哺乳類の体内時刻の新規なインジケーター、及びその利用
【課題】哺乳類の血漿中に存在し体内時刻を指示する新規なインジケーター、及びその利用方法を提供すること。
【解決手段】哺乳類の血漿中に含まれ、その存在量が概日性の周期をもって変動をする、体内時刻のインジケーターであって、１）実施例の記載に従いＬＣ−ＭＳ分析をした結果取得される、表１中に示す代謝産物；及び、２）実施例の記載に従いＣＥ−ＭＳ分析をした結果取得される、表３中に示す代謝産物；からなる代謝産物群から選択される少なくとも一つのインジケーターと、その利用方法とを提供する。
【解決手段】哺乳類の血漿中に含まれ、その存在量が概日性の周期をもって変動をする、体内時刻のインジケーターであって、１）実施例の記載に従いＬＣ−ＭＳ分析をした結果取得される、表１中に示す代謝産物；及び、２）実施例の記載に従いＣＥ−ＭＳ分析をした結果取得される、表３中に示す代謝産物；からなる代謝産物群から選択される少なくとも一つのインジケーターと、その利用方法とを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の体内時刻の新規なインジケーター、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、概日時計（サーカディアンクロック）を有し、様々な生理学的プロセス及び代謝プロセスにおいて、内在的かつ自律振動型で２４時間以内の周期性を持つ振動が見られることが報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
哺乳類では、例えば、Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1、Cry2、RevErbA、Rora、Csnk1e、Csnk1d、及びFbxl3等の時計遺伝子が、中枢時計組織及び／又は末梢時計組織における、遺伝子の周期的な発現制御の少なくとも一部に関与していると報告されている（非特許文献２〜４）。
【０００４】
また、中枢時計組織及び／又は末梢時計組織における遺伝子発現の周期的な変動を反映して（非特許文献５〜８）、投与された薬剤の効用、及び／又は、毒性は、当該薬剤が投与された時点での体内時刻に依存することが報告されている（非特許文献９〜１３）。
【０００５】
すなわち、最適な体内時刻でヒトに投与された薬剤は、その効用が最大かつ毒性が最小となり、より良好な薬物治療の結果が得られうる（非特許文献１４）。対照的に、不適切な体内時刻でヒトに投与された薬剤は、酷い副作用を引き起こしうる（非特許文献１５）。
【０００６】
しかし、上記のように、体内時刻に基づいた治療（時間治療として知られる（非特許文献９〜１３））の重要性が認識されているにも関わらず、医療現場にて体内時刻を容易に測定できる方法が無いという問題のため、時間治療の普及が進んでいないという実情があった。
【０００７】
上記の問題を解決するため、本願発明者らは、既に分子時刻表法（molecular-timetable method）という概念を確立している（非特許文献１６）。分子時刻表法では、分子時刻表中に位置づけられた遺伝子の発現量の周期的な増減パターンをプロファイリングすることで、１日の中での体内時刻を知ることができる。具体的には、本願発明者らは、標的器官中での時計制御遺伝子（clock-controlled gene）の発現プロファイルを用いて、このコンセプトの正しさを証明済である（非特許文献１６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Dunlap JC, Loros JJ, DeCoursey PJ eds. (2004) Chronobiology: Biological timekeeping (Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachusetts, U.S.A).
【非特許文献２】Reppert SM, Weaver DR (2002) Coordination of circadian timing in mammals. Nature 418: 935-941.
【非特許文献３】Ueda HR (2007) Systems biology of mammalian circadian clocks. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 72: 365-380.
【非特許文献４】Takahashi JS, Hong HK, Ko CH, McDearmon EL (2008) The genetics of mammalian circadian order and disorder: Implications for physiology and disease. Nat Rev Genet 9: 764-775.
【非特許文献５】Akhtar RA et al. (2002) Circadian cycling of the mouse liver transcriptome, as revealed by cdna microarray, is driven by the suprachiasmatic nucleus. Curr Biol 12: 540-550.
【非特許文献６】Panda S et al. (2002) Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock. Cell 109: 307-320.
【非特許文献７】Storch KF et al. (2002) Extensive and divergent circadian gene expression in liver and heart. Nature 417: 78-83.
【非特許文献８】Ueda HR et al. (2002) A transcription factor response element for gene expression during circadian night. Nature 418: 534-539.
【非特許文献９】Halberg F (1969) Chronobiology. Annu Rev Physiol 31: 675-725.
【非特許文献１０】Labrecque G, Belanger PM (1991) Biological rhythms in the absorption, distribution, metabolism and excretion of drugs. Pharmacol Ther 52: 95-107.
【非特許文献１１】Lemmer B, Scheidel B, Behne S (1991) Chronopharmacokinetics and chronopharmacodynamics of cardiovascular active drugs. Propranolol, organic nitrates, nifedipine. Ann N Y Acad Sci 618: 166-181.
【非特許文献１２】Reinberg A, Halberg F (1971) Circadian chronopharmacology. Annu Rev Pharmacol 11: 455-492.
【非特許文献１３】Reinberg A, Smolensky M, Levi F (1983) Aspects of clinical chronopharmacology. Cephalalgia 3 Suppl 1: 69-78.
【非特許文献１４】Levi F, Zidani R, Misset JL (1997) Randomised multicentre trial of chronotherapy with oxaliplatin, fluorouracil, and folinic acid in metastatic colorectal cancer. International organization for cancer chronotherapy. Lancet 350: 681-686.
【非特許文献１５】Ohdo S, Koyanagi S, Suyama H, Higuchi S, Aramaki H (2001) Changing the dosing schedule minimizes the disruptive effects of interferon on clock function. Nat Med 7: 356-360.
【非特許文献１６】Ueda HR et al. (2004) Molecular-timetable methods for detection of body time and rhythm disorders from single-time-point genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 11227-11232.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、標的器官中（例えば、肝臓中）での遺伝子発現のプロファイルから体内時刻を推測する方法は、医療現場への応用が困難である。その理由は、遺伝子発現のプロファイルを取得するために標的器官からサンプルを採取する必要が生じ、手間が非常にかかる上、患者の身体的な負担も大きくなるためである。
【００１０】
一方、哺乳類の血液中に含まれる、代謝産物（metabolite）、ホルモン等の低分子化学物質の中には、概日性の周期振動を示すものがあるらしいことが報告されている。例えば、ステロイドホルモンの一種であるコルチコステロンの濃度は、ピークが夕刻となるような周期性をもって概日時計により制御されるとの報告がある（参考文献：Kennaway DJ, Owens JA, Voultsios A, Varcoe TJ (2006) Functional central rhythmicity and light entrainment, but not liver and muscle rhythmicity, are clock independent. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 291: R1172-1180.）。また、アミン由来のホルモンであるメラトニンは、マウスでは、早朝にピークを持つ概日周期を示す（参考文献：Kennaway DJ, Voultsios A, Varcoe TJ, Moyer RW (2002) Melatonin in mice: Rhythms, response to light, adrenergic stimulation, and metabolism. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 282: R358-365.）。
【００１１】
ヒトでは、数種のペプチドホルモンのレベルが１日を通じて変化することが知られ、例えば、成長ホルモンのレベルが睡眠中に増加すること（参考文献：Takahashi Y, Kipnis DM, Daughaday WH (1968) Growth hormone secretion during sleep. J Clin Invest 47: 2079-2090.）、レプチンのレベルが夕方の間に増加すること（参考文献：Schoeller DA, Cella LK, Sinha MK, Caro JF (1997) Entrainment of the diurnal rhythm of plasma leptin to meal timing. J Clin Invest 100: 1882-1887.）、及びプロラクチンのレベルが夜中に増加することの報告がある（参考文献：Kok P et al. (2006) Increased circadian prolactin release is blunted after body weight loss in obese premenopausal women. Am J Physiol Endocrinol Metab 290: E218-224.）。また、アミノ酸である、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、システイン、グルタチオン、及びホモシステインの濃度は、ヒトの血漿中で、一日を通じて変化するとの報告がある（参考文献：（１）Breum L, Rasmussen MH, Hilsted J, Fernstrom JD (2003) Twenty-four-hour plasma tryptophan concentrations and ratios are below normal in obese subjects and are not normalized by substantial weight reduction. Am J Clin Nutr 77: 1112-1118.（２）Forslund AH et al. (2000) Inverse relationship between protein intake and plasma free amino acids in healthy men at physical exercise. Am J Physiol Endocrinol Metab 278: E857-867.（３）Blanco RA et al. (2007) Diurnal variation in glutathione and cysteine redox states in human plasma. Am J Clin Nutr 86: 1016-1023.（４）Bonsch D et al. (2007) Daily variations of homocysteine concentration may influence methylation of DNA in normal healthy individuals. Chronobiol Int 24: 315-326.）。
【００１２】
しかしながら、哺乳類の血液中の化学物質を用いて体内時刻に関連する情報を十分な精度で推測する方法は、今日まで確立されていない。その理由として、血液中の化学物質に関して、その存在量の周期的変動に関する包括的なプロファイリングの報告がなく、１）血液中の化学物質の中に体内時刻の測定に使用しうるほど正確な概日周期を示すものがあるかについてそもそも解明されていない点、及び、２）それゆえ、どの化学物質が体内時刻の測定に使用可能なほど正確な概日周期を示すのか全く知見がない点、が挙げられる。なお、体内時刻の測定に普遍的に使用できる化学物質には、性別、年齢、遺伝的背景、及び栄養摂取の状態などに左右されず、概日周期を持つ量的変化を示すものが特に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を解決するために、本願発明者らは血液サンプル中に含まれる化学物質を用いて体内時刻に関連する情報の推定が出来るか否かについて鋭意検討を行った。その結果、哺乳類の血液中の血漿成分に含まれる所定の代謝産物の存在量が、体内時刻の測定に使用可能な正確さをもって周期的に変動しており、当該代謝産物が体内時刻のインジケーターとなりうることを初めて見出し、本願発明に想到するに至った。
【００１４】
すなわち、本願発明に係る哺乳類における体内時刻のずれの検出方法は、上記の課題を解決するために、哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血液中の血漿に含まれる代謝産物の量を測定する工程と、当該代謝産物の量の経時的な変化のパターンに基づき哺乳類の体内時刻（ここでは、経時的な変化のパターンを取得したものと同じ代謝産物に基づき推定された体内時刻が好ましい）のずれを検出する工程とを含み、当該代謝産物が、１−メチルニコチンアミド、グアニドアセテート、カルニチン、シチジン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、グリシン、クレアチン、Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン、メチオニンスルホキシド、グルタミン、トレオニン、サルコシン、トレオニン（１３Ｃ）、プロリン、バリン、オルニチン、クレアチニン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート、α−アミノアジペート、シトルリン、４−グアニジノブチレート、トリメチルアミンＮ−オキシド、リゾフォスファチジルコリン(１８：１)、リゾフォスファチジルコリン(２０：４)、リゾフォスファチジルコリン(２０：３)、リゾフォスファチジルコリン(２０：２)、リゾフォスファチジルコリン(１８：３)、リゾフォスファチジルコリン(２２：６)、リゾフォスファチジルコリン(２２：５)、及びリゾフォスファチジルコリン(２２：４)（ここで、各リゾフォスファチジルコリンの後段に括弧書きで示す数字は、順に、脂肪酸の部分を構成する炭素原子の数と、不飽和結合を有する炭素原子の数とを示す）からなる代謝産物群より選択される少なくとも一つの代謝産物であることを特徴としている。
【００１５】
本願発明に係る体内時刻のずれの検出方法は、また、検査対象となる哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血液中の血漿に含まれる代謝産物の量を測定する工程と、代謝産物の量の経時的な変化のパターンを、検査対象となる哺乳類と同種の基準となる哺乳類の血漿に含まれる当該代謝産物の量の経時的な変化のパターンと比較して、パターンのずれの程度を取得する工程とを含み、上記した代謝産物群より選択される少なくとも一つの代謝産物を指標とすることを特徴としている。
【００１６】
上記のいずれかの方法によれば、哺乳類が有する概日リズムの変調のひとつの指標となる、当該哺乳類の体内時刻のずれを正確に把握することが可能となる。
【００１７】
本発明に係る体内時刻のずれの検出方法は、さらに、上記代謝産物が、カルニチン、シチジン、グリシン、サルコシン、バリン、イソロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート、４−グアニジノブチレート、及びトリメチルアミンＮ−オキシドからなる代謝産物群より選択される少なくとも一つの代謝産物であることがより好ましい。
【００１８】
上記の方法によれば、哺乳類が有する概日リズムの変調のひとつの指標となる、当該哺乳類の体内時刻のずれをより一層正確に把握することが可能となる。
【００１９】
本願発明に係る哺乳類における体内時刻のずれの検出方法は、上記の課題を解決するために、検査対象となる哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血液中の血漿に含まれる代謝産物の量を測定する工程と、代謝産物の量の経時的な変化のパターンを、検査対象となる哺乳類と同種の基準となる哺乳類の血漿に含まれる当該代謝産物の量の経時的な変化のパターンと比較して、パターンのずれの程度を取得する工程とを含み、上記代謝産物が、１）実施例の記載に従いＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析計）による解析をした結果取得される、表１中の１番目〜１４２番目（陽イオンモード）、及び１番目〜１７６番目（陰イオンモード）に示す代謝産物；、及び、２）実施例の記載に従いＣＥ−ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析計）による解析をした結果取得される、表３中の１番目〜１５３番目に示す代謝産物；からなる代謝産物群から選択される、少なくとも一つの代謝産物であることを特徴としている。なお、本発明において「〜」とは「から」の意味である。
【００２０】
本願発明に係る哺乳類における体内時刻のずれの検出方法では、より一層正確な検出を実現する観点から、さらに、上記代謝産物として、上記代謝産物群を構成する全ての代謝産物を用いることがより好ましい。
【００２１】
上記の方法によれば、哺乳類が有する概日リズムの変調のひとつの指標となる、当該哺乳類の体内時刻のずれを正確に把握することが可能となる。
【００２２】
本願発明に係る哺乳類における体内時刻のずれの検出方法では、より一層正確な検出を実現する観点から、さらに、上記パターンのずれの程度を、上記代謝産物の量が最大となる時刻、又は最小となる時刻の少なくとも一方を基準として取得することがより好ましい。
【００２３】
本願発明に係る哺乳類における体内時刻のずれの検出方法では、さらに、サンプリングを行うための１日内の異なる複数の時点が、４時間おきの６時点であってもよい。
【００２４】
本願発明に係る概日リズムの変調の有無の検査方法は、上記の課題を解決するために、上記した体内時刻のずれの検出方法により検出された体内時刻のずれが所定の範囲を越える場合に、検査対象となる哺乳類が概日リズムに変調をきたしていると判定する工程を含むことを特徴としている。
【００２５】
本願発明に係る体内時刻のインジケーターは、上記の課題を解決するために、１）実施例の記載に従いＬＣ−ＭＳ分析をした結果取得される、表１中の１番目〜１４２番目（陽イオンモード）、及び１番目〜１７６番目（陰イオンモード）に示す代謝産物；及び、２）実施例の記載に従いＣＥ−ＭＳ分析をした結果取得される、表３中の１番目〜１５３番目に示す代謝産物；からなる代謝産物群から選択される少なくとも一つであることを特徴としている。
【００２６】
本願発明に係る哺乳類の体内時刻測定キットは、上記の課題を解決するために、哺乳類の採血を行なう採血器具と、上記の体内時刻のインジケーターの血漿中における量を定量する定量手段と、を備えることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、哺乳類の血漿中に含まれる特定の代謝産物を体内時刻のインジケーターとして用いるため、当該哺乳類の体内時刻に係る情報がより容易に取得可能となるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】（ａ）〜（ｃ）は、本発明の実施例に関し、マウスの血漿中における代謝産物量が示す概日周期性の変動を表す図である。
【図２】（ａ）及び（ｂ）は、本発明の実施例に関し、マウスの体内時刻の推定の結果を示す図である。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、本発明の実施例に関し、図２に示すマウスとは系統（遺伝的背景）が異なるマウスでの体内時刻の推定の結果を示す図である。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、本発明の実施例に関し、週齢及び性別が異なるマウスでの体内時刻の推定の結果を示す図である。
【図５】（ａ）〜（ｃ）は、本発明の実施例に関し、時差ぼけ状態にあるマウスでの体内時刻の推定の結果等を示す図である。
【図６】（ａ）〜（ｄ）は、本発明の実施例に関し、ＣＥ−ＭＳ分析の結果に基づき作成した代謝産物時刻表（（ａ）・（ｂ））、及び体内時刻の推定の結果（（ｃ）・（ｄ））を示す図である。
【図７】本発明の実施例に関し、給餌環境が相違するマウスでの体内時刻の推定の結果を示す図である。
【図８】（ａ）〜（ｄ）は、本発明の実施例に関し、図６に示すものより厳格な基準でのＣＥ−ＭＳ分析に基づき作成した代謝産物時刻表（（ａ）・（ｂ））、及び体内時刻の推定の結果（（ｃ）・（ｄ））を示す図である。
【図９】本発明の実施例に関し、ＣＥ−ＭＳ分析の結果に基づき具体的な名称が特定された２８種類の代謝産物量の概日周期性の変動を表す図である。
【図１０】本発明の実施例に関し、ＬＣ−ＭＳ分析の結果に基づき具体的な名称が特定された代謝産物量の概日周期性の変動を表す図である。
【図１１】本発明の実施例に関し、ＬＣ−ＭＳ分析で得られた振動ピークのうち、代謝産物時刻表の作成に使用したピーク数と、推定された体内時刻との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００３０】
本発明は、哺乳類の血漿中に含まれる特定の代謝産物の存在量が、概日周期をもって変化する（振動する）ことを新規に見出したことに基づきなされたものである。
【００３１】
特に、対象となる哺乳類の遺伝的背景の相違、週齢、性別、食事環境（給餌環境）等の要因に左右されることなく、血漿中に含まれる特定の代謝産物が、当該哺乳類の体内時刻を示すインジケーターとして好適に利用できることを新規に見出したことに基づきなされたものである。
【００３２】
本発明において「哺乳類」の種類は特に限定されないが、ラット、ウサギ、マウス、ヤギ、サルその他の実験動物や、ヒト等が例示され、中でもヒトが好ましい。また、ヒトの中でも、後述する概日リズム障害の発症危険度の高い、或いは既に発症している蓋然性が高いヒトがより好ましい。
【００３３】
また、「概日、又は概日性（の周期、又はリズム）」とは、生物が内在的に概ね２４時間（２０時間から２８時間）で１サイクルする周期性を有することを指し、より好ましくは２２時間から２６時間で１サイクルの周期性を有することを指す。従って、上記のインジケーターが「概日性の振動」を示すとは、血漿中における当該インジケーターの存在量（血中での代謝量）が概日性の周期をもって変動することと同義である。
【００３４】
また、「概日リズム障害」とは、広義には、概日リズムの異常に起因する不調全般を指し、具体的には、例えば、家族性の睡眠相前進症候群（ADVANCED SLEEP PHASE SYNDROME）を含む睡眠覚醒リズム障害、季節性うつ病、時差ぼけ、等が挙げられる。
【００３５】
