四重トランスジェニック非ヒト動物
本発明は、ゲノムが、ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはヒトＡＰＰロンドン型タンパク質をコードする第一のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のトランスジェニックＤＮＡ配列；ｂ）Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質をコードする第二のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第二のプロモーターに作動可能に連結された第二のトランスジェニックＤＮＡ配列；ｃ）アミロイドペプチドに対する抗体の軽鎖をコードする第三のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第三のプロモーターに作動可能に連結された第三のトランスジェニックＤＮＡ配列および；ｄ）該抗体の重鎖をコードする第四のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第三のプロモーターまたは第四のプロモーターに作動可能に連結された第四のトランスジェニックＤＮＡ配列を含むトランスジェニック非ヒト動物、ならびに該動物の作製法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶消失および認知機能減退を特徴とする神経変性疾患である。ＡＤの有病率は、６５歳を過ぎると５年ごとに約２倍に増加する。全体的に見て、６５歳を超えた者の約５〜１０％が罹患している。ＡＤの臨床診断は、依然として除外診断である。脳の死後顕微鏡観察のみがアミロイド−β（Ａ−β）ペプチド原線維を含む細胞外の斑および重合したリン酸化タウタンパク質を含む細胞内濃縮体の存在に基づく確定診断を提供する。大部分の場合で、ＡＤは高齢期発症型および孤発型で起こる。早期発症型家族性ＡＤは症例の少数派に相当するが、疾患メカニズムの理解の進歩に極めて重要とされてきた。公知の突然変異は、コドン６７０／６７１（Ｋ６７０＋ＮおよびＭ６７１＋Ｌ）に及ぶスウェーデン変異（ＳＦＡＤ）およびＡＰＰのコドン７１７に及ぶロンドン変異である。全てのこれらの突然変異はＡＰＰのタンパク質分解性プロセシングに影響を及ぼし、アミロイド形成性がより大きいペプチドを生じる。
【０００２】
ＡＰＰは、少なくとも三つのセクレターゼ、すなわちα−、β−およびγ−セクレターゼによりプロセシングすることができる。β−セクレターゼは、メチオニン６７１（ＡＰＰ７７０の付番）の後でＡＰＰを切断し、１２kdの保持された膜カルボキシ末端フラグメントを導くことによりＡ−βペプチドの発生を開始する。次に、１２ｋｄのフラグメントは、疎水性膜貫通ドメイン内でγ−セクレターゼの切断を受けて４０、４２または４３残基のＡ−βペプチドを放出しうる（Seubert P, Vigo-Pelfrey C, Esch F, Lee M, Dovey H, Davis D, Sinha S, Schlossmacher M, Whaley J, Swindlehurst C. Isolation and quantification of soluble Alzheimer's beta-peptide from biological fluids. Nature. 1992. 359: 325-7）。
【０００３】
ＡＤに関する現行の処置は、わずかな症状の軽減を提供する。感受性の個体における病状経過を減速させ、そして疾患を予防または遅延させる疾患修飾剤のまだ対処されていない高い必要性がある。そのような薬剤の開発は、とりわけ疾患の分子的基盤の理解および動物モデルの開発に進歩を必要とする。
【０００４】
ＡＤに関係するタンパク質を過剰発現しているいくつかのトランスジェニック系統、例えばＡＰＰロンドンおよびβ−セクレターゼを過剰発現しているダブルトランスジェニックマウスが公知である。
【０００５】
本発明は、ゲノムが、ａ）アルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤ型病態に関連する突然変異を含むヒトＡＰＰタンパク質をコードする第一のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のトランスジェニックＤＮＡ配列；
ｂ）アルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤ型病態に関連する突然変異を含むヒトプレセニリン２タンパク質をコードする第二のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第二のプロモーターに作動可能に連結された第二のトランスジェニックＤＮＡ配列；
ｃ）アミロイドペプチドに対するヒト抗体の軽鎖をコードする第三のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第三のプロモーターに作動可能に連結された第三のトランスジェニックＤＮＡ配列；および
ｄ）該ヒト抗体の重鎖をコードする第四のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第四のプロモーターまたは第三のプロモーターに作動可能に連結された第四のトランスジェニック
を含む、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【０００６】
「アルツハイマー病（ＡＤ）の病態」という用語は、例えばニューロンのシナプス密度およびシナプス数の損失、認知能力の減少、ならびに記憶消失などの、ＡＤ患者における病態変化を表す。それらは、脳に散在性老人斑もまた含み、それらはアミロイドβペプチド、ニューロンおよび／もしくはグリア細胞の封入体、または抗Ａβ抗体で陽性染色される不溶性沈着物から主に構成される。
【０００７】
特に本発明は、ゲノムが、
ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはヒトＡＰＰロンドン型タンパク質をコードする第一のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のトランスジェニックＤＮＡ配列；
ｂ）Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質をコードする第二のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第二のプロモーターに作動可能に連結された第二のトランスジェニックＤＮＡ配列；
ｃ）ヒトアミロイドペプチドに対するヒト抗体の軽鎖をコードする第三のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第三のプロモーターに作動可能に連結された第三のトランスジェニックＤＮＡ配列；および
ｄ）該ヒト抗体の重鎖をコードする第四のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第三のプロモーターまたは第四のプロモーターに作動可能に連結された第四のトランスジェニック
を含む、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【０００８】
本発明は、また、同じまたは別の遺伝子型との繁殖によって得られた、本発明により提供されるようなトランスジェニック非ヒト動物の子孫に関する。好ましくは、その子孫は同じ遺伝子型との繁殖により得られる。該子孫は、上記四重非ヒト動物と同じトランスジェニックＤＮＡ配列を含む。
【０００９】
さらに本発明は、上記の四重非ヒトトランスジェニック動物またはその子孫から得られる細胞系または初代細胞培養物に関する。
【００１０】
加えて本発明は、また、上記の非ヒトトランスジェニック動物またはその子孫から得られる組織もしくは器官移植片またはそれらの培養物を提供する。
【００１１】
本発明は、また、上記の非ヒトトランスジェニック動物またはその子孫から得られる組織または細胞抽出物を提供する。
【００１２】
本発明は、また、ゲノムがヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、ならびにβアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードするトランスジェニックＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト動物を発生させるための方法を提供し、その方法は、
ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型をコードする該第一のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物、およびＮ１４１Ｉ置換を有するヒトプレセニリン２タンパク質をコードする第二のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること；
ｂ）アミロイドペプチドに対するヒト抗体の軽鎖をコードする第三のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物および該ヒト抗体の重鎖をコードする第四のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること、
ｃ）ａ）およびｂ）のトランスジェニック動物を交配すること
により、ゲノムがヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、βアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードするトランスジェニックＤＮＡを含む四重トランスジェニック非ヒト動物を作製することを含む。
【００１３】
または、上記方法の工程ｃ）において、第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列が同じ構築物上にあってもよい。
【００１４】
本発明は、また、ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質ならびにβアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖を発現するトランスジェニック非ヒト動物を発生させるための方法を提供し、その方法は、
ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型をコードする該第一のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物、およびＮ１４１Ｉ置換を有するヒトプレセニリン２タンパク質をコードする第二のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第二のプロモーターに作動可能に連結された第二のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること；
ｂ）ヒトアミロイドペプチドに対するヒト抗体の軽鎖をコードする第三のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第三のプロモーターに作動可能に連結された第三のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物および該ヒト抗体の重鎖をコードする第四のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第四のプロモーターに作動可能に連結された第四のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、および該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること、
ｃ）ａ）およびｂ）のトランスジェニック動物を交配することにより、ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、ならびにβアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖を発現する四重トランスジェニック非ヒト動物を作製することを含む。
【００１５】
または、上記方法の工程ｃ）において、第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列は、第三のプロモーターに作動可能に連結された同じ構築物上にあってもよい。
【００１６】
本発明は、さらに、上記方法により作製される四重トランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００１７】
ＡＰＰ
ＡＰＰは、アミロイド前駆体タンパク質を意味する。ＡＰＰのいくつかのｃＤＮＡ形態が、とりわけ三つの最も豊富に存在するアイソフォームＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０をコードするものが同定された。これらの形態は、選択的スプライシングにより単一の前駆体ＲＮＡから生じる。この遺伝子は、１８個のエキソンを有する１７５kb超に及ぶ（Yoshikai S, Sasaki H, Doh-ura K, Furuya H, Sakaki Y. Genomic organization of the human amyloid beta-protein precursor gene. Gene. 1990. 87(2):257-63）。ＡＰＰは、細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む。Ａ−βは、疎水性膜貫通ドメインのちょうど外側の最大２８個のアミノ酸およびこの膜貫通ドメインの最大１５個の残基から成る。このように、Ａ−βは、脳、ならびに心臓、腎臓および脾臓などの他の組織に通常見られるＡＰＰに由来する切断産物である。しかし、Ａ−βの沈着は、普通は脳にのみ豊富に見られる。比較的大きいＡＰＰの選択的形態（alternate form）（ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０）は、ＡＰＰ６９５および一つまたは二つの追加的なドメインから成る。ＡＰＰ７５１は、ＡＰＰ６９５の６９５個のアミノ酸およびKunitzファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤（ＫＰＩ）に相同性を有する追加的な５６個のアミノ酸から成る（Tanzi RE, McClatchey AI, Lamperti ED, Villa-Komaroff L, Gusella JF, Neve RL. Protease inhibitor domain encoded by an amyloid protein precursor mRNA associated with Alzheimer's disease. Nature. 1988. 331:528-30; Weidemann A, Konig G, Bunke D, Fischer P, Salbaum JM, Masters CL, Beyreuther K. Identification, biogenesis, and localization of precursors of Alzheimer's disease A4 amyloid protein. Cell. 1989 Apr 7; 57(1): 115-26. Kitaguchi N, Takahashi Y, Tokushima Y, Shiojiri S, Ito H. Novel precursor of Alzheimer's disease amyloid protein shows protease inhibitory activity. Nature. 1988. Feb ll;331(6156):530-2.; Tanzi RE, St George-Hyslop PH, Haines JL, Polinsky RJ, Nee L, Foncin JF, Neve RL, McClatchey AI, Conneally PM, Gusella JF. The genetic defect in familial Alzheimer's disease is not tightly linked to the amyloid beta-protein gene. Nature. 1987. 329 (6135): 156-7）。ＡＰＰ７７０は、ＡＰＰ７５１の７５１個のアミノ酸全ておよび神経細胞表面抗原ＯＸ−２に相同な追加的な１９個のアミノ酸ドメインを含む（Weidemann et al. 1989; Kitaguchi et al. 1988）。特に言及しない限り、本明細書に参照されるアミノ酸位置は、ＡＰＰ７０に出現する位置である。ＯＸ−２およびＫＰＩドメインの不在が原因で、ＡＰＰ６９５およびＡＰＰ７５１における同等の位置のアミノ酸番号は、場合により異なる。慣例により、全ての型のＡＰＰのアミノ酸位置は、ＡＰＰ７７０型での同等の位置により参照される。特に言及しない限り、本明細書ではこの慣例に従う。特に言及しない限り、本明細書に参照される全ての型のＡＰＰおよび全ての型のＡ−βを含むＡＰＰのフラグメントは、ヒトＡＰＰのアミノ酸配列に基づく。ＡＰＰは、リーダー配列の除去ならびに硫酸基および糖基の付加により翻訳後修飾される。「ＡＰＰ」という用語には、例えばＡＰＰスウェーデン型およびＡＰＰロンドン型などの突然変異ＡＰＰもまた含まれる。
【００１８】
アルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤ型病態に関連する突然変異を含むヒトＡＰＰタンパク質は、好ましくはＡＰＰスウェーデン型およびＡＰＰロンドン型である。
【００１９】
本明細書に使用されるような「ＡＰＰスウェーデン型」という用語は、Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ置換を含む上記と同義のＡＰＰアイソフォームを表す。好ましくは、ヒトＡＰＰスウェーデン型は、配列番号：１によりコードされる。
【００２０】
本明細書に使用されるような「ＡＰＰロンドン型」という用語は、Ａ−β４２ペプチドの特異的産生増加に向けたアミロイドペプチド産生に影響する一つまたは複数の天然または人工いずれかの突然変異を含む、上記と同義のＡＰＰアイソフォームを表す。下記などの、病理学的に関連するγ−セクレターゼ切断部位周辺の天然ＡＰＰ突然変異が好ましい。
【表１】
【００２１】
人工突然変異（Ａ−βドメイン外部の膜貫通領域中の全残基の置換）もまた好ましい。その例およびγ−セクレターゼ切断に及ぼすその結果は、Lichtenthalerおよび共同研究者ら（Lichtenthaler SF, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 16;96(6):3053-8）により記載されている。
【００２２】
さらに好ましくは、ヒトＡＰＰロンドン型は、天然Ｖ７１７Ｆ突然変異を含むヒトＡＰＰロンドン型である。最も好ましくは、ヒトＡＰＰロンドン型は配列番号：３によりコードされる。
【００２３】
好ましくは、第一のトランスジェニックＤＮＡ配列は、ヒトＡＰＰスウェーデン型をコードする。
【００２４】
プレセニリン２（ＰＳ２）
プレセニリン２（ＰＳ）は、γ−セクレターゼ複合体のタンパク質である。γ−セクレターゼは、ＡＰＰのプロセシングに関与する（図１参照）。
【００２５】
本明細書に使用されるような「プレセニリン２をコードするＤＮＡ配列」または「ＰＳ２遺伝子」という用語は、１９９５年６月２８日に提出された米国特許出願第０８／４９６，８４１号に最初に開示および記載され、その後Rogaevら（Nature. 1995; 376(6543):775-8）およびLevy Lahadら（Ann Neurol. 1995; 38(4):678-80）に記載された、任意の対立遺伝子変異体および異種特異的な哺乳動物ホモログを含めた哺乳動物遺伝子を表す。一つのヒトプレセニリン−２（ｈＰＳ２）ｃＤＮＡ配列は、本明細書に配列番号：９として開示されている。
【００２６】
「プレセニリン−２遺伝子」または「ＰＳ２遺伝子」という用語は、主にコード配列に関するが、フランキング調節領域および／またはイントロンの一部または全てもまた含みうる。ＰＳ２遺伝子という用語には、具体的に、スプライス変異体に基づくリコンビナント遺伝子を含めた、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから創出された人工またはリコンビナント遺伝子が含まれる。プレセニリン−２遺伝子は、Ｅ５−１遺伝子とも呼ばれてきた。
【００２７】
アルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤ型病態に関連する突然変異を含むヒトプレセニリン２タンパク質は、好ましくはＮ１４１Ｉ、Ｔ１２２Ｐ、Ｍ２３９ＶまたはＭ２３９Ｉ置換を有するヒトＰＳ２である（Shen et al., PNAS, 2007, 104(2):403-409）。さらに好ましくは、アルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤ型病態に関連する突然変異を含むヒトプレセニリン２タンパク質は、Ｎ１４１Ｉ置換を有するヒトＰＳ２である。
【００２８】
したがって、第二のトランスジェニックＤＮＡ配列は、好ましくはＮ１４１Ｉ置換を有するヒトＰＳ２をコードする。最も好ましくは、配列番号：１９をコードするＤＮＡ配列である。
【００２９】
抗体
抗体は、「Ｙ」形の分子であり、２本の重鎖および２本の軽鎖から成る。重鎖および軽鎖共に、異なる型およびサブタイプがある。各重鎖および各軽鎖は、定常領域および可変領域を有し、重鎖については定常領域のサイズの方が大きい。
【００３０】
「定常領域」または「Ｃ領域」という用語は、抗体分子の領域を表し、その領域は、同じ種の生物により産生される特異性の異なる抗体の対応する領域とほぼ同一である。同じ抗体クラス（アイソタイプ）の中で定常部は不変であり、特定の免疫グロブリンサブクラスのエフェクター機能を担う。Ｆｃフラグメントは、酵素パパインを用いた抗体の切断により発生する、定常領域の大部分を含む抗体フラグメントである。
【００３１】
本明細書に使用されるような「可変領域」という用語は、特異的抗原に結合する抗体分子の領域を表す。それは、重鎖および軽鎖の抗原結合部位の組合せから構成される。それは、異なるＢ細胞の免疫グロブリンの間で異なり、同じＢ細胞により産生される全ての免疫グロブリンに関して同じである。可変領域は、Ｂ細胞の成熟時に起こる遺伝子組換え過程により体細胞的に発生する。任意の所与の抗原に結合するために必要な莫大な多様性を創出するのは、そしてそのように外来及び病原性構造により提起される無数の抗原の重荷を免疫系が認識及び中和できるようにするのは、この再編成過程である。結果として、抗体プールは、同じＦｃ部を共有する一方で、異なるＶ領域の大きなレパートリーを担持する免疫グロブリンから構成される。
【００３２】
「フラグメント結合性抗原」または「Ｆａｂフラグメント」という用語は、抗原結合性可変領域を含む抗体フラグメントであって、酵素パパインを用いた抗体の切断によって発生する抗体フラグメントである。
【００３３】
本明細書に使用されるような「イディオタイプ領域」という用語は、各抗体型について独特な、抗体の可変領域の部分を表す。
【００３４】
第三のトランスジェニックヌクレオチド配列は、β−アミロイドペプチドに対する抗体の軽鎖をコードする。好ましくは、該抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。さらに好ましくは、該抗体は免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）である。最も好ましくは、該抗体は治療用抗体Ｍａｂ１１である（国際公開公報第０３／０７０７６０号）。
【００３５】
第四のトランスジェニックヌクレオチド配列は、β−アミロイドペプチドに対する抗体の重鎖をコードする。好ましくは、該抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。さらに好ましくは、該抗体は免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）である。最も好ましくは、該抗体は治療用抗体Ｍａｂ１１である（国際公開公報第０３／０７０７６０号）。
【００３６】
「β−アミロイドペプチド」または「Ａ−β」という用語は、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼによるＡＰＰ切断により産生されるペプチドを表す。そのペプチドは、３９〜４３個のアミノ酸を有する。それは、アルツハイマー病患者の脳におけるアミロイド斑の主構成成分である。好ましくは、β−アミロイドペプチドはヒトβ−アミロイドペプチドである。
【００３７】
好ましくは、第四のトランスジェニックヌクレオチド配列は、分泌抗体の重鎖をコードする。そのような好ましいＤＮＡ配列は、膜貫通ドメインをコードする配列を欠如している。
【００３８】
第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列は、一つのプロモーター（すなわち第三のプロモーター）と作動可能に連結されてもよいし、それぞれ別のプロモーターに作動可能に連結されてもよい（すなわち第三のトランスジェニックＤＮＡ配列は第三のプロモーターに作動可能に連結し、第四のＤＮＡ配列は第四のプロモーターに作動可能に連結される）。
【００３９】
プロモーター
本明細書に使用されるような「作動可能に連結された」という用語は、適切な転写活性化因子タンパク質が調節配列に結合している場合に、ＤＮＡ配列および調節配列が遺伝子発現を許すように連結していることを意味する。
【００４０】
本明細書に使用されるような「調節配列」という用語は、タンパク質発現をコントロールしているタンパク質に関する結合部位であるヌクレオチド配列を表す。調節配列は、例えばプロモーターまたはエンハンサーであってもよい。
【００４１】
本明細書に使用されるような「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子に結合して転写を開始する遺伝子の領域を表す。
【００４２】
本明細書に使用されるような「エンハンサー」という用語は、同じＤＮＡ分子上の最も近いプロモーターの活性を増加させることにより遺伝子転写速度を増加させるヌクレオチド配列を表す。
【００４３】
第一のプロモーターは、ニューロンに作動可能に連結されたＤＮＡを発現する任意のプロモーターであってもよい。第一のプロモーターは、遍在的プロモーターであってもよい。好ましくは、第一のプロモーターはニューロンのプロモーターである。さらに好ましくは、第一のプロモーターは脳特異的プロモーターである。
【００４４】
「組織特異的プロモーター」という用語は、組織特異的に、例えば脳組織、筋組織、肝臓組織、腎臓組織などにおける遺伝子発現をコントロールおよび指令するプロモーターを表す。脳特異的プロモーターは、脳組織における遺伝子発現をコントロールおよび指令するプロモーターである。最も好ましくは、第一のプロモーターはプリオン遺伝子のプロモーターである。
【００４５】
第一のプロモーターは、また、コントロール可能なプロモーターであってもよい。コントロール可能なプロモーターは、例えば特異的誘導因子またはリプレッサー物質の添加により調節および／または誘導可能なように導入遺伝子の発現をコントロールする任意のプロモーターであってもよい。いくつかの誘導性細菌プロモーターが当技術分野において公知である（Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H; Nat Biotechnol 1996; 14(4): 499-503; van der Neut R; Targeted gene disruption: applications in neurobiology; J Neurosci Methods 1997; 71(1): 19-27; Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su IJ, Chang TY; Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines. Biotechniques. 1998; 24(4): 624-8, 630-2）。
【００４６】
第二のプロモーターは、作動可能に連結されたＤＮＡをニューロンに発現する任意のプロモーターであってもよい。第一のプロモーターは、遍在的プロモーターであってもよい。好ましくは、第二のプロモーターはニューロンのプロモーターである。さらに好ましくは、第二のプロモーターは脳特異的プロモーターである。
【００４７】
「組織特異的プロモーター」という用語は、組織特異的に、例えば脳組織、筋組織、肝臓組織、腎臓組織などにおける遺伝子発現をコントロールおよび指令するプロモーターを表す。脳特異的プロモーターは、脳組織における遺伝子発現をコントロールおよび指令するプロモーターである。最も好ましくは、第二のプロモーターはＴｈｙ１．２糖タンパク質プロモーターである。
【００４８】
第二のプロモーターは、また、コントロール可能なプロモーターであってもよい。コントロール可能なプロモーターは、例えば特異的誘導因子またはリプレッサー物質の添加により調節および／または誘導可能なように導入遺伝子の発現をコントロールする任意のプロモーターであってもよい。いくつかの誘導性細菌プロモーターが当技術分野において公知である（Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H; Nat Biotechnol 1996; 14(4): 499-503; van der Neut R; Targeted gene disruption: applications in neurobiology; J Neurosci Methods 1997; 71(1): 19-27; Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su IJ, Chang TY; Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines. Biotechniques. 1998; 24(4): 624-8, 630-2）。
【００４９】
第三のプロモーターは、遍在的プロモーターまたはリンパ組織特異的プロモーターであってもよい。
【００５０】
好ましくは、第三のプロモーターは、ＭＨＣクラスＩ遺伝子のプロモーターである。同様に好ましくは、第三のトランスジェニックＤＮＡ配列は、エンハンサーと作動可能に連結される。さらに好ましくは、エンハンサーはＩｇＨエンハンサーである。
【００５１】
第三のプロモーターは、同様にコントロール可能なプロモーターであってもよい。コントロール可能なプロモーターは、例えば特異的誘導因子またはリプレッサー物質の添加により、調節および／または誘導可能なように導入遺伝子の発現をコントロールする任意のプロモーターでありうる。いくつかの誘導性細菌プロモーターが当技術分野において公知である（Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H; Nat Biotechnol 1996; 14(4): 499-503; van der Neut R; Targeted gene disruption: applications in neurobiology; J Neurosci Methods 1997; 71(1): 19-27; Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su IJ, Chang TY; Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines. Biotechniques. 1998; 24(4): 624-8, 630-2）。
【００５２】
第四のプロモーターは、遍在的プロモーターまたはリンパ組織特異的プロモーターでありうる。好ましくは、第四のプロモーターは、ＭＨＣクラスＩ遺伝子のプロモーターである。同様に好ましくは、第四のトランスジェニックＤＮＡ配列は、エンハンサーと作動可能に連結される。さらに好ましくは、エンハンサーはＩｇＨエンハンサーである。
【００５３】
第四のプロモーターは、同様にコントロール可能なプロモーターであってもよい。コントロール可能なプロモーターは、例えば特異的誘導因子またはリプレッサー物質の添加により、調節および／または誘導可能なように導入遺伝子の発現をコントロールする任意のプロモーターであってもよい。いくつかの誘導性細菌プロモーターが当技術分野において公知である（Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H; Nat Biotechnol 1996; 14(4): 499-503; van der Neut R; Targeted gene disruption: applications in neurobiology; J Neurosci Methods 1997; 71(1): 19-27; Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su IJ, Chang TY; Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines. Biotechniques. 1998; 24(4): 624-8, 630-2）。
【００５４】
トランスジェニック非ヒト動物は、それ自体の抗体もまた産生することから、ヒト重鎖および軽鎖は、内因性重鎖および軽鎖と混合されて混合型内因性／トランスジェニック抗体を形成しうる。マウスの場合、混合型マウス／ヒト抗体が形成しうる。ヒト重鎖および軽鎖がリンパ組織外で産生されるならば、内因性重鎖および軽鎖が存在しないことから、純粋なトランスジェニック抗体が形成するであろう。したがって、第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターは、好ましくはリンパ組織と非リンパ組織の両方に発現しているプロモーターである。
【００５５】
トランスジェニック動物／導入遺伝子の組込み
トランスジェニックＤＮＡ配列は、動物細胞の全てまたは一部に、特に生殖細胞に組込まれる。ゲノムへの組込みは、一過性または安定的でありうる。好ましくは、組込みは安定的である。
【００５６】
トランスジェニック動物は、第一、第二、第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列についてヘテロ接合性またはホモ接合性であってもよい。トランスジェニック動物は、一部のトランスジェニックＤＮＡ配列、例えば第一および第二のトランスジェニックＤＮＡ配列についてヘテロ接合性であり、残り、例えば第三および第四のＤＮＡ配列についてはホモ接合性でありうる。好ましくは、トランスジェニック動物は、少なくとも一つのトランスジェニックＤＮＡ配列についてホモ接合性である。
【００５７】
トランスジェニック動物は、任意の非ヒト動物であってもよい。好ましくは、非ヒトトランスジェニック動物は、哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスなどのげっ歯動物であり、最も好ましくは非ヒトトランスジェニック動物はマウスである。
【００５８】
トランスジェニック動物の作製
トランスジェニック非ヒト動物は、非ヒト動物であってもよい。好ましい非ヒト動物は哺乳動物である。さらに好ましくは、非ヒト動物はマウスまたはラットなどのげっ歯動物である。トランスジェニック非ヒト動物の作製法は、当技術分野で周知である。適切な方法は、すなわちHogan B., Beddington R., Costantini F. & Lacy E. Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual. 2nd Edition (1994). Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【００５９】
トランスジェニックタンパク質は、遍在的に発現しうる。好ましくは、第一および第二のトランスジェニックＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質は、ニューロンに発現する。さらに好ましくは、第一および第二のトランスジェニックＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質は、脳組織に発現する。好ましくは、第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質は、リンパ組織に発現する。さらに好ましくは、第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質は、リンパ組織および非リンパ組織の両方に発現する。
【００６０】
上記のトランスジェニック非ヒト動物は、遺伝的、分子的および行動的に分析することができる。
【００６１】
使用
上記の四重トランスジェニックマウスは、アルツハイマー病を治療するためのモデルまたはＡＤを予防するためのモデルとして使用することができる。それは、マウスＡＤモデルにおけるＡβアミロイドーシスの開始および過程にヒト抗Ａβ抗体が及ぼす効果を検討可能にする。トランスジェニック動物は、トランスジェニックヒトｍＡｂ１１抗体に対して免疫寛容であることから、例えばＭａｂ１１のような治療用抗体を用いた慢性処置の効果を判定することができる。また、可溶性Ａβレベルならびに血管アミロイドーシスの過程および動態に及ぼす効果をたどることができる。
【００６２】
さらに、上記の四重トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体を用いたアルツハイマー病の予防的処置の有効性および効果を判定するための興味深い道具である。
【００６３】
今回、本発明を全般的に説明したが、以下の図面と関連づけて具体的な実施例の参照により本発明がよりよく理解されよう。それらは、解説のために本明細書に含まれるのみであり、特に明記しない限り限定を意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＡＰＰのプロセシングの略図である。Ａ）アミロイド前駆体タンパク質。三つのセクレターゼの切断部位を表示する（α：αセクレターゼ、β：βセクレターゼ、γ：γセクレターゼ）。
【図２】アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングの略図である。ＡＰＰは、二つの経路によりタンパク質分解性プロセシングを受けるおそれがある。α−セクレターゼによる切断は、Ａ−βドメイン内で起こり、大型の可溶性Ｎ−末端ＡＰＰαおよび非アミロイド形成性Ｃ−末端フラグメントを発生する。ｇ−セクレターゼによるこのフラグメントのさらなるタンパク質分解により、非アミロイド形成性ペプチドｐ３が発生する。または、β−セクレターゼによるＡＰＰの切断は、Ａβドメインの開始部で起こり、それによりより短い可溶性Ｎ−末端であるＡＰＰβ、並びにアミロイド形成性Ｃ末端フラグメント（Ｃ９９）が発生する。γ−セクレターゼによるこのＣ−末端フラグメントのさらなる切断により、Ａβが発生する。一つまたは複数のγ−セクレターゼによる切断は、ＡβのＣ末端不均一性を招いて、Ａβ４０およびＡβ４２を発生させることができる。
【化１】
【図３】遺伝子構築物の略図である。Ａ）マウスＴｈｙ１．２糖タンパク質遺伝子（ＭＴｈｙ１．２）に包埋された、Ｋ６０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ置換を有するヒトβＡＰＰ７５１（ヒトβＡＰＰ７５１−ＳＦＡＤ）をコードするＤＮＡを含む構築物。ＫＰＩ：Kunitzプロテアーゼインヒビタードメイン；Ａβ：βアミロイドペプチド；ＥＩ：エキソンＩ；ＥＩＩ：エキソンＩＩ；ＥＩＶ：エキソンＩＶ；ＡＴＧ：開示コドン；ＴＡＧ：終止コドン。Ｂ）マウスプリオン（ｐＰｒＰＨＧ）に包埋された、Ｎ１４１置換を有する突然変異ヒトプレセニリン２（ｈＰＳ２−Ｎ１４１Ｉ）をコードするＤＮＡを含む構築物。Ｅ１：エキソン１、Ｅ２：エキソン２、ＵＴＲ：非翻訳領域；ＡＴＧ：開始コドン；ＴＡＧ：終止コドン。Ｃ）β−アミロイドペプチドに対するヒト抗体ＩｇＧ１．１（Ｍａｂ１１）の重鎖をコードするＤＮＡを含む構築物。ＭＨＣ−Ｉ：Ｈ−２ｋプロモーター領域、ＶＨ：抗体の重鎖可変領域、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３：抗体の重鎖定常領域、ＩｇＨエンハンサー：マウスＩｇＨ遺伝子の転写エンハンサーエレメント。Ｄ）β−アミロイドペプチドに対するヒト抗体ＩｇＧ１．１（Ｍａｂ１１）の軽鎖をコードするＤＮＡを含む構築物。ＭＨＣ−Ｉ：Ｈ−２ｋプロモーター領域、ＶＬ：その抗体の軽鎖可変領域、ＣＬ：その抗体の軽鎖定常領域、ＩｇＨエンハンサー：マウスＩｇＨ遺伝子の転写エンハンサーエレメント。
【図４】トランスジェニック発現のための発現ベクターｐＨＳＥ３’にクローニングされたような、ヒトＡβに特異的なヒトＩｇγ１遺伝子のコード配列全体（配列番号：１０）を示す図である。ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの位置および名前を、対応する配列の上または下に示す。終止コドンを太字で示す。リーダー配列は太字で下線付きで示す。
