哺乳類細胞の増殖を阻害する方法および組成物
【課題】被験者の異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転する方法の提供。
【解決手段】被験者に、治療のために有効な量のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼを投与する方法。該リボヌクレアーゼはアクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有し、またリボ核酸分解活性が、沸騰、オートクレーブ処理あるいは化学的変性方法によって不活性化されていることが好ましい。さらに該リボヌクレアーゼは、経口投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与あるいは吸入により投与されることが好ましい。
【解決手段】被験者に、治療のために有効な量のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼを投与する方法。該リボヌクレアーゼはアクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有し、またリボ核酸分解活性が、沸騰、オートクレーブ処理あるいは化学的変性方法によって不活性化されていることが好ましい。さらに該リボヌクレアーゼは、経口投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与あるいは吸入により投与されることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検者の異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転させるためのＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼおよびそのリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの使用に関する。さらに本発明は、有効成分として、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたはそのリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含有し、一般に増殖性の疾患または障害、特に癌を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌などの細胞増殖性の疾患および障害の治療に用いる新規な治療薬剤の開発に対する関心が、医学界と一般社会の両方に引続き存在している。
【０００３】
哺乳類の細胞に対して抗増殖性、抗定着性、抗分化性および／または抗発育性を示す薬剤は抗癌剤として使用できる可能性がある。したがって、天然の原料および合成の原料の両方からのこれら薬剤が広く探究されている。
【０００４】
ＲＩＢＡＳＥＳは、そのＲＮＡを分解する性質と異なる生物活性を示すリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）である。ＲＩＢＡＳＥＳとその構造同族体は、多種の細胞反応を行うことが知られている（Ｒｙｂａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６巻２１２０２−２１２０７頁１９９１年；Ｓｃｈｅｉｎ， Ｃ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５巻５２９−５３６頁１９９７年）。ＥＤＮとＥＣＰ、すなわち細胞傷害性好酸球の分泌顆粒に見られる２種のタンパク質（ＲＮアーゼＡのファミリーのメンバー）は、免疫反応に参画していると考えられている。自己不和合性植物において、花柱（ｓｔｙｌａｒ）のＳ−ＲＮアーゼ（ＲＮアーゼのＴ２ファミリーのメンバー）は花粉管の成長を停止させて受精を防止する。ウシガエルの卵母細胞から産生されるＲＣ−ＲＮアーゼは、Ｐ３８８およびＬ１２１０白血病細胞系などの腫瘍細胞の増殖を生体外で阻害し、かつ肉腫１８０、ＥｒｌｉｃｈおよびＭｅｐＩＩ腹水の細胞を生体内で殺すのに有効である（Ｃｈａｎｇ，Ｃ−Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８３巻２３１−２４４頁１９８８年）。いくつかのＲＮアーゼは限定されたリボヌクレアーゼ活性を示し、その一例として、血管生成を刺激するアンギオジェニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）類がある（Ｆｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４巻５４８０−５４８６頁１９８５年）。
【０００５】
生きている生物は、病原体および腫瘍細胞から守るために細胞外ＲＮアーゼを利用する。例えば、ＥＣＰは寄生虫の攻撃に反応して分泌され（Ｎｅｗｔｏｎ，ＤＬ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７巻１９５７２−１９５７８頁１９９２年）かつ抗菌活性や抗ウイルス活性を示す。また、この活性は、血液、精漿、人乳、滑液、唾液、尿および汗を含む大部分のヒトの体液に存在するＲＮアーゼである亜鉛−α２−糖タンパク質も示す（Ｌｅｉ，Ｇ．ら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊｕｌ．１５；３５５（２）；１６０−１６４頁１９９８年）。
【０００６】
細胞外ＲＮアーゼ類が細胞反応で機能する具体的な機序は分かっていない。
【０００７】
ある種のＲＮアーゼの細胞傷害活性に対する主なバリアーは細胞膜である。ＥＣＰは、人工の膜と細胞膜にチャネルを形成することが発見された。ＥＤＮ（小脳の梨状神経細胞の破壊に関与している好酸球のＲＮアーゼ）とともに顆粒膜から放出されるＥＣＰは、恐らく、ＥＤＮを細胞内空間に移送する。真菌毒素のα−サルシン（ＲＮアーゼＡファミリーのメンバー）の標的細胞中への導入は、細胞膜を透過できるようにするウイルスの感染によって決まる（Ｒｙｂａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６巻２１２０２−２１２０７頁１９９１年）。ＲＮアーゼ類はエンドサイト−シスによって細胞内に入ることもできる。ゴルジ破壊薬剤のレチノイン酸またはモネンシンを利用して、ＢＳ−ＲＮアーゼを細胞中に人工的に送達したとき、細胞傷害性が劇的に増大した（Ｗｕ Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１；２７０（２９）：１７４７６−１７４８１頁１９９５年）。
【０００８】
ＲＮアーゼ類の細胞傷害性は、治療のために利用できる。ヒトのＲＮアーゼＬは、インターフェロンによって活性化されてウイルスの増殖を阻害する。ヒトＲＮアーゼＬの遺伝子およびタバコ植物の２′５′−Ａ−シンテターゼの遺伝子の発現によって、植物は、十分に、キュウリモザイクウイルスから保護されかつジャガイモウイルスＹの複製が防止される。ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）は、ＲＮアーゼＬの抗ウイルス経路の遮断を誘発する（Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５巻５２９−５３６頁１９９７年）。ＲＮアーゼ類は、特定の膜タンパク質の抗体と融合して、イムノトキシンをつくることができる。例えば、ＲＮアーゼＡが、トランスフェリン受容体またはＴ細胞抗原ＣＤ５に対する抗体と融合すると、上記毒素各々に対する特異的受容体を保持する腫瘍細胞におけるタンパクの合成が阻害される（Ｒｙｂａｋ， Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６巻２１２０２−２１２０７頁１９９１年；Ｎｅｗｔｏｎ ＤＬら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４；３７（１５）：５１７３−５１８３頁１９９８年）。ＲＮアーゼ類は動物に対する毒性が低いので、現在使用されている免疫毒素より、望ましくない副作用が少ない。
【０００９】
細胞傷害性リボヌクレアーゼの細胞傷害性は、リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩ）と前記ＲＮアーゼの間の相互作用の強さに逆比例するようである。リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩ）は、脊椎細胞内に見られる天然に存在する分子であり、これらの細胞を、リボヌクレアーゼ類の起こりうる致命的な作用から守る働きをする。リボヌクレアーゼのインヒビターは、種々のアフィニティーでＲＮアーゼ類と結合する５０ｋＤａの細胞質タンパク質である。例えば、ＲＩは、１０桁もの阻害定数すなわち１０−６〜１０−１６Ｍの範囲内のＫｉ値で、リボヌクレアーゼのウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ）スーパーファミリーのメンバーと結合する。
【００１０】
Ａ−ＲＮアーゼ類
オンコナーゼ（ｏｎｃｏｎａｓｅ）（例えばＲＮアーゼＡとＢＳ−ＲＮアーゼ）は、ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのメンバーである。ＲＮアーゼスーパーファミリーのメンバーは、そのアミノ酸配列の約３０％が同一である。非保存残基の大部分が表面ループ（ｓｕｒｆａｃｅ ｌｏｏｐ）に位置し、各ＲＮアーゼの特定目的の生物活性に有意な役割を演じているようである。オンコナーゼは、キタヒョウガエル（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｅｏｐａｒｄ ｆｒｏｇ）（ラナ・ピピエンス）（Ｒａｎａ ｐｉｐｉｅｎｓ）の卵母細胞と早期胚から単離した。オンコナーゼは、各種の固形腫瘍に対して、原位置および生体内の両方で抗腫瘍作用がある（Ｍｉｋｕｌｓｋｉ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ １７；８２（２）１５１−１５３頁１９９０年）。オンコナーゼは、感染したＨ９白血病細胞において非細胞傷害性濃度でＨＩＶ−１の複製も特異的に阻害することが見出されている（Ｙｏｕｌｅ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２１；９１（１３）６０１２−６０１６頁１９９４年）。
【００１１】
オンコナーゼのＲＮアーゼ活性は比較的低いが、その酵素活性と細胞傷害活性はある程度、関連している。Ａ−ＲＮアーゼ類の第三級の構造が、細胞傷害型と非細胞傷害型を区別すると考えられる。例えば、オンコナーゼとＲＮアーゼＡの第三級構造の差は、オンコナーゼに観察される細胞傷害性の増大が原因であると考えられる。オンコナーゼは、ＲＮアーゼと異なり、酵素活性と細胞傷害活性の両方に不可欠のブロックされたＮ末端Ｇｌｕ１残基（ピログルタメート）を含んでいる。この独特の構造によって、オンコナーゼは、標的細胞中に浸透することができる（Ｂｏｉｘ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：２５７（５）９９２−１００７頁１９９６年）。その上に、オンコナーゼ中のＬｙｓ９残基は、ＲＮアーゼＡのＧｌｎ１１残基を置換し、その結果、活性部位の構造を生成すると考えられる。さらに、オンコナーゼとＲＮアーゼＡとの間の、一次構造のアミノ酸配列の差によって、その特異性をもたらす活性部位の周辺の形態が変化する（Ｍｏｓｉｍａｎｎ Ｓ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １４（３）；３９２−４００頁１９９２年）。
【００１２】
また、Ａ−ＲＮアーゼ類間の毒性の差もＲＩに結合するそれらの性能が原因である。ウシ精液リボヌクレアーゼ（ＢＳ−ＲＮアーゼ）は、アミノ酸配列が、ＲＮアーゼＡと８０％同一であるが、ＲＮアーゼＡスーパーファミリーの他のメンバーと異なり、二量体の形態で存在している。ＢＳ−ＲＮアーゼの第四級の構造が、ＲＩの結合を防止して、その酵素に、そのリボ核酸分解活性（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を、ＲＩの存在下で保持させることが分かっている（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０ Ｎｏ．５２：３１０９７−３１１０２頁１９９５年）。オンコナーゼは、ＲＮアーゼＡと高度の相同性を共有しているが、ＲＩの結合に対して抵抗性である。ＲＩ−オンコナーゼの複合体は、Ｋｄが、少なくともＲＩ−ＲＮアーゼＡ複合体の１億分の１より小さい。オンコナーゼのＲＩに対する結合アフィニティが小さいことによって、リボ核酸分解活性の有効な阻害を防ぎ、そしてオンコナーゼが低濃度で細胞傷害性であるがＲＮアーゼがそうでない理由を説明できる。
【００１３】
細胞表面受容体との結合は、オンコナーゼの細胞傷害性の第一のステップである。哺乳類の細胞表面におけるオンコナーゼ受容性の性能については何も分かっていない。オンコナーゼは、リシンの場合のように、細胞表面の炭水化物に結合するのかもしれずまたはポリペプチドホルモンのような薬理学的に導入された分子に対して本来生成した受容体に結合するのかもしれない（Ｗｕ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１５；２６８（１４）１０６８６−１０６９３頁１９９３年）。オンコナーゼは、マウスでは、ＲＮアーゼＡより５０〜１００倍遅い速度で、腎臓から排泄される。オンコナーゼの排泄速度が遅いことは、オンコナーゼが尿細管細胞に対して結合する性能が高いためであると説明されるかおよび／またはオンコナーゼのタンパク質分解反応に対する耐性で説明される。オンコナーゼが腎臓で強く保持されることは臨床上の意味がある（Ｖａｓａｎｄａｎｉ，Ｖ．Ｍ．ら、Ｃａｎｓｅｒ Ｒｅｓ．１５；５６（１８）４１８０−４１８６頁１９９６年）。オンコナーゼは、プルキンエ細胞のＥＤＮ受容体にも結合できる（Ｍｏｓｉｍａｎｎ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６；２６０（４）５４０−５５２頁１９９６年）。また、オンコナーゼの特異性は、そのｔＲＮＡにおいても優先的に発現される。ウサギの網状赤血球の溶解物およびアフリカツメガエルの卵母細胞において、オンコナーゼが、ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡの分解によるのではなくてｔＲＮＡの分解によって、タンパク質合成を阻害することが発見された。対照的に、ＲＮアーゼＡは、通常ｒＲＮＡとｍＲＮＡを分解する（Ｌｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４；２０４（１）１５６−１６２頁１９９４年）。
【００１４】
感受性組織の培養物をオンコナーゼで処理すると、ＲＮＡ含量のレベルが非常に低い、細胞周期のＧ１相で停止した細胞が蓄積する（Ｍｏｓｉｍａｎｎ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １４（３）３９２−４００頁１９９２年）。グリオーマ細胞において、オンコナーゼは、細胞密度が有意に低下することなしにタンパク質合成を阻害し、このことは、オンコナーゼが細胞分裂を抑制することに加えて細胞傷害性でもあることを示している（Ｗｕ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１５；２６８（１４）１０６８６−１０６９３頁（１９９３年）。化学療法薬剤と組み合わせたオンコナーゼは、多剤耐性を克服することができる。ビンクリスチンとオンコナーゼによる治療によって、ビンクリスチン耐性腫瘍を有するマウスの平均生存期間（ＭＳＴ）が、ビンクリスチン単独で治療したマウスの４４日間に比べて６６日間に増大した（Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５巻５２９−５３６頁１９９７年）。さらに、いくつかの化学療法薬剤がオンコナーゼと相乗作用を行う。オンコナーゼと、タモキシフェン（抗エストロゲン薬）、トリフルオロペラジン（ステラジン、カルモジュリン阻害剤）またはロバスタチン（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタチルコンエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤）の組合せで治療したヒト膵臓腺癌およびヒト肺癌の腫瘍細胞系において、オンコナーゼ単独で治療した細胞より、強力な増殖阻害が観察された（Ｍｉｋｕｌｓｋｉ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｎｅｔ．２３（３）２３７−２４６頁１９９０年）。したがって、有効性が一層大きくおよび／または毒性が一層低い組合せの治療方式を開発できることは明らかである。
【００１５】
ウシ精液ＲＮアーゼは、二つのジスルフィド架橋で連結されたＲＮアーゼ様サブユニットの二量体を含有する唯一のＲＮアーゼであるから、ＲＮアーゼＡファミリーの特異なメンバーである。さらにウシ精液ＲＮアーゼは、基質と反応産物の両方によってアロステリック効果を維持する。その効果は、環状ヌクレオチドの加水分解反応相で起こる。ＢＳ−ＲＮアーゼは、一本鎖ＲＮＡと二本鎖ＲＮＡの両者を開裂する性能を有している。ＢＳ−ＲＮアーゼは細胞傷害性が高い。ＢＳ−ＲＮアーゼは、マウスの白血病細胞、ＨｅＬａ細胞とヒト胎児肺細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏ ｌｕｎｇ ｃｅｌｌ）、マウス神経芽細胞腫細胞およびヒト繊維芽細胞とマウス形質細胞腫の細胞系で、生体外にて抗腫瘍作用を示す。固形肉腫（甲状腺ろ胞肉腫およびその肺への転移）を有するラットに生体内投与すると、ＢＳ−ＲＮアーゼは、治療された動物に対して検出可能な毒作用なしで、腫瘍の重量を劇的に減少させた（Ｌａｃｃｅｔｔｉ，Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２巻４５８２−４５８６頁１９９２年）。人工的に一量体にしたＢＳ−ＲＮアーゼは、天然の二量体ＢＳ−ＲＮアーゼより、リボヌクレアーゼ活性は高いが細胞傷害性は低い（Ｄ’Ａｌｌｅｓｓｉｏ，Ｇ．ら、ＴＩＢＳ １０４−１０６頁１９９１年）。これは、やはり、生物活性に対して分子構造が重要であることを示している。ＢＳ−ＲＮアーゼは、オンコナーゼのように、標的細胞中に入る前に、標的細胞の表面の単一もしくは複数の認識部位に結合するようである。
【００１６】
ＢＳ−ＲＮアーゼは、細胞傷害性であることに加えて、免疫抑制性でもある。ＢＳ−ＲＮアーゼは活性化Ｔ細胞の増殖をブロックしかつ同種異系マウスに移植された皮膚移植片の生存を延長することができる。ＳＢ−ＲＮアーゼの免疫抑制活性は、精子細胞を、雌の免疫系から守るために必要であることによって説明される。
【００１７】
Ｔ２−ＲＮアーゼ類
植物では、自家和合性が、豊富なので、自家受精を防ぐのに有効である。Ｓ遺伝子座に特定の対立遺伝子を有する花粉は、自家不和合性を制御するが、同じＳ−対立遺伝子を有する植物に受精できない。多くの自家不和合性植物の特にナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａ）とバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）のメンバーの場合、Ｔ２−ＲＮアーゼファミリーのメンバーが、雌の器官から分泌される。Ｓ−ＲＮアーゼは、自家花粉を特異的に認識して、受精が起こる前に、柱頭と花柱の成長を停止し（Ｃｌａｒｋｅ，Ａ．Ｅ．およびＮｅｗｂｉｇｉｎ，Ｅ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２７巻２５７−２７９頁１９９３年）、花粉管の成長の停止はＲＮＡ分解の直接の結果であると考えられるが、Ｓ−ＲＮアーゼが花粉管に入る方式はいぜんとして不明のままである。
【００１８】
ＲＮアーゼＴ２ファミリーのメンバーは真菌に始めて確認された（Ｅｇａｍｉ，Ｆ．およびＮａｋａｍｕｒａ Ｋ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン１９６９年）。その後、これらメンバーは、ウイルスから哺乳類にわたって多種類の生物内に発見された。特に、Ｔ２−ＲＮアーゼ類は、広く説明されているＲＮアーゼＡファミリーよりはるかに広く分布している。しかし、哺乳類細胞のＴ２−ＲＮアーゼ類の生体内での役割はまだ分かっていない。
【００１９】
微生物内において、細胞外Ｔ２−ＲＮアーゼ類は、増殖培地中に存在するポリリボヌクレオチド類の消化に寄与して拡散可能な栄養素を生成すると一般的に考えられている。また、Ｔ２−ＲＮアーゼ類は防御剤としても働く（Ｅｇａｍｉ，Ｆ．およびＮａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン１９６９年）。
植物内で、Ｔ２−ＲＮアーゼ類は、花粉管が胚珠の方に向かって伸長するのを選択的に制限することによって、送粉の過程での役割を演じている（Ｒｏｉｚ，Ｌ．およびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｏ．，Ｉｎｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５６巻３７−４１頁１９９５年；Ｒｏｉｚ，Ｌ．ら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ ９４巻５８５−５９０頁１９９５年）。現在、これらＲＮアーゼ類の花粉管に対する作用の機序は不明である。
【００２０】
したがって、癌治療剤として有効に使用できる細胞傷害性リボヌクレアーゼ類の例はほとんどない。哺乳類の細胞に対し、抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性を有する新しいリボヌクレアーゼ類が、ヒトの癌を治療するのに利用できる治療薬の範囲を広げて、癌治療の分野に新しい領域を切り開くために必要である。
【００２１】
このように、広く認められている要望があるので、癌などのヒトの増殖性疾患を治療するのに非常に有用な新規なリボヌクレアーゼを入手することは極めて有利である。
【発明の概要】
【００２２】
本発明の一つの側面によって、被検者の異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転する方法であって、被検者に、治療のため有効な量のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼを投与するステップを含んでなる方法が提供される。
【００２３】
本発明の別の側面によって、被検者の異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転する方法であって、被検者に、治療のため有効な量の、Ｔ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発現できるポリヌクレオチドを投与するステップを含んでなる方法が提供される。
【００２４】
本発明のさらに別の側面によって、（ｉ）被検者の腫瘍を治療する方法；（ｉｉ）被検者の腫瘍が発育するのを予防し、阻害しおよび／または逆転する方法；（ｉｉｉ）被検者の良性腫瘍が悪性腫瘍に転換するのを予防し、阻害しおよび／または逆転する方法；（ｉｖ）被検者の腫瘍の血管新生を予防し、阻害しおよび／または逆転する方法；（ｖ）被検者の個々の腫瘍の数を減らす方法；（ｖｉ）被検者の腫瘍の大きさを小さくする方法；（ｖｉｉ）被検者の悪性腫瘍の数を減らす方法；および（ｖｉｉｉ）被検者の組織が腫瘍に転換するのを予防し、阻害しおよび／または逆転する方法であって、被検者に、治療のため有効な量のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ、または治療のため有効な量の、Ｔ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発現できるポリヌクレオチドを投与することによって実施する方法が提供される。
【００２５】
本発明のさらに別の側面によって、有効成分としてのＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ、および医薬として許容できる担体を含有する医薬組成物が提供される。
【００２６】
本発明のさらなる側面によって、有効成分としての、Ｔ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発現することができるポリヌクレオチド、および医薬として許容できる担体を含有する医薬組成物が提供される。
【００２７】
本発明のさらに追加の側面によって、異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転するのに有用な医薬を製造する方法であって、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼを医薬として許容できる担体として組み合わせるステップを含んでなる方法が提供される。
【００２８】
本発明のさらに追加の側面によって、異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転するのに有用な医薬を製造する方法であって、Ｔ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発現できるポリヌクレオチドを医薬として許容できる担体と組み合わせるステップを含んでなる方法が提供される。
【００２９】
以下に述べる本発明の好ましい実施態様の別の特徴によれば、前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、リボ核酸分解活性を実質的に欠いている。用語「リボ核酸分解活性を実質的に欠いている」は（ｉ）類似の非不活性化リボヌクレアーゼに比較してリボ核酸分解活性が０〜１０％であるＴ２ファミリーの不活性化リボヌクレアーゼ（天然または組換えの）；および／または（ｉｉ）類似の非変異体のリボヌクレアーゼに比べてリボ核酸分解活性が０〜１０％であるＴ２ファミリーの組換え変異体（天然または人工的に誘導した）リボヌクレアーゼを意味する。Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性の不活性化は、沸騰、オートクレーブ処理および化学的変性からなる群から選択した方法で行うことができる。
【００３０】
上記好ましい実施態様のさらに別の特徴によれば、異常に増殖する細胞は癌性細胞である。
【００３１】
上記好ましい実施態様のさらに別の特徴によれば、被検者に、治療のために有効な量のＴ２ファミリーのＲＮアーゼを投与するステップは、経口投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与および吸引による投与からなる群から選択される投与方式で行われる。
【００３２】
上記好ましい実施態様のさらに別の実施態様によれば、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼはＲＮアーゼＢ１である。
上記好ましい実施態様のさらに別の特徴によって、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼＲｈ、ＲＮアーゼＭ、ＲＮアーゼＴｒＶ、ＲＮアーゼＩｒｐ、ＲＮアーゼＬｅ２、ＲＮアーゼＰｈｙｂ、ＲＮアーゼＬＥ、ＲＮアーゼＭＣ、ＲＮアーゼＣＬ１、ＲＮアーゼＢｓｐ１、ＲＮアーゼＲＣＬ２、ＲＮアーゼＤｍ、ＲＮアーゼＯｙおよびＲＮアーゼＴｐからなる群から選択される。
【００３３】
上記好ましい実施態様のさらに別の特徴によって、前記医薬は、特定の増殖性の障害または疾患、例えば特定の癌に対する治療薬を提供することが確認される。
【００３４】
上記好ましい実施態様のさらに別の特徴によって、前記異常に増殖する細胞は、乳頭腫、ブラストグリオーマ（ｂｌａｓｔｏｇｌｉｏｍａ）、カポジ肉腫、黒色腫、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星細胞腫、頭部癌、頚部癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、リウマチ様関節炎、糖尿病網膜症、血管新生、再狭窄、イン−ステント（ｉｎ−ｓｔｅｎｔ）再狭窄および移植血管の再狭窄からなる群から選択される増殖性の障害または疾患に関連する細胞である。
【００３５】
本発明は、増殖性の疾患または障害、例えば癌を予防し、阻害し、かつ逆転させるのに有用なＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの特徴的な新規な活性によって、現在知られている配置構成の欠点を成功裡に処理する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
ここで本発明を、例示することだけを目的として添付図面を参照して説明する。ここで詳細な図面を参照して、示されている詳細事項は、実施例として、本発明の好ましい実施態様を例示して考察することだけを目的とするものであり、最も有用であると考えられるものおよび本発明の原理および概念の側面が直ちに理解される説明を提供するために提供することを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要以上に詳細に本発明の構造の詳細を示すことはしておらず、図面について行った説明によって、当業技術者にとって、いくつもの形態の本発明がどのように実施できるか明らかになるであろう。
【図１】図１は、Ｒｏｉｚ，Ｌ．とＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｏ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５６巻３７−４１頁１９９５年の教示にしたがって単離したアスペルギルス・ニガーのＲＮアーゼＢ１の吸光度とＲＮアーゼ活性を示すグラフである。グラフＡは、粗濾液のＥＭＤ−ＴＭＡＥカラムクトマトグラフィーによって得た画分を示し、一方グラフＢは、上記粗濾液のＥＭＤ−ＴＭＡＥクロマトグラフィーから得た活性画分のＭＯＮＯ−Ｑカラムクロマトグラフィーから得た画分を示す。実線は２８０ｎｍの吸光度を示し、破線はＲＮアーゼ活性を示す。
【図２】図２は、利用された精製ステップを通じてＲＮアーゼＢ１タンパク質の濃度が増大するのを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥザイモグラムである。レーン１は粗濾液を示し；レーン２はＥＭＤ−ＴＭＡＥカラムからの溶出液を示し；レーン３はＭＯＮＯ−Ｑカラムからの溶出液を示し；レーン４は、ＲＮアーゼ活性についてその場で検定され次いでトルイジンブルーで染色されたレーン３の溶出液を示し；レーン５は、ＰＮＧアーゼＦによって脱グリコシル化された後、精製されたＲＮアーゼを示す。レーン１〜３と５はクーマシー・ブルーで染色した。
【図３】図３は、桃花粉の発芽（黒四角印を有する実線）と花粉管の長さ（白四角印を有する破線）に対する異なる濃度のＲＮアーゼＢ１の生体外での作用を示すグラフである。
【図４】図４は、柱頭および花柱の上部における桃花粉管の成長に対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。図４ａは対照の花を示し、一方、図４ｂは受粉前にＲＮアーゼＢ１で処置された花である。バー（Ｂａｒ）＝０．２ｍｍ。
【図５】図５は、タンジェリンの花の柱頭における花粉管の成長に対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。図５ａは、自然受粉に４８ｈｒ暴露された対照の花を示す。図５ｂは受粉前に、ＲＮアーゼＢ１で処置された花を示す。バー＝０．１ｍｍ。
【図６】図６は、ネクタリンの種子について実施した生存能力試験を示す。図６ａは未処置の花が産生した対照の種子を示し、一方、図６ｂはＲＮアーゼＢ１で処置した花が産生した種子を示す。バー＝０．３ｍｍ。
【図７】図７は、ユリｃｖ．Ｏｓｎａｔの花粉管の長さに対するＲＮアーゼＢ１、未処置、沸騰またはオートクレーブ処理の作用を示す。
【図８】図８は、生体外で成長しＩＫＩで染色されたユリ花粉管に対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。
【図９】図９は、ＲＮアーゼＢ１で処置していない花粉管（図９ａ）とＲＮアーゼＢ１で処置した花粉管（図９ｂ）におけるオルガネラの移動と局在を示す集積ビデオ画像からとらえたショットを示す。
【図１０】図１０は、成長中のユリ花粉管のアクチンフィラメントに対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。図１０ａは対照の花粉管を示し、一方、図１０ｂはＲＮアーゼＢ１で処置した花粉管を示す。両方の花粉管を実験後に切り取ってＴＲＩＴＣファロイジンで染色して可視化した。
【図１１】図１１は、アクチンに対するＲＮアーゼＢ１の結合を示すスキッチャードプロットである。Ａはアクチンの濃度（μＭ）、Ｒｆは遊離ＲＮアーゼＢ１の濃度（μＭ）、Ｒｂは結合したＲＮアーゼＢ１の濃度（μＭ）である。
【図１２】図１２は、１ｈｒ成長させて免疫金銀染色を行ったユリ花粉管を示す。図１２ａは対照を示し、一方図１２ｂと１２ｃは両者ともにＲＮアーゼＢ１で処置された花粉管である。図１２ｂに示す花粉管はウサギの免疫前血清とともにインキュベートした。一方図１２ｃに示す花粉管は抗ＲＮアーゼＢ１ウサギポリクローナル抗体とともにインキュベートした。
【図１３】図１３は、ＨＴ２９結腸癌細胞の生存能力に対することなる濃度のＲＮアーゼＢ１の作用を示す。細胞の反復試料を３７℃で４８ｈｒまたは７２ｈｒ増殖させ、トリパンブルーで分染することによって可視化して計数した。図１３ａは細胞の合計数を示すが、図１３ｂは死んだ細胞の百分率を示す。
【図１４】図１４は、ＨＴ２９細胞のクローン原性に対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。細胞の反復試料を、１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１ありまたはなしで、４８ｈｒ増殖培地でプレインキュベートし、トリプシンで処理し、洗浄し、段階的に希釈したＲＮアーゼＢ１なしの増殖培地に再懸濁させ、９６ウェル微量滴定プレート中にプレートして１４日間定着させた。コロニーを、固定と、メチレンブルーによる染色を行った後に計数した。
【図１５】図１５はＨＴ２９細胞のクローン原性に対する、ＲＮアーゼＢ１への暴露期間の作用を示す。細胞の反復試料を、１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１を含有する増殖培地とともに４８ｈｒプレインキュベートし、次いで同濃度のＲＮアーゼＢ１を含有する増殖培地またはＲＮアーゼを含有しない培地で定着させた。定着は９６ウェルの微量滴定プレートで７日間行った。各処置は、一ウェル当たりの細胞初期数が異なっていた。コロニーは同定およびメチレンブルーによる可視化を行った後に計数した。ＲＮアーゼＢ１なしの増殖培地でプレインキュベートして定着させた細胞は対照として利用した。
【図１６】図１６はＨＴ２９細胞の定着性能に対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。対照の細胞（図１６ａ）は、ＲＮアーゼＢ１なしの増殖培地で４８ｈｒプレインキュベートし、次にトリプシン処理を行い、次に９６微量滴定プレートの同じ増殖培地でインキュベートして定着させた。図１６ｂは、１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１を含有する増殖培地で４８ｈｒプレインキュベートし次にＲＮアーゼＢ１なしの増殖培地で定着させた細胞を示す。図１６ｃはプレインキュベートし次いで１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１を含有する増殖培地で定着された細胞を示す。細胞のコロニーはメチレンブルー染色法を利用して可視化した。
【図１７】図１７はラット６頭ずつの各群に対する処置を説明するラットに実施した生体内実験の模式図である。
【図１８】図１８はＲＮアーゼＢ１のＣＡＰマイクロカプセルからの放出速度に対する２種のｐＨの作用を示す。１０ｍｇのＲＮアーゼＢ１を含有するマイクロカプセルを、０．１ＭＨＣｌ（ｐＨ１）または０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）１０ｍｌ中に懸濁させ、撹拌しながら３７℃でインキュベートした。上部溶液の試料を３０分毎に採取してＲＮアーゼの活性の試験を行った。
【図１９ａ−１９ｂ】図１９ａ−１９ｂは、各実験終了時の体重で示す、ラット成長速度に対するＲＮアーゼＢ１および／またはＤＭＨの作用を示す。初期のラット重量は約２００ｇであった（ｎ＝６）。図１９ａ：ＰＢＳ、ＲＮアーゼＢ１またはＩ−ＲＮアーゼＢ１を、最初のＤＭＨ注射の後、１〜９週に浸透ポンプで投与した（予防処置）。上記のように処置したがＤＭＨなしの場合のラットを対照として使用した。図１９ｂ：ＰＢＳ、ＲＮアーゼＢ１またはＩ−ＲＮアーゼＢ１を、最初のＤＭＨ注射の後、１２〜１７週に浸透ポンプで投与した（治療処置）。
【図１９ｃ−１９ｄ】図１９ｃ−１９ｄは、各実験終了時の体重で示す、ラット成長速度に対するＲＮアーゼＢ１および／またはＤＭＨの作用を示す。初期のラット重量は約２００ｇであった（ｎ＝６）。図１９ｃ：ラットに、予防処置として、ＲＮアーゼＢ１またはグルコースを含有するマイクロカプセルを投与した。ＤＭＨなしでＲＮアーゼＢ１で処置したラットを、対照として使用した。図１９ｄ：ラットに、ＲＮアーゼＢ１またはグルコースを含有するマイクロカプセルを投与した。
【図２０】図２０は、予防処置として、ＲＮアーゼＢ１（図２０ａ）、Ｉ−ＲＮアーゼＢ１（図２０ｂ）またはＰＢＳ（図２０ｃ）が入っている浸透ポンプを移植したラットの糞便のＲＮアーゼ活性を示す。対照として、ラットをＤＭＨなしでＲＮアーゼＢ１またはＰＢＳで処置した。ＲＮアーゼの活性は、実施例の項に記載したようにして測定した。
【図２１】図２１は、予防処置として、ＲＮアーゼＢ１またはグルコースを含有するマイクロカプセルを与えたラットの糞便のＲＮアーゼ活性を示す。対照として、ラットにＤＭＨなしでＲＮアーゼＢ１またはグルコースを与えた。ＲＮアーゼ活性は実施例の項で述べたようにして測定した。
【図２２】図２２は、予防処置として浸透ポンプを移植されたラット（ｎ＝６）の遠位結腸（５ｃｍ）中の異所性陰窩病巣（ＡＣＦ）の数を示す。
【図２３】図２３は、予防処置として、ＲＮアーゼＢ１またはグルコースのマイクロカプセルを与えられたラットの遠位（５ｃｍ）結腸で検査した異なるパラメータに対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す（ｎ＝６）。図２３ａ：腫瘍の数／結腸；図２３ｂ：腫瘍の大きさ；図２３ｃ：ＡＣＦ／結腸。
【図２４】図２４は、切り取って１ｈｒ後に、内側粘膜表面を撮影したときの異なるタイプの腫瘍を示す。図２４ａ：赤色の腫瘍；図２４ｂ：白色の腫瘍。図２４ｃ：ピンク色の腫瘍と赤色の腫瘍。図２４ｄ：予防処置として、グルコースまたはＲＮアーゼＢ１を含有するマイクロカプセルを与えたラットの３種の腫瘍の分布。
【図２５】図２５は、メーヤーのヘマトキシリンとマルチウス−イエローで染色した腫瘍の組織病理学的検査を示す。図２５ａ：アデノマまたはアデノパピローマー良性腫瘍。図２５ｂ：腺癌、粘膜細胞が粘膜下組織の下側につきぬけている。図２５ｃ：十分に発育した腺癌、組織の配列がすっかり中断されている。図２５ｄ：予防処置として、グルコースまたはＲＮアーゼＢ１のカプセルで処置したラットの結腸のアデノーマ型と腺癌型の腫瘍の分布パターン。
【図２６】図２６は、治療処置として、ＰＢＳ、ＲＮアーゼＢ１またはＩ−ＲＮアーゼＢ１が入っている。浸透ポンプで処置したラットの遠位（５ｃｍ）結腸で検査した異なるパラメータに対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。図２６ａ：腫瘍の数／結腸；図２６ｂ：大きさによる腫瘍の分布；図２６ｃ：血管新生を示す色による腫瘍の分布。
【図２７】図２７は、治療処置として、ＲＮアーゼＢ１またはグルコースのマイクロカプセルを投与したラットの遠位（５ｃｍ）結腸で検査した異なるパラメータに対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。図２７ａ：腫瘍の数／直腸；図２７ｂ：大きさによる腫瘍の分布；図２７ｃ：血管新生を示す色による腫瘍の分布。
【図２８】図２８は、４日間培養し、アクチンについてＴＲＩＲＣで染色したヒト結腸癌ＨＴ−２９細胞を示す。図２８ａ：対照の細胞；図２８ｂ：１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１の存在下で増殖させた細胞。
【図２９】図２９は、４日間培養し、細胞膜のアクチンを免疫染色したヒト結腸癌ＨＴ−２９細胞を示す。図２９ａ：対照の細胞；図２９ｂ：１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１の存在下で増殖させた細胞。
【図３０】図３０は、４日間培養し、ＦＩＴＣで免疫染色したヒト結腸癌ＨＴ−２９細胞を示す。抗−ＲＮアーゼＢ１を一次抗体として使用した。図３０ａ：対照の細胞；図３０ｂ：ＲＮアーゼＢ１の存在下で増殖させた細胞。細胞表面に結合したＲＮアーゼＢ１を示している；図３０ｃ：免疫前血清（ＰＩＳ）を一次抗体として使用した。