また、「体内時刻（体内時刻：Body time又はＢＴ）」とは、生物が内在的に有するいわゆる体内時計（生物時計）に基づく時刻を指す。
【００３６】
また、「代謝産物」とは、哺乳類の体内での代謝反応における中間産物、及び最終生成物を指す通常の意味で用いており、一次代謝物、及び二次代謝物の双方を含む概念である。さらに、天然に存在する同位体を含む代謝産物、及び同位元素等で人工的に標識された化合物の代謝産物も含まれる。
【００３７】
また、「ＺＴ（ツァイトゲーバー時刻）」とは、明暗条件（ＬＤ条件と同義；照明１２時間、暗１２時間）下における照明（点灯）開始時をＺＴ０時とした２４時間周期の時間体系を指す。すなわち、明条件（照明点灯）はＺＴ０〜ＺＴ１２まで継続し、暗条件（照明消灯）はＺＴ１２〜ＺＴ２４まで継続する。
【００３８】
また、「ＣＴ（概日時刻）」とは、哺乳類にＬＤ条件を体験させた後、引き続いて恒暗条件（ＤＤ条件と同義）を体験させた場合の、恒暗条件開始時をＣＴ０時とした２４時間周期の時間体系を指す。すなわち、ＣＴ０は、ＤＤ条件に移行せずにそのままＬＤ条件を継続させたと仮定した場合のＺＴ０に相当する時刻である。
【００３９】
また、「分子ピーク時刻、又は分子時刻」とは、後述する体内時刻のインジケーターの血漿中における存在量が極大になる時刻（ＺＴ時刻体系、ＣＴ時刻体系、又は環境時刻体系における時刻）を指す。
【００４０】
なお、本発明において、「Ａ及び／又はＢ」とは、Ａ及びＢ、或いはＡ又はＢ、の双方を指す意味で用いる。
【００４１】
〔本発明に係る体内時刻のインジケーター〕
上記インジケーターとは、哺乳類の血漿中に含まれ、その存在量が概日性の周期をもって変動をするために、当該存在量を経時的に観察することで、その哺乳類の体内時刻を指し示すインジケーターとなる代謝産物を指す。すなわち、血漿中における当該インジケーターの存在量を測定すれば、対象となる哺乳類の体内時刻、及び体内時刻のずれを推定することができる。例えば、測定されたインジケーターの存在量を、後述する〔体内時刻のずれの検出方法、及び概日リズムの変調の検査方法〕の工程Ｂの説明で記載する「基準パターン１」又は「基準パターン２」と照合して、体内時刻、及び体内時刻のずれを推定することができる。
【００４２】
本発明に係るインジケーターは、具体的には、血漿中に含まれる以下の物質を指す。
１）実施例の記載に従いＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析計）による計測をした結果取得される、後述の表１中の１番目〜１４２番目（陽イオンモード）、及び１番目〜１７６番目（陰イオンモード）に示す代謝産物；及び、
２）実施例の記載に従いＣＥ−ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析計）による計測をした結果取得される、後述の表３中の１番目〜１５３番目に示す代謝産物；
からなる代謝産物群（「代謝産物群１」と称する）から選択される少なくとも一つのインジケーター。
【００４３】
上記１）に含まれる代謝産物では、具体的に化合物名が特定されているものが、血漿中における当該代謝産物の存在量の検出がより容易なため好ましい。これらの代謝産物としては、リゾフォスファチジルコリン（LysoPC）（18:1）、LysoPC（20：4）、LysoPC（20：3）、LysoPC（20：2）、LysoPC（18：3）、LysoPC（22：6）、LysoPC（22：5）、LysoPC（22：4）からなる代謝産物群（「代謝産物群２」と称する）から選択される少なくとも一つ、好ましくは全てのインジケーターが挙げられる。なお、各LysoPCの後段に付した括弧書きの記載は、順に、脂肪酸の部分を構成する炭素原子の数と、不飽和結合を有する炭素原子の数（不飽和度）とを表す。
【００４４】
また、上記２）に含まれる代謝産物の中では、よりいっそう正確なインジケーターになりうるとの観点から、表３中に示すＦＤＲが０．０１以下であるものが特に好ましい。この条件を満たすインジケーターは、具体的には、表３中の１番目〜４４番目に示す代謝産物群から選択される少なくとも一つ、好ましくは全てのインジケーターである。
【００４５】
さらに、上記２）に含まれる代謝産物の中では、具体的に化合物名が特定されているものが、血漿中における当該代謝産物の存在量の検出がより容易なため好ましい。これらの代謝産物としては、具体的には、１−メチルニコチンアミド、グアニドアセテート（グアニド酢酸エステル）、カルニチン、シチジン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、グリシン、クレアチン、Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン、メチオニンスルホキシド、グルタミン、トレオニン、サルコシン、トレオニン（１３Ｃ）、プロリン、バリン、オルニチン、クレアチニン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート（２−アミノブチルエステル）、α−アミノアジペート（α−アミノアジピン酸塩）、シトルリン、４−グアニジノブチレート（４−グアニジノブチルエステル）、及びトリメチルアミンＮ−オキシドからなる２８種類の代謝産物群（「代謝産物群３」と称する）から選択される少なくとも一つ、好ましくは全てのインジケーターが挙げられ、この中でも、表３中に示すＦＤＲが０．０１以下である上記条件を満たす、カルニチン、シチジン、グリシン、サルコシン、バリン、イソロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート、４−グアニジノブチレート、及びトリメチルアミンＮ−オキシドからなる１０種類の代謝産物群（「代謝産物群４」と称する）より選択される少なくとも一つ、好ましくは全てのインジケーターが特に好ましい。
【００４６】
なお、言及するまでもないが、表１及び表３に示す代謝産物は何れも、少なくとも実施例の記載の方法に従えば確実に検出することができるものだから、本発明に係る体内時刻のインジケーターとして当然に用いることができる。
【００４７】
〔体内時刻のずれの検出方法、及び概日リズムの変調の検査方法〕
本発明にかかる「体内時刻のずれの検出方法」の一例は、哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血漿に含まれる、代謝産物の量を測定する工程（工程Ａと称する）と、次いで、当該代謝産物の量の経時的な変化のパターンに基づき哺乳類の体内時刻のずれを検出する工程（工程Ｂと称する）と、を含んでなり、ここで測定対象となる代謝産物が、上記説明の「体内時刻のインジケーター」から選択されるものである。
【００４８】
ここで、工程Ａに関して、哺乳類から血漿をサンプリングする方法は、血液を採取し血漿を抽出するための公知の方法を採用すればよい。また、「１日内の異なる複数の時点でサンプリングする」とは、１日内に少なくとも２回以上のサンプリングをすることを指し、より好ましくは４回以上、さらに好ましくは６回以上のサンプリングをすることを指す。測定の精度を向上させるため、サンプリングの間隔を一定にすることが好ましい。例えば、１日内に４回サンプリングするときは６時間おきに、６回サンプリングするときは４時間おきに行なうことが好ましい。２点の場合は１２時間間隔で行う。なお、検出の精度を向上させるためは、サンプリングの間隔をそれぞれ４時間以内とすることが好ましい。
【００４９】
また、工程Ａに関して、「代謝産物の量を測定する方法」は特に限定されるものではなく、公知のいずれの方法を採用してもよい。具体的には例えば、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析計）分析、ＣＥ−ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析計）分析、ＧＣ／ＭＳ（ガスクロマトグラフィー／質量分析計）分析等の一般的なメタボローム解析に用いる手法（実施例も参照）；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を単独で使用する方法；ラジオイミュノアッセイ、ＥＬＩＺＡ法（エライザ法）等の免疫学的手法；を例示することができる。なお、多数（例えば、１０種以上）の代謝産物の量を同時に測定する場合には、ＬＣ−ＭＳ分析、ＣＥ−ＭＳ分析、ＧＣ／ＭＳ分析等の一般的なメタボローム解析に用いる手法を用いることがより好ましく、１又は少数（例えば、９種以下、より好ましくは１〜５種）の代謝産物の量を同時に測定する場合には、各代謝産物の量を個別に測定可能な免疫学的手法、又は高速液体クロマトグラフィーを単独で使用する方法、等がより好ましい。
【００５０】
なお、上記工程Ａは、後述する〔体内時刻のずれの検出方法、及び概日リズムの変調の検査方法〕の工程Ｂの説明で記載する「基準パターン１」又は「基準パターン２」を作成するための工程であってもよい。或いは、工程Ａは、「体内時刻」又は「体内時刻のずれ」の検出対象となる哺乳類自身（検査対象となる哺乳類）の血漿を対象として行なわれる工程であってもよい。後述の「代謝産物時刻表法」（実施例参照）に基づけば、検査対象となる哺乳類の血液（血漿）は少なくとも一時点で採取すればよいが、複数時点で採取してもよく、或いは、「代謝産物時刻表法」以外の方法に基づき「体内時刻」又は「体内時刻のずれ」を検出する場合には、検査対象となる哺乳類の血液（血漿）は複数時点で採取する必要もありえる。
【００５１】
工程Ｂに関して、「代謝産物の量の経時的な変化のパターン」とは、例えば、サンプリングした複数の時刻と、当該時刻における血漿中の代謝産物の量との関係を示すものであればよく、特に限定されないが、例えば、サンプリングした時刻と当該時刻における代謝産物の量との関係を示すグラフ等が例示される。ここで、「代謝産物の量」は実測値であってもよいし、当該実測値を正規化（ノーマライゼーション）したものであってもよい。また、一定の周期性をもって振動している物質の振動のパターンを、当該パターンに類似したコサイン曲線（余弦波）で表現したものを用いることもできる（参考文献：Ueda HR et al. (2004) Molecular-timetable methods for detection of body time and rhythm disorders from single-time-point genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 11227-11232.）。
【００５２】
また、工程Ｂに関して、「代謝産物の量の経時的な変化のパターン」に基づいて「哺乳類の体内時刻のずれを検出する」方法は特に限定されるものではないが、
１）検査対象となる哺乳類自身が平常時にあるときに、予め、血漿中の代謝産物の量の経時的な（すなわち環境時刻と対応させた）変化のパターン（「基準パターン１」と称する）を測定しておき、当該基準パターン１と、検査時に取得した当該代謝産物の量の変化のパターンとを比較して、両パターンのずれの程度を体内時刻のずれとして検出する方法、
２）検査対象となる哺乳類における上記「代謝産物の量の経時的な変化のパターン」を、検査対象となる哺乳類と同種の、基準となる哺乳類の血漿に含まれる当該代謝産物の量の経時的な変化のパターン（「基準パターン２」と称する）と比較して、パターンのずれの程度を体内時刻のずれとして検出する方法、
等が例示される。なお、基準パターン２の取得に際しては、平常時にある当該哺乳類を複数個体用いて、測定した代謝産物の量の平均値を採用することがより一層の正確性を期する上でより好ましい。
【００５３】
また、工程Ｂに関しては、１種類の代謝産物（インジケーター）のみを用いることもできるが、複数種類の代謝産物を用いることが、検出結果のより一層の正確性を期するという観点ではより好ましく、さらには、「インジケーター」の項目で説明した「代謝産物群１」、「代謝産物群２」、「代謝産物群３」、及び「代謝産物群４」の何れかの代謝産物群を構成する全ての代謝産物を用いることが特に好ましい。特に、後述する「代謝産物時刻表法」を採用する場合には、必要とされる検出精度にも依存するが、２０種類以上の上記代謝産物を用いることが好ましい（実施例も参照のこと）。
【００５４】
さらには、より容易かつ正確にパターン同士の比較が出来るという観点からは、工程Ｂに関して、前記「パターンのずれの程度」を、血漿中に含まれる代謝産物の量が最大となる時刻（分子ピーク時刻、又は分子時刻に相当）、又は最小となる時刻の少なくとも一方を基準として取得することがより好ましく、血漿中に含まれる代謝産物の量が最大となる時刻を基準とすることが特に好ましい。一例としては、検査対象となる哺乳類での或る代謝産物Ａの分子ピーク時刻と、基準となる哺乳類での代謝産物Ａの分子ピーク時刻とのずれを、前記「パターンのずれの程度」として検出することができる。
【００５５】
また、複数の代謝産物（インジケーター）を用いる場合、分子ピーク時刻が互いに異なるものを選択することが好ましい。なお、各代謝産物の分子ピーク時刻は、表１及び表３中に「Peak Time(h)」として示したものである。分子ピーク時刻に基づいて代謝産物を選択する方法は、特に限定されないが、例えば、１日（２４時間）を均等分割して、各分割時間幅に分子ピーク時刻が入る代謝産物から少なくとも一種類ずつ選択すればよい。例えば、１日を１２分割する場合、表１及び表３に示す分子ピーク時刻が０〜２ｈの代謝産物から少なくとも一種、同時刻が２〜４ｈの代謝産物から少なくとも一種、同時刻が４〜６ｈの代謝産物から少なくとも一種、以下同様にして、同時刻が２２〜２４ｈの代謝産物から少なくとも一種、選択すればよい。なお、均等分割の方式は、特に限定されないが、検出の精度を向上させるため少なくとも１日を６分割以上とすることが好ましい。
【００５６】
工程Ｂにて検出された「体内時刻のずれ」は、概日リズムの変調の有無、概日リズム障害の発症有無、又は発症のリスクを検出する上でひとつの重要な指標となりうる。すなわち「体内時刻のずれ」が実質的に検出されない（ずれが実質的に０である）、或いは、体内時刻のずれが所定の範囲内に収まっている場合には、検査対象の哺乳類は概日リズムに実質的な変調をきたしていない（すなわち、概日リズム障害を発症していない蓋然性がより高い、又は近い将来に概日リズム障害を発症するリスクがより少ない）と判定することができる。
【００５７】
一方、上記「体内時刻のずれ」が所定の範囲外である場合には、検査対象となっている哺乳類はその概日リズムに変調をきたしている（例えば、概日リズム障害を既に発症している、又は近い将来に概日リズム障害を発症するリスクを有する）と判定することができる。なお、上記「体内時刻のずれの所定の範囲」は、検査対象となる哺乳類の種類、検査に求められる精度等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、１時間以内、２時間以内、又は４時間以内である。
【００５８】
〔その他の応用〕
本発明にかかる「哺乳類の体内時刻測定キット」は、少なくとも、哺乳類の採血を行うための採血器具と、上記したインジケーターの血漿中における存在量を測定する測定手段（定量手段）とを備える。ここで、「採血器具」は、注射器などの公知のものを適宜使用することができる。また、「測定手段（定量手段）」は、対象となるインジケーターの種類に応じて公知の手段を使用することができ、例えば、当該インジケーター用のＥＬＩＺＡキット等が例示される。
【００５９】
また、上記体内時刻測定キットは、必要に応じて、キットの取扱説明書、採血を行った又は行うべき時刻を記憶する機能を有するタイムキーパー（ストップウォッチ機能及び／又はタイマー機能付の時計等）等をさらに備えていてもよい。また、当該体内時刻測定キットは、概日リズム障害の検出キットとしても利用可能である。
【００６０】
さらに、本発明にかかる体内時刻のインジケーターを用いれば、後述する代謝産物時刻表の作成（実施例参照）や、検査対象となる哺乳類の体内時刻の推定を従来よりも容易に行うことができ、日常の健康保持増進、及びいわゆる時間治療への応用可能性がより一層高まる。すなわち、哺乳類の特定の組織における遺伝子発現量の周期的な変化から体内時刻を推定する方法と比較して、本発明は、解析対象となるサンプル（血漿）の取得が容易であり、かつ週（年）齢、性別、遺伝的背景及び給餌環境（ヒトの場合、食事環境）の影響を受けにくいという特性を有している。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、初めに、本発明に用いた材料（実験動物）、及び方法について、以下の（１）〜（１４）にまとめて説明する。
【００６２】
（１）実験動物
ＣＢＡ／Ｎマウスは、日本ＳＬＣ株式会社（静岡, 日本）より購入した。５〜６週齢のオスのマウス（以下若いオスと称する）、同週齢のメスのマウス（若いメスと称する）、及び繁殖からリタイアさせた約６ヶ月齢の老齢のオスのマウス（老齢オスと称する）を準備した。オスのＣ５７Ｂｌ／６マウス（５〜６週齢）は、チャールズ・リーバー社（Charles River（横浜，日本））から購入した。
【００６３】
上記の全マウスは、明暗（ＬＤと称する；照明１２時間，暗１２時間）条件下で２週間、ペレット状の餌（ＣＲＦ−１，チャールズ・リーバー社）及び水を無制限に与えて飼育した。
【００６４】
Ｃｒｙ１遺伝子とＣｒｙ２遺伝子を両方欠損したマウス（Ｃｒｙ１,Ｃｒｙ２ｄK．O．）マウスは、元々、安井明博士 及びvan der Horst博士により作成された（参考文献：van der Horst GT et al. (1999) Mammalian cry1 and cry2 are essential for maintenance of circadian rhythms. Nature 398: 627-630.）。東北大学で維持されていたマウスの一部を理化学研究所発生・再生科学総合研究センターに移入し、同所で維持及び繁殖を行った。
【００６５】
（２）サンプリングのスケジュール
マウス血漿のサンプリングは、ＬＤ及びＤＤ（恒暗）条件下の双方で行った。ＤＤ条件下でのサンプリングでは、サンプリングを開始する日から、飼育室を恒暗条件に変更した。サンプリングはＺＴ０又はＣＴ０に開始し、ノボヘパリン（持田製薬株式会社，東京，日本）を含んだチューブ中に、４時間ごと２日間にわたりに（すなわち全部で１２サンプル）体幹血を採取した。なお、ＺＴ０とは明期の始まりを、ＣＴ０とは主観的な明期（恒暗条件において本来明期に相当する期間、subjective day）の始まりを表す。給餌状態を変えた実験の場合、サンプリング開始の１日前の消灯時点で、飼育ケージからペレット状の餌を取り除き、マウスを絶食状態とした。これらマウスは、体幹血の採取が終了するまで絶食状態を保った。サンプリングは、ＺＴ４(照明点灯後４時間)の時点で開始し、翌日のＺＴ０の時点で終了した(６時点／日)。体重の減少量を把握するため、マウスを処置する直前に当該マウスの体重測定を行なった（データ示さず）。血漿を濃縮するため、サンプリングした血液を、４°Ｃで５分間、１０００ｇの条件で２回、遠心分離した。上清（血漿サンプル）を回収し、ラジオイミュノアッセイ又はメタボローム解析（すなわち、ＬＣ−ＭＳ分析、及びＣＥ−ＭＳ分析）を行うまで、−８０℃で凍結保存した。
【００６６】
（３）時差ぼけ（jet-lag）実験
若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスを、ＬＤ条件下で２週間飼育した。次いで、照明を行なう時刻を、本来明かりがつく時間から８時間前倒しに点灯するようにし、ＬＤ条件を８時間前倒しにした（この日を第１日とする）。マウスを処置しその体幹血を、第１日、第５日、及び第１４日にサンプリングした。マウスの行動は、近赤外モニタリングシステム(NS-AS01,ニューロサイエンス社, 東京, 日本)により観察し、その観察結果をClockLab software（アクチメトリクス社（Actimetrix Inc.）, NW, 米国）を用いて可視化した。
【００６７】
（４）ＬＣ−ＭＳサンプル
上記血漿サンプルにアセトニトリル(225 μL)を加えて振とうした後、遠心分離を行なった。遠心分離で得られた上清を、新しいチューブに移して乾燥した。ＬＣ−ＭＳによる代謝産物の分析を行なう前に、当該乾燥したサンプルにアセトニトリル(25 μL)を加えて分析に供した。
【００６８】
（５）ＬＣ−ＭＳ条件
使用したＬＣシステムはAgilent 1100 series HPLC(アジレント・テクノロジーズ社, パロ・アルト, カリフォルニア, 米国)である。ZORBAX SB-C18 RRHT (φ2.1 50 mm, 1.8 μm)カラムをアジレント・テクノロジーズ社から購入し、当該カラムの温度を６０°Ｃに保持した。移動相として、Ａ液に０．１％の酢酸/水、Ｂ液にメタノールを用いた。グラジエントとして、Ｂ液４０％（０分）、Ｂ液９９％（２０分）、Ｂ液９９％（３０分）、Ｂ液４０％（３０．０１分）、これ以降４０分までＢ液４０％を保持した。また、流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入体積を１μＬとした。
【００６９】
ＭＳのデータは、Ｑｓｔａｒ ＸＬ質量分析計(アプライド・バイオシステムズ社, フォスター市, カリフォルニア州,米国)を用いて取得した。サンプルの分析は、陽イオン及び陰イオンエレクトロスプレー法の双方で行なった。
【００７０】
陽イオンのＭＳ条件（陽イオンモード,ＴＯＦスキャンモード）は以下の通りである：
スプレー電圧 ５．５キロボルト;
スキャンレンジｍ／ｚ ２５０−７００;
カーテンガス, ２０任意単位(窒素ガス)；
ガス１, ５０任意単位;
ガス２, ５０任意単位(５００°Ｃ)；
デクラスタリングポテンシャル１／２ ５０ボルト／１５ボルト；。
【００７１】
陰イオンのＭＳ条件（陰イオンモード，ＴＯＦスキャンモード）は、スプレー電圧を−４．５キロボルトとし、デクラスタリングポテンシャル１／２を−５０ボルト／−１５ボルトとした以外は、上記陽イオンの場合と同じである。
【００７２】
（６）ＬＣ−ＭＳデータのピーク相関
ＬＣ−ＭＳデータセットは、次の３連のサンプル由来のものから構成される。
第１連は、代謝産物時刻表の作成に用いる次のサンプルセットを含む：ＬＤ(サンプル数ｎ＝５／時点)条件下、ＤＤ(ｎ＝４−６／時点)条件下で採取され各時点でミックスされた、若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスの血漿、及びＣｒｙ１,Ｃｒｙ２ｄＫ．Ｏ．マウスの血漿(ｎ＝２／時点)。
第２連は、体内時刻の測定に用いる次のサンプルセットを含む：
ＬＤ条件下、及びＤＤ条件下で採取した、個体毎（６時点）のＣＢＡ／Ｎマウスの血漿；
ＬＤ条件下、及びＤＤ条件下で採取した、個体毎（６時点）のＣ５７Ｂｌ／６マウスの血漿；
ＬＤ条件下で採取した老齢オス及び若いメスのＣＢＡ／Ｎマウスの血漿（２時点）、及び時差ぼけ実験を体験させた若いオスＣＢＡ／Ｎマウスの血漿（２時点）。
第３連は、絶食期間中に採取したＣＢＡ／Ｎマウス（個体毎、６時点）の血漿である。
【００７３】
各連に含まれるサンプルは２日以内に測定をした。これら三つの連の測定間隔は、第１連と第２連との間は約３ヶ月、第１連と第３連との間は約１年であった。
【００７４】
各連間のピークの相関を求めるため、Marker View software (アプライド・バイオシステムズ社, フォスター市, カリフォルニア州, 米国)を用いた。そして、検出範囲を、移動時間３分から２８分の間に設定した。各連間のピークの相関を求めるに際して、既報（参考文献：Soga T et al. (2006) Differential metabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione consumption. J Biol Chem 281: 16768-16776.を参照）に基づいて保持時間を修正し、次いで、次の値が最小となるように２つの連間のピークの関連付けを行なった。：
連間で(ｍ／ｚの差)が見られるピークにおける、(（２つの連間のｍ／ｚの差）／Ｘ)2＋(２つの連間のＲＴの差／Ｙ)2＜Ｘ、及び(ＲＴの差)＜両連のＹそれぞれ。
ここで、上記のパラメータＸ及びＹは以下の手順（ａ）〜（ｃ）でもとめられる。：
（ａ）Ｘ及びＹの値を変化させ(例えば、Ｘ＝０．０１，０．０２，．．．，０．１５、及びＹ＝０．１，０．２，．．．，１．５)て、ピーク同士を関連付けた。
（ｂ）次いで、相関するピーク面積のピアソン相関を計算し、ｐ値を算出した。
（ｃ）そのうえで、ｐ値が最も小さくなるパラメータセットＸ・Ｙを選択した。
この手順において、最良のパラメータセットＸ・Ｙの組合わせは、第１連と第２連との間ではＸ＝０．０９，Ｙ＝０．５(陽イオン)、及びＸ＝０．１３，Ｙ＝０．４(陰イオン)であり、第１連と第３連との間では、Ｘ＝０．１１，Ｙ＝０．９(陽イオン)、及びＸ＝０．１５，Ｙ＝１．３(陰イオン)であった。
【００７５】
（７）ＣＥ−ＭＳサンプル
振動性の物質を選択するため、各時点のミックスしたマウスの血漿(４−１０匹／時点)を使用し、個々のマウスの血漿を体内時刻測定に用いた。５５μＭのメチオニンスルホン、及び５５μＭの２−モルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含む１．８ｍＬメタノール中に、血漿サンプル(１００μｌ)を加えてよく混合した。ここにさらに、８００μＬの脱イオン水、及び２ｍＬのクロロホルムを加え、当該溶液を２５００ｇで５分、４℃の条件下で遠心分離した。次いで、タンパク質を除去するため、遠心分離後に得られた８００μＬの水性の上層を、ミリポア５−ｋＤａカットオフフィルタ（Millipore 5-kDa cut-off filter）を用いて遠心ろ過した。次いで、ろ過物を凍結乾燥し、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ分析に先立って、当該ろ過物を、参照化合物（２００μＭの３−アミノピロリジン、及び２００μＭのtrimesate）を含んだ５０μＬのMilli-Q（ミリポア社, ベッドフォード, マサチューセッツ, 米国）水中に溶解した。
