説明

多コンパートメント真核生物発現系

【課題】新規な核酸発現系、発現構築物、それらを生成するための方法、およびそれらを利用し、生物学的に活性の核酸、および、必要に応じて、ポリペプチドを製造する方法を提供する。
【解決手段】多コンパートメント発現系を使用する真核細胞における目的とする異種配列を発現させるための方法および構築物。単一の構築物または複数の構築物から成りうるこれらの系では、同じ真核細胞の異なる細胞内コンパートメント内で各々活性である少なくとも２つの異なるプロモーターが利用される。該構築物は、標的遺伝子の発現を調節できるＲＮＡ分子のインビボ発現の増強を達成するために特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書で援用される、２００３年８月２２日出願の米国仮出願第６０／４９７，３０４号の利点を請求する。
【０００２】
本発明は分子生物学および発現系の分野に関する。特に、本発明は、多コンパートメント発現系、例えば、各々同じ真核細胞の異なる細胞内コンパートメント内で活性である、少なくとも２つの異なるプロモーターを集合的に利用する１つもしくはそれ以上の発現構築物を使用する真核細胞における目的とする異種配列の発現に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸は、ヒトおよび動物における病態の予防および／または治療における治療部分としてのその使用を含め、重要かつ多様な生物学的活性を有するきわめて価値がある作用物として認識されるようになった。例えば、アンチセンス機序に作用するオリゴヌクレオチドが標的ｍＲＮＡとハイブリッド形成させ、それによってｍＲＮＡの活性を調節するように設計されている。治療として核酸を利用する他の方法では、トリプレックスもしくは三重鎖形成を駆使するように設計されており、ここでは一本鎖オリゴマー（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が二重鎖ＤＮＡ標的に結合し、所望の結果、例えば、ＤＮＡ標的からの転写の阻害を生じるように設計されている。さらに治療として核酸を利用する他の方法では、リボザイムを駆使するように設計されており、ここでは構造化ＲＮＡまたは修飾オリゴマーがＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ標的に結合し、所望の結果、例えば、ＲＮＡの標的切断またはＤＮＡ標的を生じ、したがってその発現を阻害するように設計されている。核酸は、免疫応答を誘発することが可能なタンパク質を発現させる生物のＤＮＡ分子の組織または細胞へ導入することによって免疫化作用物としても使用されうる。核酸は、生物学的機能を有するタンパク質を生じるように翻訳されるＲＮＡを生成するためにも加工されうる。
【０００４】
最近になって、ＲＮＡｉまたは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）介在遺伝子サイレンシングの現象が認識されており、それによって細胞または生物における標的遺伝子の領域に補完的なｄｓＲＮＡは標的遺伝子の発現を阻害する（例えば、１９９９年７月１日公開の特許文献１、Ｆｉｒｅら、および特許文献２：「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔａｎｄａｒｄ ＲＮＡ」、特許文献３：「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ＰａｃｈｕｋとＳａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ、および２００２年１０月１８日出願の特許文献４を参照）。ｄｓＲＮＡ遺伝子サイレンシングは、核酸ベースの技術の特に刺激的な潜在的用途を示す。二本鎖ＲＮＡは、多くの異なる生物において遺伝子サイレンシングを誘発することが証明されている。遺伝子サイレンシングはさまざまな機序により起こりうるが、その１つは転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）である。転写後遺伝子サイレンシングにおいては、標的遺伝子座の転写は影響されないが、ＲＮＡ半減期は減少する。外因性ｄｓＲＮＡは、線虫、トリパノソーマ属、昆虫、および哺乳類を含む植物および動物におけるＰＴＧＳの強力な誘導因子として作用することが証明されている。転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）は、それによって遺伝子発現が調節されうる他の機序である。ＴＧＳにおいては、遺伝子の転写が阻害される。研究、治療、および予防的適用へのｄｓＲＮＡ介在遺伝子サイレンシングを生かす可能性は莫大である。標的ｍＲＮＡ分解の見事な配列特異性およびＰＴＧＳと関係がある体系的特性は、この現象を機能的ゲノムおよび創薬に理想的にする。
【０００５】
遺伝子をサイレンスする脊椎動物細胞におけるｄｓＲＮＡを使用するための一部の現行方法は、結果としてインターフェロン反応を含むｄｓＲＮＡ介在ストレス反応による望ましくない非特異的細胞毒性または細胞死がもたらされる。ｄｓＲＮＡ介在ストレス反応の誘導は迅速であり、かつ細胞アポトーシスまたは抗増殖効果をもたらしうる。ｄｓＲＮＡが脊椎動物細胞における毒性を引き起こす可能性に加えて、ｄｓＲＮＡ遺伝子サイレンシング法は、非特異的または非効率的なサイレンシングをもたらしうる。しかし、出願人は、脊椎動物細胞における毒性を誘発することが報告されている長ｄｓＲＮＡを含むｄｓＲＮＡの細胞内発現が、ｄｓＲＮＡ介在毒性を引き起こすことがない条件下に達成されることを明らかにした。しかし、かかるｄｓＲＮＡ法の実際の実施はｄｓＲＮＡ発現構築物からのｄｓＲＮＡの有効な細胞内産生および送達を必要とするという点で引き続き課題を残している。
【０００６】
生物学的活性のこれらすべての機序のために、核酸発現構築物から細胞内に生物学的活性の核酸を発現させることがしばしば望ましい。かかる方法の有効性は、治療上適切な方で、例えば、インビボまたはインビトロで所望の標的細胞に対して生物学的に活性、非毒性の形態、所望の細胞内位置または複数の位置での有効量および持続時間で標的宿主細胞において選択された核酸を有効に発現させる能力によって決まる。これはトランスフェクトするのが困難である細胞、例えば、一次細胞、一部の細胞系、例えば、Ｋ５６２５、ヒト白血病細胞系、およびインビボ使用における特定の課題を示す。したがって、改良された発現系、発現構築物、および方法が、真核生物における核酸発現構築物からの核酸の細胞内発現に必要である。好ましくは、これらの方法は、所望のポリペプチドおよび／または所望のＲＮＡ、例えば、インビトロサンプル、細胞培養、および無傷動物（例えば、ヒトを含む哺乳類など脊椎動物）におけるリボザイム、アンチセンス、トリプレックス形成、および／またはｄｓＲＮＡの産生を含む、その多様な生物学的機能のいずれかを達成することが可能な核酸を提供するために使用されうる。
【０００７】
バイオテクノロジーの出現以来の数十年間、環状プラスミド、線形プラスミド、コスミド、ウイルスゲノム、組換えウイルスゲノム、人工的染色体等を含む多様なベクター、発現構築物、および発現系が、原核生物および／または真核生物における使用に開発されている。細菌細胞培養におけるこれら発現系に使用により、インターフェロン（アルファ）、インターフェロン（ベータ）、エリトロポイエチン、第ＶＩＩＩ因子、ヒトインスリン、ｔ−ＰＡ、および医療器具のヒト成長ホルモンａ標準部品など組換えタンパク質が製造されている。
【０００８】
バイオテクノロジーおよび分子生物学の分野において開発されているきわめて多様な発現ベクターおよび発現系の中には、同じベクター上の多重プロモーターを含有する発現系がある。かかる型の多重プロモーター発現系では、原核生物において、または真核細胞の同じ細胞内コンパートメントにおいて活性である多重プロモーター（すなわち、２つもしくはそれ以上のプロモーター）を含有するベクターが利用される。例えば、当技術分野におけるかかる多重プロモーター系は、同じ細胞の同じコンパートメントにおける２つ以上の配列（例えば、ｄｓＲＮＡを形成するように設計された２つの異なった配列またはセンスおよびアンチセンス配列）の発現を可能にするように開発されており、またはそれらを使用して、異なる細胞または生物（例えば、原核生物および真核生物）内に同じ配列を発現させ、または単一の作動可能に結合される配列のより有効な転写を得ることができる。しばしば確認されるのは、例えば、バクテリオファージＴ７プロモーターおよびバクテリオファージＳＰ６プロモーター（その各々は真核細胞の細胞質において活性である）など同じプラスミド上の多重ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、または同じプラスミド上のバクテリオファージプロモーターである。
【０００９】
さらに、かかる多重プロモーターは、任意の数の方向および構成のベクター内に配置されうる。例えば、プロモーターは互いに対して発散的に配置されうるが、この場合、それらはベクター内の同じ方向で転写をドライブする。あるいは、多重プロモーターは、同じベクターにおいて互いに対して収束的に配置されうるが、この場合、転写はベクター内の対向部位で進行する。さらに、当技術分野で単一ベクター内の多重プロモーターの相対位置を表現するさまざまな用語が開発されている。「タンデム」という語は、すべてが転写される配列の５’末端に存在し、かつすべて作動可能に結合される多重プロモーターを表現するために使用されている。タンデムプロモーターは、同じまたは異なるプロモーターでありうる。「フランキング」プロモーターという語により、各プロモーターが、転写活性である場合、転写される配列の１つの鎖を転写することが可能であるような方法で、プロモーターによって転写される配列が５’および３’末端の両方で側面に位置する多重プロモーターの方向が表現される。フランキングプロモーターは、同じまたは異なるプロモーターでありうる。例えば、配列の５’末端および３’末端をフランキングする一連のバクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、センスおよびアンチセンス鎖を発現させ、二重二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する一般的な方法である（特許文献１、Ｆｉｒｅら、１９９９年７月１日公開）。
【００１０】
多重タンデムプロモーターが、例えば、異なったＲＮＡポリメラーゼによって認識され、かつ各々ＲＮＡ転写配列の発現を促進することが可能である、２つもしくはそれ以上のタンデムプロモーターから下流に位置したＲＮＡ転写配列を含むＤＮＡベクターを開示する特許文献５に記載されている。この開示におけるベクターが、例えば、各々がＲＮＡ転写配列を受入れることが可能なクローニング部位の上流に位置し、作動可能に結合される、バクテリオファージＳＰ６、Ｔ７、およびＴ３プロモーターをコード化するプラスミドである。
【００１１】
酵母において哺乳類コラーゲンまたはプロコラーゲンを製造するための方法が、逆方向で、単一または二重の種々の異種プロモーターに作動可能に結合される２つの哺乳類コラーゲン遺伝子を含んで成る構築物を使用する特許文献６に開示されている。２つのコラーゲン遺伝子をドライブするプロモーターは同じプロモーター、または異なるプロモーターでありうるが、これらを使用して２つのコラーゲン遺伝子の同程度の、好ましくは、同時の発現を提供することができる。
【００１２】
タンデムで配置され、所望のポリペプチドをコード化する異種核酸に作動可能に結合される二重細菌プロモーターを含有する発現ベクターが、特許文献７に記載されている。二重プロモーターは、ｔａｃ関連プロモーター由来の第１の成分（それ自体、ｌａｃおよびｔｒｐプロモーターの組合せである）およびガラクトース代謝に関与する酵素をコード化する細菌遺伝子またはオペロン由来の第２のプロモーターを含んで成る。二重細菌プロモーター系は相乗的に作用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）など原核細胞において結合された配列の高レベルの転写を提供する。
【００１３】
特許文献８は、真核生物および原核宿主細胞における挿入コーディング配列の翻訳を提供するベクターを開示している。詳しくは、かかるベクターは、原核および真核細胞における有効な発現のための二機能性プロモーター（真核生物および原核生物において機能性）または二重プロモーター（真核生物および原核生物において個別に機能性のプロモーター）のいずれかを含む。
【００１４】
同じベクターで使用される多重プロモーターのテーマに関する変形物を開示する当技術分野における他の無数の例がある。しかし、多重細胞内コンパートメントを有する真核細胞の２つ以上のコンパートメントにおいて特に活性に適合されるより有効な発現系の必要性が依然として存在する。タンパク質へ翻訳されるように設計された核酸を含む真核生物における核酸の細胞内発現は、重要な新しい課題を示す。医薬用途、例えば、ＤＮＡワクチンおよびｄｓＲＮＡ、および核酸発現の調節用のアンチセンス部分のかかる期待を示す核酸ベースの組成物により、真核細胞におけるより有効なＲＮＡ発現のための方法を開発することが決定的に重要である。これは、細胞へのＤＮＡ取込み、およびトランスフェクトすることが困難である一次細胞および細胞系の有効な系が存在しないため、特にインビボ送達用途に当てはまる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第９９／３２６１９号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，５０６，５５９号明細書
【特許文献３】国際公開第００／６３３６４号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願第６０／４１９，５３２号明細書
【特許文献５】米国特許第５，５４７，８６２号明細書
【特許文献６】米国特許第６，４７２，１７１号明細書
【特許文献７】米国特許第６，１１７，６５１号明細書
【特許文献８】米国特許第５，８７４，２４２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
一般に、本発明は、新規な核酸発現系、発現構築物、それらを生成するための方法、およびそれらを利用し、生物学的に活性の核酸、および、必要に応じて、ポリペプチドを製造する方法に関する。より詳しくは、本発明は、真核細胞、植物、または動物（例えば、ヒトなど哺乳類）における核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ハイブリッド、ヘテロ二本鎖、および修飾核酸）の発現のための方法および組成物に関する。本発明の核酸発現系および発現構築物は、生物学的に活性の核酸が、核酸がその所望の生物学的機能を実行することを可能にする方法や形態でインビトロおよびインビボで真核細胞および生物において有効に発現されることを可能にする。特に、核酸発現系は、その細胞内局在に関係なく真核細胞において有効に機能する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
より詳しくは、本発明は、１つもしくはそれ以上の発現構築物を含んで成る多コンパートメント真核生物発現系を提供し、ここで構築物または集合的に系を含んで成る構築物は、各々同じ真核細胞の異なる細胞内コンパートメント内で活性である少なくとも２つのプロモーターを含む少なくとも２つの異なるプロモーターを含む。多コンパートメント真核生物発現系は、各々が異なる細胞内コンパートメント、例えば、細胞質、ミトコンドリア、核小体、核（非核小体）、および同じ真核細胞の特定の細胞内コンパートメント内の機能的ドメインにおいて転写活性である少なくとも２つのプロモーターを含む２つもしくはそれ以上の異なるプロモーターを含む多重発現構築物または単一の発現構築物を含みうる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】２つもしくはそれ以上のプロモーターの制御下に同じ配列を含有するプラスミド発現ベクターを示す概略図である。各々が異なる物理的細胞内コンパートメントおよび／または細胞内コンパートメントの個別の機能的ドメインにおいて活性である、少なくとも２つのプロモーターが使用され、ベクターがインビトロまたはインビボでのトランスフェクション後の局在する細胞内環境に関係なく転写される配列の高い可能性があるようになっている。例えば、図１Ａのプラスミドは、Ｔ７プロモーター（Ｔ７ｐ）に作動可能に結合される（ヘアピンｄｓＲＮＡをコード化する）配列Ａの１つのコピー、およびヒトＵ６プロモーター（Ｕ６ｐ）などＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ プロモーターの制御下に配列Ａの第２のコピーを含む。各転写ユニットは、それぞれ、適切なターミネーター配列、Ｔ７ｔおよびＵ６ｔを含む。図１Ａにおいては、プロモーターは互いに対して異なる（すなわち、転写は同じ方向で進行する）。図１Ｂにおいては、Ｔ７プロモーターおよびＵ６プロモーターはコード化ｄｓＲＮＡ配列Ａをフランキングし、互いに対して異なる。（ターミネーターは図示されていないが、図８におけるように配置される。）矢印は転写の方向を示す。
【図２】単一の配列が、各プロモーターが転写活性を有する場合に前記配列の１つの鎖を転写することが可能であるように、プロモーターによって各端でフランキングされている「隣接したプロモーター配列」を示す図である。Ｐ１およびＰ２は、各々が単一の真核細胞の異なる細胞内コンパートメントまたは単一の細胞内コンパートメントの異なる機能的ドメインにおいて転写活性である、２つの異なるプロモーターを表す。目的とする配列は、例えば、ＲＮＡヘアピンまたはｍＲＮＡをコード化する。
【図３】所望のＲＮＡコード領域の１つのコピーがＴ７プロモーターによって１つの端で、もう一方の端ではＵ６プロモーターによってフランキングされるように選択された配列Ａの２つのコピーが配置されている三重プロモーター構築物を示す図である。（ターミネーターは図示されていない。）ベクターのほかの場所に位置しているコード化ＲＮＡ配列の第２のコピーが、ＭＣＭＶ（マウスサイトメガロウイルス）最初期プロモーターまたはＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）最初期プロモーターなどＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ プロモーターの制御下にある。
【図４】Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の５’末端でタンデムに位置している組込まれたＨＣＭＶおよびＴ７プロモーターを有するプラスミド発現ベクターを示す図である。（ターミネーターおよびポリアデニル化部位は図示されていない。）
【図５】目的とする配列の５’末端でタンデムに配置された３つのプロモーター、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３を示す図である。それらは互いに転写活性を有する細胞コンパートメントの点で異なる。
【図６】ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ プロモーターＨＣＭＶおよび細胞質Ｔ７プロモーターをタンデムで利用し、目的とする配列をドライブするプラスミド発現構築物を示す図である。ＨＣＭＶプロモーターからの核転写産物は、５’キャップ、Ｔ７プロモーター配列、および目的とする配列を含む。Ｔ７プロモーターからの細胞質転写産物は、目的とする配列のみを含む。
【図７】実施例１に詳しく記載されているように、４つの個別のシストロンを有するプラスミド発現ベクターを示す概略図である。配列Ａの２つのコピーと配列Ｂの２つのコピーがあり、各々、「ループ」領域によって分離される逆センスおよびアンチセンスＨＢＶ配列を含む異なるヘアピンｄｓＲＮＡをコード化する。配列Ａの一方のコピーはバクテリオファージＴ７プロモーター（Ｔ７ｐ）およびＴ７ターミネーター（Ｔ７ｔ）に作動可能に結合されており、もう一方のコピーはヒトＵ６プロモーター（Ｕ６ｐ）およびＵ６ターミネーター（Ｕ６ｔ）に作動可能に結合されている。配列Ｂの一方のコピーはバクテリオファージＴ７プロモーター（Ｔ７ｐ）およびＴ７ターミネーター（Ｔ７ｔ）に作動可能に結合されており、もう一方のコピーはヒトＵ６プロモーター（Ｕ６ｐ）およびＵ６ターミネーター（Ｕ６ｔ）に作動可能に結合されている。矢印は転写の方向を示す。
【図８】隣接したプロモーター配列を有する（実施例２にさらに詳しく記載）２シストロン性プラスミド発現ベクターを示す概略図である。すなわち、２つの異なるサブコンパートメント特異的プロモーター、バクテリオファージＴ７（Ｔ７ｐ）、およびヒトＵ６（Ｕ６ｐ）がフランキングし、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）特異的ヘアピンｄｓＲＮＡをコード化する配列（配列Ａ）に作動可能に結合されている。「Ｔ７ｔ」はＴ７ターミネーターを示し、「Ｕ６ｔ」はＵ６ターミネーターを示す。矢印は転写の方向を示す。Ｔ７転写産物は、５’〜３’、Ｕ６ターミネーターに対する逆相補鎖、配列Ａヘアピンを含有する。Ｕ６転写産物は５’〜３’Ｕ７ターミネーターに対する逆相補鎖、配列Ａヘアピンを含有する。
【図９】各シストロンがプラスミド上に物理的に個別の位置を占有する２シストロン性プラスミド発現ベクター（実施例５にさらに詳しく記載）を示す概略図である。各シストロンは、アンチセンスＲＮＡのみが転写されているプロモーターに作動可能に結合されている、配列Ａのコピー、ＨＢＶ配列を含有する。２つのシストロンが異なるサブコンパートメント特異的プロモーターによってドライブされる。一方のシストロンはバクテリオファージＴ７ プロモーター（Ｔ７ｐ）およびＴ７ターミネーター（Ｔ７ｔ）を含み、もう一方のシストロンはＭＣＭＶおよびＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）ポリアデニル化部位を含む。矢印は転写の方向を示す。
【図１０ａ】３つのシストロンに配置された３つのプロモーター、すなわち、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現をドライブする核プロモーター（ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス））、および１つはＨＢＶ特異的センスＲＮＡを発現し、もう１つはＨＢＶ特異的アンチセンスＲＮＡを発現する、２つの細胞質Ｔ７プロモーターを利用するプラスミド発現ベクター（図６により詳しく記載）を示す概略図である。ＲＳＶプロモーターはＢＧＨポリアデニル化部位と対をなし、Ｔ７ターミネーターが各Ｔ７シストロンの末端に位置している。矢印は転写の方向を示す。センスおよびアンチセンスＲＮＡは、互いにハイブリッド形成し、二本鎖ｄｓＲＮＡを形成することが可能である。
【図１０ｂ】ＲＳＶプロモーター、５’ＵＴＲ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼコード領域、およびＢＧＨポリアデニル化部位を含んで成る図１０ａ、および実施例６のプラスミド発現ベクターにおいて利用されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現カセットの配列を示す図である。
【図１０ｃ】図１０ｂ続き
【図１０ｄ】図１０ｂ続き
【図１０ｅ】図１０ｂ続き
【図１１】二重／組込みプロモーター系を有するプラスミド発現ベクターを示す概略図である。バクテリオファージＴ７プロモーターは、ＭＣＭＶプロモーターの３’末端で１７ヌクレオチドを置換し、Ｔ７プロモーターの５’ヌクレオチドがＭＣＭＶプロモーターのヌクレオチド１１２３に隣接している。ＭＣＭＶプロモーターおよびＴ７プロモーターは各々、ＨＢＶ特異的アンチセンス配列、配列Ａに作動可能に結合されている。Ｔ７ターミネーター（Ｔ７ｔ）およびＢＧＨポリアデニル化部位が、図示されているように配列Ａの３’に位置している。発現構築物が細胞質位置している場合、Ｔ７プロモーターが配列Ａの転写を開始するが、核に位置した発現構築物は、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターであるＭＣＭＶプロモーターからアンチセンスＲＮＡを発現する。
【図１２】実施例７および図１１に記載された二重／組込みプロモーターの配列を示す図である。欠失ＭＣＭＶプロモーター（ｎｔｓ １−１１２３）は、ｎｔ １１２３が直接、Ｔ７プロモーターの最大の５’ヌクレオチドに接するように配置されている。矢印は転写の方向を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
出願人は、本開示における全引例の全内容を具体的に援用する。さらに、量、濃度、もしくは他の値またはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または上限の好ましい値および下限の好ましい値のリストで示されている場合、これは範囲が個別に開示されているにかかわらず、範囲の上限または好ましい値および範囲の下限または好ましい値の任意の対から形成されるすべての範囲を具体的に開示すると理解すべきである。一連の数値が本明細書で列挙されている場合、特に明記しない限り、範囲はその終点、およびその範囲内の整数と分数を含むことが意図されている。本発明の範囲が範囲を規定する場合に列挙された特定の値に限定されることは意図されていない。
【００２０】
特に真核細胞におけるインビボ使用の、核酸ベースの医薬品を含む生物学的に活性の核酸の多大な将来性の実現は、大体において、より有効な送達および発現系を開発するわれわれの能力によって決まる。出願人の発明は、真核細胞における異種核酸配列の有効な発現のために設計された多コンパートメント真核生物発現系に関する。特に、本発明は、多コンパートメント真核生物発現系、例えば、少なくとも２つの異なるプロモーターを利用する１つもしくはそれ以上の発現構築物を使用し、ここで少なくとも２つの異なるプロモーターが各々、同じ真核細胞の異なる細胞内コンパートメント内で転写活性を有する、真核細胞における目的とする配列の発現のための方法に関する。多コンパートメント特異的プロモーターは、単一の発現ベクターまたは発現構築物、例えば、プラスミド、組換えウイルス等に位置し、またはそれらは単一の組成物内の異なる発現構築物、または単一の真核細胞内に位置している異なる発現構築物に位置しうる。「多重プロモーター」という語を使用することにおいて、出願人は２つ以上の異なるプロモーター配列を具体的に意味する。かかる異なるプロモーター配列は、各々、単一の真核細胞の異なる細胞内コンパートメント内で活性である。本発明の発現系では、発現系が全体として異なる細胞内コンパートメント（例えば、Ｔ７プロモーターおよびヒトミトコンドリア軽鎖プロモーター）において活性の少なくとも２つのプロモーターを含む限り、同じプロモーター（例えば、２つのＴ７プロモーター）の２つ以上のコピー、および／または同じ細胞内コンパートメント（例えば、Ｔ７プロモーターおよびＳＰ６プロモーター）において活性の２つ以上のプロモーターが利用されうることが予想される。本発明の発現系では、同じ構造の細胞内コンパートメント内に存在する異なるドメインにおいて活性のある２つもしくはそれ以上のプロモーター、すなわち核の異なるドメイン内で転写活性の２つのプロモーターを含むプロモーターの組合せが利用されることも考えられる。
【００２１】
目的とするさまざまな配列の発現のための多くの真核生物系に一般に適用可能であるが、出願人の多コンパートメント真核生物発現系は特に本明細書では生物学的に活性のＲＮＡ分子（場合によりポリペプチドへ翻訳）の有効な細胞内発現に関するものとして記載されている。本発明の重要な態様は、細胞当たりより多くの核酸（かつ場合によりポリペプチド）を発現する能力に関する。本発明の他の重要な態様は、２つ、３つ、４つ、もしくは、必要に応じて、それ以上の細胞内コンパートメントにおける核酸の発現を方向づけることによって生物学的活性を調節する能力に関する。
【００２２】
本発明の真核生物における核酸発現系の有効性への適用は、特にいくつかの理由で有用である。真核細胞のトランスフェクションまたは核酸発現構築物の真核生物へのインビボ送達の後、発現構築物は主にその中の細胞質および機能的コンパートメントに分布し、はるかに少ない部分が核および核コンパートメント、例えば核小体に局在することが認識されている。したがって、発現構築物は異なる細胞内コンパートメント内にきわめて不均一な方法で分散し、さらに、分散は静的ではない（すなわち、一部の細胞質核酸は最終的に核に入り、かつ一部の核の核酸は最終的に細胞質に局在しうる）。これは、それらがコード化プロモーターが活性ではない細胞内コンパートメントに位置しているという理由のみによって、発現構築物の集団（多くの場合、細胞に及ぶ発現構築物の大部分）が非機能的である状態をもたらす。例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ）によってドライブされる広く使用されているＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）最初期プロモーターを含むプロモーターが、最大数に発現構築物が位置している細胞質ではなく核においてのみ活性である。したがって、細胞（細胞質コンパートメントにおけるもの）における大部分のかかる発現構築物は活性ではない。真核細胞の異なる細胞内コンパートメントにおいて各々活性である２つもしくはそれ以上の、例えば数個のプロモーターを含むことによって、多コンパートメント真核生物発現系、例えば、細胞においてプラスミドが局在されていても転写活性であるプラスミド、またはプラスミドの組合せを加工することが可能である。一部の態様においては、単一の発現構築物が、例えば、転写が起こり、または起こるようになされうる真核細胞の２つ、３つ、４つ、またはすべての細胞内コンパートメントにおいて転写活性であるように設計されうる。本発明の他の態様においては、２つもしくはそれ以上の発現構築物を含んで成る真核生物発現系が、例えば、転写が起こり、または起こるようになされうる真核細胞の、単一細胞内コンパートメント内の機能的ドメインを含む２つ、３つ、４つ、またはすべての細胞内コンパートメントにおいて転写活性である異なるサブコンパートメントプロモーターの組合せを含むように設計されうる。