【図５】トランスジェニック発現のための発現ベクターｐＨＳＥ３’にクローニングされたような、ヒトＡβに特異的なヒトＩｇκ遺伝子のコード配列全体（配列番号：１１）を示す図である。ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの位置および名前を、対応する配列の上または下に示す。開始および終止コドンは太字で示す。
【図６】Ｂ６．Ｍａｂ１１×Ｂ６．ＰＳ２ＡＰＰマウスの子孫における四重トランスジェニックを検出するためのＰＣＲ電気泳動ゲルの写真である。レーン１：マーカー、レーン２〜７：Ｂ６．Ｍａｂ１１×Ｂ６．ＰＳ２ＡＰＰマウスの子孫マウス。ＩｇＨ：ＩｇＨ特異的ＰＣＲフラグメント；ＩｇＬ：ＩｇＬ特異的異ＰＣＲフラグメント。ＰＳＥＮ２：ＰＳ（Ｎ４１Ｉ）特異的ＰＣＲフラグメント。
【図７】ＡＰＰについて探索されたＢ６．ＭＡＢ１１、Ｂ６．１５２およびＢ６．ＭＡＢ１１．１５２マウス由来の脳ホモジェネートのウエスタンブロットである。Ｂ６．ＭＡＢ１１：ＭＡＢ１１の重鎖および軽鎖についてトランスジェニックのマウス。Ｂ６．１５２：ＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰスウェーデン型についてトランスジェニックのマウス。Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２：ＭＡＢ１１の重鎖および軽鎖ならびにＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰスウェーデン型についてトランスジェニックのマウス。ＡＰＰ：アミロイド前駆体タンパク質、ＣＴＦ：Ｃ末端フラグメント、Ａβ：βアミロイドペプチド。
【図８】野生型、Ｍａｂ１１トランスジェニックマウス（Ｂ６．ＭＡＢ１１）、ＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰｓｗダブルトランスジェニックマウス（Ｂ６．１５２）ならびにＭＡＢ１１の重鎖および軽鎖およびＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰスウェーデン型について四重トランスジェニックなマウス（Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２）の前頭皮質の組織切片の蛍光顕微鏡画像である。マウスは８月齢であり、切片はマウス抗Ａｂモノクローナル抗体（ＢＡＰ２／Ａｌｅｘａ５５５コンジュゲート）で染色した。四重トランスジェニックマウスにおけるＭＡＢ１１のトランスジェニック発現は、斑形成を完全に予防する。
【図９】野生型、Ｍａｂ１１トランスジェニックマウス（Ｂ６．ＭＡＢ１１）、ＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰｓｗダブルトランスジェニックマウス（Ｂ６．１５２）ならびにＭＡＢ１１の重鎖および軽鎖およびＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰスウェーデン型について四重トランスジェニックなマウス（Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２）の前頭皮質の組織切片の蛍光顕微鏡像である。マウスは８月齢であり、切片はチオフラビン−Ｓで染色した。四重トランスジェニックマウスにおけるＭＡＢ１１の発現は、斑形成を完全に予防する。
【図１０】Ｍａｂ１１トランスジェニックマウス（Ａ）および四重トランスジェニックマウス（Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２）（Ｂ）から採取された血漿中のヒトＩｇＧ、すなわちＭＡＢ１１の測定レベルの略図である。異なる独立した方法を比較した。（ｉ）
【化２】
Ａβ抗原により捕獲され、Ｆｃ特異的検出抗体により検出されたヒトＩｇＧ、（ｉｉ）
【化３】
抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）により捕獲され、（Ｈ＋Ｌ）特異的検出抗体により検出されたヒトＩｇＧおよび（ｉｉｉ）
【化４】
抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）により捕獲され、Ｆｃ特異的検出抗体により検出されたヒトＩｇＧ。
【図１１】ヒトＩｇＧ Ｍａｂ１１で探索された四重トランスジェニックマウスＢ６．ＭＡＢ１１．１５２、すなわち非トランスジェニックのバックグラウンド（Ｃ５７Ｂｌ／６）のＭａｂ１１トランスジェニックマウスＢ６．ＭＡＢ１１からの脳ホモジェネートのウエスタンブロットである。Ｍａｂ１１の測定可能な最小量を決定するために、非トランスジェニックマウスＢ６（Ｃ５７Ｂｌ／６）の脳ホモジェネートに異なる濃度（１０、３、１、０．３、０．１および０．０３μg/ml）で抗体を添加した。非トランスジェニックマウスから採取した血漿は末梢中のＭａｂ１１についての対照である。
【図１２】Ａβについて探査された、１６月齢マウスからの脳ホモジェネートのウエスタンブロットである。非トランスジェニック野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、四重トランスジェニックマウスＢ６．ＭＡＢ１１．１５２およびＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰｓｗダブルトランスジェニックマウスＢ６．１５２から脳を取り出した。陰性対照として、第一のレーンでは脳ホモジェネートを含まない試料緩衝液にＭＡＢ１１を添加した。
【図１３】Ｂ６．１５２およびＢ６．ＭＡＢ１１．１５２マウスからの脳ホモジェネート中のＡβ解離後の不溶性Ａβ測定値（Ａβ４０および４２）（ng/mg脳）のグラフである。１〜４：ＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰｓｗダブルトランスジェニックマウス（Ｂ６．１５２）：１＝４月齢；２＝８月齢、３＝１２月齢、４＝１６月齢；５〜８：四重トランスジェニックマウス（Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２）：５＝４月齢；６＝８月齢、７＝１２月齢、８＝１６月齢。Ａ）：雌性マウスで測定したＡβ４２、Ｂ）雄性マウスで測定したＡβ４２、Ｃ）雌性マウスで測定したＡβ４０、Ｄ）雄性マウスで測定したＡβ４０。
【図１４】血管アミロイド沈着および内皮細胞について二重免疫染色された、Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２から採取された皮質切片の最大値投影として視覚化された共焦点走査顕微鏡像である。図１４ＡおよびＤは、それぞれ低倍率および高倍率で染色したアミロイド沈着のＢＡＰ２染色を示す。比較のために、図１４ＢおよびＥは、それぞれ低倍率および高倍率で染色したＣＤ３１（内皮細胞マーカー）により微小管の分布を示す。図１４ＣおよびＦは、両染色をマージしたチャネルを示す。
【図１５】ダブルトランスジェニックＢ６．１５２マウスから採取された最大強度投射として視覚化された共焦点操作顕微鏡像（Ａ〜Ｃ）および高解像度での四重トランスジェニックＢ６．ＭＡＢ１１．１５２からの皮質微小管の単一共焦点面像（Ｄ〜Ｆ）である。図１５ＡおよびＤは、アミロイド沈着のＢＡＰ２染色を示す。図１４ＢおよびＥはＣＤ３１（内皮細胞マーカー）の染色を示す。図１４ＣおよびＦは、両染色をマージしたチャネルを示す。
【００６５】
実施例：
実施例に参照された市販の試薬は、特に言及しない限り製造業者の説明書に準じて使用した。
【００６６】
実施例１：トランスジェニック構築物（図１）
ＡＰＰＳｗｅ構築物：ヒトβＡＰＰ７５１をコードするｃＤＮＡはD. Goldgaber教授から贈与してもらった。スウェーデン型家族性ＡＤ二重突然変異（ＳＦＡＤ、Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ置換）を部位特異的突然変異誘発により導入した。Ｔｈｙ１．２−ｈｕβＡＰＰ７５１ＳＦＡＤ導入遺伝子は、マウスＴｈｙ−１．２糖タンパク質遺伝子およびプロモーターを含む発現ベクター（配列番号：２、ＡＣ：Ｍ１２３７９）のＸｈｏＩ部位に約２．４kbpのｈｕβＡＰＰ７５１ＳＦＡＤ ｃＤＮＡフラグメント（配列番号：１、ＡＣ：Ｘ０６９８９のヌクレオチド３２〜２３６９）を挿入することにより発生させた。この発現ベクターは、マウスＴｈｙ１．２遺伝子を含む６．８kbpのＮｏｔＩフラグメントを有し（Andra K, et al., (1996) Expression of APP in transgenic mice: a comparison of neuron-specific promotors. Neurobiol Aging 17:183-190; Vidal M, et al., (1990) Tissue-specific control elements of the Thy-1 gene. EMBO J 9:833-840）、そのフラグメントでは、エキソン２および４に位置する１．５kbpのＢａｍＩ−ＸｈｏＩフラグメントがＸｈｏＩクローニング部位に置換えられている。その構築物の部分配列を配列番号：４に示す（ヌクレオチド１−２６０２は、ＭＭＴＨＹＧＰ、ＡＣ：Ｍ１２３７９（２７．４．１９９３と同様）、マウスＴｈｙ−１．２糖タンパク質遺伝子（ＸｂａＩ−ＢａｎＩ）、ヌクレオチド２６０３−４９８２は、ｈβＡＰＰ７５１ ＳＦＡＤ（ＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−平滑末端、２４００bp）、ＡＣ：Ｘ０６９８９（０９．０１．２００３と同様）、（ｎｔ：３２−２４００）Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌを有する、ヌクレオチド４９８３−６１１２は、ＭＭＴＨＹＧＰ、ＡＣ：Ｍ１２３７９（２７．４．１９９３と同様）、ＸｈｏＩ−ＰｏｌｙＡ部位（エキソンＩＶ））。
【００６７】
ＰＳＥＮ２ｍｕｔ構築物：ＦＡＤ突然変異Ｎ１４１ＩをヒトＰＳＥＮ２ ｃＤＮＡ（配列番号：９、ＡＣ：Ｌ４３９６４）に導入した。トランスジェニックマウスに発現させるために、マウスプリオン遺伝子に基づくベクターを使用した（ｐＰｒＰＨＧ）（Fischer et al., 1996; Borchelt et al., 1996）。プリオン遺伝子コード領域を包含するＫｐｎＩ−ＮａｒＩフラグメントを欠失させ、独特なＳｃｅｌ部位に置換えた。平滑末端ライゲーションによりプレセニリン２コード配列を挿入し、挿入部位の配列決定により検証した。
【００６８】
Ｍａｂ１１構築物：ヒトＡｂペプチドに特異性を有するアイソタイプγ１の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖（Ｈ）をコードするｃＤＮＡ（配列番号：１０）およびヒトＡｂペプチドに特異性を有するアイソタイプκの軽鎖（Ｌ）をコードするｃＤＮＡ（配列番号：１１）を使用した［Bardroff, M. et.al., Anti-amyloid beta antibodies and their use。国際公開公報第０３０７０７６０号］。表１のプライマーを使用したＰＣＲ反応でｃＤＮＡを増幅させた。ｐＨＳＥ３’ベクターへの部位特異的挿入のための５’プライマーはＳａｌＩ（または適合性のＸｈｏＩ）部位を含み、５’プライマーはＢａｍＨＩ（または適合性のＢｇｌＩＩ）部位を含む［Pircher, H., et al., T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chain transgenic mice. Embo J, 1989. 8(3): p.719-27.］。ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡは、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩの両方の制限酵素で最初に酵素的に切断し、次に、ベクターｐＨＳＥ３’の対応する部位に個別に挿入した。ｐＨＳＥ３’でのＩｇ ｃＤＮＡの発現は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子Ｈ−２ｋのマウスプロモーターによりドライブされ、クローニングされた遺伝子の３’に位置するマウスＩｇＨ遺伝子エンハンサーにより高まる［Pircher, H., et al., T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chain transgenic mice. Embo J, 1989. 8(3): p. 719-27.］。この発現ベクターは、トランスジェニックマウスのＴおよびＢリンパ球における対応する挿入された遺伝子産物の高レベルの産生を確実にする（［Pircher, H., et al., T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chain transgenic mice. Embo J, 1989. 8(3): p.719-27.］）。次に、（５’から３’方向に）：Ｈ−２ｋプロモーター、挿入されたｃＤＮＡ、ポリ−Ａおよびスプライス部位ならびにＩｇＨ遺伝子エンハンサーエレメントを含む発現カセット全体を、ＸｈｏＩを用いた制限酵素切断およびアガロースゲル精製によりベクターから切り出し、受精したマウス卵母細胞にマイクロインジェクションするために適切な濃度で調製した（１０mM ＴｒｉｓＨＣｌ／０．１mM ＥＤＴＡへの２μg/ml溶液、ｐＨ７）。ｃＤＮＡのコード潜在性は、抗Ａβ ＩｇＨおよびＩｇＬ遺伝子をコードするｃＤＮＡ全体を配列決定することにより確認した。
【００６９】
【表２】
【００７０】
実施例２．トランスジェニックマウスの作製
Ｂ６．ＰＳ２ＡＰＰトランスジェニックマウス（Ｂ６．１５２系統）の作製：トランスジェニック動物は、本質的に以前に記載されたように作製した（Hogan CF, and Lyacy E. 1995. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. Ed 2. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory）。Ｔｈｙ−１−ｈｕＡＰＰ７５１ＳＦＡＤまたはＰｒｐ−ｈｕＰｓｅｎ２（Ｎ１４１Ｉ）構築物を保有する無ベクター性直鎖フラグメントを１：１の比で混合し、Ｃ５７Ｂｌ／６接合子の雄性前核にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクション後に、偽妊娠したＢ６ＣＢＡＦ１養母の卵管に生存接合子を移植した。生殖細胞系における導入遺伝子の組込みは、ＰＣＲによる導入遺伝子の検出によりＦ１後代で試験した。同時インジェクションされた導入遺伝子は同じ染色体部位に組込まれると一般に仮定されている（Overbeek PA, Aguilar-Cordova E, Hanten G, Schaffner DL, Patel P, Lebowitz RM, and Lieberman MW. 1991. Coinjection strategy for visual identification of transgenic mice. Transgenic Res. 1, 31-37）。
【００７１】
Ｂ６．Ｍａｂ１１（抗Ａβ ＩｇＧ１トランスジェニックマウス）の作製：ＥＰ−Ａ−１７４８２９４に以前に記載されたように、トランスジェニック動物を作製した。Ｃ５７ＢＬ／６雌性ドナーから得られた、受精した卵母細胞に、前節記載のＩｇＨおよびＩｇＬ遺伝子をコードする精製ＸｈｏＩフラグメント（Ｍａｂ１１構築物）の１：１混合物をマイクロインジェクションして、Ｂ６．Ｍａｂ１１動物を得た。マイクロインジェクション後に、偽妊娠したＢ６ＣＢＡＦ１養母の卵管に生存接合子を移植した。生殖細胞系における導入遺伝子の組込みは、ＰＣＲによる導入遺伝子の検出によりＦ１後代で試験した。同時インジェクションされた導入遺伝子は同じ染色体部位に組込まれると一般に仮定されている（Overbeek PA, Aguilar-Cordova E, Hanten G, Schaffner DL, Patel P, Lebowitz RM, and Lieberman MW. 1991. Coinjection strategy for visual identification of transgenic mice. Transgenic Res. 1, 31-37）。全体で、トランスジェニックＩｇＨおよびＩｇＬ遺伝子の両方を担持する５匹のダブルトランスジェニックマウスならびにＩｇＨ遺伝子のみを担持する１匹のシングルトランスジェニックマウスを作製し、繁殖させた。
【００７２】
Ｂ６．Ｍａｂ１１．ＰＳ２ＡＰＰトランスジェニックマウス（系統Ｂ６．Ｍａｂ１１．１５２）の作製：Ｍａｂ１１導入遺伝子についての雄性ヘテロ接合体と、ｈｕＰＳＥＮ２ｍｕｔおよびｈｕＡＰＰＳｗ導入遺伝子についての雌性ホモ接合体を交配することにより、Ｍａｂ１１についての導入遺伝子ならびにヒトＰＳＥＮ２ｍｕｔおよびＡＰＰＳｗ導入遺伝子の両方を有するトランスジェニックマウスを作製した。結果として得られた子孫は、全ての導入遺伝子についてのヘテロ接合体、またはｈｕＡＰＰＳｗおよびｈｕＰＳＥＮ２のみについてのヘテロ接合体のいずれかである。
【００７３】
実施例３：ＰＣＲ分析
導入遺伝子の存在は、１０日齢マウスから採取された組織生検から単離されたゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲ分析により検出する。増幅されたフラグメントは、導入遺伝子に特異的であり、内因性ＤＮＡ配列と交差反応しない。
【００７４】
Ｂ６．ＰＳ２ＡＰＰマウス（ＡＰＰスウェーデン型−ＰＳ２ｍｕｔダブルトランスジェニックマウス）：プライマー５’−ＡＡＧ ＴＡＴ ＧＴＣ ＣＧＣ ＧＣＡ ＧＡＡ ＣＡＧ ＡＡＧ Ｇ−３’（配列番号：５）および５’−ＣＴＧ ＡＧＡ ＴＡＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ＧＡＣ ＴＴＧ ＧＧＧ ＡＧ−３’（配列番号：６）を使用して、ｈｕＡＰＰおよびｍｕＴｈｙ１配列が重複した９３２bpのフラグメントを増幅する。同様に、プライマー５’−ＴＣＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＴＧＡ ＣＣＣ Ｔ−３’（配列番号：７）および５’−ＧＣＴ ＴＴＣ ＡＡＣ ＧＴＣ ＡＧＴ ＡＧＧ ＡＣＡ Ａ−３’（配列番号：８）を使用して、ｈｕＰＳＥＮ２ｍｕｔおよびプリオン配列が重複した３２７bpのフラグメントを増幅する。ｈｕＰＳＥＮ２およびｈｕＡＰＰＳｗ導入遺伝子は常に同時分離される。トークリッピング（toe clipping）組織から得られた１μl（約１００ng）の総ＤＮＡを用いて以下の条件でＰＣＲ反応を行った：９５°３分、３５×［９５°３０秒、６０°１分、７２°１分］、７２°５分。ｈｕＡＰＰ導入遺伝子に関する９３２bpおよびｈｕＰＳ２導入遺伝子に関する３２７bpのＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントを１．８％アガロースゲルで視覚化した。
【００７５】
Ｂ６．Ｍａｂ１１マウス（Ｍａｂ１１ダブルトランスジェニックマウス）：特異的プライマーを用いて、尾生検から調製したゲノムＤＮＡを増幅することにより、これらのマイクロインジェクションされた胚から生まれた子を導入遺伝子の存在についてスクリーニングした。使用したプライマーを表２に示す。尾生検から得られた１μl（約１００ng）の総ＤＮＡを使用して、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。９０°１分、３０×［９４°１０秒、６４°３０秒、７２°９０秒］、７２°７分。それぞれ約１２７０bpおよび６６０bpのＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントを、トランスジェニックＩｇＨおよびＩｇＬ遺伝子について別々に１．５％アガロースゲルで最終的に視覚化した。
【００７６】
【表３】
【００７７】
ＭＡＢ１１．ＰＳ２ＡＰＰマウス（図２）：マルチプレックスＰＣＲ反応においてＭＨＣプロモーター領域に特異的なプライマー５’−ＡＴＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＣＡＧ ＴＴＴ ＣＡＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＡＣＣ−３’（配列番号：１６）およびそれぞれγ鎖およびκ鎖に特異的なプライマー５’−ＴＧＴ ＡＣＴ ＣＣＴ ＴＧＣ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＣ−３’（配列番号：１７）および５’−ＧＣＴ ＣＡＴ ＣＡＧ ＡＴＧ ＧＣＧ ＧＧＡ ＡＧ−３’（配列番号：１８）をｈｕＰＳＥＮ２プライマー（配列番号：７および８）に添加する。全ての導入遺伝子の存在下で、それぞれｈｕＰＳＥＮ２、ｈｕＩｇ重鎖およびｈｕＩｇ軽鎖導入遺伝子について３２７bp、６００bpおよび１２００bpの異なるサイズの三つのＰＣＲ産物を増幅する。
