固定化酵素ナノファイバー及びその製造方法並びに該ナノファイバーを用いた反応装置
【課題】製造時に酵素の失活を起こしにくく、高い酵素活性を有し、長期間にわたって安定な固定化酵素ナノファイバー及びその製造方法並びに該ナノファイバーを用いた反応装置を提供する。
【解決手段】固定化酵素ナノファイバー１４は、高分子化合物及び酵素を含む原料溶液をエレクトロスピニング法により紡糸する工程を有する方法を用いて製造することができ、エレクトロスピニング法により紡糸された直径が１００ｎｍ〜３μｍの繊維状の高分子マトリックス中にリパーゼ等の酵素が固定化されている。また、反応装置は、固定化酵素ナノファイバー１４により形成された不織布を固定化酵素担体として用いており、反応効率が高く、バッチ法に比べ経済的効率も向上することができる。
【解決手段】固定化酵素ナノファイバー１４は、高分子化合物及び酵素を含む原料溶液をエレクトロスピニング法により紡糸する工程を有する方法を用いて製造することができ、エレクトロスピニング法により紡糸された直径が１００ｎｍ〜３μｍの繊維状の高分子マトリックス中にリパーゼ等の酵素が固定化されている。また、反応装置は、固定化酵素ナノファイバー１４により形成された不織布を固定化酵素担体として用いており、反応効率が高く、バッチ法に比べ経済的効率も向上することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化酵素ナノファイバー、その製造方法及び該ナノファイバーを用いた反応装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、醸造、チーズなどの発酵、繊維工業、皮革工場、食品工業、化粧品工業、医薬品工業等において、物質の生産や原料加工等に利用されている。酵素反応は温和な反応条件下で高収率かつ高選択的に進行し、副生成物を殆ど生じない。そのため、高効率で環境負荷の小さな化学プロセスとして幅広い分野への応用が期待されている。また、近年では、高い基質特異性を利用したバイオセンサー等への応用もなされている。
従来、酵素反応を用いた物質生産には、主に回分法（バッチ法）が用いられていたが、この方法では、酵素が１度しか使用できないため経済的に不効率であることから、酵素の連続生産プロセスへの適用が検討されている。酵素を連続生産プロセスに適用する場合には、担体上に酵素を固定して反応溶媒に不溶化した固定化酵素が用いられる。酵素の固定化に用いられる担体及び固定化方法は、酵素の変性及び流失の防止、反応基質と酵素との接触面積の確保等の観点から適宜選択される。
【０００３】
従来用いられている酵素の固定化方法としては、不溶性の担体の表面に酵素を物理的又は化学的に結合させる担体結合法（例えば、特許文献１参照）、２以上の官能基を有する架橋剤と酵素の表面官能基とを反応させて、不溶性の巨大分子を形成させる架橋法、網目構造を有する高分子ゲルの格子や、水溶液を包含した水不溶性のマイクロカプセル等で酵素を包み込む包括法（例えば、特許文献２〜４参照）、及びこれらの方法を組み合わせて用いる複合法（例えば、特許文献５及び６参照）等が挙げられる。
【０００４】
【特許文献１】特開昭５９−２１３３９０号公報
【特許文献２】特開昭５８−５１９３号公報
【特許文献３】特開平６−１８１７６３号公報
【特許文献４】特公昭５３−１２９９８号公報
【特許文献５】特開平３−１９６８７号公報
【特許文献６】特公昭６２−１６６３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、担体結合法は、担体粒子の大きさによる表面積の広さが活性効率に及ぼす影響が大きいため、その加工法が問題になる。
架橋法は、多量の酵素を必要とし、架橋剤と反応の際に酵素活性の低下を引き起こす等の問題点が挙げられる。
また、包括法は、マトリックスの形成に重合反応を必要とするような場合には、重合中に酵素の失活が起こりやすいという問題点を有している。
【０００６】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、製造時に酵素の失活を起こしにくく、高い酵素活性を有し、長期間にわたって安定な固定化酵素ナノファイバー及びその製造方法並びに該ナノファイバーを用いた反応装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的に沿う第１の発明に係る固定化酵素ナノファイバーは、エレクトロスピニング法により紡糸された直径が１００ｎｍ〜３μｍの繊維状の高分子マトリックス中に酵素が固定化されている。
なお、「エレクトロスピニング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）法」とは、静電紡糸法、電界紡糸法、電化誘導紡糸法等とも呼ばれている紡糸法の一種で、数十ｋＶの高電圧が印加されたキャピラリー状の紡糸口（正極）から接地された回収板（負極）に向かって、高分子化合物を含む溶液を一定の速度で押し出すことにより紡糸を行う。
【０００８】
第１の発明に係る固定化酵素ナノファイバーにおいて、前記酵素はリパーゼであってもよい。
【０００９】
第１の発明に係る固定化酵素ナノファイバーにおいて、前記高分子マトリックスは、アルコシキシラン化合物の重縮合により生成したシロキサン重合体を含んでいてもよい。
この場合において、前記シロキサン重合体は、ジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランとの混合物の重縮合により生成した共重合体であることが好ましい。
なお、「シロキサン重合体」とは、一般式（ＳｉＲ１Ｒ２Ｏ−）ｎで表される直鎖状、分岐鎖状、及び環状の重合体をいう。なお、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水酸基、アルキル基、及びアリール基のいずれかを表し、ｎは２以上の自然数を表す。例えば、ジアルキルシロキサンは、Ｒ１及びＲ２が両者共にアルキル基であるシロキサン単位を含む単独重合体又は共重合体である。
【００１０】
第２の発明に係る固定化酵素ナノファイバーの製造方法は、紡糸可能な高分子化合物及び酵素を含む原料溶液を調製する工程と、前記原料溶液をエレクトロスピニング法により紡糸する工程とを有する。
【００１１】
第２の発明に係る固定化酵素ナノファイバーの製造方法において、前記酵素はリパーゼであってもよい。
【００１２】
第２の発明に係る固定化酵素ナノファイバーの製造方法において、前記原料溶液が更に１種類又は２種類以上のアルコキシシラン化合物のゾルを含み、前記紡糸する工程においてアルコシキシラン化合物の重縮合によりシロキサン重合体が生成してもよい。
この場合において、前記アルコキシシラン化合物が、ジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランの混合物であることが好ましい。
【００１３】
第３の発明に係る反応装置は、第１の発明に係る固定化酵素ナノファイバーにより形成された不織布を固定化酵素担体として用いている。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１〜４記載の酵素固定化ナノファイバーにおいては、従来の粒状物等の固定化酵素担体と比較すると、単位体積当たりの表面積が大きく、より多くの酵素が表面に露出していると共に、酵素と基質との分子拡散距離を短くすることができるので反応効率が高い。更に、固定化する酵素や酵素反応の特性に応じて、高分子マトリックスの組成等を変化させることが可能であり、表面を化学修飾して、活性や安定性を向上させた酵素を用いることもできる。
【００１５】
特に請求項２記載の固定化酵素ナノファイバーにおいては、酵素としてリパーゼを用いているので、脂肪酸トリグリセリド等のエステルの加水分解、エステル合成、エステル交換、エステルから酸アミドの合成（アミノリシス）等の工業上有用な反応に適用可能である。
【００１６】
請求項３記載の固定化酵素ナノファイバーにおいては、高分子マトリックスがシロキサン重合体を含んでいるので、マトリックス中に固定化された酵素の熱安定性を向上させ、かつ酵素活性を向上させることができる。
【００１７】
請求項４記載の固定化酵素ナノファイバーにおいては、シロキサン重合体がジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランとの混合物の重縮合により生成した共重合体であるので、ナノファイバー中でシロキサン重合体が三次元的な架橋構造を形成し、反応基質の酵素に対するアクセスが容易になり、酵素活性を向上させることができる。
【００１８】
請求項５〜８記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法においては、反応効率が高い固定化酵素ナノファイバーを簡便かつ低コストに製造することができる。また、穏和な条件下で紡糸を行うことができるため、製造工程における酵素の失活を抑制できる。更に、多くの酵素及び高分子に適用可能なため、固定化する酵素や酵素反応の特性等に応じて、高分子マトリックスの組成等を最適化することが可能である。
【００１９】
請求項６記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法においては、酵素としてリパーゼを用いているので、脂肪酸トリグリセリド等のエステルの加水分解、エステル合成、エステル交換、エステルから酸アミドの合成等の工業上有用な反応に適用可能な固定化酵素ナノファイバーを提供できる。
【００２０】
請求項７記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法においては、紡糸する工程においてアルコキシシラン化合物の重縮合によりシロキサン重合体が生成するので、ナノファイバー中に固定化された酵素の熱安定性を向上させ、かつ酵素活性を向上させることができる。
【００２１】
請求項８記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法においては、アルコキシシラン化合物が、ジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランの混合物であるので、ナノファイバー中でシロキサン重合体が三次元的な架橋構造を形成し、反応基質の酵素に対するアクセスが容易になり、酵素活性を向上させることができる。
