哺乳動物における新規トランスポータータンパク質およびその利用
【課題】哺乳動物における有機カチオン（ＯＣ）排泄の最終段階を担う輸送体タンパク質の実体を同定するとともに、有機カチオン（ＯＣ）輸送を測定するアッセイ系を構築する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなり、細胞膜、または膜小胞においてトランスポーター活性を有するポリペプチドを含有する脂質膜を提供する。更に該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを備える脂質膜を作製するためのキットを提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなり、細胞膜、または膜小胞においてトランスポーター活性を有するポリペプチドを含有する脂質膜を提供する。更に該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを備える脂質膜を作製するためのキットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における新規トランスポータータンパク質およびその利用に関するものであり、より詳細には、薬物および／または老廃物の排出最終段階を司る新規有機カチオントランスポータータンパク質ならびにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物は、環境中の毒物および／または代謝排泄物を処理しなければならず、ヒトでは特に、非常に多岐にわたる構造の薬物などを処理しなければならない。哺乳動物において、これらの毒性を有する有機化合物は、主に腎臓および／または肝臓を介して排泄されている。腎臓での排泄は糸球体での濾過および尿細管での分泌によって行われている。毒性を有する有機化合物は、尿細管細胞の血管側膜にて取り込まれ、尿細管細胞の刷子縁膜側にて排泄されている（非特許文献１〜７を参照のこと）。肝細胞もまた、毒性を有する有機化合物を類洞にて吸収して、これらを毛細胆管に排泄している（非特許文献１〜７を参照のこと）。
【０００３】
これまで非常に多くの生化学的研究または生物学的研究によって、特定の輸送体が有機カチオン（ＯＣ）の排泄の最終段階を担っているであろうということが明らかになっており、ｅｌｅｃｔｒｏｎｅｕｔｒａｌなプロトンとＯＣとの交換輸送を仲介するＯＣ輸送体の存在が示唆されている（非特許文献５〜７を参照のこと）。この推定の輸送体は、カチオン性薬物を含む広範な種々のＯＣ、数種のビタミン、または生体内在性化合物（例えば、コリンまたはドーパミンなど）を認識するので、多剤認識性の排泄輸送体であると考えられている。
【０００４】
これまでトランスポーターの実体は知られておらず、その分子実体を同定するために既知の腎臓トランスポーターのホモログが探索されていた。しかし、目的の機能を発揮する分子（タンパク質）が同定されるには至っていない。すなわち、具体的にどのような分子が有機カチオン（ＯＣ）の排泄の最終段階を担う輸送体タンパク質として存在するのかは全く不明であり、具体的な分子の同定が望まれていた。
【０００５】
本発明者らは、目的の機能を有するタンパク質のファミリーが細菌（バクテリア）から哺乳動物まで保存されているのではないかと考え、バクテリアにおいて多剤排泄ポンプとして機能するタンパク質のオルソログが哺乳動物に存在し、このオルソログが哺乳動物でのＯＣの排泄を担っていると想定した。
【０００６】
バクテリアの多剤排泄ポンプは、いくつかのグループ（例えば、ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＭＳＦ）、ｓｍａｌｌ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＳＭＲ）ファミリー、ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ（ＲＮＤ）ファミリー、ＡＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢＣ）ファミリー、およびｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ａｎｄ ｔｏｘｉｎ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ（ＭＡＴＥ）ファミリー）に分類されている（非特許文献８〜１０を参照のこと）。
【０００７】
本発明者らは、独自の観点からデータベース上で検索した結果、ＭＡＴＥファミリータンパク質に分類されそうなタンパク質をコードする遺伝子が哺乳動物に存在することを見出した（非特許文献１１を参照のこと）。
【非特許文献１】Pritchard, J. B. and Miller, D. S. (1993) Physiol. Rev.: 73, 765-96
【非特許文献２】Ullrich, K. J. (1994) Biochim. Biophys. Acta: 1197, 45-62
【非特許文献３】Oude Elferink, R. P., et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta: 1241, 215-68
【非特許文献４】Koepsell, H. (1998) Annu. Rev. Physiol.: 60, 243-66
【非特許文献５】Inui, K. I. Et al., (2000) Kidney Int.: 58, 944-58
【非特許文献６】Wright, S. H. and Dantzler, W. H. (2004) Physiol. Rev.: 84, 987-1049
【非特許文献７】Koepsell, H. (2004) Trends Pharmacol. Sci.: 25, 375-81
【非特許文献８】Brown, M. H. et al. (1999) Mol. Microbiol.: 31, 394-5
【非特許文献９】Putman, M. et al. (2000) Microbiol. Mol. Biol. Rev.: 64, 672-93
【非特許文献１０】Hvorup, R. N. et al. (2003) Eur. J. Biochem.: 270, 799-813
【非特許文献１１】Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＫ００１７０９
【非特許文献１２】Ito, W. et al. (1991) Gene: 1002, 67-70
【非特許文献１３】Morimoto, R. et al. (2003) J. Neurochem.84: 382-91
【非特許文献１４】Tamai, I. Et al. (1997) FEBS Lett.: 419, 107-11
【非特許文献１５】Morita, Y. et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother.: 42, 1778-82
【非特許文献１６】Smith, A. C. et al. (1986) Am. J. Med. Genet.: 24, 393-414
【非特許文献１７】Bi, W. et al. (2002) Genome Res.: 12, 713-28
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１１に記載の遺伝子による推定のアミノ酸配列は、ＭＡＴＥファミリーのプロトタイプである、ビブリオ菌のＮａ＋依存性多剤排泄輸送体ＮｏｒＭとの配列相同性が非常に低く、ＭＡＴＥファミリータンパク質に分類されるとは容易に想像できない。
【０００９】
また、ＭＡＴＥファミリーは、最近分類分けされた多剤耐性獲得タンパク質の一群であり、そのいくつかが、バクテリアにおいてＨ＋またはＮａ＋依存的カチオン性薬物を排泄することが知られているのみである。すなわち、ＭＡＴＥファミリー全体の特性は依然として解明されていないばかりか、目的のタンパク質が哺乳動物でのＭＡＴＥファミリータンパク質であることを確認するためのアッセイ系もなかった。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＭＡＴＥファミリータンパク質であることを確認するためのアッセイ系を確立し、哺乳動物でのＭＡＴＥファミリータンパク質を見出すとともに、その機能を利用した技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る脂質膜は、以下のポリペプチドを含有していることを特徴としている：配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【００１２】
本発明に係る脂質膜は、天然由来の脂質膜であっても人工の脂質膜であってもよく、天然由来の脂質膜である場合は、細胞膜または膜小胞であることが好ましく、人工の脂質膜である場合は、脂質平面膜またはリポソームであることが好ましい。
【００１３】
本発明に係る形質転換体は、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る形質転換体において、上記ポリペプチドは、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列の１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００１５】
本発明に係る形質転換体において、上記ポリペプチドはまた、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによってコードされかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００１６】
本発明に係る形質転換体において、上記ポリペプチドはまた、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドによってコードされかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００１７】
本発明に係るリポソーム組成物は、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド含有していることを特徴としている。
【００１８】
本発明に係るリポソーム組成物において、上記ポリペプチドは、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列の１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００１９】
本発明に係るリポソーム組成物において、上記ポリペプチドはまた、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによってコードされかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２０】
本発明に係るリポソーム組成物において、上記ポリペプチドはまた、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドによってコードされかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２１】
本発明に係るリポソーム組成物は、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅタンパク質をさらに含有していてもよい。なお、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅタンパク質は、細胞内のプロトンを細胞外へ能動的に輸送するタンパク質であって、プロトンポンプとも称される。
【００２２】
本発明に係る脂質膜作製方法は、上記脂質膜を作製するために、下記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターを用いる工程を包含することを特徴としている：配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【００２３】
本発明に係る脂質膜作製キットは、上記脂質膜を作製するために、下記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターを備えていることを特徴としている：配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【００２４】
本発明に係る試験方法は、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するために、上記の脂質膜を、評価すべき薬剤とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００２５】
本発明に係る試験方法は、上記インキュベートする工程において、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンを共存させることが好ましい。
【００２６】
本発明に係る試験方法は、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するために、上記形質転換体を細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００２７】
本発明に係る試験方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００２８】
本発明に係る試験方法は、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するために、上記リポソーム組成物を細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００２９】
本発明に係る試験方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００３０】
本発明に係る試験キットは、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するために、上記の脂質膜を備えていることを特徴としている。
【００３１】
本発明に係る試験キットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていてもよい。
【００３２】
本発明に係る試験キットは、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するために、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００３３】
本発明に係る試験キットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００３４】
本発明に係る試験キットは、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するために、上記リポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００３５】
本発明に係る試験キットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００３６】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞膜における物質輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記の脂質膜を候補因子とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００３７】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記物質輸送は、ニコチン、メラトニンまたはステロイドホルモンの輸送、あるいは薬物および／または老廃物の排泄であることが好ましい。
【００３８】
また、本発明に係るスクリーニング方法は、上記インキュベートする工程において、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンを共存させることが好ましい。
【００３９】
本発明に係るスクリーニング方法は、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記の形質転換体をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００４０】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００４１】
本発明に係るスクリーニング方法は、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記のリポソーム組成物をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００４２】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００４３】
本発明に係るスクリーニング方法は、ニコチンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記の形質転換体をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００４４】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００４５】
本発明に係るスクリーニング方法は、ニコチンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記のリポソーム組成物をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００４６】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００４７】
本発明に係るスクリーニング方法は、メラトニンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記の形質転換体をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００４８】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００４９】
本発明に係るスクリーニング方法は、メラトニンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記のリポソーム組成物をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００５０】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００５１】
本発明に係るスクリーニング方法は、ステロイドホルモンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記の形質転換体をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００５２】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００５３】
本発明に係るスクリーニング方法は、ステロイドホルモンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記のリポソーム組成物をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００５４】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００５５】
本発明に係るスクリーニングキットは、細胞膜における物質輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記の脂質膜を備えていることを特徴としている。
【００５６】
本発明に係るスクリーニングキットにおいて、上記物質輸送は、ニコチン、メラトニンまたはステロイドホルモンの輸送、あるいは薬物および／または老廃物の排泄であることが好ましい。
【００５７】
また、本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンをさらに備えていてもよい。
【００５８】
本発明に係るスクリーニングキットは、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００５９】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００６０】
本発明に係るスクリーニングキットは、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記リポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００６１】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００６２】
本発明に係るスクリーニングキットは、ニコチンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００６３】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００６４】
本発明に係るスクリーニングキットは、ニコチンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記リポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００６５】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００６６】
本発明に係るスクリーニングキットは、メラトニンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記の形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００６７】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００６８】
本発明に係るスクリーニングキットは、メラトニンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記のリポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００６９】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００７０】
本発明に係るスクリーニングキットは、ステロイドホルモンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記の形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００７１】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００７２】
本発明に係るスクリーニングキットは、ステロイドホルモンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記のリポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００７３】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００７４】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングするために、上記の脂質膜を候補因子とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００７５】
また、本発明に係るスクリーニング方法は、上記インキュベートする工程において、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）を共存させることが好ましい。
【００７６】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングするために、上記形質転換体をテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００７７】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングするために、上記リポソーム組成物をテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００７８】
本発明に係るスクリーニングキットは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングするために、上記の脂質膜を備えていることを特徴としている。
【００７９】
また、本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）をさらに備えていてもよい。
【００８０】
本発明に係るスクリーニングキットは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングするために、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００８１】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）をさらに備えていることが好ましい。
【００８２】
本発明に係るスクリーニングキットは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングするために、上記リポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００８３】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）をさらに備えていることが好ましい。
【００８４】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドに対する阻害剤または活性増強剤をスクリーニングするために、上記形質転換体を候補化合物とインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００８５】
本発明に係るスクリーニングキットは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドに対する阻害剤または活性増強剤をスクリーニングするために、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００８６】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドに対する阻害剤または活性増強剤をスクリーニングするために、上記リポソーム組成物を候補化合物とインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００８７】
本発明に係るスクリーニングキットは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドに対する阻害剤または活性増強剤をスクリーニングするために、上記リポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００８８】
本発明に係る診断方法は、細胞膜における物質輸送異常に起因する疾患を診断するために、下記ポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列でありかつ連続する少なくとも１２塩基からなるオリゴヌクレオチドを、生物学的サンプルから調製したｍＲＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としている：
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００８９】
本発明に係る診断方法は、上記オリゴヌクレオチドが配列番号１１〜１８のいずれか１つに示される塩基配列からなることが好ましい。
【００９０】
本発明に係る診断キットは、細胞膜における物質輸送異常に起因する疾患を診断するために、下記ポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列でありかつ連続する少なくとも１２塩基からなるオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴としている：
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００９１】
本発明に係る診断キットは、上記オリゴヌクレオチドが配列番号１１〜１８のいずれか１つに示される塩基配列からなることが好ましい。
【００９２】
本発明に係る診断方法は、細胞膜における物質輸送異常に起因する疾患を診断するために、下記ポリペプチドと特異的に結合する抗体を、生物学的サンプルとインキュベートする工程を包含することを特徴としている：
・配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【００９３】
本発明に係る診断方法において、上記抗体は、配列番号１９または配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドによって惹起されることが好ましい。
【００９４】
本発明に係る診断方法は、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドが寄与する物質輸送異常に起因する疾患を診断するために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いる工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド、であることを特徴としている。
【００９５】
本発明に係る診断キットは、細胞膜における物質輸送異常に起因する疾患を診断するために、下記ポリペプチドと特異的に結合する抗体を備えていることを特徴としている：
・配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【００９６】
本発明に係る診断キットにおいて、上記抗体は、配列番号１９または配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドによって惹起されることが好ましい。
【００９７】
本発明に係る診断用キットは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドが寄与する物質輸送異常に起因する疾患を診断するために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えており、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド、であることを特徴としている。
【００９８】
本発明に係るポリペプチドは、配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド、であることを特徴としている。
【００９９】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードすることを特徴としている。
【０１００】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号２１に示される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号２１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または、配列番号２１に示される塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であり得る。
【０１０１】
本発明に係るベクターは、上記ポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。
【０１０２】
本発明に係る形質転換体は、上記ポリヌクレオチドを含有していることを特徴としている。
【０１０３】
本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。
【０１０４】
本発明に係るノックアウト動物は、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現が抑制されていることを特徴としており、マウスであることが好ましい。
【０１０５】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【発明の効果】
【０１０６】