【００２３】
真核細胞における非効率の発現のこの問題は、特に一次細胞など特定の細胞、および特定のトランスフェクトし難い細胞系におけるインビトロ使用に重要でありうるが、しかし、核酸送達が比較的不十分になる傾向があるインビボ使用に重要である。特に、インビボ送達法はＤＮＡの細胞への有効な取込みを提供することはない。例えば、わずかに約１０６−１０７のＤＮＡ分子が、１０１４もの数の分子の注入後に細胞へ内在化される。これは、トランスフェクトされたきわめてわずかな細胞だけではなく、トランスフェクトされている細胞も唯一ないし多くてもいくつかのトランスフェクトＤＮＡの分子を有する状態をもたらす。ＤＮＡが適切な細胞内コンパートメントにはない限り、これは発現されない。正確なコンパートメントにある確率は、細胞当たりのトランスフェクト細胞の数が減少するとともに低下する。したがって、多重プロモーターが使用され、プロモーターが異なる細胞内コンパートメントで個別に活性である系が、トランスフェクトされている細胞が所望のＲＮＡを発現させうる可能性を増大させる。同様の状態は、トランスフェクトが困難である一次細胞、および特定の細胞系、例えば、トランスフェクトがやはり困難であるＫ５６２細胞のトランスフェクションを含む多くのインビトロ使用について存在する。
【００２４】
多重の異なるサブコンパートメント特異的プロモーターの使用は、ＰＴＧＳおよびＴＧＳの誘導が望ましい場合に追加の利点を提供する。このような状況において、ｄｓＲＮＡの発現は細胞質および核ならびに核小体において少なくとも最小レベルで起こる必要がある。
【００２５】
本発明の多コンパートメント真核生物発現系および方法は、細胞によって利用されるすべてのプラスミドの発現の可能性を大幅に増大させる機会、およびトランスフェクト細胞当たりの発現を大幅に増大させる方法を示し、例えば、約５０％、１００％、２００％、５００％、１０００％、５０００％まで、およびさらに潜在的には約１０，０００％もしくはそれ以上までの発現レベルの増大を示す。プラスミドなど発現構築物は通常、真核細胞内できわめて不均等に分布され、９９％もしくはそれ以上が細胞質に位置しており、１％未満（多くの場合、１％をはるかに下回る）が核内に位置しているため、細胞質の転写能力を増すことにより、潜在的に発現が１０倍ないし１０００倍もしくはそれ以上増大することが予想されうる。
【００２６】
同じ細胞内コンパートメントにおいて活性である多重プロモーターを含有するベクターが一般的に使用されている。例えば、多重ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターが使用され、または、多重バクテリオファージプロモーター、例えば、Ｔ７およびＳＰ６プロモーター（その各々が細胞質において活性である）が使用されている。これら周知の発現系の大部分は多重配列を発現させるように設計されている。かかる周知の発現構築物は多くの制限および不利点を有する。すなわち、これらの方法は、その細胞内コンパートメント化とは無関係に真核細胞における発現構築物の転写を可能にしない。また、同じ核酸分子で同時に存在する同じコンパートメントにおいて活性の２つもしくはそれ以上のプロモーターの使用は、多くの理由で非効率的であり、かつ望ましくない可能性がある。すなわち、
ａ）ＤＮＡ分子からの転写は、成長鎖の前方で、かつ正当な転写鎖の後方でテンプレートＤＮＡの超らせん形成に影響を及ぼす（Ｍａｒｉｅｔｔａ ＤｕｎａｗａｙとＥｌａｉｎｅ Ａ．Ｏｓｔｒａｎｄｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：７４６−７４８頁（１９９３年）、Ｊｏｃｅｌｙｎ Ｅ．ＫｒｅｂｓとＭａｒｉｅｔｔｓ Ｄｕｎａｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５８２１−５８２９頁（１９９６年））。超らせん形成におけるこれらの変化はプラスミド全体に影響を及ぼす。超らせん形成における変化は、多くのプロモーターの活性に悪影響を及ぼし、現に活性を無効にしうる。これは発現構築物における１つのプロモーターからの活性が、他のプロモーターの活性に対して悪影響を及ぼしうるとともに、逆の場合も同じであることを意味する。
ｂ）単一の発現構築物における多重プロモーターは、同じコンパートメントにおいていずれも活性であり、同じ方向に連続している場合、プロモーターの閉塞またはプロモーターの干渉をもたらしうる。プロモーターの干渉は、プロモーターが互いの近く（数百ヌクレオチド以内）に位置していると起こる。１つのプロモーターにおける転写因子および他の因子の核形成は、第２のプロモーターにおける因子の核形成を妨害する。プロモーターの閉塞は特にターミネーターが１つのシストロンの末端、および次のプロモーターの前に位置していない系で問題となる。ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩは有効なターミネーション系を有さないため、これは同じ発現構築物における多重ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターの使用で潜在的な問題である。プロモーターの閉塞が起こるのは、１つのシストロンからの転写がシストロンの末端で終止せず、第２のプロモーターを通過し、そのプロモーターの転写開始を阻止する場合である。
ｃ）転写の干渉が起こるのは、同じ細胞内コンパートメントでいずれも活性である２つの活性プロモーターが互いに収束方向で対向している場合である。また、転写の干渉は、下流プロモーターが上流プロモーター（その両方は同じ分子において同時に活性でなければならない）の存在によって抑制される場合にも起こりうる。上流プロモーターから開始された伸張転写産物は、伸張転写産物が下流プロモーターを横断すると下流プロモーターからの開始を抑制する（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎ．Ｊ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５６２−５６５（１９８６年））。一方のプロモーターからの転写は、他方のプロモーターからの転写を干渉しうるとともに、転写産物の早期ターミネーションを誘発しうる。
【００２７】
本発明の多コンパートメント真核生物発現系は、２つもしくはそれ以上の異なる細胞内コンパートメント特異的プロモーターの制御下に、真核細胞の２つもしくはそれ以上の異なった細胞内コンパートメントにおける目的とする１つもしくはそれ以上の配列を発現させるために有利に使用されうる。本発明の１つの態様においては、第１の配列が第１の選択細胞内コンパートメント発現し、第２の配列が第２の細胞内コンパートメントで発現し、ここで第１および第２のコンパートメントは単一の真核細胞の異なる細胞内コンパートメントである。
【００２８】
二重または多重プロモーターは、単一の発現構築物または２つもしくはそれ以上の発現構築物を含んで成る発現系において使用し、２つもしくはそれ以上の転写シストロンから成る系を生成することができる。概念的には、構築物は、例えば、以下の一般的な原理に従って考案されうる。すなわち、
クラス１。これらのベクターは、２つもしくはそれ以上のプロモーターの制御下に同じ核酸配列を含有する。各プロモーターは、真核細胞の個別の機能的ドメインおよび／または物理的サブコンパートメントにおいて活性である。これは、ベクターがインビトロまたはインビボ投与のトランスフェクション後に局在する細胞内環境に関係なく転写される配列の可能性を増大させ、細胞によって製造されるＲＮＡの増大をもたらしうる。プロモーターの適切な選択も、必須の細胞内位置に転写活性を集中することによって所望の生物学的活性を達成する可能性を増大させうる。
【００２９】
現在のプラスミドベクター系の１つの問題は、インビトロまたはインビボでの細胞のトランスフェクト後、プラスミド／ベクターの多重コピーが細胞に入るが、すべてのプラスミド／ベクターが同じ細胞内コンパートメントに共局在するわけではなく、したがって、単一型のプロモーターを含有するすべてのプラスミド／ベクター分子が転写されるわけではない。２つ以上の細胞内コンパートメントで転写されることが可能なプラスミド／ベクターは、高率のトランスフェクトされたプラスミド／ベクターが発現されることを可能にする。
【００３０】
２つの型のプロモーターを有するプラスミドの例が図１Ａに示されている。配列Ａ（ループ領域によって分離される逆センスおよびアンチセンス領域を有するｄｓＲＮＡヘアピンをコード化する）の１つのコピーが、Ｔ７プロモーター（Ｔ７ｐ）の制御下にあると同時に、配列Ａヘアピンの第２のコピーがＵ６プロモーターなどＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下にあると考えられる。（ターミネーターは示されていないが、図７におけるように配置されるであろう。）ベクターがＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞の細胞質コンパートメントに局在すると、シストロンによってドライブされるＴ７プロモーターは転写される。ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターによってドライブされる転写ユニットは、それらが細胞質コンパートメントにある間は転写されない。しかし、核小体に局在するベクターは、Ｕ６プロモーターによって転写され、Ｔ７プロモーターによっては転写されない。あるいは、配列Ａヘアピンに１つのコピーがＴ７プロモーターによって一端でフランキングされ、他の一端でＵ６プロモーターによってフランキングされると考えられる（図１Ｂ）。（ターミネーターが示されていないが図８におけるように配置されるであろう。）細胞質に位置しているベクターはＴ７プロモーター末端から転写されるが、核小体におけるベクターはＵ６プロモーター末端から転写される。異なる細胞内コンパートメントにおけるプロモーター転写活性を利用するかかる多コンパートメント発現系は、細胞がより多くの特異的ヘアピンＲＮＡを作ることを可能にする。ＲＮＡがタンパク質を作るように設計されている場合は、より多くのタンパク質が細胞によって作られる。単一の配列が、各プロモーターが転写活性である場合に前記配列の１つの鎖を転写することが可能であるような方法で各端でプロモーターによってフランキングされる組成物は、図２に示されているように、「隣接したプロモーター配列」を有するとして見なされる。Ｐ１およびＰ２は２つの異なるプロモーターを表し、各々が異なる細胞内コンパートメントにおいて、または単一の細胞内コンパートメントの異なる機能的ドメインにおいて転写活性である。目的とする配列は、例えば、ＲＮＡヘアピンまたはｍＲＮＡをコード化する。
【００３１】
三重プロモーターの組合せも、例えば、Ｔ７プロモーター、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、およびＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下に目的とする１つもしくはそれ以上の核酸をコード化する発現構築物におけるように使用されうる。所望のＲＮＡコード領域の単一コピーがＴ７プロモーターによって一端でフランキングされ、他の一端ではＵ６プロモーターによってフランキングされるかかるベクターが設計されうる。ベクターのほかの場所に位置しているコード化ＲＮＡ配列の第２のコピーが、ＭＣＭＶまたはＨＣＭＶプロモーターなどＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下にある（図３を参照）。あるいは、同じ配列の３つのコピーをベクターに含めることができるが、各配列は個別プロモーターの転写制御下にある。他の実施形態においては、２つもしくは３つの異なる配列が、三重プロモーターの組合せの制御下に配置されうる。
【００３２】
上記は、本発明の多コンパートメント真核生物発現系の説明に役立つ実例にすぎず、多くの追加の実施形態は分子生物学の当業者によって容易に想定されうる。
【００３３】
クラス１ベクターに関して考慮すべき原理：
１）一斉に使用される１つもしくはそれ以上の発現構築物を含んで成る多コンパートメント真核生物発現系は、単一のベクターまたは一連のベクターにおいて少なくとも２つのプロモーターエレメントを含む必要があり、ここで各プロモーターは単一の真核細胞の異なる細胞内コンパートメント（異なる物理的サブコンパートメントまたは単一の物理的サブコンパートメント内の異なる機能的ドメインのいずれか）において活性を有する。前記発現系において使用される他のプロモーターは、同じまたは異なる細胞内コンパートメントにおいて活性でありうる。例えば、ベクターまたはベクターの組合せは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩベースのプロモーター（核小体において活性）およびＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーター（核の非核小体コンパートメントにおいて活性）など２つのプロモーターを含有しうる。プロモーターは互いに対して収束的または発散的でありうる。
２）発現系または発現構築物は、発現系または発現構築物が異なるコンパートメントにおいて転写活性を有する少なくとも１つのプロモーターをも含む場合には、同じ型の２つ以上のコンパートメント特異的プロモーター（例えば、２つのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーター）を含有しうる。
３）好ましくは、「隣接したプロモーター配列」において、各プロモーターは、プロモーターが活性である細胞内コンパートメントに関して配列の点で他のプロモーターと異なる必要がある。例えば、２つのＴ７プロモーターは使用すべきでなく、２つのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターも使用できない。しかし、１つのＴ７プロモーターをＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩまたはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターとともに使用することができる。同様に、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターをＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターとともに使用することができ、またはミトコンドリアプロモーターをＴ７プロモーターとともに使用することができる。このプロモーター配列は、転写後遺伝子サイレンシング、転写遺伝子サイレンシング、ＲＮＡｉ等に使用されるものなど長または短のヘアピンＲＮＡを転写する場合に有用である。
４）「隣接したプロモーター配列」が使用される場合、目的とする配列の単一のコピーが存在しうるが、その他の場合には目的とする配列の少なくとも２つのコピーが必要となる。
５）この系を使用して目的とする２つの異なる配列を生じることもできる。例えば配列Ａは核において転写され、配列Ｂは細胞質において転写されうる。例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列Ａ）を含有するベクターが、中初期プロモーターにおけるＨＣＭＶなどＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターの転写制御下にありうるとともに、ヘアピンＲＮＡをコード化する配列（配列Ｂ）がＴ７プロモーターの制御下にありうる（図４）。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼｍＲＮＡは核において転写され、細胞質において翻訳され、ここで細胞質に位置しているベクターから配列Ｂの転写を導くことができる。第２の例が、ＭＣＭＶ最初期（ｉｅ）プロモーターなどＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターの制御下のヒトまたはマウスミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列Ａ）、およびヒトまたはマウスミトコンドリアプロモーターの制御下のヘアピンＲＮＡ（配列Ｂ）を含有するベクターである。種には２つのみの周知のミトコンドリアプロモーター、すなわち、重鎖プロモーターと軽鎖プロモーターがある。これらのプロモーターのいずれかを構築物において使用されうる。
【００３４】
クラスＩＩ：
これらの発現構築物においては、２つもしくはそれ以上のプロモーターが、互いに対してタンデムに位置している。プロモーターは、スペーサーヌクレオチドによって直接、並列され、または分離されうる。最も好ましくは、２つのプロモーター間にスペーサーが存在せず、あまり好ましくないのは、１−１００ｂｐのスペーサーが存在し、最も好ましくないのは、１０１−５００ｂｐのスペーサーが存在することである。場合によっては、１つのプロモーターを第２のプロモーターに組込むことができる。例えば、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターを、例えば、２、３例を挙げれば、ＨＣＭＶ ｉｅ、ＭＣＭＶ ｉｅ、シミアンサイトメガロウイルス（ＳＣＭＶ）ｉｅなどＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーター、またはＲＳＶプロモーターのヌクレオチド−１〜約−２０内に配置されうる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の５’末端でタンデムに位置している組込まれたＨＣＭＶおよびＴ７プロモーターを示す図４を参照。（ターミネーターおよびポリアデニル化部位は示されていない。）この配列におけるプロモーターは、それらが活性である細胞内コンパートメントの点で互いに対して異なる必要がある。この配列においては、単一の配列が２つもしくはそれ以上のプロモーターによってフランキングされている（その各々／すべてが目的とする配列の５’末端に位置している）。図５は、目的とする配列の５’末端でタンデムに配置されている３つのプロモーター、Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３を示す。それらは、転写活性である細胞内コンパートメントの点で互いに異なる。他の例においては、ＨＣＭＶなどＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターにはＴ７プロモーターが付随しうる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞の細胞質においては、目的とする配列はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写される。核の非核小体コンパートメントに局在するベクターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩによって転写されうる。かかる配列は、例えば、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターＨＣＭＶおよび細胞質Ｔ７プロモーターをタンデムで利用し、目的とする配列をドライブする、例えば図６において確認される。ＨＣＭＶプロモーターからの核転写産物は、５’キャップ、Ｔ７プロモーター配列、および目的とする配列を含む。Ｔ７プロモーターからの細胞質転写産物は、目的とする配列のみを含む。１つのベクターにつき１つもしくはそれ以上のこれら配列が存在しうる。
【００３５】
本発明のためのプロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩなど内因性ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるものでありうる。それらは、ウイルスおよびバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼなど外部から加えられたＲＮＡポリメラーゼによって認識されるものでもありうる。応用としては、ｍＲＮＡ、リボザイム、ヘアピンＲＮＡ、構造化ＲＮＡなどＲＮＡ、および遺伝子サイレンシングに関与するものなど他の機能的ＲＮＡの転写が挙げられる。ベクターとしては、例えば、ＤＮＡプラスミドおよびエピソームが挙げられ、ウイルスベクターでありうる。
【００３６】
プロモーターの分類
ＲＮＡ ｐｏｌ ＩおよびＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩはいずれも核小体プロモーターであるが、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩおよびＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩは互いに対して異なった機能的ドメインで転写され、したがって、特許請求された発明の範囲に含まれるのは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩプロモーターがＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターと使用される場合である。
【００３７】
本発明の特定の実施形態においては、Ｕ６プロモーターを含むポリメラーゼＩＩＩプロモーターが使用される。しかし、Ｕ６プロモーターそれ自体だけではなく、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、２型、および３型プロモーター、すなわち、「Ｕ６型」プロモーターの他のクラスのメンバー（そのうちＵ６遺伝子の１つにおけるＵ６プロモーターが十分に特徴付けられたメンバーである）がＵ６プロモーターの代わりに使用されうることが理解されるであろう。他の「Ｕ６型」プロモーターの例としては、ＳｃｈｒａｍｍとＨｅｒｎａｄｅｚ（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：２５９３−２６２０頁（２００２年））およびＰａｕｌｅとＷｈｉｔｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：１２８３−９８頁（２０００年））によって検討されるＨ１、７ＳＫ、およびＭＲＰが挙げられる。また、Ｕ６型ポリメラーゼＩＩＩプロモーターに関しては、その開示が参照によって本明細書で援用される、米国特許第５，６２４，８０３号明細書、Ｎｏｏｎｂｅｒｇらを参照。
【００３８】
ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、核の非核小体コンパートメントにおいて転写される。しかし、これらのプロモーターは、核ドメイン／核機能的サブコンパートメントに関して上記のように細分されうる。具体的な例が提供されている。
【００３９】
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのための細胞質プロモーターは、例えば、Ｔ７、ＳＰ６、およびＳＰ３を含むバクテリオファージプロモーターである。ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるプロモーターは、ＲＮＡ分子上に含まれ、例えば、アルファウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、およびラブドウイルス由来など多くのＲＮＡウイルスプロモーターを含む。
【００４０】
ミトコンドリアプロモーターとしては、重鎖および軽鎖プロモーターが挙げられる。
【００４１】
定義：
本開示においては、以下の用語が、本明細書でより具体的に定義されているように、当業者の慣例の理解に従って使用される。
【００４２】
真核細胞の「コンパートメント」、「細胞内コンパートメント」、または「細胞コンパートメント」は、例えば、主に膜および特殊機能を実行する能力によって定義され、ならびに転写活性と関連した特異的多タンパク質複合体、例えば、細胞質、ミトコンドリア、核（非核小体）、および核小体を有する真核細胞内の細胞内位置を意味する。「コンパートメント」もしくは「細胞内コンパートメント」または「細胞コンパートメント」は、例えば、細胞膜によって他のコンパートメントから物理的に分離されないが、特定のプロモーターからの転写など特定の機能を実行する特異的タンパク質複合体の存在によって生化学的に定義される「機能的コンパートメント」または「機能的ドメイン」でもありうる（Ｙａｍａｇｏｅ Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３：１０２５−１０３頁（２００３年））。
【００４３】
細胞内の機能的細胞内コンパートメントである核ドメインが同定されており、特異的機能はそれらと関係がある（Ａｓｃｏｌｉ Ｃ．Ａ．およびＭａｕｌ Ｇ．Ｇ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１２：７８５−７９５頁（１９９１年）、Ｐｏｍｂｏら、ＥＭＢＯ Ｊ．１８：２２４１頁（１９９９年））。本発明のために、関係のある唯一の機能的プロモーターは、特異的プロモーターまたはプロモーターの特異的クラスの転写と関係があるものである。例えば、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩによるヘルペスウイルス１ゲノムの転写が、ＮＤ１０として周知の特異的核ドメイン内で起こることが証明されている（Ｔａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：５８２１−５８２８頁（２００３年））。したがって、２つのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターを、それらのプロモーターが機能的に異なったドメインで転写される場合にのみ、化学的多コンパートメントプロモーター系（他のプロモーターの非存在下）においてともに使用されうる。例えば、ヘルペスプロモーターを、やはりＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ、例えば、アクチンプロモーターによって転写される非ヘルペスプロモーターとともに使用されうる。
【００４４】
「転写」は、ＤＮＡの１つの鎖に含まれる遺伝子情報が用いられて、ＲＮＡ鎖における塩基の相補的配列、例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ形成ＲＮＡ、リボザイムが特定される酵素によるプロセスを意味する。
【００４５】
「転写ユニット」または「シストロン」は、その中で転写が起こるユニットを意味する。通常、「転写ユニット」は、場合によりターミネーターまたはポリアデニル化シグナルで転写される核酸配列に作動可能に結合されるプロモーター配列を意味する。単一の核酸配列の転写を開始するために作動可能に結合される２つのプロモーター、例えば、核酸配列をフランキングする２つのプロモーターは、２つの転写ユニットまたは２つのシストロンを構成し、転写される単一の核酸配列に作動可能に結合される３つのプロモーターは３つの転写ユニット等を構成する。発現構築物または発現ベクターは一般的に多重転写ユニットまたはシストロンを含有するように加工されるが、例えば、４つの個別のシストロンを有するプラスミドを示す図７を参照。
【００４６】
「転写活性」は、プロモーター配列が、例えば、バクテリオファージプロモーター、例えば、Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３などプロモーターのための必須非内因性ＲＮＡポリメラーゼの供給を含む適切な状況下、もしくは他の適切な条件下、または、例えば、誘導性プロモーターを有するシグナル下に転写を開始することが可能であることを意味する。
【００４７】
「発現系」は、細胞の異なる細胞内コンパートメントにおいて活性である少なくとも２つの転写ユニットを有する単一の真核細胞を提供するために一斉に使用される１つもしくはそれ以上の発現構築物またはベクターを意味する。発現系は、２つもしくはそれ以上の転写ユニットを含む単一の発現構築物から成り、または一斉に使用される２つ、３つ、４つ、もしくはそれ以上の発現構築物を含んで成りうる。一部の態様においては、２つもしくはそれ以上の発現構築物は、単一の組成物、例えば、医薬組成物、または研究用試薬として使用される。一部の態様においては、２つもしくはそれ以上の発現構築物は、真核細胞に送達される各構築物の生成物間に何らかの機能的相互作用がある限り、一斉に使用される、例えば、同時に、または互いに数分、数時間、または数日以内、例えば、１日、２日、３日、またはさらに互いに１週間以内に投与される２つもしくはそれ以上の組成物において使用される。発現構築物は、その各々が単一の真核細胞の異なる細胞内コンパートメント内で転写活性である少なくとも２つのプロモーターを含む２つもしくはそれ以上のプロモーターを集合的に含んで成る。発現系は、同じ真核細胞の少なくとも２つの細胞内コンパートメントにおいて活性である２つもしくはそれ以上の転写ユニットを含んで成る１つもしくはそれ以上の発現構築物を有する単一の真核細胞を提供するのに役立つ。本出願において、「転写ユニット」は、場合によりターミネーターまたはポリアデニル化シグナルで転写される核酸配列に作動可能に結合されるプロモーター配列を意味ずる。単一の核酸配列に作動可能に結合される２つのプロモーターは２つの転写ユニットを構成し、単一の転写ユニットに作動可能に結合される３つのプロモーターが３つの転写ユニット等を構成する。本発明の１つ態様においては、単一の真核細胞の少なくとも２つの細胞内コンパートメントにおいて同時に、または実質的に同時に存在し、かつ転写活性である２つもしくはそれ以上の発現構築物を有する単一の真核細胞が提供される。他の態様においては、２つもしくはそれ以上の異なる発現構築物、または２つもしくはそれ以上の転写ユニットを含有する単一の発現構築物が、単一の真核細胞に同時に、または実質的に同時に存在するが、転写ユニットは、例えば、誘導性プロモーターにより、１つもしくはそれ以上の転写ユニットからの転写のタイミングが調節されるように、例えば、１つもしくはそれ以上のプロモーターからの転写を調節するのが望ましい場合には、同時に転写活性であってはならない。１つの態様においては、発現系は単一の発現構築物または２つもしくはそれ以上の発現構築物、例えば、２つもしくはそれ以上のプロモーター、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、もしくはそれ以上を含んで成るプラスミドまたは複数のプラスミドであり、少なくともそのうち２つは同じ真核細胞の異なる細胞内コンパートメントにおいて転写活性である。好ましい実施形態においては、発現系は、同じ真核細胞の異なる細胞内コンパートメント、例えば、細胞質、核、ミトコンドリア、および核小体のほか、特異的プロモーター、例えば、細胞質および核、細胞質および核小体、細胞質およびミトコンドリア、ミトコンドリアおよび核、ミトコンドリアおよび核小体、核および核小体、細胞質、核、および核小体、細胞質、核、およびミトコンドリア、細胞質、核小体、およびミトコンドリア、ミトコンドリア、核小体、およびミトコンドリアのほか、細胞質、核、ミトコンドリア、および核小体からの転写など明確な機能を実行することが可能な特異的多タンパク質複合体の存在によって生化学的に定義された機能的細胞内コンパートメントを含むがこれに限定されない、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくはそれ以上において転写活性のプロモーターを含んで成る。また、本発明では、単一の細胞内コンパートメントの異なる機能的ドメインにおいて転写活性のプロモーターの組合せを使用することが想定されている。