【００２２】
請求項９記載の反応装置においては、請求項１〜４記載の固定化酵素ナノファイバーにより形成された不織布を固定化酵素担体として用いているので、反応効率が高く、酵素の繰り返し使用が可能であるため、バッチ法に比べ経済的効率も向上することができる。また、固定化酵素担体は不織布であるため、複数枚積層することにより、反応液の流通を確保しつつ単位体積当たりの酵素量を増大させることが容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
続いて、添付した図面を参照しつつ、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。ここで、図１は本発明の第１の実施の形態に係る固定化酵素ナノファイバーの製造に用いられるエレクトロスピニング装置の概略説明図である。
本発明の第１の実施の形態に係る固定化酵素ナノファイバー１４（図１参照）は、直径が１００ｎｍ〜３μｍの繊維状の高分子マトリックス中に酵素が固定化されている。固定化酵素ナノファイバー１４は、紡糸可能な高分子化合物及び酵素を含む原料溶液を調製する工程と、このようにして得られた原料溶液をエレクトロスピニング法により紡糸する工程とを有する方法を用いて製造される。
【００２４】
固定化酵素ナノファイバー１４の製造に使用されるエレクトロスピニング装置１０は、図１に示すように、紡糸原料となる原料溶液（以下、溶液という）１１を一定の流量で送出するためのシリンジポンプ１２、シリンジポンプ１２から送出された溶液１１を噴出するキャピラリー状の紡糸口１３、生成した固定化酵素ナノファイバー１４を回収するための回収板（コレクター）１５とを有する。紡糸口１３と回収板１５とは、間隔が数十ｃｍ程度となるように配置され、紡糸口１３には数十ｋＶの正の電圧が印加され、回収板１５は接地されている。そのため、溶液１１は正に帯電した状態で紡糸口１３から噴出される。静電引力が溶液１１の表面張力よりも大きい場合、帯電した溶液１１のジェットが発生し、回収板１５に向かって飛行する。ジェット中の溶媒は徐々に揮発し、回収板１５に到達する頃には、ジェットの直径はナノメートルオーダーまで減少する。このようにして形成された固定化酵素ナノファイバー１４は、回収板１５上に堆積し、マット状の不織布として回収される。なお、回収板１５を回転させたり、巻き取り機構を設けることにより、固定化酵素ナノファイバー１４を糸状の配向体として回収することもできる。
【００２５】
固定化酵素ナノファイバーの直径は、１００ｎｍ〜３μｍの範囲内である。直径が１００ｎｍ未満だと、機械的強度が低下すると共にビーズと呼ばれる球状の欠陥が生成しやすくなる。また、直径が３μｍを上回ると、表面積の割合が低下するため、酵素活性が低下する。
固定化酵素ナノファイバーの直径は、原料となる溶液１１中の酵素及び高分子化合物の濃度、シリンジポンプ１２からの送出速度、紡糸口１３の太さ、紡糸口１３の電位、紡糸口１３と回収板１５との間隔等によって調節することができるが、これらの各因子と得られる固定化酵素ナノファイバー１４の直径との関係は、用いられる高分子化合物、酵素及び溶媒の種類に依存するため一義的に決定することは困難である。そのため、予備実験等により事前に検討しておくことが好ましい。
【００２６】
固定化酵素ナノファイバーの製造において、高分子マトリックスの材料として用いることができる高分子化合物に特に制限はなく、エレクトロスピニング法による紡糸が可能な任意の高分子化合物を用いることができる。
用いることができる高分子化合物の具体例としては、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレンオキシド、ポリウレタン、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリカプロラクトン等の合成高分子化合物、キチン、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸、デキストラン等の多糖類、コラーゲン、ゼラチン、ポリアルギニン、γ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）、シルク等のポリペプチド系高分子化合物、シリカ又はシロキサン重合体、アルミナ、チタニア等の無機高分子化合物、及びこれらの混合物が挙げられる。これらをベースとして、化学修飾等の手法により、親水性及び疎水性、極性等を変化させた高分子化合物（例えば、ビニロン等）を用いることもできる。
【００２７】
高分子マトリックスの材料として用いられる高分子化合物は、固定化される酵素の種類、酵素反応に用いられる溶媒等に応じて適宜選択される。例えば、反応溶媒として水を用いる場合には、高分子マトリックスの膨潤や溶解を防止するために、ポリスチレン、ポリカーボネート等の疎水性高分子化合物が用いられる。
逆に、反応溶媒としてオクタン等の有機溶媒を用いる場合には、高分子マトリックスの膨潤や溶解を防止するために、ＰＶＡ、ポリエチレンオキシド等の親水性高分子化合物が用いられる。親水性高分子化合物を用いる場合には、酵素分子表面の親水性基との相互作用により酵素を安定化して失活を抑制する効果も期待できる。
或いは、紡糸性の改善等のために疎水性の高分子化合物と親水性高分子化合物を混合して用い、固定化酵素ナノファイバーの形成後に溶媒で洗浄して一方を除去してもよい。
【００２８】
高分子化合物としてシロキサン重合体を単独で、或いは他の高分子化合物と組み合わせて用いる場合には、シロキサン重合体の前駆体であるアルコキシシラン、水、更に加水分解触媒として酸又はアンモニアを溶液１１中に添加し、エレクトロスピニング法による紡糸工程と同時に、例えば、下式に示すような、アルコキシシラン化合物の加水分解及び生成したシラノールの重縮合（いわゆるゾル−ゲル法）によりシロキサン重合体を形成させることもできる。
【００２９】
ｎＳｉ（ＯＲ）４＋４ｎＨ２Ｏ→ｎＳｉ（ＯＨ）４＋４ｎＲＯＨ
ｎＳｉ（ＯＨ）４→ｎＳｉＯ２＋２ｎＨ２Ｏ
なお、上記の式において、ｎは任意の自然数である。
【００３０】
用いることができるアルコキシシラン化合物としては、下記の一般式（１）で表されるテトラアルコキシシラン、（２）で表されるモノアルキルトリアルコキシシラン、及び（３）で表されるジアルキルジアルコキシシランが挙げられる。
Ｓｉ（ＯＲ）４ ・・・（１）
ＳｉＲ１（ＯＲ）３ ・・・（２）
ＳｉＲ１Ｒ２（ＯＲ）２ ・・・（３）
なお、式（１）〜（３）において、Ｒはメチル（Ｍｅ）基又はエチル（Ｅｔ）基、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して任意の置換基を有していてもよいアルキル基又はアリール基を表す。
【００３１】
一般式（１）で表されるテトラアルコキシシランの具体例としては、テトラメトシシシラン（ＴＭＯＳ、Ｒ＝Ｍｅ）、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ）が挙げられる。
一般式（２）で表されるモノアルキルトリアルコキシシランの具体例としては、メチルトリメトキシシラン（ＭＴｒＭＯＳ、Ｒ＝Ｒ１＝Ｍｅ）、メチルトリエトキシシラン（ＭＴｒＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ、Ｒ１＝Ｍｅ）、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰｒＴＭＯＳ、Ｒ＝Ｍｅ、Ｒ１＝ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰｒＴｒＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ、Ｒ１＝ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ブチルトリメトシシシラン（ＢｕＴｒＭＯＳ、Ｒ＝Ｍｅ、Ｒ１＝Ｃ４Ｈ９）、ｎ−ブチルトリエトキシシラン（ｎ−ＢｕＴｒＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ、Ｒ１＝Ｃ４Ｈ９）、フェニルトリメトキシシラン（ＰｈｅＴｒＭＯＳ、Ｒ＝Ｍｅ、Ｒ１＝Ｃ６Ｈ５）、フェニルトリエトキシシラン（ＰｈｅＴｒＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ、Ｒ１＝Ｃ６Ｈ５）、３−トリメトキシシリルプロピルメタクリレート（ＴＳＭ、Ｒ＝Ｍｅ、Ｒ１＝ＣＨ２=Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２）３−）等が挙げられる。
一般式（３）で表されるジアルキルジアルコキシシランの具体例としては、ジメチルジメトキシシラン（ＤＭＤＭＯＳ、Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝Ｍｅ）、ジメチルジエトキシシラン（ＤＭＤＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｍｅ）、ジブチルジメトキシシラン（ＤＢＤＭＯＳ、Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃ４Ｈ９）、ジブチルジエトキシシラン（ＤＢＤＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃ４Ｈ９）等が挙げられる。
これらのアルコキシシラン化合物は、単独で用いてもよく、任意の２以上を組み合わせて（例えば、ジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランの混合物）用いることもでき。それぞれ重縮合によりホモポリマー及びコポリマー（共重合体）を生成する。
【００３２】
固定化酵素ナノファイバーの製造に用いられるアルコキシシランの種類、組み合わせ、濃度及び組成比、他の高分子化合物との濃度比は、用いられる酵素の種類、酵素反応に用いられる溶媒の種類等に応じて適宜選択される。
