できる。組織アレイを融合タンパク質無しでインキュベートする場合、ほとんど又は全く染色されないことが予期される。さらに、ＨＬＡ−Ａ２及び／又はｐ５３に対して陰性の腫瘍組織は、ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３陽性の腫瘍組織と比べて、２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質により低減した染色度を示すことが期待される。これは、２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質により認識される腫瘍の型、その相対的な比率、についての有用な情報を与え、２６４ｓｃＴＣＲベースの治療により所定の型の腫瘍を治療する妥当性を決定する助けとなる。
【実施例１７】
【０１１９】
蛍光ＴＣＲ試薬によるインビボ腫瘍の画像化
発現ベクターは、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）又はＬｕｃ（ホタル・ルシフェラーゼ）に融合した２６４ｓｃＴＣＲを産生するために構築される。これらのベクターは、本明細書記載の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１発現ベクターから、ＩｇＧ１遺伝子断片をＧＦＰ又はＬｕｃをコードする配列に置き換えることにより、産生できる。これらのコード配列は、商業的に入手可能である（例えば、ＧＦＰ遺伝子に対してはｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Clontech）、Ｌｕｃ遺伝子に対してはｐＳＰ−Ｌｕｃ（Promega））。ベクターは、標準的なＰＣＲ法により適切なＤＮＡ配列を単離するための鋳型として用いられる。対照ＴＣＲ（すなわちＣＭＶｓｃＴＣＲ）のＧＦＰ及びＬｕｃへの融合物の発現ベクターは、同じ方法で産生可能である。ある適用では、これらの発現ベクターは、ＣＨＯ細胞のような形質転換細胞に使用できる。そして結果として発現するタンパク質は、本明細書に記載されているようにして精製される。
【０１２０】
これらの精製タンパク質は、インビボに於ける腫瘍の画像化に用いられる。ＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３発現に関して様々であるヒトの腫瘍細胞を、皮下又は静脈内のいずれかに注入し、腫瘍又は転移性の肺小塊は、上記実施例１５に記載されるように発達させる。ｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ融合物に関しては、マウスに、ｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ融合タンパク質の増加した量を経静脈的に注入する。融合タンパク質が全身に循環するのに必要な時間が経過した後に、マウスに、腹腔内にルシフェラーゼの基質であるＤ−ルシフェリン２．０ ｍｇ（１００μＬのＰＢＳ溶液）を注入し、その後、体重２０ｇ当たりキシラジン（３ｍｇ／ｍＬ）及びケタミン（７ｍｇ／ｍＬ）のＰＢＳ溶液１２０μＬで麻酔する。ｓｃＴＣＲ／ＧＦＰ融合のために、マウスに、経静脈的にｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ融合タンパク質の増加した量を注入する。融合タンパク質が全身に循環するのに必要な時間が経過した後に、マウスを、上記のようにキシラジン（３ｍｇ／ｍＬ）及びケタミン（７ｍｇ／ｍＬ）のＰＢＳ溶液で麻酔する。
【０１２１】
インビボでの腫瘍の検出に関して、麻酔されたマウスは、ＮｉｇｈｔＯｗｌ ＬＢ９８１ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｇｈｔ Ｉｍａｇｅｒの内に置く。画像化は、２段階の工程手順とＷｉｎＬｉｇｈｔソフトウェア（Berthold Technologies, Oak Ridge, TN）を使用して行う。はじめに、白黒の写真画像を、１５ｍｓの照射で得、次いで５分間のフォトン積算期のバックグラウンドの差し引きをして発光画像を入手する。発光画像は、発光強度を色づけするためにソフトウェアにより加工し、その後、提示用に白黒の写真画像の上に重ねる。マウスを犠牲にし、病理学的な評価を、腫瘍の大きさ、場所及び性質（すなわち、抗原陽性又は陰性）を決定するために実施する場合もある。
ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３陽性の腫瘍細胞を保持する腫瘍部位に於ける２６４ｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＧＦＰ試薬の、他の組織と比較して異なる検出を明らかにする画像化検討から得られる結果は、ｓｃＴＣＲ試薬が、インビボに於いて腫瘍を特異的に検出できることを示している。
【０１２２】
さらに、ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３陽性の腫瘍細胞を保持する腫瘍部位に於ける２６４ｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＧＦＰの、ＣＭＶｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ又はＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＧＦＰ（対照）試薬の検出と比較して、異なる検出を明らかにする結果は、それらのｓｃＴＣＲ試薬がインビボに於いて腫瘍をより特異的に検出できることを示している。ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３陽性の腫瘍細胞を保持する腫瘍部位に於ける２６４ｓｃＴＣＲ／Ｌｕｃ又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＧＦＰの、ＨＬＡ−Ａ２陰性又はｐ５３陰性の腫瘍細胞を保持している腫瘍部位の結果と比較して、差別化された検出を明らかにする画像化の結果は、さらにそれらのｓｃＴＣＲ試薬がインビボに於いて腫瘍を特異的に検出できることを示している。
【実施例１８】
【０１２３】
放射標識ＴＣＲによるインビボ腫瘍の画像化
別の態様に於いて、２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、例えば、１３１Ｉによる直接のヨード化によって放射線標識される。ヨード化は、標準的な方法により実施される。ＨＬＡ−Ａ２及びｐ５３発現に関して様々であるヒトの腫瘍細胞を、皮下又は静脈内のいずれかに注入し、腫瘍又は転移性の肺小塊を、記載されたように発達させる。マウスに放射線標識された２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を経静脈又は腹腔内投与し、放射線標識された２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を注入して、例えば、１、２、４、８、及び１２時間後、そして１から１４日後に、画像化する。全身スキャンするために、マウスを、ペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔して、例えばマイクロコンピュータと連結した、４ｍｍピンホールのコリメーターを有した大きな視野のＳｏｐｈａ ＤＳＸカメラで、画像化する。腫瘍部位に於ける放射線核種で標識された２６４ｓｃＴＣＲ試薬の、他の組織との比較により、差別化された検出を実践する画像化の検討から得られた結果は、それらの放射線標識されたｓｃＴＣＲ試薬がインビボに於いて腫瘍を特異的に検出するために有用であることを示唆するものである。
以下の材料及び方法は、実施例に概説された実験を実施するために必要に応じて用いられた。
【０１２４】
１．材料
