地質学的物質へのバクテリアの固定化
本発明は、バクテリアに対して透過性の物質、特には地質学的物体中にバクテリアを固定化する方法であって、該物質中に、該バクテリアを含有する第１の層を形成すること及び該物質の少なくとも一部を通して該第１の層が移動することを許すこと；該物質に有効量の凝集剤を含有する第２の層を形成すること及び該物質の少なくとも一部を通して該第２の層が移動することを許すこと、ここでこれら層は少なくとも部分的に重なり合うようになりかつバクテリアの少なくとも一部が凝集し、それにより固定化されることになるようにこれら層は移動することを許される、を含む前記方法に関係する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質、特には地質学的物体中にバクテリアを固定化する方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
自然に存在する特定のバクテリアは、自然環境においてバイオミネラル化を引き起こすことができることが知られている。この知識に基づき、多孔性媒体を改変する為のバクテリアのウレアーゼの使用が、Enzyme and Microbial Technology 33(2003), 635〜642ページにおいて、Nemati及びVoordauwにより記載されている。
【０００３】
バクテリアからウレアーゼを単離する必要なくバクテリアが用いられうることが意図されている。
【０００４】
米国特許第５，１４３，１５５号明細書は、無機沈殿による表面下の地質学的形成物の透過性を減少する方法であって、該形成物の環境内における代謝活性を維持する能力を有する微生物培養物を該形成物に備えること、該形成物中に水性のミネラル化媒体を注入すること、及び該ミネラル化媒体から無機物質を沈殿させることから成る上記方法に関係する。
【０００５】
凝集により該形成物中にバクテリアを固定化することは示唆されておらず、また、バクテリアの固定化後にミネラル化媒体を添加する追加の段階を適用することも示唆されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、バクテリアのような微生物及び基体を、処理されるべき物質を通して単に流すことによっては、不満足な結果が達せられることを発見している。特に、処理された物質（土壌）の外側を形成する粒子の故に、目詰まりが生じる傾向にある。その結果、該物質は、該基質及びバクテリアに対する透過性を失う。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定の様式にて該物質中にバクテリアを固定化することが可能であり、これにより、特に該バクテリアが無機物を形成することを許すことにより、該物質を改変するために、該固定化されたバクテリアが用いられうることを本発明者らは発見した。
【０００８】
従って、本発明は、バクテリアに対して透過性の物質、特には地質学的な物体中にバクテリアを固定化する方法であって、
該物質中に、該バクテリアを含有する第１のゾーンを形成し、かつ、該第１のゾーンが、該物質の少なくとも一部を通って移動することを許すこと；
該物質に有効量の凝集剤を含有する第２のゾーンを形成し、かつ、該第２のゾーンが、該物質の少なくとも一部を通って移動することを許すこと；
ここで、これらのゾーンが少なくとも部分的に重なり合うようになりかつバクテリアの少なくとも一部が凝集し、それにより固定化されることになるようにこれらゾーンは移動することを許される、
を含む上記方法に関係する。
【０００９】
上記各段階は、固定化されたバクテリアの量を増加する（そしてこれにより物質の体積当たりのバクテリアの活性を増加させる）ために１回以上繰り返されてよい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に従う方法により、バクテリアがインシチューで（その場で）無機物を形成することを許し、同時に該物質中の孔の目詰まりを回避することにより、制御された様式で該物質が強化されうることが分かった。従って、インシチューでの無機物の堆積が、該物質の長い距離にわたり効果的に実現されうる。
【００１１】
物質を改変する活動を実行するための該バクテリアの有用性が改善されるように、該バクテリアを固定化することにおいて、本発明に従う方法は有効であることが分かった。とくに、該物質中での該バクテリアによるバイオミネラル化に関して、固定化が有利であることが分かった。
【００１２】
本発明に従う方法は特に、土木工学または採鉱において用いられうる。それは、土壌又は他の地質学的形成物を改変する為、特に該物質を安定化する及び／又は補強するために用いられうる。このことは、長い距離にわたる該物質の処理を許すために、地質学的物体のような該物質の十分な多孔性を維持しながら、可能であることが分かった。
【００１３】
図１は、懸濁物中のバクテリアの凝集を引き起こすことにおける、いくつかの凝集剤の有効性を示す。
【００１４】
図２は、該物質を通じて移動する２つのゾーンのプロフィールを示す。
【００１５】
図３は、砂物質中の固定化されたバクテリアの配置を示す。
【００１６】
図４は、バクテリアを固定化した後の、物質中の様々な位置でのウレアーゼ活性を示す。
【００１７】
図５は、バクテリアが固定化されている場合における、物質の空隙率に対する炭酸カルシウムの形成の効果を示す。
【００１８】
図６は、添加されたカルシウムイオンの関数としての、カルシウムの吸着の効果を示す。
【００１９】
図７は、バクテリアの凝集体のサイズに対する、塩化カルシウムの濃度の効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
原則として、バクテリアに対して透過性の任意の物質（すなわち、少なくとも圧力下において、バクテリアが物質を通過することを許すのに十分大きい空隙を有する任意の物質）が用いられうる。バイオミネラル化のようなインシチューでの活性の為にバクテリアを使用することが望まれる場合、該物質は通常は、そのような活性の為の基質（イオン）に対しても透過性であるべきである。本発明の方法において用いられるべき物質は、通常は、地質学的形成物又無機物質である。該地質学的形成物は特に、堆積物（粘土、沈泥、砂及び／又は砂利）、堆積岩石、土壌物質及び／又は透過性を有する岩石物質、例えば粉砕された岩石など、を含む物体でありうる。好ましい物質は、沈泥、粘土、砂及び砂利物体から成る群から選ばれる物質を包含する。特に、良い結果は砂により達成されている。