例えば、反応中心近傍に存在する疎水性環境によって反応性が向上するリパーゼ等の酵素を用いる場合には、一般式（２）及び（３）で表されるアルコシキシラン化合物の組成比を高くすることが好ましい。また、一般式（１）及び（２）で表されるアルコキシシラン化合物の組成比を高くすると、シロキサン鎖間で架橋を形成することができ、酵素の漏出を抑制しつつ、反応基質の酵素へのアクセスを改善することができる。
【００３３】
加水分解及び重縮合反応を経てシロキサン重合体を生成するアルコキシシラン化合物であれば、上記以外のアルコキシシラン化合物を用いることができる。また、ポリシリカやケイ酸ナトリウムを用いることもできる。
更に、アルコキシシランの代わりに、アルミニウム、ジルコニウム、チタンのアルコキシドを用いることもできる。
【００３４】
固定化酵素ナノファイバーの製造に用いることができる酵素に特に制限はなく、エレクトロスピニング法により失活しない任意の酵素を用いることができる。また、固定化酵素ナノファイバーの製造には、生体等に由来の酵素（いわゆるＮａｔｉｖｅ酵素）をそのまま用いてもよく、活性、熱安定性、及び至適ｐＨ改変のためにタンパク質構造に改変又は修飾を施した酵素を用いてもよい。酵素の改変又は修飾には、化学的手法、遺伝子工学的手法及び分子進化工学的手法のいずれを用いてもよい。
【００３５】
固定化酵素ナノファイバーの製造に用いることができる酵素としては、例えば、以下に示す各種酵素が挙げられる。
（１）ホルメートデヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、尿酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、プロトカテク酸−３，４−ジオキシゲナーゼ、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、Ｌ−グルタミン酸デヒドラーゼ等の酸化還元酵素。
（２）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ、クレアチンキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、トロンボキナーゼ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、カルバミン酸キナーゼ、トランスアルドラーゼ、ホスホリラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、デキストランスクラーゼ、ｔＲＮＡ−ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＮＡＤピロホスホリラーゼ等の転移酵素。
【００３６】
（３）α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アルドラーゼ、インベルターゼ、ジアスターゼ、β−グルコシダーゼ、β−フルクトフラノシダーゼ、アミログルコシダーゼ、ラクターゼ、グルコアミラーゼ、デキストラナーゼ、タカアミラーゼＡ、ヒアルロニダーゼ、アルカリ性タンパク質分解酵素、中性タンパク質分解酵素、トリプシン、α−キモトリプシン、σ−キモトリプシン、パパイン、スブチリシン、スブチロペプチターゼＡ、スブチロペプチターゼＢ、ペプシン、カルボキシペプチダーゼ、レニン、アミノペプチダーゼＭ、ロイシンアミノペプチダーゼ、アピラーゼ、ナリンギナーゼ、カリクレイン、エラスターゼ、チマーゼ、フィシン、プロナーゼ、アスパラキナーゼ、アスパルターゼ、ブロメリン、レンニン、プロリダーゼ、リパーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アミノアシラーゼ、ステロイドエステラーゼ、アシッドフォスファターゼ、アルカリフォスファターゼ、フルクトースジホスファターゼ、無機ピロホスファターゼ、アミノアシラーゼ、アミノアシラーゼ１、ＡＴＰアーゼ、ＡＴＰデアミナーゼ、ＡＭＰデアミナーゼ、リボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＴ１、ミオシンＡＴＰアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ１、ペニシリンアミダーゼ、ペニシリナーゼ、パラチオンヒドロラーゼ、アトラジンクロロヒドロラーゼ、ウレアーゼ、リゾチーム、トロンビン、アリルスルファターゼ、Ｄ−オキシニトリラーゼ等の加水分解酵素。
【００３７】
（４）フェニルアラニンデカルボキシラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ等の脱離酵素。
（５）α−アミノ−ε−カプロラクタムラセマーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等の異性化酵素。
（６）クエン酸シンターゼ、スクシニルＣｏＡシンターゼ等の合成酵素（リガーゼ）。
【００３８】
また、これらの酵素の修飾及び改変体及びこれらの混合物又は筋肉酵素抽出液を用いてもよく、例えば、メトミオグロビン、シトクロムＣ等の酵素以外の機能性タンパク質を用いることもできる。
【００３９】
酵素は、固定化酵素ナノファイバーの用途（酵素反応の種類、基質及び生成物）に応じて適宜選択される。例えば、タンパク質やペプチドの加水分解によるアミノ酸の製造には、トリプシン、α−キモトリプシン等のタンパク加水分解酵素が、脂質及び脂肪酸エステルの加水分解による脂肪酸の製造には、リパーゼがそれぞれ用いられる。これらの加水分解酵素は、反応溶媒として有機溶媒を用いることにより、逆反応であるエステル又は酸アミドの合成触媒として用いることもできる。
また、有用物質の生産以外の用途として、例えば、グルコースオキシダーゼを用いた溶液中のグルコース濃度の定量等のバイオセンサーへの応用が挙げられる。
【００４０】
エレクトロスピニング法による紡糸原料として用いられる溶液１１は、上記のような高分子化合物、及び酵素を適当な溶媒に溶解させて調製する。溶媒は、高分子化合物及び酵素の両者を適当な濃度で溶解させることができる単一溶媒又は混合溶媒が好ましく用いられる。例えば、高分子化合物がＰＶＡ等の水溶性高分子化合物である場合には、酵素に対しても良溶媒である水が用いられる。
溶液１１に含まれる高分子化合物及び酵素の濃度は、用いられる高分子化合物及び酵素の種類及びその組み合わせ、紡糸しようとする固定化酵素ナノファイバー１４の直径等に応じて適宜調節される。
【００４１】
次に、本発明の第２の実施の形態に係る反応装置について説明する。反応装置は、固定化酵素担体として、前記実施の形態の固定化酵素ナノファイバー１４を使用している。反応装置は、回分式（バッチ式）、流通式のいずれであってもよく、反応装置のスケール（内容積等）にも特に制限はない。
固定化酵素ナノファイバー１４を用いた固定化酵素担体は、反応溶液との接触面積を確保しつつ反応溶液の流通を妨げにくく、かつ複数枚積層して用いることも可能な不織布であることが好ましい。
【実施例】
【００４２】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。なお、以下の実施例においては、酵素としてリパーゼを、高分子化合物としてポリビニルアルコールを用いた場合について説明するが、本発明はこれらの組み合わせに限定されるものではない。
【００４３】
（１）エレクトロスピニング法によるＰＶＡナノファイバー作製条件の検討
図１に記載のエレクトロスピニング装置を用いて、リパーゼを含まないＰＶＡ水溶液を原料溶液とし、種々の条件下で（ＰＶＡ水溶液濃度、印加電圧、射出速度、極板間（紡糸口−回収板間）距離）ＰＶＡナノファイバーを作製した。得られた不織布状のＰＶＡナノファイバーを走査型電子顕微鏡で観察し、繊維径を測定した。
ＰＶＡ水溶液濃度、印加電圧、射出速度、及び極板間距離がＰＶＡナノファイバーの繊維径に及ぼす影響について検討した結果、ＰＶＡ水溶液濃度１０重量％、印加電圧１５ｋＶ、射出速度１．０ｍＬ／時、及び極板間距離１０ｃｍとしたときに、繊維径が約０．７５μｍのナノファイバーを再現性よく得られることがわかった。以下の実施例では、これらの条件下でナノファイバーの作製を行うこととした。
【００４４】
（２）リパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーの作製及び酵素活性の評価
精製水１８０ｍＬとＰＶＡ（シグマ−アルドリッチ社、加水分解率９８〜９９％、平均分子量１４６，０００〜１８６，０００、以下同じ）２０ｇとを混合し、数時間湯煎して溶解させた。こうして得られたＰＶＡ１０％水溶液１５ｍＬを取り、リパーゼ（和光純薬（株）、リパーゼＦ−ＡＰ、以下同じ）１５０ｍｇ（１重量％）を溶解させ、エレクトロスピニング法（印加電圧１５ｋＶ、射出速度１．０ｍＬ／時、極板間距離１０ｃｍ）を用いて、不織布状のリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーを作製した。
このようにして得られたリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーを真空乾燥し、質量が０．１ｇとなるよう切り出した切片を、室温の飽和ＬｉＣｌ水溶液上で２４時間水和処理した。このようにして得られた水和粉末を、基質として（Ｓ）−グリシドール２０ｍＭ、酢酸ビニル０．４Ｍを含むイソオクタン溶液４０ｍＬ中に分散させ、３５℃、撹拌速度３００ｒｐｍの条件下で、リパーゼを触媒とするエステル交換反応（下式参照）を行った。
【００４５】
【化１】
【００４６】
反応開始から５分毎に４回サンプリングを行い、反応生成物である酢酸（Ｓ）−グリシジルの濃度を、ガスクロマトグラフィ（ＧＬＣ）でモニターした。酢酸（Ｓ）−グリシジル濃度の時間変化より、反応の初速度を求めたところ、リパーゼ１ｍｇ当たりの反応初速度として６．３μＭ／ｍｇ／ｍｉｎという値が得られた。
なお、同様の測定を行ったところ、反応初速度として２．０μＭ／ｍｇ／ｍｉｎという値が得られた。
また、エレクトロスピニング法に用いた溶液を凍結乾燥後粉砕したリパーゼ包括ＰＶＡ粉末を用いて同様の測定を行ったところ、反応初速度として４．８μＭ／ｍｇ／ｍｉｎという値が得られた。この結果から、ナノファイバーとすることにより酵素活性が増大していることがわかる。