本発明を用いれば、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤（例えば、医薬品、農薬など）をスクリーニングし得る。また、本発明を用いれば、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験し得る。さらに、本発明は、モノアミン類、揮発性有機カチオン類、ニコチンの吸収または排出、メラトニン、ステロイドホルモン、性ホルモンおよびこれらの関連製剤の分泌、吸収または排出、植物アルカノイド類またはフェノール類の植物体内への濃縮など、多くの生体成分（特に、疎水度の強い生体成分）の輸送、分泌、蓄積または排出を測定するための実験系として利用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０７】
本発明者らは、非特許文献１１に記載される遺伝子によってコードされると推定されるタンパク質が実際に哺乳動物に存在するのか、そして当該タンパク質がＭＡＴＥファミリータンパク質であるのかを確認するために、哺乳動物から当該遺伝子の取得を試みるとともに、ＭＡＴＥファミリータンパク質としての機能を確認するために必要なアッセイ系を構築した。
【０１０８】
上記遺伝子の塩基配列情報に基づいて種々のプライマーを設計して哺乳動物の組織を用いたＲＴ−ＰＣＲを試みたが、ＭＡＴＥファミリー分子に関する情報があまり得られていないこと、特に、特定の機能ドメインがＭＡＴＥファミリー分子には存在しないことから、好ましいプライマーを設計するための指標が全くなかった。
【０１０９】
しかし、本発明者らは、独自の着眼点の確からしさを検証すべく試行錯誤を繰り返し、その結果、特定のプライマーを用いれば目的の遺伝子を増幅し得ることをついに見出した。
【０１１０】
このように、本発明者らの独自の着眼点および試行錯誤に基づいて取得し得た遺伝子は、ヒトおよびマウスにおいて存在しかつ当該遺伝子によってコードされるタンパク質が腎臓の尿細管および胆管の管腔側の膜に存在して、新規輸送体として機能していることを見出した。
【０１１１】
すなわち、本発明者らは、バクテリア由来ＭＡＴＥファミリーのヒトおよびマウスにおけるオルソログである哺乳動物ＭＡＴＥポリペプチドを同定し、哺乳動物ＭＡＴＥポリペプチドが腎臓および／または肝臓に発現して、プロトンとの交換輸送によって有機カチオン性化合物を排泄する最後の段階を担っていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０１１２】
〔１〕哺乳動物ＭＡＴＥポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明者らは、細菌において見出された毒物排出トランスポーターのオルソログが哺乳動物において存在することを見出し、そのｃＤＮＡを単離し、その機能を解析した。
【０１１３】
本発明は、哺乳動物ＭＡＴＥポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「ＭＡＴＥポリペプチド」は、「ＭＡＴＥタンパク質」または「ＭＡＴＥファミリータンパク質」と交換可能に使用され、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチド、すなわち、細胞膜を介して有機カチオン（ＯＣ）を輸送するトランスポーター活性（輸送活性）を有するポリペプチドが意図される。すなわち、本明細書中で使用される場合、用語「ＭＡＴＥ活性」は、細胞膜におけるトランスポーター活性（細胞膜を介して物質を輸送する活性）が意図され、より具体的には、細胞膜を介して有機カチオン（ＯＣ）を輸送するトランスポーター活性（輸送活性）が意図される。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、化学合成されても、天然供給源より単離されてもよい。
【０１１５】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【０１１６】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。
【０１１７】
本発明に係るポリペプチドは、後述する本発明に係るポリヌクレオチド（本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。
【０１１８】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。
【０１１９】
好ましくは、本発明に係る哺乳動物ＭＡＴＥポリペプチドは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいはその変異体であり得る。上記哺乳動物としては、ヒトまたはマウスであることが好ましい。本明細書中においてポリペプチドまたはタンパク質に関して用いられる場合、用語「変異体」は、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドまたはタンパク質が意図される。なお、ヒトＭＡＴＥ１ポリペプチド（ｈＭＡＴＥ１）、ヒトＭＡＴＥ２ポリペプチド（ｈＭＡＴＥ２）、マウスＭＡＴＥ１ポリペプチド（ｍＭＡＴＥ１）、マウスＭＡＴＥ２ポリペプチド（ｍＭＡＴＥ２）およびヒトＭＡＴＥ３ポリペプチド（ｈＭＡＴＥ３）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、４、６、８および２２に示される。また、ｈＭＡＴＥ３ポリペプチドは、これまでに全く知られていない新規ポリペプチドである。
【０１２０】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ＭＡＴＥポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドであって、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。
【０１２１】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【０１２２】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【０１２３】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のＭＡＴＥ活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【０１２４】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチドのＭＡＴＥ活性を変化させない。
【０１２５】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１アミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【０１２６】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ＭＡＴＥポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列の１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【０１２７】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ＭＡＴＥポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【０１２８】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【０１２９】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。
【０１３０】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ＭＡＴＥポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【０１３１】
例えば、「本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得ることを除いて、参照配列に同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の５％までが、欠失され得るかまたは別の塩基で置換され得るか、あるいは参照配列における全塩基の５％までの多くの塩基が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’または３’末端位置または参照配列における塩基中で個々にかまたは参照配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。
【０１３２】
本発明はまた、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを提供する。本明細書中において使用される場合、「ＭＡＴＥポリヌクレオチド」は、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体が意図される。本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。なお、ヒトＭＡＴＥ１ポリヌクレオチド、ヒトＭＡＴＥ２ポリヌクレオチド、マウスＭＡＴＥ１ポリヌクレオチド、マウスＭＡＴＥ２ポリヌクレオチドおよびヒトＭＡＴＥ３ポリヌクレオチドの塩基配列は、それぞれ配列番号１、３、５、７および２１に示される。また、ｈＭＡＴＥ３ポリヌクレオチドは、これまでに全く知られていない新規ポリヌクレオチドである。
【０１３３】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）もしくはリボヌクレオチド（Ｃ，Ａ，ＧおよびＵ）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【０１３４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【０１３６】
本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【０１３７】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、ＭＡＴＥポリヌクレオチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体はＭＡＴＥポリペプチドをコードし、かつ以下のポリヌクレオチドのいずれであることが好ましい：
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【０１３８】
他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとのプライマー対、または配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとのプライマー対を用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーから増幅されるポリヌクレオチド、あるいは、配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーとのプライマー対、または配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとのプライマー対を用いて、マウスｃＤＮＡライブラリーから増幅されるポリヌクレオチドであり、かつＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴としている。
【０１３９】
本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【０１４０】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料（例えば、ヒトまたはマウスなどの諸器官）であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。
【０１４１】
本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書中にさらに記載されるように、ＭＡＴＥ活性を測定するためのツールとして使用され得る。
【０１４２】
つまり、本発明の目的は、ＭＡＴＥポリペプチドおよびＭＡＴＥポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法およびポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。従って、上記各方法以外によって取得されるＭＡＴＥポリペプチド、およびＭＡＴＥポリヌクレオチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１４３】
〔２〕ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの利用
〔２−１〕ベクター
本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【０１４４】
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＭＡＴＥポリヌクレオチド）のｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【０１４５】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。また、発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【０１４６】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。
【０１４７】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１４８】
本発明に係るベクターを使用すれば、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを生物または細胞に導入して、当該生物または細胞中にＭＡＴＥポリペプチドを発現させることができる。さらに、本発明に係るベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、ＭＡＴＥポリペプチドを合成することができる。
【０１４９】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１５０】
〔２−２〕脂質膜
本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有する脂質膜を提供する。本発明に係る脂質膜は、天然由来の脂質膜であっても、人工の脂質膜であってもよい。本発明に係る脂質膜が天然由来である場合は、細胞膜または膜小胞であればよく、本発明に係る脂質膜が人工である場合は、脂質平面膜またはリポソーム（リポソーム組成物）であればよい。
【０１５１】
〔Ａ〕形質転換体
一実施形態において、本発明に係る脂質膜は、ＭＡＴＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体の形質膜であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。
【０１５２】
本実施形態における形質転換体は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有する形質膜が形成されていることを特徴とする。なお、本実施形態における形質転換体は、ＭＡＴＥポリペプチドが安定的に発現していることが好ましい。
【０１５３】
１つの局面において、本実施形態における形質転換体は、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、ＭＡＴＥポリペプチドが発現され得るように生物中に導入することによって取得される。本実施形態における形質転換体は、原核生物であっても真核生物であってもよい。本発明者らの解析によりＭＡＴＥポリペプチドが膜タンパク質であることが示されたので、ＭＡＴＥポリペプチドが発現する形質転換体においては、ＭＡＴＥポリペプチドを含有する形質膜が提供される。
【０１５４】
上記発現ベクターを宿主に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドで昆虫細胞を形質転換させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよく、本発明に係るポリペプチドで植物を形質転換させる場合には、アグロバクテリウム法、遺伝子銃（粒子ボンバードメント法）を用いて本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入すればよい。
【０１５５】
このように、本実施形態における形質転換体は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを含有する形質膜が形成されていればよいといえる。すなわち、上記方法以外の公知の方法によって作製された形質転換体も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１５６】
〔Ｂ〕膜小胞
一実施形態において、本発明に係る脂質膜は、ＭＡＴＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された細胞から得られる膜小胞であり得る。本明細書中で使用される場合、「膜小胞」は、超音波処理などに供されて破壊された細胞の形質膜が形成する、より小さな小胞が意図される。
【０１５７】
このように、本実施形態に係る膜小胞は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを含有する脂質膜によって形成されていればよいといえる。すなわち、機能を喪失した細胞内小器官などを内包する膜小胞もまた、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１５８】
〔Ｃ〕リポソームおよびリポソーム組成物
ＭＡＴＥポリペプチドは種々の有機カチオン（ＯＣ）を輸送するトランスポーターである。本発明者らは、これまでに、放射標識した基質を用いて、ＭＡＴＥポリペプチドを発現させたＨＥＫ２９３細胞またはアフリカツメガエル卵母細胞の系で、ＭＡＴＥポリペプチドによってどのような物質が輸送されるのか調べた。このような発現細胞を用いる系では、ＭＡＴＥポリペプチド以外に細胞由来の多数のタンパク質が共存した条件下にて測定を行うが、共存する多数のタンパク質による干渉は、特に性ホルモンなどの疎水性の高い輸送基質を用いる場合に特に問題になる。すなわち、疎水性の高い輸送基質について信頼性の高い測定を行うためには、ＭＡＴＥポリペプチド以外のタンパク質が存在しない系を用いることが好ましい。
【０１５９】
また、上述した実験系は輸送基質として標識した物質（すなわち放射標識物質または蛍光標識物質）を用いるので、標識し得ない薬物、毒物、代謝性生体成分などが輸送対象となるトランスポータータンパク質についての輸送を確認することができなかった。
【０１６０】
そこで、本発明者らは、蛋白質科学的にほぼ均一なＭＡＴＥポリペプチドを調製し、これを組み込んだリポソーム（いわゆるプロテオリポソーム）を調製し、このプロテオリポソームを輸送実験に供することにより、完全に定義された組成により構成されたＭＡＴＥポリペプチドの輸送測定系を完成した。そして、この輸送測定系をマススペクロトスコピー（質量分析計）や蛍光分光計、ＨＰＬＣなどと組み合わせることにより、これまでは不可能であった様々な非標識化合物について輸送基質となるかどうかを正確に調べることができるようになった。
【０１６１】
すなわち、一実施形態において、本発明に係る脂質膜は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「リポソーム組成物」は、特定の物質を含有したリポソームが意図される。リポソームは、ベジクルとも称される脂質人工膜であり、脂質（例えば、リン脂質）の懸濁液を激しく攪拌して分散させた後に超音波処理を施すことにより作製され得る。リポソームを用いた研究は広く行われており、細胞膜モデルとして利用されたり、薬物送達（ＤＤＳ）の手段の一つとして利用されたりしている。
【０１６２】
本発明に係るリポソーム組成物は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有していることを特徴とする。本発明に係るリポソーム組成物は、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅタンパク質をさらに含有していてもよい。なお、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅタンパク質は、細胞内のプロトンを細胞外へ能動的に輸送するタンパク質であって、プロトンポンプとも称される。プロトンポンプの精製方法は、特に限定されるものではなく、Ｍｏｒｉｙａｍａ Ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２２１４１−２２１４６（１９９１）等の従来公知の方法を好適に用いればよい。なお、本発明に係るリポソーム組成物を用いてＭＡＴＥポリペプチドの輸送活性を測定する場合、哺乳動物由来のＭＡＴＥポリペプチドであればＨ＋−ＡＴＰａｓｅタンパク質が共存しなくても活性測定が可能である。
【０１６３】
本発明を用いれば、ＭＡＴＥポリペプチド以外の夾雑タンパク質が存在しない系を構築することができるので、得られた結果がＭＡＴＥポリペプチドに起因するものであるか否かをより明確に知ることができ、多数のタンパク質が共存することによって、ＭＡＴＥポリペプチドによる基質の輸送がどのくらい干渉されるのかを知ることができる。
【０１６４】
また、本発明を用いれば、放射標識または蛍光標識した基質を用いる必要がない系を構築することができるので、広範な種々の薬物、毒物、代謝性生体成分などについて、トランスポータータンパク質の輸送対象であるか否かを解析することができる。
【０１６５】
このように、本発明によって従来の問題点を解決することができ、ＭＡＴＥポリペプチドの輸送機能をより広くより深く理解することができる。もちろん、従来どおりの標識された化合物を本発明とともに用いることもできる。
【０１６６】
このように、本発明に係るリポソーム組成物は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを含有していればよいといえる。すなわち、上記方法以外の公知の方法によって作製されたリポソーム組成物も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１６７】
〔Ｄ〕脂質平面膜
一実施形態において、本発明に係る脂質膜は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有している脂質平面膜であり得る。脂質二重層は、極性脂質（特にリン脂質）が二層となった膜状の構造である。脂質二重層構造が二次元構造として安定化するのは球状であるが、末端を水分子から隔離すれば平面構造になり得る。本明細書中で使用される場合、人工的に作製される脂質二重層のうち球状のものをリポソーム、平面状のものを脂質平面膜という。
【０１６８】
本実施形態に係る脂質平面膜を得るためには、人工的に形成した脂質二重層の膜にＭＡＴＥポリペプチドを埋め込めばよい。なお、人工的な脂質二重層は、膜タンパク質（例えば、チャネルタンパク質）の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する際に使用されており、いずれの作製方法も当該分野において周知である。
【０１６９】
このように、本発明に係る脂質平面膜は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを含有していればよいといえる。すなわち、上記方法以外の公知の方法によって作製された脂質平面膜も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１７０】
〔３〕ベクターの利用
上述したように、本発明に係るベクターを使用すれば、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを導入した生物または細胞にてＭＡＴＥポリペプチドを発現させることができる。細胞膜は、形質転換体として、または形質転換体の一部として供給されるので、本発明に係るベクターを用いれば、ＭＡＴＥポリペプチドを含有する天然由来の脂質膜を得ることができる。また、人工の脂質膜を得るためには、上述したベクターを用いて作製した精製ＭＡＴＥポリペプチド（発現系であっても無細胞系であってもよい。）を用いればよい。
【０１７１】
このように、本発明に係るベクターは、本発明に係る脂質膜を作製するためのツールとして利用され得る。すなわち、本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有する脂質膜を作製するための方法およびキットを提供する。
【０１７２】
本発明に係るＭＡＴＥポリペプチドを含有する脂質膜を作製する方法は、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを含むベクターを用いてＭＡＴＥポリペプチドを生成する工程を包含することを特徴としている。天然由来の脂質膜を作製する場合は、生成したＭＡＴＥポリペプチドを精製する必要はないが、人工の脂質膜を作製する場合は、生成したＭＡＴＥポリペプチドを精製して用いればよい。本明細書を読んだ当業者は、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを含むベクターを用いてＭＡＴＥポリペプチドを生成することを容易になし得る。
【０１７３】
また、本発明に係るＭＡＴＥポリペプチドを含有する脂質膜を作製するためのキットは、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを含むベクターを備えていることを特徴としている。天然由来の脂質膜を作製する場合は、上記ベクターは組換え発現ベクターであり、人工の脂質膜を作製する場合は、上記ベクターは組換え発現ベクターであってもなくてもよい。
【０１７４】
このように、本発明に係るＭＡＴＥポリペプチドを含有する脂質膜を作製するための方法およびキットは、少なくとも、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを含むベクターを用いればよいといえる。すなわち、上記以外の公知の技術を適用する方法およびキットも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１７５】
〔４〕脂質膜の利用
本発明は、上記脂質膜の利用をさらに提供する。本明細書中、形質転換体またはリポソーム組成物を例に挙げて、脂質膜の利用を説明するが、本発明に係る脂質膜の利用はこれらに限定されない。
【０１７６】
〔Ａ〕ＭＡＴＥポリペプチドを発現する形質転換体の利用
ＭＡＴＥ１ポリペプチドをＨＥＫ２９３細胞に発現させると、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）および１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）のＨ＋依存的な輸送が生じた。ＭＡＴＥ１の基質特異性は、腎臓または肝臓に存在するＨ＋依存性有機カチオン輸送体と類似していた。このように、ＭＡＴＥ１は、長期にわたって探索されてきた、有機カチオン（ＯＣ）を直接尿中または胆汁中に排泄する多機能なＯＣ輸送体であることが明らかになった。
【０１７７】
上述したように、ＭＡＴＥポリペプチドは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有しており、より詳細には、細胞膜を介して有機カチオン（ＯＣ）を輸送するトランスポーター活性（輸送活性）を有している。本発明は、このような輸送活性の標的となる基質をさらにスクリーニングするための方法およびキットを提供する。
【０１７８】
本発明に係るスクリーニング方法は、上記形質転換体をテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。上記工程において、基質候補の存在下または非存在下においてＴＥＡまたはＭＰＰの上記形質転換体への取り込み量に変化が生じた場合、すなわち、基質候補の存在によってＴＥＡまたはＭＰＰの輸送が阻害された場合、基質候補がＭＡＴＥポリペプチドの新たな基質であると判定することができる。
【０１７９】
後述する実施例において実証されているように、本発明に係るスクリーニング方法によって、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）および１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）以外に、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、およびチアミンがＭＡＴＥポリペプチドの基質となる。すなわち、これらの化合物は、ＭＡＴＥポリペプチドによって輸送される。
【０１８０】
このように、本発明に係るスクリーニング方法において、ＴＥＡまたはＭＰＰの代わりに上記化合物の１つ以上を用いて、その輸送阻害の有無を判定基準に用いてもよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。なお、これらの化合物は、本発明において使用される場合、検出可能に標識されていることが好ましい。好ましい標識としては放射標識が挙げられるが、これに限定されない。
【０１８１】
本発明に係るスクリーニングキットは、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。好ましい実施形態において、本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）をさらに備えていることが好ましい。上記工程において、基質候補の存在下または非存在下においてＴＥＡまたはＭＰＰの上記形質転換体取り込み量に変化が生じた場合、すなわち、基質候補の存在によってＴＥＡまたはＭＰＰの輸送が阻害された場合、基質候補がＭＡＴＥポリペプチドの新たな基質であると判定することができる。また、上述したように、ＴＥＡまたはＭＰＰの代わりにシメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの１つ以上を用いて、その輸送阻害の有無を判定基準に用いてもよい。
【０１８２】
本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを発現する形質転換体のさらなる用途を提供する。１つの局面において、本発明は、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤をスクリーニングするための方法およびキットを提供する。別の局面において、本発明は、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するための方法およびキットを提供する。さらなる局面において、本発明は、モノアミン類、揮発性有機カチオン類、ニコチンの吸収または排出、メラトニン、ステロイドホルモン、性ホルモンおよびこれらの関連製剤の分泌、吸収または排出、植物アルカノイド類またはフェノール類の植物体内への濃縮など、多くの生体成分（特に、疎水度の強い生体成分）の輸送、分泌、蓄積または排出を測定するための方法およびキットを提供するとともに、これらの輸送、分泌、蓄積または排出を調節する薬剤をスクリーニングするための方法およびキットを提供する。いずれの場合においても、本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを発現する形質転換体を用いることを特徴としており、好ましくは、ＭＡＴＥポリペプチドの基質を利用する。また、本発明に係るスクリーニングキットを用いれば、細胞膜に存在するＭＡＴＥポリペプチドにいかなる化合物が結合するかを調べることができるので、ＭＡＴＥポリペプチドに対する阻害剤または活性増強剤をスクリーニングし得る。
【０１８３】
これまではトランスポーターの実体が不明であったため、種々の医薬品試験を実施し得なかった。本発明に係るトランスポーターを阻害する薬剤は、薬剤の体内での長期貯留を引き起こし、種々の長期毒性を引き起こす可能性がある。よって、このトランスポーターに対する薬品の影響は、薬品を製品化する前に予め試験する必要がある。
【０１８４】
薬剤または毒素が体外（尿および／または便）に排出されるためには、これらの物質は何種類ものトランスポーターによっていくつもの細胞を通過する必要がある。本発明に係るトランスポーターは、このような排出の最終段階を司る。
【０１８５】
本発明は、不特定多数の有機カチオンを基質として、腎臓尿細管のアピカル部位（原尿に接する部位）または肝臓の微小胆管（胆汁を排泄する部位）に存在する新規トランスポーターを定常的に発現する培養細胞株を確立した。この細胞株は、種々の医薬品または農薬などの輸送（排出）試験を行うための測定系と使用され得る。