【００２１】
原則として、該方法は、適当な凝集剤により、特に二価陽イオンにより凝集されることができる任意のバクテリアの固定化に適当である。特に、語「バクテリア」は、本発明に従い、胞子よりもむしろ、植物性バクテリアについて用いられる。大抵は休眠状態である胞子と比較すると、（植物性）バクテリアは大抵は増加された代謝活性を示す。（胞子はまず、該胞子が発芽する条件に付される必要があるが）該（植物性）バクテリアは既に活性であり、かつ／又は、バクテリアはより容易に凝集されうるという事実故に、（植物性）バクテリアの適用は、胞子（だけ）を適用することよりも有利である。サイズの違い、細胞壁構造の違い（例えばイオン化された基の存在）、及び／又は、凝集剤と接触されたときに凝集に寄与することができる１以上の化合物、特にはエキソ多糖類、を産生する（植物性）バクテリアの能力の故に、（植物性）バクテリアはより容易に凝集させられること、又は種々の条件下で少なくとも凝集することが意図される。従って、好ましくはエキソ多糖類を産生することができる（植物性）バクテリアが、該物質に適用される。
【００２２】
該バクテリアは好ましくは、無機物、例えばＣａＣＯ３など、を形成することができるバクテリアから選ばれる。好ましくは、該バクテリアは、ウレアーゼを産生するバクテリアから成る群から、より好ましくはスポロサルシナ属（Sporosarcina）から成る群から選ばれ、特にはスポロサルシナ パスツーリ（Sporosarcina pasteurii）である。そのようなバクテリアは特に、それらのウレアーゼが良い活性を示すので、（バイオミネラル化の間に形成される）アンモニウムの存在下においても、有効であることが分かっている。
【００２３】
該バクテリアは通常は、少なくとも０．１、好ましくは０．１〜１．０、より好ましくは最大で０．５ｍＳ／分の濃度で、該物質に添加される。（基質の添加後の高いバイオミネラル化速度のような）高いバクテリア活性の為に、該バクテリアは好ましくは（バクテリアが２０℃で（水中の）１Ｍ尿素に添加されたときに産生される電気伝導度の相対的変動により決定される）少なくとも０．３ｍＳ／分の濃度で添加される。
【００２４】
存在する条件下においてバクテリアが凝集することを引き起こすのに有効な任意の剤が、凝集剤として用いられうる。多価陽イオン、特に二価陽イオンが、特に適当である。そのような陽イオンは特に、スポロサルシナバクテリアのような、ウレアーゼを産生するバクテリアを固定化するために用いられうる。（植物性）バクテリアと対照的に、そのような陽イオンの存在下において、胞子は一般に凝集されないことが、注意されるべきである。
【００２５】
本発明に従い、（炭酸カルシウム塩のような）該陽イオンを含有する沈殿した無機物の結果としてよりもむしろ、少なくとも主としてバクテリアと（カルシウムのような）該陽イオンとが一緒に相互作用（イオン的表面相互作用）することの結果として、凝集物は形成されることが、意図される。この洞察は、凝集物が２Ｍ ＨＣｌにより処理されたところの実験に基づく。ガス（ＣＯ２）が発生しなかった。
【００２６】
好ましくは、該二価陽イオンは、ニッケルイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンから成る群から選ばれる。マグネシウムイオン及びカルシウムイオンは、凝集についてのそれらの大きな効果の故に特に好ましい（図１も参照されたい）。
【００２７】
凝集剤の有効量は実験的に決定されうる。通常は、特に二価陽イオンについて、該濃度は少なくとも３ｍＭ、好ましくは少なくとも５ｍＭである。比較的大きなサイズを有するフロックは、例えば粗い砂又は砂利が処理されるような、特に比較的粗い物質の場合に、バクテリアの強い固定を得るために有利である。従って、強い固定の為に、少なくとも１０ｍＭ、特には少なくとも２０ｍＭの濃度を用いることが好ましい。
【００２８】
通常は、凝集剤の濃度は、最大で約１０００ｍＭである。バクテリアの表面への吸収に関する効果の観点において、該濃度は好ましくは、最大で１００ｍＭである。
【００２９】
さらに、バクテリアのフロックのサイズは、凝集剤の濃度を選ぶことにより定められうる（例えば図７を参照）。比較的小さなフロックを産生するために、凝集剤（特にカルシウム）の濃度は、好ましくは５０ｍＭ以下、より好ましくは４０ｍＭ以下である。これは、特に該物質が比較的細かい砂、粘土又は沈泥であるときに、目詰まりを回避する観点において有利である。
【００３０】
該物質中においてゾーンを移動する為の適当なやり方は、無機物溶液を該物質中に導入しそしてそれを該物質を通じて移動させる為の既知の方法論に基づいてよい。例えば、国際公開第００／３１２０９号パンフレットを参照されたい。
【００３１】
該ゾーンは、水圧ポンプの使用により及び／又は動電学的に（electrokinetically）移動されうる。水圧ポンプは、砂のような比較的粗い物質又は少なくとも同じ平均粒子サイズを有する物質にとって特に好ましい。導電学的な移動は、粘土又は沈泥のような比較的低い透過性の物質について特に好ましい。
【００３２】
好ましい方法において、該第２のゾーンは、該第１のゾーンの直後に形成され、そして、両ゾーンは該物質の少なくとも一部を通って同じ方向に（同時に）移動することを許される。これは、最初に、バクテリアを含有する液体を及びその後該凝集剤を含有する液体を、該物質に（例えば注入により）添加することにより、適当に達成されうる。バクテリアの粒子状性質及び／又は表面電荷の故に、バクテリアは典型的には、該凝集剤より低い速度で物質を通じて移動する。このように、両ゾーンは該物質を通じて移動するので、これらゾーンは（部分的に）重なり合うだろうし、そして、該凝集剤はバクテリアと接触し、それによりバクテリアが凝集することを引き起こす。該フロックは典型的には大きすぎて該物質を通じて移動することができず、そして、それにより固定化される。図２は、砂を含有するカラム中の該バクテリアの懸濁物の速度及び該凝集剤を含有する液体の速度の例を示す。それは、該バクテリアが該凝集剤よりゆっくりと移動すること、及び、該凝集剤を有するゾーン（左のピークにより描かれる）は該バクテリアを有するゾーン（右のピークにより描かれる）と混ざることを説明する。
【００３３】