【００７８】
トークリッピング組織から得られた１．５μl（約１５０ng）の総ＤＮＡを用いて以下の条件でＰＣＲ反応を行った:９５°１分、３０×［９５°３０秒、６２°４０秒、７２°８０秒］、７２°７分。それぞれｈｕＰＳ２、ＩｇＨおよびＩｇＬ導入遺伝子についての３２７bp、約６６０bpおよび１２００bpのＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントを１．５％アガロースゲルで視覚化した。
【００７９】
実施例４：免疫組織化学
Fluothane（登録商標）で麻酔された８月齢マウス（野生型マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６）、Ｍａｂ１１トランスジェニックマウス、ＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰｓｗダブルトランスジェニックマウスおよびＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰｓｗ／Ｍａｂ１１四重トランスジェニックマウス）を断頭し、脳を２分し、ドライアイス中でスナップ凍結（snap frozen）した。PaxinosおよびFranklinにしたがって、Leica CM3050 Sクリオスタットを用いて厚さ公称２０μmおよび−１８℃で、約１．９２から１．２mm外側の傍矢状クリオスタット切片を切り出し、Superfrost Plus（商標）スライドにマウントし、−２０℃で保存した。アミロイド斑の染色は、当技術分野の現況の免疫蛍光染色プロトコールにより、またはアミロイド斑に特異的な色素であるチオフラビン−Ｓを用いた染色により行った。簡潔には、切片をＰＢＳ中で水和させ、−２０℃で２分間予冷した１００％アセトンで処理した。ＰＢＳを用いた洗浄を２分間２回行い、続いて２％ウシ血清アルブミンおよび２％卵アルブミンのＰＢＳ溶液中で１５分間インキュベーションすることにより非特異的結合部位をブロッキングし、続いてＰＢＳ洗浄およびAlexa488フルオロホア（Molecular Probes）ｗにコンジュゲーションした高親和性マウスモノクローナル抗体（ＢＡＰ−２）と共にインキュベーションし、０．５mg/mlおよび室温で１時間インキュベーションした。チオフラビン−Ｓを用いた染色は、０．０１２５％でエタノール／ＰＢＳ（４０／６０vol％）中で行った。再蒸留水中でスライドをすすいだ後、蛍光マウント用媒質(S3023, DAKO）を用いてカバーガラスをマウントした。８月齢Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２およびＢ６．１５２の結果を同腹仔対照と共に図８（ＢＡＰ−２）および図９（チオフラビン−Ｓ）に示すが、Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２マウスにおけるアミロイド沈着の完全な不在が実証される。
【００８０】
Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２（２０月齢）マウスおよびＢ６．１５２マウス（２０月齢）の皮質由来で海馬近くの組織スライドを、８月齢動物について上に記載したように調製した。組織スライドを以下のように染色した：
１． １０．０μg/mlのラット／Ｌ抗マウスＣＤ３１（Serotec, ID:1102）濃度のＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋power Block（１×）＋１０％ヤギ血清（ｐＨ７．４）溶液、室温で１ｈインキュベーション、DakoCytomation洗浄緩衝液（トリス緩衝液塩化ナトリウム溶液＋Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ
２． ヤギ／抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡＬＥＸＡ４８８（Molecular Probes, ID:1254）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋１０％ヤギ血清（ｐＨ７．４）に１：１００希釈したもの、室温で１ｈインキュベーション；DakoCytomation洗浄緩衝液（トリス緩衝液塩化ナトリウム溶液＋Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ
３． ５．０μg/mlのマウス／ＢＡＰ−２ａ ＡＬＥＸＡ５５５（EM Labor, ID:1296）濃度のＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋power block（１×）＋１０％ヤギ血清（ｐＨ７．４）溶液、室温で１ｈインキュベーション；DakoCytomation洗浄緩衝液（トリス緩衝液塩化ナトリウム溶液＋Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ
【００８１】
スライドをＤＡＰＩで５分間洗浄し、次にDakoCytomation洗浄緩衝液で２回すすぐ、次に、４mM ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏの５０mM ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４溶液（ｐＨ５．０）で３０分間インキュベーションした。再蒸留水中でスライドをすすいだ後、蛍光マウント用媒質（S3023, DAKO）を用いてカバーガラスをマウントした。
【００８２】
図１４〜１５に結果を示す。Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２マウスの皮質の細い微小管に時に血管アミロイド沈着がある。しかし、同齢のＢ６．１５２マウスは皮質微小管の周りに血管アミロイドを示さなかった。Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２マウスおよびＢ６．１５２マウスの間では、脳膜血管および心室血管などのより大型の血管に観察された血管アミロイドーシスの程度に明らかな差はなかった。
【００８３】
実施例５：ウエスタンブロット分析およびＡβの測定
ウエスタンブロット分析
総タンパク質抽出物１５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、続いてニトロセルロース膜（Amersham, Hybond）に移行させた。Ａβの検出のために、膜をＰＢＳ（８．１mMリン酸水素二ナトリウム、１．５mMリン酸二水素カリウム、１３７mM塩化ナトリウム、２．７mM塩化カリウム）中で９５℃で５分間加熱してエピトープの変性およびエピトープの提示を増加させ、５％(w/v)の脱脂ドライミルク濃度のＰＢＳＴ（ＰＢＳおよび０．０５％(v/v)Ｔｗｅｅｎ ２０）溶液でブロッキングし、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベーションした。ＡＰＰの検出のために、一次抗体ＷＯ−２（Ida et al., J Biol Chem. 1996, 271(37):22908-l）を濃度１μg/mlで使用した。プレセニリン−２の検出のために、アミノ末端フラグメントを検出するモノクローナル抗体ＰＳＴ−２０を、タウのために抗体Ｔａｕ−５（Invitrogen）を、総ＡＰＰのために抗ＡＰＰ−ＣＴ２０抗体（Calbiochem）を、ヒトＡＰＰのために、ヒトＡＰＰに特異的な抗体ＷＯ−２を使用した（Loetscher et al. J Biol Chem. 1997 Aug 15;272(33):20655-9）。全ての洗浄工程は、４℃でＰＢＳＴを用いて行った。一次抗体の結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲーションした抗ＩｇＧ抗体（Amersham）に続いて、製造業者の説明書にしたがいＥＣＬ検出システム（Amersham）により明らかにした。
【００８４】
Ａβの測定
プロテアーゼインヒビターのカクテル（Complete（商標）, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim-Germany）を含有する１０容(w/v)の９Ｍ尿素、５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で一つの脳半球をホモジェナイズした。４℃で５分間、１５００ｇで遠心分離することにより細胞の破片を除去した。BCA Protein Assay（Pierce, USA）を使用して上清中のタンパク質濃度を測定した。
【００８５】
Czechらが記載したように、液相電気化学発光（ＬＰＥＣＬ）を使用して脳ホモジェネート中のＡβ４０およびＡβ４２レベルを測定した（J Neurochem, 2007. 101(4): 929-36）。簡潔には、Ｍ−２８０常磁性ビーズ（Bioveris）をアッセイ緩衝液（５０mM Tris、６０mM ＮａＣｌ、０．５％ ＢＳＡ、１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で希釈した。脳抽出物５０μlを室温で５０μlのビーズおよび２５μlのラベル化抗体（Ａβ１−４０の検出のために６Ｅ１０−ｂｉｏおよびＢＡＰ２４−ｔａｇ、ならびにＡβ１−４２の検出のために６Ｅ１０−ｂｉｏおよびＢＡＰ２４−ＴＡＧ）と共に最終容積２５０μlで３時間静かに振盪しながらインキュベーションした。M-Series M8分析装置（Bioveris）を使用してＥＣＬを定量した。アッセイ緩衝液で脳ホモジェネートを様々に希釈したものを測定して直線状のシグナル応答を保証し、合成標準Ａβ１−４０およびＡβ１−４２ペプチド（Bachem）と比較した。Ａβペプチドを濃度１mg/mlでＤＭＳＯに溶かし、小分けし、−８０℃で凍結保存した。結果は、それぞれＡβ１−４０およびＡβ１−４２の標準曲線と対比させて脳ホモジェネート１mgあたりのngとして表現した。各試料希釈について２回の繰り返しで測定を行い、少なくとも２回繰り返した。
【００８６】
実施例６：Ｂ６．ｍａｂ１１．１５２マウスにおけるｍａｂ１１のｑＲＴ−ＰＣＲ
脾臓全体を細かく切ったものに７０μM細胞ストレーナーを通過させることにより脾臓細胞を単離し、ＲＮＳ抽出のために系列希釈した。皮質からレーザ顕微解剖で脳試料を採取し、小脳および海馬台を用意し、RNAlater（登録商標）に収集した。Qiagen製RNAeasyキットを使用してＲＮＡを抽出した。QuantiTectプローブＲＴ−ＰＣＲキット(Qiagen)でＰＣＲを行った。製造業者の説明書に準じてTaqMan（登録商標）アッセイ（Applied Biosystems Inc）を行った。プローブは、ｍｕＩＧＨ６＿Ｍｍ０１７１８９５６＿ｍ１（ＩｇＭ＝Ｂ細胞マーカー）、ｍｕＡＰＰ Ｍｍ００４３１８２７＿ｍ１（脳のための参照遺伝子）、ｈｕＨＣ＿ｃｕｓｔｏｍ（ｍａｂ１１ ＩｇＧ１構築物に基づきABIが注文生産）、およびｈｕＬＣ＿ｃｕｓｔｏｍ（ｍａｂ１１ Ｉｇκ構築物に基づきABIが注文生産）であった。
【００８７】
ＬＣ４８０（Roche Diagnostics）でＰＣＲを行った。ターゲットＲＮＡの相対定量はΔＣｔ法により行った。非トランスジェニックマウスからの脳顕微解剖は、Ｍａｂ１１ ＩｇＨおよびＩｇＫ ＲＮＡに関する陽性シグナルを与えなかった。Ｂ６．ｍａｂ１１．１５２マウスについての結果を表３および５に示す。
【００８８】
【表４】
【００８９】
野生型マウスおよびトランスジェニックマウスにおける内因性参照遺伝子ＩｇＭおよびＣＤ２０についての発現は細胞数に依存した。トランスジェニックマウスのみにおいて、ｈｕＩｇについての強く細胞数に依存するシグナルが見られた。野生型マウスではアッセイバックグラウンドに比べてシグナルが検出されなかった（表４および５参照）。
【００９０】
【表５】
【００９１】
【表６】
【技術分野】
【０００１】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶消失および認知機能減退を特徴とする神経変性疾患である。ＡＤの有病率は、６５歳を過ぎると５年ごとに約２倍に増加する。全体的に見て、６５歳を超えた者の約５〜１０％が罹患している。ＡＤの臨床診断は、依然として除外診断である。脳の死後顕微鏡観察のみがアミロイド−β（Ａ−β）ペプチド原線維を含む細胞外の斑および重合したリン酸化タウタンパク質を含む細胞内濃縮体の存在に基づく確定診断を提供する。大部分の場合で、ＡＤは高齢期発症型および孤発型で起こる。早期発症型家族性ＡＤは症例の少数派に相当するが、疾患メカニズムの理解の進歩に極めて重要とされてきた。公知の突然変異は、コドン６７０／６７１（Ｋ６７０＋ＮおよびＭ６７１＋Ｌ）に及ぶスウェーデン変異（ＳＦＡＤ）およびＡＰＰのコドン７１７に及ぶロンドン変異である。全てのこれらの突然変異はＡＰＰのタンパク質分解性プロセシングに影響を及ぼし、アミロイド形成性がより大きいペプチドを生じる。
【０００２】
ＡＰＰは、少なくとも三つのセクレターゼ、すなわちα−、β−およびγ−セクレターゼによりプロセシングすることができる。β−セクレターゼは、メチオニン６７１（ＡＰＰ７７０の付番）の後でＡＰＰを切断し、１２kdの保持された膜カルボキシ末端フラグメントを導くことによりＡ−βペプチドの発生を開始する。次に、１２ｋｄのフラグメントは、疎水性膜貫通ドメイン内でγ−セクレターゼの切断を受けて４０、４２または４３残基のＡ−βペプチドを放出しうる（Seubert P, Vigo-Pelfrey C, Esch F, Lee M, Dovey H, Davis D, Sinha S, Schlossmacher M, Whaley J, Swindlehurst C. Isolation and quantification of soluble Alzheimer's beta-peptide from biological fluids. Nature. 1992. 359: 325-7）。
【０００３】
ＡＤに関する現行の処置は、わずかな症状の軽減を提供する。感受性の個体における病状経過を減速させ、そして疾患を予防または遅延させる疾患修飾剤のまだ対処されていない高い必要性がある。そのような薬剤の開発は、とりわけ疾患の分子的基盤の理解および動物モデルの開発に進歩を必要とする。
【０００４】
ＡＤに関係するタンパク質を過剰発現しているいくつかのトランスジェニック系統、例えばＡＰＰロンドンおよびβ−セクレターゼを過剰発現しているダブルトランスジェニックマウスが公知である。
【０００５】
本発明は、ゲノムが、ａ）アルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤ型病態に関連する突然変異を含むヒトＡＰＰタンパク質をコードする第一のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のトランスジェニックＤＮＡ配列；
ｂ）アルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤ型病態に関連する突然変異を含むヒトプレセニリン２タンパク質をコードする第二のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第二のプロモーターに作動可能に連結された第二のトランスジェニックＤＮＡ配列；
ｃ）アミロイドペプチドに対するヒト抗体の軽鎖をコードする第三のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第三のプロモーターに作動可能に連結された第三のトランスジェニックＤＮＡ配列；および
ｄ）該ヒト抗体の重鎖をコードする第四のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第四のプロモーターまたは第三のプロモーターに作動可能に連結された第四のトランスジェニック
を含む、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【０００６】
「アルツハイマー病（ＡＤ）の病態」という用語は、例えばニューロンのシナプス密度およびシナプス数の損失、認知能力の減少、ならびに記憶消失などの、ＡＤ患者における病態変化を表す。それらは、脳に散在性老人斑もまた含み、それらはアミロイドβペプチド、ニューロンおよび／もしくはグリア細胞の封入体、または抗Ａβ抗体で陽性染色される不溶性沈着物から主に構成される。
【０００７】
特に本発明は、ゲノムが、
ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはヒトＡＰＰロンドン型タンパク質をコードする第一のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のトランスジェニックＤＮＡ配列；
ｂ）Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質をコードする第二のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第二のプロモーターに作動可能に連結された第二のトランスジェニックＤＮＡ配列；
ｃ）ヒトアミロイドペプチドに対するヒト抗体の軽鎖をコードする第三のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第三のプロモーターに作動可能に連結された第三のトランスジェニックＤＮＡ配列；および
ｄ）該ヒト抗体の重鎖をコードする第四のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第三のプロモーターまたは第四のプロモーターに作動可能に連結された第四のトランスジェニック
を含む、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【０００８】
本発明は、また、同じまたは別の遺伝子型との繁殖によって得られた、本発明により提供されるようなトランスジェニック非ヒト動物の子孫に関する。好ましくは、その子孫は同じ遺伝子型との繁殖により得られる。該子孫は、上記四重非ヒト動物と同じトランスジェニックＤＮＡ配列を含む。
【０００９】
さらに本発明は、上記の四重非ヒトトランスジェニック動物またはその子孫から得られる細胞系または初代細胞培養物に関する。
【００１０】
加えて本発明は、また、上記の非ヒトトランスジェニック動物またはその子孫から得られる組織もしくは器官移植片またはそれらの培養物を提供する。
【００１１】
本発明は、また、上記の非ヒトトランスジェニック動物またはその子孫から得られる組織または細胞抽出物を提供する。
【００１２】
本発明は、また、ゲノムがヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、ならびにβアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードするトランスジェニックＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト動物を発生させるための方法を提供し、その方法は、
ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型をコードする該第一のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物、およびＮ１４１Ｉ置換を有するヒトプレセニリン２タンパク質をコードする第二のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること；
ｂ）アミロイドペプチドに対するヒト抗体の軽鎖をコードする第三のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物および該ヒト抗体の重鎖をコードする第四のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること、
ｃ）ａ）およびｂ）のトランスジェニック動物を交配すること
により、ゲノムがヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、βアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードするトランスジェニックＤＮＡを含む四重トランスジェニック非ヒト動物を作製することを含む。