【０１８６】
なお、ＭＡＴＥポリペプチドを発現する形質転換体を用いて本発明に係る方法およびキットを説明してきたが、ＭＡＴＥポリペプチドを発現する形質転換体を作製するための工程をさらに包含する方法、およびＭＡＴＥポリペプチドを発現する形質転換体を作製するためのツールをさらに備えているキットもまた、本発明の技術的範囲に属する。
【０１８７】
〔Ｂ〕ＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物の利用
実施例にて詳述するように、ＭＡＴＥ１ポリペプチドをＨＥＫ２９３細胞に発現させると、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）および１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）のＨ＋依存的な輸送が生じた。また、ＭＡＴＥ１ポリペプチドを含有しているリポソーム組成物において、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）のＨ＋依存的な輸送が確認された。ＭＡＴＥ１の基質特異性は、腎臓または肝臓に存在するＨ＋依存性有機カチオン輸送体と類似していた。このように、ＭＡＴＥ１は、長期にわたって探索されてきた、有機カチオン（ＯＣ）を直接尿中または胆汁中に排泄する多機能なＯＣ輸送体であることが明らかになった。
【０１８８】
上述したように、ＭＡＴＥポリペプチドは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有しており、より詳細には、細胞膜を介して有機カチオン（ＯＣ）を輸送するトランスポーター活性（輸送活性）を有している。本発明は、このような輸送活性の標的となる基質をさらにスクリーニングするための方法およびキットを提供する。
【０１８９】
本発明に係るスクリーニング方法は、上記リポソーム組成物をテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。上記工程において、基質候補の存在下または非存在下においてＴＥＡまたはＭＰＰの上記リポソーム組成物への取り込み量に変化が生じた場合、すなわち、基質候補の存在によってＴＥＡまたはＭＰＰの輸送が阻害された場合、基質候補がＭＡＴＥポリペプチドの新たな基質であると判定することができる。
【０１９０】
後述する実施例において実証されているように、本発明に係るスクリーニング方法によって、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）および１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）以外に、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、およびチアミンがＭＡＴＥポリペプチドの基質となる。すなわち、これらの化合物は、ＭＡＴＥポリペプチドによって輸送される。
【０１９１】
このように、本発明に係るスクリーニング方法において、ＴＥＡまたはＭＰＰの代わりに上記化合物の１つ以上を用いて、その輸送阻害の有無を判定基準に用いてもよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。なお、これらの化合物は、本発明において使用される場合、検出可能に標識されていてもよい。好ましい標識としては放射標識または蛍光標識が挙げられるが、これに限定されない。
【０１９２】
本発明に係るスクリーニングキットは、上記リポソーム組成物を備えていることを特徴としている。好ましい実施形態において、本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）をさらに備えていることが好ましい。上記工程において、基質候補の存在下または非存在下においてＴＥＡまたはＭＰＰの上記リポソーム組成物取り込み量に変化が生じた場合、すなわち、基質候補の存在によってＴＥＡまたはＭＰＰの輸送が阻害された場合、基質候補がＭＡＴＥポリペプチドの新たな基質であると判定することができる。また、上述したように、ＴＥＡまたはＭＰＰの代わりにシメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの１つ以上を用いて、その輸送阻害の有無を判定基準に用いてもよい。
【０１９３】
本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物のさらなる用途を提供する。１つの局面において、本発明は、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤をスクリーニングするための方法およびキットを提供する。別の局面において、本発明は、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するための方法およびキットを提供する。さらなる局面において、本発明は、モノアミン類、揮発性有機カオチン類、ニコチンの吸収または排出、メラトニン、ステロイドホルモン、性ホルモンおよびこれらの関連製剤の分泌、吸収または排出、植物アルカノイド類またはフェノール類の植物体内への濃縮など、多くの生体成分（特に、疎水度の強い生体成分）の輸送、分泌、蓄積または排出を測定するための方法およびキットを提供するとともに、これらの輸送、分泌、蓄積または排出を調節する薬剤をスクリーニングするための方法およびキットを提供する。いずれの場合においても、本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物を用いることを特徴としており、好ましくは、ＭＡＴＥポリペプチドの基質を利用する。また、本発明に係るスクリーニングキットを用いれば、細胞膜に存在するＭＡＴＥポリペプチドにいかなる化合物が結合するかを調べることができるので、ＭＡＴＥポリペプチドに対する阻害剤または活性増強剤をスクリーニングし得る。
【０１９４】
これまではトランスポーターの実体が不明であったため、種々の医薬品試験を実施し得なかった。本発明に係るトランスポーターを阻害する薬剤は、薬剤の体内での長期貯留を引き起こし、種々の長期毒性を引き起こす可能性がある。よって、このトランスポーターに対する薬品の影響は、薬品を製品化する前に予め試験する必要がある。
【０１９５】
薬剤または毒素が体外（尿および／または便）に排出されるためには、これらの物質は何種類ものトランスポーターによっていくつもの細胞を通過する必要がある。本発明に係るトランスポーターは、このような排出の最終段階を司る。
【０１９６】
本発明は、不特定多数の有機カチオンを基質として、腎臓尿細管のアピカル部位（原尿に接する部位）または肝臓の微小胆管（胆汁を排泄する部位）に存在する新規トランスポーターを含有しているリポソーム組成物を確立した。このリポソーム組成物は、種々の医薬品または農薬などの輸送（排出）試験を行うための測定系と使用され得る。
【０１９７】
なお、ＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物を用いて本発明に係る方法およびキットを説明してきたが、ＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物を作製するための工程をさらに包含する方法、およびＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物を作製するためのツールをさらに備えているキットもまた、本発明の技術的範囲に属する。
【０１９８】
〔５〕オリゴヌクレオチドおよびその利用
本発明は、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくはその変異体のフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９９】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、そしてより好ましくは少なくとも２０塩基、なおより好ましくは少なくとも３０塩基、そしてさらにより好ましくは少なくとも４０塩基の長さのフラグメントが意図される。一実施形態において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７または２１に基づくＤＮＡフラグメントであり得る。本明細書を参照すれば配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号１、３、５、７または２１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。別の実施形態において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号１１〜１８のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであり得る。
【０２００】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして本発明に係るポリペプチドを作製するために使用され得る。また、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、特定の組織における目的遺伝子のｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析またはＰＣＲプライマーとして使用され得る。すなわち、ＭＡＴＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたはＭＡＴＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして、本発明に係るオリゴヌクレオチドを利用することによって、ＭＡＴＥポリペプチドを発現する生物または組織を容易に検出することができる。また、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いれば、ＭＡＴＥポリペプチドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の強弱を確認することができるので、物質輸送異常に起因する疾患、障害を診断することができる。
【０２０１】
すなわち、本発明はさらに、上記オリゴヌクレオチドを用いる診断方法および診断キットを提供する。上述したように、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、「ＭＡＴＥ活性」、すなわち、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド（ＭＡＴＥポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド（ＭＡＴＥポリヌクレオチド）と特異的にハイブリダイズする。よって、本発明に係るオリゴヌクレオチドを用いて生体各組織におけるＭＡＴＥポリヌクレオチドの存在の有無を検出することにより、物質輸送異常に起因する疾患、障害を診断することができる。具体的には、生体組織から生検等により採取した生物学的サンプル（特に、被検体から得られた組織、細胞または体液である被検体サンプル）から調整したｍＲＮＡと、本発明に係るオリゴヌクレオチドとを反応させることにより、生物学的サンプル中でのＭＡＴＥポリヌクレオチドの発現量を知ることができる。
【０２０２】
本発明に係るＭＡＴＥポリペプチドが寄与する物質輸送異常に起因する疾患を診断するキットは、本発明に係るオリゴヌクレオチドを少なくとも備えていればよい。本キットはさらに、必要に応じて、このオリゴヌクレオチドを検出するための試薬を備えていてもよい。なお、ＭＡＴＥポリペプチドによって輸送される物質としては、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、およびチアミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０３】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るオリゴヌクレオチドおよびその利用を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したオリゴヌクレオチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるオリゴヌクレオチドも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０２０４】
〔６〕抗体およびその利用
本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。一実施形態において、本発明に係る抗体は、ｈＭＡＴＥ１ポリペプチドまたはｍＭＡＴＥ１ポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。本実施形態に係る抗体は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるペプチド抗原または配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチド抗原によって惹起されることが好ましいが、抗体の生成方法としてはこれに限定されない。
【０２０５】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）が意図され、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に係る抗体は、ＭＡＴＥポリペプチドを発現する生物材料を選択するに有用であり得、発現部位を同定するになお有用である。
【０２０６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＭＡＴＥポリペプチドと特異的に結合する抗体」は、ＭＡＴＥポリペプチドに特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことが意図される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、ＭＡＴＥポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。
【０２０７】
このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、上記ペプチド抗原を認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、上記ペプチド抗原を認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。
【０２０８】
本発明はまた、哺乳動物ＭＡＴＥポリペプチドを検出し得る抗体を惹起するペプチド抗原を提供する。すなわち、本発明に係るペプチド抗原は、免疫アッセイに有効な抗体を生成するための方法およびキットにおいて有用である。本明細書中で使用される場合、用語「免疫アッセイ」は、抗原抗体反応に基づいた免疫学的な結合反応を利用して行われるアッセイが意図される。免疫学的な結合反応を利用したアッセイとしては、免疫組織化学、免疫電子顕微鏡法、ウエスタンブロット、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、放射性イムノアッセイ、および免疫拡散アッセイのような抗体アッセイ、ならびにアフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられる。
【０２０９】
上記ペプチド抗原は、ＭＡＴＥポリペプチドと同様に、化学合成されても、天然供給源より単離されてもよく、組換え発現（例えば、ＧＳＴ融合タンパク質）を利用して取得されてもよい。
【０２１０】
本明細書を読んだ当業者は、上記ペプチド抗原を用いて抗体を惹起する工程を包含する抗体の生成方法およびキットもまた本発明の範囲内に含まれることを容易に理解する。なお、本発明に係る抗体の生成方法において、上記ポリペプチドをアジュバントとの複合体を抗原として用いてもよい。
【０２１１】
本発明はさらに、上記抗体を用いる診断方法および診断キットを提供する。上述したように、本発明に係る抗体は、「ＭＡＴＥ活性」、すなわち、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド（ＭＡＴＥポリペプチド）と特異的に結合する。よって、本発明に係る抗体を用いて生体各組織におけるＭＡＴＥポリペプチドの存在の有無を検出することにより、物質輸送異常に起因する疾患、障害を診断することができる。具体的には、生体組織から生検等により採取した生物学的サンプル（特に、被検体から得られた組織、細胞または体液である被検体サンプル）と、ＭＡＴＥポリペプチドに特異的に結合する抗体とを反応させることにより、生物学的サンプル中にこの抗体と結合する抗原ペプチド（すなわちＭＡＴＥポリペプチド）の発現量を知ることができる。
【０２１２】
本発明に係るＭＡＴＥポリペプチドが寄与する物質輸送異常に起因する疾患を診断するキットは、ＭＡＴＥポリペプチドに特異的に結合する抗体を少なくとも備えていればよく、該抗体は、マウスまたはヒトのＭＡＴＥ１またはＭＡＴＥ２に対する抗体であることが好ましい。本キットはさらに、必要に応じて、この抗体を検出するための試薬を備えていてもよい。なお、ＭＡＴＥポリペプチドによって輸送される物質としては、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、およびチアミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１３】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るＭＡＴＥポリペプチドを認識する抗体およびその利用を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０２１４】
〔７〕ノックアウト動物
ノックアウト動物は、特定の遺伝子を破壊することによって得られた遺伝子欠損動物である。ノックアウト動物（特にマウス）は、全能性を有する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）において遺伝子破壊を行い、標的遺伝子破壊を起こしたＥＳ細胞を選抜し、その細胞とマウス胚を用いてキメラ個体を作製し、ＥＳ細胞に由来する生殖細胞を有するキメラ個体から二世代以上の交配によって標的破壊遺伝子をホモで有する個体として作出される。ノックアウト動物は、新しい実験動物、特に疾患モデル動物の作出に非常に有効な技術である。
【０２１５】
本発明は、ＭＡＴＥ遺伝子を破壊したノックアウト動物を提供する。本発明に係るノックアウト動物は、マウスであることが好ましい。ノックアウト動物の作製方法は当該分野において周知であるので、本明細書によって提供されるＭＡＴＥ遺伝子の情報に基づけば、当業者はＭＡＴＥ遺伝子ノックアウト動物を容易に作製し得る。
【０２１６】
本発明に係るノックアウト動物を用いれば、細胞膜における物質輸送を調節する薬剤をスクリーニングしたり、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングしたりすることができる。また、本発明に係るノックアウト動物を用いれば、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験することができる。さらに、本発明に係るノックアウト動物は、細胞膜における物質輸送異常に起因する疾患に関するモデル動物として疾患治療に大いに貢献し得る。
【０２１７】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。
【実施例】
【０２１８】
〔１：材料および方法〕
〔１−１．ｃＤＮＡのクローニング〕
ヒトＭＡＴＥ１（ｈＭＡＴＥ１：アクセッション番号ＮＰ−０６０７１２）のｃＤＮＡをヒト脳より抽出した総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。逆転写反応後に、ｃＤＮＡ溶液を１０倍希釈して、０．６ｍＭ ｄＮＴＰｓ（１５０μＭの各ｄＮＴＰ）、および２５ｐｍｏｌのプライマー対、１．５ユニットのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含むＰＣＲ緩衝液中に添加した。ＰＣＲ増幅を以下に従って行った：９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長。増幅産物（１８０４塩基対）をアガロースゲル電気泳動にて解析した。なお、プライマーを、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＫ００１７０９に基づいて作製した（センスプライマー：５’−ｇｇｃｃｇｇｔａｃｃｃｇｃｇａｇｔｃａｃａｔｇｇａａｇｃｔｃ−３’；アンチセンスプライマー：５’−ｃａｃｔｔｃｔａｇａｃｃｔｇｔｇａａｔｔｇｔｇｔｇｔａａｇｃ−３’）。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素（ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ）で消化して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）に挿入した。ヒトＭＡＴＥ１の遺伝子配列をヒトゲノム配列と比較して、エラーがないことを確認した。
【０２１９】
同様に、プライマー対（センス：５’−ａｇｔｃｇａａｔｔｃｃａｃｃａｔｇｇａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇａｃａｃａｇｔｇｇ−３’；アンチセンス：５’ａｇｃｔｃｔｃｇａｇｃｔａｇｔｇｃｃｔｇｇｔｇｇｃｔａｇｇａｔｃｃｔｇａｃ−３’）を用いてヒトＭＡＴＥ２（ｈＭＡＴＥ２：アクセッション番号ＮＰ−６９０８７２）を、プライマー対（センス：５’−ｃｇｃｃｇｇｔａｃｃａｃｃａｔｇｇａａｃｇｃａｃｇｇａｇｇａ−３’；アンチセンス：５’−ａｇａｃａｇｔｔｔａｔｔｇｃｔｇｔｃｃｔｔｔｇｇａｃｇｇａｔ−３’）を用いてマウスＭＡＴＥ１（ｍＭＡＴＥ１：アクセッション番号ＡＡＨ３１４３６）を、プライマー対（センス：５’−ｃａｃｃｇａａｔｔｃａｔｇｇａｇｃｃｇｇｃｃｇａｇｇａｃａ−３’；アンチセンス：５’−ｃｇｔａｃｔｃｇａｇｔｔａｇｃｃａｃｇｇｔｃａｔｔｇａａａ−３’）を用いてマウスＭＡＴＥ２（ｍＭＡＴＥ２：アクセッション番号ＸＰ＿３５４６１１）をクローニングした。
【０２２０】
〔１−２．点変異導入〕
非特許文献１２の方法に従って、オリゴヌクレオチドプライマー（５’−ｇｇｃｃｃａｃｃａｃｔｇｃａｔｇｃａｃａｇｃａｔｇａｇｃ−３’）を用いて、ヒトＭＡＴＥ１に点変異（Ｅ２７３Ｑ）を導入した。
【０２２１】
〔１−３．ノーザンブロット解析〕
ヒトおよびマウスの多組織ノーザンブロット（ＭＴＮ）をＣｌｏｎｔｅｃｈより購入した。ＰＣＲ増幅して得たヒトＭＡＴＥ１のＮ末端領域（ｎｔ１０〜６０１；５９２ｂｐ）、ヒトＭＡＴＥ２のＣ末端領域（ｎｔ１４１２〜１７１２；３０１ｂｐ）、マウスＭＡＴＥ１のＣ末端領域（ｎｔ１３３６〜１５９９；２６４ｂｐ）およびマウスＭＡＴＥ２のＣ末端領域（ｎｔ１０８７〜１６４８；５６２ｂｐ）を、ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、ノーザンブロットのプローブに用いた。ハイブリダイゼーションを、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて６８℃にて１時間行い、５０℃にて洗浄した。
【０２２２】
〔１−４．抗体作製〕
ヒトＭＡＴＥ１のアミノ酸４６１〜５４６位またはマウスＭＡＴＥ１のアミノ酸Ｐ４９５〜Ｑ５３２をＧＳＴと融合させたＧＳＴ融合タンパク質を抗原に用いて、ヒトＭＡＴＥ１またはマウスＭＡＴＥ１に特異的なウサギポリクローナル抗体を作製した。
【０２２３】
〔１−５．ウエスタンブロッティング〕
ヒト組織サンプルをコスモバイオより購入した。マウス組織１ｇから膜画分を調製した。各組織を、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、０．３Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅ、５ｍＭ ＥＤＴＡおよびタンパク質分解酵素阻害剤（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、ａｎｔｉｐａｉｎおよびｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎを各１０μｇ／ｍｌ）からなる緩衝液中に懸濁した後、ホモジナイズした。核を除去した後、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。上清を除去し、沈殿を上記緩衝液中に懸濁した。１％ ＳＤＳおよび１０％ β−メルカプトエタノールを含む緩衝液を加えた後、ヒト膜画分（１００μｇ）およびマウス膜画分（２００μｇ）を電気泳動用サンプルとして用いた。ウエスタンブロッティングを定法（非特許文献１３を参照のこと）に従って行った。
【０２２４】
〔１−６．免疫組織染色〕
ヒトパラフィン組織切片をＢｉｏｃｈａｉｎ社より購入した。免疫組織化学解析を、ＨＲＰ−ＤＡＢ法または間接蛍光抗体顕微鏡法を用いて、非特許文献１３に従って行った。１０００倍希釈または１μｇ／ｍｌの１次抗体を用いて、１次抗体反応を、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中にて室温で１時間行った。サンプルを、Ｏｌｙｍｕｐｕｓ ＢＸ６０顕微鏡またはＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ３００共焦点レーザ顕微鏡を用いて解析した。
【０２２５】
〔１−７．免疫電子顕微鏡〕
金コロイド銀増感電子顕微鏡法を、非特許文献１３に従って行った。エーテルにて麻酔したマウスを、心臓から生理食塩水を灌流し、次いで、４％パラホルムアルデヒドを溶解した０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を還流した。腎臓を単離してＰＢＳで洗浄した。３０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液を浸透させた組織を切片化（６ｍｍ厚）し、シラン化したスライドグラス上に配置して、ＯＴＣ化合物（Ｓａｋｕｒａ ＦｉｎｅＴｅｋ）中に包埋した。切片を、０．２５％サポニンおよび５％ ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中にて３０分間インキュベートし、次いで、０．００５％サポニン、１０％ ＢＳＡ、１０％ヤギ血清、および０．１％ ｃｏｌｄ ｗａｔｅｒ ｆｉｓｈ ｇｅｌａｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を含むブロッキング溶液を用いてブロッキングした。次いで、切片を、ブロッキング溶液で１０００倍希釈したウサギ抗マウスＭＡＴＥ１抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。０．００５％サポニンを含む緩衝液で十分洗浄した後、切片を、ヤギ抗ウサギＩｇＧ金コロイド（金粒子の直径は１．４ｍｍ）を含むブロッキング溶液中で２時間インキュベートし、緩衝液で６回洗浄し、次いで、１％グルタルアルデヒドを用いて１０分間固定した。さらに洗浄した後、切片を、銀増感キット（ＨＱ ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）を室温で５分間処理し、次いで、０．５％ ４酸化オスミウムを用いて９０分間固定した。超薄切片を、酢酸ウランおよびクエン酸鉛にて２重染色し、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ−７１００電子顕微鏡にて解析した。
【０２２６】
〔１−８．輸送活性の測定〕
ＨＥＫ２９３細胞を、非特許文献１４に従って、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地中、５％ ＣＯ２にて、３７℃で培養した。ヒトＭＡＴＥ１またはマウスＭＡＴＥ１をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングして得たｐｃＤＮＡ３．１／ｈＭＡＴＥ１プラスミドを、ＴｒａｎｓＩＴ試薬（Ｍｉｒｕｓ）を用いて、培養２４時間後のＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした（細胞数：１．５×１０６細胞／１０ｃｍ ｄｉｓｈ）。２日間培養した細胞を回収し、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、４．８ｍＭ塩化カリウム、５．６ｍＭ Ｄ−グルコース、１．２ｍＭ塩化カルシウム、１．２ｍＭリン酸二水素カリウム、１．２ｍＭ硫酸マグネシウムおよび２５ｍＭトリシンからなる活性測定用緩衝液（ｐＨ８．０）中に懸濁した。細胞を３７℃で５分間インキュベートし、５０μＭのＲＩ標識化ＴＥＡ（５ｋＢｑ／アッセイ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）を添加して、輸送活性の測定を開始した。所定の時点で活性測定反応液を２００μｌずつ回収し、０．４５μｍのＨＡメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過し、フィルター上に残存する放射活性を測定した。
【０２２７】
〔１−９．ニコチン輸送活性の測定〕
ｐＨ８．０における活性測定には、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、４．８ｍＭ塩化カリウム、５．６ｍＭ Ｄ−グルコース、１．２ｍＭ塩化カルシウム、１．２ｍＭリン酸二水素カリウム、１．２ｍＭ硫酸マグネシウムおよび２５ｍＭトリシンからなる緩衝液を用いた。また、ｐＨ７．０における活性測定には、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、４．８ｍＭ塩化カリウム、５．６ｍＭ Ｄ−グルコース、１．２ｍＭ塩化カルシウム、１．２ｍＭリン酸二水素カリウム、１．２ｍＭ硫酸マグネシウムおよび２５ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨからなる緩衝液を用いた。
【０２２８】
上記８で作製したヒトＭＡＴＥ１発現ＨＥＫ２９３細胞（８×１０５個）を懸濁した上記活性測定用緩衝液中に、放射性ニコチン（１００ｎＣｉ、２μＭ）を添加して最終容量を２００μｌとした。細胞を３７℃で５分間インキュベートした後、懸濁液を５，０００ｒｐｍにて３７℃で遠心分離した。細胞と上清とを分画し、それぞれに含まれる放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定することにより、細胞中へのニコチンの取り込みを測定した。
【０２２９】
〔１−１０．プロトンポンプタンパク質の精製〕
Ｍｏｒｉｙａｍａ Ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２２１４１−２２１４６（１９９１）に記載の手順に従って、プロトンポンプであるＦ０Ｆ１タンパク質を調製した。
【０２３０】
Ｆ０Ｆ１の大量発現プラスミドｐＢＷＵ１３を含有している大腸菌ＤＫ８を、０．５％グリセロールを含むＴａｎａｋａ培地（３４ｍＭ一カリウムリン酸、６４ｍＭ二カリウムリン酸、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．３ｍＭ塩化マグネシウム、１μＭ硫酸鉄、１μＭ塩化カルシウム、１μＭ塩化亜鉛、１００μｇ／ｍｌイソロイシン、１００μｇ／ｍｌバリン、２μｇ／ｍｌチアミン）で培養した後、菌体を回収した。以降の調製を全て４℃で行った。
【０２３１】
菌体（ＤＫ８／ｐＢＷＵ１３）約１０ｇを、４０ｍｌの膜調製緩衝液（４℃の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ塩化マグネシウム、０，５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁し、フレンチプレス（１，５００ｋｇ／ｃｍ２）で細胞を破砕した。破砕液を１７，０００×ｇにて１０分間遠心分離し、得られた上清をさらに２１０，０００×ｇで１時間２０分間遠心分離した。得られた膜小胞の沈澱を、Ｆ０Ｆ１調製用緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ硫酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．８％オクチルグルコシド）中に懸濁し、再度遠心分離した。沈澱物として調製した膜小胞６０ｍｇを、２％のオクチルグルコシドを含む３ｍｌのＦ０Ｆ１調製用緩衝液中に懸濁し、Ｆ０Ｆ１を可溶化した。可溶化溶液を、２６０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清画分からＦ０Ｆ１を回収した。回収したＦ０Ｆ１を、１０％（ｗ／ｖ）〜３０％（ｗ／ｖ）のグリセロール密度勾配遠心分離（３３０，０００×ｇで５時間）によって精製した。グリセロール密度勾配を、１％オクチルグルコシドを含むＦ０Ｆ１調製用緩衝液で作製した。密度勾配遠心後、遠心管の底から１０分画に分けて分離し、最初の４画分をＦ０Ｆ１として回収し、−８０℃で保存した。