本発明者らは、部分的に重なる別個のゾーン中で（植物性）バクテリアと凝集剤とが移動することを許すことにより、バクテリアの固定化が制御された様式で達成されうること、それにより、一方で、（例えばバクテリアとミネラル化基質が該物質を通じて１のゾーン中で移動される方法と比較して）目詰まりのリスクを回避し又は少なくとも減少し、かつ／又は、（例えばバクテリア又は胞子を凝集させること無く、該物質がバクテリア又は胞子を備えられ、よってバクテリア又は胞子が固定化されるときに）意図される効果を達成するために必要とされるバクテリアの量を減少することを意図する。
【００３４】
好都合なことに、例えば、凝集プロセスを制御することに関して、バクテリアと凝集剤は同じ方向に移動される。
【００３５】
原則として、バクテリアと凝集剤は、（例えば、任意的にポンプとの組み合わせにおいて、電気泳動的に及び／又は動電学的に）互いに対して、実質的に反対方向に移動されうる。
【００３６】
バクテリアを含有するゾーンと凝集剤を含有するゾーンとを、或る角度下で移動させることにより、混合を引き起こすことも可能であり、例えば、該バクテリアが実質的に水平に移動され、かつ、該凝集剤が実質的に垂直に又は該バクテリアに対して０と９０°の間の角度で移動されうる、又は、逆も同様である。これは、（該ゾーンが沿って移動する進路の交差点で）該物質の局在的な部分における固定化が所望される場合に有利でありうる。
【００３７】
該バクテリアを含有する液体は好ましくは、処理されるべき該物質の先端において、少なくとも該物質の反対の先端にバクテリアが検出されうるまで添加される。検出は、該反対の先端で、例えば６００ｎｍでの、光学密度を監視することにより、視覚的な観察又は当技術分野において既知の他の技術による顕微鏡的な検査により、適切になされうる。
【００３８】
該凝集剤を含有する液体は好ましくは、少なくとも該凝集剤又はこの液体の他の成分が反対の先端で検出可能となるまで、該物質に添加される。これは、検出されるべき成分についての任意の適当な検出技術によりなされうる。伝導度の監視は、一般に適当な様式である。
【００３９】
該固定化は、環境の条件化で、特には、室温で実施されうる。
【００４０】
該バクテリアと該凝集剤は通常は、０．１〜２．０の水圧勾配と少なくとも等しい流速で、該物質中に導入される。実際的な理由により、水圧勾配は通常は最大で０．８〜１．２であり、好ましくは最大で１．０である。
【００４１】
該バクテリアが固定化された後に、物質改変活性、例えば無機物の産生など、を実行することを該バクテリアに許すために、該物質に基質が添加されうる。最初の、凝集による該バクテリアの固定化、及びその後の基質の添加は、ミネラル化などの該活性が、例えばミネラル化基質と固定化剤とが同時に適用されるだろうところの方法と比較して、より良く制御されうることにおいて有利である。特に、該物質は、より均一な様式において改変され、かつ／又は物質のより多くの量の範囲で（例えば、より長い距離にわたり）改変されうる。
【００４２】
基質の選択は、バクテリアと意図されるその活性に依存する。ウレアーゼ活性を有するバクテリアを使用する、炭酸塩のような無機物を形成する為に、尿素及び陽イオン、例えばカルシウムなど、がバイオミネラル化を引き起こすために添加されうる。基質成分の濃度は、当技術分野で既知の方法論に基づき選ばれてよい。好ましくは、該陽イオン（カルシウム）濃度は、少なくとも１００ｍＭ、より好ましくは８００〜１５００ｍＭの範囲である。該尿素濃度は好ましくは、該添加された陽イオンの濃度と（ほぼ）等モル濃度である。
【００４３】
本発明は、ここで、以下の実施例により説明されるだろう。
【００４４】
実施例１：バクテリアの凝集化
【００４５】
スポロサルシナ パスツーリバクテリアの懸濁物（６００ｎｍでの光学密度＝１．０）が、二価陽イオンの２０ｍＭの最終濃度へと、２０℃の温度で、いくつかの二価陽イオンの塩と混合された。該塩は夫々、Ｎｉ（ＮＯ３）２、ＺｎＣｌ２、Ｍｇ（ＮＯ３）２、ＣａＣｌ２であった。
【００４６】
混合の５分後、６００ｎｍでの光学密度が測定され、対照（添加された二価陽イオン無しのバクテリア懸濁物）と比較された。図１は、結果を示す。
【００４７】
光学密度における増加から、ニッケル、亜鉛、マグネシウム及びカルシウムが凝集を引き起こすのに有効であることが結論付けられる。
【００４８】
実施例２：ブレイクスルー体積の決定
【００４９】
カラム（１．６ｃｍの円の内径、長さ１ｍ）が、Itterbeek砂（ｄ５０＝４２０μｍ）により、１．７ｇ／ｃｍ３の密度へと充満された。
【００５０】
５０ｍＭ塩化カルシウムの１０ｍｌパルスが注入された。その後、該塩化カルシウムが脱イオン水によりカラムを通してポンプ移送され、そして、塩素化合物レベルがカラムの端で観察された。図３は、実質的に遅れること無く該物質を通じて塩化カルシウムが移動することを示す。すなわち、約１カラム体積の後に塩化カルシウムゾーンの先端がカラムの端に達し、そして、１．５カラム体積以内で、実質的に全ての塩化カルシウムが物質を通じて移動した。
【００５１】
別個の実験において、スポロサルシナ パスツーリバクテリアの懸濁物（４．２の６００ｎｍでの光学密度）が１０ｍｌパルスとして注入された。実験は、バクテリアを含有するゾーンの先端は、１カラム体積超がカラム中を通過された後に、カラムの端に達し、これはバクテリアが凝集剤（塩化カルシウム）よりもカラム中をゆっくりを移動していることを示す。
【００５２】
実施例３：バクテリアの固定化
【００５３】
カラム（円の直径１．８ｃｍ、長さ６．８ｍ）がItterbeek砂（ｄ５０＝４２０μｍ）により充満され、そして、飽和した条件下で維持された。バクテリア(濃度＝０．５ｍＳ／分）が、それらがカラム出口に現れるまで注入された。その後すぐに、５０ｍＭ塩化カルシウムの同じ体積が注入され、１時間、放置された。カラムは次に、細孔容積の３倍の脱イオン水により洗い流され、そして、ウレアーゼ活性分析の為に片に切断された。
【００５４】
ウレアーゼ活性は、容器中の砂の既知体積を秤量すること及び１Ｍの最終濃度へ尿素を添加すること、次に尿素加水分解速度を得るために電気伝導度（ｍＳ／分）を計測することにより、決定された。
【００５５】
ウレアーゼ活性は、カラムの長さ６．８ｍに沿って全ての場所で検出された（図３）。
【００５６】
実施例４：ex-situ（別の場所）でのセメンテーション
【００５７】
カラム（円の直径１．８ｃｍ、長さ６．８ｍ）が、Itterbeek砂（ｄ５０＝４２０μｍ）により充満され、そして、飽和した条件下で維持された。バクテリア（濃度＝０．５ｍＳ／分）が、それらがカラム出口に現れるまで注入された。その後すぐに、５０ｍＭ塩化カルシウムの同じ体積が注入され、１時間、放置された。カラムは次に、細孔容積の３倍の脱イオン水により洗い流され、そして、ウレアーゼ活性分析の為に片に切断された。ウレアーゼ活性は、実施例３におけるように測定された。
