多孔複合材料、その生成方法およびその再生医療デバイス類への使用
本発明は、多孔複合材料に関し、その多孔複合材料は、少なくとも１つの相互分散させたバイオポリマーを有し、ミネラル成分の総重量に対して、５０重量％から９５重量％のα−リン酸三カルシウム（α‐ＴＣＰ，α‐Ｃａ３（ＰＯ４）２）と、５重量％から５０重量％のリン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ，Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）とからなるカルシウム‐リン酸ミネラル成分を有して形成される。α‐ＴＣＰとＯＣＰのそのような組み合わせは、生体内での吸収率を上げるので、ナノ結晶構造の低結晶度のミネラル成分を持つ新しい骨組織の短時間での形成を可能にする。この特徴は、生体のリン灰石の特徴と非常に似ている。この多孔複合材料は、骨および／または軟骨の代用品（骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ））としての利用、再生医療デバイス類の生成に関する利用を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔複合材料に関し、その生成方法、骨および／または軟骨の再生への使用、そして再生医療デバイス類（ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅｓ）の実現に関する。
【背景技術】
【０００２】
周知のように、骨組織は、極めて複雑なバイオミネラル複合材料（ｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）であり、主に、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）および水のような無機材料（７０〜８０％）と、Ｉ型コラーゲン、プロテオグリカン類およびその他の非コラーゲンタンパク質類（ｎｏｎ‐ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のような有機材料類（２０〜３０％）とで構成される。骨を生成する間は、低結晶度のヒドロキシアパタイトのナノ結晶が増殖し、有機材料の繊維状と強固に結びつき、そのようにして、機械特性および弾性特性に極めて優れたナノ構造複合材料を形成する。
【０００３】
骨の欠陥や、欠損部の整復に係る需要または既存部の増量に係る需要は、整形外科、美容整形および神経外科の分野で大きな課題となっている。骨の代替材料として、様々な生体医療材料が研究され提案されているが、それらは、高い生体適合性を有さなければならないと共に、生物学的構造をホストの骨組織および細胞と活性化させるようなバイオ特性を有さなければならず、新しい組成および骨の固化プロセスが提案され続けている。この固化プロセス機能が完了すると、通常は、これらの材料は完全に再吸収され、新しく形成される骨の専用スペースを残す。この再生方法は、通常、“骨再生誘導法（ｇｕｉｄｅｄ ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）”といわれる。
【０００４】
例えば、国際特許出願０３／０７１９９１において、多孔マトリクス（ｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｒｉｘ）が開示されており、骨を再生する材料として使用可能である。この多孔マトリクスは、水に溶けない繊維ポリマーから成り、特に、不溶性のコラーゲン、コラーゲン誘導体もしくは変性のゼラチン誘導体であり、リン酸カルシウムとミネラル化される。
【０００５】
このバイオポリマーは、水溶性リガンドと混ぜて使用されてもよく、例えば水溶性リガンドは、水溶性のコラーゲンやゼラチン、ポリ乳酸、ポリグリセリン酸およびその他の水溶性リガンドである。ミネラル化すなわち石灰化は、ポリマー繊維を、カルシウムイオンとリン酸塩イオンの塩基性のｐＨの水溶液で処理することで得られる。その後、水溶性のリガンドは、ミネラル化されたバイオポリマー水溶液に加えられて混ぜられて、その混合物は冷却されて凍結乾燥される。多孔マトリクスは、例えばグルタルアルデヒトを加えて架橋される。
【０００６】
国際特許出願ＷＯ０６／０３１１９６には、バイオ材料とミネラルチャージ（ｍｉｎｅｒａｌ ｃｈａｒｇｅ）とを含む多孔複合物が開示されている。そのバイオ材料は、広範囲の製品から選択されおり、プロテイン類（例えば、コラーゲン、エラスチン、ゼラチンおよびその他）、ペプチド類、多糖類である。ミネラルチャージは、リン酸カルシウムであってもよく、例えば、リン灰石、代用リン灰石、またはブルッシャイト、リン酸三カルシウム、リン酸オクタカルシウムであってもよい。その生体鉱物は、様々な架橋剤と架橋されてもよく、例えば、架橋剤は、アクリルアミド類、ジオン類（ｄｉｏｎｓ）、グルタルアルデヒド、アセトアルデヒド、ホルムアルデヒド、またはリボースのような架橋剤である。合成物は、水中で、様々な手法によって、バイオ材料とミネラルチャージとを混ぜることにより準備され、懸濁液が得られ、その後、凍結乾燥される。
【０００７】
Ｃｈｕｎ‐Ｈｓｕ Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．“Ｃａｌｖａｒｉａｌ ｂｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐ｇｅｎｉｐｉｎ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｇｅｌａｔｉｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６ （２００５），Ｐ．３０６５−３０７４は、ゼラチンをゲニピンおよびリン酸三カルシウムのセラミックの粒子と架橋させて得られる生体分解性の多孔合成物の生体内における生体反応に関する研究を報告している。ゼラチンの架橋を引き起こすために、０．５重量％のゲニピン水溶液が１８％のゼラチン水溶液に加えられる。その後に、２００〜３００μｍの粒子のリン酸三カルシウム（Ｍｅｒｃｋ）が加えられる。凝固後、合成物は−８０℃で凍結されて凍結乾燥される。
【０００８】
Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．“Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｓｐｏｎｇｅｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ β‐ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ"， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６（２００５），Ｐ３５８７−３５９６は、ゼラチンとβ−リン酸三カルシウムとから構成される生体分解性の多孔材料の生成および生体外における間葉系幹細胞の骨形成分化への使用について開示している。これらの材料は、β‐リン酸三カルシウムが存在する下で、ゼラチンをグルタルアルデヒドと架橋させることにより準備されて、その後凍結乾燥される。
【０００９】
Ｈａｅ‐Ｗｏｎ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎ‐ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ” ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６（２００５），Ｐ５２２１−５２３０は、ナノ複合材料ベースのコラーゲン／水酸化リン灰石が存在する条件下での、骨芽細胞の生体外での反応に関する研究に最終的に注目している。そのナノ複合材料は、ゼラチン溶液でヒドロキシアパタイトを共沈させることにより生成され、その後凍結乾燥される。そのヒドロキシアパタイトは、ゼラチン溶液に、カルシウムイオンとリン酸イオンを加えて得るか、または、ゼラチン溶液に、粉末のヒドロキシアパタイトを直接混合することで得ても良い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