Ａ２．１ ２６４ＣＴＬクローン＃５は、ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウス［文献４９参照］に於いて産生されたヒトｐ５３ ２６４〜２７２ペプチドに特異的なＣＴＬラインから限界希釈法［文献５０参照］により得られた。ＣＨＯ．Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣、ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球、ＣＴＬＬ−２マウス細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔ２ヒトリンパ芽球、Ａ３７５ヒトメラノーマ、Ｈ５７−５９７ハイブリドーマ、及びＢＢ７．２ハイブリドーマ細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ：Rockville, MD）から得られた。Ｔ２ヒトリンパ芽球細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１に対し陽性であるが、外来性ペプチドを収容することができる空のＭＨＣ分子を提示するための、ＴＡＰ１及び２タンパク質が欠損している［文献２参照］。Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞株は、本発明者らの研究室でＨＬＡ−Ａ２．１及びｐ５３に関して試験されて、両方の抗原に関して陽性であることが見出された。Ｈ５７−５９７ハイブリドーマは、マウスのＴＣＲβ定常領域に於けるエピトープを認識するモノクローナル抗体を産生し、ＢＢ７．２ハイブリドーマは、ＨＬＡ−Ａ２のα２ドメイン上のエピトープを特異的に認識するＢＢ７．２モノクローナル抗体を産生する。ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５の高度に転移性のサブクローン、Ａ３７５−Ｃ１５Ｎは、インビボに於ける転移性検討にしか使われないものであるが、以前に報告されたように維持された［文献５３参照］。薬物速度論検討に於けるＥＬＩＳＡに使用される、組み換えヒトＩＬ−２及びビオチン化抗ヒトＩＬ−２ポリクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Minneapolis, MN）から購入された。抗ＴＣＲ ＣβｍＡｂＨ５７−５９７、抗マウスＴＣＲ Ｖβ３ｍＡｂ、抗マウスＣＤ３εｍＡｂ、抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂ、抗ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体及びアイソタイプの対照抗体、及びＦＩＴＣ標識されたヤギ抗マウスＩｇＧは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（San Diego, CA）から得られた。すべての細胞培養培地及び添加物は、ＣｅｌｌＧｒｏ（Herndon, VA）から購入され、他に記されない限り、すべての細胞培養材料は、Ｎｕｎｃ（Rochester, NY）から購入された。すべてのマウスは、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓ（Indianapolis, IN）から購入された。
【０１２５】
２．細胞培養
すべての細胞株は、１０％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び１ ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（形質転換されたＣＨＯ細胞についてのみ）を添加されたＩＭＤＭを含む完全な培養培地中で、３７℃にて５％のＣＯ２下で維持された。ＣＴＬＬ−２細胞は、９Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−２を添加した同じ培地中で維持された。Ａ３７５−Ｃ１５Ｎ細胞は、１０％熱不活性化ＦＢＳ、ペニシリン及びストレプトマイシン（Life Technologies）を含むＲＰＭＩ−１６４０中で維持された。
【０１２６】
マウス脾臓細胞は、ＢＬＡＢ／ｃマウスから無菌的に解剖された脾臓を押しつぶして、ナイロンメッシュのスクリーンを通し、そして培養培地で洗浄することにより単離された。赤血球はＧｅｙ溶液で２分間溶解され、次いで溶解を停止するための培養培地が添加された。単一細胞のペレットは２回洗浄されて、培養培地中のｍＬ当たり２．５ｘ１０６細胞に再縣濁され、そして５０μＭの２−ＭＥ、１００ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−２、及び５０ｎｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３εｍＡｂを含む完全な培養培地で培養された。
【０１２７】
３．構築物
プライマー−オリゴヌクレオチドプライマーは、マウスＴ細胞受容体及びヒトＩＬ−２遺伝子に適合する又は相補する配列から合成された：
ＫＣ２２８：５’−ＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣ−３’；（配列番号３）
ＫＣ２２９：５’−ＧＡＧＧＴＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＴＧＧＣＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＧ−３’；（配列番号４）
ＰＲＩＢ４：５’−ＧＧＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＴＴＣＡＧＡＣＴＣ−３’；（配列番号５）
ＫＣ１７６：５’−ＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣ−３’；（配列番号６）
ＥＴ−ＴＣＲＦ１：５’−ＣＣＣＡＣＣＧＧＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣＣＣ−３’；（配列番号７）
ＫＣ−１７０：５’−ＧＴＧＧＡＧＴＴＣＧＡＡＡＡＧＧＴＧＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’；（配列番号８）
ＫＣ２３１：５’ＣＧＡＴＡＡＧＴＧＴＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＴＣＧＧＣＡＴＧＴＡＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＧ−３’；（配列番号９）
ＫＣ２０８：５’ＧＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡＴＡＡＧＴＧＴＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＴＣＣＧＧＡＧＴＴＡＡＣＧＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’；（配列番号１０）
ＫＣ３２７Ｂ：５’−ＴＡＧＧＴＧＴＣＣＧＧＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣ−３’；（配列番号１１）
ＫＣ３２８Ｂ：５’−ＴＡＧＧＴＧＴＣＧＣＧＡＡＧＴＴＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧ−３’；（配列番号１２）
ＡＰ２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ−３’；（配列番号１３）
ＣαＨＹＢ：５’ＧＣＴＧＴＣＣＴＧＡＧＡＣＣＧＡＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＡＣＴＧ３’；（配列番号１４）