【図３１】図３１は、ユリの花粉管の長さに対する異なるタンパク質による処理の作用を示す。花粉管は、実施例の項で述べたように２５℃にて１ｈｒ生体外で増殖させた。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、被検者の異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転するための、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたはそのリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの使用を教示する。本発明は、さらに、有効成分として、一般に増殖性の疾患または傷害を、および特に癌を治療するのに用いるＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたはそのリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物を教示する。
【００３８】
細胞傷害活性を有するリボヌクレアーゼを、腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用することは、新しいことではなく、当該技術分野ではすでに論証されている。オンコナーゼとして商業的に知られているＡファミリーのリボヌクレアーゼは、臨床試験で腫瘍状組織における細胞の増殖を阻害することが分かっている。ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのいくつもの他のＲＮアーゼも、それらのリボ核酸分解活性に加えて細胞傷害活性を有することも論証されている。
【００３９】
いくつかのリボヌクレアーゼの細胞傷害性は、ある程度、それらのリボ核酸分解活性に依存しているが、リボ核酸分解活性のレベルは、リボヌクレアーゼについて観察される細胞傷害性のレベルと必ずしも相関関係があるわけではない。さらに、細胞傷害活性を全く示さないがリボヌクレアーゼとしてうまく機能するリボヌクレアーゼのいくつもの例がある。最もよく知られている例はＲＮアーゼＡである。他の場合では、反応速度が、より特異的な結合またはいくつかの他の性能の改良された機能のために犠牲になっている。例えば、アンギオジェニンの活性部位は、ＲＮアーゼＡに存在しない側鎖によってブロックされて、ＲＮアーゼを、全基質に対する活性を１００００分の一にするが、リボソームのＲＮＡの分解に対しては一層特異的にする。ＢＳ−ＲＮアーゼはそれがモノマーの場合、より速いヌクレアーゼである。しかし、その細胞傷害性は一層高いので、二量体の形態の場合、リボヌクレアーゼ阻害剤による阻害はかなり低下する。グリコシル化ＲＮアーゼＢは、大部分の基質に対して、ＲＮアーゼＡより活性が低いが、ＢＳ−ＲＮアーゼにしばしば観察される脱アミド反応（アスパラギン６７からイソアスパルテートへ）は、該タンパク質の水素結合構造の全連鎖を切断することによって、ＲＮアーゼＡ変異体の活性を低下させる（Ｓｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５巻５２９−５３６頁１９９７年に概説されている）。
【００４０】
Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ類は、それらの独特な分子の特徴が特徴である。ＡファミリーとＴ２ファミリーのＲＮアーゼのメンバーの比較結果を以下の表２に要約してある（アミノ酸の位置は、ファミリーＡのＲＮアーゼＡとファミリーＴ２のＲＮアーゼＴ２の後である）。
【００４１】
【表１】
【００４２】
Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ類は、植物中のみならず多数の微生物中に確認されており、植物内では、花粉管が胚珠の方に向いて伸びるのを選択的に制御することによって、受粉の過程で能動的な役割を演じている。
【００４３】
本発明の発明者らが明らかにして、実施例１，２および６で以下に詳細に述べるように、ＲＮアーゼＢ１すなわち一種のＴ２リボヌクレアーゼは、リボ核酸分解的に活性かまたはリボ核酸分解的に不活性であり、伸長中の花粉管中のアクチンに特異的に結合して花粉管の伸長を阻害し、かつ哺乳類の細胞のアクチンにも結合する。
【００４４】
アクチンは、細胞構造を維持しかつ臓器細胞の細胞内輸送を支持するのに能動的な、細胞の必須細胞骨格成分であるフィラメントを形成することが知られている。その結果、アクチンフィラメントは、増殖、定着、分化、転換、および組織形成を含む他の発育の側面を含む、正常細胞および異常細胞のライフサイクル全体の多くの細胞プロセスに参画している。アクチンが、癌細胞の発育を制御する各種細胞プロセスにも参画しているということは、多数の研究論文が示している（Ｊｏｒｄａｎ，Ｍ．Ａ．およびＷｉｌｓｏｎ，Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０巻１２３−１３０頁１９９８年； Ｊａｍｍｙ，Ｐ．Ａ．およびＣｈａｐｏｎｎｉｅｒ，Ｃ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７巻１１１−１１７頁１９９５年； Ｓｉｇｍｏｎｄ，Ｓ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８巻６６−７３頁１９９６年； Ｔａｐｏｎ，Ｎ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９巻８６−９２頁１９９７年）。したがって、例えば、アクチンフィラメントは異常細胞の増殖に参画している（Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．Ｋ．およびＺｈｕ，Ｘ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９巻９３−９８頁１９９７年）。悪性細胞は、正常細胞よりサイトカラシンＢに対して感受性であることが発見された（Ｈｅｍｓｔｒｅｅｔ，Ｇ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５Ｓ １９７−２０４頁１９９６年）。
【００４５】
アクチンは、高度保存タンパク質であり、進化の面で遠縁の生物間に高レベルの相同性を維持しているので、花粉管の伸長を阻害するＲＮアーゼＢ１のアクチン結合活性を、この理論によって限定されることなく利用して、哺乳類の細胞のアクチンに特異的に結合させて、その細胞の増殖、定着、分化および／または発育を阻害できるという仮説を立てたのである。
【００４６】
本発明を、実施例の項の実施例２と５で述べるように実施すると、外因性ＲＮアーゼＢ１が膜アクチンに特異的に結合して、細胞アクチンネットワークの障害を起こす。実施例３〜５に示すように、ＲＮアーゼＢ１の哺乳類癌細胞に対する作用を、生体外と生体内でさらに研究した。その実施例で明らかに立証されているように、ＲＮアーゼＢ１は、（ｉ）培養で増殖させた腺癌細胞の増殖および／または定着をかなり減少させ、そして（ｉｉ）大腸癌ラットモデルにおいて、予防的方式および／または治療的方式で、異所性クリプト病巣（ａｂｅｒｒａｎｔ ｃｒｙｐｔ ｆｏｃｉ）（ＡＣＦ）を減らし、腫瘍の数と大きさを小さくし、腫瘍の血管新生を阻害し、腫瘍の悪性度とアデノーマから腺癌への移行を減らし、一方大腸もしくは他の臓器の健康な組織に対して明らかな副作用が全くない。
【００４７】
本発明の少なくとも一つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に述べられているかまたは諸実施例に例示されている詳細事項にその用途を限定されないと解すべきである。本発明は、他の実施態様を実施できるかまたは種々の方式で実施することができる。また、本願で利用される語句は、説明を目的とするもので本発明を限定しないと解すべきである。また、本発明は、本願に示される理論または仮説によって拘束されるかまたは限定されることがないと解すべきである。
【００４８】
Ｔ２ファミリーの１種以上のリボヌクレアーゼを、本願では、総合的にＴ２−ＲＮアーゼと呼称する。同様に、Ｔ２ファミリーの１種以上のリボヌクレアーゼをコードする１種以上のポリヌクレオチドを、本願では、総合的に、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチド（または同等物）と呼称する。
【００４９】
したがって、本発明の一側面によって、被検者の異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転する方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、被検者に、治療のために有効な量のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたはＴ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発見できるポリヌクレオチドを、それ自体でまたは医薬組成物の有効成分として投与することによって行われる。
【００５０】
したがって、本発明の他の側面によって、有効成分としてのＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたはＴ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発現できるポリヌクレオチド、および医薬として許容できる担体を含有する医薬組成物が提供される。
【００５１】
本発明のさらに他の側面によって、異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転するのに有用な薬剤の製造方法であって、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたはＴ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発現できるポリヌクレオチドを、医薬として許容できる担体と組み合わせるステップを含んでなる方法が提供される。
【００５２】
上記薬剤は、好ましくは、例えば特定の癌のような特定の増殖性の障害または疾患に対し治療剤を提供することが確認される。このような確認は、当該技術分野でよく知られているように、例えば、薬剤が入っている容器またはリーフレットに印刷される。
【００５３】
本発明の方法と医薬組成物は、例えば（ｉ）被検者の腫瘍を治療するため；（ｉｉ）被検者に腫瘍が発するのを予防し、阻害し、および／または逆転させるため；（ｉｉｉ）被検者の良性腫瘍が悪性腫瘍に転換するのを予防し、阻害しおよび／または逆転させるため；（ｉｖ）被検者の腫瘍の血管新生を予防し、阻害および／または逆転させるため；（ｖ）被検者の個々の腫瘍の数を減らすため；（ｖｉ）被検者の腫瘍の大きさを小さくするため；（ｖｉｉ）被検者の悪性腫瘍の数を減らすため；および／または（ｖｉｉｉ）被検者の組織が腫瘍に転換するのを予防し、阻害しおよび／または逆転させるために利用できる。
【００５４】
Ｔ２−ＲＮアーゼは、天然の原料から、下記実施例１に例示するように誘導することができ、あるいは、適当なポリヌクレオチド（下記表２とそれに続く説明参照）と発現系を使用して組換えタンパク質として製造することができる。組換えタンパク質の発現と精製は、当該技術分野で周知のことであり、多数の教本および研究所のプロトコル書に詳細に記載されている複数の方法のうちのいずれか一つによって行うことができ、それらの教本とプロトコル書としては、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ−ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４年； Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州ボルチモア１９８９年； Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク州；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク州；Ｂｉｒｒｅｎら編、「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ 」１−４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク州１９９８年がある。
【００５５】
【表２】
【００５６】
いくつかの用途の場合、望ましくない副作用があるかまたは望ましくない副作用を起こすことがあるリボ核酸分解活性を実質的に欠いているリボヌクレアーゼを使用することが有利である。用語「リボ核酸分解活性を実質的に欠いている」は、本願で使用する場合、（ｉ）類似の非不活性化リボヌクレアーゼに比べてリボ核酸分解活性が０〜１０％であるＴ２ファミリーの不活性化リボヌクレアーゼ（天然または組換えの）；および／または（ｉｉ）類似の非変異体リボヌクレアーゼに比べてリボ核酸分解活性が０〜１０％であるＴ２ファミリーの組換え変異体（天然の単離物または人工によるもの）のリボヌクレアーゼを意味する。Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性の不活性化は、沸騰、オートクレーブ処理および化学的な変性もしくは不活性化からなる群から選択した方法で行うことができる。
【００５７】
後記実施例２と６でさらに詳細に述べるように、本発明の発明者らは、ＲＮアーゼＢ１の抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性がそのリボ核酸分解活性に依存しておらず、沸騰させ、オートクレーブ処理しおよび化学的に不活性化（アセチル化）したＲＮアーゼＢ１はリボ核酸分解活性がほとんどない（１０％）かまたは実質的にない（０〜１０％）が、その抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性はすべて実質的に保持していることを示した。
【００５８】
したがって、本発明のＴ２−ＲＮアーゼタンパク質は、天然のリボ核酸分解活性型、または代わりに、リボ核酸分解活性がないか（０％）またはほとんどない（１０％まで）サイレントのもしくは抑制されたリボ核酸分解活性型であるがその他の活性を維持している型の両方で利用することができる。それ故、用語「Ｔ２−ＲＮアーゼ」は、そのタンパク質の他の特性のいかんにかかわらず、そのタンパク質の抗増殖型、抗定着型、抗分化型および抗発育型のすべてを含んでいるものとする。
【００５９】
リボ核酸分解活性は被検者に望ましくない副作用をもたらすことがあるので、望ましい活性を示すがリボ核酸分解活性が欠けているかまたは抑制されているＴ２−ＲＮアーゼを、直接に、またはポリヌクレオチドから発現させて利用することが特に有利であることが分かるであろう。
【００６０】
本願で定義されるＴ２−ＲＮアーゼのアミノ酸配列を示すポリペプチドは、当該技術分野で周知のいくつもの方法のうちのいずれか一つによって製造することができる。例えば、そのポリペプチドは、標準のペプチド合成技法によって、例えば、標準の９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆ−Ｍｏｃ）化学（例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．とＳｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１６５ １９８５年参照）または標準のブチロキシカーボネート（Ｔ−Ｂｏｃ）化学を利用して合成で製造できるが、ごく最近、Ｓｈｅｐｐａｒｄが開発したフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）／ｔｅｒ−ブチル系がますます広く利用されていることに注目すべきである（Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ，Ｔｈｅ ＬＫＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ３３巻９頁１９８６年）。
【００６１】
あるいは、Ｔ２−ＲＮアーゼタンパク質は、このタンパク質を発現することが分かっている生物から、当該技術分野で周知の方法で単離し次いで精製することもできる。このような生物としては、例えば、エロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎｕｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ホエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、リソプス・ニベウス（Ｒｈｉｓｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、レンティヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）、イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕｓ）、フィサルム・ポリセフルム（Ｐｈｙｓａｒｕｍ ｐｏｌｙｃｅｐｈｌｕｍ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、リコペルシコン・エスクレンツム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ニコチアナ・アラタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ）、マルス・ドメスチカ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ピルス・ピリフォリア（Ｐｙｒｕｓ Ｐｙｒｉｆｏｌｉａ）、モモルディカ・カランチア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）、ガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）、ラナ・カテスベイアナ（Ｒａｎａ ｃａｔｅｓｂｅｉａｎａ）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｙｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、クラソステラ・ギグス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｅｒａ ｇｉｇｕｓ）、トダロデス・パシフィクス（Ｔｏｄａｒｏｄｅｓ ｐａｓｉｆｉｃｕｓ）、およびホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）がある。しかし、Ｔ２−ＲＮアーゼを産生することがまだ知られていない他の生物は、産生することが発見されると、本発明によって、Ｔ２−ＲＮアーゼの原料として使用できると考えられる。
【００６２】
あるいは、好ましくは、Ｔ２−ＲＮアーゼタンパク質は、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適当な発現ベクター系を使って発現させることによって組換え法で製造することができる。好ましくは、適切な翻訳後の修飾体を提供する発現系が選択される。適切な発現ベクター系としては、限定されないが、ウイルス（例えばアデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アビポックスウイルス）に感染した哺乳類細胞；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞；遺伝子によって改変された植物、またはプラスミド、植物ウイルスもしくはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌で形質転換された植物細胞；酵母ベクターを含有する酵母などの形質転換された微生物またはバクテリオファージＤＮＡ、プラミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌がある。ベクターの発現制御要素は利用される宿主−ベクター系に対応してその強度と仕様が変化し、いくつもの適切な転写要素と翻訳要素のうちのいずれか一つを使用できる。組換え法で製造したＴ２−ＲＮアーゼは、宿主の細胞から、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、免疫沈降法、沈降法などの当該技術分野で公知の方法によって精製することができる。
精製されたＴ２−ＲＮアーゼを使用し、適当な医薬として許容される担体および／または添加剤を添加して、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、研和、乳化、被包形成、封入（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）または凍結乾燥の方法によって本発明の薬剤を製造することができ、あるいは精製されたＴ２−ＲＮアーゼは、先に述べたような適当な送達ベヒクルに結合してもよい。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチドは天然のＴ２−ＲＮアーゼタンパク質をコードすることができ、この場合のいずれの用語も、抗増殖活性とリボ核酸分解活性の両方を有するＴ２−ＲＮアーゼを述べており、または、代わりに、本発明のポリヌクレオチドは、リボ核酸分解活性を全くもっていないかもしくはほとんどもっていないサイレントなもしくは抑制されたＴ２−ＲＮアーゼ変異体をコードして、リボ核酸分解活性を実質的にもっていないタンパク質を生体内で発現し（例えば転写し翻訳し）することができる。
【００６４】
したがって、用語「ポリヌクレオチド」は、一般的なＴ２−ＲＮアーゼの場合にまたは特異的なＴ２−ＲＮアーゼの場合に、本願で用いるとき、異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転させるのに能動的で、リボ核酸分解活性を有しているかまたは実質的に欠いているＴ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を意味する。リボ核酸分解活性を欠いたＴ２−ＲＮアーゼをコードしているポリヌクレオチドは、公知の分子生物学の技法、例えばランダム突然変異誘発法、部位特異的突然変異誘発法および促進進化（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）法を利用して得ることができる。部位特異的突然変異誘発法は、Ｔ２−ＲＮアーゼのリボ核酸分解活性のために不可欠のアミノ酸残基が分かっているので［Ｋｕｓａｎｏら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２巻８７−９４頁１９９８年（この文献は本願に援用する）および前記表２を参照］、直ちに利用できる。
【００６５】
したがって、本発明を使用して、異常に増殖する細胞例えば癌性などの細胞を特徴とする症状、症候群または疾患であって、限定されないが、例えば乳頭腫、ブラストグリオーマ、カポジ肉腫、黒色腫、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星細胞腫、頭部癌、頸部癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、リウマチ様関節炎、糖尿病網膜症、血管新生、再狭窄、イン−ステント再狭窄および移植血管再狭窄を治療することができる。
【００６６】
用語「癌」または「腫瘍」は、本願で使用するとき、異常な細胞増殖を示す細胞を特徴とする無数の疾患を含む、臨床で述べられる用語である。用語「腫瘍」は、組織に使用される場合、過剰でかつ異常な細胞の増殖を特徴とする異常な組織の増殖を意味する。腫瘍は、「良性」でその元の病巣から拡散できないことがあり、または「悪性」もしくは「転移性」で、その解剖学的部位を超えて他の領域へ、宿主身体全体にわたって拡散可能であることがある。用語「癌」は古い用語であり、悪性腫瘍またはそれから起こる疾患の状態を述べるのに一般に使用される。あるいは、その用語は、新生物のような異常増殖および悪性新生物のような悪性異常増殖を意味する。
【００６７】
本願に記載されかつ後記実施例の項に例示されている、抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼはいずれも、本発明の教示にしたがって、治療薬として使用できる。同様に、本願に記載されている抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドはいずれも、本発明の教示にしたがって、治療薬として使用できる。Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼの網羅的でないリストは上記表２に提供してある。後記実施例でさらに例示されるように、Ｔ２ファミリーのメンバーである。ＲＮアーゼＢ１は、抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性を有し、これらの活性は生体内および生体外の検定法で確認した。さらに、ＲＮアーゼＢ１は、リボ核酸分解活性がなくなるように処理された場合でさえ、アクチンに結合することが示されている。したがって、本発明は、当業技術者が、与えられたリボヌクレアーゼを、その抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性について試験できる三つの異なる検定法を提供し、それらの方法は、被検リボヌクレアーゼの癌性細胞に対する作用を確認する生体外検定法、被検リボヌクレアーゼの腫瘍の発育に対する作用を確認する生体内検定法、および被検リボヌクレアーゼの、細胞アクチンおよび／または遊離アクチンに結合する性能を確認するもう一つの生体外検定法である。本発明を、理論によって限定することなしに、アクチンに結合するリボヌクレアーゼの性能は、このようなリボヌクレアーゼが抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性を有していることを示していると考えられる。
【００６８】
本発明のリボヌクレアーゼは、ヒトまたは他の動物などの生物に、それ自体で、または適切な担体または添加剤が混合されている医薬組成物で投与することができる。
【００６９】
用語「医薬組成物」および「薬剤」は、本願で使用する場合、他の化学的成分、例えば薬理学に適切な担体および添加剤を含有する、本願に記載されている１種以上のリボヌクレアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドの製剤を意味する。医薬組成物の目的は、化合物を生物に投与しやすくすることである。
【００７０】
用語「添加剤」は、本願で使用する場合、医薬組成物に添加して、化合物の投与を一層容易にする不活性物質を意味する。添加剤の例としては、限定されないが炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種の糖類と各種のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコール類がある。
【００７１】
また医薬組成物は、一種以上の追加の有効成分を含有していてもよく、例えば限定されないが、抗炎症薬、抗菌薬、麻酔薬などが主有効成分に加えられる。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知の方法、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、研和、乳化、被包形成、封入または凍結乾燥の方法によって製造することができる。
【００７３】
したがって本発明にしたがって使用される医薬組成物は、有効化合物を、医薬として使用できる製剤に加工しやすくする添加剤と助剤を含む一種以上の薬理学的に許容できる担体を使用する通常の方式で調合できる。適正な調合は、選択される投与経路によって決まる。
【００７４】
したがって、投与を行うために、本発明の医薬組成物は、適切な医薬担体、および有効量のＴ２−ＲＮアーゼもしくはそれをコードするポリヌクレオチドを含有し、例えば、局所、眼内、非経口、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または当該技術分野で周知の方法による他の有効な手段で投与される。
【００７５】
静脈内、筋肉内または皮下の注射の場合、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、好ましくは生理的に相容性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液または生理食塩水の緩衝液で調合することができる。例えば、有効量のＴ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含有する生理学的に適当な溶液は、血液循環系中に、全身にわたって投与して、直接到達できないかまたは解剖学的に切離すことができない癌または腫瘍を治療することができる。有効量のＴ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含有する生理的に適当な溶液は、標的組織の腫瘍細胞を治療するために有効な量を、針によって、標的の癌組織または腫瘍組織に直接注射することができる。
【００７６】
経粘膜投与の場合は、浸透させるべきバリアーに対して適当な浸透剤を調合に使用する。このような浸透剤は、当該技術分野で広く知られている。
【００７７】
経口投与に使用する場合、本発明の医薬組成物は、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを、当該技術分野で周知の医薬として許容できる担体と組み合わせることによって容易に調合することができる。このような担体によって、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして、患者が経口摂取するために調合することができる。経口で服用する薬理学的製剤は、固体の添加剤を使用し、得られた混合物を任意に粉砕し、次いで所望の場合、適当な助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して製造し、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適切な添加剤は詳しくのべると充填剤であり、例えば糖類（ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む）、セルロース製剤（例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、および／または生理的に許容できるポリマー類例えばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）がある。所望により、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩例えばアルギン酸ナトリウムがある。
【００７８】
糖衣錠コアには適切なコーティングが行われる。この目的のため、濃縮糖溶液が使用され、この溶液は任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有している。染料または顔料を錠剤または糖衣錠のコーティングに添加して、識別したりまたは有効成分の投与量の異なる組合せを特徴づけることができる。
【００７９】
経口で服用できる追加の医薬組成物としては、ゼラチン製のプッシュ−フィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤、およびゼラチンや可塑剤例えばグリセリンもしくはソルビトールで製造された密封軟カプセル剤がある。前記プッシュ−フィットカプセル剤には、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドがラクトースなどの充填剤、デンプン類などの結合剤、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤および任意に安定剤と混合されて入っている。軟カプセル剤中には、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドが、適切な液体例えば脂肪油類、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコール類に溶解されているか懸濁されている。さらに安定剤を加えてもよい。経口投与用の配合物はすべて、選択された投与経路に適切な用量でなければならない。
【００８０】
本発明の医薬組成物の経口による送達は、胃腸期間に存在するｐＨと酵素による分解のため成功しないことがある。したがって、そのような医薬組成物は、望ましくない環境を避けるように調合しなければならない。例えば、腸溶コーティングを経口固体調合物に適用することができる。酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）およびアクリル樹脂類のような耐酸性の物質が、マイクロカプセル化のための錠剤または顆粒をコートするために最も一般的に使用される。腸溶コートされた顆粒を製造するには、有効成分とコーティングの反応を避けるため、湿式造粒法を利用することが好ましい（Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．およびＫａｗａｓｈｉｍａ，Ｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．４巻７０−７４頁１９８７年）。溶媒蒸発法も利用できる。溶媒蒸発法は、血中グルコース濃度を維持するため糖尿病ラットに投与されるインシュリンをカプセルにつめるのに使用された（Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｄｅｖｉｃｅ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｏｇａｎ １３巻１８７−２０１頁１９８６年およびＬｉｎ，Ｓ．Ｙ．ら、Ｂｉｏｍｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏｒｇａｎ １６巻８１５−８２８頁１９８８年）。溶媒蒸発法は、ウイルス抗原やコンカナバリンＡなどの高分子量の生物物質をカプセルにつめるのにも使用された（Ｍａｈａｒａｊ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．Ｓｃｉ．７３巻３９−４２頁１９８４年）。
【００８１】
口腔内投与の場合、本発明の医薬組成物は、通常の方式で調合された錠剤またはロゼンジの形態であればよい。
【００８２】
直腸投与の場合は、当該技術分野で周知である坐剤を利用できる。
【００８３】
吸入による投与の場合、本発明によって使用されるＴ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、加圧パックまたはネブライザーから、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素を使用してエーロゾルスプレイの形態で便利に送達される。加圧エーロゾルの場合、用量単位は、弁を設置して計量された量を送達することによって決定することができる。吸入器または吹入器に使用する例えばゼラチン製のカプセルやカートリッジは、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドおよびラクトースもしくはデンプンなどの適切な粉末ベースの粉末混合物を入れて調合できる。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用にも調合できる。注射用組成物は、単位剤形、例えば任意に保存剤を加えたアンプルもしくはマルチドーズコンテナーで提供できる。その組成物は、油性もしくは水性の媒体による懸濁液、溶液または乳液でもよくそして懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの調合剤を含有していてもよい。
【００８５】
非経口投与用医薬組成物としては、水溶性型の有効成分の水溶液がある。さらに、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドの懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として製造することができる。適切な親油性の溶媒または媒体としては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド類もしくはリポソーム類などの合成の脂肪酸エステルがある。水性注射懸濁剤は、その懸濁液の粘度を増大する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有していてもよい。この懸濁剤は、Ｔ２−ＲＮアーゼもしくはそれをコードするポリヌクレオチドの溶解度を増大して、高濃度溶液を製造できるようにする適切な安定剤または薬品を任意に含有していてもよい。
【００８６】
あるいは、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、使用する前に、適切な媒体、例えば滅菌されたパイロジェンなしの水で再構成するための粉末形態でもよい。
【００８７】
本発明の医薬組成物は、例えばカカオバターなどのグリセリド類のような通常の坐薬ベースを使用して、坐剤または保持浣腸剤などの直腸組成物にも調合することができる。
【００８８】
さらに、体腔、例えば眼、胃腸管、泌尿生殖器官（例えば膀胱）、肺系統および気管支系統などに存在する癌または腫瘍は、有効量のＴ２−ＲＮアーゼもしくはそれをコードするポリヌクレオチドを含有する生理学的に適当な組成物（例えば滅菌された、食塩水もしくはリン酸緩衝液などの溶液、懸濁液または乳液）を、針による直接の注射または癌もしくは腫瘍に冒された中空臓器中に配置されたカテーテルなどの送達管によって受け取ることができる。Ｘ線、ソノグラムまたは光ファイバーの視覚化装置などの有効な画像形成装置を使用して標的組織の位置をつきとめて針またはカテーテル管を、該組織の近くに案内することができる。
【００８９】
本発明の医薬組成物は、浸透マイクロポンプで送達することもできる。その浸透マイクロポンプは体腔のうちの一つに移植され、医薬が治療すべき組織に、定期的に続いて放出される。この方法は、その医薬組成物に対する免疫反応が経験されている場合、特に有利である。この方法はオンコナーゼに利用されている（Ｖａｓａｎｄａｎｉ Ｖ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５；５６（１８）４１８０−４１８６頁１９９６年）。
【００９０】
あるいは、本発明の別の好ましい実施態様によれば、医薬として許容できる担体としては、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを、被検者の哺乳類細胞に送達することができる送達媒体がある。
【００９１】
タンパク質または核酸を、腫瘍または癌細胞を標的として送りこむ多くの送達媒体や方法が当該技術分野で知られている。例えば、リポソームは、タンパク質または核酸を標的細胞中に送達するのに利用できる人工膜のベシクルである（Ｎｅｗｔｏｎ，Ａ．Ｃ．およびＨｕｅｓｔｉｓ，Ｗ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７巻４６５５−４６５９頁１９８８年；Ｔａｎｓｗｅｌｌ，Ａ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １０４４巻２６９−２７４頁１９９０年；およびＣｅｃｃｏｌｌ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ９３巻１９０−１９４頁１９８９年）。したがって、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、高い効率でリポソームベシクルで被包して哺乳類細胞中に送達できる。その上に、Ｔ２−ＲＮアーゼタンパク質または核酸は、例えばＬｅｅの米国特許第５９２５６２８号に記載されているように、ミセルによって、腫瘍または癌の細胞を標的として送達することもできる。なおこの特許は本願に援用するものである。
【００９２】
リポソームまたはミセルに被包されたＴ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、局所、眼内、非経口、鼻腔内、気管内、気管支内、筋肉内、皮下に、または他の有効な手段によって、標的組織の異常に増殖する細胞を治療するのに有効な投与量で投与することができる。リポソームは、被包されたＴ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドの有効量を含有する生理学的に適当な組成物で投与することができる。
【００９３】
あるいは、本発明の他の好ましい実施態様によって、その送達媒体は、限定されないが、特定の細胞表面受容体またはマーカーに結合できる抗体またはリガンドでもよい。抗体またはリガンドは、Ｔ２−ＲＮアーゼタンパク質もしくは核酸に、適切なリンカーを通じて直接結合できるか、あるいはこのような抗体もしくはリガンドは、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを被包しているリポソームの表面に提供することができる。