【００４７】
（３）リパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーの作製
ＴＭＯＳ（テトラメトキシシラン）０．１３６ｍｍｏｌ、ジメチルジメトキシシラン（ＤＭＤＭＯＳ）、及びＤＭＤＭＯＳ−ＴＭＯＳの４：１（モル比）混合物のいずれか（０．６８１ｍｍｏｌ）を精製水２３．３μＬ、及び４０ｍＭ塩酸１．５μＬとそれぞれ混合し、加水分解を行った。これを氷水で冷却しながら１００ｍＭリン酸緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）５０μＬを混合し、更にリン酸緩衝液１６７μＬに溶解したリパーゼ１５０ｍｇを加えた。このようにして得られた３種類の溶液をそれぞれ１０％ＰＶＡ水溶液１５ｇに加え、よく撹拌した後、エレクトロスピニング法（印加電圧１５ｋＶ、射出速度１．０ｍＬ／時、極板間距離１０ｃｍ）を用いて、不織布状のリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーを作製した。
（２）で作製したリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーと同様に処理し、得られた水和粉末を、基質として（Ｓ）−グリシドール２０ｍＭ、酢酸ビニル０．４Ｍを含むイソオクタン溶液４０ｍＬ中に分散させ、３５℃、撹拌速度３００ｒｐｍの条件下でエステル交換させた。反応開始から５分毎に４回サンプリングを行い、反応生成物である酢酸（Ｓ）−グリシジルの濃度を、ガスクロマトグラフィ（ＧＬＣ）でモニターした。酢酸（Ｓ）−グリシジル濃度の時間変化より、反応の初速度を求めた。
得られた結果を、（２）において得られた結果と併せて表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
なお、表１において、Ｎｏ．１及びＮｏ．２は、それぞれ反応基質のイソオクタン溶液中に直接分散させた粉末状のリパーゼ、及びリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーより得られた水和粉末を表し（前記（２）参照）、Ｎｏ．３〜６は、本実施例において、種々の条件下で調製したリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーより得られた水和粉末を表す。
Ｎｏ．１と２との比較より、リパーゼをＰＶＡ中に固定化することによって、酵素活性が向上していることがわかる。
Ｎｏ．２とＮｏ．３及び４の結果との比較より、ＴＭＯＳ由来のシロキサン重合体の高分子マトリックスへの導入は、リパーゼ近傍の親水性を高めるため酵素活性はむしろ低下するが、ＤＭＤＭＯＳ由来のシロキサン重合体の高分子マトリックスへの導入は、リパーゼ近傍に疎水性環境をもたらすことにより酵素活性が向上することがわかる。
【００５０】
なお、Ｎｏ．５は、ＤＭＤＭＯＳ加水分解物とリパーゼとの混合溶液を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥粉末を１０％ＰＶＡ水溶液に加えた溶液から作製したリパーゼ固定化ナノファイバーより得られた結果である。凍結乾燥を行わなかった場合（Ｎｏ．４）に比べて若干酵素活性は低下するものの、Ｎｏ．１及び２に比べて高い酵素活性を示すことがわかる。
また、Ｎｏ．４と６との比較より、ＤＭＤＭＯＳ及びＴＭＯＳを共に高分子マトリックスに導入することで、更に酵素活性が向上することがわかる。これは、シロキサン鎖間で架橋が形成されることにより、立体的な骨格が形成されたため、反応基質がリパーゼと接触しやすくなることによると考えられる。
【００５１】
（４）リパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーへのシロキサンゲルの被覆
（２）で作製した不織布状のリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーを真空乾燥後、質量が０．１ｇとなるよう切り出した切片を、３５℃に加温した５％ＤＭＤＭＯＳヘキサン溶液に撹拌しながら８５時間浸漬した。溶液から取り出したリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーは、空気中の水分により加水分解したＤＭＤＭＯＳより生成したシロキサンゲルで被覆されていた。これを真空乾燥後、上述の方法により酵素活性を測定したところ、反応初速度として１２μＭ／ｍｇ／ｍｉｎという値が得られた。この結果を、表１のＮｏ．２の結果と比較すると、ＰＶＡのみを高分子マトリックスとして用いた場合よりも酵素活性が向上していることがわかる。このことから、リパーゼをＰＶＡマトリックス中に固定化した後にＤＭＤＭＯＳで処理することによっても、リパーゼの酵素活性を向上させることができることが確認された。
【００５２】
（５）リパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバー及びリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーを用いた反応装置の作製並びに性能評価
（２）と同様の方法により作製、真空乾燥、及び水和処理した不織布状のリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバー、並びに（３）と同様の方法により（ＤＭＤＤＯＳ−ＴＭＯＳ４：１混合物を使用）作製、真空乾燥、及び水和処理した不織布状のリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーを、それぞれ６ｍｍ径のパンチで切り出し、それぞれ円筒形の流通型反応装置に装入した。
基質として（Ｓ）−グリシドール２０ｍＭ、酢酸ビニル０．４Ｍを含むイソオクタン溶液を、一定流量（１．０、０．５、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）で通液し、反応開始から１０分毎にサンプリングを行い、反応生成物である酢酸（Ｓ）−グリシジルへの変換率を、ガスクロマトグラフィ（ＧＬＣ）でモニターした。変換率が一定になった時点の値を定常反応率とした。結果は表２に示すとおりである。
【００５３】
【表２】
【００５４】
流速が小さいほど定常反応率が高くなること、及びリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーの方がリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーよりも高い定常反応率を示すことがわかる。
【００５５】
リパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバー及びリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーを、それぞれ反応装置中に２７枚、及び１００枚装入し、流通速度０．５ｍＬ／ｍｉｎで上記と同様の測定を行った結果を表３に示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】
リパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバー及びリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーのいずれの場合についても、積層枚数を多くすることによって定常反応率が向上していることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る固定化酵素ナノファイバーの製造に用いられるエレクトロスピニング装置の概略説明図である。
【符号の説明】
【００５９】
１０：エレクトロスピニング装置、１１：溶液、１２：シリンジポンプ、１３：紡糸口、１４：固定化酵素ナノファイバー、１５：回収板
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固定化酵素ナノファイバー、その製造方法及び該ナノファイバーを用いた反応装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、醸造、チーズなどの発酵、繊維工業、皮革工場、食品工業、化粧品工業、医薬品工業等において、物質の生産や原料加工等に利用されている。酵素反応は温和な反応条件下で高収率かつ高選択的に進行し、副生成物を殆ど生じない。そのため、高効率で環境負荷の小さな化学プロセスとして幅広い分野への応用が期待されている。また、近年では、高い基質特異性を利用したバイオセンサー等への応用もなされている。
従来、酵素反応を用いた物質生産には、主に回分法（バッチ法）が用いられていたが、この方法では、酵素が１度しか使用できないため経済的に不効率であることから、酵素の連続生産プロセスへの適用が検討されている。酵素を連続生産プロセスに適用する場合には、担体上に酵素を固定して反応溶媒に不溶化した固定化酵素が用いられる。酵素の固定化に用いられる担体及び固定化方法は、酵素の変性及び流失の防止、反応基質と酵素との接触面積の確保等の観点から適宜選択される。
【０００３】
従来用いられている酵素の固定化方法としては、不溶性の担体の表面に酵素を物理的又は化学的に結合させる担体結合法（例えば、特許文献１参照）、２以上の官能基を有する架橋剤と酵素の表面官能基とを反応させて、不溶性の巨大分子を形成させる架橋法、網目構造を有する高分子ゲルの格子や、水溶液を包含した水不溶性のマイクロカプセル等で酵素を包み込む包括法（例えば、特許文献２〜４参照）、及びこれらの方法を組み合わせて用いる複合法（例えば、特許文献５及び６参照）等が挙げられる。
【０００４】
【特許文献１】特開昭５９−２１３３９０号公報
【特許文献２】特開昭５８−５１９３号公報
【特許文献３】特開平６−１８１７６３号公報
【特許文献４】特公昭５３−１２９９８号公報
【特許文献５】特開平３−１９６８７号公報
【特許文献６】特公昭６２−１６６３７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、担体結合法は、担体粒子の大きさによる表面積の広さが活性効率に及ぼす影響が大きいため、その加工法が問題になる。