出願人は、骨および／または軟骨の再生を加速するために使用可能な多孔複合材料を得ることを目的とする。その多孔複合材料は、生体内での吸収率に優れ、急速に新組織を形成するプロセスに適している。このようにして、この複合材料は、骨および／または軟骨の再生技術を提供し、再生医学デバイスを実現することに特に適する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
出願人は、この問題が、下記の請求項で請求されている多孔複合材料により、解決されるという驚くべき発見をした。すなわち、少なくとも１つの相互分散させたバイオポリマーは、ミネラル成分の総重量に対して、５０重量％から９５重量％のα−リン酸三カルシウム（α‐ＴＣＰ，α‐Ｃａ３（ＰＯ４）２）と、５重量％から５０重量％のリン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ，Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）とからなるカルシウム‐リン酸ミネラル成分を有して形成される。α‐ＴＣＰとＯＣＰのこの組み合わせは、生体内での吸収率を上げるので、ナノ結晶構造の低結晶度のミネラル成分を持つ新しい骨組織の短時間での形成を可能にする。この特徴は、生体のリン灰石の特徴と非常に似ている。
【００１２】
したがって、第１の特徴に関する本発明は、ミネラル成分に相互分散された少なくとも１つのバイオポリマーからなる多孔複合材料に関する発明であり、そのミネラル成分は、ミネラル成分の総重量に対して、５０重量％から９５重量％のα‐リン酸三カルシウム（α‐ＴＣＰ）と５重量％から５０重量％のリン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ）とからなる。
【００１３】
好ましくは、ミネラル成分は、６０重量％から８５重量％のα‐ＴＣＰと、１５重量％から４０重量％のＯＣＰとから成る。さらに好ましくは、ミネラル成分は、７０重量％ から８０重量％のα‐ＴＣＰと、２０重量％から３０重量％のＯＣＰから成る。
【００１４】
好ましくは、バイオポリマーはタンパク質もしくは多糖類である。さらに好ましくは、バイオポリマーは水溶性のタンパク質であって、特に、動物性ゼラチンから得られる。動物性ゼラチンは、例えば、筋肉や結合組織のような生体組織であって、例えば、骨、腱、じん帯、軟骨、皮膚（ｓｋｉｎ、ｄｅｒｍａ）から採取される。多孔複合材料は、好ましくは、３０重量％から９９重量％、さらに好ましくは、５５重量％から９５重量％の少なくとも１つのバイオポリマーと、１重量％から７０重量％、さらに好ましくは、５重量％から４５重量％の上記ミネラル成分とからなる。この割合は、多孔複合材料の総重量に対する割合である。
【００１５】
別の特徴として、本発明は、前記の多孔複合材料を生成する方法に関する。多孔複合材料は、発泡体を得るために、水性溶媒中で、少なくとも１つのバイオポリマーを、α−リン酸三カルシウム （α‐ＴＣＰ）で実質的に構成されるミネラル成分と混ぜる工程と、そのようにして得られた発泡体を、バイオポリマーのゲル化を得るために必要な時間放置する工程と、−２０℃よりも低い温度、好ましくは−９０℃よりも低い温度で発泡体を冷却する工程と、冷却された発泡体を凍結乾燥する工程とを有する。
【００１６】
別の特徴として、本発明は、上記の多孔複合材料の使用に関する発明であって、骨および／または軟骨の再生のための材料への使用を含む。
【００１７】
別の特徴として、本発明は、上記の多孔複合材料の使用に関する発明であって、組織工学デバイスの製造物のための材料への使用を含む。
【００１８】
別の特徴として、本発明は、上記の多孔複合材料の使用に関する発明であって、骨および／または軟骨の代用品（骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ））への使用を含む。
【００１９】
本発明の製造方法によれば、上記のα‐ＴＣＰとＯＣＰとの組み合わせは、水溶液中のα−ＴＣＰが部分的に加水分解されてＯＣＰになる際のα‐ＴＣＰから得られる。この点においては、Ｂｉｇｉ ｅｔ ａｌ．“Ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｏ ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２３（２００２），Ｐ．１８４９−１８５４を参照。
【００２０】
本発明のこのような結果は、他のリン酸カルシウムからは得られない。たとえば、α‐ＴＣＰとは全く異なるＴＣＰの結晶状態であるβ‐ＴＣＰからであっても、ＴＣＰとして一般的に販売されている市販品の主成分であるヒドロキシアパタイトからであっても、本発明のような結果は得られない。このことは、出願人により実験されて証明されており、以後に報告されている。
【００２１】
好適な実施例によれば、前記少なくとも１つのバイオポリマーは、本発明多孔複合材料に含まれて、架橋されている。こうすることによって、以下の用途が必要とする高い機械的な耐圧性と良好な耐劣化性とを調節可能である。
【００２２】
バイオポリマーの架橋は、生成中に、少なくとも１つの架橋剤を加えることで得ても良い。架橋剤は、たとえば、アクリルアミドのようなアミド類、グルタルアルデヒドのようなアルデヒド類、ジオン類から選択されても良い。
【００２３】
特に好適な架橋剤はゲニピンで、極めて低い細胞毒性の生分解性の天然産物である。ゲニピンはゲニポシドの加水分解生成物であって、通常は、アカネ科クチナシ属の実（ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ ｏｆ Ｇａｒｄｅｎｉａ ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ Ｅｌｌｉｓ）から得られる。
【００２４】
架橋剤は、バイオポリマーの架橋結合を得るために必要な時間かき混ぜる間に、バイオポリマーとα‐ＴＣＰとが拡散された水性の溶媒に加えられる。架橋剤の量は、通常、バイオポリマーの重量に対して、０．５重量％から５重量％、好ましくは、１．５重量％から３．０重量％である。
【００２５】
冷却されて凍結乾燥される前に、その取得された発泡体は、バイオポリマーをゲル化するために必要な時間放置される。
【００２６】
使用目的に合わせて最終的な材料の形状とサイズを調整するために、ゲル化の段階は、適切なサイコロ形状であっても良い。そうすることで、無駄が最小限になる。そうでなければ、適した形と大きさを得るために、凍結乾燥後に材料をカットしても良い。
【００２７】
凍結乾燥の工程は、一般的な方法で行われる。通常は−２０℃以下、好ましくは−４０から−６０℃の間で、通常は、１８時間以上の時間で、好ましくは、２４時間から３日の間で、通常は、１０ミリバールを越えない減圧環境で、好ましくは、０．１から１．０ミリバールで凍結乾燥の工程が実行される。
【００２８】
本発明に係る複合材料は、多孔構造を有し、その平均パーティクルサイズは１μｍから５００μｍである。ＳＥＭ分析によると、多孔構造はマクロ多孔性とミクロ多孔性とを有すると共に、相互接合したマクロ気孔を有し、そのマクロ気孔の平均パーティクルサイズは１００μｍから２００μｍである。マクロ気孔の気孔壁はミクロ気孔であり、そのミクロ気孔の平均パーティクルサイズは数マイクロメートルである。
【００２９】
本発明に係る多孔複合材料は、生体内および／または生体外の再生医療用のセルであっても良い。これらのセルは、分化型（骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞など）、および／または未分化型（間葉幹細胞など）、自己移植型または同種移植型であり、手術での移植の際に、多孔複合材料と結合されても良い。また、それらは、生体内で移植されるように、生体外で工学的な構造を得るために培養しても良い。成長因子またはその他のタンパク質類および／または生体刺激（合成とバイオの両方、自己移植型または同種移植型）は、それらの製造工程で、多孔複合材料と結合されても良い。同時に、その移植手術の際にセルはあってもなくても良く、移植の前の生体外での工学的に生成する段階であっても良い。