【００９４】
例えば、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野ですでに述べられているように、特定の組織または細胞を標的として向かわせるために、特定の膜タンパク質の抗体もしくはリガンドと融合させてもよい。この点については、リボヌクレアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼＡが、トランスフェリン受容体に対する抗体または抗原ＣＤ５に対する抗体と融合すると、上記毒素各々に対して特異的な受容体を保持する腫瘍細胞内でのタンパク質合成が阻害されることが分かるであろう（Ｒｙｂａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６巻２１２０２−２１２０７頁１９９１年およびＮｅｗｔｏｎ，ＤＬら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０（４）巻４６３−４７０頁１９９７年）。
【００９５】
本発明で使用するのに適切な医薬組成物としては、有効成分の意図する目的を達成するのに有効な量を含有する組成物がある。より具体的に述べると、治療のために有効な量とは、疾患の症状を予防し、軽減しまたは改善するためまたは治療されている被検者の生存を延長するために有効な有効成分の量を意味する。
【００９６】
治療のために有効な量を決定することは、特に、本願に詳細に開示されていることにてらして、十分に当業技術者の技量の範囲内にある。
【００９７】
本願に記載の有効成分の毒性と治療効力は、細胞培養または実験動物の標準的製薬学的方法によって、例えば被検者に対する有効成分のＩＣ５０およびＬＤ５０（被検動物の５０％が死ぬ致死量）を測定することによって確認することができる。これらの細胞培養検定法や動物実験から得たデータを利用して、ヒトに使用する投与量の範囲内の調合を行うことができる。その投与量は、利用される剤形と利用される投与経路に応じて変えることができる。正確な調合、投与経路および投与量は、個々の医師が、患者の症状を考慮して選択することができる（例えば、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」１章１頁１９７５年のＦｉｎｇｌらの論文参照）。
【００９８】
投与は、治療される症状の重症度と反応性に対応して、徐放性組成物の一回の投与でもよく、治療の過程は、数日間〜数週間または治癒するまでもしくは疾患状態が減退するまで続く。
【００９９】
投与すべき組成物の量は、勿論、治療される被検者、苦痛のきびしさ、投与の方式、担当医師の判断などによって決まる。
【０１００】
さきにすでに述べているように、本発明の一側面によって、医薬組成物の有効成分は、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドである。
【０１０１】
本発明のこの側面によって、前記ポリヌクレオチドは、医薬として許容できる担体とともに哺乳類細胞中に導入され、その導入によって、その細胞の遺伝子調節が行われて、その細胞内でＴ２−ＲＮアーゼを発現することができる。
【０１０２】
用語「遺伝子調節」は、本願の明細書と特許請求の範囲で使用される場合、核酸を細胞に挿入する方法を意味する。その挿入は、例えばウイルス感染、注射、トランスフェクション、粒子衝撃法または核酸を細胞に導入するのに有効な他の手段で行うことができ、これら手段のうちいくつかは、以下にさらに詳細に説明する。遺伝子調節によって、前記核酸は、全部か一部が細胞のゲノム（ＤＮＡ）に組みこまれるかまたは細胞ゲノムの外側に留まり、安定して修飾された細胞または一時的に修飾された細胞が提供される。
【０１０３】
したがって、本発明のこの側面の医薬組成物は、遺伝子治療に使用することができる。
【０１０４】
用語「遺伝子治療」または「遺伝治療」は、本願で使用する場合、互いに取り換えて使用することができ、かつ癌細胞などの増殖性細胞類の安定した遺伝子調節または一時的な遺伝子調節によって前記細胞の増殖が阻害される治療法を意味する。
【０１０５】
そのＧｅｎｅＢａｎｋ の受託番号によって表２にあげたポリヌクレオチドのいずれか一つを、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドとして、本発明で利用することができる。さらに、先に列挙したポリヌクレオチドと、４０％以上相同性でおよび／またはゆるやかなおよび／またはストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッドを形成するポリヌクレオチドも、それがコードするタンパク質がＴ２−ＲＮアーゼとしての特性を有しかつ所望の活性を示すならば、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドとして利用できる。さらに、かようなポリヌクレオチドの部分、変異体、キメラまたは対立遺伝子も、かようなポリヌクレオチドのかような部分、変異体、キメラまたは対立遺伝子が、所望の活性を示すＴ２−ＲＮアーゼをコードするならば、やはり、本発明によって、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドとして使用できる。
【０１０６】
Ｔ２−ＲＮアーゼをコードする新規なポリヌクレオチドを単離することも考えられる。このような単離は当該技術分野で周知の方法を利用して行うことができ、限定されないがライブラリースクリーニング、ハイブリッド形成、ＰＣＲ増幅、標識化プライマー、標識化変性プライマー（ｌａｂｅｌｅｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）がある。したがってゲノムとｃＤＮＡのポリヌクレオチドを利用できる。
【０１０７】
本発明のポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法を使用して、他のタンパク質をコードするポリペプチドに、インフレームで融合させて、融合タンパク質をコードさせることができる。例えば、そのポリペプチドは、リーダー配列または分泌のためのシグナルペプチドに融合させることができる。同様に、Ｔ２−ＲＮアーゼタンパク質は、当該技術分野で周知の方法を使用して他のタンパク質に融合（複合）させることができる。タンパク質を含む異なるタイプの分子を、複合または融合（連結）させる多種類の方法が当該技術分野で知られている。これらの方法は、本発明で使用して、Ｔ２−ＲＮアーゼを、リガンドもしくは抗体などの他の分子に連結させ、Ｔ２−ＲＮアーゼが特定の細胞型を標的として向かわせてそれに結合するのを助ける。当業技術者に知られている複合方法を使用して、タンパク質のペアを複合もしくは融合させることができる。これらのタンパク質は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸エヌヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートとも呼称されている（「ＳＤＰＤ」）（Ｓｉｇｍａ カタログ番号：Ｐ−３４１５）、グルターアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）複合法またはカルボジイミド複合法を使用して複合することができる。
【０１０８】
本発明の好ましい実施態様によれば、ポリヌクレオチドが、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードする配列に作動的に連結された、一つ以上のセグメントを保持する転写制御配列を含有している。このような転写制御配列は、限定されないが以下に詳細に説明するプロモーターおよびエンハンサーを含有している。これらの転写制御配列は、一般にコード領域の上流に作動的に連結されて、転写および／またはその翻訳を調節する働きをする。
【０１０９】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドは、真核細胞の発現ベクター内に含まれている。用語「発現ベクター」は、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードする配列および転写制御配列を含有し、かつＴ２−ＲＮアーゼを哺乳類の細胞内で発現することができる核酸配列を意味する。
【０１１０】
哺乳類の遺伝子を発現させることを目的として、ＤＮＡ断片をベクター中に挿入する多種類の方法が、当該技術分野で知られていて、適当な転写／翻訳制御配列および所望のＴ２−ＲＮアーゼのポリヌクレオチド配列を含有する、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードする遺伝子発現ベクターを構築するのに利用することができる。これらの方法としては、生体外でのＤＮＡ組換え法と合成法および生体内での遺伝子組換え法がある。Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドの発現は、転写制御配列によって調節され、その結果、Ｔ２−ＲＮアーゼが、組換えＤＮＡ分子でインフェクトされたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞内で発現される。例えば、Ｔ２−ＲＮアーゼの発現は、当該技術分野で知られているプロモーター／エンハンサーの要素によって制御できる。そのプロモーターの活性化は、組織特異的であるかまたは代謝産物もしくは投与された物質によって誘発することができる。
【０１１１】
標的の組織もしくは細胞内でのＴ２−ＲＮアーゼの発現を制御するのに使用できるプロモーター／エンハンサーとしては、限定されないが、天然のＲＢプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター／エンハンサー（Ｋａｒａｓｕｙａｍａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９巻１３頁１９８９年）ヒトβ−アクチンプロモーター（Ｇｕｎｎｉｎｇ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４巻４８３１−４８３５頁１９８７年）、マウスの乳癌ウイルスのロングターミナルリピート（ＨＨＴＶＬＴＲ）中に存在するグルココルチコイド誘発性プロモーター（Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｄ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４巻１３５４−１３６２頁１９８４年）、Ｈｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスのロングターミナルリピート配列（ＭＵＬＶ ＬＴＲ）（Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．ら、ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ １９８５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）、ＳＶ４０初期領域プロモーター（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９０巻３０４−３１０頁１９８１年）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３′ロングターミナルリピートに含まれているプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ ２２巻７８７−７９７頁１９８０年）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼプロモーター／エンハンサー（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８巻１４４１−１４４５頁１９８１年）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９６巻３９−４２頁１９８２年）、アデノウイルスのプロモーター（Ｙａｍａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２（１１）巻３５６７−３５７１頁１９８５年）、および単純ヘルペスウイルスＬＡＴプロモーター（Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １巻３７９−３８４頁１９９２年）がある。
【０１１２】
腫瘍または癌の細胞の遺伝子治療で使用する、哺乳類宿主細胞と相容性の発現ベクターとしては、限定されないがプラスミド、レトロウイルスのベクター、アデノウイルスのベクター、ヘルペスウイルスのベクターおよび非複製型のアビポックス（ａｖｉｐｏｘ）ウイルスがあり、例えば米国特許第５１７４９９３号に記載されている。なおこの特許は本願に援用するものである。
【０１１３】
いくつもの方法を使用して、発現ベクターを、本発明のこの側面によって、一種または複数種の標的哺乳類細胞に送達することができる。
【０１１４】
例えば、有効量の発現ベクターを含有する、生理学的に適当な溶液などの適切な医薬として許容できる担体は、局所、眼内、非経口、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下にまたは他の有効な手段によって投与することができる。
【０１１５】
有効量の発現ベクターを含有する生理学的に適当な溶液は、血液循環系中に全身に投与して、直接には到達できないかまたは解剖学的に分離できない癌または腫瘍を治療することができる。
【０１１６】
腫瘍塊を治療する場合、有効量の発現ベクターを含有する生理学的に適当な溶液は、標的腫瘍塊の腫瘍細胞を治療するのに有効な量で、針を通じて標的腫瘍塊中に直接注射することができる。
【０１１７】
あるいは、例えば、眼、胃腸管、泌尿生殖器官（例えば膀胱）、肺および気管支の系統内の体腔内に存在する癌または腫瘍は、有効量の発現ベクターを含有する生理学的に適当な組成物（例えば、発現ベクター以外は滅菌されている食塩水またはリン酸緩衝液の溶液）を、針による直接注射または癌もしくは腫瘍に冒された中空臓器内に配置されたカテーテルもしくは他の送達管によって受け取ることができる。Ｘ線、ソノグラムまたは光ファイバーの可視化装置などの有効な画像形成装置を使用して、標的組織の位置をつきとめて針またはカテーテル管を案内することができる。
【０１１８】
「裸の」発現ベクターは、哺乳類の細胞が能動的に吸収できるので、その発現ベクターが適当に充填されているかまたは被包されているならば、取り込みや標的に対する送達が促進される。
【０１１９】
したがって、本発明の他の好ましい実施態様によれば、医薬として許容できる担体は、発現ベクターを、哺乳類の細胞中に、標的指向方式で送達するのに適切な送達媒体を含んでいる。
【０１２０】
ウイルス発現ベクターは、感染または形質導入によって、発現可能の形態で標的細胞中に、送達媒体で導入することができる。このような送達媒体としては、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびアビポックスウイルスがある。ベクター構造体を標的細胞中に導入することができかつＴ２−ＲＮアーゼを標的細胞内で細胞の増殖を阻害する量で発現できる送達媒体は、上記の有効な方法で投与することができる。
【０１２１】
あるいは、このような送達媒体としては、限定されないが、先に述べたようなリポソーム、ミセル、抗体またはリガンドがある。
【０１２２】
本願に記載のポリヌクレオチドは、それを、適当な医薬として許容できる担体と混合することによって、哺乳類の哺乳類細胞の増殖を阻害するのに有用な薬剤を製造するのに利用できることは分かるであろう。
【０１２３】
先に述べたように、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドは各種の方法で得ることができるが、これらの方法としては、限定されないが、Ｔ２−ＲＮアーゼ特異的プライマーを使用してゲノムまたはｃＤＮＡのライブラリーをスクリーニングし、Ｔ２−ＲＮアーゼ特異的プライマーとともに逆転写ＰＣＲを使用して、Ｔ２−ＲＮアーゼを発現することが分かっている生物から単離されたｍＲＮＡを増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅方法、またはＴ２−ＲＮアーゼをコードするＤＮＡ配列を適当な生物から直接単離する方法がある。この場合、上記方法は、活性形態の上記Ｔ２−ＲＮアーゼを単離または発生させるのに利用することもできることは分かるであろう。
【０１２４】
精製されたポリヌクレオチドは、次に適当な発現ベクター中に挿入するか、または適当な転写制御配列を提供して上記のように製造することができる。
【０１２５】
以下の実施例の章でさらに例示しかつ先に述べたように、特定のＴ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドの作用を確認する検定法も本発明の教示によって提供される。このような検定は、例えば、増殖中の細胞をＴ２−ＲＮアーゼに暴露してそれら細胞の増殖挙動を時間の経過とともに追跡して、対照の未処置の細胞と比較することによって行われる。この検定法は、特定の用途に対して最も強力なＴ２−ＲＮアーゼを選択するのに利用できるだけでなく、用量反応を確証するのにも利用することができる。このことは生体内実験中、または被検者を治療中の初期治療投与量に反映させることができ、これらのことは、Ｔ２ファミリーのＲＮアーゼＢ１について本願でさらに例示する。この検定法は、抗増殖活性の部位もしくは部分またはＴ２−ＲＮアーゼを確認するとか、または発生もしくは単離した、リボ核酸分解活性を示さない変異体の活性を確認するのに使用することもできることが分かるであろう。
【０１２６】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、以下の実施例を試験すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳細に説明されかつ特許請求の範囲の章で請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、以下の実施例で実験によって支持されている。
【実施例】
【０１２７】
ここで以下の実施例について述べるが、これら実施例は、上記説明とともに本発明を例示し、本発明を限定するものではない。
【０１２８】
一般に、本願で利用される命名法と本発明で利用される実験手順としては、分子生化学的方法、微生物学的方法および組換えＤＮＡ法がある。このような技法は文献に綿密に説明されている。例えば以下の文献を参照されたい。すなわち、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ−ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４年；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州ボルチモア１９８９年；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１−４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載されているような諸方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ−ＩＩＩ巻１９９４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ著「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」第３版１９９４年、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、米国ニューヨーク；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ−ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第８版１９９４年、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネチカット州ノーウォーク；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．米国ニューヨーク１９８０年があり；そして利用可能な免疫検定法は特許や科学文献に広く記載されている。例えば以下のものを参照されたい。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ 著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年と「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」ｖｏｌ．１−３１７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｅ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら著「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ １９９６年。これらの特許や文献は、あたかも本願に完全に記載されているように本願に援用するものである。他の一般的文献がこの文書全体に提供されている。これら文献の方法は、当該技術分野では周知であると考えられ、読者に便利なように提供されている。これら文献に含まれている情報はすべて本願に援用するものである。
【０１２９】
実施例１
アスペルギル・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）Ｂ１のＲＮアーゼの特性決定と、そのＲＮアーゼの、果物の木の花粉管成長に対する阻害作用
材料と方法
エー・ニガーの細胞外ＲＮアーゼの調製と精製：
アスペルギルス・ニガーＢ１（ＣＭＩ ＣＣ ３２４６２６）を、１％（ｗ／ｖ）の小麦粉と０．０５％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムを含有する液体培地で増殖させた。得られた混合物を、塩酸でｐＨ３．５に調節してオートクレーブで処理した。約１０６個の胞子からなる接種物を１００ｍｌの培地１００ｍｌに懸濁させ、次に２００ｒｐｍのオービタルシェーカーで３０℃にて１００ｈｒインキュベートした。その増殖培地を、１０倍容積の２ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）に対し、０．２μｍ膜を通過させて３回透析した。その透析溶液２ｌを、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６で平衡化させたＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ−ＴＭＡＥ ６５０（Ｍ）２６／１０（Ｍｅｒｃｋ）カラムに注入した。捕捉されたタンパク質類を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を流量５ｍｌ・ｍｉｎ−１で使用して、同じ緩衝液中０〜１．０Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配液５００ｍｌで溶離させた。最高のＲＮアーゼ活性を示す画分をプールし、２ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）に対して透析し、次にその５０ｍｌを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）で平衡化したＭＯＮＯ−Ｑ５／５ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム中に注入した。溶離は、０〜１．０Ｍの塩勾配液１０ｍｌだけを１ｍｌ−ｍｉｎ−１の流量で使用したことを除いて、前記ＥＭＤ−ＴＭＡＥカラムの場合と同様にして行った。
【０１３０】
タンパク質類は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２巻２４８−２４５頁１９７６年）にしたがって２８０ｎｍで監視して測定した。異なる画分は、１２．５％ドデシル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｍｍｅｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ ２２７巻６８０−６８５頁１９７０年）によって分析した。ＲＮアーゼ活性は、先に記載したようにして（ＲｏｉｚおよびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５６巻３７−４１頁１９９５年）測定した。
【０１３１】
上記精製されたＲＮアーゼＢ１を、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓらが報告した方法（Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ，Ｗ．Ｐ．ら、Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ，４巻２５８−２６６頁１９９１年）にしたがって酵素によって脱グリコシル化した。その酵素は、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと５％（ｗ／ｖ）β−メルカプトエタノールに混合し、１００℃で５分間加熱した。放冷後、その反応混合物を、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有する緩衝液で２．５倍希釈した。ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、最終濃度２０単位・ｍｌ−１まで加えて、一夜３７℃でインキュベートした。次にその試料を試料用緩衝液と混合し、１００℃で５分間加熱し、次いで１２．５％のゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１３２】
ＲＮアーゼ検定：
ＲＮアーゼの活性に対する最適の条件を、１０℃ずつ上昇させる２０〜１００℃の温度範囲と、５０ｍＭと１２ｍＭのリン酸塩−クエン酸塩緩衝液で行った、０．５ｐＨ単位ずつ上昇させるｐＨ２．５〜７の範囲を使ってＢｒｏｗｎとＨｏの方法（Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｈ．およびＨｏ，Ｔ．Ｈ．Ｄ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８２巻８０１−８０６頁１９８６年）を改変した方法によって決定した。１０μｌずつの各試料を、４ｍｇ・ｍｌ−１の酵母ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有する氷冷緩衝液４９０μｌに加えた。各試料の１／２に、２５％（ｗ／ｖ）過塩素酸中０．７５％（ｗ／ｖ）硫酸ウラニル５０μｌを含有する停止溶液を直ちに添加することによってブランクとして使用した。残りの１／２は、１０分間インキュベートし、続いて停止溶液５０μｌを各々に添加した。１５０００Ｘｇで５分間遠心分離を行った後、その上澄み液を蒸留水で２０倍に希釈し、２６０ｎｍの吸光度を測定した。ＲＮアーゼ活性の１単位を、１Ａ．Ｕ２６０ｎｍ／ｍｉｎの速度で可溶性ヌクレオチドを放出する酵素の量と決定した。
【０１３３】
ＲＮアーゼＢ１を、先に記載したようにして（ＲｏｉｚおよびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５６巻３７−４１頁１９９５年）可視化した。ＲＮアーゼＢ１を含有するＳＤＳゲルを、２５％（ｖ／ｖ）イソプロパノールを含有する２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）を使って１５分間ずつ２回洗浄し、次に、上記緩衝液だけで１５分間ずつ２回洗浄することによって再生させた。ＲＮアーゼＢ１を含有する再生されたゲルを、２０ｍＭ酢酸塩緩衝液中０．１％ＲＮＡと０．８％アガロースを含むプレート上に塗布し、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。そのゲルを取り出し、そのアガロースプレートを、トルイジンブルーの０．０２％（ｗ／ｖ）水溶液で染色してＲＮアーゼの活性を可視化した。
【０１３４】
ＲＮアーゼＢ１の花粉管成長に対する作用
Ｐｅａｃｈ ｃｖ．Ａｌｍｏｇの花粉を、先に述べたようにして（ＲｏｉｄおよびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５６巻３７−４１頁１９９５年）、液体培地中、生体外で発芽させた。１５％（ｗ／ｖ）スクロース、１００μｇ・ｍｌ−１ホウ酸、２００μｇ・ｍｌ−１硫酸マグネシウム、２００μｇ・ｍｌ−１硝酸カルシウムおよび各種濃度のＲＮアーゼＢ１を含有する１００μｌずつに花粉粒を懸濁させた。暗室中、２５℃で一夜インキュベートした後、発芽率を記録した。花粉管の長さを、アイピースマイクロメータで測定した。
【０１３５】
花粉管の成長に対するＲＮアーゼＢ１による処理の作用も生体内で試験した。桃とタンジェリン［シトルス・レチキュラータ（Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、Ｂｌａｎｃｏ ｃｖ．Ｍｕｒｃｏｔｔ］の無傷の花に、開花の初期段階において、１００単位・ｍｌ−１のＲＮアーゼＢ１を含有する２０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）をスプレーした。各々の種の、異なる枝にある同じ段階の追加の花は、対照として緩衝液だけをスプレーするかまたは処理しないままで残した。自然受粉に４８ｈｒ暴露した後、花柱を、酢酸：エタノールの容積比率３：１の混合物内で２４ｈｒ固定し、蒸留水で洗浄し、次に、８Ｍ水酸化ナトリウム内で一夜吸水させた。蒸留水で十分洗浄した後、花柱を縦方向に切断し、各々をスライドガラス上の０．１Ｍリン酸カリウム中０．１％（ｗ／ｖ）アニリンブルーの一滴の中に浸漬させ、次いでカバーガラスで注意深く押しつぶした。花粉管をエピフルオレッセンスマイクロスコピー（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＷＩＢキューブを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４０）で観察した。
【０１３６】
実止りに対するＲＮアーゼＢ１の作用：
フィールド実験をネクタリン［プルヌス・ペルシカ変種ネクタリナ・ファンタシア（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ ｖａｒ．Ｎｅｃｔａｒｉｎａ Ｆａｎｔａｓｉａ）］について行った。花がほぼ１０％開いた長さ３０〜４０ｃｍの枝に、２０ｍＭクエン酸塩緩衝液ｐＨ３．５と０．０２５％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００混合液中、異なる濃度のＲＮアーゼＢ１をスプレーした。未処理の枝および緩衝液とｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００混合液のみをスプレーした枝を対照とした。これらの枝に、開花期間中（１４日間）２〜３日間隔でスプレーした。一ヶ月後、１枝当り果実の数をかぞえた。生存度試験を行うため、種子を胚をとおって縦方向に切断し、１％の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド含有水溶液中に、暗室内で２０℃にて４ｈｒ浸漬した。赤色に染色した組織は生存可能な組織を示した。
【０１３７】
実験結果
ＲＮアーゼＢ１の精製と特性決定：
液体培地で増殖させたエー・ニガーは、かなりな量の細胞外ＲＮアーゼＢ１を産生した。温度６０℃でｐＨ３．５が、ＲＮアーゼの活性に対して最適であることが発見されたので、その後のＲＮアーゼ検定法の標準条件として採用した。
【０１３８】
ＲＮアーゼＢ１の精製には三つのステップ（表３）がある。第一ステップにおいて、粗濾液には１０００単位・ｍｌ−１含まれていて、０．０５ｍｇ・ｍｌ−１のタンパク質が得られた。その粗濾液に、ＥＭＤ−ＴＭＡＥカラムを通過させ、そしてプールされた活性画分（図１グラフＡ）は０．１ｍｇ・ｍｌ−１のタンパク質を含有し、ＲＮアーゼの活性は４００００単位・ｍｌ−１であった。最後のステップで、プールされた画分に、ＭＯＮＯ−Ｑカラムを通過させ次に、活性ＲＮアーゼの画分を溶離させた（図１、グラフＢ）。この画分はタンパク質濃度が１．０５μｇ・ｍｌ−１で、ＲＮアーゼ活性は５４３０００単位・ｍｌ−１であった。４０ｋＤａと３２ｋＤａの二つの主要タンパク質のバンドが、精製されたＲＮアーゼＢ１画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果観察された（図２）。ＲＮアーゼ活性ゲルが、前記３２ｋＤａと４０ｋＤａのタンパク質に対応する活性バンドを示した。ＰＮＧアーゼＦにかけると、単一のタンパク質バンドが２９ｋＤａに出現した。ＲＮアーゼ活性は、ＰＮＧアーゼ消化の後も保持された（図示していない）。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
花粉管と実止りに対するＲＮアーゼＢ１の作用：
生体外の実験では、対照花粉の７５％が発芽しそして花粉管は長さが約０．５ｍｍになった。増殖培地中に、ＲＮアーゼＢ１を添加すると、投与量反応方式で、発芽百分率と花粉管の長さが低下した（図３）。ＲＮアーゼＢ１には著しい阻害作用があった。０．１μｇ・ｍｌ−１のタンパク質を示す５０単位・ｍｌ−１が致命的であったが、１２５μｇ・ｍｌ−１のＢＳＡは花粉発芽力と花粉管の生成の１／２しか低下させなかった。
【０１４１】
生体内では、桃の対照の花粉管は受粉後４８ｈｒに、柱頭組織を通過して花柱に向かって成長するのが観察された（図４ａ）。類似の作用が、緩衝液だけで処理された花柱に観察された。対照的に、ＲＮアーゼＢ１で処理され、柱頭で発芽した花粉粒は短い花粉管を生成した。その花粉管は成長方向を欠いているようであり、花柱組織を通過できなかった（図４ｂ）。タンジェリンの場合、柱頭組織（直径が２〜３ｍｍであった）のごく小さい部分しか顕微鏡の視野内にとらえられなかった。したがって図５に示すように、ごく少数の花粉管しか観察されなかった。しかし、対照の花粉管の正常な成長（図５ａ）と、ＲＮアーゼで処理された花粉管の異常な成長（図５ｂ）の差は明白であった。
【０１４２】
ネクタリンｃｖ．ファンタシア（ｎｅｃｔａｒｉｎｅ ｃｖ．Ｆａｎｔａｓｉａ）の場合、ＲＮアーゼＢ１は、実止まりの低下を起こした（表４）。未処理のままで残した枝またはｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００含有緩衝液をスプレーした枝はそれぞれ実止りが４８．３％と３６．３％であった。低ｐＨの緩衝液は、実止まりに対する阻害作用がいくらかあるようであったが、５００単位・ｍｌ−１および１０００単位・ｍｌ−１のＲＮアーゼＢ１で処理した枝はそれぞれ実止りが２３．３％と１８．４％であった。このことは、投与量依存方式のＲＮアーゼの有意な間引き作用を示している。
【０１４３】
【表４】
【０１４４】
ＲＮアーゼＢ１で処理した枝には、多数の未熟の小果実が観察された。生存度の試験は、対照の花の場合（未処理かまたは緩衝液だけをスプレー）は、胚組織が赤色に染色されたが（図６ａ）ＲＮアーゼで処理された花の中で成長した胚の組織は、壊死を示す褐色に染色された（図６ａ）。
【０１４５】
アスペスギルス・ニガーＢ１細胞外ＲＮアーゼ（ＲＮアーゼＢ１）を均一になるまで精製した。そのＲＮアーゼは、２９ｋＤａのタンパク質コアを共有する３２ｋＤａおよび４０ｋＤａの糖タンパク質の２種のアイソフォームを含有していることが発見された。最適のＲＮアーゼ活性が温度６０℃とｐＨ３．５で観察された。桃（プルヌス・ペルシカｃｖ．Ａｌｍｏｇ）とタンジェリン（シトルス・レチキュラータ、Ｂｌａｎｃｏ ｃｖ．Ｍｕｒｃｏｔｔ）の場合、該酵素は、生体外および生体内で花粉の発芽と花粉管の成長を阻害した。フィールド実験で、ＲＮアーゼはネクタリン（プルヌス・ペルシカ変種ネクタリナ・ファンタジア）の実止りを低下させかつ正常な胚の成長を阻害した。
【０１４６】
実施例２
Ｔ２−ＲＮアーゼによる花粉の発芽と花粉管の成長の阻害はアクチンとの相互作用によって仲介される
ＲＮアーゼによって花粉の発芽と花粉管の成長が阻害されることはよく知られているが、この酵素が前記伸長プロセスを阻害する機序はまだ明らかでない。したがって、この試験を、花粉管の伸長プロセスを阻害するＲＮアーゼＢ１の役割を読み解くために始めた。
【０１４７】
材料と実験方法
花粉管の成長に対するＲＮアーゼＢ１の作用：
ユリ［リリウム・グランジフロルム Ｌ．ｃｖ．Ｏｓｎａｔ（Ｌｉｌｉｕｍ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ Ｌ．ｃｖ．Ｏｓｎａｔ）］のやくを、室温で２４ｈｒ裂開させ、新鮮なものを使うかまたは−２０℃で貯蔵した。ＲＮアーゼＢ１を、アスペルス・ニガーの増殖培地の濾液から、実施例１に記載されているようにして製造して精製した。７％スクロース、１．２７ｍＭ ＣａＮＯ３、０．１６ｍＭ Ｈ３ＢＯ３、１ｍＭ Ｋ２ＮＯ３および３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を含有する水１００μｌずつの水性培地で、花粉を生体外で発芽させた（ＹｏｋｏｔａおよびＳｈｉｍｍｅｎの１９９４年の論文）。いくつかの培地は、１００単位／ｍｌのＲＮアーゼ活性を有するＲＮアーゼＢ１を、最終タンパク質濃度１６μｇ／ｍｌまで補充した。追加の培地は、予め３０分間沸騰させて５０％の活性を失わせたＲＮアーゼまたは触媒活性を欠いているオートクレーブ処理されたＲＮアーゼを補充した。暗所にて２５℃で２ｈｒインキュベートした後、花粉管の長さを、顕微鏡のアイピースマイクロメーターで測定した。花粉管をＩＫＩ（０．３％Ｉ２と１．５％ＫＩの水溶液）で染色してデンプン体（ｓｔａｒｃｈ ｂｏｄｙ）を検出した。１ｈｒにわたって活発に伸長している花粉管を顕微鏡載物台上のガラスセルに移した。その花粉管の成長パターンとオルガネラの移動を、Ａｐｐｌｉｔｅｃ ＭＳＶ−８００ビデオ・プレゼンタを使用し、Ｈｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．とＨｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｙ．法（Ｈｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．およびＨｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｙ．，Ｓｅｘ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ．３巻１８７−１９４頁１９９０年）の改変法でビデオに記録した。画像は、Ｓｃｉｏｎ ＬＧ−３フレームグラバーによって、０．８フレーム／ｓｅｃで８秒間とらえ、次にＮＩＨ画像ソフトウエアによってディジタル化して統合した。それらの写真はＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， 米国カリフォルニア州マウンテン・ビュー）およびＰｏｗｅｒ−Ｐｏｉｎｔ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏ．）のソフトウエアを使用して処理した。
【０１４８】
花粉管のアクチンフィラメントに対するＲＮアーゼの作用：
ＲＮアーゼありまたはなしの水性培地で、花粉を生体外にて発芽させた。一夜インキュベートした後、花粉管を、おだやかにペレット処理を行い（ｐｅｌｌｅｔ）、次いで前記増殖培地を、１０−６ＭのテトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）で標識化したファロイジン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳＴ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４および０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）と取りかえた。生体内観察を行うため、ｌｉｌｙ ｃｖ．Ｓｔａｒｇａｚｅｒの花を、開花開始時に除雄し、次に１０単位／ｍｌのＲＮアーゼを含有する増殖培地０．５ｍｌを、柱頭を通じて花柱溝中に注射した。ＲＮアーゼなしの増殖培地を注射された花を、対照として使用した。上記液体を、花柱組織中に２５℃で５ｈｒ吸収させた後、柱頭に、ｌｉｌｙ ｃｖ．Ｏｓｎａｔの花粉を手作業で受粉させた。２５℃で４８ｈｒインキュベートした後、各雌ずいを縦方向に切断し、そして花粉管を注意深く切り取って、ＴＲＩＴＣ−ＴＢＳＴ溶液中に移し、１ｈｒインキュベートした。柱頭での切開は花粉管に影響しなかった。というのは花粉管の死活にかかわるプロトプラストは遠位部分に位置していて、カロースプラグ（ｃａｌｌｏｓｅ ｐｌｕｇ）で保護されているからである。生体外と生体内の実験の両方で、染色された花粉管をＴＢＳ（Ｔｗｅｅｎ−２０）を欠いたＴＢＳＴ）ですすぎ、スライドガラス上に置いて、エピフルオレッセント光学顕微鏡（ＵＳＨ−１０２Ｄ水銀ランプを備えたＯｌｙｐｕｓ ＢＸ４０）で観察した。