ＣβＨＹＢ：５’−ＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＴＣＴＧＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＧ−３’；（配列番号１５）
【０１２８】
ＴＣＲ遺伝子は、Ｔ細胞クローンＡ２．１ ２６４＃５からクローン化された。本発明者らは、このＴ細胞クローン２６４ｓｃＴＣＲから得られた一本鎖のＴＣＲを指定する。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ＭｉｃｒｏＦａｓｔ Ｔｒａｃｋキット（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて細胞から抽出され、二本鎖ｃＤＮＡが調製され、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Clontech, Palo Alto, CA）を用いて二本鎖のアダプターオリゴヌクレオチドに結合された。Ｖα及びＶβセグメント（segment)を同定するために、Ａ２．１ ２６４＃５ ｃＤＮＡ調製物、上記リストのＡＰ２プライマー（アダプターＤＮＡに特異的）、及びＣαＨＹＢ（α鎖の定常ドメインに特異的）又はＣβＨＹＢ（β鎖の定常ドメインに特異的）を用いて、５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲが実施された。ＰＣＲ断片は、ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いて、ｐＣＲ２．１ベクターにクローン化され、その配列は、Ｍ１３フォワード及びリバースプライマーを用いて決定された。Ｔ細胞受容体Ｖα鎖は、ＳｆｉＩ／ＳｐｅＩ断片を産生するためにＫＣ２２８及びＫＣ２２９プライマーを用いて増幅され、ＶβＣβ鎖は、ＸｈｏＩ／ＸｍａＩ断片を産生するためにＰＲＩＢ４及びＫＣ１７６プライマーを用いて増幅された。Ｃβ鎖は、全長Ｃβ鎖の１２７番目のアミノ酸残基システインの直前で切断された。ＳｆｉＩ／ＳｐｅＩ Ｖα鎖断片は、無関係なＴＣＲをコードするＥ．Ｃｏｌｉ発現ベクターであるｐＫＣ６０のＳｆｉＩ／ＳｐｅＩで消化されたものに、元来のＴＣＲインサートを置き換えることにより、サブクローン化された。ＸｈｏＩ／ＸｍａＩ ＶβＣβ断片は、その後、このベクターのＸｈｏＩ／ＸｍａＩ消化物に結合され、可溶性の３つのドメインの２６４ｓｃＴＣＲをコードするベクターを産生した。この構築物由来の３ドメインＴ細胞受容体は、ＥＴ−ＴＣＲＦ１及びＫＣ１７０プライマーを用いてＡｇｅＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡ断片を産生するために増幅され、その断片はその後ＡｇｅＩ／ＨｐａＩ断片を産生するために、ＫＣ２３１及びＫＣ２０８プライマーを用いたＰＣＲの鋳型として用いられた。
【０１２９】
ヒトＩＬ−２をコードする配列は、Ｍｉｎｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡキット（Qiagen, Valencia CA）及びＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ（Qiagen, Valencia CA）を用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞から単離された全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによりクローン化された。逆転写は、ＫＣ３２８Ｂプライマーを用いて行われ、ＰＣＲはＢｓｐＥＩ／ＮｒｕＩヒトＩＬ−２断片を産生するために、ＫＣ３２７Ｂ及びＫＣ３２８Ｂプライマーを用いて実施された。ＢｓｐＥＩ／ＮｒｕＩ ＩＬ−２断片は、無関係なＴＣＲ／抗体融合タンパク質をコードするクローニングベクターであるＢｓｐＥＩ／ＮｒｕＩで消化されたｐ１４９Ｂ１ＳＰに、融合タンパク質の抗体部分を置き換えた。ＩＬ−２修飾ベクターは、ＡｇｅＩ及びＨｐａＩにより消化され、上述のＡｇｅＩ／ＨｐａＩ２６４ｓｃＴＣＲ断片はそれに結合された。最後に、ＡｇｅＩ／ＣｌａＩ２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質断片は、ＡｇｅＩ／ＢｓｔＢＩで消化された、ｓｃＴＣＲ／マウスκ融合ベクターであるｐＳＵＮ２７内にクローン化され、元来クローン化されていた無関係なＴＣＲを置き換え、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質発現ベクターであるｐＳＵＮ３８を産生した。フローサイトメトリー分析のいくつかに関して、陰性対照として用いられた２６４ｓｃＴＣＲ／κ融合物は、ＡｇｅＩ／ＢｓｔＢＩ２６４ｓｃＴＣＲ断片をＡｇｅＩ／ＢｓｔＢＩで消化されたｐＳＵＮ２７にクローン化して、元来のＴＣＲを置き換えることで産生された。
【０１３０】
哺乳動物細胞で融合タンパク質を産生することに関して、ＣＨＯ．Ｋ１細胞は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ・Ｇｅｎｅ・Ｐｕｌｓｅｒを用いてエレクトロポレーションされ、次いで限界希釈法によりクローン化されて、１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含む培地中で選択された。
【０１３１】
４．タンパク質精製
２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２は、抗マウスＴＣＲモノクローナル抗体Ｈ５７−５９７を用いた免疫親和性クロマトグラフィにより、細胞培養物の上清液から精製された。なお、この抗マウスＴＣＲモノクローナル抗体Ｈ５７−５９７は、ＴＣＲβ鎖の不変領域にあるエピトープを認識して、セファロース４Ｂカラム（Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ）に結合している。精製された試料は、その後、３０ｋＤａの分子量でカットオフする膜（Millipore, Bedford, MA）を有したＵｌｔｒａｆｒｅｅ−１５遠心性フィルターを用いて、濃縮され、ＰＢＳに緩衝液交換された。ＴＣＲ融合タンパク質試料は、２〜８℃（短期間）又は−８０℃（長期間）で生化学的及び機能的分析のために保存された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥが、還元条件又は非還元条件のいずれかで、４〜１２％のＮｕ−ＰＡＧＥポリアクリルアミドゲル（Novex, San Diego, CA）及びＮｏｖｅｘ ＥＸ−Ｃｅｌｌ ＩＩシステムを用いて実施された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、クーマシーブルーで染色された。
【０１３２】
５．ＥＬＩＳＡ
すべてのＥＬＩＳＡは、１００〜２００ｎｇ／ｗｅｌｌの抗ヒトＩＬ−２ｍＡｂ又は抗マウスＴＣＲ Ｖβ３ｍＡｂでコートされたＭａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルプレート（Nunc, Rochester, NY）を用いて行われた。融合タンパク質は、ビオチン化された抗マウスＴＣＲＨ５７ｍＡｂ、抗マウスＴＣＲＶβ３ｍＡｂ、又は抗ＩＬ−２ポリクローナル抗体、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）、ＴＭＢ基質、及び反応を停止させるための０．１８ＭのＨ２ＳＯ４（BioFx, Owings Mills, MD）で検出された。吸光度は、９６ウェルプレートリーダー（Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT）を用いて、４５０ｎｍで測定された。
【０１３３】
６．ＴＣＲ融合タンパク質による細胞染色
ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）又はｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチドのいずれかでパルスされたＴ２細胞は、１％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で、０．５μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質と室温にて３０分間インキュベートされた。細胞はその後、０．５μｇの抗ＩＬ−２Ａｂ又は０．５μｇのビオチン化抗ＴＣＲＨ５７−５９７ｍＡｂと、室温にて３０分間インキュベートされ、次いで１μｇの抗マウスκＰＥ又は５ｎｇのストレプトアビジン−ＰＥ（両方とも、Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ）とそれぞれインキュベートされた。試料は、ＦＡＣＳｃａｎ分析（Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ）の前に１％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で、洗浄された。両ｐ５３ペプチドがＨＬＡ−Ａ２に同様に結合するかどうかを決定するため、ペプチドを収容した細胞は、ＢＢ７．２を用いて室温にて３０分間染色され、次いでＦＩＴＣで標識されたヤギ抗マウスＩｇＧで染色され、そしてＦＡＣＳｃａｎ機器で分析された。
【０１３４】
ＣＴＬＬ−２細胞は、０．５μｇの融合タンパク質と室温にて３０分間インキュベートされた。結合した融合タンパク質を検出するために、０．５μｇのビオチン化抗ＴＣＲ Ｖβ３ｍＡｂが添加され、室温にて３０分間インキュベートされ、次いで、５ｎｇのストレプトアビジン−ＰＥでインキュベートされた、又は０．５μｇのＰＥで標識されたＨＬＡ−Ａ２．１ ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）四量体を３０分間用いることにより、そのタンパク質は検出された。ｐ５３ペプチドで収容され結合したＨＬＡ−Ａ２四量体は、以前に述べられたように、産生された［文献１参照］。試料は、ＦＡＣＳｃａｎ分析の前に１％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で洗浄された。ＩＬ−２受容体ブロッキング実験に関しては、ＣＴＬＬ−２細胞は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２又は２６４ｓｃＴＣＲ／κ融合タンパク質とインキュベートされる前に、αヒトＣＤ２５ブロッキング抗体又はアイソタイプの対照抗体と３０分間インキュベートされた。ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞染色に関しては、結合した融合タンパク質を検出するために、ＨＬＡ−Ａ２．１ ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）四量体を用いて、ＣＴＬＬ−２細胞に関して記載されたように染色を実施した。
【０１３５】
Ａ３７５細胞は、無酵素細胞解離緩衝液（Sigma, St. Louis, Mo）で回収された。５ｘ１０５細胞の試料は、１％のＦＢＳを含むＰＢＳ中で洗浄され、融合タンパク質無し、５μｇの３Ｃ８（無関係なＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質）、又は５μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ ＩＬ−２と共に室温にて３０分間インキュベートされ、次いで、１μｇのビオチン化Ｈ５７−５９７ｍＡｂでインキュベートされた。細胞はその後、ＰＥ標識されたストレプトアビジンと室温にて１５分間インキュベートされ、洗浄され、そしてＦＡＣＳｃａｎにより分析された。
【０１３６】
７．細胞結合
ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチド又はｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチドのいずれかでパルスされたＴ２細胞は、７．８８ｎｇ／ｍｌのジヒドロエチジウム（ＨＥ）（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）で標識され、ＣＴＬＬ−２細胞は、５０ｎｇ／ｍｌのカルセインＡＭ（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）で標識された。洗浄後、標識された細胞の二つの集団は、１対１の比率で、２μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の存在又は非存在下で、室温にて２０分間一緒に混合された。細胞はその後、ＦＡＣＳｃａｎにより分析された。
【０１３７】
８．バイオアッセイ
ＣＴＬＬ−２細胞は、様々な濃度の組み換えＩＬ−２又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２のいずれかを含む１００μＬの培養培地中に、１ウェル当たり４ｘ１０３細胞で撒かれ、３７℃にて２１時間、５％ＣＯ２下でインキュベートされた。特異性についての対照として、ＣＴＬＬ−２細胞は、５又は５０μｇの抗ヒトＣＤ２５ブロッキング抗体又はアイソタイプの対照抗体の存在又は非存在下で、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２と３７℃にて２１時間、５％ＣＯ２下でインキュベートされた。細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Roche Inc., Indianapolis, IN）が、１ウェル当たり２０μＬ添加され、３７℃にて４時間、５％ＣＯ２下でインキュベートされた。吸光度は、９６ウェルプレートリーダー上４５０ｎｍで測定された。
【０１３８】
９．マウスに於ける薬物速度論
動物に関するすべての実験に於いて、適用可能なところでは、特定の国内法令と同様、研究室に於ける動物配慮の原則（ＮＩＨ発行 Ｎｏ．８５〜２３，１９８５年改訂）に従った。メスのＢＡＬＢ／ｃマウスは、経静脈的に側部尾静脈を介して、１００μＬになるようにＰＢＳで希釈した、３２μｇの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を注入した。血清は、バックグラウンドレベルを確立するために、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２を注入されていない一つのマウス集団から採取された。血清は、注入された集団から、１５分、３０分、１、２、４、８、及び２４時間後に、尾の出血で採取された。血液試料は、１４，０００ｘｇにて、４℃で１０分間遠心され、血清は回収され、そして使用されるまで−８０℃に保存された。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２濃度は、捕獲のため抗ＴＣＲＶβ３又は抗ＩＬ−２モノクローナル抗体、及びビオチン化抗ＴＣＲＨ５７モノクローナル又は抗ＩＬ−２モノクローナル抗体のいずれか、次いで、検出のためにストレプトアビジンＨＲＰを用いて、ＥＬＩＳＡにより決定された。
【０１３９】
１０．インビボ研究
メスの胸腺欠損ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）は、５．０ｘ１０５のＡ３７５−Ｃ１５Ｎ細胞を側部尾静脈を介して、注入された。動物は、様々な濃度の２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２（全量１００μｌに３２、１０、３、１、又は０．１μｇ）又は組み換えヒトＩＬ−２（全量１００μｌに８、２．５、０．７５、０．２５、又は０．０２５μｇ）を、腫瘍細胞投与後１、２、３、４、７、１０、１４、１７、２１、２８、及び３５日に注入された。腫瘍細胞注入後４２日に、すべての動物は人道的に犠牲にされ、肺が取り出され、Ｂｏｕｉｎ溶液中で固定され、肺表面腫瘍小塊が数えられた。それぞれの肺の腫瘍小塊は、二人の観察者によって数えられ、平均数が記録された。