【００３０】
本発明のいくらかの例を図示するが、本発明の範囲の範囲を何ら制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ゼラチンの多孔材料のＳＥＭ画像の様々な拡大図である。このゼラチン多孔材料はミネラル成分を含まない。
【図２】図２は本発明に係る多孔複合材料のＳＥＭ画像の様々な拡大図である。図２の多孔複合材料は、多孔複合材料の総量重量に対して、９重量％のミネラル成分を含む。
【図３】図３は本発明に係る多孔複合材料のＳＥＭ画像の様々な拡大図である。図３の多孔複合材料は、多孔複合材料の総量重量に対して、２３重量％のミネラル成分を含む。
【図４】図４は本発明に係る多孔複合材料のＳＥＭ画像の様々な拡大図である。図４の多孔複合材料は、多孔複合材料の総量重量に対して、３３重量％のミネラル成分を含む。
【図５】図５は本発明に係る多孔複合材料のＳＥＭ画像の様々な拡大図である。図５の多孔複合材料は、多孔複合材料の総量重量に対して、４２重量％のミネラル成分を含む。
【図６】図６は、本発明の多孔複合材料の生成に用いられるα‐ＴＣＰの粉末のＸ線回折図である。
【図７】図７は、本発明の多孔複合材料から分離されたミネラル成分の粉末のＸ線回折図である。図７の多孔複合材料は、多孔複合材料の総重量に対して、２３重量％のミネラル成分を含む。
【図８】図８は、本発明の多孔複合材料から分離されたミネラル成分の粉末のＸ線回折図である。図８の多孔複合材料は、多孔複合材料の総重量に対して、３３重量％のミネラル成分を含む。
【図９】図９は、本発明の多孔複合材料から分離されたミネラル成分の粉末のＸ線回折図である。図９の多孔複合材料は、多孔複合材料の総重量に対して、４２重量％のミネラル成分を含む。
【図１０】図１０は、従来技術の多孔複合材料の生成に用いられるβ‐ＴＣＰの粉末のＸ線回折図である。
【図１１】図１１は、従来技術のβ‐ＴＣＰから得られる多孔複合材料から分離されるミネラル成分の粉末のＸ線回折図である。そのミネラル成分は、多孔複合材料の総重量に対して、３３重量％含まれている。
【図１２】図１２は、従来技術の多孔複合材料の生成に使用される市販品のＴＣＰ（Ｍｅｒｃｋ）の粉末のＸ線回折図である。
【図１３】図１３は、従来技術に係る市販品のＴＣＰ（Ｍｅｒｃｋ）から得られる多孔複合材料から分離されたミネラル成分の粉末のＸ線回折図である。そのミネラル成分は、多孔複合材料の全重量に対して、４２重量％含まれている。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
実施例１−５
使用される材料
酸抽出で得られる豚の皮のゼラチンが使われる。
【００３３】
α‐ＴＣＰは、ＣａＣＯ３とＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏの混合物の固相反応により生成される。固相反応の条件は、ＣａＣＯ３とＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏのモル比が１：２、１３００℃、５時間である。固形生成物は、使用前に微細に粉砕される。
【００３４】
多孔複合材料の生成
以下の工程では、様々なサンプルの生成が行われる。
【００３５】
ａ）ゼラチンは、α‐ＴＣＰを含む水中で溶解され、α‐ＴＣＰは、最終状態の複合材料中に、所定のミネラル成分量を得るような濃度で含まれる。ミネラル成分量は、最終状態の複合材料中に、実施例２では９重量％、実施例３では２３重量％、実施例４では３３重量％、実施例５では４２重量％である。溶解液は、物理的に攪拌する事で得られる。攪拌の条件は、４０℃、５０分間、１，０００ｒｐｍである。攪拌が終了すると、発泡体が得られる。
【００３６】
ｂ）発泡体は、発泡体をペトリ皿の中で（ｉｎ ａ Ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈ）、１０分間から４０分間大気温度で放置する間にゲル化される。
【００３７】
ｃ）得られたゲルは、液体ニトロ（−１９５℃）の中に１０分間浸すことにより、凍結される。
【００３８】
ｄ）凍結されたゲルは、−５０℃で２４時間、１ミリバールの圧力下で凍結乾燥される。
【００３９】
比較例の多孔材料も生成する。比較例の多孔材料は、本願発明のα‐ＴＣＰを加えないで、ゼラチンを使って、前記と同じ方法で生成する（比較例１）。
【００４０】
もし、架橋された複合材料のサンプルが必要ならば、ａ）の工程の後に、ゼラチンの重量に対して、１．５重量％のゲニピンを得るようにゲニピン水溶液を加える。そのように取得された組成物は、その後、１０分間に渡って攪拌される。
【００４１】
複合材料の特性
図２−５は、本発明に係る多孔複合材料のＳＥＭ顕微鏡写真である。実施例２は、９重量％のミネラル成分を含む（図２）。実施例３は、２３重量％のミネラル成分を含む（図３）。実施例４は、３３重量％のミネラル成分を含む（図４）。実施例５は、４２重量％のミネラル成分を含む（図５）。
【００４２】
比較例として、図１は、ミネラル成分を含まない比較例１に係るゼラチンの多孔材料のＳＥＭ画像を様々な拡大で示す。
【００４３】
上記のように、多孔構造は、マクロ多孔性とミクロ多孔性とを示す。マクロ気孔は、相互結合していると考えられ、１００〜２００μｍの平均パーティクルサイズを有する。画像は、無機層についての詳細は示さず、複合材料の良好な均質化を示す。
【００４４】
ミネラル成分の結晶構造の特性評価は、粉末のＸ線回折により行われる。特性評価は、Ｘ線回折装置Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯ（ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ）を使用する。
【００４５】
図６は、多孔複合材料のサンプルの生成に用いられるα‐ＴＣＰから得られる粉末のＸ線回折図を示す。全ての回折ピークは、α‐ＴＣＰのピーク特性（ＩＣＤＤのα‐ＴＣＰの参照ファイルのピーク特性に関する部分で図中に報告されている。）と一致する。
【００４６】
図７は、ゼラチンの可溶化により複合材料から分離されたミネラル成分から得られる粉末のＸ線回折図である。この複合材料は、２３重量％のミネラル成分を含み、凍結乾燥された直後のものである（実施例３）。図７は、典型的なα‐ＴＣＰのピークと同様に、ＯＣＰに特有の他の回折ピーク（ＩＣＤＤのＯＣＰの参照ファイルのピーク特性に関する部分で図中に報告されている。）の存在を示す。
【００４７】
図８および図９に示すように、ミネラル成分の含有量が異なるサンプルについても、同様の結果が得られている。図８は、実施例４の結果を示し、３３重量％のミネラル成分を含む。図９は、実施例５の結果を示し、４２重量％のミネラル成分を含む。
【００４８】
α‐ＴＣＰとＯＣＰ２つの段階の相対量は、全ての回折図の構造の詳細化によって計算されており、ＱＵＡＮＴＯ ｐｒｏｇｒａｍを使用することにより実現されている。得られたデータは、全ての実施例のサンプルにわたり、非常に似通っており、複合材料の異なるミネラル成分の含有量の値に関係している。このデータは、生成後に１ヶ月を上限として様々なタイミングで測定されており、２６±５％のＯＣＰと７４±５%のα‐ＴＣＰである。
【００４９】
複合材料のサンプルは、１ｋＮのロードセルを備えたＩＮＳＴＲＯＮ ４４６５ ｄｙｎａｍｏｍｅｔｅｒにより、圧力環境にさらされる。この時、バーの速度は、１ｍｍ／ｍｉｎである。その結果は、ミネラル成分の含有が、圧力環境下で機械特性に対してどのように影響するかを示す。実際に、機械特性は、ミネラル成分の含有に応じて良好になる。圧力下での応力は、ミネラル成分を含まないサンプルにおいて平均値で０．０８±２Ｍｐａから、７０重量％のミネラル成分を含むサンプルにおいて平均値で０．２１±３Ｍｐａに増加する。同時に、ヤング率の値は、０．９±１ＭＰａから４±１ＭＰａに増加する。
【００５０】
細孔径分布測定分析（ｉｎｔｒｕｓｉｏｎ ｐｏｒｏｓｉｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ Ｐａｓｃａｌ１４０、Ｐａｓｃａｌ２４０により、上記の複合材料のサンプルに実施した。測定分析の条件は、最大圧力の２４０ＭＰａとし、水銀−サンプルの接触角度を１４０度とした。気孔サイズはＳＥＭ画像により測定されている。結果は、ミクロ気孔とマクロ気孔による相互接合した多孔性を示し、１〜５００μｍのサイズである。