【００４８】
「ミトコンドリア」は、エネルギーを産生し、かつその独自のＤＮＡゲノムを含有するが、ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼを含む核ゲノムによってコード化されるタンパク質のための細胞に依存している真核細胞の細胞質に存在する膜結合細胞小器官を意味する。
【００４９】
「核」または「核の」は、核膜によって取囲まれ、染色体を含有する真核細胞の内部コンパートメントを意味する。本特許出願においては、核は核小体と明確に異なると見なされる。
【００５０】
「核小体」、「核小体の」、または「核小体非核の」は、そのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子がＲＮＡポリメラーゼＩによって猛烈な速度で転写されるＤＮＡの大きなループを含有する真核細胞の核内の大きな拡散した構造を意味する。かかるｒＲＮＡはリボソームタンパク質で核小体に直ちにパッケージされ、リボソームを生成する。本特許出願において、核小体は核と明確に異なると見なされる。
【００５１】
「真核生物」または「真核細胞」は、いくつもの染色体および核を有する、高等生物、植物または動物、無脊椎動物および脊椎動物の高度な細胞を意味する。
【００５２】
「原核細胞」または「原核細胞」は、単一の染色体のみを含有し、核膜を有さない細菌など下等生物の原始的型の細胞を意味する。
【００５３】
「ＲＮＡポリメラーゼ」は、ＲＮＡを合成する酵素を意味する。ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレートからＲＮＡ転写産物を合成する。ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレートからＲＮＡ転写産物を合成する。真核細胞におけるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ活性の一般的な例としては、ＲＮＡポリメラーゼＩ（ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ）、ＲＮＡ ポリメラーゼＩＩＩ（ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ）、ミトコンドリアポリメラーゼのほか、真核細胞に提供される他のポリメラーゼ、例えば、バクテリオファージポリメラーゼが挙げられる。
【００５４】
「センス」および「アンチセンス」：「センス」は、ｍＲＮＡに存在するのと同じ配列および方向を有する核酸配列を意味する。「アンチセンス」は、相補的な核酸、およびセンス核酸との反対方向を意味する。
【００５５】
「発現構築物」は、ＲＮＡを転写するように設計された二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ、例えば、下流遺伝子または目的とするコード領域（例えば、タンパク質、または目的とするＲＮＡをコード化するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）に作動可能に結合された少なくとも１つのプロモーターを含有する構築物を意味する。発現構築物の受容細胞へのトランスフェクションまたはトランスフォーメーションは、細胞が発現構築物によってコード化されるＲＮＡまたはタンパク質を発現することを可能にする。発現構築物は、遺伝子操作されたプラスミド、ウイルス、または、例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルス由来の人工的染色体、またはさらに以下で「発現ベクター」に記載された実施形態でありうる。発現構築物は、生きた細胞において複製され、または合成的に製造されうる。本出願において、「発現構築物」、「発現ベクター」、「ベクター」、および「プラスミド」という語は同義的に使用され、一般的な説明的な意味で本発明の用途を示し、発現構築物の特定の型に本発明を限定することは意図されていない。
【００５６】
「発現ベクター」は、下流遺伝子またはコード領域（例えば、タンパク質をコード化し、場合により、コード領域、アンチセンスＲＮＡコード領域の外側に位置する配列、またはコード領域の外側に位置するＲＮＡ配列に作動可能に結合されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）に作動可能に結合された少なくとも１つのプロモーターを含有するＤＮＡ構築物を意味する。発現ベクターの受容細胞へのトランスフェクションまたはトランスフォーメーションは、細胞が発現ベクターによってコード化されるＲＮＡを発現することを可能にする。発現ベクターは、遺伝子操作されたプラスミド、ウイルス、または、例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルス由来の人工的染色体でありうる。かかる発現ベクターは、細菌、ウイルス、またはファージからの配列を含みうる。かかるベクターとしては、染色体、エピソーム、およびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、およびウイル由来ベクター、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント、コスミドおよびファージミド由来など、その組合せ由来のベクターが挙げられる。したがって、１つの例示としてのベクターは二本鎖ＤＮＡファージベクターである。他の例示としてのベクターは二本鎖ＤＮＡウイルスベクターである。
【００５７】
この二本鎖または部分的に二本鎖の分子は、ＤＮＡベクター、ＤＮＡプラスミド、または、細胞における発現のために細胞にポリヌクレオチド配列を送達するように設計された二本鎖ＤＮＡ構築物でありうる。この二本鎖分子は１つの実施形態においては線状であり、他の実施形態においては、この二本鎖分子が環状である。ＤＮＡ分子は、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、および／またはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ、および／またはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、および／またはミトコンドリアプロモーター、および／またはウイルス、細菌、およびバクテリオファージプロモーターを含む、本明細書のほかの場所に記載されたプロモーターの所望の組合せの制御下に配列を含有する二本鎖プラスミドまたはベクターでありうる。好ましくは、プロモーターがＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターである場合、ＲＮＡ分子をコード化する配列は、約３００のヌクレオチドよりも大きい読み取り枠を有し、非センスｍＲＮＡサーベイランス分解機序によって核の分解を回避する。かかるプラスミドまたはベクターは、細菌、ウイルス、またはファージからの配列を含みうる。
【００５８】
「単離」という語は、実質的にまたは基本的に、その自然な状態で存在する物質を通常伴う成分を含まない物質を指すことが意味される。したがって、単離タンパク質は、その原位置の環境に通常付随する物質を含まない。単離核酸は、その内部に通常、自然な状態で存在する配列、例えば、通常、自然な状態でフランキングされる他の染色体配列から単離された遺伝子を実質的に含まず、またはタンパク質および他の分子を含む他の細胞物質を含まない。一般的に、本発明の単離タンパク質または核酸は、純度を測定するための一般に認められた分析的方法によって測定されるように、少なくとも約８０％の純度、通常、少なくとも約９０％、好ましくは、少なくとも約９５％もしくは、さらに９９％超の純度である。本発明において、ポリペプチドはトランスジェニック細胞から精製される。
【００５９】
本明細書で使用される「異種配列」または「異種核酸」は、外来源（または種）由来のもの、または、同じ源由来である場合は、その元の形態から修飾されている。したがって、プロモーターに作動可能に結合されている異種核酸は、プロモーターの由来とは異なる源由来であり、または同じ源由来である場合は、その元の形態から修飾されている。例えば、ＵＤＰグルコース４−エピメラーゼ遺伝子プロモーターは、天然のＵＤＰグルコース４−エピメラーゼとは別のポリペプチドをコード化する構造的遺伝子に結合されうる。異種配列の修飾は、例えば、ＤＮＡを制限酵素で処理し、プロモーターに作動可能に結合されることが可能であるＤＮＡ断片を生成することによって起こりうる。部位特異的突然変異誘発法などの方法も異種配列を修飾するために有用である。
【００６０】
「作動可能に結合され」という語は、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、エンハンサー、または転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列との間の機能的結合を指し、ここで発現制御配列は、適切な分子（例えば、転写アクティベータータンパク質）が発現制御配列に結合されている場合、第２の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に影響を及ぼす。
【００６１】
細胞に関して使用される場合、「組換え」という語は、細胞が異種核酸を複製し、または異種核酸によってコード化されるペプチドまたはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、細胞の天然の（非組換え）形態内には存在しない遺伝子を発現しうる。組換え細胞は、細胞の天然の形態において存在する遺伝子も発現しうるが、ここで遺伝子は修飾され、人工的手段によって細胞へ再導入される。
【００６２】
「少なくとも部分的に二本鎖ＲＮＡを提供する作用物」は、細胞または動物において少なくとも部分的に二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを生成する組成物を意味する。例えば、作用物は、ｄｓＲＮＡ、細胞または動物内部での２本鎖構造（例えば、ヘアピン）が想定される一本鎖ＲＮＡ分子、または同時にもしくは連続的に投与され、かつ細胞または動物内部での２本鎖構造が想定される２つの一本鎖ＲＮＡ分子の組合せでありうる。他の例示的作用物としては、ＤＮＡ分子、プラスミド、ウイルスベクター、または少なくとも部分的にｄｓＲＮＡをコード化する組換えウイルスである。他の作用物は、２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレットに開示されている。一部の実施形態においては、作用物は、１ｎｇ〜２０ｍｇ、１ｎｇ〜１μｇ、１μｇ〜１ｍｇ、または１ｍｇ〜２０ｍｇのＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む。
【００６３】
「アンチセンス」または「アセンチセンス用途」または「アンチセンス技術」または「アンチセンス治療」は、腫瘍遺伝子発現、ウイルス遺伝子発現等を含む遺伝子発現を阻害する方法を意味する。「アンチセンス」ＲＮＡ分子は、標的細胞に存在するタンパク質コード化ＲＮＡの相補物を含有し、したがって、これとハイブリッド形成するものである。アンチセンスＲＮＡのその細胞ＲＮＡ相補物へのハイブリダイゼーションは、おそらくその翻訳可能性を制限することによって、細胞ＲＮＡの発現を阻止しうると考えられている。さまざまな研究が、遺伝子発現の阻害のためにＲＮＡの処理またはアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの細胞への直接導入に及んでいる（Ｂｒｏｗｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓ．４：２４３−５２頁（１９８９年）、Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：１０２８−３２頁（１９８８年）、Ｓｍｉｔｈら、１９８６年、Ｂｕｖｏｌｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９０９１頁（１９８７年））が、これまでのアンチセンスＲＮＡの細胞導入のより有望な手段は、ベクターが細胞へ導入されるとアンチセンスＲＮＡを発現する組換えベクターの構成によるものである。したがって、本発明の多コンパートメント発現系は、特にインビボ使用のための真核細胞におけるアンチセンス分子のより有効な発現にきわめて重要である。
【００６４】
アンチセンスＲＮＡ技術の主な用途は、特異的遺伝子の発現に影響を及ぼす試みに関連している。例えば、Ｄｅｌａｕｎｅｙらは、トランスジェニック植物における遺伝子発現を阻害するアンチセンス転写産物の使用を報告している（Ｄｅｌａｕｎｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３００−０４頁（１９８８年））。これらの著者らは、アンチセンス技術の適用によるＣＡＴ配列でトランスフォームしたタバコ植物におけるクロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼのダウンレギュレーションを報告している。
【００６５】
アンチセンス技術は、さまざまな腫瘍遺伝子の発現を阻害する試みにも適用されている。例えば、Ｋａｓｉｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３５４−６頁（１９８９年）は、アデノウイルス２後期プロモーターの制御下にもたらされるアンチセンス方向でのＣｒａｆ−１ ｃＤＮＡ断片を使用する組換えベクター構築物の調製を報告している。これらの著者らは、この組換え構築物のヒト扁平上皮細胞癌への導入により制御センストランスフェクタントでトランスフェクトした細胞に対して腫瘍形成能の大幅な削減がもたらされたと報告している。同様に、Ｐｒｏｃｈｏｗｎｉｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：３６８３−９５頁（１９８８年）は、分化を加速し、フレンドマウス白血病細胞における分化を加速し、Ｇ１増殖を阻害するｃｍｙｃアンチス構築物の使用を報告している。それに対して、Ｋｈｏｋｈａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：９４７−５０頁（１９８９年）は、マウス組織阻害剤またはメタロプロテイナーゼのレベルを削減するアンチセンスの使用による３Ｔ３細胞に対して発癌性を与えるアンチセンスＲＮＡの使用を開示している。
【００６６】
アンチセンス法では、核酸が「相補的」配列と対を成す傾向があることが駆使される。相補的配列は、標準のワトソン・クリック相補性法則に従って塩基対が可能であるポリヌクレオチドのものである。すなわち、より大きなプリンがより小さなピリミジンと塩基対をなし、シトシンと対をなしたグアニン（Ｇ：Ｃ）、ＤＮＡの場合にチミンと対をなしたアデニン（Ａ：Ｔ）、またはＲＮＡの場合にウラシルと対をなしたアデニン（Ａ：Ｕ）のいずれかの組合せを形成する。例えば、ハイブリッド形成配列におけるイノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンなど一般的ではない塩基の包含は、ペアリングを妨げることはない。ポリヌクレオチドによる二本鎖ＤＮＡのターゲティングは、３本鎖らせん形成をもたらす。ＲＮＡのターゲティングは、２本鎖らせん形成をもたらす。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞へ導入されると、その標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、転写、ＲＮＡ処理、輸送、翻訳、および／または安定性を妨げる。かかるアンチセンスＲＮＡをコード化するＤＮＡは、インビトロまたはインビボのいずれかで、ヒト対象を含む宿主動物内など、遺伝子転写もしくは翻訳または宿主細胞内での両方を阻害するために使用されうる。
【００６７】
「ＤＮＡワクチン」または「ＤＮＡ免疫法」または「ＤＮＡベースのワクチン」または「遺伝子免疫法」は、例えば、免疫法のために、ヒトなど哺乳類生物を含む、宿主生物への抗原の送達用の手段としてのＤＮＡ、例えば、発現構築物の使用を意味する。ワクチン接種および免疫法は、一般に、個体の免疫系が病原体によるチャレンジに対する防御が利用できる免疫応答を開始しうる非毒性剤の導入を指す。免疫系は、主に、通常は個体には存在しないタンパク質および他の大きな分子を識別することによって侵入する「外来」組成物および作用物を識別する。外来タンパク質は、それに対して免疫応答がなされる標的を表す。
【００６８】
ＤＮＡワクチンは、インビボ、またはエキソビボで個体の細胞のいずれかで個体に直接投与される免疫原性ペプチドまたはタンパク質をコード化する遺伝物質を利用する。遺伝物質は、標的される免疫原性タンパク質と少なくともエピトープを共有するペプチドまたはタンパク質をコード化する。遺伝物質は、個体の細胞によって発現され、免疫応答を誘発する免疫原性標的タンパク質を形成する。結果として生じる免疫応答は広範囲にわたり、液性免疫応答に加えて、細胞免疫応答の両側が誘発される。したがって、ＤＮＡベースのワクチン接種法によって誘発される免疫応答は、病原体感染に対して保護するか、過剰増殖性疾患または自己免疫疾患と関連した細胞に対処するのに特に有効である。
【００６９】
個体におけるワクチン接種細胞で生じる標的タンパク質によって誘発される免疫応答は、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）反応を含むＢ細胞およびＴ細胞反応を含む広範囲にわたる免疫応答である。宿主の細胞内に生じる標的抗原が細胞内で処理される。すなわち、小さいペプチドに分解され、クラスＩ ＭＨＣ（主要組織適合複合体）分子によって結合され、細胞表面で発現される。クラスＩ ＭＨＣ標的抗原複合体は、表現型的にキラー／サプレッサ細胞であるＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激することが可能である。したがって、遺伝子による免疫法は、ＣＴＬ反応（キラー細胞反応）を誘発することが可能である。遺伝子による免疫法は他の免疫法よりもＣＴＬ反応を有する可能性がより高いことが確認されている。
【００７０】
ＤＮＡの動物への直接注入は免疫法のための特異的抗原を送達する有望な方法である（Ｂａｒｒｙら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６：６１６−６１９頁（１９９４年）、Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１：１８４７−１８５１頁（１９９３年）、Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２−１５４年（１９９２年）、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７０：３３３８−３３４４頁（１９９３年）、およびＷｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５−１４６８頁（１９９０年））。この方法は、マウスおよびニワトリにおけるインフルエンザウイルスに対する、マウスおよびウシにおけるウシヘルペスウイルス１に対する、およびマウスにおける狂犬病に対する保護的免疫を生成するために有効に使用されている（Ｃｏｘら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５６６４−５６６７頁（１９９３年）、Ｆｙｎａｎら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７８５−７８９年（１９９３年）、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９頁（１９９３年）、およびＸｉａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９：１３２−１４０頁（１９９４年））。ほとんどの場合、強く、さらにきわめて多様な抗体および細胞毒性Ｔ細胞反応が感染の制御と関係があった。実際に、持続的なメモリーＣＴＬを生成する可能性が、不活化ワクチンを含み、かつ抗体反応を生成するものと比べ、この方法を特に魅力的にしている。しかし、核酸送達が比較的不良である傾向がある他のインビボ使用と同様、ＤＮＡワクチンの有効性は本発明の方法によって大いに改善されうる。したがって、本発明の多コンパートメント発現系は、特にインビボ使用のために、真核細胞におけるＤＮＡワクチン分子からの免疫原性ペプチドまたはタンパク質のより有効な発現にきわめて重要である。
【００７１】
「遺伝子発現のレベルの変化」は、遺伝子の生成物、すなわち、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの全体的な量が増加または減少するように、転写、翻訳、もしくはｍＲＮＡまたはタンパク質の安定性における変化を意味する。
【００７２】
「細菌感染」は、病原性細菌による宿主細胞の侵襲を意味する。例えば、感染は、動物の体内または体上に通常存在する細菌の過度の成長、または動物内もしくは動物上に通常存在しない細菌の成長を含みうる。より一般的に、細菌感染は、細菌集団の存在が宿主動物に有害である状況でありうる。したがって、動物は、過度の量の細菌集団が動物の体内または体上に存在している場合、または細菌集団の存在が動物の細胞または組織に損傷を与えていると、細菌感染に「かかっている」。１つの実施形態においては、細菌の特定の属または種の数は、動物において通常存在する数の少なくとも２倍、４倍、６倍、または８倍である。細菌感染は、グラム陽性および／またはグラム陰性細菌による場合もある。
【００７３】
「減少」は、ａ）タンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット分析によって測定）、ｂ）レポーター遺伝子活性（例えば、レポーター遺伝子アッセイによって測定、例えば、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼ活性）、ｃ）ｍＲＮＡ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、または内部制御に対してノーザンブロット分析によって測定、例えば「ハウスキーピング」遺伝子生成物、例えば、β−アクチン、またはグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）など）、またはｄ）細胞機能、例えば、試験サンプルにおけるアポトーシス細胞、移動細胞、増殖細胞、細胞周期停止細胞、侵入性細胞、分化細胞、または脱分化細胞の数によって測定のレベルの低下を意味する。すべての場合に、低下は、好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、かつ最も好ましくは、少なくとも９０％である。本明細書で使用される減少は、ＰＴＧＳ、ＴＧＳ、または他の遺伝子サイレンシング事象の直接または間接の結果である。
【００７４】
「核酸分子」は、１つもしくはそれ以上のリン酸分子が糖質（例えば、ペントースまたはヘキソース）と結合され、これらが次いでプリン由来の塩基（例えば、アデニンまたはグアニン）およびピリミジン由来の塩基（例えば、チミン、シトシン、またはウラシル）と結合される化合物を意味する。特定の天然由来核酸分子としては、ゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびゲノムリボ核酸（ＲＮＡ）のほか、後者のいくつかの異なる形態、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のほか、リボザイムなど触媒ＲＮＡ構造が挙げられる。異なるＲＮＡ分子に相補的である異なるＤＮＡ分子（ｃＤＮＡ）も含まれる。合成ＤＮＡ、またはその天然由来ＤＮＡとハイブリッドのほか、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡ分子（Ｇａｍｂａｒｉ、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．７：１８３９−６２頁（２００１年））も「核酸分子」の定義内に含まれる。
【００７５】
核酸は一般的に２つもしくはそれ以上の共有結合天然由来もしくは修飾デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を有する。修飾核酸としては、例えば、ペプチド核酸および非天然塩基を有するヌクレオチドが挙げられる。修飾としては、以下で「ｄｓＲＮＡ」の定義に記載される化学的および構造的修飾が挙げられる。例えば、「ｄｓＲＮＡ」、「発現ベクター」、および「発現構築物」の定義内、および本明細書のほかの場所に記載されているさまざまな構造も含まれる。
【００７６】
「ｄｓＲＮＡ」は、１７もしくはそれ以上の、好ましくは、少なくとも１９もしくはそれ以上の、二本鎖構造である塩基対の領域を含有する核酸分子を意味する。さまざまな実施形態においては、ｄｓＲＮＡは完全にリボヌクレオドから成り、または、例えば、２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレット、または１９９９年４月２１日出願の米国特許出願第６０／１３０，３７７号明細書によって開示されているＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドなど、リボヌクレオチドとデオキシヌクレオチドの混合物から成る。ｄｓＲＮＡは、分子の一部分のヌクレオチドが分子の他の部分におけるヌクレオチドと塩基対を成すように自己相補の領域を有する単一の分子でありうる。さまざまな実施形態においては、単一の分子から成るｄｓＲＮＡは完全にリボヌクレオチドから成り、またはデオキシリボヌクレオチドの領域と相補的であるリボヌクレオチドの領域を含む。あるいは、ｄｓＲＮＡは二本鎖ｄｓＲＮＡであり、すなわち互いと相補的な領域を有する２つの異なる鎖を含んで成りうる。さまざま実施形態においては、両方の鎖が完全にリボヌクレオチドから成り、一方の鎖が完全にリボヌクレオチドから成り、かつもう一方が完全にデオキシヌクレオチドから成り、または一方もしくは両方がリボヌクレオチドとデオキシヌクレオチドの混合物から成る。好ましくは、相補性の領域は、少なくとも７０、８０、９０、９５、９８、または１００％相補性である。好ましくは、二本鎖構造で存在するｄｓＲＮＡの領域は、少なくとも１９、２０、３０、５０、７５、１００、２００、５００、１０００、２０００、または５０００のヌクレオチドを含み、またはｄｓＲＮＡで表されるｃＤＮＡにおけるヌクレオチドのすべてを含む。一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは、一本鎖末端など一本鎖領域を含有せず、またはｄｓＲＮＡがヘアピンである。他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは１つもしくはそれ以上の一本鎖領域またはオーバーハングを有する。好ましいＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドとしては、アンチセンス鎖または領域である（例えば、標的核酸と少なくとも７０、８０、９０、９５、９８、または１００％相補性を有する）ＤＮＡ鎖または領域、およびセンス鎖または領域である（例えば、標的核酸と少なくとも７０、８０、９０、９５、９８、または１００％同一性を有する）ＲＮＡ鎖または領域、またはその逆もまた同様に挙げられる。さまざまな実施形態においては、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、本明細書に記載され、または２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレット、または１９９９年４月２１日出願の米国特許出願第６０／１３０，３７７号明細書に記載されているものなど酵素または化学合成法を使用してインビトロで行われる。他の実施形態においては、インビトロ合成されたＤＮＡ鎖が、ＤＮＡ鎖の細胞へのトランスフォーメーション前後または同時にインビボまたはインビトロで作られたＲＮＡ鎖と複合される。さらに他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡはセンスおよびアンチセンス領域を含有する単一環状核酸であるか、ｄｓＲＮＡは環状核酸、および第２の環状核酸または線状核酸のいずれかを含む（例えば、２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレット、または１９９９年４月２１日出願の米国特許出願第６０／１３０，３７７号明細書を参照）。例示としての環状核酸としては、ヌクレオチドの遊離５’ホスホリル基がループバック式に他のヌクレオチドの２’ヒドロキシル基に結合されることになるラリアート構造が挙げられる。好ましいｄｓＲＮＡとしては、２００３年７月３１日出願の米国仮出願第６０／３９９，９９８号明細書、「Ｕｓｅ ｏｆ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｈａｔ Ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｅｌｌ」、および２００３年７月３１日出願のＰＣＴ／ＵＳ０３／１２４００２８号明細書、「Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」に開示されている「強制（ｆｏｒｃｅｄ）ヘアピン」および「部分的（ｐａｒｔｉａｌ）ヘアピン」が挙げられる。他の好ましいヘアピンｄｓＲＮＡは、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）または他の同様の酵素と無関係にｓｉＲＮＡ（１９−１７塩基対の短鎖干渉ｄｓＲＮＡ）へ開裂されうる長ｄｓＲＮＡであり、参照によって本明細書で援用される、２００２年１０月１８日出願の米国仮出願第６０／４１９，５３２号明細書、および２００３年１０月２０日出願のＰＣＴＵＳ２００３／３３４６６号明細書を参照。
