変異体ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス
本発明は、Ｅタンパク質中の保存されているシステインが欠失しているか、あるいは非システイン残基に変更されているように改変された遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスと、それをコードするポリヌクレオチドとを提供する。上記遺伝的に改変されたウイルスおよびポリヌクレオチドを含むワクチンも提供する。
【図１】
【図１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスおよびそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。上記遺伝的に改変されたウイルスおよびポリヌクレオチドを含むワクチンも提供する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）は、成熟したメスブタおよび未成熟のメスブタにおける流産、死産、および他の生殖上の問題、ならびに若いブタの呼吸器疾患を特徴とする。原因物質は、アルテリウイルス科およびニドウイルス目の一員であるＰＲＲＳウイルスである。このウイルスの２つの異なった遺伝子型が、北米およびヨーロッパで、１９８０年代後半にほぼ同時に現れた。ＰＲＲＳウイルスは、現在、ほとんどすべてのブタ産出国で風土病となっており、全世界のブタ肉産業に影響を与えている経済的に最も重要な疾患の１つであると考えられている。
【０００３】
現在、ＰＲＲＳに対する市販のワクチンには、改変生ワクチンおよび死菌（不活性化）ワクチンが含まれる。死菌ワクチンは、異種系統のＰＲＲＳウイルスに対しては活発な免疫を誘導しないことが批判されている。改変生ワクチンは、病原力がなくなるまで、細胞培養における連続継代によって弱毒化されている。改変生ワクチンは、死菌ワクチンより広範な防御を誘発するが、残留病原力、非接種のブタへの伝搬、および病原性への遺伝的復帰を含めた、いくつかの安全性に関する懸念を与えることがある。弱毒化の過程で起こる抗原性の変化のため、そのようなワクチンは、病原性の強い野生株のＰＲＲＳウイルスに対する防御能力の一部を失うこともある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そのため、ＰＲＲＳから防御するための新規かつ改善された改変生ワクチンに対する緊急な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
配列の簡単な説明
配列番号１ シャトルプラスミドＰＴＢ−Ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７の順方向シャトルプライマー
配列番号２ シャトルプラスミドＰＴＢ−Ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７の逆方向シャトルプライマー
配列番号３ 変異原性プライマー２ｂ−Ｃ５４ｓ−Ｆｏｒｗａｒｄ
配列番号４ 変異原性プライマー２ｂ−Ｃ５４ｓ−Ｆｏｒｗａｒｄ
配列番号５ ＰＲＲＳＶ Ｐ１２９のＥタンパク質
配列番号６ ＰＲＲＳＶ １２９Ｅタンパク質のｃＤＮＡ
配列番号７ 変異導入されたＯＲＦ２ｂ
配列番号８ 変異導入されたＯＲＦ２ｂのペプチド
配列番号９、１１、１５、１９、２３、２７ 様々なＣ５４ｓ変異−ヌクレオチド配列
配列番号１０、１２、１６、２０、２４、２８ 様々なＣ５４ｓ変異−ペプチド
配列番号１３、１４、１７、１８、２１、２２、２５、２６、２９、３０ Ｃ５４ｓ変異の順方向（Ｆ）および逆方向（Ｒ）変異原性プライマー
【０００６】
本発明は、Ｅタンパク質中の保存されているシステインが欠失しているか、あるいは非システイン残基に変更されているように改変された遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを提供する。
【０００７】
本発明は、Ｅタンパク質中の保存されているシステインが欠失しているか、あるいは非システイン残基に変更されているように改変されており、ただし、上記非システイン残基はチロシンではない遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをさらに提供する。
【０００８】
本発明は、上述の遺伝的に改変されたウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をさらに提供する。
【０００９】
本発明は、上述の感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子をさらに提供する。
【００１０】
本発明は、上述のウイルスの生物学的に純粋な培養物（すなわち他のウイルスを実質的に含まない）をも提供する。
【００１１】
本発明は、上述の遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含むウイルスベクターをさらに提供する。
【００１２】
本発明は、前述のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、単離されたポリヌクレオチド、または上述のウイルスベクターのいずれかを含む形質移入された宿主細胞をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護するワクチンをさらに提供し、上記ワクチンは、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の、上述の遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルス；上記遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする上述の感染性ＲＮＡ分子；遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする上述の単離されたポリヌクレオチド分子（プラスミドの形態でもよい）；または遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする上述のウイルスベクター；および獣医学的使用に許容できる担体を含む。
【００１４】
本発明は、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の、上述のワクチンを動物に接種するステップを含む、ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護する方法をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、上述のＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列に変異導入するステップと、適切な発現系を用いて遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを発現するステップとを含む、遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを作製する方法を提供する。
【００１６】
ＰＲＲＳウイルスは、野生型のものも、遺伝的に改変されたものも、当技術分野で一般的に知られている適当な発現系を用いて、単離されたポリヌクレオチド分子から発現させることができ、そのような発現系の例は、本出願に記載されている。例えば、単離されたポリヌクレオチド分子は、下記にさらに詳述する通り、コードされているウイルスを適当な宿主細胞で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現することができるプラスミドの形態のものでよい。
【００１７】
本発明の他の特徴は、概観することで明らかになろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明者らは、上記ウイルスのＥ（または２ｂ）タンパク質中にある、特定のシステイン残基に変異導入するか、あるいはこれを欠失させることによって病原性のＰＲＲＳウイルスを弱毒化する方法、前記弱毒化ウイルスを含む免疫原性組成物、および前記免疫原性組成物を用いたワクチン接種によってＰＲＲＳからブタを保護する方法をここに開示する。この方法によって弱毒化されたＰＲＲＳウイルスは、病原性野生株の抗原性の特徴を保持し、それゆえ、細胞培養によって弱毒化されたウイルスに基づくワクチンより効果的な防御を提供するに違いない。
【００１９】
アルテリウイルスは、暫定的にエンベロープ（Ｅ）タンパク質と名付けられた小さな疎水性の構造タンパク質をコードする（Ｓｎｉｊｄｅｒ，Ｅ．Ｊ．ら（１９９９年）、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３（８）、６３３５−６３４５）。
【００２０】
Ｅタンパク質の機能は未知であるが、このタンパク質はすべてのアルテリウイルスで保存されている。ウマ動脈炎ウイルスにおけるノックアウト変異は、細胞培養でのウイルス複製にＥタンパク質が必須であることを示した。ＰＲＲＳウイルスの他の構造タンパク質はそれぞれ、対応する特有のサブゲノムＲＮＡによってコードされているが、それらとは異なり、Ｅタンパク質およびＧＰ２タンパク質は、単一のサブゲノムＲＮＡを共有する。ＯＲＦ２ｂ（Ｅをコードしている）は、より大きなＯＲＦ２ａ（ＧＰ２をコードしている）の内部に完全に含有されており、かつ異なったリーディングフレームを用いている。ＯＲＦ２ｂのＡＴＧ開始コドンはＯＲＦ２ａ開始コドンの下流に位置するが、前者は、翻訳開始により好適なコンテクストの中にあり、おそらく、このサブゲノムＲＮＡから産生される主要産物である（Ｗｕ，Ｗ．Ｈ．ら（２００１年）、Ａ １０−ｋＤａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ＯＲＦ２ｂ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８７（１）、１８３−１９１）。
【００２１】
北米遺伝子型ＰＲＲＳウイルスは、それらのＥタンパク質のアミノ酸配列中に、通常２つのシステイン残基を、位置４９および５４に含有する。北米型ＰＲＲＳの単離株Ｐ１２９の感染性ｃＤＮＡクローンを用いて、Ｃ４９およびＣ５４を個別にセリンに変異させた。この結果得られたＣ４９Ｓ変異体は、生育可能であった。同様に、Ｃ５４Ｓ変異体も生育可能であり、感染性クローンから多量の子孫ウイルスを産生した。Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ４９ＳおよびＰ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスは、ＭＡＲＣ細胞上で容易に継代および力価測定された。しかし、Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスは、改変されたプラーク形態（小型で透明なプラーク）と、加速された細胞変性効果（ＣＰＥ）とを示した。この変異は、ブタにおける弱毒化を導くはずである。
【００２２】
ヨーロッパ遺伝子型ＰＲＲＳウイルスは、位置５１に単一のシステイン残基を含有し、これは、Ｅタンパク質配列をアラインメントした場合、北米型ＰＲＲＳウイルスのＣ５４に正確に対応している。本発明者らは、ヨーロッパ型ＰＲＲＳＶ Ｅタンパク質におけるＣ５１の消失（欠失または置換による）が、細胞培養において、Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓに類似した改変表現型を有し、ブタで弱毒化されるであろうと予測する（下記の通り、本発明者らは、北米型ＰＲＲＳおよびヨーロッパ型ＰＲＲＳ Ｅタンパク質の両方に存在しているシステイン残基を「保存されているシステイン」と名付けた）。このタイプのウイルス変異は、単独でも、他の弱毒化変異と併用する場合でも、新規なＰＲＲＳワクチンを設計するのに貴重である。
【００２３】
定義
ＣＰＥは、細胞変性効果である。
【００２４】
ＰＲＲＳＶ「Ｅタンパク質」または「ＯＲＦ２ｂタンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、ＰＲＲＳウイルスのヨーロッパ単離株およびアメリカ単離株両方のＯＲＦ２ｂによってコードされているポリペプチドと定義される。ＰＲＲＳウイルスの他の構造タンパク質はそれぞれ、対応する特有のサブゲノムＲＮＡによってコードされているが、それらとは異なり、Ｅタンパク質およびＧＰ２タンパク質は、単一のサブゲノムＲＮＡを共有する。ＯＲＦ２ｂ（Ｅをコードしている）は、より大きなＯＲＦ２ａ（ＧＰ２をコードしている）の内部に完全に含有されており、かつ異なったリーディングフレームを用いている。ＯＲＦ２ｂのＡＴＧ開始コドンはＯＲＦ２ａ開始コドンの下流に位置するが、前者は、翻訳開始により好適なコンテクストの中にありおそらく、このサブゲノムＲＮＡから産生される主要産物である（Ｗｕら、２００１年）。
【００２５】
「ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルス」という用語は、１９９１年頃にヨーロッパで最初に単離されたＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．ら、１９９１年、Ｖｅｔ．Ｑ．１３：１２１−１３０）に関連した遺伝的特性を有する、いかなる株のＰＲＲＳウイルスも意味する。当技術分野では、「ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルス」を「レリスタットウイルス」と呼ぶこともある。
【００２６】
「遺伝的に改変された」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、人的な介入により遺伝的に変異されていることを意味する。
【００２７】
「ＰＲＲＳウイルスの複製を支持できる宿主細胞」という用語は、本発明のウイルスまたはポリヌクレオチドで感染または形質移入させた感染性ＰＲＲＳを生じることができる細胞系を意味する。そのような細胞には、ブタ肺胞マクロファージ細胞およびブタ肺胞マクロファージ細胞に由来する細胞、ＭＡ−１０４細胞およびＭＡ−１０４細胞に由来する細胞、ならびにＭＡＲＣ−１４５細胞およびＭＡＲＣ−１４５細胞に由来する細胞が含まれる。本発明のプラークが小さい表現型を実証するには、ＭＡＲＣ−１４５細胞が特に好ましい。「ＰＲＲＳウイルスの複製を支持できる宿主細胞」という用語には、生きているブタの体内にある細胞も含まれうる。
【００２８】
本発明の目的では、「免疫応答」という用語は、１つまたは複数の特定の抗原エピトープに対する抗体および／または細胞（Ｔリンパ球など）、あるいは上記エピトープの分解または阻害を補助する抗体および／または細胞の産生を意味する。「効果的免疫防御反応」という句ならびに「免疫防御」および同様な用語は、本発明の目的では、ワクチン接種された動物体内で病原体による感染に対して防御する、上記病原体の１つまたは複数の抗原エピトープに向けられた免疫応答を意味する。本発明の目的では、病原体による感染に対する防御には、感染の絶対的予防のみでなく、ワクチン接種されなかった感染動物と比較した際の、病原体による感染の程度または速度におけるいかなる検出可能な低減も、あるいはワクチン接種された動物体内の病原体による感染から生じた疾患またはなんらかの症候もしくは状態の重症度におけるいかなる検出可能な低減も含まれる。効果的免疫防御反応は、以前に病原体に感染していない、かつ／もしくはワクチン接種時に病原体に感染していない動物で誘導できる。効果的免疫防御反応は、ワクチン接種時に既に病原体に感染していた動物でも誘導できる。
【００２９】
「変異導入された」という用語は、あるアミノ酸から別のアミノ酸への交換、または、あるコーディングヌクレオチドから別のヌクレオチドへの交換（例えばＴからＣへ）、すなわち、いわゆる「置換」、好ましくはコードされているアミノ酸を変更するやり方での置換、あるいは「欠失」または「挿入」などの他の任意な変異を意味する。上記の変異は常に、コーディングヌクレオチド配列中で行われたものである。
【００３０】
「北米型ＰＲＲＳウイルス」という用語は、限定されるものではないが、１９９０年代初期に米国で最初に単離されたＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｅ．ら、１９９２年、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４：１１７−１２６を参照）；北米型ＰＲＲＳウイルス単離株ＭＮ−１ｂ（Ｋｗａｎｇ、Ｊ．ら、１９９４年、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６：２９３−２９６）；ＰＲＲＳのＱｕｅｂｅｃ ＩＡＦ−ｅｘｐ９１株（Ｍａｒｄａｓｓｉ、Ｈ．ら、１９９５年、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４０：１４０５−１４１８）；および北米型ＰＲＲＳウイルス単離株ＶＲ２３８５（Ｍｅｎｇ，Ｘ．−Ｊら、１９９４年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１７９５−１８０１）などの北米型ＰＲＲＳウイルス単離株に関連した遺伝的特性を有するいかなるＰＲＲＳウイルスも意味する。遺伝的特性とは、北米型ＰＲＲＳウイルス株が共有するゲノムヌクレオチド配列類似性およびアミノ酸配列類似性を意味する。
【００３１】
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定のＰＲＲＳウイルスタンパク質を、終止コドンの介在なしにコードするのに必要な最小限のヌクレオチド配列を指す。
【００３２】
「ブタの（ｐｏｒｃｉｎｅ）」および「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」という用語は、本明細書では同義的に使用され、例えば豚（ｐｉｇ）など、イノシシ（Ｓｕｉｄａｅ）科の一員であるいかなる動物も指す。「ＰＲＲＳウイルス」、または「ＰＲＲＳＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、北米型またはヨーロッパ型いずれかのいかなるＰＲＲＳウイルス株も意味する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ＰＲＲＳ」という用語は、ＰＲＲＳウイルス感染によって引き起こされる、ブタの疾患症候を包含する。そのような症候の例には、妊娠したメスの流産、ならびに若いブタの成長遅滞、呼吸困難、食欲不振、および死亡が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「ＰＲＲＳを生じさせることができない」ＰＲＲＳウイルスは、ブタに感染することができるウイルスであって、通常はブタのＰＲＲＳ感染に関連している疾患症候のうちいかなるものも生じさせないウイルス、あるいはそのような症候を生じさせるが、野生型の病原性の感染と比較して、その程度が小さいか、もしくは生じさせるそのような症候の数が少ないか、またはその両方であるウイルスを指す。