【００５１】
実施例６−７（従来技術）
実施例６では、α‐ＴＣＰの代わりに、無機材料としてβ‐ＴＣＰを使用し、実施例７では、ＴＣＰと表示されたＭｅｒｃｋの市販品を使用した以外は、上記の実施例１〜５と同じ方法により、いくつかの多孔複合材料の生成試験が行われた。
【００５２】
β‐ＴＣＰは、ＣａＣＯ３とＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏの混合物の固相反応により生成される。固相反応の条件は、ＣａＣＯ３とＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏのモル比が１：２で、１０００℃、１５時間である。目的物のＸ線回折図を図１０に示す。全ての回折ピークは、β‐ＴＣＰの特性（ＩＣＤＤのβ‐ＴＣＰの参照ファイルのピーク特性に関する部分で図中に報告されている。）と一致する。図１１は、複合材料から分離されたミネラル成分（ゼラチンの可溶化による）から得られるパウダーのＸ線回折図を示す。この複合材料は、３３重量％のミネラル成分を含み、凍結乾燥の直後のものである。
【００５３】
全ての回折ピークはβ‐ＴＣＰの特性（ＩＣＤＤのβ‐ＴＣＰの参照ファイルのピーク特性に関する部分で報告されている。）と一致する。かなりの量のＯＣＰとα‐ＴＣＰとが観察されない。
【００５４】
市販品のＴＣＰ（Ｍｅｒｃｋ）のＸ線回折図が図１２に報告されている。全ての回折ピークは、実際にＨＡのピーク特性と一致しており、ＴＣＰのピーク特性とは異なる（ＩＣＣＤのＨＡの参照ファイルのピーク特性に関する部分で図中に報告されている）。図１３は、複合材料から分離されたミネラル成分（ゼラチンの可溶化による）から得られた粉末のＸ線回折図である。この複合材料は、４２重量％のミネラル成分を含んでおり、冷結乾燥直後のものである。全ての回折ピークはＨＡのピーク特性（この場合も、ＩＣＣＤのＨＡの参照ファイルのピーク特性に関する部分で図中に報告されている）と一致している。かなりの量のＯＣＰとα‐ＴＣＰが観察されない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔複合材料に関し、その生成方法、骨および／または軟骨の再生への使用、そして再生医療デバイス類（ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅｓ）の実現に関する。
【背景技術】
【０００２】
周知のように、骨組織は、極めて複雑なバイオミネラル複合材料（ｂｉｏｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）であり、主に、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）および水のような無機材料（７０〜８０％）と、Ｉ型コラーゲン、プロテオグリカン類およびその他の非コラーゲンタンパク質類（ｎｏｎ‐ｃｏｌｌａｇｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）のような有機材料類（２０〜３０％）とで構成される。骨を生成する間は、低結晶度のヒドロキシアパタイトのナノ結晶が増殖し、有機材料の繊維状と強固に結びつき、そのようにして、機械特性および弾性特性に極めて優れたナノ構造複合材料を形成する。
【０００３】
骨の欠陥や、欠損部の整復に係る需要または既存部の増量に係る需要は、整形外科、美容整形および神経外科の分野で大きな課題となっている。骨の代替材料として、様々な生体医療材料が研究され提案されているが、それらは、高い生体適合性を有さなければならないと共に、生物学的構造をホストの骨組織および細胞と活性化させるようなバイオ特性を有さなければならず、新しい組成および骨の固化プロセスが提案され続けている。この固化プロセス機能が完了すると、通常は、これらの材料は完全に再吸収され、新しく形成される骨の専用スペースを残す。この再生方法は、通常、“骨再生誘導法（ｇｕｉｄｅｄ ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）”といわれる。
【０００４】
例えば、国際特許出願０３／０７１９９１において、多孔マトリクス（ｐｏｒｏｕｓ ｍａｔｒｉｘ）が開示されており、骨を再生する材料として使用可能である。この多孔マトリクスは、水に溶けない繊維ポリマーから成り、特に、不溶性のコラーゲン、コラーゲン誘導体もしくは変性のゼラチン誘導体であり、リン酸カルシウムとミネラル化される。
【０００５】
このバイオポリマーは、水溶性リガンドと混ぜて使用されてもよく、例えば水溶性リガンドは、水溶性のコラーゲンやゼラチン、ポリ乳酸、ポリグリセリン酸およびその他の水溶性リガンドである。ミネラル化すなわち石灰化は、ポリマー繊維を、カルシウムイオンとリン酸塩イオンの塩基性のｐＨの水溶液で処理することで得られる。その後、水溶性のリガンドは、ミネラル化されたバイオポリマー水溶液に加えられて混ぜられて、その混合物は冷却されて凍結乾燥される。多孔マトリクスは、例えばグルタルアルデヒトを加えて架橋される。
【０００６】
国際特許出願ＷＯ０６／０３１１９６には、バイオ材料とミネラルチャージ（ｍｉｎｅｒａｌ ｃｈａｒｇｅ）とを含む多孔複合物が開示されている。そのバイオ材料は、広範囲の製品から選択されおり、プロテイン類（例えば、コラーゲン、エラスチン、ゼラチンおよびその他）、ペプチド類、多糖類である。ミネラルチャージは、リン酸カルシウムであってもよく、例えば、リン灰石、代用リン灰石、またはブルッシャイト、リン酸三カルシウム、リン酸オクタカルシウムであってもよい。その生体鉱物は、様々な架橋剤と架橋されてもよく、例えば、架橋剤は、アクリルアミド類、ジオン類（ｄｉｏｎｓ）、グルタルアルデヒド、アセトアルデヒド、ホルムアルデヒド、またはリボースのような架橋剤である。合成物は、水中で、様々な手法によって、バイオ材料とミネラルチャージとを混ぜることにより準備され、懸濁液が得られ、その後、凍結乾燥される。
【０００７】
Ｃｈｕｎ‐Ｈｓｕ Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．“Ｃａｌｖａｒｉａｌ ｂｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐ｇｅｎｉｐｉｎ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｇｅｌａｔｉｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６ （２００５），Ｐ．３０６５−３０７４は、ゼラチンをゲニピンおよびリン酸三カルシウムのセラミックの粒子と架橋させて得られる生体分解性の多孔合成物の生体内における生体反応に関する研究を報告している。ゼラチンの架橋を引き起こすために、０．５重量％のゲニピン水溶液が１８％のゼラチン水溶液に加えられる。その後に、２００〜３００μｍの粒子のリン酸三カルシウム（Ｍｅｒｃｋ）が加えられる。凝固後、合成物は−８０℃で凍結されて凍結乾燥される。
【０００８】
Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．“Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｓｐｏｎｇｅｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ β‐ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ"， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６（２００５），Ｐ３５８７−３５９６は、ゼラチンとβ−リン酸三カルシウムとから構成される生体分解性の多孔材料の生成および生体外における間葉系幹細胞の骨形成分化への使用について開示している。これらの材料は、β‐リン酸三カルシウムが存在する下で、ゼラチンをグルタルアルデヒドと架橋させることにより準備されて、その後凍結乾燥される。