架橋法は、多量の酵素を必要とし、架橋剤と反応の際に酵素活性の低下を引き起こす等の問題点が挙げられる。
また、包括法は、マトリックスの形成に重合反応を必要とするような場合には、重合中に酵素の失活が起こりやすいという問題点を有している。
【０００６】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、製造時に酵素の失活を起こしにくく、高い酵素活性を有し、長期間にわたって安定な固定化酵素ナノファイバー及びその製造方法並びに該ナノファイバーを用いた反応装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的に沿う第１の発明に係る固定化酵素ナノファイバーは、エレクトロスピニング法により紡糸された直径が１００ｎｍ〜３μｍの繊維状の高分子マトリックス中に酵素が固定化されている。
なお、「エレクトロスピニング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）法」とは、静電紡糸法、電界紡糸法、電化誘導紡糸法等とも呼ばれている紡糸法の一種で、数十ｋＶの高電圧が印加されたキャピラリー状の紡糸口（正極）から接地された回収板（負極）に向かって、高分子化合物を含む溶液を一定の速度で押し出すことにより紡糸を行う。
【０００８】
第１の発明に係る固定化酵素ナノファイバーにおいて、前記酵素はリパーゼであってもよい。
【０００９】
第１の発明に係る固定化酵素ナノファイバーにおいて、前記高分子マトリックスは、アルコシキシラン化合物の重縮合により生成したシロキサン重合体を含んでいてもよい。
この場合において、前記シロキサン重合体は、ジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランとの混合物の重縮合により生成した共重合体であることが好ましい。
なお、「シロキサン重合体」とは、一般式（ＳｉＲ１Ｒ２Ｏ−）ｎで表される直鎖状、分岐鎖状、及び環状の重合体をいう。なお、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水酸基、アルキル基、及びアリール基のいずれかを表し、ｎは２以上の自然数を表す。例えば、ジアルキルシロキサンは、Ｒ１及びＲ２が両者共にアルキル基であるシロキサン単位を含む単独重合体又は共重合体である。
【００１０】
第２の発明に係る固定化酵素ナノファイバーの製造方法は、紡糸可能な高分子化合物及び酵素を含む原料溶液を調製する工程と、前記原料溶液をエレクトロスピニング法により紡糸する工程とを有する。
【００１１】
第２の発明に係る固定化酵素ナノファイバーの製造方法において、前記酵素はリパーゼであってもよい。
【００１２】
第２の発明に係る固定化酵素ナノファイバーの製造方法において、前記原料溶液が更に１種類又は２種類以上のアルコキシシラン化合物のゾルを含み、前記紡糸する工程においてアルコシキシラン化合物の重縮合によりシロキサン重合体が生成してもよい。
この場合において、前記アルコキシシラン化合物が、ジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランの混合物であることが好ましい。
【００１３】
第３の発明に係る反応装置は、第１の発明に係る固定化酵素ナノファイバーにより形成された不織布を固定化酵素担体として用いている。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１〜４記載の酵素固定化ナノファイバーにおいては、従来の粒状物等の固定化酵素担体と比較すると、単位体積当たりの表面積が大きく、より多くの酵素が表面に露出していると共に、酵素と基質との分子拡散距離を短くすることができるので反応効率が高い。更に、固定化する酵素や酵素反応の特性に応じて、高分子マトリックスの組成等を変化させることが可能であり、表面を化学修飾して、活性や安定性を向上させた酵素を用いることもできる。
【００１５】
特に請求項２記載の固定化酵素ナノファイバーにおいては、酵素としてリパーゼを用いているので、脂肪酸トリグリセリド等のエステルの加水分解、エステル合成、エステル交換、エステルから酸アミドの合成（アミノリシス）等の工業上有用な反応に適用可能である。
【００１６】
請求項３記載の固定化酵素ナノファイバーにおいては、高分子マトリックスがシロキサン重合体を含んでいるので、マトリックス中に固定化された酵素の熱安定性を向上させ、かつ酵素活性を向上させることができる。
【００１７】
請求項４記載の固定化酵素ナノファイバーにおいては、シロキサン重合体がジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランとの混合物の重縮合により生成した共重合体であるので、ナノファイバー中でシロキサン重合体が三次元的な架橋構造を形成し、反応基質の酵素に対するアクセスが容易になり、酵素活性を向上させることができる。
【００１８】
請求項５〜８記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法においては、反応効率が高い固定化酵素ナノファイバーを簡便かつ低コストに製造することができる。また、穏和な条件下で紡糸を行うことができるため、製造工程における酵素の失活を抑制できる。更に、多くの酵素及び高分子に適用可能なため、固定化する酵素や酵素反応の特性等に応じて、高分子マトリックスの組成等を最適化することが可能である。
【００１９】
請求項６記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法においては、酵素としてリパーゼを用いているので、脂肪酸トリグリセリド等のエステルの加水分解、エステル合成、エステル交換、エステルから酸アミドの合成等の工業上有用な反応に適用可能な固定化酵素ナノファイバーを提供できる。
【００２０】
請求項７記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法においては、紡糸する工程においてアルコキシシラン化合物の重縮合によりシロキサン重合体が生成するので、ナノファイバー中に固定化された酵素の熱安定性を向上させ、かつ酵素活性を向上させることができる。
【００２１】
請求項８記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法においては、アルコキシシラン化合物が、ジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランの混合物であるので、ナノファイバー中でシロキサン重合体が三次元的な架橋構造を形成し、反応基質の酵素に対するアクセスが容易になり、酵素活性を向上させることができる。
【００２２】
請求項９記載の反応装置においては、請求項１〜４記載の固定化酵素ナノファイバーにより形成された不織布を固定化酵素担体として用いているので、反応効率が高く、酵素の繰り返し使用が可能であるため、バッチ法に比べ経済的効率も向上することができる。また、固定化酵素担体は不織布であるため、複数枚積層することにより、反応液の流通を確保しつつ単位体積当たりの酵素量を増大させることが容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
続いて、添付した図面を参照しつつ、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。ここで、図１は本発明の第１の実施の形態に係る固定化酵素ナノファイバーの製造に用いられるエレクトロスピニング装置の概略説明図である。
本発明の第１の実施の形態に係る固定化酵素ナノファイバー１４（図１参照）は、直径が１００ｎｍ〜３μｍの繊維状の高分子マトリックス中に酵素が固定化されている。固定化酵素ナノファイバー１４は、紡糸可能な高分子化合物及び酵素を含む原料溶液を調製する工程と、このようにして得られた原料溶液をエレクトロスピニング法により紡糸する工程とを有する方法を用いて製造される。
【００２４】
固定化酵素ナノファイバー１４の製造に使用されるエレクトロスピニング装置１０は、図１に示すように、紡糸原料となる原料溶液（以下、溶液という）１１を一定の流量で送出するためのシリンジポンプ１２、シリンジポンプ１２から送出された溶液１１を噴出するキャピラリー状の紡糸口１３、生成した固定化酵素ナノファイバー１４を回収するための回収板（コレクター）１５とを有する。紡糸口１３と回収板１５とは、間隔が数十ｃｍ程度となるように配置され、紡糸口１３には数十ｋＶの正の電圧が印加され、回収板１５は接地されている。そのため、溶液１１は正に帯電した状態で紡糸口１３から噴出される。静電引力が溶液１１の表面張力よりも大きい場合、帯電した溶液１１のジェットが発生し、回収板１５に向かって飛行する。ジェット中の溶媒は徐々に揮発し、回収板１５に到達する頃には、ジェットの直径はナノメートルオーダーまで減少する。このようにして形成された固定化酵素ナノファイバー１４は、回収板１５上に堆積し、マット状の不織布として回収される。なお、回収板１５を回転させたり、巻き取り機構を設けることにより、固定化酵素ナノファイバー１４を糸状の配向体として回収することもできる。
【００２５】
固定化酵素ナノファイバーの直径は、１００ｎｍ〜３μｍの範囲内である。直径が１００ｎｍ未満だと、機械的強度が低下すると共にビーズと呼ばれる球状の欠陥が生成しやすくなる。また、直径が３μｍを上回ると、表面積の割合が低下するため、酵素活性が低下する。
固定化酵素ナノファイバーの直径は、原料となる溶液１１中の酵素及び高分子化合物の濃度、シリンジポンプ１２からの送出速度、紡糸口１３の太さ、紡糸口１３の電位、紡糸口１３と回収板１５との間隔等によって調節することができるが、これらの各因子と得られる固定化酵素ナノファイバー１４の直径との関係は、用いられる高分子化合物、酵素及び溶媒の種類に依存するため一義的に決定することは困難である。そのため、予備実験等により事前に検討しておくことが好ましい。
【００２６】
固定化酵素ナノファイバーの製造において、高分子マトリックスの材料として用いることができる高分子化合物に特に制限はなく、エレクトロスピニング法による紡糸が可能な任意の高分子化合物を用いることができる。