【００３４】
「形質移入された宿主細胞」という用語は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５６００６６２号に記載のものなど、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡで形質移入された際に第１ラウンドのＰＲＲＳビリオンを産生できる実際的にいかなる宿主細胞も指す。さらに増殖性の感染が望ましい場合には、以下に定義する「ＰＲＲＳウイルスの複製を支持できる宿主細胞」が使用されるであろう。
【００３５】
ポリヌクレオチド分子は、当技術分野で知られている部位特異的変異導入による技法、または化学変異原もしくは放射線照射への曝露による技法などの、無作為変異導入による技法を含めた、当業者に知られている組換え技法を用いて遺伝的に変異させることができる。前記変異導入は、当技術分野で知られている標準法によって、例えば、記載（例えば、Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、１９９８年、４４０：１９９−２０６）の通り、感染性コピーの部位特異的変異導入（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社、米国ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ所在）によって実施できる。
【００３６】
したがって、本発明は、上述のＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列に変異導入するステップと、適切な発現系を用いて遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを発現するステップとを含む、遺伝的に改変された北米型ＰＲＲＳウイルスを作製する方法をさらに提供する。遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスは、当技術分野で一般的に知られている適当な発現系を用いて、単離されたポリヌクレオチド分子から発現させることができる。そのような発現系の例は、本出願で記載されている。例えば、上記単離されたポリヌクレオチド分子は、下記に詳細に記述する通り、コードされているウイルスを適当な宿主細胞で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現できるプラスミドの形態のものでもよい。
【００３７】
現在知られている、Ｅタンパク質の特定のイソ型の例には、アメリカ型ＰＲＲＳの７３アミノ酸ポリペプチドとして、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ８７３９２に報告されている配列（ＶＲ２３３２としても知られている）のゲノム位置１２０７８〜１２２９９によって予測されているもの、およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ４９４０４２の配列（Ｐ１２９としても知られている）によって予測されており、かつタンパク質ＡＡＭ１８５６０．１として報告されているものがあり、さらに、７０残基のヨーロッパ型ＰＲＲＳ Ｅタンパク質として、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ９６２６２（Ｌｅｌｙｓｔａｄ（レリスタット）単離株としても知られている）のゲノム位置１１８０１〜１２０１３によって予測されているものがある。
【００３８】
これらの北米型ＰＲＲＳＶのＥタンパク質配列は高度に保存されており、報告されている配列は、相互に約９３％の同一性を有する。北米型およびヨーロッパ型のＰＲＲＳＶ Ｅタンパク質は約８３％同一であり、ＶＲ２３３２およびＰ１２９Ｅタンパク質単離体の残基５４、そして、Ｌｅｌｙｓｔａｄ単離Ｅタンパク質の残基５１にある、保存されているシステインを（他の多くの残基と共に）共有している。図３は、本発明者らが「保存されているシステイン」と指摘したシステイン、すなわちヨーロッパ型およびアメリカ型のＰＲＲＳ単離株の間で保存されているシステインを明示したものである。上記で参照したアミノ酸付番は、言及したデータベースの記載に従ったものである。他のＰＲＲＳ単離株では、付番が異なっているかもしれないが、それらすべてで、対象のＰＲＲＳ株にある、保存されている特徴的なアミノ酸を同定し、それを標準株とアラインメントすることによって、適切なシステインが容易に同定される。置換、欠失、または挿入によって、保存されているシステインが欠失し、その結果、プラークの小さい表現型が生ずるように、ＰＲＲＳウイルスまたはそれをコードする核酸を改変することは、本発明の目的の１つである。
【００３９】
保存されているシステインを除去する欠失または置換の導入は、本発明のウイルスをコードするポリヌクレオチドの改変によって行う。好ましい実施形態では、欠失または挿入が、保存されているシステインの除去をもたらす、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸を含む欠失または挿入であり、その際、前記欠失または置換の結果、それによって生じるウイルスが、プラークの小さい表現型のものとなる。好ましい実施形態は、５アミノ酸またはそれ未満の欠失または挿入であろう。
【００４０】
アミノ酸は、物理学的特性、ならびにタンパク質の二次構造および三次構造への寄与に応じて分類することができる。保存的置換は、当技術分野において、あるアミノ酸から、類似の特性を有する別のアミノ酸への置換であると認識されている。保存的置換の例を、すぐ下の表Ａに示す（国際公開第９７／０９４３３号パンフレット、１０ページ、１９９７年３月１３日公開（１９９６年９月６日出願のＰＣＴ出願第ＧＢ９６／０２１９７号）より）。
【００４１】
【表１】
【００４２】
別法では、すぐ下の表Ｂに示す通り、保存的アミノ酸をＬｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在（１９７５年）、ｐｐ．７１−７７）に従って分類することができる。
【００４３】
【表２】
【００４４】
さらに別の別法として、保存的置換の例をすぐ下の表Ｃに示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】
遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスの調製
組換えＤＮＡ技術は、核酸をＤＮＡレベルで改変することを目的とした極めて多様かつ強力な分子生物学技法を含み、分子レベルでのゲノムの分析および改変を可能にする。この点に関して、ＰＲＲＳウイルスなどのウイルスは、そのゲノムのサイズが小さいため、そのような操作がとりわけ容易である。しかし、レトロウイルスではないＲＮＡウイルスは、それらの複製においてＤＮＡ中間体の段階を包含しないため、組換えＤＮＡ技術は、それらに直ちに適用することができない。そのようなウイルスに関しては、改変ウイルスを生成させるために、それらのゲノムに組換えＤＮＡ技術を適用できるようになる前に、感染性のｃＤＮＡクローンを発生させなければならない。感染性クローンは、研究しているウイルスの完全長（ゲノム長）ｃＤＮＡ（ここでは、ＲＮＡのＤＮＡコピーに関する広い意味で用いられおり、厳密な意味でのｍＲＮＡのＤＮＡコピーのみではない）を構築し、その後、その完全長ｃＤＮＡで形質移入された細胞で、ｉｎ ｖｉｖｏで感染性転写産物を合成させることを介して得ることができる。感染性転写物は、完全長ｃＤＮＡ、または、完全なウイルスゲノムを含む、連結された部分長ｃＤＮＡ断片からのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によっても得ることができる。すべての場合において、転写されたＲＮＡは、上記ｃＤＮＡに導入されたすべての改変を保有し、そのように改変されたウイルスのさらなる継代に使用することができる。
【００４７】
ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルス単離株であるレリスタットウイルスの感染性クローンの調製は、参照により本明細書に完全に組み込まれている米国特許第６２６８１９９号明細書、Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇら、２００１年７月３１日に記載されている。Ｐ１２９と名付けられた北米型ＰＲＲＳウイルス単離株の感染性ｃＤＮＡクローンの調製は、参照により本明細書に完全に組み込まれている米国特許第６５００６６２号明細書、Ｃａｌｖｅｒｔら、２００２年１２月３１日に記載されている。Ｐ１２９のｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ４９４０４２および米国特許第６５００６６２号明細書、Ｃａｌｖｅｒｔら、２００２年１２月３１日に開示されている。本発明者らの下記の研究は、プラスミドの状態でＣＭＶ前初期プロモーターによって発現されるそのような感染性クローンを利用している。この感染性クローンは、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９と呼ばれ、米国特許第６５００６６２号明細書、Ｃａｌｖｅｒｔら、２００２年１２月３１日の中でも開示されている。米国特許第６５００６６２号明細書、Ｃａｌｖｅｒｔら、２００２年１２月３１日に記載の通り、他のプラスミドおよびプロモーターも適している。
【００４８】
対象とするいかなるオープンリーディングフレームも、その完全な配列、および対象とするアミノ酸残基の位置が得られれば、当業者が、所望の特定の位置における変化を設計するのに、コドン表を参照するのみで十分であるのは明らかである。
【００４９】
【表４】
【００５０】
アミノ酸、ならびにそれらを表す短縮表記、シンボル、およびコドンの表を、以下の表Ｅに詳細に示す。
【００５１】
【表５】
【００５２】
当技術分野でよく知られている通り、コドンは、ｍＲＮＡ分子およびそれらに対応するｃＤＮＡ分子において、ヌクレオチドのトリプレット配列を構成する。コドンは、ｍＲＮＡ分子中に存在する場合には、ウラシル（Ｕ）塩基を特徴とするが、ＤＮＡ中に存在する場合には、チミジン（Ｔ）塩基を特徴とする。ポリヌクレオチド中における、同じアミノ酸残基をコードするコドンの単純な変化は、コードされているポリペプチドの配列も、構造も変化させないであろう。ある特定の３ヌクレオチド配列が、いずれのアミノ酸であれ、特定のアミノ酸を「コードしている」と述べる句が存在する場合、当業者ならば、上記の表から、問題としている特定のヌクレオチドを同定する手段が得られると認識するであろうことは明らかである。一例として、ある特定の３ヌクレオチド配列がシステインをコードしている場合、上記の表は、可能である２つのトリプレット配列がＵＧＣ（ＤＮＡではＴＧＣ）およびＵＧＵ（ＤＮＡではＴＧＴ）であることを開示している。セリンは、ＡＧＣ、ＡＧＵ（ＤＮＡではＡＧＴ）、ＵＣＡ（ＤＮＡではＴＣＡ）、ＵＣＣ（ＤＮＡではＴＣＣ）、ＵＣＧ（ＤＮＡではＴＣＧ）、およびＵＣＵ（ＤＮＡではＴＣＴ）によってコードされている。コードされているタンパク質中にある、あるシステインをセリン残基に変えるには、コードしている核酸中のＴＧＣまたはＴＧＴトリプレットを、ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、またはＴＣＴのうちのいずれかに交換できよう。
【００５３】
まさしくそのような変異体Ｅタンパク質のポリヌクレオチド配列の構築を、例示によって以下に示す。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
シャトルプラスミドＰＴＢ−ＳＨＵＴＴＬＥ−ＰＲＲＳＶ−３９９７の構築
完全長ＰＲＲＳウイルスゲノムｃＤＮＡクローンへの特定の改変の導入を容易にするために、シャトルプラスミドを構築した。ウイルスゲノムの最も３’末端側に相当する３９９７ｂｐ断片（２１残基のポリアデノシンテールを含むヌクレオチド位置１１５０４から１５４１６まで）および下流のベクター配列８４ｂｐをＰＣＲ増幅させた。このＰＣＲ反応は、５ｎｇのｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９プラスミドＤＮＡ（米国特許６５００６６２号明細書）、３００ｎｇの順方向プライマーＰ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｆｗｄ、配列番号１（５’−ＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＡＴＧ−３’：位置１１５０４から１１５３０まで）、３００ｎｇの逆方向プライマーＰ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｒｅｖプライマー、配列番号２（５’−ＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＣＧＣＧＧＣ−３’：位置１５５００から１５４７５まで）、各１ｍＭのｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、および２．５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を含有し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて行った。反応物を９５℃で５分間加熱し、下記の条件、すなわち、９５℃で３０秒の変性、５５℃で１分間のプライマーアニーリング、および７２℃で３分間の伸長で、３５サイクルの増幅を行った。このＰＣＲ産物を、ＴｒｕｅＢｌｕｅ ＭｉｃｒｏＣａｒｔｒｉｄｇｅ（商標）ＰＣＲクローニングキットＸＬ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｏｎｅ社；米国ニューヨーク州Ｂｕｆｆａｌｏ所在）を用いて、ｐＴｒｕｅＢｌｕｅベクター中にクローニングして、ｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７を作製した。
【００５５】
（実施例２）
Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスを生成させるための、タンパク質Ｅ（または２Ｂ）のシステイン残基５４の置換
ＰＲＲＳＶ Ｐ１２９のＥタンパク質は、ＯＲＦ２ｂによってコードされており、アミノ酸位置４９および５４に２つのシステイン残基を含有する。配列番号５、ＭＧＳＩＱＳＬＦＤＫＩＧＱＬＦＶＤＡＦＴＥＦＬＶＳＩＶＤＩＩＩＦＬＡＩＬＦＧＦＴＩＡＧＷＬＶＶＦＣＩＲＬＶＣＳＡＶＦＲＡＲＰＡＩＨＰＥＱＬＱＫＩＬを参照のこと。配列番号５のｃＤＮＡは、配列番号６ＡＴＧＧＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＡＡＧＣＣＴＣＴＴＣＧＡＣＡＡＡＡＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＧＣＴＴＴＣＡＣＧＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＴＧＣＡＴＣＡＧＡＴＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣＣＧＣＧＧＴＡＴＴＣＣＧＴＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＡＴＧＡである。
【００５６】
位置５４のシステイン残基（Ｐ１２９ゲノムのヌクレオチド位置１２２２１〜１２２２３）を、ＰＣＲベースの部位特異的変異導入を用いてセリンで置換した。変異原プライマー２ｂ−Ｃ５４Ｓ−Ｆｗｄ、配列番号３（５’−ＧＣＡＴＣＡＧＡＴＴＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＧＣＧＧＴＡＴＴＣＣＧ−３’：ヌクレオチド位置１２２０７から１２２３８まで）および２ｂ−Ｃ５４Ｓ−Ｒｅｖ、配列番号４（５’−ＣＧＧＡＡＴＡＣＣＧＣＧＧＡＧＣＴＡＡＣＣＡＡＴＣＴＧＡＴＧＣ−３’：ヌクレオチド位置１２２０７から１２２３８まで）と共に、シャトルプラスミドｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７を鋳型として用いた。変異導入されたコドンには下線が引かれている。ＰＣＲ増幅は、５ｎｇのｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７プラスミドＤＮＡ、順方向プライマーおよび逆方向プライマーそれぞれ３００ｎｇ；ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＴＴＰのそれぞれ１ｍＭ濃度、１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）ならびに２．５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて行った。下記の条件、すなわち、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で１分間のプライマーアニーリング、および６８℃で１２分３０秒間のプライマー伸長で、試料の増幅を１６サイクル行った。ＰＣＲサイクルの後に、メチル化されているプラスミドＤＮＡ鋳型を除去するために、１０ＵのＤｐｎＩでＰＣＲ産物を消化させた。変異導入されたプラスミドを含有するＰＣＲ−Ｄｐｎ Ｉ消化反応物４μｌを用い、熱ショックによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換させ、アンピシリンを含有するＬＢアガープレート上に広げた。コロニーを無作為に選択し、終夜培養した。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて調製した。システインからセリンへ（Ｃ５４Ｓ）の所望の変異の存在を、ヌクレオチド配列の決定によって確認し、結果として得られたプラスミドをｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｅ−Ｃ５４Ｓと命名した。変異導入されたＯＲＦ２ｂの配列は、配列番号７ＡＴＧＧＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＡＡＧＣＣＴＣＴＴＣＧＡＣＡＡＡＡＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＧＣＴＴＴＣＡＣＧＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＴＧＣＡＴＣＡＧＡＴＴＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＧＣＧＧＴＡＴＴＣＣＧＴＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＡＴＧＡであり、コードされているペプチドは、配列番号８ＭＧＳＩＱＳＬＦＤＫＩＧＱＬＦＶＤＡＦＴＥＦＬＶＳＩＶＤＩＩＩＦＬＡＩＬＦＧＦＴＩＡＧＷＬＶＶＦＣＩＲＬＶＳＳＡＶＦＲＡＲＰＡＩＨＰＥＱＬＱＫＩＬである。