【００５８】
この試験に加えて、ウレアーゼ活性について分析された区分のすぐ次のカラム片が、取り除かれ、そして、その場（インシチュー）でのセメンテーション（cementation）を模倣するために、１Ｍ尿素と１Ｍ塩化カルシウムとを含有する密封された容器中に置かれた。これらの容器は穏やかに混合され、そしてアンモニウム産生が計測された。
【００５９】
注入点（４０ｃｍ）に最も近い片を除いて、コアの全ての片が、完全なセメンテーションを達成した。コア中に検出されたウレアーゼ活性と（最初の２４時間の間の）当初のアンモニウム産生速度とは一致した（図４）。
【００６０】
実施例５：空隙率に対するＣａＣｏ３含有量の効果
【００６１】
実施例４の実験が、０．３の水圧勾配を有する、大規模のカラム（内径６．６ｃｍ、長さ５ｍ）中で繰り返された。物質中の種々のＣａＣＯ３含有量を得るために、１．１Ｍ等モルの尿素及び塩化カルシウム溶液が注入され、そして、カラムに沿った勾配中でセメント化された。カラムは、片に切断され、そして、空隙率に対する効果が測定された。図５に示されるように、所定の方法によるバクテリアの固定化及び続くセメンテーションの後、炭酸カルシウム含有量の増加と共にわずかな空隙率の減少だけが観察された。これは、本発明が、バルクの物質において、又は、地質学的形成物の長い距離にわたり、バイオミネラル化を引き起こすのに適当であることを支持する。
【００６２】
実施例６：凝集物サイズに対する凝集剤濃度の効果
【００６３】
或る量のバクテリア（６００ｎｍでの光学密度＝１．０）が、様々なＣａＣｌ２濃度と混合された。凝集物サイズに対する効果は、レーザー回折により決定された。図７に示されるように、凝集物サイズは、凝集剤の濃度の増加と共に増加する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】バクテリアの懸濁物に対する２０ｍＭ二価陽イオンの効果を示すグラフである。
【図２】物質を通じて移動する２つのゾーンの特性を示すグラフである。
【図３】砂物質中の固定化されたバクテリアの位置を示すグラフである。
【図４】バクテリアを固定化した後の、物質中の様々な位置でのウレアーゼ活性を示すグラフである。
【図５】バクテリアが固定化されているところの、物質の空隙率に対する炭酸カルシウムの形成の効果を示すグラフである。
【図６】添加されたカルシウムイオンの関数としての、カルシウムの吸収の効果を示すグラフである。
【図７】バクテリアのフロックのサイズに対する、塩化カルシウムの濃度の効果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質、特には地質学的物体中にバクテリアを固定化する方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
自然に存在する特定のバクテリアは、自然環境においてバイオミネラル化を引き起こすことができることが知られている。この知識に基づき、多孔性媒体を改変する為のバクテリアのウレアーゼの使用が、Enzyme and Microbial Technology 33(2003), 635〜642ページにおいて、Nemati及びVoordauwにより記載されている。
【０００３】
バクテリアからウレアーゼを単離する必要なくバクテリアが用いられうることが意図されている。
【０００４】
米国特許第５，１４３，１５５号明細書は、無機沈殿による表面下の地質学的形成物の透過性を減少する方法であって、該形成物の環境内における代謝活性を維持する能力を有する微生物培養物を該形成物に備えること、該形成物中に水性のミネラル化媒体を注入すること、及び該ミネラル化媒体から無機物質を沈殿させることから成る上記方法に関係する。
【０００５】
凝集により該形成物中にバクテリアを固定化することは示唆されておらず、また、バクテリアの固定化後にミネラル化媒体を添加する追加の段階を適用することも示唆されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、バクテリアのような微生物及び基体を、処理されるべき物質を通して単に流すことによっては、不満足な結果が達せられることを発見している。特に、処理された物質（土壌）の外側を形成する粒子の故に、目詰まりが生じる傾向にある。その結果、該物質は、該基質及びバクテリアに対する透過性を失う。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定の様式にて該物質中にバクテリアを固定化することが可能であり、これにより、特に該バクテリアが無機物を形成することを許すことにより、該物質を改変するために、該固定化されたバクテリアが用いられうることを本発明者らは発見した。
【０００８】
従って、本発明は、バクテリアに対して透過性の物質、特には地質学的な物体中にバクテリアを固定化する方法であって、
該物質中に、該バクテリアを含有する第１のゾーンを形成し、かつ、該第１のゾーンが、該物質の少なくとも一部を通って移動することを許すこと；
該物質に有効量の凝集剤を含有する第２のゾーンを形成し、かつ、該第２のゾーンが、該物質の少なくとも一部を通って移動することを許すこと；
ここで、これらのゾーンが少なくとも部分的に重なり合うようになりかつバクテリアの少なくとも一部が凝集し、それにより固定化されることになるようにこれらゾーンは移動することを許される、
を含む上記方法に関係する。
【０００９】
上記各段階は、固定化されたバクテリアの量を増加する（そしてこれにより物質の体積当たりのバクテリアの活性を増加させる）ために１回以上繰り返されてよい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に従う方法により、バクテリアがインシチューで（その場で）無機物を形成することを許し、同時に該物質中の孔の目詰まりを回避することにより、制御された様式で該物質が強化されうることが分かった。従って、インシチューでの無機物の堆積が、該物質の長い距離にわたり効果的に実現されうる。
【００１１】
物質を改変する活動を実行するための該バクテリアの有用性が改善されるように、該バクテリアを固定化することにおいて、本発明に従う方法は有効であることが分かった。とくに、該物質中での該バクテリアによるバイオミネラル化に関して、固定化が有利であることが分かった。