用いることができる高分子化合物の具体例としては、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレンオキシド、ポリウレタン、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリカプロラクトン等の合成高分子化合物、キチン、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸、デキストラン等の多糖類、コラーゲン、ゼラチン、ポリアルギニン、γ−ポリグルタミン酸（γ−ＰＧＡ）、シルク等のポリペプチド系高分子化合物、シリカ又はシロキサン重合体、アルミナ、チタニア等の無機高分子化合物、及びこれらの混合物が挙げられる。これらをベースとして、化学修飾等の手法により、親水性及び疎水性、極性等を変化させた高分子化合物（例えば、ビニロン等）を用いることもできる。
【００２７】
高分子マトリックスの材料として用いられる高分子化合物は、固定化される酵素の種類、酵素反応に用いられる溶媒等に応じて適宜選択される。例えば、反応溶媒として水を用いる場合には、高分子マトリックスの膨潤や溶解を防止するために、ポリスチレン、ポリカーボネート等の疎水性高分子化合物が用いられる。
逆に、反応溶媒としてオクタン等の有機溶媒を用いる場合には、高分子マトリックスの膨潤や溶解を防止するために、ＰＶＡ、ポリエチレンオキシド等の親水性高分子化合物が用いられる。親水性高分子化合物を用いる場合には、酵素分子表面の親水性基との相互作用により酵素を安定化して失活を抑制する効果も期待できる。
或いは、紡糸性の改善等のために疎水性の高分子化合物と親水性高分子化合物を混合して用い、固定化酵素ナノファイバーの形成後に溶媒で洗浄して一方を除去してもよい。
【００２８】
高分子化合物としてシロキサン重合体を単独で、或いは他の高分子化合物と組み合わせて用いる場合には、シロキサン重合体の前駆体であるアルコキシシラン、水、更に加水分解触媒として酸又はアンモニアを溶液１１中に添加し、エレクトロスピニング法による紡糸工程と同時に、例えば、下式に示すような、アルコキシシラン化合物の加水分解及び生成したシラノールの重縮合（いわゆるゾル−ゲル法）によりシロキサン重合体を形成させることもできる。
【００２９】
ｎＳｉ（ＯＲ）４＋４ｎＨ２Ｏ→ｎＳｉ（ＯＨ）４＋４ｎＲＯＨ
ｎＳｉ（ＯＨ）４→ｎＳｉＯ２＋２ｎＨ２Ｏ
なお、上記の式において、ｎは任意の自然数である。
【００３０】
用いることができるアルコキシシラン化合物としては、下記の一般式（１）で表されるテトラアルコキシシラン、（２）で表されるモノアルキルトリアルコキシシラン、及び（３）で表されるジアルキルジアルコキシシランが挙げられる。
Ｓｉ（ＯＲ）４ ・・・（１）
ＳｉＲ１（ＯＲ）３ ・・・（２）
ＳｉＲ１Ｒ２（ＯＲ）２ ・・・（３）
なお、式（１）〜（３）において、Ｒはメチル（Ｍｅ）基又はエチル（Ｅｔ）基、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して任意の置換基を有していてもよいアルキル基又はアリール基を表す。
【００３１】
一般式（１）で表されるテトラアルコキシシランの具体例としては、テトラメトシシシラン（ＴＭＯＳ、Ｒ＝Ｍｅ）、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ）が挙げられる。
一般式（２）で表されるモノアルキルトリアルコキシシランの具体例としては、メチルトリメトキシシラン（ＭＴｒＭＯＳ、Ｒ＝Ｒ１＝Ｍｅ）、メチルトリエトキシシラン（ＭＴｒＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ、Ｒ１＝Ｍｅ）、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰｒＴＭＯＳ、Ｒ＝Ｍｅ、Ｒ１＝ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰｒＴｒＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ、Ｒ１＝ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ブチルトリメトシシシラン（ＢｕＴｒＭＯＳ、Ｒ＝Ｍｅ、Ｒ１＝Ｃ４Ｈ９）、ｎ−ブチルトリエトキシシラン（ｎ−ＢｕＴｒＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ、Ｒ１＝Ｃ４Ｈ９）、フェニルトリメトキシシラン（ＰｈｅＴｒＭＯＳ、Ｒ＝Ｍｅ、Ｒ１＝Ｃ６Ｈ５）、フェニルトリエトキシシラン（ＰｈｅＴｒＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ、Ｒ１＝Ｃ６Ｈ５）、３−トリメトキシシリルプロピルメタクリレート（ＴＳＭ、Ｒ＝Ｍｅ、Ｒ１＝ＣＨ２=Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯ（ＣＨ２）３−）等が挙げられる。
一般式（３）で表されるジアルキルジアルコキシシランの具体例としては、ジメチルジメトキシシラン（ＤＭＤＭＯＳ、Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝Ｍｅ）、ジメチルジエトキシシラン（ＤＭＤＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｍｅ）、ジブチルジメトキシシラン（ＤＢＤＭＯＳ、Ｒ＝Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃ４Ｈ９）、ジブチルジエトキシシラン（ＤＢＤＥＯＳ、Ｒ＝Ｅｔ、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｃ４Ｈ９）等が挙げられる。
これらのアルコキシシラン化合物は、単独で用いてもよく、任意の２以上を組み合わせて（例えば、ジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランの混合物）用いることもでき。それぞれ重縮合によりホモポリマー及びコポリマー（共重合体）を生成する。
【００３２】
固定化酵素ナノファイバーの製造に用いられるアルコキシシランの種類、組み合わせ、濃度及び組成比、他の高分子化合物との濃度比は、用いられる酵素の種類、酵素反応に用いられる溶媒の種類等に応じて適宜選択される。
例えば、反応中心近傍に存在する疎水性環境によって反応性が向上するリパーゼ等の酵素を用いる場合には、一般式（２）及び（３）で表されるアルコシキシラン化合物の組成比を高くすることが好ましい。また、一般式（１）及び（２）で表されるアルコキシシラン化合物の組成比を高くすると、シロキサン鎖間で架橋を形成することができ、酵素の漏出を抑制しつつ、反応基質の酵素へのアクセスを改善することができる。
【００３３】
加水分解及び重縮合反応を経てシロキサン重合体を生成するアルコキシシラン化合物であれば、上記以外のアルコキシシラン化合物を用いることができる。また、ポリシリカやケイ酸ナトリウムを用いることもできる。
更に、アルコキシシランの代わりに、アルミニウム、ジルコニウム、チタンのアルコキシドを用いることもできる。
【００３４】
固定化酵素ナノファイバーの製造に用いることができる酵素に特に制限はなく、エレクトロスピニング法により失活しない任意の酵素を用いることができる。また、固定化酵素ナノファイバーの製造には、生体等に由来の酵素（いわゆるＮａｔｉｖｅ酵素）をそのまま用いてもよく、活性、熱安定性、及び至適ｐＨ改変のためにタンパク質構造に改変又は修飾を施した酵素を用いてもよい。酵素の改変又は修飾には、化学的手法、遺伝子工学的手法及び分子進化工学的手法のいずれを用いてもよい。
【００３５】
固定化酵素ナノファイバーの製造に用いることができる酵素としては、例えば、以下に示す各種酵素が挙げられる。
（１）ホルメートデヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、尿酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、プロトカテク酸−３，４−ジオキシゲナーゼ、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、カタラーゼ、Ｌ−グルタミン酸デヒドラーゼ等の酸化還元酵素。
（２）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ、クレアチンキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、トロンボキナーゼ、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、カルバミン酸キナーゼ、トランスアルドラーゼ、ホスホリラーゼ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、デキストランスクラーゼ、ｔＲＮＡ−ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＮＡＤピロホスホリラーゼ等の転移酵素。
【００３６】
（３）α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アルドラーゼ、インベルターゼ、ジアスターゼ、β−グルコシダーゼ、β−フルクトフラノシダーゼ、アミログルコシダーゼ、ラクターゼ、グルコアミラーゼ、デキストラナーゼ、タカアミラーゼＡ、ヒアルロニダーゼ、アルカリ性タンパク質分解酵素、中性タンパク質分解酵素、トリプシン、α−キモトリプシン、σ−キモトリプシン、パパイン、スブチリシン、スブチロペプチターゼＡ、スブチロペプチターゼＢ、ペプシン、カルボキシペプチダーゼ、レニン、アミノペプチダーゼＭ、ロイシンアミノペプチダーゼ、アピラーゼ、ナリンギナーゼ、カリクレイン、エラスターゼ、チマーゼ、フィシン、プロナーゼ、アスパラキナーゼ、アスパルターゼ、ブロメリン、レンニン、プロリダーゼ、リパーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アミノアシラーゼ、ステロイドエステラーゼ、アシッドフォスファターゼ、アルカリフォスファターゼ、フルクトースジホスファターゼ、無機ピロホスファターゼ、アミノアシラーゼ、アミノアシラーゼ１、ＡＴＰアーゼ、ＡＴＰデアミナーゼ、ＡＭＰデアミナーゼ、リボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＴ１、ミオシンＡＴＰアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ１、ペニシリンアミダーゼ、ペニシリナーゼ、パラチオンヒドロラーゼ、アトラジンクロロヒドロラーゼ、ウレアーゼ、リゾチーム、トロンビン、アリルスルファターゼ、Ｄ−オキシニトリラーゼ等の加水分解酵素。