【００５７】
シャトルプラスミドｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｅ−Ｃ５４Ｓおよび野生型完全長ゲノムクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９は両方とも、ユニークなＥｃｏ４７ ＩＩＩ部位およびＢｓｒＧ Ｉ部位を含有している（それぞれ位置２８５および１１９２、ならびに位置１１７８５および１２６９２）。各プラスミドをＥｃｏ４７ ＩＩＩおよびＢｓｒＧ Ｉで消化させた。９０８ｂｐのＥｃｏ４７ ＩＩＩ−ＢｓｒＧ Ｉ断片をｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｅ−Ｃ５４Ｓからゲル精製し、１７９８４ｂｐのＥｃｏ４７ ＩＩＩ−ＢｓｒＧ Ｉ断片をｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９からゲル精製した。これら２つの断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて連結し、Ｃ５４Ｓ改変完全長ゲノムｃＤＮＡクローンを構築した。１０μｌの連結反応物で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換させた。アンピシリンを含有するＬＢプレートから細菌コロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。Ｘｍａ Ｉ消化パターンに基づいて、全長クローンを選択した。完全長ゲノムｃＤＮＡクローンにおけるＣ５４Ｓ改変の存在を確認するために、選択されたクローンの配列決定を行った。この結果得られたプラスミドを、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓと名付けた。
【００５８】
ＭＡＲＣ−１４５細胞を、８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。直径３５ｍｍの培養皿中に細胞を播種し、７０％集密状態まで培養した。これらの細胞に、２μｇのｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓまたは親プラスミドｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９のＤＮＡで、２４時間、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて形質移入した。形質移入細胞を、８％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ中、３７℃で５日間インキュベートした。ＰＲＲＳＶ特異的な細胞変性効果（ＣＰＥ）は、形質移入の３日後から観測され、近傍の細胞へのさらなる伝搬は、形質移入の５日後から見られた。ＣＰＥの特異性は、非構造タンパク質ｎｓｐ２およびｎｓｐ３に対するウサギ抗血清、ならびにＮ特異的ＭＡｂ ＳＤＯＷ１７を用いた免疫蛍光細胞染色によって確認した。形質移入の５日後に、形質移入細胞の培養上清を採取し、「Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓ継代１」（Ｐ１）と名付けた。継代１ウイルスを用いて、新たなＭＡＲＣ−１４５細胞に播種し、５日後に採取したものを「継代２」（Ｐ２）と名付けた。「継代３」ウイルスも、Ｐ２と同様に調製した。各ウイルス継代の１ｍｌアリコートを、使用するまで−８０℃で保存した。Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスの各継代をプラークアッセイによって力価決定した。継代１、２、および３の力価は、それぞれ、１．５×１０４、５×１０５、および１×１０４ｐｆｕ／ｍｌと測定された。平行して、野生型Ｐ１２９ウイルスをｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９から産生し、力価決定した。その結果得られた、継代１、２、および３の力価は、それぞれ、１×１０３、１×１０４、および５×１０５ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００５９】
Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスは、Ｐ１２９親ウイルスと比較して、遅いＣＰＥ出現開始を示す明確に異なった細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生を誘導し、プラークが小さい表現型を示した。親ｃＤＮＡクローンＰＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９または変異体ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４ＳでＭＡＲＣ−１４５細胞に形質移入した結果として、感染細胞の可視的な増殖巣が生じた。また、Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスによって媒介されたＣＰＥは、サイズが極めて類似したものであったが、形質移入の４日後までに現れるＰ１２９親ウイルスによるＣＰＥに比べて、出現が遅かった。しかしその後、変異体ウイルスは、増殖巣の中に死細胞または脱離細胞の領域を伴う急速かつ広範なＣＰＥを引き起こし（形質移入の約５日後）、一方、親ウイルスは、同期間中には単に、増殖巣サイズの中程度な増大を示した。ＣＰＥの相違を図１に示す。ウイルス力価は、ＣＰＥのこの相違に対応して、最初２代のウイルス継代の間、変異体ウイルスが親ウイルスより多くの（しかし３代目では少ない）子孫ウイルスを産生した。プラーク形態の相違を図２に示す。Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスは、親ウイルスであるＰ１２９のプラークと比較して、直径が小さく、形態の異なるプラークを産生する。Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ４５４Ｓプラークは、その中心にある細胞がＰ１２９プラークより早くかつ完全に死亡および脱離するため、より透明であった。プラークが小さい表現型に関しては、いくつかの生物学的説明が存在しうるが、小さいプラークが観察されたことは、細胞から細胞までの、Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスの伝搬が、親ウイルスより遅いことの直接的証拠である。この特徴は、病原性の親ウイルスから弱毒化された（病原性がより弱い）生ワクチンウイルスを生成させるのに本発明で使用できる。
【００６０】
実際、プラークが小さい表現型を生じるウイルスであって、かつそれらの天然宿主中で弱毒化されているウイルスの多数の例が存在する（Ｍａｔｈｅｗら、「Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ５Ｒ ａｆｆｅｃｔｓ ｐｌａｑｕｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ，ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｔｉｎ ｔａｉｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（３）：２４２９−３８（１９９８年）；Ｅｎｇｅｌｓｔａｄら、「Ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ４２−ｋＤａ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｇｒｅｓｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４（２）：６２７−３７（１９９３年）；Ｌｅｗｉｓら、「Ａｎ Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ＥＲＶ１−ＡＬＲ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ，９ＧＬ，ａｆｆｅｃｔｓ ｖｉｒｉｏｎ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ ｓｗｉｎｅ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（３）：１２７５−８５（２０００年）；Ｌｅｅら、「Ｃｏｍｍｏｎ Ｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｆｏｒ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ａｎｄ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓｅｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８（１５）：８２７１−８０（２００４年）；Ｆｒａｍｐｔｏｎら、「Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｕｎｉｑｕｅ ｓｈｏｒｔ ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ｅｑｕｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ １ ｔｏ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ」、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９０（１−２）：２８７−３０１（２００２年）；Ｌｅｅら、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（１０）：４９０１−１１、（２００２年）；Ｂｕｔｒａｐｅｔら、「Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ２ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ １６６８１（ＰＤＫ−５３），ａｒｅ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ５’ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ １ ａｎｄ ３」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（７）：３０１１−９（２０００年））。米国特許出願公開第２００２／００１２６７０号に由来する下記の実施例は、ＰＲＲＳウイルスの２つの異なった株の病原性の特性を比較するための明確な手引きを提供する。
【００６１】
（実施例３）
システイン残基５４の復帰抵抗性変異
ＴＧＣ（システイン）からＡＧＣ（セリン）に、単一コドン中の単一ヌクレオチドを改変することによって、実施例２に記載したＣ５４Ｓ変異を生成させた。変異の表現型の決定に関しては適切であるが、無作為な変異と自然選択とによって比較的高い頻度で、この結果生じたウイルスが親配列（そして、親表現型）に復帰するかもしれないと予測されるであろう。本発明の好ましい実施形態、特にワクチンを目的としたものでは、位置５４の残基がシステインに戻る確率を最小にするように、そして、他の隣接残基（特に残基５１〜５７）が変異してシステインになる確率を最小にするように設計された複数のヌクレオチド置換および／または欠失を含有するであろう。遺伝暗号を調べることによって、システインは２つのコドン（ＴＧＴおよびＴＧＣ）のみによってコードされていることが明らかになる。システインコドンになるのに、２もしくは３回の別々のヌクレオチド変異事象を必要とするコドンの使用は、１回のみを必要とするものより好ましい。そのような「復帰抵抗性」の変異の例を表Ｆに示す。これらは、限定ではなく、代表であると意図されている。当業者ならば、復帰抵抗性変異の例を他にも多数想起することができる。
【００６２】
Ｃ５４Ｓ−２変異（表Ｆを参照）は、Ｃ５４Ｓ変異と同じアミノ酸変化をもたらすが、セリンコドンの選択がＡＧＣからＴＣＧに変わっている。したがって、システインコドンを生成するのに２回の独立したヌクレオチド変異が必要であり、表現型が復帰する確率がＣ５４Ｓと比較して低下している。変異Ｃ５４Ｓ−３は、位置５４に同じセリンコドンを組み入れているが、ロイシン５２（ＴＴＧからＣＴＧに）、バリン５３（ＧＴＴからＧＴＡに）、およびセリン５５（ＴＣＣからＴＣＧに）のコドン改変も有する。その結果、これら３つのコドンがシステインコドンに変異する確率が低下しており、したがって、位置５４におけるシステイン残基の不在を機能的に補足する確率が低下している。ＣＳ５４−５５ＡＡ変異では、Ｃ５４およびＳ５５が両方とも、アラニン残基をコードするように変異させられている。セリンと同様にアラニンも、小型で無電荷の側鎖を有しており、システインが有するジスルフィド結合を形成する能力も、金属イオンと相互作用する能力ももたない。４つの可能なアラニンコドンのうち２つ（ＧＣＧおよびＧＣＡ）はシステインコドンとは十分に相違しており、システインコドンを生成するには、３つのヌクレオチドすべてに変異導入しなければならない。したがって、アラニン置換は、表現型復帰の可能性をさらに低下させる好ましい方法である。最後に、ＣＳ５４−５５ｄｅｌＡ変異では、位置５４のコドンが除去されている。加えて、セリン５５がアラニンに改変され、ロイシン５２およびバリン５３のコドンが改変されている。そのような変異体ウイルスの表現型復帰は、極めてまれであると予測されている。
【００６３】
復帰抵抗性の変異を設計する場合、ときに制限酵素認識部位が生成または破壊されるように、代替コドンを選択することができる。これらの相違は、変異していないプラスミドおよびウイルスから変異したものを識別するのに好都合なマーカーとして利用できる。Ｃ５４Ｓ−３、ＣＳ５４−５５ＡＡ、およびＣＳ５４−５５ｄｅｌＡ変異（表Ｆ）の場合、Ｓ５５コドンＴＣＣからＴＣＧ（セリン）またはＧＣＧ（アラニン）のいずれかへの変異は、天然に存在するＳａｃ ＩＩ制限部位（ＣＣＧＣＧＧ）の破壊をもたらす。
【００６４】
ＯＲＦ２ｂはＯＲＦ２ａ（異なったリーディングフレームでＧＰ２をコードする）とオーバーラップしているので、ＯＲＦ２ｂ中のコドンを改変する過程でＯＲＦ２ａに終止コドンを導入しないように注意しなければならない。場合によっては、ＯＲＦ２ｂに加えたコドン変化が、ＯＲＦ２ａによってコードされているアミノ酸配列を変化させることがある。ＧＰ２タンパク質機能に加えられたそのような変化の影響は予測が困難である可能性があり、経験的に判定するのが最良である。
【００６５】
【表６】
【００６６】
（実施例４）
弱毒化の確立
各試験には、無ＰＲＲＳＶ農場から得られた妊娠経験のないメスブタが、１群あたり少なくとも１０匹含まれている。
【００６７】
動物が、ＰＲＲＳウイルス特異的な血清抗体を有していないかどうか、また、ＰＲＲＳＶに関して陰性であるかどうか試験した。試験に含まれているすべての動物は、供給源および品種が同一のものである。群への動物の分配は無作為化して行った。
【００６８】
攻撃は、鼻孔あたり１０５ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳＶ １ｍｌを鼻腔内投与することによって、妊娠９０日目に行う。試験設定ごとに、少なくとも３群が存在する。すなわち、１群は、Ｐ１２９に曝露させるため；１試験群は、弱毒化している可能性のあるウイルスに攻撃させるため；そして１群は厳密な対照群である。
【００６９】
試験期間全体を通して、厳密な対照がＰＲＲＳＶ陰性のまま残り、かつ、Ｐ１２９曝露された群では、厳密な対照と比較して、生きた健康な子ブタの誕生が少なくとも２５％少ない場合に、この試験は有効であるとする。
【００７０】
弱毒化は、換言すれば病原性の低減であり、自己増殖能力を決定する１つまたは複数のパラメータの統計的に有意な変化と定義され、Ｐ１２９感染群との比較で、試験群（弱毒化ウイルスである可能性がある）に関する以下のパラメータ、すなわち、
ａ．）死産の頻度、
ｂ．）妊娠１１２日目またはその以前における流産、
ｃ．）ミイラ変性した子ブタの数、
ｄ．）不活発で弱い子ブタの数、
ｅ．）離乳前の死亡率
のうちの少なくとも１つにおける有意な減少が好ましく、さらに、Ｐ１２９感染群との比較で、試験群に関する以下のパラメータ、すなわち、
ｆ．）メスブタ１匹あたりの離乳した子ブタの数、
ｇ．）メスブタ１匹あたりに産まれた、生きていて健康な子ブタの数
のうちの１つにおける有意の増大が好ましい。
【００７１】
ワクチン
弱毒化株はワクチンの製剤に貴重である。本ワクチンが有効であるというのは、ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護する場合である。あるワクチンがＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護するというのは、１匹または複数の非罹患ブタにワクチンを投与した後、それに続いて、生物学的に純粋なウイルス単離株（例えば、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６、Ｐ１２９など）で攻撃した結果、疾患のなんらかの肉眼的または組織病理学的な変化（例えば肺における病変）および／または症候の重症度が、保護されなかった同様なブタで上記単離株によって通常引き起こされるそれらの変化または症候と比較して（すなわち適切な対照と比較して）低下している場合である。より詳細には、本ワクチンは、それを必要とする１匹または複数の適当なブタに本ワクチン投与し、その後、適当な期間（例えば４週間）の後に、生物学的に純粋なＰＲＲＳＶ単離株の大量の試料（１０（３〜７）ＴＣＩＤ（５０））で攻撃することによって、有効であることを示すことができる。その後、約１週間後に、攻撃されたブタから血液試料を採取し、次に、血液試料からウイルスを単離する試み（例えば、下記実験ＶＩＩＩに例示するウイルス単離過程を参照）を行う。ウイルスの高レベルの単離（ワクチン接種されておらず、攻撃された対照ブタと同様）は、ワクチンが有効でないであろうことの指標である。ウイルス単離ができないことまたは単離されたウイルスの量の減少は、ワクチンが有効であろうことの指標である。
【００７２】