【０１４０】
１１．ＩｇＧ及びＢｉｒＡ標識配列を含むＴＣＲ構築物及び融合タンパク質
ＴＣＲ遺伝子は、記載されたようにＴ細胞クローンＡ２．１ ２６４＃５からクローン化された。このＴ細胞クローンから得られた一本鎖のＴＣＲは、２６４ｓｃＴＣＲと指定された。３ドメインの一本鎖２６４ｓｃＴＣＲは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質構築物を鋳型として用いて、増幅された。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１発現構築物を産生するために、一本鎖のＴＣＲ断片は、抗体重鎖発現ベクターに結紮されて、抗体の可変領域を置き換え、一本鎖のＴＣＲをヒトＩｇＧ１重鎖領域に結合させた。２６４ｓｃＴＣＲ／ｔｒｕｎＩｇＧ１を産生するために、ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域の前で切り取られたＩｇＧ１重鎖ドメインを含む発現ベクターに、ＴＣＲ断片が結紮された。
【０１４１】
２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ発現構築物を産生するために、標識配列が２６４ｓｃＴＣＲ分子のＣ末端での構造に発現されるような、ＢｉｒＡ標識配列（Beckett, D.ら Protein Sci. 1999 April; 8(4):921-9）を含む発現ベクターに、一本鎖のＴＣＲ断片が結紮された。
【０１４２】
サイトメガロウィルス一本鎖のＴＣＲ（ＣＭＶｓｃＴＣＲ）が、ＨＬＡ−Ａ２限定性ＣＭＶ−ｐｐ６５ペプチドで刺激されたＣＴＬｓからクローン化された。ＩｇＧ１断片は、ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１構築物を作るために、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１ ＤＮＡから増幅された。
【０１４３】
哺乳動物細胞に於ける融合タンパク質の産生のため、ＣＨＯ．Ｋ１細胞は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒにより、エレクトロポレーションされ、次いで、限界希釈法によりクローン化され、そして１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培養培地中で選択された。
【０１４４】
タンパク質精製は、以下のように実施された。２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ及び２６４ｓｃＴＣＲ／ｔｒｕｎＩｇＧ１は、セファロース４Ｂカラム（Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ）に結合されたＨ５７−５９７モノクローナル抗体を用いた、免疫親和性クロマトグラフィにより、細胞培養上清から精製された。ＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１は、セファロース４Ｂカラム（Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ）に結合されたＢＦ１モノクローナル抗体を用いた、免疫親和性クロマトグラフィにより、細胞培養上清から精製された。２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡは、業者により推奨された条件下で、ビオチン−タンパク質リガーゼ（Avidity）によりビオチン化された。
【０１４５】
１２．フローサイトメトリーを用いた２６４ｓｃＴＣＲ試薬による細胞染色の検出
２６４ｓｃＴＣＲ試薬が固定された及び固定されていない細胞を染色する能力は、いくつかの検討で特徴付けられた。細胞染色方法は、様々な検出可能ドメインを保持している２６４ｓｃＴＣＲ融合物の利用、及び様々な蛍光標識プローブでこれらの融合物の細胞レベルの相互作用を検出すること、を含む。いくつかの対照は、特異的な染色を評価するために用いられた。対照は、ｐ５３（ａａ２６４〜２７３）抗原を欠損している細胞を２６４ｓｃＴＣＲ試薬で染色すること、ｐ５３陽性細胞をＣＭＶｓｃＴＣＲ試薬で染色すること、ｐ５３陽性細胞を二次染色試薬だけで染色すること、及びｐ５３陽性細胞を可溶性ＨＬＡ−Ａ２／ｐ５３多量体のような競合的ブロッキング試薬の存在下及び非存在下に於いて２６４ｓｃＴＣＲ試薬で染色すること、を含んでいる。
【０１４６】
単量体又は多量体型２６４ｓｃＴＣＲの細胞は、特異的に染色する能力について試験された。Ｔ２細胞は、３７℃、２．５時間で１００μｇ／ｍｌのｐ５３（ａａ２６４〜２７３）又はｐ５３（ａａ１４９〜１５７）を収容した。過剰なペプチドを取り除く洗浄工程後、細胞は１２５ｐＭの２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１、２６４ｓｃＴＣＲ／ｔｒＩｇＧ１又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ（ビオチン化無しで）と、３０〜４５分間インキュベートされた。還元及び非還元試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、２６４ｓｃＴＣＲ／ｔｒｕｎＩｇＧ１及び２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡタンパク質が単量体であること、及び２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１タンパク質が二量体であることを示していた。更に一回の洗浄工程の後、細胞は２．５μｇのＰＥ結合Ｈ５７ｍＡｂ（Ｈ５７−ＰＥ）と共に３０分間インキュベートされた。細胞は洗浄され、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー装置（BD Sciences, San Jose, CA）で、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（BD Sciences, San Jose, CA）を用いて分析された。非染色及びＨ５７−ＰＥで染色されたＴ２細胞はまた、バックグラウンド染色を確認するために分析された。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１Ａ〜Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の模式的な構造（１Ａ）とアミノ酸配列（１Ｂ）を示す図である。
【図２】図２は、形質転換したＣＨＯ細胞に於ける２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の産生を示すサイズゲルを示すものである。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＴＣＲ部分のＭＨＣ／ペプチド結合能力を示すグラフである。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質のＩＬ−２部分のＩＬ−２受容体結合能力を示すグラフである。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の生物学的活性を示すグラフである。
【図６】図６Ａ〜Ｄは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質により仲介されるペプチドを収容したＴ２細胞とＣＴＬＬ−２細胞の結合を示すグラフである。