【００７７】
他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは、糖における２’位置がハロゲン（フッ素基など）を含有するか、または対応する２’位置が水素またはヒドロキシル基を含有する対応するｄｓＲＮＡと比べインビトロまたはインビボでｄｓＲＮＡの半減期を増大させる、アルコキシ基（メトキシ基など）を含有する１つもしくはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは、天然由来のホスホジエステル結合以外の隣接したヌクレオチド間の１つもしくはそれ以上の結合を含む。かかる結合の例としては、ホスホルアミド、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエート結合を含む。他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡが、例えば、２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレット、または１９９９年４月２１日出願の米国特許出願第６０／１３０，３７７号明細書によって開示されているように、１つもしくは２つのキャップド鎖または非キャップド鎖を含有する。他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡはコード配列または非コード配列、例えば、調節配列（例えば、ｍＲＮＡの転写因子結合部位、プロモーター、または５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ））を含有する。また、ｄｓＲＮＡは、２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレット（例えば、８−２２頁を参照）に開示されている少なくとも部分的に二本鎖ＲＮＡ分子のいずれかでありうる。ｄｓＲＮＡ分子のいずれかは、本明細書に記載されている方法を使用して、または２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレット（例えば、１６−２２頁を参照）に記載されているものなど標準の方法を使用してインビトロまたはインビボで発現されうる。
【００７８】
「ｄｓＲＮＡ発現ライブラリー」は、核酸配列、例えば、核酸配列の発現と同時のｄｓＲＮＡを形成することが可能であるｃＤＮＡ配列またはランダム化核酸配列を含有する核酸発現ベクターのコレクションを意味する。好ましくは、ｄｓＲＮＡ発現ライブラリーは、少なくとも１０，０００の独自の核酸配列、より好ましくは、少なくとも５０，０００、１００，０００、または５００，０００の独自の核酸配列、かつ最も好ましくは、少なくとも１，０００，０００の独自の核酸配列を含有する。「独自の核酸配列」は、ｄｓＲＮＡ発現ライブラリーの核酸配列が、完全長配列が比較される場合、ｄｓＲＮＡ発現ライブラリーの他の核酸配列と好ましくは、５０％未満、より好ましくは、２５％または２０％未満、かつ最も好ましくは、１０％の未満の核酸同一性を有することを意味する。配列同一性は、一般的にＢＬＡＳＴ（登録商標）（ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ））またはＢＬＡＳＴ（登録商標）２を使用して測定されるが、デフォルトパラメータは中に指定されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁（１９９０年）、およびＴａｔｉａｎａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０頁（１９９９年）を参照）。このソフトウェアプログラムは、さまざまな置換、欠失、および他の修飾との相同の程度を指定することによって同様の配列にマッチさせる。保存的置換としては一般的に以下の群内の置換が挙げられる。すなわち、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００７９】
ｄｓＲＮＡ発現ライブラリーを生成するためのｃＤＮＡの調製は、例えば、米国公開出願第２００２／０１３２２５７号明細書および欧州公開出願第１２２９１３４号明細書における「Ｕｓｅ ｏｆ ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｈａｔ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｅｌｌ」に記載されており、その開示は参照によって本明細書で援用される。ランダム化核酸ライブラリーは、例えば、その開示が参照によって本明細書で援用される、米国特許第５，６３９，５９５号明細書に記載されているようにも生成され、かつｄｓＲＮＡ介在機能的ゲノム用途に利用されうる。ｄｓＲＮＡ発現ライブラリーは、核で転写され、または細胞の細胞質で転写される核酸配列を含有しうる。ｄｓＲＮＡ発現ライブラリーは、本明細書に記載されている方法を使用して生成されうる。
【００８０】
「強制ヘアピン」は、５’から３’への順で、目的とする第１の領域、第１の塩基対領域、ループ領域、および第２の塩基対領域を有する、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子またはベクター）またはＲＮＡをコード化する核酸分子の集団（例えば、部分または完全ヘアピン）を意味する。第１および第２の塩基対領域は互いに塩基対を成す。好ましくは、核酸はさらに第２の塩基対領域の下流で目的とする第２の領域を含む。目的とする第２の領域が存在する場合は、目的とする第１および第２の領域は互いに塩基対を成す。好ましくは、目的とする第１および第２の領域におけるヌクレオチドの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００％が、互いとワトソン・クリック塩基対合に関与する。これら２つの領域は、同じ長さである場合もあり、または１つもしくはそれ以上のヌクレオチドによって長さが異なる場合もある。例えば、目的とする１つの領域が、目的とする他の領域のいずれかの部分におけるヌクレオチドと塩基対を成していない領域の一端で追加のヌクレオチドを有しうる。関連態様においては、本発明は、これらの核酸によってコード化されるＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の集団を特徴とする。参照によって本明細書で援用される、２００２年７月３１日出願の米国仮出願第６０／３９９，９９８号明細書、「Ｕｓｅ ｏｆ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｈａｔ Ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｅｌｌ」、および２００２年７月３１日出願のＰＣＴ／ＵＳ０３／１２４００２８号明細書、「Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」の開示を参照。
【００８１】
「完全ＲＮＡヘアピン」は、一本鎖オーバーハングなしのヘアピンを意味する。
【００８２】
「細胞の機能」は、測定または評価されうる細胞活性を意味する。細胞機能の例としては、細胞移動性、アポトーシス、細胞成長、細胞侵襲、血管形成、細胞周期事象、細胞分化、細胞脱分化、神経細胞再生、およびウイルス複製を支持する細胞の能力が挙げられるが、これらに限定されない。細胞の機能は、他の細胞、例えば、隣接細胞、細胞と接触している細胞、または細胞が含まれている培地または他の細胞外液と接触している細胞の機能、遺伝子発現、またはポリペプチド生物学的活性に影響を及ぼす場合もある。
【００８３】
「高い厳密性条件」によって、少なくとも４０ヌクレオチドのＤＮＡのプローブ長さで４０℃下での２×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーションが意味される。高い厳密性条件の他の定義については、参照によって本明細書で援用される、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６．３．１−６．３．６頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州（ＮＹ）、１９９４年を参照。
【００８４】
「単離核酸」、「単離核酸配列」、「単離核酸分子」、「単離ｄｓＲＮＡ核酸配列」、または「単離ｄｓＲＮＡ核酸」は、本発明の核酸配列が由来する生物の天然由来ゲノムにおいて、遺伝子をフランキングする遺伝子を含んでいない核酸分子、またはその部分を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクター、例えば、ｄｓＲＮＡ発現ベクターへ、自己複製プラスミドまたはウイルスへ、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡへ組込まれ、または他の配列とは無関係に個別の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるｃＤＮＡもしくはゲノムまたはｃＤＮＡ断片）として存在する、５’または３’フランキング配列の有無による組換えＤＮＡを含む。
【００８５】
「増加」は、ａ）タンパク質（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット分析によって測定）、ｂ）レポーター遺伝子活性（例えば、レポーター遺伝子アッセイによって測定、例えば、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはルシフェラーゼ活性）、ｃ）ｍＲＮＡ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、または内部制御に対してノーザンブロット分析によって測定、例えば「ハウスキーピング」遺伝子生成物、例えば、β−アクチン、またはグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）など）、またはｄ）細胞機能、例えば、試験サンプルにおけるアポトーシス細胞、移動細胞、増殖細胞、細胞周期停止細胞、侵入性細胞、分化細胞、または脱分化細胞の数による測定のレベルの上昇を意味する。好ましくは、増加は、少なくとも１．５倍〜２倍、より好ましくは、少なくとも３倍、かつ最も好ましくは、少なくとも５倍である。本明細書で使用される増加は、ＰＴＧＳ、ＴＧＳ、または他の遺伝子サイレンシング事象の間接的結果でありうる。例えば、ｄｓＲＮＡは、その他の場合には他の核酸分子の発現を阻害しうるサプレッサタンパク質など、タンパク質の発現を阻害しうる。
【００８６】
「長鎖ｄｓＲＮＡ」は、長さが少なくとも４０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００、もしくはそれ以上のヌクレオチドであるｄｓＲＮＡを意味する。一部の実施形態においては、包括的に、長鎖ｄｓＲＮＡは、３０〜１００、１００〜１００００、１００〜１０００、２００〜１０００、または２００〜５００隣接ヌクレオチド間の二本鎖領域を有する。一部の実施形態においては、長鎖ｄｓＲＮＡは、結果としてヘアピン構造の形成がもたらされる、自己相補の領域（例えば、逆方向反復またはタンデムセンスおよびアンチセンス配列）によって二本鎖構造を達成する一本鎖である。１つの実施形態においては、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、機能的タンパク質を産生せず、翻訳されていない。例えば、長鎖ｄｓＲＮＡは翻訳に関与する細胞因子と相互作用するように設計されてはならない。例示としての長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、ポリ−アデニル化配列、タンパク質翻訳に必要なＫｏｚａｋ領域、メチオニン開始コドン、および／またはキャップ構造を欠く。他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡ分子はキャップ構造、１つもしくはそれ以上のイントロン、および／またはポリアデニル化配列を有する。他のかかる長鎖ｄｓＲＮＡ分子としては、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが挙げられる。本発明の方法およびその調製と送達のためのさまざまな手段において使用されうる他のｄｓＲＮＡ分子は、その開示が参照によって本明細書で援用される、２０００年４月１１出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレットに記載されている。
【００８７】
「調節する」は、減少または増加のいずれかによる変更を意味する。本明細書で使用されるように、好ましくは、核酸分子は細胞の機能、細胞における標的核酸分子の発現、または細胞における標的ポリペプチドの生物学的活性を、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％または７５％、かつ最も好ましくは、少なくとも９０％減少させる。また本明細書で使用されるように、好ましくは、核酸分子は細胞の機能、細胞における標的核酸分子の発現、または細胞における標的ポリペプチドの生物学的活性を、少なくとも１．５倍〜２倍、より好ましくは、少なくとも３倍、かつ最も好ましくは、少なくとも５倍、増加させる。
【００８８】
「多重クローニング部位」は、１つもしくはそれ以上の制限酵素の単一の特異的制限酵素認識部位を含有し、かつ核酸配列の挿入部位として役立つＤＮＡプラスミド構築物内の周知の配列を意味する。多重クローニング部位は、ポリリンカーまたはポリクローニング部位とも称される。さまざまなこれら部位が当技術分野で周知である。
【００８９】
「多重エピトープｄｓＲＮＡ」は、多重標的核酸由来の部分を有するか、同じ標的核酸からの非隣接部分を有するＲＮＡ分子を意味する。例えば、多重エピトープｄｓＲＮＡは、（ｉ）単一生物の多重遺伝子を表す配列、（ｉｉ）さまざまな異なる生物からの１つもしくはそれ以上の遺伝子を表す配列、および／または（ｉｉｉ）特定の遺伝子の異なる領域を表す配列（例えば、プロモーターからの１つもしくはそれ以上の配列、およびエクソンなどコード領域からの１つもしくはそれ以上の配列）由来の部分を有しうる。好ましくは、各部分は、標的核酸の対応する領域と実質的な同一配列を有する。さまざまな好ましい実施形態においては、標的核酸と実質的な同一配列を有する部分は、長さが少なくとも３０、４０、５０、１００、２００、５００、７５０、もしくはそれ以上のヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、多重エピトープｄｓＲＮＡは、少なくとも２、４、６、８、１０、１５、２０、もしくはそれ以上の標的遺伝子の発現を、少なくとも２０、４０、６０、８０、９０、９５、または１００％阻害する。一部の実施形態においては、多重エピトープｄｓＲＮＡは、これらの部分の天然に存在する５’から３’への順にあるかどうかにかかわらず同じ標的遺伝子からの非隣接部分を有し、かつｄｓＲＮＡは、唯一の部分を有するｄｓＲＮＡと比べ少なくとも５０、１００、２００、５００、または１０００％多く、核酸の発現を阻害する。
【００９０】
「部分ＲＮＡヘアピン」は、５’または３’オーバーハングなど一本鎖オーバーハングを有するヘアピンを意味する。好ましくは、部分ヘアピンは、核酸（例えば、ＤＮＡ分子またはベクター）によってコード化される。コード化ＲＮＡ分子は、５’〜３’の順で、目的とする第１の領域（領域１）、ループ領域、および目的とする第２の領域（領域２）を有する。目的とする領域は長さが異なり、領域１は、目的とする他の領域（領域２）におけるヌクレオチドと塩基対を成していない領域の一端で追加のヌクレオチドを有する。目的とする一方の領域は標的遺伝子と実質的同一性の配列を含んで成り、目的とする他方の領域は標的遺伝子と実質的相補性の配列を含んで成る。また、「部分」ヘアピンＲＮＡは「強制」ヘアピンＲＮＡでありうるが、この場合、標的遺伝子に対してセンスまたはアンチセンスのいずれかの配列を含む領域１は配列Ａも含み、かつ領域２は、配列Ａの少なくとも一部分と塩基対を成すように設計された配列Ｂを含み、これは「強制して」ＲＮＡをヘアピン構造と見なす働きをする。場合により、領域２は領域１のヌクレオチドと相補的な追加の３’ヌクレオチドを含む。関連態様においては、本発明はこれらの核酸によってコード化されるＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の集団を特徴とする。好ましくは、コード化ＲＮＡは、細胞または動物における標的遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、部分ＲＮＡヘアピンは、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼにより（例えば、細胞または動物において）インビトロまたはインビボで伸張される。好ましくは、部分ヘアピンの伸張は完全ヘアピンをもたらす。参照によって本明細書で援用される、２００３年７月３１日出願の米国仮出願第６０／３９９，９９８号明細書、「Ｕｓｅ ｏｆ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｈａｔ Ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｅｌｌ」、および２００２年７月３１日出願のＰＣＴ／ＵＳ０３／１２４００２８号明細書、「Ｄｏｕｂｌｅ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」の開示を参照。
【００９１】
「表現型」は、例えば、分子、高分子、構造、代謝、エネルギー利用、組織、器官、反射、および挙動など検出可能または観察可能な外面上の物理的な発現のほか、検出可能な構造、機能、または細胞、組織、または生物の挙動の一部であるすべてを意味する。本発明の方法において特に有用なのは、ｄｓＲＮＡ介在変化であり、ここでは検出可能な表現型は、細胞の機能の調節、標的核酸の発現の調節、または標的核酸分子に対するｄｓＲＮＡ効果による標的ポリペプチドの生物学的活性の調節に由来する。
【００９２】
「ポリペプチド生物学的活性」は、細胞機能を調節する標的ポリペプチドの能力を意味する。ポリペプチド生物学的活性のレベルは、当技術分野で周知の標準アッセイを使用することによって直接測定されうる。例えば、ポリペプチド生物学的活性の相対レベルは、標的ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡのレベル（例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅またはノーザンブロット分析によって）、標的ポリペプチドのレベル（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット分析によって）、標的ポリペプチド転写調節領域の転写調節下のレポーター遺伝子の活性（例えば、下記のとおり、レポーター遺伝子アッセイによって）、他の分子、例えば、標的ポリペプチドによって活性化され、または標的ポリペプチド活性を阻害するポリペプチドと標的ポリペプチドの特異的相互作用（例えば、２ハイブリッドアッセイ）、または標的ポリペプチドのリン酸化またはグリコシル化状態を測定することによって評価されうる。細胞、細胞抽出物、または他の実験サンプル内の標的ポリペプチドのレベル、標的ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡ、またはレポーター遺伝子活性を増加させるｄｓＲＮＡなどの化合物は、標的ポリペプチドの生物学的活性を刺激するか、増加させる化合物である。細胞、細胞抽出物、または他の実験サンプル内の標的ポリペプチドのレベル、標的ポリペプチドをコード化するｍＲＮＡ、またはレポーター遺伝子活性を減少させるｄｓＲＮＡなどの化合物は、標的ポリペプチドの生物学的活性を減少させる化合物である。
【００９３】
「プロモーター」は、ｐｏｌ Ｉプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ミトコンドリアプロモーター、およびウイルス、細菌、および転写をドライブすることが可能な他のプロモーター配列を含む遺伝子の転写を誘導するのに十分な最小の配列を意味する。この定義には、細胞型特異的、組織特異的、または時間特異的方法で制御可能なプロモーター依存遺伝子発現を与えるのに十分であるか、または外部シグナルもしくは作用物によって誘導性である、転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）も含まれ、当業者には公知であるかかるエレメントは、遺伝子の５’または３’領域またはイントロン内にありうる。好ましくは、プロモーターが作動可能に核酸配列、例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子、または生物学的活性のＲＮＡをコード化する核酸配列に、例えば、ｍＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ｄｓＲＮＡおよび一本鎖ヘアピン形成ｄｓＲＮＡを含む）、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、トリプレックス形成ＲＮＡ、および、場合により、ポリペプチド生成物へ翻訳することが可能であるｍＲＮＡとして核酸配列の発現を可能にするような方法で結合される。本発明において、プロモーターは、プロモーターが転写活性である真核細胞の特異的細胞内コンパートメント、例えば、細胞質（細胞質プロモーター）、ミトコンドリア（ミトコンドリアプロモーター）、核（核プロモーター）、および非核核小体（核小体プロモーター）のほか、ＨＤＡＣ（ヒストンデアセチラーゼ複合体）など機能的に異なったコンパートメントに従って分類される。プロモーターは、それらが真核細胞の異なった細胞内コンパートメントで転写活性であるため、「サブコンパートメント特異的」または「コンパートメント特異的」である。例えば、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーター（ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩによって転写を開始する）は核（非核小体）プロモーターであり、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩによって転写を開始する）は核小体プロモーターであり、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉプロモーター（ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉによって転写を開始する）は核小体プロモーターであり、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３、および他のバクテリオファージプロモーターはそのそれぞれのＲＮＡポリメラーゼ（ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ）の存在下に細胞質において活性であり、ミトコンドリアプロモーター、例えば、ヒト軽鎖プロモーター、ヒト重鎖プロモーター、および、ミトコンドリアにおいて転写活性であるマウス、モルモット、ウサギ、およびさまざまな霊長類プロモーターなど動物プロモーターである（２００２年９月６日公開の国際公開第０２／０６８６２９号パンフレット、Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎらの開示を参照）。本発明において、適切なプロモーターは周知の天然由来のプロモーターだけではなく、選択された細胞内コンパートメントにおいて転写を開始するように設計された合成的および半合成的プロモーターを含むことが理解されるであろう。例えば、ＰａｃｈｕｋとＳａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎの２００３年４月２２日出願の米国特許出願第６０／４６４，４３４号明細書、および２００２年４月２２日出願のＰＣＴ ＵＳ０２／３３６６９号明細書「トランスフェクション動力学および構造的プロモーター（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」の強制開放パドロックプロモーター、およびキメラプロモーターを含む構造的プロモーターを参照。
【００９４】
１つもしくはそれ以上のプロモーターが、ｌａｃ（Ｃｒｏｎｉｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１５０６−１５１７頁（２００２年））、ａｒａ（Ｋｈｌｅｂｎｉｋｏｖら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：７０２９−３４頁（２０００年））、ｅｃｄｙｓｏｎｅ（レオジェン（Ｒｈｅｏｇｅｎ）、ｗｗｗ．ｒｈｅｏｇｅｎｅ．ｃｏｍ）、ＲＵ４８（メフェプリストン（ｍｅｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ））（コルチコステロイド拮抗薬）（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：８４８３−８８頁（１９９９年））、またはｔｅｔプロモーター（Ｒｅｎｄａｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１３：３３５−４２頁（２００２年）、Ｌａｒｎａｒｔｉｎａら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９９−２１０頁（２００２年））、または２００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレットに開示されているプロモーターなどの誘導性プロモーターでありうる。誘導性プロモーターが使用される場合、適切なシグナルまたは刺激の供給によって必要に応じて誘発されることが可能であるという点で「転写活性」と考えられる。
【００９５】
「タンパク質」または「ポリペプチド」または「ポリペプチド断片」は、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係なく３個のアミノ酸以上の鎖を意味し、天然由来ポリペプチドまたはペプチドの全部または部分を構成し、または非天然由来ポリペプチドまたはペプチドを構成する。
【００９６】
「レポーター遺伝子」は、その発現が検出可能であり、かつ／または免疫学的、化学的、生化学的、または生物学的アッセイによって定量化されうる生成物をコード化する遺伝子を意味する。レポーター遺伝子生成物は、例えば、以下の属性の１つを制限なしに有しうる：蛍光（例えば、緑色蛍光タンパク質）、酵素活性（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、毒性（例えば、リシンＡ）、または追加の分子（例えば、非標識抗体、次いで標識二次抗体、またはビオチン、または検出可能標識抗体）によって特異的に結合される能力。当業者が容易に利用可能であるレポーター遺伝子の加工変形も制限なしに前記定義に包含されることが理解される。
【００９７】
「リボザイム」は、特異的配列でＲＮＡ切断の触媒が可能である触媒ＲＮＡポリヌクレオチドを意味する。リボザイムは、例えば、特定のｍＲＮＡを攻撃するために有用である。例えば、慢性骨髄性白血病においては、遺伝子ｂｃｒおよびａｂｌ（フィラデルフィア染色体）を含む染色体転座の結果として、ｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質の発現が生じ、これはａｂｌ腫瘍タンパク質の異常な機能の結果と考えられている。ｂｃｒ遺伝子とａｂｌ遺伝子との融合は２つのイントロンの１つの内部の部分で起こるため、スプライスされたｂｃｒ−ａｂｌ融合転写産物はｂｃｒエクソンとａｂｌエクソンとの間のスプライス部位で２つのみの可能な配列を含有する。ｂｃｒ−ａｂｌ ｍＲＮＡがこの発癌性染色体転座を受けたリンパ球様細胞においてのみ生じると、２つのｂｃｒ−ａｂｌ融合ｍＲＮＡスプライス部位のいずれかに特異的なリボザイムが調製され、したがって、対応する腫瘍タンパク質の発現を阻害しうる。米国特許第６，０８０，８５１号明細書、「Ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｗｉｔｈ ｌｉｎｋｅｄ ａｎｃｈｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｐａｃｈｕｋらを参照。
【００９８】