したがって本ワクチンの有効性は、定量的（すなわち、適切な対照群と比較しての圧縮された（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ）肺組織の割合の低下）にも、定性的（例えば、血液からのＰＲＲＳＶの単離、免疫アッセイ法による肺、扁桃腺、またはリンパ節組織標本中のＰＲＲＳＶ抗原の検出）にも評価できる。ブタ生殖器呼吸器疾患の症候は、定量的（例えば体温／熱）にも、準定量的（例えば、呼吸困難（下記に詳細に説明する）の重症度）にも、または定性的（例えば、チアノーゼ、肺炎、心臓および／もしくは脳障害などの１つもしくは複数の症候が存在するかどうか、もしくはそれらにおける重症度低下）にも評価できる。
【００７３】
非罹患ブタとは、ブタ生殖器呼吸器疾患感染因子に曝露されていないブタ、またはブタ生殖器呼吸器疾患感染性因子に曝露されているが上記疾患の症候を示していないブタである。罹患ブタとは、ＰＲＲＳの症候を示しているか、あるいはＰＲＲＳＶを単離することができるブタである。
【００７４】
本発明のワクチンは、標準的な緩衝剤、安定化剤、希釈剤、保存剤、および／または可溶化剤など、ヒト（適切な場合）を含めた動物にとって許容できる担体を含むように、許容できる通例に従って製剤でき、また、持続放出を容易にするように製剤することもできる。希釈剤には、水、食塩水、ブドウ糖、エタノール、グリセロールなどが含まれる。等張化添加物には、とりわけ、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれる。安定化剤には、とりわけ、アルブミンが含まれる。他の適当なワクチン媒体および添加物には、改変生ワクチンを製剤するのに特に有用なものが含まれ、当業者には既知であるか、明らかであろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社を参照のこと。
【００７５】
本発明のワクチンは、例えば中でもアジュバントまたはサイトカインなど、１つまたは複数の追加免疫調節性成分もさらに含むことができる。本発明のワクチンで使用できるアジュバントの非限定例には、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ社、米国モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ所在）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルなどの鉱物ゲル、水中油型乳剤、油中水型乳剤、例えばフロインドの完全および不完全アジュバント、ブロック共重合体（ＣｙｔＲｘ、米国ジョージア州Ａｔｌａｎｔａ所在）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、米国マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ所在）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、米国カリフォルニア州Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ所在）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａもしくは他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、ならびにアブリジン脂質アミンアジュバントが含まれる。本発明のワクチンで有用な水中油型乳剤の非限定例には、改変ＳＥＡＭ６２およびＳＥＡＭ１／２製剤が含まれる。改変ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、０．７％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）界面活性剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ社）、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、２００ｐｇ／ｍｌ Ｑｕｉｌ Ａ、１００［ｍｇｒ］ｇ／ｍｌコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）レシチンを含有する水中油型乳剤である。改変ＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性剤、０．７％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０界面活性剤、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、１００μｇ／ｍｌ Ｑｕｉｌ Ａ、および５０μｇ／ｍｌコレステロールを含む水中油型乳剤である。ワクチンに含有させることができる他の免疫調節剤には、例えば、１つまたは複数のインターロイキン、インターフェロン、または他の既知なサイトカインが含まれる。
【００７６】
本発明のワクチンは、任意選択で、本発明のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターの持続放出用に製剤することもできる。そのような持続放出製剤の例には、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなど生体適合ポリマーの複合物と併せたウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターが含まれる。薬物送達媒体における分解性高分子の構造、選択、および使用は、参照により本明細書に組み込まれている、Ａ．Ｄｏｍｂら、１９９２年、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３：２７９−２９２を含めたいくつかの出版物に概説されている。製剤におけるポリマーの選択および使用に関する追加の手引きは、当技術分野で知られている教科書、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第４５巻（Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ、米国ニューヨーク州所在）中のＭ．ＣｈａｓｉｎおよびＲ．Ｌａｎｇｅｒ（編集）、１９９０年、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」で見出すことができる。別法または追加として、ウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターは、投与および効力を改善するためにマイクロカプセルに入れることができる。抗原をマイクロカプセルに入れる方法は、当技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第３１３７６３１号；第３９５９４５７号；第４２０５０６０号；第４６０６９４０号；第４７４４９３３号；第５１３２１１７号明細書；および国際特許公開第９５／２８２２７号パンフレットに記載の技法が含まれる。
【００７７】
ウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターの持続放出を提供するのに、リポソームを用いることもできる。リポソーム製剤をどのように作製および使用するかに関する詳細は、とりわけ、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４０１６１００号；第４４５２７４７号；第４９２１７０６号；第４９２７６３７号；第４９４４９４８号；第５００８０５０号；および第５００９９５６号明細書に見出すことができる。
【００７８】
上述したどのワクチンも、効果をモニターしながら、低用量のウイルス、プラスミドまたはウイルスベクターから開始して、その後、用量を増強する従来の方法によってその有効量を決定することができる。有効量は、ワクチンの単独投与後に得られても、ワクチンの多回投与後に得られてもよい。動物あたりの最適用量を決定する際には、既知な因子を考慮に入れることができる。これらには、種、サイズ、動物の年齢、一般的な健康状態、動物体内における他剤の存在などが含まれる。実際の用量は、他の動物試験から得られた結果を考慮した後に選択することが好ましい。
【００７９】
適切な免疫応答が実現されたかどうか検出する方法の１つは、ワクチン接種後に動物体内における血清転換および抗体価を測定することである。ワクチン接種のタイミング、および追加免疫が必要な場合におけるその数は、好ましくは、すべての関連要因の分析に基づいて、医師または獣医によって決定されるであろう。そのような関連要因の一部は上述されている。
【００８０】
本発明のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターの有効用量は、既知な技法を使用し、ワクチン接種される動物の体重などの、当業者によって測定できる因子を考慮に入れて決定することができる。本発明のワクチン中の本発明のウイルスの用量は、好ましくは約１０１から約１０９ｐｆｕ（プラーク形成単位）まで、より好ましくは約１０２から約１０８ｐｆｕまで、そして最も好ましくは約１０３から約１０７ｐｆｕまでの範囲にある。本発明のワクチン中の本発明のプラスミドの用量は、好ましくは約０．１μｇから約１００ｍｇまで、より好ましくは約１μｇから約１０ｍｇまで、さらにより好ましくは約１０μｇから約１ｍｇまでの範囲にある。本発明のワクチン中の本発明の感染性ＲＮＡ分子の用量は、好ましくは約０．１μｇから約１００ｍｇまで、より好ましくは１μｇから約１０ｍｇまで、さらにより好ましくは約１０μｇから約１ｍｇまでの範囲にある。本発明のワクチン中の本発明のウイルスベクターの用量は、好ましくは約１０１ｐｆｕから約１０９ｐｆｕまで、より好ましくは約１０２ｐｆｕから約１０８ｐｆｕまで、そして最も好ましくは約１０３から約１０７ｐｆｕまでの範囲にある。適当な用量サイズは、約０．５ｍｌから約１０ｍｌまで、より好ましくは約１ｍｌから約５ｍｌまでの範囲にある。
【００８１】
本発明はさらに、本明細書に記載のＰＲＲＳウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターを含むワクチンを調製する方法を提供し、この方法は、本発明のＰＲＲＳウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターのうち１つの有効量を、薬学的または獣医学的使用に許容できる担体と合わせるステップを含む。
【００８２】
加えて、本発明の弱毒化生ワクチンは、米国特許第６５００６６２号明細書に記載の通り、既知な組換え技法を用いて、ＰＲＲＳウイルスゲノムに挿入された異種抗原エピトープをコードするように改変することができる。本発明の異種抗原エピトープとして有用な抗原エピトープには、ＰＲＲＳウイルス以外のブタ病原体由来の抗原エピトープが含まれ、これらには、限定されるものではないが、ブタパルボウイルス、ブタシルコウィルス、ブタロタウイルス、ブタインフルエンザ、仮性狂犬病ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、古典的ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、脳心筋炎ウイルス、ブタパラミクソウイルス、アクチノバシラスプルロニュウモニエ、炭疽菌、気管支敗血症菌、クロストリジウムヘモリティクム、クロストリジウムパーフリンジェンス、破傷風菌、大腸菌、ブタ丹毒菌、ヘモフィルスパラスイス、レプトスピラ属全種、マイコプラズマ−ヒオニューモニエ、マイコプラズマ−ヒオリニス、パスツレラヘモリチカ、パスツレラムルトシダ、ブタコレラ菌、ネズミチフス菌、ストレプトコッカスエクイシミリス、およびブタ連鎖球菌からなる群から選択されたブタ病原体由来の抗原エピトープが含まれる。前述のブタの病原体から抗原性のエピトープをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で知っていて、ＮＣＢＩによって提供されたＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）などの公共の遺伝子データベースから得ることができる。
【００８３】
本発明の追加の機能および変異は、詳細な説明を含めた本出願全体から、当業者には明らかであろう。そのような特徴のすべてが本発明の態様として意図されている。同様に、本明細書に記載の本発明の特徴は、それらの特徴の組合せが、本発明の一態様または実施形態として、上記に特別に言及されているかどうかに関係なく、それらを再結合して、追加の実施形態にすることができ、それらも本発明の態様として意図されている。本発明に重要であると本明細書に記述されているような限定のみを、限定として考えるべきである。本明細書に重要な限定と記述されていない本発明の変法は、本発明の態様と意図されている。以上の説明および実施例で特に記載されている方法とは別の方法で、本発明を実施できることは明らかであろう。
【００８４】
上記の教示に照らして、多数の本発明の修正および変形が可能であり、それゆえ、それらも本発明に包含される。
【００８５】
本明細書に引用したすべての出版物の全開示を参照により本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスおよびそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。上記遺伝的に改変されたウイルスおよびポリヌクレオチドを含むワクチンも提供する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）は、成熟したメスブタおよび未成熟のメスブタにおける流産、死産、および他の生殖上の問題、ならびに若いブタの呼吸器疾患を特徴とする。原因物質は、アルテリウイルス科およびニドウイルス目の一員であるＰＲＲＳウイルスである。このウイルスの２つの異なった遺伝子型が、北米およびヨーロッパで、１９８０年代後半にほぼ同時に現れた。ＰＲＲＳウイルスは、現在、ほとんどすべてのブタ産出国で風土病となっており、全世界のブタ肉産業に影響を与えている経済的に最も重要な疾患の１つであると考えられている。
【０００３】
現在、ＰＲＲＳに対する市販のワクチンには、改変生ワクチンおよび死菌（不活性化）ワクチンが含まれる。死菌ワクチンは、異種系統のＰＲＲＳウイルスに対しては活発な免疫を誘導しないことが批判されている。改変生ワクチンは、病原力がなくなるまで、細胞培養における連続継代によって弱毒化されている。改変生ワクチンは、死菌ワクチンより広範な防御を誘発するが、残留病原力、非接種のブタへの伝搬、および病原性への遺伝的復帰を含めた、いくつかの安全性に関する懸念を与えることがある。弱毒化の過程で起こる抗原性の変化のため、そのようなワクチンは、病原性の強い野生株のＰＲＲＳウイルスに対する防御能力の一部を失うこともある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そのため、ＰＲＲＳから防御するための新規かつ改善された改変生ワクチンに対する緊急な必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
配列の簡単な説明
配列番号１ シャトルプラスミドＰＴＢ−Ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７の順方向シャトルプライマー
配列番号２ シャトルプラスミドＰＴＢ−Ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７の逆方向シャトルプライマー
配列番号３ 変異原性プライマー２ｂ−Ｃ５４ｓ−Ｆｏｒｗａｒｄ
配列番号４ 変異原性プライマー２ｂ−Ｃ５４ｓ−Ｆｏｒｗａｒｄ
配列番号５ ＰＲＲＳＶ Ｐ１２９のＥタンパク質
配列番号６ ＰＲＲＳＶ １２９Ｅタンパク質のｃＤＮＡ
配列番号７ 変異導入されたＯＲＦ２ｂ
配列番号８ 変異導入されたＯＲＦ２ｂのペプチド
配列番号９、１１、１５、１９、２３、２７ 様々なＣ５４ｓ変異−ヌクレオチド配列
配列番号１０、１２、１６、２０、２４、２８ 様々なＣ５４ｓ変異−ペプチド
配列番号１３、１４、１７、１８、２１、２２、２５、２６、２９、３０ Ｃ５４ｓ変異の順方向（Ｆ）および逆方向（Ｒ）変異原性プライマー
【０００６】
本発明は、Ｅタンパク質中の保存されているシステインが欠失しているか、あるいは非システイン残基に変更されているように改変された遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを提供する。
【０００７】
本発明は、Ｅタンパク質中の保存されているシステインが欠失しているか、あるいは非システイン残基に変更されているように改変されており、ただし、上記非システイン残基はチロシンではない遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをさらに提供する。
【０００８】
本発明は、上述の遺伝的に改変されたウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をさらに提供する。
【０００９】
本発明は、上述の感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子をさらに提供する。
【００１０】
本発明は、上述のウイルスの生物学的に純粋な培養物（すなわち他のウイルスを実質的に含まない）をも提供する。
【００１１】
本発明は、上述の遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含むウイルスベクターをさらに提供する。
【００１２】
本発明は、前述のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、単離されたポリヌクレオチド、または上述のウイルスベクターのいずれかを含む形質移入された宿主細胞をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護するワクチンをさらに提供し、上記ワクチンは、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の、上述の遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルス；上記遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする上述の感染性ＲＮＡ分子；遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする上述の単離されたポリヌクレオチド分子（プラスミドの形態でもよい）；または遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする上述のウイルスベクター；および獣医学的使用に許容できる担体を含む。
【００１４】