【００７６】
（８）ＣＥ−ＭＳ用の代謝産物標準
全ての標準化学物質は通常ルートの購入により入手し、これら化学物質の１０ｍＭ又は１００ｍＭのストック溶液を得るために、Milli-Q水、０．１ＮのＨＣｌ、又は０．１ＮのＮａＯＨ中に溶解した。使用する標準化学物質の混合液は、ＣＥ−ＴＯＦＭＳに注入する直前に、上記ストック溶液をMilli-Q水で希釈して調製した。使用した標準化学物質は何れも分析又は試薬等級のものである。
【００７７】
（９）ＣＥ−ＭＳ用の分析装置
ＣＥ−ＴＯＦＭＳの実験は全て、何れもアジレント・テクノロジーズ社製の、アジレントＣＥキャピラリー電気泳動システム、アジレントG3250AA LC/MSD TOFシステム、アジレント１１００シリーズ・バイナリーＨＰＬＣポンプ、G1603A アジレント CE-MS アダプタ、及びG1607A アジレント CE-ESI-MS スプレイヤー・キット、を用いて行なった。
【００７８】
ＣＥ−ＭＳ用の装置の制御、及びデータの取得のため、ＣＥ用にはG2201AA アジレント ケム・ステーション ソフトウェアを、アジレント TOFMS ソフトウェア用にはthe Analyst QSを用いた。ＣＥ−ＭＳ／ＭＳ分析における化合物の同定は、Agilent CE instrumentに接続した、Q-Star XL Hybrid LC-MS/MS System(アプライド・バイオシステムズ社)を用いて行なった。
【００７９】
（１０）陽イオン性の代謝産物の分析のためのＣＥ−ＴＯＦＭＳ条件
電解質としての１Ｍのギ酸で満たした、溶融シリカキャピラリー(内径５０μｍ×全長１００ｃｍ)を用いて分離を行った。およそ４８倍に希釈した３ｎｌのサンプル溶液を、５０ｍｂａｒで３秒、３０キロボルトの印加電圧条件で、当該キャピラリー内に注入した。
【００８０】
キャピラリーの温度を２０℃に維持し、サンプルトレーの温度を５℃以下に冷却した。シース液として０．５μＭのレセルピンを含むメタノール／水（５０％ ｖ／ｖ）を、１０μＬ／ｍｉｎの流速でキャピラリーに供給した。ＥＳＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（上記〔（９）ＣＥ−ＭＳ用の分析装置〕で説明したもの）を陽イオンモードで操作し、キャピラリーへの印加電圧を４キロボルトにセットした。熱乾燥窒素ガス（ヒーター温度３００℃）の流速を、ゲージ圧で１０ｐｓｉｇに維持した。ＴＯＦＭＳにおいて、フラグメンター電圧、スキマー電圧、及びオクタポール参照（Ｏｃｔ ＲＦＶ）電圧を、それぞれ１２０、５０、及び２００ボルトとした。
【００８１】
取得された各スペクトラムの自動リキャリブレーション（recalibration）は、参照標準物質の参照質量を用いて行なった。メタノール付加イオン（［２ＭｅＯＨ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｈ］＋, ｍ／ｚ ＝６５．０５９７）、及びレセルピン（［Ｍ＋Ｈ］＋， ｍ／ｚ＝６０９．２８０６）が、正確な質量測定用のロックマスを供する。正確な質量データは５０−１，０００ｍ／ｚのレンジにわたり、１０spectra/sのレートで取得した。
【００８２】
（１１）ＣＥ−ＭＳデータのピークの関連付け
ＣＥ−ＭＳデータのピークの関連付けは、KEIO MasterHANDs software(参考文献：Baran R et al. (2006) Mathdamp: A package for differential analysis of metabolite profiles. BMC Bioinformatics 7: 530)を用い、当該ソフトウェアの自動アルゴリズム及びマニュアルによる補完（manual curation）により行った。
【００８３】
（１２）ピーク面積のノーマライゼーション（正規化）
取得したＬＣ−ＭＳデータに関して、２４種のＬＤ及びＤＤ保存サンプルの中から一つの（重心）サンプルを選択した（この重心サンプルは、残りの２３サンプルとのピアソン相関の平均が最大となるものである。）。重心サンプルは、陽イオンのデータ及び陰イオンのデータからそれぞれ独立に選択した。そして、サンプル毎に、ターゲットの面積（Ｘ）及び重心サンプルの面積（Ｙ）について関数Ｙ＝Ｘ＋ａへの直線回帰を行い、ターゲットの面積から直線回帰後の値（ａ）を差し引くことで、得られた回帰直線に従ってターゲットサンプルのピーク面積を正規化した。ＣＥ−ＭＳデータに関しては、各サンプル内にスパイクされた内部標準(メチオニンスルホン)の面積により各ピーク面積を除することで、これら各ピーク面積を正規化した。
【００８４】
（１３）代謝産物時刻表の作成
はじめに、ＬＤ条件下及びＤＤ条件下の双方において、１０またはそれ以上の時点で検出された代謝産物を選択した。次に、選択された各代謝産物に関し、ＬＤ条件下及びＤＤ条件下で平均面積値が同じになるように、ＬＤ及びＤＤにおけるそれぞれの面積値を計算した。産出された各面積に関し、フーリエ変換に基づいた方法（参考文献：Chatfield C (1996) The analysis of time series: An introduction (Chapman & Hall/CRC, London)を用いて、様々な位相を有する２４時間周期をもつコサイン曲線（余弦波）とのピアソン相関係数を産出し、相関係数が最大となるもの、及びその頂点位相を探索した。
【００８５】
次いで、順列テストにより、各代謝産物に関してｐ値とＦＤＲ(false discovery rate)とを見積もった。ＬＣ−ＭＳデータに関してはＦＤＲ＜０．０１を満たす物質を、ＣＥ―ＭＳデータに関してはＦＤＲ＜０．０１を満たす物質、及びＦＤＲ＜０．１を満たす物質の双方を、統計的に有意な振動をしている代謝産物として選択した。
【００８６】
（１４）体内時刻の測定
メタボロミクスに基づく体内時刻の測定は、体内時刻の推定に二つのサンプルを用いた点を除けば、発現ベースの体内時刻測定法（参考文献：Ueda HR et al. (2004) Molecular-timetable methods for detection of body time and rhythm disorders from single-time-point genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 11227-11232.）に従い行なった。すなわち、本実施例の方法（代謝産物時刻表法）では、１２時間のサンプリング時間間隔が空いた二つのサンプルを使用した（例えば、ＺＴ０の体内時刻の測定に際して、ＺＴ０及びＺＴ１２を用いる）。これは、測定実験間で生じうる検出感度の変動を補正するためである。
【００８７】
具体的には、所定の代謝産物ｉに関して、或るサンプル中の面積をＡｓｉと定義し、上記二つのサンプル（１２時間のサンプリング時間間隔を有するもの）を平均した面積をＭｓｉと定義し、さらに、時刻表中の所定時刻における代謝産物ｉの当該平均の面積（所定時刻でのＭｓｉに相当）、標準偏差、及びピーク時刻を、それぞれ順に、Ｍｔｉ、Ｓｔｉ、及びＰｔｉと定義した。
【００８８】
体内時刻の推定のため、下記式（１）の条件を充足しない統計的にはずれ値を示す代謝産物は使用しなかった。
【００８９】
【数１】
【００９０】
そして、ｂを０から２３．９まで０．１ずつ変化させて、下記式（２）及び（３）間のピアソン相関が最大となるｂを探索し、このｂを標的サンプルの体内時刻とした。また、この予測のｐ値を評価するため、最大相関に対する順列テストを行なった。
【００９１】
【数２】
【００９２】
〔実施例１〕：ＬＣ−ＭＳ分析に基づく、血漿中の代謝産物時刻表の作成
上記説明の通り、血漿サンプルは、ＬＤ又はＤＤ条件下で、２日にわたり４時間毎に、若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスから取得した。血漿中に振動を示す物質が含まれていることを示すため、既知の振動物質であるコルチコステロン量を、ラジオイミュノアッセイにより定量し、明確な概日性の振動（以下、「概日振動」と称する）があることを示した（図１の（ａ）中のａ−１及びａ−２参照）。代謝産物時刻表を作成するため、上記した方法に従い、血漿中に含まれる化学物質量をＬＣ−ＭＳ分析にて定量した。
【００９３】
ＬＣ−ＭＳ分析により、６９５の陰イオン、及び９３８の陽イオンのピークが得られた。これらピークのうち、ＬＤ及びＤＤ条件下で、１７６の陰イオン、及び１４２の陽イオンのピークが顕著な概日振動を示した（図１の（ｂ）：ＦＤＲ＜０．０１：上記の方法の項も参照）。概日振動を示すピークは、マウス血漿中で検出されたピークの凡そ１９．５％に相当する。これらのピークに相当する代謝産物は、時刻を指示する代謝産物（必要に応じて「時刻指示代謝産物」と称する）として機能する。なぜなら、これらの代謝産物は、時刻情報のない（一定の）環境下（例えばＤＤ条件下）でも、顕著に振動を示すからである。
【００９４】
例えば、ＺＴ０(明期の始まり)又はＣＴ０(主観的な明期の始まり)では、凡そＺＴ０又はＣＴ０においてピークを示す夜明けを指示する代謝産物レベル（代謝産物の量）が高くなる一方で（図１の（ｂ）；分子ピーク時刻を示すバー中で「dawn」と示す）、凡そＺＴ１２又はＣＴ１２においてピークを示す夕暮れ（dusk）を指示する代謝産物レベルが低くなる（図１の（ｂ）；分子ピーク時刻を示すバー中で「dusk」と示す）。これとは反対に、ＺＴ１２又はＣＴ１２では、夜明けを指示する代謝産物レベルが低くなる一方で、夕暮れを指示する代謝産物レベルが高くなる。これはすなわち、時刻指示代謝産物量は、体内時刻、及び概日時計の内的な状態を反映していることを意味する。実際、これらの時刻指示代謝産物の振動は、概日時計により直接的又は間接的に制御されている。その証拠に、分子レベルで概日時計の本体の機能が欠損しているＣｒｙ１,Ｃｒｙ２ｄＫ．Ｏ.マウスにおいて、これら代謝産物レベルの変動の周期性は失われている（図１の（ａ）中のａ−３、及び図１の（ｃ）を参照）。ここで得られたＬＣ−ＭＳのデータを用いて、表１に示す、マウスの血漿中に含まれる時刻指示代謝産物の分子時刻表（代謝産物時刻表）を構築した。
【００９５】
なお、表１中で、「mode」とはＬＣ-ＭＳの検出モードを指し、「Avg.ｍ/ｚ」、「Avg.RT」、「Avg.Area」、「StdDev AREA」はそれぞれ、２４時点（ＬＤ１２時点、及びＤＤ１２時点）での各相関ピークの平均ｍ／ｚ値、平均保持時間、平均面積、当該面積の標準偏差を指す。「Peak time」、「correlation」、「p value」、及び「ＦＤＲ」は、いずれも概日性の振動の統計解析の結果を示すものであり、それぞれ、概日性の振動のピーク時刻、概日性の振動に適合したコサイン曲線のピアソン相関の最大値、ピアソン相関の有意性に係るp値及びＦＤＲを指す。「p value」、及び「ＦＤＲ」は数値を切り上げしており、その他の値は数値を切り下げしている。
【００９６】
【表１】
【００９７】
【表２】
【００９８】
【表３】
【００９９】
【表４】
【０１００】
【表５】
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
【表７】
【０１０３】
【表８】
【０１０４】
【表９】
【０１０５】
【表１０】
【０１０６】
【表１１】
【０１０７】
【表１２】
【０１０８】
【表１３】
【０１０９】
【表１４】
【０１１０】
【表１５】
【０１１１】
【表１６】
【０１１２】
なお、上記した図１の（ａ）〜（ｃ）は、本実施例１にて得られた、マウス血漿中に存在する代謝産物が示す概日性の周期を示すものである。図１の（ａ）は、ＬＤ条件下（同図のａ−１）、及びＤＤ条件下（同図のａ−２）での、ＣＢＡ／Ｎマウスの血漿中でのコルチコステロンレベルの概日性の変化を示す。また、図１の（ａ）中のａ−３には、ＤＤ条件下のＣｒｙ１,Ｃｒｙ２ｄＫ．Ｏ．マウスが示す、リズム性のないコルチコステロンレベルの変化のパターンを表す。全ての値は、平均±標準誤差で表している。また、グラフ上の白いバーは昼（照明点灯状態）を、グレーのバーは主観的昼（恒暗条件下での日中相当（subjective day））を、黒いバーは夜及び主観的夜（subjective night）を示す。ＺＴ０は照明開始時の時刻であり、概日時刻ＣＴ０は、ＬＤ条件であれば照明開始時に相当するＤＤ条件下の時間である。
【０１１３】
また、図１の（ｂ）・（ｃ）は、ＬＣ−ＭＳ分析により測定した、ＣＢＡ／Ｎマウス（図１の（ｂ））の血漿中、Ｃｒｙ１,Ｃｒｙ２ｄＫ．Ｏ．マウス（図１の（ｃ））の血漿中における、概日性の振動を示す代謝産物（陽イオン（図中のｂ−１、ｃ−１）、陰イオン（図中のｂ−２、ｃ−２））を示す。血漿中に含まれる代謝産物の量は、各代謝産物を示すタイルのグレースケールの相違により表現している（図中、右側のグレースケールのバーも参照）。また、代謝産物は、その分子ピーク時刻により上から順に並べた。
【０１１４】
実施例１では、１４個のピークについて、具体的な代謝産物名を同定することができた（図１０、及び表１を参照）。これらの代謝産物は、図１０及び表１に示す、リゾフォスファチジルコリン（LysoPC）（18:1）、LysoPC（20：4）、LysoPC（20：3）、LysoPC（20：2）、LysoPC（18：3）、LysoPC（22：6）、LysoPC（22：5）、及びLysoPC（22：4）であり、中性環境下での化学式は順に、Ｃ２６Ｈ５２ＮＯ７Ｐ、Ｃ２8Ｈ５0ＮＯ７Ｐ、Ｃ２8Ｈ５２ＮＯ７Ｐ、Ｃ２8Ｈ５4ＮＯ７Ｐ、Ｃ２６Ｈ48ＮＯ７Ｐ、Ｃ30Ｈ５0ＮＯ７Ｐ、Ｃ30Ｈ５２ＮＯ７Ｐ、及びＣ30Ｈ５4ＮＯ７Ｐ、である。また、図１０の（ａ）には、陰イオンモード下の４個のピークに相当する代謝産物が示す概日性のリズムを表示し、図１０の（ｂ）には、陽イオンモード下の１０個のピークに相当する代謝産物が示す概日性のリズムを表示している。なお、これらの図において、代謝産物の量は平均値を１．０として正規化（ノーマライズ）して示す。
【０１１５】
〔実施例２〕：独立のサンプルを用いた体内時刻の測定
得られた概日振動物質が体内時刻の優れたインジケーターであって代謝産物時刻表を用いた体内時刻の診断法が機能するかを確認するため、独立にサンプリングしたマウスの代謝産物プロファイルから体内時刻を推定した。具体的には、サンプリングの時間、及び／又は照明の条件が、体内時刻の推定に影響を与える可能性を検討するために、若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスの個体から、４時間毎に２４時間にわたり、ＬＤ条件下及びＤＤ条件下の双方で血漿を採取した。
【０１１６】
上記した方法に従い、血漿サンプル中における時刻指示代謝産物のプロファイルを得るためにＬＣ−ＭＳ分析を行った（図２の（ａ）・（ｂ））。本発明で述べた代謝産物時刻表法を用いることで、これらサンプル中の全ての代謝産物プロファイルにおいて、顕著な概日性リズムが検出された（ｐ＜０．０１：図２の（ａ）・（ｂ））。ＬＤ条件下でのＺＴ、又はＤＤ条件下でのＣＴにおいてサンプリングした場合、わずかな推定誤差（ＬＤ条件で１．０±０．４９ｈ、ＤＤ条件で１．３±０．４５ｈ：平均±標準偏差：表２参照）を伴うのみで、体内時刻は環境時刻と一致した。これらの結果は、本発明を用いることにより、独立にサンプリングされたマウスの代謝産物プロファイルから、体内時刻を正確に推定できることを示唆する。
【０１１７】
以下の表２において、「peak」の欄にはサンプル間に共通して見出された全ての振動ピーク（All）と、はずれ値を除き実際に使用したピーク数（Used）を示す。「ZT/CT」は、サンプリングを行なったＺＴ（ＬＤ条件下）又はＣＴ（ＤＤ条件下）での環境時刻を指す。「Difference」は（体内時刻から環境時刻を差し引いた値）の絶対値を指す。なお、使用した振動のピークの情報は表１（代謝産物時刻表）に記載している。
【０１１８】
【表１７】
【０１１９】
【表１８】
【０１２０】
なお、図２の（ａ）・（ｂ）は、体内時刻の推定結果を示し、これは若いオスのＣＢＡ/Ｎ体内時刻マウスの血漿をＬＤ条件下（図２の（ａ））、及びＤＤ条件下（図２の（ｂ））で採取した場合の結果である。円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘとする）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙとする）をとった場合の各振動代謝産物に相当する。このとき、各物質の分子ピーク時刻は規定されているから（表１のピーク時刻を参照）、全ての図で同じ物質が同じｘの値をとる。これに対し、物質量はサンプル間で可変なので、ｙの値は変化する。例えばピーク時刻１２の物質は全ての図でｘ＝１２のところにプロットされるが、ｙの値はＺＴ０では低く、ＺＴ１２では高くなる。コサイン曲線（１）のピーク時刻が推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻がサンプリングした時刻（環境時刻）に相当する。曲線（１）と曲線（２）との重複度合いが大きいほど、測定精度が高いことを示す。縦方向の破線は、体内時刻又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。
【０１２１】
〔実施例３〕：遺伝的背景の相違が与える影響
臨床応用に際して、体内時刻推定の方法は、異なる遺伝的背景をもつ集団に適用可能なものでなければならない。代謝産物時刻表法が、遺伝的背景が異なる個体に対して適用可能であることを実証するため、当該方法を、代謝産物時刻表をつくった系統であるＣＢＡ／Ｎマウスとは異なる遺伝的背景を持つ近交系のマウス系統から得たサンプルについても適用可能か、検討した。具体的には、若いオスＣ５７Ｂｌ／６マウスの個体から、４時間毎に２４時間にわたり、ＬＤ条件下及びＤＤ条件下の双方で、血漿サンプルを採取した。そして、上記したＬＣ−ＭＳ法を用いて、血漿中の時刻指示代謝産物の定量化を行なった（図３の（ａ）・（ｂ））。
【０１２２】
代謝産物時刻表法により、ＬＤ条件（図３の（ａ））及びＤＤ条件（図３の（ｂ））下の何れの時刻で採取したサンプルのプロファイルについても、顕著な概日性のリズム（ｐ＜０．０１）を検出した。推定された体内時刻は、ＬＤ条件下では１．６±０．３６ｈ、ＤＤ条件下では１．７±０．２４ｈの推定誤差（平均±標準偏差, 表２も参照）を伴うのみで、環境時刻と非常に一致した。この結果は、異なる遺伝的背景を有するマウスにおいても、代謝産物のプロファイルから正確に体内時刻を決定することができることを示唆する。
【０１２３】
なお、図３の（ａ）・（ｂ）は、ＬＤ条件下（図３の（ａ））、及びＤＤ条件下（図３の（ｂ））で飼育したＣ５７Ｂｌ／６マウスの血漿を用いた体内時刻の測定結果を示す。円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘ）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙ）をとった場合の各振動代謝産物（ｘ、ｙ）に相当する。コサイン曲線（１）のピーク時刻は推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻は環境時刻に相当する。縦方向の破線は、体内時刻、又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。また、統計の結果は上記の表２に示す。
【０１２４】
〔実施例４〕：給餌環境の相違
摂食行動が概日性のリズムを有することは良く知られている。それゆえ、給餌環境（ヒトでは食事環境）は、代謝産物時刻表法の正確性に影響を与えうる。異なる給餌環境にある個体に対して、代謝産物時刻表法を適用できるか否かを評価するため、ある時点から餌を与えなかったＣＢＡ／Ｎマウスに対し代謝産物時刻表法を適用した。これまでの実施例では、ＣＢＡ／Ｎマウスは自由摂食下（ad libitum feeding）で飼育されていたため、この餌の剥奪状態（food deprivation）は、元々の給餌状態とは大きく異なる。
【０１２５】
ある時点より餌をケージから取り除いた若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスから、ＬＤ条件下で４時間毎に一個体ずつ２４時間にわたり血漿を回収し、ＬＣ−ＭＳ分析を行なった（図７参照）。この状態においても、代謝産物時刻表法を用いることで、全ての代謝産物プロファイルから顕著な概日性のリズムを検出した（ｐ＜０．０３）。推定された体内時刻は、２．２±０．５ｈの推定誤差（平均±標準偏差、表２参照）を伴い、環境時刻と一致した。これらの結果は、厳しい給餌環境下に維持されてさえも、マウスの代謝産物プロファイルから体内時刻を決定することができることを示唆する。
【０１２６】
なお、図７中、円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘ）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙ）をとった場合の各振動代謝産物（ｘ、ｙ）に相当する。コサイン曲線（１）のピーク時刻は推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻は環境時刻に相当する。縦方向の破線は、体内時刻、又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。また、統計の結果は上記の表２に示す。
【０１２７】
〔実施例５〕：年齢及び性別による相違
本発明においては、若いオスのマウスのみから代謝産物時刻表を構築した。上記実施例１〜４では、若いオスを用いることで様々な条件下で体内時刻が推定できることを示したが、年齢や性別が代謝産物時刻表法の正確性に影響を与える可能性が考えられた。年齢や性別の体内時刻推定に与える影響を評価するため、本願発明者らは、代謝産物時刻表法を、代謝産物時刻表を作成したと同じＣＢＡ/Ｎ系統の、老齢オス、及び若いメスにも適用した。老齢オス、又は若いメスのＣＢＡ／Ｎマウス個体から、ＺＴ０（明期の始まり。すなわち照明を開始する時間）、ＺＴ１２（明期の終わり、すなわち消灯する時間）の二つの時点で血漿をサンプリングした。これら二つの時点は、光の状態が劇的に変化するため、最もノイズが生じやすい時点であると考えられる。
血漿中の時刻指示代謝産物は、上記のＬＣ−ＭＳで定量し、顕著な概日性のリズム）を、老齢オス及び若いメスの全ての代謝産物プロファイル中に確認した（ｐ＜０．０１）（図４の（ｂ）・（ｃ））。ＺＴ０及びＺＴ１２で採取されたマウスの推定体内時刻は、老齢オスでは体内時刻２３．０及び体内時刻１１．０であり、若いメスでは体内時刻１．２及び体内時刻１３．２であった（表２参照）。これらの結果は、異なる年齢及び性別のマウスの代謝産物プロファイルからも、体内時刻が正確に決定出来ることを示す。
【０１２８】
なお、図４の（ａ）〜（ｃ）は、ＺＴ０（図中左側）、及びＺＴ１２(図中右側)の時点で取得した、若いオス（図４の（ａ））、老齢オス（図４の（ｂ））、及び、若いメス（図４の（ｃ））での体内時刻測定の結果を示す。円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘ）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙ）をとった場合の各振動代謝産物（ｘ、ｙ）に相当する。コサイン曲線（１）のピーク時刻は推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻は環境時刻に相当する。縦方向の破線は、体内時刻、又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。また、若いオスの結果（（図４の（ａ））は、比較用に図２から再録して表示している。これらの統計の結果は上記の表２に示す。
【０１２９】
〔実施例６〕：時差ぼけの検出
本発明の最終目的の一つは、概日リズム障害の診断に代謝産物時刻表を利用することである。時差ぼけは一般的な概日リズム障害であり、内的な時刻である体内時刻と外的な時刻の環境時刻とが相違することで生ずる。そこで、本願発明者らは、時差ぼけを模したモデルを作成するために、通常のＬＤ条件下で二週間若いオスのＣＢＡ/Ｎマウスを飼育した後に、照明スケジュールを８時間前倒しにした新しいＬＤ条件下に飼育環境を移行した。
【０１３０】
血漿サンプルは、次に述べる異なる３日（第１日、第５日、第１４日）の二つの時点（元々のＬＤサイクルのＺＴ０及びＺＴ１２。以下、それぞれ時刻１、時刻２と称する）で採取した。：第１日（照明スケジュールを８時間前倒しにした新しい環境に同調する前）、第５日（新しい環境に同調中）、及び第１４日（新しい環境に同調後）（図５の（ａ）・（ｂ））。
【０１３１】
第１日では、推定された体内時刻は、２３．８ｈ（時刻１）及び１１．８ｈ（時刻２）であり、内的な体内時刻が明暗環境を変化させる前の時間に従っていることを示唆していた。これに対し第１４日では、推定された体内時刻は、８．８ｈ（時刻１）及び２０．８ｈ（時刻２）であり、内的な体内時刻が元々のＬＤ周期から約８時間ずれてきて、新しい周期に完全に同調していることを示していた。第５日では、推定された体内時刻は３．５ｈ（時刻１）及び１５．５ｈ（時刻２）であり、元々のＬＤ周期から３．５ｈのずれであって、これは元の明暗環境とも前倒しにした新しい環境とも不完全に同調した状態であることを意味しており、時差ぼけ状態にあることを示唆している（図５の（ｃ）及び、表２参照）。以上の結果は、本発明にかかる代謝産物時刻表法が、正しく概日リズム障害を検出できることを示唆する。