【０００９】
Ｈａｅ‐Ｗｏｎ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎ‐ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ” ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６（２００５），Ｐ５２２１−５２３０は、ナノ複合材料ベースのコラーゲン／水酸化リン灰石が存在する条件下での、骨芽細胞の生体外での反応に関する研究に最終的に注目している。そのナノ複合材料は、ゼラチン溶液でヒドロキシアパタイトを共沈させることにより生成され、その後凍結乾燥される。そのヒドロキシアパタイトは、ゼラチン溶液に、カルシウムイオンとリン酸イオンを加えて得るか、または、ゼラチン溶液に、粉末のヒドロキシアパタイトを直接混合することで得ても良い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
出願人は、骨および／または軟骨の再生を加速するために使用可能な多孔複合材料を得ることを目的とする。その多孔複合材料は、生体内での吸収率に優れ、急速に新組織を形成するプロセスに適している。このようにして、この複合材料は、骨および／または軟骨の再生技術を提供し、再生医学デバイスを実現することに特に適する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
出願人は、この問題が、下記の請求項で請求されている多孔複合材料により、解決されるという驚くべき発見をした。すなわち、少なくとも１つの相互分散させたバイオポリマーは、ミネラル成分の総重量に対して、５０重量％から９５重量％のα−リン酸三カルシウム（α‐ＴＣＰ，α‐Ｃａ３（ＰＯ４）２）と、５重量％から５０重量％のリン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ，Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６・５Ｈ２Ｏ）とからなるカルシウム‐リン酸ミネラル成分を有して形成される。α‐ＴＣＰとＯＣＰのこの組み合わせは、生体内での吸収率を上げるので、ナノ結晶構造の低結晶度のミネラル成分を持つ新しい骨組織の短時間での形成を可能にする。この特徴は、生体のリン灰石の特徴と非常に似ている。
【００１２】
したがって、第１の特徴に関する本発明は、ミネラル成分に相互分散された少なくとも１つのバイオポリマーからなる多孔複合材料に関する発明であり、そのミネラル成分は、ミネラル成分の総重量に対して、５０重量％から９５重量％のα‐リン酸三カルシウム（α‐ＴＣＰ）と５重量％から５０重量％のリン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ）とからなる。
【００１３】
好ましくは、ミネラル成分は、６０重量％から８５重量％のα‐ＴＣＰと、１５重量％から４０重量％のＯＣＰとから成る。さらに好ましくは、ミネラル成分は、７０重量％ から８０重量％のα‐ＴＣＰと、２０重量％から３０重量％のＯＣＰから成る。
【００１４】
好ましくは、バイオポリマーはタンパク質もしくは多糖類である。さらに好ましくは、バイオポリマーは水溶性のタンパク質であって、特に、動物性ゼラチンから得られる。動物性ゼラチンは、例えば、筋肉や結合組織のような生体組織であって、例えば、骨、腱、じん帯、軟骨、皮膚（ｓｋｉｎ、ｄｅｒｍａ）から採取される。多孔複合材料は、好ましくは、３０重量％から９９重量％、さらに好ましくは、５５重量％から９５重量％の少なくとも１つのバイオポリマーと、１重量％から７０重量％、さらに好ましくは、５重量％から４５重量％の上記ミネラル成分とからなる。この割合は、多孔複合材料の総重量に対する割合である。
【００１５】
別の特徴として、本発明は、前記の多孔複合材料を生成する方法に関する。多孔複合材料は、発泡体を得るために、水性溶媒中で、少なくとも１つのバイオポリマーを、α−リン酸三カルシウム （α‐ＴＣＰ）で実質的に構成されるミネラル成分と混ぜる工程と、そのようにして得られた発泡体を、バイオポリマーのゲル化を得るために必要な時間放置する工程と、−２０℃よりも低い温度、好ましくは−９０℃よりも低い温度で発泡体を冷却する工程と、冷却された発泡体を凍結乾燥する工程とを有する。
【００１６】
別の特徴として、本発明は、上記の多孔複合材料の使用に関する発明であって、骨および／または軟骨の再生のための材料への使用を含む。
【００１７】
別の特徴として、本発明は、上記の多孔複合材料の使用に関する発明であって、組織工学デバイスの製造物のための材料への使用を含む。
【００１８】
別の特徴として、本発明は、上記の多孔複合材料の使用に関する発明であって、骨および／または軟骨の代用品（骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ））への使用を含む。
【００１９】
本発明の製造方法によれば、上記のα‐ＴＣＰとＯＣＰとの組み合わせは、水溶液中のα−ＴＣＰが部分的に加水分解されてＯＣＰになる際のα‐ＴＣＰから得られる。この点においては、Ｂｉｇｉ ｅｔ ａｌ．“Ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｔｏ ｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅ”，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２３（２００２），Ｐ．１８４９−１８５４を参照。
【００２０】
本発明のこのような結果は、他のリン酸カルシウムからは得られない。たとえば、α‐ＴＣＰとは全く異なるＴＣＰの結晶状態であるβ‐ＴＣＰからであっても、ＴＣＰとして一般的に販売されている市販品の主成分であるヒドロキシアパタイトからであっても、本発明のような結果は得られない。このことは、出願人により実験されて証明されており、以後に報告されている。
【００２１】
好適な実施例によれば、前記少なくとも１つのバイオポリマーは、本発明多孔複合材料に含まれて、架橋されている。こうすることによって、以下の用途が必要とする高い機械的な耐圧性と良好な耐劣化性とを調節可能である。
【００２２】
バイオポリマーの架橋は、生成中に、少なくとも１つの架橋剤を加えることで得ても良い。架橋剤は、たとえば、アクリルアミドのようなアミド類、グルタルアルデヒドのようなアルデヒド類、ジオン類から選択されても良い。
【００２３】
特に好適な架橋剤はゲニピンで、極めて低い細胞毒性の生分解性の天然産物である。ゲニピンはゲニポシドの加水分解生成物であって、通常は、アカネ科クチナシ属の実（ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ ｏｆ Ｇａｒｄｅｎｉａ ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ Ｅｌｌｉｓ）から得られる。
【００２４】
架橋剤は、バイオポリマーの架橋結合を得るために必要な時間かき混ぜる間に、バイオポリマーとα‐ＴＣＰとが拡散された水性の溶媒に加えられる。架橋剤の量は、通常、バイオポリマーの重量に対して、０．５重量％から５重量％、好ましくは、１．５重量％から３．０重量％である。
【００２５】
冷却されて凍結乾燥される前に、その取得された発泡体は、バイオポリマーをゲル化するために必要な時間放置される。
【００２６】
使用目的に合わせて最終的な材料の形状とサイズを調整するために、ゲル化の段階は、適切なサイコロ形状であっても良い。そうすることで、無駄が最小限になる。そうでなければ、適した形と大きさを得るために、凍結乾燥後に材料をカットしても良い。
【００２７】
凍結乾燥の工程は、一般的な方法で行われる。通常は−２０℃以下、好ましくは−４０から−６０℃の間で、通常は、１８時間以上の時間で、好ましくは、２４時間から３日の間で、通常は、１０ミリバールを越えない減圧環境で、好ましくは、０．１から１．０ミリバールで凍結乾燥の工程が実行される。
【００２８】