「選択的条件」によって、特異的細胞または細胞群が選択を受けることができる条件が意味される。例えば、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）のパラメータを調節し、特異的細胞または細胞群を識別することができる。当業者に周知の方法である細胞パニングが、選択的条件を使用する他の方法である。
【００９９】
「短鎖ｄｓＲＮＡ」は、二本鎖構造である長さが４５、４０、３５、３０、２７、２５、２３、２１、２０、１９、１８、最小１７個のヌクレオチドを有するｄｓＲＮＡを意味する。好ましくは、短鎖ｄｓＲＮＡは少なくとも長さが１９塩基対である。好ましい実施形態においては、二本鎖領域は、包括的に、長さが１９〜４５、１９〜４０、１９〜３０、１９〜２０、１９〜２５、２０〜２５、２１〜２３、２５〜３０、または３０〜４０の隣接塩基対である。一部の実施形態においては、短鎖ｄｓＲＮＡは、包括的に、全長が３８〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、４００〜５００、５００〜７００、７００〜１０００、１０００〜２０００、または２０００〜５０００個のヌクレオチドであり、独立して、包括的に、長さが１７、１８、または１９および４５個の隣接塩基対である、１つもしくはそれ以上の二本鎖領域を有する。１つの実施形態においては、短鎖ｄｓＲＮＡは完全に二本鎖である。一部の実施形態においては、短鎖ｄｓＲＮＡは長さが１９〜３０個の塩基対であり、完全なｄｓＲＮＡは二本鎖である。他の実施形態においては、短鎖ｄｓＲＮＡｇは１つもしくはそれ以上の一本鎖領域を有する。特定の実施形態においては、短鎖ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ介在ストレス反応経路においてＰＫＲ（タンパク質キナーゼＲＮＡ誘導性）または他のタンパク質に結合する。好ましくは、短鎖ｄｓＲＮＡは、ＰＫＲの二量化および活性化を少なくとも２０、４０、６０、８０、９０、または１００％阻害する。一部の好ましい実施形態においては、短鎖ｄｓＲＮＡは、長鎖ｄｓＲＮＡのＰＫＲまたはｄｓＲＮＡ介在ストレス反応経路の他の成分への結合を少なくとも２０、４０、６０、８０、９０、または１００％阻害する。
【０１００】
「特異的にハイブリッド形成する」は、標的核酸分子をハイブリッド形成するが、もちろん、変性条件下に評価されると、標的核酸分子を含む、実質的にサンプル（例えば、細胞からのサンプル）における他の核酸分子をハイブリッド形成することがないｄｓＲＮＡを意味する。１つの実施形態においては、ｄｓＲＮＡをハイブリッド形成し、これと関連した標的核酸分子の量は、標準アッセイを使用して測定すると、ｄｓＲＮＡをハイブリッド形成し、またはこれと関連した対照核酸分子の量の２倍、好ましくは、５倍、より好ましくは、１０倍、および最も好ましくは、５０倍多い。
【０１０１】
「標的核酸分子の発現を特異的に阻害する」は、細胞または生物学的サンプルにおける標的核酸分子の発現の阻害が、標的核酸分子のそれと９９、９５、９０、８０、または７０％未満同一または相補的である配列を有する非標的核酸分子の発現の阻害よりも大きな程度に生じることを意味する。好ましくは、非標的分子の発現の阻害は、標的核酸分子の発現の阻害よりも２倍、好ましくは、５倍、より好ましくは、１０倍、かつ最も好ましくは、５０倍少ない。
【０１０２】
ヌクレオチド配列が実質的に同一である指標は、２つの分子が互いに厳密性条件下にハイブリッド形成する場合である。厳密性条件は配列依存であり、異なる環境において異なる。一般に、厳密性条件は、明確なイオン強度およびｐＨでの特異的配列に対する熱融点（Ｔｍ）よりも低い、約５℃〜約２０℃、通常、約１０℃〜約１５℃であるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブをハイブリッド形成する（明確なイオン強度およびｐＨ下の）温度である。一般的に、厳密性条件は、塩分濃度がｐＨ７で約０．０２モルであり、温度が少なくとも約６０℃である条件である。例えば、標準のサザンハイブリダイゼーション法においては、厳密性条件は、４２℃下での６×ＳＳＣでの初期洗浄後、少なくとも約５５℃、一般的には約６０℃、かつしばしば約６５℃の温度での０．２×ＳＳＣにおける１回もしくはそれ以上の追加の洗浄を含む。
【０１０３】
「実質的な配列相補性」は、核酸が標的核酸分子の発現を阻害するために、ｄｓＲＮＡまたは他の生物学的活性核酸と標的核酸分子との間の十分な配列相補性を意味する。好ましくは、ｄｓＲＮＡの配列は、標的核酸分子の領域の配列と少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００％相補性である。
【０１０４】
「実質的な配列同一性」は、ｄｓＲＮＡが核酸分子の発現を阻害するために、ｄｓＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡと標的核酸分子との間の十分な配列同一性を意味する。好ましくは、ｄｓＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの配列は、標的核酸分子の領域の配列と少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００％同一性である。
【０１０５】
「標的」、「標的核酸」、「標的遺伝子」、「標的ポリヌクレオチド」、または「標的ポリヌクレオチド配列」は、その発現が転写後遺伝子サイレンシング、転写遺伝子サイレンシング、またはアンチセンス、リボザイム切断等など他の配列特異的ｄｓＲＮＡ介在阻害の結果調節される、天然由来、かつ場合により欠陥のあるポリヌクレオチド配列、または細胞内もしくは細胞外の病原性感染または疾患により存在する異種配列に関係なく、真核細胞、植物または動物、脊椎動物または無脊椎動物、哺乳類、鳥類等に存在する核酸配列を意味する。本明細書で使用される「標的」、「標的核酸」、「標的遺伝子」、または「標的ポリヌクレオチド配列」は、ＰＴＧＳ、転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）、または他の遺伝子サイレンシング事象が起こる細胞においてか、または隣接細胞において、またはＰＴＧＳ、ＴＧＳ、または他の遺伝子サイレンシング事象を受けた細胞が含まれる培地または他の細胞外液と接触する細胞においてありうる。かかる「標的」、「標的核酸」、「標的遺伝子」、または「標的ポリヌクレオチド配列」はコード配列でありうる、すなわち、タンパク質またはその機能的断片を発現するように翻訳されるかどうかに関係なく、ｍＲＮＡを含むＲＮＡへ転写される。あるいは、非コードであるが、プロモーター、エンハンサー、レプレッサ、または他の調節エレメントを含む調節機能を有しうる。「遺伝子」という語は、プロモーターなど調節配列を含む、転写および／または翻訳されているかどうかに関係なく、「サイレンスされる」ことが意図された標的配列を含むことが意図されている。
【０１０６】
例示としての「標的」、「標的核酸」、「標的遺伝子」、または「標的ポリヌクレオチド配列」分子としては、腫瘍遺伝子など癌または異常な細胞成長と関連した核酸分子、および常染色体優性または劣勢疾患と関連した核酸分子が挙げられる（例えば、国際公開第００／６３３６４号パンフレット、国際公開第００／４４９１４号パンフレット、および国際公開第９９／３２６１９号パンフレットを参照）。好ましくは、アンチセンスＲＮＡ、トリプレックス形成ＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡは、優性疾患と関連した突然変異を有する核酸分子の対立遺伝子の発現を阻害し、実質的に核酸分子の他の対立遺伝子（例えば、疾患と関連した突然変異なしの対立遺伝子）を阻害することはない。他の例示としての「標的」、「標的核酸」、「標的遺伝子」、または「標的ポリヌクレオチド配列」分子としては、ウイルス、細菌、酵母、原虫、または寄生虫など病原体の感染または増殖に必要とされるコードおよび非コード領域を含む宿主細胞核酸分子および病原体核酸分子が挙げられる。
【０１０７】
「標的ポリペプチド」は、その生物学的活性が、アンチセンス、リボザイム切断等などを含む遺伝子サイレンシングまたは他の配列特異的ＲＮＡ介在機序の結果として調節されるポリペプチドを意味する。本明細書で使用される標的ポリペプチドは、ＰＴＧＳ、ＴＧＳ、または他の配列特異的調節が起こる細胞においてあり、または隣接細胞において、またはＰＴＧＳ、ＴＧＳ、または他の遺伝子サイレンシング事象を受けた細胞が含まれる培地または他の細胞外液と接触する細胞においてありうる。
【０１０８】
「トランスフォーメーション」または「トランスフェクション」は、外来分子を細胞（例えば、細菌、酵母、真菌、藻類、植物、昆虫、または動物細胞、特に脊椎動物または哺乳類細胞）へ導入するための方法を意味する。リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、マイクロインジェクション、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、ウイルスまたはレトロウイルス送達、エレクトロポレーション、および遺伝子銃トランスフォーメーションは、当業者に周知のトランスフォーメーション／トランスフェクション法のほんの一部である。ＲＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターは裸のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは局所麻酔複合ＲＮＡまたはＤＮＡでありうる（Ｐａｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４６８：２０−３０頁（２０００年））。他の標準トランスフォーメーション／トランスフェクション法および他のＲＮＡおよび／またはＤＮＡ送達剤（例えば、陽イオン性脂質、リポソーム、またはブピバカイン）は、２０００年４月１９日出願の国際公開第００／６３３６４号パンフレット（例えば、１８−２９頁を参照）に記載されている。ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ発現構築物は、米国特許第５，８３７，５３３号明細書、同第６，１２７，１７０号明細書、または同第６，３７９，９６５号明細書（Ｂｏｕｔｉｎ）の多機能分子複合体、または２００３年５月６日出願のＰＣＴ／ＵＳ０３／１４２８８号明細書（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）の多機能分子複合体または油／水陽イオン両親媒性エマルジョンとも複合されうる。市販のキットも使用し、ＲＮＡまたはＤＮＡを細胞に送達することができる。例えば、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）（Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州（Ｃａｌ．）のトランスメッセンジャーキット、キセラゴン社（Ｘｅｒａｇｏｎ Ｉｎｃ．）のＲＮＡキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）から入手可能）、およびＤＮＡエンジン社（ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｉｎｃ．）（Ｓｅａｔｔｌｅ、ワシントン州（ＷＡ））のＲＮＡキットを使用し、単一またはｄｓＲＮＡを細胞へ導入することができる。
【０１０９】
「形質転換細胞」または「トランスフェクト細胞」は、核酸分子、例えば、ｄｓＲＮＡまたは二本鎖発現ベクターが、組換え核酸法によって導入されている細胞（または細胞の子孫）を意味する。かかる細胞は、安定して、または一時的にトランスフェクトされうる。
【０１１０】
「癌を治療、安定化、または予防する」は、腫瘍のサイズの削減を引き起こすか、腫瘍のサイズの増大を遅延または阻止するか、腫瘍の消失とその再出現との疾患のない生存時間を増大するか、腫瘍の初期またはその後の発生を阻止するか、または腫瘍と関連した有害な症状を削減または安定化することを意味する。１つの実施形態においては、治療を生き残る癌細胞のパーセンテージは、標準のアッセイを使用して測定されるように、癌細胞の初期の数よりも少なくとも２０、４０、６０、８０、または１００％低い。好ましくは、本発明の組成物の投与によってもたらされる癌細胞の数の減少は、非癌細胞の数の減少よりも少なくとも２、５、１０、２０、または５０倍多い。さらに他の実施形態においては、本発明の組成物の投与後に存在する癌細胞の数は、賦形剤対照の投与後に存在する癌細胞の数よりも少なくとも２、５、１０、２０、または５０倍少ない。好ましくは、本発明の方法は、標準の方法を使用して測定される腫瘍のサイズの２０、４０、６０、８０、または１００％の減少をもたらす。好ましくは、治療対象の少なくとも２０、４０、６０、８０、９０、または９５％が、癌の全証拠が消失する完全寛解を示す。好ましくは、癌は再発することなく、または少なくとも５、１０、１５、または２０年後に再発する。他の好ましい実施形態においては、患者が癌と診断され、本発明の組成物で治療された後に生存する期間は、（ｉ）未治療患者が生存する平均期間、または（ｉｉ）他の療法で治療された患者が生存する平均期間と比べ少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、２００、または５００％長い。
【０１１１】
「疾患または障害を治療、安定化、または予防する」は、疾患または障害の初期またはその後の発生を阻止するか、または遅延させるか、病状の消失とその再発との間の疾患のない生存期間を増大させるか、病状と関連した有害な症状を安定化または削減するか、または病状の進行を抑制または安定化することを意味する。これは、ウイルス、細菌、または真菌など感染性病原体による感染前の治療が確立しており、感染の重篤度または期間を阻止するか、または削減する予防的治療を含む。好ましくは、治療対象の少なくとも２０、４０、６０、８０、９０、または９５％が、疾患の全証拠が消失する完全寛解を示す。他の実施形態においては、患者が病気と診断され、本発明の組成物で治療された後に生存する期間は、（ｉ）未治療患者が生存する平均期間、または（ｉｉ）他の療法で治療された患者が生存する平均期間と比べ少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、２００、または５００％長い。
【０１１２】
「インターフェロン反応またはｄｓＲＮＡストレス反応を阻害または阻止する条件下」は、細胞毒性、細胞死、抗増殖反応、またはＰＴＧＳまたはＴＧＳ事象を行うｄｓＲＮＡの能力減少を含む１つもしくはそれ以上のインターフェロン反応または細胞ＲＮＡストレス反応を阻止または阻害する条件を意味する。これらの反応としては、インターフェロン誘導（Ｉ型およびＩＩ型）、１つもしくはそれ以上のインターフェロン刺激遺伝子の誘導、ＰＫＲ活性化、２’５’−ＯＡＳ（オリゴアデニル酸シンセターゼ）活性化、および下流細胞および／またはこれらの反応の１つもしくはそれ以上の活性化／誘導に起因する生物続発症が挙げられるが、これらに限定されない。「生物続発症」は、ストレス反応によって引き起こされる動物全体、器官、またはより局所（例えば、注入部位）における効果を意味する。例示としての徴候としては、サイトカイン産生の上昇、局所炎症、および壊死が挙げられる。好ましくは、これらの反応を阻害する条件は、状態を阻害するかかるインターフェロン反応にさらされていない細胞と比べ９５％、９０％、８０％、７５％、６０％、４０％、または２５％以下、かつ最も好ましくは、１０％以下の細胞が細胞毒性、細胞死、またはＰＴＧＳ、ＴＧＳ、または他の遺伝子サイレンシング事象を行う能力減少を受けるようにすることであり、他の状態はすべて同等である（例えば、同じ細胞型、同じｄｓＲＮＡ発現ライブラリーによる同じトランスフォーメーション）。
【０１１３】
アポトーシス、インターフェロン誘導、２’５’−ＯＡＳ活性化／誘導、ＰＫＲ誘導／活性化、抗増殖反応、および細胞変性効果はすべてＲＮＡストレス反応経路の指標である。本明細書に記載されるＲＮＡストレス反応の誘導を測定するために使用されうる例示としてのアッセイとしては、アポトーシス細胞を検出するＴＵＮＥＬアッセイ、アルファ、ベータ、およびガンマインターフェロンの誘導を検出するＥＬＩＳＡアッセイ、２’５’−ＯＡＳの活性化を検出するリボソームＲＮＡ断面化分析、ＰＫＲ活性化の指標としてのリン酸化ｅｌＦ２ａの測定、細胞増殖の変化を検出する増殖アッセイ、および細胞の細胞変性効果を確認する細胞の顕微鏡分析が挙げられる。好ましくは、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ発現ベクターにより形質転換された細胞におけるインターフェロン反応またはｄｓＲＮＡストレス反応のレベルは、本明細書に記載されたアッセイの１つを使用して測定されるように、同じ条件下に偽トランスフェクト対照細胞における対応するレベルよりも２０、１０、５、または２倍未満大きい。他の実施形態においては、本発明の方法を使用するｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ発現ベクターにより形質転換された細胞におけるインターフェロン反応またはｄｓＲＮＡストレス反応のレベルは、他のすべての状態が同等である、状態を阻害するかかるインターフェロン反応にさらされていない対応する形質転換細胞における対応するレベルよりも５００％、２００％、１００％、５０％、２５％、または１０％未満大きい。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、細胞転写または翻訳の広範囲の阻害を誘発することはない。
【０１１４】
「ウイルス感染」は、宿主細胞のウイルスによる侵襲を意味する。例えば、感染は、動物の体内または体上に通常存在するウイルスの過剰な成長、または動物内または上に通常存在しないウイルスの成長を含みうる。より一般には、ウイルス感染は、ウイルス集団の存在が宿主動物に有害である状態でありうる。したがって、動物は、過剰量のウイルス集団が動物の体内または体上に存在する場合、またはウイルス集団の存在が動物の細胞または他の組織に有害である場合に、ウイルス感染に「罹って」いる。
【０１１５】
好ましい実施形態においては、本発明の方法に関するウイルス感染は、以下のウイルスの１つもしくはそれ以上による感染である。すなわち、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ピコルナリルス（ｐｉｃｏｒｎａｒｉｒｕｓ）、ポリオ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、コクサッキー、単純ヘルペスウイルス１型および２型、セントルイス脳炎、エプスタイン・バー、ミクソウイルス、ＪＣ、コクサッキーウイルスＢ、トガウイルス、麻疹、パラミクソウイルス、エコーウイルス、ブンヤウイルス、サイトメガロウイルス、水痘−帯状疱疹、ムンプス、馬脳炎、リンパ球性脈絡髄膜炎、狂犬病、サルウイルス４０、ヒトポリオーマウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルス、霊長類アデノウイルス、コロナウイルス、レトロウイルス、デング熱、黄熱病、日本脳炎ウイルス、および／またはＢＫを含むラボドウイルス（ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｕｓｅｓ）。一部の実施形態においては、第１のｄｓＲＮＡは、ウイルスに感染した細胞または動物におけるウイルス核酸の発現を阻害する。
【０１１６】
本発明の治療および予防的方法に特に適切なのは、ＤＮＡウイルス、または中間ＤＮＡ段階を有するウイルスである。かかるウイルスの中には、限定されることなく、レトロウイルス種、ヘルペスウイルス種、ヘパデノウイルス種、ポックスウイルス種、パルボウイルス種、パピロルナウイルス種、およびパポバウイルス種のウイルスが含まれる。特に、この方法で治療するより好ましいウイルスの一部としては、限定されることなく、ＨＩＶ、ＨＢＶ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、（ヒトＴ−リンパ球ウイルス（ＨＴＬＶ）、およびエプスタイン・バー（ＥＢＶ）が挙げられる。この方法で使用される薬剤は、哺乳類の細胞に少なくとも部分的に本明細書に記載された二本鎖ＲＮＡ分子を提供し、これは感染哺乳類細胞におけるウイルスの複製および／または病原に必要なウイルスポリヌクレオチド配列である標的ポリヌクレオチドと実質的に相同の二本鎖配列を含む。かかる標的ポリオヌクレオチド配列の中には、ウイルスの増殖に必要なタンパク質の配列、例えば、特に、ＨＩＶｇａｇ、ｅｎｖ、およびｐｏｌ遺伝子、ＨＰＶ１６ＬＩおよびＥ２遺伝子、ＨＰＶ１１ＬＩおよびＥ２遺伝子、ＨＰＶ１６Ｅ６およびＥ７遺伝子、ＢＰＶ１８Ｅ６およびＥ７遺伝子、ＨＢＶ表面抗原、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ逆転写酵素、ＨＳＶｇＤ遺伝子、ＨＳＶｖｐ１６遺伝子、ＨＳＶｇＣ、ｇＨ、ｇＬおよびｇＢ遺伝子、ＨＳＶＩＣＰＯ、ＩＣＰ４およびＩＣＰ６遺伝子、水痘帯状疱疹ｇＢ、ｇＣおよびｇＨ遺伝子、およびＢＣＲ−ａｂｌ染色体配列、および細胞から細胞への感染の移動に必要な調節機能を提供する非コードウイルスポリヌクレオチド配列、例えば、ＨＩＶＬＴＲ、および他のウイルスプロモーター配列、例えば、ＨＳＶｖｐ１６プロモーター、ＨＳＶ−ＩＣＰＯプロモーター、ＨＳＶ−ＩＣＰ４、ＩＣＰ６、およびｇＤプロモーター、ＨＢＶ表面抗原プロモーター、ＨＢＶプレ−ゲノムプロモーターをコード化するタンパク質がある。
【０１１７】
したがって、この方法を使用し、ＨＩＶなどのウイルスにすでに感染した哺乳類対象を治療し、ＨＩＶｇａｇなどウイルス複製および／または病原に必須のウイルス遺伝子機能を停止し、または阻害することができる。あるいは、この方法を使用し、潜在ウイルス、例えば、水痘帯状疱疹ウイルスとして哺乳類に存在し、かつ帯状疱疹として周知の疾患の原因物質であるウイルスの機能を阻害することができる。同様に、少なくとも部分的に、ウイルス、細菌、または他の病原体によって引き起こされることが証明されているアテローム性動脈硬化、潰瘍、慢性疲労症候群、および自己免疫疾患、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の再発、ＨＰＶ持続感染、例えば、陰部疣贅、および特に慢性ＢＢＶ感染などの疾患が、哺乳類対象におけるウイルス複製および／または病原に必須の特定のウイルスポリヌクレオチド配列を標的することによって、この方法に従って治療されうる。
【０１１８】
さらに本発明の上記の「抗ウイルス」法の他の類似の実施形態としては、哺乳類においてウイルス誘発性癌の治療または予防の方法が挙げられる。かかる癌としては、ＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７ウイルス誘発性子宮頸癌、ＨＴＬＶ誘発性癌、および、特にバーキットリンパ腫などＥＢＶ誘発性癌が挙げられる。この方法は、本明細書に記載されている、標的ポリヌクレオチドが腫瘍抗原またはその機能的断片をコード化する配列であるか、その抗原または配列機能が哺乳類における腫瘍の維持に必要である非発現制御配列である組成物を哺乳類に投与することによって達成される。かかる配列の中には、限定されることなく、ＨＰＶ１６Ｅ６およびＥ７配列およびＨＰＶ１８Ｅ６およびＥ７配列が含まれる。その他は当業者によって容易に選択されうる。組成物は、哺乳類における抗原も機能を削減または阻害するのに有効な量で投与され、好ましくは、本明細書に記載されている組成成分、投与量、および投与経路を使用する。
【０１１９】
転写および転写後遺伝子サイレンシング
転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）は、遺伝子発現のサイレンシングがＲＮＡ転写のレベルで起こる現象である。二本鎖ＲＮＡは、ＴＧＳおよび転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を仲介するが、ｄｓＲＮＡは核（好ましくは、核小体、より好ましくは、核コンパートメントと核小体）に位置していることが必要であり、好ましくは、ＴＧＳを仲介するために核で作られる。ＰＴＧＳは細胞質で起こる。本明細書では、ＴＧＳ、ＰＴＧＳ、または両方を仲介しうる多くのｄｓＲＮＡ構造およびｄｓＲＮＡ発現ベクターが描写されている。ＴＧＳ、ＰＴＧＳ、または両方のさまざまな方法が以下に示されている。
【０１２０】
本明細書に記載されている細胞質ｄｓＲＮＡ発現ベクターのすべては、ｄｓＲＮＡが標的ｍＲＮＡと干渉する細胞質でｄｓＲＮＡを生成するため、ＰＴＧＳを仲介する。これらのベクターによって作られるｄｓＲＮＡの一部は受動的過程によって核にトランスロケーションするため（例えば、有糸分裂中の核エンベロープ変性および矯正により）、これらのベクターは分裂細胞において低効率でＴＧＳに影響を及ぼすことも予想される。
【０１２１】
ＴＧＳを増強するために、発現ベクターにはさらに、これら選択ポリヌクレオチド配列を転写が起こる分子でトランスフェクトした細胞の核にターゲットする核局在化シグナルが提供されうる。適切な核局在化シグナルは当業者に周知であり、本発明の限定ではない［例えば、Ｄ．Ａ．Ｄｅａｎ、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２３０：２９３−３０２頁（１９９７年）を参照］。
【０１２２】
ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩベクターは、細胞質に入るさまざまな能力で核におけるＲＮＡ分子を発現する。必要に応じて、１つもしくはそれ以上の構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）配列を添加し、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩによって核で作られる異なるエフェクターＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ヘアピン、または二本鎖ｄｓＲＮＡ）の細胞質輸送を可能にする。イントロンおよび／またはポリＡ配列の代わりに、かつ／またはそれに加えてＣＴＥを使用し、輸送を促進することができる。ＣＴＥの好ましい位置は、ＲＮＡ分子の３’末端近くである。必要に応じて、多重ＣＴＥ配列（例えば、２、３、４、５、６、もしくはそれ以上の配列を使用することができる）。好ましいＣＴＥは、Ｍａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス由来である（米国特許第５，８８０，２７６号明細書および同第５，５８５，２６３号明細書）。
【０１２３】
ポリアデニル化シグナルと組合わせて機能的イントロンまたはＣＴＥをコード化するベクターは、より有効にｄｓＲＮＡを細胞質に輸出する。（ｉ）イントロンまたはＣＴＥのみを有し、ポリアデニル化シグナルを有さず、または（ｉｉ）ポリアデニル化シグナルのみを有し、イントロンまたはＣＴＥを有さないベクターは、より低い効率でＲＮＡを細胞質へ輸出し、結果として細胞質により少ないＲＮＡおよびＰＴＧＳのより低い効率が生じる。イントロン、ＣＴＥ、およびポリアデニル化シグナルなしにＲＮＡをコード化するベクターは、細胞質に最小有効に輸送されるＲＮＡ分子がもたらされる。ＲＮＡの細胞質レベルが低いほど、核におけるＲＮＡ保持は多く、ＴＧＳが誘発される効率が高くなる。したがって、これらベクターのすべては、細胞質輸送および核保持のレベルに従って、それぞれ、上記のように、異なる効率でＰＴＧＳおよびＴＧＳを誘発する。
【０１２４】
場合により１つもしくはそれ以上のイントロンを有し、またはイントロンを有さず、かつポリＡテイルを有し、またはポリＡテイルを有さないＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩベクターは、核で作られ、主に核で保持されるＲＮＡ分子をコード化する。この核ＲＮＡはＴＧＳを誘発する。しかし、転写ＲＮＡのパーセンテージは細胞質に達し、したがって、ＰＴＧＳを誘発しうる。ＴＧＳ誘導のためには、ｄｓＲＮＡは、好ましくは、プロモーター、またはプロモーター配列の一部を含有し、かつ核に保持される。あるいは、ｄｓＲＮＡはコードまたはＵＴＲ配列のみを含有し、または好ましくは、コードまたはＵＴＲ配列とプロモーター配列の組合せを含有しうる。かかる「融合標的」ｄｓＲＮＡは、例えば、プロモーター配列、および同時ＴＧＳおよびＰＴＧＳがターゲットされる結合遺伝子配列を含有しうる。本発明の多コンパートメント発現系は、かかる「融合標的」配列が関連コンパートメント、例えば、細胞質、核、および核小体のすべてにおいて、必須コンパートメント特異的プロモーターを使用し、転写を開始することによって発現することを確実にしうる。ＰＴＧＳのためには、ｄｓＲＮＡはＲＮＡ由来の配列（例えば、ｍＲＮＡからのコードまたはＵＴＲ配列）を含有し、プロモーター配列を含有することはない。また、より有効なＰＴＧＳは、細胞質転写を可能にするベクター、または結果としてより有効な細胞質輸送ＲＮＡがもたらされるベクターによって誘発される。必要に応じて、ＰＴＧＳおよびＴＧＳは、本明細書に記載された方法、かつ当業者に周知の方法を使用することにより、これらベクターの組合せで同時に誘発されうる。
【０１２５】
他の発現制御配列としては、適切な転写開始、末端、プロモーター、およびエンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなど有効なＲＮＡ処理シグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列、および必要に応じて、コード化生成物の分泌を増強する配列が挙げられる。
【０１２６】
本明細書に記載されたベクターのいずれか、または他の標準のベクターを使用し、本発明の所望の生物学的に活性の核酸構造物、例えば、ｄｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ（必要に応じて、ポリペプチドへ翻訳される）、アンチセンスＲＮＡ、およびリボザイムＲＮＡを生成し、本発明の方法で使用されうる。
【０１２７】
転写後遺伝子サイレンシングを増強するための方法
ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩによって核において転写されたｄｓＲＮＡによってＰＴＧＳを増強するために、１つもしくはそれ以上のイントロンおよび／またはポリアデニル化シグナルをｄｓＲＮＡに添加し、転写ＲＮＡの処理を可能にすることができる。この処理は、スプライシングおよびポリアデニル化が核から細胞質への輸出を促進するため好ましい。また、ポリアデニル化はＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ転写産物を安定化する。これらの同じ方法は、タンパク質へ翻訳される機能的ｍＲＮＡの発現に有用となる。一部の実施形態においては、原核抗生物質耐性遺伝子、例えば、ゼオマイシン発現カセットが、イントロンに位置している。他の例示としての原核の選択可能なマーカーとしては、米国特許第５，８５１，８０４号明細書のキメラカナマイシン耐性遺伝子を含むカナマイシンなど他の抗生物質耐性遺伝子、アミノグリコシド、テトラサイクリン、およびアンピシリンが挙げられる。ゼオマイシン遺伝子は原核プロモーターの調節制御下にあり、かつ宿主細菌におけるゼオマイシンの翻訳は、開始ＡＴＧの上流の約１０個の塩基対以内に位置しているシャイン・ダルガノ配列の存在によって確実にされる。あるいは、ゼオマイシン発現カセットは、ヘアピンの逆方向反復配列間（すなわち、サイレンスされる標的核酸と実質的に同一のセンスとアンチセンス配列との間）の位置に配置されうる。
【０１２８】
逆方向反復配列は通常、ベクターが細菌において増殖するとＤＮＡ組換えによってＤＮＡから削除されるが、少数の細菌は、逆方向反復を有するＤＮＡを安定して維持することを可能にする組換え経路での突然変異を有しうる。これらの珍しい細菌をスクリーニングするために、ゼオマイシン選択が培養に追加される。逆方向反復を除去することが可能である望ましくない細菌は、ゼオマイシン発現カセットも組換え中に削除されるため殺傷される。無傷ゼオマイシン発現カセットを有する所望の細菌のみがこれらの選択を生き延びる。
【０１２９】
ＤＮＡがこれら選択細菌から単離され、ＲＮＡの発現のために真核生物（例えば、哺乳類細胞培養）または動物（例えば、成体哺乳類）へ挿入された後、イントロンはＲＮＡ転写産物からスプライスされる。ゼオマイシン発現カセットがイントロンに位置している場合は、このカセットはＲＮＡスプライシングによって除去される。無効なスプライシングの場合には、ゼオマイシン発現カセットは、この遺伝子の転写および翻訳のための真核生物シグナルがないため発現しない。抗生物質耐性カセットの除去は、カセットの除去がｄｓＲＮＡ分子のサイズを減少させるため、短鎖ｄｓＲＮＡを含む用途に好ましい。ゼオマイシンカセットは、イントロン内部ではなくイントロンのいずれか末端のそばに位置している。この場合、ゼオマイシン発現カセットは、イントロンがスプライスされた後に残存し、ヘアピンのループ構造に関与するために使用されうる。これらのＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ転写産物は核で作られ、細胞質へ輸送され、ここでＰＴＧＳをもたらしうる。しかし、一部のＲＮＡ分子は核に保持されうる。これらの核ＲＮＡ分子はＴＧＳをもたらしうる。ＴＧＳ用途のために、コード化ｄｓＲＮＡは、好ましくは、プロモーターまたはプロモーターの一部を含有する。核内にＲＮＡをより有効に保持するために、イントロンおよび／またはポリアデニル化シグナルは除去されうる。
【０１３０】
細胞質および核の局在化のための別の方法が、「上流」または内部ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを使用することである（例えば、Ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ａ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、第３版、Ｄａｖｉｄ Ｌａｔｃｈｍａｎ（編）Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔｈｏｍｅｓ：Ｃｈｅｌｔｅｎｈａｍ、英国、１９９８年）。これらのプロモーターは、結果として核転写ＲＮＡ転写産物をもたらし、その一部は輸出され、かつその一部は核に保持され、したがってＰＴＧＳおよび／またはＴＧＳに使用されうる。これらのプロモーターを使用し、本発明の部分および強制ヘアピン構造を含むヘアピン、または二本鎖ＲＮＡを、変換プロモーターの使用または２つのベクターもしくは２つのシストロン系の使用により生成することができる。１つのプロモーターはセンス鎖の合成を誘導し、他のプロモーターはアンチセンスＲＮＡの合成を誘導する。これらのプロモーターによって転写されるＲＮＡの長さは、一般に数百個のヌクレオチド（２５０−５００個）に制限される。また、転写終結シグナルは、有効な転写終結を可能にするこれらベクターにおいて使用されうる。
【０１３１】
本出願において必要とされる大部分の用語および一般の実験手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、第１−３巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）、２０００年に見られる。このマニュアルを以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」と呼ぶ。
【０１３２】
クローニング、ＤＮＡ単離、増幅および精製、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む酵素反応のための標準法、およびさまざまな分離法は、例えば、参照によって本明細書で援用される、以下の引例におけるように分子生物学の当業者によって周知であり、一般的に使用されている。すなわち、多くの標準法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９４年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリッシング社（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．）、およびワイリー・アンド・サンズ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、ニューヨーク州（Ｎ．Ｙ．）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ニューヨーク、Ｗｕ（編）（１９９３年）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１８、第Ｉ部、Ｗｕ（編）（１９７９年）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８、Ｗｕら（編）（１９８３年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００および１０１、ＧｒｏｓｓｍａｎとＭｏｌｄａｖｅ（編）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５、Ｍｉｌｌｅｒ（編）（１９７２年）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、ＯｌｄとＰｒｉｍｒｏｓｅ（１９８１年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、カリフォルニア大学プレス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ）、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＳｃｈｌｅｉｆとＷｅｎｓｉｎｋ（１９８２年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｌｏｖｅｒ（編）（１９８５年）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ第Ｉ巻およびＩＩ巻、ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ、英国（ＵＫ）、ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ（編）（１９８５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬプレス（Ｐｒｅｓｓ）、Ｏｘｆｏｒｄ、英国（ＵＫ）、およびＳｅｔｌｏｗとＨｏｌｌａｅｎｄｅｒ（１９７９年）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１−４巻、プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークに記載されている。「連鎖反応クローニング」と呼ばれる、ここで使用される特に有用な方法は、米国特許第６，１４３，５２７号明細書、「Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ」、Ｐａｃｈｕｋらに記載されている。使用される略語および用語は、現場で標準と見なされ、本明細書で引用されているものなど専門誌で一般的に使用されている。
【０１３３】
医薬組成物
本発明の多コンパートメント発現系は、本明細書のほかの場所で記載されているようにさまざまな医薬用途に有利に使用されうる。さまざまな実施形態においては、医薬組成物は約１ｎｇ〜約２０ｍｇの核酸、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、ウイルスベクター、組換えウイルス、またはその混合物を含み、これらは所望量の核酸分子（標的核酸、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、トリプレックス形成ＲＮＡ等と相同のｄｓＲＮＡ）を提供する。一部の実施形態においては、組成物は、約１０ｎｇ〜約１０ｍｇの核酸、約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１ｍｇ〜約３５０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約２５０ｍｇ、または約１００ｍｇの核酸を含有する。臨床薬剤学の当業者は、ルーチンの実験を使用してかかる投与量に容易に到達することができる。
【０１３４】
適切な担体としては、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、およびその組合せが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は投与方法に適合させることができ、例えば、丸剤、錠剤、カプセル、スプレー、粉末、または液体の形でありうる。一部の実施形態においては、この医薬組成物は、投与の選択された経路および方法に適した、１つもしくはそれ以上の薬剤として許容される添加剤を含有する。これらの組成物は、限定されることなく、静脈内（ＩＶ）、動脈内、筋内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、皮内、腹腔内、髄腔内を含む任意の非経口経路のほか、局所、経口、および鼻腔内、吸入、直腸、膣、口内、および舌下など粘膜の送達経路によって投与されうる。一部の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、注入用の滅菌、非発熱性液体、エマルジョン、粉末、エアロゾル、錠剤、カプセル、腸溶性製剤、または坐剤を含む液体の形で脊椎動物（例えば、哺乳類）対象に対する投与のために調製される。
【０１３５】
本明細書に記載されているように、例えば、バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下に、例えば、天然痘ウイルスおよび炭疽毒素のヒト細胞受容体配列からの１つもしくはそれ以上の遺伝子と実質的に相同のｄｓＲＮＡを発現するＤＮＡプラスミド構築物を含んで成る医薬組成物を調製することができる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、適切なプロモーター、例えば、ｈＣＭＶ、サルＣＭＶ、またはＳＶ４０の制御下に同じまたは他のプラスミドから同時送達および発現されうる。一部の実施形態においては、同じまたは他の構築物は、標的遺伝子（例えば、標的天然痘遺伝子）を標的天然痘遺伝子と相同のｄｓＲＮＡと同時に発現する。この医薬組成物は、特定の投与経路に適切な医薬ビークルで調製される。ＩＭ、ＳＣ、ＩＶ、皮内、髄腔内、または他の非経口の投与経路のために、注入用の滅菌水など滅菌、非毒性、発熱物質を含まない水溶液、および、場合により、さまざまな濃度の塩、例えば、ＮａＣｌ、および／またはブドウ糖、（例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー液、ブドウ糖輸液、ブドウ糖および塩化ナトリウム注射、および乳酸加リンガー液）が一般的に使用される。場合により、薬剤学の当業者に周知の他の薬剤として適切な添加剤、防腐剤、または緩衝剤も使用される。注入用の１回量のバイアルで供給される場合は、用量は薬理学の当業者によって決定されるとおり変動するが、一般的に５ｍｃｇ〜５００ｍｃｇの活性構築物を含有する。必要に応じて、相当に大量を毒性なしに、例えば、５−１０ｍｇまで投与されうる。
【０１３６】
本発明の医薬組成物および本発明に従って使用するための医薬組成物は、薬剤として許容される賦形剤または担体を含みうる。本明細書で使用される「薬剤として許容される担体」は、非毒性、不活性固体、半固体、または液体充填剤、希釈剤、封入材料、または任意の型の製剤助剤を意味する。薬剤として許容される担体として使用されうる材料の一部の例は、乳糖、ブドウ糖、およびショ糖などの糖、コーンスターチおよびジャガイモでんぷんなどのでんぷん、セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース、トラガント粉末、モルト、ゼラチン、タルク、カカオバターや坐剤用ワックスなどの賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油、プロピレングリコールなどのグリコール、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、寒天、Ｔｗｅｅｎ８０などの洗剤、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張食塩水、リンガー液、エチルアルコール、およびリン酸緩衝液などの緩衝剤のほか、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど他の非毒性適合性潤滑剤、着色剤、解除剤、被覆剤、甘味剤、香味剤および香料、防腐剤および抗酸化剤も製剤者の判断に従って組成物に存在しうる。
【０１３７】
注射製剤は、例えば、細菌保持フィルタによるろ過によって、または滅菌水もしくは他の滅菌注入溶剤中に使用前に溶解または分散されうる滅菌固体組成物の形で滅菌剤を組込むことによって滅菌されうる。
【０１３８】
直腸または膣投与のための組成物は、好ましくは、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔で融解し、微粒子を放出するカカオバター、ポリエチレングリコール、または坐剤用ワックスなど適切な非刺激性賦形剤または担体と発現構築物を混合することによって調製されうる坐剤である。
【０１３９】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル、錠剤、丸剤、粉末および顆粒が挙げられる。かかる固体剤形においては、発現構築物は、少なくとも１つの不活性の薬剤として許容される賦形剤または担体、例えばクエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウム、および／または、ａ）充填剤または増量剤、例えば、でんぷん、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール、およびケイ酸、ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、ショ糖、およびアカシア、ｃ）湿潤剤、例えばグリセロール、ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカでんぷん、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、ｅ）パラフィンなどの溶液緩和剤、ｆ）第四級アンモニウム化合物など吸収促進剤、ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール、ｈ）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土、およびｉ）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびその混合物と混合される。カプセル、錠剤、および丸剤の場合は、剤形が緩衝剤も含んで成りうる。
【０１４０】
本発明による医薬組成物の局所または経皮投与の剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、またはパッチが挙げられる。発現構築物は、滅菌条件下、薬剤として許容される担体および必要な防腐剤または緩衝剤と必要に応じて混合される。眼科用製剤、点耳剤、および点眼剤も本発明の範囲内であると考えられる。
【０１４１】
経皮パッチは、化合物の体内への制御された送達を提供する追加の利点を有する。かかる剤形は、適切な溶剤で発現構築物を溶解または分散することによって行われうる。吸収促進剤を使用し、皮膚上の化合物の流束を増大させることもできる。速度は、速度制御膜を提供し、または発現構築物をポリマーマトリクスまたはゲルに分散させることによって制御されうる。
【０１４２】
発現構築物の投与の好ましい方法
本発明のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ構築物は、トランスフェクション促進剤なしに医薬ビークルで調製された「裸の」ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡとして宿主細胞／組織／生物に投与される。より有効な送達は、例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ送達の当業者に周知の、かかるポリヌクレオチドトランスフェクション促進剤を使用することにより、ＤＮＡおよびＲＮＡ送達の当業者に周知にように達成されうる。以下は例示として薬剤である：ブピバカイン、陽イオン性脂質、リポソーム、または脂質粒子など局所麻酔薬を含む陽イオン性両親媒性分子、ポリリシンなどポリカチオン、デンドリマーなど分岐三次元ポリカチオン、糖質、洗剤、またはベンジルコニウム塩化物などベンジルアンモニウム界面活性剤を含む界面活性剤。本発明において有用なかかる促進剤または共存する剤の非排他的例は、その開示が参照によって本明細書で援用される、米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，７０３，０５５号明細書、同第５，７３９，１１８号明細書、同第５，８３７，５３３号明細書、同第５，９６２，４８２号明細書、同第６，１２７，１７０号明細書、および同第６，３７９，９６５号明細書のほか、２００３年５月６日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／１４２８８号明細書（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ ｏｉｌ／ｗａｔｅｒ ｃａｔｉｏｎｉｃ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、およびＰＣＴ／ＵＳ９８／２２８４１号明細書に記載されている。米国特許第５，８２４，５３８号明細書、同第５，６４３，７７１号明細書、および同第５，８７７，１５９号明細書（参照によって本明細書で援用される）は、ポリヌクレオチド組成物以外の組成物、例えば、本発明の発現構築物を含有するトランスフェクトドナー細胞または細菌の送達を開示している。
【０１４３】
一部の実施形態においては、本発明の発現構築物は、米国特許第４，８９７，３５５号明細書（Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８７年１０月２９日出願）、同第５，２６４，６１８号明細書（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９９１年４月１６日出願）、または米国特許第５，４５９，１２７号明細書（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９９３年９月１６日出願）において開示されている組成物など、１つもしくはそれ以上の陽イオン性資質または陽イオン性両親媒性分子と複合される。他の実施形態においては、発現構築物は、陽イオン性脂質を含み、かつ場合により、中性脂肪など別の成分を含むリポソーム／リポソーム組成物と複合される（例えば、米国特許第５，２７９，８３３号明細書（Ｒｏｓｅ）、同第５，２８３，１８５号明細書（Ｅｐａｎｄ）、および同第５，９３２，２４１号明細書（Ｇｏｒｍａｎ）を参照）。他の実施形態においては、発現構築物は、米国特許第５，８３７，５３３号明細書、同第６，１２７，１７０号明細書、および同第６，３７９，９６５号明細書（Ｂｏｕｔｉｎ）の多機能分子複合体と、または、好ましくは、その開示が参照によって本明細書で援用される、２００２年５月６日出願の米国仮出願第６０／３７８，１９１号明細書、および２００３年５月６日出願のＰＣＴ／ＵＳ０３／１４２８８号明細書（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）の多機能分子複合体または油／水陽イオン性両親媒性エマルジョンと複合される。後者の出願は、核酸を含む組成物、コレステロールまたは脂肪酸を含むエンドソーム溶解スペルミン、および細胞表面分子のためのリガンドを含む標的スペルミンを開示している。組成物の正負電荷比は、包括的に、０．５〜１．５であり、エンドソーム溶解スペルミンは組成物中に少なくとも２０％のスペルミン含有分子を構成し、標的スペルミンは組成物中に少なくとも１０％のスペルミン含有分子を構成する。好ましくは、正負電荷比は、包括的に、０．８〜０．９など、包括的に、０．８〜１．２である。標的スペルミンは、組成物を目的とする特定の細胞または組織に局在するように設計されている。エンドソーム溶解スペルミンは、エンドサイトーシス中の組成物を封入するエンドソーム小胞を崩壊させ、エンドソーム小胞からおよび細胞の細胞質または核への核酸の放出を促進する。
【０１４４】
さらに他の実施形態においては、発現構築物は、薬剤学および分子生物学の当業者によって発明されている他の組成物と複合される。一部の実施形態においては、構築物またはベクターが陽イオン性脂質と複合体化されない。
【０１４５】
細胞のトランスフォーメーション／トランスフェクションは、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、マイクロインジェクション、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、ウイルスまたはレトロウイルス送達、エレクトロポレーション、または遺伝子銃トランスフォーメーションを含むが、これらに限定されないさまざまな手段により起こりうる。発現構築物（ＤＮＡ）は、裸のＤＮＡまたは局所麻酔複合ＤＮＡでありうる（Ｐａｃｈｕｋら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４６８：２０−３０頁（２０００年））。好ましくは、真核細胞は、例えば、脊椎動物（例えば、哺乳類）は、インビボであり、または少数の継代のみ（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから直接得られている３０継代未満の細胞系）培養されている細胞であり、または一次細胞である。
【０１４６】
好ましい細胞
本発明のいずれかの態様のさらに別の実施形態においては、細胞は真核植物細胞または動物細胞である。好ましくは、動物細胞は、無脊椎動物または脊椎動物細胞（例えば、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞）である。細胞はエクソビボまたはインビボでありうる。細胞は配偶子または体細胞、例えば、癌細胞、幹細胞、免疫系の細胞、神経細胞、筋細胞、または含脂肪細胞である。一部の実施形態においては、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）またはアルゴナウト（Ａｒｇｏｎａｕｔ）など遺伝子サイレンシングに関与する１つもしくはそれ以上のタンパク質が細胞または動物において過剰発現または活性化し、遺伝子発現の阻害量を増大させる。
【０１４７】
哺乳類の複製開始点の包含
複製開始点は、ＤＮＡプラスミドが核局在化と同時に複製され、したがって発現を強化することを可能にする。その利点は、より多くのプラスミドが核転写のために利用可能であり、したがって、より多くのエフェクター分子が作られることである（例えば、より多くのアンチセンス、ｍＲＮＡ、ｄｓＲＮＡヘアピンおよび／またはより多くのｄｓＲＮＡ二本鎖）。多くの起源が種特異的であり、哺乳類のすべての種ではなく、一部の種で機能している。例えば、複製のＳＶ４０Ｔ起源（例えば、クローンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）からのプラスミドｐＤｓＲｅｄ１−Ｍｉｔｏ由来、米国特許第５，６２４，８２０号明細書）は、マウスで機能的であるが、ヒトでは機能的ではない。したがって、この起源は、マウスにおいて使用されるか、試験されるベクターのために使用されうる。エプスタイン・バー核抗原（ＥＢＮＡ）起源などヒト用に使用されうる他の起源（例えば、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのプラスミドｐＳＥＳ．ＴｋおよびｐＳＥＳ．Ｂ）。これらのエレメントを含有するＤＮＡベクターは市販されており、起源をコード化するＤＮＡ部分は、起源を含有する制限断片を分離し、または起源をＰＣＲ増幅することによって標準の方法を用いて獲得されうる。これらのベクターの制限マップおよび配列は、公的に入手可能であり、当業者はこれらの配列を増幅させ、または適切な制限断片を単離することが可能である。これらのベクターは、ＳＶ４０ＴＡｇおよびＥＢＮＡなど適切なアクセサリー因子を発現する細胞の核において複製する。これらの因子の発現は、複製の対応する起源を含有する市販のベクターの一部（例えば、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのｐＳＥＳ．ＴｋおよびｐＳＥＳ．Ｂ）もＳＶ４０ＴａｇまたはＥＢＮＡのいずれかを発現するため、容易に達成される。複製開始点を含有するこれらのＤＮＡ分子は、当業者によって目的とするベクター（例えば、ヘアピンまたは二本鎖などｄｓＲＮＡを発現するベクター）へ容易にクローン化されうる。次いで、これらのベクターが同時トランスフェクトされ、注入され、または、それぞれ、複製のＥＢＮＡまたはＴａｇ起源を有するプラスミドの複製を可能にするＥＢＮＡまたはＴａｇを発現するベクターとともに投与される。あるいは、ＥＢＮＡまたはＴａｇをコード化する遺伝子は、標準の方法を使用して目的とする細胞、動物、または生物における機能するように設計された他の発現ベクターへクローン化される。ＥＢＮＡまたはＴａｇをコード化する遺伝子は、複製開始点を有する同じベクターもクローン化されうる。複製の適切な起源はＥＢＮＡまたはＴａｇに限定されず、例えば、モントリオールのレプリコル（Ｒｅｐｌｉｃｏｒ）は、複製を伴うＤＮＡ配列を可能にする３６個の塩基対の哺乳類起源コンセンサス配列を同定した（１９９９年８月１６日付ＢｉｏＷｏｒｌｄ Ｔｏｄａｙ、第１０巻、１５７号で論評）。この配列は、複製を可能にする補助配列の共発現を必要としない。
【０１４８】
本発明の範囲には、本発明の発現構築物を含有する組成物を含んで成るキットも含まれるが、ここでかかるキットは、場合により、発現構築物の安定性、送達、使いやすさ、または有効性を補助する溶媒、溶液、および他の組成物を含んで成る。
【実施例】
【０１４９】
本発明はさらに以下の実施例において説明される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すと同時に、例示のみを目的として示されている。上記の検討およびこれらの実施例から当業者は本発明の好ましい特徴を理解し、かつその精神および範囲を逸脱することなく、本発明のさまざまな変更および改造を行って、さまざまな使用および条件に適合させることができる。
【０１５０】
実施例１
各々が個別のシストロン内に位置している２つの異なるＨＢＶ由来ヘアピンｄｓＲＮＡの２つのコピーをコード化するプラスミド多コンパートメント真核生物発現系
２つの異なるＨＢＶ特異的ヘアピンＲＮＡ（「ループ」配列によって分離される逆センスおよびアンチセンス配列を含んで成ることによって二本鎖構造をとることが可能なＲＮＡ鎖）の各々の２つのコピーをコード化するプラスミドが構成されている。かかる配列Ａおよび配列Ｂの各々は、真核細胞の異なる細胞内コンパートメントにおいて各々転写活性である２つの別個の異なったプロモーター、すなわち、バクテリオファージＴ７プロモーター（Ｔ７ｐ）（細胞質においてＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写を促進する）およびヒトＵ６プロモーター（核小体において転写活性であるＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）の制御下にある。転写ユニット（シストロン）は、４つのシストロンのすべてについて各シストロンの別個の位置が存在するように配置されている（図７）。Ｔ７プロモーターは、市販のベクターで供給される異なる種類の１つでありうるが、本実施例および以下の実施例に記載されたものは以下のとおりである（５’〜３’）：５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’（配列番号１）。ここで留意すべきは、Ｔ７プロモーターの定義が、＋１および＋２および＋３部位に位置した１つ、２つ、または３つのＧ残基（イタリック体で示される）を含み、有効な転写開始を確実にする。これらのＧは、Ｔ７プロモーターの「コア」ヌクレオチドに対する＋１、または＋１および＋２、または＋１、＋２、および＋３の位置にあるようにプロモーターの３’末端に直接位置している。Ｔ７ターミネーター（Ｔ７ｔ）（Ｌｙａｋｈｏｖら［１］）は、図７に示されているように各Ｔ７シストロンの末端に含まれうる。