【０１３２】
なお、図５の（ａ）は光照射条件を示す概略図であり、白色のバーは照明点灯の状態を、黒色のバーは消灯の状態を示す。第１日では、それ以前より８時間早く消灯をした。血漿のサンプリングは、ＬＤシフト（図中、矢印で示す）後の、第１日、第５日、及び第１４日それぞれの２つの時点で、行なった。図５の（ｂ）は、代表的なマウスの行動パターンを示す図（アクトグラム）であり、明暗条件に同調した場合の活動パターン、ＬＤシフトにより誘導された時差ぼけを経験している状態、及び新しい環境に再同調した様子を示す。点灯期間と、消灯期間（グレーのシャドウイング）とを図中に示す。３つの矢頭は、第１日（図中の上）、第５日（図中の中央）、及び第１４日（図中の下）を示す。図５の（ｃ）は、照明スケジュールを８時間前倒しにした新たな明暗環境に同調する前（第１日、上）、同調中（第５日、中央）、及び同調した後（第１４日、下）に採取したマウスの血漿を用いた体内時刻測定の結果を示す。円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘ）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙ）をとった場合の各振動代謝産物（ｘ、ｙ）に相当する。コサイン曲線（１）のピーク時刻は推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻は環境時刻に相当する。縦方向の破線は、体内時刻、又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。また、統計の結果は上記の表２に示し、表２中のアステリスク（＊）は、時差ぼけ実験においてマウスが新たなＬＤ周期に入る以前の、元々のＬＤ周期におけるＺＴを示していることを指す。
【０１３３】
〔実施例７〕：代謝産物時刻表法の一般適用（ＣＥ−ＭＳ分析）
実施例１〜６に示す通りＬＣ−ＭＳ分析に基づく代謝産物時刻表法は、個体の体内時刻を正確に測定可能であり、時差ぼけのような概日リズム障害を非常に高感度に診断することができた。この方法は、上記した多数の時刻指示代謝産物の振動に依拠しているものであるゆえ、この方法は、ＣＥ−ＭＳ分析のような他のメタボロミクス技術によって見出された振動物質を用いても応用可能であると考えられる。
【０１３４】
ＣＥ−ＭＳ分析では、電荷を帯びた化合物の分離が可能である。つまり、ＣＥ−ＭＳ分析はＬＣ−ＭＳ分析に対して相補的な技術に相当する。代謝産物時刻表法の他のメタボロミクス技術への適用可能性を確認するため、若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスから、二日間にわたり、ＬＤまたはＤＤ条件下で４時間ごとに血漿を採取した。次いで、これらの血漿サンプル中に含まれる、陽性に荷電した化合物を、ＣＥ−ＭＳにより測定し９５３個のピークを検出した。これらのピークのうち１５３個が、ＬＤ及びＤＤ条件下で有意な概日性の振動を示した（図６の（ａ）参照。ＦＤＲ＜０．１）。
【０１３５】
次いで、これらのＣＥ−ＭＳ分析のデータに基づき、マウス血漿中の代謝産物時刻表を構築した（表３参照）。なお、以下の表３中、「Avg.ｍ/ｚ」、「Avg.RT」、「Peak Time」、「Correlation」、「p value」、及び「FDR」の定義は表１と同じであり、「Avg.Area/Area(Isl)」、及び「StdDev Area/Area(Isl)」は、それぞれ、２４時点（ＬＤ１２時点、及びＤＤ１２時点）での各相関ピークの平均面積及び当該面積の標準偏差を、内部標準（メチオニンスルホン）の面積で除した値を指す。「p value」、及び「ＦＤＲ」は数値を切り上げしており、その他の値は数値を切り下げしている。また、２８のピークについては、具体的な代謝産物名を同定することができた（図６の（ｂ）、及び図９参照）。図９には同定された代謝産物が示す概日性のリズムを示すが、当該代謝産物の量は平均値を１．０として正規化（ノーマライズ）して示している。
【０１３６】
【表１９】
【０１３７】
【表２０】
【０１３８】
【表２１】
【０１３９】
【表２２】
【０１４０】
【表２３】
【０１４１】
【表２４】
【０１４２】
【表２５】
【０１４３】
【表２６】
【０１４４】
あわせて、ＣＥ−ＭＳで検出された振動代謝産物が個体の体内時刻を示す良いインジケーターであって、ＣＥ−ＭＳに基づく代謝産物時刻表を利用することで体内時刻を検出すことが可能かを確認するため、独立にサンプリングしたマウスの代謝産物プロファイルから体内時刻を推測した。具体的には、若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスから、ＬＤ及びＤＤ条件下の双方で、２４時間にわたり４時間ごとに血漿を採取した。次いで、上記の方法で、血漿サンプルのＣＥ−ＭＳ分析を行なって時刻指示代謝産物をプロファイルした（図６の（ｃ）・（ｄ））。
【０１４５】
ＣＥ−ＭＳ分析に基づく代謝産物時刻表法では、これらサンプルの全代謝産物プロファイルで顕著な概日性の周期が検出された（ｐ＜０．０１、図６の（ｃ）・（ｄ））。ここで推定された体内時刻は、ＬＤ条件下で０．６±０．２９ｈ、ＤＤ条件下で０．６±０．５４ｈの推定誤差（平均±標準偏差、表４参照）を伴うのみで、環境時刻と一致した。これらの結果は、代謝産物時刻表法は、ＣＥ−ＭＳ分析のような他のメタボロミクス技術にも一般的に適用できることを示唆する。なお、以下の表４中、「peak」、「ZT/CT」、及び「Difference」の定義は表２と同様である。なお、使用した振動のピークの情報は表３（代謝産物時刻表）に記載している。
【０１４６】
【表２７】
【０１４７】
なお、図６の（ａ）は、マウスの血漿中に含まれる概日性の振動を示す代謝産物（陽イオン，ＦＤＲ＜０．１）を示し、図６の（ｂ）は、具体的な名称まで同定された振動性の代謝産物を示す。血漿中に含まれる代謝産物の量は、各代謝産物を示すタイルのグレースケールの相違により表現している（図中、左側のグレースケールのバーも参照）。図中、右側の垂直バーは、１日の中で、各代謝産物が指示する分子ピーク時刻を示す。図６の（ｃ）・（ｄ）は、ＬＤ条件下（図６の（ｃ））、及びＤＤ条件下（図６の（ｄ））で飼育されたマウスの体内時刻の測定結果を示す。円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘ）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙ）をとった場合の各振動代謝産物（ｘ、ｙ）に相当する。コサイン曲線（１）のピーク時刻は推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻は環境時刻に相当する。縦方向の破線は、体内時刻、又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。また、統計の結果は上記の表３に示す。
【０１４８】
〔実施例８〕より厳格な基準でのＣＥ−ＭＳ分析に基づく代謝産物時刻表法
実施例７に示す通り、ＣＥ−ＭＳ分析により、血漿サンプル中に９５３個のピークを検出した。これらのピークのうち、より厳格な統計基準（ＦＤＲ＜０．０１：図８参照）下では、４４個のピークが顕著な概日性の振動を示した。これら４４個のピークのうち１０個のピーク（２２．７％）に相当する代謝産物の名称を特定できた（図８の（ｂ）参照。ＣＥ−ＭＳ分析の結果、検出された、及び／又は、名称まで特定された時刻指示代謝産物に基づいて、マウスの血漿中における代謝産物時刻表を構築した（表３参照）。
【０１４９】
この代謝産物時刻表に示された概日振動代謝産物をインジケーターとした場合に、個体の体内時刻を充分に反映して精度よく体内時刻が推定されるか否かを評価するため、マウスの代謝産物のプロファイルから体内時刻の推定を試みた。若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスの個体から、４時間毎に２４時間にわたり、ＬＤ条件下、又はＤＤ条件下の双方で鮮血の血漿を採取し、その代謝産物のプロファイルを評価した（図８の（ｃ）・（ｄ））。予期した通り、これら全サンプルの全ての代謝産物のプロファイルにおいて、顕著な概日性のリズムを検出することができた（Ｐ＜０．０１, 図８の（ｃ）・（ｄ））。推定された体内時刻は、ＬＤ条件において１．５±０．７６h、及びＤＤ条件において１．４±０．９０ｈ(何れも平均±標準偏差、表５参照)の推定誤差を伴うのみで、サンプリング時間（環境時刻）と一致した。この結果が示唆するのは、上記したＬＣ−ＭＳ分析に基づく方法と同等の厳格な基準（ＦＤＲ＜０．０１）により選択された時刻指示代謝産物を用いたＣＥ−ＭＳ分析に基づく方法においても、ある時点で採取された個体の体内時刻を正確に検出することに役立つということである。なお、以下の表５中、「peak」、「ZT/CT」、及び「Difference」の定義は表２と同様である。なお、使用した振動のピークの情報は表３（代謝産物時刻表）に記載している。
【０１５０】
【表２８】
【０１５１】
なお、図８の（ａ）は、マウスの血漿中における概日性の振動を示す代謝産物（陽イオン，ＦＤＲ＜０．０１）を示し、図８の（ｂ）は、具体的な名称まで同定された振動性の代謝産物を示す。血漿中に含まれる代謝産物の量は、各代謝産物を示すタイルのグレースケールの相違により表現している（図中、左側のグレースケールのバーも参照）。図中、右側の垂直バーは、１日の中で、各代謝産物が指示する分子ピーク時刻を示す。図８の（ｃ）・（ｄ）は、ＬＤ条件下（図８の（ｃ））、及びＤＤ条件下（図８の（ｄ））で飼育されたマウスの体内時刻の測定結果を示す。円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘ）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙ）をとった場合の各振動代謝産物（ｘ、ｙ）に相当する。コサイン曲線（１）のピーク時刻は推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻は環境時刻に相当する。縦方向の破線は、体内時刻、又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。また、統計の結果は上記の表４に示す。
【０１５２】
〔実施例９〕使用するピーク数と、体内時刻の推定結果との相関
本願発明者らは、代謝産物時刻表法において使用するピーク数の好適な範囲を求めるべく次の実験を行なった。具体的には、ＬＣ−ＭＳ分析の結果得られた有意な振動を示すピーク（表１参照）のうちＦＤＲの低いものを使用し、代謝産物時刻表法に基づいて体内時刻の推定を行った。このとき、初めに使用したピークは、ＦＤＲの低いものから順に選択した、陽イオンモードの１２４個、陰イオンモードの７６個、計２００個である。
【０１５３】
次いで、これら２００個のピークから、統計基準のきつい（余弦波から遠い：ＦＤＲが大きい）ものより順に５個ずつ使用するピークを減らして体内時刻の推定を行い（すなわち、１９５個、１９０個、１８５個・・・と使用するピークの数を減らした）、さらに、使用するピークの数が５０個以下になった時点からは使用するピークを２個ずつ減らして体内時刻の推定を行なった。なお、本実施例では、使用したピークの数の最小値は４個である。結果を、図１１に示す。
【０１５４】
図１１中の（ａ）は、使用したピーク数（４個〜２００個）と、推定された体内時刻の有意性（そのｐ値）との関係を示す。（ａ）において、薄い網掛けはｐ値が０．０５未満の領域を示し、濃い網掛けはｐ値が０．０１未満の領域を示す。また、図１１中の（ｂ）は、使用したピーク数（４個〜２００個）と、推定誤差（推定された体内時刻と環境時刻との差（単位：時間））との関係を示す。（ｂ）において、薄い網掛けは推定誤差が２時間未満の領域を示し、濃い網掛けは推定誤差が１時間未満の領域を示す。図１１中の（ａ）及び（ｂ）で拡大して示すのは、使用したピーク数が１６個〜３６個の範囲内での結果である。
【０１５５】
推定された体内時刻の有意性の値の好適な範囲は、体内時刻推定の目的等にも依存するが、例えば、そのｐ値が約０．０１未満であれば充分に信頼性があると判断される。この条件を満たすのは、使用したピーク数が約２０個以上の場合である（図１１中の（ａ）参照）。また、使用したピーク数が約２０個以上の場合には、上記の推定誤差が約１時間程度以下に収まるため、実用上充分な推定精度といえる。すなわち、代謝産物時刻表法に基づいて体内時刻の推定を行なう場合には、使用するピークの数（すなわち本発明にかかるインジケーターの数）を２０個以上とすることが好ましい。ただし、使用するピークの数が２０個未満の場合であっても体内時刻、及びそのずれの推定を行なうことは可能である。
【０１５６】
上記の実施例７〜８で示したＣＥ−ＭＳ分析で同定可能な時刻指示代謝産物（図６の（ｂ））には、顕著な概日性のリズムを示す多くのアミノ酸が含まれていた（ＦＤＲ＜０．１）。例えば、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）の分子ピーク時刻（peak time, PT, 0が明期の始まり、１２が暗期の始まりに相当）は凡そ深夜（〜ＰＴ１８）である一方、グリシン（Ｇｌｙ）の分子ピーク時刻は夕方であった（ＰＴ１２．１）。また、尿素サイクルに関連する代謝産物の中では、オルニチン（ＰＴ１８．６）、シトルリン（ＰＴ１９．９）、及び４−グアニジノブチレート（ＰＴ２０．１）等の代謝産物が、顕著な概日性のリズム（ＦＤＲ＜０．１）を示した。さらに、尿素サイクルで重要な役割を果たすアルギニン（Ａｒｇ）も、概日性のリズム（ＦＤＲ＝０．２１５、ＰＴ０．６）を有すると示唆された。
【０１５７】
クレアチン経路、及びこれの近傍のグリシン並びにトレオニンの代謝においては、グアニドアセテート（ＰＴ６．２）、クレアチン（ＰＴ１４．７）、クレアチニン（ＰＴ１８．７）、サルコシン（ＰＴ１８．０）、及びジメチルグリシン（ＰＴ１６．５）のような代謝産物が顕著な概日性のリズム（ＦＤＲ＜０．１）を示した。アルギニン（ＰＴ０．６）は、最初にグアニドアセテートに変換され、次いでグアニドアセテート（ＰＴ６．２）はクレアチンに変換される。クレアチン（ＰＴ１４．７）は最終的にクレアチニン（ＰＴ１８．７）又はサルコシン（ＰＴ１８．０）に変換され、これらはジメチルグリシン（ＰＴ１６．５）からも変換されるものである。これら代謝産物の分子ピーク時間の相違は、クレアチン経路、及びこれに近傍のグリシン並びにトレオニンの代謝における連続的なプロセシングの様子を反映しているといえる。
【０１５８】
また、実施例１から９にて示した通り、代謝産物時刻表法を用いることで、哺乳類の個体で安定して体内時刻を測定でき、また概日リズム障害が検出できる（特に実施例６）。概日リズム障害は、環境的な要因（例えば時差ぼけ）により、及び／又は、遺伝的要因（家族性の睡眠相前進症候群）により引き起こされる。
【０１５９】
Ｂｒｏｗｎら（参考文献：（１）Brown SA et al. (2005) The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLoS Biol 3: e338.：（２）Brown SA et al. (2008) Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 1602-1607.）は、細胞中の概日時計を特徴づけすることによって、概日リズム障害を検出したことを報告している。具体的には、彼らはヒトの皮膚サンプルを採取し、その細胞を培養して、体内時計に制御されるレポータを当該細胞中に遺伝子導入し、体内時計の様子を観察した。単離細胞中の概日時計の特徴は、対象たるヒトのクロノタイプ（個体レベルの概日時計の特徴）と相関を示し、この方法によって先天的な（inherited）概日リズム障害を検出することができる可能性を示唆した。しかし、Ｂｒｏｗｎらの方法は環境要因を排するために、先天的な（遺伝的要因による）概日リズム障害は検出できるが、後天的な（環境要因による）概日リズム障害（例えば時差ぼけ）は検出できない。仮に彼らの方法で環境要因を含む概日リズム障害を検出しようとすると、個体レベルで遺伝子導入を行わなければならず、これは現実的ではない。また、現状では検査する細胞を採取する必要があることや、培養細胞に対して遺伝子導入を行わなければならないために、検査の手間も非常にかかるなどの問題がある。一方で、本発明ではこれらの問題を招来することがない。
【０１６０】
さらに、実施例１から５および実施例７、８にて示した通り、１）本発明に係るインジケーターを用いて、異なる光条件（ＬＤ及びＤＤ）下で、及び異なる遺伝的背景を有する個体間（ＣＢＡ／Ｎ及びＣ５７Ｂｌ／６マウス）で、一日を通じた個体の体内時刻の推定を非常に高精度に行うことができた。２）また、血漿中のインジケーターを用いた代謝産物時刻表は、給餌環境、年齢及び性別の違いを超えて共通しており、当該インジケーターの有用性が示唆された。３）加えて、本発明の方法が、時差ぼけ哺乳類における概日リズムの不調に対する敏感かつ正確な検出手段となることが示唆された。
【０１６１】
もちろん、ＬＣ−ＭＳ分析、ＣＥ−ＭＳ分析に限定されず他のメタボロミクス技術も本発明の目的で使用することができ、これにより何百もの時刻指示代謝産物の定量・同定が可能となり、個々人の血液サンプルから体内時刻の測定をすることができる。すなわち、本発明は、例えば個人特化型の（テーラーメイド）医薬の実現の一つの可能性である時間治療に道を拓くものであるが、これは、個人の体内時刻の情報を用いた投薬を行い、薬剤の効能を最大化したりその副作用を最小化したりするものである。
【０１６２】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明は、ヒトを含む哺乳類の体内時刻の推定、及び体内時刻のずれの検出に利用することができる。そのため、本発明を、例えば、概日リズム障害の発症有無の検出、時間治療、及び個人特化型の医薬や投薬方法の開発に利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の体内時刻の新規なインジケーター、及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、概日時計（サーカディアンクロック）を有し、様々な生理学的プロセス及び代謝プロセスにおいて、内在的かつ自律振動型で２４時間以内の周期性を持つ振動が見られることが報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
哺乳類では、例えば、Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1、Cry2、RevErbA、Rora、Csnk1e、Csnk1d、及びFbxl3等の時計遺伝子が、中枢時計組織及び／又は末梢時計組織における、遺伝子の周期的な発現制御の少なくとも一部に関与していると報告されている（非特許文献２〜４）。
【０００４】
また、中枢時計組織及び／又は末梢時計組織における遺伝子発現の周期的な変動を反映して（非特許文献５〜８）、投与された薬剤の効用、及び／又は、毒性は、当該薬剤が投与された時点での体内時刻に依存することが報告されている（非特許文献９〜１３）。
【０００５】
すなわち、最適な体内時刻でヒトに投与された薬剤は、その効用が最大かつ毒性が最小となり、より良好な薬物治療の結果が得られうる（非特許文献１４）。対照的に、不適切な体内時刻でヒトに投与された薬剤は、酷い副作用を引き起こしうる（非特許文献１５）。
【０００６】
しかし、上記のように、体内時刻に基づいた治療（時間治療として知られる（非特許文献９〜１３））の重要性が認識されているにも関わらず、医療現場にて体内時刻を容易に測定できる方法が無いという問題のため、時間治療の普及が進んでいないという実情があった。
【０００７】
上記の問題を解決するため、本願発明者らは、既に分子時刻表法（molecular-timetable method）という概念を確立している（非特許文献１６）。分子時刻表法では、分子時刻表中に位置づけられた遺伝子の発現量の周期的な増減パターンをプロファイリングすることで、１日の中での体内時刻を知ることができる。具体的には、本願発明者らは、標的器官中での時計制御遺伝子（clock-controlled gene）の発現プロファイルを用いて、このコンセプトの正しさを証明済である（非特許文献１６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Dunlap JC, Loros JJ, DeCoursey PJ eds. (2004) Chronobiology: Biological timekeeping (Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachusetts, U.S.A).
【非特許文献２】Reppert SM, Weaver DR (2002) Coordination of circadian timing in mammals. Nature 418: 935-941.
【非特許文献３】Ueda HR (2007) Systems biology of mammalian circadian clocks. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 72: 365-380.
【非特許文献４】Takahashi JS, Hong HK, Ko CH, McDearmon EL (2008) The genetics of mammalian circadian order and disorder: Implications for physiology and disease. Nat Rev Genet 9: 764-775.
【非特許文献５】Akhtar RA et al. (2002) Circadian cycling of the mouse liver transcriptome, as revealed by cdna microarray, is driven by the suprachiasmatic nucleus. Curr Biol 12: 540-550.
【非特許文献６】Panda S et al. (2002) Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock. Cell 109: 307-320.
【非特許文献７】Storch KF et al. (2002) Extensive and divergent circadian gene expression in liver and heart. Nature 417: 78-83.
【非特許文献８】Ueda HR et al. (2002) A transcription factor response element for gene expression during circadian night. Nature 418: 534-539.
【非特許文献９】Halberg F (1969) Chronobiology. Annu Rev Physiol 31: 675-725.
【非特許文献１０】Labrecque G, Belanger PM (1991) Biological rhythms in the absorption, distribution, metabolism and excretion of drugs. Pharmacol Ther 52: 95-107.
【非特許文献１１】Lemmer B, Scheidel B, Behne S (1991) Chronopharmacokinetics and chronopharmacodynamics of cardiovascular active drugs. Propranolol, organic nitrates, nifedipine. Ann N Y Acad Sci 618: 166-181.
【非特許文献１２】Reinberg A, Halberg F (1971) Circadian chronopharmacology. Annu Rev Pharmacol 11: 455-492.
【非特許文献１３】Reinberg A, Smolensky M, Levi F (1983) Aspects of clinical chronopharmacology. Cephalalgia 3 Suppl 1: 69-78.
【非特許文献１４】Levi F, Zidani R, Misset JL (1997) Randomised multicentre trial of chronotherapy with oxaliplatin, fluorouracil, and folinic acid in metastatic colorectal cancer. International organization for cancer chronotherapy. Lancet 350: 681-686.
【非特許文献１５】Ohdo S, Koyanagi S, Suyama H, Higuchi S, Aramaki H (2001) Changing the dosing schedule minimizes the disruptive effects of interferon on clock function. Nat Med 7: 356-360.