【図７】図７Ａ〜Ｃは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の血清半減期を示すグラフである。
【図８】図８は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質を用いた腫瘍細胞染色を示すグラフである。
【図９】図９は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ−２融合タンパク質の抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａ〜Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ試薬による、非特異的なｐ５３ペプチド（１０Ａ）又は特異的なｐ５３ペプチド（１０Ｂ）を収容したＴ２細胞の染色を示すグラフである。
【図１１】図１１Ａ〜Ｄは、様々な２６４ｓｃＴＣＲ試薬及び二次試薬による、腫瘍細胞の染色を示すグラフである。
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは、競合する可溶性ペプチドＭＨＣ分子（２６４−ＴＥＴ標識される）の添加あり及び無しで、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１及びＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１（対照）試薬を用いて、固定されたＡ３７５（図１２Ａ）又はＴ２細胞（図１２Ｂ）を染色したものを示すグラフである。
【図１３】図１３は、固定された腫瘍細胞型（Ａ３７５、ＨＴ２９及びＳａｏｓ２）の、Ａ２及びｐ５３抗原に関する、及び２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１及びＣＭＶｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質を用いた、染色パターンを示す連続的な顕微鏡写真である。
【図１４】図１４は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体と反応させたＴ２細胞の定量的染色を示すグラフである。
【図１５】図１５は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質と反応させたＴ２細胞の定量的染色を示すグラフである。
【図１６】図１６は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ融合物と反応させた細胞に関して、収容されたｐ５３ペプチドの増加する量と細胞あたりの複合体の数を示すグラフである。
【図１７】図１７Ａ〜Ｂは、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体（図１７Ａ）又は２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質（図１７Ｂ）と反応させたＡ３７５腫瘍細胞の定量的染色を示すグラフである。
【図１８】図１８は、２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡ四量体と反応させた３つの腫瘍細胞株の定量的染色（細胞あたりの複合体の数）を示すグラフである。
【図１９】図１９は、図１８と同様に、２６４ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質と反応させた３つの腫瘍細胞株の定量的染色を示すグラフである。
【図２０】図２０は、二次抗体、ＣＶＭｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１（対照）又は２６４ＴＣＲ／ＩｇＧ１融合タンパク質で染色されたＡ３７５腫瘍の固定された切片を示す３枚の倍率２００倍の顕微鏡写真である。
【図２１】図２１は、図２０と同様に、腫瘍切片を示す３枚の高倍率（４００倍）の顕微鏡写真である。
【０１４８】
参考文献
次の文献は、本発明の開示の全体を通して、（以下に示される番号によって）参照される。その各々は、参照して本明細書に取り込む。
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【０１４９】
ここに開示されたすべての参考文献は、参照して本明細書に取り込む。本発明は、それらのより好ましい態様を参照して記載するものである。しかしながら、当業者であれば、本開示を考慮の上、本発明の精神と範囲内で、修飾及び改良を加えることができるものと理解されたい。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細胞又は組織を、存在しているペプチド抗原と可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が特異的な結合複合体を形成する条件下で、少なくとも一つの可溶性ＴＣＲ分子又はその機能性断片に接触させる、
ｂ）存在しているペプチド抗原に結合しなかったすべての可溶性ＴＣＲ分子又はその断片を取り除くのに適した条件下で、細胞又は組織を洗浄する、及び
ｃ）存在しているペプチド抗原を含む細胞又は組織の指標としての特異的な結合複合体を検出する、
工程を含む、ＭＨＣ複合体として細胞又は組織上に存在しているペプチド抗原を含む細胞又は組織を検出するための方法。
【請求項２】
細胞又は組織をさらに、少なくとも一つのブロッキング試薬と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可溶性ＴＣＲ又はその断片と細胞との非特異的結合を減少させるために、工程ａの前に細胞又は組織をブロッキング試薬と接触させることを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ブロッキング試薬が過酸化物、血清蛋白質、抗体又はその断片である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
複合体に結合できる可溶性ＴＣＲ又はその断片に競合的及び特異的に結合する条件下で、前記複合体を競合ＭＨＣ分子又はその断片と接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
競合複合体を形成するために、実質的にすべての可溶性ＴＣＲ又はその断片が競合ＭＨＣ分子又はその断片に結合している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
競合複合体を検出すること及びＭＨＣ分子又は可溶性ＴＣＲの結合特異性を決定することを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＭＨＣ分子又はその断片が一本鎖である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＭＨＣ分子又はその断片がペプチド抗原を収容している、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
細胞又は組織を少なくとも一つの変性試薬と接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａの前に、細胞又は組織を変性試薬と接触させ、細胞又は組織を変性させる（固定させる）ことを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複数の細胞又は組織をアレイに搭載することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞又は組織を搭載したアレイのそれぞれの要素に於いて実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アレイのそれぞれの要素に於いて実質的に同時に実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｃが、アレイをスキャンすること、及び特異的な結合複合体の存在を示す画像情報を発生させることを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