【００３７】
（４）フェニルアラニンデカルボキシラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ等の脱離酵素。
（５）α−アミノ−ε−カプロラクタムラセマーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等の異性化酵素。
（６）クエン酸シンターゼ、スクシニルＣｏＡシンターゼ等の合成酵素（リガーゼ）。
【００３８】
また、これらの酵素の修飾及び改変体及びこれらの混合物又は筋肉酵素抽出液を用いてもよく、例えば、メトミオグロビン、シトクロムＣ等の酵素以外の機能性タンパク質を用いることもできる。
【００３９】
酵素は、固定化酵素ナノファイバーの用途（酵素反応の種類、基質及び生成物）に応じて適宜選択される。例えば、タンパク質やペプチドの加水分解によるアミノ酸の製造には、トリプシン、α−キモトリプシン等のタンパク加水分解酵素が、脂質及び脂肪酸エステルの加水分解による脂肪酸の製造には、リパーゼがそれぞれ用いられる。これらの加水分解酵素は、反応溶媒として有機溶媒を用いることにより、逆反応であるエステル又は酸アミドの合成触媒として用いることもできる。
また、有用物質の生産以外の用途として、例えば、グルコースオキシダーゼを用いた溶液中のグルコース濃度の定量等のバイオセンサーへの応用が挙げられる。
【００４０】
エレクトロスピニング法による紡糸原料として用いられる溶液１１は、上記のような高分子化合物、及び酵素を適当な溶媒に溶解させて調製する。溶媒は、高分子化合物及び酵素の両者を適当な濃度で溶解させることができる単一溶媒又は混合溶媒が好ましく用いられる。例えば、高分子化合物がＰＶＡ等の水溶性高分子化合物である場合には、酵素に対しても良溶媒である水が用いられる。
溶液１１に含まれる高分子化合物及び酵素の濃度は、用いられる高分子化合物及び酵素の種類及びその組み合わせ、紡糸しようとする固定化酵素ナノファイバー１４の直径等に応じて適宜調節される。
【００４１】
次に、本発明の第２の実施の形態に係る反応装置について説明する。反応装置は、固定化酵素担体として、前記実施の形態の固定化酵素ナノファイバー１４を使用している。反応装置は、回分式（バッチ式）、流通式のいずれであってもよく、反応装置のスケール（内容積等）にも特に制限はない。
固定化酵素ナノファイバー１４を用いた固定化酵素担体は、反応溶液との接触面積を確保しつつ反応溶液の流通を妨げにくく、かつ複数枚積層して用いることも可能な不織布であることが好ましい。
【実施例】
【００４２】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。なお、以下の実施例においては、酵素としてリパーゼを、高分子化合物としてポリビニルアルコールを用いた場合について説明するが、本発明はこれらの組み合わせに限定されるものではない。
【００４３】
（１）エレクトロスピニング法によるＰＶＡナノファイバー作製条件の検討
図１に記載のエレクトロスピニング装置を用いて、リパーゼを含まないＰＶＡ水溶液を原料溶液とし、種々の条件下で（ＰＶＡ水溶液濃度、印加電圧、射出速度、極板間（紡糸口−回収板間）距離）ＰＶＡナノファイバーを作製した。得られた不織布状のＰＶＡナノファイバーを走査型電子顕微鏡で観察し、繊維径を測定した。
ＰＶＡ水溶液濃度、印加電圧、射出速度、及び極板間距離がＰＶＡナノファイバーの繊維径に及ぼす影響について検討した結果、ＰＶＡ水溶液濃度１０重量％、印加電圧１５ｋＶ、射出速度１．０ｍＬ／時、及び極板間距離１０ｃｍとしたときに、繊維径が約０．７５μｍのナノファイバーを再現性よく得られることがわかった。以下の実施例では、これらの条件下でナノファイバーの作製を行うこととした。
【００４４】
（２）リパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーの作製及び酵素活性の評価
精製水１８０ｍＬとＰＶＡ（シグマ−アルドリッチ社、加水分解率９８〜９９％、平均分子量１４６，０００〜１８６，０００、以下同じ）２０ｇとを混合し、数時間湯煎して溶解させた。こうして得られたＰＶＡ１０％水溶液１５ｍＬを取り、リパーゼ（和光純薬（株）、リパーゼＦ−ＡＰ、以下同じ）１５０ｍｇ（１重量％）を溶解させ、エレクトロスピニング法（印加電圧１５ｋＶ、射出速度１．０ｍＬ／時、極板間距離１０ｃｍ）を用いて、不織布状のリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーを作製した。
このようにして得られたリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーを真空乾燥し、質量が０．１ｇとなるよう切り出した切片を、室温の飽和ＬｉＣｌ水溶液上で２４時間水和処理した。このようにして得られた水和粉末を、基質として（Ｓ）−グリシドール２０ｍＭ、酢酸ビニル０．４Ｍを含むイソオクタン溶液４０ｍＬ中に分散させ、３５℃、撹拌速度３００ｒｐｍの条件下で、リパーゼを触媒とするエステル交換反応（下式参照）を行った。
【００４５】
【化１】
【００４６】
反応開始から５分毎に４回サンプリングを行い、反応生成物である酢酸（Ｓ）−グリシジルの濃度を、ガスクロマトグラフィ（ＧＬＣ）でモニターした。酢酸（Ｓ）−グリシジル濃度の時間変化より、反応の初速度を求めたところ、リパーゼ１ｍｇ当たりの反応初速度として６．３μＭ／ｍｇ／ｍｉｎという値が得られた。
なお、同様の測定を行ったところ、反応初速度として２．０μＭ／ｍｇ／ｍｉｎという値が得られた。
また、エレクトロスピニング法に用いた溶液を凍結乾燥後粉砕したリパーゼ包括ＰＶＡ粉末を用いて同様の測定を行ったところ、反応初速度として４．８μＭ／ｍｇ／ｍｉｎという値が得られた。この結果から、ナノファイバーとすることにより酵素活性が増大していることがわかる。
【００４７】
（３）リパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーの作製
ＴＭＯＳ（テトラメトキシシラン）０．１３６ｍｍｏｌ、ジメチルジメトキシシラン（ＤＭＤＭＯＳ）、及びＤＭＤＭＯＳ−ＴＭＯＳの４：１（モル比）混合物のいずれか（０．６８１ｍｍｏｌ）を精製水２３．３μＬ、及び４０ｍＭ塩酸１．５μＬとそれぞれ混合し、加水分解を行った。これを氷水で冷却しながら１００ｍＭリン酸緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４−ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）５０μＬを混合し、更にリン酸緩衝液１６７μＬに溶解したリパーゼ１５０ｍｇを加えた。このようにして得られた３種類の溶液をそれぞれ１０％ＰＶＡ水溶液１５ｇに加え、よく撹拌した後、エレクトロスピニング法（印加電圧１５ｋＶ、射出速度１．０ｍＬ／時、極板間距離１０ｃｍ）を用いて、不織布状のリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーを作製した。
（２）で作製したリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーと同様に処理し、得られた水和粉末を、基質として（Ｓ）−グリシドール２０ｍＭ、酢酸ビニル０．４Ｍを含むイソオクタン溶液４０ｍＬ中に分散させ、３５℃、撹拌速度３００ｒｐｍの条件下でエステル交換させた。反応開始から５分毎に４回サンプリングを行い、反応生成物である酢酸（Ｓ）−グリシジルの濃度を、ガスクロマトグラフィ（ＧＬＣ）でモニターした。酢酸（Ｓ）−グリシジル濃度の時間変化より、反応の初速度を求めた。
得られた結果を、（２）において得られた結果と併せて表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
なお、表１において、Ｎｏ．１及びＮｏ．２は、それぞれ反応基質のイソオクタン溶液中に直接分散させた粉末状のリパーゼ、及びリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーより得られた水和粉末を表し（前記（２）参照）、Ｎｏ．３〜６は、本実施例において、種々の条件下で調製したリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーより得られた水和粉末を表す。
Ｎｏ．１と２との比較より、リパーゼをＰＶＡ中に固定化することによって、酵素活性が向上していることがわかる。
Ｎｏ．２とＮｏ．３及び４の結果との比較より、ＴＭＯＳ由来のシロキサン重合体の高分子マトリックスへの導入は、リパーゼ近傍の親水性を高めるため酵素活性はむしろ低下するが、ＤＭＤＭＯＳ由来のシロキサン重合体の高分子マトリックスへの導入は、リパーゼ近傍に疎水性環境をもたらすことにより酵素活性が向上することがわかる。
【００５０】
なお、Ｎｏ．５は、ＤＭＤＭＯＳ加水分解物とリパーゼとの混合溶液を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥粉末を１０％ＰＶＡ水溶液に加えた溶液から作製したリパーゼ固定化ナノファイバーより得られた結果である。凍結乾燥を行わなかった場合（Ｎｏ．４）に比べて若干酵素活性は低下するものの、Ｎｏ．１及び２に比べて高い酵素活性を示すことがわかる。