【非特許文献１６】Ueda HR et al. (2004) Molecular-timetable methods for detection of body time and rhythm disorders from single-time-point genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 11227-11232.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、標的器官中（例えば、肝臓中）での遺伝子発現のプロファイルから体内時刻を推測する方法は、医療現場への応用が困難である。その理由は、遺伝子発現のプロファイルを取得するために標的器官からサンプルを採取する必要が生じ、手間が非常にかかる上、患者の身体的な負担も大きくなるためである。
【００１０】
一方、哺乳類の血液中に含まれる、代謝産物（metabolite）、ホルモン等の低分子化学物質の中には、概日性の周期振動を示すものがあるらしいことが報告されている。例えば、ステロイドホルモンの一種であるコルチコステロンの濃度は、ピークが夕刻となるような周期性をもって概日時計により制御されるとの報告がある（参考文献：Kennaway DJ, Owens JA, Voultsios A, Varcoe TJ (2006) Functional central rhythmicity and light entrainment, but not liver and muscle rhythmicity, are clock independent. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 291: R1172-1180.）。また、アミン由来のホルモンであるメラトニンは、マウスでは、早朝にピークを持つ概日周期を示す（参考文献：Kennaway DJ, Voultsios A, Varcoe TJ, Moyer RW (2002) Melatonin in mice: Rhythms, response to light, adrenergic stimulation, and metabolism. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 282: R358-365.）。
【００１１】
ヒトでは、数種のペプチドホルモンのレベルが１日を通じて変化することが知られ、例えば、成長ホルモンのレベルが睡眠中に増加すること（参考文献：Takahashi Y, Kipnis DM, Daughaday WH (1968) Growth hormone secretion during sleep. J Clin Invest 47: 2079-2090.）、レプチンのレベルが夕方の間に増加すること（参考文献：Schoeller DA, Cella LK, Sinha MK, Caro JF (1997) Entrainment of the diurnal rhythm of plasma leptin to meal timing. J Clin Invest 100: 1882-1887.）、及びプロラクチンのレベルが夜中に増加することの報告がある（参考文献：Kok P et al. (2006) Increased circadian prolactin release is blunted after body weight loss in obese premenopausal women. Am J Physiol Endocrinol Metab 290: E218-224.）。また、アミノ酸である、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、システイン、グルタチオン、及びホモシステインの濃度は、ヒトの血漿中で、一日を通じて変化するとの報告がある（参考文献：（１）Breum L, Rasmussen MH, Hilsted J, Fernstrom JD (2003) Twenty-four-hour plasma tryptophan concentrations and ratios are below normal in obese subjects and are not normalized by substantial weight reduction. Am J Clin Nutr 77: 1112-1118.（２）Forslund AH et al. (2000) Inverse relationship between protein intake and plasma free amino acids in healthy men at physical exercise. Am J Physiol Endocrinol Metab 278: E857-867.（３）Blanco RA et al. (2007) Diurnal variation in glutathione and cysteine redox states in human plasma. Am J Clin Nutr 86: 1016-1023.（４）Bonsch D et al. (2007) Daily variations of homocysteine concentration may influence methylation of DNA in normal healthy individuals. Chronobiol Int 24: 315-326.）。
【００１２】
しかしながら、哺乳類の血液中の化学物質を用いて体内時刻に関連する情報を十分な精度で推測する方法は、今日まで確立されていない。その理由として、血液中の化学物質に関して、その存在量の周期的変動に関する包括的なプロファイリングの報告がなく、１）血液中の化学物質の中に体内時刻の測定に使用しうるほど正確な概日周期を示すものがあるかについてそもそも解明されていない点、及び、２）それゆえ、どの化学物質が体内時刻の測定に使用可能なほど正確な概日周期を示すのか全く知見がない点、が挙げられる。なお、体内時刻の測定に普遍的に使用できる化学物質には、性別、年齢、遺伝的背景、及び栄養摂取の状態などに左右されず、概日周期を持つ量的変化を示すものが特に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を解決するために、本願発明者らは血液サンプル中に含まれる化学物質を用いて体内時刻に関連する情報の推定が出来るか否かについて鋭意検討を行った。その結果、哺乳類の血液中の血漿成分に含まれる所定の代謝産物の存在量が、体内時刻の測定に使用可能な正確さをもって周期的に変動しており、当該代謝産物が体内時刻のインジケーターとなりうることを初めて見出し、本願発明に想到するに至った。
【００１４】
すなわち、本願発明に係る哺乳類における体内時刻のずれの検出方法は、上記の課題を解決するために、哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血液中の血漿に含まれる代謝産物の量を測定する工程と、当該代謝産物の量の経時的な変化のパターンに基づき哺乳類の体内時刻（ここでは、経時的な変化のパターンを取得したものと同じ代謝産物に基づき推定された体内時刻が好ましい）のずれを検出する工程とを含み、当該代謝産物が、１−メチルニコチンアミド、グアニドアセテート、カルニチン、シチジン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、グリシン、クレアチン、Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン、メチオニンスルホキシド、グルタミン、トレオニン、サルコシン、トレオニン（１３Ｃ）、プロリン、バリン、オルニチン、クレアチニン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート、α−アミノアジペート、シトルリン、４−グアニジノブチレート、トリメチルアミンＮ−オキシド、リゾフォスファチジルコリン(１８：１)、リゾフォスファチジルコリン(２０：４)、リゾフォスファチジルコリン(２０：３)、リゾフォスファチジルコリン(２０：２)、リゾフォスファチジルコリン(１８：３)、リゾフォスファチジルコリン(２２：６)、リゾフォスファチジルコリン(２２：５)、及びリゾフォスファチジルコリン(２２：４)（ここで、各リゾフォスファチジルコリンの後段に括弧書きで示す数字は、順に、脂肪酸の部分を構成する炭素原子の数と、不飽和結合を有する炭素原子の数とを示す）からなる代謝産物群より選択される少なくとも一つの代謝産物であることを特徴としている。
【００１５】
本願発明に係る体内時刻のずれの検出方法は、また、検査対象となる哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血液中の血漿に含まれる代謝産物の量を測定する工程と、代謝産物の量の経時的な変化のパターンを、検査対象となる哺乳類と同種の基準となる哺乳類の血漿に含まれる当該代謝産物の量の経時的な変化のパターンと比較して、パターンのずれの程度を取得する工程とを含み、上記した代謝産物群より選択される少なくとも一つの代謝産物を指標とすることを特徴としている。
【００１６】
上記のいずれかの方法によれば、哺乳類が有する概日リズムの変調のひとつの指標となる、当該哺乳類の体内時刻のずれを正確に把握することが可能となる。
【００１７】
本発明に係る体内時刻のずれの検出方法は、さらに、上記代謝産物が、カルニチン、シチジン、グリシン、サルコシン、バリン、イソロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート、４−グアニジノブチレート、及びトリメチルアミンＮ−オキシドからなる代謝産物群より選択される少なくとも一つの代謝産物であることがより好ましい。
【００１８】
上記の方法によれば、哺乳類が有する概日リズムの変調のひとつの指標となる、当該哺乳類の体内時刻のずれをより一層正確に把握することが可能となる。
【００１９】
本願発明に係る哺乳類における体内時刻のずれの検出方法は、上記の課題を解決するために、検査対象となる哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血液中の血漿に含まれる代謝産物の量を測定する工程と、代謝産物の量の経時的な変化のパターンを、検査対象となる哺乳類と同種の基準となる哺乳類の血漿に含まれる当該代謝産物の量の経時的な変化のパターンと比較して、パターンのずれの程度を取得する工程とを含み、上記代謝産物が、１）実施例の記載に従いＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析計）による解析をした結果取得される、表１中の１番目〜１４２番目（陽イオンモード）、及び１番目〜１７６番目（陰イオンモード）に示す代謝産物；、及び、２）実施例の記載に従いＣＥ−ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析計）による解析をした結果取得される、表３中の１番目〜１５３番目に示す代謝産物；からなる代謝産物群から選択される、少なくとも一つの代謝産物であることを特徴としている。なお、本発明において「〜」とは「から」の意味である。
【００２０】
本願発明に係る哺乳類における体内時刻のずれの検出方法では、より一層正確な検出を実現する観点から、さらに、上記代謝産物として、上記代謝産物群を構成する全ての代謝産物を用いることがより好ましい。
【００２１】
上記の方法によれば、哺乳類が有する概日リズムの変調のひとつの指標となる、当該哺乳類の体内時刻のずれを正確に把握することが可能となる。
【００２２】
本願発明に係る哺乳類における体内時刻のずれの検出方法では、より一層正確な検出を実現する観点から、さらに、上記パターンのずれの程度を、上記代謝産物の量が最大となる時刻、又は最小となる時刻の少なくとも一方を基準として取得することがより好ましい。
【００２３】
本願発明に係る哺乳類における体内時刻のずれの検出方法では、さらに、サンプリングを行うための１日内の異なる複数の時点が、４時間おきの６時点であってもよい。
【００２４】
本願発明に係る概日リズムの変調の有無の検査方法は、上記の課題を解決するために、上記した体内時刻のずれの検出方法により検出された体内時刻のずれが所定の範囲を越える場合に、検査対象となる哺乳類が概日リズムに変調をきたしていると判定する工程を含むことを特徴としている。
【００２５】
本願発明に係る体内時刻のインジケーターは、上記の課題を解決するために、１）実施例の記載に従いＬＣ−ＭＳ分析をした結果取得される、表１中の１番目〜１４２番目（陽イオンモード）、及び１番目〜１７６番目（陰イオンモード）に示す代謝産物；及び、２）実施例の記載に従いＣＥ−ＭＳ分析をした結果取得される、表３中の１番目〜１５３番目に示す代謝産物；からなる代謝産物群から選択される少なくとも一つであることを特徴としている。
【００２６】
本願発明に係る哺乳類の体内時刻測定キットは、上記の課題を解決するために、哺乳類の採血を行なう採血器具と、上記の体内時刻のインジケーターの血漿中における量を定量する定量手段と、を備えることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、哺乳類の血漿中に含まれる特定の代謝産物を体内時刻のインジケーターとして用いるため、当該哺乳類の体内時刻に係る情報がより容易に取得可能となるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】（ａ）〜（ｃ）は、本発明の実施例に関し、マウスの血漿中における代謝産物量が示す概日周期性の変動を表す図である。
【図２】（ａ）及び（ｂ）は、本発明の実施例に関し、マウスの体内時刻の推定の結果を示す図である。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、本発明の実施例に関し、図２に示すマウスとは系統（遺伝的背景）が異なるマウスでの体内時刻の推定の結果を示す図である。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、本発明の実施例に関し、週齢及び性別が異なるマウスでの体内時刻の推定の結果を示す図である。
【図５】（ａ）〜（ｃ）は、本発明の実施例に関し、時差ぼけ状態にあるマウスでの体内時刻の推定の結果等を示す図である。
【図６】（ａ）〜（ｄ）は、本発明の実施例に関し、ＣＥ−ＭＳ分析の結果に基づき作成した代謝産物時刻表（（ａ）・（ｂ））、及び体内時刻の推定の結果（（ｃ）・（ｄ））を示す図である。
【図７】本発明の実施例に関し、給餌環境が相違するマウスでの体内時刻の推定の結果を示す図である。
【図８】（ａ）〜（ｄ）は、本発明の実施例に関し、図６に示すものより厳格な基準でのＣＥ−ＭＳ分析に基づき作成した代謝産物時刻表（（ａ）・（ｂ））、及び体内時刻の推定の結果（（ｃ）・（ｄ））を示す図である。
【図９】本発明の実施例に関し、ＣＥ−ＭＳ分析の結果に基づき具体的な名称が特定された２８種類の代謝産物量の概日周期性の変動を表す図である。
【図１０】本発明の実施例に関し、ＬＣ−ＭＳ分析の結果に基づき具体的な名称が特定された代謝産物量の概日周期性の変動を表す図である。
【図１１】本発明の実施例に関し、ＬＣ−ＭＳ分析で得られた振動ピークのうち、代謝産物時刻表の作成に使用したピーク数と、推定された体内時刻との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００３０】
本発明は、哺乳類の血漿中に含まれる特定の代謝産物の存在量が、概日周期をもって変化する（振動する）ことを新規に見出したことに基づきなされたものである。
【００３１】
特に、対象となる哺乳類の遺伝的背景の相違、週齢、性別、食事環境（給餌環境）等の要因に左右されることなく、血漿中に含まれる特定の代謝産物が、当該哺乳類の体内時刻を示すインジケーターとして好適に利用できることを新規に見出したことに基づきなされたものである。
【００３２】
本発明において「哺乳類」の種類は特に限定されないが、ラット、ウサギ、マウス、ヤギ、サルその他の実験動物や、ヒト等が例示され、中でもヒトが好ましい。また、ヒトの中でも、後述する概日リズム障害の発症危険度の高い、或いは既に発症している蓋然性が高いヒトがより好ましい。
【００３３】
また、「概日、又は概日性（の周期、又はリズム）」とは、生物が内在的に概ね２４時間（２０時間から２８時間）で１サイクルする周期性を有することを指し、より好ましくは２２時間から２６時間で１サイクルの周期性を有することを指す。従って、上記のインジケーターが「概日性の振動」を示すとは、血漿中における当該インジケーターの存在量（血中での代謝量）が概日性の周期をもって変動することと同義である。
【００３４】
また、「概日リズム障害」とは、広義には、概日リズムの異常に起因する不調全般を指し、具体的には、例えば、家族性の睡眠相前進症候群（ADVANCED SLEEP PHASE SYNDROME）を含む睡眠覚醒リズム障害、季節性うつ病、時差ぼけ、等が挙げられる。
【００３５】
また、「体内時刻（体内時刻：Body time又はＢＴ）」とは、生物が内在的に有するいわゆる体内時計（生物時計）に基づく時刻を指す。
【００３６】
また、「代謝産物」とは、哺乳類の体内での代謝反応における中間産物、及び最終生成物を指す通常の意味で用いており、一次代謝物、及び二次代謝物の双方を含む概念である。さらに、天然に存在する同位体を含む代謝産物、及び同位元素等で人工的に標識された化合物の代謝産物も含まれる。
【００３７】
また、「ＺＴ（ツァイトゲーバー時刻）」とは、明暗条件（ＬＤ条件と同義；照明１２時間、暗１２時間）下における照明（点灯）開始時をＺＴ０時とした２４時間周期の時間体系を指す。すなわち、明条件（照明点灯）はＺＴ０〜ＺＴ１２まで継続し、暗条件（照明消灯）はＺＴ１２〜ＺＴ２４まで継続する。
【００３８】
また、「ＣＴ（概日時刻）」とは、哺乳類にＬＤ条件を体験させた後、引き続いて恒暗条件（ＤＤ条件と同義）を体験させた場合の、恒暗条件開始時をＣＴ０時とした２４時間周期の時間体系を指す。すなわち、ＣＴ０は、ＤＤ条件に移行せずにそのままＬＤ条件を継続させたと仮定した場合のＺＴ０に相当する時刻である。
【００３９】
また、「分子ピーク時刻、又は分子時刻」とは、後述する体内時刻のインジケーターの血漿中における存在量が極大になる時刻（ＺＴ時刻体系、ＣＴ時刻体系、又は環境時刻体系における時刻）を指す。
【００４０】
なお、本発明において、「Ａ及び／又はＢ」とは、Ａ及びＢ、或いはＡ又はＢ、の双方を指す意味で用いる。
【００４１】
〔本発明に係る体内時刻のインジケーター〕
上記インジケーターとは、哺乳類の血漿中に含まれ、その存在量が概日性の周期をもって変動をするために、当該存在量を経時的に観察することで、その哺乳類の体内時刻を指し示すインジケーターとなる代謝産物を指す。すなわち、血漿中における当該インジケーターの存在量を測定すれば、対象となる哺乳類の体内時刻、及び体内時刻のずれを推定することができる。例えば、測定されたインジケーターの存在量を、後述する〔体内時刻のずれの検出方法、及び概日リズムの変調の検査方法〕の工程Ｂの説明で記載する「基準パターン１」又は「基準パターン２」と照合して、体内時刻、及び体内時刻のずれを推定することができる。
【００４２】
本発明に係るインジケーターは、具体的には、血漿中に含まれる以下の物質を指す。
１）実施例の記載に従いＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析計）による計測をした結果取得される、後述の表１中の１番目〜１４２番目（陽イオンモード）、及び１番目〜１７６番目（陰イオンモード）に示す代謝産物；及び、
２）実施例の記載に従いＣＥ−ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析計）による計測をした結果取得される、後述の表３中の１番目〜１５３番目に示す代謝産物；
からなる代謝産物群（「代謝産物群１」と称する）から選択される少なくとも一つのインジケーター。
【００４３】
上記１）に含まれる代謝産物では、具体的に化合物名が特定されているものが、血漿中における当該代謝産物の存在量の検出がより容易なため好ましい。これらの代謝産物としては、リゾフォスファチジルコリン（LysoPC）（18:1）、LysoPC（20：4）、LysoPC（20：3）、LysoPC（20：2）、LysoPC（18：3）、LysoPC（22：6）、LysoPC（22：5）、LysoPC（22：4）からなる代謝産物群（「代謝産物群２」と称する）から選択される少なくとも一つ、好ましくは全てのインジケーターが挙げられる。なお、各LysoPCの後段に付した括弧書きの記載は、順に、脂肪酸の部分を構成する炭素原子の数と、不飽和結合を有する炭素原子の数（不飽和度）とを表す。
【００４４】
また、上記２）に含まれる代謝産物の中では、よりいっそう正確なインジケーターになりうるとの観点から、表３中に示すＦＤＲが０．０１以下であるものが特に好ましい。この条件を満たすインジケーターは、具体的には、表３中の１番目〜４４番目に示す代謝産物群から選択される少なくとも一つ、好ましくは全てのインジケーターである。
【００４５】
さらに、上記２）に含まれる代謝産物の中では、具体的に化合物名が特定されているものが、血漿中における当該代謝産物の存在量の検出がより容易なため好ましい。これらの代謝産物としては、具体的には、１−メチルニコチンアミド、グアニドアセテート（グアニド酢酸エステル）、カルニチン、シチジン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、グリシン、クレアチン、Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン、メチオニンスルホキシド、グルタミン、トレオニン、サルコシン、トレオニン（１３Ｃ）、プロリン、バリン、オルニチン、クレアチニン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート（２−アミノブチルエステル）、α−アミノアジペート（α−アミノアジピン酸塩）、シトルリン、４−グアニジノブチレート（４−グアニジノブチルエステル）、及びトリメチルアミンＮ−オキシドからなる２８種類の代謝産物群（「代謝産物群３」と称する）から選択される少なくとも一つ、好ましくは全てのインジケーターが挙げられ、この中でも、表３中に示すＦＤＲが０．０１以下である上記条件を満たす、カルニチン、シチジン、グリシン、サルコシン、バリン、イソロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート、４−グアニジノブチレート、及びトリメチルアミンＮ−オキシドからなる１０種類の代謝産物群（「代謝産物群４」と称する）より選択される少なくとも一つ、好ましくは全てのインジケーターが特に好ましい。
【００４６】
なお、言及するまでもないが、表１及び表３に示す代謝産物は何れも、少なくとも実施例の記載の方法に従えば確実に検出することができるものだから、本発明に係る体内時刻のインジケーターとして当然に用いることができる。
【００４７】
〔体内時刻のずれの検出方法、及び概日リズムの変調の検査方法〕
本発明にかかる「体内時刻のずれの検出方法」の一例は、哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血漿に含まれる、代謝産物の量を測定する工程（工程Ａと称する）と、次いで、当該代謝産物の量の経時的な変化のパターンに基づき哺乳類の体内時刻のずれを検出する工程（工程Ｂと称する）と、を含んでなり、ここで測定対象となる代謝産物が、上記説明の「体内時刻のインジケーター」から選択されるものである。
【００４８】
ここで、工程Ａに関して、哺乳類から血漿をサンプリングする方法は、血液を採取し血漿を抽出するための公知の方法を採用すればよい。また、「１日内の異なる複数の時点でサンプリングする」とは、１日内に少なくとも２回以上のサンプリングをすることを指し、より好ましくは４回以上、さらに好ましくは６回以上のサンプリングをすることを指す。測定の精度を向上させるため、サンプリングの間隔を一定にすることが好ましい。例えば、１日内に４回サンプリングするときは６時間おきに、６回サンプリングするときは４時間おきに行なうことが好ましい。２点の場合は１２時間間隔で行う。なお、検出の精度を向上させるためは、サンプリングの間隔をそれぞれ４時間以内とすることが好ましい。
【００４９】
また、工程Ａに関して、「代謝産物の量を測定する方法」は特に限定されるものではなく、公知のいずれの方法を採用してもよい。具体的には例えば、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析計）分析、ＣＥ−ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析計）分析、ＧＣ／ＭＳ（ガスクロマトグラフィー／質量分析計）分析等の一般的なメタボローム解析に用いる手法（実施例も参照）；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を単独で使用する方法；ラジオイミュノアッセイ、ＥＬＩＺＡ法（エライザ法）等の免疫学的手法；を例示することができる。なお、多数（例えば、１０種以上）の代謝産物の量を同時に測定する場合には、ＬＣ−ＭＳ分析、ＣＥ−ＭＳ分析、ＧＣ／ＭＳ分析等の一般的なメタボローム解析に用いる手法を用いることがより好ましく、１又は少数（例えば、９種以下、より好ましくは１〜５種）の代謝産物の量を同時に測定する場合には、各代謝産物の量を個別に測定可能な免疫学的手法、又は高速液体クロマトグラフィーを単独で使用する方法、等がより好ましい。
