多発性骨髄腫細胞からの抗原ペプチドの同定
多発性骨髄腫（ＭＭ）はクローンＢ細胞腫瘍であり、従来の抗腫瘍療法では本質的に不治のままである。ＭＭ患者の生存期間中央値はたった３年である。ＭＭは、骨髄（ＢＭ）中の成熟形質細胞が増殖かつ蓄積され、骨破壊、ＢＭ不全、貧血症、及び免疫機能の低下に至ることを特徴とする。多発性骨髄腫細胞上に提示されるＭＨＣクラスＩ、ＨＬＡ−Ａ２関連ペプチドの同定は、ＭＭに対する免疫療法の開発における重要な工程である。本明細書に示されるのは、ペプチド負荷Ｔ２標的細胞及び多発性骨髄腫細胞株の両方に細胞傷害性である活性化Ｔリンパ球を作製する方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全体的に、生物学的、免疫学的、かつ新規な抗原ペプチドに関する。より詳細には、本発明は、ペプチド負荷標的細胞及び多発性骨髄腫細胞に対して細胞傷害性である、活性化Ｔリンパ球を再現性よく産生する多発性骨髄腫細胞株から同定された抗原ペプチドに関する。本発明は更に、多発性骨髄腫の治療における、活性化Ｔリンパ球の抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）としての利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書を通して、特許、公開された出願、技術論文、及び学術論文を包含し得る種々の出版物は括弧内に引用され、各々の完全な引用は本明細書の末尾に見出され得る。それらの引用された各出版物はその全体が、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００３】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、異物に対する哺乳類の免疫反応において重要な役割を担い、インビボで腫瘍細胞の死を誘発することができる。ＣＴＬはナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞由来であり、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ細胞表面レセプターにより提示される抗原ペプチドを認識し、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる。ナイーブＴ細胞は、抗原又は他の活性化に必要なシグナルに未だ遭遇していないという点で、活性化Ｔ細胞と区別される。ナイーブＴ細胞の誘導には２つのシグナルが必要であると一般に認識されている。シグナル１は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）とＭＨＣ／抗原ペプチド複合体との間の相互作用により誘導され、ＭＨＣクラスＩ分子の非多型部位へのＣＤ８コレセプターの結合により促進される。シグナル２はシグナル１と質的に異なり、ＭＨＣクラスＩＩ分子及び共刺激分子を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の相補的リガンドと相互作用するＴ細胞共刺激分子を介して伝達される。シグナル１及び２は相乗的に機能し、最終的にＴ細胞を誘導して増殖し、サイトカインを産生し、かつ抗原特異的ＣＴＬ（後に全身を移動して他の特異的抗原陽性細胞を探索しかつ破壊できる）へ分化するという一連のシグナル伝達現象を引き起こす。
【０００４】
加えて、細胞性抗原に対する応答は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、すなわちヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）により届けられる支援に依存することが証明されている。この支援の本質とは、ＣＴＬの増幅に必要とするＩＬ−２の産生のために、活性化ＨＴＬを要すると解釈されている。また、最近の研究では、この支援が、ＨＴＬによる樹状細胞の活性化に由来するものであり、ＣＤ４０とそのリガンドの相互作用により媒介されることも示している。樹状細胞は、ＣＴＬ応答の極めて強力な誘導因子であると証明されており、ＣＴＬのプライミングに関与する主要ＡＰＣであると考えられている。一般にＡＰＣは、これらの細胞に特有のメカニズムから、シャペロン分子を伴う可溶性抗原の形態で、又は食作用により抗原を取り込むと考えられている。
【０００５】
最近では、ＣＴＬにより認識される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする多くの遺伝子が、様々なヒト腫瘍細胞のｃＤＮＡから同定されている。例えば、黒色腫におけるＴＡＡの同定は、強力なＴ細胞応答をインビボで誘導する試みにおいて、抗原が免疫原的な状況で送達されるワクチン接種戦略を用いて癌細胞を標的とする治療を試験する臨床試験に導いた。これらのＴＡＡによるワクチン接種戦略により、新たな癌免疫療法の開発が期待できる。
【０００６】
養子免疫療法は、新たな癌免疫療法として期待される別の戦略である。養子免疫療法には、１つ以上の腫瘍抗原に特異的なＴ細胞のインビトロ活性化と増幅、それに続く活性化Ｔ細胞による患者の治療が含まれる。ＴＡＡを用いるワクチン接種療法と比較して、養子Ｔ細胞療法には、寛容原性機構が免疫原性応答に影響し得る宿主環境からのＴ細胞除去が含まれるため利点がある。更に、マウス腫瘍モデルにおける試験では、養子免疫療法が、最小限の毒性で有効性を示し得ることが証明された。過去における、ヒト腫瘍の治療に対してこの戦略を適用する上での障害の１つは、ＣＴＬ媒介型破壊を受けやすい腫瘍細胞の状態にする免疫原性抗原に関する情報の欠如であった。しかし最近になって癌患者から腫瘍反応性Ｔ細胞が単離され、ＣＴＬが対象とするＴＡＡの同定につながった。これらの一部には、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、及びＭＡＧＥが挙げられる。これらのうち、チロシナーゼ及びＭＡＲＴ−１は、黒色腫細胞でほぼ普遍的に発現しており、そのため黒色腫患者の養子免疫療法に対する所望の標的選択を表す。
【０００７】
初期の養子免疫療法の取り組みとしてはリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）を用いた後、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用い、双方ともＩＬ−２を用いてエクスビボで活性化された。しかし、効果ははっきりと証明されず、したがってこれらの初期の比較臨床試験は、黒色腫患者に対するＩＬ−２の直接投与に優る、エクスビボ活性化細胞使用の利点を示すことができなかった。更に最近の試験では、特定の養子Ｔ細胞治療の取り組みについての可能性が明確に示された（Ｙｅｅら、ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９９，ｐｐ．１６１６８〜１６１７３，（２００２）；Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９８，ｐｐ．８５０〜８５４，（２００２））。これらの試験には、ＭＡＲＴ−１若しくはｇｐ１００に特異的なＴ細胞クローン及び低用量ＩＬ−２、又は、同種異系の支持細胞を用いてエクスビボで増幅したＴＩＬ及び高用量ＩＬ−２のいずれかの使用が含まれる。これらの試験により、養子免疫療法が癌の治療に期待できることが確認された。
【０００８】
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の利用は、治療的数の抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を再現性よく生成するエクスビボ法である。というのは、天然のＡＰＣをインビトロでＴ細胞の活性化に使用することは可能であるが（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、又は自己腫瘍細胞）、天然ＡＰＣのＭＨＣ分子が多くの他のペプチドエピトープを含むため、活性化の効力は低くなることがあるからである。その結果、これにより選択したエピトープの提示は最少となり得る。加えて、これら提示されたペプチドの多くは、正常で無害な内因性タンパク質を表す。この問題に対するより直接的な取り組みは、疾患の治療に関与するエピトープのみに対して、ＣＤ８+ Ｔ細胞を特異的に活性化することである。この取り組みはａＡＰＣを用いて達成できる（例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号、及び同第６，７９０，６６２号、米国特許公開第２００９／００１７０００号、及び同第２００９／０００４１４２号、並びに国際公開第２００７／１０３００９号を参照されたい）。
【０００９】
そのようなａＡＰＣの１つが、キイロショウジョウバエ（ミバエ）の胚細胞株を使用して開発されており、これは主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を発現する。ショウジョウバエは、ヒトＭＨＣ分子へのペプチドエピトープ負荷に関与するヒトＴＡＰ１及びＴＡＰ２ペプチドトランスポーターに相同するものを欠いている。その結果、形質移入したクラスＩ分子及びクラスＩＩ分子は、中身がない容器としてショウジョウバエ細胞の表面上に現れる。ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩをコードする発現ベクターで形質移入したショウジョウバエの細胞を、特異的ＭＨＣ分子に結合する１つ以上の外因性合成ペプチド（すなわち、Ｔ細胞ペプチドエピトープとして提示するためのＴＡＡ）とインキュベートすることにより、利用できる全てのＭＨＣ分子がＭＨＣ拘束性特異的ペプチドエピトープに占有され得る。特に、単一又は複数のペプチドエピトープを提示しているＨＬＡ−Ａ２．１ ＭＨＣクラスＩ分子の高密度発現、及び、これらショウジョウバエａＡＰＣへの主要補助分子Ｂ７−１（ＣＤ８０）、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、及びＣＤ７０の追加は、選択したペプチドに特異的でありかつ細胞療法としての利用に好適である、強力な自己細胞傷害性ＣＤ８+ Ｔ細胞のインビトロ生成を可能にする。
【００１０】
このような細胞療法の１つは、黒色腫関連抗原由来の選択されたＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ペプチドにペプチド特異性を示すエクスビボ活性化自己ＣＤ８＋ＣＴＬを用いて調製された、自己免疫療法生成物を含む。細胞療法生成物の活性成分は患者自身のＣＤ８＋細胞であり、それら細胞は選択されたＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ペプチドに対する特異性を有する選択したペプチドを負荷したａＡＰＣに対して曝露することによりエクスビボで活性化されている。細胞療法生成物を生成するために、ＣＴＬは、１）治験受託施設で採取されたリンパ球フェレーシスサンプルから単離された自己ナイーブＴ細胞から取り出され、２）ａＡＰＣとしてショウジョウバエ細胞を用いて黒色腫抗原ペプチドエピトープに対してエクスビボで感作（primed）され、３）好ましくはインターロイキン−２（ＩＬ−２）及びインターロイキン−７（ＩＬ−７）の両方の存在下で、黒色腫抗原性エピトープを負荷した自己単核細胞を用いた再刺激により増幅され、続いて、ＯＫＴ（登録商標）３を用いて非特異的に増幅され、４）採取され、洗浄され、かつ注入用の最終製剤に再懸濁され、５）ＣＤ８＋細胞が取出された患者に注入される。再注入用の最終細胞療法生成物は、乳酸リンゲル注射液（７６％（容積／容積））、生理食塩水（Ｄ５ＮＳ）中の５％デキストロース（４％（容積／容積））、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（２０％（容積／容積））の入った３００ｍＬ中に、１〜１０×１０9個のＣＴＬ細胞を含むことが好ましい。
【００１１】
自己ＣＤ８＋ＣＴＬのエクスビボ活性化に特異的な抗原を利用するこれらの有望な新規免疫療法は、癌治療に有望な戦略を提供する。これは、現在の治療法では不治である癌に対して、特に興味深い進歩である。多発性骨髄腫（ＭＭ）は、米国において年間約１５，０００人が新たに発症するクローナルＢ細胞の悪性腫瘍である。ＭＭの生存期間中央値はたった３年であり、骨髄（ＢＭ）中の成熟形質細胞（ＰＣ）が増殖かつ蓄積され、骨破壊、ＢＭ不全、貧血症、及び免疫機能の低下に至ることを特徴とする。ＭＭは、従来の抗腫瘍療法では本質的に不治のままである（Ｋｙｌｅ及びＲａｊｋｕｍａｒ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００４ Ｏｃｔ ２８；３５１（１８）：１８６０〜７３）。多発性骨髄腫細胞上に唯一提示される骨髄腫特異的抗原ペプチドの同定は、ＭＭに対する有効な免疫療法治療の開発における重要な工程である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、本明細書において、添付の独立及び従属クレームにより定義される実施形態を対象とする。本発明の様々な態様の実施形態、特徴、及び長所は、添付の図面に関連づけられる以下の発明を実施するための形態から明らかになるであろう。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、Ｔリンパ球を活性化可能な合成ペプチドを含み、この合成ペプチドは、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、活性化Ｔリンパ球は多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である。
【００１４】
第２の実施形態では、本発明は、Ｔリンパ球を活性化可能な少なくとも１つの抗原ペプチドを含む組成物を含み、この抗原ペプチドは、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、その活性化Ｔリンパ球は多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である。
【００１５】
第３の実施形態では、本発明は、多発性骨髄腫と診断された患者に投与するための活性化Ｔリンパ球を作製する方法を含み、この方法は、（ａ）抗原ペプチド負荷ショウジョウバエ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、少なくとも１つの抗原ペプチドをショウジョウバエａＡＰＣに負荷することにより調製する工程であって、この抗原ペプチドが、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む工程と、（ｂ）その患者からＴリンパ球を単離する工程と、（ｃ）かかるＴリンパ球をかかる抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣと接触させる工程と、（ｄ）活性化Ｔリンパ球を生成する工程であって、この活性化Ｔリンパ球が多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である工程と、（ｅ）その患者に戻し投与するためにその活性化Ｔリンパ球を回収する工程と、を含む。
【００１６】
第４の実施形態では、本発明は、（ｆ）かかる回収工程で回収された有効量の活性化Ｔリンパ球をかかる患者に投与する工程を更に含む、上記方法を含む。
【００１７】
第５の実施形態では、本発明は、多発性骨髄腫と診断された患者に投与するための活性化Ｔリンパ球を作製する方法を含み、この方法は、（ａ）抗原ペプチド負荷ショウジョウバエ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、２つ以上の抗原ペプチドの混合物をショウジョウバエａＡＰＣに負荷することにより調製する工程であって、この抗原ペプチドが、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む工程と、（ｂ）その患者からＴリンパ球を単離する工程と、（ｃ）かかるＴリンパ球をかかる抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣと接触させる工程と、（ｄ）活性化Ｔリンパ球を生成する工程であって、この活性化Ｔリンパ球が多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である工程と、（ｅ）その患者に戻し投与するためにその活性化Ｔリンパ球を回収する工程と、を含む。
【００１８】
第６の実施形態では、本発明は、この２つ以上の抗原ペプチドの混合物が配列番号：３、配列番号：１３、及び配列番号：１４を含有する組成物を含む、上記方法を含む。
【００１９】
第７の実施形態では、本発明は、多発性骨髄腫と診断された患者に投与するための活性化Ｔリンパ球を作製するエクスビボ法を含み、この方法は、（ａ）抗原ペプチド負荷ショウジョウバエ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、少なくとも１つの抗原ペプチドをショウジョウバエａＡＰＣに負荷することにより調製する工程であって、この抗原ペプチドが、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む工程と、（ｂ）その患者からＴリンパ球を単離する工程と、（ｃ）かかるＴリンパ球をかかる抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣと接触させる工程と、（ｄ）活性化Ｔリンパ球を生成する工程であって、この活性化Ｔリンパ球が多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である工程と、（ｅ）その患者に戻し投与するためのその活性化Ｔリンパ球を回収する工程と、（ｆ）かかる活性化Ｔリンパ球を再刺激する工程であって、かかる再刺激手順が、（ｉ）その活性化Ｔリンパ球を、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−ｇ、及びＴＮＦ−αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインと接触させ、これにより活性化Ｔ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進する工程と、（ｉｉ）その活性化Ｔ細胞を、照射した自己非ＣＤ８＋細胞、接着性非ＣＤ８＋細胞、又は抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣとインキュベートし、これにより再刺激された活性化Ｔリンパ球を生成する工程とを含む工程と、を含む。
【００２０】
第８の実施形態では、本発明は、かかる再刺激手順が、（ｉ）その活性化Ｔリンパ球を、ＩＬ−２と、ＩＬ−７、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１からなる群から選択される少なくとも１つのその他サイトカインとの組み合わせと接触させ、これにより活性化Ｔ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進する工程と、（ｉｉ）その活性化Ｔ細胞を、照射した自己非ＣＤ８＋細胞、接着性非ＣＤ８＋細胞、又は抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣとインキュベートし、これにより再刺激された活性化Ｔリンパ球を生成する工程とを含む、上記方法を含む。
【００２１】
第９の実施形態では、本発明は、かかる再刺激手順が、濃度１〜１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２；濃度１〜１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−７、濃度１〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５及び濃度１〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１の存在下で、その活性化Ｔリンパ球を抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣと接触させる工程を含む、上記方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
ここで本発明の実施形態を、添付の図面を参照し、例示のみの目的で説明する。
【図１】ペプチドを同定するＬＣ／ＭＳ／ＭＳピークの選択、ＨＬＡ−Ａ２安定化検定法でのペプチド結合に対するペプチドの試験、及び51Ｃｒ遊離アッセイでのＣＴＬ活性の試験を含む、ペプチド同定プロセスの略図を示す。
【図２】合成され、Ｔ２細胞におけるＨＬＡ−Ａ２分子への結合及び安定化能について評価された２４種類の選択したペプチドに関する、ペプチド濃度に対する蛍光強度中央値（ＭＦＩ）のグラフを示す。ＨＢＣ（Ｂ型肝炎コアタンパク質）のペプチドを陽性対照として用いた。
【図２Ａ】ＨＢＣ対照ペプチド及びペプチド１〜６（Ｐ１〜Ｐ６）の結果を示しており、記号は以下の通りである。ＨＢＣ（黒丸）、Ｐ１（白丸）、Ｐ２（黒三角）、Ｐ３（白三角）、Ｐ４（黒四角）、Ｐ５（白四角）、及びＰ６（黒菱形）。
【図２Ｂ】対照ペプチド（ＨＢＣ）及びペプチド７〜１２（Ｐ７〜Ｐ１２）の結果を示しており、記号は以下の通りである。ＨＢＣ（黒丸）、Ｐ７（白丸）、Ｐ８（黒三角）、Ｐ９（白三角）、Ｐ１０（黒四角）、Ｐ１１（白四角）、及びＰ１２（黒菱形）。
【図２Ｃ】対照ペプチド（ＨＢＣ）及びペプチド１３〜１８（Ｐ１３〜Ｐ１８）の結果を示しており、記号は以下の通りである。ＨＢＣ（黒丸）、Ｐ１３（白丸）、Ｐ１４（黒三角）、Ｐ１５（白三角）、Ｐ１６（黒四角）、Ｐ１７（白四角）、及びＰ１８（黒菱形）。
【図２Ｄ】対照ペプチド（ＨＢＣ）及びペプチド１９〜２４（Ｐ１９〜Ｐ２４）の結果を示しており、記号は以下の通りである。ＨＢＣ（黒丸）、Ｐ１９（白丸）、Ｐ２０（黒三角）、Ｐ２１（白三角）、Ｐ２２（黒四角）、Ｐ２３（白四角）、及びＰ２４（黒菱形）。
【図３】51Ｃｒ遊離アッセイで測定したＣＴＬ活性のグラフを示す。５種の異なるＣＴＬのバッチを１人のＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー（ドナー１）から生成した。ＣＴＬ生成及びＴ２細胞への負荷の両方のために、２４種類の選択したペプチドを混合して又は個々に用いて、異なる組み合わせのペプチド混合物（ＰＭ）、又は個々のペプチド（Ｐ）を作製した。個々のペプチド、又は各ＣＴＬを生成するのに用いたのと同じペプチド混合物を負荷したＴ２細胞により、51Ｃｒ遊離アッセイにおいて異なるＣＴＬの活性を測定した。データを、エフェクター（Ｅ）標的（Ｔ）比（Ｅ／Ｔ）に対する特異的致死率（％）として示す。
【図３Ａ】ペプチド混合物１（ＰＭ１）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ１、Ｐ７、Ｐ９、及びＰ１２を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ１、Ｐ７、Ｐ９、若しくはＰ１２、又はペプチドＰ１、Ｐ７、Ｐ９、及びＰ１２を含むペプチド混合物ＰＭ１を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１（黒丸）、Ｐ７（白丸）、Ｐ９（黒三角）、Ｐ１２（白三角）、ＰＭ１（黒四角）、ＨＢＣ（白四角）、及びペプチドなし（黒菱形）。
【図３Ｂ】ペプチド混合物２（ＰＭ２）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ１３、Ｐ１７、及びＰ２１を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ１３、Ｐ１７、若しくは２１、又はペプチドＰ１３、Ｐ１７、及びＰ２１を含むペプチド混合物ＰＭ２を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１３（黒丸）、Ｐ１７（白丸）、Ｐ２１（黒三角）、ＰＭ２（白三角）、ＨＢＣ（黒四角）、ペプチドなし（白四角）。
【図３Ｃ】ペプチド混合物３（ＰＭ３）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ５、Ｐ６、Ｐ８、及びＰ１０を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ５、Ｐ６、Ｐ８、若しくはＰ１０、又はペプチドＰ５、Ｐ６、Ｐ８、及びＰ１０を含むペプチド混合物ＰＭ３を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ５（黒丸）、Ｐ６（白丸）、Ｐ８（黒三角）、Ｐ１０（白三角）、ＰＭ３（黒四角）、ＨＢＣ（白四角）、及びペプチドなし（黒菱形）。
【図３Ｄ】ペプチド混合物４（ＰＭ４）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ１４、Ｐ１５、及びＰ２０を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ１４、Ｐ１５、若しくはＰ２０、又はペプチドＰ１４、Ｐ１５、及びＰ２０を含むペプチド混合物ＰＭ４を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１４（黒丸）、Ｐ１５（白丸）、Ｐ２０（黒三角）、ＰＭ４（白三角）、ＨＢＣ（黒四角）、ペプチドなし（白四角）。
【図３Ｅ】ペプチド１４を用いて生成したＣＴＬの結果を示す。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、又は個々のＰ１４ペプチドを負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチドを負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１４（黒丸）、ＨＢＣ（白丸）、及びペプチドなし（黒三角）。