本発明に係る複合材料は、多孔構造を有し、その平均パーティクルサイズは１μｍから５００μｍである。ＳＥＭ分析によると、多孔構造はマクロ多孔性とミクロ多孔性とを有すると共に、相互接合したマクロ気孔を有し、そのマクロ気孔の平均パーティクルサイズは１００μｍから２００μｍである。マクロ気孔の気孔壁はミクロ気孔であり、そのミクロ気孔の平均パーティクルサイズは数マイクロメートルである。
【００２９】
本発明に係る多孔複合材料は、生体内および／または生体外の再生医療用のセルであっても良い。これらのセルは、分化型（骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞など）、および／または未分化型（間葉幹細胞など）、自己移植型または同種移植型であり、手術での移植の際に、多孔複合材料と結合されても良い。また、それらは、生体内で移植されるように、生体外で工学的な構造を得るために培養しても良い。成長因子またはその他のタンパク質類および／または生体刺激（合成とバイオの両方、自己移植型または同種移植型）は、それらの製造工程で、多孔複合材料と結合されても良い。同時に、その移植手術の際にセルはあってもなくても良く、移植の前の生体外での工学的に生成する段階であっても良い。
【００３０】
本発明のいくらかの例を図示するが、本発明の範囲の範囲を何ら制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ゼラチンの多孔材料のＳＥＭ画像の様々な拡大図である。このゼラチン多孔材料はミネラル成分を含まない。
【図２】図２は本発明に係る多孔複合材料のＳＥＭ画像の様々な拡大図である。図２の多孔複合材料は、多孔複合材料の総量重量に対して、９重量％のミネラル成分を含む。
【図３】図３は本発明に係る多孔複合材料のＳＥＭ画像の様々な拡大図である。図３の多孔複合材料は、多孔複合材料の総量重量に対して、２３重量％のミネラル成分を含む。
【図４】図４は本発明に係る多孔複合材料のＳＥＭ画像の様々な拡大図である。図４の多孔複合材料は、多孔複合材料の総量重量に対して、３３重量％のミネラル成分を含む。
【図５】図５は本発明に係る多孔複合材料のＳＥＭ画像の様々な拡大図である。図５の多孔複合材料は、多孔複合材料の総量重量に対して、４２重量％のミネラル成分を含む。
【図６】図６は、本発明の多孔複合材料の生成に用いられるα‐ＴＣＰの粉末のＸ線回折図である。
【図７】図７は、本発明の多孔複合材料から分離されたミネラル成分の粉末のＸ線回折図である。図７の多孔複合材料は、多孔複合材料の総重量に対して、２３重量％のミネラル成分を含む。
【図８】図８は、本発明の多孔複合材料から分離されたミネラル成分の粉末のＸ線回折図である。図８の多孔複合材料は、多孔複合材料の総重量に対して、３３重量％のミネラル成分を含む。
【図９】図９は、本発明の多孔複合材料から分離されたミネラル成分の粉末のＸ線回折図である。図９の多孔複合材料は、多孔複合材料の総重量に対して、４２重量％のミネラル成分を含む。
【図１０】図１０は、従来技術の多孔複合材料の生成に用いられるβ‐ＴＣＰの粉末のＸ線回折図である。
【図１１】図１１は、従来技術のβ‐ＴＣＰから得られる多孔複合材料から分離されるミネラル成分の粉末のＸ線回折図である。そのミネラル成分は、多孔複合材料の総重量に対して、３３重量％含まれている。
【図１２】図１２は、従来技術の多孔複合材料の生成に使用される市販品のＴＣＰ（Ｍｅｒｃｋ）の粉末のＸ線回折図である。
【図１３】図１３は、従来技術に係る市販品のＴＣＰ（Ｍｅｒｃｋ）から得られる多孔複合材料から分離されたミネラル成分の粉末のＸ線回折図である。そのミネラル成分は、多孔複合材料の全重量に対して、４２重量％含まれている。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
実施例１−５
使用される材料
酸抽出で得られる豚の皮のゼラチンが使われる。
【００３３】
α‐ＴＣＰは、ＣａＣＯ３とＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏの混合物の固相反応により生成される。固相反応の条件は、ＣａＣＯ３とＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏのモル比が１：２、１３００℃、５時間である。固形生成物は、使用前に微細に粉砕される。
【００３４】
多孔複合材料の生成
以下の工程では、様々なサンプルの生成が行われる。
【００３５】
ａ）ゼラチンは、α‐ＴＣＰを含む水中で溶解され、α‐ＴＣＰは、最終状態の複合材料中に、所定のミネラル成分量を得るような濃度で含まれる。ミネラル成分量は、最終状態の複合材料中に、実施例２では９重量％、実施例３では２３重量％、実施例４では３３重量％、実施例５では４２重量％である。溶解液は、物理的に攪拌する事で得られる。攪拌の条件は、４０℃、５０分間、１，０００ｒｐｍである。攪拌が終了すると、発泡体が得られる。
【００３６】
ｂ）発泡体は、発泡体をペトリ皿の中で（ｉｎ ａ Ｐｅｔｒｉ ｄｉｓｈ）、１０分間から４０分間大気温度で放置する間にゲル化される。
【００３７】
ｃ）得られたゲルは、液体ニトロ（−１９５℃）の中に１０分間浸すことにより、凍結される。
【００３８】
ｄ）凍結されたゲルは、−５０℃で２４時間、１ミリバールの圧力下で凍結乾燥される。
【００３９】
比較例の多孔材料も生成する。比較例の多孔材料は、本願発明のα‐ＴＣＰを加えないで、ゼラチンを使って、前記と同じ方法で生成する（比較例１）。
【００４０】
もし、架橋された複合材料のサンプルが必要ならば、ａ）の工程の後に、ゼラチンの重量に対して、１．５重量％のゲニピンを得るようにゲニピン水溶液を加える。そのように取得された組成物は、その後、１０分間に渡って攪拌される。
【００４１】
複合材料の特性
図２−５は、本発明に係る多孔複合材料のＳＥＭ顕微鏡写真である。実施例２は、９重量％のミネラル成分を含む（図２）。実施例３は、２３重量％のミネラル成分を含む（図３）。実施例４は、３３重量％のミネラル成分を含む（図４）。実施例５は、４２重量％のミネラル成分を含む（図５）。
【００４２】
比較例として、図１は、ミネラル成分を含まない比較例１に係るゼラチンの多孔材料のＳＥＭ画像を様々な拡大で示す。
【００４３】
上記のように、多孔構造は、マクロ多孔性とミクロ多孔性とを示す。マクロ気孔は、相互結合していると考えられ、１００〜２００μｍの平均パーティクルサイズを有する。画像は、無機層についての詳細は示さず、複合材料の良好な均質化を示す。
【００４４】
ミネラル成分の結晶構造の特性評価は、粉末のＸ線回折により行われる。特性評価は、Ｘ線回折装置Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯ（ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ）を使用する。
【００４５】
図６は、多孔複合材料のサンプルの生成に用いられるα‐ＴＣＰから得られる粉末のＸ線回折図を示す。全ての回折ピークは、α‐ＴＣＰのピーク特性（ＩＣＤＤのα‐ＴＣＰの参照ファイルのピーク特性に関する部分で図中に報告されている。）と一致する。
【００４６】
図７は、ゼラチンの可溶化により複合材料から分離されたミネラル成分から得られる粉末のＸ線回折図である。この複合材料は、２３重量％のミネラル成分を含み、凍結乾燥された直後のものである（実施例３）。図７は、典型的なα‐ＴＣＰのピークと同様に、ＯＣＰに特有の他の回折ピーク（ＩＣＤＤのＯＣＰの参照ファイルのピーク特性に関する部分で図中に報告されている。）の存在を示す。
【００４７】
図８および図９に示すように、ミネラル成分の含有量が異なるサンプルについても、同様の結果が得られている。図８は、実施例４の結果を示し、３３重量％のミネラル成分を含む。図９は、実施例５の結果を示し、４２重量％のミネラル成分を含む。
【００４８】
α‐ＴＣＰとＯＣＰ２つの段階の相対量は、全ての回折図の構造の詳細化によって計算されており、ＱＵＡＮＴＯ ｐｒｏｇｒａｍを使用することにより実現されている。得られたデータは、全ての実施例のサンプルにわたり、非常に似通っており、複合材料の異なるミネラル成分の含有量の値に関係している。このデータは、生成後に１ヶ月を上限として様々なタイミングで測定されており、２６±５％のＯＣＰと７４±５%のα‐ＴＣＰである。