【００５０】
なお、上記工程Ａは、後述する〔体内時刻のずれの検出方法、及び概日リズムの変調の検査方法〕の工程Ｂの説明で記載する「基準パターン１」又は「基準パターン２」を作成するための工程であってもよい。或いは、工程Ａは、「体内時刻」又は「体内時刻のずれ」の検出対象となる哺乳類自身（検査対象となる哺乳類）の血漿を対象として行なわれる工程であってもよい。後述の「代謝産物時刻表法」（実施例参照）に基づけば、検査対象となる哺乳類の血液（血漿）は少なくとも一時点で採取すればよいが、複数時点で採取してもよく、或いは、「代謝産物時刻表法」以外の方法に基づき「体内時刻」又は「体内時刻のずれ」を検出する場合には、検査対象となる哺乳類の血液（血漿）は複数時点で採取する必要もありえる。
【００５１】
工程Ｂに関して、「代謝産物の量の経時的な変化のパターン」とは、例えば、サンプリングした複数の時刻と、当該時刻における血漿中の代謝産物の量との関係を示すものであればよく、特に限定されないが、例えば、サンプリングした時刻と当該時刻における代謝産物の量との関係を示すグラフ等が例示される。ここで、「代謝産物の量」は実測値であってもよいし、当該実測値を正規化（ノーマライゼーション）したものであってもよい。また、一定の周期性をもって振動している物質の振動のパターンを、当該パターンに類似したコサイン曲線（余弦波）で表現したものを用いることもできる（参考文献：Ueda HR et al. (2004) Molecular-timetable methods for detection of body time and rhythm disorders from single-time-point genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 11227-11232.）。
【００５２】
また、工程Ｂに関して、「代謝産物の量の経時的な変化のパターン」に基づいて「哺乳類の体内時刻のずれを検出する」方法は特に限定されるものではないが、
１）検査対象となる哺乳類自身が平常時にあるときに、予め、血漿中の代謝産物の量の経時的な（すなわち環境時刻と対応させた）変化のパターン（「基準パターン１」と称する）を測定しておき、当該基準パターン１と、検査時に取得した当該代謝産物の量の変化のパターンとを比較して、両パターンのずれの程度を体内時刻のずれとして検出する方法、
２）検査対象となる哺乳類における上記「代謝産物の量の経時的な変化のパターン」を、検査対象となる哺乳類と同種の、基準となる哺乳類の血漿に含まれる当該代謝産物の量の経時的な変化のパターン（「基準パターン２」と称する）と比較して、パターンのずれの程度を体内時刻のずれとして検出する方法、
等が例示される。なお、基準パターン２の取得に際しては、平常時にある当該哺乳類を複数個体用いて、測定した代謝産物の量の平均値を採用することがより一層の正確性を期する上でより好ましい。
【００５３】
また、工程Ｂに関しては、１種類の代謝産物（インジケーター）のみを用いることもできるが、複数種類の代謝産物を用いることが、検出結果のより一層の正確性を期するという観点ではより好ましく、さらには、「インジケーター」の項目で説明した「代謝産物群１」、「代謝産物群２」、「代謝産物群３」、及び「代謝産物群４」の何れかの代謝産物群を構成する全ての代謝産物を用いることが特に好ましい。特に、後述する「代謝産物時刻表法」を採用する場合には、必要とされる検出精度にも依存するが、２０種類以上の上記代謝産物を用いることが好ましい（実施例も参照のこと）。
【００５４】
さらには、より容易かつ正確にパターン同士の比較が出来るという観点からは、工程Ｂに関して、前記「パターンのずれの程度」を、血漿中に含まれる代謝産物の量が最大となる時刻（分子ピーク時刻、又は分子時刻に相当）、又は最小となる時刻の少なくとも一方を基準として取得することがより好ましく、血漿中に含まれる代謝産物の量が最大となる時刻を基準とすることが特に好ましい。一例としては、検査対象となる哺乳類での或る代謝産物Ａの分子ピーク時刻と、基準となる哺乳類での代謝産物Ａの分子ピーク時刻とのずれを、前記「パターンのずれの程度」として検出することができる。
【００５５】
また、複数の代謝産物（インジケーター）を用いる場合、分子ピーク時刻が互いに異なるものを選択することが好ましい。なお、各代謝産物の分子ピーク時刻は、表１及び表３中に「Peak Time(h)」として示したものである。分子ピーク時刻に基づいて代謝産物を選択する方法は、特に限定されないが、例えば、１日（２４時間）を均等分割して、各分割時間幅に分子ピーク時刻が入る代謝産物から少なくとも一種類ずつ選択すればよい。例えば、１日を１２分割する場合、表１及び表３に示す分子ピーク時刻が０〜２ｈの代謝産物から少なくとも一種、同時刻が２〜４ｈの代謝産物から少なくとも一種、同時刻が４〜６ｈの代謝産物から少なくとも一種、以下同様にして、同時刻が２２〜２４ｈの代謝産物から少なくとも一種、選択すればよい。なお、均等分割の方式は、特に限定されないが、検出の精度を向上させるため少なくとも１日を６分割以上とすることが好ましい。
【００５６】
工程Ｂにて検出された「体内時刻のずれ」は、概日リズムの変調の有無、概日リズム障害の発症有無、又は発症のリスクを検出する上でひとつの重要な指標となりうる。すなわち「体内時刻のずれ」が実質的に検出されない（ずれが実質的に０である）、或いは、体内時刻のずれが所定の範囲内に収まっている場合には、検査対象の哺乳類は概日リズムに実質的な変調をきたしていない（すなわち、概日リズム障害を発症していない蓋然性がより高い、又は近い将来に概日リズム障害を発症するリスクがより少ない）と判定することができる。
【００５７】
一方、上記「体内時刻のずれ」が所定の範囲外である場合には、検査対象となっている哺乳類はその概日リズムに変調をきたしている（例えば、概日リズム障害を既に発症している、又は近い将来に概日リズム障害を発症するリスクを有する）と判定することができる。なお、上記「体内時刻のずれの所定の範囲」は、検査対象となる哺乳類の種類、検査に求められる精度等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、１時間以内、２時間以内、又は４時間以内である。
【００５８】
〔その他の応用〕
本発明にかかる「哺乳類の体内時刻測定キット」は、少なくとも、哺乳類の採血を行うための採血器具と、上記したインジケーターの血漿中における存在量を測定する測定手段（定量手段）とを備える。ここで、「採血器具」は、注射器などの公知のものを適宜使用することができる。また、「測定手段（定量手段）」は、対象となるインジケーターの種類に応じて公知の手段を使用することができ、例えば、当該インジケーター用のＥＬＩＺＡキット等が例示される。
【００５９】
また、上記体内時刻測定キットは、必要に応じて、キットの取扱説明書、採血を行った又は行うべき時刻を記憶する機能を有するタイムキーパー（ストップウォッチ機能及び／又はタイマー機能付の時計等）等をさらに備えていてもよい。また、当該体内時刻測定キットは、概日リズム障害の検出キットとしても利用可能である。
【００６０】
さらに、本発明にかかる体内時刻のインジケーターを用いれば、後述する代謝産物時刻表の作成（実施例参照）や、検査対象となる哺乳類の体内時刻の推定を従来よりも容易に行うことができ、日常の健康保持増進、及びいわゆる時間治療への応用可能性がより一層高まる。すなわち、哺乳類の特定の組織における遺伝子発現量の周期的な変化から体内時刻を推定する方法と比較して、本発明は、解析対象となるサンプル（血漿）の取得が容易であり、かつ週（年）齢、性別、遺伝的背景及び給餌環境（ヒトの場合、食事環境）の影響を受けにくいという特性を有している。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、初めに、本発明に用いた材料（実験動物）、及び方法について、以下の（１）〜（１４）にまとめて説明する。
【００６２】
（１）実験動物
ＣＢＡ／Ｎマウスは、日本ＳＬＣ株式会社（静岡, 日本）より購入した。５〜６週齢のオスのマウス（以下若いオスと称する）、同週齢のメスのマウス（若いメスと称する）、及び繁殖からリタイアさせた約６ヶ月齢の老齢のオスのマウス（老齢オスと称する）を準備した。オスのＣ５７Ｂｌ／６マウス（５〜６週齢）は、チャールズ・リーバー社（Charles River（横浜，日本））から購入した。
【００６３】
上記の全マウスは、明暗（ＬＤと称する；照明１２時間，暗１２時間）条件下で２週間、ペレット状の餌（ＣＲＦ−１，チャールズ・リーバー社）及び水を無制限に与えて飼育した。
【００６４】
Ｃｒｙ１遺伝子とＣｒｙ２遺伝子を両方欠損したマウス（Ｃｒｙ１,Ｃｒｙ２ｄK．O．）マウスは、元々、安井明博士 及びvan der Horst博士により作成された（参考文献：van der Horst GT et al. (1999) Mammalian cry1 and cry2 are essential for maintenance of circadian rhythms. Nature 398: 627-630.）。東北大学で維持されていたマウスの一部を理化学研究所発生・再生科学総合研究センターに移入し、同所で維持及び繁殖を行った。
【００６５】
（２）サンプリングのスケジュール
マウス血漿のサンプリングは、ＬＤ及びＤＤ（恒暗）条件下の双方で行った。ＤＤ条件下でのサンプリングでは、サンプリングを開始する日から、飼育室を恒暗条件に変更した。サンプリングはＺＴ０又はＣＴ０に開始し、ノボヘパリン（持田製薬株式会社，東京，日本）を含んだチューブ中に、４時間ごと２日間にわたりに（すなわち全部で１２サンプル）体幹血を採取した。なお、ＺＴ０とは明期の始まりを、ＣＴ０とは主観的な明期（恒暗条件において本来明期に相当する期間、subjective day）の始まりを表す。給餌状態を変えた実験の場合、サンプリング開始の１日前の消灯時点で、飼育ケージからペレット状の餌を取り除き、マウスを絶食状態とした。これらマウスは、体幹血の採取が終了するまで絶食状態を保った。サンプリングは、ＺＴ４(照明点灯後４時間)の時点で開始し、翌日のＺＴ０の時点で終了した(６時点／日)。体重の減少量を把握するため、マウスを処置する直前に当該マウスの体重測定を行なった（データ示さず）。血漿を濃縮するため、サンプリングした血液を、４°Ｃで５分間、１０００ｇの条件で２回、遠心分離した。上清（血漿サンプル）を回収し、ラジオイミュノアッセイ又はメタボローム解析（すなわち、ＬＣ−ＭＳ分析、及びＣＥ−ＭＳ分析）を行うまで、−８０℃で凍結保存した。
【００６６】
（３）時差ぼけ（jet-lag）実験
若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスを、ＬＤ条件下で２週間飼育した。次いで、照明を行なう時刻を、本来明かりがつく時間から８時間前倒しに点灯するようにし、ＬＤ条件を８時間前倒しにした（この日を第１日とする）。マウスを処置しその体幹血を、第１日、第５日、及び第１４日にサンプリングした。マウスの行動は、近赤外モニタリングシステム(NS-AS01,ニューロサイエンス社, 東京, 日本)により観察し、その観察結果をClockLab software（アクチメトリクス社（Actimetrix Inc.）, NW, 米国）を用いて可視化した。
【００６７】
（４）ＬＣ−ＭＳサンプル
上記血漿サンプルにアセトニトリル(225 μL)を加えて振とうした後、遠心分離を行なった。遠心分離で得られた上清を、新しいチューブに移して乾燥した。ＬＣ−ＭＳによる代謝産物の分析を行なう前に、当該乾燥したサンプルにアセトニトリル(25 μL)を加えて分析に供した。
【００６８】
（５）ＬＣ−ＭＳ条件
使用したＬＣシステムはAgilent 1100 series HPLC(アジレント・テクノロジーズ社, パロ・アルト, カリフォルニア, 米国)である。ZORBAX SB-C18 RRHT (φ2.1 50 mm, 1.8 μm)カラムをアジレント・テクノロジーズ社から購入し、当該カラムの温度を６０°Ｃに保持した。移動相として、Ａ液に０．１％の酢酸/水、Ｂ液にメタノールを用いた。グラジエントとして、Ｂ液４０％（０分）、Ｂ液９９％（２０分）、Ｂ液９９％（３０分）、Ｂ液４０％（３０．０１分）、これ以降４０分までＢ液４０％を保持した。また、流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入体積を１μＬとした。
【００６９】
ＭＳのデータは、Ｑｓｔａｒ ＸＬ質量分析計(アプライド・バイオシステムズ社, フォスター市, カリフォルニア州,米国)を用いて取得した。サンプルの分析は、陽イオン及び陰イオンエレクトロスプレー法の双方で行なった。
【００７０】
陽イオンのＭＳ条件（陽イオンモード,ＴＯＦスキャンモード）は以下の通りである：
スプレー電圧 ５．５キロボルト;
スキャンレンジｍ／ｚ ２５０−７００;
カーテンガス, ２０任意単位(窒素ガス)；
ガス１, ５０任意単位;
ガス２, ５０任意単位(５００°Ｃ)；
デクラスタリングポテンシャル１／２ ５０ボルト／１５ボルト；。
【００７１】
陰イオンのＭＳ条件（陰イオンモード，ＴＯＦスキャンモード）は、スプレー電圧を−４．５キロボルトとし、デクラスタリングポテンシャル１／２を−５０ボルト／−１５ボルトとした以外は、上記陽イオンの場合と同じである。
【００７２】
（６）ＬＣ−ＭＳデータのピーク相関
ＬＣ−ＭＳデータセットは、次の３連のサンプル由来のものから構成される。
第１連は、代謝産物時刻表の作成に用いる次のサンプルセットを含む：ＬＤ(サンプル数ｎ＝５／時点)条件下、ＤＤ(ｎ＝４−６／時点)条件下で採取され各時点でミックスされた、若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスの血漿、及びＣｒｙ１,Ｃｒｙ２ｄＫ．Ｏ．マウスの血漿(ｎ＝２／時点)。
第２連は、体内時刻の測定に用いる次のサンプルセットを含む：
ＬＤ条件下、及びＤＤ条件下で採取した、個体毎（６時点）のＣＢＡ／Ｎマウスの血漿；
ＬＤ条件下、及びＤＤ条件下で採取した、個体毎（６時点）のＣ５７Ｂｌ／６マウスの血漿；
ＬＤ条件下で採取した老齢オス及び若いメスのＣＢＡ／Ｎマウスの血漿（２時点）、及び時差ぼけ実験を体験させた若いオスＣＢＡ／Ｎマウスの血漿（２時点）。
第３連は、絶食期間中に採取したＣＢＡ／Ｎマウス（個体毎、６時点）の血漿である。
【００７３】
各連に含まれるサンプルは２日以内に測定をした。これら三つの連の測定間隔は、第１連と第２連との間は約３ヶ月、第１連と第３連との間は約１年であった。
【００７４】
各連間のピークの相関を求めるため、Marker View software (アプライド・バイオシステムズ社, フォスター市, カリフォルニア州, 米国)を用いた。そして、検出範囲を、移動時間３分から２８分の間に設定した。各連間のピークの相関を求めるに際して、既報（参考文献：Soga T et al. (2006) Differential metabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione consumption. J Biol Chem 281: 16768-16776.を参照）に基づいて保持時間を修正し、次いで、次の値が最小となるように２つの連間のピークの関連付けを行なった。：
連間で(ｍ／ｚの差)が見られるピークにおける、(（２つの連間のｍ／ｚの差）／Ｘ)2＋(２つの連間のＲＴの差／Ｙ)2＜Ｘ、及び(ＲＴの差)＜両連のＹそれぞれ。
ここで、上記のパラメータＸ及びＹは以下の手順（ａ）〜（ｃ）でもとめられる。：
（ａ）Ｘ及びＹの値を変化させ(例えば、Ｘ＝０．０１，０．０２，．．．，０．１５、及びＹ＝０．１，０．２，．．．，１．５)て、ピーク同士を関連付けた。
（ｂ）次いで、相関するピーク面積のピアソン相関を計算し、ｐ値を算出した。
（ｃ）そのうえで、ｐ値が最も小さくなるパラメータセットＸ・Ｙを選択した。
この手順において、最良のパラメータセットＸ・Ｙの組合わせは、第１連と第２連との間ではＸ＝０．０９，Ｙ＝０．５(陽イオン)、及びＸ＝０．１３，Ｙ＝０．４(陰イオン)であり、第１連と第３連との間では、Ｘ＝０．１１，Ｙ＝０．９(陽イオン)、及びＸ＝０．１５，Ｙ＝１．３(陰イオン)であった。
【００７５】
（７）ＣＥ−ＭＳサンプル
振動性の物質を選択するため、各時点のミックスしたマウスの血漿(４−１０匹／時点)を使用し、個々のマウスの血漿を体内時刻測定に用いた。５５μＭのメチオニンスルホン、及び５５μＭの２−モルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含む１．８ｍＬメタノール中に、血漿サンプル(１００μｌ)を加えてよく混合した。ここにさらに、８００μＬの脱イオン水、及び２ｍＬのクロロホルムを加え、当該溶液を２５００ｇで５分、４℃の条件下で遠心分離した。次いで、タンパク質を除去するため、遠心分離後に得られた８００μＬの水性の上層を、ミリポア５−ｋＤａカットオフフィルタ（Millipore 5-kDa cut-off filter）を用いて遠心ろ過した。次いで、ろ過物を凍結乾燥し、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ分析に先立って、当該ろ過物を、参照化合物（２００μＭの３−アミノピロリジン、及び２００μＭのtrimesate）を含んだ５０μＬのMilli-Q（ミリポア社, ベッドフォード, マサチューセッツ, 米国）水中に溶解した。
【００７６】
（８）ＣＥ−ＭＳ用の代謝産物標準
全ての標準化学物質は通常ルートの購入により入手し、これら化学物質の１０ｍＭ又は１００ｍＭのストック溶液を得るために、Milli-Q水、０．１ＮのＨＣｌ、又は０．１ＮのＮａＯＨ中に溶解した。使用する標準化学物質の混合液は、ＣＥ−ＴＯＦＭＳに注入する直前に、上記ストック溶液をMilli-Q水で希釈して調製した。使用した標準化学物質は何れも分析又は試薬等級のものである。
【００７７】
（９）ＣＥ−ＭＳ用の分析装置
ＣＥ−ＴＯＦＭＳの実験は全て、何れもアジレント・テクノロジーズ社製の、アジレントＣＥキャピラリー電気泳動システム、アジレントG3250AA LC/MSD TOFシステム、アジレント１１００シリーズ・バイナリーＨＰＬＣポンプ、G1603A アジレント CE-MS アダプタ、及びG1607A アジレント CE-ESI-MS スプレイヤー・キット、を用いて行なった。
【００７８】
ＣＥ−ＭＳ用の装置の制御、及びデータの取得のため、ＣＥ用にはG2201AA アジレント ケム・ステーション ソフトウェアを、アジレント TOFMS ソフトウェア用にはthe Analyst QSを用いた。ＣＥ−ＭＳ／ＭＳ分析における化合物の同定は、Agilent CE instrumentに接続した、Q-Star XL Hybrid LC-MS/MS System(アプライド・バイオシステムズ社)を用いて行なった。
【００７９】
（１０）陽イオン性の代謝産物の分析のためのＣＥ−ＴＯＦＭＳ条件
電解質としての１Ｍのギ酸で満たした、溶融シリカキャピラリー(内径５０μｍ×全長１００ｃｍ)を用いて分離を行った。およそ４８倍に希釈した３ｎｌのサンプル溶液を、５０ｍｂａｒで３秒、３０キロボルトの印加電圧条件で、当該キャピラリー内に注入した。
【００８０】
キャピラリーの温度を２０℃に維持し、サンプルトレーの温度を５℃以下に冷却した。シース液として０．５μＭのレセルピンを含むメタノール／水（５０％ ｖ／ｖ）を、１０μＬ／ｍｉｎの流速でキャピラリーに供給した。ＥＳＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（上記〔（９）ＣＥ−ＭＳ用の分析装置〕で説明したもの）を陽イオンモードで操作し、キャピラリーへの印加電圧を４キロボルトにセットした。熱乾燥窒素ガス（ヒーター温度３００℃）の流速を、ゲージ圧で１０ｐｓｉｇに維持した。ＴＯＦＭＳにおいて、フラグメンター電圧、スキマー電圧、及びオクタポール参照（Ｏｃｔ ＲＦＶ）電圧を、それぞれ１２０、５０、及び２００ボルトとした。
【００８１】
取得された各スペクトラムの自動リキャリブレーション（recalibration）は、参照標準物質の参照質量を用いて行なった。メタノール付加イオン（［２ＭｅＯＨ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｈ］＋, ｍ／ｚ ＝６５．０５９７）、及びレセルピン（［Ｍ＋Ｈ］＋， ｍ／ｚ＝６０９．２８０６）が、正確な質量測定用のロックマスを供する。正確な質量データは５０−１，０００ｍ／ｚのレンジにわたり、１０spectra/sのレートで取得した。
【００８２】
（１１）ＣＥ−ＭＳデータのピークの関連付け
ＣＥ−ＭＳデータのピークの関連付けは、KEIO MasterHANDs software(参考文献：Baran R et al. (2006) Mathdamp: A package for differential analysis of metabolite profiles. BMC Bioinformatics 7: 530)を用い、当該ソフトウェアの自動アルゴリズム及びマニュアルによる補完（manual curation）により行った。
【００８３】
（１２）ピーク面積のノーマライゼーション（正規化）
取得したＬＣ−ＭＳデータに関して、２４種のＬＤ及びＤＤ保存サンプルの中から一つの（重心）サンプルを選択した（この重心サンプルは、残りの２３サンプルとのピアソン相関の平均が最大となるものである。）。重心サンプルは、陽イオンのデータ及び陰イオンのデータからそれぞれ独立に選択した。そして、サンプル毎に、ターゲットの面積（Ｘ）及び重心サンプルの面積（Ｙ）について関数Ｙ＝Ｘ＋ａへの直線回帰を行い、ターゲットの面積から直線回帰後の値（ａ）を差し引くことで、得られた回帰直線に従ってターゲットサンプルのピーク面積を正規化した。ＣＥ−ＭＳデータに関しては、各サンプル内にスパイクされた内部標準(メチオニンスルホン)の面積により各ピーク面積を除することで、これら各ピーク面積を正規化した。
【００８４】
（１３）代謝産物時刻表の作成
はじめに、ＬＤ条件下及びＤＤ条件下の双方において、１０またはそれ以上の時点で検出された代謝産物を選択した。次に、選択された各代謝産物に関し、ＬＤ条件下及びＤＤ条件下で平均面積値が同じになるように、ＬＤ及びＤＤにおけるそれぞれの面積値を計算した。産出された各面積に関し、フーリエ変換に基づいた方法（参考文献：Chatfield C (1996) The analysis of time series: An introduction (Chapman & Hall/CRC, London)を用いて、様々な位相を有する２４時間周期をもつコサイン曲線（余弦波）とのピアソン相関係数を産出し、相関係数が最大となるもの、及びその頂点位相を探索した。
【００８５】
次いで、順列テストにより、各代謝産物に関してｐ値とＦＤＲ(false discovery rate)とを見積もった。ＬＣ−ＭＳデータに関してはＦＤＲ＜０．０１を満たす物質を、ＣＥ―ＭＳデータに関してはＦＤＲ＜０．０１を満たす物質、及びＦＤＲ＜０．１を満たす物質の双方を、統計的に有意な振動をしている代謝産物として選択した。
【００８６】
（１４）体内時刻の測定
メタボロミクスに基づく体内時刻の測定は、体内時刻の推定に二つのサンプルを用いた点を除けば、発現ベースの体内時刻測定法（参考文献：Ueda HR et al. (2004) Molecular-timetable methods for detection of body time and rhythm disorders from single-time-point genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 11227-11232.）に従い行なった。すなわち、本実施例の方法（代謝産物時刻表法）では、１２時間のサンプリング時間間隔が空いた二つのサンプルを使用した（例えば、ＺＴ０の体内時刻の測定に際して、ＺＴ０及びＺＴ１２を用いる）。これは、測定実験間で生じうる検出感度の変動を補正するためである。
【００８７】
具体的には、所定の代謝産物ｉに関して、或るサンプル中の面積をＡｓｉと定義し、上記二つのサンプル（１２時間のサンプリング時間間隔を有するもの）を平均した面積をＭｓｉと定義し、さらに、時刻表中の所定時刻における代謝産物ｉの当該平均の面積（所定時刻でのＭｓｉに相当）、標準偏差、及びピーク時刻を、それぞれ順に、Ｍｔｉ、Ｓｔｉ、及びＰｔｉと定義した。
【００８８】
体内時刻の推定のため、下記式（１）の条件を充足しない統計的にはずれ値を示す代謝産物は使用しなかった。
【００８９】
【数１】
【００９０】