【図４】51Ｃｒ遊離アッセイで測定したＣＴＬ活性のグラフを示す。６種の異なるＣＴＬのバッチを１人のＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー（ドナー２）から生成した。ＣＴＬ生成及びＴ２細胞への負荷の両方に対し、２４種類の選択したペプチドを混合して、又は個々に用いて、異なる組み合わせのペプチド混合物（ＰＭ）、又は個々のペプチド（Ｐ）を作製した。個々のペプチド、又は各ＣＴＬを生成するのに用いたのと同じペプチド混合物を負荷したＴ２細胞により、51Ｃｒ遊離アッセイにおいて異なるＣＴＬの活性を測定した。データを、エフェクター（Ｅ）標的（Ｔ）比（Ｅ／Ｔ）に対する特異的致死率（％）として示す。
【図４Ａ】ペプチド混合物１（ＰＭ１）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ５、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ１０、及びＰ１３を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ５、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ１０、若しくはＰ１３、又はペプチドＰ５、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ１０、及びＰ１３を含むペプチド混合物ＰＭ１を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ５（黒丸）、Ｐ６（白丸）、Ｐ８（黒三角）、Ｐ１０（白三角）、Ｐ１３（黒四角）、ＰＭ１（白四角）、ＨＢＣ（黒菱形）、及びペプチドなし（白菱形）。
【図４Ｂ】ペプチド混合物２（ＰＭ２）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ１４、Ｐ１５、Ｐ１７、Ｐ２０、及びＰ２１を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ１４、Ｐ１５、Ｐ１７、Ｐ２０、若しくはＰ２１、又はペプチドＰ１４、Ｐ１５、Ｐ１７、Ｐ２０、及びＰ２１を含むペプチド混合物ＰＭ２を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１４（黒丸）、Ｐ１５（白丸）、Ｐ１７（黒三角）、Ｐ２０（白三角）、Ｐ２１（黒四角）、ＰＭ２（白四角）、ＨＢＣ（黒菱形）、ペプチドなし（白菱形）。
【図４Ｃ】ペプチド混合物３（ＰＭ３）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ１、Ｐ３、Ｐ７、Ｐ９、及びＰ１１を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ１、Ｐ３、Ｐ７、Ｐ９、若しくはＰ１１、又はペプチドＰ１、Ｐ３、Ｐ７、Ｐ９、及びＰ１１を含むペプチド混合物ＰＭ３を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１（黒丸）、Ｐ３（白丸）、Ｐ７（黒三角）、Ｐ９（白三角）、Ｐ１１（黒四角）、ＰＭ３（白四角）、ＨＢＣ（黒菱形）、及びペプチドなし（白菱形）。
【図４Ｄ】ペプチド混合物４（ＰＭ４）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ１２、Ｐ１６、Ｐ２２、及びＰ２３を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ１２、Ｐ１６、Ｐ２２、若しくはＰ２３、又はペプチドＰ１２、Ｐ１６、Ｐ２２、及びＰ２３を含むペプチド混合物ＰＭ４を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１２（黒丸）、Ｐ１６（白丸）、Ｐ２２（黒三角）、Ｐ２３（白三角）、ＰＭ４（黒四角）、ＨＢＣ（白四角）、及びペプチドなし（黒三角）。
【図４Ｅ】ペプチド５を用いて生成したＣＴＬの結果を示す。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、又は個々のＰ５ペプチドを負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチドを負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ５（黒丸）、ＨＢＣ（白丸）、及びペプチドなし（黒三角）。
【図４Ｆ】ペプチド１４を用いて生成したＣＴＬの結果を示す。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、又は個々のＰ１４ペプチドを負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチドを負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１４（黒丸）、ＨＢＣ（白丸）、及びペプチドなし（黒三角）。
【図５】51Ｃｒ遊離アッセイで測定したＣＴＬ活性のグラフを示す。３種の選択したペプチドＰ３、Ｐ１３、及びＰ１４の混合物（ＰＭ）を用いて、１人のＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー（ドナー１６）からＣＴＬを生成した。個々のペプチド、又はＣＴＬを生成するのに用いたのと同じペプチド混合物を負荷したＴ２細胞により、51Ｃｒ遊離アッセイにおいてＣＴＬ活性を測定した。データを、エフェクター（Ｅ）標的（Ｔ）比（Ｅ／Ｔ）に対する特異的致死率（％）として示す。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）において、記号は以下の通りである。Ｐ３（黒丸）、Ｐ１３（白丸）、Ｐ１４（黒三角）、ＰＭ（白三角）、及びペプチドなし（黒四角）。
【図６】３種のペプチド（Ｐ３、Ｐ１３、及びＰ１４）の混合物を使用して１人のＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー（ドナー１６）から生成されたＣＴＬを用いる、４種の異なる腫瘍細胞株に対するＣＴＬ溶解活性のグラフを示す。４種の細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１９６）、ＩＦＮ−α処理したＵ２６６、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８０８３、及びＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１４８４であった。データを、エフェクター（Ｅ）標的（Ｔ）比（Ｅ／Ｔ）に対する特異的致死率（％）として示す。
【図６Ａ】ＩＦＮ−α処理したＵ２６６細胞（黒丸）及びＵ２６６細胞（白丸）の特異的致死率（％）の結果を示す。
【図６Ｂ】ＩＦＮ−α処理したＣＣＬ−８０８３細胞（黒丸）及びＣＣＬ−１４８４細胞（白丸）の特異的致死率（％）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明を説明するため、様々な代表的実施形態を以下に記載する。
【００２４】
本発明では、ＨＬＡ−Ａ２分子の免疫親和性精製により、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株（Ｕ２６６）からＨＬＡ−Ａ２関連ペプチドを精製した。液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によるピークの系統的同定、及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いるデノボシーケンス解析の後に、ペプチドのアミノ酸配列を決定した。本発明の抗原ペプチドはＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化し、活性化Ｔ細胞はペプチド負荷Ｔ２標的細胞及び多発性骨髄腫細胞株の両方を死滅させた。
【００２５】
ペプチド
本発明は、少なくとも１つの抗原ペプチドを含む組成物に関し、この抗原ペプチドは、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、ＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この抗原ペプチドはＴリンパ球を活性化でき、その活性化Ｔリンパ球は多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である。
【００２６】
上記参照組成物は、２つ以上の抗原ペプチドの混合物を含むことができる。
【００２７】
本発明はまた、２つ以上の抗原ペプチドの混合物を含む組成物にも関し、この混合物の少なくとも１つの抗原ペプチドは、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、ＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択され、かつこの混合物の少なくとも１つの別の抗原ペプチドは、癌への関与が知られているその他抗原ペプチドから選択され、又は癌細胞に対するＣＴＬ応答の誘導能によって選択される。代表的なその他抗原ペプチドについては、例えば、米国特許第７，４０２，３１４号及び米国特許公開第２００９／００１７０００号を参照されたい。
【００２８】
自然に処理され、クラスＩのＭＨＣ分子に結合されるペプチドは、腫瘍特異的ＣＴＬによって認識され、ＣＴＬ応答を刺激するのに必ずしも最適なペプチドではない（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：２５３９〜２５４８，１９９６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４：３２１〜３２７，１９９８を参照されたい）。したがって、より容易にＣＴＬ応答を誘導するように、ペプチドを修飾することが有用であり得る。一般には、２種類の位置でペプチドを修飾できる。クラスＩのＭＨＣ分子との相互作用が予測されるアミノ酸残基においてペプチドを修飾でき、この場合、元のペプチドよりもクラスＩのＭＨＣ分子に対する親和性が高いペプチドを作製するのが目的である。また、ＣＴＬ上のＴ細胞レセプターとの相互作用が予測されるアミノ酸残基においてペプチドを修飾することもでき、この場合、元のペプチドよりもＴ細胞レセプターに対する親和性が高いペプチドを作製するのが目的である。これら両タイプの修飾により、元のペプチドに関連するが、元のペプチドよりも良好なＣＴＬ応答誘導が可能な変異型ペプチドを得ることができる。本明細書で用いるとき、用語「元のペプチド」は、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、ＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。
【００２９】
天然の相同タンパク質又はペプチドのファミリーの配列変化における研究において、特定のアミノ酸置換は他のものよりも許容される場合が多い。これらの置換を有するタンパク質又はペプチドは、元のタンパク質又は元のペプチドの特定の性質を維持する。このような変化は「保存的置換」と呼ばれる。ペプチド鎖内で異なっている、場合によっては選択的な部位における１つ以上の残基の「保存的置換」により、本明細書で開示される抗原ペプチドを修飾することもできる。保存的置換として、元のペプチド中のアミノ酸を、大きさ又は電荷、極性、若しくは疎水性などの化学的性質について元のペプチド中のアミノ酸と比較して類似している別のアミノ酸で置き換えることを挙げてよい。例えば、元のペプチドのある疎水性アミノ酸を、別の疎水性アミノ酸で置き換えてよい。更により保存的な置換は、ロイシンをイソロイシンで置き換えるような、同一又は類似する大きさ及び化学的性質のアミノ酸の置き換えである。
【００３０】
本明細書では、保存的置換を、次の５つのグループ、すなわち、小型の脂肪族非極性又はわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）を含むグループ１、極性で負に帯電した残基とそのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）を含むグループ２、極性で正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）を含むグループ３、大型の脂肪族非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ｌｉｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）を含むグループ４、大型の芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を含むグループ５のうちの、１つのグループ内での交換であると定義する。その他の保存的置換として、アラニンをイソロイシン残基で置き換えるように、あるアミノ酸を、類似する性質を有するが大きさが若干異なる別のもので置き換えることを含み得る。
【００３１】
当然のことながら、このような置換基には、一般的なＬ−アミノ酸以外の構造を含んでもよい。したがって、本発明の抗原ペプチドに通常見出されるＬ−アミノ酸に対してＤ−アミノ酸が置換されてもよく、これもまた本明細書の開示により包含される。加えて、非標準的Ｒ基（すなわち、天然タンパク質の一般的な２０種のアミノ酸で見出されるもの以外であるＲ基）を有するアミノ酸もまた置換目的で用い、本発明による抗原ペプチドを作製してもよい。
【００３２】
２か所以上の位置で置換が見出され、元のペプチドと実質的に同等の又はより高い活性を有する抗原ペプチドが得られる場合、これらの置換の組み合わせを検証し、組み合わされた置換が、ペプチドの抗原性に対して相加効果又は相乗（syngeneic）効果をもたらすのかどうかを確認することになる。ペプチド内で多くても４か所以下の位置が、同時に置換され得る。
【００３３】
置換されたペプチドのＣＴＬ応答刺激能で規定されるように、抗原活性が元のペプチドの大体１０倍である場合には、修飾された又は置換されたペプチドは、細胞傷害性評価法に基づいて、元のペプチドと実質的に同一であると見なされる。したがって、例えば、元のペプチド及び置換されたペプチドを等モル濃度使用したエフェクター：標的曲線の直線部分において溶解活性を比較するとき、置換されたペプチドと共にインキュベートした標的細胞で観察される特異的致死率パーセントは、比較が行われる点における元のペプチドのエフェクター：標的比よりわずか１０倍上回る、又は１０倍下回るエフェクター：標的比において、元のペプチドのそれと同等でなければならない。
【００３４】
本発明の抗原ペプチドを合成的に調製してよく、又はこれらを元のタンパク質生成物を発現している腫瘍細胞などの天然源から単離してもよい。合成的に調製される抗原ペプチドに関して、本明細書で想到される抗原ペプチドは、従来技術に従って溶液中又は固体支持体上で合成できる。様々な自動ペプチド合成機が市販されており、既知の手順に従って使用できる。例えば、Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，１９９２，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。より大きなペプチド合成の中間体として、本発明の抗原ペプチドフラグメントを合成することもできる。
【００３５】
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）
本発明の抗原ペプチドは、ナイーブＴ細胞を活性化し、選択したペプチドに特異的な活性化Ｔ細胞（例えば、活性化した表面抗原分類（ＣＤ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞、又は活性化したＣＤ８＋ Ｔ細胞のいずれかであり、それぞれ活性化ヘルパーＴ細胞、又はＣＴＬである）になり得る、１つ以上の抗原ペプチドを負荷した人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の生成に有用である。ａＡＰＣは、ペプチド負荷ａＡＰＣを接触させることにより生成される活性化Ｔ細胞を含む、治療用組成物及び細胞療法生成物の調製に有用である。抗原提示系の調製及び利用に関する一般的指針については、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号、及び同第６，７９０，６６２号、米国特許公開第２００９／００１７０００号、及び同第２００９／０００４１４２号、並びに国際公開第２００７／１０３００９号を参照されたい。
【００３６】
活性化Ｔリンパ球を生成し、ＣＴＬ応答を刺激するのに用いられるａＡＰＣは、一般的には、追加のプロセシングなしでペプチドのＭＨＣ分子への直接結合を可能にする最適長のペプチドと共にインキュベートされる。ＭＨＣクラスＩ分子は、一般に長さが８〜１２アミノ酸のペプチドに結合する。最も一般的な大きさはノナペプチド（nonopaptide）である。より大きいペプチド、例えば１５アミノ酸より大きいものは、クラスＩのＭＨＣ分子への結合効果が低いことが知られている。加えて、ａＡＰＣにより活性化される特異的Ｔ細胞系譜は、ａＡＰＣの表面上に発現されるＭＨＣ分子の性質に依存する。よって、ＭＨＣクラスＩ分子のみを発現しているａＡＰＣは、選択された１つ以上の抗原ペプチドを提示してＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化でき、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しているａＡＰＣは、選択された１つ以上の抗原ペプチドを提示してＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性化できる。同様に、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子の両方を発現しているａＡＰＣは、選択された１つ以上の抗原ペプチドを提示して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の両方を活性化できる。当該技術分野において現在既知の、又は利用できるようになる様々な手段及び手技により、選択された抗原ペプチドを細胞に提示し、ａＡＰＣに負荷してよい。好ましくは、ペプチドはａＡＰＣ系培地に添加される。
【００３７】
本発明の活性化Ｔ細胞を含む治療用組成物及び細胞療法生成物の調製に利用されるａＡＰＣは、外因性分子をその表面上に発現可能なヒト以外の種由来の修飾細胞を含む。ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子から選択される外因性ＭＨＣ分子を発現させるためにａＡＰＣが作製される。代表的なＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２．１である。
【００３８】
外因性ＭＨＣ分子に加えて、本発明のａＡＰＣ系はまた、少なくとも１つの外因性補助分子も含んでよい。任意の好適な数及び組み合わせの補助分子を利用してよい。ナイーブＴ細胞が、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合される抗原ペプチド又はその他免疫原を提示されるとき、補助分子はかかるナイーブＴ細胞の活性化を促進する。補助分子は、共刺激分子及び接着分子などの補助分子から選択されてよい。代表的な共刺激分子として、ＣＤ７０及びＢ７．１（Ｂ７．１は、以前はＢ７として知られており、ＣＤ８０としても知られる）が挙げられ、特にＴ細胞表面上のＣＤ２８及び／又はＣＴＬＡ−４分子に結合し、これにより、例えば、Ｔ細胞増幅、Ｔｈ１分化、Ｔ細胞短期間生存、及びインターロイキン（ＩＬ）−２などのサイトカイン分泌に作用する（Ｋｉｍら、２００４，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２２（４），ｐｐ．４０３〜４１０を参照されたい）。接着分子として、セレクチンなどの炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通型結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、及び細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの単回膜貫通型免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質などを挙げることができ、これらは、例えば細胞対細胞、又は細胞対マトリックスの接触を促進する。代表的な接着分子として、ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１などのＩＣＡＭが挙げられる。共刺激分子及び接着分子を包含する代表的な補助分子の選択、クローニング、調製、及び発現に有用な手技、方法、及び試薬は、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、及び同第６，３６２，００１号に例示されている。
【００３９】
ａＡＰＣになるように選択された細胞は、好ましくは細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチド輸送、及び／又は細胞内ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子−ペプチド負荷が欠失しているか、又は変温性（すなわち温度攻撃に対して哺乳類細胞株よりも感受性が低い）であるか、又はこれら欠失と変温性特性の両方を保有している。好ましくは、ａＡＰＣになるように選択された細胞はまた、外因性ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子、及び細胞内に導入される補助分子要素に対して、少なくとも１つの内因性対応物（例えば、内因性ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子、及び／又は上記内因性補助分子）を発現する能力をも欠失している。更に、ａＡＰＣは好ましくは、ａＡＰＣ生成のためのそれらの修飾以前に細胞が保有していた欠失及び変温性特性を保持する。代表的なａＡＰＣは、昆虫細胞株などの抗原プロセシング関連トランスポーター（ＴＡＰ）−欠失細胞株を構成するか、もしくはその細胞株由来である。代表的な変温性昆虫細胞株は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２細胞株などのショウジョウバエ細胞株である（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．１９７２ Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．３５３〜３６５を参照されたい）。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２細胞の調製、増殖、培養に関する実例となる方法は、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、及び同第６，３６２，００１号に記載されている。
【００４０】
一実施形態では、ａＡＰＣは凍結解凍サイクルにも曝される。代表的な凍結解凍サイクルにおいて、ａＡＰＣを収容する好適な容器を、適量の液体窒素、固体二酸化炭素（すなわちドライアイス）、又は急速に凍結を起こすような同様の低温材料と接触させることにより、ａＡＰＣを凍結してよい。続いて、低温材料をａＡＰＣから除去して周囲室温条件に曝すことにより、又は、微温湯浴若しくは温かい手を用いて解凍時間の短縮を促進する促進化解凍プロセスのいずれかにより、凍結したａＡＰＣを解凍する。更には、ａＡＰＣを凍結し、解凍まで長期間保存してもよい。また、凍結したａＡＰＣを解凍し、続いて更に用いるまで凍結乾燥してもよい。好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びその他防腐剤などの凍結解凍手順に悪影響を及ぼし得る防腐剤は、本質的にそのような防腐剤を欠く培地にａＡＰＣを移すことなどにより、凍結解凍サイクルを受けるａＡＰＣを含む培地には含まれず、又は本質的に除去される。
【００４１】
他の好ましい実施形態では、不活化後に、細胞増殖、核酸の複製又は発現が本質的に起こらないように、異種核酸及びａＡＰＣ内因性の核酸を架橋により不活化してよい。一実施形態では、外因性ＭＨＣ及び補助分子の発現、このような分子のａＡＰＣ表面上への提示、並びに選択された単一のペプチド又は複数のペプチドによる提示されたＭＨＣ分子の負荷に続く点で、ａＡＰＣが不活化される。よって、このような不活化されて選択したペプチド負荷ａＡＰＣは、本質的に増殖不能又は複製不能にされているものの、選択したペプチド提示機能を保持しており、好ましくはナイーブＴ細胞活性化機能をも保持している。好ましくは、架橋によっても、ａＡＰＣの抗原提示細胞機能を実質的に低下させることなく、細菌及びウイルス（viruse）などの微生物汚染が本質的にないａＡＰＣがもたらされる。したがって、架橋は、ａＡＰＣの重要なＡＰＣ機能を維持する一方で、ａＡＰＣを用いて開発された細胞療法生成物の安全性に関する懸念を軽減するのに役立つ。架橋及びａＡＰＣに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９／００１７０００号を参照されたい。
【００４２】
上記のように調製され不活化されたａＡＰＣは、外因性空ＭＨＣ分子を提示するため、高密度の選択したペプチド−ＭＨＣ複合体がａＡＰＣ表面上に実現され、かつこの高密度が野生型哺乳類ＡＰＣで観察される密度よりも実質的に高くなるように、十分量の選択したペプチドを有利にａＡＰＣに加えることができる。その後、ナイーブＴ細胞／不活化ａＡＰＣ培養を、治療的に有効なＣＴＬ集団を活性化し、濃縮するために適切な時間まで長期に維持できる。例えば、ナイーブＴ細胞／不活化ａＡＰＣの培養持続時間は、約１日〜約１０日、例えば２〜９日、３〜８日、又は４〜６日であってよい。