工程ｃが、リアルタイムに情報を利用者に出力すること、及び必要に応じて画像情報の保存画像に見出しをつけることを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞上に存在しているペプチド抗原の量が、約１００，０００コピーより少ない、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞上に存在しているペプチド抗原の量が、約４００コピーより少ない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ペプチド抗原が、腫瘍関連ペプチド抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
細胞又は組織が懸濁されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が、一本鎖のＴＣＲを少なくとも一つ含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が検出可能に標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
検出可能な標識が、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素又はその触媒活性を有する断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、又は、蛍光、りん光若しくは化学発光分子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
一本鎖のＴＣＲ又はその断片が、少なくとも一つの共有結合したサイトカインを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が、共有結合したサイトカイン又はその断片を含む一本鎖のＴＣＲである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
一本鎖のＴＣＲ又はその断片が、インターロイキン２（ＩＬ−２）をコードする配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
一本鎖のＴＣＲ又はその断片が、少なくとも一つの共有結合した免疫グロビンドメインを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が、共有結合した免疫グロビンドメイン又はその断片を含む一本鎖のＴＣＲである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
一本鎖のＴＣＲ又はその断片がＩｇＧ１ドメイン又はその断片をコードする配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＭＨＣ複合体がＨＬＡ−Ａ２限定性である、請求項１の方法。
【請求項３１】
ペプチド抗原を含まない細胞と可溶性ＴＣＲ又はその断片の如何なる結合をも検出するための対照を用いることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
存在しているペプチド抗原が、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）又はｐ５３（ａａ２６４〜２７２）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
インビボ、エキソビボ、又はインビトロで実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
細胞又は組織が腫瘍細胞又は腫瘍組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
細胞又は組織が、ＭＨＣ複合体として細胞又は組織上に存在している腫瘍関連ペプチド抗原を含み、
ａ）存在しているペプチド抗原と可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が特異的な結合複合体を形成する条件下で、可溶性ＴＣＲ分子又はその機能性断片を患者に投与すること、及び
ｂ）存在している腫瘍関連ペプチド抗原を含む腫瘍細胞又は腫瘍組織の指標として、特異的な結合複合体を検出すること、
を含む患者の腫瘍細胞又は腫瘍組織を検出する方法。
【請求項３６】
可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が一本鎖のＴＣＲを少なくとも一つ含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が検出可能に標識されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
検出可能な標識が、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素又はその触媒活性を有する断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、又は蛍光、りん光若しくは化学発光分子である、請求項３７に記載の方法。
【請求項１】
ａ）細胞又は組織を、存在しているペプチド抗原と可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が特異的な結合複合体を形成する条件下で、少なくとも一つの可溶性ＴＣＲ分子又はその機能性断片に接触させる、
ｂ）存在しているペプチド抗原に結合しなかったすべての可溶性ＴＣＲ分子又はその断片を取り除くのに適した条件下で、細胞又は組織を洗浄する、及び
ｃ）存在しているペプチド抗原を含む細胞又は組織の指標としての特異的な結合複合体を検出する、
工程を含む、ＭＨＣ複合体として細胞又は組織上に存在しているペプチド抗原を含む細胞又は組織を検出するための方法。
【請求項２】
細胞又は組織をさらに、少なくとも一つのブロッキング試薬と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
可溶性ＴＣＲ又はその断片と細胞との非特異的結合を減少させるために、工程ａの前に細胞又は組織をブロッキング試薬と接触させることを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ブロッキング試薬が過酸化物、血清蛋白質、抗体又はその断片である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
複合体に結合できる可溶性ＴＣＲ又はその断片に競合的及び特異的に結合する条件下で、前記複合体を競合ＭＨＣ分子又はその断片と接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
競合複合体を形成するために、実質的にすべての可溶性ＴＣＲ又はその断片が競合ＭＨＣ分子又はその断片に結合している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
競合複合体を検出すること及びＭＨＣ分子又は可溶性ＴＣＲの結合特異性を決定することを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＭＨＣ分子又はその断片が一本鎖である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＭＨＣ分子又はその断片がペプチド抗原を収容している、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