【０１５１】
ベクターの説明：
第１のヘアピン（配列Ａ）は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３の配位２９０５−２９２９に位置する（すなわち、ヘアピンはＴＴＣＡＡＡＡＧＡのループ構造によって分離されるこの配列のセンスおよびアンチセンス種類を含有する）。Ｕ６ベースのベクター系の説明はＬｅｅら［２］で見られる。第２のベクターコード化ヘアピン（配列Ｂ）は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３の配位１２１５−１２３９に位置する。第１のヘアピンと同様、これはＴＴＣＡＡＡＡＧＡのループ構造によって分離されるこの配列のセンスおよびアンチセンス種類をコード化する。このベクターは、以下に記載されるＨＢＶレプリコンモデルで評価される。クローニングは標準の方法を使用して実行され、または必要に応じて、方向性ライゲーションクローニング、ＣＲＣが使用される［３］（参照によって本明細書で援用される、米国特許第６，１４３，５２７号明細書「Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ」、Ｐａｃｈｕｋらの開示を参照）。この実験のために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ源を供給するために実験的プラスミドと共トランスフェクされる。このベクターは本実施例の最後近くに記載されている。
【０１５２】
ＨＢＶレプリコンモデル：複製適格細胞培養モデルにおけるサイレンシングＨＢＶ複製および発現
細胞培養モデルの簡単な説明：
Ｈｕｈ７細胞系などヒト肝由来細胞系が、ウイルスＲＮＡのすべてを転写し、感染性ウイルスを産生することが可能である末端が重複するウイルスゲノムから成るＨＢＶの感染性分子クローンとトランスフェクトされる［４−６］。これらの試験で使用されるレプリコンは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３に存在するウイルス配列由来である。肝細胞への内在化および核局在化の後、一部のウイルスプロモーターからの感染性ＨＢＶプラスミドの転写は、ＨＢＶ複製を反映させる一連の事象を開始することが証明されている。これらの事象としては、転写ウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写プレゲノムＲＮＡのコア粒子へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写、およびビリオンとＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）粒子のトランスフェクト細胞の培地への集合と分泌が挙げられる。このトランスフェクションモデルは、感染肝細胞内のＨＢＶ複製の大部分の態様を再現し、したがって、ＨＢＶ発現および複製のサイレンシングを観察するには優れた細胞培養モデルである。
【０１５３】
本モデルでは、細胞が評価されるＨＢＶの感染性分子クローンおよびエフェクターＲＮＡ構築物と同時トランスフェクトされる。次いで、細胞がＨＢＶ発現および複製の喪失について下記のとおりモニタリングされる。
【０１５４】
実験手順：トランスフェクション
トランスフェクションの時点で８０−９０％密集度となるように、Ｈｕｈ７細胞を６ウェルプレートへ接種する。すべてのトランスフェクションは、リポフェクタミン（商標）ポリカチオン性脂質／中性脂肪リポソーム製剤（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をメーカーの指示に従って使用して行われる。本実験では、感染性ＨＢＶプラスミド５０ｎｇ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド１μｇ（以下にプラスミドの説明）、および図７に示された実施例１の実験プラスミド１．５μｇで細胞をトランスフェクトする。対照細胞は、ＨＢＶプラスミド５０ｎｇおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド１μｇでトランスフェクトする。不活性フィラーＤＮＡ、ｐＧＬ３−ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））をすべてのトランスフェクションに添加し、全ＤＮＡ／トランスフェクションを２．５μｇ ＤＮＡまでにする。
【０１５５】
ＨＢＶ発現の喪失についての細胞のモニタリング
トランスフェクション後、ＨＢｓＡｇ分泌およびＤＮＡ含有ウイルス粒子分泌を測定することによってＨＢＶ発現および複製の喪失または削減について細胞をモニタリングする。ｄｓＲＮＡ投与後２日で開始し、その後３週間一日おきにトランスフェクト細胞の培地を評価することによって細胞をモニタリングする。アボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、イリノイ州（ＩＬ））から市販のＡｕｓｚｙｍｅ ＥＬＩＳＡを使用し、ＨＢＶ表面Ａｇ（ｓＡｇ）を検出する。ｓＡｇを測定するのは、表面Ａｇがウイルス複製だけではなく、トランスフェクト感染性ＨＢＶクローンにおける表面ＡｇシストロンのＲＮＡポリメラーゼＩＩ開始転写とも関係があるためである。表面Ａｇ合成はＨＢＶ複製の非存在下に持続しうるため、かつ慢性ＨＢＶ感染における表面抗原の持続産生が肝細胞癌の発症と関係があるため、ウイルス複製だけではなくｓＡｇの複製依存合成もダウンレギュレートすることが重要である。カプシドで包まれたＨＢＶゲノムＤＮＡを含有するビリオン粒子の分布も測定される。カプシドで包まれたＤＮＡを含有するビリオン粒子の喪失は、ＨＢＶ複製の喪失を示す。
【０１５６】
ビリオン分泌の分析は、裸の未熟コア粒子とエンベロープを持った感染性ＨＢＶビリオンを区別する方法を含む［７］。手短に言えば、培養細胞の培地からのペレットウイルス粒子をプロテイナーゼＫ消化にさらし、コアタンパク質を分解させる。プロテイナーゼＫの不活性化後、サンプルをＲＱ１ＤＮａｓｅ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））でインキュベートし、コア粒子から遊離されたＤＮＡを分解する。ＳＤＳの存在下にプロテイナーゼＫでサンプルを再び消化し、ＤＮａｓｅを不活性化するとともに、感染性のエンベロープを持ったビリオン粒子を崩壊、分解させる。次いで、フェノール／クロロホルム抽出によってＤＮＡを精製し、エタノール沈殿させる。ＨＢＶ特異的ＤＮＡをゲル電気泳動後のサザンブロット分析によって検出する。
【０１５７】
予測結果は、ＨＢＶプラスミドＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドおよびフィラーＤＮＡのみでトランスフェクトされた細胞に対して、ＨＢＶプラスミド、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド、および実験的プラスミドでトランスフェクトされた細胞の培地におけるｓＡｇおよびウイルス粒子分泌における７０−９５％の減少を示す。
【０１５８】
実験で使用されたベクター
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の配列：
配列番号２は、ｐＣＥＰ４（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州（ＣＡ））など哺乳類発現ベクターへクローン化されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の配列である。クローニングは当業者によって容易になされうる。当業者は、Ｋｏｚａｋ配列を有するリーダー配列がＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子から直接上流でクローン化される必要があることも認識するであろう。
【０１５９】
実施例２
隣接したプロモーター配列におけるＨＢＶ由来ヘアピンＲＮＡをコード化するベクター
２つの別個の異なるコンパートメントプロモーター、すなわち、バクテリオファージＴ７プロモーター（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼも供給される場合に細胞質）およびヒトＵ６プロモーター（ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、核小体）の制御下に、ＨＢＶ特異的ヘアピンＲＮＡ（実施例１からの配列Ａ）をコード化するプラスミドが構成されている。配列はＴ７プロモーターによって１つの方向で転写され、Ｕ６プロモーターによって逆方向で転写される。Ｔ７ターミネーターは、Ｔ７プロモーターに対して配列Ａの３’末端でクローン化され、Ｕ６ターミネーターは、Ｕ６ターミネーターに対して配列Ａの３’末端でクローン化される。Ｔ７転写産物は、５’から３’まで、すなわち、Ｕ６ターミネーターに対する逆相補鎖および配列Ａヘアピン（例えば、センス−ループ−アンチセンス）を含有する。Ｕ６転写産物は５’から３’まで、すなわち、Ｔ７ターミネーターに対する逆相補鎖、および配列Ａヘアピン（例えば、アンチセンス−ループ−センス）を含有する。Ｔ７転写産物内にコード化されたＨＢＶヘアピン配列はＵ６転写産物によってコード化されるものの逆相補鎖であるが、両方の転写産物は二本鎖構造で同じセンスおよびアンチセンスＨＢＶ配列を含有し、したがって、ＨＢＶ特異的サイレンシングに対して機能的に同等であることが予想される。
【０１６０】
ベクターの説明：
ヘアピン（配列Ａ）は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３の配位２９０５−２９２９に位置する（すなわち、ヘアピンはＴＴＣＡＡＡＡＧＡのループ構造によって分離されるこの配列のセンスおよびアンチセンス種類を含有する）。クローニングは、標準の方法を使用して実行され、または必要に応じて、方向性ライゲーションクローニング、ＣＲＣが使用される［３］（参照によって本明細書で援用される、米国特許第６，１４３，５２７号明細書「Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ」、Ｐａｃｈｕｋらの開示を参照）。ベクターはＨＢＶレプリコンモデルにおいて評価される。この実験のために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドは（上記の実施例１に示されているように）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ源を供給するために実験的プラスミドと同時トランスフェクトされる。
【０１６１】
ＨＢＶレプリコンモデル：複製適格細胞培養モデルにおけるサイレンシングＨＢＶ複製および発現
細胞培養モデルの簡単な説明：
Ｈｕｈ７細胞系などヒト肝由来細胞系が、ウイルスＲＮＡのすべてを転写し、感染性ウイルスを産生することが可能である末端が重複するウイルスゲノムから成るＨＢＶの感染性分子クローンとトランスフェクトされる［４−６］。これらの試験で使用されるレプリコンは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３に存在するウイルス配列由来である。肝細胞への内在化および核局在化の後、一部のウイルスプロモーターからの感染性ＨＢＶプラスミドの転写は、ＨＢＶ複製を反映させる一連の事象を開始することが証明されている。これらの事象としては、転写ウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写プレゲノムＲＮＡのコア粒子へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写、およびビリオンとＨＢｓＡｇ粒子のトランスフェクト細胞の培地への集合と分泌が挙げられる。このトランスフェクションモデルは、感染肝細胞内のＨＢＶ複製の大部分の態様を再現し、したがって、ＨＢＶ発現および複製のサイレンシングを観察するには優れた細胞培養モデルである。
【０１６２】
本モデルでは、細胞が評価されるＨＢＶの感染性分子クローンおよびエフェクターＲＮＡ構築物と同時トランスフェクトされる。次いで、細胞がＨＢＶ発現および複製の喪失について下記のとおりモニタリングされる。
【０１６３】
実験手順：トランスフェクション
トランスフェクションの時点で８０−９０％密集度となるように、Ｈｕｈ７細胞を６ウェルプレートへ接種する。すべてのトランスフェクションは、リポフェクタミン（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をメーカーの指示に従って使用して行われる。本実験では、感染性ＨＢＶプラスミド５０ｎｇ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド１μｇ（以下にプラスミドの説明）、および図８に示された実験プラスミド１．５μｇで細胞をトランスフェクトする。対照細胞は、ＨＢＶプラスミド５０ｎｇおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド１μｇでトランスフェクトする。不活性フィラーＤＮＡ、ｐＧＬ３−ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））をすべてのトランスフェクションに添加し、全ＤＮＡ／トランスフェクションを２．５μｇ ＤＮＡまでにする。
【０１６４】
ＨＢＶ発現の喪失についての細胞のモニタリング
トランスフェクション後、ＨＢｓＡｇ分泌およびＤＮＡ含有ウイルス粒子分泌を測定することによってＨＢＶ発現および複製の喪失または削減について細胞をモニタリングする。ｄｓＲＮＡ投与後２日で開始し、その後３週間一日おきにトランスフェクト細胞の培地を評価することによって細胞をモニタリングする。アボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、イリノイ州（ＩＬ））から市販のＡｕｓｚｙｍｅ ＥＬＩＳＡを使用し、表面Ａｇ（ｓＡｇ）を検出する。ｓＡｇを測定するのは、表面Ａｇがウイルス複製だけではなく、トランスフェクト感染性ＨＢＶクローンにおける表面ＡｇシストロンのＲＮＡポリメラーゼＩＩ開始転写とも関係があるためである。表面Ａｇ合成はＨＢＶ複製の非存在下に持続しうるため、ウイルス複製だけではなくｓＡｇの複製依存合成もダウンレギュレートすることが重要である。カプシドで包まれたＨＢＶゲノムＤＮＡを含有するビリオン粒子の分布も測定される。カプシドで包まれたＤＮＡを含有するビリオン粒子の喪失は、ＨＢＶ複製の喪失を示す。
【０１６５】
ビリオン分泌の分析は、裸の未熟コア粒子とエンベロープを持った感染性ＨＢＶビリオンを区別する方法を含む［７］。手短に言えば、培養細胞の培地からのペレットウイルス粒子をプロテイナーゼＫ消化にさらし、コアタンパク質を分解させる。プロテイナーゼＫの不活性化後、サンプルをＲＱ１ＤＮａｓｅ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））でインキュベートし、コア粒子から遊離されたＤＮＡを分解する。ＳＤＳの存在下にプロテイナーゼＫでサンプルを再び消化し、ＤＮａｓｅを不活性化するとともに、感染性のエンベロープを持ったビリオン粒子を崩壊、分解させる。次いで、フェノール／クロロホルム抽出によってＤＮＡを精製し、エタノール沈殿させる。ＨＢＶ特異的ＤＮＡをゲル電気泳動後のサザンブロット分析によって検出する。
【０１６６】
予測結果は、ＨＢＶプラスミドＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドおよびフィラーＤＮＡのみでトランスフェクトされた細胞に対して、ＨＢＶプラスミド、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド、および実験的プラスミドでトランスフェクトされた細胞の培地におけるｓＡｇおよびウイルス粒子分泌における７０−９０％の減少を示す。本発明の多コンパートメント真核生物発現系は、単一Ｔ７シストロンまたは単一ＵＰ６シストロンのいずれからの配列Ａを発現する制御プラスミドに対して、ＨＢＶのより大きな阻害をもたらすことも予想される。
【０１６７】
実施例３
２つのＨＢＶヘアピンＲＮＡをコード化する多コンパートメント真核生物発現ベクターはインビボで有効性を示す
以下に記載される実験では、実施例１に記載され、図７に示されており、２つのＨＢＶヘアピンＲＮＡ分子をコード化し、各々がサブコンパートメントの異なったプロモーター、および実施例１のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドを有する２つの異なるシストロン由来である、多コンパートメント真核生物発現ベクターとともに複製成分ＨＢＶａｙｗプラスミドを同時送達する方法として流体力学的送達が利用される。流体力学的送達は、肝への核酸の有効な送達がもたらされるため、本実験に理想的である［８］。同じ製剤へのｄｓＲＮＡエフェクタープラスミドと複製適格ＨＢＶプラスミドの組合せは、すべてのプラスミドが同じ細胞によって取込まれる可能性を増大させる。発現エフェクターｄｓＲＮＡは、複製ＨＢＶプラスミドを有する大部分の細胞に存在するため、観察結果は、送達有効性の違いではなくエフェクタープラスミドの性能に起因しうる。本実験は、特定の構築物が感染肝において有効であることのみを示す。製剤および送達が本実施例によって扱われない。ｅｉＲＮＡベクター（発現干渉ｄｓＲＮＡ）の製剤、投与、および送達情報は、本明細書のほかの場所、およびトランスジェニックマウスが使用されているインビボ実施例４に記載されているとおりである。
【０１６８】
実験手順（インビボ）：
ウイルスＲＮＡのすべてを転写し、感染性ウイルスを産生することが可能である末端が重複するウイルスゲノムから成るＨＢＶ（ａｙｗ亜型）の感染性分子クローンとともに対照Ｂ１０．Ｄ２マウスを流体力学的に注入する［４−６］。肝細胞への内在化および核局在化の後、一部のウイルスプロモーターからのＨＢＶａｙｗプラスミドの転写は、ＨＢＶ複製を反映させる一連の事象を開始することが証明されている［４］。これらの事象としては、転写ウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写プレゲノムＲＮＡのコア粒子へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写、およびビリオンとＨＢｓＡｇ粒子の注入動物の血清への集合と分泌が挙げられる。動物に対し、４つの用量のＨＢＶレプリコンプラスミド（１μｇ、３μｇ、５μｇ、および１０μｇ）を注入する。これらの用量は、それらが流体力学的送達後にレポータープラスミドの検出可能な発現を誘発することが可能である非飽和用量を示すため選択される。動物に対し、７−１６μｇ用量の多コンパートメントｄｓＲＮＡ発現ベクター（ｅｉＲＮＡ）（図７）および３μｇ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドを同時注入し、各群の動物が２０μｇの総ＤＮＡ量を投与するようにする。例えば、ＨＢＶレプリコン用量３μｇ＋Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド３μｇが投与されるマウスでは、ｅｉＲＮＡベクター１４μｇが合計２０μｇの注入ＤＮＡのために注入される。したがって、このｅｉＲＮＡベクター用量の量は、使用されるＨＢＶプラスミドの用量に依存する。対照動物には、ＨＢＶレプリコンおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドが注入されるが、ｅｉＲＮＡベクターは注入されない。対照マウスには、その代わりに不活性フィラーＤＮＡ、ｐＧＬ３ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））がいっしょに注入され、製剤でのＤＮＡの総量が２０μｇで維持されるようにする。
【０１６９】
肝サンプルを注入後１日目に注入動物から採取し、ＨＢＶ ＲＮＡの存在について分析する。この時点は、流体力学的送達後のマウスにおけるＨＢＶａｙｗプラスミド複製の動態を詳述し、ピークＲＮＡ発現が流体力学的送達後１日目の肝において生じることを明らかにするＣｈｉｓａｒｉ博士の研究室からの公表結果に基づき選択されている［４］。肝サンプルにおけるＨＢＶ ＲＮＡの存在は、ノーザンブロット分析によって確認されている。肝組織は、ＨＢＶ ＲＮＡ発現のダウンレギュレーションについて評価される。また、ＨＢｓＡｇおよびＤＮＡ含有ウイルス粒子の測定のために４日目のマウスから血清を収集する。アッセイは細胞培養レプリコン実験（実施例１）について記載され、かつＹａｎｇらにおけるように実行される［４］。各ベクターおよび対照群は２セットの動物で構成され、各セットは収集時点に対応する。各セットの動物は５匹である。
【０１７０】
予測結果：
ＨＢＶレプリコンおよびｅｉＲＮＡ構築物が注入されるマウスは、ＨＢＶ特異的ＲＮＡ、およびＨＢｓＡｇおよびＨＢＶウイルス粒子を対照動物と比べて減少させた。個々の動物においては、減少範囲は約７０％〜ほぼ１００％である。
【０１７１】
実施例４
トランスジェニックマウス試験：背景
Ｃｈｉｓａｒｉ博士の研究室で開発されたＨＢＶトランスジェニックマウスモデルを使用する［９−１０］。これらのマウスは大量のＨＢＶ ＤＮＡを複製し、ヒト用に有効であることの予測因子である抗ウイルススクリーンとしての有用性を明らかにした［１１］。これらの動物は、抗原のＨＢＶインテグラント介在発現のモデルであり、したがって、ウイルス複製だけではなく、抗原のＲＴ依存発現のためのモデルとして使用されうるという点でも理想的である。これはわれわれがウイルス複製だけではなくエレメント介在抗原発現のターゲティングにも興味があるため重要である。これらの実験は、エフェクタープラスミドが臨床的に適切な核酸送達法を使用して動物に投与されるという点で流体力学的送達実験と異なる。このモデルにおける有効性は、マウス肝細胞へのエフェクタープラスミドの有効な送達を示す。
【０１７２】
実験
文献［９］に記載されたマウスに対し、流体力学的送達実施例（実施例３）に記載されたベクターを含有する製剤を静脈内（ＩＶ）注射する。
【０１７３】
注入されるＤＮＡの調製
２００２年５月６日出願の米国仮出願６０／３７８，１９１号明細書、および２００３年５月６日出願のＰＣＴ／ＵＳ０３／１４２８８明細書（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）に示されているように、トリラクトシルスペルミンおよびコレステリルスペルミンでＤＮＡを調製する。手短に言えば、すべて１．２の電荷比（正負電荷）を使用して３つの製剤を作る。しかし、包括的に０．８〜１．２の電荷比を有する製剤はすべて有効性を示すことが予想される。引用特許出願は、核酸と、コレステロールまたは脂肪酸を含むエンドソーム溶解スペルミンと、細胞表面分子用のリガンドを含む標的スペルミンとを含む組成物を開示している。組成物の正負電荷比は、包括的に０．５〜１．５であり、エンドソーム溶解スペルミンは組成物中のスペルミン含有分子の少なくとも２０％を構成する。標的スペルミンは組成物中のスペルミン含有分子の少なくとも１０％を構成する。好ましくは、正負電荷比は、包括的に０．８〜０．９など、包括的に０．８〜１．２である。標的スペルミンは、目的とする特定の細胞または組織に組成物を局在するように設計されている。エンドソーム溶解スペルミンは、エンドサイトーシス中の組成物を封入するエンドソーム小胞を崩壊させ、エンドソーム小胞からおよび細胞の細胞質または核への核酸の放出を促進する。
【０１７４】
各プラスミドのためのＤＮＡ開始原液は４ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。２つのプラスミド原液を同等量で混合し、各プラスミドが２ｍｇ／ｍｌになるようにする。このプラスミド混合液を最終調製用に使用する。製剤は、２００２年５月６日出願の米国仮出願６０／３７８，１９１号明細書、および２００３年５月６日出願のＰＣＴ／ＵＳ０３／１４２８８明細書（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）に示されているとおりである。製剤Ａ）３５％トリラクトシルスペルミン、６５％コレステリルスペルミン、製剤Ｂ）５０％トリラクトシルスペルミン、５０％コレステリルスペルミン、および製剤Ｃ）８０％トリラクトシルスペルミン、２０％コレステリルスペルミン。ここで、すべての結果として生じる製剤は各々１ｍｇ／ｍｌでプラスミドを含有する。
【０１７５】
マウスに対し、１００μｌ調製ＤＮＡをＩＶ注入する。第１群のマウスには製剤Ａを投与し、第２群には製剤Ｂを投与し、第３群には製剤Ｃを投与する。３群の対照マウスに対し、同様に対照ＤＮＡ、ｐＧＬ３ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））を含有する同じ製剤、製剤Ｄ、Ｅ、およびＦを注入する。注入は、４日間連続で１日１回行う。１−３日間のみの注入は有効であるが、しかし、４日注入プロトコールでより強い効果が予想される。
【０１７６】
投与後、ＨＢＶ ＲＮＡおよびウイルス粒子を含有するＨＢｓＡｇおよびＤＮＡの血清レベルを第１の注入後５日および９日に定量する。すべての分析は、流体力学的送達試験用に記載されている。
【０１７７】
予想結果：
ＨＢＶ特異的ＲＮＡレベル、ＨＢｓＡｇ、およびＤＮＡ粒子を含有するウイルスは、対照に対して製剤Ａ、Ｂ、およびＣ群で減少する。
【０１７８】
実施例５
二重プロモーターの制御下に単一のＨＢＶ由来アンチセンスＲＮＡをコード化するベクター
２つの異なるプロモーターの制御下に、単一のＨＢＶ特異的アンチセンスＲＮＡをコード化する多コンパートメント真核生物プラスミド発現ベクターが構成されている。アンチセンスＲＮＡの転写を誘導するプロモーターは、Ｔ７プロモーター（実施例１に記載）およびＭＣＭＶ最初期プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ０６５７０）である。転写ユニット（シストロン）は、２つの別個の位置に配置された２つのシストロンが存在するように配置されている（図９）。
【０１７９】
ベクターの説明：
ＨＢＶ特異的ＲＮＡ（配列Ａ）は、マップをＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３の２６００−２９９０に調整する。配列は、図９に示されているようにプラスミドの２つの遺伝子座に位置するようにプラスミドベクターへクローン化される。配列は、アンチセンスＲＮＡ（ＨＢＶ ｍＲＮＡに対して）鎖のみが転写されるようにして誘導プロモーターに対して配置される。一方の配列はＴ７プロモーター（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが存在し、または提供される場合細胞質プロモーター）の転写制御下にあり、他方の配列はＭＣＭＶ ＩＥプロモーター（核、非核小体、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーター）の転写制御下にある。Ｔ７ターミネーターは図９に示されているようにＴ７シストロンの末端に位置しており、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ部位がＭＣＭＶシストロンの末端に位置している。ＢＧＨポリＡ部位は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，カリフォルニア州（ＣＡ））からのｐＶＡＸ１など多くの市販のベクターで利用可能であり、例えば、ＰＣＲ増幅によって容易に生成され、かつ当業者によって容易に実行されうる。ポリＡ部位が本実施例に含まれ、有効な細胞質輸送を可能にしたが、１つもしくはそれ以上も連続的輸送エレメント、すなわちＣＴＥによって置換され［１２］、または削除されうる。（必要に応じて、１つもしくはそれ以上の連続的輸送エレメント（ＣＴＥ）配列を添加し、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩによって核で作られる異なるエフェクターＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ヘアピン、または二本鎖ｄｓＲＮＡ）の細胞質輸送を可能にする。ＣＴＥを、イントロンおよび／またはポリＡ配列の代わりに、かつ／またはそれに加えて使用し、輸送を促進することができる。ＣＴＥのための好ましい位置がＲＮＡ分子の３’末端近くにある。必要に応じて、多重ＣＴＥ配列（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくはそれ以上の配列を使用することができる）。好ましいＣＴＥが、参照によって本明細書で援用される、米国特許第５，８８０，２７６号明細書および同第５，５８５，２６３号明細書で開示されているＭａｓｏｎ−Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス由来である。）このベクターは、ＨＢＶレプリコンモデルにおいて評価される。クローニングは、標準の方法を使用して実行され、または必要に応じて、方向性ライゲーションクローニング、ＣＲＣが使用される［３］（参照によって本明細書で援用される、米国特許第６，１４３，５２７号明細書「Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ」、Ｐａｃｈｕｋらの開示を参照）。
【０１８０】