【００１２】
本発明に従う方法は特に、土木工学または採鉱において用いられうる。それは、土壌又は他の地質学的形成物を改変する為、特に該物質を安定化する及び／又は補強するために用いられうる。このことは、長い距離にわたる該物質の処理を許すために、地質学的物体のような該物質の十分な多孔性を維持しながら、可能であることが分かった。
【００１３】
図１は、懸濁物中のバクテリアの凝集を引き起こすことにおける、いくつかの凝集剤の有効性を示す。
【００１４】
図２は、該物質を通じて移動する２つのゾーンのプロフィールを示す。
【００１５】
図３は、砂物質中の固定化されたバクテリアの配置を示す。
【００１６】
図４は、バクテリアを固定化した後の、物質中の様々な位置でのウレアーゼ活性を示す。
【００１７】
図５は、バクテリアが固定化されている場合における、物質の空隙率に対する炭酸カルシウムの形成の効果を示す。
【００１８】
図６は、添加されたカルシウムイオンの関数としての、カルシウムの吸着の効果を示す。
【００１９】
図７は、バクテリアの凝集体のサイズに対する、塩化カルシウムの濃度の効果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
原則として、バクテリアに対して透過性の任意の物質（すなわち、少なくとも圧力下において、バクテリアが物質を通過することを許すのに十分大きい空隙を有する任意の物質）が用いられうる。バイオミネラル化のようなインシチューでの活性の為にバクテリアを使用することが望まれる場合、該物質は通常は、そのような活性の為の基質（イオン）に対しても透過性であるべきである。本発明の方法において用いられるべき物質は、通常は、地質学的形成物又無機物質である。該地質学的形成物は特に、堆積物（粘土、沈泥、砂及び／又は砂利）、堆積岩石、土壌物質及び／又は透過性を有する岩石物質、例えば粉砕された岩石など、を含む物体でありうる。好ましい物質は、沈泥、粘土、砂及び砂利物体から成る群から選ばれる物質を包含する。特に、良い結果は砂により達成されている。
【００２１】
原則として、該方法は、適当な凝集剤により、特に二価陽イオンにより凝集されることができる任意のバクテリアの固定化に適当である。特に、語「バクテリア」は、本発明に従い、胞子よりもむしろ、植物性バクテリアについて用いられる。大抵は休眠状態である胞子と比較すると、（植物性）バクテリアは大抵は増加された代謝活性を示す。（胞子はまず、該胞子が発芽する条件に付される必要があるが）該（植物性）バクテリアは既に活性であり、かつ／又は、バクテリアはより容易に凝集されうるという事実故に、（植物性）バクテリアの適用は、胞子（だけ）を適用することよりも有利である。サイズの違い、細胞壁構造の違い（例えばイオン化された基の存在）、及び／又は、凝集剤と接触されたときに凝集に寄与することができる１以上の化合物、特にはエキソ多糖類、を産生する（植物性）バクテリアの能力の故に、（植物性）バクテリアはより容易に凝集させられること、又は種々の条件下で少なくとも凝集することが意図される。従って、好ましくはエキソ多糖類を産生することができる（植物性）バクテリアが、該物質に適用される。
【００２２】
該バクテリアは好ましくは、無機物、例えばＣａＣＯ３など、を形成することができるバクテリアから選ばれる。好ましくは、該バクテリアは、ウレアーゼを産生するバクテリアから成る群から、より好ましくはスポロサルシナ属（Sporosarcina）から成る群から選ばれ、特にはスポロサルシナ パスツーリ（Sporosarcina pasteurii）である。そのようなバクテリアは特に、それらのウレアーゼが良い活性を示すので、（バイオミネラル化の間に形成される）アンモニウムの存在下においても、有効であることが分かっている。
【００２３】
該バクテリアは通常は、少なくとも０．１、好ましくは０．１〜１．０、より好ましくは最大で０．５ｍＳ／分の濃度で、該物質に添加される。（基質の添加後の高いバイオミネラル化速度のような）高いバクテリア活性の為に、該バクテリアは好ましくは（バクテリアが２０℃で（水中の）１Ｍ尿素に添加されたときに産生される電気伝導度の相対的変動により決定される）少なくとも０．３ｍＳ／分の濃度で添加される。
【００２４】
存在する条件下においてバクテリアが凝集することを引き起こすのに有効な任意の剤が、凝集剤として用いられうる。多価陽イオン、特に二価陽イオンが、特に適当である。そのような陽イオンは特に、スポロサルシナバクテリアのような、ウレアーゼを産生するバクテリアを固定化するために用いられうる。（植物性）バクテリアと対照的に、そのような陽イオンの存在下において、胞子は一般に凝集されないことが、注意されるべきである。
【００２５】
本発明に従い、（炭酸カルシウム塩のような）該陽イオンを含有する沈殿した無機物の結果としてよりもむしろ、少なくとも主としてバクテリアと（カルシウムのような）該陽イオンとが一緒に相互作用（イオン的表面相互作用）することの結果として、凝集物は形成されることが、意図される。この洞察は、凝集物が２Ｍ ＨＣｌにより処理されたところの実験に基づく。ガス（ＣＯ２）が発生しなかった。
【００２６】
好ましくは、該二価陽イオンは、ニッケルイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンから成る群から選ばれる。マグネシウムイオン及びカルシウムイオンは、凝集についてのそれらの大きな効果の故に特に好ましい（図１も参照されたい）。
【００２７】
凝集剤の有効量は実験的に決定されうる。通常は、特に二価陽イオンについて、該濃度は少なくとも３ｍＭ、好ましくは少なくとも５ｍＭである。比較的大きなサイズを有するフロックは、例えば粗い砂又は砂利が処理されるような、特に比較的粗い物質の場合に、バクテリアの強い固定を得るために有利である。従って、強い固定の為に、少なくとも１０ｍＭ、特には少なくとも２０ｍＭの濃度を用いることが好ましい。
【００２８】
通常は、凝集剤の濃度は、最大で約１０００ｍＭである。バクテリアの表面への吸収に関する効果の観点において、該濃度は好ましくは、最大で１００ｍＭである。
【００２９】
さらに、バクテリアのフロックのサイズは、凝集剤の濃度を選ぶことにより定められうる（例えば図７を参照）。比較的小さなフロックを産生するために、凝集剤（特にカルシウム）の濃度は、好ましくは５０ｍＭ以下、より好ましくは４０ｍＭ以下である。これは、特に該物質が比較的細かい砂、粘土又は沈泥であるときに、目詰まりを回避する観点において有利である。