【０１４９】
アクチンのＲＮアーゼＢ１への結合：
ＲＮアーゼＢ１とアクチンの間の相互作用を、Ｓｉｍｍ法（Ｓｉｍｍ，Ｆ．Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６巻４９−５４頁１９８７年）を改変して利用して定量した。ウサギの筋肉グロブ（Ｇ−）アクチン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）を、緩衝液Ｆ（１０ｍＭ トリスｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１Ｍ ＫＣｌおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で、室温にて３０分間重合させて線維状（Ｆ−）アクチンを得た。３０μＭのＦ−アクチンを各々含有する５０μｌずつの試料を、１〜３３μＭ ＲＮアーゼＢ１とともに、一夜４℃でインキュベートした。対照として、各濃度のＲＮアーゼを、緩衝液Ｆのみとともにインキュベートした。これら試料を、１５０００ｇで４０分間遠心分離し、その上澄み液のＲＮアーゼ活性を測定した（Ｒｏｉｚ，Ｌ．，Ｇｏｒｅｎ，Ｒ．およびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｏ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．９４巻５８５−５９０頁１９９５年）。
【０１５０】
花粉管上のＲＮアーゼＢ１の免疫金−銀染色法：
免疫金−銀染色法（ＩＧＳＳ）を利用して、ユリの花粉管に対するＲＮアーゼの吸着を検出した。ポリクローナル抗体を、ウサギに、ＲＮアーゼＢ１（Ａｍｉｎｏｌａｂ）に対して生成した。生体外で２ｈｒ経過したユリの花粉管を、２．５％グルターアルデヒド含有ＰＢＳＴ中、４℃で一夜固定した。その花粉管を、ＰＢＳＴ内で１ｈｒ洗浄し、１％ＢＳＡと２％脱脂乳を含有するＰＢＳＴ中で１ｈｒブロックし、次にＰＢＳＴで１：５００の比率で希釈した抗−ＲＮアーゼＢ１内で１ｈｒインキュベートした。ウサギの免疫前血清（ＰＩＳ）を対照として利用した。これら花粉管を各々、ＰＢＳＴで１０分間ずつ３回洗浄し、５ｎｍの金粒子と結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＰＢＳＴで１：１００の比率にて希釈）内で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ内で１０分間ずつ２回洗浄し、次に水中で１０分間１回洗浄した後、反応を最終的に起こさせるため銀−染色キット（Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。前記花粉管を、混合したキットの溶液に１０〜１５分間浸漬し、過剰の蒸留水で洗浄し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４０）で観察した。
【０１５１】
実験結果
ＲＮアーゼなしの成長培地で生体外にて発芽させたユリの花粉管の対照試料は、長さが約３００μｍになった（図７）。同じ条件下ＲＮアーゼで処置した培養物は、長さが１６０μｍにしかならなかった。ＲＮアーゼを沸騰もしくはオートクレーブ処理した場合それぞれの花粉管の長は１３０μｍと１７０μｍであった。花粉管のＲＮアーゼで処理された３群間に、有意差はないとみなされた。
【０１５２】
デンプン染色法は、対照試料のアミロプラストが、先端領域を除いて花粉管にそって広がっていることが観察されることを示した（図８ａ）。一方、ＲＮアーゼで処理した花粉管のＩＫＩで染色された本体が先端領域に蓄積した（図８ｂ）。
【０１５３】
能動的に延びる花粉管の集積ビデオ画像は、細胞質のフローライン（ｆｌｏｗ ｌｉｎｅ）を示した（図９ａと９ｂ）。対照試料の場合、連続した縦方向の運動が最も一般的であり、花粉管の周囲は求頂的フローであり、中心は求基的フローであり、先端領域の下側に「逆噴水（ｉｎｖｅｒｓｅ ｆｏｕｎｔａｉｎ）」パターンを形成した（図９ａ）。先端領域自体は、非常に小さい本体、主としてＰ粒子が占めていたが、その運動パターンはほとんど観察されなかった。ＲＮアーゼで阻害された花粉管の先端は、膨潤していて、先端領域に到達しているデンプンと脂質の粒子がよく見えた（図９ｂ）。連続した運動は検出できなかったが、代わりに、伸長した不規則な画像が、細胞質体がランダムに回転していることを示した。
【０１５４】
アクチンフィラメントの分布に対するＲＮアーゼの作用を、生体外で１ｈｒおよび生体内で４８ｈｒの花粉管で試験した。生体内の花粉管は長さが約３〜４ｃｍになり、それらのＴＲＩＴＣ−ファロイジン染色は生体外の花粉管より強力であった。しかし、ＲＮアーゼの作用のモードは、両方の実験では類似していた。対照の場合、アクチンのマイクロフィラメントが、花粉管の軸線にそって縦方向に組み付けられて、先端領域に微小ネットワークを形成した（図１０ａ）、一方、ＲＮアーゼで処理された花粉管の場合、アクチンの塊が、先端の細胞壁に蓄積された（図１０ｂ）。
【０１５５】
ＲＮアーゼＢ１とアクチンの間の相互作用を、スキャッチャード分析法を利用して定量した。アクチン−ＲＮアーゼＢ１実験において、０．４５で横座標軸と交差する回帰直線（図１１）は、ＲＮアーゼ：アクチンのモル比が０．４５であることを示したが、二つのアクチン分子が各ＲＮアーゼ分子に結合していることを示唆している。
【０１５６】
ＲＮアーゼＢ１の存在下で発芽させた花粉を光学顕微鏡で調べるために調製し、ＲＮアーゼの位置を、抗ＲＮアーゼ抗体を使用して、ＩＧＳＳで確認した（図１２ａ〜ｃ）。ＲＮアーゼなしで成長させた花粉管（図１２ａ）またはＲＮアーゼありで成長させたがＰＩＳで処理した花粉管（図１２ｂ）の場合、その細胞壁の外面は、銀による染色がなかった。一方、ＲＮアーゼＢ１で処置した花粉管の場合、明瞭な免疫金−銀の染色が現れ、先端領域に蓄積した（図１２ｃ）。
【０１５７】
この試験では、ユリ「リリウム・グランディフロルム（Ｌｉｌｉｕｍ ｇｒａｎｄｉｆｌｒｕｍ）の花粉の発芽と花粉管の伸長は、エー・ニガーのＲＮアーゼＢ１によって特異的に阻害された。沸騰もしくはオートクレーブ処理され、元の触媒活性をほとんど欠いているＲＮアーゼは、同様の阻害作用を示した。これら試験結果は、エー・ニガーのＲＮアーゼが、花粉管の伸長に対する阻害作用を有するアクチン結合タンパク質であることを立証した。ＲＮアーゼＢ１の触媒活性には無関係のこの結合によって、花粉管アクチンフィラメントの配列が変形して細胞質の流れが中断される。
【０１５８】
実施例３
ヒトの結腸癌細胞に対するＲＮアーゼＢ１の作用
花粉管においてＲＮアーゼＢ−１に対して開かれたアクチン結合活性が、細胞傷害活性がある可能性を暗示したので、ヒト結腸癌細胞に対するＲＮアーゼＢ１の細胞傷害作用を試験することが決定された。
【０１５９】
材料と実験方法および試験結果
細胞の培養：
すべての実験を生体外で実施した。ヒトの結腸腺癌（ＨＴ２９）細胞を、１０％のウシ胎仔血清、１％のグルタミンおよび１０％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｉｃｏｔｉｃ溶液（Ｂｉｏｌａｂ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｂｅｔ Ｈａｅｍｅｋ）で増殖させた。その細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿大気中で３７℃にてインキュベートした。ＲＮアーゼＢ１の溶液は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．８）で調製した。
【０１６０】
細胞生存能の予備検定：
細胞を５０ｍｌのフラスコでインキュベートした。各フラスコには、異なる濃度（１０−８〜１０−６Ｍ）のＲＮアーゼＢ１の存在下または非存在下、７ｍｌの培地中２×１０５の細胞を入れた。これらの細胞を４８ｈｒまたは７２ｈｒ増殖させ、次いで生存可能な細胞と生存不能の細胞を、トリパンブルー染色法を利用し、区別して計数した。
【０１６１】
すべての処理で、７２ｈｒ間増殖させた細胞の合計数（５５〜６０×１０５）は、４８ｈｒ培養後に得た細胞の数（２５〜３０×１０５）の約２倍になった（図１３ａ）。増殖培地中にＲＮアーゼＢ１が存在していることは、細胞の増殖に対して有意な作用はなかった。しかし、４８ｈｒと７２ｈｒのインキュベーションの両者で、死んだ細胞の数に対するＲＮアーゼＢ１の小さいが有意な作用が見られた（図１３ｂ）。
クローン原性（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の検定Ｉ：
腫瘍細胞の長期間の生存は、それら細胞の分裂してクローンを産生する性能が特徴である。細胞を１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１を含有する増殖培地で４８ｈｒプレインキュベートし次にトリプシンで処理し、洗浄し、次にＲＮアーゼＢ１を欠いた増殖培地中に再懸濁させた。９６ウェル微量滴定プレート中にプレートする前に、その細胞を、各ウェル（２００ｍｌ）中、５０〜１０５細胞の範囲で、５倍ずつの段階希釈を行った。これらプレートを、新しい増殖培地を添加することなく、上記条件で１４日間培養し、続いてコロニーを固定してメチレンブルーで染色した。各ウェル中のクローン原性細胞を、クローン可視化を行った後、計数した。対照の細胞は上記のように処理したが、最初の４８ｈｒを、ＲＮアーゼＢ１を欠いた培地でプレインキュベートした。
【０１６２】
１００個の細胞をプレートしたウェルには、両方の処置で、類似の数のコロニーが観察された（図１４）。ＲＮアーゼＢ１の細胞傷害作用は、高密度の細胞が入っているウェルに出現した。５００個ずつの細胞をプレートされたウェルの場合、対照の細胞とＲＮアーゼＢ１で処理された細胞は、それぞれ、１個のウェル当たり１８０個と１００個のコロニーを産生した。さらに、１０００個ずつの細胞でプレートしたウェルの場合、ＲＮアーゼＢ１で処置した細胞は、ウェル１個当たり約２５０個のコロニーを形成したが、一方、対照の細胞は、融合して連続層になった非常に多数のコロニーを形成したので、図１４には計数して示すことができなかった。高密度でプレートした細胞は、培地を変えない培養では生存しなかった。
【０１６３】
クローン原性検定ＩＩ：
腫瘍細胞が増殖しおよび定着する能力を、ＲＮアーゼＢ１に短時間または連続的に暴露して試験した。この実験は、（ｉ）対照の細胞；（ｉｉ）１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１を含有する培地でプレインキュベートし次にＲＮアーゼＢ１なしの増殖培地で定着させた細胞；および（ｉｉｉ）（ｉｉ）と同様にプレインキュベートし、次に、定着検定中、１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１を含有する増殖培地でインキュベートした細胞；を使用して、クローン原性検定Ｉに記載したのと同様に実施した。これらの実験で、初期密度は２５０〜１０００細胞／ウェルの範囲内であり、そして定着期間は７日間であった。
【０１６４】
この実験で利用した短期間のインキュベーション（７日間）を１４日間のプレインキュベーションと比べたところディフューズされたコロニー（ｄｅｆｕｓｅｄ ｃｏｌｏｎｙ）は全くなかった。このコロニーは高密度の細胞を含有するウェルでさえも識別できる。すべての密度において、ＲＮアーゼＢ１とともに４８ｈｒインキュベートすると、細胞が定着する能力は、対照と比べて、２０〜３０％低下した（図１５）。しかし、各密度において、ＲＮアーゼＢ１に連続して暴露すると、クローン原性の９０％が劇的に低下した。図１６ａ〜ｃは、ＲＮアーゼＢ１で連続的に処置した細胞（図１６ｃ）が、ＲＮアーゼＢ１とともに４８ｈｒプレインキュベートした細胞（図１６ｂ）または対照の細胞（図１６ａ）より小さくかつ染色性が低かったことを示している。この試験結果は、ＲＮアーゼＢ１がコロニー増殖速度を損なったことを示している。
【０１６５】
したがって、ここで提供した試験結果から明らかに分かるように、エー・ニガーのＲＮアーゼＢ１は、ヒトの腺癌ＨＴ２９細胞に対し、明確な細胞傷害作用を有している。ＲＮアーゼＢ１の細胞傷害作用は、細胞の生存能力の低下ではなくて、細胞のクローン原性の低下によって表現される。ＲＮアーゼＢ１は腫瘍細胞に対して長期間、作用することができる。ＲＮアーゼＢ１は対照と比べてコロニー増殖速度を低下させる。このことはＲＮアーゼＢ１は、細胞の増殖する能力を損なうことを示している。
【０１６６】
実施例４
ラットモデルにおける腫瘍発生に対するＲＮアーゼＢ１の生体外作用
ＲＮアーゼＢ１の抗癌作用をさらに試験するため、生体内の実験をラットで行った。
【０１６７】
材料と実験方法
Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ由来の４週間齢雄ラットを６頭ずつの群に分けた。いくつかの群のラットは、ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）を一週間に一回ずつ五回注射することによって結腸癌を発生させた。この実験では、ＲＮアーゼＢ１の２種の投与方式を試験した。ＲＮアーゼＢ１は、浸透マイクロポンプによって、結腸に直接適用するか、または腸溶コートされたマイクロカプセルを使用して経口投与した。各ラット群に行った処置全体は図１の模式図に記載してある。実験中、ラットの重量を週一回測定して、ラットの成長速度に対するＤＭＨおよび／またはＲＮアーゼＢ１の作用を監視した。ＲＮアーゼＢ１で処置された群の糞便を、各ケージから週一回集めて６０℃で乾燥した。２５０ｍｇの乾燥糞便の試料を粉砕し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再溶解した。遠心分離を行った後、上部溶液のＲＮアーゼ活性を、Ｒｏｉｚ，Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．１２５（１）巻９−１４頁２０００年に記載されているようにして試験した。
【０１６８】
浸透マイクロポンプによる、ＲＮアーゼＢ１の結腸への投与：
ＲＮアーゼＢ１を浸透マイクロポンプ（ＡＬＺＥＴ）に注入した。そのポンプをラット腹部の皮下に移植した。その浸透ポンプは、ラット結腸の容積が約４ｍｌであると想定して、結腸中１０−６Ｍの計算濃度で少なくとも６週間、ＲＮアーゼＢ１を結腸にカテーテルによって一定量を放出した。ラットは次のように処置した。第一群のラットには、完全なＲＮアーゼ活性を有する「生の（ｌｉｖｅ）」ＲＮアーゼＢ１（ＲＮアーゼＢ１）が入っているポンプを移植した。第二群のラットには、オートクレーブによって不活性化されてＲＮアーゼ活性を欠いているＲＮアーゼＢ１（Ｉ−ＲＮアーゼＢ１）が入っているポンプを移植した。一方第三群のラットには、最初の２群にＲＮアーゼＢ１の媒体として使用したＰＢＳが入っているポンプを移植して、対照として利用した。
【０１６９】
ＲＮアーゼＢ１の可能な予防作用を検査するため、選ばれてＤＭＨで処置されたラットに、ＲＮアーゼＢ１を、最初にＤＭＨを注射した後、１〜９週間にわたって投与した。次いで、これらラットを殺し、それらラットの結腸を切り取り、ＰＢＳで洗い次に０．１Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有するＰＢＳで洗浄した。次にその結腸を縦方向に切開し、濾紙上で、４％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ内にて少なくとも１ｈｒ固定した。０．０２５％メチレンブルー含有ＰＢＳで染色した後、その結腸粘膜を、低倍率の顕微鏡によって異所性陰窩病巣（ａｂｅｒｒａｎｔ ｃｒｙｐｔ ｆｏｃｉ）（ＡＣＦ）について観察した。遠位（５ｃｍ）結腸のＡＣＦを計数した。
【０１７０】
ＲＮアーゼＢ１の治療作用を検査するため、残りのラットには、最初にＤＭＨを注射した後１２〜１７週にわたってＲＮアーゼＢ１を投与した。その結腸を切り取り、上記のようにして固定し、腫瘍を計数し、測定した。組織病理学的検査を行うため、各腫瘍をパラフィン内に埋包した。薄い（１０μｍ）切片を染色して悪性度を評価した。
【０１７１】
ＲＮアーゼＢ１の経口投与：
マイクロカプセルの製造：
Ｌｉｎ Ｊ．Ｊ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．１４；２０４（１）１５６−１６２頁１９９４年に記載されている改変法で、マイクロカプセルを製造した。凍結乾燥されたＲＮアーゼＢ１ ０．６ｇとグルコース２．４ｇの混合物を、乳鉢と乳棒で十分に粉砕した。その微細粉末を、２００ｍｌの流動パラフィンと２ｍｌのＳｐａｎ−８０が入っている１Ｌビーカー中にそそぎ入れ、次いで６００ｒｐｍで２０分間撹拌した。アセトン−エタノール−酢酸ブタル酸セルロース（ＣＡＰ）溶液を、上記撹拌中の混合物に注意深く添加し（９：１のアセトン：９５％エタノール４０ｍｌ中に３．２ｇのＣＡＰ）、次にフード内でさらに２ｈｒ撹拌して痕跡のアセトンを除いた。そのマイクロカプセルを、３０ｍｌのエーテルを添加することによって硬化させ、次にブフナー漏斗を使って濾紙上で乾燥し、次いで痕跡の流動パラフィンを、３０ｍｌのエーテルによる追加の洗浄２回によって除いた。そのマイクロカプセルを一夜乾燥し、微細なメッシュを通過させた。大部分のマイクロカプセルは２００〜５００μｍであった。
【０１７２】
予備実験で（図１８）、ＣＡＰのマイクロカプセルは、胃の環境に相当する酸性ｐＨでは不溶性であることが分かった。しかし、アルカリ性ｐＨ中、１ｈｒ後に、最高のＲＮアーゼ活性に到達した。これはそのマイクロカプセルが、その内容物を、腸において容易に放出できることを示している。
【０１７３】
ＲＮアーゼＢ１のマイクロカプセルの経口投与：
ＲＮアーゼＢ１を含有するマイクロカプセルまたはグルコースをプラセボとして含有するマイクロカプセルを、粉砕したピューリナ（Ｐｕｒｉｎａ）の固形飼料と混合した。ＲＮアーゼＢ１で処置されたラットは各々毎日、ＲＮアーゼＢ１ １．６ｍｇの投与量で投与され、結腸の最終濃度が１０−５Ｍに到達した。経口投与の実験の詳細は、試験終了を遅らせて（１１週間）、ＲＮアーゼＢ１の予防効果を評価したことを除いて、マイクロポンプによる投与について先に述べたのと同じであった（図１７）。
【０１７４】
実験結果
ラットの成長速度に対する異なる処置の効果：
ラットの初期重量は約２００ｇであった。実験は、上記のように各処置について異なる時間で終了した。ラットは、一般に、約４００〜５００ｇの最終体重に到達したが、異なる処置間に有意差はなかった（図１９ａ〜ｄ）。しかし、ＤＭＨで処置した群は、ＤＭＨの存在下または非存在下でＲＮアーゼＢ１で処置した群に比べて、体重がわずかに低下した。
【０１７５】
ラット糞便中のＲＮアーゼ活性：
図２０ａ〜ｃは、予防モード（図１）で８週間にわたって、ＲＮアーゼＢ１、Ｉ−ＲＮアーゼＢ１またはＰＢＳが入っている浸透ポンプを移植されたラットの糞便のＲＮアーゼ活性の変化を示す。ＲＮアーゼＢ１で処置されたラットの場合（図２０ａ）、糞便中のＲＮアーゼ活性は、Ｉ−ＲＮアーゼＢ１で処置されたラット（図２０ｂ）またはＰＢＳで処置されたラット（図２０ｃ）の場合の５倍であった。この活性は、５週間にわたって高く維持され、次いでポンプ中のＲＮアーゼＢ１の貯槽のＲＮアーゼＢ１が消費されるにつれて徐々に減少した。基礎的内因性（ｂａｓａｌ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ＲＮアーゼ活性が、前記後者二つの群の糞便中に観察された。
【０１７６】
マイクロカプセル化したＲＮアーゼＢ１を与えられたラットには、同様のパターンが観察されたが、グルコースだけを含有するマイクロカプセルを与えられたラットと比べて、８倍もの高いＲＮアーゼ活性が検出された（図２１）。この実験において、ＲＮアーゼの活性が徐々に減少するのは、ラットの体重が増加しその結果、結腸の容積が増大したためであると説明できる。
【０１７７】
予防剤としてのＲＮアーゼＢ１の作用：
ポンプを移植されたラットは、ポンプの部位に感染が観察されたので、８週間後に殺した。この段階ではＡＣＦのみがみとめられた。ＡＣＦは、発癌の開始相中のラット結腸の発癌性変化の代理のバイオマーカーである。陰窩（ｃｒｙｐｔａｅ）の杯細胞はより大きくなり、通常の粘膜細胞に比べて強く染色された。ＡＣＦの計数値は、ＲＮアーゼＢ１またはＩ−ＲＮアーゼＢ１で処置した場合、劇的に減少した（図２２）。結腸粘膜に対する損傷作用は、ＤＭＨなしで、ＲＮアーゼＢ１またはＩ−ＲＮアーゼＢ１で処置したラットには全く観察されなかった。
【０１７８】
マイクロカプセル化ＲＮアーゼＢ１を与えられたラットの場合、実験は、ＤＭＨを最初に投与した後、１１週間続けた。その時点で、腫瘍とＡＣＦの両方が存在していた。ＲＮアーゼＢ１は、対照と比べて、腫瘍の数／結腸（図２３ａ）、腫瘍の大きさ（図２３ｂ）およびＡＣＦの数（図２３ｃ）を減少させた。
【０１７９】
さらに、結腸腫瘍の色の多様性が観察された。すなわち、強力に血液を供給された赤色の腫瘍（図２４ａ）、ほとんど血管を欠いている白色の腫瘍（図２４ｂ）、およびごく少数の血管を有する「ピンク」色の腫瘍（図２４ｃ）が観察された。グルコースで処置したラットの腫瘍はすべて赤色であった。一方、ＲＮアーゼＢ１で処置されたラットは、赤みを帯びた腫瘍の数が有意に減少するのを観察され（図２４ｄ）、腫瘍の１０％がピンク色で５０％が白色であった。これらの試験結果は、ＲＮアーゼＢ１の抗血管新生作用を明確に示している。
【０１８０】
腫瘍は、組織病理学的パラメータによって、良性であるかまたは悪性であるかを識別することもできる。アデノーマと呼ばれる良性腫瘍（図２５ａ）は、増殖した粘膜層によって、そして時にはアデノパピローマの発育によって形成されるが、その粘膜下組織は、無傷であり、他の結腸層に対し輪郭がはっきりしている。腺癌と呼ばれる悪性腫瘍の場合、粘膜細胞が、粘膜下組織の下側につきぬけて、結局、組織の配列が失われる（図２５ｂと２５ｃ）。グルコースまたはＲＮアーゼＢ１で予防のため処置したラットの異なるタイプの腫瘍の分布を検査した結果、ＲＮアーゼＢ１が悪性度を明確に低下したことが分かった（図９ｄ）。
【０１８１】
治療剤としてのＲＮアーゼＢ１の作用：
浸透ポンプによって直接に適用するかまたは経口で適用する方式の両方で、十分に発育した腫瘍を、実験の１２〜１７週間中、ＲＮアーゼＢ１に暴露した。浸透ポンプによって処置したラットに対し、ＲＮアーゼＢ１は腫瘍の数／結腸を減少させた（図２６ａ）。対照に比べて約５０％の阻害作用は、Ｉ−ＲＮアーゼＢ１で処置したラットの場合、最も有意であった。
【０１８２】
ＲＮアーゼＢ１は、大きさの分布によって立証されているように腫瘍の増殖に影響した（図２６Ｂ）。一般に大部分の腫瘍は、直径が３〜５ｍｍであったが、ＰＢＳで処理されたラットの場合、９〜１２ｍｍを越える例外的に大きい腫瘍が出現した。この試験結果は、ＲＮアーゼＢ１が既存の腫瘍の発育を阻害または阻止することを暗示している。しかし、ＲＮアーゼＢ１とＩ−ＲＮアーゼＢ１の作用の間に有意差は全く観察されなかった。
【０１８３】
ＲＮアーゼＢ１の予防作用の実験の場合と同様に、血管新生のパターンも、浸透ポンによって適用されたＲＮアーゼＢ１によって影響を受ける（図２６ｃ）。ＰＢＳで処置されたラットの大部分の腫瘍約８０％が赤色であった。対照的に、ＲＮアーゼＢ１で処置されたラットとＩ−ＲＮアーゼＢ１で処置されたラットの両者は、腫瘍の３０％しか赤色でなかったが、一方、残りの腫瘍はピンク色もしくは白色であった。ＲＮアーゼＢ１は、既存の腫瘍の血管新生を減らすことも明らかであった。
【０１８４】
カプセル化されたＲＮアーゼＢ１を与えられたラットの場合、処置の作用は、浸透ポンプで得た作用より有意性は小さかった（図２７ａ〜ｃ）。この結果は、タンパク質のごく少部分が結腸に到達すると想定することによって説明される。先に述べたように、マイクロカプセルは実際に胃を通過するが、さらに、小腸や盲腸を通る長い経路がある。したがって、この仮説を試験する実験を、蛍光タンパク質を負荷したＣＡＰマイクロカプセルを使用しラットに与えて実施した。これらラットは６ｈｒ後に殺し、これらラットの胃腸管の内容物を、蛍光顕微鏡で観察した。マイクロカプセルは、十二指腸内で溶解し始めることが発見された。その溶解はさらに回腸や空腸で行われる。マイクロカプセルが盲腸に到達すると、その蛍光の大部分は盲腸の内容物中に拡散した。マイクロカプセルが損傷すると、ＲＮアーゼＢ１の作用は、腸や盲腸内に存在するプロテアーゼのために低下する。
【０１８５】
経口投与されたＲＮアーゼＢ１は、既存の腫瘍の数と大きさを小さくしなかった事実があるにもかかわらず、腫瘍の色の種類の分布はわずかに影響を受けた（図２７ｃ）。グルコースで処置したラットおよびＲＮアーゼＢ１で処置したラットはそれぞれ、赤色の腫瘍が約６０％と４０％であった。本発明の配合で経口投与されたＲＮアーゼＢ１は血管新生にも影響するが、中位の影響であるようである。
【０１８６】
実施例５
ヒトＨＴ−２９結腸癌細胞に対するＲＮアーゼＢ１の生体外での作用
材料と実験方法
細胞増殖の条件：
実験はすべて、ヒト直腸腺癌（ＨＴ−２９）細胞で実施した。これらの細胞は、１０％ウシ胎仔血清、１％グルタミンおよび１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｉｃｏｔｉｃ溶液（Ｂｉｏｌａｂ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｂｅｔ Ｈａｅｍｅｋ）が入っている５０ｍｌフラスコ中で増殖させた。その細胞をトリプシンで処理し、５×１０４個の細胞を含有する２ｍｌの培地を、６ウェルプレートの各ウェルにプレートした。いくつかのプレートは、ＲＮアーゼＢ１を、最終濃度１０−６Ｍまで補充した。その細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿大気中、３７℃でインキュベートした。４８ｈｒ後、ＲＮアーゼＢ１が存在しているかまたは存在していない培地をそれぞれ十分に取り換えて、成分とＲＮアーゼＢ１の一定の供給を維持した。４日後、培地を除き、細胞培養物を、４％ホルムアルデヒド含有のＰＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４）ｐＨ７．２中で１５分間氷上にて固定した。それら細胞を異なる目的のために、以下のように染色した。
【０１８７】
細胞内アクチンの直接染色：
細胞をＰＢＳで洗浄し、次に０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）内で１ｈｒ室温にて透過性にした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞は、アクチンを、１０−６ＭのテトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）で標識化したファロイジン（Ｓｉｇｍａ）で、１ｈｒ染色し、ＰＢＳ中で４℃にて一夜静置して過剰の染色材料を除いた。細胞を、スライドガラス上の水中に広げ、Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＬＳＭ）５１０（Ｚｅｉｓｓ）を使用して可視化した。
【０１８８】
細胞膜アクチンの免疫染色：
細胞をホルムアルデヒドで固定し、上記のようにしてＰＢＳで洗浄し次いでＰＢＳで１：５００の比率で希釈したウサギ抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。次にその細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＰＢＳで１：１００の比率で希釈）とともに、さらに１ｈｒ、同じ条件でインキュベートし、再び洗浄し、次に上記のようにして可視化した。
【０１８９】
細胞表面上のＲＮアーゼＢ１の免疫染色：
ポリクローナル抗体（Ａｍｉｎｏｌａｂ、イスラエル）をウサギ内で精製ＲＮアーゼＢ１に対して発生させた。上記の手順にしたがって、ＨＴ−２９を免疫染色する際の一次抗体として、抗−ＲＮアーゼＢ１を使用した。
【０１９０】
実験結果
細胞内アクチンの直接染色：
ＲＮアーゼＢ１なしで増殖している対照細胞に、微細なアクチンネットワークが、ＴＲＩＴＣで染色されて観察され、細胞の細胞質を満たしていた。うすい染色が膜の表面に観察された（図２８ａ）。対照的に、ＲＮアーゼＢ１で処置された細胞の場合、各細胞の膜および細胞質の周辺領域は強く染色された（図２８ｂ）。これは、ＲＮアーゼＢ１の外部添加に対する反応としてのアクチンネットワークの再発列を示している。
【０１９１】
細胞膜アクチンの免疫染色：
ＦＩＴＣ−免疫染色したところ、対照細胞の細胞膜領域にアクチンの微小蛍光スポットが見つかった（図２９ａ）。この結果は図２８ａに示したＴＲＩＴＣ染色と一致している。この実験では、界面活性剤は全く使わなかったので、抗体は、細胞の細胞質中にほとんど浸透しなかった。それ故、これらの細胞では、細胞膜アクチンは外部環境と相互に作用する。ＲＮアーゼＢ１で処理された細胞に、非常に弱い免疫染色が観察されたが（図２９ｂ）、これは、細胞膜アクチンにすでに結合していたＲＮアーゼＢ１が抗アクチン抗体の結合を阻害したことを暗示している。
【０１９２】
ＲＮアーゼＢ１で処置されていない追加の細胞を、予め混合したウサギ抗アクチンと１μＭアクチンとともにインキュベートした。図２９ｂで述べたのと同様の微弱の蛍光が観察された（図示せず）。自発的なＦＩＴＣ蛍光の起こる可能性をなくすために、細胞を、抗アクチンを省略したことを除いて先に述べたように処置した。蛍光染色は全く検出されなかった。
【０１９３】
細胞面上のＲＮアーゼＢ１の免疫染色：
非常に微弱なＦＩＴＣ蛍光が、抗ＲＮアーゼＢ１とともにインキュベートした対照細胞に出現した（図３０ａ）。しかし、ＲＮアーゼＢ１で処理した細胞は強い蛍光反応を示した（図３０ｂ）。この試験結果は、ＲＮアーゼＢ１が、細胞表面上、特に細胞の端縁と延長部分に有意に存在していることを示している。抗ＲＮアーゼＢ１の代わりに、ウサギの免疫前血清（ＰＩＳ）で処置したところ、非常に弱い傾向を生じた（図３０ｃ）。
【０１９４】
実施例６
ユリ花粉管の成長に対するＩＡＣ−ＲＮアーゼＢ１の作用
材料と実験方法
ＲＮアーゼＢ１のヨードアセチル化：
ＲＮアーゼＢ１のヨードアセチル化をＩｒｉｅ Ｍ，ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９（３）巻６２７−６３３頁１９８６年の方法で実施した。ＲＮアーゼＢ１を、０．１Ｍのヨード酢酸を含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液２．５ｍｌに溶解して、１０ｎＭの最終濃度にした。３７で一夜インキュベートした後、タンパク質を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラムで脱塩した。タンパク質を含有する画分を集め、水に対して強く透析した。凍結乾燥を行った後、１０ｍｇのタンパク質を得た。ヨードアセチル化（ＩＡｃ−）ＲＮアーゼＢ１のＲＮアーゼ活性を、修飾されていないＲＮアーゼＢ１と比較した。
【０１９５】
ユリの花粉管に対するＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１の作用：
凍結乾燥されたＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１を、７％スクロース、１．２７ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２、０．１６ｍＭ Ｈ３ＢＯ３、１ｍＭ ＫＮＯ３および３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を水中に含有するユリ花粉管の成長培地中に、１または５μＭの最終濃度まで溶解した（Ｙｏｋｏｔａ，Ｅ．およびＳｈｉｍｍｅｎ，Ｔ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ １７７巻１５３−１６２頁１９９４年）。ユリ（リリウム・ロンギフロルム）の花粉粒を、花粉管の入っている１００μｌの増殖培地で、１０−６ＭのＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１ありまたはなしで、生体外で発芽させた。追加の対照として、ユリの花粉を、同じ濃度のＲＮアーゼＢ１またはＢＳＡを含有する増殖培地で発芽させた。暗所にて２５℃にて１．５ｈｒインキュベートした後、各処置の花粉管の長さを光学顕微鏡で測定した。
【０１９６】
実験結果
ＲＮアーゼＢ１のヨードアセチル化：
ヨード酢酸は、ＲＮアーゼの活性部位のヒスチジン残基に結合することによって、ＲＮアーゼの活性を阻害する。ＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１のＲＮアーゼ活性は、処置されていないＲＮアーゼＢ１と比べて９０％小さかった。
【０１９７】
ユリ花粉管の成長に対するＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１の作用：
対照のユリ花粉管は、０．２６ｍｍの長さに到達する（図３１）。ＢＳＡは、花粉管に対して細胞傷害作用がないので、この実験では、ＢＳＡを対照として使用した。ＢＳＡは、１０−６Ｍの濃度で実際に、花粉管の成長に対し有意な作用はなかった。５×１０−６ＭのＢＳＡの阻害作用は、花粉管が、成長培地の浸透ポテンシャルの変化に対し敏感であるという事実の結果と説明できる。ＲＮアーゼＢ１とＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１は、花粉管の成長に対し明確な阻害作用を示した。両方の濃度で、ＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１の方がＲＮアーゼＢ１より有効であったが、その差は有意でなかった。このように、ユリの花粉管の場合、ＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１は修飾されていないＲＮアーゼＢ１の類似の方式で花粉管の成長を阻害する。このことはＲＮアーゼ活性の損失がその阻害作用を低下させないことを示している。
【０１９８】
本発明をその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの変形と変化が当業技術者にとって明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内にあるかような変形と変化すべてを含むものである。本明細書にあげられているすべての刊行物、特許、特許願および受託番号で識別されている配列は、あたかも個々の刊行物、特許、特許願または配列が具体的にかつ個々に本願に参照して組みこまれているのと、同程度に本発明に援用するものである。さらに、本願に文献を引用することは、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検者の異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転させるためのＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼおよびそのリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの使用に関する。さらに本発明は、有効成分として、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたはそのリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含有し、一般に増殖性の疾患または障害、特に癌を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌などの細胞増殖性の疾患および障害の治療に用いる新規な治療薬剤の開発に対する関心が、医学界と一般社会の両方に引続き存在している。
【０００３】
哺乳類の細胞に対して抗増殖性、抗定着性、抗分化性および／または抗発育性を示す薬剤は抗癌剤として使用できる可能性がある。したがって、天然の原料および合成の原料の両方からのこれら薬剤が広く探究されている。
【０００４】
ＲＩＢＡＳＥＳは、そのＲＮＡを分解する性質と異なる生物活性を示すリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）である。ＲＩＢＡＳＥＳとその構造同族体は、多種の細胞反応を行うことが知られている（Ｒｙｂａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６巻２１２０２−２１２０７頁１９９１年；Ｓｃｈｅｉｎ， Ｃ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５巻５２９−５３６頁１９９７年）。ＥＤＮとＥＣＰ、すなわち細胞傷害性好酸球の分泌顆粒に見られる２種のタンパク質（ＲＮアーゼＡのファミリーのメンバー）は、免疫反応に参画していると考えられている。自己不和合性植物において、花柱（ｓｔｙｌａｒ）のＳ−ＲＮアーゼ（ＲＮアーゼのＴ２ファミリーのメンバー）は花粉管の成長を停止させて受精を防止する。ウシガエルの卵母細胞から産生されるＲＣ−ＲＮアーゼは、Ｐ３８８およびＬ１２１０白血病細胞系などの腫瘍細胞の増殖を生体外で阻害し、かつ肉腫１８０、ＥｒｌｉｃｈおよびＭｅｐＩＩ腹水の細胞を生体内で殺すのに有効である（Ｃｈａｎｇ，Ｃ−Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８３巻２３１−２４４頁１９８８年）。いくつかのＲＮアーゼは限定されたリボヌクレアーゼ活性を示し、その一例として、血管生成を刺激するアンギオジェニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）類がある（Ｆｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４巻５４８０−５４８６頁１９８５年）。
【０００５】
生きている生物は、病原体および腫瘍細胞から守るために細胞外ＲＮアーゼを利用する。例えば、ＥＣＰは寄生虫の攻撃に反応して分泌され（Ｎｅｗｔｏｎ，ＤＬ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７巻１９５７２−１９５７８頁１９９２年）かつ抗菌活性や抗ウイルス活性を示す。また、この活性は、血液、精漿、人乳、滑液、唾液、尿および汗を含む大部分のヒトの体液に存在するＲＮアーゼである亜鉛−α２−糖タンパク質も示す（Ｌｅｉ，Ｇ．ら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊｕｌ．１５；３５５（２）；１６０−１６４頁１９９８年）。
【０００６】
細胞外ＲＮアーゼ類が細胞反応で機能する具体的な機序は分かっていない。
【０００７】
ある種のＲＮアーゼの細胞傷害活性に対する主なバリアーは細胞膜である。ＥＣＰは、人工の膜と細胞膜にチャネルを形成することが発見された。ＥＤＮ（小脳の梨状神経細胞の破壊に関与している好酸球のＲＮアーゼ）とともに顆粒膜から放出されるＥＣＰは、恐らく、ＥＤＮを細胞内空間に移送する。真菌毒素のα−サルシン（ＲＮアーゼＡファミリーのメンバー）の標的細胞中への導入は、細胞膜を透過できるようにするウイルスの感染によって決まる（Ｒｙｂａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６巻２１２０２−２１２０７頁１９９１年）。ＲＮアーゼ類はエンドサイト−シスによって細胞内に入ることもできる。ゴルジ破壊薬剤のレチノイン酸またはモネンシンを利用して、ＢＳ−ＲＮアーゼを細胞中に人工的に送達したとき、細胞傷害性が劇的に増大した（Ｗｕ Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１；２７０（２９）：１７４７６−１７４８１頁１９９５年）。
【０００８】
ＲＮアーゼ類の細胞傷害性は、治療のために利用できる。ヒトのＲＮアーゼＬは、インターフェロンによって活性化されてウイルスの増殖を阻害する。ヒトＲＮアーゼＬの遺伝子およびタバコ植物の２′５′−Ａ−シンテターゼの遺伝子の発現によって、植物は、十分に、キュウリモザイクウイルスから保護されかつジャガイモウイルスＹの複製が防止される。ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）は、ＲＮアーゼＬの抗ウイルス経路の遮断を誘発する（Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５巻５２９−５３６頁１９９７年）。ＲＮアーゼ類は、特定の膜タンパク質の抗体と融合して、イムノトキシンをつくることができる。例えば、ＲＮアーゼＡが、トランスフェリン受容体またはＴ細胞抗原ＣＤ５に対する抗体と融合すると、上記毒素各々に対する特異的受容体を保持する腫瘍細胞におけるタンパクの合成が阻害される（Ｒｙｂａｋ， Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６巻２１２０２−２１２０７頁１９９１年；Ｎｅｗｔｏｎ ＤＬら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４；３７（１５）：５１７３−５１８３頁１９９８年）。ＲＮアーゼ類は動物に対する毒性が低いので、現在使用されている免疫毒素より、望ましくない副作用が少ない。
【０００９】