これらのベクターは、実施例１に示されているように、ＨＢＶレプリコンモデルにおいて評価される。この実験のために、上記のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ源を提供するために実験的プラスミドと同時トランスフェクトされる。
【０１８１】
ＨＢＶレプリコンモデル：複製適格細胞培養モデルにおけるサイレンシングＨＢＶ複製および発現
細胞培養モデルの簡単な説明：
Ｈｕｈ７細胞系などヒト肝由来細胞系が、ウイルスＲＮＡのすべてを転写し、感染性ウイルスを産生することが可能である末端が重複するウイルスゲノムから成るＨＢＶの感染性分子クローンとトランスフェクトされる［４−６］。これらの試験で使用されるレプリコンは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３に存在するウイルス配列由来である。肝細胞への内在化および核局在化の後、一部のウイルスプロモーターからの感染性ＨＢＶプラスミドの転写は、ＨＢＶ複製を反映させる一連の事象を開始することが証明されている。これらの事象としては、転写ウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写プレゲノムＲＮＡのコア粒子へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写、およびビリオンとＨＢｓＡｇ粒子のトランスフェクト細胞の培地への集合と分泌が挙げられる。このトランスフェクションモデルは、感染肝細胞内のＨＢＶ複製の大部分の態様を再現し、したがって、ＨＢＶ発現および複製のサイレンシングを観察するには優れた細胞培養モデルである。
【０１８２】
本モデルでは、細胞が評価されるＨＢＶの感染性分子クローンおよびエフェクターＲＮＡ構築物と同時トランスフェクトされる。次いで、細胞がＨＢＶ発現および複製の喪失について下記のとおりモニタリングされる。
【０１８３】
実験手順：
トランスフェクション。トランスフェクションの時点で８０−９０％密集度となるように、Ｈｕｈ７細胞を６ウェルプレートへ接種する。すべてのトランスフェクションは、リポフェクタミン（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をメーカーの指示に従って使用して行われる。本実験では、感染性ＨＢＶプラスミド５０ｎｇ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド１μｇ（実施例１のプラスミドの説明）、および図９に示された実験プラスミド１．５μｇで細胞をトランスフェクトする。対照細胞は、ＨＢＶプラスミド５０ｎｇおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド１μｇでトランスフェクトする。不活性フィラーＤＮＡ、ｐＧＬ３−ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））をすべてのトランスフェクションに添加し、全ＤＮＡ／トランスフェクションを２．５μｇ ＤＮＡまでにする。
【０１８４】
ＨＢＶ発現の喪失についての細胞のモニタリング
トランスフェクション後、ＨＢｓＡｇ分泌およびＤＮＡ含有ウイルス粒子分泌を測定することによってＨＢＶ発現および複製の喪失または削減について細胞をモニタリングする。ｄｓＲＮＡ投与後２日で開始し、その後３週間一日おきにトランスフェクト細胞の培地を評価することによって細胞をモニタリングする。アボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、イリノイ州（ＩＬ））から市販のＡｕｓｚｙｍｅ ＥＬＩＳＡを使用し、表面Ａｇ（ｓＡｇ）を検出する。ｓＡｇを測定するのは、表面Ａｇがウイルス複製だけではなく、トランスフェクト感染性ＨＢＶクローンにおける表面ＡｇシストロンのＲＮＡポリメラーゼＩＩ開始転写とも関係があるためである。表面Ａｇ合成はＨＢＶ複製の非存在下に持続しうるため、ウイルス複製だけではなくｓＡｇの複製依存合成もダウンレギュレートすることが重要である。カプシドで包まれたＨＢＶゲノムＤＮＡを含有するビリオン粒子の分布も測定される。カプシドで包まれたＤＮＡを含有するビリオン粒子の喪失は、ＨＢＶ複製の喪失を示す。
【０１８５】
ビリオン分泌の分析は、裸の未熟コア粒子とエンベロープを持った感染性ＨＢＶビリオンを区別する方法を含む［７］。手短に言えば、培養細胞の培地からのペレットウイルス粒子をプロテイナーゼＫ消化にさらし、コアタンパク質を分解させる。プロテイナーゼＫの不活性化後、サンプルをＲＱ１ＤＮａｓｅ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））でインキュベートし、コア粒子から遊離されたＤＮＡを分解する。ＳＤＳの存在下にプロテイナーゼＫでサンプルを再び消化し、ＤＮａｓｅを不活性化するとともに、感染性のエンベロープを持ったビリオン粒子を崩壊、分解させる。次いで、フェノール／クロロホルム抽出によってＤＮＡを精製し、エタノール沈殿させる。ＨＢＶ特異的ＤＮＡをゲル電気泳動後のサザンブロット分析によって検出する。
【０１８６】
予想結果は、ＨＢＶプラスミドＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドおよびフィラーＤＮＡのみでトランスフェクトされた細胞に対して、ＨＢＶプラスミド、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド、および実験的プラスミドでトランスフェクトされた細胞の培地におけるｓＡｇおよびウイルス粒子分泌における減少を示す。
【０１８７】
実施例６
プロモーターを利用するベクター：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現をドライブする核プロモーター、ならびにセンスおよびアンチセンスＲＮＡの発現をそれぞれドライブする２つのＴ７プロモーター
ＨＢＶ特異的ＲＮＡ配列のセンスおよびアンチセンス鎖をコード化するプラスミド（図１０ａ参照）が構成されている。センスおよびアンチセンスＲＮＡの発現は、２つの別個のシストロンに位置している２つのＴ７プロモーターの制御下にある。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子も同じベクター上でＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ＲＳＶプロモーターの制御下にコード化される。細胞においては、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩは核（非核小体）におけるＲＳＶプロモーターからＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を転写する。次いで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼｍＲＮＡは細胞質に輸送され、かつ翻訳され、そこで活性であり、かつＴ７ドライブセンスおよびアンチセンスＲＮＡを細胞質的に局在したプラスミドから転写する。次いで、センスおよびアンチセンスＲＮＡは互いに塩基対を成し、二本鎖ｄｓＲＮＡを形成する。
【０１８８】
ベクターの説明：
ＨＢＶ特異的ＲＮＡ（配列Ａ）は、マップを登録番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３の２６００−２９９０に調整する。配列は、図１０ａに示されているようにプラスミドの２つの遺伝子座に位置するようにプラスミドベクターへクローン化される。配列は、アンチセンスＲＮＡ（ＨＢＶ ｍＲＮＡに対して）が１つのＴ７プロモーターによって転写され、センスＲＮＡがその他によって転写されるようにして誘導プロモーターに対して配置される。Ｔ７ターミネーターは各Ｔ７シストロンの末端に位置している。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現カセットの配列が図１０ｂ（配列番号３）に示されており、ＲＳＶプロモーター、５’ＵＴＲ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼコード領域、およびＢＧＨポリアデニル化部位で構成されている。ベクターの図が図１０ａに示されている。このベクターは、以下に記載されているＨＢＶレプリコンモデルで評価される。クローニングは、標準の方法を使用して実行され、または必要に応じて、方向性ライゲーションクローニング、ＣＲＣが使用される［３］（参照によって本明細書で援用される、米国特許第６，１４３，５２７号明細書「Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ」、Ｐａｃｈｕｋらの開示を参照）。
【０１８９】
ＨＢＶレプリコンモデル：複製適格細胞培養モデルにおけるサイレンシングＨＢＶ複製および発現
細胞培養モデルの簡単な説明：
Ｈｕｈ７細胞系などヒト肝由来細胞系が、ウイルスＲＮＡのすべてを転写し、感染性ウイルスを産生することが可能である末端が重複するウイルスゲノムから成るＨＢＶの感染性分子クローンとトランスフェクトされる［４−６］。これらの試験で使用されるレプリコンは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３に存在するウイルス配列由来である。肝細胞への内在化および核局在化の後、一部のウイルスプロモーターからの感染性ＨＢＶプラスミドの転写は、ＨＢＶ複製を反映させる一連の事象を開始することが証明されている。これらの事象としては、転写ウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写プレゲノムＲＮＡのコア粒子へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写、およびビリオンとＨＢｓＡｇ粒子のトランスフェクト細胞の培地への集合と分泌が挙げられる。このトランスフェクションモデルは、感染肝細胞内のＨＢＶ複製の大部分の態様を再現し、したがって、ＨＢＶ発現および複製のサイレンシングを観察するには優れた細胞培養モデルである。
【０１９０】
本モデルでは、細胞が評価されるＨＢＶの感染性分子クローンおよびエフェクターＲＮＡ構築物と同時トランスフェクトされる。次いで、細胞がＨＢＶ発現および複製の喪失について下記のとおりモニタリングされる。
【０１９１】
実験手順：トランスフェクション
トランスフェクションの時点で８０−９０％密集度となるように、Ｈｕｈ７細胞を６ウェルプレートへ接種する。すべてのトランスフェクションは、リポフェクタミン（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をメーカーの指示に従って使用して行われる。本実験では、感染性ＨＢＶプラスミド５０ｎｇおよび図１０ａに示された実験プラスミド２．５μｇで細胞をトランスフェクトする。対照細胞は、ＨＢＶプラスミド５０ｎｇでトランスフェクトする。不活性フィラーＤＮＡ、ｐＧＬ３−ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））をすべてのトランスフェクションに添加し、全ＤＮＡ／トランスフェクションを２．５μｇ ＤＮＡまでにする。
【０１９２】
ＨＢＶ発現の喪失についての細胞のモニタリング
トランスフェクション後、ＨＢｓＡｇ分泌およびＤＮＡ含有ウイルス粒子分泌を測定することによってＨＢＶ発現および複製の喪失または削減について細胞をモニタリングする。ｄｓＲＮＡ投与後２日で開始し、その後３週間一日おきにトランスフェクト細胞の培地を評価することによって細胞をモニタリングする。アボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、イリノイ州（ＩＬ））から市販のＡｕｓｚｙｍｅ ＥＬＩＳＡを使用し、表面Ａｇ（ｓＡｇ）を検出する。ｓＡｇを測定するのは、表面Ａｇがウイルス複製だけではなく、トランスフェクト感染性ＨＢＶクローンにおける表面ＡｇシストロンのＲＮＡポリメラーゼＩＩ開始転写とも関係があるためである。表面Ａｇ合成はＨＢＶ複製の非存在下に持続しうるため、ウイルス複製だけではなくｓＡｇの複製依存合成もダウンレギュレートすることが重要である。カプシドで包まれたＨＢＶゲノムＤＮＡを含有するビリオン粒子の分布も測定される。カプシドで包まれたＤＮＡを含有するビリオン粒子の喪失は、ＨＢＶ複製の喪失を示す。
【０１９３】
ビリオン分泌の分析は、裸の未熟コア粒子とエンベロープを持った感染性ＨＢＶビリオンを区別する方法を含む［７］。手短に言えば、培養細胞の培地からのペレットウイルス粒子をプロテイナーゼＫ消化にさらし、コアタンパク質を分解させる。プロテイナーゼＫの不活性化後、サンプルをＲＱ１ＤＮａｓｅ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））でインキュベートし、コア粒子から遊離されたＤＮＡを分解する。ＳＤＳの存在下にプロテイナーゼＫでサンプルを再び消化し、ＤＮａｓｅを不活性化するとともに、感染性のエンベロープを持ったビリオン粒子を崩壊、分解させる。次いで、フェノール／クロロホルム抽出によってＤＮＡを精製し、エタノール沈殿させる。ＨＢＶ特異的ＤＮＡをゲル電気泳動後のサザンブロット分析によって検出する。
【０１９４】
予想結果は、ＨＢＶプラスミド、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド、およびフィラーＤＮＡのみでトランスフェクトされた細胞に対して、ＨＢＶプラスミド、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド、および実験的プラスミドでトランスフェクトされた細胞の培地におけるＨＢｓＡｇおよびウイルス粒子分泌における減少を示す。
【０１９５】
実施例７
二重／組込みプロモーター発現系：組込みプロモーター系を利用する多コンパートメント真核生物発現：ＭＣＭＶプロモーター内に組込まれるＴ７プロモーター
ＨＢＶ特異的アンチセンスＲＮＡ配列をコード化するプラスミドが構成されている。アンチセンスＲＮＡの発現は、組込みプロモーターの制御下にある（図１１）。この発現プラスミドは、実施例１に示されているように、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現ベクターといっしょに送達される。二重／組込みプロモーターを生成するには、ＭＣＭＶプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３９２２）の３’末端における最後の１７個のヌクレオチドが削除され、図１１に示されているようにＴ７プロモーターで置換される。細胞質においては、組込みプロモーターベクターがＴ７プロモーターからアンチセンスＲＮＡを発現するが、核に局在したベクターは、核において活性であるＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターであるＭＣＭＶプロモーターからアンチセンスＲＮＡを発現する。
【０１９６】
ベクターの説明：
ＨＢＶ特異的ＲＮＡ（配列Ａ）は、マップを登録番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３の２６００−２９９０に調整する。配列は、アンチセンス鎖がプロモーターに対して転写されるような方向でプラスミドベクターへクローン化される。ＭＣＭＶプロモーターは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３９２２を含めて座標１−１１２３にマッピングする配列を含有する。Ｔ７プロモーター（実施例１に記載されているように）は、この配列と直接並列し、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３９２２の座標１１２３にマッピングするＭＣＭＶヌクレオチドの直後のヌクレオチドがＴ７プロモーターの第１のヌクレオチドであるようになっている（図１２）。Ｔ７ターミネーターおよびＢＧＨポリアデニル化シグナルは、図１１に示されているようにベクターに位置している。
【０１９７】
このベクターは、以下に記載されているＨＢＶレプリコンモデルで評価される。クローニングは、標準の方法を使用して実行され、または必要に応じて、方向性ライゲーションクローニング、ＣＲＣが使用される［３］（参照によって本明細書で援用される、米国特許第６，１４３，５２７号明細書「Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ」、Ｐａｃｈｕｋらの開示を参照）。
【０１９８】
ＨＢＶレプリコンモデル：複製適格細胞培養モデルにおけるサイレンシングＨＢＶ複製および発現
細胞培養モデルの簡単な説明：
Ｈｕｈ７細胞系などヒト肝由来細胞系が、ウイルスＲＮＡのすべてを転写し、感染性ウイルスを産生することが可能である末端が重複するウイルスゲノムから成るＨＢＶの感染性分子クローンとトランスフェクトされる［４−６］。これらの試験で使用されるレプリコンは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３に存在するウイルス配列由来である。肝細胞への内在化および核局在化の後、一部のウイルスプロモーターからの感染性ＨＢＶプラスミドの転写は、ＨＢＶ複製を反映させる一連の事象を開始することが証明されている。これらの事象としては、転写ウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写プレゲノムＲＮＡのコア粒子へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写、およびビリオンとＨＢｓＡｇ粒子のトランスフェクト細胞の培地への集合と分泌が挙げられる。このトランスフェクションモデルは、感染肝細胞内のＨＢＶ複製の大部分の態様を再現し、したがって、ＨＢＶ発現および複製のサイレンシングを観察するには優れた細胞培養モデルである。
【０１９９】
本モデルでは、細胞が評価されるＨＢＶの感染性分子クローンおよびエフェクターＲＮＡ構築物と同時トランスフェクトされる。次いで、細胞がＨＢＶ発現および複製の喪失について下記のとおりモニタリングされる。
【０２００】
実験手順：トランスフェクション
トランスフェクションの時点で８０−９０％密集度となるように、Ｈｕｈ７細胞を６ウェルプレートへ接種する。すべてのトランスフェクションは、リポフェクタミン（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をメーカーの指示に従って使用して行われる。本実験では、感染性ＨＢＶプラスミド５０ｎｇおよび図１１に示された実験プラスミド２．５μｇで細胞をトランスフェクトする。対照細胞は、ＨＢＶプラスミド５０ｎｇでトランスフェクトする。不活性フィラーＤＮＡ、ｐＧＬ３−ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））をすべてのトランスフェクションに添加し、全ＤＮＡ／トランスフェクションを２．５μｇ ＤＮＡまでにする。
【０２０１】
ＨＢＶ発現の喪失についての細胞のモニタリング
トランスフェクション後、ＨＢｓＡｇ分泌およびＤＮＡ含有ウイルス粒子分泌を測定することによってＨＢＶ発現および複製の喪失または削減について細胞をモニタリングする。ｄｓＲＮＡ投与後２日で開始し、その後３週間一日おきにトランスフェクト細胞の培地を評価することによって細胞をモニタリングする。アボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、イリノイ州（ＩＬ））から市販のＡｕｓｚｙｍｅ ＥＬＩＳＡを使用し、ＨＢＶ表面Ａｇ（ｓＡｇ）を検出する。ＨＢｓＡｇを測定するのは、表面Ａｇがウイルス複製だけではなく、トランスフェクト感染性ＨＢＶクローンにおける表面ＡｇシストロンのＲＮＡポリメラーゼＩＩ開始転写とも関係があるためである。表面Ａｇ合成はＨＢＶ複製の非存在下に持続しうるため、ウイルス複製だけではなくｓＡｇの複製依存合成もダウンレギュレートすることが重要である。カプシドで包まれたＨＢＶゲノムＤＮＡを含有するビリオン粒子の分布も測定される。カプシドで包まれたＤＮＡを含有するビリオン粒子の喪失は、ＨＢＶ複製の喪失を示す。
【０２０２】
ビリオン分泌の分析は、裸の未熟コア粒子とエンベロープを持った感染性ＨＢＶビリオンを区別する方法を含む［７］。手短に言えば、培養細胞の培地からのペレットウイルス粒子をプロテイナーゼＫ消化にさらし、コアタンパク質を分解させる。プロテイナーゼＫの不活性化後、サンプルをＲＱ１ＤＮａｓｅ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））でインキュベートし、コア粒子から遊離されたＤＮＡを分解する。ＳＤＳの存在下にプロテイナーゼＫでサンプルを再び消化し、ＤＮａｓｅを不活性化するとともに、感染性のエンベロープを持ったビリオン粒子を崩壊、分解させる。次いで、フェノール／クロロホルム抽出によってＤＮＡを精製し、エタノール沈殿させる。ＨＢＶ特異的ＤＮＡをゲル電気泳動後のサザンブロット分析によって検出する。
【０２０３】
予想結果は、ＨＢＶプラスミドＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド、およびフィラーＤＮＡのみでトランスフェクトされた細胞に対して、ＨＢＶプラスミド、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド、および実験的プラスミドでトランスフェクトされた細胞の培地におけるｓＡｇおよびウイルス粒子分泌における減少を示す。
[1] Lyakhov, D.L., et al., Pausing and termination by bacteriophage T7 RNA polymerase. J. Mol. Biol. 280:201-213 (1998).
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【配列表フリーテキスト】
【０２０４】
配列番号１は、Ｔ７プロモーターを表す。
配列番号２は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を表す。
配列番号３は、ＲＳＶプロモーター、５’ＵＴＲ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼコード領域、およびＢＧＨポリアデニル化部位を含んで成るＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現ユニットを表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つもしくはそれ以上の発現構築物を含んで成る真核生物発現系であって、前記１つもしくはそれ以上の発現構築物が集合的に少なくとも第１および第２のプロモーターを含んで成り、かつ前記第１および第２のプロモーターが各々同じ真核細胞の異なる細胞内コンパートメント内で転写活性である真核生物発現系。
【請求項２】
前記第１および第２のプロモーターが異なる分子をコード化する核酸配列に作動可能に結合されている、請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
前記第１および第２のプロモーターが同じ分子をコード化する核酸配列に作動可能に結合されている、請求項１に記載の発現系。
【請求項４】
前記第１および第２のプロモーターがいずれも前記核酸配列の単一コピーに作動可能に結合されている、請求項３に記載の発現系。
【請求項５】
前記第１および第２のプロモーターが前記核酸配列の異なるコピーに作動可能に結合されている、請求項３に記載の発現系。
【請求項６】
前記細胞内コンパートメントが、細胞質、ミトコンドリア、核、核小体、細胞質内の機能的ドメイン、核内の機能的ドメイン、および核小体内の機能的ドメインから選択される、請求項１に記載の発現系。
【請求項７】
前記第１および第２のプロモーターが、核および細胞質において、核およびミトコンドリアにおいて、核および核小体において、細胞質およびミトコンドリアにおいて、細胞質および核小体において、ミトコンドリアおよび核小体において、または核小体の異なる機能的コンパートメントにおいて転写活性である、請求項１に記載の発現系。
【請求項８】
第３のプロモーターをさらに含んで成る、請求項１に記載の発現系。
【請求項９】
前記第３のプロモーターが、前記第１および第２のプロモーターと異なる細胞内コンパートメント内で転写活性を有する、請求項８に記載の発現系。
【請求項１０】
前記第１、第２、および第３のプロモーターが、細胞質、核、および核小体において、細胞質、核、およびミトコンドリアにおいて、細胞質、核小体、およびミトコンドリアにおいて、またはミトコンドリア、核小体、およびミトコンドリアにおいて転写活性を有する、請求項８に記載の発現系。
【請求項１１】
前記プロモーターが、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ、Ｔ７、ＳＰ６、ＳＰ３、ＲＮＡウイルスプロモーター、ミトコンドリア重鎖プロモーター、ミトコンドリア軽鎖プロモーター、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ型２プロモーター、およびＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ型３プロモーターから選択される、請求項１に記載の発現系。
【請求項１２】
前記第１および第２のプロモーターが単一の発現構築物に位置している、請求項１に記載の発現系。
【請求項１３】
前記第１および第２のプロモーターが２つの異なる発現構築物に位置している、請求項１に記載の発現系。
【請求項１４】
前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項１に記載の発現系。
【請求項１５】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項１４に記載の発現系。
【請求項１６】
前記発現構築物が同じ組成物から前記真核細胞に送達される、請求項１に記載の発現系。
【請求項１７】
前記発現構築物が２つの異なる組成物から前記真核細胞に送達される、請求項１に記載の発現系。
【請求項１８】
前記２つの組成物が前記真核細胞に同時に送達される、請求項１７に記載の発現系。
【請求項１９】
前記２つの組成物が前記真核細胞に異なる時点で送達される、請求項１７に記載の発現系。
【請求項２０】
前記第１のプロモーターまたは前記第２のプロモーターが、標的遺伝子の発現を調節することが可能な分子をコード化する核酸配列に作動可能に結合されている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項２１】
前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターが、標的遺伝子の発現を調節することが可能な分子をコード化する核酸配列に各々作動可能に結合されている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の発現系。
【請求項２２】
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項２０に記載の発現系。
【請求項２３】
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項２１に記載の発現系。
【請求項２４】
請求項１〜１３の発現構築物の１つもしくはそれ以上を真核細胞に送達することを特徴とする、目的とする分子を真核細胞に送達する方法であって、発現構築物の少なくとも１つが、目的とする分子の少なくとも一部分をコード化する核酸配列を含んで成るものである、方法。
【請求項２５】
前記１つもしくはそれ以上の発現構築物が、異なる組成物から前記真核細胞に送達される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つもしくはそれ以上の発現構築物が、同じ組成物から前記真核細胞に送達される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記目的とする分子が、標的遺伝子の発現を調節することが可能である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記目的とする分子が、標的遺伝子の発現を調節することが可能である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的遺伝子がウイルス遺伝子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記真核細胞が哺乳類細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも第１および第２のプロモーターを含んで成り、前記第１および第２のプロモーターが同じ真核細胞の異なる細胞内コンパートメント内で各々転写活性を有する、発現構築物。
【請求項３６】
請求項３５に記載の構築物を含んで成る哺乳類細胞。
【請求項３７】
請求項３５に記載の構築物を含んで成るヒト細胞。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【公開番号】特開２０１２−８０８８９（Ｐ２０１２−８０８８９Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２５６１２２（Ｐ２０１１−２５６１２２）
【出願日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【分割の表示】特願２００６−５２４０６２（Ｐ２００６−５２４０６２）の分割
【原出願日】平成１６年８月２０日（２００４．８．２０）
【出願人】（５０５３６９１５８）アルナイラム　ファーマシューティカルズ，　インコーポレイテッド (51)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＮＹＬＡＭ　ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，　ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】

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