【０２３２】
〔２：結果〕
〔２−１．遺伝子構造およびヒトＭＡＴＥ１の発現〕
バクテリアにおける多剤排泄輸送体であるＭＡＴＥファミリーの哺乳動物における類似体をデータベース上で検索した結果、ＭＡＴＥファミリー類似体をコードする遺伝子がヒト第１７染色体上に３つ並んで存在することを見出し、これらをｈＭＡＴＥ１（アクセッション番号ＮＰ−０６０７１２）、ｈＭＡＴＥ２（アクセッション番号ＮＰ−６９０８７２）およびｈＭＡＴＥ３と命名した（図１）。なお、ＭＡＴＥ３遺伝子は新規遺伝子であった。
【０２３３】
上記遺伝子の推定のアミノ酸配列は、ＭＡＴＥファミリーのプロトタイプである、ビブリオ菌のＮａ＋依存性多剤排泄輸送体ＮｏｒＭ（非特許文献１５を参照のこと）に対してそれぞれ１９．８％および１８．６％の相同性を示した（図２）。図２中、同一のアミノ酸にアスタリスクを付し、推定の膜貫通領域を四角で囲んだ。Ｅ２７３は、輸送活性に重要なアミノ酸であるグルタミン酸である。ヒトＭＡＴＥ１は、その疎水性プロットに基づくと、１２箇所の膜貫通領域を有するタンパク質である（図３）。
【０２３４】
ヒト組織に対するノーザンブロット解析の結果、ヒトＭＡＴＥ１遺伝子は、主に腎臓、肝臓および骨格筋において４．１ｋｂの転写物として発現されていることがわかった。また、ヒトＭＡＴＥ２遺伝子は、腎臓において３．２ｋｂの転写物として発現されているが、その他の組織においては発現されていなかった（図４（ａ））。
【０２３５】
〔２−２．腎臓および肝臓におけるヒトＭＡＴＥ１の局在〕
本発明者らは、ヒトＭＡＴＥ１がタンパク質レベルでのＨ＋依存性ＯＣ輸送体であると考え、その発現および局在を調べた。ヒトＭＡＴＥ１のＣ末端ペプチドに対する特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果、ヒト腎臓膜画分において、推定の分子量サイズに等しい６２ｋＤａのバンドを検出した（図４（ｂ））。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ＤＡＢ染色による免疫組織化学の結果、ヒトＭＡＴＥ１タンパク質は、腎臓の近位尿細管および遠位尿細管の表皮細胞部位に発現されており（図４（ｃ））、特に、肝細胞の胆管部位に発現されていることがわかった（図４（ｄ））。
【０２３６】
〔２−３．マウスＭＡＴＥ１の発現および局在〕
マウスにおけるＭＡＴＥファミリー類似体を取得して、哺乳動物におけるＭＡＴＥファミリーの解析をさらに行った。マウスＭＡＴＥファミリー類似体をコードする遺伝子は、マウス第１１染色体上に２つ並んで存在することを見出し、これらをｍＭＡＴＥ１（アクセッション番号ＡＡＨ３１４３６）およびｍＭＡＴＥ２（アクセッション番号ＸＰ＿３５４６１１）と命名した（図５）。これらの推定のアミノ酸配列はヒトＭＡＴＥ１に対してそれぞれ７８．１％および３８．１％の相同性を有した（図６）。
【０２３７】
マウス組織に対するノーザンブロット解析の結果、マウスＭＡＴＥ１遺伝子は、主に腎臓、肝臓および心臓において３．８ｋｂの転写物として発現されていることがわかった。また、マウスＭＡＴＥ２遺伝子は、特に精巣において３．３ｋｂの転写物として発現されていることがわかった（図７（ａ））。
【０２３８】
マウスＭＡＴＥ１に対する特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果、マウスの腎臓および肝臓において、推定の分子量サイズに等しい５３ｋＤａのバンドを検出した（図７（ｂ））。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ＤＡＢ染色による免疫組織化学の結果、マウスＭＡＴＥ１タンパク質についての反応が、腎臓の集合管および近位尿細管に強く検出され、（図７（ｃ））、特に、ヘンレループの周辺にも反応を検出した（図７（ｄ））。また、弱いレベルではあるが遠位尿細管および糸球体においてもマウスＭＡＴＥ１タンパク質についての反応が明確に検出された（図７（ｃ））。
【０２３９】
免疫電子顕微鏡解析の結果、近位尿細管の刷子縁膜にマウスＭＡＴＥ１の局在を確認した（図８（ａ））。肝臓では、マウスＭＡＴＥ１は毛細胆管に存在し、胆管の表面に分布していた（図８（ｂ））。
【０２４０】
これらの結果より、哺乳動物のＭＡＴＥ１は、主に腎臓（特に近位尿細管の刷子縁膜）および肝臓（毛細胆管）に発現されていることがわかった。このことは、これまでに知られていたＨ＋／ＯＣの交換輸送活性と一致している（非特許文献５〜７を参照のこと）。
【０２４１】
〔２−４．ＭＡＴＥ１はプロトン依存性電位差を生じさせることなくＯＣ交換輸送を担う〕
ＭＡＴＥ１がプロトン共役のＯＣ交換輸送活性を有するか否かを明らかにするために、ヒトＭＡＴＥ１を発現させたＨＥＫ２９３細胞において生体膜を介するＯＣのｐＨ依存的な輸送を解析した。本方法に従えば、管腔におけるＯＣ輸送を古典的な細胞取り込み活性として解析し得る（非特許文献１４を参照のこと）。ヒトＭＡＴＥ１を発現した細胞は、プロトン共役性のＯＣ輸送体に典型的な基質であるＴＥＡに対して、時間依存的な輸送活性を示した（図９（ａ）、および（ｂ））。野生型ＭＡＴＥ１を発現する細胞において、輸送活性は飽和し、ＴＥＡに対するＫｍ値は２２０μＭであった（図９（ｃ））。また、野生型ＭＡＴＥ１を発現する細胞において、輸送活性はｐＨ依存性を示し、ｐＨ６．０では活性が低く、ｐＨが高くなるにつれて活性が増加し、ｐＨ８．０〜８．５において活性は最大であった（図９（ｄ））。しかし、図９（ｅ）に示すように、この輸送活性にはナトリウムイオンは必要ではなかった。すなわち、６５ｍＭの塩化カリウム存在下で５μＭのバリノマイシンを添加することにより膜の脱分極を引き起こしても、ＴＥＡ取り込み活性に影響はなかった。また、塩化アンモニウムによってＴＥＡ取り込み活性は６０％阻害された。さらに、プロトンコンダクターであるＳＦ６８４７（１０μＭ）、または塩化カリウム存在下でのナイジェリシン（５μＭ）によりｐＨ勾配を消滅させると、ＴＥＡ取り込み活性は大きく減少した（図９（ｅ））。
【０２４２】
これらの結果より、ヒトＭＡＴＥ１は、電位差を生じさせることなくＨ＋／ＴＥＡ交換輸送を行うことがわかった。
【０２４３】
〔２−５．種々の化合物による輸送活性阻害〕
ｈＭＡＴＥ１またはｍＭＡＴＥ１を発現させたＨＥＫ２９３細胞を用いて、表中の化合物を示した濃度で存在させた場合と存在させなかった場合において、５０μＭのＲＩ標識化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）の取り込みをｐＨ８．０にて解析した（表１）。
【０２４４】
【表１】
【０２４５】
表中の値は、何も添加していない最大のＴＥＡの取り込み活性値を１００％とした場合の割合で示した。ＮＭＮ：Ｎ−メチルニコチンアミド。データを、３〜９回の実験の平均値±標準偏差にて示した。＊＜０．０５、＊＊＜０．００１。
【０２４６】
記載した化合物の存在下での放射性ＴＥＡの細胞への取り込みを測定することにより、当該化合物が輸送基質となるか否かを検討することができる。表１に示すように、ＴＥＡの取り込み活性は、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチンで阻害されている。すなわち、これらの化合物が、ＭＡＴＥ１によって輸送されることがわかった。特に、ＴＥＡの取り込み活性は、シメチジン、キニジンまたはベラパミルによって強く阻害され、ニコチンまたはコリンによって軽度に阻害された。しかし、有機アニオンであるパラアミノ酪酸または尿酸では全く阻害されなかった。プロトン共役性のＯＣ輸送体の基質としてよく知られているＭＰＰを用いると、ＴＥＡを用いた場合と同様のｐＨ依存性が観察され、そのＫｍ値およびＶｍａｘはそれぞれ１６μＭおよび１７０ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。このように、ＭＡＴＥ１の特性は、これまでに予想されていた腎臓におけるプロトン共役性ＯＣ輸送活性と全く一致した。
【０２４７】
ニコチンについての輸送体はこれまでまったく知られていなかったが、放射性ニコチンを用いた実験により、ＭＡＴＥ１タンパク質がニコチン輸送体として機能していることを見出した（図１０）。図中、データを、３回の実験の平均値±標準偏差にて示した。
【０２４８】
このように、ＴＥＡ輸送における競合阻害実験によってＭＡＴＥ１の基質特異性が明らかになった。また、ＴＥＡ輸送の競合阻害実験の結果は、腎臓におけるプロトン共役性ＯＣ輸送活性と同様の結果を示した。
【０２４９】
〔３：リポソーム組成物を用いた測定系の構築〕
〔３−１．ｈＭＡＴＥ１発現用バキュロウイルスの作製〕
５’末端にＣＡＣＣの４塩基対を付加したｈＭＡＴＥ１ ｃＤＮＡをＴＯＰＯベクターと混合し、これらをヒートショック法にてコンピテントセル（ＤＨ５α）に導入した。ｈＭＡＴＥ１を組み込んだプラスミドｐＥＮＴＥＲ−ｈＭＡＴＥ１をカナマイシンにより選択し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて回収した。このプラスミド中のｈＭＡＴＥ１ ｃＤＮＡを、ＬＲリコンビナーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて、発現ベクターｐＤＥＳＴ１０（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に組み換えた。得られたプラスミドを、アンピシリン培地上で選択し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて回収した。このプラスミドを用いて形質転換したＤＨ１０Ｂａｃ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）培地上で選択した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞はバキュロウイルスのゲノムＤＮＡを有しており、ｐＤＥＳＴ１０上に導入されたｃＤＮＡはトランスポゾンによって自動的にウイルスゲノム上に組み換えられる。その結果、ウイルスゲノム上のガラクトシダーゼ遺伝子が破壊され、精製されるコロニーは白くなる。この培地上の白いコロニーからバックミド（組換えウイルスゲノムＤＮＡ）を、以下の手順に従うミニプレップ法によって回収した。
【０２５０】
形質転換したＤＨ１０Ｂａｃを、０．３ｍｌの溶液Ｉ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭグルコース、１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸）に懸濁し、この懸濁液に、同量の溶液ＩＩ（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％ドデシル硫酸ナトリウム）を添加した。５分間静置した後、この懸濁液に、０．３ｍｌの溶液ＩＩＩ（３Ｍカリウム酢酸（ｐＨ５．２））を添加した。この懸濁液を１８，０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上清に０．８ｍｌのイソプロピルを添加した。この溶液を氷上で５分間静置した後、さらに１５分間遠心分離した。得られた沈澱物を、７０％の氷冷エタノールで２回洗浄後、乾燥させた。乾燥した沈殿物を４０μｌのＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸）に懸濁し、組換えバックミド溶液を得た。
【０２５１】
組換えバキュロウイルスの作製を下記の手順に従って行った。調製したバックミド約３μｌを、セルフェクチン試薬（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いてｓｆ９昆虫細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に導入した。バックミドを導入したｓｆ９を、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌファンギゾンを含むＴＮＭ−ＦＨ培地（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。これらの細胞を２７℃で４〜７日間培養した後に培養上清を回収し、培養上清から組換えバキュロウイルスを得た。得られた組換えバキュロウイルスを、再度ｓｆ９細胞に感染させ、この感染細胞を７０〜７５ｃｍ２フラスコ中で４〜７日間培養した後に培養上清を回収し、培養上清から高濃度ウイルスを得た。
【０２５２】
〔３−２．ｈＭＡＴＥ１ポリペプチドの精製〕
２１枚の１×１０７細胞／ｄｉｓｈで培養したＨｉ−Ｆｉｖｅ ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ｈＭＡＴＥ１発現用ウイルスをＭＯＩ＝１にて感染させた。感染細胞を、２７℃で４８時間インキュベートした後に回収した。回収した細胞を、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０％グリセロール、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）１０ｍｌに懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、同一の緩衝液１０ｍｌに再度懸濁した。同じ操作を繰り返した（２回洗浄）。その後、同じ緩衝液１０ｍｌに懸濁した細胞を、超音波発生装置（ＴＯＭＹ ＵＤ２００）により破砕した。未破砕細胞を２０００ｒｐｍで８分間の遠心分離により除去し、得られた後の上清を、さらに４０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ−６０、６０Ｔ１ローター））した。得られた沈殿を、２％オクチルグリコシド、１０％グリセロール，１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含有する２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）３ｍｌに懸濁し、この懸濁液を氷上で３０分間放置した。続いて、ＴＬ−１００ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを用いて７００００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、可溶化されたＭＡＴＥ１粗標品を上清として得た。この粗標品にＮｉ−ＮＴＡ ｒｅｓｉｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を加えて４℃で４時間インキュベートした。樹脂を、１％オクチルグリコシド、１０％グリセロール，１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含有する２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）２０ｍｌで洗浄し、続いて、１％オクチルグリコシド、１０％グリセロール，１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含有する２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）３ｍｌ中でインキュベートし、１．３ｍｇの精製ｈＭＡＴＥ１ポリペプチドを得た（図１１）。
【０２５３】
図１１には、ｈＭＡＴＥ１の精製段階の各工程（Ｓは可溶化した昆虫細胞膜画分１００μｇ；Ｗ１、Ｗ２はそれぞれ洗浄した際の上清８０μｌ；Ｅは精製ｈＭＡＴＥ ２０μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｌはリポソームに再構成されたｈＭＡＴＥ ２０μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の一部をＳＤＳゲル電気泳動し、このゲルをＣＢＢ染色した結果を示す。図１１より、目的のｈＭＡＴＥポリペプチドをほぼ単一のタンパク質バンドとして精製したことがわかる。
【０２５４】
〔３−３．リポソーム組成物の生成〕
大豆リン脂質（Ｓｉｇｍａ ｔｙｐｅ ＩＩＳ）を、１０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ ＤＴＴ中に懸濁した（１０ｍｇ／ｍｌ）。この懸濁液をｂａｔｈ−ｔｙｐｅ ｓｏｎｉｃａｔｏｒで超音波処理し、均質な溶液を分注して−８０℃で保存した。
【０２５５】
保存した溶液の一部を溶解し、この溶液１５０μｌに対して１ｍｇの精製ｈＭＡＴＥ１（８００μｌ）を添加して激しく混和した。これらの混合液を−８０℃にて迅速に凍結し、１０分間保持した後に手中で溶解し、次いで、０．１Ｍ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴを含有する、氷冷した２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）２０ｍｌと迅速に混合した。この混合液を、４５０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、再構成リポソームを沈殿として得た。この再構成リポソームを、０．１Ｍ 酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴを含有する、氷冷した２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）５００μｌに懸濁して、輸送実験に供した。
【０２５６】
〔３−４．ＭＡＴＥポリペプチドの輸送活性の測定〕
上述した再構成リポソーム（ＭＡＴＥポリペプチドを含有するリポソーム）４０μｌ（約１２μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ相当）を分取し、さらに、１ｍＭの１４Ｃ−ＴＥＡ（０．５μＣｉ）を含む緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０），０．１Ｍ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム）５４０μｌを添加することにより、測定を開始した。
【０２５７】
一定時間経過した後に反応液１５０μｌを採取し、セファデックスＧ５０を充填した１ｍｌのテルモシリンジにアプライし、速やかに２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。シリンジより溶出した液（リポソームを含有する。）を一定量採取し液体シンチレーションカウンターにて放射能量を測定した（図１２）。なお、外液はシリンジ内にトラップされている。
【０２５８】
図１２に、輸送の経時変化を示した。外液のｐＨを変更することにより、リポソーム膜内外に形成されるｐＨ勾配の大きさを変化させることができる。図１２に示すように、ｐＨに依存したＴＥＡの取り込みが観察された。トランスポーターであるＭＡＴＥポリペプチドが存在しない場合は、放射活性はほとんど検出されない(バックグラウンドレベル)。
【０２５９】
〔４：排泄の最終段階のＯＣ輸送体として機能するＭＡＴＥ１〕
以上の結果に基づけば、ＭＡＴＥ１は、これまで長い間にわたって探索されてきた、腎臓および／または肝臓にてＯＣの排泄の最終段階を担うプロトン共役性ＯＣ輸送体であるといえる（図１３）。上記結果に基づけば、毒性を有するＯＣを生体内から排泄する機構に関与する輸送体の全貌を明らかにし得る。
【０２６０】
ＯＣは，肝臓の有機カチオン輸送体（ＯＣＴ１）または腎臓の尿細管でのＯＣＴ２によって取り込まれるが、取り込まれたＯＣが、ＭＡＴＥ１とＰ糖タンパク質との協奏反応によって細胞から排泄されることがわかった。競合阻害実験から、ＭＡＴＥ１は種々の代謝物を基質とし得ることもわかった。
【０２６１】
また、動植物〜細菌にわたって、ニコチンの輸送体についてはこれまで全く知られていなかったが、本発明によりＭＡＴＥ１がその機能を担うことが始めて明かされた。また、メラトニンやホルモンの輸送体についてもこれまで知られていないことから、ＭＡＴＥ１は臨床的にも非常に重要なタンパク質であるといえる。実際に、マウス肺胞上皮細胞の原形質膜（アピカル側）や脳血管にてＭＡＴＥポリペプチドが発現している（図１４および１５）。また、ヒト肺胞上皮細胞においてもｈＭＡＴＥ１の発現を確認している（図１６）。
【０２６２】
ＭＡＴＥポリペプチドは、皮膚、松果体等の様々な組織において老廃物の排泄以外の機能を有していることが分かった。皮膚においては、汗腺、皮脂腺等にＭＡＴＥ１が発現しており、薬物の経皮吸収、体臭に関わる物質の排泄等に関わっていることを示している（図１７）。メラトニンの分泌を通して概日リズムをコントロールしている松果体においても、ＭＡＴＥ１が発現していることが分かった（図１８）。このことは、ＭＡＴＥ１がメラトニンを輸送基質とすることを間接的に示しており、表１に示した結果を支持する。したがって、ＭＡＴＥ１は、松果体細胞でのメラトニントランスポーターであると考えられる。また、ヒトＭＡＴＥ１とマウスＭＡＴＥ１との相同性は非常に高いので、ヒトにおいても同様な役割を担っているものと推定される。
【０２６３】
さらに、マウスＭＡＴＥ２は、精巣においてテストステロン等のステロイドホルモンを分泌している精巣ライディッヒ細胞に特異的に発現していることが分かった（図１９）。このことは、ＭＡＴＥ２がステロイドホルモンを輸送することを間接的に示しており、表１に示した結果を支持する。したがって、ＭＡＴＥ２はステロイドホルモントランスポーターであると考えられる。ヒトＭＡＴＥ３とマウスＭＡＴＥ２との相同性も非常に高く、発現部位も類似しているので（図２０）、ヒトにおいても同様な役割を担っているものと推定される。
【０２６４】
さらに、植物フラボノイドであるケルセチンは、植物の液胞に蓄積されることが知られているが、その機能は不明である。本発明に従えば、植物において、ＭＡＴＥ１様輸送体が植物フラボノイドの輸送体として機能することが示唆される。
【０２６５】
ＭＡＴＥ１およびＭＡＴＥ２が腎臓、肝臓以外にも発現されていることから、ＭＡＴＥタイプの輸送体はＯＣ輸送体以外の機能を有することが示唆される。すなわち、ＭＡＴＥタイプの輸送体は、種々の大きさ、構造、疎水性を有する生理的代謝物の輸送を機能的に制御し、かつ生体内電解質の恒常性を維持する分子機構を担うと考えられる。
【０２６６】
１７ｑ１１．２染色体の異常によって生じる、多様性のある先天的な奇形および軽度の精神的発育遅延を呈するスミスマジェニス症候群において、欠損している約８０個の遺伝子の中にＭＡＴＥ遺伝子が含まれていることが知られている（例えば、非特許文献１６、１７を参照のこと）。スミスマジェニス症候群の患者はＨ＋／ＯＣ輸送体を欠いていると考えられるが、本発明に基づくさらなる研究によって本症候群における症状とＭＡＴＥファミリーとの関係を明らかにし得る。また、本発明に係る哺乳動物ＭＡＴＥ分子によって、生体内毒素、薬物および生体内代謝物の相互作用、遺伝子多型、ならびに遺伝子変異に関する研究が飛躍的に進歩し得る。またさらに、植物における、薬剤に対する耐性または内在性の毒性代謝物に対する耐性は、その植物におけるＭＡＴＥが関与していると考えられる。このように、ＭＡＴＥファミリーは、自然界における基本的なＯＣ輸送体であり、ＯＣおよびその関連化合物の排泄に広範な役割を担う。
【０２６７】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２６８】
本発明を用いれば、これまで見出すことができなかった薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤（例えば、医薬品、農薬など）をスクリーニングすることができるので、新たな医薬分野の発展に貢献し得る。また、本発明を用いれば、任意の薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験し得るので、医学／薬学における研究を推進し得るとともに研究ツールの開発に寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】図１は、ｈＭＡＴＥ１遺伝子、ｈＭＡＴＥ２遺伝子およびｈＭＡＴＥ３遺伝子の染色体上における位置および構成を示す図である。
【図２】図２は、ｈＭＡＴＥ１、ｈＭＡＴＥ２およびｈＭＡＴＥ３のアミノ酸配列とバクテリア由来のＮｏｒＭのアミノ酸配列とのアラインメントを示す図である。輸送活性に重要なＥ２７３は全てに保存されていることがわかる。
【図３】図３は、ｈＭＡＴＥ１の推定の２次構造を示すスキームである。図中、輸送活性に重要なグルタミン酸残基（Ｅ２７３）を丸で囲んだ。
【図４】図４（ａ）は、ｈＭＡＴＥ１遺伝子およびｈＭＡＴＥ２遺伝子のヒトにおける発現を調べたノーザンブロット解析の結果を示す図である。ｈＭＡＴＥ１遺伝子は、主に、腎臓、肝臓および骨格筋において発現されており、ｈＭＡＴＥ２遺伝子は、腎臓において発現されていることがわかる。図４（ｂ）は、抗ｈＭＡＴＥ１抗体を用いてｈＭＡＴＥ１の発現を確認したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。抗ｈＭＡＴＥ１抗体は、ＨＥＫ２９３細胞に発現させたｈＭＡＴＥ１を特異的に認識する。また、同一サイズのタンパク質が腎臓に存在し、抗ｈＭＡＴＥ１抗体によるこのタンパク質の検出が、抗原ペプチド（ｈＭＡＴＥ１のＮ４６１〜Ｒ５４６）によって吸収される。図４（ｃ）は、腎臓におけるｈＭＡＴＥ１の免疫組織化学の結果を示す図である。ヒト標本切片を、ＨＲＰ−ＤＡＢ法により染色した。図中、ＰＣＴは、近位尿細管、ＤＣＴは、遠位尿細管を示す。バーは１００μｍである。図４（ｄ）は、肝臓におけるｈＭＡＴＥ１の免疫組織化学の結果を示す図である。ヒト標本切片を、ＨＲＰ法により染色した。バーは１００μｍである。
【図５】図５は、ｍＭＡＴＥ１遺伝子およびｍＭＡＴＥ２遺伝子の染色体上における位置および構成を示す図である。
【図６】図６は、ｍＭＡＴＥ１およびｍＭＡＴＥ２のアミノ酸配列とｈＭＡＴＥ１のアミノ酸配列とのアラインメントを示す図である。図中、同一のアミノ酸にアスタリスクを付した。Ｅ２７３は、輸送活性に重要なアミノ酸であるグルタミン酸である。
【図７】図７（ａ）は、種々の臓器におけるｍＭＡＴＥ１遺伝子およびｍＭＡＴＥ２遺伝子の発現を調べたノーザンブロット解析の結果を示す図である。ｍＭＡＴＥ１遺伝子は、主に、腎臓および肝臓において発現されており、ｍＭＡＴＥ２遺伝子は、精巣において発現されていた。図７（ｂ）は、抗ｍＭＡＴＥ１抗体を用いてｍＭＡＴＥ１の発現を確認したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。抗ｍＭＡＴＥ１抗体は、ＨＥＫ２９３細胞に発現させたｍＭＡＴＥ１を特異的に認識する。また、同一サイズのタンパク質が腎臓および肝臓に存在する。図７（ｃ）は、腎臓におけるｍＭＡＴＥ１の免疫組織化学の結果を示す図である。マウス標本切片を、ＨＲＰ−ＤＡＢ法により染色した。ｍＭＡＴＥ１は腎皮質に発現されている。図中、ＧＬは糸球体を、ＰＣＴは近位尿細管を、ＤＣＴは遠位尿細管を、ＣＣＤは集合管を示す。バーは１００μｍである。図７（ｄ）は、腎臓におけるｍＭＡＴＥ１の免疫組織化学の結果を示す図である。マウス標本切片を、ＨＲＰ−ＤＡＢ法により染色した。ｍＭＡＴＥ１は腎髄質に発現されている。
【図８】図８（ａ）は、腎臓におけるｍＭＡＴＥ１の免疫電子顕微鏡像を示す図である。ｍＭＡＴＥ１は尿細管の表皮（膜部分）に存在している。図中、ＢＢＭは刷子縁膜を、ＢＭは基底膜を、Ｍはミトコンドリアを、Ｌは管腔を示す。バーは１μｍである。図８（ｂ）は、肝臓（毛細胆管膜）におけるｍＭＡＴＥ１の間接免疫蛍光顕微鏡像を示す図である。図８（ｃ）は、肝臓（胆管膜の表皮側）におけるｍＭＡＴＥ１の間接免疫蛍光顕微鏡像を示す図である。図中、ＢＤは小葉間胆管を、ＨＰＶは門脈を示す。バーは１０μｍである。
【図９】図９（ａ）は、ＨＥＫ２９３細胞に発現させたｈＭＡＴＥ１の野生型（Ｗｉｌｄ）、変異体（Ｅ２７３Ｑ）の免疫蛍光顕微鏡像を示す図である。図９（ｂ）は、図９ａで示した細胞におけるｐＨ８．０でのＴＥＡ（５０μＭ）の取り込みを経時的に観察した結果を示すグラフである。図９（ｃ）は、種々の濃度のＴＥＡ輸送を観察した結果を示すグラフである。ｈＭＡＴＥ１の野生型を発現する細胞における値からプラスミドのみ（Ｍｏｃｋ）をトランスフェクトした細胞における値を差し引いた。図９（ｄ）は、種々のｐＨにおけるＴＥＡ輸送を観察した結果を示すグラフである。図９（ｅ）は、ＴＥＡ輸送に対するＮａ＋の影響を示すグラフである。図９（ｆ）は、ＴＥＡの排泄に対するｐＨの影響を観察した結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＭＡＴＥ１がニコチン輸送体として機能することを示すグラフである。
【図１１】図１１は、バキュロウイルスの系を用いて精製したｈＭＡＴＥ１の各精製工程のサンプルを電気泳動したゲルをＣＢＢ染色した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有するリポソームを用いて測定したＴＥＡ輸送の経時変化を示した図である。
【図１３】図１３は、ＭＡＴＥ１がＯＣ排泄の最終段階を担う多剤輸送性のＯＣ輸送体であることを示すスキームである。肝臓において、肝細胞はｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅにて有機カチオン輸送体であるＯＣＴ１およびＯＣＴ２を介してＯＣを取り込み、ＭＡＴＥ１およびＭＤＲ１を介して胆汁中に排泄している。腎臓において、尿細管細胞にて主にＯＣＴ２によりＯＣは取り込まれており、ＭＡＴＥ１、ＭＤＲ１およびＯＣＴＮ２を介して排泄されている。
【図１４】図１４は、マウス肺胞上皮細胞におけるｍＭＡＴＥ１を蛍光染色した結果を示す図である。
【図１５】図１５は、脳毛細血管におけるｍＭＡＴＥ１を蛍光染色した結果を示す図である。図中、バーは１０μｍである。
【図１６】図１６は、ヒト肺胞上皮細胞におけるｈＭＡＴＥ１をＨＲＰ法で染色した結果を示す図である。図中、バーは１０μｍである。
【図１７】図１７は、皮膚におけるｍＭＡＴＥ１の局在を示す図である。皮脂腺にｍＭＡＴＥ１が存在していることがわかる。図中、バーは１０μｍである。
【図１８】図１８は、松果体におけるｍＭＡＴＥ１の局在を示す図である。松果体細胞にｍＭＡＴＥ１が存在していることがわかる。図中、バーは１０μｍである。
【図１９】図１９は、精巣ライディッヒ細胞の原形質膜におけるｍＭＡＴＥ２の局在を示す図である。図中、バーは１０μｍである。
【図２０】図２０は、精巣、骨格筋、腎臓および肝臓でのｈＭＡＴＥ３遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲ法で調べたものである。ｈＭＡＴＥ３遺伝子はｍＭＡＴＥ２と同様に精巣にのみ発現していることがわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物における新規トランスポータータンパク質およびその利用に関するものであり、より詳細には、薬物および／または老廃物の排出最終段階を司る新規有機カチオントランスポータータンパク質ならびにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物は、環境中の毒物および／または代謝排泄物を処理しなければならず、ヒトでは特に、非常に多岐にわたる構造の薬物などを処理しなければならない。哺乳動物において、これらの毒性を有する有機化合物は、主に腎臓および／または肝臓を介して排泄されている。腎臓での排泄は糸球体での濾過および尿細管での分泌によって行われている。毒性を有する有機化合物は、尿細管細胞の血管側膜にて取り込まれ、尿細管細胞の刷子縁膜側にて排泄されている（非特許文献１〜７を参照のこと）。肝細胞もまた、毒性を有する有機化合物を類洞にて吸収して、これらを毛細胆管に排泄している（非特許文献１〜７を参照のこと）。
【０００３】
これまで非常に多くの生化学的研究または生物学的研究によって、特定の輸送体が有機カチオン（ＯＣ）の排泄の最終段階を担っているであろうということが明らかになっており、ｅｌｅｃｔｒｏｎｅｕｔｒａｌなプロトンとＯＣとの交換輸送を仲介するＯＣ輸送体の存在が示唆されている（非特許文献５〜７を参照のこと）。この推定の輸送体は、カチオン性薬物を含む広範な種々のＯＣ、数種のビタミン、または生体内在性化合物（例えば、コリンまたはドーパミンなど）を認識するので、多剤認識性の排泄輸送体であると考えられている。
【０００４】
これまでトランスポーターの実体は知られておらず、その分子実体を同定するために既知の腎臓トランスポーターのホモログが探索されていた。しかし、目的の機能を発揮する分子（タンパク質）が同定されるには至っていない。すなわち、具体的にどのような分子が有機カチオン（ＯＣ）の排泄の最終段階を担う輸送体タンパク質として存在するのかは全く不明であり、具体的な分子の同定が望まれていた。
【０００５】