細胞傷害性リボヌクレアーゼの細胞傷害性は、リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩ）と前記ＲＮアーゼの間の相互作用の強さに逆比例するようである。リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩ）は、脊椎細胞内に見られる天然に存在する分子であり、これらの細胞を、リボヌクレアーゼ類の起こりうる致命的な作用から守る働きをする。リボヌクレアーゼのインヒビターは、種々のアフィニティーでＲＮアーゼ類と結合する５０ｋＤａの細胞質タンパク質である。例えば、ＲＩは、１０桁もの阻害定数すなわち１０−６〜１０−１６Ｍの範囲内のＫｉ値で、リボヌクレアーゼのウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ）スーパーファミリーのメンバーと結合する。
【００１０】
Ａ−ＲＮアーゼ類
オンコナーゼ（ｏｎｃｏｎａｓｅ）（例えばＲＮアーゼＡとＢＳ−ＲＮアーゼ）は、ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのメンバーである。ＲＮアーゼスーパーファミリーのメンバーは、そのアミノ酸配列の約３０％が同一である。非保存残基の大部分が表面ループ（ｓｕｒｆａｃｅ ｌｏｏｐ）に位置し、各ＲＮアーゼの特定目的の生物活性に有意な役割を演じているようである。オンコナーゼは、キタヒョウガエル（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｅｏｐａｒｄ ｆｒｏｇ）（ラナ・ピピエンス）（Ｒａｎａ ｐｉｐｉｅｎｓ）の卵母細胞と早期胚から単離した。オンコナーゼは、各種の固形腫瘍に対して、原位置および生体内の両方で抗腫瘍作用がある（Ｍｉｋｕｌｓｋｉ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ １７；８２（２）１５１−１５３頁１９９０年）。オンコナーゼは、感染したＨ９白血病細胞において非細胞傷害性濃度でＨＩＶ−１の複製も特異的に阻害することが見出されている（Ｙｏｕｌｅ，Ｒ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２１；９１（１３）６０１２−６０１６頁１９９４年）。
【００１１】
オンコナーゼのＲＮアーゼ活性は比較的低いが、その酵素活性と細胞傷害活性はある程度、関連している。Ａ−ＲＮアーゼ類の第三級の構造が、細胞傷害型と非細胞傷害型を区別すると考えられる。例えば、オンコナーゼとＲＮアーゼＡの第三級構造の差は、オンコナーゼに観察される細胞傷害性の増大が原因であると考えられる。オンコナーゼは、ＲＮアーゼと異なり、酵素活性と細胞傷害活性の両方に不可欠のブロックされたＮ末端Ｇｌｕ１残基（ピログルタメート）を含んでいる。この独特の構造によって、オンコナーゼは、標的細胞中に浸透することができる（Ｂｏｉｘ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：２５７（５）９９２−１００７頁１９９６年）。その上に、オンコナーゼ中のＬｙｓ９残基は、ＲＮアーゼＡのＧｌｎ１１残基を置換し、その結果、活性部位の構造を生成すると考えられる。さらに、オンコナーゼとＲＮアーゼＡとの間の、一次構造のアミノ酸配列の差によって、その特異性をもたらす活性部位の周辺の形態が変化する（Ｍｏｓｉｍａｎｎ Ｓ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １４（３）；３９２−４００頁１９９２年）。
【００１２】
また、Ａ−ＲＮアーゼ類間の毒性の差もＲＩに結合するそれらの性能が原因である。ウシ精液リボヌクレアーゼ（ＢＳ−ＲＮアーゼ）は、アミノ酸配列が、ＲＮアーゼＡと８０％同一であるが、ＲＮアーゼＡスーパーファミリーの他のメンバーと異なり、二量体の形態で存在している。ＢＳ−ＲＮアーゼの第四級の構造が、ＲＩの結合を防止して、その酵素に、そのリボ核酸分解活性（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を、ＲＩの存在下で保持させることが分かっている（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０ Ｎｏ．５２：３１０９７−３１１０２頁１９９５年）。オンコナーゼは、ＲＮアーゼＡと高度の相同性を共有しているが、ＲＩの結合に対して抵抗性である。ＲＩ−オンコナーゼの複合体は、Ｋｄが、少なくともＲＩ−ＲＮアーゼＡ複合体の１億分の１より小さい。オンコナーゼのＲＩに対する結合アフィニティが小さいことによって、リボ核酸分解活性の有効な阻害を防ぎ、そしてオンコナーゼが低濃度で細胞傷害性であるがＲＮアーゼがそうでない理由を説明できる。
【００１３】
細胞表面受容体との結合は、オンコナーゼの細胞傷害性の第一のステップである。哺乳類の細胞表面におけるオンコナーゼ受容性の性能については何も分かっていない。オンコナーゼは、リシンの場合のように、細胞表面の炭水化物に結合するのかもしれずまたはポリペプチドホルモンのような薬理学的に導入された分子に対して本来生成した受容体に結合するのかもしれない（Ｗｕ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１５；２６８（１４）１０６８６−１０６９３頁１９９３年）。オンコナーゼは、マウスでは、ＲＮアーゼＡより５０〜１００倍遅い速度で、腎臓から排泄される。オンコナーゼの排泄速度が遅いことは、オンコナーゼが尿細管細胞に対して結合する性能が高いためであると説明されるかおよび／またはオンコナーゼのタンパク質分解反応に対する耐性で説明される。オンコナーゼが腎臓で強く保持されることは臨床上の意味がある（Ｖａｓａｎｄａｎｉ，Ｖ．Ｍ．ら、Ｃａｎｓｅｒ Ｒｅｓ．１５；５６（１８）４１８０−４１８６頁１９９６年）。オンコナーゼは、プルキンエ細胞のＥＤＮ受容体にも結合できる（Ｍｏｓｉｍａｎｎ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６；２６０（４）５４０−５５２頁１９９６年）。また、オンコナーゼの特異性は、そのｔＲＮＡにおいても優先的に発現される。ウサギの網状赤血球の溶解物およびアフリカツメガエルの卵母細胞において、オンコナーゼが、ｒＲＮＡまたはｍＲＮＡの分解によるのではなくてｔＲＮＡの分解によって、タンパク質合成を阻害することが発見された。対照的に、ＲＮアーゼＡは、通常ｒＲＮＡとｍＲＮＡを分解する（Ｌｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４；２０４（１）１５６−１６２頁１９９４年）。
【００１４】
感受性組織の培養物をオンコナーゼで処理すると、ＲＮＡ含量のレベルが非常に低い、細胞周期のＧ１相で停止した細胞が蓄積する（Ｍｏｓｉｍａｎｎ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １４（３）３９２−４００頁１９９２年）。グリオーマ細胞において、オンコナーゼは、細胞密度が有意に低下することなしにタンパク質合成を阻害し、このことは、オンコナーゼが細胞分裂を抑制することに加えて細胞傷害性でもあることを示している（Ｗｕ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１５；２６８（１４）１０６８６−１０６９３頁（１９９３年）。化学療法薬剤と組み合わせたオンコナーゼは、多剤耐性を克服することができる。ビンクリスチンとオンコナーゼによる治療によって、ビンクリスチン耐性腫瘍を有するマウスの平均生存期間（ＭＳＴ）が、ビンクリスチン単独で治療したマウスの４４日間に比べて６６日間に増大した（Ｓｃｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５巻５２９−５３６頁１９９７年）。さらに、いくつかの化学療法薬剤がオンコナーゼと相乗作用を行う。オンコナーゼと、タモキシフェン（抗エストロゲン薬）、トリフルオロペラジン（ステラジン、カルモジュリン阻害剤）またはロバスタチン（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタチルコンエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤）の組合せで治療したヒト膵臓腺癌およびヒト肺癌の腫瘍細胞系において、オンコナーゼ単独で治療した細胞より、強力な増殖阻害が観察された（Ｍｉｋｕｌｓｋｉ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｎｅｔ．２３（３）２３７−２４６頁１９９０年）。したがって、有効性が一層大きくおよび／または毒性が一層低い組合せの治療方式を開発できることは明らかである。
【００１５】
ウシ精液ＲＮアーゼは、二つのジスルフィド架橋で連結されたＲＮアーゼ様サブユニットの二量体を含有する唯一のＲＮアーゼであるから、ＲＮアーゼＡファミリーの特異なメンバーである。さらにウシ精液ＲＮアーゼは、基質と反応産物の両方によってアロステリック効果を維持する。その効果は、環状ヌクレオチドの加水分解反応相で起こる。ＢＳ−ＲＮアーゼは、一本鎖ＲＮＡと二本鎖ＲＮＡの両者を開裂する性能を有している。ＢＳ−ＲＮアーゼは細胞傷害性が高い。ＢＳ−ＲＮアーゼは、マウスの白血病細胞、ＨｅＬａ細胞とヒト胎児肺細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏ ｌｕｎｇ ｃｅｌｌ）、マウス神経芽細胞腫細胞およびヒト繊維芽細胞とマウス形質細胞腫の細胞系で、生体外にて抗腫瘍作用を示す。固形肉腫（甲状腺ろ胞肉腫およびその肺への転移）を有するラットに生体内投与すると、ＢＳ−ＲＮアーゼは、治療された動物に対して検出可能な毒作用なしで、腫瘍の重量を劇的に減少させた（Ｌａｃｃｅｔｔｉ，Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２巻４５８２−４５８６頁１９９２年）。人工的に一量体にしたＢＳ−ＲＮアーゼは、天然の二量体ＢＳ−ＲＮアーゼより、リボヌクレアーゼ活性は高いが細胞傷害性は低い（Ｄ’Ａｌｌｅｓｓｉｏ，Ｇ．ら、ＴＩＢＳ １０４−１０６頁１９９１年）。これは、やはり、生物活性に対して分子構造が重要であることを示している。ＢＳ−ＲＮアーゼは、オンコナーゼのように、標的細胞中に入る前に、標的細胞の表面の単一もしくは複数の認識部位に結合するようである。
【００１６】
ＢＳ−ＲＮアーゼは、細胞傷害性であることに加えて、免疫抑制性でもある。ＢＳ−ＲＮアーゼは活性化Ｔ細胞の増殖をブロックしかつ同種異系マウスに移植された皮膚移植片の生存を延長することができる。ＳＢ−ＲＮアーゼの免疫抑制活性は、精子細胞を、雌の免疫系から守るために必要であることによって説明される。
【００１７】
Ｔ２−ＲＮアーゼ類
植物では、自家和合性が、豊富なので、自家受精を防ぐのに有効である。Ｓ遺伝子座に特定の対立遺伝子を有する花粉は、自家不和合性を制御するが、同じＳ−対立遺伝子を有する植物に受精できない。多くの自家不和合性植物の特にナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａ）とバラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）のメンバーの場合、Ｔ２−ＲＮアーゼファミリーのメンバーが、雌の器官から分泌される。Ｓ−ＲＮアーゼは、自家花粉を特異的に認識して、受精が起こる前に、柱頭と花柱の成長を停止し（Ｃｌａｒｋｅ，Ａ．Ｅ．およびＮｅｗｂｉｇｉｎ，Ｅ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２７巻２５７−２７９頁１９９３年）、花粉管の成長の停止はＲＮＡ分解の直接の結果であると考えられるが、Ｓ−ＲＮアーゼが花粉管に入る方式はいぜんとして不明のままである。
【００１８】
ＲＮアーゼＴ２ファミリーのメンバーは真菌に始めて確認された（Ｅｇａｍｉ，Ｆ．およびＮａｋａｍｕｒａ Ｋ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン１９６９年）。その後、これらメンバーは、ウイルスから哺乳類にわたって多種類の生物内に発見された。特に、Ｔ２−ＲＮアーゼ類は、広く説明されているＲＮアーゼＡファミリーよりはるかに広く分布している。しかし、哺乳類細胞のＴ２−ＲＮアーゼ類の生体内での役割はまだ分かっていない。
【００１９】
微生物内において、細胞外Ｔ２−ＲＮアーゼ類は、増殖培地中に存在するポリリボヌクレオチド類の消化に寄与して拡散可能な栄養素を生成すると一般的に考えられている。また、Ｔ２−ＲＮアーゼ類は防御剤としても働く（Ｅｇａｍｉ，Ｆ．およびＮａｋａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン１９６９年）。
植物内で、Ｔ２−ＲＮアーゼ類は、花粉管が胚珠の方に向かって伸長するのを選択的に制限することによって、送粉の過程での役割を演じている（Ｒｏｉｚ，Ｌ．およびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｏ．，Ｉｎｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５６巻３７−４１頁１９９５年；Ｒｏｉｚ，Ｌ．ら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ ９４巻５８５−５９０頁１９９５年）。現在、これらＲＮアーゼ類の花粉管に対する作用の機序は不明である。
【００２０】
したがって、癌治療剤として有効に使用できる細胞傷害性リボヌクレアーゼ類の例はほとんどない。哺乳類の細胞に対し、抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性を有する新しいリボヌクレアーゼ類が、ヒトの癌を治療するのに利用できる治療薬の範囲を広げて、癌治療の分野に新しい領域を切り開くために必要である。
【００２１】
このように、広く認められている要望があるので、癌などのヒトの増殖性疾患を治療するのに非常に有用な新規なリボヌクレアーゼを入手することは極めて有利である。
【発明の概要】
【００２２】
本発明の一つの側面によって、被検者の異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転する方法であって、被検者に、治療のため有効な量のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼを投与するステップを含んでなる方法が提供される。
【００２３】
本発明の別の側面によって、被検者の異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転する方法であって、被検者に、治療のため有効な量の、Ｔ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発現できるポリヌクレオチドを投与するステップを含んでなる方法が提供される。
【００２４】
本発明のさらに別の側面によって、（ｉ）被検者の腫瘍を治療する方法；（ｉｉ）被検者の腫瘍が発育するのを予防し、阻害しおよび／または逆転する方法；（ｉｉｉ）被検者の良性腫瘍が悪性腫瘍に転換するのを予防し、阻害しおよび／または逆転する方法；（ｉｖ）被検者の腫瘍の血管新生を予防し、阻害しおよび／または逆転する方法；（ｖ）被検者の個々の腫瘍の数を減らす方法；（ｖｉ）被検者の腫瘍の大きさを小さくする方法；（ｖｉｉ）被検者の悪性腫瘍の数を減らす方法；および（ｖｉｉｉ）被検者の組織が腫瘍に転換するのを予防し、阻害しおよび／または逆転する方法であって、被検者に、治療のため有効な量のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ、または治療のため有効な量の、Ｔ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発現できるポリヌクレオチドを投与することによって実施する方法が提供される。
【００２５】
本発明のさらに別の側面によって、有効成分としてのＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼ、および医薬として許容できる担体を含有する医薬組成物が提供される。
【００２６】
本発明のさらなる側面によって、有効成分としての、Ｔ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発現することができるポリヌクレオチド、および医薬として許容できる担体を含有する医薬組成物が提供される。
【００２７】
本発明のさらに追加の側面によって、異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転するのに有用な医薬を製造する方法であって、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼを医薬として許容できる担体として組み合わせるステップを含んでなる方法が提供される。
【００２８】
本発明のさらに追加の側面によって、異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転するのに有用な医薬を製造する方法であって、Ｔ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発現できるポリヌクレオチドを医薬として許容できる担体と組み合わせるステップを含んでなる方法が提供される。
【００２９】
以下に述べる本発明の好ましい実施態様の別の特徴によれば、前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、リボ核酸分解活性を実質的に欠いている。用語「リボ核酸分解活性を実質的に欠いている」は（ｉ）類似の非不活性化リボヌクレアーゼに比較してリボ核酸分解活性が０〜１０％であるＴ２ファミリーの不活性化リボヌクレアーゼ（天然または組換えの）；および／または（ｉｉ）類似の非変異体のリボヌクレアーゼに比べてリボ核酸分解活性が０〜１０％であるＴ２ファミリーの組換え変異体（天然または人工的に誘導した）リボヌクレアーゼを意味する。Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性の不活性化は、沸騰、オートクレーブ処理および化学的変性からなる群から選択した方法で行うことができる。
【００３０】
上記好ましい実施態様のさらに別の特徴によれば、異常に増殖する細胞は癌性細胞である。
【００３１】
上記好ましい実施態様のさらに別の特徴によれば、被検者に、治療のために有効な量のＴ２ファミリーのＲＮアーゼを投与するステップは、経口投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与および吸引による投与からなる群から選択される投与方式で行われる。
【００３２】
上記好ましい実施態様のさらに別の実施態様によれば、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼはＲＮアーゼＢ１である。
上記好ましい実施態様のさらに別の特徴によって、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼＲｈ、ＲＮアーゼＭ、ＲＮアーゼＴｒＶ、ＲＮアーゼＩｒｐ、ＲＮアーゼＬｅ２、ＲＮアーゼＰｈｙｂ、ＲＮアーゼＬＥ、ＲＮアーゼＭＣ、ＲＮアーゼＣＬ１、ＲＮアーゼＢｓｐ１、ＲＮアーゼＲＣＬ２、ＲＮアーゼＤｍ、ＲＮアーゼＯｙおよびＲＮアーゼＴｐからなる群から選択される。
【００３３】
上記好ましい実施態様のさらに別の特徴によって、前記医薬は、特定の増殖性の障害または疾患、例えば特定の癌に対する治療薬を提供することが確認される。
【００３４】
上記好ましい実施態様のさらに別の特徴によって、前記異常に増殖する細胞は、乳頭腫、ブラストグリオーマ（ｂｌａｓｔｏｇｌｉｏｍａ）、カポジ肉腫、黒色腫、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星細胞腫、頭部癌、頚部癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、リウマチ様関節炎、糖尿病網膜症、血管新生、再狭窄、イン−ステント（ｉｎ−ｓｔｅｎｔ）再狭窄および移植血管の再狭窄からなる群から選択される増殖性の障害または疾患に関連する細胞である。
【００３５】
本発明は、増殖性の疾患または障害、例えば癌を予防し、阻害し、かつ逆転させるのに有用なＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの特徴的な新規な活性によって、現在知られている配置構成の欠点を成功裡に処理する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
ここで本発明を、例示することだけを目的として添付図面を参照して説明する。ここで詳細な図面を参照して、示されている詳細事項は、実施例として、本発明の好ましい実施態様を例示して考察することだけを目的とするものであり、最も有用であると考えられるものおよび本発明の原理および概念の側面が直ちに理解される説明を提供するために提供することを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要以上に詳細に本発明の構造の詳細を示すことはしておらず、図面について行った説明によって、当業技術者にとって、いくつもの形態の本発明がどのように実施できるか明らかになるであろう。
【図１】図１は、Ｒｏｉｚ，Ｌ．とＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｏ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５６巻３７−４１頁１９９５年の教示にしたがって単離したアスペルギルス・ニガーのＲＮアーゼＢ１の吸光度とＲＮアーゼ活性を示すグラフである。グラフＡは、粗濾液のＥＭＤ−ＴＭＡＥカラムクトマトグラフィーによって得た画分を示し、一方グラフＢは、上記粗濾液のＥＭＤ−ＴＭＡＥクロマトグラフィーから得た活性画分のＭＯＮＯ−Ｑカラムクロマトグラフィーから得た画分を示す。実線は２８０ｎｍの吸光度を示し、破線はＲＮアーゼ活性を示す。
【図２】図２は、利用された精製ステップを通じてＲＮアーゼＢ１タンパク質の濃度が増大するのを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥザイモグラムである。レーン１は粗濾液を示し；レーン２はＥＭＤ−ＴＭＡＥカラムからの溶出液を示し；レーン３はＭＯＮＯ−Ｑカラムからの溶出液を示し；レーン４は、ＲＮアーゼ活性についてその場で検定され次いでトルイジンブルーで染色されたレーン３の溶出液を示し；レーン５は、ＰＮＧアーゼＦによって脱グリコシル化された後、精製されたＲＮアーゼを示す。レーン１〜３と５はクーマシー・ブルーで染色した。
【図３】図３は、桃花粉の発芽（黒四角印を有する実線）と花粉管の長さ（白四角印を有する破線）に対する異なる濃度のＲＮアーゼＢ１の生体外での作用を示すグラフである。
【図４】図４は、柱頭および花柱の上部における桃花粉管の成長に対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。図４ａは対照の花を示し、一方、図４ｂは受粉前にＲＮアーゼＢ１で処置された花である。バー（Ｂａｒ）＝０．２ｍｍ。
【図５】図５は、タンジェリンの花の柱頭における花粉管の成長に対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。図５ａは、自然受粉に４８ｈｒ暴露された対照の花を示す。図５ｂは受粉前に、ＲＮアーゼＢ１で処置された花を示す。バー＝０．１ｍｍ。
【図６】図６は、ネクタリンの種子について実施した生存能力試験を示す。図６ａは未処置の花が産生した対照の種子を示し、一方、図６ｂはＲＮアーゼＢ１で処置した花が産生した種子を示す。バー＝０．３ｍｍ。
【図７】図７は、ユリｃｖ．Ｏｓｎａｔの花粉管の長さに対するＲＮアーゼＢ１、未処置、沸騰またはオートクレーブ処理の作用を示す。
【図８】図８は、生体外で成長しＩＫＩで染色されたユリ花粉管に対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。
【図９】図９は、ＲＮアーゼＢ１で処置していない花粉管（図９ａ）とＲＮアーゼＢ１で処置した花粉管（図９ｂ）におけるオルガネラの移動と局在を示す集積ビデオ画像からとらえたショットを示す。
【図１０】図１０は、成長中のユリ花粉管のアクチンフィラメントに対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。図１０ａは対照の花粉管を示し、一方、図１０ｂはＲＮアーゼＢ１で処置した花粉管を示す。両方の花粉管を実験後に切り取ってＴＲＩＴＣファロイジンで染色して可視化した。
【図１１】図１１は、アクチンに対するＲＮアーゼＢ１の結合を示すスキッチャードプロットである。Ａはアクチンの濃度（μＭ）、Ｒｆは遊離ＲＮアーゼＢ１の濃度（μＭ）、Ｒｂは結合したＲＮアーゼＢ１の濃度（μＭ）である。
【図１２】図１２は、１ｈｒ成長させて免疫金銀染色を行ったユリ花粉管を示す。図１２ａは対照を示し、一方図１２ｂと１２ｃは両者ともにＲＮアーゼＢ１で処置された花粉管である。図１２ｂに示す花粉管はウサギの免疫前血清とともにインキュベートした。一方図１２ｃに示す花粉管は抗ＲＮアーゼＢ１ウサギポリクローナル抗体とともにインキュベートした。
【図１３】図１３は、ＨＴ２９結腸癌細胞の生存能力に対することなる濃度のＲＮアーゼＢ１の作用を示す。細胞の反復試料を３７℃で４８ｈｒまたは７２ｈｒ増殖させ、トリパンブルーで分染することによって可視化して計数した。図１３ａは細胞の合計数を示すが、図１３ｂは死んだ細胞の百分率を示す。
【図１４】図１４は、ＨＴ２９細胞のクローン原性に対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。細胞の反復試料を、１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１ありまたはなしで、４８ｈｒ増殖培地でプレインキュベートし、トリプシンで処理し、洗浄し、段階的に希釈したＲＮアーゼＢ１なしの増殖培地に再懸濁させ、９６ウェル微量滴定プレート中にプレートして１４日間定着させた。コロニーを、固定と、メチレンブルーによる染色を行った後に計数した。
【図１５】図１５はＨＴ２９細胞のクローン原性に対する、ＲＮアーゼＢ１への暴露期間の作用を示す。細胞の反復試料を、１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１を含有する増殖培地とともに４８ｈｒプレインキュベートし、次いで同濃度のＲＮアーゼＢ１を含有する増殖培地またはＲＮアーゼを含有しない培地で定着させた。定着は９６ウェルの微量滴定プレートで７日間行った。各処置は、一ウェル当たりの細胞初期数が異なっていた。コロニーは同定およびメチレンブルーによる可視化を行った後に計数した。ＲＮアーゼＢ１なしの増殖培地でプレインキュベートして定着させた細胞は対照として利用した。
【図１６】図１６はＨＴ２９細胞の定着性能に対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。対照の細胞（図１６ａ）は、ＲＮアーゼＢ１なしの増殖培地で４８ｈｒプレインキュベートし、次にトリプシン処理を行い、次に９６微量滴定プレートの同じ増殖培地でインキュベートして定着させた。図１６ｂは、１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１を含有する増殖培地で４８ｈｒプレインキュベートし次にＲＮアーゼＢ１なしの増殖培地で定着させた細胞を示す。図１６ｃはプレインキュベートし次いで１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１を含有する増殖培地で定着された細胞を示す。細胞のコロニーはメチレンブルー染色法を利用して可視化した。
【図１７】図１７はラット６頭ずつの各群に対する処置を説明するラットに実施した生体内実験の模式図である。
【図１８】図１８はＲＮアーゼＢ１のＣＡＰマイクロカプセルからの放出速度に対する２種のｐＨの作用を示す。１０ｍｇのＲＮアーゼＢ１を含有するマイクロカプセルを、０．１ＭＨＣｌ（ｐＨ１）または０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）１０ｍｌ中に懸濁させ、撹拌しながら３７℃でインキュベートした。上部溶液の試料を３０分毎に採取してＲＮアーゼの活性の試験を行った。
【図１９ａ−１９ｂ】図１９ａ−１９ｂは、各実験終了時の体重で示す、ラット成長速度に対するＲＮアーゼＢ１および／またはＤＭＨの作用を示す。初期のラット重量は約２００ｇであった（ｎ＝６）。図１９ａ：ＰＢＳ、ＲＮアーゼＢ１またはＩ−ＲＮアーゼＢ１を、最初のＤＭＨ注射の後、１〜９週に浸透ポンプで投与した（予防処置）。上記のように処置したがＤＭＨなしの場合のラットを対照として使用した。図１９ｂ：ＰＢＳ、ＲＮアーゼＢ１またはＩ−ＲＮアーゼＢ１を、最初のＤＭＨ注射の後、１２〜１７週に浸透ポンプで投与した（治療処置）。
【図１９ｃ−１９ｄ】図１９ｃ−１９ｄは、各実験終了時の体重で示す、ラット成長速度に対するＲＮアーゼＢ１および／またはＤＭＨの作用を示す。初期のラット重量は約２００ｇであった（ｎ＝６）。図１９ｃ：ラットに、予防処置として、ＲＮアーゼＢ１またはグルコースを含有するマイクロカプセルを投与した。ＤＭＨなしでＲＮアーゼＢ１で処置したラットを、対照として使用した。図１９ｄ：ラットに、ＲＮアーゼＢ１またはグルコースを含有するマイクロカプセルを投与した。
【図２０】図２０は、予防処置として、ＲＮアーゼＢ１（図２０ａ）、Ｉ−ＲＮアーゼＢ１（図２０ｂ）またはＰＢＳ（図２０ｃ）が入っている浸透ポンプを移植したラットの糞便のＲＮアーゼ活性を示す。対照として、ラットをＤＭＨなしでＲＮアーゼＢ１またはＰＢＳで処置した。ＲＮアーゼの活性は、実施例の項に記載したようにして測定した。
【図２１】図２１は、予防処置として、ＲＮアーゼＢ１またはグルコースを含有するマイクロカプセルを与えたラットの糞便のＲＮアーゼ活性を示す。対照として、ラットにＤＭＨなしでＲＮアーゼＢ１またはグルコースを与えた。ＲＮアーゼ活性は実施例の項で述べたようにして測定した。
【図２２】図２２は、予防処置として浸透ポンプを移植されたラット（ｎ＝６）の遠位結腸（５ｃｍ）中の異所性陰窩病巣（ＡＣＦ）の数を示す。
【図２３】図２３は、予防処置として、ＲＮアーゼＢ１またはグルコースのマイクロカプセルを与えられたラットの遠位（５ｃｍ）結腸で検査した異なるパラメータに対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す（ｎ＝６）。図２３ａ：腫瘍の数／結腸；図２３ｂ：腫瘍の大きさ；図２３ｃ：ＡＣＦ／結腸。
【図２４】図２４は、切り取って１ｈｒ後に、内側粘膜表面を撮影したときの異なるタイプの腫瘍を示す。図２４ａ：赤色の腫瘍；図２４ｂ：白色の腫瘍。図２４ｃ：ピンク色の腫瘍と赤色の腫瘍。図２４ｄ：予防処置として、グルコースまたはＲＮアーゼＢ１を含有するマイクロカプセルを与えたラットの３種の腫瘍の分布。
【図２５】図２５は、メーヤーのヘマトキシリンとマルチウス−イエローで染色した腫瘍の組織病理学的検査を示す。図２５ａ：アデノマまたはアデノパピローマー良性腫瘍。図２５ｂ：腺癌、粘膜細胞が粘膜下組織の下側につきぬけている。図２５ｃ：十分に発育した腺癌、組織の配列がすっかり中断されている。図２５ｄ：予防処置として、グルコースまたはＲＮアーゼＢ１のカプセルで処置したラットの結腸のアデノーマ型と腺癌型の腫瘍の分布パターン。
【図２６】図２６は、治療処置として、ＰＢＳ、ＲＮアーゼＢ１またはＩ−ＲＮアーゼＢ１が入っている。浸透ポンプで処置したラットの遠位（５ｃｍ）結腸で検査した異なるパラメータに対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。図２６ａ：腫瘍の数／結腸；図２６ｂ：大きさによる腫瘍の分布；図２６ｃ：血管新生を示す色による腫瘍の分布。
【図２７】図２７は、治療処置として、ＲＮアーゼＢ１またはグルコースのマイクロカプセルを投与したラットの遠位（５ｃｍ）結腸で検査した異なるパラメータに対するＲＮアーゼＢ１の作用を示す。図２７ａ：腫瘍の数／直腸；図２７ｂ：大きさによる腫瘍の分布；図２７ｃ：血管新生を示す色による腫瘍の分布。
【図２８】図２８は、４日間培養し、アクチンについてＴＲＩＲＣで染色したヒト結腸癌ＨＴ−２９細胞を示す。図２８ａ：対照の細胞；図２８ｂ：１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１の存在下で増殖させた細胞。
【図２９】図２９は、４日間培養し、細胞膜のアクチンを免疫染色したヒト結腸癌ＨＴ−２９細胞を示す。図２９ａ：対照の細胞；図２９ｂ：１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１の存在下で増殖させた細胞。
【図３０】図３０は、４日間培養し、ＦＩＴＣで免疫染色したヒト結腸癌ＨＴ−２９細胞を示す。抗−ＲＮアーゼＢ１を一次抗体として使用した。図３０ａ：対照の細胞；図３０ｂ：ＲＮアーゼＢ１の存在下で増殖させた細胞。細胞表面に結合したＲＮアーゼＢ１を示している；図３０ｃ：免疫前血清（ＰＩＳ）を一次抗体として使用した。
【図３１】図３１は、ユリの花粉管の長さに対する異なるタンパク質による処理の作用を示す。花粉管は、実施例の項で述べたように２５℃にて１ｈｒ生体外で増殖させた。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、被検者の異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転するための、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたはそのリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドの使用を教示する。本発明は、さらに、有効成分として、一般に増殖性の疾患または傷害を、および特に癌を治療するのに用いるＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたはそのリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物を教示する。
【００３８】
細胞傷害活性を有するリボヌクレアーゼを、腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用することは、新しいことではなく、当該技術分野ではすでに論証されている。オンコナーゼとして商業的に知られているＡファミリーのリボヌクレアーゼは、臨床試験で腫瘍状組織における細胞の増殖を阻害することが分かっている。ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのいくつもの他のＲＮアーゼも、それらのリボ核酸分解活性に加えて細胞傷害活性を有することも論証されている。
【００３９】
いくつかのリボヌクレアーゼの細胞傷害性は、ある程度、それらのリボ核酸分解活性に依存しているが、リボ核酸分解活性のレベルは、リボヌクレアーゼについて観察される細胞傷害性のレベルと必ずしも相関関係があるわけではない。さらに、細胞傷害活性を全く示さないがリボヌクレアーゼとしてうまく機能するリボヌクレアーゼのいくつもの例がある。最もよく知られている例はＲＮアーゼＡである。他の場合では、反応速度が、より特異的な結合またはいくつかの他の性能の改良された機能のために犠牲になっている。例えば、アンギオジェニンの活性部位は、ＲＮアーゼＡに存在しない側鎖によってブロックされて、ＲＮアーゼを、全基質に対する活性を１００００分の一にするが、リボソームのＲＮＡの分解に対しては一層特異的にする。ＢＳ−ＲＮアーゼはそれがモノマーの場合、より速いヌクレアーゼである。しかし、その細胞傷害性は一層高いので、二量体の形態の場合、リボヌクレアーゼ阻害剤による阻害はかなり低下する。グリコシル化ＲＮアーゼＢは、大部分の基質に対して、ＲＮアーゼＡより活性が低いが、ＢＳ−ＲＮアーゼにしばしば観察される脱アミド反応（アスパラギン６７からイソアスパルテートへ）は、該タンパク質の水素結合構造の全連鎖を切断することによって、ＲＮアーゼＡ変異体の活性を低下させる（Ｓｈｅｉｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５巻５２９−５３６頁１９９７年に概説されている）。
【００４０】
Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ類は、それらの独特な分子の特徴が特徴である。ＡファミリーとＴ２ファミリーのＲＮアーゼのメンバーの比較結果を以下の表２に要約してある（アミノ酸の位置は、ファミリーＡのＲＮアーゼＡとファミリーＴ２のＲＮアーゼＴ２の後である）。
【００４１】
【表１】
【００４２】
Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼ類は、植物中のみならず多数の微生物中に確認されており、植物内では、花粉管が胚珠の方に向いて伸びるのを選択的に制御することによって、受粉の過程で能動的な役割を演じている。
【００４３】
本発明の発明者らが明らかにして、実施例１，２および６で以下に詳細に述べるように、ＲＮアーゼＢ１すなわち一種のＴ２リボヌクレアーゼは、リボ核酸分解的に活性かまたはリボ核酸分解的に不活性であり、伸長中の花粉管中のアクチンに特異的に結合して花粉管の伸長を阻害し、かつ哺乳類の細胞のアクチンにも結合する。
【００４４】
アクチンは、細胞構造を維持しかつ臓器細胞の細胞内輸送を支持するのに能動的な、細胞の必須細胞骨格成分であるフィラメントを形成することが知られている。その結果、アクチンフィラメントは、増殖、定着、分化、転換、および組織形成を含む他の発育の側面を含む、正常細胞および異常細胞のライフサイクル全体の多くの細胞プロセスに参画している。アクチンが、癌細胞の発育を制御する各種細胞プロセスにも参画しているということは、多数の研究論文が示している（Ｊｏｒｄａｎ，Ｍ．Ａ．およびＷｉｌｓｏｎ，Ｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０巻１２３−１３０頁１９９８年； Ｊａｍｍｙ，Ｐ．Ａ．およびＣｈａｐｏｎｎｉｅｒ，Ｃ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７巻１１１−１１７頁１９９５年； Ｓｉｇｍｏｎｄ，Ｓ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８巻６６−７３頁１９９６年； Ｔａｐｏｎ，Ｎ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９巻８６−９２頁１９９７年）。したがって、例えば、アクチンフィラメントは異常細胞の増殖に参画している（Ａｓｓｏｉａｎ，Ｒ．Ｋ．およびＺｈｕ，Ｘ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９巻９３−９８頁１９９７年）。悪性細胞は、正常細胞よりサイトカラシンＢに対して感受性であることが発見された（Ｈｅｍｓｔｒｅｅｔ，Ｇ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５Ｓ １９７−２０４頁１９９６年）。
【００４５】
アクチンは、高度保存タンパク質であり、進化の面で遠縁の生物間に高レベルの相同性を維持しているので、花粉管の伸長を阻害するＲＮアーゼＢ１のアクチン結合活性を、この理論によって限定されることなく利用して、哺乳類の細胞のアクチンに特異的に結合させて、その細胞の増殖、定着、分化および／または発育を阻害できるという仮説を立てたのである。
【００４６】
本発明を、実施例の項の実施例２と５で述べるように実施すると、外因性ＲＮアーゼＢ１が膜アクチンに特異的に結合して、細胞アクチンネットワークの障害を起こす。実施例３〜５に示すように、ＲＮアーゼＢ１の哺乳類癌細胞に対する作用を、生体外と生体内でさらに研究した。その実施例で明らかに立証されているように、ＲＮアーゼＢ１は、（ｉ）培養で増殖させた腺癌細胞の増殖および／または定着をかなり減少させ、そして（ｉｉ）大腸癌ラットモデルにおいて、予防的方式および／または治療的方式で、異所性クリプト病巣（ａｂｅｒｒａｎｔ ｃｒｙｐｔ ｆｏｃｉ）（ＡＣＦ）を減らし、腫瘍の数と大きさを小さくし、腫瘍の血管新生を阻害し、腫瘍の悪性度とアデノーマから腺癌への移行を減らし、一方大腸もしくは他の臓器の健康な組織に対して明らかな副作用が全くない。
【００４７】
本発明の少なくとも一つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明に述べられているかまたは諸実施例に例示されている詳細事項にその用途を限定されないと解すべきである。本発明は、他の実施態様を実施できるかまたは種々の方式で実施することができる。また、本願で利用される語句は、説明を目的とするもので本発明を限定しないと解すべきである。また、本発明は、本願に示される理論または仮説によって拘束されるかまたは限定されることがないと解すべきである。
【００４８】
Ｔ２ファミリーの１種以上のリボヌクレアーゼを、本願では、総合的にＴ２−ＲＮアーゼと呼称する。同様に、Ｔ２ファミリーの１種以上のリボヌクレアーゼをコードする１種以上のポリヌクレオチドを、本願では、総合的に、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチド（または同等物）と呼称する。
【００４９】