【００１３】
または、上記方法の工程ｃ）において、第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列が同じ構築物上にあってもよい。
【００１４】
本発明は、また、ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質ならびにβアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖を発現するトランスジェニック非ヒト動物を発生させるための方法を提供し、その方法は、
ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型をコードする該第一のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物、およびＮ１４１Ｉ置換を有するヒトプレセニリン２タンパク質をコードする第二のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第二のプロモーターに作動可能に連結された第二のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること；
ｂ）ヒトアミロイドペプチドに対するヒト抗体の軽鎖をコードする第三のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第三のプロモーターに作動可能に連結された第三のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物および該ヒト抗体の重鎖をコードする第四のトランスジェニックＤＮＡ配列であって、第四のプロモーターに作動可能に連結された第四のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、および該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること、
ｃ）ａ）およびｂ）のトランスジェニック動物を交配することにより、ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、ならびにβアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖を発現する四重トランスジェニック非ヒト動物を作製することを含む。
【００１５】
または、上記方法の工程ｃ）において、第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列は、第三のプロモーターに作動可能に連結された同じ構築物上にあってもよい。
【００１６】
本発明は、さらに、上記方法により作製される四重トランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００１７】
ＡＰＰ
ＡＰＰは、アミロイド前駆体タンパク質を意味する。ＡＰＰのいくつかのｃＤＮＡ形態が、とりわけ三つの最も豊富に存在するアイソフォームＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０をコードするものが同定された。これらの形態は、選択的スプライシングにより単一の前駆体ＲＮＡから生じる。この遺伝子は、１８個のエキソンを有する１７５kb超に及ぶ（Yoshikai S, Sasaki H, Doh-ura K, Furuya H, Sakaki Y. Genomic organization of the human amyloid beta-protein precursor gene. Gene. 1990. 87(2):257-63）。ＡＰＰは、細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む。Ａ−βは、疎水性膜貫通ドメインのちょうど外側の最大２８個のアミノ酸およびこの膜貫通ドメインの最大１５個の残基から成る。このように、Ａ−βは、脳、ならびに心臓、腎臓および脾臓などの他の組織に通常見られるＡＰＰに由来する切断産物である。しかし、Ａ−βの沈着は、普通は脳にのみ豊富に見られる。比較的大きいＡＰＰの選択的形態（alternate form）（ＡＰＰ７５１、ＡＰＰ７７０）は、ＡＰＰ６９５および一つまたは二つの追加的なドメインから成る。ＡＰＰ７５１は、ＡＰＰ６９５の６９５個のアミノ酸およびKunitzファミリーのセリンプロテアーゼ阻害剤（ＫＰＩ）に相同性を有する追加的な５６個のアミノ酸から成る（Tanzi RE, McClatchey AI, Lamperti ED, Villa-Komaroff L, Gusella JF, Neve RL. Protease inhibitor domain encoded by an amyloid protein precursor mRNA associated with Alzheimer's disease. Nature. 1988. 331:528-30; Weidemann A, Konig G, Bunke D, Fischer P, Salbaum JM, Masters CL, Beyreuther K. Identification, biogenesis, and localization of precursors of Alzheimer's disease A4 amyloid protein. Cell. 1989 Apr 7; 57(1): 115-26. Kitaguchi N, Takahashi Y, Tokushima Y, Shiojiri S, Ito H. Novel precursor of Alzheimer's disease amyloid protein shows protease inhibitory activity. Nature. 1988. Feb ll;331(6156):530-2.; Tanzi RE, St George-Hyslop PH, Haines JL, Polinsky RJ, Nee L, Foncin JF, Neve RL, McClatchey AI, Conneally PM, Gusella JF. The genetic defect in familial Alzheimer's disease is not tightly linked to the amyloid beta-protein gene. Nature. 1987. 329 (6135): 156-7）。ＡＰＰ７７０は、ＡＰＰ７５１の７５１個のアミノ酸全ておよび神経細胞表面抗原ＯＸ−２に相同な追加的な１９個のアミノ酸ドメインを含む（Weidemann et al. 1989; Kitaguchi et al. 1988）。特に言及しない限り、本明細書に参照されるアミノ酸位置は、ＡＰＰ７０に出現する位置である。ＯＸ−２およびＫＰＩドメインの不在が原因で、ＡＰＰ６９５およびＡＰＰ７５１における同等の位置のアミノ酸番号は、場合により異なる。慣例により、全ての型のＡＰＰのアミノ酸位置は、ＡＰＰ７７０型での同等の位置により参照される。特に言及しない限り、本明細書ではこの慣例に従う。特に言及しない限り、本明細書に参照される全ての型のＡＰＰおよび全ての型のＡ−βを含むＡＰＰのフラグメントは、ヒトＡＰＰのアミノ酸配列に基づく。ＡＰＰは、リーダー配列の除去ならびに硫酸基および糖基の付加により翻訳後修飾される。「ＡＰＰ」という用語には、例えばＡＰＰスウェーデン型およびＡＰＰロンドン型などの突然変異ＡＰＰもまた含まれる。
【００１８】
アルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤ型病態に関連する突然変異を含むヒトＡＰＰタンパク質は、好ましくはＡＰＰスウェーデン型およびＡＰＰロンドン型である。
【００１９】
本明細書に使用されるような「ＡＰＰスウェーデン型」という用語は、Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ置換を含む上記と同義のＡＰＰアイソフォームを表す。好ましくは、ヒトＡＰＰスウェーデン型は、配列番号：１によりコードされる。
【００２０】
本明細書に使用されるような「ＡＰＰロンドン型」という用語は、Ａ−β４２ペプチドの特異的産生増加に向けたアミロイドペプチド産生に影響する一つまたは複数の天然または人工いずれかの突然変異を含む、上記と同義のＡＰＰアイソフォームを表す。下記などの、病理学的に関連するγ−セクレターゼ切断部位周辺の天然ＡＰＰ突然変異が好ましい。
【表１】
【００２１】
人工突然変異（Ａ−βドメイン外部の膜貫通領域中の全残基の置換）もまた好ましい。その例およびγ−セクレターゼ切断に及ぼすその結果は、Lichtenthalerおよび共同研究者ら（Lichtenthaler SF, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 16;96(6):3053-8）により記載されている。
【００２２】
さらに好ましくは、ヒトＡＰＰロンドン型は、天然Ｖ７１７Ｆ突然変異を含むヒトＡＰＰロンドン型である。最も好ましくは、ヒトＡＰＰロンドン型は配列番号：３によりコードされる。
【００２３】
好ましくは、第一のトランスジェニックＤＮＡ配列は、ヒトＡＰＰスウェーデン型をコードする。
【００２４】
プレセニリン２（ＰＳ２）
プレセニリン２（ＰＳ）は、γ−セクレターゼ複合体のタンパク質である。γ−セクレターゼは、ＡＰＰのプロセシングに関与する（図１参照）。
【００２５】
本明細書に使用されるような「プレセニリン２をコードするＤＮＡ配列」または「ＰＳ２遺伝子」という用語は、１９９５年６月２８日に提出された米国特許出願第０８／４９６，８４１号に最初に開示および記載され、その後Rogaevら（Nature. 1995; 376(6543):775-8）およびLevy Lahadら（Ann Neurol. 1995; 38(4):678-80）に記載された、任意の対立遺伝子変異体および異種特異的な哺乳動物ホモログを含めた哺乳動物遺伝子を表す。一つのヒトプレセニリン−２（ｈＰＳ２）ｃＤＮＡ配列は、本明細書に配列番号：９として開示されている。
【００２６】
「プレセニリン−２遺伝子」または「ＰＳ２遺伝子」という用語は、主にコード配列に関するが、フランキング調節領域および／またはイントロンの一部または全てもまた含みうる。ＰＳ２遺伝子という用語には、具体的に、スプライス変異体に基づくリコンビナント遺伝子を含めた、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから創出された人工またはリコンビナント遺伝子が含まれる。プレセニリン−２遺伝子は、Ｅ５−１遺伝子とも呼ばれてきた。
【００２７】
アルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤ型病態に関連する突然変異を含むヒトプレセニリン２タンパク質は、好ましくはＮ１４１Ｉ、Ｔ１２２Ｐ、Ｍ２３９ＶまたはＭ２３９Ｉ置換を有するヒトＰＳ２である（Shen et al., PNAS, 2007, 104(2):403-409）。さらに好ましくは、アルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤ型病態に関連する突然変異を含むヒトプレセニリン２タンパク質は、Ｎ１４１Ｉ置換を有するヒトＰＳ２である。
【００２８】
したがって、第二のトランスジェニックＤＮＡ配列は、好ましくはＮ１４１Ｉ置換を有するヒトＰＳ２をコードする。最も好ましくは、配列番号：１９をコードするＤＮＡ配列である。
【００２９】
抗体
抗体は、「Ｙ」形の分子であり、２本の重鎖および２本の軽鎖から成る。重鎖および軽鎖共に、異なる型およびサブタイプがある。各重鎖および各軽鎖は、定常領域および可変領域を有し、重鎖については定常領域のサイズの方が大きい。
【００３０】
「定常領域」または「Ｃ領域」という用語は、抗体分子の領域を表し、その領域は、同じ種の生物により産生される特異性の異なる抗体の対応する領域とほぼ同一である。同じ抗体クラス（アイソタイプ）の中で定常部は不変であり、特定の免疫グロブリンサブクラスのエフェクター機能を担う。Ｆｃフラグメントは、酵素パパインを用いた抗体の切断により発生する、定常領域の大部分を含む抗体フラグメントである。
【００３１】
本明細書に使用されるような「可変領域」という用語は、特異的抗原に結合する抗体分子の領域を表す。それは、重鎖および軽鎖の抗原結合部位の組合せから構成される。それは、異なるＢ細胞の免疫グロブリンの間で異なり、同じＢ細胞により産生される全ての免疫グロブリンに関して同じである。可変領域は、Ｂ細胞の成熟時に起こる遺伝子組換え過程により体細胞的に発生する。任意の所与の抗原に結合するために必要な莫大な多様性を創出するのは、そしてそのように外来及び病原性構造により提起される無数の抗原の重荷を免疫系が認識及び中和できるようにするのは、この再編成過程である。結果として、抗体プールは、同じＦｃ部を共有する一方で、異なるＶ領域の大きなレパートリーを担持する免疫グロブリンから構成される。
【００３２】
「フラグメント結合性抗原」または「Ｆａｂフラグメント」という用語は、抗原結合性可変領域を含む抗体フラグメントであって、酵素パパインを用いた抗体の切断によって発生する抗体フラグメントである。
【００３３】
本明細書に使用されるような「イディオタイプ領域」という用語は、各抗体型について独特な、抗体の可変領域の部分を表す。
【００３４】
第三のトランスジェニックヌクレオチド配列は、β−アミロイドペプチドに対する抗体の軽鎖をコードする。好ましくは、該抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。さらに好ましくは、該抗体は免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）である。最も好ましくは、該抗体は治療用抗体Ｍａｂ１１である（国際公開公報第０３／０７０７６０号）。
【００３５】
第四のトランスジェニックヌクレオチド配列は、β−アミロイドペプチドに対する抗体の重鎖をコードする。好ましくは、該抗体は、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体である。さらに好ましくは、該抗体は免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）である。最も好ましくは、該抗体は治療用抗体Ｍａｂ１１である（国際公開公報第０３／０７０７６０号）。
【００３６】
「β−アミロイドペプチド」または「Ａ−β」という用語は、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼによるＡＰＰ切断により産生されるペプチドを表す。そのペプチドは、３９〜４３個のアミノ酸を有する。それは、アルツハイマー病患者の脳におけるアミロイド斑の主構成成分である。好ましくは、β−アミロイドペプチドはヒトβ−アミロイドペプチドである。
【００３７】
好ましくは、第四のトランスジェニックヌクレオチド配列は、分泌抗体の重鎖をコードする。そのような好ましいＤＮＡ配列は、膜貫通ドメインをコードする配列を欠如している。
【００３８】
第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列は、一つのプロモーター（すなわち第三のプロモーター）と作動可能に連結されてもよいし、それぞれ別のプロモーターに作動可能に連結されてもよい（すなわち第三のトランスジェニックＤＮＡ配列は第三のプロモーターに作動可能に連結し、第四のＤＮＡ配列は第四のプロモーターに作動可能に連結される）。
【００３９】
プロモーター
本明細書に使用されるような「作動可能に連結された」という用語は、適切な転写活性化因子タンパク質が調節配列に結合している場合に、ＤＮＡ配列および調節配列が遺伝子発現を許すように連結していることを意味する。
【００４０】
本明細書に使用されるような「調節配列」という用語は、タンパク質発現をコントロールしているタンパク質に関する結合部位であるヌクレオチド配列を表す。調節配列は、例えばプロモーターまたはエンハンサーであってもよい。
【００４１】
本明細書に使用されるような「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子に結合して転写を開始する遺伝子の領域を表す。
【００４２】
本明細書に使用されるような「エンハンサー」という用語は、同じＤＮＡ分子上の最も近いプロモーターの活性を増加させることにより遺伝子転写速度を増加させるヌクレオチド配列を表す。
【００４３】
第一のプロモーターは、ニューロンに作動可能に連結されたＤＮＡを発現する任意のプロモーターであってもよい。第一のプロモーターは、遍在的プロモーターであってもよい。好ましくは、第一のプロモーターはニューロンのプロモーターである。さらに好ましくは、第一のプロモーターは脳特異的プロモーターである。
【００４４】
「組織特異的プロモーター」という用語は、組織特異的に、例えば脳組織、筋組織、肝臓組織、腎臓組織などにおける遺伝子発現をコントロールおよび指令するプロモーターを表す。脳特異的プロモーターは、脳組織における遺伝子発現をコントロールおよび指令するプロモーターである。最も好ましくは、第一のプロモーターはプリオン遺伝子のプロモーターである。
【００４５】
第一のプロモーターは、また、コントロール可能なプロモーターであってもよい。コントロール可能なプロモーターは、例えば特異的誘導因子またはリプレッサー物質の添加により調節および／または誘導可能なように導入遺伝子の発現をコントロールする任意のプロモーターであってもよい。いくつかの誘導性細菌プロモーターが当技術分野において公知である（Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H; Nat Biotechnol 1996; 14(4): 499-503; van der Neut R; Targeted gene disruption: applications in neurobiology; J Neurosci Methods 1997; 71(1): 19-27; Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su IJ, Chang TY; Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines. Biotechniques. 1998; 24(4): 624-8, 630-2）。
【００４６】
第二のプロモーターは、作動可能に連結されたＤＮＡをニューロンに発現する任意のプロモーターであってもよい。第一のプロモーターは、遍在的プロモーターであってもよい。好ましくは、第二のプロモーターはニューロンのプロモーターである。さらに好ましくは、第二のプロモーターは脳特異的プロモーターである。
【００４７】
「組織特異的プロモーター」という用語は、組織特異的に、例えば脳組織、筋組織、肝臓組織、腎臓組織などにおける遺伝子発現をコントロールおよび指令するプロモーターを表す。脳特異的プロモーターは、脳組織における遺伝子発現をコントロールおよび指令するプロモーターである。最も好ましくは、第二のプロモーターはＴｈｙ１．２糖タンパク質プロモーターである。
【００４８】
第二のプロモーターは、また、コントロール可能なプロモーターであってもよい。コントロール可能なプロモーターは、例えば特異的誘導因子またはリプレッサー物質の添加により調節および／または誘導可能なように導入遺伝子の発現をコントロールする任意のプロモーターであってもよい。いくつかの誘導性細菌プロモーターが当技術分野において公知である（Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H; Nat Biotechnol 1996; 14(4): 499-503; van der Neut R; Targeted gene disruption: applications in neurobiology; J Neurosci Methods 1997; 71(1): 19-27; Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su IJ, Chang TY; Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines. Biotechniques. 1998; 24(4): 624-8, 630-2）。
【００４９】
第三のプロモーターは、遍在的プロモーターまたはリンパ組織特異的プロモーターであってもよい。
【００５０】
好ましくは、第三のプロモーターは、ＭＨＣクラスＩ遺伝子のプロモーターである。同様に好ましくは、第三のトランスジェニックＤＮＡ配列は、エンハンサーと作動可能に連結される。さらに好ましくは、エンハンサーはＩｇＨエンハンサーである。