そして、ｂを０から２３．９まで０．１ずつ変化させて、下記式（２）及び（３）間のピアソン相関が最大となるｂを探索し、このｂを標的サンプルの体内時刻とした。また、この予測のｐ値を評価するため、最大相関に対する順列テストを行なった。
【００９１】
【数２】
【００９２】
〔実施例１〕：ＬＣ−ＭＳ分析に基づく、血漿中の代謝産物時刻表の作成
上記説明の通り、血漿サンプルは、ＬＤ又はＤＤ条件下で、２日にわたり４時間毎に、若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスから取得した。血漿中に振動を示す物質が含まれていることを示すため、既知の振動物質であるコルチコステロン量を、ラジオイミュノアッセイにより定量し、明確な概日性の振動（以下、「概日振動」と称する）があることを示した（図１の（ａ）中のａ−１及びａ−２参照）。代謝産物時刻表を作成するため、上記した方法に従い、血漿中に含まれる化学物質量をＬＣ−ＭＳ分析にて定量した。
【００９３】
ＬＣ−ＭＳ分析により、６９５の陰イオン、及び９３８の陽イオンのピークが得られた。これらピークのうち、ＬＤ及びＤＤ条件下で、１７６の陰イオン、及び１４２の陽イオンのピークが顕著な概日振動を示した（図１の（ｂ）：ＦＤＲ＜０．０１：上記の方法の項も参照）。概日振動を示すピークは、マウス血漿中で検出されたピークの凡そ１９．５％に相当する。これらのピークに相当する代謝産物は、時刻を指示する代謝産物（必要に応じて「時刻指示代謝産物」と称する）として機能する。なぜなら、これらの代謝産物は、時刻情報のない（一定の）環境下（例えばＤＤ条件下）でも、顕著に振動を示すからである。
【００９４】
例えば、ＺＴ０(明期の始まり)又はＣＴ０(主観的な明期の始まり)では、凡そＺＴ０又はＣＴ０においてピークを示す夜明けを指示する代謝産物レベル（代謝産物の量）が高くなる一方で（図１の（ｂ）；分子ピーク時刻を示すバー中で「dawn」と示す）、凡そＺＴ１２又はＣＴ１２においてピークを示す夕暮れ（dusk）を指示する代謝産物レベルが低くなる（図１の（ｂ）；分子ピーク時刻を示すバー中で「dusk」と示す）。これとは反対に、ＺＴ１２又はＣＴ１２では、夜明けを指示する代謝産物レベルが低くなる一方で、夕暮れを指示する代謝産物レベルが高くなる。これはすなわち、時刻指示代謝産物量は、体内時刻、及び概日時計の内的な状態を反映していることを意味する。実際、これらの時刻指示代謝産物の振動は、概日時計により直接的又は間接的に制御されている。その証拠に、分子レベルで概日時計の本体の機能が欠損しているＣｒｙ１,Ｃｒｙ２ｄＫ．Ｏ.マウスにおいて、これら代謝産物レベルの変動の周期性は失われている（図１の（ａ）中のａ−３、及び図１の（ｃ）を参照）。ここで得られたＬＣ−ＭＳのデータを用いて、表１に示す、マウスの血漿中に含まれる時刻指示代謝産物の分子時刻表（代謝産物時刻表）を構築した。
【００９５】
なお、表１中で、「mode」とはＬＣ-ＭＳの検出モードを指し、「Avg.ｍ/ｚ」、「Avg.RT」、「Avg.Area」、「StdDev AREA」はそれぞれ、２４時点（ＬＤ１２時点、及びＤＤ１２時点）での各相関ピークの平均ｍ／ｚ値、平均保持時間、平均面積、当該面積の標準偏差を指す。「Peak time」、「correlation」、「p value」、及び「ＦＤＲ」は、いずれも概日性の振動の統計解析の結果を示すものであり、それぞれ、概日性の振動のピーク時刻、概日性の振動に適合したコサイン曲線のピアソン相関の最大値、ピアソン相関の有意性に係るp値及びＦＤＲを指す。「p value」、及び「ＦＤＲ」は数値を切り上げしており、その他の値は数値を切り下げしている。
【００９６】
【表１】
【００９７】
【表２】
【００９８】
【表３】
【００９９】
【表４】
【０１００】
【表５】
【０１０１】
【表６】
【０１０２】
【表７】
【０１０３】
【表８】
【０１０４】
【表９】
【０１０５】
【表１０】
【０１０６】
【表１１】
【０１０７】
【表１２】
【０１０８】
【表１３】
【０１０９】
【表１４】
【０１１０】
【表１５】
【０１１１】
【表１６】
【０１１２】
なお、上記した図１の（ａ）〜（ｃ）は、本実施例１にて得られた、マウス血漿中に存在する代謝産物が示す概日性の周期を示すものである。図１の（ａ）は、ＬＤ条件下（同図のａ−１）、及びＤＤ条件下（同図のａ−２）での、ＣＢＡ／Ｎマウスの血漿中でのコルチコステロンレベルの概日性の変化を示す。また、図１の（ａ）中のａ−３には、ＤＤ条件下のＣｒｙ１,Ｃｒｙ２ｄＫ．Ｏ．マウスが示す、リズム性のないコルチコステロンレベルの変化のパターンを表す。全ての値は、平均±標準誤差で表している。また、グラフ上の白いバーは昼（照明点灯状態）を、グレーのバーは主観的昼（恒暗条件下での日中相当（subjective day））を、黒いバーは夜及び主観的夜（subjective night）を示す。ＺＴ０は照明開始時の時刻であり、概日時刻ＣＴ０は、ＬＤ条件であれば照明開始時に相当するＤＤ条件下の時間である。
【０１１３】
また、図１の（ｂ）・（ｃ）は、ＬＣ−ＭＳ分析により測定した、ＣＢＡ／Ｎマウス（図１の（ｂ））の血漿中、Ｃｒｙ１,Ｃｒｙ２ｄＫ．Ｏ．マウス（図１の（ｃ））の血漿中における、概日性の振動を示す代謝産物（陽イオン（図中のｂ−１、ｃ−１）、陰イオン（図中のｂ−２、ｃ−２））を示す。血漿中に含まれる代謝産物の量は、各代謝産物を示すタイルのグレースケールの相違により表現している（図中、右側のグレースケールのバーも参照）。また、代謝産物は、その分子ピーク時刻により上から順に並べた。
【０１１４】
実施例１では、１４個のピークについて、具体的な代謝産物名を同定することができた（図１０、及び表１を参照）。これらの代謝産物は、図１０及び表１に示す、リゾフォスファチジルコリン（LysoPC）（18:1）、LysoPC（20：4）、LysoPC（20：3）、LysoPC（20：2）、LysoPC（18：3）、LysoPC（22：6）、LysoPC（22：5）、及びLysoPC（22：4）であり、中性環境下での化学式は順に、Ｃ２６Ｈ５２ＮＯ７Ｐ、Ｃ２8Ｈ５0ＮＯ７Ｐ、Ｃ２8Ｈ５２ＮＯ７Ｐ、Ｃ２8Ｈ５4ＮＯ７Ｐ、Ｃ２６Ｈ48ＮＯ７Ｐ、Ｃ30Ｈ５0ＮＯ７Ｐ、Ｃ30Ｈ５２ＮＯ７Ｐ、及びＣ30Ｈ５4ＮＯ７Ｐ、である。また、図１０の（ａ）には、陰イオンモード下の４個のピークに相当する代謝産物が示す概日性のリズムを表示し、図１０の（ｂ）には、陽イオンモード下の１０個のピークに相当する代謝産物が示す概日性のリズムを表示している。なお、これらの図において、代謝産物の量は平均値を１．０として正規化（ノーマライズ）して示す。
【０１１５】
〔実施例２〕：独立のサンプルを用いた体内時刻の測定
得られた概日振動物質が体内時刻の優れたインジケーターであって代謝産物時刻表を用いた体内時刻の診断法が機能するかを確認するため、独立にサンプリングしたマウスの代謝産物プロファイルから体内時刻を推定した。具体的には、サンプリングの時間、及び／又は照明の条件が、体内時刻の推定に影響を与える可能性を検討するために、若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスの個体から、４時間毎に２４時間にわたり、ＬＤ条件下及びＤＤ条件下の双方で血漿を採取した。
【０１１６】
上記した方法に従い、血漿サンプル中における時刻指示代謝産物のプロファイルを得るためにＬＣ−ＭＳ分析を行った（図２の（ａ）・（ｂ））。本発明で述べた代謝産物時刻表法を用いることで、これらサンプル中の全ての代謝産物プロファイルにおいて、顕著な概日性リズムが検出された（ｐ＜０．０１：図２の（ａ）・（ｂ））。ＬＤ条件下でのＺＴ、又はＤＤ条件下でのＣＴにおいてサンプリングした場合、わずかな推定誤差（ＬＤ条件で１．０±０．４９ｈ、ＤＤ条件で１．３±０．４５ｈ：平均±標準偏差：表２参照）を伴うのみで、体内時刻は環境時刻と一致した。これらの結果は、本発明を用いることにより、独立にサンプリングされたマウスの代謝産物プロファイルから、体内時刻を正確に推定できることを示唆する。
【０１１７】
以下の表２において、「peak」の欄にはサンプル間に共通して見出された全ての振動ピーク（All）と、はずれ値を除き実際に使用したピーク数（Used）を示す。「ZT/CT」は、サンプリングを行なったＺＴ（ＬＤ条件下）又はＣＴ（ＤＤ条件下）での環境時刻を指す。「Difference」は（体内時刻から環境時刻を差し引いた値）の絶対値を指す。なお、使用した振動のピークの情報は表１（代謝産物時刻表）に記載している。
【０１１８】
【表１７】
【０１１９】
【表１８】
【０１２０】
なお、図２の（ａ）・（ｂ）は、体内時刻の推定結果を示し、これは若いオスのＣＢＡ/Ｎ体内時刻マウスの血漿をＬＤ条件下（図２の（ａ））、及びＤＤ条件下（図２の（ｂ））で採取した場合の結果である。円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘとする）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙとする）をとった場合の各振動代謝産物に相当する。このとき、各物質の分子ピーク時刻は規定されているから（表１のピーク時刻を参照）、全ての図で同じ物質が同じｘの値をとる。これに対し、物質量はサンプル間で可変なので、ｙの値は変化する。例えばピーク時刻１２の物質は全ての図でｘ＝１２のところにプロットされるが、ｙの値はＺＴ０では低く、ＺＴ１２では高くなる。コサイン曲線（１）のピーク時刻が推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻がサンプリングした時刻（環境時刻）に相当する。曲線（１）と曲線（２）との重複度合いが大きいほど、測定精度が高いことを示す。縦方向の破線は、体内時刻又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。
【０１２１】
〔実施例３〕：遺伝的背景の相違が与える影響
臨床応用に際して、体内時刻推定の方法は、異なる遺伝的背景をもつ集団に適用可能なものでなければならない。代謝産物時刻表法が、遺伝的背景が異なる個体に対して適用可能であることを実証するため、当該方法を、代謝産物時刻表をつくった系統であるＣＢＡ／Ｎマウスとは異なる遺伝的背景を持つ近交系のマウス系統から得たサンプルについても適用可能か、検討した。具体的には、若いオスＣ５７Ｂｌ／６マウスの個体から、４時間毎に２４時間にわたり、ＬＤ条件下及びＤＤ条件下の双方で、血漿サンプルを採取した。そして、上記したＬＣ−ＭＳ法を用いて、血漿中の時刻指示代謝産物の定量化を行なった（図３の（ａ）・（ｂ））。
【０１２２】
代謝産物時刻表法により、ＬＤ条件（図３の（ａ））及びＤＤ条件（図３の（ｂ））下の何れの時刻で採取したサンプルのプロファイルについても、顕著な概日性のリズム（ｐ＜０．０１）を検出した。推定された体内時刻は、ＬＤ条件下では１．６±０．３６ｈ、ＤＤ条件下では１．７±０．２４ｈの推定誤差（平均±標準偏差, 表２も参照）を伴うのみで、環境時刻と非常に一致した。この結果は、異なる遺伝的背景を有するマウスにおいても、代謝産物のプロファイルから正確に体内時刻を決定することができることを示唆する。
【０１２３】
なお、図３の（ａ）・（ｂ）は、ＬＤ条件下（図３の（ａ））、及びＤＤ条件下（図３の（ｂ））で飼育したＣ５７Ｂｌ／６マウスの血漿を用いた体内時刻の測定結果を示す。円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘ）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙ）をとった場合の各振動代謝産物（ｘ、ｙ）に相当する。コサイン曲線（１）のピーク時刻は推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻は環境時刻に相当する。縦方向の破線は、体内時刻、又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。また、統計の結果は上記の表２に示す。
【０１２４】
〔実施例４〕：給餌環境の相違
摂食行動が概日性のリズムを有することは良く知られている。それゆえ、給餌環境（ヒトでは食事環境）は、代謝産物時刻表法の正確性に影響を与えうる。異なる給餌環境にある個体に対して、代謝産物時刻表法を適用できるか否かを評価するため、ある時点から餌を与えなかったＣＢＡ／Ｎマウスに対し代謝産物時刻表法を適用した。これまでの実施例では、ＣＢＡ／Ｎマウスは自由摂食下（ad libitum feeding）で飼育されていたため、この餌の剥奪状態（food deprivation）は、元々の給餌状態とは大きく異なる。
【０１２５】
ある時点より餌をケージから取り除いた若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスから、ＬＤ条件下で４時間毎に一個体ずつ２４時間にわたり血漿を回収し、ＬＣ−ＭＳ分析を行なった（図７参照）。この状態においても、代謝産物時刻表法を用いることで、全ての代謝産物プロファイルから顕著な概日性のリズムを検出した（ｐ＜０．０３）。推定された体内時刻は、２．２±０．５ｈの推定誤差（平均±標準偏差、表２参照）を伴い、環境時刻と一致した。これらの結果は、厳しい給餌環境下に維持されてさえも、マウスの代謝産物プロファイルから体内時刻を決定することができることを示唆する。
【０１２６】
なお、図７中、円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘ）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙ）をとった場合の各振動代謝産物（ｘ、ｙ）に相当する。コサイン曲線（１）のピーク時刻は推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻は環境時刻に相当する。縦方向の破線は、体内時刻、又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。また、統計の結果は上記の表２に示す。
【０１２７】
〔実施例５〕：年齢及び性別による相違
本発明においては、若いオスのマウスのみから代謝産物時刻表を構築した。上記実施例１〜４では、若いオスを用いることで様々な条件下で体内時刻が推定できることを示したが、年齢や性別が代謝産物時刻表法の正確性に影響を与える可能性が考えられた。年齢や性別の体内時刻推定に与える影響を評価するため、本願発明者らは、代謝産物時刻表法を、代謝産物時刻表を作成したと同じＣＢＡ/Ｎ系統の、老齢オス、及び若いメスにも適用した。老齢オス、又は若いメスのＣＢＡ／Ｎマウス個体から、ＺＴ０（明期の始まり。すなわち照明を開始する時間）、ＺＴ１２（明期の終わり、すなわち消灯する時間）の二つの時点で血漿をサンプリングした。これら二つの時点は、光の状態が劇的に変化するため、最もノイズが生じやすい時点であると考えられる。
血漿中の時刻指示代謝産物は、上記のＬＣ−ＭＳで定量し、顕著な概日性のリズム）を、老齢オス及び若いメスの全ての代謝産物プロファイル中に確認した（ｐ＜０．０１）（図４の（ｂ）・（ｃ））。ＺＴ０及びＺＴ１２で採取されたマウスの推定体内時刻は、老齢オスでは体内時刻２３．０及び体内時刻１１．０であり、若いメスでは体内時刻１．２及び体内時刻１３．２であった（表２参照）。これらの結果は、異なる年齢及び性別のマウスの代謝産物プロファイルからも、体内時刻が正確に決定出来ることを示す。
【０１２８】
なお、図４の（ａ）〜（ｃ）は、ＺＴ０（図中左側）、及びＺＴ１２(図中右側)の時点で取得した、若いオス（図４の（ａ））、老齢オス（図４の（ｂ））、及び、若いメス（図４の（ｃ））での体内時刻測定の結果を示す。円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘ）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙ）をとった場合の各振動代謝産物（ｘ、ｙ）に相当する。コサイン曲線（１）のピーク時刻は推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻は環境時刻に相当する。縦方向の破線は、体内時刻、又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。また、若いオスの結果（（図４の（ａ））は、比較用に図２から再録して表示している。これらの統計の結果は上記の表２に示す。
【０１２９】
〔実施例６〕：時差ぼけの検出
本発明の最終目的の一つは、概日リズム障害の診断に代謝産物時刻表を利用することである。時差ぼけは一般的な概日リズム障害であり、内的な時刻である体内時刻と外的な時刻の環境時刻とが相違することで生ずる。そこで、本願発明者らは、時差ぼけを模したモデルを作成するために、通常のＬＤ条件下で二週間若いオスのＣＢＡ/Ｎマウスを飼育した後に、照明スケジュールを８時間前倒しにした新しいＬＤ条件下に飼育環境を移行した。
【０１３０】
血漿サンプルは、次に述べる異なる３日（第１日、第５日、第１４日）の二つの時点（元々のＬＤサイクルのＺＴ０及びＺＴ１２。以下、それぞれ時刻１、時刻２と称する）で採取した。：第１日（照明スケジュールを８時間前倒しにした新しい環境に同調する前）、第５日（新しい環境に同調中）、及び第１４日（新しい環境に同調後）（図５の（ａ）・（ｂ））。
【０１３１】
第１日では、推定された体内時刻は、２３．８ｈ（時刻１）及び１１．８ｈ（時刻２）であり、内的な体内時刻が明暗環境を変化させる前の時間に従っていることを示唆していた。これに対し第１４日では、推定された体内時刻は、８．８ｈ（時刻１）及び２０．８ｈ（時刻２）であり、内的な体内時刻が元々のＬＤ周期から約８時間ずれてきて、新しい周期に完全に同調していることを示していた。第５日では、推定された体内時刻は３．５ｈ（時刻１）及び１５．５ｈ（時刻２）であり、元々のＬＤ周期から３．５ｈのずれであって、これは元の明暗環境とも前倒しにした新しい環境とも不完全に同調した状態であることを意味しており、時差ぼけ状態にあることを示唆している（図５の（ｃ）及び、表２参照）。以上の結果は、本発明にかかる代謝産物時刻表法が、正しく概日リズム障害を検出できることを示唆する。
【０１３２】
なお、図５の（ａ）は光照射条件を示す概略図であり、白色のバーは照明点灯の状態を、黒色のバーは消灯の状態を示す。第１日では、それ以前より８時間早く消灯をした。血漿のサンプリングは、ＬＤシフト（図中、矢印で示す）後の、第１日、第５日、及び第１４日それぞれの２つの時点で、行なった。図５の（ｂ）は、代表的なマウスの行動パターンを示す図（アクトグラム）であり、明暗条件に同調した場合の活動パターン、ＬＤシフトにより誘導された時差ぼけを経験している状態、及び新しい環境に再同調した様子を示す。点灯期間と、消灯期間（グレーのシャドウイング）とを図中に示す。３つの矢頭は、第１日（図中の上）、第５日（図中の中央）、及び第１４日（図中の下）を示す。図５の（ｃ）は、照明スケジュールを８時間前倒しにした新たな明暗環境に同調する前（第１日、上）、同調中（第５日、中央）、及び同調した後（第１４日、下）に採取したマウスの血漿を用いた体内時刻測定の結果を示す。円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘ）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙ）をとった場合の各振動代謝産物（ｘ、ｙ）に相当する。コサイン曲線（１）のピーク時刻は推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻は環境時刻に相当する。縦方向の破線は、体内時刻、又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。また、統計の結果は上記の表２に示し、表２中のアステリスク（＊）は、時差ぼけ実験においてマウスが新たなＬＤ周期に入る以前の、元々のＬＤ周期におけるＺＴを示していることを指す。
【０１３３】
〔実施例７〕：代謝産物時刻表法の一般適用（ＣＥ−ＭＳ分析）
実施例１〜６に示す通りＬＣ−ＭＳ分析に基づく代謝産物時刻表法は、個体の体内時刻を正確に測定可能であり、時差ぼけのような概日リズム障害を非常に高感度に診断することができた。この方法は、上記した多数の時刻指示代謝産物の振動に依拠しているものであるゆえ、この方法は、ＣＥ−ＭＳ分析のような他のメタボロミクス技術によって見出された振動物質を用いても応用可能であると考えられる。
【０１３４】
ＣＥ−ＭＳ分析では、電荷を帯びた化合物の分離が可能である。つまり、ＣＥ−ＭＳ分析はＬＣ−ＭＳ分析に対して相補的な技術に相当する。代謝産物時刻表法の他のメタボロミクス技術への適用可能性を確認するため、若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスから、二日間にわたり、ＬＤまたはＤＤ条件下で４時間ごとに血漿を採取した。次いで、これらの血漿サンプル中に含まれる、陽性に荷電した化合物を、ＣＥ−ＭＳにより測定し９５３個のピークを検出した。これらのピークのうち１５３個が、ＬＤ及びＤＤ条件下で有意な概日性の振動を示した（図６の（ａ）参照。ＦＤＲ＜０．１）。
【０１３５】
次いで、これらのＣＥ−ＭＳ分析のデータに基づき、マウス血漿中の代謝産物時刻表を構築した（表３参照）。なお、以下の表３中、「Avg.ｍ/ｚ」、「Avg.RT」、「Peak Time」、「Correlation」、「p value」、及び「FDR」の定義は表１と同じであり、「Avg.Area/Area(Isl)」、及び「StdDev Area/Area(Isl)」は、それぞれ、２４時点（ＬＤ１２時点、及びＤＤ１２時点）での各相関ピークの平均面積及び当該面積の標準偏差を、内部標準（メチオニンスルホン）の面積で除した値を指す。「p value」、及び「ＦＤＲ」は数値を切り上げしており、その他の値は数値を切り下げしている。また、２８のピークについては、具体的な代謝産物名を同定することができた（図６の（ｂ）、及び図９参照）。図９には同定された代謝産物が示す概日性のリズムを示すが、当該代謝産物の量は平均値を１．０として正規化（ノーマライズ）して示している。
【０１３６】
【表１９】
【０１３７】
【表２０】
【０１３８】
【表２１】
【０１３９】
【表２２】
【０１４０】
【表２３】
【０１４１】
【表２４】
【０１４２】
【表２５】
【０１４３】
【表２６】
【０１４４】
あわせて、ＣＥ−ＭＳで検出された振動代謝産物が個体の体内時刻を示す良いインジケーターであって、ＣＥ−ＭＳに基づく代謝産物時刻表を利用することで体内時刻を検出すことが可能かを確認するため、独立にサンプリングしたマウスの代謝産物プロファイルから体内時刻を推測した。具体的には、若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスから、ＬＤ及びＤＤ条件下の双方で、２４時間にわたり４時間ごとに血漿を採取した。次いで、上記の方法で、血漿サンプルのＣＥ−ＭＳ分析を行なって時刻指示代謝産物をプロファイルした（図６の（ｃ）・（ｄ））。
【０１４５】
ＣＥ−ＭＳ分析に基づく代謝産物時刻表法では、これらサンプルの全代謝産物プロファイルで顕著な概日性の周期が検出された（ｐ＜０．０１、図６の（ｃ）・（ｄ））。ここで推定された体内時刻は、ＬＤ条件下で０．６±０．２９ｈ、ＤＤ条件下で０．６±０．５４ｈの推定誤差（平均±標準偏差、表４参照）を伴うのみで、環境時刻と一致した。これらの結果は、代謝産物時刻表法は、ＣＥ−ＭＳ分析のような他のメタボロミクス技術にも一般的に適用できることを示唆する。なお、以下の表４中、「peak」、「ZT/CT」、及び「Difference」の定義は表２と同様である。なお、使用した振動のピークの情報は表３（代謝産物時刻表）に記載している。
【０１４６】
【表２７】
【０１４７】
なお、図６の（ａ）は、マウスの血漿中に含まれる概日性の振動を示す代謝産物（陽イオン，ＦＤＲ＜０．１）を示し、図６の（ｂ）は、具体的な名称まで同定された振動性の代謝産物を示す。血漿中に含まれる代謝産物の量は、各代謝産物を示すタイルのグレースケールの相違により表現している（図中、左側のグレースケールのバーも参照）。図中、右側の垂直バーは、１日の中で、各代謝産物が指示する分子ピーク時刻を示す。図６の（ｃ）・（ｄ）は、ＬＤ条件下（図６の（ｃ））、及びＤＤ条件下（図６の（ｄ））で飼育されたマウスの体内時刻の測定結果を示す。円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘ）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙ）をとった場合の各振動代謝産物（ｘ、ｙ）に相当する。コサイン曲線（１）のピーク時刻は推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻は環境時刻に相当する。縦方向の破線は、体内時刻、又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。また、統計の結果は上記の表３に示す。
【０１４８】
〔実施例８〕より厳格な基準でのＣＥ−ＭＳ分析に基づく代謝産物時刻表法