本発明者らは、目的の機能を有するタンパク質のファミリーが細菌（バクテリア）から哺乳動物まで保存されているのではないかと考え、バクテリアにおいて多剤排泄ポンプとして機能するタンパク質のオルソログが哺乳動物に存在し、このオルソログが哺乳動物でのＯＣの排泄を担っていると想定した。
【０００６】
バクテリアの多剤排泄ポンプは、いくつかのグループ（例えば、ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＭＳＦ）、ｓｍａｌｌ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＳＭＲ）ファミリー、ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ（ＲＮＤ）ファミリー、ＡＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢＣ）ファミリー、およびｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ａｎｄ ｔｏｘｉｎ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ（ＭＡＴＥ）ファミリー）に分類されている（非特許文献８〜１０を参照のこと）。
【０００７】
本発明者らは、独自の観点からデータベース上で検索した結果、ＭＡＴＥファミリータンパク質に分類されそうなタンパク質をコードする遺伝子が哺乳動物に存在することを見出した（非特許文献１１を参照のこと）。
【非特許文献１】Pritchard, J. B. and Miller, D. S. (1993) Physiol. Rev.: 73, 765-96
【非特許文献２】Ullrich, K. J. (1994) Biochim. Biophys. Acta: 1197, 45-62
【非特許文献３】Oude Elferink, R. P., et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta: 1241, 215-68
【非特許文献４】Koepsell, H. (1998) Annu. Rev. Physiol.: 60, 243-66
【非特許文献５】Inui, K. I. Et al., (2000) Kidney Int.: 58, 944-58
【非特許文献６】Wright, S. H. and Dantzler, W. H. (2004) Physiol. Rev.: 84, 987-1049
【非特許文献７】Koepsell, H. (2004) Trends Pharmacol. Sci.: 25, 375-81
【非特許文献８】Brown, M. H. et al. (1999) Mol. Microbiol.: 31, 394-5
【非特許文献９】Putman, M. et al. (2000) Microbiol. Mol. Biol. Rev.: 64, 672-93
【非特許文献１０】Hvorup, R. N. et al. (2003) Eur. J. Biochem.: 270, 799-813
【非特許文献１１】Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＫ００１７０９
【非特許文献１２】Ito, W. et al. (1991) Gene: 1002, 67-70
【非特許文献１３】Morimoto, R. et al. (2003) J. Neurochem.84: 382-91
【非特許文献１４】Tamai, I. Et al. (1997) FEBS Lett.: 419, 107-11
【非特許文献１５】Morita, Y. et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother.: 42, 1778-82
【非特許文献１６】Smith, A. C. et al. (1986) Am. J. Med. Genet.: 24, 393-414
【非特許文献１７】Bi, W. et al. (2002) Genome Res.: 12, 713-28
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１１に記載の遺伝子による推定のアミノ酸配列は、ＭＡＴＥファミリーのプロトタイプである、ビブリオ菌のＮａ＋依存性多剤排泄輸送体ＮｏｒＭとの配列相同性が非常に低く、ＭＡＴＥファミリータンパク質に分類されるとは容易に想像できない。
【０００９】
また、ＭＡＴＥファミリーは、最近分類分けされた多剤耐性獲得タンパク質の一群であり、そのいくつかが、バクテリアにおいてＨ＋またはＮａ＋依存的カチオン性薬物を排泄することが知られているのみである。すなわち、ＭＡＴＥファミリー全体の特性は依然として解明されていないばかりか、目的のタンパク質が哺乳動物でのＭＡＴＥファミリータンパク質であることを確認するためのアッセイ系もなかった。
【００１０】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＭＡＴＥファミリータンパク質であることを確認するためのアッセイ系を確立し、哺乳動物でのＭＡＴＥファミリータンパク質を見出すとともに、その機能を利用した技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係る脂質膜は、以下のポリペプチドを含有していることを特徴としている：配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【００１２】
本発明に係る脂質膜は、天然由来の脂質膜であっても人工の脂質膜であってもよく、天然由来の脂質膜である場合は、細胞膜または膜小胞であることが好ましく、人工の脂質膜である場合は、脂質平面膜またはリポソームであることが好ましい。
【００１３】
本発明に係る形質転換体は、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る形質転換体において、上記ポリペプチドは、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列の１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００１５】
本発明に係る形質転換体において、上記ポリペプチドはまた、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによってコードされかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００１６】
本発明に係る形質転換体において、上記ポリペプチドはまた、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドによってコードされかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００１７】
本発明に係るリポソーム組成物は、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド含有していることを特徴としている。
【００１８】
本発明に係るリポソーム組成物において、上記ポリペプチドは、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列の１または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００１９】
本発明に係るリポソーム組成物において、上記ポリペプチドはまた、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドによってコードされかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２０】
本発明に係るリポソーム組成物において、上記ポリペプチドはまた、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチドによってコードされかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００２１】
本発明に係るリポソーム組成物は、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅタンパク質をさらに含有していてもよい。なお、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅタンパク質は、細胞内のプロトンを細胞外へ能動的に輸送するタンパク質であって、プロトンポンプとも称される。
【００２２】
本発明に係る脂質膜作製方法は、上記脂質膜を作製するために、下記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターを用いる工程を包含することを特徴としている：配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【００２３】
本発明に係る脂質膜作製キットは、上記脂質膜を作製するために、下記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターを備えていることを特徴としている：配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【００２４】
本発明に係る試験方法は、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するために、上記の脂質膜を、評価すべき薬剤とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００２５】
本発明に係る試験方法は、上記インキュベートする工程において、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンを共存させることが好ましい。
【００２６】
本発明に係る試験方法は、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するために、上記形質転換体を細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００２７】
本発明に係る試験方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００２８】
本発明に係る試験方法は、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するために、上記リポソーム組成物を細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００２９】
本発明に係る試験方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００３０】
本発明に係る試験キットは、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するために、上記の脂質膜を備えていることを特徴としている。
【００３１】
本発明に係る試験キットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていてもよい。
【００３２】
本発明に係る試験キットは、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するために、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００３３】
本発明に係る試験キットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００３４】
本発明に係る試験キットは、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するために、上記リポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００３５】
本発明に係る試験キットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００３６】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞膜における物質輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記の脂質膜を候補因子とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００３７】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記物質輸送は、ニコチン、メラトニンまたはステロイドホルモンの輸送、あるいは薬物および／または老廃物の排泄であることが好ましい。
【００３８】
また、本発明に係るスクリーニング方法は、上記インキュベートする工程において、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンを共存させることが好ましい。
【００３９】
本発明に係るスクリーニング方法は、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記の形質転換体をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００４０】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００４１】
本発明に係るスクリーニング方法は、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記のリポソーム組成物をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００４２】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００４３】
本発明に係るスクリーニング方法は、ニコチンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記の形質転換体をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００４４】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００４５】
本発明に係るスクリーニング方法は、ニコチンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記のリポソーム組成物をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００４６】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００４７】
本発明に係るスクリーニング方法は、メラトニンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記の形質転換体をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００４８】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００４９】
本発明に係るスクリーニング方法は、メラトニンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記のリポソーム組成物をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００５０】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００５１】
本発明に係るスクリーニング方法は、ステロイドホルモンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記の形質転換体をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００５２】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００５３】
本発明に係るスクリーニング方法は、ステロイドホルモンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質とともに上記のリポソーム組成物をインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００５４】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記基質は、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンであることが好ましい。
【００５５】
本発明に係るスクリーニングキットは、細胞膜における物質輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記の脂質膜を備えていることを特徴としている。
【００５６】
本発明に係るスクリーニングキットにおいて、上記物質輸送は、ニコチン、メラトニンまたはステロイドホルモンの輸送、あるいは薬物および／または老廃物の排泄であることが好ましい。
【００５７】
また、本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンをさらに備えていてもよい。
【００５８】
本発明に係るスクリーニングキットは、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００５９】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００６０】
本発明に係るスクリーニングキットは、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記リポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００６１】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００６２】
本発明に係るスクリーニングキットは、ニコチンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００６３】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００６４】
本発明に係るスクリーニングキットは、ニコチンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記リポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００６５】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００６６】
本発明に係るスクリーニングキットは、メラトニンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記の形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００６７】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００６８】
本発明に係るスクリーニングキットは、メラトニンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記のリポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００６９】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００７０】
本発明に係るスクリーニングキットは、ステロイドホルモンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記の形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００７１】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００７２】
本発明に係るスクリーニングキットは、ステロイドホルモンの輸送を調節する薬剤をスクリーニングするために、上記のリポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００７３】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの少なくとも１つをさらに備えていることが好ましい。
【００７４】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングするために、上記の脂質膜を候補因子とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００７５】
また、本発明に係るスクリーニング方法は、上記インキュベートする工程において、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）を共存させることが好ましい。
【００７６】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングするために、上記形質転換体をテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００７７】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングするために、上記リポソーム組成物をテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００７８】
本発明に係るスクリーニングキットは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングするために、上記の脂質膜を備えていることを特徴としている。
【００７９】
また、本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）をさらに備えていてもよい。
【００８０】
本発明に係るスクリーニングキットは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングするために、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００８１】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）をさらに備えていることが好ましい。
【００８２】
本発明に係るスクリーニングキットは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングするために、上記リポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００８３】
本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）をさらに備えていることが好ましい。
【００８４】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドに対する阻害剤または活性増強剤をスクリーニングするために、上記形質転換体を候補化合物とインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００８５】
本発明に係るスクリーニングキットは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドに対する阻害剤または活性増強剤をスクリーニングするために、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。
【００８６】
本発明に係るスクリーニング方法は、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドに対する阻害剤または活性増強剤をスクリーニングするために、上記リポソーム組成物を候補化合物とインキュベートする工程を包含することを特徴としている。
【００８７】
本発明に係るスクリーニングキットは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドに対する阻害剤または活性増強剤をスクリーニングするために、上記リポソーム組成物を備えていることを特徴としている。
【００８８】
本発明に係る診断方法は、細胞膜における物質輸送異常に起因する疾患を診断するために、下記ポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列でありかつ連続する少なくとも１２塩基からなるオリゴヌクレオチドを、生物学的サンプルから調製したｍＲＮＡとハイブリダイズさせる工程を包含することを特徴としている：
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００８９】
本発明に係る診断方法は、上記オリゴヌクレオチドが配列番号１１〜１８のいずれか１つに示される塩基配列からなることが好ましい。
【００９０】
本発明に係る診断キットは、細胞膜における物質輸送異常に起因する疾患を診断するために、下記ポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列でありかつ連続する少なくとも１２塩基からなるオリゴヌクレオチドを備えていることを特徴としている：
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００９１】
本発明に係る診断キットは、上記オリゴヌクレオチドが配列番号１１〜１８のいずれか１つに示される塩基配列からなることが好ましい。
【００９２】
本発明に係る診断方法は、細胞膜における物質輸送異常に起因する疾患を診断するために、下記ポリペプチドと特異的に結合する抗体を、生物学的サンプルとインキュベートする工程を包含することを特徴としている：
・配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【００９３】
本発明に係る診断方法において、上記抗体は、配列番号１９または配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドによって惹起されることが好ましい。
【００９４】
本発明に係る診断方法は、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドが寄与する物質輸送異常に起因する疾患を診断するために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いる工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド、であることを特徴としている。
【００９５】
本発明に係る診断キットは、細胞膜における物質輸送異常に起因する疾患を診断するために、下記ポリペプチドと特異的に結合する抗体を備えていることを特徴としている：
・配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【００９６】
本発明に係る診断キットにおいて、上記抗体は、配列番号１９または配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドによって惹起されることが好ましい。
【００９７】
本発明に係る診断用キットは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドが寄与する物質輸送異常に起因する疾患を診断するために、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えており、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド、であることを特徴としている。
【００９８】
本発明に係るポリペプチドは、配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいは配列番号２２に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド、であることを特徴としている。
【００９９】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードすることを特徴としている。
【０１００】
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号２１に示される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号２１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；または、配列番号２１に示される塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、であり得る。
【０１０１】
本発明に係るベクターは、上記ポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。
【０１０２】
本発明に係る形質転換体は、上記ポリヌクレオチドを含有していることを特徴としている。
【０１０３】
本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。
【０１０４】
本発明に係るノックアウト動物は、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現が抑制されていることを特徴としており、マウスであることが好ましい。
【０１０５】
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【発明の効果】
【０１０６】
本発明を用いれば、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤（例えば、医薬品、農薬など）をスクリーニングし得る。また、本発明を用いれば、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験し得る。さらに、本発明は、モノアミン類、揮発性有機カチオン類、ニコチンの吸収または排出、メラトニン、ステロイドホルモン、性ホルモンおよびこれらの関連製剤の分泌、吸収または排出、植物アルカノイド類またはフェノール類の植物体内への濃縮など、多くの生体成分（特に、疎水度の強い生体成分）の輸送、分泌、蓄積または排出を測定するための実験系として利用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０７】
本発明者らは、非特許文献１１に記載される遺伝子によってコードされると推定されるタンパク質が実際に哺乳動物に存在するのか、そして当該タンパク質がＭＡＴＥファミリータンパク質であるのかを確認するために、哺乳動物から当該遺伝子の取得を試みるとともに、ＭＡＴＥファミリータンパク質としての機能を確認するために必要なアッセイ系を構築した。
【０１０８】
上記遺伝子の塩基配列情報に基づいて種々のプライマーを設計して哺乳動物の組織を用いたＲＴ−ＰＣＲを試みたが、ＭＡＴＥファミリー分子に関する情報があまり得られていないこと、特に、特定の機能ドメインがＭＡＴＥファミリー分子には存在しないことから、好ましいプライマーを設計するための指標が全くなかった。
【０１０９】
しかし、本発明者らは、独自の着眼点の確からしさを検証すべく試行錯誤を繰り返し、その結果、特定のプライマーを用いれば目的の遺伝子を増幅し得ることをついに見出した。
【０１１０】
このように、本発明者らの独自の着眼点および試行錯誤に基づいて取得し得た遺伝子は、ヒトおよびマウスにおいて存在しかつ当該遺伝子によってコードされるタンパク質が腎臓の尿細管および胆管の管腔側の膜に存在して、新規輸送体として機能していることを見出した。
【０１１１】
すなわち、本発明者らは、バクテリア由来ＭＡＴＥファミリーのヒトおよびマウスにおけるオルソログである哺乳動物ＭＡＴＥポリペプチドを同定し、哺乳動物ＭＡＴＥポリペプチドが腎臓および／または肝臓に発現して、プロトンとの交換輸送によって有機カチオン性化合物を排泄する最後の段階を担っていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０１１２】
〔１〕哺乳動物ＭＡＴＥポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明者らは、細菌において見出された毒物排出トランスポーターのオルソログが哺乳動物において存在することを見出し、そのｃＤＮＡを単離し、その機能を解析した。
【０１１３】
本発明は、哺乳動物ＭＡＴＥポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「ＭＡＴＥポリペプチド」は、「ＭＡＴＥタンパク質」または「ＭＡＴＥファミリータンパク質」と交換可能に使用され、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチド、すなわち、細胞膜を介して有機カチオン（ＯＣ）を輸送するトランスポーター活性（輸送活性）を有するポリペプチドが意図される。すなわち、本明細書中で使用される場合、用語「ＭＡＴＥ活性」は、細胞膜におけるトランスポーター活性（細胞膜を介して物質を輸送する活性）が意図され、より具体的には、細胞膜を介して有機カチオン（ＯＣ）を輸送するトランスポーター活性（輸送活性）が意図される。