したがって、本発明の一側面によって、被検者の異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転する方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、被検者に、治療のために有効な量のＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたはＴ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発見できるポリヌクレオチドを、それ自体でまたは医薬組成物の有効成分として投与することによって行われる。
【００５０】
したがって、本発明の他の側面によって、有効成分としてのＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたはＴ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発現できるポリヌクレオチド、および医薬として許容できる担体を含有する医薬組成物が提供される。
【００５１】
本発明のさらに他の側面によって、異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転するのに有用な薬剤の製造方法であって、Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼまたはＴ２ファミリーの組換えリボヌクレアーゼをコードして生体内で発現できるポリヌクレオチドを、医薬として許容できる担体と組み合わせるステップを含んでなる方法が提供される。
【００５２】
上記薬剤は、好ましくは、例えば特定の癌のような特定の増殖性の障害または疾患に対し治療剤を提供することが確認される。このような確認は、当該技術分野でよく知られているように、例えば、薬剤が入っている容器またはリーフレットに印刷される。
【００５３】
本発明の方法と医薬組成物は、例えば（ｉ）被検者の腫瘍を治療するため；（ｉｉ）被検者に腫瘍が発するのを予防し、阻害し、および／または逆転させるため；（ｉｉｉ）被検者の良性腫瘍が悪性腫瘍に転換するのを予防し、阻害しおよび／または逆転させるため；（ｉｖ）被検者の腫瘍の血管新生を予防し、阻害および／または逆転させるため；（ｖ）被検者の個々の腫瘍の数を減らすため；（ｖｉ）被検者の腫瘍の大きさを小さくするため；（ｖｉｉ）被検者の悪性腫瘍の数を減らすため；および／または（ｖｉｉｉ）被検者の組織が腫瘍に転換するのを予防し、阻害しおよび／または逆転させるために利用できる。
【００５４】
Ｔ２−ＲＮアーゼは、天然の原料から、下記実施例１に例示するように誘導することができ、あるいは、適当なポリヌクレオチド（下記表２とそれに続く説明参照）と発現系を使用して組換えタンパク質として製造することができる。組換えタンパク質の発現と精製は、当該技術分野で周知のことであり、多数の教本および研究所のプロトコル書に詳細に記載されている複数の方法のうちのいずれか一つによって行うことができ、それらの教本とプロトコル書としては、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ−ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４年； Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州ボルチモア１９８９年； Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク州；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク州；Ｂｉｒｒｅｎら編、「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ 」１−４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク州１９９８年がある。
【００５５】
【表２】
【００５６】
いくつかの用途の場合、望ましくない副作用があるかまたは望ましくない副作用を起こすことがあるリボ核酸分解活性を実質的に欠いているリボヌクレアーゼを使用することが有利である。用語「リボ核酸分解活性を実質的に欠いている」は、本願で使用する場合、（ｉ）類似の非不活性化リボヌクレアーゼに比べてリボ核酸分解活性が０〜１０％であるＴ２ファミリーの不活性化リボヌクレアーゼ（天然または組換えの）；および／または（ｉｉ）類似の非変異体リボヌクレアーゼに比べてリボ核酸分解活性が０〜１０％であるＴ２ファミリーの組換え変異体（天然の単離物または人工によるもの）のリボヌクレアーゼを意味する。Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性の不活性化は、沸騰、オートクレーブ処理および化学的な変性もしくは不活性化からなる群から選択した方法で行うことができる。
【００５７】
後記実施例２と６でさらに詳細に述べるように、本発明の発明者らは、ＲＮアーゼＢ１の抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性がそのリボ核酸分解活性に依存しておらず、沸騰させ、オートクレーブ処理しおよび化学的に不活性化（アセチル化）したＲＮアーゼＢ１はリボ核酸分解活性がほとんどない（１０％）かまたは実質的にない（０〜１０％）が、その抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性はすべて実質的に保持していることを示した。
【００５８】
したがって、本発明のＴ２−ＲＮアーゼタンパク質は、天然のリボ核酸分解活性型、または代わりに、リボ核酸分解活性がないか（０％）またはほとんどない（１０％まで）サイレントのもしくは抑制されたリボ核酸分解活性型であるがその他の活性を維持している型の両方で利用することができる。それ故、用語「Ｔ２−ＲＮアーゼ」は、そのタンパク質の他の特性のいかんにかかわらず、そのタンパク質の抗増殖型、抗定着型、抗分化型および抗発育型のすべてを含んでいるものとする。
【００５９】
リボ核酸分解活性は被検者に望ましくない副作用をもたらすことがあるので、望ましい活性を示すがリボ核酸分解活性が欠けているかまたは抑制されているＴ２−ＲＮアーゼを、直接に、またはポリヌクレオチドから発現させて利用することが特に有利であることが分かるであろう。
【００６０】
本願で定義されるＴ２−ＲＮアーゼのアミノ酸配列を示すポリペプチドは、当該技術分野で周知のいくつもの方法のうちのいずれか一つによって製造することができる。例えば、そのポリペプチドは、標準のペプチド合成技法によって、例えば、標準の９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆ−Ｍｏｃ）化学（例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．とＳｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１６５ １９８５年参照）または標準のブチロキシカーボネート（Ｔ−Ｂｏｃ）化学を利用して合成で製造できるが、ごく最近、Ｓｈｅｐｐａｒｄが開発したフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）／ｔｅｒ−ブチル系がますます広く利用されていることに注目すべきである（Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ，Ｔｈｅ ＬＫＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ３３巻９頁１９８６年）。
【００６１】
あるいは、Ｔ２−ＲＮアーゼタンパク質は、このタンパク質を発現することが分かっている生物から、当該技術分野で周知の方法で単離し次いで精製することもできる。このような生物としては、例えば、エロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎｕｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ホエニシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｈｏｅｎｉｃｉｓ）、リソプス・ニベウス（Ｒｈｉｓｏｐｕｓ ｎｉｖｅｕｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、レンティヌラ・エドデス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）、イルペックス・ラクテウス（Ｉｒｐｅｘ ｌａｃｔｅｕｓ）、フィサルム・ポリセフルム（Ｐｈｙｓａｒｕｍ ｐｏｌｙｃｅｐｈｌｕｍ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、リコペルシコン・エスクレンツム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ニコチアナ・アラタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａ）、マルス・ドメスチカ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ピルス・ピリフォリア（Ｐｙｒｕｓ Ｐｙｒｉｆｏｌｉａ）、モモルディカ・カランチア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）、ガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）、ラナ・カテスベイアナ（Ｒａｎａ ｃａｔｅｓｂｅｉａｎａ）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｙｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、クラソステラ・ギグス（Ｃｒａｓｓｏｓｔｅｒａ ｇｉｇｕｓ）、トダロデス・パシフィクス（Ｔｏｄａｒｏｄｅｓ ｐａｓｉｆｉｃｕｓ）、およびホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）がある。しかし、Ｔ２−ＲＮアーゼを産生することがまだ知られていない他の生物は、産生することが発見されると、本発明によって、Ｔ２−ＲＮアーゼの原料として使用できると考えられる。
【００６２】
あるいは、好ましくは、Ｔ２−ＲＮアーゼタンパク質は、そのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、適当な発現ベクター系を使って発現させることによって組換え法で製造することができる。好ましくは、適切な翻訳後の修飾体を提供する発現系が選択される。適切な発現ベクター系としては、限定されないが、ウイルス（例えばアデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アビポックスウイルス）に感染した哺乳類細胞；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞；遺伝子によって改変された植物、またはプラスミド、植物ウイルスもしくはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌で形質転換された植物細胞；酵母ベクターを含有する酵母などの形質転換された微生物またはバクテリオファージＤＮＡ、プラミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌がある。ベクターの発現制御要素は利用される宿主−ベクター系に対応してその強度と仕様が変化し、いくつもの適切な転写要素と翻訳要素のうちのいずれか一つを使用できる。組換え法で製造したＴ２−ＲＮアーゼは、宿主の細胞から、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、免疫沈降法、沈降法などの当該技術分野で公知の方法によって精製することができる。
精製されたＴ２−ＲＮアーゼを使用し、適当な医薬として許容される担体および／または添加剤を添加して、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、研和、乳化、被包形成、封入（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）または凍結乾燥の方法によって本発明の薬剤を製造することができ、あるいは精製されたＴ２−ＲＮアーゼは、先に述べたような適当な送達ベヒクルに結合してもよい。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチドは天然のＴ２−ＲＮアーゼタンパク質をコードすることができ、この場合のいずれの用語も、抗増殖活性とリボ核酸分解活性の両方を有するＴ２−ＲＮアーゼを述べており、または、代わりに、本発明のポリヌクレオチドは、リボ核酸分解活性を全くもっていないかもしくはほとんどもっていないサイレントなもしくは抑制されたＴ２−ＲＮアーゼ変異体をコードして、リボ核酸分解活性を実質的にもっていないタンパク質を生体内で発現し（例えば転写し翻訳し）することができる。
【００６４】
したがって、用語「ポリヌクレオチド」は、一般的なＴ２−ＲＮアーゼの場合にまたは特異的なＴ２−ＲＮアーゼの場合に、本願で用いるとき、異常に増殖する細胞の増殖、定着、分化および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転させるのに能動的で、リボ核酸分解活性を有しているかまたは実質的に欠いているＴ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を意味する。リボ核酸分解活性を欠いたＴ２−ＲＮアーゼをコードしているポリヌクレオチドは、公知の分子生物学の技法、例えばランダム突然変異誘発法、部位特異的突然変異誘発法および促進進化（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）法を利用して得ることができる。部位特異的突然変異誘発法は、Ｔ２−ＲＮアーゼのリボ核酸分解活性のために不可欠のアミノ酸残基が分かっているので［Ｋｕｓａｎｏら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２巻８７−９４頁１９９８年（この文献は本願に援用する）および前記表２を参照］、直ちに利用できる。
【００６５】
したがって、本発明を使用して、異常に増殖する細胞例えば癌性などの細胞を特徴とする症状、症候群または疾患であって、限定されないが、例えば乳頭腫、ブラストグリオーマ、カポジ肉腫、黒色腫、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星細胞腫、頭部癌、頸部癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病、バーキット病、関節炎、リウマチ様関節炎、糖尿病網膜症、血管新生、再狭窄、イン−ステント再狭窄および移植血管再狭窄を治療することができる。
【００６６】
用語「癌」または「腫瘍」は、本願で使用するとき、異常な細胞増殖を示す細胞を特徴とする無数の疾患を含む、臨床で述べられる用語である。用語「腫瘍」は、組織に使用される場合、過剰でかつ異常な細胞の増殖を特徴とする異常な組織の増殖を意味する。腫瘍は、「良性」でその元の病巣から拡散できないことがあり、または「悪性」もしくは「転移性」で、その解剖学的部位を超えて他の領域へ、宿主身体全体にわたって拡散可能であることがある。用語「癌」は古い用語であり、悪性腫瘍またはそれから起こる疾患の状態を述べるのに一般に使用される。あるいは、その用語は、新生物のような異常増殖および悪性新生物のような悪性異常増殖を意味する。
【００６７】
本願に記載されかつ後記実施例の項に例示されている、抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼはいずれも、本発明の教示にしたがって、治療薬として使用できる。同様に、本願に記載されている抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドはいずれも、本発明の教示にしたがって、治療薬として使用できる。Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼの網羅的でないリストは上記表２に提供してある。後記実施例でさらに例示されるように、Ｔ２ファミリーのメンバーである。ＲＮアーゼＢ１は、抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性を有し、これらの活性は生体内および生体外の検定法で確認した。さらに、ＲＮアーゼＢ１は、リボ核酸分解活性がなくなるように処理された場合でさえ、アクチンに結合することが示されている。したがって、本発明は、当業技術者が、与えられたリボヌクレアーゼを、その抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性について試験できる三つの異なる検定法を提供し、それらの方法は、被検リボヌクレアーゼの癌性細胞に対する作用を確認する生体外検定法、被検リボヌクレアーゼの腫瘍の発育に対する作用を確認する生体内検定法、および被検リボヌクレアーゼの、細胞アクチンおよび／または遊離アクチンに結合する性能を確認するもう一つの生体外検定法である。本発明を、理論によって限定することなしに、アクチンに結合するリボヌクレアーゼの性能は、このようなリボヌクレアーゼが抗増殖活性、抗定着活性、抗分化活性および／または抗発育活性を有していることを示していると考えられる。
【００６８】
本発明のリボヌクレアーゼは、ヒトまたは他の動物などの生物に、それ自体で、または適切な担体または添加剤が混合されている医薬組成物で投与することができる。
【００６９】
用語「医薬組成物」および「薬剤」は、本願で使用する場合、他の化学的成分、例えば薬理学に適切な担体および添加剤を含有する、本願に記載されている１種以上のリボヌクレアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドの製剤を意味する。医薬組成物の目的は、化合物を生物に投与しやすくすることである。
【００７０】
用語「添加剤」は、本願で使用する場合、医薬組成物に添加して、化合物の投与を一層容易にする不活性物質を意味する。添加剤の例としては、限定されないが炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種の糖類と各種のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコール類がある。
【００７１】
また医薬組成物は、一種以上の追加の有効成分を含有していてもよく、例えば限定されないが、抗炎症薬、抗菌薬、麻酔薬などが主有効成分に加えられる。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知の方法、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、研和、乳化、被包形成、封入または凍結乾燥の方法によって製造することができる。
【００７３】
したがって本発明にしたがって使用される医薬組成物は、有効化合物を、医薬として使用できる製剤に加工しやすくする添加剤と助剤を含む一種以上の薬理学的に許容できる担体を使用する通常の方式で調合できる。適正な調合は、選択される投与経路によって決まる。
【００７４】
したがって、投与を行うために、本発明の医薬組成物は、適切な医薬担体、および有効量のＴ２−ＲＮアーゼもしくはそれをコードするポリヌクレオチドを含有し、例えば、局所、眼内、非経口、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または当該技術分野で周知の方法による他の有効な手段で投与される。
【００７５】
静脈内、筋肉内または皮下の注射の場合、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、好ましくは生理的に相容性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液または生理食塩水の緩衝液で調合することができる。例えば、有効量のＴ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含有する生理学的に適当な溶液は、血液循環系中に、全身にわたって投与して、直接到達できないかまたは解剖学的に切離すことができない癌または腫瘍を治療することができる。有効量のＴ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含有する生理的に適当な溶液は、標的組織の腫瘍細胞を治療するために有効な量を、針によって、標的の癌組織または腫瘍組織に直接注射することができる。
【００７６】
経粘膜投与の場合は、浸透させるべきバリアーに対して適当な浸透剤を調合に使用する。このような浸透剤は、当該技術分野で広く知られている。
【００７７】
経口投与に使用する場合、本発明の医薬組成物は、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを、当該技術分野で周知の医薬として許容できる担体と組み合わせることによって容易に調合することができる。このような担体によって、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして、患者が経口摂取するために調合することができる。経口で服用する薬理学的製剤は、固体の添加剤を使用し、得られた混合物を任意に粉砕し、次いで所望の場合、適当な助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して製造し、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適切な添加剤は詳しくのべると充填剤であり、例えば糖類（ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む）、セルロース製剤（例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、および／または生理的に許容できるポリマー類例えばポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）がある。所望により、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはその塩例えばアルギン酸ナトリウムがある。
【００７８】
糖衣錠コアには適切なコーティングが行われる。この目的のため、濃縮糖溶液が使用され、この溶液は任意にアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含有している。染料または顔料を錠剤または糖衣錠のコーティングに添加して、識別したりまたは有効成分の投与量の異なる組合せを特徴づけることができる。
【００７９】
経口で服用できる追加の医薬組成物としては、ゼラチン製のプッシュ−フィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル剤、およびゼラチンや可塑剤例えばグリセリンもしくはソルビトールで製造された密封軟カプセル剤がある。前記プッシュ−フィットカプセル剤には、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドがラクトースなどの充填剤、デンプン類などの結合剤、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤および任意に安定剤と混合されて入っている。軟カプセル剤中には、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドが、適切な液体例えば脂肪油類、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコール類に溶解されているか懸濁されている。さらに安定剤を加えてもよい。経口投与用の配合物はすべて、選択された投与経路に適切な用量でなければならない。
【００８０】
本発明の医薬組成物の経口による送達は、胃腸期間に存在するｐＨと酵素による分解のため成功しないことがある。したがって、そのような医薬組成物は、望ましくない環境を避けるように調合しなければならない。例えば、腸溶コーティングを経口固体調合物に適用することができる。酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）およびアクリル樹脂類のような耐酸性の物質が、マイクロカプセル化のための錠剤または顆粒をコートするために最も一般的に使用される。腸溶コートされた顆粒を製造するには、有効成分とコーティングの反応を避けるため、湿式造粒法を利用することが好ましい（Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．およびＫａｗａｓｈｉｍａ，Ｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．４巻７０−７４頁１９８７年）。溶媒蒸発法も利用できる。溶媒蒸発法は、血中グルコース濃度を維持するため糖尿病ラットに投与されるインシュリンをカプセルにつめるのに使用された（Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒ，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｄｅｖｉｃｅ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｏｇａｎ １３巻１８７−２０１頁１９８６年およびＬｉｎ，Ｓ．Ｙ．ら、Ｂｉｏｍｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏｒｇａｎ １６巻８１５−８２８頁１９８８年）。溶媒蒸発法は、ウイルス抗原やコンカナバリンＡなどの高分子量の生物物質をカプセルにつめるのにも使用された（Ｍａｈａｒａｊ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．Ｓｃｉ．７３巻３９−４２頁１９８４年）。
【００８１】
口腔内投与の場合、本発明の医薬組成物は、通常の方式で調合された錠剤またはロゼンジの形態であればよい。
【００８２】
直腸投与の場合は、当該技術分野で周知である坐剤を利用できる。
【００８３】
吸入による投与の場合、本発明によって使用されるＴ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、加圧パックまたはネブライザーから、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素を使用してエーロゾルスプレイの形態で便利に送達される。加圧エーロゾルの場合、用量単位は、弁を設置して計量された量を送達することによって決定することができる。吸入器または吹入器に使用する例えばゼラチン製のカプセルやカートリッジは、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドおよびラクトースもしくはデンプンなどの適切な粉末ベースの粉末混合物を入れて調合できる。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与用にも調合できる。注射用組成物は、単位剤形、例えば任意に保存剤を加えたアンプルもしくはマルチドーズコンテナーで提供できる。その組成物は、油性もしくは水性の媒体による懸濁液、溶液または乳液でもよくそして懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの調合剤を含有していてもよい。
【００８５】
非経口投与用医薬組成物としては、水溶性型の有効成分の水溶液がある。さらに、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドの懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として製造することができる。適切な親油性の溶媒または媒体としては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド類もしくはリポソーム類などの合成の脂肪酸エステルがある。水性注射懸濁剤は、その懸濁液の粘度を増大する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有していてもよい。この懸濁剤は、Ｔ２−ＲＮアーゼもしくはそれをコードするポリヌクレオチドの溶解度を増大して、高濃度溶液を製造できるようにする適切な安定剤または薬品を任意に含有していてもよい。
【００８６】
あるいは、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、使用する前に、適切な媒体、例えば滅菌されたパイロジェンなしの水で再構成するための粉末形態でもよい。
【００８７】
本発明の医薬組成物は、例えばカカオバターなどのグリセリド類のような通常の坐薬ベースを使用して、坐剤または保持浣腸剤などの直腸組成物にも調合することができる。
【００８８】
さらに、体腔、例えば眼、胃腸管、泌尿生殖器官（例えば膀胱）、肺系統および気管支系統などに存在する癌または腫瘍は、有効量のＴ２−ＲＮアーゼもしくはそれをコードするポリヌクレオチドを含有する生理学的に適当な組成物（例えば滅菌された、食塩水もしくはリン酸緩衝液などの溶液、懸濁液または乳液）を、針による直接の注射または癌もしくは腫瘍に冒された中空臓器中に配置されたカテーテルなどの送達管によって受け取ることができる。Ｘ線、ソノグラムまたは光ファイバーの視覚化装置などの有効な画像形成装置を使用して標的組織の位置をつきとめて針またはカテーテル管を、該組織の近くに案内することができる。
【００８９】
本発明の医薬組成物は、浸透マイクロポンプで送達することもできる。その浸透マイクロポンプは体腔のうちの一つに移植され、医薬が治療すべき組織に、定期的に続いて放出される。この方法は、その医薬組成物に対する免疫反応が経験されている場合、特に有利である。この方法はオンコナーゼに利用されている（Ｖａｓａｎｄａｎｉ Ｖ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５；５６（１８）４１８０−４１８６頁１９９６年）。
【００９０】
あるいは、本発明の別の好ましい実施態様によれば、医薬として許容できる担体としては、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを、被検者の哺乳類細胞に送達することができる送達媒体がある。
【００９１】
タンパク質または核酸を、腫瘍または癌細胞を標的として送りこむ多くの送達媒体や方法が当該技術分野で知られている。例えば、リポソームは、タンパク質または核酸を標的細胞中に送達するのに利用できる人工膜のベシクルである（Ｎｅｗｔｏｎ，Ａ．Ｃ．およびＨｕｅｓｔｉｓ，Ｗ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７巻４６５５−４６５９頁１９８８年；Ｔａｎｓｗｅｌｌ，Ａ．Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １０４４巻２６９−２７４頁１９９０年；およびＣｅｃｃｏｌｌ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ ９３巻１９０−１９４頁１９８９年）。したがって、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、高い効率でリポソームベシクルで被包して哺乳類細胞中に送達できる。その上に、Ｔ２−ＲＮアーゼタンパク質または核酸は、例えばＬｅｅの米国特許第５９２５６２８号に記載されているように、ミセルによって、腫瘍または癌の細胞を標的として送達することもできる。なおこの特許は本願に援用するものである。
【００９２】
リポソームまたはミセルに被包されたＴ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、局所、眼内、非経口、鼻腔内、気管内、気管支内、筋肉内、皮下に、または他の有効な手段によって、標的組織の異常に増殖する細胞を治療するのに有効な投与量で投与することができる。リポソームは、被包されたＴ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドの有効量を含有する生理学的に適当な組成物で投与することができる。
【００９３】
あるいは、本発明の他の好ましい実施態様によって、その送達媒体は、限定されないが、特定の細胞表面受容体またはマーカーに結合できる抗体またはリガンドでもよい。抗体またはリガンドは、Ｔ２−ＲＮアーゼタンパク質もしくは核酸に、適切なリンカーを通じて直接結合できるか、あるいはこのような抗体もしくはリガンドは、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドを被包しているリポソームの表面に提供することができる。
【００９４】
例えば、Ｔ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野ですでに述べられているように、特定の組織または細胞を標的として向かわせるために、特定の膜タンパク質の抗体もしくはリガンドと融合させてもよい。この点については、リボヌクレアーゼＡスーパーファミリーのＲＮアーゼＡが、トランスフェリン受容体に対する抗体または抗原ＣＤ５に対する抗体と融合すると、上記毒素各々に対して特異的な受容体を保持する腫瘍細胞内でのタンパク質合成が阻害されることが分かるであろう（Ｒｙｂａｋ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６巻２１２０２−２１２０７頁１９９１年およびＮｅｗｔｏｎ，ＤＬら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０（４）巻４６３−４７０頁１９９７年）。
【００９５】
本発明で使用するのに適切な医薬組成物としては、有効成分の意図する目的を達成するのに有効な量を含有する組成物がある。より具体的に述べると、治療のために有効な量とは、疾患の症状を予防し、軽減しまたは改善するためまたは治療されている被検者の生存を延長するために有効な有効成分の量を意味する。
【００９６】
治療のために有効な量を決定することは、特に、本願に詳細に開示されていることにてらして、十分に当業技術者の技量の範囲内にある。
【００９７】
本願に記載の有効成分の毒性と治療効力は、細胞培養または実験動物の標準的製薬学的方法によって、例えば被検者に対する有効成分のＩＣ５０およびＬＤ５０（被検動物の５０％が死ぬ致死量）を測定することによって確認することができる。これらの細胞培養検定法や動物実験から得たデータを利用して、ヒトに使用する投与量の範囲内の調合を行うことができる。その投与量は、利用される剤形と利用される投与経路に応じて変えることができる。正確な調合、投与経路および投与量は、個々の医師が、患者の症状を考慮して選択することができる（例えば、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」１章１頁１９７５年のＦｉｎｇｌらの論文参照）。
【００９８】
投与は、治療される症状の重症度と反応性に対応して、徐放性組成物の一回の投与でもよく、治療の過程は、数日間〜数週間または治癒するまでもしくは疾患状態が減退するまで続く。
【００９９】
投与すべき組成物の量は、勿論、治療される被検者、苦痛のきびしさ、投与の方式、担当医師の判断などによって決まる。
【０１００】
さきにすでに述べているように、本発明の一側面によって、医薬組成物の有効成分は、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドである。
【０１０１】
本発明のこの側面によって、前記ポリヌクレオチドは、医薬として許容できる担体とともに哺乳類細胞中に導入され、その導入によって、その細胞の遺伝子調節が行われて、その細胞内でＴ２−ＲＮアーゼを発現することができる。
【０１０２】
用語「遺伝子調節」は、本願の明細書と特許請求の範囲で使用される場合、核酸を細胞に挿入する方法を意味する。その挿入は、例えばウイルス感染、注射、トランスフェクション、粒子衝撃法または核酸を細胞に導入するのに有効な他の手段で行うことができ、これら手段のうちいくつかは、以下にさらに詳細に説明する。遺伝子調節によって、前記核酸は、全部か一部が細胞のゲノム（ＤＮＡ）に組みこまれるかまたは細胞ゲノムの外側に留まり、安定して修飾された細胞または一時的に修飾された細胞が提供される。
【０１０３】
したがって、本発明のこの側面の医薬組成物は、遺伝子治療に使用することができる。
【０１０４】
用語「遺伝子治療」または「遺伝治療」は、本願で使用する場合、互いに取り換えて使用することができ、かつ癌細胞などの増殖性細胞類の安定した遺伝子調節または一時的な遺伝子調節によって前記細胞の増殖が阻害される治療法を意味する。
【０１０５】
そのＧｅｎｅＢａｎｋ の受託番号によって表２にあげたポリヌクレオチドのいずれか一つを、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドとして、本発明で利用することができる。さらに、先に列挙したポリヌクレオチドと、４０％以上相同性でおよび／またはゆるやかなおよび／またはストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッドを形成するポリヌクレオチドも、それがコードするタンパク質がＴ２−ＲＮアーゼとしての特性を有しかつ所望の活性を示すならば、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドとして利用できる。さらに、かようなポリヌクレオチドの部分、変異体、キメラまたは対立遺伝子も、かようなポリヌクレオチドのかような部分、変異体、キメラまたは対立遺伝子が、所望の活性を示すＴ２−ＲＮアーゼをコードするならば、やはり、本発明によって、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドとして使用できる。
【０１０６】
Ｔ２−ＲＮアーゼをコードする新規なポリヌクレオチドを単離することも考えられる。このような単離は当該技術分野で周知の方法を利用して行うことができ、限定されないがライブラリースクリーニング、ハイブリッド形成、ＰＣＲ増幅、標識化プライマー、標識化変性プライマー（ｌａｂｅｌｅｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）がある。したがってゲノムとｃＤＮＡのポリヌクレオチドを利用できる。
【０１０７】
本発明のポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法を使用して、他のタンパク質をコードするポリペプチドに、インフレームで融合させて、融合タンパク質をコードさせることができる。例えば、そのポリペプチドは、リーダー配列または分泌のためのシグナルペプチドに融合させることができる。同様に、Ｔ２−ＲＮアーゼタンパク質は、当該技術分野で周知の方法を使用して他のタンパク質に融合（複合）させることができる。タンパク質を含む異なるタイプの分子を、複合または融合（連結）させる多種類の方法が当該技術分野で知られている。これらの方法は、本発明で使用して、Ｔ２−ＲＮアーゼを、リガンドもしくは抗体などの他の分子に連結させ、Ｔ２−ＲＮアーゼが特定の細胞型を標的として向かわせてそれに結合するのを助ける。当業技術者に知られている複合方法を使用して、タンパク質のペアを複合もしくは融合させることができる。これらのタンパク質は、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸エヌヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートとも呼称されている（「ＳＤＰＤ」）（Ｓｉｇｍａ カタログ番号：Ｐ−３４１５）、グルターアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）複合法またはカルボジイミド複合法を使用して複合することができる。
【０１０８】
本発明の好ましい実施態様によれば、ポリヌクレオチドが、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードする配列に作動的に連結された、一つ以上のセグメントを保持する転写制御配列を含有している。このような転写制御配列は、限定されないが以下に詳細に説明するプロモーターおよびエンハンサーを含有している。これらの転写制御配列は、一般にコード領域の上流に作動的に連結されて、転写および／またはその翻訳を調節する働きをする。
【０１０９】
本発明の別の好ましい実施態様によれば、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドは、真核細胞の発現ベクター内に含まれている。用語「発現ベクター」は、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードする配列および転写制御配列を含有し、かつＴ２−ＲＮアーゼを哺乳類の細胞内で発現することができる核酸配列を意味する。
【０１１０】