【００５１】
第三のプロモーターは、同様にコントロール可能なプロモーターであってもよい。コントロール可能なプロモーターは、例えば特異的誘導因子またはリプレッサー物質の添加により、調節および／または誘導可能なように導入遺伝子の発現をコントロールする任意のプロモーターでありうる。いくつかの誘導性細菌プロモーターが当技術分野において公知である（Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H; Nat Biotechnol 1996; 14(4): 499-503; van der Neut R; Targeted gene disruption: applications in neurobiology; J Neurosci Methods 1997; 71(1): 19-27; Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su IJ, Chang TY; Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines. Biotechniques. 1998; 24(4): 624-8, 630-2）。
【００５２】
第四のプロモーターは、遍在的プロモーターまたはリンパ組織特異的プロモーターでありうる。好ましくは、第四のプロモーターは、ＭＨＣクラスＩ遺伝子のプロモーターである。同様に好ましくは、第四のトランスジェニックＤＮＡ配列は、エンハンサーと作動可能に連結される。さらに好ましくは、エンハンサーはＩｇＨエンハンサーである。
【００５３】
第四のプロモーターは、同様にコントロール可能なプロモーターであってもよい。コントロール可能なプロモーターは、例えば特異的誘導因子またはリプレッサー物質の添加により、調節および／または誘導可能なように導入遺伝子の発現をコントロールする任意のプロモーターであってもよい。いくつかの誘導性細菌プロモーターが当技術分野において公知である（Schultze N, Burki Y, Lang Y, Certa U, Bluethmann H; Nat Biotechnol 1996; 14(4): 499-503; van der Neut R; Targeted gene disruption: applications in neurobiology; J Neurosci Methods 1997; 71(1): 19-27; Liu HS, Lee CH, Lee CF, Su IJ, Chang TY; Lac/Tet dual-inducible system functions in mammalian cell lines. Biotechniques. 1998; 24(4): 624-8, 630-2）。
【００５４】
トランスジェニック非ヒト動物は、それ自体の抗体もまた産生することから、ヒト重鎖および軽鎖は、内因性重鎖および軽鎖と混合されて混合型内因性／トランスジェニック抗体を形成しうる。マウスの場合、混合型マウス／ヒト抗体が形成しうる。ヒト重鎖および軽鎖がリンパ組織外で産生されるならば、内因性重鎖および軽鎖が存在しないことから、純粋なトランスジェニック抗体が形成するであろう。したがって、第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターは、好ましくはリンパ組織と非リンパ組織の両方に発現しているプロモーターである。
【００５５】
トランスジェニック動物／導入遺伝子の組込み
トランスジェニックＤＮＡ配列は、動物細胞の全てまたは一部に、特に生殖細胞に組込まれる。ゲノムへの組込みは、一過性または安定的でありうる。好ましくは、組込みは安定的である。
【００５６】
トランスジェニック動物は、第一、第二、第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列についてヘテロ接合性またはホモ接合性であってもよい。トランスジェニック動物は、一部のトランスジェニックＤＮＡ配列、例えば第一および第二のトランスジェニックＤＮＡ配列についてヘテロ接合性であり、残り、例えば第三および第四のＤＮＡ配列についてはホモ接合性でありうる。好ましくは、トランスジェニック動物は、少なくとも一つのトランスジェニックＤＮＡ配列についてホモ接合性である。
【００５７】
トランスジェニック動物は、任意の非ヒト動物であってもよい。好ましくは、非ヒトトランスジェニック動物は、哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスなどのげっ歯動物であり、最も好ましくは非ヒトトランスジェニック動物はマウスである。
【００５８】
トランスジェニック動物の作製
トランスジェニック非ヒト動物は、非ヒト動物であってもよい。好ましい非ヒト動物は哺乳動物である。さらに好ましくは、非ヒト動物はマウスまたはラットなどのげっ歯動物である。トランスジェニック非ヒト動物の作製法は、当技術分野で周知である。適切な方法は、すなわちHogan B., Beddington R., Costantini F. & Lacy E. Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual. 2nd Edition (1994). Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
【００５９】
トランスジェニックタンパク質は、遍在的に発現しうる。好ましくは、第一および第二のトランスジェニックＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質は、ニューロンに発現する。さらに好ましくは、第一および第二のトランスジェニックＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質は、脳組織に発現する。好ましくは、第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質は、リンパ組織に発現する。さらに好ましくは、第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質は、リンパ組織および非リンパ組織の両方に発現する。
【００６０】
上記のトランスジェニック非ヒト動物は、遺伝的、分子的および行動的に分析することができる。
【００６１】
使用
上記の四重トランスジェニックマウスは、アルツハイマー病を治療するためのモデルまたはＡＤを予防するためのモデルとして使用することができる。それは、マウスＡＤモデルにおけるＡβアミロイドーシスの開始および過程にヒト抗Ａβ抗体が及ぼす効果を検討可能にする。トランスジェニック動物は、トランスジェニックヒトｍＡｂ１１抗体に対して免疫寛容であることから、例えばＭａｂ１１のような治療用抗体を用いた慢性処置の効果を判定することができる。また、可溶性Ａβレベルならびに血管アミロイドーシスの過程および動態に及ぼす効果をたどることができる。
【００６２】
さらに、上記の四重トランスジェニック非ヒト動物は、ヒト抗体を用いたアルツハイマー病の予防的処置の有効性および効果を判定するための興味深い道具である。
【００６３】
今回、本発明を全般的に説明したが、以下の図面と関連づけて具体的な実施例の参照により本発明がよりよく理解されよう。それらは、解説のために本明細書に含まれるのみであり、特に明記しない限り限定を意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＡＰＰのプロセシングの略図である。Ａ）アミロイド前駆体タンパク質。三つのセクレターゼの切断部位を表示する（α：αセクレターゼ、β：βセクレターゼ、γ：γセクレターゼ）。
【図２】アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のプロセシングの略図である。ＡＰＰは、二つの経路によりタンパク質分解性プロセシングを受けるおそれがある。α−セクレターゼによる切断は、Ａ−βドメイン内で起こり、大型の可溶性Ｎ−末端ＡＰＰαおよび非アミロイド形成性Ｃ−末端フラグメントを発生する。ｇ−セクレターゼによるこのフラグメントのさらなるタンパク質分解により、非アミロイド形成性ペプチドｐ３が発生する。または、β−セクレターゼによるＡＰＰの切断は、Ａβドメインの開始部で起こり、それによりより短い可溶性Ｎ−末端であるＡＰＰβ、並びにアミロイド形成性Ｃ末端フラグメント（Ｃ９９）が発生する。γ−セクレターゼによるこのＣ−末端フラグメントのさらなる切断により、Ａβが発生する。一つまたは複数のγ−セクレターゼによる切断は、ＡβのＣ末端不均一性を招いて、Ａβ４０およびＡβ４２を発生させることができる。
【化１】
【図３】遺伝子構築物の略図である。Ａ）マウスＴｈｙ１．２糖タンパク質遺伝子（ＭＴｈｙ１．２）に包埋された、Ｋ６０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ置換を有するヒトβＡＰＰ７５１（ヒトβＡＰＰ７５１−ＳＦＡＤ）をコードするＤＮＡを含む構築物。ＫＰＩ：Kunitzプロテアーゼインヒビタードメイン；Ａβ：βアミロイドペプチド；ＥＩ：エキソンＩ；ＥＩＩ：エキソンＩＩ；ＥＩＶ：エキソンＩＶ；ＡＴＧ：開示コドン；ＴＡＧ：終止コドン。Ｂ）マウスプリオン（ｐＰｒＰＨＧ）に包埋された、Ｎ１４１置換を有する突然変異ヒトプレセニリン２（ｈＰＳ２−Ｎ１４１Ｉ）をコードするＤＮＡを含む構築物。Ｅ１：エキソン１、Ｅ２：エキソン２、ＵＴＲ：非翻訳領域；ＡＴＧ：開始コドン；ＴＡＧ：終止コドン。Ｃ）β−アミロイドペプチドに対するヒト抗体ＩｇＧ１．１（Ｍａｂ１１）の重鎖をコードするＤＮＡを含む構築物。ＭＨＣ−Ｉ：Ｈ−２ｋプロモーター領域、ＶＨ：抗体の重鎖可変領域、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３：抗体の重鎖定常領域、ＩｇＨエンハンサー：マウスＩｇＨ遺伝子の転写エンハンサーエレメント。Ｄ）β−アミロイドペプチドに対するヒト抗体ＩｇＧ１．１（Ｍａｂ１１）の軽鎖をコードするＤＮＡを含む構築物。ＭＨＣ−Ｉ：Ｈ−２ｋプロモーター領域、ＶＬ：その抗体の軽鎖可変領域、ＣＬ：その抗体の軽鎖定常領域、ＩｇＨエンハンサー：マウスＩｇＨ遺伝子の転写エンハンサーエレメント。
【図４】トランスジェニック発現のための発現ベクターｐＨＳＥ３’にクローニングされたような、ヒトＡβに特異的なヒトＩｇγ１遺伝子のコード配列全体（配列番号：１０）を示す図である。ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの位置および名前を、対応する配列の上または下に示す。終止コドンを太字で示す。リーダー配列は太字で下線付きで示す。
【図５】トランスジェニック発現のための発現ベクターｐＨＳＥ３’にクローニングされたような、ヒトＡβに特異的なヒトＩｇκ遺伝子のコード配列全体（配列番号：１１）を示す図である。ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの位置および名前を、対応する配列の上または下に示す。開始および終止コドンは太字で示す。
【図６】Ｂ６．Ｍａｂ１１×Ｂ６．ＰＳ２ＡＰＰマウスの子孫における四重トランスジェニックを検出するためのＰＣＲ電気泳動ゲルの写真である。レーン１：マーカー、レーン２〜７：Ｂ６．Ｍａｂ１１×Ｂ６．ＰＳ２ＡＰＰマウスの子孫マウス。ＩｇＨ：ＩｇＨ特異的ＰＣＲフラグメント；ＩｇＬ：ＩｇＬ特異的異ＰＣＲフラグメント。ＰＳＥＮ２：ＰＳ（Ｎ４１Ｉ）特異的ＰＣＲフラグメント。
【図７】ＡＰＰについて探索されたＢ６．ＭＡＢ１１、Ｂ６．１５２およびＢ６．ＭＡＢ１１．１５２マウス由来の脳ホモジェネートのウエスタンブロットである。Ｂ６．ＭＡＢ１１：ＭＡＢ１１の重鎖および軽鎖についてトランスジェニックのマウス。Ｂ６．１５２：ＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰスウェーデン型についてトランスジェニックのマウス。Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２：ＭＡＢ１１の重鎖および軽鎖ならびにＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰスウェーデン型についてトランスジェニックのマウス。ＡＰＰ：アミロイド前駆体タンパク質、ＣＴＦ：Ｃ末端フラグメント、Ａβ：βアミロイドペプチド。
【図８】野生型、Ｍａｂ１１トランスジェニックマウス（Ｂ６．ＭＡＢ１１）、ＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰｓｗダブルトランスジェニックマウス（Ｂ６．１５２）ならびにＭＡＢ１１の重鎖および軽鎖およびＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰスウェーデン型について四重トランスジェニックなマウス（Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２）の前頭皮質の組織切片の蛍光顕微鏡画像である。マウスは８月齢であり、切片はマウス抗Ａｂモノクローナル抗体（ＢＡＰ２／Ａｌｅｘａ５５５コンジュゲート）で染色した。四重トランスジェニックマウスにおけるＭＡＢ１１のトランスジェニック発現は、斑形成を完全に予防する。
【図９】野生型、Ｍａｂ１１トランスジェニックマウス（Ｂ６．ＭＡＢ１１）、ＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰｓｗダブルトランスジェニックマウス（Ｂ６．１５２）ならびにＭＡＢ１１の重鎖および軽鎖およびＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰスウェーデン型について四重トランスジェニックなマウス（Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２）の前頭皮質の組織切片の蛍光顕微鏡像である。マウスは８月齢であり、切片はチオフラビン−Ｓで染色した。四重トランスジェニックマウスにおけるＭＡＢ１１の発現は、斑形成を完全に予防する。
【図１０】Ｍａｂ１１トランスジェニックマウス（Ａ）および四重トランスジェニックマウス（Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２）（Ｂ）から採取された血漿中のヒトＩｇＧ、すなわちＭＡＢ１１の測定レベルの略図である。異なる独立した方法を比較した。（ｉ）
【化２】
Ａβ抗原により捕獲され、Ｆｃ特異的検出抗体により検出されたヒトＩｇＧ、（ｉｉ）
【化３】
抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）により捕獲され、（Ｈ＋Ｌ）特異的検出抗体により検出されたヒトＩｇＧおよび（ｉｉｉ）
【化４】
抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）により捕獲され、Ｆｃ特異的検出抗体により検出されたヒトＩｇＧ。
【図１１】ヒトＩｇＧ Ｍａｂ１１で探索された四重トランスジェニックマウスＢ６．ＭＡＢ１１．１５２、すなわち非トランスジェニックのバックグラウンド（Ｃ５７Ｂｌ／６）のＭａｂ１１トランスジェニックマウスＢ６．ＭＡＢ１１からの脳ホモジェネートのウエスタンブロットである。Ｍａｂ１１の測定可能な最小量を決定するために、非トランスジェニックマウスＢ６（Ｃ５７Ｂｌ／６）の脳ホモジェネートに異なる濃度（１０、３、１、０．３、０．１および０．０３μg/ml）で抗体を添加した。非トランスジェニックマウスから採取した血漿は末梢中のＭａｂ１１についての対照である。
【図１２】Ａβについて探査された、１６月齢マウスからの脳ホモジェネートのウエスタンブロットである。非トランスジェニック野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、四重トランスジェニックマウスＢ６．ＭＡＢ１１．１５２およびＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰｓｗダブルトランスジェニックマウスＢ６．１５２から脳を取り出した。陰性対照として、第一のレーンでは脳ホモジェネートを含まない試料緩衝液にＭＡＢ１１を添加した。
【図１３】Ｂ６．１５２およびＢ６．ＭＡＢ１１．１５２マウスからの脳ホモジェネート中のＡβ解離後の不溶性Ａβ測定値（Ａβ４０および４２）（ng/mg脳）のグラフである。１〜４：ＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰｓｗダブルトランスジェニックマウス（Ｂ６．１５２）：１＝４月齢；２＝８月齢、３＝１２月齢、４＝１６月齢；５〜８：四重トランスジェニックマウス（Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２）：５＝４月齢；６＝８月齢、７＝１２月齢、８＝１６月齢。Ａ）：雌性マウスで測定したＡβ４２、Ｂ）雄性マウスで測定したＡβ４２、Ｃ）雌性マウスで測定したＡβ４０、Ｄ）雄性マウスで測定したＡβ４０。
【図１４】血管アミロイド沈着および内皮細胞について二重免疫染色された、Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２から採取された皮質切片の最大値投影として視覚化された共焦点走査顕微鏡像である。図１４ＡおよびＤは、それぞれ低倍率および高倍率で染色したアミロイド沈着のＢＡＰ２染色を示す。比較のために、図１４ＢおよびＥは、それぞれ低倍率および高倍率で染色したＣＤ３１（内皮細胞マーカー）により微小管の分布を示す。図１４ＣおよびＦは、両染色をマージしたチャネルを示す。
【図１５】ダブルトランスジェニックＢ６．１５２マウスから採取された最大強度投射として視覚化された共焦点操作顕微鏡像（Ａ〜Ｃ）および高解像度での四重トランスジェニックＢ６．ＭＡＢ１１．１５２からの皮質微小管の単一共焦点面像（Ｄ〜Ｆ）である。図１５ＡおよびＤは、アミロイド沈着のＢＡＰ２染色を示す。図１４ＢおよびＥはＣＤ３１（内皮細胞マーカー）の染色を示す。図１４ＣおよびＦは、両染色をマージしたチャネルを示す。
【００６５】
実施例：
実施例に参照された市販の試薬は、特に言及しない限り製造業者の説明書に準じて使用した。
【００６６】
実施例１：トランスジェニック構築物（図１）
ＡＰＰＳｗｅ構築物：ヒトβＡＰＰ７５１をコードするｃＤＮＡはD. Goldgaber教授から贈与してもらった。スウェーデン型家族性ＡＤ二重突然変異（ＳＦＡＤ、Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ置換）を部位特異的突然変異誘発により導入した。Ｔｈｙ１．２−ｈｕβＡＰＰ７５１ＳＦＡＤ導入遺伝子は、マウスＴｈｙ−１．２糖タンパク質遺伝子およびプロモーターを含む発現ベクター（配列番号：２、ＡＣ：Ｍ１２３７９）のＸｈｏＩ部位に約２．４kbpのｈｕβＡＰＰ７５１ＳＦＡＤ ｃＤＮＡフラグメント（配列番号：１、ＡＣ：Ｘ０６９８９のヌクレオチド３２〜２３６９）を挿入することにより発生させた。この発現ベクターは、マウスＴｈｙ１．２遺伝子を含む６．８kbpのＮｏｔＩフラグメントを有し（Andra K, et al., (1996) Expression of APP in transgenic mice: a comparison of neuron-specific promotors. Neurobiol Aging 17:183-190; Vidal M, et al., (1990) Tissue-specific control elements of the Thy-1 gene. EMBO J 9:833-840）、そのフラグメントでは、エキソン２および４に位置する１．５kbpのＢａｍＩ−ＸｈｏＩフラグメントがＸｈｏＩクローニング部位に置換えられている。その構築物の部分配列を配列番号：４に示す（ヌクレオチド１−２６０２は、ＭＭＴＨＹＧＰ、ＡＣ：Ｍ１２３７９（２７．４．１９９３と同様）、マウスＴｈｙ−１．２糖タンパク質遺伝子（ＸｂａＩ−ＢａｎＩ）、ヌクレオチド２６０３−４９８２は、ｈβＡＰＰ７５１ ＳＦＡＤ（ＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−平滑末端、２４００bp）、ＡＣ：Ｘ０６９８９（０９．０１．２００３と同様）、（ｎｔ：３２−２４００）Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌを有する、ヌクレオチド４９８３−６１１２は、ＭＭＴＨＹＧＰ、ＡＣ：Ｍ１２３７９（２７．４．１９９３と同様）、ＸｈｏＩ−ＰｏｌｙＡ部位（エキソンＩＶ））。
【００６７】