【００４９】
複合材料のサンプルは、１ｋＮのロードセルを備えたＩＮＳＴＲＯＮ ４４６５ ｄｙｎａｍｏｍｅｔｅｒにより、圧力環境にさらされる。この時、バーの速度は、１ｍｍ／ｍｉｎである。その結果は、ミネラル成分の含有が、圧力環境下で機械特性に対してどのように影響するかを示す。実際に、機械特性は、ミネラル成分の含有に応じて良好になる。圧力下での応力は、ミネラル成分を含まないサンプルにおいて平均値で０．０８±２Ｍｐａから、７０重量％のミネラル成分を含むサンプルにおいて平均値で０．２１±３Ｍｐａに増加する。同時に、ヤング率の値は、０．９±１ＭＰａから４±１ＭＰａに増加する。
【００５０】
細孔径分布測定分析（ｉｎｔｒｕｓｉｏｎ ｐｏｒｏｓｉｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ Ｐａｓｃａｌ１４０、Ｐａｓｃａｌ２４０により、上記の複合材料のサンプルに実施した。測定分析の条件は、最大圧力の２４０ＭＰａとし、水銀−サンプルの接触角度を１４０度とした。気孔サイズはＳＥＭ画像により測定されている。結果は、ミクロ気孔とマクロ気孔による相互接合した多孔性を示し、１〜５００μｍのサイズである。
【００５１】
実施例６−７（従来技術）
実施例６では、α‐ＴＣＰの代わりに、無機材料としてβ‐ＴＣＰを使用し、実施例７では、ＴＣＰと表示されたＭｅｒｃｋの市販品を使用した以外は、上記の実施例１〜５と同じ方法により、いくつかの多孔複合材料の生成試験が行われた。
【００５２】
β‐ＴＣＰは、ＣａＣＯ３とＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏの混合物の固相反応により生成される。固相反応の条件は、ＣａＣＯ３とＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏのモル比が１：２で、１０００℃、１５時間である。目的物のＸ線回折図を図１０に示す。全ての回折ピークは、β‐ＴＣＰの特性（ＩＣＤＤのβ‐ＴＣＰの参照ファイルのピーク特性に関する部分で図中に報告されている。）と一致する。図１１は、複合材料から分離されたミネラル成分（ゼラチンの可溶化による）から得られるパウダーのＸ線回折図を示す。この複合材料は、３３重量％のミネラル成分を含み、凍結乾燥の直後のものである。
【００５３】
全ての回折ピークはβ‐ＴＣＰの特性（ＩＣＤＤのβ‐ＴＣＰの参照ファイルのピーク特性に関する部分で報告されている。）と一致する。かなりの量のＯＣＰとα‐ＴＣＰとが観察されない。
【００５４】
市販品のＴＣＰ（Ｍｅｒｃｋ）のＸ線回折図が図１２に報告されている。全ての回折ピークは、実際にＨＡのピーク特性と一致しており、ＴＣＰのピーク特性とは異なる（ＩＣＣＤのＨＡの参照ファイルのピーク特性に関する部分で図中に報告されている）。図１３は、複合材料から分離されたミネラル成分（ゼラチンの可溶化による）から得られた粉末のＸ線回折図である。この複合材料は、４２重量％のミネラル成分を含んでおり、冷結乾燥直後のものである。全ての回折ピークはＨＡのピーク特性（この場合も、ＩＣＣＤのＨＡの参照ファイルのピーク特性に関する部分で図中に報告されている）と一致している。かなりの量のＯＣＰとα‐ＴＣＰが観察されない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの相互分散したバイオポリマーを含み、前記バイオポリマーは、ミネラル成分の総重量に対して、５０重量％から９５重量％のα‐リン酸三カルシウム（α‐ＴＣＰ）と、５重量％から５０重量％のリン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ）とからなるミネラル成分に相互分散されている多孔性の複合材料。
【請求項２】
請求項１に記載の多孔性の複合材料であって、
前記ミネラル成分は、６０重量％から８５重量％のα‐ＴＣＰと、１５重量％から４０重量％のＯＣＰとからなる多孔性の複合材料。
【請求項３】
請求項２に記載の多孔性の複合材料であって、
前記ミネラル成分は、７０重量％から８０重量％のα‐ＴＣＰと、２０重量％から３０重量％のＯＣＰとからなる多孔性の複合材料。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載の多孔性の複合材料あって、
前記ミネラル成分は、α‐ＴＣＰ自体の中で部分加水分解によって得られる多孔性の複合材料。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の多孔性の複合材料あって、
前記少なくとも１つのバイオポリマーはタンパク質または多糖類である多孔性の複合材料。
【請求項６】
請求項５に記載の多孔性の複合材料あって、
前記少なくとも１つのバイオポリマーは、水溶性のタンパク質であり、好ましくは動物性ゼラチンである多孔性の複合材料。
【請求項７】
請求項１〜６の何れかに記載の多孔性の複合材料あって、
３０重量％から９９重量％であり、好ましくは５５重量％から９５重量％である前記少なくとも１つのバイオポリマーと、１重量％から７０重量％であり、好ましくは５重量％から４５重量％である前記ミネラル成分とからなる多孔性の複合材料。
【請求項８】
請求項１〜７の何れかに記載の多孔性の複合材料あって、
前記少なくとも１つのバイオポリマーは架橋されている多孔性の複合材料。
【請求項９】
請求項８に記載の多孔性の複合材料あって、
前記少なくとも１つのバイオポリマーは、アミド類、アルデヒド類、ジオン類から選択される架橋剤で架橋される多孔性の複合材料。
【請求項１０】
請求項８に記載の多孔性の複合材料あって、
前記少なくとも１つのバイオポリマーはゲニピンで架橋される多孔性の複合材料。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れかに記載の多孔性の複合材料あって、
１μｍから５００μｍの平均パーティクルサイズを持つ多孔性の構造を有する多孔性の複合材料。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れかに記載の多孔性の複合材料あって、
さらに、分化型および／または未分化型のセル、自己移植型のまたは同種移植型、成長分子または他のタンパク質類および／または生体刺激物質を含む多孔性の複合材料。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れかに記載の多孔性の複合材料を生成する製造方法あって、
発泡体を得るために、水性溶媒中で、少なくとも１つのバイオポリマーを、α−リン酸三カルシウム（α‐ＴＣＰ）で 実質的に構成されるミネラル成分と混ぜる工程と、
そのようにして得た前記発泡体を、ゲル化したバイオポリマーを得るために必要とする時間放置する工程と、
前記発泡体を、−２０℃より低い温度、好ましくは−９０℃より低い温度で冷却する工程と、
前記冷却された発泡体を凍結乾燥する工程を含む製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の製造方法あって、
前記少なくとも１つの架橋剤が水性溶媒に加えられる製造方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の製造方法であって、
前記少なくとも１つの架橋剤は、アミド類、アルデヒド類、ジオン類から選択される製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の製造方法であって、
前記架橋剤がゲニピンである製造方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６の何れかに記載の製造方法であって、
前記架橋剤は、ポリマーの重量に対して、０．５重量％から５重量％、好ましくは１．５重量％から３重量％の量で加えられる製造方法。
【請求項１８】
請求項１３〜１７の何れかに記載の製造方法であって、
前記凍結乾燥工程は、−２０℃を越えない温度、好ましくは−４０℃から−６０℃の間、１８時間以上、好ましくは２４時間から３日の間で行われ、１０ミリバールより低く、好ましくは０．１ミリバールから１．０ミリバールの間の減圧環境で行われる製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２の何れかに記載の多孔性の複合材料の使用であって、