哺乳類の遺伝子を発現させることを目的として、ＤＮＡ断片をベクター中に挿入する多種類の方法が、当該技術分野で知られていて、適当な転写／翻訳制御配列および所望のＴ２−ＲＮアーゼのポリヌクレオチド配列を含有する、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードする遺伝子発現ベクターを構築するのに利用することができる。これらの方法としては、生体外でのＤＮＡ組換え法と合成法および生体内での遺伝子組換え法がある。Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドの発現は、転写制御配列によって調節され、その結果、Ｔ２−ＲＮアーゼが、組換えＤＮＡ分子でインフェクトされたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞内で発現される。例えば、Ｔ２−ＲＮアーゼの発現は、当該技術分野で知られているプロモーター／エンハンサーの要素によって制御できる。そのプロモーターの活性化は、組織特異的であるかまたは代謝産物もしくは投与された物質によって誘発することができる。
【０１１１】
標的の組織もしくは細胞内でのＴ２−ＲＮアーゼの発現を制御するのに使用できるプロモーター／エンハンサーとしては、限定されないが、天然のＲＢプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター／エンハンサー（Ｋａｒａｓｕｙａｍａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９巻１３頁１９８９年）ヒトβ−アクチンプロモーター（Ｇｕｎｎｉｎｇ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４巻４８３１−４８３５頁１９８７年）、マウスの乳癌ウイルスのロングターミナルリピート（ＨＨＴＶＬＴＲ）中に存在するグルココルチコイド誘発性プロモーター（Ｋｌｅｓｓｉｇ，Ｄ．Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４巻１３５４−１３６２頁１９８４年）、Ｈｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスのロングターミナルリピート配列（ＭＵＬＶ ＬＴＲ）（Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．ら、ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ １９８５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）、ＳＶ４０初期領域プロモーター（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９０巻３０４−３１０頁１９８１年）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３′ロングターミナルリピートに含まれているプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ ２２巻７８７−７９７頁１９８０年）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼプロモーター／エンハンサー（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８巻１４４１−１４４５頁１９８１年）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９６巻３９−４２頁１９８２年）、アデノウイルスのプロモーター（Ｙａｍａｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２（１１）巻３５６７−３５７１頁１９８５年）、および単純ヘルペスウイルスＬＡＴプロモーター（Ｗｏｌｆｅ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １巻３７９−３８４頁１９９２年）がある。
【０１１２】
腫瘍または癌の細胞の遺伝子治療で使用する、哺乳類宿主細胞と相容性の発現ベクターとしては、限定されないがプラスミド、レトロウイルスのベクター、アデノウイルスのベクター、ヘルペスウイルスのベクターおよび非複製型のアビポックス（ａｖｉｐｏｘ）ウイルスがあり、例えば米国特許第５１７４９９３号に記載されている。なおこの特許は本願に援用するものである。
【０１１３】
いくつもの方法を使用して、発現ベクターを、本発明のこの側面によって、一種または複数種の標的哺乳類細胞に送達することができる。
【０１１４】
例えば、有効量の発現ベクターを含有する、生理学的に適当な溶液などの適切な医薬として許容できる担体は、局所、眼内、非経口、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下にまたは他の有効な手段によって投与することができる。
【０１１５】
有効量の発現ベクターを含有する生理学的に適当な溶液は、血液循環系中に全身に投与して、直接には到達できないかまたは解剖学的に分離できない癌または腫瘍を治療することができる。
【０１１６】
腫瘍塊を治療する場合、有効量の発現ベクターを含有する生理学的に適当な溶液は、標的腫瘍塊の腫瘍細胞を治療するのに有効な量で、針を通じて標的腫瘍塊中に直接注射することができる。
【０１１７】
あるいは、例えば、眼、胃腸管、泌尿生殖器官（例えば膀胱）、肺および気管支の系統内の体腔内に存在する癌または腫瘍は、有効量の発現ベクターを含有する生理学的に適当な組成物（例えば、発現ベクター以外は滅菌されている食塩水またはリン酸緩衝液の溶液）を、針による直接注射または癌もしくは腫瘍に冒された中空臓器内に配置されたカテーテルもしくは他の送達管によって受け取ることができる。Ｘ線、ソノグラムまたは光ファイバーの可視化装置などの有効な画像形成装置を使用して、標的組織の位置をつきとめて針またはカテーテル管を案内することができる。
【０１１８】
「裸の」発現ベクターは、哺乳類の細胞が能動的に吸収できるので、その発現ベクターが適当に充填されているかまたは被包されているならば、取り込みや標的に対する送達が促進される。
【０１１９】
したがって、本発明の他の好ましい実施態様によれば、医薬として許容できる担体は、発現ベクターを、哺乳類の細胞中に、標的指向方式で送達するのに適切な送達媒体を含んでいる。
【０１２０】
ウイルス発現ベクターは、感染または形質導入によって、発現可能の形態で標的細胞中に、送達媒体で導入することができる。このような送達媒体としては、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびアビポックスウイルスがある。ベクター構造体を標的細胞中に導入することができかつＴ２−ＲＮアーゼを標的細胞内で細胞の増殖を阻害する量で発現できる送達媒体は、上記の有効な方法で投与することができる。
【０１２１】
あるいは、このような送達媒体としては、限定されないが、先に述べたようなリポソーム、ミセル、抗体またはリガンドがある。
【０１２２】
本願に記載のポリヌクレオチドは、それを、適当な医薬として許容できる担体と混合することによって、哺乳類の哺乳類細胞の増殖を阻害するのに有用な薬剤を製造するのに利用できることは分かるであろう。
【０１２３】
先に述べたように、Ｔ２−ＲＮアーゼをコードするポリヌクレオチドは各種の方法で得ることができるが、これらの方法としては、限定されないが、Ｔ２−ＲＮアーゼ特異的プライマーを使用してゲノムまたはｃＤＮＡのライブラリーをスクリーニングし、Ｔ２−ＲＮアーゼ特異的プライマーとともに逆転写ＰＣＲを使用して、Ｔ２−ＲＮアーゼを発現することが分かっている生物から単離されたｍＲＮＡを増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅方法、またはＴ２−ＲＮアーゼをコードするＤＮＡ配列を適当な生物から直接単離する方法がある。この場合、上記方法は、活性形態の上記Ｔ２−ＲＮアーゼを単離または発生させるのに利用することもできることは分かるであろう。
【０１２４】
精製されたポリヌクレオチドは、次に適当な発現ベクター中に挿入するか、または適当な転写制御配列を提供して上記のように製造することができる。
【０１２５】
以下の実施例の章でさらに例示しかつ先に述べたように、特定のＴ２−ＲＮアーゼまたはそれをコードするポリヌクレオチドの作用を確認する検定法も本発明の教示によって提供される。このような検定は、例えば、増殖中の細胞をＴ２−ＲＮアーゼに暴露してそれら細胞の増殖挙動を時間の経過とともに追跡して、対照の未処置の細胞と比較することによって行われる。この検定法は、特定の用途に対して最も強力なＴ２−ＲＮアーゼを選択するのに利用できるだけでなく、用量反応を確証するのにも利用することができる。このことは生体内実験中、または被検者を治療中の初期治療投与量に反映させることができ、これらのことは、Ｔ２ファミリーのＲＮアーゼＢ１について本願でさらに例示する。この検定法は、抗増殖活性の部位もしくは部分またはＴ２−ＲＮアーゼを確認するとか、または発生もしくは単離した、リボ核酸分解活性を示さない変異体の活性を確認するのに使用することもできることが分かるであろう。
【０１２６】
本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、以下の実施例を試験すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳細に説明されかつ特許請求の範囲の章で請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、以下の実施例で実験によって支持されている。
【実施例】
【０１２７】
ここで以下の実施例について述べるが、これら実施例は、上記説明とともに本発明を例示し、本発明を限定するものではない。
【０１２８】
一般に、本願で利用される命名法と本発明で利用される実験手順としては、分子生化学的方法、微生物学的方法および組換えＤＮＡ法がある。このような技法は文献に綿密に説明されている。例えば以下の文献を参照されたい。すなわち、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ−ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４年；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州ボルチモア１９８９年；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１−４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ 米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載されているような諸方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．編「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ−ＩＩＩ巻１９９４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ著「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」第３版１９９４年、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、米国ニューヨーク；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ−ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第８版１９９４年、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネチカット州ノーウォーク；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．米国ニューヨーク１９８０年があり；そして利用可能な免疫検定法は特許や科学文献に広く記載されている。例えば以下のものを参照されたい。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ 著「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年と「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」ｖｏｌ．１−３１７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｅ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら著「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ １９９６年。これらの特許や文献は、あたかも本願に完全に記載されているように本願に援用するものである。他の一般的文献がこの文書全体に提供されている。これら文献の方法は、当該技術分野では周知であると考えられ、読者に便利なように提供されている。これら文献に含まれている情報はすべて本願に援用するものである。
【０１２９】
実施例１
アスペルギル・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）Ｂ１のＲＮアーゼの特性決定と、そのＲＮアーゼの、果物の木の花粉管成長に対する阻害作用
材料と方法
エー・ニガーの細胞外ＲＮアーゼの調製と精製：
アスペルギルス・ニガーＢ１（ＣＭＩ ＣＣ ３２４６２６）を、１％（ｗ／ｖ）の小麦粉と０．０５％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムを含有する液体培地で増殖させた。得られた混合物を、塩酸でｐＨ３．５に調節してオートクレーブで処理した。約１０６個の胞子からなる接種物を１００ｍｌの培地１００ｍｌに懸濁させ、次に２００ｒｐｍのオービタルシェーカーで３０℃にて１００ｈｒインキュベートした。その増殖培地を、１０倍容積の２ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）に対し、０．２μｍ膜を通過させて３回透析した。その透析溶液２ｌを、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６で平衡化させたＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ−ＴＭＡＥ ６５０（Ｍ）２６／１０（Ｍｅｒｃｋ）カラムに注入した。捕捉されたタンパク質類を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を流量５ｍｌ・ｍｉｎ−１で使用して、同じ緩衝液中０〜１．０Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配液５００ｍｌで溶離させた。最高のＲＮアーゼ活性を示す画分をプールし、２ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）に対して透析し、次にその５０ｍｌを、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）で平衡化したＭＯＮＯ−Ｑ５／５ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム中に注入した。溶離は、０〜１．０Ｍの塩勾配液１０ｍｌだけを１ｍｌ−ｍｉｎ−１の流量で使用したことを除いて、前記ＥＭＤ−ＴＭＡＥカラムの場合と同様にして行った。
【０１３０】
タンパク質類は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２巻２４８−２４５頁１９７６年）にしたがって２８０ｎｍで監視して測定した。異なる画分は、１２．５％ドデシル硫酸ナトリウム−アクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｍｍｅｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ ２２７巻６８０−６８５頁１９７０年）によって分析した。ＲＮアーゼ活性は、先に記載したようにして（ＲｏｉｚおよびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５６巻３７−４１頁１９９５年）測定した。
【０１３１】
上記精製されたＲＮアーゼＢ１を、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓらが報告した方法（Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ，Ｗ．Ｐ．ら、Ｓｅｘ．Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ，４巻２５８−２６６頁１９９１年）にしたがって酵素によって脱グリコシル化した。その酵素は、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと５％（ｗ／ｖ）β−メルカプトエタノールに混合し、１００℃で５分間加熱した。放冷後、その反応混合物を、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有する緩衝液で２．５倍希釈した。ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を、最終濃度２０単位・ｍｌ−１まで加えて、一夜３７℃でインキュベートした。次にその試料を試料用緩衝液と混合し、１００℃で５分間加熱し、次いで１２．５％のゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０１３２】
ＲＮアーゼ検定：
ＲＮアーゼの活性に対する最適の条件を、１０℃ずつ上昇させる２０〜１００℃の温度範囲と、５０ｍＭと１２ｍＭのリン酸塩−クエン酸塩緩衝液で行った、０．５ｐＨ単位ずつ上昇させるｐＨ２．５〜７の範囲を使ってＢｒｏｗｎとＨｏの方法（Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｈ．およびＨｏ，Ｔ．Ｈ．Ｄ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８２巻８０１−８０６頁１９８６年）を改変した方法によって決定した。１０μｌずつの各試料を、４ｍｇ・ｍｌ−１の酵母ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を含有する氷冷緩衝液４９０μｌに加えた。各試料の１／２に、２５％（ｗ／ｖ）過塩素酸中０．７５％（ｗ／ｖ）硫酸ウラニル５０μｌを含有する停止溶液を直ちに添加することによってブランクとして使用した。残りの１／２は、１０分間インキュベートし、続いて停止溶液５０μｌを各々に添加した。１５０００Ｘｇで５分間遠心分離を行った後、その上澄み液を蒸留水で２０倍に希釈し、２６０ｎｍの吸光度を測定した。ＲＮアーゼ活性の１単位を、１Ａ．Ｕ２６０ｎｍ／ｍｉｎの速度で可溶性ヌクレオチドを放出する酵素の量と決定した。
【０１３３】
ＲＮアーゼＢ１を、先に記載したようにして（ＲｏｉｚおよびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５６巻３７−４１頁１９９５年）可視化した。ＲＮアーゼＢ１を含有するＳＤＳゲルを、２５％（ｖ／ｖ）イソプロパノールを含有する２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）を使って１５分間ずつ２回洗浄し、次に、上記緩衝液だけで１５分間ずつ２回洗浄することによって再生させた。ＲＮアーゼＢ１を含有する再生されたゲルを、２０ｍＭ酢酸塩緩衝液中０．１％ＲＮＡと０．８％アガロースを含むプレート上に塗布し、次いで３７℃で３０分間インキュベートした。そのゲルを取り出し、そのアガロースプレートを、トルイジンブルーの０．０２％（ｗ／ｖ）水溶液で染色してＲＮアーゼの活性を可視化した。
【０１３４】
ＲＮアーゼＢ１の花粉管成長に対する作用
Ｐｅａｃｈ ｃｖ．Ａｌｍｏｇの花粉を、先に述べたようにして（ＲｏｉｄおよびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１５６巻３７−４１頁１９９５年）、液体培地中、生体外で発芽させた。１５％（ｗ／ｖ）スクロース、１００μｇ・ｍｌ−１ホウ酸、２００μｇ・ｍｌ−１硫酸マグネシウム、２００μｇ・ｍｌ−１硝酸カルシウムおよび各種濃度のＲＮアーゼＢ１を含有する１００μｌずつに花粉粒を懸濁させた。暗室中、２５℃で一夜インキュベートした後、発芽率を記録した。花粉管の長さを、アイピースマイクロメータで測定した。
【０１３５】
花粉管の成長に対するＲＮアーゼＢ１による処理の作用も生体内で試験した。桃とタンジェリン［シトルス・レチキュラータ（Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、Ｂｌａｎｃｏ ｃｖ．Ｍｕｒｃｏｔｔ］の無傷の花に、開花の初期段階において、１００単位・ｍｌ−１のＲＮアーゼＢ１を含有する２０ｍＭクエン酸塩緩衝液（ｐＨ３．５）をスプレーした。各々の種の、異なる枝にある同じ段階の追加の花は、対照として緩衝液だけをスプレーするかまたは処理しないままで残した。自然受粉に４８ｈｒ暴露した後、花柱を、酢酸：エタノールの容積比率３：１の混合物内で２４ｈｒ固定し、蒸留水で洗浄し、次に、８Ｍ水酸化ナトリウム内で一夜吸水させた。蒸留水で十分洗浄した後、花柱を縦方向に切断し、各々をスライドガラス上の０．１Ｍリン酸カリウム中０．１％（ｗ／ｖ）アニリンブルーの一滴の中に浸漬させ、次いでカバーガラスで注意深く押しつぶした。花粉管をエピフルオレッセンスマイクロスコピー（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＷＩＢキューブを備えたＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４０）で観察した。
【０１３６】
実止りに対するＲＮアーゼＢ１の作用：
フィールド実験をネクタリン［プルヌス・ペルシカ変種ネクタリナ・ファンタシア（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ ｖａｒ．Ｎｅｃｔａｒｉｎａ Ｆａｎｔａｓｉａ）］について行った。花がほぼ１０％開いた長さ３０〜４０ｃｍの枝に、２０ｍＭクエン酸塩緩衝液ｐＨ３．５と０．０２５％ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００混合液中、異なる濃度のＲＮアーゼＢ１をスプレーした。未処理の枝および緩衝液とｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００混合液のみをスプレーした枝を対照とした。これらの枝に、開花期間中（１４日間）２〜３日間隔でスプレーした。一ヶ月後、１枝当り果実の数をかぞえた。生存度試験を行うため、種子を胚をとおって縦方向に切断し、１％の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド含有水溶液中に、暗室内で２０℃にて４ｈｒ浸漬した。赤色に染色した組織は生存可能な組織を示した。
【０１３７】
実験結果
ＲＮアーゼＢ１の精製と特性決定：
液体培地で増殖させたエー・ニガーは、かなりな量の細胞外ＲＮアーゼＢ１を産生した。温度６０℃でｐＨ３．５が、ＲＮアーゼの活性に対して最適であることが発見されたので、その後のＲＮアーゼ検定法の標準条件として採用した。
【０１３８】
ＲＮアーゼＢ１の精製には三つのステップ（表３）がある。第一ステップにおいて、粗濾液には１０００単位・ｍｌ−１含まれていて、０．０５ｍｇ・ｍｌ−１のタンパク質が得られた。その粗濾液に、ＥＭＤ−ＴＭＡＥカラムを通過させ、そしてプールされた活性画分（図１グラフＡ）は０．１ｍｇ・ｍｌ−１のタンパク質を含有し、ＲＮアーゼの活性は４００００単位・ｍｌ−１であった。最後のステップで、プールされた画分に、ＭＯＮＯ−Ｑカラムを通過させ次に、活性ＲＮアーゼの画分を溶離させた（図１、グラフＢ）。この画分はタンパク質濃度が１．０５μｇ・ｍｌ−１で、ＲＮアーゼ活性は５４３０００単位・ｍｌ−１であった。４０ｋＤａと３２ｋＤａの二つの主要タンパク質のバンドが、精製されたＲＮアーゼＢ１画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果観察された（図２）。ＲＮアーゼ活性ゲルが、前記３２ｋＤａと４０ｋＤａのタンパク質に対応する活性バンドを示した。ＰＮＧアーゼＦにかけると、単一のタンパク質バンドが２９ｋＤａに出現した。ＲＮアーゼ活性は、ＰＮＧアーゼ消化の後も保持された（図示していない）。
【０１３９】
【表３】
【０１４０】
花粉管と実止りに対するＲＮアーゼＢ１の作用：
生体外の実験では、対照花粉の７５％が発芽しそして花粉管は長さが約０．５ｍｍになった。増殖培地中に、ＲＮアーゼＢ１を添加すると、投与量反応方式で、発芽百分率と花粉管の長さが低下した（図３）。ＲＮアーゼＢ１には著しい阻害作用があった。０．１μｇ・ｍｌ−１のタンパク質を示す５０単位・ｍｌ−１が致命的であったが、１２５μｇ・ｍｌ−１のＢＳＡは花粉発芽力と花粉管の生成の１／２しか低下させなかった。
【０１４１】
生体内では、桃の対照の花粉管は受粉後４８ｈｒに、柱頭組織を通過して花柱に向かって成長するのが観察された（図４ａ）。類似の作用が、緩衝液だけで処理された花柱に観察された。対照的に、ＲＮアーゼＢ１で処理され、柱頭で発芽した花粉粒は短い花粉管を生成した。その花粉管は成長方向を欠いているようであり、花柱組織を通過できなかった（図４ｂ）。タンジェリンの場合、柱頭組織（直径が２〜３ｍｍであった）のごく小さい部分しか顕微鏡の視野内にとらえられなかった。したがって図５に示すように、ごく少数の花粉管しか観察されなかった。しかし、対照の花粉管の正常な成長（図５ａ）と、ＲＮアーゼで処理された花粉管の異常な成長（図５ｂ）の差は明白であった。
【０１４２】
ネクタリンｃｖ．ファンタシア（ｎｅｃｔａｒｉｎｅ ｃｖ．Ｆａｎｔａｓｉａ）の場合、ＲＮアーゼＢ１は、実止まりの低下を起こした（表４）。未処理のままで残した枝またはｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００含有緩衝液をスプレーした枝はそれぞれ実止りが４８．３％と３６．３％であった。低ｐＨの緩衝液は、実止まりに対する阻害作用がいくらかあるようであったが、５００単位・ｍｌ−１および１０００単位・ｍｌ−１のＲＮアーゼＢ１で処理した枝はそれぞれ実止りが２３．３％と１８．４％であった。このことは、投与量依存方式のＲＮアーゼの有意な間引き作用を示している。
【０１４３】
【表４】
【０１４４】
ＲＮアーゼＢ１で処理した枝には、多数の未熟の小果実が観察された。生存度の試験は、対照の花の場合（未処理かまたは緩衝液だけをスプレー）は、胚組織が赤色に染色されたが（図６ａ）ＲＮアーゼで処理された花の中で成長した胚の組織は、壊死を示す褐色に染色された（図６ａ）。
【０１４５】
アスペスギルス・ニガーＢ１細胞外ＲＮアーゼ（ＲＮアーゼＢ１）を均一になるまで精製した。そのＲＮアーゼは、２９ｋＤａのタンパク質コアを共有する３２ｋＤａおよび４０ｋＤａの糖タンパク質の２種のアイソフォームを含有していることが発見された。最適のＲＮアーゼ活性が温度６０℃とｐＨ３．５で観察された。桃（プルヌス・ペルシカｃｖ．Ａｌｍｏｇ）とタンジェリン（シトルス・レチキュラータ、Ｂｌａｎｃｏ ｃｖ．Ｍｕｒｃｏｔｔ）の場合、該酵素は、生体外および生体内で花粉の発芽と花粉管の成長を阻害した。フィールド実験で、ＲＮアーゼはネクタリン（プルヌス・ペルシカ変種ネクタリナ・ファンタジア）の実止りを低下させかつ正常な胚の成長を阻害した。
【０１４６】
実施例２
Ｔ２−ＲＮアーゼによる花粉の発芽と花粉管の成長の阻害はアクチンとの相互作用によって仲介される
ＲＮアーゼによって花粉の発芽と花粉管の成長が阻害されることはよく知られているが、この酵素が前記伸長プロセスを阻害する機序はまだ明らかでない。したがって、この試験を、花粉管の伸長プロセスを阻害するＲＮアーゼＢ１の役割を読み解くために始めた。
【０１４７】
材料と実験方法
花粉管の成長に対するＲＮアーゼＢ１の作用：
ユリ［リリウム・グランジフロルム Ｌ．ｃｖ．Ｏｓｎａｔ（Ｌｉｌｉｕｍ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ Ｌ．ｃｖ．Ｏｓｎａｔ）］のやくを、室温で２４ｈｒ裂開させ、新鮮なものを使うかまたは−２０℃で貯蔵した。ＲＮアーゼＢ１を、アスペルス・ニガーの増殖培地の濾液から、実施例１に記載されているようにして製造して精製した。７％スクロース、１．２７ｍＭ ＣａＮＯ３、０．１６ｍＭ Ｈ３ＢＯ３、１ｍＭ Ｋ２ＮＯ３および３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を含有する水１００μｌずつの水性培地で、花粉を生体外で発芽させた（ＹｏｋｏｔａおよびＳｈｉｍｍｅｎの１９９４年の論文）。いくつかの培地は、１００単位／ｍｌのＲＮアーゼ活性を有するＲＮアーゼＢ１を、最終タンパク質濃度１６μｇ／ｍｌまで補充した。追加の培地は、予め３０分間沸騰させて５０％の活性を失わせたＲＮアーゼまたは触媒活性を欠いているオートクレーブ処理されたＲＮアーゼを補充した。暗所にて２５℃で２ｈｒインキュベートした後、花粉管の長さを、顕微鏡のアイピースマイクロメーターで測定した。花粉管をＩＫＩ（０．３％Ｉ２と１．５％ＫＩの水溶液）で染色してデンプン体（ｓｔａｒｃｈ ｂｏｄｙ）を検出した。１ｈｒにわたって活発に伸長している花粉管を顕微鏡載物台上のガラスセルに移した。その花粉管の成長パターンとオルガネラの移動を、Ａｐｐｌｉｔｅｃ ＭＳＶ−８００ビデオ・プレゼンタを使用し、Ｈｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．とＨｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｙ．法（Ｈｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．およびＨｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｙ．，Ｓｅｘ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄ．３巻１８７−１９４頁１９９０年）の改変法でビデオに記録した。画像は、Ｓｃｉｏｎ ＬＧ−３フレームグラバーによって、０．８フレーム／ｓｅｃで８秒間とらえ、次にＮＩＨ画像ソフトウエアによってディジタル化して統合した。それらの写真はＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， 米国カリフォルニア州マウンテン・ビュー）およびＰｏｗｅｒ−Ｐｏｉｎｔ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏ．）のソフトウエアを使用して処理した。
【０１４８】
花粉管のアクチンフィラメントに対するＲＮアーゼの作用：
ＲＮアーゼありまたはなしの水性培地で、花粉を生体外にて発芽させた。一夜インキュベートした後、花粉管を、おだやかにペレット処理を行い（ｐｅｌｌｅｔ）、次いで前記増殖培地を、１０−６ＭのテトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）で標識化したファロイジン（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳＴ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４および０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）と取りかえた。生体内観察を行うため、ｌｉｌｙ ｃｖ．Ｓｔａｒｇａｚｅｒの花を、開花開始時に除雄し、次に１０単位／ｍｌのＲＮアーゼを含有する増殖培地０．５ｍｌを、柱頭を通じて花柱溝中に注射した。ＲＮアーゼなしの増殖培地を注射された花を、対照として使用した。上記液体を、花柱組織中に２５℃で５ｈｒ吸収させた後、柱頭に、ｌｉｌｙ ｃｖ．Ｏｓｎａｔの花粉を手作業で受粉させた。２５℃で４８ｈｒインキュベートした後、各雌ずいを縦方向に切断し、そして花粉管を注意深く切り取って、ＴＲＩＴＣ−ＴＢＳＴ溶液中に移し、１ｈｒインキュベートした。柱頭での切開は花粉管に影響しなかった。というのは花粉管の死活にかかわるプロトプラストは遠位部分に位置していて、カロースプラグ（ｃａｌｌｏｓｅ ｐｌｕｇ）で保護されているからである。生体外と生体内の実験の両方で、染色された花粉管をＴＢＳ（Ｔｗｅｅｎ−２０）を欠いたＴＢＳＴ）ですすぎ、スライドガラス上に置いて、エピフルオレッセント光学顕微鏡（ＵＳＨ−１０２Ｄ水銀ランプを備えたＯｌｙｐｕｓ ＢＸ４０）で観察した。
【０１４９】
アクチンのＲＮアーゼＢ１への結合：
ＲＮアーゼＢ１とアクチンの間の相互作用を、Ｓｉｍｍ法（Ｓｉｍｍ，Ｆ．Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６巻４９−５４頁１９８７年）を改変して利用して定量した。ウサギの筋肉グロブ（Ｇ−）アクチン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）を、緩衝液Ｆ（１０ｍＭ トリスｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＡＴＰ、０．２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１Ｍ ＫＣｌおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で、室温にて３０分間重合させて線維状（Ｆ−）アクチンを得た。３０μＭのＦ−アクチンを各々含有する５０μｌずつの試料を、１〜３３μＭ ＲＮアーゼＢ１とともに、一夜４℃でインキュベートした。対照として、各濃度のＲＮアーゼを、緩衝液Ｆのみとともにインキュベートした。これら試料を、１５０００ｇで４０分間遠心分離し、その上澄み液のＲＮアーゼ活性を測定した（Ｒｏｉｚ，Ｌ．，Ｇｏｒｅｎ，Ｒ．およびＳｈｏｓｅｙｏｖ，Ｏ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．９４巻５８５−５９０頁１９９５年）。
【０１５０】
花粉管上のＲＮアーゼＢ１の免疫金−銀染色法：
免疫金−銀染色法（ＩＧＳＳ）を利用して、ユリの花粉管に対するＲＮアーゼの吸着を検出した。ポリクローナル抗体を、ウサギに、ＲＮアーゼＢ１（Ａｍｉｎｏｌａｂ）に対して生成した。生体外で２ｈｒ経過したユリの花粉管を、２．５％グルターアルデヒド含有ＰＢＳＴ中、４℃で一夜固定した。その花粉管を、ＰＢＳＴ内で１ｈｒ洗浄し、１％ＢＳＡと２％脱脂乳を含有するＰＢＳＴ中で１ｈｒブロックし、次にＰＢＳＴで１：５００の比率で希釈した抗−ＲＮアーゼＢ１内で１ｈｒインキュベートした。ウサギの免疫前血清（ＰＩＳ）を対照として利用した。これら花粉管を各々、ＰＢＳＴで１０分間ずつ３回洗浄し、５ｎｍの金粒子と結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＰＢＳＴで１：１００の比率にて希釈）内で１ｈｒインキュベートした。ＰＢＳＴ内で１０分間ずつ２回洗浄し、次に水中で１０分間１回洗浄した後、反応を最終的に起こさせるため銀−染色キット（Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。前記花粉管を、混合したキットの溶液に１０〜１５分間浸漬し、過剰の蒸留水で洗浄し、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４０）で観察した。
【０１５１】
実験結果
ＲＮアーゼなしの成長培地で生体外にて発芽させたユリの花粉管の対照試料は、長さが約３００μｍになった（図７）。同じ条件下ＲＮアーゼで処置した培養物は、長さが１６０μｍにしかならなかった。ＲＮアーゼを沸騰もしくはオートクレーブ処理した場合それぞれの花粉管の長は１３０μｍと１７０μｍであった。花粉管のＲＮアーゼで処理された３群間に、有意差はないとみなされた。
【０１５２】
デンプン染色法は、対照試料のアミロプラストが、先端領域を除いて花粉管にそって広がっていることが観察されることを示した（図８ａ）。一方、ＲＮアーゼで処理した花粉管のＩＫＩで染色された本体が先端領域に蓄積した（図８ｂ）。
【０１５３】
能動的に延びる花粉管の集積ビデオ画像は、細胞質のフローライン（ｆｌｏｗ ｌｉｎｅ）を示した（図９ａと９ｂ）。対照試料の場合、連続した縦方向の運動が最も一般的であり、花粉管の周囲は求頂的フローであり、中心は求基的フローであり、先端領域の下側に「逆噴水（ｉｎｖｅｒｓｅ ｆｏｕｎｔａｉｎ）」パターンを形成した（図９ａ）。先端領域自体は、非常に小さい本体、主としてＰ粒子が占めていたが、その運動パターンはほとんど観察されなかった。ＲＮアーゼで阻害された花粉管の先端は、膨潤していて、先端領域に到達しているデンプンと脂質の粒子がよく見えた（図９ｂ）。連続した運動は検出できなかったが、代わりに、伸長した不規則な画像が、細胞質体がランダムに回転していることを示した。
【０１５４】
アクチンフィラメントの分布に対するＲＮアーゼの作用を、生体外で１ｈｒおよび生体内で４８ｈｒの花粉管で試験した。生体内の花粉管は長さが約３〜４ｃｍになり、それらのＴＲＩＴＣ−ファロイジン染色は生体外の花粉管より強力であった。しかし、ＲＮアーゼの作用のモードは、両方の実験では類似していた。対照の場合、アクチンのマイクロフィラメントが、花粉管の軸線にそって縦方向に組み付けられて、先端領域に微小ネットワークを形成した（図１０ａ）、一方、ＲＮアーゼで処理された花粉管の場合、アクチンの塊が、先端の細胞壁に蓄積された（図１０ｂ）。
【０１５５】
ＲＮアーゼＢ１とアクチンの間の相互作用を、スキャッチャード分析法を利用して定量した。アクチン−ＲＮアーゼＢ１実験において、０．４５で横座標軸と交差する回帰直線（図１１）は、ＲＮアーゼ：アクチンのモル比が０．４５であることを示したが、二つのアクチン分子が各ＲＮアーゼ分子に結合していることを示唆している。
【０１５６】
ＲＮアーゼＢ１の存在下で発芽させた花粉を光学顕微鏡で調べるために調製し、ＲＮアーゼの位置を、抗ＲＮアーゼ抗体を使用して、ＩＧＳＳで確認した（図１２ａ〜ｃ）。ＲＮアーゼなしで成長させた花粉管（図１２ａ）またはＲＮアーゼありで成長させたがＰＩＳで処理した花粉管（図１２ｂ）の場合、その細胞壁の外面は、銀による染色がなかった。一方、ＲＮアーゼＢ１で処置した花粉管の場合、明瞭な免疫金−銀の染色が現れ、先端領域に蓄積した（図１２ｃ）。
【０１５７】
この試験では、ユリ「リリウム・グランディフロルム（Ｌｉｌｉｕｍ ｇｒａｎｄｉｆｌｒｕｍ）の花粉の発芽と花粉管の伸長は、エー・ニガーのＲＮアーゼＢ１によって特異的に阻害された。沸騰もしくはオートクレーブ処理され、元の触媒活性をほとんど欠いているＲＮアーゼは、同様の阻害作用を示した。これら試験結果は、エー・ニガーのＲＮアーゼが、花粉管の伸長に対する阻害作用を有するアクチン結合タンパク質であることを立証した。ＲＮアーゼＢ１の触媒活性には無関係のこの結合によって、花粉管アクチンフィラメントの配列が変形して細胞質の流れが中断される。
【０１５８】
実施例３
ヒトの結腸癌細胞に対するＲＮアーゼＢ１の作用
花粉管においてＲＮアーゼＢ−１に対して開かれたアクチン結合活性が、細胞傷害活性がある可能性を暗示したので、ヒト結腸癌細胞に対するＲＮアーゼＢ１の細胞傷害作用を試験することが決定された。
【０１５９】
材料と実験方法および試験結果
細胞の培養：
すべての実験を生体外で実施した。ヒトの結腸腺癌（ＨＴ２９）細胞を、１０％のウシ胎仔血清、１％のグルタミンおよび１０％のＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｉｃｏｔｉｃ溶液（Ｂｉｏｌａｂ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｂｅｔ Ｈａｅｍｅｋ）で増殖させた。その細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿大気中で３７℃にてインキュベートした。ＲＮアーゼＢ１の溶液は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．８）で調製した。
【０１６０】
細胞生存能の予備検定：
細胞を５０ｍｌのフラスコでインキュベートした。各フラスコには、異なる濃度（１０−８〜１０−６Ｍ）のＲＮアーゼＢ１の存在下または非存在下、７ｍｌの培地中２×１０５の細胞を入れた。これらの細胞を４８ｈｒまたは７２ｈｒ増殖させ、次いで生存可能な細胞と生存不能の細胞を、トリパンブルー染色法を利用し、区別して計数した。
【０１６１】
すべての処理で、７２ｈｒ間増殖させた細胞の合計数（５５〜６０×１０５）は、４８ｈｒ培養後に得た細胞の数（２５〜３０×１０５）の約２倍になった（図１３ａ）。増殖培地中にＲＮアーゼＢ１が存在していることは、細胞の増殖に対して有意な作用はなかった。しかし、４８ｈｒと７２ｈｒのインキュベーションの両者で、死んだ細胞の数に対するＲＮアーゼＢ１の小さいが有意な作用が見られた（図１３ｂ）。
クローン原性（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の検定Ｉ：