【０１１４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、化学合成されても、天然供給源より単離されてもよい。
【０１１５】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【０１１６】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。
【０１１７】
本発明に係るポリペプチドは、後述する本発明に係るポリヌクレオチド（本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。
【０１１８】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。
【０１１９】
好ましくは、本発明に係る哺乳動物ＭＡＴＥポリペプチドは、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいはその変異体であり得る。上記哺乳動物としては、ヒトまたはマウスであることが好ましい。本明細書中においてポリペプチドまたはタンパク質に関して用いられる場合、用語「変異体」は、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドまたはタンパク質が意図される。なお、ヒトＭＡＴＥ１ポリペプチド（ｈＭＡＴＥ１）、ヒトＭＡＴＥ２ポリペプチド（ｈＭＡＴＥ２）、マウスＭＡＴＥ１ポリペプチド（ｍＭＡＴＥ１）、マウスＭＡＴＥ２ポリペプチド（ｍＭＡＴＥ２）およびヒトＭＡＴＥ３ポリペプチド（ｈＭＡＴＥ３）のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、４、６、８および２２に示される。また、ｈＭＡＴＥ３ポリペプチドは、これまでに全く知られていない新規ポリペプチドである。
【０１２０】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ＭＡＴＥポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドであって、配列番号２、４、６、８または２２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。
【０１２１】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【０１２２】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【０１２３】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望のＭＡＴＥ活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【０１２４】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチドのＭＡＴＥ活性を変化させない。
【０１２５】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１アミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【０１２６】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ＭＡＴＥポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列の１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【０１２７】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ＭＡＴＥポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【０１２８】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【０１２９】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。
【０１３０】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ＭＡＴＥポリペプチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体は、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【０１３１】
例えば、「本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得ることを除いて、参照配列に同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の５％までが、欠失され得るかまたは別の塩基で置換され得るか、あるいは参照配列における全塩基の５％までの多くの塩基が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’または３’末端位置または参照配列における塩基中で個々にかまたは参照配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。
【０１３２】
本発明はまた、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを提供する。本明細書中において使用される場合、「ＭＡＴＥポリヌクレオチド」は、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその変異体が意図される。本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。なお、ヒトＭＡＴＥ１ポリヌクレオチド、ヒトＭＡＴＥ２ポリヌクレオチド、マウスＭＡＴＥ１ポリヌクレオチド、マウスＭＡＴＥ２ポリヌクレオチドおよびヒトＭＡＴＥ３ポリヌクレオチドの塩基配列は、それぞれ配列番号１、３、５、７および２１に示される。また、ｈＭＡＴＥ３ポリヌクレオチドは、これまでに全く知られていない新規ポリヌクレオチドである。
【０１３３】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）もしくはリボヌクレオチド（Ｃ，Ａ，ＧおよびＵ）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【０１３４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【０１３６】
本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【０１３７】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、ＭＡＴＥポリヌクレオチドまたはその変異体であって、ここで当該変異体はＭＡＴＥポリペプチドをコードし、かつ以下のポリヌクレオチドのいずれであることが好ましい：
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列の１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
・配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【０１３８】
他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーとのプライマー対、または配列番号１３に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１４に示される塩基配列からなるプライマーとのプライマー対を用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーから増幅されるポリヌクレオチド、あるいは、配列番号１５に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１６に示される塩基配列からなるプライマーとのプライマー対、または配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１８に示される塩基配列からなるプライマーとのプライマー対を用いて、マウスｃＤＮＡライブラリーから増幅されるポリヌクレオチドであり、かつＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴としている。
【０１３９】
本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【０１４０】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料（例えば、ヒトまたはマウスなどの諸器官）であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。
【０１４１】
本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、本明細書中にさらに記載されるように、ＭＡＴＥ活性を測定するためのツールとして使用され得る。
【０１４２】
つまり、本発明の目的は、ＭＡＴＥポリペプチドおよびＭＡＴＥポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法およびポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。従って、上記各方法以外によって取得されるＭＡＴＥポリペプチド、およびＭＡＴＥポリヌクレオチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１４３】
〔２〕ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの利用
〔２−１〕ベクター
本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【０１４４】
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、ＭＡＴＥ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＭＡＴＥポリヌクレオチド）のｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【０１４５】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。また、発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【０１４６】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、目的タンパク質を回収、精製することができる。
【０１４７】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１４８】
本発明に係るベクターを使用すれば、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを生物または細胞に導入して、当該生物または細胞中にＭＡＴＥポリペプチドを発現させることができる。さらに、本発明に係るベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、ＭＡＴＥポリペプチドを合成することができる。
【０１４９】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１５０】
〔２−２〕脂質膜
本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有する脂質膜を提供する。本発明に係る脂質膜は、天然由来の脂質膜であっても、人工の脂質膜であってもよい。本発明に係る脂質膜が天然由来である場合は、細胞膜または膜小胞であればよく、本発明に係る脂質膜が人工である場合は、脂質平面膜またはリポソーム（リポソーム組成物）であればよい。
【０１５１】
〔Ａ〕形質転換体
一実施形態において、本発明に係る脂質膜は、ＭＡＴＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体の形質膜であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。
【０１５２】
本実施形態における形質転換体は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有する形質膜が形成されていることを特徴とする。なお、本実施形態における形質転換体は、ＭＡＴＥポリペプチドが安定的に発現していることが好ましい。
【０１５３】
１つの局面において、本実施形態における形質転換体は、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、ＭＡＴＥポリペプチドが発現され得るように生物中に導入することによって取得される。本実施形態における形質転換体は、原核生物であっても真核生物であってもよい。本発明者らの解析によりＭＡＴＥポリペプチドが膜タンパク質であることが示されたので、ＭＡＴＥポリペプチドが発現する形質転換体においては、ＭＡＴＥポリペプチドを含有する形質膜が提供される。
【０１５４】
上記発現ベクターを宿主に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドで昆虫細胞を形質転換させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよく、本発明に係るポリペプチドで植物を形質転換させる場合には、アグロバクテリウム法、遺伝子銃（粒子ボンバードメント法）を用いて本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入すればよい。
【０１５５】
このように、本実施形態における形質転換体は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを含有する形質膜が形成されていればよいといえる。すなわち、上記方法以外の公知の方法によって作製された形質転換体も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１５６】
〔Ｂ〕膜小胞
一実施形態において、本発明に係る脂質膜は、ＭＡＴＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された細胞から得られる膜小胞であり得る。本明細書中で使用される場合、「膜小胞」は、超音波処理などに供されて破壊された細胞の形質膜が形成する、より小さな小胞が意図される。
【０１５７】
このように、本実施形態に係る膜小胞は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを含有する脂質膜によって形成されていればよいといえる。すなわち、機能を喪失した細胞内小器官などを内包する膜小胞もまた、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１５８】
〔Ｃ〕リポソームおよびリポソーム組成物
ＭＡＴＥポリペプチドは種々の有機カチオン（ＯＣ）を輸送するトランスポーターである。本発明者らは、これまでに、放射標識した基質を用いて、ＭＡＴＥポリペプチドを発現させたＨＥＫ２９３細胞またはアフリカツメガエル卵母細胞の系で、ＭＡＴＥポリペプチドによってどのような物質が輸送されるのか調べた。このような発現細胞を用いる系では、ＭＡＴＥポリペプチド以外に細胞由来の多数のタンパク質が共存した条件下にて測定を行うが、共存する多数のタンパク質による干渉は、特に性ホルモンなどの疎水性の高い輸送基質を用いる場合に特に問題になる。すなわち、疎水性の高い輸送基質について信頼性の高い測定を行うためには、ＭＡＴＥポリペプチド以外のタンパク質が存在しない系を用いることが好ましい。
【０１５９】
また、上述した実験系は輸送基質として標識した物質（すなわち放射標識物質または蛍光標識物質）を用いるので、標識し得ない薬物、毒物、代謝性生体成分などが輸送対象となるトランスポータータンパク質についての輸送を確認することができなかった。
【０１６０】
そこで、本発明者らは、蛋白質科学的にほぼ均一なＭＡＴＥポリペプチドを調製し、これを組み込んだリポソーム（いわゆるプロテオリポソーム）を調製し、このプロテオリポソームを輸送実験に供することにより、完全に定義された組成により構成されたＭＡＴＥポリペプチドの輸送測定系を完成した。そして、この輸送測定系をマススペクロトスコピー（質量分析計）や蛍光分光計、ＨＰＬＣなどと組み合わせることにより、これまでは不可能であった様々な非標識化合物について輸送基質となるかどうかを正確に調べることができるようになった。
【０１６１】
すなわち、一実施形態において、本発明に係る脂質膜は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「リポソーム組成物」は、特定の物質を含有したリポソームが意図される。リポソームは、ベジクルとも称される脂質人工膜であり、脂質（例えば、リン脂質）の懸濁液を激しく攪拌して分散させた後に超音波処理を施すことにより作製され得る。リポソームを用いた研究は広く行われており、細胞膜モデルとして利用されたり、薬物送達（ＤＤＳ）の手段の一つとして利用されたりしている。
【０１６２】
本発明に係るリポソーム組成物は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有していることを特徴とする。本発明に係るリポソーム組成物は、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅタンパク質をさらに含有していてもよい。なお、Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅタンパク質は、細胞内のプロトンを細胞外へ能動的に輸送するタンパク質であって、プロトンポンプとも称される。プロトンポンプの精製方法は、特に限定されるものではなく、Ｍｏｒｉｙａｍａ Ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２２１４１−２２１４６（１９９１）等の従来公知の方法を好適に用いればよい。なお、本発明に係るリポソーム組成物を用いてＭＡＴＥポリペプチドの輸送活性を測定する場合、哺乳動物由来のＭＡＴＥポリペプチドであればＨ＋−ＡＴＰａｓｅタンパク質が共存しなくても活性測定が可能である。
【０１６３】
本発明を用いれば、ＭＡＴＥポリペプチド以外の夾雑タンパク質が存在しない系を構築することができるので、得られた結果がＭＡＴＥポリペプチドに起因するものであるか否かをより明確に知ることができ、多数のタンパク質が共存することによって、ＭＡＴＥポリペプチドによる基質の輸送がどのくらい干渉されるのかを知ることができる。
【０１６４】
また、本発明を用いれば、放射標識または蛍光標識した基質を用いる必要がない系を構築することができるので、広範な種々の薬物、毒物、代謝性生体成分などについて、トランスポータータンパク質の輸送対象であるか否かを解析することができる。
【０１６５】
このように、本発明によって従来の問題点を解決することができ、ＭＡＴＥポリペプチドの輸送機能をより広くより深く理解することができる。もちろん、従来どおりの標識された化合物を本発明とともに用いることもできる。
【０１６６】
このように、本発明に係るリポソーム組成物は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを含有していればよいといえる。すなわち、上記方法以外の公知の方法によって作製されたリポソーム組成物も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１６７】
〔Ｄ〕脂質平面膜
一実施形態において、本発明に係る脂質膜は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有している脂質平面膜であり得る。脂質二重層は、極性脂質（特にリン脂質）が二層となった膜状の構造である。脂質二重層構造が二次元構造として安定化するのは球状であるが、末端を水分子から隔離すれば平面構造になり得る。本明細書中で使用される場合、人工的に作製される脂質二重層のうち球状のものをリポソーム、平面状のものを脂質平面膜という。
【０１６８】
本実施形態に係る脂質平面膜を得るためには、人工的に形成した脂質二重層の膜にＭＡＴＥポリペプチドを埋め込めばよい。なお、人工的な脂質二重層は、膜タンパク質（例えば、チャネルタンパク質）の活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定する際に使用されており、いずれの作製方法も当該分野において周知である。
【０１６９】
このように、本発明に係る脂質平面膜は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを含有していればよいといえる。すなわち、上記方法以外の公知の方法によって作製された脂質平面膜も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１７０】
〔３〕ベクターの利用
上述したように、本発明に係るベクターを使用すれば、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを導入した生物または細胞にてＭＡＴＥポリペプチドを発現させることができる。細胞膜は、形質転換体として、または形質転換体の一部として供給されるので、本発明に係るベクターを用いれば、ＭＡＴＥポリペプチドを含有する天然由来の脂質膜を得ることができる。また、人工の脂質膜を得るためには、上述したベクターを用いて作製した精製ＭＡＴＥポリペプチド（発現系であっても無細胞系であってもよい。）を用いればよい。
【０１７１】
このように、本発明に係るベクターは、本発明に係る脂質膜を作製するためのツールとして利用され得る。すなわち、本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有する脂質膜を作製するための方法およびキットを提供する。
【０１７２】
本発明に係るＭＡＴＥポリペプチドを含有する脂質膜を作製する方法は、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを含むベクターを用いてＭＡＴＥポリペプチドを生成する工程を包含することを特徴としている。天然由来の脂質膜を作製する場合は、生成したＭＡＴＥポリペプチドを精製する必要はないが、人工の脂質膜を作製する場合は、生成したＭＡＴＥポリペプチドを精製して用いればよい。本明細書を読んだ当業者は、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを含むベクターを用いてＭＡＴＥポリペプチドを生成することを容易になし得る。
【０１７３】
また、本発明に係るＭＡＴＥポリペプチドを含有する脂質膜を作製するためのキットは、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを含むベクターを備えていることを特徴としている。天然由来の脂質膜を作製する場合は、上記ベクターは組換え発現ベクターであり、人工の脂質膜を作製する場合は、上記ベクターは組換え発現ベクターであってもなくてもよい。
【０１７４】
このように、本発明に係るＭＡＴＥポリペプチドを含有する脂質膜を作製するための方法およびキットは、少なくとも、ＭＡＴＥポリヌクレオチドを含むベクターを用いればよいといえる。すなわち、上記以外の公知の技術を適用する方法およびキットも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１７５】
〔４〕脂質膜の利用
本発明は、上記脂質膜の利用をさらに提供する。本明細書中、形質転換体またはリポソーム組成物を例に挙げて、脂質膜の利用を説明するが、本発明に係る脂質膜の利用はこれらに限定されない。
【０１７６】
〔Ａ〕ＭＡＴＥポリペプチドを発現する形質転換体の利用
ＭＡＴＥ１ポリペプチドをＨＥＫ２９３細胞に発現させると、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）および１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）のＨ＋依存的な輸送が生じた。ＭＡＴＥ１の基質特異性は、腎臓または肝臓に存在するＨ＋依存性有機カチオン輸送体と類似していた。このように、ＭＡＴＥ１は、長期にわたって探索されてきた、有機カチオン（ＯＣ）を直接尿中または胆汁中に排泄する多機能なＯＣ輸送体であることが明らかになった。
【０１７７】
上述したように、ＭＡＴＥポリペプチドは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有しており、より詳細には、細胞膜を介して有機カチオン（ＯＣ）を輸送するトランスポーター活性（輸送活性）を有している。本発明は、このような輸送活性の標的となる基質をさらにスクリーニングするための方法およびキットを提供する。
【０１７８】
本発明に係るスクリーニング方法は、上記形質転換体をテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。上記工程において、基質候補の存在下または非存在下においてＴＥＡまたはＭＰＰの上記形質転換体への取り込み量に変化が生じた場合、すなわち、基質候補の存在によってＴＥＡまたはＭＰＰの輸送が阻害された場合、基質候補がＭＡＴＥポリペプチドの新たな基質であると判定することができる。
【０１７９】
後述する実施例において実証されているように、本発明に係るスクリーニング方法によって、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）および１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）以外に、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、およびチアミンがＭＡＴＥポリペプチドの基質となる。すなわち、これらの化合物は、ＭＡＴＥポリペプチドによって輸送される。
【０１８０】
このように、本発明に係るスクリーニング方法において、ＴＥＡまたはＭＰＰの代わりに上記化合物の１つ以上を用いて、その輸送阻害の有無を判定基準に用いてもよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。なお、これらの化合物は、本発明において使用される場合、検出可能に標識されていることが好ましい。好ましい標識としては放射標識が挙げられるが、これに限定されない。
【０１８１】
本発明に係るスクリーニングキットは、上記形質転換体を備えていることを特徴としている。好ましい実施形態において、本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）をさらに備えていることが好ましい。上記工程において、基質候補の存在下または非存在下においてＴＥＡまたはＭＰＰの上記形質転換体取り込み量に変化が生じた場合、すなわち、基質候補の存在によってＴＥＡまたはＭＰＰの輸送が阻害された場合、基質候補がＭＡＴＥポリペプチドの新たな基質であると判定することができる。また、上述したように、ＴＥＡまたはＭＰＰの代わりにシメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの１つ以上を用いて、その輸送阻害の有無を判定基準に用いてもよい。
【０１８２】
本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを発現する形質転換体のさらなる用途を提供する。１つの局面において、本発明は、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤をスクリーニングするための方法およびキットを提供する。別の局面において、本発明は、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するための方法およびキットを提供する。さらなる局面において、本発明は、モノアミン類、揮発性有機カチオン類、ニコチンの吸収または排出、メラトニン、ステロイドホルモン、性ホルモンおよびこれらの関連製剤の分泌、吸収または排出、植物アルカノイド類またはフェノール類の植物体内への濃縮など、多くの生体成分（特に、疎水度の強い生体成分）の輸送、分泌、蓄積または排出を測定するための方法およびキットを提供するとともに、これらの輸送、分泌、蓄積または排出を調節する薬剤をスクリーニングするための方法およびキットを提供する。いずれの場合においても、本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを発現する形質転換体を用いることを特徴としており、好ましくは、ＭＡＴＥポリペプチドの基質を利用する。また、本発明に係るスクリーニングキットを用いれば、細胞膜に存在するＭＡＴＥポリペプチドにいかなる化合物が結合するかを調べることができるので、ＭＡＴＥポリペプチドに対する阻害剤または活性増強剤をスクリーニングし得る。
【０１８３】
これまではトランスポーターの実体が不明であったため、種々の医薬品試験を実施し得なかった。本発明に係るトランスポーターを阻害する薬剤は、薬剤の体内での長期貯留を引き起こし、種々の長期毒性を引き起こす可能性がある。よって、このトランスポーターに対する薬品の影響は、薬品を製品化する前に予め試験する必要がある。
【０１８４】
薬剤または毒素が体外（尿および／または便）に排出されるためには、これらの物質は何種類ものトランスポーターによっていくつもの細胞を通過する必要がある。本発明に係るトランスポーターは、このような排出の最終段階を司る。
【０１８５】
本発明は、不特定多数の有機カチオンを基質として、腎臓尿細管のアピカル部位（原尿に接する部位）または肝臓の微小胆管（胆汁を排泄する部位）に存在する新規トランスポーターを定常的に発現する培養細胞株を確立した。この細胞株は、種々の医薬品または農薬などの輸送（排出）試験を行うための測定系と使用され得る。
【０１８６】
なお、ＭＡＴＥポリペプチドを発現する形質転換体を用いて本発明に係る方法およびキットを説明してきたが、ＭＡＴＥポリペプチドを発現する形質転換体を作製するための工程をさらに包含する方法、およびＭＡＴＥポリペプチドを発現する形質転換体を作製するためのツールをさらに備えているキットもまた、本発明の技術的範囲に属する。
【０１８７】
〔Ｂ〕ＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物の利用
実施例にて詳述するように、ＭＡＴＥ１ポリペプチドをＨＥＫ２９３細胞に発現させると、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）および１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）のＨ＋依存的な輸送が生じた。また、ＭＡＴＥ１ポリペプチドを含有しているリポソーム組成物において、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）のＨ＋依存的な輸送が確認された。ＭＡＴＥ１の基質特異性は、腎臓または肝臓に存在するＨ＋依存性有機カチオン輸送体と類似していた。このように、ＭＡＴＥ１は、長期にわたって探索されてきた、有機カチオン（ＯＣ）を直接尿中または胆汁中に排泄する多機能なＯＣ輸送体であることが明らかになった。
【０１８８】
上述したように、ＭＡＴＥポリペプチドは、細胞膜におけるトランスポーター活性を有しており、より詳細には、細胞膜を介して有機カチオン（ＯＣ）を輸送するトランスポーター活性（輸送活性）を有している。本発明は、このような輸送活性の標的となる基質をさらにスクリーニングするための方法およびキットを提供する。
【０１８９】
本発明に係るスクリーニング方法は、上記リポソーム組成物をテトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。上記工程において、基質候補の存在下または非存在下においてＴＥＡまたはＭＰＰの上記リポソーム組成物への取り込み量に変化が生じた場合、すなわち、基質候補の存在によってＴＥＡまたはＭＰＰの輸送が阻害された場合、基質候補がＭＡＴＥポリペプチドの新たな基質であると判定することができる。
【０１９０】