本発明は、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の、上述のワクチンを動物に接種するステップを含む、ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護する方法をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、上述のＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列に変異導入するステップと、適切な発現系を用いて遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを発現するステップとを含む、遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを作製する方法を提供する。
【００１６】
ＰＲＲＳウイルスは、野生型のものも、遺伝的に改変されたものも、当技術分野で一般的に知られている適当な発現系を用いて、単離されたポリヌクレオチド分子から発現させることができ、そのような発現系の例は、本出願に記載されている。例えば、単離されたポリヌクレオチド分子は、下記にさらに詳述する通り、コードされているウイルスを適当な宿主細胞で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現することができるプラスミドの形態のものでよい。
【００１７】
本発明の他の特徴は、概観することで明らかになろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明者らは、上記ウイルスのＥ（または２ｂ）タンパク質中にある、特定のシステイン残基に変異導入するか、あるいはこれを欠失させることによって病原性のＰＲＲＳウイルスを弱毒化する方法、前記弱毒化ウイルスを含む免疫原性組成物、および前記免疫原性組成物を用いたワクチン接種によってＰＲＲＳからブタを保護する方法をここに開示する。この方法によって弱毒化されたＰＲＲＳウイルスは、病原性野生株の抗原性の特徴を保持し、それゆえ、細胞培養によって弱毒化されたウイルスに基づくワクチンより効果的な防御を提供するに違いない。
【００１９】
アルテリウイルスは、暫定的にエンベロープ（Ｅ）タンパク質と名付けられた小さな疎水性の構造タンパク質をコードする（Ｓｎｉｊｄｅｒ，Ｅ．Ｊ．ら（１９９９年）、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３（８）、６３３５−６３４５）。
【００２０】
Ｅタンパク質の機能は未知であるが、このタンパク質はすべてのアルテリウイルスで保存されている。ウマ動脈炎ウイルスにおけるノックアウト変異は、細胞培養でのウイルス複製にＥタンパク質が必須であることを示した。ＰＲＲＳウイルスの他の構造タンパク質はそれぞれ、対応する特有のサブゲノムＲＮＡによってコードされているが、それらとは異なり、Ｅタンパク質およびＧＰ２タンパク質は、単一のサブゲノムＲＮＡを共有する。ＯＲＦ２ｂ（Ｅをコードしている）は、より大きなＯＲＦ２ａ（ＧＰ２をコードしている）の内部に完全に含有されており、かつ異なったリーディングフレームを用いている。ＯＲＦ２ｂのＡＴＧ開始コドンはＯＲＦ２ａ開始コドンの下流に位置するが、前者は、翻訳開始により好適なコンテクストの中にあり、おそらく、このサブゲノムＲＮＡから産生される主要産物である（Ｗｕ，Ｗ．Ｈ．ら（２００１年）、Ａ １０−ｋＤａ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ＯＲＦ２ｂ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８７（１）、１８３−１９１）。
【００２１】
北米遺伝子型ＰＲＲＳウイルスは、それらのＥタンパク質のアミノ酸配列中に、通常２つのシステイン残基を、位置４９および５４に含有する。北米型ＰＲＲＳの単離株Ｐ１２９の感染性ｃＤＮＡクローンを用いて、Ｃ４９およびＣ５４を個別にセリンに変異させた。この結果得られたＣ４９Ｓ変異体は、生育可能であった。同様に、Ｃ５４Ｓ変異体も生育可能であり、感染性クローンから多量の子孫ウイルスを産生した。Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ４９ＳおよびＰ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスは、ＭＡＲＣ細胞上で容易に継代および力価測定された。しかし、Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスは、改変されたプラーク形態（小型で透明なプラーク）と、加速された細胞変性効果（ＣＰＥ）とを示した。この変異は、ブタにおける弱毒化を導くはずである。
【００２２】
ヨーロッパ遺伝子型ＰＲＲＳウイルスは、位置５１に単一のシステイン残基を含有し、これは、Ｅタンパク質配列をアラインメントした場合、北米型ＰＲＲＳウイルスのＣ５４に正確に対応している。本発明者らは、ヨーロッパ型ＰＲＲＳＶ Ｅタンパク質におけるＣ５１の消失（欠失または置換による）が、細胞培養において、Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓに類似した改変表現型を有し、ブタで弱毒化されるであろうと予測する（下記の通り、本発明者らは、北米型ＰＲＲＳおよびヨーロッパ型ＰＲＲＳ Ｅタンパク質の両方に存在しているシステイン残基を「保存されているシステイン」と名付けた）。このタイプのウイルス変異は、単独でも、他の弱毒化変異と併用する場合でも、新規なＰＲＲＳワクチンを設計するのに貴重である。
【００２３】
定義
ＣＰＥは、細胞変性効果である。
【００２４】
ＰＲＲＳＶ「Ｅタンパク質」または「ＯＲＦ２ｂタンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、ＰＲＲＳウイルスのヨーロッパ単離株およびアメリカ単離株両方のＯＲＦ２ｂによってコードされているポリペプチドと定義される。ＰＲＲＳウイルスの他の構造タンパク質はそれぞれ、対応する特有のサブゲノムＲＮＡによってコードされているが、それらとは異なり、Ｅタンパク質およびＧＰ２タンパク質は、単一のサブゲノムＲＮＡを共有する。ＯＲＦ２ｂ（Ｅをコードしている）は、より大きなＯＲＦ２ａ（ＧＰ２をコードしている）の内部に完全に含有されており、かつ異なったリーディングフレームを用いている。ＯＲＦ２ｂのＡＴＧ開始コドンはＯＲＦ２ａ開始コドンの下流に位置するが、前者は、翻訳開始により好適なコンテクストの中にありおそらく、このサブゲノムＲＮＡから産生される主要産物である（Ｗｕら、２００１年）。
【００２５】
「ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルス」という用語は、１９９１年頃にヨーロッパで最初に単離されたＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．ら、１９９１年、Ｖｅｔ．Ｑ．１３：１２１−１３０）に関連した遺伝的特性を有する、いかなる株のＰＲＲＳウイルスも意味する。当技術分野では、「ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルス」を「レリスタットウイルス」と呼ぶこともある。
【００２６】
「遺伝的に改変された」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、人的な介入により遺伝的に変異されていることを意味する。
【００２７】
「ＰＲＲＳウイルスの複製を支持できる宿主細胞」という用語は、本発明のウイルスまたはポリヌクレオチドで感染または形質移入させた感染性ＰＲＲＳを生じることができる細胞系を意味する。そのような細胞には、ブタ肺胞マクロファージ細胞およびブタ肺胞マクロファージ細胞に由来する細胞、ＭＡ−１０４細胞およびＭＡ−１０４細胞に由来する細胞、ならびにＭＡＲＣ−１４５細胞およびＭＡＲＣ−１４５細胞に由来する細胞が含まれる。本発明のプラークが小さい表現型を実証するには、ＭＡＲＣ−１４５細胞が特に好ましい。「ＰＲＲＳウイルスの複製を支持できる宿主細胞」という用語には、生きているブタの体内にある細胞も含まれうる。
【００２８】
本発明の目的では、「免疫応答」という用語は、１つまたは複数の特定の抗原エピトープに対する抗体および／または細胞（Ｔリンパ球など）、あるいは上記エピトープの分解または阻害を補助する抗体および／または細胞の産生を意味する。「効果的免疫防御反応」という句ならびに「免疫防御」および同様な用語は、本発明の目的では、ワクチン接種された動物体内で病原体による感染に対して防御する、上記病原体の１つまたは複数の抗原エピトープに向けられた免疫応答を意味する。本発明の目的では、病原体による感染に対する防御には、感染の絶対的予防のみでなく、ワクチン接種されなかった感染動物と比較した際の、病原体による感染の程度または速度におけるいかなる検出可能な低減も、あるいはワクチン接種された動物体内の病原体による感染から生じた疾患またはなんらかの症候もしくは状態の重症度におけるいかなる検出可能な低減も含まれる。効果的免疫防御反応は、以前に病原体に感染していない、かつ／もしくはワクチン接種時に病原体に感染していない動物で誘導できる。効果的免疫防御反応は、ワクチン接種時に既に病原体に感染していた動物でも誘導できる。
【００２９】
「変異導入された」という用語は、あるアミノ酸から別のアミノ酸への交換、または、あるコーディングヌクレオチドから別のヌクレオチドへの交換（例えばＴからＣへ）、すなわち、いわゆる「置換」、好ましくはコードされているアミノ酸を変更するやり方での置換、あるいは「欠失」または「挿入」などの他の任意な変異を意味する。上記の変異は常に、コーディングヌクレオチド配列中で行われたものである。
【００３０】
「北米型ＰＲＲＳウイルス」という用語は、限定されるものではないが、１９９０年代初期に米国で最初に単離されたＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｅ．ら、１９９２年、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４：１１７−１２６を参照）；北米型ＰＲＲＳウイルス単離株ＭＮ−１ｂ（Ｋｗａｎｇ、Ｊ．ら、１９９４年、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６：２９３−２９６）；ＰＲＲＳのＱｕｅｂｅｃ ＩＡＦ−ｅｘｐ９１株（Ｍａｒｄａｓｓｉ、Ｈ．ら、１９９５年、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４０：１４０５−１４１８）；および北米型ＰＲＲＳウイルス単離株ＶＲ２３８５（Ｍｅｎｇ，Ｘ．−Ｊら、１９９４年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１７９５−１８０１）などの北米型ＰＲＲＳウイルス単離株に関連した遺伝的特性を有するいかなるＰＲＲＳウイルスも意味する。遺伝的特性とは、北米型ＰＲＲＳウイルス株が共有するゲノムヌクレオチド配列類似性およびアミノ酸配列類似性を意味する。
【００３１】
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定のＰＲＲＳウイルスタンパク質を、終止コドンの介在なしにコードするのに必要な最小限のヌクレオチド配列を指す。
【００３２】
「ブタの（ｐｏｒｃｉｎｅ）」および「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」という用語は、本明細書では同義的に使用され、例えば豚（ｐｉｇ）など、イノシシ（Ｓｕｉｄａｅ）科の一員であるいかなる動物も指す。「ＰＲＲＳウイルス」、または「ＰＲＲＳＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、北米型またはヨーロッパ型いずれかのいかなるＰＲＲＳウイルス株も意味する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ＰＲＲＳ」という用語は、ＰＲＲＳウイルス感染によって引き起こされる、ブタの疾患症候を包含する。そのような症候の例には、妊娠したメスの流産、ならびに若いブタの成長遅滞、呼吸困難、食欲不振、および死亡が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「ＰＲＲＳを生じさせることができない」ＰＲＲＳウイルスは、ブタに感染することができるウイルスであって、通常はブタのＰＲＲＳ感染に関連している疾患症候のうちいかなるものも生じさせないウイルス、あるいはそのような症候を生じさせるが、野生型の病原性の感染と比較して、その程度が小さいか、もしくは生じさせるそのような症候の数が少ないか、またはその両方であるウイルスを指す。
【００３４】
「形質移入された宿主細胞」という用語は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５６００６６２号に記載のものなど、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡで形質移入された際に第１ラウンドのＰＲＲＳビリオンを産生できる実際的にいかなる宿主細胞も指す。さらに増殖性の感染が望ましい場合には、以下に定義する「ＰＲＲＳウイルスの複製を支持できる宿主細胞」が使用されるであろう。
【００３５】
ポリヌクレオチド分子は、当技術分野で知られている部位特異的変異導入による技法、または化学変異原もしくは放射線照射への曝露による技法などの、無作為変異導入による技法を含めた、当業者に知られている組換え技法を用いて遺伝的に変異させることができる。前記変異導入は、当技術分野で知られている標準法によって、例えば、記載（例えば、Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、１９９８年、４４０：１９９−２０６）の通り、感染性コピーの部位特異的変異導入（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社、米国ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ所在）によって実施できる。
【００３６】
したがって、本発明は、上述のＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列に変異導入するステップと、適切な発現系を用いて遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを発現するステップとを含む、遺伝的に改変された北米型ＰＲＲＳウイルスを作製する方法をさらに提供する。遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスは、当技術分野で一般的に知られている適当な発現系を用いて、単離されたポリヌクレオチド分子から発現させることができる。そのような発現系の例は、本出願で記載されている。例えば、上記単離されたポリヌクレオチド分子は、下記に詳細に記述する通り、コードされているウイルスを適当な宿主細胞で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現できるプラスミドの形態のものでもよい。
【００３７】
現在知られている、Ｅタンパク質の特定のイソ型の例には、アメリカ型ＰＲＲＳの７３アミノ酸ポリペプチドとして、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ８７３９２に報告されている配列（ＶＲ２３３２としても知られている）のゲノム位置１２０７８〜１２２９９によって予測されているもの、およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ４９４０４２の配列（Ｐ１２９としても知られている）によって予測されており、かつタンパク質ＡＡＭ１８５６０．１として報告されているものがあり、さらに、７０残基のヨーロッパ型ＰＲＲＳ Ｅタンパク質として、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ９６２６２（Ｌｅｌｙｓｔａｄ（レリスタット）単離株としても知られている）のゲノム位置１１８０１〜１２０１３によって予測されているものがある。
【００３８】
これらの北米型ＰＲＲＳＶのＥタンパク質配列は高度に保存されており、報告されている配列は、相互に約９３％の同一性を有する。北米型およびヨーロッパ型のＰＲＲＳＶ Ｅタンパク質は約８３％同一であり、ＶＲ２３３２およびＰ１２９Ｅタンパク質単離体の残基５４、そして、Ｌｅｌｙｓｔａｄ単離Ｅタンパク質の残基５１にある、保存されているシステインを（他の多くの残基と共に）共有している。図３は、本発明者らが「保存されているシステイン」と指摘したシステイン、すなわちヨーロッパ型およびアメリカ型のＰＲＲＳ単離株の間で保存されているシステインを明示したものである。上記で参照したアミノ酸付番は、言及したデータベースの記載に従ったものである。他のＰＲＲＳ単離株では、付番が異なっているかもしれないが、それらすべてで、対象のＰＲＲＳ株にある、保存されている特徴的なアミノ酸を同定し、それを標準株とアラインメントすることによって、適切なシステインが容易に同定される。置換、欠失、または挿入によって、保存されているシステインが欠失し、その結果、プラークの小さい表現型が生ずるように、ＰＲＲＳウイルスまたはそれをコードする核酸を改変することは、本発明の目的の１つである。
【００３９】
保存されているシステインを除去する欠失または置換の導入は、本発明のウイルスをコードするポリヌクレオチドの改変によって行う。好ましい実施形態では、欠失または挿入が、保存されているシステインの除去をもたらす、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸を含む欠失または挿入であり、その際、前記欠失または置換の結果、それによって生じるウイルスが、プラークの小さい表現型のものとなる。好ましい実施形態は、５アミノ酸またはそれ未満の欠失または挿入であろう。
【００４０】
アミノ酸は、物理学的特性、ならびにタンパク質の二次構造および三次構造への寄与に応じて分類することができる。保存的置換は、当技術分野において、あるアミノ酸から、類似の特性を有する別のアミノ酸への置換であると認識されている。保存的置換の例を、すぐ下の表Ａに示す（国際公開第９７／０９４３３号パンフレット、１０ページ、１９９７年３月１３日公開（１９９６年９月６日出願のＰＣＴ出願第ＧＢ９６／０２１９７号）より）。
【００４１】
【表１】
【００４２】
別法では、すぐ下の表Ｂに示す通り、保存的アミノ酸をＬｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在（１９７５年）、ｐｐ．７１−７７）に従って分類することができる。
【００４３】
【表２】
【００４４】