ＰＳＥＮ２ｍｕｔ構築物：ＦＡＤ突然変異Ｎ１４１ＩをヒトＰＳＥＮ２ ｃＤＮＡ（配列番号：９、ＡＣ：Ｌ４３９６４）に導入した。トランスジェニックマウスに発現させるために、マウスプリオン遺伝子に基づくベクターを使用した（ｐＰｒＰＨＧ）（Fischer et al., 1996; Borchelt et al., 1996）。プリオン遺伝子コード領域を包含するＫｐｎＩ−ＮａｒＩフラグメントを欠失させ、独特なＳｃｅｌ部位に置換えた。平滑末端ライゲーションによりプレセニリン２コード配列を挿入し、挿入部位の配列決定により検証した。
【００６８】
Ｍａｂ１１構築物：ヒトＡｂペプチドに特異性を有するアイソタイプγ１の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖（Ｈ）をコードするｃＤＮＡ（配列番号：１０）およびヒトＡｂペプチドに特異性を有するアイソタイプκの軽鎖（Ｌ）をコードするｃＤＮＡ（配列番号：１１）を使用した［Bardroff, M. et.al., Anti-amyloid beta antibodies and their use。国際公開公報第０３０７０７６０号］。表１のプライマーを使用したＰＣＲ反応でｃＤＮＡを増幅させた。ｐＨＳＥ３’ベクターへの部位特異的挿入のための５’プライマーはＳａｌＩ（または適合性のＸｈｏＩ）部位を含み、５’プライマーはＢａｍＨＩ（または適合性のＢｇｌＩＩ）部位を含む［Pircher, H., et al., T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chain transgenic mice. Embo J, 1989. 8(3): p.719-27.］。ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡは、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩの両方の制限酵素で最初に酵素的に切断し、次に、ベクターｐＨＳＥ３’の対応する部位に個別に挿入した。ｐＨＳＥ３’でのＩｇ ｃＤＮＡの発現は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子Ｈ−２ｋのマウスプロモーターによりドライブされ、クローニングされた遺伝子の３’に位置するマウスＩｇＨ遺伝子エンハンサーにより高まる［Pircher, H., et al., T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chain transgenic mice. Embo J, 1989. 8(3): p. 719-27.］。この発現ベクターは、トランスジェニックマウスのＴおよびＢリンパ球における対応する挿入された遺伝子産物の高レベルの産生を確実にする（［Pircher, H., et al., T cell tolerance to Mlsa encoded antigens in T cell receptor V beta 8.1 chain transgenic mice. Embo J, 1989. 8(3): p.719-27.］）。次に、（５’から３’方向に）：Ｈ−２ｋプロモーター、挿入されたｃＤＮＡ、ポリ−Ａおよびスプライス部位ならびにＩｇＨ遺伝子エンハンサーエレメントを含む発現カセット全体を、ＸｈｏＩを用いた制限酵素切断およびアガロースゲル精製によりベクターから切り出し、受精したマウス卵母細胞にマイクロインジェクションするために適切な濃度で調製した（１０mM ＴｒｉｓＨＣｌ／０．１mM ＥＤＴＡへの２μg/ml溶液、ｐＨ７）。ｃＤＮＡのコード潜在性は、抗Ａβ ＩｇＨおよびＩｇＬ遺伝子をコードするｃＤＮＡ全体を配列決定することにより確認した。
【００６９】
【表２】
【００７０】
実施例２．トランスジェニックマウスの作製
Ｂ６．ＰＳ２ＡＰＰトランスジェニックマウス（Ｂ６．１５２系統）の作製：トランスジェニック動物は、本質的に以前に記載されたように作製した（Hogan CF, and Lyacy E. 1995. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. Ed 2. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory）。Ｔｈｙ−１−ｈｕＡＰＰ７５１ＳＦＡＤまたはＰｒｐ−ｈｕＰｓｅｎ２（Ｎ１４１Ｉ）構築物を保有する無ベクター性直鎖フラグメントを１：１の比で混合し、Ｃ５７Ｂｌ／６接合子の雄性前核にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクション後に、偽妊娠したＢ６ＣＢＡＦ１養母の卵管に生存接合子を移植した。生殖細胞系における導入遺伝子の組込みは、ＰＣＲによる導入遺伝子の検出によりＦ１後代で試験した。同時インジェクションされた導入遺伝子は同じ染色体部位に組込まれると一般に仮定されている（Overbeek PA, Aguilar-Cordova E, Hanten G, Schaffner DL, Patel P, Lebowitz RM, and Lieberman MW. 1991. Coinjection strategy for visual identification of transgenic mice. Transgenic Res. 1, 31-37）。
【００７１】
Ｂ６．Ｍａｂ１１（抗Ａβ ＩｇＧ１トランスジェニックマウス）の作製：ＥＰ−Ａ−１７４８２９４に以前に記載されたように、トランスジェニック動物を作製した。Ｃ５７ＢＬ／６雌性ドナーから得られた、受精した卵母細胞に、前節記載のＩｇＨおよびＩｇＬ遺伝子をコードする精製ＸｈｏＩフラグメント（Ｍａｂ１１構築物）の１：１混合物をマイクロインジェクションして、Ｂ６．Ｍａｂ１１動物を得た。マイクロインジェクション後に、偽妊娠したＢ６ＣＢＡＦ１養母の卵管に生存接合子を移植した。生殖細胞系における導入遺伝子の組込みは、ＰＣＲによる導入遺伝子の検出によりＦ１後代で試験した。同時インジェクションされた導入遺伝子は同じ染色体部位に組込まれると一般に仮定されている（Overbeek PA, Aguilar-Cordova E, Hanten G, Schaffner DL, Patel P, Lebowitz RM, and Lieberman MW. 1991. Coinjection strategy for visual identification of transgenic mice. Transgenic Res. 1, 31-37）。全体で、トランスジェニックＩｇＨおよびＩｇＬ遺伝子の両方を担持する５匹のダブルトランスジェニックマウスならびにＩｇＨ遺伝子のみを担持する１匹のシングルトランスジェニックマウスを作製し、繁殖させた。
【００７２】
Ｂ６．Ｍａｂ１１．ＰＳ２ＡＰＰトランスジェニックマウス（系統Ｂ６．Ｍａｂ１１．１５２）の作製：Ｍａｂ１１導入遺伝子についての雄性ヘテロ接合体と、ｈｕＰＳＥＮ２ｍｕｔおよびｈｕＡＰＰＳｗ導入遺伝子についての雌性ホモ接合体を交配することにより、Ｍａｂ１１についての導入遺伝子ならびにヒトＰＳＥＮ２ｍｕｔおよびＡＰＰＳｗ導入遺伝子の両方を有するトランスジェニックマウスを作製した。結果として得られた子孫は、全ての導入遺伝子についてのヘテロ接合体、またはｈｕＡＰＰＳｗおよびｈｕＰＳＥＮ２のみについてのヘテロ接合体のいずれかである。
【００７３】
実施例３：ＰＣＲ分析
導入遺伝子の存在は、１０日齢マウスから採取された組織生検から単離されたゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲ分析により検出する。増幅されたフラグメントは、導入遺伝子に特異的であり、内因性ＤＮＡ配列と交差反応しない。
【００７４】
Ｂ６．ＰＳ２ＡＰＰマウス（ＡＰＰスウェーデン型−ＰＳ２ｍｕｔダブルトランスジェニックマウス）：プライマー５’−ＡＡＧ ＴＡＴ ＧＴＣ ＣＧＣ ＧＣＡ ＧＡＡ ＣＡＧ ＡＡＧ Ｇ−３’（配列番号：５）および５’−ＣＴＧ ＡＧＡ ＴＡＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ＧＡＣ ＴＴＧ ＧＧＧ ＡＧ−３’（配列番号：６）を使用して、ｈｕＡＰＰおよびｍｕＴｈｙ１配列が重複した９３２bpのフラグメントを増幅する。同様に、プライマー５’−ＴＣＡ ＴＴＧ ＧＣＴ ＴＧＴ ＧＴＣ ＴＧＡ ＣＣＣ Ｔ−３’（配列番号：７）および５’−ＧＣＴ ＴＴＣ ＡＡＣ ＧＴＣ ＡＧＴ ＡＧＧ ＡＣＡ Ａ−３’（配列番号：８）を使用して、ｈｕＰＳＥＮ２ｍｕｔおよびプリオン配列が重複した３２７bpのフラグメントを増幅する。ｈｕＰＳＥＮ２およびｈｕＡＰＰＳｗ導入遺伝子は常に同時分離される。トークリッピング（toe clipping）組織から得られた１μl（約１００ng）の総ＤＮＡを用いて以下の条件でＰＣＲ反応を行った：９５°３分、３５×［９５°３０秒、６０°１分、７２°１分］、７２°５分。ｈｕＡＰＰ導入遺伝子に関する９３２bpおよびｈｕＰＳ２導入遺伝子に関する３２７bpのＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントを１．８％アガロースゲルで視覚化した。
【００７５】
Ｂ６．Ｍａｂ１１マウス（Ｍａｂ１１ダブルトランスジェニックマウス）：特異的プライマーを用いて、尾生検から調製したゲノムＤＮＡを増幅することにより、これらのマイクロインジェクションされた胚から生まれた子を導入遺伝子の存在についてスクリーニングした。使用したプライマーを表２に示す。尾生検から得られた１μl（約１００ng）の総ＤＮＡを使用して、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。９０°１分、３０×［９４°１０秒、６４°３０秒、７２°９０秒］、７２°７分。それぞれ約１２７０bpおよび６６０bpのＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントを、トランスジェニックＩｇＨおよびＩｇＬ遺伝子について別々に１．５％アガロースゲルで最終的に視覚化した。
【００７６】
【表３】
【００７７】
ＭＡＢ１１．ＰＳ２ＡＰＰマウス（図２）：マルチプレックスＰＣＲ反応においてＭＨＣプロモーター領域に特異的なプライマー５’−ＡＴＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＣＡＧ ＴＴＴ ＣＡＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＡＣＣ−３’（配列番号：１６）およびそれぞれγ鎖およびκ鎖に特異的なプライマー５’−ＴＧＴ ＡＣＴ ＣＣＴ ＴＧＣ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＣ−３’（配列番号：１７）および５’−ＧＣＴ ＣＡＴ ＣＡＧ ＡＴＧ ＧＣＧ ＧＧＡ ＡＧ−３’（配列番号：１８）をｈｕＰＳＥＮ２プライマー（配列番号：７および８）に添加する。全ての導入遺伝子の存在下で、それぞれｈｕＰＳＥＮ２、ｈｕＩｇ重鎖およびｈｕＩｇ軽鎖導入遺伝子について３２７bp、６００bpおよび１２００bpの異なるサイズの三つのＰＣＲ産物を増幅する。
【００７８】
トークリッピング組織から得られた１．５μl（約１５０ng）の総ＤＮＡを用いて以下の条件でＰＣＲ反応を行った:９５°１分、３０×［９５°３０秒、６２°４０秒、７２°８０秒］、７２°７分。それぞれｈｕＰＳ２、ＩｇＨおよびＩｇＬ導入遺伝子についての３２７bp、約６６０bpおよび１２００bpのＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントを１．５％アガロースゲルで視覚化した。
【００７９】
実施例４：免疫組織化学
Fluothane（登録商標）で麻酔された８月齢マウス（野生型マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６）、Ｍａｂ１１トランスジェニックマウス、ＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰｓｗダブルトランスジェニックマウスおよびＰＳ２（Ｎ１４１Ｉ）／ＡＰＰｓｗ／Ｍａｂ１１四重トランスジェニックマウス）を断頭し、脳を２分し、ドライアイス中でスナップ凍結（snap frozen）した。PaxinosおよびFranklinにしたがって、Leica CM3050 Sクリオスタットを用いて厚さ公称２０μmおよび−１８℃で、約１．９２から１．２mm外側の傍矢状クリオスタット切片を切り出し、Superfrost Plus（商標）スライドにマウントし、−２０℃で保存した。アミロイド斑の染色は、当技術分野の現況の免疫蛍光染色プロトコールにより、またはアミロイド斑に特異的な色素であるチオフラビン−Ｓを用いた染色により行った。簡潔には、切片をＰＢＳ中で水和させ、−２０℃で２分間予冷した１００％アセトンで処理した。ＰＢＳを用いた洗浄を２分間２回行い、続いて２％ウシ血清アルブミンおよび２％卵アルブミンのＰＢＳ溶液中で１５分間インキュベーションすることにより非特異的結合部位をブロッキングし、続いてＰＢＳ洗浄およびAlexa488フルオロホア（Molecular Probes）ｗにコンジュゲーションした高親和性マウスモノクローナル抗体（ＢＡＰ−２）と共にインキュベーションし、０．５mg/mlおよび室温で１時間インキュベーションした。チオフラビン−Ｓを用いた染色は、０．０１２５％でエタノール／ＰＢＳ（４０／６０vol％）中で行った。再蒸留水中でスライドをすすいだ後、蛍光マウント用媒質(S3023, DAKO）を用いてカバーガラスをマウントした。８月齢Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２およびＢ６．１５２の結果を同腹仔対照と共に図８（ＢＡＰ−２）および図９（チオフラビン−Ｓ）に示すが、Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２マウスにおけるアミロイド沈着の完全な不在が実証される。
【００８０】
Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２（２０月齢）マウスおよびＢ６．１５２マウス（２０月齢）の皮質由来で海馬近くの組織スライドを、８月齢動物について上に記載したように調製した。組織スライドを以下のように染色した：
１． １０．０μg/mlのラット／Ｌ抗マウスＣＤ３１（Serotec, ID:1102）濃度のＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋power Block（１×）＋１０％ヤギ血清（ｐＨ７．４）溶液、室温で１ｈインキュベーション、DakoCytomation洗浄緩衝液（トリス緩衝液塩化ナトリウム溶液＋Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ
２． ヤギ／抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡＬＥＸＡ４８８（Molecular Probes, ID:1254）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋１０％ヤギ血清（ｐＨ７．４）に１：１００希釈したもの、室温で１ｈインキュベーション；DakoCytomation洗浄緩衝液（トリス緩衝液塩化ナトリウム溶液＋Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ
３． ５．０μg/mlのマウス／ＢＡＰ−２ａ ＡＬＥＸＡ５５５（EM Labor, ID:1296）濃度のＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋power block（１×）＋１０％ヤギ血清（ｐＨ７．４）溶液、室温で１ｈインキュベーション；DakoCytomation洗浄緩衝液（トリス緩衝液塩化ナトリウム溶液＋Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ
【００８１】
スライドをＤＡＰＩで５分間洗浄し、次にDakoCytomation洗浄緩衝液で２回すすぐ、次に、４mM ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏの５０mM ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４溶液（ｐＨ５．０）で３０分間インキュベーションした。再蒸留水中でスライドをすすいだ後、蛍光マウント用媒質（S3023, DAKO）を用いてカバーガラスをマウントした。
【００８２】
図１４〜１５に結果を示す。Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２マウスの皮質の細い微小管に時に血管アミロイド沈着がある。しかし、同齢のＢ６．１５２マウスは皮質微小管の周りに血管アミロイドを示さなかった。Ｂ６．ＭＡＢ１１．１５２マウスおよびＢ６．１５２マウスの間では、脳膜血管および心室血管などのより大型の血管に観察された血管アミロイドーシスの程度に明らかな差はなかった。
【００８３】
実施例５：ウエスタンブロット分析およびＡβの測定
ウエスタンブロット分析
総タンパク質抽出物１５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、続いてニトロセルロース膜（Amersham, Hybond）に移行させた。Ａβの検出のために、膜をＰＢＳ（８．１mMリン酸水素二ナトリウム、１．５mMリン酸二水素カリウム、１３７mM塩化ナトリウム、２．７mM塩化カリウム）中で９５℃で５分間加熱してエピトープの変性およびエピトープの提示を増加させ、５％(w/v)の脱脂ドライミルク濃度のＰＢＳＴ（ＰＢＳおよび０．０５％(v/v)Ｔｗｅｅｎ ２０）溶液でブロッキングし、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベーションした。ＡＰＰの検出のために、一次抗体ＷＯ−２（Ida et al., J Biol Chem. 1996, 271(37):22908-l）を濃度１μg/mlで使用した。プレセニリン−２の検出のために、アミノ末端フラグメントを検出するモノクローナル抗体ＰＳＴ−２０を、タウのために抗体Ｔａｕ−５（Invitrogen）を、総ＡＰＰのために抗ＡＰＰ−ＣＴ２０抗体（Calbiochem）を、ヒトＡＰＰのために、ヒトＡＰＰに特異的な抗体ＷＯ−２を使用した（Loetscher et al. J Biol Chem. 1997 Aug 15;272(33):20655-9）。全ての洗浄工程は、４℃でＰＢＳＴを用いて行った。一次抗体の結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲーションした抗ＩｇＧ抗体（Amersham）に続いて、製造業者の説明書にしたがいＥＣＬ検出システム（Amersham）により明らかにした。
【００８４】
Ａβの測定
プロテアーゼインヒビターのカクテル（Complete（商標）, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim-Germany）を含有する１０容(w/v)の９Ｍ尿素、５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で一つの脳半球をホモジェナイズした。４℃で５分間、１５００ｇで遠心分離することにより細胞の破片を除去した。BCA Protein Assay（Pierce, USA）を使用して上清中のタンパク質濃度を測定した。
【００８５】
Czechらが記載したように、液相電気化学発光（ＬＰＥＣＬ）を使用して脳ホモジェネート中のＡβ４０およびＡβ４２レベルを測定した（J Neurochem, 2007. 101(4): 929-36）。簡潔には、Ｍ−２８０常磁性ビーズ（Bioveris）をアッセイ緩衝液（５０mM Tris、６０mM ＮａＣｌ、０．５％ ＢＳＡ、１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で希釈した。脳抽出物５０μlを室温で５０μlのビーズおよび２５μlのラベル化抗体（Ａβ１−４０の検出のために６Ｅ１０−ｂｉｏおよびＢＡＰ２４−ｔａｇ、ならびにＡβ１−４２の検出のために６Ｅ１０−ｂｉｏおよびＢＡＰ２４−ＴＡＧ）と共に最終容積２５０μlで３時間静かに振盪しながらインキュベーションした。M-Series M8分析装置（Bioveris）を使用してＥＣＬを定量した。アッセイ緩衝液で脳ホモジェネートを様々に希釈したものを測定して直線状のシグナル応答を保証し、合成標準Ａβ１−４０およびＡβ１−４２ペプチド（Bachem）と比較した。Ａβペプチドを濃度１mg/mlでＤＭＳＯに溶かし、小分けし、−８０℃で凍結保存した。結果は、それぞれＡβ１−４０およびＡβ１−４２の標準曲線と対比させて脳ホモジェネート１mgあたりのngとして表現した。各試料希釈について２回の繰り返しで測定を行い、少なくとも２回繰り返した。