骨および／または軟骨を再生する材料として用いられる多孔性の複合材料の使用。
【請求項２０】
請求項１〜１２の何れかに記載の多孔性の複合材料の使用であって、
組織工学デバイスの製造用の材料として用いられる多孔性の複合材料の使用。
【請求項２１】
請求項１〜１２の何れかに記載の多孔性の複合材料の使用であって、
骨および／または軟骨の代用品として用いられる多孔性の複合材料の使用。
【請求項１】
少なくとも１つの相互分散したバイオポリマーを含み、前記バイオポリマーは、ミネラル成分の総重量に対して、５０重量％から９５重量％のα‐リン酸三カルシウム（α‐ＴＣＰ）と、５重量％から５０重量％のリン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ）とからなるミネラル成分に相互分散されている多孔性の複合材料。
【請求項２】
請求項１に記載の多孔性の複合材料であって、
前記ミネラル成分は、６０重量％から８５重量％のα‐ＴＣＰと、１５重量％から４０重量％のＯＣＰとからなる多孔性の複合材料。
【請求項３】
請求項２に記載の多孔性の複合材料であって、
前記ミネラル成分は、７０重量％から８０重量％のα‐ＴＣＰと、２０重量％から３０重量％のＯＣＰとからなる多孔性の複合材料。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載の多孔性の複合材料あって、
前記ミネラル成分は、α‐ＴＣＰ自体の中で部分加水分解によって得られる多孔性の複合材料。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載の多孔性の複合材料あって、
前記少なくとも１つのバイオポリマーはタンパク質または多糖類である多孔性の複合材料。
【請求項６】
請求項５に記載の多孔性の複合材料あって、
前記少なくとも１つのバイオポリマーは、水溶性のタンパク質であり、好ましくは動物性ゼラチンである多孔性の複合材料。
【請求項７】
請求項１〜６の何れかに記載の多孔性の複合材料あって、
３０重量％から９９重量％であり、好ましくは５５重量％から９５重量％である前記少なくとも１つのバイオポリマーと、１重量％から７０重量％であり、好ましくは５重量％から４５重量％である前記ミネラル成分とからなる多孔性の複合材料。
【請求項８】
請求項１〜７の何れかに記載の多孔性の複合材料あって、
前記少なくとも１つのバイオポリマーは架橋されている多孔性の複合材料。
【請求項９】
請求項８に記載の多孔性の複合材料あって、
前記少なくとも１つのバイオポリマーは、アミド類、アルデヒド類、ジオン類から選択される架橋剤で架橋される多孔性の複合材料。
【請求項１０】
請求項８に記載の多孔性の複合材料あって、
前記少なくとも１つのバイオポリマーはゲニピンで架橋される多孔性の複合材料。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れかに記載の多孔性の複合材料あって、
１μｍから５００μｍの平均パーティクルサイズを持つ多孔性の構造を有する多孔性の複合材料。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れかに記載の多孔性の複合材料あって、
さらに、分化型および／または未分化型のセル、自己移植型のまたは同種移植型、成長分子または他のタンパク質類および／または生体刺激物質を含む多孔性の複合材料。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れかに記載の多孔性の複合材料を生成する製造方法あって、
発泡体を得るために、水性溶媒中で、少なくとも１つのバイオポリマーを、α−リン酸三カルシウム（α‐ＴＣＰ）で 実質的に構成されるミネラル成分と混ぜる工程と、
そのようにして得た前記発泡体を、ゲル化したバイオポリマーを得るために必要とする時間放置する工程と、
前記発泡体を、−２０℃より低い温度、好ましくは−９０℃より低い温度で冷却する工程と、
前記冷却された発泡体を凍結乾燥する工程を含む製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の製造方法あって、
前記少なくとも１つの架橋剤が水性溶媒に加えられる製造方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の製造方法であって、
前記少なくとも１つの架橋剤は、アミド類、アルデヒド類、ジオン類から選択される製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の製造方法であって、
前記架橋剤がゲニピンである製造方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６の何れかに記載の製造方法であって、
前記架橋剤は、ポリマーの重量に対して、０．５重量％から５重量％、好ましくは１．５重量％から３重量％の量で加えられる製造方法。
【請求項１８】
請求項１３〜１７の何れかに記載の製造方法であって、
前記凍結乾燥工程は、−２０℃を越えない温度、好ましくは−４０℃から−６０℃の間、１８時間以上、好ましくは２４時間から３日の間で行われ、１０ミリバールより低く、好ましくは０．１ミリバールから１．０ミリバールの間の減圧環境で行われる製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２の何れかに記載の多孔性の複合材料の使用であって、
骨および／または軟骨を再生する材料として用いられる多孔性の複合材料の使用。
【請求項２０】
請求項１〜１２の何れかに記載の多孔性の複合材料の使用であって、
組織工学デバイスの製造用の材料として用いられる多孔性の複合材料の使用。
【請求項２１】
請求項１〜１２の何れかに記載の多孔性の複合材料の使用であって、
骨および／または軟骨の代用品として用いられる多孔性の複合材料の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１０−５３１７０４（Ｐ２０１０−５３１７０４Ａ）
【公表日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１４１６９（Ｐ２０１０−５１４１６９）
【出願日】平成２０年６月２７日（２００８．６．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００１６８８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００４４４５
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５０７２５３３０３）アルマ マテル ストゥディオルム−ウニヴェルシタ ディ ボローニャ (3)
【出願人】（５０９３５２３３６）
【氏名又は名称原語表記】ＩＳＴＩＴＵＴＯ ＯＲＴＯＰＥＤＩＣＯ ＲＩＺＺＯＬＩ
【住所又は居所原語表記】Ｖｉａ ｄｉ Ｂａｒｂｉａｎｏ， １／１０， Ｉ−４０１３６ Ｂｏｌｏｇｎａ（ＩＴ）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２７日（２００８．６．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００１６８８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００４４４５
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５０７２５３３０３）アルマ マテル ストゥディオルム−ウニヴェルシタ ディ ボローニャ (3)
【出願人】（５０９３５２３３６）
【氏名又は名称原語表記】ＩＳＴＩＴＵＴＯ ＯＲＴＯＰＥＤＩＣＯ ＲＩＺＺＯＬＩ
【住所又は居所原語表記】Ｖｉａ ｄｉ Ｂａｒｂｉａｎｏ， １／１０， Ｉ−４０１３６ Ｂｏｌｏｇｎａ（ＩＴ）
【Ｆターム（参考）】
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