腫瘍細胞の長期間の生存は、それら細胞の分裂してクローンを産生する性能が特徴である。細胞を１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１を含有する増殖培地で４８ｈｒプレインキュベートし次にトリプシンで処理し、洗浄し、次にＲＮアーゼＢ１を欠いた増殖培地中に再懸濁させた。９６ウェル微量滴定プレート中にプレートする前に、その細胞を、各ウェル（２００ｍｌ）中、５０〜１０５細胞の範囲で、５倍ずつの段階希釈を行った。これらプレートを、新しい増殖培地を添加することなく、上記条件で１４日間培養し、続いてコロニーを固定してメチレンブルーで染色した。各ウェル中のクローン原性細胞を、クローン可視化を行った後、計数した。対照の細胞は上記のように処理したが、最初の４８ｈｒを、ＲＮアーゼＢ１を欠いた培地でプレインキュベートした。
【０１６２】
１００個の細胞をプレートしたウェルには、両方の処置で、類似の数のコロニーが観察された（図１４）。ＲＮアーゼＢ１の細胞傷害作用は、高密度の細胞が入っているウェルに出現した。５００個ずつの細胞をプレートされたウェルの場合、対照の細胞とＲＮアーゼＢ１で処理された細胞は、それぞれ、１個のウェル当たり１８０個と１００個のコロニーを産生した。さらに、１０００個ずつの細胞でプレートしたウェルの場合、ＲＮアーゼＢ１で処置した細胞は、ウェル１個当たり約２５０個のコロニーを形成したが、一方、対照の細胞は、融合して連続層になった非常に多数のコロニーを形成したので、図１４には計数して示すことができなかった。高密度でプレートした細胞は、培地を変えない培養では生存しなかった。
【０１６３】
クローン原性検定ＩＩ：
腫瘍細胞が増殖しおよび定着する能力を、ＲＮアーゼＢ１に短時間または連続的に暴露して試験した。この実験は、（ｉ）対照の細胞；（ｉｉ）１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１を含有する培地でプレインキュベートし次にＲＮアーゼＢ１なしの増殖培地で定着させた細胞；および（ｉｉｉ）（ｉｉ）と同様にプレインキュベートし、次に、定着検定中、１０−６ＭのＲＮアーゼＢ１を含有する増殖培地でインキュベートした細胞；を使用して、クローン原性検定Ｉに記載したのと同様に実施した。これらの実験で、初期密度は２５０〜１０００細胞／ウェルの範囲内であり、そして定着期間は７日間であった。
【０１６４】
この実験で利用した短期間のインキュベーション（７日間）を１４日間のプレインキュベーションと比べたところディフューズされたコロニー（ｄｅｆｕｓｅｄ ｃｏｌｏｎｙ）は全くなかった。このコロニーは高密度の細胞を含有するウェルでさえも識別できる。すべての密度において、ＲＮアーゼＢ１とともに４８ｈｒインキュベートすると、細胞が定着する能力は、対照と比べて、２０〜３０％低下した（図１５）。しかし、各密度において、ＲＮアーゼＢ１に連続して暴露すると、クローン原性の９０％が劇的に低下した。図１６ａ〜ｃは、ＲＮアーゼＢ１で連続的に処置した細胞（図１６ｃ）が、ＲＮアーゼＢ１とともに４８ｈｒプレインキュベートした細胞（図１６ｂ）または対照の細胞（図１６ａ）より小さくかつ染色性が低かったことを示している。この試験結果は、ＲＮアーゼＢ１がコロニー増殖速度を損なったことを示している。
【０１６５】
したがって、ここで提供した試験結果から明らかに分かるように、エー・ニガーのＲＮアーゼＢ１は、ヒトの腺癌ＨＴ２９細胞に対し、明確な細胞傷害作用を有している。ＲＮアーゼＢ１の細胞傷害作用は、細胞の生存能力の低下ではなくて、細胞のクローン原性の低下によって表現される。ＲＮアーゼＢ１は腫瘍細胞に対して長期間、作用することができる。ＲＮアーゼＢ１は対照と比べてコロニー増殖速度を低下させる。このことはＲＮアーゼＢ１は、細胞の増殖する能力を損なうことを示している。
【０１６６】
実施例４
ラットモデルにおける腫瘍発生に対するＲＮアーゼＢ１の生体外作用
ＲＮアーゼＢ１の抗癌作用をさらに試験するため、生体内の実験をラットで行った。
【０１６７】
材料と実験方法
Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ由来の４週間齢雄ラットを６頭ずつの群に分けた。いくつかの群のラットは、ジメチルヒドラジン（ＤＭＨ）を一週間に一回ずつ五回注射することによって結腸癌を発生させた。この実験では、ＲＮアーゼＢ１の２種の投与方式を試験した。ＲＮアーゼＢ１は、浸透マイクロポンプによって、結腸に直接適用するか、または腸溶コートされたマイクロカプセルを使用して経口投与した。各ラット群に行った処置全体は図１の模式図に記載してある。実験中、ラットの重量を週一回測定して、ラットの成長速度に対するＤＭＨおよび／またはＲＮアーゼＢ１の作用を監視した。ＲＮアーゼＢ１で処置された群の糞便を、各ケージから週一回集めて６０℃で乾燥した。２５０ｍｇの乾燥糞便の試料を粉砕し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再溶解した。遠心分離を行った後、上部溶液のＲＮアーゼ活性を、Ｒｏｉｚ，Ｌ．ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔ．Ｓｃｉ．１２５（１）巻９−１４頁２０００年に記載されているようにして試験した。
【０１６８】
浸透マイクロポンプによる、ＲＮアーゼＢ１の結腸への投与：
ＲＮアーゼＢ１を浸透マイクロポンプ（ＡＬＺＥＴ）に注入した。そのポンプをラット腹部の皮下に移植した。その浸透ポンプは、ラット結腸の容積が約４ｍｌであると想定して、結腸中１０−６Ｍの計算濃度で少なくとも６週間、ＲＮアーゼＢ１を結腸にカテーテルによって一定量を放出した。ラットは次のように処置した。第一群のラットには、完全なＲＮアーゼ活性を有する「生の（ｌｉｖｅ）」ＲＮアーゼＢ１（ＲＮアーゼＢ１）が入っているポンプを移植した。第二群のラットには、オートクレーブによって不活性化されてＲＮアーゼ活性を欠いているＲＮアーゼＢ１（Ｉ−ＲＮアーゼＢ１）が入っているポンプを移植した。一方第三群のラットには、最初の２群にＲＮアーゼＢ１の媒体として使用したＰＢＳが入っているポンプを移植して、対照として利用した。
【０１６９】
ＲＮアーゼＢ１の可能な予防作用を検査するため、選ばれてＤＭＨで処置されたラットに、ＲＮアーゼＢ１を、最初にＤＭＨを注射した後、１〜９週間にわたって投与した。次いで、これらラットを殺し、それらラットの結腸を切り取り、ＰＢＳで洗い次に０．１Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有するＰＢＳで洗浄した。次にその結腸を縦方向に切開し、濾紙上で、４％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ内にて少なくとも１ｈｒ固定した。０．０２５％メチレンブルー含有ＰＢＳで染色した後、その結腸粘膜を、低倍率の顕微鏡によって異所性陰窩病巣（ａｂｅｒｒａｎｔ ｃｒｙｐｔ ｆｏｃｉ）（ＡＣＦ）について観察した。遠位（５ｃｍ）結腸のＡＣＦを計数した。
【０１７０】
ＲＮアーゼＢ１の治療作用を検査するため、残りのラットには、最初にＤＭＨを注射した後１２〜１７週にわたってＲＮアーゼＢ１を投与した。その結腸を切り取り、上記のようにして固定し、腫瘍を計数し、測定した。組織病理学的検査を行うため、各腫瘍をパラフィン内に埋包した。薄い（１０μｍ）切片を染色して悪性度を評価した。
【０１７１】
ＲＮアーゼＢ１の経口投与：
マイクロカプセルの製造：
Ｌｉｎ Ｊ．Ｊ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｎ．１４；２０４（１）１５６−１６２頁１９９４年に記載されている改変法で、マイクロカプセルを製造した。凍結乾燥されたＲＮアーゼＢ１ ０．６ｇとグルコース２．４ｇの混合物を、乳鉢と乳棒で十分に粉砕した。その微細粉末を、２００ｍｌの流動パラフィンと２ｍｌのＳｐａｎ−８０が入っている１Ｌビーカー中にそそぎ入れ、次いで６００ｒｐｍで２０分間撹拌した。アセトン−エタノール−酢酸ブタル酸セルロース（ＣＡＰ）溶液を、上記撹拌中の混合物に注意深く添加し（９：１のアセトン：９５％エタノール４０ｍｌ中に３．２ｇのＣＡＰ）、次にフード内でさらに２ｈｒ撹拌して痕跡のアセトンを除いた。そのマイクロカプセルを、３０ｍｌのエーテルを添加することによって硬化させ、次にブフナー漏斗を使って濾紙上で乾燥し、次いで痕跡の流動パラフィンを、３０ｍｌのエーテルによる追加の洗浄２回によって除いた。そのマイクロカプセルを一夜乾燥し、微細なメッシュを通過させた。大部分のマイクロカプセルは２００〜５００μｍであった。
【０１７２】
予備実験で（図１８）、ＣＡＰのマイクロカプセルは、胃の環境に相当する酸性ｐＨでは不溶性であることが分かった。しかし、アルカリ性ｐＨ中、１ｈｒ後に、最高のＲＮアーゼ活性に到達した。これはそのマイクロカプセルが、その内容物を、腸において容易に放出できることを示している。
【０１７３】
ＲＮアーゼＢ１のマイクロカプセルの経口投与：
ＲＮアーゼＢ１を含有するマイクロカプセルまたはグルコースをプラセボとして含有するマイクロカプセルを、粉砕したピューリナ（Ｐｕｒｉｎａ）の固形飼料と混合した。ＲＮアーゼＢ１で処置されたラットは各々毎日、ＲＮアーゼＢ１ １．６ｍｇの投与量で投与され、結腸の最終濃度が１０−５Ｍに到達した。経口投与の実験の詳細は、試験終了を遅らせて（１１週間）、ＲＮアーゼＢ１の予防効果を評価したことを除いて、マイクロポンプによる投与について先に述べたのと同じであった（図１７）。
【０１７４】
実験結果
ラットの成長速度に対する異なる処置の効果：
ラットの初期重量は約２００ｇであった。実験は、上記のように各処置について異なる時間で終了した。ラットは、一般に、約４００〜５００ｇの最終体重に到達したが、異なる処置間に有意差はなかった（図１９ａ〜ｄ）。しかし、ＤＭＨで処置した群は、ＤＭＨの存在下または非存在下でＲＮアーゼＢ１で処置した群に比べて、体重がわずかに低下した。
【０１７５】
ラット糞便中のＲＮアーゼ活性：
図２０ａ〜ｃは、予防モード（図１）で８週間にわたって、ＲＮアーゼＢ１、Ｉ−ＲＮアーゼＢ１またはＰＢＳが入っている浸透ポンプを移植されたラットの糞便のＲＮアーゼ活性の変化を示す。ＲＮアーゼＢ１で処置されたラットの場合（図２０ａ）、糞便中のＲＮアーゼ活性は、Ｉ−ＲＮアーゼＢ１で処置されたラット（図２０ｂ）またはＰＢＳで処置されたラット（図２０ｃ）の場合の５倍であった。この活性は、５週間にわたって高く維持され、次いでポンプ中のＲＮアーゼＢ１の貯槽のＲＮアーゼＢ１が消費されるにつれて徐々に減少した。基礎的内因性（ｂａｓａｌ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ＲＮアーゼ活性が、前記後者二つの群の糞便中に観察された。
【０１７６】
マイクロカプセル化したＲＮアーゼＢ１を与えられたラットには、同様のパターンが観察されたが、グルコースだけを含有するマイクロカプセルを与えられたラットと比べて、８倍もの高いＲＮアーゼ活性が検出された（図２１）。この実験において、ＲＮアーゼの活性が徐々に減少するのは、ラットの体重が増加しその結果、結腸の容積が増大したためであると説明できる。
【０１７７】
予防剤としてのＲＮアーゼＢ１の作用：
ポンプを移植されたラットは、ポンプの部位に感染が観察されたので、８週間後に殺した。この段階ではＡＣＦのみがみとめられた。ＡＣＦは、発癌の開始相中のラット結腸の発癌性変化の代理のバイオマーカーである。陰窩（ｃｒｙｐｔａｅ）の杯細胞はより大きくなり、通常の粘膜細胞に比べて強く染色された。ＡＣＦの計数値は、ＲＮアーゼＢ１またはＩ−ＲＮアーゼＢ１で処置した場合、劇的に減少した（図２２）。結腸粘膜に対する損傷作用は、ＤＭＨなしで、ＲＮアーゼＢ１またはＩ−ＲＮアーゼＢ１で処置したラットには全く観察されなかった。
【０１７８】
マイクロカプセル化ＲＮアーゼＢ１を与えられたラットの場合、実験は、ＤＭＨを最初に投与した後、１１週間続けた。その時点で、腫瘍とＡＣＦの両方が存在していた。ＲＮアーゼＢ１は、対照と比べて、腫瘍の数／結腸（図２３ａ）、腫瘍の大きさ（図２３ｂ）およびＡＣＦの数（図２３ｃ）を減少させた。
【０１７９】
さらに、結腸腫瘍の色の多様性が観察された。すなわち、強力に血液を供給された赤色の腫瘍（図２４ａ）、ほとんど血管を欠いている白色の腫瘍（図２４ｂ）、およびごく少数の血管を有する「ピンク」色の腫瘍（図２４ｃ）が観察された。グルコースで処置したラットの腫瘍はすべて赤色であった。一方、ＲＮアーゼＢ１で処置されたラットは、赤みを帯びた腫瘍の数が有意に減少するのを観察され（図２４ｄ）、腫瘍の１０％がピンク色で５０％が白色であった。これらの試験結果は、ＲＮアーゼＢ１の抗血管新生作用を明確に示している。
【０１８０】
腫瘍は、組織病理学的パラメータによって、良性であるかまたは悪性であるかを識別することもできる。アデノーマと呼ばれる良性腫瘍（図２５ａ）は、増殖した粘膜層によって、そして時にはアデノパピローマの発育によって形成されるが、その粘膜下組織は、無傷であり、他の結腸層に対し輪郭がはっきりしている。腺癌と呼ばれる悪性腫瘍の場合、粘膜細胞が、粘膜下組織の下側につきぬけて、結局、組織の配列が失われる（図２５ｂと２５ｃ）。グルコースまたはＲＮアーゼＢ１で予防のため処置したラットの異なるタイプの腫瘍の分布を検査した結果、ＲＮアーゼＢ１が悪性度を明確に低下したことが分かった（図９ｄ）。
【０１８１】
治療剤としてのＲＮアーゼＢ１の作用：
浸透ポンプによって直接に適用するかまたは経口で適用する方式の両方で、十分に発育した腫瘍を、実験の１２〜１７週間中、ＲＮアーゼＢ１に暴露した。浸透ポンプによって処置したラットに対し、ＲＮアーゼＢ１は腫瘍の数／結腸を減少させた（図２６ａ）。対照に比べて約５０％の阻害作用は、Ｉ−ＲＮアーゼＢ１で処置したラットの場合、最も有意であった。
【０１８２】
ＲＮアーゼＢ１は、大きさの分布によって立証されているように腫瘍の増殖に影響した（図２６Ｂ）。一般に大部分の腫瘍は、直径が３〜５ｍｍであったが、ＰＢＳで処理されたラットの場合、９〜１２ｍｍを越える例外的に大きい腫瘍が出現した。この試験結果は、ＲＮアーゼＢ１が既存の腫瘍の発育を阻害または阻止することを暗示している。しかし、ＲＮアーゼＢ１とＩ−ＲＮアーゼＢ１の作用の間に有意差は全く観察されなかった。
【０１８３】
ＲＮアーゼＢ１の予防作用の実験の場合と同様に、血管新生のパターンも、浸透ポンによって適用されたＲＮアーゼＢ１によって影響を受ける（図２６ｃ）。ＰＢＳで処置されたラットの大部分の腫瘍約８０％が赤色であった。対照的に、ＲＮアーゼＢ１で処置されたラットとＩ−ＲＮアーゼＢ１で処置されたラットの両者は、腫瘍の３０％しか赤色でなかったが、一方、残りの腫瘍はピンク色もしくは白色であった。ＲＮアーゼＢ１は、既存の腫瘍の血管新生を減らすことも明らかであった。
【０１８４】
カプセル化されたＲＮアーゼＢ１を与えられたラットの場合、処置の作用は、浸透ポンプで得た作用より有意性は小さかった（図２７ａ〜ｃ）。この結果は、タンパク質のごく少部分が結腸に到達すると想定することによって説明される。先に述べたように、マイクロカプセルは実際に胃を通過するが、さらに、小腸や盲腸を通る長い経路がある。したがって、この仮説を試験する実験を、蛍光タンパク質を負荷したＣＡＰマイクロカプセルを使用しラットに与えて実施した。これらラットは６ｈｒ後に殺し、これらラットの胃腸管の内容物を、蛍光顕微鏡で観察した。マイクロカプセルは、十二指腸内で溶解し始めることが発見された。その溶解はさらに回腸や空腸で行われる。マイクロカプセルが盲腸に到達すると、その蛍光の大部分は盲腸の内容物中に拡散した。マイクロカプセルが損傷すると、ＲＮアーゼＢ１の作用は、腸や盲腸内に存在するプロテアーゼのために低下する。
【０１８５】
経口投与されたＲＮアーゼＢ１は、既存の腫瘍の数と大きさを小さくしなかった事実があるにもかかわらず、腫瘍の色の種類の分布はわずかに影響を受けた（図２７ｃ）。グルコースで処置したラットおよびＲＮアーゼＢ１で処置したラットはそれぞれ、赤色の腫瘍が約６０％と４０％であった。本発明の配合で経口投与されたＲＮアーゼＢ１は血管新生にも影響するが、中位の影響であるようである。
【０１８６】
実施例５
ヒトＨＴ−２９結腸癌細胞に対するＲＮアーゼＢ１の生体外での作用
材料と実験方法
細胞増殖の条件：
実験はすべて、ヒト直腸腺癌（ＨＴ−２９）細胞で実施した。これらの細胞は、１０％ウシ胎仔血清、１％グルタミンおよび１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｉｃｏｔｉｃ溶液（Ｂｉｏｌａｂ）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｂｅｔ Ｈａｅｍｅｋ）が入っている５０ｍｌフラスコ中で増殖させた。その細胞をトリプシンで処理し、５×１０４個の細胞を含有する２ｍｌの培地を、６ウェルプレートの各ウェルにプレートした。いくつかのプレートは、ＲＮアーゼＢ１を、最終濃度１０−６Ｍまで補充した。その細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿大気中、３７℃でインキュベートした。４８ｈｒ後、ＲＮアーゼＢ１が存在しているかまたは存在していない培地をそれぞれ十分に取り換えて、成分とＲＮアーゼＢ１の一定の供給を維持した。４日後、培地を除き、細胞培養物を、４％ホルムアルデヒド含有のＰＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４）ｐＨ７．２中で１５分間氷上にて固定した。それら細胞を異なる目的のために、以下のように染色した。
【０１８７】
細胞内アクチンの直接染色：
細胞をＰＢＳで洗浄し、次に０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）内で１ｈｒ室温にて透過性にした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞は、アクチンを、１０−６ＭのテトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）で標識化したファロイジン（Ｓｉｇｍａ）で、１ｈｒ染色し、ＰＢＳ中で４℃にて一夜静置して過剰の染色材料を除いた。細胞を、スライドガラス上の水中に広げ、Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＬＳＭ）５１０（Ｚｅｉｓｓ）を使用して可視化した。
【０１８８】
細胞膜アクチンの免疫染色：
細胞をホルムアルデヒドで固定し、上記のようにしてＰＢＳで洗浄し次いでＰＢＳで１：５００の比率で希釈したウサギ抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。次にその細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＰＢＳで１：１００の比率で希釈）とともに、さらに１ｈｒ、同じ条件でインキュベートし、再び洗浄し、次に上記のようにして可視化した。
【０１８９】
細胞表面上のＲＮアーゼＢ１の免疫染色：
ポリクローナル抗体（Ａｍｉｎｏｌａｂ、イスラエル）をウサギ内で精製ＲＮアーゼＢ１に対して発生させた。上記の手順にしたがって、ＨＴ−２９を免疫染色する際の一次抗体として、抗−ＲＮアーゼＢ１を使用した。
【０１９０】
実験結果
細胞内アクチンの直接染色：
ＲＮアーゼＢ１なしで増殖している対照細胞に、微細なアクチンネットワークが、ＴＲＩＴＣで染色されて観察され、細胞の細胞質を満たしていた。うすい染色が膜の表面に観察された（図２８ａ）。対照的に、ＲＮアーゼＢ１で処置された細胞の場合、各細胞の膜および細胞質の周辺領域は強く染色された（図２８ｂ）。これは、ＲＮアーゼＢ１の外部添加に対する反応としてのアクチンネットワークの再発列を示している。
【０１９１】
細胞膜アクチンの免疫染色：
ＦＩＴＣ−免疫染色したところ、対照細胞の細胞膜領域にアクチンの微小蛍光スポットが見つかった（図２９ａ）。この結果は図２８ａに示したＴＲＩＴＣ染色と一致している。この実験では、界面活性剤は全く使わなかったので、抗体は、細胞の細胞質中にほとんど浸透しなかった。それ故、これらの細胞では、細胞膜アクチンは外部環境と相互に作用する。ＲＮアーゼＢ１で処理された細胞に、非常に弱い免疫染色が観察されたが（図２９ｂ）、これは、細胞膜アクチンにすでに結合していたＲＮアーゼＢ１が抗アクチン抗体の結合を阻害したことを暗示している。
【０１９２】
ＲＮアーゼＢ１で処置されていない追加の細胞を、予め混合したウサギ抗アクチンと１μＭアクチンとともにインキュベートした。図２９ｂで述べたのと同様の微弱の蛍光が観察された（図示せず）。自発的なＦＩＴＣ蛍光の起こる可能性をなくすために、細胞を、抗アクチンを省略したことを除いて先に述べたように処置した。蛍光染色は全く検出されなかった。
【０１９３】
細胞面上のＲＮアーゼＢ１の免疫染色：
非常に微弱なＦＩＴＣ蛍光が、抗ＲＮアーゼＢ１とともにインキュベートした対照細胞に出現した（図３０ａ）。しかし、ＲＮアーゼＢ１で処理した細胞は強い蛍光反応を示した（図３０ｂ）。この試験結果は、ＲＮアーゼＢ１が、細胞表面上、特に細胞の端縁と延長部分に有意に存在していることを示している。抗ＲＮアーゼＢ１の代わりに、ウサギの免疫前血清（ＰＩＳ）で処置したところ、非常に弱い傾向を生じた（図３０ｃ）。
【０１９４】
実施例６
ユリ花粉管の成長に対するＩＡＣ−ＲＮアーゼＢ１の作用
材料と実験方法
ＲＮアーゼＢ１のヨードアセチル化：
ＲＮアーゼＢ１のヨードアセチル化をＩｒｉｅ Ｍ，ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９（３）巻６２７−６３３頁１９８６年の方法で実施した。ＲＮアーゼＢ１を、０．１Ｍのヨード酢酸を含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液２．５ｍｌに溶解して、１０ｎＭの最終濃度にした。３７で一夜インキュベートした後、タンパク質を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラムで脱塩した。タンパク質を含有する画分を集め、水に対して強く透析した。凍結乾燥を行った後、１０ｍｇのタンパク質を得た。ヨードアセチル化（ＩＡｃ−）ＲＮアーゼＢ１のＲＮアーゼ活性を、修飾されていないＲＮアーゼＢ１と比較した。
【０１９５】
ユリの花粉管に対するＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１の作用：
凍結乾燥されたＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１を、７％スクロース、１．２７ｍＭ Ｃａ（ＮＯ３）２、０．１６ｍＭ Ｈ３ＢＯ３、１ｍＭ ＫＮＯ３および３ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４を水中に含有するユリ花粉管の成長培地中に、１または５μＭの最終濃度まで溶解した（Ｙｏｋｏｔａ，Ｅ．およびＳｈｉｍｍｅｎ，Ｔ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ １７７巻１５３−１６２頁１９９４年）。ユリ（リリウム・ロンギフロルム）の花粉粒を、花粉管の入っている１００μｌの増殖培地で、１０−６ＭのＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１ありまたはなしで、生体外で発芽させた。追加の対照として、ユリの花粉を、同じ濃度のＲＮアーゼＢ１またはＢＳＡを含有する増殖培地で発芽させた。暗所にて２５℃にて１．５ｈｒインキュベートした後、各処置の花粉管の長さを光学顕微鏡で測定した。
【０１９６】
実験結果
ＲＮアーゼＢ１のヨードアセチル化：
ヨード酢酸は、ＲＮアーゼの活性部位のヒスチジン残基に結合することによって、ＲＮアーゼの活性を阻害する。ＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１のＲＮアーゼ活性は、処置されていないＲＮアーゼＢ１と比べて９０％小さかった。
【０１９７】
ユリ花粉管の成長に対するＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１の作用：
対照のユリ花粉管は、０．２６ｍｍの長さに到達する（図３１）。ＢＳＡは、花粉管に対して細胞傷害作用がないので、この実験では、ＢＳＡを対照として使用した。ＢＳＡは、１０−６Ｍの濃度で実際に、花粉管の成長に対し有意な作用はなかった。５×１０−６ＭのＢＳＡの阻害作用は、花粉管が、成長培地の浸透ポテンシャルの変化に対し敏感であるという事実の結果と説明できる。ＲＮアーゼＢ１とＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１は、花粉管の成長に対し明確な阻害作用を示した。両方の濃度で、ＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１の方がＲＮアーゼＢ１より有効であったが、その差は有意でなかった。このように、ユリの花粉管の場合、ＩＡｃ−ＲＮアーゼＢ１は修飾されていないＲＮアーゼＢ１の類似の方式で花粉管の成長を阻害する。このことはＲＮアーゼ活性の損失がその阻害作用を低下させないことを示している。
【０１９８】
本発明をその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの変形と変化が当業技術者にとって明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内にあるかような変形と変化すべてを含むものである。本明細書にあげられているすべての刊行物、特許、特許願および受託番号で識別されている配列は、あたかも個々の刊行物、特許、特許願または配列が具体的にかつ個々に本願に参照して組みこまれているのと、同程度に本発明に援用するものである。さらに、本願に文献を引用することは、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要のある被検者において異常に増殖する細胞の増殖、定着および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転させるための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項２】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼが、リボ核酸分解活性を欠いている請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性が、沸騰、オートクレーブ処理および化学的変性からなる群から選択される方法によって不活性化される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記異常に増殖する細胞が腫瘍細胞である請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記腫瘍細胞が癌性細胞である請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記腫瘍細胞が、乳頭腫、ブラストグリオーマ、カポジ肉腫、黒色腫、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星細胞腫、頭部癌、頸部癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病、およびバーキット病からなる群から選択される増殖性の障害または疾患に関連する細胞である請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記異常に増殖する細胞が、関節炎、リウマチ様関節炎、糖尿病網膜症、再狭窄、イン−ステント再狭窄および移植血管再狭窄からなる群から選択される障害または疾患に関連する細胞である請求項１または２に記載の使用。
【請求項８】
前記薬剤が、経口投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与および吸入による投与からなる群から選択された投与方法のために処方されている請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼがＲＮアーゼＢ１である請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼが、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼＲｈ、ＲＮアーゼＭ、ＲＮアーゼＴｒｖ、ＲＮアーゼＩｒｐ、ＲＮアーゼＬｅ２、ＲＮアーゼＰｈｙｂ、ＲＮアーゼＬＥ、ＲＮアーゼＭＣ、ＲＮアーゼＣＬ１、ＲＮアーゼＢｓｐ１、ＲＮアーゼＲＣＬ２、ＲＮアーゼＤｍ、ＲＮアーゼＯｙおよびＲＮアーゼＴｐからなる群から選択される請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
必要のある被検者において腫瘍血管新生を阻害するための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項１２】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼが、リボ核酸分解活性を欠いている請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性が、沸騰、オートクレーブ処理および化学的変性からなる群から選択される方法によって不活性化される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が癌性腫瘍である請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記腫瘍が、乳頭腫、ブラストグリオーマ、カポジ肉腫、黒色腫、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星細胞腫、頭部癌、頸部癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病、およびバーキット病からなる群から選択される障害または疾患に関連する腫瘍である請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記薬剤が、経口投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与および吸入による投与からなる群から選択された投与方法のために処方されている請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼがＲＮアーゼＢ１である請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼが、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼＲｈ、ＲＮアーゼＭ、ＲＮアーゼＴｒｖ、ＲＮアーゼＩｒｐ、ＲＮアーゼＬｅ２、ＲＮアーゼＰｈｙｂ、ＲＮアーゼＬＥ、ＲＮアーゼＭＣ、ＲＮアーゼＣＬ１、ＲＮアーゼＢｓｐ１、ＲＮアーゼＲＣＬ２、ＲＮアーゼＤｍ、ＲＮアーゼＯｙおよびＲＮアーゼＴｐからなる群から選択される請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
必要のある被検者において腫瘍の発育を予防し、阻害しおよび／または逆転させるための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項２０】
必要のある被検者において良性腫瘍の悪性腫瘍への転換を予防し、阻害しおよび／または逆転させるための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項２１】
必要のある被検者において個々の腫瘍の数を減らすための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項２２】
必要のある被検者において腫瘍の大きさを小さくするための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項２３】
必要のある被検者において悪性腫瘍の数を減らすための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項２４】
前記腫瘍が悪性腫瘍である請求項４，１１，１９および２１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
前記腫瘍が良性腫瘍である請求項４，１１，１９および２１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１】
必要のある被検者において異常に増殖する細胞の増殖、定着および／または発育を予防し、阻害しおよび／または逆転させるための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項２】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼが、リボ核酸分解活性を欠いている請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性が、沸騰、オートクレーブ処理および化学的変性からなる群から選択される方法によって不活性化される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記異常に増殖する細胞が腫瘍細胞である請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記腫瘍細胞が癌性細胞である請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記腫瘍細胞が、乳頭腫、ブラストグリオーマ、カポジ肉腫、黒色腫、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星細胞腫、頭部癌、頸部癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病、およびバーキット病からなる群から選択される増殖性の障害または疾患に関連する細胞である請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記異常に増殖する細胞が、関節炎、リウマチ様関節炎、糖尿病網膜症、再狭窄、イン−ステント再狭窄および移植血管再狭窄からなる群から選択される障害または疾患に関連する細胞である請求項１または２に記載の使用。
【請求項８】
前記薬剤が、経口投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与および吸入による投与からなる群から選択された投与方法のために処方されている請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼがＲＮアーゼＢ１である請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼが、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼＲｈ、ＲＮアーゼＭ、ＲＮアーゼＴｒｖ、ＲＮアーゼＩｒｐ、ＲＮアーゼＬｅ２、ＲＮアーゼＰｈｙｂ、ＲＮアーゼＬＥ、ＲＮアーゼＭＣ、ＲＮアーゼＣＬ１、ＲＮアーゼＢｓｐ１、ＲＮアーゼＲＣＬ２、ＲＮアーゼＤｍ、ＲＮアーゼＯｙおよびＲＮアーゼＴｐからなる群から選択される請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
必要のある被検者において腫瘍血管新生を阻害するための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項１２】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼが、リボ核酸分解活性を欠いている請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼのリボ核酸分解活性が、沸騰、オートクレーブ処理および化学的変性からなる群から選択される方法によって不活性化される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が癌性腫瘍である請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記腫瘍が、乳頭腫、ブラストグリオーマ、カポジ肉腫、黒色腫、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、星細胞腫、頭部癌、頸部癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、ホジキン病、およびバーキット病からなる群から選択される障害または疾患に関連する腫瘍である請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記薬剤が、経口投与、局所投与、経粘膜投与、非経口投与、直腸投与および吸入による投与からなる群から選択された投与方法のために処方されている請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼがＲＮアーゼＢ１である請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記Ｔ２ファミリーのリボヌクレアーゼが、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼＲｈ、ＲＮアーゼＭ、ＲＮアーゼＴｒｖ、ＲＮアーゼＩｒｐ、ＲＮアーゼＬｅ２、ＲＮアーゼＰｈｙｂ、ＲＮアーゼＬＥ、ＲＮアーゼＭＣ、ＲＮアーゼＣＬ１、ＲＮアーゼＢｓｐ１、ＲＮアーゼＲＣＬ２、ＲＮアーゼＤｍ、ＲＮアーゼＯｙおよびＲＮアーゼＴｐからなる群から選択される請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
必要のある被検者において腫瘍の発育を予防し、阻害しおよび／または逆転させるための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項２０】
必要のある被検者において良性腫瘍の悪性腫瘍への転換を予防し、阻害しおよび／または逆転させるための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項２１】
必要のある被検者において個々の腫瘍の数を減らすための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項２２】
必要のある被検者において腫瘍の大きさを小さくするための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項２３】
必要のある被検者において悪性腫瘍の数を減らすための薬剤の製造のための、アクチン結合活性および２４〜３６ｋＤａの分子量を有するＴ２ファミリーのリボヌクレアーゼの使用。
【請求項２４】
前記腫瘍が悪性腫瘍である請求項４，１１，１９および２１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
前記腫瘍が良性腫瘍である請求項４，１１，１９および２１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９ａ−１９ｂ】
【図１９ｃ−１９ｄ】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９ａ−１９ｂ】
【図１９ｃ−１９ｄ】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【公開番号】特開２０１１−２５１９７１（Ｐ２０１１−２５１９７１Ａ）
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４９８４９（Ｐ２０１１−１４９８４９）
【出願日】平成２３年７月６日（２０１１．７．６）
【分割の表示】特願２００１−５１９７６０（Ｐ２００１−５１９７６０）の分割
【原出願日】平成１２年８月２９日（２０００．８．２９）
【出願人】（５９２１６９３３４）イッサム・リサーチ・ディベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブルー・ユニバーシティ・オブ・エルサレム (2)
【氏名又は名称原語表記】ＹＩＳＳＵＭ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＣＯＭＰＡＮＹ ＯＦ ＴＨＥ ＨＥＢＲＥＷ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＪＥＲＵＳＡＬＥＭ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月１５日（２０１１．１２．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月６日（２０１１．７．６）
【分割の表示】特願２００１−５１９７６０（Ｐ２００１−５１９７６０）の分割
【原出願日】平成１２年８月２９日（２０００．８．２９）
【出願人】（５９２１６９３３４）イッサム・リサーチ・ディベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブルー・ユニバーシティ・オブ・エルサレム (2)
【氏名又は名称原語表記】ＹＩＳＳＵＭ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＣＯＭＰＡＮＹ ＯＦ ＴＨＥ ＨＥＢＲＥＷ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＪＥＲＵＳＡＬＥＭ
【Ｆターム（参考）】
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