【００４３】
本発明のａＡＰＣでは、ＭＨＣ分子は空分子として発現される。そのような空分子は、任意の結合した抗原ペプチド、又はそのようなペプチドの抗原ペプチドフラグメントを本質的に欠いている。そのため、空ＭＨＣ分子を有するａＡＰＣは、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるペプチドを含む、１つ以上の抗原ペプチドを負荷することができ、この単数のペプチド又は複数のペプチドがａＡＰＣ表面上に発現されるＭＨＣ分子の抗原結合部位を占有し、この結合部位には選択された１つ以上の抗原ペプチドへの曝露前に結合しているペプチドはなかった。いったん負荷されれば、選択された１つ以上の抗原ペプチドはナイーブＴ細胞の活性化を引き起こす様式でナイーブＴ細胞に提示されることができる。
【００４４】
１つのペプチド種が、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択される実施形態では、選択したペプチド種は複数のペプチド分子を含み、そのそれぞれのアミノ酸組成及び配列が他と同一である。２つ以上のペプチド種が、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択される実施形態では、２つ以上の選択したペプチド種のそれぞれが複数のペプチド分子を独立して含み、そのそれぞれのアミノ酸組成及び配列が他と同一である。これらの２つ以上の種は、それぞれがａＡＰＣと同時に、または異なる段階のいずれかで接触させるために使用される。これらの実施形態のそれぞれにおいて、多抗原性又は多免疫原性ＭＨＣ−ペプチド複合体がａＡＰＣ上に生成される。空ＭＨＣ分子への選択したペプチドの負荷は、好ましくは、インビトロ、エクスビボ又はインビボに近似し得るほぼ生物学的結合条件下で起こる。
【００４５】
更に別の実施形態では、ａＡＰＣは、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるペプチドを含む、１つ以上の抗原ペプチド、並びに１つ以上のその他抗原ペプチドを負荷されてよい。代表的なその他抗原ペプチドについては、例えば、米国特許第７，４０２，３１４号及び米国特許公開第２００９／００１７０００号を参照されたい。
【００４６】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
本発明は更に、患者への投与用の治療用組成物及び細胞療法生成物として用いられる、活性化Ｔリンパ球をエクスビボで産生する方法に関する。活性化Ｔリンパ球をエクスビボで産生するために、被験者から採取されたフェレーシスサンプルからナイーブＴ細胞を得て、それを選択された１つ以上の本発明の抗原ペプチドを負荷したａＡＰＣと接触させる。その結果、接触されたナイーブＴ細胞は活性化され、その場合、ナイーブＴ細胞を活性化するのに使用した、選択された１つ以上の抗原ペプチドに対応する少なくとも１つのエピトープを発現する「標的細胞」に対して感作される。活性化Ｔ細胞に遭遇すると、このような標的細胞は、特異的な標的細胞傷害性を示す活性化T細胞の能力に基づく活性化T細胞によって死滅され得る（すなわち、特異的殺細胞）。したがって、その活性化Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）となる。活性化Ｔリンパ球のＣＴＬ活性を測定するのに使用し得る評価法に関しては当該技術分野において多くの例があり、例えば、ＣＴＬ活性は標準的なクロム（５１Ｃｒ）遊離アッセイを用いて測定できる（Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９６８ Ｆｅｂ；１４（２）：１８１〜９６）。
【００４７】
ナイーブＴ細胞を含むフェレーシスサンプルは、治療を必要とする被験者から得ることができる。好ましくは、被験者は、癌治療を必要とするヒト患者である。より好ましくは、被験者は、多発性骨髄腫治療を必要とするヒト患者である。あるいは、適切な条件下において、治療を受ける被験者由来ではなく、免疫細胞ドナーとしての健康な個人などのその他の適合性供給源から得られるナイーブＴ細胞などの免疫細胞を用いることができる（Ｓａｄｏｖｎｉｋｏｖａら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（１）：１９３〜２００（１９９８）；Ｍｕｎｚら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１）：２５〜３４（１９９９）；Ｌｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５８（４）：６２９〜３８（２００９））。また、不死化した又は形質転換した免疫細胞株を使用し、本発明による治療用組成物及び細胞療法生成物として用いる活性化Ｔ細胞を調製することもできる。
【００４８】
フェレーシスサンプルは、当該技術分野において現在既知の、又は利用できるようになる多くの好適なリンパ球除去（lymphocytapheresis）、リムファフェレーシス（lymphapheresis）、及び白血球除去（leukaphoresis）手順のいずれかにより被験者から採取でき、これにより採取した末梢血からＰＢＬの回収をもたらし、更に白血球をサンプルの他の血漿成分から分離し得る。代表的な手順は、例えば、米国特許第４，６９０，９１５号、同第５，１２６，１３２号、同第６，２５５，０７３号、同第５，８４６，８２７号、同第６，２５１，３８５号、同第６，１９４，２０７号、同第５，４４３，９８３号、同第６，０４０，１７７号、及び同第５，７６６，９２０号、並びに米国特許公開第２００９／００１０９５０号、及び同第２００７／０２５８９５９号に例示されている。
【００４９】
ナイーブＴ細胞は、細胞成長及び増殖状態、細胞表現型、並びに細胞活性に関連するような日常的に選択される１つ以上の適切な特性に基づいて実験的に同定することができる。細胞成長及び増殖状態に関して、ナイーブＴ細胞は、好ましくは静止しているＴ細胞（つまり、細胞周期のＧ0部分に属する傾向がある）集団を含む。活性化Ｔ細胞は、多くの場合細胞周期のＧ1期又はＳ期にある。記憶Ｔ細胞は、一時ナイーブであったが、活性化され、続いて再度静止状態に入ったＴ細胞を含むか、又は恒常性増幅の結果として記憶表現型を獲得したナイーブＴ細胞を含む（例えば、Ｏｐｆｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８３，ｐｐ．１７４５〜１７４８（１９９９）；Ｗｈｅｒｒｙら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．２２５〜２３４（２００３）；Ｋａｅｃｈら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１１１，ｐｐ．８３７〜８５１（２００２）；Ｋｉｅｐｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９６，ｐｐ．１３３０６〜１３３１１（１９９９）；Ｇｏｌｄｒａｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１９２，ｐｐ．５５７〜５６４（２０００）；Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６５，ｐｐ．１７３３〜１７３７（２０００）を参照されたい）。このような記憶Ｔ細胞は、例えば感作抗原への再暴露、ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞からの補助、及び／又は適切なサイトカインへの曝露で再活性化され得る。したがって、ナイーブＴ細胞は、ナイーブＴ細胞プールの枯渇（抗原に対する応答においてＴ細胞の強力な活性化中に起こるような）により、ナイーブＴ細胞の数を再び満たすために比較的ゆっくりとした恒常性増殖の期間を必要としない限り、記憶Ｔ細胞及び活性化Ｔに比べてインビボで比較的非増殖的である（例えば、Ｋｉｅｐｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐｐ．３１５７〜３１６３（２００５），及びＢａｃｃａｌａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐｐ．４６０６〜４６１２（２００５）を参照されたい）。表現型について、ナイーブＴ細胞は、非ナイーブＴ細胞で観察される発現レベルと比較して、ＣＤ１１ａlow／ＬＦＡ−１low（又はdim）、ＣＤ２５low、ＣＤ２７+（又はhi）、ＣＤ４４low又はＣＤ４４int、ＣＤ４５ＲＡ+（又はpos）、ＣＤ４５ＲＯ-（又はneg）、ＣＤ９５low（又はdim）、ＣＤ５７-（又はneg）、及びＣＤ６２Ｌhi（又はbright）を含み得るナイーブＴ細胞関連ＣＤ分子の特性の存在及び相対的発現レベルによって、非ナイーブＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、及びエフェクターＴ細胞（例えばＣＴＬ））と識別され得る。ナイーブＴ細胞は、非ナイーブＴ細胞で観察される発現レベルと比較して、比較的高レベルのケモカインレセプターＣＣＲ７（ＣＣＲ７hi）の発現により識別することもできる（例えば、ＭｃＦａｒｌａｎｄら、ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９７（８），ｐｐ．４２１５〜４２２０（２０００）；Ｉｓｈｉｍａｒｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．７（７），ｐｐ．７６３〜７７２（２００６）；及びＫｅｒｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ．２９０８〜２９１５（１９９９）を参照されたい）。対照的に、例えば記憶細胞は、ＣＤ２７low、ＣＤ４４hi、ＣＤ４５ＲＡ-、ＣＤ４５ＲＯ+、ＣＤ５７+（又はｈｉ）、ＣＤ６２Ｌlow、及び／又はＣＣＲ７low表現型により特徴付けることができる（例えば、Ｋｅｒｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ．２９０８〜２９１５（１９９９）及びＢａｃｃａｌａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７４：４６０６〜４６１２（２００５）を参照されたい）。細胞活性に関して、ナイーブＴ細胞は、インターフェロンα、インターフェロンγ、インターロイキン（ＩＬ）１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、及び／又は顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦを効率的に産生又は分泌できないことにより特徴付けることができる（例えば、Ｃｅｒｗｅｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．，１６１，ｐｐ．９７〜１０５（１９９８）；Ｗａｌｚｅｒら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２０６，ｐｐ．１６〜２５（２０００）；米国特許公開第２００２／０１１９１２１を参照されたい）。また、ナイーブＴ細胞は仮定の標的細胞に対して実質的な細胞傷害性又は特異的殺細胞活性を示さない。
【００５０】
好ましくは、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞、又はナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞及びナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞であってよいこれらのナイーブＴ細胞は、他の末梢血白血球（ＰＢＬ）、例えば非Ｔ細胞から実質的に分離され、次いで活性化Ｔ細胞を含有する治療用組成物又は細胞療法生成物の製造に用いられる。ＰＢＬの選択法として、Ｆｉｃｏｌｌ勾配、免疫精製を利用する技術（例えばＣＤ分子などの細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体、並びに抗体が吸着できるセファロース−、プロテインＡ−、及びプロテインＧ−結合ビーズなどのビーズ、並びに抗体が吸着できる磁気ビーズ）、フローサイトメトリー、及び蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析が挙げられる。好ましくは、選択されたナイーブＴ細胞は、当該技術分野で利用できるような磁気ビーズ精製システム、例えばＦＡＣＳに基づく手法などの細胞ソーティング法と組み合わせたＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びＤｙｎａｂｅａｄシステム（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、又は他の適切な細胞ソーティングデバイス及び方法により実質的に精製される。次いで、実質的に精製されたナイーブＴ細胞を、選択したペプチド負荷ａＡＰＣと混合し、活性化ヘルパーＴ細胞、好ましくはＣＴＬ又はＣＤ８＋記憶Ｔ細胞などの、活性化Ｔ細胞の所望の集団に活性化し、濃縮するために十分な時間インキュベートする。このような活性化Ｔ細胞は、好ましくはペプチド特異的な様式で活性化される。
【００５１】
実質的に分離されたナイーブＴ細胞とａＡＰＣの比率はまた、例えば、個体のリンパ球の培養条件に対する適用性、及び治療される疾患又はその他状態の性質及び重篤度などの個体の特性を考慮して、特定の個体について最適化することもできる。代表的な分離されたナイーブＴ細胞と不活化ａＡＰＣの比は、約３０：１〜３００：１である。例えば、３×１０7個のヒトナイーブＴ細胞及び１×１０6個のａＡＰＣを混合し、ＲＰＭＩ １６４０培地を含む培地で維持することができる。
【００５２】
活性化Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞、又はＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＤ４＋ Ｔ細胞の組み合わせを含んでよく、これらは感作され、かつ刺激され、したがって上記のように活性化され、所望により再刺激及び／又は増幅されて、所望の表現型及び数の活性化Ｔ細胞を含む治療用組成物及び細胞療法生成物を製造することができる。代表的な再刺激手順には、活性化Ｔ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進する１つ以上の選択されたサイトカインを添加する工程と、活性化Ｔ細胞を選択したペプチド負荷非ＣＤ８＋細胞、例えばＣＤ１４＋細胞とインキュベートする工程と、を含む。適切なサイトカインの選択は、治療用組成物又は細胞療法生成物を最終的に含むことになる活性化Ｔ細胞の所望の表現型に依存する。したがって、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞は、活性化され所望により再刺激及び／又は増幅されてＣＤ４＋ Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＣＤ４＋ Ｔｈ１細胞又はＣＤ４＋ Ｔｈ２細胞になり得、そしてナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞は、活性化され所望により再刺激及び／又は増幅されてＴ細胞傷害性（Ｔｃ）様の表現型を有するＣＴＬ、例えば当該技術分野の指針を考慮する技術者により所望されるように、Ｔｃ１様表現型を有するＣＴＬ、Ｔｃ２様表現型を有するＣＴＬ、記憶Ｔ細胞、又はこのような組み合わせになり得る（例えば、Ｃｅｒｗｅｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６３（１０），ｐｐ．５５３５〜５５４３（１９９９）；Ｍｏｓｍａｎｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，Ｖｏｌ．１７（３），ｐｐ．１３８〜１４６（１９９６）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．８（３），ｐｐ．３３６〜３４２（１９９６）；Ｃｒｏｆｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１８０，ｐｐ．１７１５〜１７２８（１９９４）；Ｆｕｊｉｈａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．３６１３〜３６１８（１９９６）；及び米国特許第６，３５５，４７９号を参照されたい）。代表的なサイトカインとして、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αが挙げられる。代表的なＴ細胞増幅手順は、活性化Ｔ細胞を、照射した非ＣＤ８＋細胞と共に、選択されたサイトカイン及びＯＫＴ（登録商標）３などの抗ＣＤ３抗体調製物の存在下でインキュベートし、非特異的活性化Ｔ細胞増幅を促進する工程を含む。使用されるこのような再刺激及び増幅プロトコールの数、順序、及び組み合わせの選択は、技術者の関心の範囲内にあり、当該技術分野の指針により容易になり得る。例えば、Ｃｅｒｗｅｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６１，ｐｐ．９７〜１０５（１９９８）；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．２４（４），ｐｐ．６１９〜６２９（１９９５）；及びＳａｄら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．２７１〜２７９（１９９５）を参照されたい。
【００５３】
好ましい実施形態では、刺激されたＴ細胞は引き続き、刺激されたＴ細胞を、活性化Ｔ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進するために十分な量のＩＬ−２及びＩＬ−７と接触させる工程と、続いてそのように接触させたＴ細胞を、照射した自己由来接着性非ＣＤ８＋細胞（例えばＣＤ１４＋細胞）並びに追加の十分量のＩＬ−２及びＩＬ−７とインキュベートする工程と、を含む、少なくとも１回繰り返す再刺激手順にかけられる。再刺激手順が２回以上行われる実施形態では、活性化Ｔ細胞を、各再刺激手順の繰り返しの間に追加量のＩＬ−２及びＩＬ−７と接触させる。他の好ましい実施形態では、活性化Ｔ細胞は、少なくとも１回の再刺激手順の繰り返しに引き続いて少なくとも１回の増幅手順にかけられ、ここで増幅手順は、活性化Ｔ細胞を、照射した非ＣＤ８＋細胞と、そのように接触させたＴ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進するために十分な量のＩＬ−２、並びに抗ＣＤ３抗体調製物、好ましくはＯＫＴ（登録商標）３の存在下でインキュベートする工程を含む。
【００５４】
好ましい実施形態では、ナイーブＴ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞を含み、活性化され所望により再刺激及び／又は増幅される際に、例えば、それらが標的とする細胞に対する細胞傷害性活性を示すことができ、又は免疫賦活性（immunostimlatory）若しくは細胞傷害性関連のサイトカインを産生することがでる。好ましくは、これらの特徴の組み合わせを示す。感作され活性化されたナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞を、上述の再刺激手順及び／又は増幅プロトコールにかけることができ、このことは特異的ＣＴＬ細胞系譜の表現型への活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞の分化を推進する。ペプチド負荷ａＡＰＣ−活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞もまた、選択したペプチド単独と、又は特定のサイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１２、並びにインターフェロンγと共に、又は活性化Ｔ細胞表面上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び共刺激分子に対するものなどの抗体と共に、インビボ又はインビトロでの再刺激手順に数回かけることができる。好ましい実施形態では、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、このような方法で更に再刺激され、少なくとも約４世代又は５世代にわたり標的細胞に関する免疫原性及び細胞傷害性を維持し、記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞を生じる。記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞の同定、特性決定、免疫原性維持、及び増幅の方法は、例えば、Ｃｅｒｗｅｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．，１６１，ｐｐ．９７〜１０５（１９９８）；Ｃｅｒｗｅｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６３，ｐｐ．５５３５〜５５４３（１９９９）；米国特許公開第２００２／０１１９１２１号に見出すことができる。
【００５５】
活性化Ｔ細胞は、当該技術分野において既知又は利用可能な好適な技術を用いてａＡＰＣから分離することができる。例えば、ａＡＰＣ、ａＡＰＣ上に負荷されたペプチド、又は活性化Ｔ細胞（若しくはその一部）に特異的なモノクローナル抗体を使用して、適切な相補的リガンドを結合できる。続いて、免疫沈降又は免疫評価法などの好適な技術により、ａＡＰＣ／活性化Ｔ細胞混合物から抗体標識した細胞を抽出できる。あるいは、分離工程を完全に省略し、不活化ａＡＰＣを活性化Ｔ細胞と共に培養中に残してもよい。
【００５６】
好適な実施形態では、ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞が活性化のために選択され、所望量の得られたＣＴＬを使用して治療的投与のための細胞療法生成物を調製する。好ましくは投与前に、活性化Ｔリンパ球又は細胞療法生成物について１種以上の品質保証試験を行う。好ましい実施形態では、品質保証試験は、１種以上の試験を実施し、患者とＴリンパ球との間のＨＬＡマッチ；フローサイトメトリー分析（ＣＤ８＋、ＴＣＲ＋）；無菌性（細菌又は真菌の成長がない）；細菌についてグラム染色陰性；ＰＣＲ／ＥＬＩＳＡについてマイコプラズマ陰性；残存ショウジョウバエＤＮＡがない；昆虫ウイルスｃＤＮＡの不在；生存率（＞７２％生存）；及びＣＴＬ評価による細胞溶解活性を確認することを含む。
【００５７】
被験者を治療するために、本発明による有効量の細胞療法生成物が、疾患、傷害、又は状態を患っているか、又はこれらを有すると診断された被験者に対して投与される。「有効量」は、かかる治療を必要とする患者において、所望の治療的又は予防的効果を一般的にもたらすのに十分な量又は十分な投与量である。本発明の細胞療法生成物の有効量又は有効投与量は、モデリング、用量増加試験又は臨床試験などの常法により、並びに、例えば投与の態様や経路又は薬剤送達、細胞療法生成物の薬物動態、疾患、傷害又は状態の重篤度及び経過、被験者の過去又は現在の治療法、被験者の健康状態及び薬物への応答、及び治療に携わる医師の判断などの所定の因子を考慮することにより決定することができる。代表的な投与量として、細胞集団は、成人のヒトに対して、約１×１０6〜約１×１０12個の活性化Ｔ細胞、例えば１×１０8〜１×１０11、又は１×１０9〜１×１０10個の活性化Ｔ細胞を含むことができる。
【００５８】
細胞療法生成物は、活性化Ｔ細胞と、被験者に注入されるまで活性化Ｔ細胞を維持するのに好適な賦形剤、例えば製薬上許容できる希釈剤又は溶媒とを含む治療用組成物として調製される。好適な実施形態では、細胞療法生成物は、乳酸リンゲル注射液ＵＳＰ（７６％（容積／容積））、５％デキストロース生理食塩液（Ｄ５ＮＳ；４％（容積／容積））、及び２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；２０％（容積／容積））を含む溶液に、約１×１０9〜約１０×１０9個のＣＴＬを含む。
【００５９】
細胞成分を含む組成物を被験者に投与するための任意の好適な技術を使用できる。例えば、静脈内注入による活性化ＣＴＬの投与を採用できる。複数回の注入を必要とする、又は指示される場合があり、これらの注入を数週間、又はそれ以上の期間にわたり行うことができる。代表的な技術は、例えば、米国特許第４，８４４，８９３号、及び同第４，６９０，９１５号に記載される。
【００６０】
所望により、細胞療法生成物又は調製物は、選択したペプチドを負荷したａＡＰＣに加えて、その他免疫調整成分、好ましくは免疫刺激成分を含むように補充してよい。このような追加成分を、ナイーブＴ細胞のペプチド負荷ａＡＰＣとの接触前、それと同時、又はその後に加えてよい。このような補助的免疫調整成分、好ましくは免疫刺激成分が加えられる所望の時点、投与濃度、及び頻度の選択は、所望の増殖速度、増幅率、細胞数、寿命、又は免疫原性などの関連する検討事項に従って選択できる。補助的成分又は免疫刺激成分は、例えば、非ナイーブＴ細胞以外の１つ以上の白血球、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、及び抗体であってよい。選択できる代表的な白血球として、非ＣＤ８接着細胞、ＣＤ１４＋接着細胞などの接着細胞、単核細胞、マクロファージ、ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、及び免疫調整性、好ましくは免疫刺激性の効果又は刺激を付与できるその他白血球が挙げられる。このような白血球は、自己由来又は異種起源であってよい。代表的なサイトカインとして、インターロイキン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、インターフェロン、例えばｇ−インターフェロン、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦ−αが挙げられる（例えば、Ｔｉｚａｒｄ Ｉ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１２９〜１４３，（１９９２）；米国特許公開第２００２／０１１９１２１号を参照されたい）。サイトカインは組換え型又は天然起源であってよい。代表的な抗体として、モノクローナル抗ＣＤ３抗体、例えばＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ ＯＫＴ（登録商標）３（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）として示されるものが挙げられる。