【００３０】
該物質中においてゾーンを移動する為の適当なやり方は、無機物溶液を該物質中に導入しそしてそれを該物質を通じて移動させる為の既知の方法論に基づいてよい。例えば、国際公開第００／３１２０９号パンフレットを参照されたい。
【００３１】
該ゾーンは、水圧ポンプの使用により及び／又は動電学的に（electrokinetically）移動されうる。水圧ポンプは、砂のような比較的粗い物質又は少なくとも同じ平均粒子サイズを有する物質にとって特に好ましい。導電学的な移動は、粘土又は沈泥のような比較的低い透過性の物質について特に好ましい。
【００３２】
好ましい方法において、該第２のゾーンは、該第１のゾーンの直後に形成され、そして、両ゾーンは該物質の少なくとも一部を通って同じ方向に（同時に）移動することを許される。これは、最初に、バクテリアを含有する液体を及びその後該凝集剤を含有する液体を、該物質に（例えば注入により）添加することにより、適当に達成されうる。バクテリアの粒子状性質及び／又は表面電荷の故に、バクテリアは典型的には、該凝集剤より低い速度で物質を通じて移動する。このように、両ゾーンは該物質を通じて移動するので、これらゾーンは（部分的に）重なり合うだろうし、そして、該凝集剤はバクテリアと接触し、それによりバクテリアが凝集することを引き起こす。該フロックは典型的には大きすぎて該物質を通じて移動することができず、そして、それにより固定化される。図２は、砂を含有するカラム中の該バクテリアの懸濁物の速度及び該凝集剤を含有する液体の速度の例を示す。それは、該バクテリアが該凝集剤よりゆっくりと移動すること、及び、該凝集剤を有するゾーン（左のピークにより描かれる）は該バクテリアを有するゾーン（右のピークにより描かれる）と混ざることを説明する。
【００３３】
本発明者らは、部分的に重なる別個のゾーン中で（植物性）バクテリアと凝集剤とが移動することを許すことにより、バクテリアの固定化が制御された様式で達成されうること、それにより、一方で、（例えばバクテリアとミネラル化基質が該物質を通じて１のゾーン中で移動される方法と比較して）目詰まりのリスクを回避し又は少なくとも減少し、かつ／又は、（例えばバクテリア又は胞子を凝集させること無く、該物質がバクテリア又は胞子を備えられ、よってバクテリア又は胞子が固定化されるときに）意図される効果を達成するために必要とされるバクテリアの量を減少することを意図する。
【００３４】
好都合なことに、例えば、凝集プロセスを制御することに関して、バクテリアと凝集剤は同じ方向に移動される。
【００３５】
原則として、バクテリアと凝集剤は、（例えば、任意的にポンプとの組み合わせにおいて、電気泳動的に及び／又は動電学的に）互いに対して、実質的に反対方向に移動されうる。
【００３６】
バクテリアを含有するゾーンと凝集剤を含有するゾーンとを、或る角度下で移動させることにより、混合を引き起こすことも可能であり、例えば、該バクテリアが実質的に水平に移動され、かつ、該凝集剤が実質的に垂直に又は該バクテリアに対して０と９０°の間の角度で移動されうる、又は、逆も同様である。これは、（該ゾーンが沿って移動する進路の交差点で）該物質の局在的な部分における固定化が所望される場合に有利でありうる。
【００３７】
該バクテリアを含有する液体は好ましくは、処理されるべき該物質の先端において、少なくとも該物質の反対の先端にバクテリアが検出されうるまで添加される。検出は、該反対の先端で、例えば６００ｎｍでの、光学密度を監視することにより、視覚的な観察又は当技術分野において既知の他の技術による顕微鏡的な検査により、適切になされうる。
【００３８】
該凝集剤を含有する液体は好ましくは、少なくとも該凝集剤又はこの液体の他の成分が反対の先端で検出可能となるまで、該物質に添加される。これは、検出されるべき成分についての任意の適当な検出技術によりなされうる。伝導度の監視は、一般に適当な様式である。
【００３９】
該固定化は、環境の条件化で、特には、室温で実施されうる。
【００４０】
該バクテリアと該凝集剤は通常は、０．１〜２．０の水圧勾配と少なくとも等しい流速で、該物質中に導入される。実際的な理由により、水圧勾配は通常は最大で０．８〜１．２であり、好ましくは最大で１．０である。
【００４１】
該バクテリアが固定化された後に、物質改変活性、例えば無機物の産生など、を実行することを該バクテリアに許すために、該物質に基質が添加されうる。最初の、凝集による該バクテリアの固定化、及びその後の基質の添加は、ミネラル化などの該活性が、例えばミネラル化基質と固定化剤とが同時に適用されるだろうところの方法と比較して、より良く制御されうることにおいて有利である。特に、該物質は、より均一な様式において改変され、かつ／又は物質のより多くの量の範囲で（例えば、より長い距離にわたり）改変されうる。
【００４２】
基質の選択は、バクテリアと意図されるその活性に依存する。ウレアーゼ活性を有するバクテリアを使用する、炭酸塩のような無機物を形成する為に、尿素及び陽イオン、例えばカルシウムなど、がバイオミネラル化を引き起こすために添加されうる。基質成分の濃度は、当技術分野で既知の方法論に基づき選ばれてよい。好ましくは、該陽イオン（カルシウム）濃度は、少なくとも１００ｍＭ、より好ましくは８００〜１５００ｍＭの範囲である。該尿素濃度は好ましくは、該添加された陽イオンの濃度と（ほぼ）等モル濃度である。
【００４３】
本発明は、ここで、以下の実施例により説明されるだろう。
【００４４】
実施例１：バクテリアの凝集化
【００４５】
スポロサルシナ パスツーリバクテリアの懸濁物（６００ｎｍでの光学密度＝１．０）が、二価陽イオンの２０ｍＭの最終濃度へと、２０℃の温度で、いくつかの二価陽イオンの塩と混合された。該塩は夫々、Ｎｉ（ＮＯ３）２、ＺｎＣｌ２、Ｍｇ（ＮＯ３）２、ＣａＣｌ２であった。
【００４６】
混合の５分後、６００ｎｍでの光学密度が測定され、対照（添加された二価陽イオン無しのバクテリア懸濁物）と比較された。図１は、結果を示す。
【００４７】
光学密度における増加から、ニッケル、亜鉛、マグネシウム及びカルシウムが凝集を引き起こすのに有効であることが結論付けられる。
【００４８】
実施例２：ブレイクスルー体積の決定
【００４９】
カラム（１．６ｃｍの円の内径、長さ１ｍ）が、Itterbeek砂（ｄ５０＝４２０μｍ）により、１．７ｇ／ｃｍ３の密度へと充満された。
【００５０】