細胞又は組織を少なくとも一つの変性試薬と接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａの前に、細胞又は組織を変性試薬と接触させ、細胞又は組織を変性させる（固定させる）ことを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複数の細胞又は組織をアレイに搭載することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞又は組織を搭載したアレイのそれぞれの要素に於いて実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アレイのそれぞれの要素に於いて実質的に同時に実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｃが、アレイをスキャンすること、及び特異的な結合複合体の存在を示す画像情報を発生させることを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
工程ｃが、リアルタイムに情報を利用者に出力すること、及び必要に応じて画像情報の保存画像に見出しをつけることを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞上に存在しているペプチド抗原の量が、約１００，０００コピーより少ない、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞上に存在しているペプチド抗原の量が、約４００コピーより少ない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ペプチド抗原が、腫瘍関連ペプチド抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
細胞又は組織が懸濁されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が、一本鎖のＴＣＲを少なくとも一つ含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が検出可能に標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
検出可能な標識が、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素又はその触媒活性を有する断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、又は、蛍光、りん光若しくは化学発光分子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
一本鎖のＴＣＲ又はその断片が、少なくとも一つの共有結合したサイトカインを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が、共有結合したサイトカイン又はその断片を含む一本鎖のＴＣＲである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
一本鎖のＴＣＲ又はその断片が、インターロイキン２（ＩＬ−２）をコードする配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
一本鎖のＴＣＲ又はその断片が、少なくとも一つの共有結合した免疫グロビンドメインを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が、共有結合した免疫グロビンドメイン又はその断片を含む一本鎖のＴＣＲである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
一本鎖のＴＣＲ又はその断片がＩｇＧ１ドメイン又はその断片をコードする配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＭＨＣ複合体がＨＬＡ−Ａ２限定性である、請求項１の方法。
【請求項３１】
ペプチド抗原を含まない細胞と可溶性ＴＣＲ又はその断片の如何なる結合をも検出するための対照を用いることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
存在しているペプチド抗原が、ｐ５３（ａａ１４９〜１５７）又はｐ５３（ａａ２６４〜２７２）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
インビボ、エキソビボ、又はインビトロで実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
細胞又は組織が腫瘍細胞又は腫瘍組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
細胞又は組織が、ＭＨＣ複合体として細胞又は組織上に存在している腫瘍関連ペプチド抗原を含み、
ａ）存在しているペプチド抗原と可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が特異的な結合複合体を形成する条件下で、可溶性ＴＣＲ分子又はその機能性断片を患者に投与すること、及び
ｂ）存在している腫瘍関連ペプチド抗原を含む腫瘍細胞又は腫瘍組織の指標として、特異的な結合複合体を検出すること、
を含む患者の腫瘍細胞又は腫瘍組織を検出する方法。
【請求項３６】
可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が一本鎖のＴＣＲを少なくとも一つ含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
可溶性ＴＣＲ分子又はその断片が検出可能に標識されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
検出可能な標識が、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素又はその触媒活性を有する断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、又は蛍光、りん光若しくは化学発光分子である、請求項３７に記載の方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公表番号】特表２００７−５１３３２６（Ｐ２００７−５１３３２６Ａ）
【公表日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３９８２９（Ｐ２００６−５３９８２９）
【出願日】平成１６年１１月１０日（２００４．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７５６９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４６４４９
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（５０４０９０１９０）アルター・バイオサイエンス・コーポレーション (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１０日（２００４．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３７５６９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４６４４９
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（５０４０９０１９０）アルター・バイオサイエンス・コーポレーション (8)
【Ｆターム（参考）】
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