【００６１】
本発明の一実施形態では、自己非ＣＤ８、ＣＤ１４＋接着細胞、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びモノクローナル抗ＣＤ３抗体調製物（ＯＫＴ（登録商標）３）が、細胞療法用調製法における追加の免疫刺激成分として使用される。このような実施形態では、選択したペプチドを負荷したａＡＰＣで初回刺激を受けたナイーブＴ細胞を、有効量の組換えＩＬ−２及び組換えＩＬ−７（例えば、約１〜１００単位／ｍＬのＩＬ−２、好ましくは１、１０、１５、２０、５０、又は１００単位／ｍＬのＩＬ−２、及び約１〜１００単位／ｍＬのＩＬ−７、好ましくは１、１０、１５、２０、又は５０単位／ｍＬのＩＬ−７）と接触させる工程と、次いで有効量の自己由来の選択したペプチド負荷非ＣＤ８、ＣＤ１４＋接着細胞（例えば、初回刺激を行ったナイーブＴ細胞４個ごとに、非ＣＤ８、ＣＤ１４＋接着細胞を約１個）と接触させる工程と、を含む再刺激手順にかける。ＩＬ−２／ＩＬ−７及びＣＤ１４＋接着細胞と接触させる期間は、それぞれ約２日、及び約３〜約４日であり、各再刺激手順を少なくとも１回続けて繰り返してよい。少なくとも２回の再刺激手順の後、非特異的Ｔ細胞増幅レジメンとして、細胞をＩＬ−２及び抗ＣＤ３（例えば、ＯＫＴ（登録商標）３）と約２〜約５日接触させる工程を含む。
【００６２】
別の実施形態では、自己ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、又はＩＬ−２１を、初回刺激又は再刺激手順の前、それと同時、又はその後にナイーブＴ細胞と接触させる。また、ＩＬ−２を、ＩＬ−７、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１のうち少なくとも１つと組み合わせて使用してもよい。ＩＬ−１５が使用される場合、ＩＬ−１５の有効量は、約１〜１００ｎｇ／ｍＬ、例えば１、１０、２０、２５、４０、又は５０ｎｇ／ｍＬの量のＩＬ−１５である。同様に、ＩＬ−２１が使用される場合、ＩＬ−２１の有効量は、約１〜１００ｎｇ／ｍＬ、例えば１、１０、２０、２５、４０、又は５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１である。このような実施形態では、ナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が記憶Ｔ細胞になることを目的としてよい。かかるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞レジメンを、上記再刺激手順又は非特異的Ｔ細胞増幅手順のいずれかに加えて、又はこれら手順の代わりに使用し、エクスビボでの複数回の再刺激手順を許容できる記憶Ｔ細胞とする。更には、次いでこのような記憶Ｔ細胞を含む細胞療法生成物は、被験者に投与されると、選択したペプチド及びその他活性化の合図と遭遇した際に、インビボで増幅されかつ刺激されてよい。ヘルパーＴ細胞の調製に、並びに記憶Ｔ細胞又はＣＴＬになるためのＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、及び／又はＩＬ−２１への取り込みが補助するナイーブＴ細胞の刺激又は増幅に全体的に関連する方法は、例えば、米国特許公開第２００２／０１１９１２１号に見出すことができる。
【００６３】
被験者の治療のために、細胞療法生成物を、細胞療法生成物の調製に用いたフェレーシス生成物を元々得た被験者に投与することが好ましくい。したがって、細胞療法生成物で治療される被験者に、好ましくは自己由来の活性化Ｔ細胞を含む、及びより好ましくはＣＴＬを含む、細胞療法生成物が投与される。活性化Ｔ細胞を取出すのに用いたフェレーシスサンプルを得た被験者に、活性化Ｔ細胞を再注入、つまり戻し注入してよい。使用できる再注入手順として、例えば、米国特許第４，８４４，８９３号、及び同第４，６９０，９１５号に開示される手順が挙げられる。
【００６４】
本発明による細胞療法生成物で治療され得る代表的な疾患、傷害、又は状態として、例えば、多発性骨髄腫などの癌が挙げられる。別の治療用生成物又はレジメンでの異なる治療前に、それと同時に、又はその後に、本発明による細胞療法生成物を用いた疾患、傷害、又は状態の治療を行ってよい。本発明の細胞療法生成物の投与と共に使用できる代表的な追加レジメン、構成成分、又はモダリティとして、例えば、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はインターフェロン投与などの免疫刺激、免疫抑制、及びその他の免疫療法レジメン；デニロイキンジフチトクス（ＤＡＢ−ＩＬ２）又はクラドリビン投与などのリンパ球枯渇及び骨髄破壊的（myeloblative）レジメン；並びに、従来の化学療法及び放射線療法が挙げられる。好適な実施形態では、国際公開第２００７／１０３００９号に開示されるものなどのリンパ球枯渇療法レジメンが、細胞療法生成物による治療と共に利用される。
【００６５】
よって、ナイーブＴ細胞は、本発明の細胞療法生成物で治療可能な状態又は疾患に罹患している被験者から有利に得ることができ、その後ナイーブＴ細胞の活性化を妨害、減弱、又は制限し得る他の治療又は療法を開始する。例えば、異常増殖又は腫瘍を有する個体の治療において、化学療法又は放射線療法の開始前にナイーブＴ細胞を含むリムファフェレーシス（lympapheresis）生成物を得て、培養液中に維持する、又は後で使用するために凍らせておくことができる。次いで、ナイーブＴ細胞を本発明に従って活性化することにより細胞療法生成物が提供され、他の治療レジメンの前、これらと同時、又はこれらの後に被験者に注入することができる。
【００６６】
本発明のその他の実施形態、特徴、及び利点は以下の実施例を参照することにより更に例示される。
【実施例】
【００６７】
更に説明しなくても、当業者は、上記の記述及び下記の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製及び使用し、特許請求する方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実際的な実施例は、本発明の実施形態を特異的に指摘するものであって、本開示の残部をいかようにも限定するものと解釈されない。
【００６８】
Ｕ２６６細胞株の細胞培養
抗原同定に用いた細胞株であるＵ２６６（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１９６）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補完したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、細胞培養用フラスコ及び攪拌ボトル内で増幅した。１日目に、通常は０．５×１０6個細胞／ｍＬで細胞を播種し、細胞密度が２×１０6個細胞／ｍＬになったとき、典型的には３日目又は４日目に細胞を分割した。
【００６９】
Ｕ２６６細胞株の細胞採取
細胞懸濁液を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して培養した細胞を集め、５０ｍＬのコニカルチューブ内で氷冷１×リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３回洗浄し、その後カウントした。約１×１０9個の細胞に相当する細胞ペレットのアリコートを液体窒素で急速に凍らせ、使用まで−８０℃で保存した。
【００７０】
ＨＬＡ−Ａ２抗体のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）への結合
ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＨＢ−８２（商標）（Ｐａｒｈａｍ及びＢｒｏｄｓｋｙ、Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（４）：２７７〜９９（１９８１））であるハイブリドーマ細胞株の細胞培養上清から、ＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体を精製した。ＢＢ７．２抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｏｄｕｃｔ＃ ｓｃ−３２２３６）及びＡｂｃａｍ（Ｐｒｏｄｕｃｔ＃ ａｂ７４６７４）から入手することもできる。ＢＢ７．２抗体はマウスモノクローナル抗ＨＬＡ−Ａ２抗体であり、ＩｇＧ2bアイソタイプである。この抗体は、ヒトＨＬＡ−Ａ２組織適合抗原内の、α−２ヘリックスのＣ末端にあるエピトープ、及び下部βストランドの１つ上のターンを認識する。ＢＢ７．２は全てのＨＬＡ−Ａ２サブタイプを認識するであろう。ＨＬＡ−Ａ２．１は、９０％がＡ２サブタイプを示し、残りの１０％には主にＡ２．２、Ａ２．３、Ａ２．５及びＡ２．７が含まれることを意味する。ＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体の結合前に、０．５ｍＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）トシル活性化（Tosylactivated）ビーズ（Ｄｙｎａｌ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号６５５．０１）を集め、ｐＨ９．５の０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液を含むコーティング緩衝液を用いて４回洗浄した。次いで、０．４２ｍＬの４．８ｍｇ／ｍＬ ＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体、コーティング緩衝液３．２６ｍＬ中、２．０８ｍＬの３Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4を用いて、室温（ＲＴ）で７２時間ビーズをインキュベートした。Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＭＰＣ（商標）−１磁気粒子濃縮器（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＳＡ，ＯＳＬＯ，Ｎｏｒｗａｙ）で上清を除去した。続いて、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む総容積が同じＰＢＳをビーズに添加し、このビーズをＲＴで更に４８時間インキュベートした。次いで、０．１％ ＢＳＡ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳでビーズを３回洗浄し、０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ ２ｍＬに再懸濁した。
【００７１】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）トシル活性化ビーズへの結合前及び後における、溶液中のＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体量を比較して、ＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体結合効率を評価した。総タンパク質２μｇを含有するサンプルをサンプル緩衝液に加え、１００℃で１５分間沸騰させた。サンプルを１０〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法），で分析した（データ示さず）。９０％を超える結合が確認された。
【００７２】
ＨＬＡ−Ａ２関連ペプチドの単離
Ｕ２６６細胞ペレットのアリコート（１×１０9個細胞より）を、２．５×１０7個細胞／ｍＬ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＣＨＡＰＳ（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２２６９４７）、５μＭ ＥＤＴＡ、０．２％アジ化ナトリウム、１７．４μｇ／ｍＬ ＰＭＳＦ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、及び２錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１６９７４９８）の濃度で含有する溶解用緩衝液４０ｍＬ中、回転装置を用いて１時間４℃にて再懸濁した。可溶化液を１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。沈殿物を捨て、上清を０．２２μｍのフィルターに通した。続いて、上清をＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体を結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（１ｍｇ ＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体／２５ｍｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、４℃で２４時間、回転装置使用）と共にインキュベートした。ビーズペレットをＤｙｎａｌ（登録商標）ＭＰＣ（商標）−１を用いて回収し、以下の４種類の洗浄緩衝液を用いて、一連の５０ｍＬ洗浄液で洗浄した。
洗浄緩衝液１：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＣＨＡＰＳ、５μＭ ＥＤＴＡ、０．２％アジ化ナトリウム、１７．４μｇ／ｍＬ ＰＭＳＦ
洗浄緩衝液２：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ
洗浄緩衝液３：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、４５０ｍＭ ＮａＣｌ
洗浄緩衝液４：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）
【００７３】
一連の４回の洗浄工程後、ＲＴで５分間、２ｍＬの１０％ ＨＡＣ（ｐＨ２．５）と共にビーズをインキュベートし、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＭＰＣ（商標）−１を５分間使用して、ＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体を結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）からペプチドを溶出した。ビーズから溶出された物質を１．５ｍＬ容のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ製プラスチックチューブに入れ、５分間ボイルして、ＭＨＣクラスＩ、ＨＬＡ−Ａ２重鎖から任意の結合したペプチドを更に解離させた。続いて、公称の分子量カットオフが５０００ダルトンであるＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ膜（Ａｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＵＦＣ４ＬＣＣ２５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用い、遠心分離により同時精製される重鎖及びβ２−ミクログロブリンからペプチドを分離した。使用前に、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ膜ユニットを１ｍＬの１０％酢酸で予め濡らし、１時間回転させ、両リザーバ中の全ての液体を捨てた。次いで、ビーズから溶出された物質を予め濡らしたＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ膜ユニットに移し、これを４℃で約５時間、３５００×ｇで遠心分離した。ろ液及び残余物の両方を回収した。ＭＨＣクラスＩ、ＨＬＡ−Ａ２分子（残余物）を含むペプチドを含まない画分のアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ペプチドを含まない画分は、それぞれＭＨＣクラスＩ重鎖及びβ２−ミクログロブリンに対応する４４ｋＤａ及び１２ｋＤａの予想されるバンドを有し、その純度は９５％であった（データ示さず）。ペプチド溶液（ろ液）を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）で分析し、その後デノボペプチドシーケンス解析によりペプチドのアミノ酸配列を決定した。
【００７４】
液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）
ペプチド溶液（ＨＬＡ−Ａ２関連ペプチドを単離したろ液）を、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加することにより酸性化した。各サンプルについて脱塩／トラップを目的に１０μＬをＥｋｓｉｇｅｎｔ ｎａｎｏＬＣ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に次の設定で注入した：トラップカラム＝ＬＣ ＰａｃｋｉｎｇｓのＣ１８ Ｐｅｐｍａｐ １００、粒径５μｍ、ポア径１００Å、カラム内径３００μｍ×５ｍｍ；トラップ用移動相＝水、２％メタノール、０．０５％ ＴＦＡ；トラップ用流速＝５μＬ／分；分析カラム＝Ｖｙｄａｃ Ｅｖｅｒｅｓｔ Ｃ１８、粒径５μｍ、ポア径３００Å、カラム内径７５μｍ×１５０ｍｍ；分析移動相：Ａ＝水、２％メタノール、０．１％ギ酸；Ｂ＝１０％水、９０％アセトニトリル、０．１％ギ酸；流速＝０．２μＬ／分；分析勾配＝０〜８０分１０〜３０％ Ｂ、８０〜１２０分３０〜６０％ Ｂ。Ｍａｓｓｌｙｎｘ ４．０を備えるＭｉｃｒｏｍａｓｓ ｑＴＯＦ Ｕｌｔｉｍａ及びＥＳＩ＋モードのｎａｎｏＳｏｕｒｃｅにおいて、データ依存ＭＳ／ＭＳ取り込みを実施した。デノボペプチドシーケンス解析にはＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ ２．０を使用した。
【００７５】
抗原ペプチドの配列決定
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたデノボシーケンス解析で得られるペプチド配列は、不完全なペプチド断片化により通常は曖昧である。ペプチドがアルゴンガスと衝突するとき、全ての可能性があるフラグメントが必ず発生するわけではない。実際に、ペプチド結合の一部は、変わらずに無傷である場合がある。加えて、様々な理由（例えば、共溶出、イオン抑制、又はフラグメントが正電荷を持たない場合）により、質量分析計で全てのペプチドフラグメントを検出できるわけではない。したがって、特定のペプチドのＬＣ／ＭＳ／ＭＳスペクトルは、完全ではない場合があり、すなわち、ラダー中に欠落段階があり得る。本発明では、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ ２．０シーケンス解析ツールを用い、続いて５回の反復評価のうち少なくとも３回から得られた類似する大きさのＬＣ／ＭＳ／ＭＳピーク配列を比較することにより、及び、ペプチド配列をヒトタンパク質配列データベースと比較することにより、ペプチド配列の曖昧さを低減した。この方法で、２１個のＬＣ／ＭＳ／ＭＳピークについて、９〜１２個のアミノ酸長を有する２４種類のペプチド配列を選択した。２４種類のペプチド配列のうち１９種を既知のヒト完全長タンパク質にマッピングした（表１）。その後、完全長タンパク質中のＨＬＡ結合モチーフの探索により、コンピュータ予測された更なるペプチドを得た（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２ Ｄｅｃ １；１４９（１１）：３５８０〜７）。２４種類の実験的に同定されたペプチド、ペプチドの一部の切断部、及びコンピュータ予測されたペプチドを合成し（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ Ｉｎｃ．，Ｂｒａｄｅｎｔｏｎ，ＦＬ）、ＨＬＡ−Ａ２安定化評価法で試験し、ＣＴＬを生成してそれらの活性を標準的な51Ｃｒ遊離アッセイで試験した。ペプチド同定方法の略図は図１に示される。表１は、更なる特性評価のために合成された２４種類の選択したペプチドのリスト、及び同定された場合はその各ペプチドの関連タンパク質を示す。
【００７６】
表１
配列決定され、ＨＬＡ−Ａ２安定化及びＣＴＬ活性に対する更なる特性評価のために合成するよう選択された２４種類のペプチド。完全長タンパク質が同定されなかったペプチド配列は、遺伝子記号、タンパク質受入番号、及び完全長タンパク質のアミノ酸残基の数について空欄である。
【００７７】
【表１】
【００７８】
ＨＬＡ−Ａ２安定化評価法
クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ／ＨＬＡ−Ａ２）分子へのペプチド結合の評価は、抗原プロセシング関連トランスポーター（ＴＡＰ）欠失細胞株、Ｔ２（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−１９９２）内で合成されるＭＨＣクラスＩ、ＨＬＡ−Ａ２分子に対するペプチドの安定化能力に基づく。ＭＨＣクラスＩ分子の安定化の程度は、添加されたペプチドの結合親和性に直接関連する（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ．１９９０ Ｊｕｌ ２７；６２（２）：２８５〜９５；Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．１９９９ Ａｕｇ；５４（２）：１８５〜９０）。
【００７９】
評価において、Ｔ２細胞を、１×１０6個細胞／ｍＬの密度で、最終ペプチド濃度２００μＭ、２０μＭ、２μＭ、２００ｎＭ、２０ｎＭ、２ｎＭ、ペプチドなし（陰性対照として）を含むＲＰＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）の９６ウェルＶ底プレートにまいた。ペプチドを含む細胞を、２６℃、５％ＣＯ2で１８時間インキュベートした。１８時間後、プレートを３７℃、５％ＣＯ2に移し、更に３時間インキュベートした。プレート内の細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２．５％ＦＣＳ、１％ＮａＮ3）で１回洗浄し、続いて１μＬ／ウェルのＦＩＴＣ標識したマウス抗ヒトＨＬＡ−Ａ２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カタログ番号５５１２８５）、１μＬ／ウェルのＰｌを添加して染色し、更に４℃で３０分間インキュベートした。染色後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、９６ウェルプレートから９６本のマイクロチューブのラックに移した。サンプルをＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターにかけ、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを分析した。
【００８０】
図２は、合成され、Ｔ２細胞におけるＨＬＡ−Ａ２分子への結合及び安定化能について評価された２４種類の選択したペプチドに関する、ペプチド濃度に対する蛍光強度中央値（ＭＦＩ）のグラフを示す。Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢＣ）のペプチドを陽性対照として用いた。Ｂ型肝炎コアペプチドは強力なＨＬＡ−Ａ２．１エピトープであり、残基数１８〜２７のコア配列である、アミノ酸ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号：７３）からなる（Ｚｈａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００７，１２１（１）：１０５〜１２）。ペプチドの結合親和性を強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）と特徴付けし、表２にまとめる。
【００８１】
表２
２４種類の選択したペプチドの相対結合親和性。
【００８２】
結合親和性は強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）と特徴付けられた。
【００８３】
【表２】
【００８４】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成
ショウジョウバエａＡＰＣをＳｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２細胞（Ｓ２細胞）から生成した。この細胞は数百のＯｒｅｇｏｎ−Ｒ（野生型）キイロショウジョウバエ（Ｏｒｅｇｏｎ−Ｒ）の胚（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ＣＲＬ−１９６３）から、発表された手順（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．１９７２ Ｖｏｌ ２７，ｐｐ．３５３〜３６５）に従って、元々は１９６９年に確立され、ＡＴＣＣに寄託されたものである（ＣＲＬ１０９７４）。Ｓ２細胞を１０％加熱不活化ウシ胎児血清を補充した市販のＳｃｈｎｅｉｄｅｒショウジョウバエ用培地で増殖した。ａＡＰＣを生成させるため、ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、及びＣＤ７０に対するヒト相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をｐＲｍＨａ−３ベクターに別々に挿入し、ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、及びＣＤ７０のプラスミドＤＮＡの混合物（ａＡＰＣクローン１１２０について）及びｐｈｓｈｎｅｏプラスミドを用いて、リン酸カルシウム沈降法によりＳ２細胞を形質転換した（ｐＲＭＨａプラスミドベクターの構築及び使用法については米国特許第６，２２５，０４２号を参照されたい）。Ｋ５６２細胞からのＨＬＡ−Ａ２．１、Ｋ５６２細胞からのＢ７．１、ＨＬ６０細胞からのＬＦＡ−３、Ｋ５６２細胞からのＩＣＡＭ−１、及びＨＬＡ−Ａ２．１＋ＬＣＬ細胞からのＣＤ７０について既報の配列から誘導されたプライマーを使用する、逆転写ＰＣＲによる標準的な手法を用いてヒトｃＤＮＡを調製した。Ｋ５６２細胞はヒト赤白血病細胞株であり、ＨＬ６０細胞は前骨髄球性白血病ヒト細胞株であり、かつＨＬＡ−Ａ２．１＋ＬＣＬ細胞はエプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）である。ジェネテシンを含むＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地で培養し、安定的に形質転換された細胞を選択した。細胞のスケールアップ前に、ＣｕＳＯ４を添加して形質転換遺伝子の発現を誘導する。抗ＨＬＡ−Ａ２．１、抗Ｂ７．１、抗ＬＦＡ−３、抗ＩＣＡＭ−１、及びＣＤ７０抗体を用いるフローサイトメトリーにより発現レベルを評価する。ＣＤ８＋リンパ球の効率的なインビトロ活性化には、３０％超のショウジョウバエ細胞がＨＬＡ−Ａ２．１分子を発現しなくてはならない。ショウジョウバエ細胞は、７０〜９０％のレベルで各分子を恒常的に発現している。ショウジョウバエａＡＰＣを洗浄し、続いて１０μＭの異なる組み合わせの混合ペプチド、又は個々のペプチドと共にＲＴで４時間インキュベートした（例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号、及び同第６，７９０，６６２号、米国特許公開第２００９／００１７０００号、及び同第２００９／０００４１４２号、並びに国際公開第ＷＯ２００７／１０３００９号、を参照されたい）。続いて、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー由来の精製されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ペプチド負荷ショウジョウバエＡＰＣと共に、３７℃、５％ＣＯ2で５日間インキュベートした。５日目にヒトＩＬ−２（２０Ｕ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＩＬ−７（３０Ｕ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、ペプチド存在下における同一ドナー由来の総末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）調製物中の非ＣＤ８接着細胞を用いて、７日目及び１５日目に活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＴＬ）を２回再刺激した。
【００８５】
異なるドナー由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞、及び異なる組み合わせの混合ペプチド（１つのペプチドのみを含む組み合わせを含む）を用いて、様々なＣＴＬを生成した。例えば、２４種類の選択したペプチドを混合して、又は個々に用いて、異なる組み合わせのペプチド混合物（ＰＭ）又は個々のペプチド（Ｐ５及びＰ１４）を作製し、ペプチド負荷ショウジョウバエＡＰＣを産生した。得られたペプチド負荷ショウジョウバエＡＰＣを異なる２人のドナー（ドナー１及びドナー２）由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞とインキュベートし、１１種の異なるＣＴＬバッチ（ドナー１：ＰＭ１、ＰＭ２、ＰＭ３、ＰＭ４、及びＰ１４、ドナー２：ＰＭ１、ＰＭ２、ＰＭ３、ＰＭ４、Ｐ５、及びＰ１４）を産生した（表３）。
【００８６】
表３
１１種の異なるＣＴＬバッチ（ドナー１：ＰＭ１、ＰＭ２、ＰＭ３、ＰＭ４、及びＰ１４、ドナー２：ＰＭ１、ＰＭ２、ＰＭ３、ＰＭ４、Ｐ５、及びＰ１４）の産生に用いた混合ペプチドの組み合わせを含む組成物、及びペプチド１種のみを含む組成物。
【００８７】
【表３】
【００８８】
その後、３種のペプチド（Ｐ３、Ｐ１３、及びＰ１４）を用いて、別のＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー（ドナー１６、図５）由来のＣＴＬを生成し、混合ペプチドの組み合わせ又は個々のペプチドを用いて更なるＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞でより多くのＣＴＬを生成した（表４）。
【００８９】
表４
多くの更なるＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー由来のＣＴＬ産生に用いた混合ペプチドの組み合わせを含む組成物、及びペプチド１種のみを含む組成物。
【００９０】
【表４】
【００９１】
ＣＴＬ活性に対するクロム（51Ｃｒ）遊離アッセイ
ＣＴＬ（エフェクター）活性を、個々のペプチドを負荷したＴ２細胞（標的）、及び標的細胞として多くの腫瘍細胞株も用いた標準的なクロム（51Ｃｒ）遊離アッセイにより測定した（Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９６８ Ｆｅｂ；１４（２）：１８１〜９６）。用量反応を起こすために、１：５で連続希釈したＣＴＬ（エフェクター）を用いると、エフェクター（Ｅ）標的（Ｔ）比（Ｅ／Ｔ）の最高値は５０：１であった。評価の前に、標的細胞（３×１０6個細胞／４％ ＦＣＳを含む１×ＰＢＳ １００μＬにおけるＴ２細胞）を、１００μＬの51Ｃｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより、標識した。インキュベート後、２．５％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１×Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識標的細胞を４回洗浄し、４℃において１２００〜１５００ｒｐｍで８分間回転し、１５ｍＬの新しいＭＬＲ培地（１０％ＦＣＳ、１％グルタミン（Glutamin）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％ ＨＥＰＥＳ、及び１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を含むＲＰＭＩ−１６４０）に再懸濁した。標識Ｔ２細胞の最終濃度は０．２×１０6個細胞／ｍＬであった。評価前に、１０μＭの個々のペプチドを用いて室温（Ｒ．Ｔ．）で３０分間標識Ｔ２細胞を負荷した。評価を開始するため、１００μＬのＣＴＬ（開始時濃度５×１０6個細胞／ｍＬ）を、丸底９６ウェルプレート内でＭＬＲ培地を用いて１：５に段階的に希釈し、各エフェクター細胞濃度について２回反復とした。１００μＬの異なる希釈段階のＣＴＬを含む各ウェルに、５０μＬのＫ−５６２細胞（４×１０6個細胞／ｍＬ）（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＣＬ−２４３（商標））及び５０μＬのペプチド負荷51Ｃｒ標識Ｔ２標的細胞（０．２×１０6個細胞／ｍＬ）を加えた。プレートを３７℃、５％ ＣＯ2で４時間インキュベートし、次いで９００ｒｐｍで５分間回転し、各ウェルの上清１００μＬを51Ｃｒ計数用チューブに移し、カウントした。
【００９２】
51Ｃｒ遊離アッセイにより、９種のペプチド（Ｐ１、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１７、及びＰ２３）が２人の正常ドナー（ドナー１及びドナー２）においてＣＴＬを誘導することが示された（それぞれ図３及び図４）。３種のペプチド（Ｐ３、Ｐ１３、及びＰ１４）の組み合わせ１種を用いて別のドナー（ドナー１６）由来のＣＴＬを生成し、個々のペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞に対する殺細胞能を試験した（図５）。
【００９３】
続いて２４種のペプチドを用いて更なるドナー由来のＣＴＬを生成し、各ペプチドから生成されたＣＴＬの相対活性を、強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）、又は未測定（ｎ．ｄ．）として特徴付けた。各ペプチドのＣＴＬ生成に用いたドナーの総数に対する各レベルの活性を引き起こしたドナーの数の割合として、ＣＴＬ活性を決定した（表５）。
【００９４】
表５
標的細胞として個々のペプチドを負荷したＴ２細胞を用いた51Ｃｒ遊離アッセイにおけるＣＴＬ活性ＣＴＬ活性を強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）、又は未測定（ｎ．ｄ．）として特徴付け、各ペプチドのＣＴＬ生成に用いたドナーの総数に対する各レベルの活性を引き起こしたドナーの数の割合として、ＣＴＬ活性を決定した。
【００９５】
【表５】
【００９６】
更なるＣＴＬも産生し、かつＰ３、Ｐ１３、及びＰ１４ペプチドの切断バージョン（表６）、及び完全長タンパク質により同定される元のペプチド配列中のＨＬＡ結合モチーフ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２ Ｄｅｃ １；１４９（１１）：３５８０〜７）の探索により得られた、コンピュータ予測されたペプチド（表７）を用いて試験した。切断されたペプチド及びコンピュータ予測されたペプチドを合成し、ＨＬＡ−Ａ２安定化評価法で試験し、ＣＴＬを生成して51Ｃｒ遊離アッセイで試験した。ＨＬＡ−Ａ２安定化評価法における結合活性は、強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）、又は未測定（ｎ．ｄ．）と特徴付けし、また51Ｃｒ遊離アッセイにおけるＣＴＬ活性も、強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）、又は未測定（ｎ．ｄ．）と特徴付けた。Ｐ３の切断ペプチド（Ｐ３−８）（図４Ａ）、Ｐ１３の切断ペプチド（Ｐ１３−１３）（表６Ｂ）、Ｐ１４の切断ペプチド（Ｐ１４−１４及びＰ１４−１５）（表６Ｃ）、及びコンピュータ予測されたペプチド（Ｐ３−９、Ｐ３−１１、Ｐ１３−１７、Ｐ１３−１８、及びＰ１４−１９）（表７）は、正常なドナーにおいてＣＴＬの誘導が可能であった。
【００９７】
表６
ペプチドの切断バージョン、Ｐ３（Ａ）、Ｐ１３（Ｂ）、及びＰ１４（Ｃ）で生成されたＣＴＬに対する、標的細胞として個々のペプチドを負荷したＴ２細胞を用いる51Ｃｒ遊離アッセイにおけるＨＬＡ−Ａ２結合親和性及びＣＴＬ活性。ＨＬＡ−Ａ２結合親和性及びＣＴＬ活性を強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）、又は未測定（ｎ．ｄ．）として特徴付けた。
【００９８】
【表６】
【００９９】
表７
標的細胞として、完全長タンパク質により同定される元のペプチド配列中のＨＬＡ結合モチーフの探索により得られたコンピュータ予測されたペプチドを負荷したＴ２細胞を用いる51Ｃｒ遊離アッセイにおけるＨＬＡ−Ａ２結合親和性及びＣＴＬ活性。ＨＬＡ−Ａ２結合親和性及びＣＴＬ活性を強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）、又は未測定（ｎ．ｄ．）として特徴付けた。
【０１００】
【表７】
【０１０１】
更に、４種の異なる腫瘍細胞株、Ｕ２６６（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１９６）、ＩＦＮ−α処理したＵ２６６、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８０８３、及びＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１４８４（図６）に対する殺細胞能について、３種の異なるペプチド（Ｐ３、Ｐ１３、及びＰ１４）の組み合わせにより生成したＣＴＬを試験した。３種の異なるペプチドの組み合わせにより生成されたＣＴＬは、細胞株Ｕ２６６、ＩＦＮ−α処理したＵ２６６、及びＣＣＬ−８０８３を死滅させたが、ＣＣＬ−１４８４を死滅させなかった。細胞株ＣＣＬ−１４８４はＭＸ−１及びＤＮＭＬ−１を発現しているが、ＭＨＣクラスＩを発現しておらず、これによりＣＴＬによる殺細胞はＭＨＣ依存性であることが示される。
【０１０２】
細胞可溶化物のウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングを用い、それぞれ２種の同定されたペプチドＰ１４及びＰ１３に対応する、２種のタンパク質、インターフェロン誘導型ＭＸタンパク質（ＭＸ１）及びダイナミン１様タンパク質（ＤＮＭ１Ｌ）の発現を定量した。ヤギ抗ヒトＭＸ１ポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ−３４１２８）及びロバ抗ヤギＡｐ結合抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。マウス抗ヒトＤＮＭ１Ｌポリクローナル抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−５５２３７）及び抗マウスＡＰ結合抗体をＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。細胞可溶化物を新たに培養された細胞から作製した。簡潔に言うと、細胞を採取して１×ＰＢＳで３回洗浄し、細胞ペレットを溶解用緩衝液（ＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｍ細胞溶解試薬、Ｓｉｇｍａ、Ｃ２９７８−５０、１×１０8個細胞／ｍＬ）に再懸濁し、４℃で１時間回転した。可溶化物を遠心分離により澄明にし、細胞可溶化物中のタンパク質濃度をＢＣＡ法で測定した。３μｇの細胞可溶化物を１０〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜に転写した。抗ＭＸ１及び抗ＤＮＭ１Ｌ抗体を用いてブロットを精査し、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＷＢ７１０４）を用いて検出した。ウェスタンブロッティングの結果により、ＭＸ１はほとんどの腫瘍細胞で発現しており、細胞のＩＦＮα処理後に発現が上昇することが示された。正常なヒトドナー由来のＰＢＭＣでは、ＭＸ１の発現は検出されなかった。ウェスタンブロッティングにより、ＤＮＭ１Ｌが全ての細胞種で発現していることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は全体的に、生物学的、免疫学的、かつ新規な抗原ペプチドに関する。より詳細には、本発明は、ペプチド負荷標的細胞及び多発性骨髄腫細胞に対して細胞傷害性である、活性化Ｔリンパ球を再現性よく産生する多発性骨髄腫細胞株から同定された抗原ペプチドに関する。本発明は更に、多発性骨髄腫の治療における、活性化Ｔリンパ球の抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）としての利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書を通して、特許、公開された出願、技術論文、及び学術論文を包含し得る種々の出版物は括弧内に引用され、各々の完全な引用は本明細書の末尾に見出され得る。それらの引用された各出版物はその全体が、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００３】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、異物に対する哺乳類の免疫反応において重要な役割を担い、インビボで腫瘍細胞の死を誘発することができる。ＣＴＬはナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞由来であり、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ細胞表面レセプターにより提示される抗原ペプチドを認識し、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる。ナイーブＴ細胞は、抗原又は他の活性化に必要なシグナルに未だ遭遇していないという点で、活性化Ｔ細胞と区別される。ナイーブＴ細胞の誘導には２つのシグナルが必要であると一般に認識されている。シグナル１は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）とＭＨＣ／抗原ペプチド複合体との間の相互作用により誘導され、ＭＨＣクラスＩ分子の非多型部位へのＣＤ８コレセプターの結合により促進される。シグナル２はシグナル１と質的に異なり、ＭＨＣクラスＩＩ分子及び共刺激分子を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の相補的リガンドと相互作用するＴ細胞共刺激分子を介して伝達される。シグナル１及び２は相乗的に機能し、最終的にＴ細胞を誘導して増殖し、サイトカインを産生し、かつ抗原特異的ＣＴＬ（後に全身を移動して他の特異的抗原陽性細胞を探索しかつ破壊できる）へ分化するという一連のシグナル伝達現象を引き起こす。
【０００４】
加えて、細胞性抗原に対する応答は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、すなわちヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）により届けられる支援に依存することが証明されている。この支援の本質とは、ＣＴＬの増幅に必要とするＩＬ−２の産生のために、活性化ＨＴＬを要すると解釈されている。また、最近の研究では、この支援が、ＨＴＬによる樹状細胞の活性化に由来するものであり、ＣＤ４０とそのリガンドの相互作用により媒介されることも示している。樹状細胞は、ＣＴＬ応答の極めて強力な誘導因子であると証明されており、ＣＴＬのプライミングに関与する主要ＡＰＣであると考えられている。一般にＡＰＣは、これらの細胞に特有のメカニズムから、シャペロン分子を伴う可溶性抗原の形態で、又は食作用により抗原を取り込むと考えられている。
【０００５】
最近では、ＣＴＬにより認識される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする多くの遺伝子が、様々なヒト腫瘍細胞のｃＤＮＡから同定されている。例えば、黒色腫におけるＴＡＡの同定は、強力なＴ細胞応答をインビボで誘導する試みにおいて、抗原が免疫原的な状況で送達されるワクチン接種戦略を用いて癌細胞を標的とする治療を試験する臨床試験に導いた。これらのＴＡＡによるワクチン接種戦略により、新たな癌免疫療法の開発が期待できる。
【０００６】
養子免疫療法は、新たな癌免疫療法として期待される別の戦略である。養子免疫療法には、１つ以上の腫瘍抗原に特異的なＴ細胞のインビトロ活性化と増幅、それに続く活性化Ｔ細胞による患者の治療が含まれる。ＴＡＡを用いるワクチン接種療法と比較して、養子Ｔ細胞療法には、寛容原性機構が免疫原性応答に影響し得る宿主環境からのＴ細胞除去が含まれるため利点がある。更に、マウス腫瘍モデルにおける試験では、養子免疫療法が、最小限の毒性で有効性を示し得ることが証明された。過去における、ヒト腫瘍の治療に対してこの戦略を適用する上での障害の１つは、ＣＴＬ媒介型破壊を受けやすい腫瘍細胞の状態にする免疫原性抗原に関する情報の欠如であった。しかし最近になって癌患者から腫瘍反応性Ｔ細胞が単離され、ＣＴＬが対象とするＴＡＡの同定につながった。これらの一部には、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、及びＭＡＧＥが挙げられる。これらのうち、チロシナーゼ及びＭＡＲＴ−１は、黒色腫細胞でほぼ普遍的に発現しており、そのため黒色腫患者の養子免疫療法に対する所望の標的選択を表す。
【０００７】
初期の養子免疫療法の取り組みとしてはリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）を用いた後、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用い、双方ともＩＬ−２を用いてエクスビボで活性化された。しかし、効果ははっきりと証明されず、したがってこれらの初期の比較臨床試験は、黒色腫患者に対するＩＬ−２の直接投与に優る、エクスビボ活性化細胞使用の利点を示すことができなかった。更に最近の試験では、特定の養子Ｔ細胞治療の取り組みについての可能性が明確に示された（Ｙｅｅら、ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９９，ｐｐ．１６１６８〜１６１７３，（２００２）；Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２９８，ｐｐ．８５０〜８５４，（２００２））。これらの試験には、ＭＡＲＴ−１若しくはｇｐ１００に特異的なＴ細胞クローン及び低用量ＩＬ−２、又は、同種異系の支持細胞を用いてエクスビボで増幅したＴＩＬ及び高用量ＩＬ−２のいずれかの使用が含まれる。これらの試験により、養子免疫療法が癌の治療に期待できることが確認された。
【０００８】
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の利用は、治療的数の抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を再現性よく生成するエクスビボ法である。というのは、天然のＡＰＣをインビトロでＴ細胞の活性化に使用することは可能であるが（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、又は自己腫瘍細胞）、天然ＡＰＣのＭＨＣ分子が多くの他のペプチドエピトープを含むため、活性化の効力は低くなることがあるからである。その結果、これにより選択したエピトープの提示は最少となり得る。加えて、これら提示されたペプチドの多くは、正常で無害な内因性タンパク質を表す。この問題に対するより直接的な取り組みは、疾患の治療に関与するエピトープのみに対して、ＣＤ８+ Ｔ細胞を特異的に活性化することである。この取り組みはａＡＰＣを用いて達成できる（例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号、及び同第６，７９０，６６２号、米国特許公開第２００９／００１７０００号、及び同第２００９／０００４１４２号、並びに国際公開第２００７／１０３００９号を参照されたい）。
【０００９】
そのようなａＡＰＣの１つが、キイロショウジョウバエ（ミバエ）の胚細胞株を使用して開発されており、これは主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を発現する。ショウジョウバエは、ヒトＭＨＣ分子へのペプチドエピトープ負荷に関与するヒトＴＡＰ１及びＴＡＰ２ペプチドトランスポーターに相同するものを欠いている。その結果、形質移入したクラスＩ分子及びクラスＩＩ分子は、中身がない容器としてショウジョウバエ細胞の表面上に現れる。ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩをコードする発現ベクターで形質移入したショウジョウバエの細胞を、特異的ＭＨＣ分子に結合する１つ以上の外因性合成ペプチド（すなわち、Ｔ細胞ペプチドエピトープとして提示するためのＴＡＡ）とインキュベートすることにより、利用できる全てのＭＨＣ分子がＭＨＣ拘束性特異的ペプチドエピトープに占有され得る。特に、単一又は複数のペプチドエピトープを提示しているＨＬＡ−Ａ２．１ ＭＨＣクラスＩ分子の高密度発現、及び、これらショウジョウバエａＡＰＣへの主要補助分子Ｂ７−１（ＣＤ８０）、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、及びＣＤ７０の追加は、選択したペプチドに特異的でありかつ細胞療法としての利用に好適である、強力な自己細胞傷害性ＣＤ８+ Ｔ細胞のインビトロ生成を可能にする。
【００１０】