さらに別の別法として、保存的置換の例をすぐ下の表Ｃに示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】
遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスの調製
組換えＤＮＡ技術は、核酸をＤＮＡレベルで改変することを目的とした極めて多様かつ強力な分子生物学技法を含み、分子レベルでのゲノムの分析および改変を可能にする。この点に関して、ＰＲＲＳウイルスなどのウイルスは、そのゲノムのサイズが小さいため、そのような操作がとりわけ容易である。しかし、レトロウイルスではないＲＮＡウイルスは、それらの複製においてＤＮＡ中間体の段階を包含しないため、組換えＤＮＡ技術は、それらに直ちに適用することができない。そのようなウイルスに関しては、改変ウイルスを生成させるために、それらのゲノムに組換えＤＮＡ技術を適用できるようになる前に、感染性のｃＤＮＡクローンを発生させなければならない。感染性クローンは、研究しているウイルスの完全長（ゲノム長）ｃＤＮＡ（ここでは、ＲＮＡのＤＮＡコピーに関する広い意味で用いられおり、厳密な意味でのｍＲＮＡのＤＮＡコピーのみではない）を構築し、その後、その完全長ｃＤＮＡで形質移入された細胞で、ｉｎ ｖｉｖｏで感染性転写産物を合成させることを介して得ることができる。感染性転写物は、完全長ｃＤＮＡ、または、完全なウイルスゲノムを含む、連結された部分長ｃＤＮＡ断片からのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によっても得ることができる。すべての場合において、転写されたＲＮＡは、上記ｃＤＮＡに導入されたすべての改変を保有し、そのように改変されたウイルスのさらなる継代に使用することができる。
【００４７】
ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルス単離株であるレリスタットウイルスの感染性クローンの調製は、参照により本明細書に完全に組み込まれている米国特許第６２６８１９９号明細書、Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇら、２００１年７月３１日に記載されている。Ｐ１２９と名付けられた北米型ＰＲＲＳウイルス単離株の感染性ｃＤＮＡクローンの調製は、参照により本明細書に完全に組み込まれている米国特許第６５００６６２号明細書、Ｃａｌｖｅｒｔら、２００２年１２月３１日に記載されている。Ｐ１２９のｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ４９４０４２および米国特許第６５００６６２号明細書、Ｃａｌｖｅｒｔら、２００２年１２月３１日に開示されている。本発明者らの下記の研究は、プラスミドの状態でＣＭＶ前初期プロモーターによって発現されるそのような感染性クローンを利用している。この感染性クローンは、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９と呼ばれ、米国特許第６５００６６２号明細書、Ｃａｌｖｅｒｔら、２００２年１２月３１日の中でも開示されている。米国特許第６５００６６２号明細書、Ｃａｌｖｅｒｔら、２００２年１２月３１日に記載の通り、他のプラスミドおよびプロモーターも適している。
【００４８】
対象とするいかなるオープンリーディングフレームも、その完全な配列、および対象とするアミノ酸残基の位置が得られれば、当業者が、所望の特定の位置における変化を設計するのに、コドン表を参照するのみで十分であるのは明らかである。
【００４９】
【表４】
【００５０】
アミノ酸、ならびにそれらを表す短縮表記、シンボル、およびコドンの表を、以下の表Ｅに詳細に示す。
【００５１】
【表５】
【００５２】
当技術分野でよく知られている通り、コドンは、ｍＲＮＡ分子およびそれらに対応するｃＤＮＡ分子において、ヌクレオチドのトリプレット配列を構成する。コドンは、ｍＲＮＡ分子中に存在する場合には、ウラシル（Ｕ）塩基を特徴とするが、ＤＮＡ中に存在する場合には、チミジン（Ｔ）塩基を特徴とする。ポリヌクレオチド中における、同じアミノ酸残基をコードするコドンの単純な変化は、コードされているポリペプチドの配列も、構造も変化させないであろう。ある特定の３ヌクレオチド配列が、いずれのアミノ酸であれ、特定のアミノ酸を「コードしている」と述べる句が存在する場合、当業者ならば、上記の表から、問題としている特定のヌクレオチドを同定する手段が得られると認識するであろうことは明らかである。一例として、ある特定の３ヌクレオチド配列がシステインをコードしている場合、上記の表は、可能である２つのトリプレット配列がＵＧＣ（ＤＮＡではＴＧＣ）およびＵＧＵ（ＤＮＡではＴＧＴ）であることを開示している。セリンは、ＡＧＣ、ＡＧＵ（ＤＮＡではＡＧＴ）、ＵＣＡ（ＤＮＡではＴＣＡ）、ＵＣＣ（ＤＮＡではＴＣＣ）、ＵＣＧ（ＤＮＡではＴＣＧ）、およびＵＣＵ（ＤＮＡではＴＣＴ）によってコードされている。コードされているタンパク質中にある、あるシステインをセリン残基に変えるには、コードしている核酸中のＴＧＣまたはＴＧＴトリプレットを、ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、またはＴＣＴのうちのいずれかに交換できよう。
【００５３】
まさしくそのような変異体Ｅタンパク質のポリヌクレオチド配列の構築を、例示によって以下に示す。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
シャトルプラスミドＰＴＢ−ＳＨＵＴＴＬＥ−ＰＲＲＳＶ−３９９７の構築
完全長ＰＲＲＳウイルスゲノムｃＤＮＡクローンへの特定の改変の導入を容易にするために、シャトルプラスミドを構築した。ウイルスゲノムの最も３’末端側に相当する３９９７ｂｐ断片（２１残基のポリアデノシンテールを含むヌクレオチド位置１１５０４から１５４１６まで）および下流のベクター配列８４ｂｐをＰＣＲ増幅させた。このＰＣＲ反応は、５ｎｇのｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９プラスミドＤＮＡ（米国特許６５００６６２号明細書）、３００ｎｇの順方向プライマーＰ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｆｗｄ、配列番号１（５’−ＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＡＴＧ−３’：位置１１５０４から１１５３０まで）、３００ｎｇの逆方向プライマーＰ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｒｅｖプライマー、配列番号２（５’−ＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＣＧＣＧＧＣ−３’：位置１５５００から１５４７５まで）、各１ｍＭのｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、および２．５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を含有し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム２４００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて行った。反応物を９５℃で５分間加熱し、下記の条件、すなわち、９５℃で３０秒の変性、５５℃で１分間のプライマーアニーリング、および７２℃で３分間の伸長で、３５サイクルの増幅を行った。このＰＣＲ産物を、ＴｒｕｅＢｌｕｅ ＭｉｃｒｏＣａｒｔｒｉｄｇｅ（商標）ＰＣＲクローニングキットＸＬ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｏｎｅ社；米国ニューヨーク州Ｂｕｆｆａｌｏ所在）を用いて、ｐＴｒｕｅＢｌｕｅベクター中にクローニングして、ｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７を作製した。
【００５５】
（実施例２）
Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスを生成させるための、タンパク質Ｅ（または２Ｂ）のシステイン残基５４の置換
ＰＲＲＳＶ Ｐ１２９のＥタンパク質は、ＯＲＦ２ｂによってコードされており、アミノ酸位置４９および５４に２つのシステイン残基を含有する。配列番号５、ＭＧＳＩＱＳＬＦＤＫＩＧＱＬＦＶＤＡＦＴＥＦＬＶＳＩＶＤＩＩＩＦＬＡＩＬＦＧＦＴＩＡＧＷＬＶＶＦＣＩＲＬＶＣＳＡＶＦＲＡＲＰＡＩＨＰＥＱＬＱＫＩＬを参照のこと。配列番号５のｃＤＮＡは、配列番号６ＡＴＧＧＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＡＡＧＣＣＴＣＴＴＣＧＡＣＡＡＡＡＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＧＣＴＴＴＣＡＣＧＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＴＧＣＡＴＣＡＧＡＴＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣＣＧＣＧＧＴＡＴＴＣＣＧＴＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＡＴＧＡである。
【００５６】
位置５４のシステイン残基（Ｐ１２９ゲノムのヌクレオチド位置１２２２１〜１２２２３）を、ＰＣＲベースの部位特異的変異導入を用いてセリンで置換した。変異原プライマー２ｂ−Ｃ５４Ｓ−Ｆｗｄ、配列番号３（５’−ＧＣＡＴＣＡＧＡＴＴＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＧＣＧＧＴＡＴＴＣＣＧ−３’：ヌクレオチド位置１２２０７から１２２３８まで）および２ｂ−Ｃ５４Ｓ−Ｒｅｖ、配列番号４（５’−ＣＧＧＡＡＴＡＣＣＧＣＧＧＡＧＣＴＡＡＣＣＡＡＴＣＴＧＡＴＧＣ−３’：ヌクレオチド位置１２２０７から１２２３８まで）と共に、シャトルプラスミドｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７を鋳型として用いた。変異導入されたコドンには下線が引かれている。ＰＣＲ増幅は、５ｎｇのｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７プラスミドＤＮＡ、順方向プライマーおよび逆方向プライマーそれぞれ３００ｎｇ；ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＴＴＰのそれぞれ１ｍＭ濃度、１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）ならびに２．５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて行った。下記の条件、すなわち、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で１分間のプライマーアニーリング、および６８℃で１２分３０秒間のプライマー伸長で、試料の増幅を１６サイクル行った。ＰＣＲサイクルの後に、メチル化されているプラスミドＤＮＡ鋳型を除去するために、１０ＵのＤｐｎＩでＰＣＲ産物を消化させた。変異導入されたプラスミドを含有するＰＣＲ−Ｄｐｎ Ｉ消化反応物４μｌを用い、熱ショックによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換させ、アンピシリンを含有するＬＢアガープレート上に広げた。コロニーを無作為に選択し、終夜培養した。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて調製した。システインからセリンへ（Ｃ５４Ｓ）の所望の変異の存在を、ヌクレオチド配列の決定によって確認し、結果として得られたプラスミドをｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｅ−Ｃ５４Ｓと命名した。変異導入されたＯＲＦ２ｂの配列は、配列番号７ＡＴＧＧＧＧＴＣＴＡＴＡＣＡＡＡＧＣＣＴＣＴＴＣＧＡＣＡＡＡＡＴＴＧＧＣＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＧＣＴＴＴＣＡＣＧＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＴＧＴＣＣＡＴＴＧＴＴＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＴＴＴＴＧＣＡＴＣＡＧＡＴＴＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＧＣＧＧＴＡＴＴＣＣＧＴＧＣＧＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＡＴＧＡであり、コードされているペプチドは、配列番号８ＭＧＳＩＱＳＬＦＤＫＩＧＱＬＦＶＤＡＦＴＥＦＬＶＳＩＶＤＩＩＩＦＬＡＩＬＦＧＦＴＩＡＧＷＬＶＶＦＣＩＲＬＶＳＳＡＶＦＲＡＲＰＡＩＨＰＥＱＬＱＫＩＬである。
【００５７】
シャトルプラスミドｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｅ−Ｃ５４Ｓおよび野生型完全長ゲノムクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９は両方とも、ユニークなＥｃｏ４７ ＩＩＩ部位およびＢｓｒＧ Ｉ部位を含有している（それぞれ位置２８５および１１９２、ならびに位置１１７８５および１２６９２）。各プラスミドをＥｃｏ４７ ＩＩＩおよびＢｓｒＧ Ｉで消化させた。９０８ｂｐのＥｃｏ４７ ＩＩＩ−ＢｓｒＧ Ｉ断片をｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｅ−Ｃ５４Ｓからゲル精製し、１７９８４ｂｐのＥｃｏ４７ ＩＩＩ−ＢｓｒＧ Ｉ断片をｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９からゲル精製した。これら２つの断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて連結し、Ｃ５４Ｓ改変完全長ゲノムｃＤＮＡクローンを構築した。１０μｌの連結反応物で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換させた。アンピシリンを含有するＬＢプレートから細菌コロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。Ｘｍａ Ｉ消化パターンに基づいて、全長クローンを選択した。完全長ゲノムｃＤＮＡクローンにおけるＣ５４Ｓ改変の存在を確認するために、選択されたクローンの配列決定を行った。この結果得られたプラスミドを、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓと名付けた。
【００５８】
ＭＡＲＣ−１４５細胞を、８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補ったダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。直径３５ｍｍの培養皿中に細胞を播種し、７０％集密状態まで培養した。これらの細胞に、２μｇのｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓまたは親プラスミドｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９のＤＮＡで、２４時間、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて形質移入した。形質移入細胞を、８％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ中、３７℃で５日間インキュベートした。ＰＲＲＳＶ特異的な細胞変性効果（ＣＰＥ）は、形質移入の３日後から観測され、近傍の細胞へのさらなる伝搬は、形質移入の５日後から見られた。ＣＰＥの特異性は、非構造タンパク質ｎｓｐ２およびｎｓｐ３に対するウサギ抗血清、ならびにＮ特異的ＭＡｂ ＳＤＯＷ１７を用いた免疫蛍光細胞染色によって確認した。形質移入の５日後に、形質移入細胞の培養上清を採取し、「Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓ継代１」（Ｐ１）と名付けた。継代１ウイルスを用いて、新たなＭＡＲＣ−１４５細胞に播種し、５日後に採取したものを「継代２」（Ｐ２）と名付けた。「継代３」ウイルスも、Ｐ２と同様に調製した。各ウイルス継代の１ｍｌアリコートを、使用するまで−８０℃で保存した。Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスの各継代をプラークアッセイによって力価決定した。継代１、２、および３の力価は、それぞれ、１．５×１０４、５×１０５、および１×１０４ｐｆｕ／ｍｌと測定された。平行して、野生型Ｐ１２９ウイルスをｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９から産生し、力価決定した。その結果得られた、継代１、２、および３の力価は、それぞれ、１×１０３、１×１０４、および５×１０５ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００５９】
Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスは、Ｐ１２９親ウイルスと比較して、遅いＣＰＥ出現開始を示す明確に異なった細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生を誘導し、プラークが小さい表現型を示した。親ｃＤＮＡクローンＰＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９または変異体ｃＤＮＡクローンｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４ＳでＭＡＲＣ−１４５細胞に形質移入した結果として、感染細胞の可視的な増殖巣が生じた。また、Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスによって媒介されたＣＰＥは、サイズが極めて類似したものであったが、形質移入の４日後までに現れるＰ１２９親ウイルスによるＣＰＥに比べて、出現が遅かった。しかしその後、変異体ウイルスは、増殖巣の中に死細胞または脱離細胞の領域を伴う急速かつ広範なＣＰＥを引き起こし（形質移入の約５日後）、一方、親ウイルスは、同期間中には単に、増殖巣サイズの中程度な増大を示した。ＣＰＥの相違を図１に示す。ウイルス力価は、ＣＰＥのこの相違に対応して、最初２代のウイルス継代の間、変異体ウイルスが親ウイルスより多くの（しかし３代目では少ない）子孫ウイルスを産生した。プラーク形態の相違を図２に示す。Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスは、親ウイルスであるＰ１２９のプラークと比較して、直径が小さく、形態の異なるプラークを産生する。Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ４５４Ｓプラークは、その中心にある細胞がＰ１２９プラークより早くかつ完全に死亡および脱離するため、より透明であった。プラークが小さい表現型に関しては、いくつかの生物学的説明が存在しうるが、小さいプラークが観察されたことは、細胞から細胞までの、Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルスの伝搬が、親ウイルスより遅いことの直接的証拠である。この特徴は、病原性の親ウイルスから弱毒化された（病原性がより弱い）生ワクチンウイルスを生成させるのに本発明で使用できる。