実施例７に示す通り、ＣＥ−ＭＳ分析により、血漿サンプル中に９５３個のピークを検出した。これらのピークのうち、より厳格な統計基準（ＦＤＲ＜０．０１：図８参照）下では、４４個のピークが顕著な概日性の振動を示した。これら４４個のピークのうち１０個のピーク（２２．７％）に相当する代謝産物の名称を特定できた（図８の（ｂ）参照。ＣＥ−ＭＳ分析の結果、検出された、及び／又は、名称まで特定された時刻指示代謝産物に基づいて、マウスの血漿中における代謝産物時刻表を構築した（表３参照）。
【０１４９】
この代謝産物時刻表に示された概日振動代謝産物をインジケーターとした場合に、個体の体内時刻を充分に反映して精度よく体内時刻が推定されるか否かを評価するため、マウスの代謝産物のプロファイルから体内時刻の推定を試みた。若いオスのＣＢＡ／Ｎマウスの個体から、４時間毎に２４時間にわたり、ＬＤ条件下、又はＤＤ条件下の双方で鮮血の血漿を採取し、その代謝産物のプロファイルを評価した（図８の（ｃ）・（ｄ））。予期した通り、これら全サンプルの全ての代謝産物のプロファイルにおいて、顕著な概日性のリズムを検出することができた（Ｐ＜０．０１, 図８の（ｃ）・（ｄ））。推定された体内時刻は、ＬＤ条件において１．５±０．７６h、及びＤＤ条件において１．４±０．９０ｈ(何れも平均±標準偏差、表５参照)の推定誤差を伴うのみで、サンプリング時間（環境時刻）と一致した。この結果が示唆するのは、上記したＬＣ−ＭＳ分析に基づく方法と同等の厳格な基準（ＦＤＲ＜０．０１）により選択された時刻指示代謝産物を用いたＣＥ−ＭＳ分析に基づく方法においても、ある時点で採取された個体の体内時刻を正確に検出することに役立つということである。なお、以下の表５中、「peak」、「ZT/CT」、及び「Difference」の定義は表２と同様である。なお、使用した振動のピークの情報は表３（代謝産物時刻表）に記載している。
【０１５０】
【表２８】
【０１５１】
なお、図８の（ａ）は、マウスの血漿中における概日性の振動を示す代謝産物（陽イオン，ＦＤＲ＜０．０１）を示し、図８の（ｂ）は、具体的な名称まで同定された振動性の代謝産物を示す。血漿中に含まれる代謝産物の量は、各代謝産物を示すタイルのグレースケールの相違により表現している（図中、左側のグレースケールのバーも参照）。図中、右側の垂直バーは、１日の中で、各代謝産物が指示する分子ピーク時刻を示す。図８の（ｃ）・（ｄ）は、ＬＤ条件下（図８の（ｃ））、及びＤＤ条件下（図８の（ｄ））で飼育されたマウスの体内時刻の測定結果を示す。円形のドットは、横軸に各物質の分子ピーク時刻（ｘ）をとり、縦軸に物質の存在量（ｙ）をとった場合の各振動代謝産物（ｘ、ｙ）に相当する。コサイン曲線（１）のピーク時刻は推定された体内時刻に相当し、コサイン曲線（２）のピーク時刻は環境時刻に相当する。縦方向の破線は、体内時刻、又は環境時刻（ＺＴ／ＣＴ）を示す。また、統計の結果は上記の表４に示す。
【０１５２】
〔実施例９〕使用するピーク数と、体内時刻の推定結果との相関
本願発明者らは、代謝産物時刻表法において使用するピーク数の好適な範囲を求めるべく次の実験を行なった。具体的には、ＬＣ−ＭＳ分析の結果得られた有意な振動を示すピーク（表１参照）のうちＦＤＲの低いものを使用し、代謝産物時刻表法に基づいて体内時刻の推定を行った。このとき、初めに使用したピークは、ＦＤＲの低いものから順に選択した、陽イオンモードの１２４個、陰イオンモードの７６個、計２００個である。
【０１５３】
次いで、これら２００個のピークから、統計基準のきつい（余弦波から遠い：ＦＤＲが大きい）ものより順に５個ずつ使用するピークを減らして体内時刻の推定を行い（すなわち、１９５個、１９０個、１８５個・・・と使用するピークの数を減らした）、さらに、使用するピークの数が５０個以下になった時点からは使用するピークを２個ずつ減らして体内時刻の推定を行なった。なお、本実施例では、使用したピークの数の最小値は４個である。結果を、図１１に示す。
【０１５４】
図１１中の（ａ）は、使用したピーク数（４個〜２００個）と、推定された体内時刻の有意性（そのｐ値）との関係を示す。（ａ）において、薄い網掛けはｐ値が０．０５未満の領域を示し、濃い網掛けはｐ値が０．０１未満の領域を示す。また、図１１中の（ｂ）は、使用したピーク数（４個〜２００個）と、推定誤差（推定された体内時刻と環境時刻との差（単位：時間））との関係を示す。（ｂ）において、薄い網掛けは推定誤差が２時間未満の領域を示し、濃い網掛けは推定誤差が１時間未満の領域を示す。図１１中の（ａ）及び（ｂ）で拡大して示すのは、使用したピーク数が１６個〜３６個の範囲内での結果である。
【０１５５】
推定された体内時刻の有意性の値の好適な範囲は、体内時刻推定の目的等にも依存するが、例えば、そのｐ値が約０．０１未満であれば充分に信頼性があると判断される。この条件を満たすのは、使用したピーク数が約２０個以上の場合である（図１１中の（ａ）参照）。また、使用したピーク数が約２０個以上の場合には、上記の推定誤差が約１時間程度以下に収まるため、実用上充分な推定精度といえる。すなわち、代謝産物時刻表法に基づいて体内時刻の推定を行なう場合には、使用するピークの数（すなわち本発明にかかるインジケーターの数）を２０個以上とすることが好ましい。ただし、使用するピークの数が２０個未満の場合であっても体内時刻、及びそのずれの推定を行なうことは可能である。
【０１５６】
上記の実施例７〜８で示したＣＥ−ＭＳ分析で同定可能な時刻指示代謝産物（図６の（ｂ））には、顕著な概日性のリズムを示す多くのアミノ酸が含まれていた（ＦＤＲ＜０．１）。例えば、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、バリン（Ｖａｌ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）の分子ピーク時刻（peak time, PT, 0が明期の始まり、１２が暗期の始まりに相当）は凡そ深夜（〜ＰＴ１８）である一方、グリシン（Ｇｌｙ）の分子ピーク時刻は夕方であった（ＰＴ１２．１）。また、尿素サイクルに関連する代謝産物の中では、オルニチン（ＰＴ１８．６）、シトルリン（ＰＴ１９．９）、及び４−グアニジノブチレート（ＰＴ２０．１）等の代謝産物が、顕著な概日性のリズム（ＦＤＲ＜０．１）を示した。さらに、尿素サイクルで重要な役割を果たすアルギニン（Ａｒｇ）も、概日性のリズム（ＦＤＲ＝０．２１５、ＰＴ０．６）を有すると示唆された。
【０１５７】
クレアチン経路、及びこれの近傍のグリシン並びにトレオニンの代謝においては、グアニドアセテート（ＰＴ６．２）、クレアチン（ＰＴ１４．７）、クレアチニン（ＰＴ１８．７）、サルコシン（ＰＴ１８．０）、及びジメチルグリシン（ＰＴ１６．５）のような代謝産物が顕著な概日性のリズム（ＦＤＲ＜０．１）を示した。アルギニン（ＰＴ０．６）は、最初にグアニドアセテートに変換され、次いでグアニドアセテート（ＰＴ６．２）はクレアチンに変換される。クレアチン（ＰＴ１４．７）は最終的にクレアチニン（ＰＴ１８．７）又はサルコシン（ＰＴ１８．０）に変換され、これらはジメチルグリシン（ＰＴ１６．５）からも変換されるものである。これら代謝産物の分子ピーク時間の相違は、クレアチン経路、及びこれに近傍のグリシン並びにトレオニンの代謝における連続的なプロセシングの様子を反映しているといえる。
【０１５８】
また、実施例１から９にて示した通り、代謝産物時刻表法を用いることで、哺乳類の個体で安定して体内時刻を測定でき、また概日リズム障害が検出できる（特に実施例６）。概日リズム障害は、環境的な要因（例えば時差ぼけ）により、及び／又は、遺伝的要因（家族性の睡眠相前進症候群）により引き起こされる。
【０１５９】
Ｂｒｏｗｎら（参考文献：（１）Brown SA et al. (2005) The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLoS Biol 3: e338.：（２）Brown SA et al. (2008) Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 1602-1607.）は、細胞中の概日時計を特徴づけすることによって、概日リズム障害を検出したことを報告している。具体的には、彼らはヒトの皮膚サンプルを採取し、その細胞を培養して、体内時計に制御されるレポータを当該細胞中に遺伝子導入し、体内時計の様子を観察した。単離細胞中の概日時計の特徴は、対象たるヒトのクロノタイプ（個体レベルの概日時計の特徴）と相関を示し、この方法によって先天的な（inherited）概日リズム障害を検出することができる可能性を示唆した。しかし、Ｂｒｏｗｎらの方法は環境要因を排するために、先天的な（遺伝的要因による）概日リズム障害は検出できるが、後天的な（環境要因による）概日リズム障害（例えば時差ぼけ）は検出できない。仮に彼らの方法で環境要因を含む概日リズム障害を検出しようとすると、個体レベルで遺伝子導入を行わなければならず、これは現実的ではない。また、現状では検査する細胞を採取する必要があることや、培養細胞に対して遺伝子導入を行わなければならないために、検査の手間も非常にかかるなどの問題がある。一方で、本発明ではこれらの問題を招来することがない。
【０１６０】
さらに、実施例１から５および実施例７、８にて示した通り、１）本発明に係るインジケーターを用いて、異なる光条件（ＬＤ及びＤＤ）下で、及び異なる遺伝的背景を有する個体間（ＣＢＡ／Ｎ及びＣ５７Ｂｌ／６マウス）で、一日を通じた個体の体内時刻の推定を非常に高精度に行うことができた。２）また、血漿中のインジケーターを用いた代謝産物時刻表は、給餌環境、年齢及び性別の違いを超えて共通しており、当該インジケーターの有用性が示唆された。３）加えて、本発明の方法が、時差ぼけ哺乳類における概日リズムの不調に対する敏感かつ正確な検出手段となることが示唆された。
【０１６１】
もちろん、ＬＣ−ＭＳ分析、ＣＥ−ＭＳ分析に限定されず他のメタボロミクス技術も本発明の目的で使用することができ、これにより何百もの時刻指示代謝産物の定量・同定が可能となり、個々人の血液サンプルから体内時刻の測定をすることができる。すなわち、本発明は、例えば個人特化型の（テーラーメイド）医薬の実現の一つの可能性である時間治療に道を拓くものであるが、これは、個人の体内時刻の情報を用いた投薬を行い、薬剤の効能を最大化したりその副作用を最小化したりするものである。
【０１６２】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明は、ヒトを含む哺乳類の体内時刻の推定、及び体内時刻のずれの検出に利用することができる。そのため、本発明を、例えば、概日リズム障害の発症有無の検出、時間治療、及び個人特化型の医薬や投薬方法の開発に利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血液中の血漿に含まれる、代謝産物の量を測定する工程と、次いで、
上記代謝産物の量の経時的な変化のパターンに基づき哺乳類の体内時刻のずれを検出する工程と、を含んでなり、
上記代謝産物が、１−メチルニコチンアミド、グアニドアセテート、カルニチン、シチジン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、グリシン、クレアチン、Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン、メチオニンスルホキシド、グルタミン、トレオニン、サルコシン、トレオニン（１３Ｃ）、プロリン、バリン、オルニチン、クレアチニン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート、α−アミノアジペート、シトルリン、４−グアニジノブチレート、トリメチルアミンＮ−オキシド、リゾフォスファチジルコリン(１８：１)、リゾフォスファチジルコリン(２０：４)、リゾフォスファチジルコリン(２０：３)、リゾフォスファチジルコリン(２０：２)、リゾフォスファチジルコリン(１８：３)、リゾフォスファチジルコリン(２２：６)、リゾフォスファチジルコリン(２２：５)、及びリゾフォスファチジルコリン(２２：４)（ここで、各リゾフォスファチジルコリンの後段に括弧書きで示す数字は、順に、脂肪酸の部分を構成する炭素原子の数と、不飽和結合を有する炭素原子の数とを示す）からなる代謝産物群より選択される少なくとも一つの代謝産物であることを特徴とする、哺乳類における体内時刻のずれの検出方法。
【請求項２】
検査対象となる哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血液中の血漿に含まれる、代謝産物の量を測定する工程と、次いで、
上記代謝産物の量の経時的な変化のパターンを、検査対象となる上記哺乳類と同種の基準となる哺乳類の血漿に含まれる当該代謝産物の量の経時的な変化のパターンと比較して、パターンのずれの程度を取得する工程と、を含んでなり、
上記代謝産物が、１−メチルニコチンアミド、グアニドアセテート、カルニチン、シチジン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、グリシン、クレアチン、Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン、メチオニンスルホキシド、グルタミン、トレオニン、サルコシン、トレオニン（１３Ｃ）、プロリン、バリン、オルニチン、クレアチニン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート、α−アミノアジペート、シトルリン、４−グアニジノブチレート、トリメチルアミンＮ−オキシド、リゾフォスファチジルコリン(１８：１)、リゾフォスファチジルコリン(２０：４)、リゾフォスファチジルコリン(２０：３)、リゾフォスファチジルコリン(２０：２)、リゾフォスファチジルコリン(１８：３)、リゾフォスファチジルコリン(２２：６)、リゾフォスファチジルコリン(２２：５)、及びリゾフォスファチジルコリン(２２：４)（ここで、各リゾフォスファチジルコリンの後段に括弧書きで示す数字は、順に、脂肪酸の部分を構成する炭素原子の数と、不飽和結合を有する炭素原子の数とを示す）からなる代謝産物群より選択される少なくとも一つの代謝産物であることを特徴とする、哺乳類における体内時刻のずれの検出方法。
【請求項３】
前記代謝産物が、カルニチン、シチジン、グリシン、サルコシン、バリン、イソロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート、４−グアニジノブチレート、及びトリメチルアミンＮ−オキシドからなる代謝産物群より選択される少なくとも一つの代謝産物であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の体内時刻のずれの検出方法。
【請求項４】
検査対象となる哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血液中の血漿に含まれる代謝産物の量を測定する工程と、次いで、
上記代謝産物の量の経時的な変化のパターンを、検査対象となる上記哺乳類と同種の基準となる哺乳類の血漿に含まれる当該代謝産物の量の経時的な変化のパターンと比較して、パターンのずれの程度を取得する工程と、を含んでなり、
上記代謝産物が、以下の１）及び２）からなる代謝産物群から選択される少なくとも一つの代謝産物である、
１）実施例の記載に従いＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析計）を用いた分析の結果取得される、表１中の１番目〜１４２番目（陽イオンモード）、及び１番目〜１７６番目（陰イオンモード）に示す代謝産物；
２）実施例の記載に従いＣＥ−ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析計）分析をした結果取得される、表３中の１番目〜１５３番目に示す代謝産物；
ことを特徴とする、哺乳類における体内時刻のずれの検出方法。
【請求項５】
前記代謝産物として、前記代謝産物群を構成する全ての代謝産物を用いることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の体内時刻のずれの検出方法。
【請求項６】
前記パターンのずれの程度を、前記代謝産物の量が最大となる時刻、又は最小となる時刻の少なくとも一方を基準として取得することを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の体内時刻のずれの検出方法。
【請求項７】
１日内の異なる複数の時点が、４時間おきの６時点であることを特徴とする、請求項１から６の何れか一項に記載の体内時刻のずれの検出方法。
【請求項８】
請求項１から７の何れか一項に記載の検出方法により検出された体内時刻のずれが所定の範囲を越える場合に、検査対象となる哺乳類が概日リズムに変調をきたしていると判定する工程を含む、概日リズムの変調の有無の検査方法。
【請求項９】
哺乳類の血漿中に含まれ、その存在量が概日性の周期をもって変動をする、体内時刻のインジケーターであって、
１）実施例の記載に従いＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析計）による分析をした結果取得される、表１中の１番目〜１４２番目（陽イオンモード）、及び１番目〜１７６番目（陰イオンモード）に示す代謝産物；及び、
２）実施例の記載に従いＣＥ−ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析計）による分析をした結果取得される、表３中の１番目〜１５３番目に示す代謝産物；
からなる代謝産物群から選択される少なくとも一つのインジケーター。
【請求項１０】
哺乳類の採血を行なう採血器具と、請求項９に記載のインジケーターの血漿中における量を定量する定量手段と、を備えることを特徴とする、哺乳類の体内時刻測定キット。
【請求項１】
哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血液中の血漿に含まれる、代謝産物の量を測定する工程と、次いで、
上記代謝産物の量の経時的な変化のパターンに基づき哺乳類の体内時刻のずれを検出する工程と、を含んでなり、
上記代謝産物が、１−メチルニコチンアミド、グアニドアセテート、カルニチン、シチジン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、グリシン、クレアチン、Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン、メチオニンスルホキシド、グルタミン、トレオニン、サルコシン、トレオニン（１３Ｃ）、プロリン、バリン、オルニチン、クレアチニン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート、α−アミノアジペート、シトルリン、４−グアニジノブチレート、トリメチルアミンＮ−オキシド、リゾフォスファチジルコリン(１８：１)、リゾフォスファチジルコリン(２０：４)、リゾフォスファチジルコリン(２０：３)、リゾフォスファチジルコリン(２０：２)、リゾフォスファチジルコリン(１８：３)、リゾフォスファチジルコリン(２２：６)、リゾフォスファチジルコリン(２２：５)、及びリゾフォスファチジルコリン(２２：４)（ここで、各リゾフォスファチジルコリンの後段に括弧書きで示す数字は、順に、脂肪酸の部分を構成する炭素原子の数と、不飽和結合を有する炭素原子の数とを示す）からなる代謝産物群より選択される少なくとも一つの代謝産物であることを特徴とする、哺乳類における体内時刻のずれの検出方法。
【請求項２】
検査対象となる哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血液中の血漿に含まれる、代謝産物の量を測定する工程と、次いで、
上記代謝産物の量の経時的な変化のパターンを、検査対象となる上記哺乳類と同種の基準となる哺乳類の血漿に含まれる当該代謝産物の量の経時的な変化のパターンと比較して、パターンのずれの程度を取得する工程と、を含んでなり、
上記代謝産物が、１−メチルニコチンアミド、グアニドアセテート、カルニチン、シチジン、３−メチルヒスチジン、ヒドロキシプロリン、グリシン、クレアチン、Ｎ,Ｎ−ジメチルグリシン、メチオニンスルホキシド、グルタミン、トレオニン、サルコシン、トレオニン（１３Ｃ）、プロリン、バリン、オルニチン、クレアチニン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート、α−アミノアジペート、シトルリン、４−グアニジノブチレート、トリメチルアミンＮ−オキシド、リゾフォスファチジルコリン(１８：１)、リゾフォスファチジルコリン(２０：４)、リゾフォスファチジルコリン(２０：３)、リゾフォスファチジルコリン(２０：２)、リゾフォスファチジルコリン(１８：３)、リゾフォスファチジルコリン(２２：６)、リゾフォスファチジルコリン(２２：５)、及びリゾフォスファチジルコリン(２２：４)（ここで、各リゾフォスファチジルコリンの後段に括弧書きで示す数字は、順に、脂肪酸の部分を構成する炭素原子の数と、不飽和結合を有する炭素原子の数とを示す）からなる代謝産物群より選択される少なくとも一つの代謝産物であることを特徴とする、哺乳類における体内時刻のずれの検出方法。
【請求項３】
前記代謝産物が、カルニチン、シチジン、グリシン、サルコシン、バリン、イソロイシン、トリプトファン、２−アミノブチレート、４−グアニジノブチレート、及びトリメチルアミンＮ−オキシドからなる代謝産物群より選択される少なくとも一つの代謝産物であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の体内時刻のずれの検出方法。
【請求項４】
検査対象となる哺乳類から１日内の異なる複数の時点でサンプリングされた血液中の血漿に含まれる代謝産物の量を測定する工程と、次いで、
上記代謝産物の量の経時的な変化のパターンを、検査対象となる上記哺乳類と同種の基準となる哺乳類の血漿に含まれる当該代謝産物の量の経時的な変化のパターンと比較して、パターンのずれの程度を取得する工程と、を含んでなり、
上記代謝産物が、以下の１）及び２）からなる代謝産物群から選択される少なくとも一つの代謝産物である、
１）実施例の記載に従いＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析計）を用いた分析の結果取得される、表１中の１番目〜１４２番目（陽イオンモード）、及び１番目〜１７６番目（陰イオンモード）に示す代謝産物；
２）実施例の記載に従いＣＥ−ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析計）分析をした結果取得される、表３中の１番目〜１５３番目に示す代謝産物；
ことを特徴とする、哺乳類における体内時刻のずれの検出方法。
【請求項５】
前記代謝産物として、前記代謝産物群を構成する全ての代謝産物を用いることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の体内時刻のずれの検出方法。
【請求項６】
前記パターンのずれの程度を、前記代謝産物の量が最大となる時刻、又は最小となる時刻の少なくとも一方を基準として取得することを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の体内時刻のずれの検出方法。
【請求項７】
１日内の異なる複数の時点が、４時間おきの６時点であることを特徴とする、請求項１から６の何れか一項に記載の体内時刻のずれの検出方法。
【請求項８】
請求項１から７の何れか一項に記載の検出方法により検出された体内時刻のずれが所定の範囲を越える場合に、検査対象となる哺乳類が概日リズムに変調をきたしていると判定する工程を含む、概日リズムの変調の有無の検査方法。
【請求項９】
哺乳類の血漿中に含まれ、その存在量が概日性の周期をもって変動をする、体内時刻のインジケーターであって、
１）実施例の記載に従いＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析計）による分析をした結果取得される、表１中の１番目〜１４２番目（陽イオンモード）、及び１番目〜１７６番目（陰イオンモード）に示す代謝産物；及び、
２）実施例の記載に従いＣＥ−ＭＳ（キャピラリー電気泳動−質量分析計）による分析をした結果取得される、表３中の１番目〜１５３番目に示す代謝産物；
からなる代謝産物群から選択される少なくとも一つのインジケーター。
【請求項１０】
哺乳類の採血を行なう採血器具と、請求項９に記載のインジケーターの血漿中における量を定量する定量手段と、を備えることを特徴とする、哺乳類の体内時刻測定キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１０−２６１７６４（Ｐ２０１０−２６１７６４Ａ）
【公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１１６０２（Ｐ２００９−１１１６０２）
【出願日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【Ｆターム（参考）】
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