このような細胞療法の１つは、黒色腫関連抗原由来の選択されたＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ペプチドにペプチド特異性を示すエクスビボ活性化自己ＣＤ８＋ＣＴＬを用いて調製された、自己免疫療法生成物を含む。細胞療法生成物の活性成分は患者自身のＣＤ８＋細胞であり、それら細胞は選択されたＨＬＡ−Ａ２．１拘束性ペプチドに対する特異性を有する選択したペプチドを負荷したａＡＰＣに対して曝露することによりエクスビボで活性化されている。細胞療法生成物を生成するために、ＣＴＬは、１）治験受託施設で採取されたリンパ球フェレーシスサンプルから単離された自己ナイーブＴ細胞から取り出され、２）ａＡＰＣとしてショウジョウバエ細胞を用いて黒色腫抗原ペプチドエピトープに対してエクスビボで感作（primed）され、３）好ましくはインターロイキン−２（ＩＬ−２）及びインターロイキン−７（ＩＬ−７）の両方の存在下で、黒色腫抗原性エピトープを負荷した自己単核細胞を用いた再刺激により増幅され、続いて、ＯＫＴ（登録商標）３を用いて非特異的に増幅され、４）採取され、洗浄され、かつ注入用の最終製剤に再懸濁され、５）ＣＤ８＋細胞が取出された患者に注入される。再注入用の最終細胞療法生成物は、乳酸リンゲル注射液（７６％（容積／容積））、生理食塩水（Ｄ５ＮＳ）中の５％デキストロース（４％（容積／容積））、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（２０％（容積／容積））の入った３００ｍＬ中に、１〜１０×１０9個のＣＴＬ細胞を含むことが好ましい。
【００１１】
自己ＣＤ８＋ＣＴＬのエクスビボ活性化に特異的な抗原を利用するこれらの有望な新規免疫療法は、癌治療に有望な戦略を提供する。これは、現在の治療法では不治である癌に対して、特に興味深い進歩である。多発性骨髄腫（ＭＭ）は、米国において年間約１５，０００人が新たに発症するクローナルＢ細胞の悪性腫瘍である。ＭＭの生存期間中央値はたった３年であり、骨髄（ＢＭ）中の成熟形質細胞（ＰＣ）が増殖かつ蓄積され、骨破壊、ＢＭ不全、貧血症、及び免疫機能の低下に至ることを特徴とする。ＭＭは、従来の抗腫瘍療法では本質的に不治のままである（Ｋｙｌｅ及びＲａｊｋｕｍａｒ、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００４ Ｏｃｔ ２８；３５１（１８）：１８６０〜７３）。多発性骨髄腫細胞上に唯一提示される骨髄腫特異的抗原ペプチドの同定は、ＭＭに対する有効な免疫療法治療の開発における重要な工程である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、本明細書において、添付の独立及び従属クレームにより定義される実施形態を対象とする。本発明の様々な態様の実施形態、特徴、及び長所は、添付の図面に関連づけられる以下の発明を実施するための形態から明らかになるであろう。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、Ｔリンパ球を活性化可能な合成ペプチドを含み、この合成ペプチドは、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、活性化Ｔリンパ球は多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である。
【００１４】
第２の実施形態では、本発明は、Ｔリンパ球を活性化可能な少なくとも１つの抗原ペプチドを含む組成物を含み、この抗原ペプチドは、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、その活性化Ｔリンパ球は多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である。
【００１５】
第３の実施形態では、本発明は、多発性骨髄腫と診断された患者に投与するための活性化Ｔリンパ球を作製する方法を含み、この方法は、（ａ）抗原ペプチド負荷ショウジョウバエ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、少なくとも１つの抗原ペプチドをショウジョウバエａＡＰＣに負荷することにより調製する工程であって、この抗原ペプチドが、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む工程と、（ｂ）その患者からＴリンパ球を単離する工程と、（ｃ）かかるＴリンパ球をかかる抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣと接触させる工程と、（ｄ）活性化Ｔリンパ球を生成する工程であって、この活性化Ｔリンパ球が多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である工程と、（ｅ）その患者に戻し投与するためにその活性化Ｔリンパ球を回収する工程と、を含む。
【００１６】
第４の実施形態では、本発明は、（ｆ）かかる回収工程で回収された有効量の活性化Ｔリンパ球をかかる患者に投与する工程を更に含む、上記方法を含む。
【００１７】
第５の実施形態では、本発明は、多発性骨髄腫と診断された患者に投与するための活性化Ｔリンパ球を作製する方法を含み、この方法は、（ａ）抗原ペプチド負荷ショウジョウバエ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、２つ以上の抗原ペプチドの混合物をショウジョウバエａＡＰＣに負荷することにより調製する工程であって、この抗原ペプチドが、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む工程と、（ｂ）その患者からＴリンパ球を単離する工程と、（ｃ）かかるＴリンパ球をかかる抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣと接触させる工程と、（ｄ）活性化Ｔリンパ球を生成する工程であって、この活性化Ｔリンパ球が多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である工程と、（ｅ）その患者に戻し投与するためにその活性化Ｔリンパ球を回収する工程と、を含む。
【００１８】
第６の実施形態では、本発明は、この２つ以上の抗原ペプチドの混合物が配列番号：３、配列番号：１３、及び配列番号：１４を含有する組成物を含む、上記方法を含む。
【００１９】
第７の実施形態では、本発明は、多発性骨髄腫と診断された患者に投与するための活性化Ｔリンパ球を作製するエクスビボ法を含み、この方法は、（ａ）抗原ペプチド負荷ショウジョウバエ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、少なくとも１つの抗原ペプチドをショウジョウバエａＡＰＣに負荷することにより調製する工程であって、この抗原ペプチドが、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む工程と、（ｂ）その患者からＴリンパ球を単離する工程と、（ｃ）かかるＴリンパ球をかかる抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣと接触させる工程と、（ｄ）活性化Ｔリンパ球を生成する工程であって、この活性化Ｔリンパ球が多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である工程と、（ｅ）その患者に戻し投与するためのその活性化Ｔリンパ球を回収する工程と、（ｆ）かかる活性化Ｔリンパ球を再刺激する工程であって、かかる再刺激手順が、（ｉ）その活性化Ｔリンパ球を、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−ｇ、及びＴＮＦ−αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインと接触させ、これにより活性化Ｔ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進する工程と、（ｉｉ）その活性化Ｔ細胞を、照射した自己非ＣＤ８＋細胞、接着性非ＣＤ８＋細胞、又は抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣとインキュベートし、これにより再刺激された活性化Ｔリンパ球を生成する工程とを含む工程と、を含む。
【００２０】
第８の実施形態では、本発明は、かかる再刺激手順が、（ｉ）その活性化Ｔリンパ球を、ＩＬ−２と、ＩＬ−７、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１からなる群から選択される少なくとも１つのその他サイトカインとの組み合わせと接触させ、これにより活性化Ｔ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進する工程と、（ｉｉ）その活性化Ｔ細胞を、照射した自己非ＣＤ８＋細胞、接着性非ＣＤ８＋細胞、又は抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣとインキュベートし、これにより再刺激された活性化Ｔリンパ球を生成する工程とを含む、上記方法を含む。
【００２１】
第９の実施形態では、本発明は、かかる再刺激手順が、濃度１〜１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２；濃度１〜１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−７、濃度１〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５及び濃度１〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１の存在下で、その活性化Ｔリンパ球を抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣと接触させる工程を含む、上記方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
ここで本発明の実施形態を、添付の図面を参照し、例示のみの目的で説明する。
【図１】ペプチドを同定するＬＣ／ＭＳ／ＭＳピークの選択、ＨＬＡ−Ａ２安定化検定法でのペプチド結合に対するペプチドの試験、及び51Ｃｒ遊離アッセイでのＣＴＬ活性の試験を含む、ペプチド同定プロセスの略図を示す。
【図２】合成され、Ｔ２細胞におけるＨＬＡ−Ａ２分子への結合及び安定化能について評価された２４種類の選択したペプチドに関する、ペプチド濃度に対する蛍光強度中央値（ＭＦＩ）のグラフを示す。ＨＢＣ（Ｂ型肝炎コアタンパク質）のペプチドを陽性対照として用いた。
【図２Ａ】ＨＢＣ対照ペプチド及びペプチド１〜６（Ｐ１〜Ｐ６）の結果を示しており、記号は以下の通りである。ＨＢＣ（黒丸）、Ｐ１（白丸）、Ｐ２（黒三角）、Ｐ３（白三角）、Ｐ４（黒四角）、Ｐ５（白四角）、及びＰ６（黒菱形）。
【図２Ｂ】対照ペプチド（ＨＢＣ）及びペプチド７〜１２（Ｐ７〜Ｐ１２）の結果を示しており、記号は以下の通りである。ＨＢＣ（黒丸）、Ｐ７（白丸）、Ｐ８（黒三角）、Ｐ９（白三角）、Ｐ１０（黒四角）、Ｐ１１（白四角）、及びＰ１２（黒菱形）。
【図２Ｃ】対照ペプチド（ＨＢＣ）及びペプチド１３〜１８（Ｐ１３〜Ｐ１８）の結果を示しており、記号は以下の通りである。ＨＢＣ（黒丸）、Ｐ１３（白丸）、Ｐ１４（黒三角）、Ｐ１５（白三角）、Ｐ１６（黒四角）、Ｐ１７（白四角）、及びＰ１８（黒菱形）。
【図２Ｄ】対照ペプチド（ＨＢＣ）及びペプチド１９〜２４（Ｐ１９〜Ｐ２４）の結果を示しており、記号は以下の通りである。ＨＢＣ（黒丸）、Ｐ１９（白丸）、Ｐ２０（黒三角）、Ｐ２１（白三角）、Ｐ２２（黒四角）、Ｐ２３（白四角）、及びＰ２４（黒菱形）。
【図３】51Ｃｒ遊離アッセイで測定したＣＴＬ活性のグラフを示す。５種の異なるＣＴＬのバッチを１人のＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー（ドナー１）から生成した。ＣＴＬ生成及びＴ２細胞への負荷の両方のために、２４種類の選択したペプチドを混合して又は個々に用いて、異なる組み合わせのペプチド混合物（ＰＭ）、又は個々のペプチド（Ｐ）を作製した。個々のペプチド、又は各ＣＴＬを生成するのに用いたのと同じペプチド混合物を負荷したＴ２細胞により、51Ｃｒ遊離アッセイにおいて異なるＣＴＬの活性を測定した。データを、エフェクター（Ｅ）標的（Ｔ）比（Ｅ／Ｔ）に対する特異的致死率（％）として示す。
【図３Ａ】ペプチド混合物１（ＰＭ１）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ１、Ｐ７、Ｐ９、及びＰ１２を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ１、Ｐ７、Ｐ９、若しくはＰ１２、又はペプチドＰ１、Ｐ７、Ｐ９、及びＰ１２を含むペプチド混合物ＰＭ１を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１（黒丸）、Ｐ７（白丸）、Ｐ９（黒三角）、Ｐ１２（白三角）、ＰＭ１（黒四角）、ＨＢＣ（白四角）、及びペプチドなし（黒菱形）。
【図３Ｂ】ペプチド混合物２（ＰＭ２）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ１３、Ｐ１７、及びＰ２１を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ１３、Ｐ１７、若しくは２１、又はペプチドＰ１３、Ｐ１７、及びＰ２１を含むペプチド混合物ＰＭ２を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１３（黒丸）、Ｐ１７（白丸）、Ｐ２１（黒三角）、ＰＭ２（白三角）、ＨＢＣ（黒四角）、ペプチドなし（白四角）。
【図３Ｃ】ペプチド混合物３（ＰＭ３）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ５、Ｐ６、Ｐ８、及びＰ１０を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ５、Ｐ６、Ｐ８、若しくはＰ１０、又はペプチドＰ５、Ｐ６、Ｐ８、及びＰ１０を含むペプチド混合物ＰＭ３を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ５（黒丸）、Ｐ６（白丸）、Ｐ８（黒三角）、Ｐ１０（白三角）、ＰＭ３（黒四角）、ＨＢＣ（白四角）、及びペプチドなし（黒菱形）。
【図３Ｄ】ペプチド混合物４（ＰＭ４）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ１４、Ｐ１５、及びＰ２０を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ１４、Ｐ１５、若しくはＰ２０、又はペプチドＰ１４、Ｐ１５、及びＰ２０を含むペプチド混合物ＰＭ４を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１４（黒丸）、Ｐ１５（白丸）、Ｐ２０（黒三角）、ＰＭ４（白三角）、ＨＢＣ（黒四角）、ペプチドなし（白四角）。
【図３Ｅ】ペプチド１４を用いて生成したＣＴＬの結果を示す。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、又は個々のＰ１４ペプチドを負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチドを負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１４（黒丸）、ＨＢＣ（白丸）、及びペプチドなし（黒三角）。
【図４】51Ｃｒ遊離アッセイで測定したＣＴＬ活性のグラフを示す。６種の異なるＣＴＬのバッチを１人のＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー（ドナー２）から生成した。ＣＴＬ生成及びＴ２細胞への負荷の両方に対し、２４種類の選択したペプチドを混合して、又は個々に用いて、異なる組み合わせのペプチド混合物（ＰＭ）、又は個々のペプチド（Ｐ）を作製した。個々のペプチド、又は各ＣＴＬを生成するのに用いたのと同じペプチド混合物を負荷したＴ２細胞により、51Ｃｒ遊離アッセイにおいて異なるＣＴＬの活性を測定した。データを、エフェクター（Ｅ）標的（Ｔ）比（Ｅ／Ｔ）に対する特異的致死率（％）として示す。
【図４Ａ】ペプチド混合物１（ＰＭ１）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ５、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ１０、及びＰ１３を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ５、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ１０、若しくはＰ１３、又はペプチドＰ５、Ｐ６、Ｐ８、Ｐ１０、及びＰ１３を含むペプチド混合物ＰＭ１を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ５（黒丸）、Ｐ６（白丸）、Ｐ８（黒三角）、Ｐ１０（白三角）、Ｐ１３（黒四角）、ＰＭ１（白四角）、ＨＢＣ（黒菱形）、及びペプチドなし（白菱形）。
【図４Ｂ】ペプチド混合物２（ＰＭ２）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ１４、Ｐ１５、Ｐ１７、Ｐ２０、及びＰ２１を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ１４、Ｐ１５、Ｐ１７、Ｐ２０、若しくはＰ２１、又はペプチドＰ１４、Ｐ１５、Ｐ１７、Ｐ２０、及びＰ２１を含むペプチド混合物ＰＭ２を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１４（黒丸）、Ｐ１５（白丸）、Ｐ１７（黒三角）、Ｐ２０（白三角）、Ｐ２１（黒四角）、ＰＭ２（白四角）、ＨＢＣ（黒菱形）、ペプチドなし（白菱形）。
【図４Ｃ】ペプチド混合物３（ＰＭ３）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ１、Ｐ３、Ｐ７、Ｐ９、及びＰ１１を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ１、Ｐ３、Ｐ７、Ｐ９、若しくはＰ１１、又はペプチドＰ１、Ｐ３、Ｐ７、Ｐ９、及びＰ１１を含むペプチド混合物ＰＭ３を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１（黒丸）、Ｐ３（白丸）、Ｐ７（黒三角）、Ｐ９（白三角）、Ｐ１１（黒四角）、ＰＭ３（白四角）、ＨＢＣ（黒菱形）、及びペプチドなし（白菱形）。
【図４Ｄ】ペプチド混合物４（ＰＭ４）を用いて生成したＣＴＬの結果を示しており、この混合物はペプチドＰ１２、Ｐ１６、Ｐ２２、及びＰ２３を含む。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、個々のペプチドＰ１２、Ｐ１６、Ｐ２２、若しくはＰ２３、又はペプチドＰ１２、Ｐ１６、Ｐ２２、及びＰ２３を含むペプチド混合物ＰＭ４を負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１２（黒丸）、Ｐ１６（白丸）、Ｐ２２（黒三角）、Ｐ２３（白三角）、ＰＭ４（黒四角）、ＨＢＣ（白四角）、及びペプチドなし（黒三角）。
【図４Ｅ】ペプチド５を用いて生成したＣＴＬの結果を示す。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、又は個々のＰ５ペプチドを負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチドを負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ５（黒丸）、ＨＢＣ（白丸）、及びペプチドなし（黒三角）。
【図４Ｆ】ペプチド１４を用いて生成したＣＴＬの結果を示す。ペプチドなし、ＨＢＣ対照ペプチド、又は個々のＰ１４ペプチドを負荷したＴ２細胞について、ＣＴＬ活性を測定した。各ペプチドを負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）のグラフにおいて、記号は以下の通りである。Ｐ１４（黒丸）、ＨＢＣ（白丸）、及びペプチドなし（黒三角）。
【図５】51Ｃｒ遊離アッセイで測定したＣＴＬ活性のグラフを示す。３種の選択したペプチドＰ３、Ｐ１３、及びＰ１４の混合物（ＰＭ）を用いて、１人のＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー（ドナー１６）からＣＴＬを生成した。個々のペプチド、又はＣＴＬを生成するのに用いたのと同じペプチド混合物を負荷したＴ２細胞により、51Ｃｒ遊離アッセイにおいてＣＴＬ活性を測定した。データを、エフェクター（Ｅ）標的（Ｔ）比（Ｅ／Ｔ）に対する特異的致死率（％）として示す。各ペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞の特異的致死率（％）において、記号は以下の通りである。Ｐ３（黒丸）、Ｐ１３（白丸）、Ｐ１４（黒三角）、ＰＭ（白三角）、及びペプチドなし（黒四角）。
【図６】３種のペプチド（Ｐ３、Ｐ１３、及びＰ１４）の混合物を使用して１人のＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー（ドナー１６）から生成されたＣＴＬを用いる、４種の異なる腫瘍細胞株に対するＣＴＬ溶解活性のグラフを示す。４種の細胞株は、Ｕ２６６（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１９６）、ＩＦＮ−α処理したＵ２６６、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８０８３、及びＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１４８４であった。データを、エフェクター（Ｅ）標的（Ｔ）比（Ｅ／Ｔ）に対する特異的致死率（％）として示す。
【図６Ａ】ＩＦＮ−α処理したＵ２６６細胞（黒丸）及びＵ２６６細胞（白丸）の特異的致死率（％）の結果を示す。
【図６Ｂ】ＩＦＮ−α処理したＣＣＬ−８０８３細胞（黒丸）及びＣＣＬ−１４８４細胞（白丸）の特異的致死率（％）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明を説明するため、様々な代表的実施形態を以下に記載する。
【００２４】
本発明では、ＨＬＡ−Ａ２分子の免疫親和性精製により、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株（Ｕ２６６）からＨＬＡ−Ａ２関連ペプチドを精製した。液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によるピークの系統的同定、及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いるデノボシーケンス解析の後に、ペプチドのアミノ酸配列を決定した。本発明の抗原ペプチドはＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化し、活性化Ｔ細胞はペプチド負荷Ｔ２標的細胞及び多発性骨髄腫細胞株の両方を死滅させた。
【００２５】
ペプチド
本発明は、少なくとも１つの抗原ペプチドを含む組成物に関し、この抗原ペプチドは、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、ＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、この抗原ペプチドはＴリンパ球を活性化でき、その活性化Ｔリンパ球は多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である。
【００２６】
上記参照組成物は、２つ以上の抗原ペプチドの混合物を含むことができる。
【００２７】
本発明はまた、２つ以上の抗原ペプチドの混合物を含む組成物にも関し、この混合物の少なくとも１つの抗原ペプチドは、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、ＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択され、かつこの混合物の少なくとも１つの別の抗原ペプチドは、癌への関与が知られているその他抗原ペプチドから選択され、又は癌細胞に対するＣＴＬ応答の誘導能によって選択される。代表的なその他抗原ペプチドについては、例えば、米国特許第７，４０２，３１４号及び米国特許公開第２００９／００１７０００号を参照されたい。
【００２８】
自然に処理され、クラスＩのＭＨＣ分子に結合されるペプチドは、腫瘍特異的ＣＴＬによって認識され、ＣＴＬ応答を刺激するのに必ずしも最適なペプチドではない（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：２５３９〜２５４８，１９９６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，４：３２１〜３２７，１９９８を参照されたい）。したがって、より容易にＣＴＬ応答を誘導するように、ペプチドを修飾することが有用であり得る。一般には、２種類の位置でペプチドを修飾できる。クラスＩのＭＨＣ分子との相互作用が予測されるアミノ酸残基においてペプチドを修飾でき、この場合、元のペプチドよりもクラスＩのＭＨＣ分子に対する親和性が高いペプチドを作製するのが目的である。また、ＣＴＬ上のＴ細胞レセプターとの相互作用が予測されるアミノ酸残基においてペプチドを修飾することもでき、この場合、元のペプチドよりもＴ細胞レセプターに対する親和性が高いペプチドを作製するのが目的である。これら両タイプの修飾により、元のペプチドに関連するが、元のペプチドよりも良好なＣＴＬ応答誘導が可能な変異型ペプチドを得ることができる。本明細書で用いるとき、用語「元のペプチド」は、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、ＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。
【００２９】