【００６０】
実際、プラークが小さい表現型を生じるウイルスであって、かつそれらの天然宿主中で弱毒化されているウイルスの多数の例が存在する（Ｍａｔｈｅｗら、「Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ５Ｒ ａｆｆｅｃｔｓ ｐｌａｑｕｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ，ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｔｉｎ ｔａｉｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２（３）：２４２９−３８（１９９８年）；Ｅｎｇｅｌｓｔａｄら、「Ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ４２−ｋＤａ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｇｒｅｓｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４（２）：６２７−３７（１９９３年）；Ｌｅｗｉｓら、「Ａｎ Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ＥＲＶ１−ＡＬＲ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ，９ＧＬ，ａｆｆｅｃｔｓ ｖｉｒｉｏｎ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ ｓｗｉｎｅ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（３）：１２７５−８５（２０００年）；Ｌｅｅら、「Ｃｏｍｍｏｎ Ｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｆｏｒ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ａｎｄ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓｅｓ」Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８（１５）：８２７１−８０（２００４年）；Ｆｒａｍｐｔｏｎら、「Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｕｎｉｑｕｅ ｓｈｏｒｔ ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ｅｑｕｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ １ ｔｏ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ」、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９０（１−２）：２８７−３０１（２００２年）；Ｌｅｅら、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（１０）：４９０１−１１、（２００２年）；Ｂｕｔｒａｐｅｔら、「Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｄｅｎｇｕｅ ｔｙｐｅ ２ ｖａｃｃｉｎｅ ｖｉｒｕｓ，ｓｔｒａｉｎ １６６８１（ＰＤＫ−５３），ａｒｅ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ５’ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ １ ａｎｄ ３」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４（７）：３０１１−９（２０００年））。米国特許出願公開第２００２／００１２６７０号に由来する下記の実施例は、ＰＲＲＳウイルスの２つの異なった株の病原性の特性を比較するための明確な手引きを提供する。
【００６１】
（実施例３）
システイン残基５４の復帰抵抗性変異
ＴＧＣ（システイン）からＡＧＣ（セリン）に、単一コドン中の単一ヌクレオチドを改変することによって、実施例２に記載したＣ５４Ｓ変異を生成させた。変異の表現型の決定に関しては適切であるが、無作為な変異と自然選択とによって比較的高い頻度で、この結果生じたウイルスが親配列（そして、親表現型）に復帰するかもしれないと予測されるであろう。本発明の好ましい実施形態、特にワクチンを目的としたものでは、位置５４の残基がシステインに戻る確率を最小にするように、そして、他の隣接残基（特に残基５１〜５７）が変異してシステインになる確率を最小にするように設計された複数のヌクレオチド置換および／または欠失を含有するであろう。遺伝暗号を調べることによって、システインは２つのコドン（ＴＧＴおよびＴＧＣ）のみによってコードされていることが明らかになる。システインコドンになるのに、２もしくは３回の別々のヌクレオチド変異事象を必要とするコドンの使用は、１回のみを必要とするものより好ましい。そのような「復帰抵抗性」の変異の例を表Ｆに示す。これらは、限定ではなく、代表であると意図されている。当業者ならば、復帰抵抗性変異の例を他にも多数想起することができる。
【００６２】
Ｃ５４Ｓ−２変異（表Ｆを参照）は、Ｃ５４Ｓ変異と同じアミノ酸変化をもたらすが、セリンコドンの選択がＡＧＣからＴＣＧに変わっている。したがって、システインコドンを生成するのに２回の独立したヌクレオチド変異が必要であり、表現型が復帰する確率がＣ５４Ｓと比較して低下している。変異Ｃ５４Ｓ−３は、位置５４に同じセリンコドンを組み入れているが、ロイシン５２（ＴＴＧからＣＴＧに）、バリン５３（ＧＴＴからＧＴＡに）、およびセリン５５（ＴＣＣからＴＣＧに）のコドン改変も有する。その結果、これら３つのコドンがシステインコドンに変異する確率が低下しており、したがって、位置５４におけるシステイン残基の不在を機能的に補足する確率が低下している。ＣＳ５４−５５ＡＡ変異では、Ｃ５４およびＳ５５が両方とも、アラニン残基をコードするように変異させられている。セリンと同様にアラニンも、小型で無電荷の側鎖を有しており、システインが有するジスルフィド結合を形成する能力も、金属イオンと相互作用する能力ももたない。４つの可能なアラニンコドンのうち２つ（ＧＣＧおよびＧＣＡ）はシステインコドンとは十分に相違しており、システインコドンを生成するには、３つのヌクレオチドすべてに変異導入しなければならない。したがって、アラニン置換は、表現型復帰の可能性をさらに低下させる好ましい方法である。最後に、ＣＳ５４−５５ｄｅｌＡ変異では、位置５４のコドンが除去されている。加えて、セリン５５がアラニンに改変され、ロイシン５２およびバリン５３のコドンが改変されている。そのような変異体ウイルスの表現型復帰は、極めてまれであると予測されている。
【００６３】
復帰抵抗性の変異を設計する場合、ときに制限酵素認識部位が生成または破壊されるように、代替コドンを選択することができる。これらの相違は、変異していないプラスミドおよびウイルスから変異したものを識別するのに好都合なマーカーとして利用できる。Ｃ５４Ｓ−３、ＣＳ５４−５５ＡＡ、およびＣＳ５４−５５ｄｅｌＡ変異（表Ｆ）の場合、Ｓ５５コドンＴＣＣからＴＣＧ（セリン）またはＧＣＧ（アラニン）のいずれかへの変異は、天然に存在するＳａｃ ＩＩ制限部位（ＣＣＧＣＧＧ）の破壊をもたらす。
【００６４】
ＯＲＦ２ｂはＯＲＦ２ａ（異なったリーディングフレームでＧＰ２をコードする）とオーバーラップしているので、ＯＲＦ２ｂ中のコドンを改変する過程でＯＲＦ２ａに終止コドンを導入しないように注意しなければならない。場合によっては、ＯＲＦ２ｂに加えたコドン変化が、ＯＲＦ２ａによってコードされているアミノ酸配列を変化させることがある。ＧＰ２タンパク質機能に加えられたそのような変化の影響は予測が困難である可能性があり、経験的に判定するのが最良である。
【００６５】
【表６】
【００６６】
（実施例４）
弱毒化の確立
各試験には、無ＰＲＲＳＶ農場から得られた妊娠経験のないメスブタが、１群あたり少なくとも１０匹含まれている。
【００６７】
動物が、ＰＲＲＳウイルス特異的な血清抗体を有していないかどうか、また、ＰＲＲＳＶに関して陰性であるかどうか試験した。試験に含まれているすべての動物は、供給源および品種が同一のものである。群への動物の分配は無作為化して行った。
【００６８】
攻撃は、鼻孔あたり１０５ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳＶ １ｍｌを鼻腔内投与することによって、妊娠９０日目に行う。試験設定ごとに、少なくとも３群が存在する。すなわち、１群は、Ｐ１２９に曝露させるため；１試験群は、弱毒化している可能性のあるウイルスに攻撃させるため；そして１群は厳密な対照群である。
【００６９】
試験期間全体を通して、厳密な対照がＰＲＲＳＶ陰性のまま残り、かつ、Ｐ１２９曝露された群では、厳密な対照と比較して、生きた健康な子ブタの誕生が少なくとも２５％少ない場合に、この試験は有効であるとする。
【００７０】
弱毒化は、換言すれば病原性の低減であり、自己増殖能力を決定する１つまたは複数のパラメータの統計的に有意な変化と定義され、Ｐ１２９感染群との比較で、試験群（弱毒化ウイルスである可能性がある）に関する以下のパラメータ、すなわち、
ａ．）死産の頻度、
ｂ．）妊娠１１２日目またはその以前における流産、
ｃ．）ミイラ変性した子ブタの数、
ｄ．）不活発で弱い子ブタの数、
ｅ．）離乳前の死亡率
のうちの少なくとも１つにおける有意な減少が好ましく、さらに、Ｐ１２９感染群との比較で、試験群に関する以下のパラメータ、すなわち、
ｆ．）メスブタ１匹あたりの離乳した子ブタの数、
ｇ．）メスブタ１匹あたりに産まれた、生きていて健康な子ブタの数
のうちの１つにおける有意の増大が好ましい。
【００７１】
ワクチン
弱毒化株はワクチンの製剤に貴重である。本ワクチンが有効であるというのは、ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護する場合である。あるワクチンがＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護するというのは、１匹または複数の非罹患ブタにワクチンを投与した後、それに続いて、生物学的に純粋なウイルス単離株（例えば、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６、Ｐ１２９など）で攻撃した結果、疾患のなんらかの肉眼的または組織病理学的な変化（例えば肺における病変）および／または症候の重症度が、保護されなかった同様なブタで上記単離株によって通常引き起こされるそれらの変化または症候と比較して（すなわち適切な対照と比較して）低下している場合である。より詳細には、本ワクチンは、それを必要とする１匹または複数の適当なブタに本ワクチン投与し、その後、適当な期間（例えば４週間）の後に、生物学的に純粋なＰＲＲＳＶ単離株の大量の試料（１０（３〜７）ＴＣＩＤ（５０））で攻撃することによって、有効であることを示すことができる。その後、約１週間後に、攻撃されたブタから血液試料を採取し、次に、血液試料からウイルスを単離する試み（例えば、下記実験ＶＩＩＩに例示するウイルス単離過程を参照）を行う。ウイルスの高レベルの単離（ワクチン接種されておらず、攻撃された対照ブタと同様）は、ワクチンが有効でないであろうことの指標である。ウイルス単離ができないことまたは単離されたウイルスの量の減少は、ワクチンが有効であろうことの指標である。
【００７２】
したがって本ワクチンの有効性は、定量的（すなわち、適切な対照群と比較しての圧縮された（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ）肺組織の割合の低下）にも、定性的（例えば、血液からのＰＲＲＳＶの単離、免疫アッセイ法による肺、扁桃腺、またはリンパ節組織標本中のＰＲＲＳＶ抗原の検出）にも評価できる。ブタ生殖器呼吸器疾患の症候は、定量的（例えば体温／熱）にも、準定量的（例えば、呼吸困難（下記に詳細に説明する）の重症度）にも、または定性的（例えば、チアノーゼ、肺炎、心臓および／もしくは脳障害などの１つもしくは複数の症候が存在するかどうか、もしくはそれらにおける重症度低下）にも評価できる。
【００７３】
非罹患ブタとは、ブタ生殖器呼吸器疾患感染因子に曝露されていないブタ、またはブタ生殖器呼吸器疾患感染性因子に曝露されているが上記疾患の症候を示していないブタである。罹患ブタとは、ＰＲＲＳの症候を示しているか、あるいはＰＲＲＳＶを単離することができるブタである。
【００７４】
本発明のワクチンは、標準的な緩衝剤、安定化剤、希釈剤、保存剤、および／または可溶化剤など、ヒト（適切な場合）を含めた動物にとって許容できる担体を含むように、許容できる通例に従って製剤でき、また、持続放出を容易にするように製剤することもできる。希釈剤には、水、食塩水、ブドウ糖、エタノール、グリセロールなどが含まれる。等張化添加物には、とりわけ、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれる。安定化剤には、とりわけ、アルブミンが含まれる。他の適当なワクチン媒体および添加物には、改変生ワクチンを製剤するのに特に有用なものが含まれ、当業者には既知であるか、明らかであろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社を参照のこと。
【００７５】
本発明のワクチンは、例えば中でもアジュバントまたはサイトカインなど、１つまたは複数の追加免疫調節性成分もさらに含むことができる。本発明のワクチンで使用できるアジュバントの非限定例には、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ社、米国モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ所在）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルなどの鉱物ゲル、水中油型乳剤、油中水型乳剤、例えばフロインドの完全および不完全アジュバント、ブロック共重合体（ＣｙｔＲｘ、米国ジョージア州Ａｔｌａｎｔａ所在）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、米国マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ所在）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、米国カリフォルニア州Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ所在）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａもしくは他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、ならびにアブリジン脂質アミンアジュバントが含まれる。本発明のワクチンで有用な水中油型乳剤の非限定例には、改変ＳＥＡＭ６２およびＳＥＡＭ１／２製剤が含まれる。改変ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、０．７％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）界面活性剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ社）、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、２００ｐｇ／ｍｌ Ｑｕｉｌ Ａ、１００［ｍｇｒ］ｇ／ｍｌコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）レシチンを含有する水中油型乳剤である。改変ＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性剤、０．７％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０界面活性剤、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、１００μｇ／ｍｌ Ｑｕｉｌ Ａ、および５０μｇ／ｍｌコレステロールを含む水中油型乳剤である。ワクチンに含有させることができる他の免疫調節剤には、例えば、１つまたは複数のインターロイキン、インターフェロン、または他の既知なサイトカインが含まれる。
【００７６】
本発明のワクチンは、任意選択で、本発明のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターの持続放出用に製剤することもできる。そのような持続放出製剤の例には、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなど生体適合ポリマーの複合物と併せたウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターが含まれる。薬物送達媒体における分解性高分子の構造、選択、および使用は、参照により本明細書に組み込まれている、Ａ．Ｄｏｍｂら、１９９２年、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３：２７９−２９２を含めたいくつかの出版物に概説されている。製剤におけるポリマーの選択および使用に関する追加の手引きは、当技術分野で知られている教科書、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第４５巻（Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ、米国ニューヨーク州所在）中のＭ．ＣｈａｓｉｎおよびＲ．Ｌａｎｇｅｒ（編集）、１９９０年、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」で見出すことができる。別法または追加として、ウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターは、投与および効力を改善するためにマイクロカプセルに入れることができる。抗原をマイクロカプセルに入れる方法は、当技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第３１３７６３１号；第３９５９４５７号；第４２０５０６０号；第４６０６９４０号；第４７４４９３３号；第５１３２１１７号明細書；および国際特許公開第９５／２８２２７号パンフレットに記載の技法が含まれる。