また、Ｎｏ．４と６との比較より、ＤＭＤＭＯＳ及びＴＭＯＳを共に高分子マトリックスに導入することで、更に酵素活性が向上することがわかる。これは、シロキサン鎖間で架橋が形成されることにより、立体的な骨格が形成されたため、反応基質がリパーゼと接触しやすくなることによると考えられる。
【００５１】
（４）リパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーへのシロキサンゲルの被覆
（２）で作製した不織布状のリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーを真空乾燥後、質量が０．１ｇとなるよう切り出した切片を、３５℃に加温した５％ＤＭＤＭＯＳヘキサン溶液に撹拌しながら８５時間浸漬した。溶液から取り出したリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーは、空気中の水分により加水分解したＤＭＤＭＯＳより生成したシロキサンゲルで被覆されていた。これを真空乾燥後、上述の方法により酵素活性を測定したところ、反応初速度として１２μＭ／ｍｇ／ｍｉｎという値が得られた。この結果を、表１のＮｏ．２の結果と比較すると、ＰＶＡのみを高分子マトリックスとして用いた場合よりも酵素活性が向上していることがわかる。このことから、リパーゼをＰＶＡマトリックス中に固定化した後にＤＭＤＭＯＳで処理することによっても、リパーゼの酵素活性を向上させることができることが確認された。
【００５２】
（５）リパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバー及びリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーを用いた反応装置の作製並びに性能評価
（２）と同様の方法により作製、真空乾燥、及び水和処理した不織布状のリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバー、並びに（３）と同様の方法により（ＤＭＤＤＯＳ−ＴＭＯＳ４：１混合物を使用）作製、真空乾燥、及び水和処理した不織布状のリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーを、それぞれ６ｍｍ径のパンチで切り出し、それぞれ円筒形の流通型反応装置に装入した。
基質として（Ｓ）−グリシドール２０ｍＭ、酢酸ビニル０．４Ｍを含むイソオクタン溶液を、一定流量（１．０、０．５、０．１ｍＬ／ｍｉｎ）で通液し、反応開始から１０分毎にサンプリングを行い、反応生成物である酢酸（Ｓ）−グリシジルへの変換率を、ガスクロマトグラフィ（ＧＬＣ）でモニターした。変換率が一定になった時点の値を定常反応率とした。結果は表２に示すとおりである。
【００５３】
【表２】
【００５４】
流速が小さいほど定常反応率が高くなること、及びリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーの方がリパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバーよりも高い定常反応率を示すことがわかる。
【００５５】
リパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバー及びリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーを、それぞれ反応装置中に２７枚、及び１００枚装入し、流通速度０．５ｍＬ／ｍｉｎで上記と同様の測定を行った結果を表３に示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】
リパーゼ固定化ＰＶＡナノファイバー及びリパーゼ固定化ＰＶＡ−ポリシロキサンナノファイバーのいずれの場合についても、積層枚数を多くすることによって定常反応率が向上していることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る固定化酵素ナノファイバーの製造に用いられるエレクトロスピニング装置の概略説明図である。
【符号の説明】
【００５９】
１０：エレクトロスピニング装置、１１：溶液、１２：シリンジポンプ、１３：紡糸口、１４：固定化酵素ナノファイバー、１５：回収板
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エレクトロスピニング法により紡糸された直径が１００ｎｍ〜３μｍの繊維状の高分子マトリックス中に酵素が固定化されていることを特徴とする固定化酵素ナノファイバー。
【請求項２】
請求項１記載の固定化酵素ナノファイバーにおいて、前記酵素はリパーゼであることを特徴とする固定化酵素ナノファイバー。
【請求項３】
請求項１及び２のいずれか１項に記載の固定化酵素ナノファイバーにおいて、前記高分子マトリックスは、アルコシキシラン化合物の重縮合により生成したシロキサン重合体を含んでいることを特徴とする固定化酵素ナノファイバー。
【請求項４】
請求項３記載の固定化酵素ナノファイバーにおいて、前記シロキサン重合体は、ジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランとの混合物の重縮合により生成した共重合体であることを特徴とする固定化酵素ナノファイバー。
【請求項５】
紡糸可能な高分子化合物及び酵素を含む原料溶液を調製する工程と、前記原料溶液をエレクトロスピニング法により紡糸する工程とを有することを特徴とする固定化酵素ナノファイバーの製造方法。
【請求項６】
請求項５記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法において、前記酵素はリパーゼであることを特徴とする固定化酵素ナノファイバーの製造方法。
【請求項７】
請求項５及び６のいずれか１項に記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法において、前記原料溶液が更に１種類又は２種類以上のアルコキシシラン化合物のゾルを含み、前記紡糸する工程において該アルコキシシラン化合物の重縮合によりシロキサン重合体が生成することを特徴とする固定化酵素ナノファイバーの製造方法。
【請求項８】
請求項７記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法において、前記アルコキシシラン化合物が、ジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランの混合物であることを特徴とする固定化酵素ナノファイバーの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の固定化酵素ナノファイバーにより形成された不織布を固定化酵素担体として用いたことを特徴とする反応装置。
【請求項１】
エレクトロスピニング法により紡糸された直径が１００ｎｍ〜３μｍの繊維状の高分子マトリックス中に酵素が固定化されていることを特徴とする固定化酵素ナノファイバー。
【請求項２】
請求項１記載の固定化酵素ナノファイバーにおいて、前記酵素はリパーゼであることを特徴とする固定化酵素ナノファイバー。
【請求項３】
請求項１及び２のいずれか１項に記載の固定化酵素ナノファイバーにおいて、前記高分子マトリックスは、アルコシキシラン化合物の重縮合により生成したシロキサン重合体を含んでいることを特徴とする固定化酵素ナノファイバー。
【請求項４】
請求項３記載の固定化酵素ナノファイバーにおいて、前記シロキサン重合体は、ジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランとの混合物の重縮合により生成した共重合体であることを特徴とする固定化酵素ナノファイバー。
【請求項５】
紡糸可能な高分子化合物及び酵素を含む原料溶液を調製する工程と、前記原料溶液をエレクトロスピニング法により紡糸する工程とを有することを特徴とする固定化酵素ナノファイバーの製造方法。
【請求項６】
請求項５記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法において、前記酵素はリパーゼであることを特徴とする固定化酵素ナノファイバーの製造方法。
【請求項７】
請求項５及び６のいずれか１項に記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法において、前記原料溶液が更に１種類又は２種類以上のアルコキシシラン化合物のゾルを含み、前記紡糸する工程において該アルコキシシラン化合物の重縮合によりシロキサン重合体が生成することを特徴とする固定化酵素ナノファイバーの製造方法。
【請求項８】
請求項７記載の固定化酵素ナノファイバーの製造方法において、前記アルコキシシラン化合物が、ジアルキルジアルコキシシランとテトラアルコキシシランの混合物であることを特徴とする固定化酵素ナノファイバーの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の固定化酵素ナノファイバーにより形成された不織布を固定化酵素担体として用いたことを特徴とする反応装置。
【図１】
【公開番号】特開２００９−５６６９（Ｐ２００９−５６６９Ａ）
【公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１７２７５５（Ｐ２００７−１７２７５５）
【出願日】平成１９年６月２９日（２００７．６．２９）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（５９１０６５５４９）福岡県 (121)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月１５日（２００９．１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２９日（２００７．６．２９）
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【出願人】（５９１０６５５４９）福岡県 (121)
【Ｆターム（参考）】
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