天然の相同タンパク質又はペプチドのファミリーの配列変化における研究において、特定のアミノ酸置換は他のものよりも許容される場合が多い。これらの置換を有するタンパク質又はペプチドは、元のタンパク質又は元のペプチドの特定の性質を維持する。このような変化は「保存的置換」と呼ばれる。ペプチド鎖内で異なっている、場合によっては選択的な部位における１つ以上の残基の「保存的置換」により、本明細書で開示される抗原ペプチドを修飾することもできる。保存的置換として、元のペプチド中のアミノ酸を、大きさ又は電荷、極性、若しくは疎水性などの化学的性質について元のペプチド中のアミノ酸と比較して類似している別のアミノ酸で置き換えることを挙げてよい。例えば、元のペプチドのある疎水性アミノ酸を、別の疎水性アミノ酸で置き換えてよい。更により保存的な置換は、ロイシンをイソロイシンで置き換えるような、同一又は類似する大きさ及び化学的性質のアミノ酸の置き換えである。
【００３０】
本明細書では、保存的置換を、次の５つのグループ、すなわち、小型の脂肪族非極性又はわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）を含むグループ１、極性で負に帯電した残基とそのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）を含むグループ２、極性で正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）を含むグループ３、大型の脂肪族非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ｌｉｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）を含むグループ４、大型の芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を含むグループ５のうちの、１つのグループ内での交換であると定義する。その他の保存的置換として、アラニンをイソロイシン残基で置き換えるように、あるアミノ酸を、類似する性質を有するが大きさが若干異なる別のもので置き換えることを含み得る。
【００３１】
当然のことながら、このような置換基には、一般的なＬ−アミノ酸以外の構造を含んでもよい。したがって、本発明の抗原ペプチドに通常見出されるＬ−アミノ酸に対してＤ−アミノ酸が置換されてもよく、これもまた本明細書の開示により包含される。加えて、非標準的Ｒ基（すなわち、天然タンパク質の一般的な２０種のアミノ酸で見出されるもの以外であるＲ基）を有するアミノ酸もまた置換目的で用い、本発明による抗原ペプチドを作製してもよい。
【００３２】
２か所以上の位置で置換が見出され、元のペプチドと実質的に同等の又はより高い活性を有する抗原ペプチドが得られる場合、これらの置換の組み合わせを検証し、組み合わされた置換が、ペプチドの抗原性に対して相加効果又は相乗（syngeneic）効果をもたらすのかどうかを確認することになる。ペプチド内で多くても４か所以下の位置が、同時に置換され得る。
【００３３】
置換されたペプチドのＣＴＬ応答刺激能で規定されるように、抗原活性が元のペプチドの大体１０倍である場合には、修飾された又は置換されたペプチドは、細胞傷害性評価法に基づいて、元のペプチドと実質的に同一であると見なされる。したがって、例えば、元のペプチド及び置換されたペプチドを等モル濃度使用したエフェクター：標的曲線の直線部分において溶解活性を比較するとき、置換されたペプチドと共にインキュベートした標的細胞で観察される特異的致死率パーセントは、比較が行われる点における元のペプチドのエフェクター：標的比よりわずか１０倍上回る、又は１０倍下回るエフェクター：標的比において、元のペプチドのそれと同等でなければならない。
【００３４】
本発明の抗原ペプチドを合成的に調製してよく、又はこれらを元のタンパク質生成物を発現している腫瘍細胞などの天然源から単離してもよい。合成的に調製される抗原ペプチドに関して、本明細書で想到される抗原ペプチドは、従来技術に従って溶液中又は固体支持体上で合成できる。様々な自動ペプチド合成機が市販されており、既知の手順に従って使用できる。例えば、Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，１９９２，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。より大きなペプチド合成の中間体として、本発明の抗原ペプチドフラグメントを合成することもできる。
【００３５】
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）
本発明の抗原ペプチドは、ナイーブＴ細胞を活性化し、選択したペプチドに特異的な活性化Ｔ細胞（例えば、活性化した表面抗原分類（ＣＤ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞、又は活性化したＣＤ８＋ Ｔ細胞のいずれかであり、それぞれ活性化ヘルパーＴ細胞、又はＣＴＬである）になり得る、１つ以上の抗原ペプチドを負荷した人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の生成に有用である。ａＡＰＣは、ペプチド負荷ａＡＰＣを接触させることにより生成される活性化Ｔ細胞を含む、治療用組成物及び細胞療法生成物の調製に有用である。抗原提示系の調製及び利用に関する一般的指針については、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号、及び同第６，７９０，６６２号、米国特許公開第２００９／００１７０００号、及び同第２００９／０００４１４２号、並びに国際公開第２００７／１０３００９号を参照されたい。
【００３６】
活性化Ｔリンパ球を生成し、ＣＴＬ応答を刺激するのに用いられるａＡＰＣは、一般的には、追加のプロセシングなしでペプチドのＭＨＣ分子への直接結合を可能にする最適長のペプチドと共にインキュベートされる。ＭＨＣクラスＩ分子は、一般に長さが８〜１２アミノ酸のペプチドに結合する。最も一般的な大きさはノナペプチド（nonopaptide）である。より大きいペプチド、例えば１５アミノ酸より大きいものは、クラスＩのＭＨＣ分子への結合効果が低いことが知られている。加えて、ａＡＰＣにより活性化される特異的Ｔ細胞系譜は、ａＡＰＣの表面上に発現されるＭＨＣ分子の性質に依存する。よって、ＭＨＣクラスＩ分子のみを発現しているａＡＰＣは、選択された１つ以上の抗原ペプチドを提示してＣＤ８＋ Ｔ細胞を活性化でき、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しているａＡＰＣは、選択された１つ以上の抗原ペプチドを提示してＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性化できる。同様に、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子の両方を発現しているａＡＰＣは、選択された１つ以上の抗原ペプチドを提示して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の両方を活性化できる。当該技術分野において現在既知の、又は利用できるようになる様々な手段及び手技により、選択された抗原ペプチドを細胞に提示し、ａＡＰＣに負荷してよい。好ましくは、ペプチドはａＡＰＣ系培地に添加される。
【００３７】
本発明の活性化Ｔ細胞を含む治療用組成物及び細胞療法生成物の調製に利用されるａＡＰＣは、外因性分子をその表面上に発現可能なヒト以外の種由来の修飾細胞を含む。ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子から選択される外因性ＭＨＣ分子を発現させるためにａＡＰＣが作製される。代表的なＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２．１である。
【００３８】
外因性ＭＨＣ分子に加えて、本発明のａＡＰＣ系はまた、少なくとも１つの外因性補助分子も含んでよい。任意の好適な数及び組み合わせの補助分子を利用してよい。ナイーブＴ細胞が、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合される抗原ペプチド又はその他免疫原を提示されるとき、補助分子はかかるナイーブＴ細胞の活性化を促進する。補助分子は、共刺激分子及び接着分子などの補助分子から選択されてよい。代表的な共刺激分子として、ＣＤ７０及びＢ７．１（Ｂ７．１は、以前はＢ７として知られており、ＣＤ８０としても知られる）が挙げられ、特にＴ細胞表面上のＣＤ２８及び／又はＣＴＬＡ−４分子に結合し、これにより、例えば、Ｔ細胞増幅、Ｔｈ１分化、Ｔ細胞短期間生存、及びインターロイキン（ＩＬ）−２などのサイトカイン分泌に作用する（Ｋｉｍら、２００４，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２２（４），ｐｐ．４０３〜４１０を参照されたい）。接着分子として、セレクチンなどの炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通型結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、及び細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などの単回膜貫通型免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質などを挙げることができ、これらは、例えば細胞対細胞、又は細胞対マトリックスの接触を促進する。代表的な接着分子として、ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１などのＩＣＡＭが挙げられる。共刺激分子及び接着分子を包含する代表的な補助分子の選択、クローニング、調製、及び発現に有用な手技、方法、及び試薬は、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、及び同第６，３６２，００１号に例示されている。
【００３９】
ａＡＰＣになるように選択された細胞は、好ましくは細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチド輸送、及び／又は細胞内ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子−ペプチド負荷が欠失しているか、又は変温性（すなわち温度攻撃に対して哺乳類細胞株よりも感受性が低い）であるか、又はこれら欠失と変温性特性の両方を保有している。好ましくは、ａＡＰＣになるように選択された細胞はまた、外因性ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子、及び細胞内に導入される補助分子要素に対して、少なくとも１つの内因性対応物（例えば、内因性ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ分子、及び／又は上記内因性補助分子）を発現する能力をも欠失している。更に、ａＡＰＣは好ましくは、ａＡＰＣ生成のためのそれらの修飾以前に細胞が保有していた欠失及び変温性特性を保持する。代表的なａＡＰＣは、昆虫細胞株などの抗原プロセシング関連トランスポーター（ＴＡＰ）−欠失細胞株を構成するか、もしくはその細胞株由来である。代表的な変温性昆虫細胞株は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２細胞株などのショウジョウバエ細胞株である（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．１９７２ Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．３５３〜３６５を参照されたい）。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２細胞の調製、増殖、培養に関する実例となる方法は、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、及び同第６，３６２，００１号に記載されている。
【００４０】
一実施形態では、ａＡＰＣは凍結解凍サイクルにも曝される。代表的な凍結解凍サイクルにおいて、ａＡＰＣを収容する好適な容器を、適量の液体窒素、固体二酸化炭素（すなわちドライアイス）、又は急速に凍結を起こすような同様の低温材料と接触させることにより、ａＡＰＣを凍結してよい。続いて、低温材料をａＡＰＣから除去して周囲室温条件に曝すことにより、又は、微温湯浴若しくは温かい手を用いて解凍時間の短縮を促進する促進化解凍プロセスのいずれかにより、凍結したａＡＰＣを解凍する。更には、ａＡＰＣを凍結し、解凍まで長期間保存してもよい。また、凍結したａＡＰＣを解凍し、続いて更に用いるまで凍結乾燥してもよい。好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びその他防腐剤などの凍結解凍手順に悪影響を及ぼし得る防腐剤は、本質的にそのような防腐剤を欠く培地にａＡＰＣを移すことなどにより、凍結解凍サイクルを受けるａＡＰＣを含む培地には含まれず、又は本質的に除去される。
【００４１】
他の好ましい実施形態では、不活化後に、細胞増殖、核酸の複製又は発現が本質的に起こらないように、異種核酸及びａＡＰＣ内因性の核酸を架橋により不活化してよい。一実施形態では、外因性ＭＨＣ及び補助分子の発現、このような分子のａＡＰＣ表面上への提示、並びに選択された単一のペプチド又は複数のペプチドによる提示されたＭＨＣ分子の負荷に続く点で、ａＡＰＣが不活化される。よって、このような不活化されて選択したペプチド負荷ａＡＰＣは、本質的に増殖不能又は複製不能にされているものの、選択したペプチド提示機能を保持しており、好ましくはナイーブＴ細胞活性化機能をも保持している。好ましくは、架橋によっても、ａＡＰＣの抗原提示細胞機能を実質的に低下させることなく、細菌及びウイルス（viruse）などの微生物汚染が本質的にないａＡＰＣがもたらされる。したがって、架橋は、ａＡＰＣの重要なＡＰＣ機能を維持する一方で、ａＡＰＣを用いて開発された細胞療法生成物の安全性に関する懸念を軽減するのに役立つ。架橋及びａＡＰＣに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９／００１７０００号を参照されたい。
【００４２】
上記のように調製され不活化されたａＡＰＣは、外因性空ＭＨＣ分子を提示するため、高密度の選択したペプチド−ＭＨＣ複合体がａＡＰＣ表面上に実現され、かつこの高密度が野生型哺乳類ＡＰＣで観察される密度よりも実質的に高くなるように、十分量の選択したペプチドを有利にａＡＰＣに加えることができる。その後、ナイーブＴ細胞／不活化ａＡＰＣ培養を、治療的に有効なＣＴＬ集団を活性化し、濃縮するために適切な時間まで長期に維持できる。例えば、ナイーブＴ細胞／不活化ａＡＰＣの培養持続時間は、約１日〜約１０日、例えば２〜９日、３〜８日、又は４〜６日であってよい。
【００４３】
本発明のａＡＰＣでは、ＭＨＣ分子は空分子として発現される。そのような空分子は、任意の結合した抗原ペプチド、又はそのようなペプチドの抗原ペプチドフラグメントを本質的に欠いている。そのため、空ＭＨＣ分子を有するａＡＰＣは、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるペプチドを含む、１つ以上の抗原ペプチドを負荷することができ、この単数のペプチド又は複数のペプチドがａＡＰＣ表面上に発現されるＭＨＣ分子の抗原結合部位を占有し、この結合部位には選択された１つ以上の抗原ペプチドへの曝露前に結合しているペプチドはなかった。いったん負荷されれば、選択された１つ以上の抗原ペプチドはナイーブＴ細胞の活性化を引き起こす様式でナイーブＴ細胞に提示されることができる。
【００４４】
１つのペプチド種が、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択される実施形態では、選択したペプチド種は複数のペプチド分子を含み、そのそれぞれのアミノ酸組成及び配列が他と同一である。２つ以上のペプチド種が、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択される実施形態では、２つ以上の選択したペプチド種のそれぞれが複数のペプチド分子を独立して含み、そのそれぞれのアミノ酸組成及び配列が他と同一である。これらの２つ以上の種は、それぞれがａＡＰＣと同時に、または異なる段階のいずれかで接触させるために使用される。これらの実施形態のそれぞれにおいて、多抗原性又は多免疫原性ＭＨＣ−ペプチド複合体がａＡＰＣ上に生成される。空ＭＨＣ分子への選択したペプチドの負荷は、好ましくは、インビトロ、エクスビボ又はインビボに近似し得るほぼ生物学的結合条件下で起こる。
【００４５】
更に別の実施形態では、ａＡＰＣは、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるペプチドを含む、１つ以上の抗原ペプチド、並びに１つ以上のその他抗原ペプチドを負荷されてよい。代表的なその他抗原ペプチドについては、例えば、米国特許第７，４０２，３１４号及び米国特許公開第２００９／００１７０００号を参照されたい。
【００４６】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
本発明は更に、患者への投与用の治療用組成物及び細胞療法生成物として用いられる、活性化Ｔリンパ球をエクスビボで産生する方法に関する。活性化Ｔリンパ球をエクスビボで産生するために、被験者から採取されたフェレーシスサンプルからナイーブＴ細胞を得て、それを選択された１つ以上の本発明の抗原ペプチドを負荷したａＡＰＣと接触させる。その結果、接触されたナイーブＴ細胞は活性化され、その場合、ナイーブＴ細胞を活性化するのに使用した、選択された１つ以上の抗原ペプチドに対応する少なくとも１つのエピトープを発現する「標的細胞」に対して感作される。活性化Ｔ細胞に遭遇すると、このような標的細胞は、特異的な標的細胞傷害性を示す活性化T細胞の能力に基づく活性化T細胞によって死滅され得る（すなわち、特異的殺細胞）。したがって、その活性化Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）となる。活性化Ｔリンパ球のＣＴＬ活性を測定するのに使用し得る評価法に関しては当該技術分野において多くの例があり、例えば、ＣＴＬ活性は標準的なクロム（５１Ｃｒ）遊離アッセイを用いて測定できる（Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９６８ Ｆｅｂ；１４（２）：１８１〜９６）。
【００４７】
ナイーブＴ細胞を含むフェレーシスサンプルは、治療を必要とする被験者から得ることができる。好ましくは、被験者は、癌治療を必要とするヒト患者である。より好ましくは、被験者は、多発性骨髄腫治療を必要とするヒト患者である。あるいは、適切な条件下において、治療を受ける被験者由来ではなく、免疫細胞ドナーとしての健康な個人などのその他の適合性供給源から得られるナイーブＴ細胞などの免疫細胞を用いることができる（Ｓａｄｏｖｎｉｋｏｖａら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（１）：１９３〜２００（１９９８）；Ｍｕｎｚら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１）：２５〜３４（１９９９）；Ｌｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５８（４）：６２９〜３８（２００９））。また、不死化した又は形質転換した免疫細胞株を使用し、本発明による治療用組成物及び細胞療法生成物として用いる活性化Ｔ細胞を調製することもできる。
【００４８】
フェレーシスサンプルは、当該技術分野において現在既知の、又は利用できるようになる多くの好適なリンパ球除去（lymphocytapheresis）、リムファフェレーシス（lymphapheresis）、及び白血球除去（leukaphoresis）手順のいずれかにより被験者から採取でき、これにより採取した末梢血からＰＢＬの回収をもたらし、更に白血球をサンプルの他の血漿成分から分離し得る。代表的な手順は、例えば、米国特許第４，６９０，９１５号、同第５，１２６，１３２号、同第６，２５５，０７３号、同第５，８４６，８２７号、同第６，２５１，３８５号、同第６，１９４，２０７号、同第５，４４３，９８３号、同第６，０４０，１７７号、及び同第５，７６６，９２０号、並びに米国特許公開第２００９／００１０９５０号、及び同第２００７／０２５８９５９号に例示されている。
【００４９】
ナイーブＴ細胞は、細胞成長及び増殖状態、細胞表現型、並びに細胞活性に関連するような日常的に選択される１つ以上の適切な特性に基づいて実験的に同定することができる。細胞成長及び増殖状態に関して、ナイーブＴ細胞は、好ましくは静止しているＴ細胞（つまり、細胞周期のＧ0部分に属する傾向がある）集団を含む。活性化Ｔ細胞は、多くの場合細胞周期のＧ1期又はＳ期にある。記憶Ｔ細胞は、一時ナイーブであったが、活性化され、続いて再度静止状態に入ったＴ細胞を含むか、又は恒常性増幅の結果として記憶表現型を獲得したナイーブＴ細胞を含む（例えば、Ｏｐｆｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８３，ｐｐ．１７４５〜１７４８（１９９９）；Ｗｈｅｒｒｙら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．２２５〜２３４（２００３）；Ｋａｅｃｈら、Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１１１，ｐｐ．８３７〜８５１（２００２）；Ｋｉｅｐｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９６，ｐｐ．１３３０６〜１３３１１（１９９９）；Ｇｏｌｄｒａｔｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１９２，ｐｐ．５５７〜５６４（２０００）；Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６５，ｐｐ．１７３３〜１７３７（２０００）を参照されたい）。このような記憶Ｔ細胞は、例えば感作抗原への再暴露、ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞からの補助、及び／又は適切なサイトカインへの曝露で再活性化され得る。したがって、ナイーブＴ細胞は、ナイーブＴ細胞プールの枯渇（抗原に対する応答においてＴ細胞の強力な活性化中に起こるような）により、ナイーブＴ細胞の数を再び満たすために比較的ゆっくりとした恒常性増殖の期間を必要としない限り、記憶Ｔ細胞及び活性化Ｔに比べてインビボで比較的非増殖的である（例えば、Ｋｉｅｐｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐｐ．３１５７〜３１６３（２００５），及びＢａｃｃａｌａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐｐ．４６０６〜４６１２（２００５）を参照されたい）。表現型について、ナイーブＴ細胞は、非ナイーブＴ細胞で観察される発現レベルと比較して、ＣＤ１１ａlow／ＬＦＡ−１low（又はdim）、ＣＤ２５low、ＣＤ２７+（又はhi）、ＣＤ４４low又はＣＤ４４int、ＣＤ４５ＲＡ+（又はpos）、ＣＤ４５ＲＯ-（又はneg）、ＣＤ９５low（又はdim）、ＣＤ５７-（又はneg）、及びＣＤ６２Ｌhi（又はbright）を含み得るナイーブＴ細胞関連ＣＤ分子の特性の存在及び相対的発現レベルによって、非ナイーブＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、及びエフェクターＴ細胞（例えばＣＴＬ））と識別され得る。ナイーブＴ細胞は、非ナイーブＴ細胞で観察される発現レベルと比較して、比較的高レベルのケモカインレセプターＣＣＲ７（ＣＣＲ７hi）の発現により識別することもできる（例えば、ＭｃＦａｒｌａｎｄら、ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９７（８），ｐｐ．４２１５〜４２２０（２０００）；Ｉｓｈｉｍａｒｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．７（７），ｐｐ．７６３〜７７２（２００６）；及びＫｅｒｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ．２９０８〜２９１５（１９９９）を参照されたい）。対照的に、例えば記憶細胞は、ＣＤ２７low、ＣＤ４４hi、ＣＤ４５ＲＡ-、ＣＤ４５ＲＯ+、ＣＤ５７+（又はｈｉ）、ＣＤ６２Ｌlow、及び／又はＣＣＲ７low表現型により特徴付けることができる（例えば、Ｋｅｒｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ．２９０８〜２９１５（１９９９）及びＢａｃｃａｌａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１７４：４６０６〜４６１２（２００５）を参照されたい）。細胞活性に関して、ナイーブＴ細胞は、インターフェロンα、インターフェロンγ、インターロイキン（ＩＬ）１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、及び／又は顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦを効率的に産生又は分泌できないことにより特徴付けることができる（例えば、Ｃｅｒｗｅｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．，１６１，ｐｐ．９７〜１０５（１９９８）；Ｗａｌｚｅｒら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２０６，ｐｐ．１６〜２５（２０００）；米国特許公開第２００２／０１１９１２１を参照されたい）。また、ナイーブＴ細胞は仮定の標的細胞に対して実質的な細胞傷害性又は特異的殺細胞活性を示さない。