後述する実施例において実証されているように、本発明に係るスクリーニング方法によって、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）および１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）以外に、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、およびチアミンがＭＡＴＥポリペプチドの基質となる。すなわち、これらの化合物は、ＭＡＴＥポリペプチドによって輸送される。
【０１９１】
このように、本発明に係るスクリーニング方法において、ＴＥＡまたはＭＰＰの代わりに上記化合物の１つ以上を用いて、その輸送阻害の有無を判定基準に用いてもよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。なお、これらの化合物は、本発明において使用される場合、検出可能に標識されていてもよい。好ましい標識としては放射標識または蛍光標識が挙げられるが、これに限定されない。
【０１９２】
本発明に係るスクリーニングキットは、上記リポソーム組成物を備えていることを特徴としている。好ましい実施形態において、本発明に係るスクリーニングキットは、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）または１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）をさらに備えていることが好ましい。上記工程において、基質候補の存在下または非存在下においてＴＥＡまたはＭＰＰの上記リポソーム組成物取り込み量に変化が生じた場合、すなわち、基質候補の存在によってＴＥＡまたはＭＰＰの輸送が阻害された場合、基質候補がＭＡＴＥポリペプチドの新たな基質であると判定することができる。また、上述したように、ＴＥＡまたはＭＰＰの代わりにシメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、またはチアミンの１つ以上を用いて、その輸送阻害の有無を判定基準に用いてもよい。
【０１９３】
本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物のさらなる用途を提供する。１つの局面において、本発明は、薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤をスクリーニングするための方法およびキットを提供する。別の局面において、本発明は、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験するための方法およびキットを提供する。さらなる局面において、本発明は、モノアミン類、揮発性有機カオチン類、ニコチンの吸収または排出、メラトニン、ステロイドホルモン、性ホルモンおよびこれらの関連製剤の分泌、吸収または排出、植物アルカノイド類またはフェノール類の植物体内への濃縮など、多くの生体成分（特に、疎水度の強い生体成分）の輸送、分泌、蓄積または排出を測定するための方法およびキットを提供するとともに、これらの輸送、分泌、蓄積または排出を調節する薬剤をスクリーニングするための方法およびキットを提供する。いずれの場合においても、本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物を用いることを特徴としており、好ましくは、ＭＡＴＥポリペプチドの基質を利用する。また、本発明に係るスクリーニングキットを用いれば、細胞膜に存在するＭＡＴＥポリペプチドにいかなる化合物が結合するかを調べることができるので、ＭＡＴＥポリペプチドに対する阻害剤または活性増強剤をスクリーニングし得る。
【０１９４】
これまではトランスポーターの実体が不明であったため、種々の医薬品試験を実施し得なかった。本発明に係るトランスポーターを阻害する薬剤は、薬剤の体内での長期貯留を引き起こし、種々の長期毒性を引き起こす可能性がある。よって、このトランスポーターに対する薬品の影響は、薬品を製品化する前に予め試験する必要がある。
【０１９５】
薬剤または毒素が体外（尿および／または便）に排出されるためには、これらの物質は何種類ものトランスポーターによっていくつもの細胞を通過する必要がある。本発明に係るトランスポーターは、このような排出の最終段階を司る。
【０１９６】
本発明は、不特定多数の有機カチオンを基質として、腎臓尿細管のアピカル部位（原尿に接する部位）または肝臓の微小胆管（胆汁を排泄する部位）に存在する新規トランスポーターを含有しているリポソーム組成物を確立した。このリポソーム組成物は、種々の医薬品または農薬などの輸送（排出）試験を行うための測定系と使用され得る。
【０１９７】
なお、ＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物を用いて本発明に係る方法およびキットを説明してきたが、ＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物を作製するための工程をさらに包含する方法、およびＭＡＴＥポリペプチドを含有しているリポソーム組成物を作製するためのツールをさらに備えているキットもまた、本発明の技術的範囲に属する。
【０１９８】
〔５〕オリゴヌクレオチドおよびその利用
本発明は、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドもしくはその変異体のフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１９９】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、そしてより好ましくは少なくとも２０塩基、なおより好ましくは少なくとも３０塩基、そしてさらにより好ましくは少なくとも４０塩基の長さのフラグメントが意図される。一実施形態において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７または２１に基づくＤＮＡフラグメントであり得る。本明細書を参照すれば配列番号１、３、５、７または２１に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号１、３、５、７または２１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。別の実施形態において、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号１１〜１８のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであり得る。
【０２００】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして本発明に係るポリペプチドを作製するために使用され得る。また、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、特定の組織における目的遺伝子のｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析またはＰＣＲプライマーとして使用され得る。すなわち、ＭＡＴＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたはＭＡＴＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして、本発明に係るオリゴヌクレオチドを利用することによって、ＭＡＴＥポリペプチドを発現する生物または組織を容易に検出することができる。また、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いれば、ＭＡＴＥポリペプチドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の強弱を確認することができるので、物質輸送異常に起因する疾患、障害を診断することができる。
【０２０１】
すなわち、本発明はさらに、上記オリゴヌクレオチドを用いる診断方法および診断キットを提供する。上述したように、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、「ＭＡＴＥ活性」、すなわち、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド（ＭＡＴＥポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド（ＭＡＴＥポリヌクレオチド）と特異的にハイブリダイズする。よって、本発明に係るオリゴヌクレオチドを用いて生体各組織におけるＭＡＴＥポリヌクレオチドの存在の有無を検出することにより、物質輸送異常に起因する疾患、障害を診断することができる。具体的には、生体組織から生検等により採取した生物学的サンプル（特に、被検体から得られた組織、細胞または体液である被検体サンプル）から調整したｍＲＮＡと、本発明に係るオリゴヌクレオチドとを反応させることにより、生物学的サンプル中でのＭＡＴＥポリヌクレオチドの発現量を知ることができる。
【０２０２】
本発明に係るＭＡＴＥポリペプチドが寄与する物質輸送異常に起因する疾患を診断するキットは、本発明に係るオリゴヌクレオチドを少なくとも備えていればよい。本キットはさらに、必要に応じて、このオリゴヌクレオチドを検出するための試薬を備えていてもよい。なお、ＭＡＴＥポリペプチドによって輸送される物質としては、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、およびチアミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０３】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るオリゴヌクレオチドおよびその利用を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したオリゴヌクレオチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるオリゴヌクレオチドも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０２０４】
〔６〕抗体およびその利用
本発明は、ＭＡＴＥポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。一実施形態において、本発明に係る抗体は、ｈＭＡＴＥ１ポリペプチドまたはｍＭＡＴＥ１ポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。本実施形態に係る抗体は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるペプチド抗原または配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチド抗原によって惹起されることが好ましいが、抗体の生成方法としてはこれに限定されない。
【０２０５】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）が意図され、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に係る抗体は、ＭＡＴＥポリペプチドを発現する生物材料を選択するに有用であり得、発現部位を同定するになお有用である。
【０２０６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＭＡＴＥポリペプチドと特異的に結合する抗体」は、ＭＡＴＥポリペプチドに特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことが意図される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、ＭＡＴＥポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。
【０２０７】
このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、上記ペプチド抗原を認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、上記ペプチド抗原を認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。
【０２０８】
本発明はまた、哺乳動物ＭＡＴＥポリペプチドを検出し得る抗体を惹起するペプチド抗原を提供する。すなわち、本発明に係るペプチド抗原は、免疫アッセイに有効な抗体を生成するための方法およびキットにおいて有用である。本明細書中で使用される場合、用語「免疫アッセイ」は、抗原抗体反応に基づいた免疫学的な結合反応を利用して行われるアッセイが意図される。免疫学的な結合反応を利用したアッセイとしては、免疫組織化学、免疫電子顕微鏡法、ウエスタンブロット、免疫沈降法、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、放射性イムノアッセイ、および免疫拡散アッセイのような抗体アッセイ、ならびにアフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられる。
【０２０９】
上記ペプチド抗原は、ＭＡＴＥポリペプチドと同様に、化学合成されても、天然供給源より単離されてもよく、組換え発現（例えば、ＧＳＴ融合タンパク質）を利用して取得されてもよい。
【０２１０】
本明細書を読んだ当業者は、上記ペプチド抗原を用いて抗体を惹起する工程を包含する抗体の生成方法およびキットもまた本発明の範囲内に含まれることを容易に理解する。なお、本発明に係る抗体の生成方法において、上記ポリペプチドをアジュバントとの複合体を抗原として用いてもよい。
【０２１１】
本発明はさらに、上記抗体を用いる診断方法および診断キットを提供する。上述したように、本発明に係る抗体は、「ＭＡＴＥ活性」、すなわち、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド（ＭＡＴＥポリペプチド）と特異的に結合する。よって、本発明に係る抗体を用いて生体各組織におけるＭＡＴＥポリペプチドの存在の有無を検出することにより、物質輸送異常に起因する疾患、障害を診断することができる。具体的には、生体組織から生検等により採取した生物学的サンプル（特に、被検体から得られた組織、細胞または体液である被検体サンプル）と、ＭＡＴＥポリペプチドに特異的に結合する抗体とを反応させることにより、生物学的サンプル中にこの抗体と結合する抗原ペプチド（すなわちＭＡＴＥポリペプチド）の発現量を知ることができる。
【０２１２】
本発明に係るＭＡＴＥポリペプチドが寄与する物質輸送異常に起因する疾患を診断するキットは、ＭＡＴＥポリペプチドに特異的に結合する抗体を少なくとも備えていればよく、該抗体は、マウスまたはヒトのＭＡＴＥ１またはＭＡＴＥ２に対する抗体であることが好ましい。本キットはさらに、必要に応じて、この抗体を検出するための試薬を備えていてもよい。なお、ＭＡＴＥポリペプチドによって輸送される物質としては、テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチン、ローダミン６Ｇ、クロロキン、キニン、ピリメタミン、クロロプロマジン、ベルベリン、シスプラチン、プロプラノロール、パパベリン、およびチアミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１３】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るＭＡＴＥポリペプチドを認識する抗体およびその利用を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０２１４】
〔７〕ノックアウト動物
ノックアウト動物は、特定の遺伝子を破壊することによって得られた遺伝子欠損動物である。ノックアウト動物（特にマウス）は、全能性を有する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）において遺伝子破壊を行い、標的遺伝子破壊を起こしたＥＳ細胞を選抜し、その細胞とマウス胚を用いてキメラ個体を作製し、ＥＳ細胞に由来する生殖細胞を有するキメラ個体から二世代以上の交配によって標的破壊遺伝子をホモで有する個体として作出される。ノックアウト動物は、新しい実験動物、特に疾患モデル動物の作出に非常に有効な技術である。
【０２１５】
本発明は、ＭＡＴＥ遺伝子を破壊したノックアウト動物を提供する。本発明に係るノックアウト動物は、マウスであることが好ましい。ノックアウト動物の作製方法は当該分野において周知であるので、本明細書によって提供されるＭＡＴＥ遺伝子の情報に基づけば、当業者はＭＡＴＥ遺伝子ノックアウト動物を容易に作製し得る。
【０２１６】
本発明に係るノックアウト動物を用いれば、細胞膜における物質輸送を調節する薬剤をスクリーニングしたり、細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチドの基質をスクリーニングしたりすることができる。また、本発明に係るノックアウト動物を用いれば、薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験することができる。さらに、本発明に係るノックアウト動物は、細胞膜における物質輸送異常に起因する疾患に関するモデル動物として疾患治療に大いに貢献し得る。
【０２１７】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。
【実施例】
【０２１８】
〔１：材料および方法〕
〔１−１．ｃＤＮＡのクローニング〕
ヒトＭＡＴＥ１（ｈＭＡＴＥ１：アクセッション番号ＮＰ−０６０７１２）のｃＤＮＡをヒト脳より抽出した総ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。逆転写反応後に、ｃＤＮＡ溶液を１０倍希釈して、０．６ｍＭ ｄＮＴＰｓ（１５０μＭの各ｄＮＴＰ）、および２５ｐｍｏｌのプライマー対、１．５ユニットのＡｍｐｌｉ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含むＰＣＲ緩衝液中に添加した。ＰＣＲ増幅を以下に従って行った：９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長。増幅産物（１８０４塩基対）をアガロースゲル電気泳動にて解析した。なお、プライマーを、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＫ００１７０９に基づいて作製した（センスプライマー：５’−ｇｇｃｃｇｇｔａｃｃｃｇｃｇａｇｔｃａｃａｔｇｇａａｇｃｔｃ−３’；アンチセンスプライマー：５’−ｃａｃｔｔｃｔａｇａｃｃｔｇｔｇａａｔｔｇｔｇｔｇｔａａｇｃ−３’）。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素（ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ）で消化して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）に挿入した。ヒトＭＡＴＥ１の遺伝子配列をヒトゲノム配列と比較して、エラーがないことを確認した。
【０２１９】
同様に、プライマー対（センス：５’−ａｇｔｃｇａａｔｔｃｃａｃｃａｔｇｇａｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇａｃａｃａｇｔｇｇ−３’；アンチセンス：５’ａｇｃｔｃｔｃｇａｇｃｔａｇｔｇｃｃｔｇｇｔｇｇｃｔａｇｇａｔｃｃｔｇａｃ−３’）を用いてヒトＭＡＴＥ２（ｈＭＡＴＥ２：アクセッション番号ＮＰ−６９０８７２）を、プライマー対（センス：５’−ｃｇｃｃｇｇｔａｃｃａｃｃａｔｇｇａａｃｇｃａｃｇｇａｇｇａ−３’；アンチセンス：５’−ａｇａｃａｇｔｔｔａｔｔｇｃｔｇｔｃｃｔｔｔｇｇａｃｇｇａｔ−３’）を用いてマウスＭＡＴＥ１（ｍＭＡＴＥ１：アクセッション番号ＡＡＨ３１４３６）を、プライマー対（センス：５’−ｃａｃｃｇａａｔｔｃａｔｇｇａｇｃｃｇｇｃｃｇａｇｇａｃａ−３’；アンチセンス：５’−ｃｇｔａｃｔｃｇａｇｔｔａｇｃｃａｃｇｇｔｃａｔｔｇａａａ−３’）を用いてマウスＭＡＴＥ２（ｍＭＡＴＥ２：アクセッション番号ＸＰ＿３５４６１１）をクローニングした。
【０２２０】
〔１−２．点変異導入〕
非特許文献１２の方法に従って、オリゴヌクレオチドプライマー（５’−ｇｇｃｃｃａｃｃａｃｔｇｃａｔｇｃａｃａｇｃａｔｇａｇｃ−３’）を用いて、ヒトＭＡＴＥ１に点変異（Ｅ２７３Ｑ）を導入した。
【０２２１】
〔１−３．ノーザンブロット解析〕
ヒトおよびマウスの多組織ノーザンブロット（ＭＴＮ）をＣｌｏｎｔｅｃｈより購入した。ＰＣＲ増幅して得たヒトＭＡＴＥ１のＮ末端領域（ｎｔ１０〜６０１；５９２ｂｐ）、ヒトＭＡＴＥ２のＣ末端領域（ｎｔ１４１２〜１７１２；３０１ｂｐ）、マウスＭＡＴＥ１のＣ末端領域（ｎｔ１３３６〜１５９９；２６４ｂｐ）およびマウスＭＡＴＥ２のＣ末端領域（ｎｔ１０８７〜１６４８；５６２ｂｐ）を、ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、ノーザンブロットのプローブに用いた。ハイブリダイゼーションを、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて６８℃にて１時間行い、５０℃にて洗浄した。
【０２２２】
〔１−４．抗体作製〕
ヒトＭＡＴＥ１のアミノ酸４６１〜５４６位またはマウスＭＡＴＥ１のアミノ酸Ｐ４９５〜Ｑ５３２をＧＳＴと融合させたＧＳＴ融合タンパク質を抗原に用いて、ヒトＭＡＴＥ１またはマウスＭＡＴＥ１に特異的なウサギポリクローナル抗体を作製した。
【０２２３】
〔１−５．ウエスタンブロッティング〕
ヒト組織サンプルをコスモバイオより購入した。マウス組織１ｇから膜画分を調製した。各組織を、２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、０．３Ｍ ｓｕｃｒｏｓｅ、５ｍＭ ＥＤＴＡおよびタンパク質分解酵素阻害剤（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、ａｎｔｉｐａｉｎおよびｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎを各１０μｇ／ｍｌ）からなる緩衝液中に懸濁した後、ホモジナイズした。核を除去した後、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。上清を除去し、沈殿を上記緩衝液中に懸濁した。１％ ＳＤＳおよび１０％ β−メルカプトエタノールを含む緩衝液を加えた後、ヒト膜画分（１００μｇ）およびマウス膜画分（２００μｇ）を電気泳動用サンプルとして用いた。ウエスタンブロッティングを定法（非特許文献１３を参照のこと）に従って行った。
【０２２４】
〔１−６．免疫組織染色〕
ヒトパラフィン組織切片をＢｉｏｃｈａｉｎ社より購入した。免疫組織化学解析を、ＨＲＰ−ＤＡＢ法または間接蛍光抗体顕微鏡法を用いて、非特許文献１３に従って行った。１０００倍希釈または１μｇ／ｍｌの１次抗体を用いて、１次抗体反応を、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中にて室温で１時間行った。サンプルを、Ｏｌｙｍｕｐｕｓ ＢＸ６０顕微鏡またはＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ３００共焦点レーザ顕微鏡を用いて解析した。
【０２２５】
〔１−７．免疫電子顕微鏡〕
金コロイド銀増感電子顕微鏡法を、非特許文献１３に従って行った。エーテルにて麻酔したマウスを、心臓から生理食塩水を灌流し、次いで、４％パラホルムアルデヒドを溶解した０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を還流した。腎臓を単離してＰＢＳで洗浄した。３０％ショ糖を含むＰＢＳ溶液を浸透させた組織を切片化（６ｍｍ厚）し、シラン化したスライドグラス上に配置して、ＯＴＣ化合物（Ｓａｋｕｒａ ＦｉｎｅＴｅｋ）中に包埋した。切片を、０．２５％サポニンおよび５％ ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中にて３０分間インキュベートし、次いで、０．００５％サポニン、１０％ ＢＳＡ、１０％ヤギ血清、および０．１％ ｃｏｌｄ ｗａｔｅｒ ｆｉｓｈ ｇｅｌａｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を含むブロッキング溶液を用いてブロッキングした。次いで、切片を、ブロッキング溶液で１０００倍希釈したウサギ抗マウスＭＡＴＥ１抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。０．００５％サポニンを含む緩衝液で十分洗浄した後、切片を、ヤギ抗ウサギＩｇＧ金コロイド（金粒子の直径は１．４ｍｍ）を含むブロッキング溶液中で２時間インキュベートし、緩衝液で６回洗浄し、次いで、１％グルタルアルデヒドを用いて１０分間固定した。さらに洗浄した後、切片を、銀増感キット（ＨＱ ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ）を室温で５分間処理し、次いで、０．５％ ４酸化オスミウムを用いて９０分間固定した。超薄切片を、酢酸ウランおよびクエン酸鉛にて２重染色し、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈ−７１００電子顕微鏡にて解析した。
【０２２６】
〔１−８．輸送活性の測定〕
ＨＥＫ２９３細胞を、非特許文献１４に従って、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地中、５％ ＣＯ２にて、３７℃で培養した。ヒトＭＡＴＥ１またはマウスＭＡＴＥ１をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングして得たｐｃＤＮＡ３．１／ｈＭＡＴＥ１プラスミドを、ＴｒａｎｓＩＴ試薬（Ｍｉｒｕｓ）を用いて、培養２４時間後のＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした（細胞数：１．５×１０６細胞／１０ｃｍ ｄｉｓｈ）。２日間培養した細胞を回収し、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、４．８ｍＭ塩化カリウム、５．６ｍＭ Ｄ−グルコース、１．２ｍＭ塩化カルシウム、１．２ｍＭリン酸二水素カリウム、１．２ｍＭ硫酸マグネシウムおよび２５ｍＭトリシンからなる活性測定用緩衝液（ｐＨ８．０）中に懸濁した。細胞を３７℃で５分間インキュベートし、５０μＭのＲＩ標識化ＴＥＡ（５ｋＢｑ／アッセイ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）を添加して、輸送活性の測定を開始した。所定の時点で活性測定反応液を２００μｌずつ回収し、０．４５μｍのＨＡメンブレンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過し、フィルター上に残存する放射活性を測定した。
【０２２７】
〔１−９．ニコチン輸送活性の測定〕
ｐＨ８．０における活性測定には、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、４．８ｍＭ塩化カリウム、５．６ｍＭ Ｄ−グルコース、１．２ｍＭ塩化カルシウム、１．２ｍＭリン酸二水素カリウム、１．２ｍＭ硫酸マグネシウムおよび２５ｍＭトリシンからなる緩衝液を用いた。また、ｐＨ７．０における活性測定には、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、４．８ｍＭ塩化カリウム、５．６ｍＭ Ｄ−グルコース、１．２ｍＭ塩化カルシウム、１．２ｍＭリン酸二水素カリウム、１．２ｍＭ硫酸マグネシウムおよび２５ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨからなる緩衝液を用いた。
【０２２８】
上記８で作製したヒトＭＡＴＥ１発現ＨＥＫ２９３細胞（８×１０５個）を懸濁した上記活性測定用緩衝液中に、放射性ニコチン（１００ｎＣｉ、２μＭ）を添加して最終容量を２００μｌとした。細胞を３７℃で５分間インキュベートした後、懸濁液を５，０００ｒｐｍにて３７℃で遠心分離した。細胞と上清とを分画し、それぞれに含まれる放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定することにより、細胞中へのニコチンの取り込みを測定した。
【０２２９】
〔１−１０．プロトンポンプタンパク質の精製〕
Ｍｏｒｉｙａｍａ Ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，２２１４１−２２１４６（１９９１）に記載の手順に従って、プロトンポンプであるＦ０Ｆ１タンパク質を調製した。
【０２３０】
Ｆ０Ｆ１の大量発現プラスミドｐＢＷＵ１３を含有している大腸菌ＤＫ８を、０．５％グリセロールを含むＴａｎａｋａ培地（３４ｍＭ一カリウムリン酸、６４ｍＭ二カリウムリン酸、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．３ｍＭ塩化マグネシウム、１μＭ硫酸鉄、１μＭ塩化カルシウム、１μＭ塩化亜鉛、１００μｇ／ｍｌイソロイシン、１００μｇ／ｍｌバリン、２μｇ／ｍｌチアミン）で培養した後、菌体を回収した。以降の調製を全て４℃で行った。
【０２３１】
菌体（ＤＫ８／ｐＢＷＵ１３）約１０ｇを、４０ｍｌの膜調製緩衝液（４℃の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ塩化マグネシウム、０，５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁し、フレンチプレス（１，５００ｋｇ／ｃｍ２）で細胞を破砕した。破砕液を１７，０００×ｇにて１０分間遠心分離し、得られた上清をさらに２１０，０００×ｇで１時間２０分間遠心分離した。得られた膜小胞の沈澱を、Ｆ０Ｆ１調製用緩衝液（２０ｍＭ ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ硫酸マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、０．８％オクチルグルコシド）中に懸濁し、再度遠心分離した。沈澱物として調製した膜小胞６０ｍｇを、２％のオクチルグルコシドを含む３ｍｌのＦ０Ｆ１調製用緩衝液中に懸濁し、Ｆ０Ｆ１を可溶化した。可溶化溶液を、２６０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清画分からＦ０Ｆ１を回収した。回収したＦ０Ｆ１を、１０％（ｗ／ｖ）〜３０％（ｗ／ｖ）のグリセロール密度勾配遠心分離（３３０，０００×ｇで５時間）によって精製した。グリセロール密度勾配を、１％オクチルグルコシドを含むＦ０Ｆ１調製用緩衝液で作製した。密度勾配遠心後、遠心管の底から１０分画に分けて分離し、最初の４画分をＦ０Ｆ１として回収し、−８０℃で保存した。
【０２３２】
〔２：結果〕
〔２−１．遺伝子構造およびヒトＭＡＴＥ１の発現〕
バクテリアにおける多剤排泄輸送体であるＭＡＴＥファミリーの哺乳動物における類似体をデータベース上で検索した結果、ＭＡＴＥファミリー類似体をコードする遺伝子がヒト第１７染色体上に３つ並んで存在することを見出し、これらをｈＭＡＴＥ１（アクセッション番号ＮＰ−０６０７１２）、ｈＭＡＴＥ２（アクセッション番号ＮＰ−６９０８７２）およびｈＭＡＴＥ３と命名した（図１）。なお、ＭＡＴＥ３遺伝子は新規遺伝子であった。
【０２３３】
上記遺伝子の推定のアミノ酸配列は、ＭＡＴＥファミリーのプロトタイプである、ビブリオ菌のＮａ＋依存性多剤排泄輸送体ＮｏｒＭ（非特許文献１５を参照のこと）に対してそれぞれ１９．８％および１８．６％の相同性を示した（図２）。図２中、同一のアミノ酸にアスタリスクを付し、推定の膜貫通領域を四角で囲んだ。Ｅ２７３は、輸送活性に重要なアミノ酸であるグルタミン酸である。ヒトＭＡＴＥ１は、その疎水性プロットに基づくと、１２箇所の膜貫通領域を有するタンパク質である（図３）。
【０２３４】
ヒト組織に対するノーザンブロット解析の結果、ヒトＭＡＴＥ１遺伝子は、主に腎臓、肝臓および骨格筋において４．１ｋｂの転写物として発現されていることがわかった。また、ヒトＭＡＴＥ２遺伝子は、腎臓において３．２ｋｂの転写物として発現されているが、その他の組織においては発現されていなかった（図４（ａ））。
【０２３５】
〔２−２．腎臓および肝臓におけるヒトＭＡＴＥ１の局在〕
本発明者らは、ヒトＭＡＴＥ１がタンパク質レベルでのＨ＋依存性ＯＣ輸送体であると考え、その発現および局在を調べた。ヒトＭＡＴＥ１のＣ末端ペプチドに対する特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果、ヒト腎臓膜画分において、推定の分子量サイズに等しい６２ｋＤａのバンドを検出した（図４（ｂ））。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ＤＡＢ染色による免疫組織化学の結果、ヒトＭＡＴＥ１タンパク質は、腎臓の近位尿細管および遠位尿細管の表皮細胞部位に発現されており（図４（ｃ））、特に、肝細胞の胆管部位に発現されていることがわかった（図４（ｄ））。