【００８６】
実施例６：Ｂ６．ｍａｂ１１．１５２マウスにおけるｍａｂ１１のｑＲＴ−ＰＣＲ
脾臓全体を細かく切ったものに７０μM細胞ストレーナーを通過させることにより脾臓細胞を単離し、ＲＮＳ抽出のために系列希釈した。皮質からレーザ顕微解剖で脳試料を採取し、小脳および海馬台を用意し、RNAlater（登録商標）に収集した。Qiagen製RNAeasyキットを使用してＲＮＡを抽出した。QuantiTectプローブＲＴ−ＰＣＲキット(Qiagen)でＰＣＲを行った。製造業者の説明書に準じてTaqMan（登録商標）アッセイ（Applied Biosystems Inc）を行った。プローブは、ｍｕＩＧＨ６＿Ｍｍ０１７１８９５６＿ｍ１（ＩｇＭ＝Ｂ細胞マーカー）、ｍｕＡＰＰ Ｍｍ００４３１８２７＿ｍ１（脳のための参照遺伝子）、ｈｕＨＣ＿ｃｕｓｔｏｍ（ｍａｂ１１ ＩｇＧ１構築物に基づきABIが注文生産）、およびｈｕＬＣ＿ｃｕｓｔｏｍ（ｍａｂ１１ Ｉｇκ構築物に基づきABIが注文生産）であった。
【００８７】
ＬＣ４８０（Roche Diagnostics）でＰＣＲを行った。ターゲットＲＮＡの相対定量はΔＣｔ法により行った。非トランスジェニックマウスからの脳顕微解剖は、Ｍａｂ１１ ＩｇＨおよびＩｇＫ ＲＮＡに関する陽性シグナルを与えなかった。Ｂ６．ｍａｂ１１．１５２マウスについての結果を表３および５に示す。
【００８８】
【表４】
【００８９】
野生型マウスおよびトランスジェニックマウスにおける内因性参照遺伝子ＩｇＭおよびＣＤ２０についての発現は細胞数に依存した。トランスジェニックマウスのみにおいて、ｈｕＩｇについての強く細胞数に依存するシグナルが見られた。野生型マウスではアッセイバックグラウンドに比べてシグナルが検出されなかった（表４および５参照）。
【００９０】
【表５】
【００９１】
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムが、
ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはヒトＡＰＰロンドン型タンパク質をコードし、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のトランスジェニックＤＮＡ配列；
ｂ）Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質をコードし、第二のプロモーターに作動可能に連結された第二のトランスジェニックＤＮＡ配列；
ｃ）アミロイドペプチドに対する抗体の軽鎖をコードし、第三のプロモーターに作動可能に連結された第三のトランスジェニックＤＮＡ配列および；
ｄ）該抗体の重鎖をコードし、第三のプロモーターまたは第四のプロモーターに作動可能に連結された第四のトランスジェニックＤＮＡ配列
を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列が、抗Ａβ抗体Ｍａｂ１１の軽鎖および重鎖をコードする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
第一および第二のプロモーターが、ニューロンのプロモーターである、請求項１または２のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
第一および第二のプロモーターが、脳特異的プロモーターである、請求項１または２のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
第三および／または第四のプロモーターが、ＭＨＣクラスＩ遺伝子のプロモーターである、請求項１〜４のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
第三および／または第四のプロモーターが、ＩｇＨエンハンサーと組合されている、請求項１〜５のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
少なくとも一つのトランスジェニックＤＮＡ配列についてホモ接合性である、請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
非ヒト哺乳動物である、請求項１〜７のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
マウスである、請求項１〜８のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
同一または別の遺伝子型の動物を用いた繁殖により得られる、請求項１〜９のいずれか一項記載の非ヒトトランスジェニック動物の子孫。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項記載の非ヒトトランスジェニック動物または請求項１０記載のその子孫から得られる細胞系または初代細胞培養物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項記載の非ヒトトランスジェニック動物または請求項１０記載のその子孫から得られる組織もしくは器官移植片またはそれらの培養物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項記載の非ヒトトランスジェニック動物または請求項１０記載のその子孫から得られる組織または細胞抽出物。
【請求項１４】
ゲノムが、ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、ならびにβアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードするトランスジェニックＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト動物を発生させるための方法であって、
ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型をコードする第一のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物およびＮ１４１Ｉ置換を有するヒトプレセニリン２タンパク質をコードする第二のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること；
ｂ）アミロイドペプチドに対するヒト抗体の軽鎖をコードする第三のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物および該ヒト抗体の重鎖をコードする第四のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること；
ｃ）ａ）およびｂ）のトランスジェニック動物を交配することによって、ゲノムが、ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、βアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードするトランスジェニックＤＮＡを含む四重トランスジェニック非ヒト動物を作製すること
を含む方法。
【請求項１５】
ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、ならびに（ヒト）βアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖を発現するトランスジェニック非ヒト動物を発生させるための方法であって、
ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型をコードし、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物およびＮ１４１Ｉ置換を有するヒトプレセニリン２タンパク質をコードし、第二のプロモーターに作動可能に連結された第二のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること；
ｂ）ヒトアミロイドペプチドに対するヒト抗体の軽鎖をコードし、第三のプロモーターに作動可能に連結された第三のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物および該ヒト抗体の重鎖をコードし、第四のプロモーターに作動可能に連結された第四のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること；
ｃ）ａ）およびｂ）のトランスジェニック動物を交配することによって、ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、ならびにβアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖を発現する四重トランスジェニック非ヒト動物を作製すること
を含む方法。
【請求項１６】
第一および第二のプロモーターが、ニューロンのプロモーターである、請求項１５記載の作製法。
【請求項１７】
第一および第二のプロモーターが、脳特異的プロモーターである、請求項１５記載の作製法。
【請求項１８】
第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列が、抗Ａβ抗体Ｍａｂ１１の軽鎖および重鎖をコードする、請求項１４〜１７のいずれか一項記載の作製法。
【請求項１９】
第一のプロモーターが、Ｔｈｙ１．２糖タンパク質プロモーターである、請求項１４〜１８のいずれか一項記載の作製法。
【請求項２０】
第二のプロモーターが、プリオン遺伝子である、請求項１４〜１９のいずれか一項記載の作製法。
【請求項２１】
第三および／または第四のプロモーターが、ＭＨＣクラスＩ遺伝子のプロモーターである、請求項１４〜２０のいずれか一項記載の作製法。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれか一項記載の方法により作製される四重トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２３】
アルツハイマー病の治療のためのモデルとしての、請求項１〜９および２２のいずれか一項記載の四重トランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項２４】
アルツハイマー病の予防のためのモデルとしての、請求項１〜９および２２のいずれか一項記載の四重トランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項１】
ゲノムが、
ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはヒトＡＰＰロンドン型タンパク質をコードし、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のトランスジェニックＤＮＡ配列；
ｂ）Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質をコードし、第二のプロモーターに作動可能に連結された第二のトランスジェニックＤＮＡ配列；
ｃ）アミロイドペプチドに対する抗体の軽鎖をコードし、第三のプロモーターに作動可能に連結された第三のトランスジェニックＤＮＡ配列および；
ｄ）該抗体の重鎖をコードし、第三のプロモーターまたは第四のプロモーターに作動可能に連結された第四のトランスジェニックＤＮＡ配列
を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列が、抗Ａβ抗体Ｍａｂ１１の軽鎖および重鎖をコードする、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
第一および第二のプロモーターが、ニューロンのプロモーターである、請求項１または２のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
第一および第二のプロモーターが、脳特異的プロモーターである、請求項１または２のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
第三および／または第四のプロモーターが、ＭＨＣクラスＩ遺伝子のプロモーターである、請求項１〜４のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
第三および／または第四のプロモーターが、ＩｇＨエンハンサーと組合されている、請求項１〜５のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
少なくとも一つのトランスジェニックＤＮＡ配列についてホモ接合性である、請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
非ヒト哺乳動物である、請求項１〜７のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
マウスである、請求項１〜８のいずれか一項記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
同一または別の遺伝子型の動物を用いた繁殖により得られる、請求項１〜９のいずれか一項記載の非ヒトトランスジェニック動物の子孫。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項記載の非ヒトトランスジェニック動物または請求項１０記載のその子孫から得られる細胞系または初代細胞培養物。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項記載の非ヒトトランスジェニック動物または請求項１０記載のその子孫から得られる組織もしくは器官移植片またはそれらの培養物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項記載の非ヒトトランスジェニック動物または請求項１０記載のその子孫から得られる組織または細胞抽出物。
【請求項１４】
ゲノムが、ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、ならびにβアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードするトランスジェニックＤＮＡを含むトランスジェニック非ヒト動物を発生させるための方法であって、
ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型をコードする第一のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物およびＮ１４１Ｉ置換を有するヒトプレセニリン２タンパク質をコードする第二のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること；
ｂ）アミロイドペプチドに対するヒト抗体の軽鎖をコードする第三のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物および該ヒト抗体の重鎖をコードする第四のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること；
ｃ）ａ）およびｂ）のトランスジェニック動物を交配することによって、ゲノムが、ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、βアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖をコードするトランスジェニックＤＮＡを含む四重トランスジェニック非ヒト動物を作製すること
を含む方法。
【請求項１５】
ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、ならびに（ヒト）βアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖を発現するトランスジェニック非ヒト動物を発生させるための方法であって、
ａ）ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型をコードし、第一のプロモーターに作動可能に連結された第一のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物およびＮ１４１Ｉ置換を有するヒトプレセニリン２タンパク質をコードし、第二のプロモーターに作動可能に連結された第二のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること；
ｂ）ヒトアミロイドペプチドに対するヒト抗体の軽鎖をコードし、第三のプロモーターに作動可能に連結された第三のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物および該ヒト抗体の重鎖をコードし、第四のプロモーターに作動可能に連結された第四のトランスジェニックＤＮＡ配列を含む遺伝子構築物を非ヒト接合子または非ヒト胚性幹細胞に同時注入すること、ならびに該接合子または胚性幹細胞からダブルトランスジェニック非ヒト動物を発生させること；
ｃ）ａ）およびｂ）のトランスジェニック動物を交配することによって、ヒトＡＰＰスウェーデン型またはＡＰＰロンドン型、Ｎ１４１Ｉ置換を含むヒトプレセニリン２タンパク質、ならびにβアミロイドペプチドに対するヒト抗体の重鎖および軽鎖を発現する四重トランスジェニック非ヒト動物を作製すること
を含む方法。
【請求項１６】
第一および第二のプロモーターが、ニューロンのプロモーターである、請求項１５記載の作製法。
【請求項１７】
第一および第二のプロモーターが、脳特異的プロモーターである、請求項１５記載の作製法。
【請求項１８】
第三および第四のトランスジェニックＤＮＡ配列が、抗Ａβ抗体Ｍａｂ１１の軽鎖および重鎖をコードする、請求項１４〜１７のいずれか一項記載の作製法。
【請求項１９】
第一のプロモーターが、Ｔｈｙ１．２糖タンパク質プロモーターである、請求項１４〜１８のいずれか一項記載の作製法。
【請求項２０】
第二のプロモーターが、プリオン遺伝子である、請求項１４〜１９のいずれか一項記載の作製法。
【請求項２１】
第三および／または第四のプロモーターが、ＭＨＣクラスＩ遺伝子のプロモーターである、請求項１４〜２０のいずれか一項記載の作製法。
【請求項２２】
請求項１４〜２１のいずれか一項記載の方法により作製される四重トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２３】
アルツハイマー病の治療のためのモデルとしての、請求項１〜９および２２のいずれか一項記載の四重トランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項２４】
アルツハイマー病の予防のためのモデルとしての、請求項１〜９および２２のいずれか一項記載の四重トランスジェニック非ヒト動物の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１４Ｆ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ】
【図１５Ｆ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４−１】
【図４−２】
【図５】
【図６】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１４Ｅ】
【図１４Ｆ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ】
【図１５Ｆ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１１−５０１９５５（Ｐ２０１１−５０１９５５Ａ）
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１４４７（Ｐ２０１０−５３１４４７）
【出願日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００８９７１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５６２５７
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００８９７１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５６２５７
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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