【００７７】
ウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターの持続放出を提供するのに、リポソームを用いることもできる。リポソーム製剤をどのように作製および使用するかに関する詳細は、とりわけ、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４０１６１００号；第４４５２７４７号；第４９２１７０６号；第４９２７６３７号；第４９４４９４８号；第５００８０５０号；および第５００９９５６号明細書に見出すことができる。
【００７８】
上述したどのワクチンも、効果をモニターしながら、低用量のウイルス、プラスミドまたはウイルスベクターから開始して、その後、用量を増強する従来の方法によってその有効量を決定することができる。有効量は、ワクチンの単独投与後に得られても、ワクチンの多回投与後に得られてもよい。動物あたりの最適用量を決定する際には、既知な因子を考慮に入れることができる。これらには、種、サイズ、動物の年齢、一般的な健康状態、動物体内における他剤の存在などが含まれる。実際の用量は、他の動物試験から得られた結果を考慮した後に選択することが好ましい。
【００７９】
適切な免疫応答が実現されたかどうか検出する方法の１つは、ワクチン接種後に動物体内における血清転換および抗体価を測定することである。ワクチン接種のタイミング、および追加免疫が必要な場合におけるその数は、好ましくは、すべての関連要因の分析に基づいて、医師または獣医によって決定されるであろう。そのような関連要因の一部は上述されている。
【００８０】
本発明のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターの有効用量は、既知な技法を使用し、ワクチン接種される動物の体重などの、当業者によって測定できる因子を考慮に入れて決定することができる。本発明のワクチン中の本発明のウイルスの用量は、好ましくは約１０１から約１０９ｐｆｕ（プラーク形成単位）まで、より好ましくは約１０２から約１０８ｐｆｕまで、そして最も好ましくは約１０３から約１０７ｐｆｕまでの範囲にある。本発明のワクチン中の本発明のプラスミドの用量は、好ましくは約０．１μｇから約１００ｍｇまで、より好ましくは約１μｇから約１０ｍｇまで、さらにより好ましくは約１０μｇから約１ｍｇまでの範囲にある。本発明のワクチン中の本発明の感染性ＲＮＡ分子の用量は、好ましくは約０．１μｇから約１００ｍｇまで、より好ましくは１μｇから約１０ｍｇまで、さらにより好ましくは約１０μｇから約１ｍｇまでの範囲にある。本発明のワクチン中の本発明のウイルスベクターの用量は、好ましくは約１０１ｐｆｕから約１０９ｐｆｕまで、より好ましくは約１０２ｐｆｕから約１０８ｐｆｕまで、そして最も好ましくは約１０３から約１０７ｐｆｕまでの範囲にある。適当な用量サイズは、約０．５ｍｌから約１０ｍｌまで、より好ましくは約１ｍｌから約５ｍｌまでの範囲にある。
【００８１】
本発明はさらに、本明細書に記載のＰＲＲＳウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターを含むワクチンを調製する方法を提供し、この方法は、本発明のＰＲＲＳウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターのうち１つの有効量を、薬学的または獣医学的使用に許容できる担体と合わせるステップを含む。
【００８２】
加えて、本発明の弱毒化生ワクチンは、米国特許第６５００６６２号明細書に記載の通り、既知な組換え技法を用いて、ＰＲＲＳウイルスゲノムに挿入された異種抗原エピトープをコードするように改変することができる。本発明の異種抗原エピトープとして有用な抗原エピトープには、ＰＲＲＳウイルス以外のブタ病原体由来の抗原エピトープが含まれ、これらには、限定されるものではないが、ブタパルボウイルス、ブタシルコウィルス、ブタロタウイルス、ブタインフルエンザ、仮性狂犬病ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、古典的ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、脳心筋炎ウイルス、ブタパラミクソウイルス、アクチノバシラスプルロニュウモニエ、炭疽菌、気管支敗血症菌、クロストリジウムヘモリティクム、クロストリジウムパーフリンジェンス、破傷風菌、大腸菌、ブタ丹毒菌、ヘモフィルスパラスイス、レプトスピラ属全種、マイコプラズマ−ヒオニューモニエ、マイコプラズマ−ヒオリニス、パスツレラヘモリチカ、パスツレラムルトシダ、ブタコレラ菌、ネズミチフス菌、ストレプトコッカスエクイシミリス、およびブタ連鎖球菌からなる群から選択されたブタ病原体由来の抗原エピトープが含まれる。前述のブタの病原体から抗原性のエピトープをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で知っていて、ＮＣＢＩによって提供されたＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）などの公共の遺伝子データベースから得ることができる。
【００８３】
本発明の追加の機能および変異は、詳細な説明を含めた本出願全体から、当業者には明らかであろう。そのような特徴のすべてが本発明の態様として意図されている。同様に、本明細書に記載の本発明の特徴は、それらの特徴の組合せが、本発明の一態様または実施形態として、上記に特別に言及されているかどうかに関係なく、それらを再結合して、追加の実施形態にすることができ、それらも本発明の態様として意図されている。本発明に重要であると本明細書に記述されているような限定のみを、限定として考えるべきである。本明細書に重要な限定と記述されていない本発明の変法は、本発明の態様と意図されている。以上の説明および実施例で特に記載されている方法とは別の方法で、本発明を実施できることは明らかであろう。
【００８４】
上記の教示に照らして、多数の本発明の修正および変形が可能であり、それゆえ、それらも本発明に包含される。
【００８５】
本明細書に引用したすべての出版物の全開示を参照により本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも以下のもの、すなわち、
ａ）Ｅタンパク質中の保存されているシステイン残基に変異導入されるように改変された遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルス；
ｂ）ａ）の遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子；および、
ｃ）ｂ）の感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子
のうちの１つを含む組成物。
【請求項２】
前記保存されているシステインが欠失しているか、あるいは非システイン残基で置換されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記システインが別の非システイン残基で置換されており、ただし、前記非システイン残基はチロシンではない、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記保存されているシステインがセリンまたはセリンの保存的置換基で置換されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記保存されているシステインが、セリン、トレオニン、メチオニン、およびチロシンからなる群から選択されたアミノ酸残基で置換されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記保存されているシステインが、セリン、トレオニン、およびメチオニンからなる群から選択されたアミノ酸残基で置換されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
位置５４の残基がシステインに復帰する確率を最小にするために、前記保存されているシステインの変異が復帰抵抗性にされている、請求項１から６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＰＲＲＳウイルスが、北米型ＰＲＲＳウイルスまたはヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルスのいずれかである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記改変の結果、プラークが小さい表現型のウイルスが生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の請求項１から９のいずれかに記載の組成物および獣医学的使用に許容できる担体を含むＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護するためのワクチン。
【請求項１１】
ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護する方法であって、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の請求項１０に記載のワクチンを前記動物に接種するステップを含む方法。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれかに記載の組成物を含む、形質移入された宿主細胞。
【請求項１３】
遺伝的に改変された北米型ＰＲＲＳウイルスを作製する方法であって、
ａ）ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列に変異導入して、Ｅタンパク質中の保存されているシステインが非システイン残基に変更されている遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを産生するステップと、
ｂ）ＰＲＲＳウイルスの複製を支持できる宿主細胞に、前記遺伝的に改変された北米型ＰＲＲＳウイルスを導入するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
前記ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞がＭＡＲＣ−１４５細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞が生きているブタの体内に含まれている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１】
少なくとも以下のもの、すなわち、
ａ）Ｅタンパク質中の保存されているシステイン残基に変異導入されるように改変された遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルス；
ｂ）ａ）の遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子；および、
ｃ）ｂ）の感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子
のうちの１つを含む組成物。
【請求項２】
前記保存されているシステインが欠失しているか、あるいは非システイン残基で置換されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記システインが別の非システイン残基で置換されており、ただし、前記非システイン残基はチロシンではない、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記保存されているシステインがセリンまたはセリンの保存的置換基で置換されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記保存されているシステインが、セリン、トレオニン、メチオニン、およびチロシンからなる群から選択されたアミノ酸残基で置換されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記保存されているシステインが、セリン、トレオニン、およびメチオニンからなる群から選択されたアミノ酸残基で置換されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
位置５４の残基がシステインに復帰する確率を最小にするために、前記保存されているシステインの変異が復帰抵抗性にされている、請求項１から６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＰＲＲＳウイルスが、北米型ＰＲＲＳウイルスまたはヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルスのいずれかである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記改変の結果、プラークが小さい表現型のウイルスが生じる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の請求項１から９のいずれかに記載の組成物および獣医学的使用に許容できる担体を含むＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護するためのワクチン。
【請求項１１】
ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを保護する方法であって、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の請求項１０に記載のワクチンを前記動物に接種するステップを含む方法。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれかに記載の組成物を含む、形質移入された宿主細胞。
【請求項１３】
遺伝的に改変された北米型ＰＲＲＳウイルスを作製する方法であって、
ａ）ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列に変異導入して、Ｅタンパク質中の保存されているシステインが非システイン残基に変更されている遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを産生するステップと、
ｂ）ＰＲＲＳウイルスの複製を支持できる宿主細胞に、前記遺伝的に改変された北米型ＰＲＲＳウイルスを導入するステップと
を含む方法。
【請求項１４】
前記ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞がＭＡＲＣ−１４５細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞が生きているブタの体内に含まれている、請求項１３に記載の方法。
【図１】親ｃＤＮＡクローンであるｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９（上部）または変異体ｃＤＮＡクローンであるｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓ（下部）を用いた形質移入の４日後（左）および５日後（右）におけるＭＡＲＣ−１４５細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す図である。
【図２】親ウイルスであるＰ１２９ウイルス（上部）および変異体であるＰ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルス（下部）のプラーク形態を示す図である。ＭＡＲＣ−１４５細胞の単層培養を感染させ、アガロースの上敷きで覆い、プラークが透明になるまでインキュベートし、ニュートラルレッドで染色してプラークを可視化した。変異体ウイルスプラークの方が小さく、中心により完全なＣＰＥがあった。
【図３】ＰＲＲＳウイルス北米型およびヨーロッパ型単離株由来のＥタンパク質のアラインメントを示す図である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】親ウイルスであるＰ１２９ウイルス（上部）および変異体であるＰ１２９−Ｅ−Ｃ５４Ｓウイルス（下部）のプラーク形態を示す図である。ＭＡＲＣ−１４５細胞の単層培養を感染させ、アガロースの上敷きで覆い、プラークが透明になるまでインキュベートし、ニュートラルレッドで染色してプラークを可視化した。変異体ウイルスプラークの方が小さく、中心により完全なＣＰＥがあった。
【図３】ＰＲＲＳウイルス北米型およびヨーロッパ型単離株由来のＥタンパク質のアラインメントを示す図である。
【図１】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５１９５９４（Ｐ２００８−５１９５９４Ａ）
【公表日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４０７４４（Ｐ２００７−５４０７４４）
【出願日】平成１７年１１月２日（２００５．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００３３６６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５１３９６
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月２日（２００５．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００３３６６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０５１３９６
【国際公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
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