５０ｍＭ塩化カルシウムの１０ｍｌパルスが注入された。その後、該塩化カルシウムが脱イオン水によりカラムを通してポンプ移送され、そして、塩素化合物レベルがカラムの端で観察された。図３は、実質的に遅れること無く該物質を通じて塩化カルシウムが移動することを示す。すなわち、約１カラム体積の後に塩化カルシウムゾーンの先端がカラムの端に達し、そして、１．５カラム体積以内で、実質的に全ての塩化カルシウムが物質を通じて移動した。
【００５１】
別個の実験において、スポロサルシナ パスツーリバクテリアの懸濁物（４．２の６００ｎｍでの光学密度）が１０ｍｌパルスとして注入された。実験は、バクテリアを含有するゾーンの先端は、１カラム体積超がカラム中を通過された後に、カラムの端に達し、これはバクテリアが凝集剤（塩化カルシウム）よりもカラム中をゆっくりを移動していることを示す。
【００５２】
実施例３：バクテリアの固定化
【００５３】
カラム（円の直径１．８ｃｍ、長さ６．８ｍ）がItterbeek砂（ｄ５０＝４２０μｍ）により充満され、そして、飽和した条件下で維持された。バクテリア(濃度＝０．５ｍＳ／分）が、それらがカラム出口に現れるまで注入された。その後すぐに、５０ｍＭ塩化カルシウムの同じ体積が注入され、１時間、放置された。カラムは次に、細孔容積の３倍の脱イオン水により洗い流され、そして、ウレアーゼ活性分析の為に片に切断された。
【００５４】
ウレアーゼ活性は、容器中の砂の既知体積を秤量すること及び１Ｍの最終濃度へ尿素を添加すること、次に尿素加水分解速度を得るために電気伝導度（ｍＳ／分）を計測することにより、決定された。
【００５５】
ウレアーゼ活性は、カラムの長さ６．８ｍに沿って全ての場所で検出された（図３）。
【００５６】
実施例４：ex-situ（別の場所）でのセメンテーション
【００５７】
カラム（円の直径１．８ｃｍ、長さ６．８ｍ）が、Itterbeek砂（ｄ５０＝４２０μｍ）により充満され、そして、飽和した条件下で維持された。バクテリア（濃度＝０．５ｍＳ／分）が、それらがカラム出口に現れるまで注入された。その後すぐに、５０ｍＭ塩化カルシウムの同じ体積が注入され、１時間、放置された。カラムは次に、細孔容積の３倍の脱イオン水により洗い流され、そして、ウレアーゼ活性分析の為に片に切断された。ウレアーゼ活性は、実施例３におけるように測定された。
【００５８】
この試験に加えて、ウレアーゼ活性について分析された区分のすぐ次のカラム片が、取り除かれ、そして、その場（インシチュー）でのセメンテーション（cementation）を模倣するために、１Ｍ尿素と１Ｍ塩化カルシウムとを含有する密封された容器中に置かれた。これらの容器は穏やかに混合され、そしてアンモニウム産生が計測された。
【００５９】
注入点（４０ｃｍ）に最も近い片を除いて、コアの全ての片が、完全なセメンテーションを達成した。コア中に検出されたウレアーゼ活性と（最初の２４時間の間の）当初のアンモニウム産生速度とは一致した（図４）。
【００６０】
実施例５：空隙率に対するＣａＣｏ３含有量の効果
【００６１】
実施例４の実験が、０．３の水圧勾配を有する、大規模のカラム（内径６．６ｃｍ、長さ５ｍ）中で繰り返された。物質中の種々のＣａＣＯ３含有量を得るために、１．１Ｍ等モルの尿素及び塩化カルシウム溶液が注入され、そして、カラムに沿った勾配中でセメント化された。カラムは、片に切断され、そして、空隙率に対する効果が測定された。図５に示されるように、所定の方法によるバクテリアの固定化及び続くセメンテーションの後、炭酸カルシウム含有量の増加と共にわずかな空隙率の減少だけが観察された。これは、本発明が、バルクの物質において、又は、地質学的形成物の長い距離にわたり、バイオミネラル化を引き起こすのに適当であることを支持する。
【００６２】
実施例６：凝集物サイズに対する凝集剤濃度の効果
【００６３】
或る量のバクテリア（６００ｎｍでの光学密度＝１．０）が、様々なＣａＣｌ２濃度と混合された。凝集物サイズに対する効果は、レーザー回折により決定された。図７に示されるように、凝集物サイズは、凝集剤の濃度の増加と共に増加する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】バクテリアの懸濁物に対する２０ｍＭ二価陽イオンの効果を示すグラフである。
【図２】物質を通じて移動する２つのゾーンの特性を示すグラフである。
【図３】砂物質中の固定化されたバクテリアの位置を示すグラフである。
【図４】バクテリアを固定化した後の、物質中の様々な位置でのウレアーゼ活性を示すグラフである。
【図５】バクテリアが固定化されているところの、物質の空隙率に対する炭酸カルシウムの形成の効果を示すグラフである。
【図６】添加されたカルシウムイオンの関数としての、カルシウムの吸収の効果を示すグラフである。
【図７】バクテリアのフロックのサイズに対する、塩化カルシウムの濃度の効果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バクテリアに対して透過性の物質中に、特には地質学的物体中にバクテリアを固定化する方法であって、
該物質中に、該バクテリアを含有する第１のゾーンを形成し、かつ、該第１のゾーンが、該物質の少なくとも一部を通って移動することを許すこと；
該物質に有効量の凝集剤を含有する第２のゾーンを形成し、かつ、該第２のゾーンが、該物質の少なくとも一部を通って移動することを許すこと、
ここで、これらのゾーンが少なくとも部分的に重なり合うようになりかつバクテリアの少なくとも一部が凝集し、それにより固定化されることになるようにこれらゾーンは移動することを許される、
を含む前記方法。
【請求項２】
該第２のゾーンが、該第１のゾーンの直後に形成され、かつ、両ゾーンが該物質の少なくとも一部を通って同じ方向に移動することを許される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該第１のゾーンが第１の方向に移動され、かつ、該第２のゾーンが該第１の方向から或る角度で移動され、ここで該方向はこれらのゾーンが互いに向き合って移動しかつ互いに交差するようなものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該物質が、（粘土、沈泥、砂及び／又は砂利のような）堆積物を含有する地質学的物体；堆積岩石；土壌物質及び（粉砕された岩石のような）バクテリアに対して透過性の岩石物質からなる群から選ばれる物質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該凝集剤が、二価陽イオンから成る群から、特にはニッケルイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンから成る群から選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該凝集剤が、３〜１００ｍｍｏｌ／液体リットルの濃度で該物質に添加される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該バクテリアが、ウレアーゼを産生するバクテリアから成る群から選ばれる、好ましくはスポロサルシナ属から成る群から選ばれる、特にはスポロサルシナ パスツーリである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該バクテリアが、（バクテリアが２０℃で１Ｍ尿素に添加されたときに産生される電気伝導度の相対的変動により決定される）０．