【０２３６】
〔２−３．マウスＭＡＴＥ１の発現および局在〕
マウスにおけるＭＡＴＥファミリー類似体を取得して、哺乳動物におけるＭＡＴＥファミリーの解析をさらに行った。マウスＭＡＴＥファミリー類似体をコードする遺伝子は、マウス第１１染色体上に２つ並んで存在することを見出し、これらをｍＭＡＴＥ１（アクセッション番号ＡＡＨ３１４３６）およびｍＭＡＴＥ２（アクセッション番号ＸＰ＿３５４６１１）と命名した（図５）。これらの推定のアミノ酸配列はヒトＭＡＴＥ１に対してそれぞれ７８．１％および３８．１％の相同性を有した（図６）。
【０２３７】
マウス組織に対するノーザンブロット解析の結果、マウスＭＡＴＥ１遺伝子は、主に腎臓、肝臓および心臓において３．８ｋｂの転写物として発現されていることがわかった。また、マウスＭＡＴＥ２遺伝子は、特に精巣において３．３ｋｂの転写物として発現されていることがわかった（図７（ａ））。
【０２３８】
マウスＭＡＴＥ１に対する特異的抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果、マウスの腎臓および肝臓において、推定の分子量サイズに等しい５３ｋＤａのバンドを検出した（図７（ｂ））。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ＤＡＢ染色による免疫組織化学の結果、マウスＭＡＴＥ１タンパク質についての反応が、腎臓の集合管および近位尿細管に強く検出され、（図７（ｃ））、特に、ヘンレループの周辺にも反応を検出した（図７（ｄ））。また、弱いレベルではあるが遠位尿細管および糸球体においてもマウスＭＡＴＥ１タンパク質についての反応が明確に検出された（図７（ｃ））。
【０２３９】
免疫電子顕微鏡解析の結果、近位尿細管の刷子縁膜にマウスＭＡＴＥ１の局在を確認した（図８（ａ））。肝臓では、マウスＭＡＴＥ１は毛細胆管に存在し、胆管の表面に分布していた（図８（ｂ））。
【０２４０】
これらの結果より、哺乳動物のＭＡＴＥ１は、主に腎臓（特に近位尿細管の刷子縁膜）および肝臓（毛細胆管）に発現されていることがわかった。このことは、これまでに知られていたＨ＋／ＯＣの交換輸送活性と一致している（非特許文献５〜７を参照のこと）。
【０２４１】
〔２−４．ＭＡＴＥ１はプロトン依存性電位差を生じさせることなくＯＣ交換輸送を担う〕
ＭＡＴＥ１がプロトン共役のＯＣ交換輸送活性を有するか否かを明らかにするために、ヒトＭＡＴＥ１を発現させたＨＥＫ２９３細胞において生体膜を介するＯＣのｐＨ依存的な輸送を解析した。本方法に従えば、管腔におけるＯＣ輸送を古典的な細胞取り込み活性として解析し得る（非特許文献１４を参照のこと）。ヒトＭＡＴＥ１を発現した細胞は、プロトン共役性のＯＣ輸送体に典型的な基質であるＴＥＡに対して、時間依存的な輸送活性を示した（図９（ａ）、および（ｂ））。野生型ＭＡＴＥ１を発現する細胞において、輸送活性は飽和し、ＴＥＡに対するＫｍ値は２２０μＭであった（図９（ｃ））。また、野生型ＭＡＴＥ１を発現する細胞において、輸送活性はｐＨ依存性を示し、ｐＨ６．０では活性が低く、ｐＨが高くなるにつれて活性が増加し、ｐＨ８．０〜８．５において活性は最大であった（図９（ｄ））。しかし、図９（ｅ）に示すように、この輸送活性にはナトリウムイオンは必要ではなかった。すなわち、６５ｍＭの塩化カリウム存在下で５μＭのバリノマイシンを添加することにより膜の脱分極を引き起こしても、ＴＥＡ取り込み活性に影響はなかった。また、塩化アンモニウムによってＴＥＡ取り込み活性は６０％阻害された。さらに、プロトンコンダクターであるＳＦ６８４７（１０μＭ）、または塩化カリウム存在下でのナイジェリシン（５μＭ）によりｐＨ勾配を消滅させると、ＴＥＡ取り込み活性は大きく減少した（図９（ｅ））。
【０２４２】
これらの結果より、ヒトＭＡＴＥ１は、電位差を生じさせることなくＨ＋／ＴＥＡ交換輸送を行うことがわかった。
【０２４３】
〔２−５．種々の化合物による輸送活性阻害〕
ｈＭＡＴＥ１またはｍＭＡＴＥ１を発現させたＨＥＫ２９３細胞を用いて、表中の化合物を示した濃度で存在させた場合と存在させなかった場合において、５０μＭのＲＩ標識化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ）の取り込みをｐＨ８．０にて解析した（表１）。
【０２４４】
【表１】
【０２４５】
表中の値は、何も添加していない最大のＴＥＡの取り込み活性値を１００％とした場合の割合で示した。ＮＭＮ：Ｎ−メチルニコチンアミド。データを、３〜９回の実験の平均値±標準偏差にて示した。＊＜０．０５、＊＊＜０．００１。
【０２４６】
記載した化合物の存在下での放射性ＴＥＡの細胞への取り込みを測定することにより、当該化合物が輸送基質となるか否かを検討することができる。表１に示すように、ＴＥＡの取り込み活性は、シメチジン、キニヂン、ベラパミル、１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ）、ニコチン、コルチコステロン、ローダミン１２３，テストステロン、メラトニン、プロゲステロン、アンドロステロン、ケルセチンで阻害されている。すなわち、これらの化合物が、ＭＡＴＥ１によって輸送されることがわかった。特に、ＴＥＡの取り込み活性は、シメチジン、キニジンまたはベラパミルによって強く阻害され、ニコチンまたはコリンによって軽度に阻害された。しかし、有機アニオンであるパラアミノ酪酸または尿酸では全く阻害されなかった。プロトン共役性のＯＣ輸送体の基質としてよく知られているＭＰＰを用いると、ＴＥＡを用いた場合と同様のｐＨ依存性が観察され、そのＫｍ値およびＶｍａｘはそれぞれ１６μＭおよび１７０ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎであった。このように、ＭＡＴＥ１の特性は、これまでに予想されていた腎臓におけるプロトン共役性ＯＣ輸送活性と全く一致した。
【０２４７】
ニコチンについての輸送体はこれまでまったく知られていなかったが、放射性ニコチンを用いた実験により、ＭＡＴＥ１タンパク質がニコチン輸送体として機能していることを見出した（図１０）。図中、データを、３回の実験の平均値±標準偏差にて示した。
【０２４８】
このように、ＴＥＡ輸送における競合阻害実験によってＭＡＴＥ１の基質特異性が明らかになった。また、ＴＥＡ輸送の競合阻害実験の結果は、腎臓におけるプロトン共役性ＯＣ輸送活性と同様の結果を示した。
【０２４９】
〔３：リポソーム組成物を用いた測定系の構築〕
〔３−１．ｈＭＡＴＥ１発現用バキュロウイルスの作製〕
５’末端にＣＡＣＣの４塩基対を付加したｈＭＡＴＥ１ ｃＤＮＡをＴＯＰＯベクターと混合し、これらをヒートショック法にてコンピテントセル（ＤＨ５α）に導入した。ｈＭＡＴＥ１を組み込んだプラスミドｐＥＮＴＥＲ−ｈＭＡＴＥ１をカナマイシンにより選択し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて回収した。このプラスミド中のｈＭＡＴＥ１ ｃＤＮＡを、ＬＲリコンビナーゼ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて、発現ベクターｐＤＥＳＴ１０（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に組み換えた。得られたプラスミドを、アンピシリン培地上で選択し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて回収した。このプラスミドを用いて形質転換したＤＨ１０Ｂａｃ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）培地上で選択した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞はバキュロウイルスのゲノムＤＮＡを有しており、ｐＤＥＳＴ１０上に導入されたｃＤＮＡはトランスポゾンによって自動的にウイルスゲノム上に組み換えられる。その結果、ウイルスゲノム上のガラクトシダーゼ遺伝子が破壊され、精製されるコロニーは白くなる。この培地上の白いコロニーからバックミド（組換えウイルスゲノムＤＮＡ）を、以下の手順に従うミニプレップ法によって回収した。
【０２５０】
形質転換したＤＨ１０Ｂａｃを、０．３ｍｌの溶液Ｉ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭグルコース、１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸）に懸濁し、この懸濁液に、同量の溶液ＩＩ（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％ドデシル硫酸ナトリウム）を添加した。５分間静置した後、この懸濁液に、０．３ｍｌの溶液ＩＩＩ（３Ｍカリウム酢酸（ｐＨ５．２））を添加した。この懸濁液を１８，０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた上清に０．８ｍｌのイソプロピルを添加した。この溶液を氷上で５分間静置した後、さらに１５分間遠心分離した。得られた沈澱物を、７０％の氷冷エタノールで２回洗浄後、乾燥させた。乾燥した沈殿物を４０μｌのＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭエチレンジアミン４酢酸）に懸濁し、組換えバックミド溶液を得た。
【０２５１】
組換えバキュロウイルスの作製を下記の手順に従って行った。調製したバックミド約３μｌを、セルフェクチン試薬（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いてｓｆ９昆虫細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に導入した。バックミドを導入したｓｆ９を、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌファンギゾンを含むＴＮＭ−ＦＨ培地（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。これらの細胞を２７℃で４〜７日間培養した後に培養上清を回収し、培養上清から組換えバキュロウイルスを得た。得られた組換えバキュロウイルスを、再度ｓｆ９細胞に感染させ、この感染細胞を７０〜７５ｃｍ２フラスコ中で４〜７日間培養した後に培養上清を回収し、培養上清から高濃度ウイルスを得た。
【０２５２】
〔３−２．ｈＭＡＴＥ１ポリペプチドの精製〕
２１枚の１×１０７細胞／ｄｉｓｈで培養したＨｉ−Ｆｉｖｅ ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ｈＭＡＴＥ１発現用ウイルスをＭＯＩ＝１にて感染させた。感染細胞を、２７℃で４８時間インキュベートした後に回収した。回収した細胞を、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０％グリセロール、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）１０ｍｌに懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、同一の緩衝液１０ｍｌに再度懸濁した。同じ操作を繰り返した（２回洗浄）。その後、同じ緩衝液１０ｍｌに懸濁した細胞を、超音波発生装置（ＴＯＭＹ ＵＤ２００）により破砕した。未破砕細胞を２０００ｒｐｍで８分間の遠心分離により除去し、得られた後の上清を、さらに４０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ−６０、６０Ｔ１ローター））した。得られた沈殿を、２％オクチルグリコシド、１０％グリセロール，１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含有する２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）３ｍｌに懸濁し、この懸濁液を氷上で３０分間放置した。続いて、ＴＬ−１００ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを用いて７００００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、可溶化されたＭＡＴＥ１粗標品を上清として得た。この粗標品にＮｉ−ＮＴＡ ｒｅｓｉｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を加えて４℃で４時間インキュベートした。樹脂を、１％オクチルグリコシド、１０％グリセロール，１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含有する２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）２０ｍｌで洗浄し、続いて、１％オクチルグリコシド、１０％グリセロール，１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含有する２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）３ｍｌ中でインキュベートし、１．３ｍｇの精製ｈＭＡＴＥ１ポリペプチドを得た（図１１）。
【０２５３】
図１１には、ｈＭＡＴＥ１の精製段階の各工程（Ｓは可溶化した昆虫細胞膜画分１００μｇ；Ｗ１、Ｗ２はそれぞれ洗浄した際の上清８０μｌ；Ｅは精製ｈＭＡＴＥ ２０μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｌはリポソームに再構成されたｈＭＡＴＥ ２０μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の一部をＳＤＳゲル電気泳動し、このゲルをＣＢＢ染色した結果を示す。図１１より、目的のｈＭＡＴＥポリペプチドをほぼ単一のタンパク質バンドとして精製したことがわかる。
【０２５４】
〔３−３．リポソーム組成物の生成〕
大豆リン脂質（Ｓｉｇｍａ ｔｙｐｅ ＩＩＳ）を、１０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ ＤＴＴ中に懸濁した（１０ｍｇ／ｍｌ）。この懸濁液をｂａｔｈ−ｔｙｐｅ ｓｏｎｉｃａｔｏｒで超音波処理し、均質な溶液を分注して−８０℃で保存した。
【０２５５】
保存した溶液の一部を溶解し、この溶液１５０μｌに対して１ｍｇの精製ｈＭＡＴＥ１（８００μｌ）を添加して激しく混和した。これらの混合液を−８０℃にて迅速に凍結し、１０分間保持した後に手中で溶解し、次いで、０．１Ｍ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴを含有する、氷冷した２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）２０ｍｌと迅速に混合した。この混合液を、４５０００ｒｐｍで１時間遠心分離し、再構成リポソームを沈殿として得た。この再構成リポソームを、０．１Ｍ 酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＤＴＴを含有する、氷冷した２０ｍＭ ＭＯＰＳ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）５００μｌに懸濁して、輸送実験に供した。
【０２５６】
〔３−４．ＭＡＴＥポリペプチドの輸送活性の測定〕
上述した再構成リポソーム（ＭＡＴＥポリペプチドを含有するリポソーム）４０μｌ（約１２μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ相当）を分取し、さらに、１ｍＭの１４Ｃ−ＴＥＡ（０．５μＣｉ）を含む緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０），０．１Ｍ酢酸カリウム、５ｍＭ酢酸マグネシウム）５４０μｌを添加することにより、測定を開始した。
【０２５７】
一定時間経過した後に反応液１５０μｌを採取し、セファデックスＧ５０を充填した１ｍｌのテルモシリンジにアプライし、速やかに２０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。シリンジより溶出した液（リポソームを含有する。）を一定量採取し液体シンチレーションカウンターにて放射能量を測定した（図１２）。なお、外液はシリンジ内にトラップされている。
【０２５８】
図１２に、輸送の経時変化を示した。外液のｐＨを変更することにより、リポソーム膜内外に形成されるｐＨ勾配の大きさを変化させることができる。図１２に示すように、ｐＨに依存したＴＥＡの取り込みが観察された。トランスポーターであるＭＡＴＥポリペプチドが存在しない場合は、放射活性はほとんど検出されない(バックグラウンドレベル)。
【０２５９】
〔４：排泄の最終段階のＯＣ輸送体として機能するＭＡＴＥ１〕
以上の結果に基づけば、ＭＡＴＥ１は、これまで長い間にわたって探索されてきた、腎臓および／または肝臓にてＯＣの排泄の最終段階を担うプロトン共役性ＯＣ輸送体であるといえる（図１３）。上記結果に基づけば、毒性を有するＯＣを生体内から排泄する機構に関与する輸送体の全貌を明らかにし得る。
【０２６０】
ＯＣは，肝臓の有機カチオン輸送体（ＯＣＴ１）または腎臓の尿細管でのＯＣＴ２によって取り込まれるが、取り込まれたＯＣが、ＭＡＴＥ１とＰ糖タンパク質との協奏反応によって細胞から排泄されることがわかった。競合阻害実験から、ＭＡＴＥ１は種々の代謝物を基質とし得ることもわかった。
【０２６１】
また、動植物〜細菌にわたって、ニコチンの輸送体についてはこれまで全く知られていなかったが、本発明によりＭＡＴＥ１がその機能を担うことが始めて明かされた。また、メラトニンやホルモンの輸送体についてもこれまで知られていないことから、ＭＡＴＥ１は臨床的にも非常に重要なタンパク質であるといえる。実際に、マウス肺胞上皮細胞の原形質膜（アピカル側）や脳血管にてＭＡＴＥポリペプチドが発現している（図１４および１５）。また、ヒト肺胞上皮細胞においてもｈＭＡＴＥ１の発現を確認している（図１６）。
【０２６２】
ＭＡＴＥポリペプチドは、皮膚、松果体等の様々な組織において老廃物の排泄以外の機能を有していることが分かった。皮膚においては、汗腺、皮脂腺等にＭＡＴＥ１が発現しており、薬物の経皮吸収、体臭に関わる物質の排泄等に関わっていることを示している（図１７）。メラトニンの分泌を通して概日リズムをコントロールしている松果体においても、ＭＡＴＥ１が発現していることが分かった（図１８）。このことは、ＭＡＴＥ１がメラトニンを輸送基質とすることを間接的に示しており、表１に示した結果を支持する。したがって、ＭＡＴＥ１は、松果体細胞でのメラトニントランスポーターであると考えられる。また、ヒトＭＡＴＥ１とマウスＭＡＴＥ１との相同性は非常に高いので、ヒトにおいても同様な役割を担っているものと推定される。
【０２６３】
さらに、マウスＭＡＴＥ２は、精巣においてテストステロン等のステロイドホルモンを分泌している精巣ライディッヒ細胞に特異的に発現していることが分かった（図１９）。このことは、ＭＡＴＥ２がステロイドホルモンを輸送することを間接的に示しており、表１に示した結果を支持する。したがって、ＭＡＴＥ２はステロイドホルモントランスポーターであると考えられる。ヒトＭＡＴＥ３とマウスＭＡＴＥ２との相同性も非常に高く、発現部位も類似しているので（図２０）、ヒトにおいても同様な役割を担っているものと推定される。
【０２６４】
さらに、植物フラボノイドであるケルセチンは、植物の液胞に蓄積されることが知られているが、その機能は不明である。本発明に従えば、植物において、ＭＡＴＥ１様輸送体が植物フラボノイドの輸送体として機能することが示唆される。
【０２６５】
ＭＡＴＥ１およびＭＡＴＥ２が腎臓、肝臓以外にも発現されていることから、ＭＡＴＥタイプの輸送体はＯＣ輸送体以外の機能を有することが示唆される。すなわち、ＭＡＴＥタイプの輸送体は、種々の大きさ、構造、疎水性を有する生理的代謝物の輸送を機能的に制御し、かつ生体内電解質の恒常性を維持する分子機構を担うと考えられる。
【０２６６】
１７ｑ１１．２染色体の異常によって生じる、多様性のある先天的な奇形および軽度の精神的発育遅延を呈するスミスマジェニス症候群において、欠損している約８０個の遺伝子の中にＭＡＴＥ遺伝子が含まれていることが知られている（例えば、非特許文献１６、１７を参照のこと）。スミスマジェニス症候群の患者はＨ＋／ＯＣ輸送体を欠いていると考えられるが、本発明に基づくさらなる研究によって本症候群における症状とＭＡＴＥファミリーとの関係を明らかにし得る。また、本発明に係る哺乳動物ＭＡＴＥ分子によって、生体内毒素、薬物および生体内代謝物の相互作用、遺伝子多型、ならびに遺伝子変異に関する研究が飛躍的に進歩し得る。またさらに、植物における、薬剤に対する耐性または内在性の毒性代謝物に対する耐性は、その植物におけるＭＡＴＥが関与していると考えられる。このように、ＭＡＴＥファミリーは、自然界における基本的なＯＣ輸送体であり、ＯＣおよびその関連化合物の排泄に広範な役割を担う。
【０２６７】
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２６８】
本発明を用いれば、これまで見出すことができなかった薬物および／または老廃物の排泄を調節する薬剤（例えば、医薬品、農薬など）をスクリーニングすることができるので、新たな医薬分野の発展に貢献し得る。また、本発明を用いれば、任意の薬剤の腎毒性および／または肝毒性を試験し得るので、医学／薬学における研究を推進し得るとともに研究ツールの開発に寄与し得る。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】図１は、ｈＭＡＴＥ１遺伝子、ｈＭＡＴＥ２遺伝子およびｈＭＡＴＥ３遺伝子の染色体上における位置および構成を示す図である。
【図２】図２は、ｈＭＡＴＥ１、ｈＭＡＴＥ２およびｈＭＡＴＥ３のアミノ酸配列とバクテリア由来のＮｏｒＭのアミノ酸配列とのアラインメントを示す図である。輸送活性に重要なＥ２７３は全てに保存されていることがわかる。
【図３】図３は、ｈＭＡＴＥ１の推定の２次構造を示すスキームである。図中、輸送活性に重要なグルタミン酸残基（Ｅ２７３）を丸で囲んだ。
【図４】図４（ａ）は、ｈＭＡＴＥ１遺伝子およびｈＭＡＴＥ２遺伝子のヒトにおける発現を調べたノーザンブロット解析の結果を示す図である。ｈＭＡＴＥ１遺伝子は、主に、腎臓、肝臓および骨格筋において発現されており、ｈＭＡＴＥ２遺伝子は、腎臓において発現されていることがわかる。図４（ｂ）は、抗ｈＭＡＴＥ１抗体を用いてｈＭＡＴＥ１の発現を確認したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。抗ｈＭＡＴＥ１抗体は、ＨＥＫ２９３細胞に発現させたｈＭＡＴＥ１を特異的に認識する。また、同一サイズのタンパク質が腎臓に存在し、抗ｈＭＡＴＥ１抗体によるこのタンパク質の検出が、抗原ペプチド（ｈＭＡＴＥ１のＮ４６１〜Ｒ５４６）によって吸収される。図４（ｃ）は、腎臓におけるｈＭＡＴＥ１の免疫組織化学の結果を示す図である。ヒト標本切片を、ＨＲＰ−ＤＡＢ法により染色した。図中、ＰＣＴは、近位尿細管、ＤＣＴは、遠位尿細管を示す。バーは１００μｍである。図４（ｄ）は、肝臓におけるｈＭＡＴＥ１の免疫組織化学の結果を示す図である。ヒト標本切片を、ＨＲＰ法により染色した。バーは１００μｍである。
【図５】図５は、ｍＭＡＴＥ１遺伝子およびｍＭＡＴＥ２遺伝子の染色体上における位置および構成を示す図である。
【図６】図６は、ｍＭＡＴＥ１およびｍＭＡＴＥ２のアミノ酸配列とｈＭＡＴＥ１のアミノ酸配列とのアラインメントを示す図である。図中、同一のアミノ酸にアスタリスクを付した。Ｅ２７３は、輸送活性に重要なアミノ酸であるグルタミン酸である。
【図７】図７（ａ）は、種々の臓器におけるｍＭＡＴＥ１遺伝子およびｍＭＡＴＥ２遺伝子の発現を調べたノーザンブロット解析の結果を示す図である。ｍＭＡＴＥ１遺伝子は、主に、腎臓および肝臓において発現されており、ｍＭＡＴＥ２遺伝子は、精巣において発現されていた。図７（ｂ）は、抗ｍＭＡＴＥ１抗体を用いてｍＭＡＴＥ１の発現を確認したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。抗ｍＭＡＴＥ１抗体は、ＨＥＫ２９３細胞に発現させたｍＭＡＴＥ１を特異的に認識する。また、同一サイズのタンパク質が腎臓および肝臓に存在する。図７（ｃ）は、腎臓におけるｍＭＡＴＥ１の免疫組織化学の結果を示す図である。マウス標本切片を、ＨＲＰ−ＤＡＢ法により染色した。ｍＭＡＴＥ１は腎皮質に発現されている。図中、ＧＬは糸球体を、ＰＣＴは近位尿細管を、ＤＣＴは遠位尿細管を、ＣＣＤは集合管を示す。バーは１００μｍである。図７（ｄ）は、腎臓におけるｍＭＡＴＥ１の免疫組織化学の結果を示す図である。マウス標本切片を、ＨＲＰ−ＤＡＢ法により染色した。ｍＭＡＴＥ１は腎髄質に発現されている。
【図８】図８（ａ）は、腎臓におけるｍＭＡＴＥ１の免疫電子顕微鏡像を示す図である。ｍＭＡＴＥ１は尿細管の表皮（膜部分）に存在している。図中、ＢＢＭは刷子縁膜を、ＢＭは基底膜を、Ｍはミトコンドリアを、Ｌは管腔を示す。バーは１μｍである。図８（ｂ）は、肝臓（毛細胆管膜）におけるｍＭＡＴＥ１の間接免疫蛍光顕微鏡像を示す図である。図８（ｃ）は、肝臓（胆管膜の表皮側）におけるｍＭＡＴＥ１の間接免疫蛍光顕微鏡像を示す図である。図中、ＢＤは小葉間胆管を、ＨＰＶは門脈を示す。バーは１０μｍである。
【図９】図９（ａ）は、ＨＥＫ２９３細胞に発現させたｈＭＡＴＥ１の野生型（Ｗｉｌｄ）、変異体（Ｅ２７３Ｑ）の免疫蛍光顕微鏡像を示す図である。図９（ｂ）は、図９ａで示した細胞におけるｐＨ８．０でのＴＥＡ（５０μＭ）の取り込みを経時的に観察した結果を示すグラフである。図９（ｃ）は、種々の濃度のＴＥＡ輸送を観察した結果を示すグラフである。ｈＭＡＴＥ１の野生型を発現する細胞における値からプラスミドのみ（Ｍｏｃｋ）をトランスフェクトした細胞における値を差し引いた。図９（ｄ）は、種々のｐＨにおけるＴＥＡ輸送を観察した結果を示すグラフである。図９（ｅ）は、ＴＥＡ輸送に対するＮａ＋の影響を示すグラフである。図９（ｆ）は、ＴＥＡの排泄に対するｐＨの影響を観察した結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＭＡＴＥ１がニコチン輸送体として機能することを示すグラフである。
【図１１】図１１は、バキュロウイルスの系を用いて精製したｈＭＡＴＥ１の各精製工程のサンプルを電気泳動したゲルをＣＢＢ染色した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、ＭＡＴＥポリペプチドを含有するリポソームを用いて測定したＴＥＡ輸送の経時変化を示した図である。
【図１３】図１３は、ＭＡＴＥ１がＯＣ排泄の最終段階を担う多剤輸送性のＯＣ輸送体であることを示すスキームである。肝臓において、肝細胞はｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅにて有機カチオン輸送体であるＯＣＴ１およびＯＣＴ２を介してＯＣを取り込み、ＭＡＴＥ１およびＭＤＲ１を介して胆汁中に排泄している。腎臓において、尿細管細胞にて主にＯＣＴ２によりＯＣは取り込まれており、ＭＡＴＥ１、ＭＤＲ１およびＯＣＴＮ２を介して排泄されている。
【図１４】図１４は、マウス肺胞上皮細胞におけるｍＭＡＴＥ１を蛍光染色した結果を示す図である。
【図１５】図１５は、脳毛細血管におけるｍＭＡＴＥ１を蛍光染色した結果を示す図である。図中、バーは１０μｍである。
【図１６】図１６は、ヒト肺胞上皮細胞におけるｈＭＡＴＥ１をＨＲＰ法で染色した結果を示す図である。図中、バーは１０μｍである。
【図１７】図１７は、皮膚におけるｍＭＡＴＥ１の局在を示す図である。皮脂腺にｍＭＡＴＥ１が存在していることがわかる。図中、バーは１０μｍである。
【図１８】図１８は、松果体におけるｍＭＡＴＥ１の局在を示す図である。松果体細胞にｍＭＡＴＥ１が存在していることがわかる。図中、バーは１０μｍである。
【図１９】図１９は、精巣ライディッヒ細胞の原形質膜におけるｍＭＡＴＥ２の局在を示す図である。図中、バーは１０μｍである。
【図２０】図２０は、精巣、骨格筋、腎臓および肝臓でのｈＭＡＴＥ３遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲ法で調べたものである。ｈＭＡＴＥ３遺伝子はｍＭＡＴＥ２と同様に精巣にのみ発現していることがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のポリペプチドを含有していることを特徴とする脂質膜：
・配列番号４または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号４または８に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
天然由来の脂質膜であることを特徴とする請求項１に記載の脂質膜。
【請求項３】
細胞膜または膜小胞であることを特徴とする請求項２に記載の脂質膜。
【請求項４】
人工の脂質膜であることを特徴とする請求項１に記載の脂質膜。
【請求項５】
脂質平面膜またはリポソームであることを特徴とする請求項４に記載の脂質膜。
【請求項６】
請求項１に記載の脂質膜を作製する方法であって、下記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターを用いる工程を包含することを特徴とする方法：
・配列番号４または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号４または８に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載の脂質膜を作製するためのキットであって、下記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターを備えていることを特徴とするキット：
・配列番号４または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号４または８に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【請求項１】
以下のポリペプチドを含有していることを特徴とする脂質膜：
・配列番号４または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号４または８に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
天然由来の脂質膜であることを特徴とする請求項１に記載の脂質膜。
【請求項３】
細胞膜または膜小胞であることを特徴とする請求項２に記載の脂質膜。
【請求項４】
人工の脂質膜であることを特徴とする請求項１に記載の脂質膜。
【請求項５】
脂質平面膜またはリポソームであることを特徴とする請求項４に記載の脂質膜。
【請求項６】
請求項１に記載の脂質膜を作製する方法であって、下記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターを用いる工程を包含することを特徴とする方法：
・配列番号４または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号４または８に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１に記載の脂質膜を作製するためのキットであって、下記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターを備えていることを特徴とするキット：
・配列番号４または８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
・配列番号４または８に示されるアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなりかつ細胞膜におけるトランスポーター活性を有するポリペプチド。
【図１０】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２００８−２２８５５（Ｐ２００８−２２８５５Ａ）
【公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２０３４９７（Ｐ２００７−２０３４９７）
【出願日】平成１９年８月３日（２００７．８．３）
【分割の表示】特願２００７−７１５３６（Ｐ２００７−７１５３６）の分割
【原出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月３日（２００７．８．３）
【分割の表示】特願２００７−７１５３６（Ｐ２００７−７１５３６）の分割
【原出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５０４１４７２４３）国立大学法人 岡山大学 (444)
【Ｆターム（参考）】
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