１〜１．０ｍＳ／分を含有する懸濁物の形態で、該物質に添加される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該第１及び／又は該第２のゾーンが、０．１〜２．０の範囲の水圧勾配により規定される速度で、該物質を通って移動される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
固定化後に、該バクテリアが無機物を形成することを許す有効量で、基質が該物質に添加される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
尿素とカルシウムイオンとが、該バクテリアがＣａＣＯ３を形成することを許す有効量で該固定化されたバクテリアに接触される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
バクテリアに対して透過性の物質中に、特には地質学的物体中にバクテリアを固定化する方法であって、
該物質中に、該バクテリアを含有する第１のゾーンを形成し、かつ、該第１のゾーンが、該物質の少なくとも一部を通って移動することを許すこと；
該物質に有効量の凝集剤を含有する第２のゾーンを形成し、かつ、該第２のゾーンが、該物質の少なくとも一部を通って移動することを許すこと、
ここで、これらのゾーンが少なくとも部分的に重なり合うようになりかつバクテリアの少なくとも一部が凝集し、それにより固定化されることになるようにこれらゾーンは移動することを許される、
を含む前記方法。
【請求項２】
該第２のゾーンが、該第１のゾーンの直後に形成され、かつ、両ゾーンが該物質の少なくとも一部を通って同じ方向に移動することを許される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該第１のゾーンが第１の方向に移動され、かつ、該第２のゾーンが該第１の方向から或る角度で移動され、ここで該方向はこれらのゾーンが互いに向き合って移動しかつ互いに交差するようなものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該物質が、（粘土、沈泥、砂及び／又は砂利のような）堆積物を含有する地質学的物体；堆積岩石；土壌物質及び（粉砕された岩石のような）バクテリアに対して透過性の岩石物質からなる群から選ばれる物質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該凝集剤が、二価陽イオンから成る群から、特にはニッケルイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン及びカルシウムイオンから成る群から選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該凝集剤が、３〜１００ｍｍｏｌ／液体リットルの濃度で該物質に添加される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該バクテリアが、ウレアーゼを産生するバクテリアから成る群から選ばれる、好ましくはスポロサルシナ属から成る群から選ばれる、特にはスポロサルシナ パスツーリである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該バクテリアが、（バクテリアが２０℃で１Ｍ尿素に添加されたときに産生される電気伝導度の相対的変動により決定される）０．１〜１．０ｍＳ／分を含有する懸濁物の形態で、該物質に添加される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該第１及び／又は該第２のゾーンが、０．１〜２．０の範囲の水圧勾配により規定される速度で、該物質を通って移動される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
固定化後に、該バクテリアが無機物を形成することを許す有効量で、基質が該物質に添加される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
尿素とカルシウムイオンとが、該バクテリアがＣａＣＯ３を形成することを許す有効量で該固定化されたバクテリアに接触される、請求項１０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５１９０３６（Ｐ２００９−５１９０３６Ａ）
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４５５１４（Ｐ２００８−５４５５１４）
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０００５９８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６９８８４
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０８１７８４２３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０００５９８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０６９８８４
【国際公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【出願人】（５０８１７８４２３）
【Ｆターム（参考）】
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