【００５０】
好ましくは、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞、又はナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞及びナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞であってよいこれらのナイーブＴ細胞は、他の末梢血白血球（ＰＢＬ）、例えば非Ｔ細胞から実質的に分離され、次いで活性化Ｔ細胞を含有する治療用組成物又は細胞療法生成物の製造に用いられる。ＰＢＬの選択法として、Ｆｉｃｏｌｌ勾配、免疫精製を利用する技術（例えばＣＤ分子などの細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体、並びに抗体が吸着できるセファロース−、プロテインＡ−、及びプロテインＧ−結合ビーズなどのビーズ、並びに抗体が吸着できる磁気ビーズ）、フローサイトメトリー、及び蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）分析が挙げられる。好ましくは、選択されたナイーブＴ細胞は、当該技術分野で利用できるような磁気ビーズ精製システム、例えばＦＡＣＳに基づく手法などの細胞ソーティング法と組み合わせたＭｉｌｔｅｎｙｉビーズ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びＤｙｎａｂｅａｄシステム（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、又は他の適切な細胞ソーティングデバイス及び方法により実質的に精製される。次いで、実質的に精製されたナイーブＴ細胞を、選択したペプチド負荷ａＡＰＣと混合し、活性化ヘルパーＴ細胞、好ましくはＣＴＬ又はＣＤ８＋記憶Ｔ細胞などの、活性化Ｔ細胞の所望の集団に活性化し、濃縮するために十分な時間インキュベートする。このような活性化Ｔ細胞は、好ましくはペプチド特異的な様式で活性化される。
【００５１】
実質的に分離されたナイーブＴ細胞とａＡＰＣの比率はまた、例えば、個体のリンパ球の培養条件に対する適用性、及び治療される疾患又はその他状態の性質及び重篤度などの個体の特性を考慮して、特定の個体について最適化することもできる。代表的な分離されたナイーブＴ細胞と不活化ａＡＰＣの比は、約３０：１〜３００：１である。例えば、３×１０7個のヒトナイーブＴ細胞及び１×１０6個のａＡＰＣを混合し、ＲＰＭＩ １６４０培地を含む培地で維持することができる。
【００５２】
活性化Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞、又はＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＤ４＋ Ｔ細胞の組み合わせを含んでよく、これらは感作され、かつ刺激され、したがって上記のように活性化され、所望により再刺激及び／又は増幅されて、所望の表現型及び数の活性化Ｔ細胞を含む治療用組成物及び細胞療法生成物を製造することができる。代表的な再刺激手順には、活性化Ｔ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進する１つ以上の選択されたサイトカインを添加する工程と、活性化Ｔ細胞を選択したペプチド負荷非ＣＤ８＋細胞、例えばＣＤ１４＋細胞とインキュベートする工程と、を含む。適切なサイトカインの選択は、治療用組成物又は細胞療法生成物を最終的に含むことになる活性化Ｔ細胞の所望の表現型に依存する。したがって、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞は、活性化され所望により再刺激及び／又は増幅されてＣＤ４＋ Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＣＤ４＋ Ｔｈ１細胞又はＣＤ４＋ Ｔｈ２細胞になり得、そしてナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞は、活性化され所望により再刺激及び／又は増幅されてＴ細胞傷害性（Ｔｃ）様の表現型を有するＣＴＬ、例えば当該技術分野の指針を考慮する技術者により所望されるように、Ｔｃ１様表現型を有するＣＴＬ、Ｔｃ２様表現型を有するＣＴＬ、記憶Ｔ細胞、又はこのような組み合わせになり得る（例えば、Ｃｅｒｗｅｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６３（１０），ｐｐ．５５３５〜５５４３（１９９９）；Ｍｏｓｍａｎｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，Ｖｏｌ．１７（３），ｐｐ．１３８〜１４６（１９９６）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．８（３），ｐｐ．３３６〜３４２（１９９６）；Ｃｒｏｆｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１８０，ｐｐ．１７１５〜１７２８（１９９４）；Ｆｕｊｉｈａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．３６１３〜３６１８（１９９６）；及び米国特許第６，３５５，４７９号を参照されたい）。代表的なサイトカインとして、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、及びＴＮＦ−αが挙げられる。代表的なＴ細胞増幅手順は、活性化Ｔ細胞を、照射した非ＣＤ８＋細胞と共に、選択されたサイトカイン及びＯＫＴ（登録商標）３などの抗ＣＤ３抗体調製物の存在下でインキュベートし、非特異的活性化Ｔ細胞増幅を促進する工程を含む。使用されるこのような再刺激及び増幅プロトコールの数、順序、及び組み合わせの選択は、技術者の関心の範囲内にあり、当該技術分野の指針により容易になり得る。例えば、Ｃｅｒｗｅｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６１，ｐｐ．９７〜１０５（１９９８）；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．２４（４），ｐｐ．６１９〜６２９（１９９５）；及びＳａｄら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．２７１〜２７９（１９９５）を参照されたい。
【００５３】
好ましい実施形態では、刺激されたＴ細胞は引き続き、刺激されたＴ細胞を、活性化Ｔ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進するために十分な量のＩＬ−２及びＩＬ−７と接触させる工程と、続いてそのように接触させたＴ細胞を、照射した自己由来接着性非ＣＤ８＋細胞（例えばＣＤ１４＋細胞）並びに追加の十分量のＩＬ−２及びＩＬ−７とインキュベートする工程と、を含む、少なくとも１回繰り返す再刺激手順にかけられる。再刺激手順が２回以上行われる実施形態では、活性化Ｔ細胞を、各再刺激手順の繰り返しの間に追加量のＩＬ−２及びＩＬ−７と接触させる。他の好ましい実施形態では、活性化Ｔ細胞は、少なくとも１回の再刺激手順の繰り返しに引き続いて少なくとも１回の増幅手順にかけられ、ここで増幅手順は、活性化Ｔ細胞を、照射した非ＣＤ８＋細胞と、そのように接触させたＴ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進するために十分な量のＩＬ−２、並びに抗ＣＤ３抗体調製物、好ましくはＯＫＴ（登録商標）３の存在下でインキュベートする工程を含む。
【００５４】
好ましい実施形態では、ナイーブＴ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞を含み、活性化され所望により再刺激及び／又は増幅される際に、例えば、それらが標的とする細胞に対する細胞傷害性活性を示すことができ、又は免疫賦活性（immunostimlatory）若しくは細胞傷害性関連のサイトカインを産生することがでる。好ましくは、これらの特徴の組み合わせを示す。感作され活性化されたナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞を、上述の再刺激手順及び／又は増幅プロトコールにかけることができ、このことは特異的ＣＴＬ細胞系譜の表現型への活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞の分化を推進する。ペプチド負荷ａＡＰＣ−活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞もまた、選択したペプチド単独と、又は特定のサイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１２、並びにインターフェロンγと共に、又は活性化Ｔ細胞表面上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）及び共刺激分子に対するものなどの抗体と共に、インビボ又はインビトロでの再刺激手順に数回かけることができる。好ましい実施形態では、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、このような方法で更に再刺激され、少なくとも約４世代又は５世代にわたり標的細胞に関する免疫原性及び細胞傷害性を維持し、記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞を生じる。記憶ＣＤ８＋ Ｔ細胞の同定、特性決定、免疫原性維持、及び増幅の方法は、例えば、Ｃｅｒｗｅｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．，１６１，ｐｐ．９７〜１０５（１９９８）；Ｃｅｒｗｅｎｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１６３，ｐｐ．５５３５〜５５４３（１９９９）；米国特許公開第２００２／０１１９１２１号に見出すことができる。
【００５５】
活性化Ｔ細胞は、当該技術分野において既知又は利用可能な好適な技術を用いてａＡＰＣから分離することができる。例えば、ａＡＰＣ、ａＡＰＣ上に負荷されたペプチド、又は活性化Ｔ細胞（若しくはその一部）に特異的なモノクローナル抗体を使用して、適切な相補的リガンドを結合できる。続いて、免疫沈降又は免疫評価法などの好適な技術により、ａＡＰＣ／活性化Ｔ細胞混合物から抗体標識した細胞を抽出できる。あるいは、分離工程を完全に省略し、不活化ａＡＰＣを活性化Ｔ細胞と共に培養中に残してもよい。
【００５６】
好適な実施形態では、ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞が活性化のために選択され、所望量の得られたＣＴＬを使用して治療的投与のための細胞療法生成物を調製する。好ましくは投与前に、活性化Ｔリンパ球又は細胞療法生成物について１種以上の品質保証試験を行う。好ましい実施形態では、品質保証試験は、１種以上の試験を実施し、患者とＴリンパ球との間のＨＬＡマッチ；フローサイトメトリー分析（ＣＤ８＋、ＴＣＲ＋）；無菌性（細菌又は真菌の成長がない）；細菌についてグラム染色陰性；ＰＣＲ／ＥＬＩＳＡについてマイコプラズマ陰性；残存ショウジョウバエＤＮＡがない；昆虫ウイルスｃＤＮＡの不在；生存率（＞７２％生存）；及びＣＴＬ評価による細胞溶解活性を確認することを含む。
【００５７】
被験者を治療するために、本発明による有効量の細胞療法生成物が、疾患、傷害、又は状態を患っているか、又はこれらを有すると診断された被験者に対して投与される。「有効量」は、かかる治療を必要とする患者において、所望の治療的又は予防的効果を一般的にもたらすのに十分な量又は十分な投与量である。本発明の細胞療法生成物の有効量又は有効投与量は、モデリング、用量増加試験又は臨床試験などの常法により、並びに、例えば投与の態様や経路又は薬剤送達、細胞療法生成物の薬物動態、疾患、傷害又は状態の重篤度及び経過、被験者の過去又は現在の治療法、被験者の健康状態及び薬物への応答、及び治療に携わる医師の判断などの所定の因子を考慮することにより決定することができる。代表的な投与量として、細胞集団は、成人のヒトに対して、約１×１０6〜約１×１０12個の活性化Ｔ細胞、例えば１×１０8〜１×１０11、又は１×１０9〜１×１０10個の活性化Ｔ細胞を含むことができる。
【００５８】
細胞療法生成物は、活性化Ｔ細胞と、被験者に注入されるまで活性化Ｔ細胞を維持するのに好適な賦形剤、例えば製薬上許容できる希釈剤又は溶媒とを含む治療用組成物として調製される。好適な実施形態では、細胞療法生成物は、乳酸リンゲル注射液ＵＳＰ（７６％（容積／容積））、５％デキストロース生理食塩液（Ｄ５ＮＳ；４％（容積／容積））、及び２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；２０％（容積／容積））を含む溶液に、約１×１０9〜約１０×１０9個のＣＴＬを含む。
【００５９】
細胞成分を含む組成物を被験者に投与するための任意の好適な技術を使用できる。例えば、静脈内注入による活性化ＣＴＬの投与を採用できる。複数回の注入を必要とする、又は指示される場合があり、これらの注入を数週間、又はそれ以上の期間にわたり行うことができる。代表的な技術は、例えば、米国特許第４，８４４，８９３号、及び同第４，６９０，９１５号に記載される。
【００６０】
所望により、細胞療法生成物又は調製物は、選択したペプチドを負荷したａＡＰＣに加えて、その他免疫調整成分、好ましくは免疫刺激成分を含むように補充してよい。このような追加成分を、ナイーブＴ細胞のペプチド負荷ａＡＰＣとの接触前、それと同時、又はその後に加えてよい。このような補助的免疫調整成分、好ましくは免疫刺激成分が加えられる所望の時点、投与濃度、及び頻度の選択は、所望の増殖速度、増幅率、細胞数、寿命、又は免疫原性などの関連する検討事項に従って選択できる。補助的成分又は免疫刺激成分は、例えば、非ナイーブＴ細胞以外の１つ以上の白血球、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、及び抗体であってよい。選択できる代表的な白血球として、非ＣＤ８接着細胞、ＣＤ１４＋接着細胞などの接着細胞、単核細胞、マクロファージ、ヘルパーＴ細胞、記憶Ｔ細胞、及び免疫調整性、好ましくは免疫刺激性の効果又は刺激を付与できるその他白血球が挙げられる。このような白血球は、自己由来又は異種起源であってよい。代表的なサイトカインとして、インターロイキン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、インターフェロン、例えばｇ−インターフェロン、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦ−αが挙げられる（例えば、Ｔｉｚａｒｄ Ｉ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｐ．１２９〜１４３，（１９９２）；米国特許公開第２００２／０１１９１２１号を参照されたい）。サイトカインは組換え型又は天然起源であってよい。代表的な抗体として、モノクローナル抗ＣＤ３抗体、例えばＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ ＯＫＴ（登録商標）３（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）として示されるものが挙げられる。
【００６１】
本発明の一実施形態では、自己非ＣＤ８、ＣＤ１４＋接着細胞、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びモノクローナル抗ＣＤ３抗体調製物（ＯＫＴ（登録商標）３）が、細胞療法用調製法における追加の免疫刺激成分として使用される。このような実施形態では、選択したペプチドを負荷したａＡＰＣで初回刺激を受けたナイーブＴ細胞を、有効量の組換えＩＬ−２及び組換えＩＬ−７（例えば、約１〜１００単位／ｍＬのＩＬ−２、好ましくは１、１０、１５、２０、５０、又は１００単位／ｍＬのＩＬ−２、及び約１〜１００単位／ｍＬのＩＬ−７、好ましくは１、１０、１５、２０、又は５０単位／ｍＬのＩＬ−７）と接触させる工程と、次いで有効量の自己由来の選択したペプチド負荷非ＣＤ８、ＣＤ１４＋接着細胞（例えば、初回刺激を行ったナイーブＴ細胞４個ごとに、非ＣＤ８、ＣＤ１４＋接着細胞を約１個）と接触させる工程と、を含む再刺激手順にかける。ＩＬ−２／ＩＬ−７及びＣＤ１４＋接着細胞と接触させる期間は、それぞれ約２日、及び約３〜約４日であり、各再刺激手順を少なくとも１回続けて繰り返してよい。少なくとも２回の再刺激手順の後、非特異的Ｔ細胞増幅レジメンとして、細胞をＩＬ−２及び抗ＣＤ３（例えば、ＯＫＴ（登録商標）３）と約２〜約５日接触させる工程を含む。
【００６２】
別の実施形態では、自己ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、又はＩＬ−２１を、初回刺激又は再刺激手順の前、それと同時、又はその後にナイーブＴ細胞と接触させる。また、ＩＬ−２を、ＩＬ−７、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１のうち少なくとも１つと組み合わせて使用してもよい。ＩＬ−１５が使用される場合、ＩＬ−１５の有効量は、約１〜１００ｎｇ／ｍＬ、例えば１、１０、２０、２５、４０、又は５０ｎｇ／ｍＬの量のＩＬ−１５である。同様に、ＩＬ−２１が使用される場合、ＩＬ−２１の有効量は、約１〜１００ｎｇ／ｍＬ、例えば１、１０、２０、２５、４０、又は５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１である。このような実施形態では、ナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が記憶Ｔ細胞になることを目的としてよい。かかるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞レジメンを、上記再刺激手順又は非特異的Ｔ細胞増幅手順のいずれかに加えて、又はこれら手順の代わりに使用し、エクスビボでの複数回の再刺激手順を許容できる記憶Ｔ細胞とする。更には、次いでこのような記憶Ｔ細胞を含む細胞療法生成物は、被験者に投与されると、選択したペプチド及びその他活性化の合図と遭遇した際に、インビボで増幅されかつ刺激されてよい。ヘルパーＴ細胞の調製に、並びに記憶Ｔ細胞又はＣＴＬになるためのＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、及び／又はＩＬ−２１への取り込みが補助するナイーブＴ細胞の刺激又は増幅に全体的に関連する方法は、例えば、米国特許公開第２００２／０１１９１２１号に見出すことができる。
【００６３】
被験者の治療のために、細胞療法生成物を、細胞療法生成物の調製に用いたフェレーシス生成物を元々得た被験者に投与することが好ましくい。したがって、細胞療法生成物で治療される被験者に、好ましくは自己由来の活性化Ｔ細胞を含む、及びより好ましくはＣＴＬを含む、細胞療法生成物が投与される。活性化Ｔ細胞を取出すのに用いたフェレーシスサンプルを得た被験者に、活性化Ｔ細胞を再注入、つまり戻し注入してよい。使用できる再注入手順として、例えば、米国特許第４，８４４，８９３号、及び同第４，６９０，９１５号に開示される手順が挙げられる。
【００６４】
本発明による細胞療法生成物で治療され得る代表的な疾患、傷害、又は状態として、例えば、多発性骨髄腫などの癌が挙げられる。別の治療用生成物又はレジメンでの異なる治療前に、それと同時に、又はその後に、本発明による細胞療法生成物を用いた疾患、傷害、又は状態の治療を行ってよい。本発明の細胞療法生成物の投与と共に使用できる代表的な追加レジメン、構成成分、又はモダリティとして、例えば、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、インターロイキン、又はインターフェロン投与などの免疫刺激、免疫抑制、及びその他の免疫療法レジメン；デニロイキンジフチトクス（ＤＡＢ−ＩＬ２）又はクラドリビン投与などのリンパ球枯渇及び骨髄破壊的（myeloblative）レジメン；並びに、従来の化学療法及び放射線療法が挙げられる。好適な実施形態では、国際公開第２００７／１０３００９号に開示されるものなどのリンパ球枯渇療法レジメンが、細胞療法生成物による治療と共に利用される。
【００６５】
よって、ナイーブＴ細胞は、本発明の細胞療法生成物で治療可能な状態又は疾患に罹患している被験者から有利に得ることができ、その後ナイーブＴ細胞の活性化を妨害、減弱、又は制限し得る他の治療又は療法を開始する。例えば、異常増殖又は腫瘍を有する個体の治療において、化学療法又は放射線療法の開始前にナイーブＴ細胞を含むリムファフェレーシス（lympapheresis）生成物を得て、培養液中に維持する、又は後で使用するために凍らせておくことができる。次いで、ナイーブＴ細胞を本発明に従って活性化することにより細胞療法生成物が提供され、他の治療レジメンの前、これらと同時、又はこれらの後に被験者に注入することができる。
【００６６】
本発明のその他の実施形態、特徴、及び利点は以下の実施例を参照することにより更に例示される。
【実施例】
【００６７】
更に説明しなくても、当業者は、上記の記述及び下記の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製及び使用し、特許請求する方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実際的な実施例は、本発明の実施形態を特異的に指摘するものであって、本開示の残部をいかようにも限定するものと解釈されない。
【００６８】
Ｕ２６６細胞株の細胞培養
抗原同定に用いた細胞株であるＵ２６６（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１９６）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補完したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、細胞培養用フラスコ及び攪拌ボトル内で増幅した。１日目に、通常は０．５×１０6個細胞／ｍＬで細胞を播種し、細胞密度が２×１０6個細胞／ｍＬになったとき、典型的には３日目又は４日目に細胞を分割した。
【００６９】
Ｕ２６６細胞株の細胞採取
細胞懸濁液を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して培養した細胞を集め、５０ｍＬのコニカルチューブ内で氷冷１×リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３回洗浄し、その後カウントした。約１×１０9個の細胞に相当する細胞ペレットのアリコートを液体窒素で急速に凍らせ、使用まで−８０℃で保存した。
【００７０】
ＨＬＡ−Ａ２抗体のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）への結合
ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＨＢ−８２（商標）（Ｐａｒｈａｍ及びＢｒｏｄｓｋｙ、Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（４）：２７７〜９９（１９８１））であるハイブリドーマ細胞株の細胞培養上清から、ＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体を精製した。ＢＢ７．２抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｏｄｕｃｔ＃ ｓｃ−３２２３６）及びＡｂｃａｍ（Ｐｒｏｄｕｃｔ＃ ａｂ７４６７４）から入手することもできる。ＢＢ７．２抗体はマウスモノクローナル抗ＨＬＡ−Ａ２抗体であり、ＩｇＧ2bアイソタイプである。この抗体は、ヒトＨＬＡ−Ａ２組織適合抗原内の、α−２ヘリックスのＣ末端にあるエピトープ、及び下部βストランドの１つ上のターンを認識する。ＢＢ７．２は全てのＨＬＡ−Ａ２サブタイプを認識するであろう。ＨＬＡ−Ａ２．１は、９０％がＡ２サブタイプを示し、残りの１０％には主にＡ２．２、Ａ２．３、Ａ２．５及びＡ２．７が含まれることを意味する。ＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体の結合前に、０．５ｍＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）トシル活性化（Tosylactivated）ビーズ（Ｄｙｎａｌ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号６５５．０１）を集め、ｐＨ９．５の０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液を含むコーティング緩衝液を用いて４回洗浄した。次いで、０．４２ｍＬの４．８ｍｇ／ｍＬ ＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体、コーティング緩衝液３．２６ｍＬ中、２．０８ｍＬの３Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4を用いて、室温（ＲＴ）で７２時間ビーズをインキュベートした。Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＭＰＣ（商標）−１磁気粒子濃縮器（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＳＡ，ＯＳＬＯ，Ｎｏｒｗａｙ）で上清を除去した。続いて、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む総容積が同じＰＢＳをビーズに添加し、このビーズをＲＴで更に４８時間インキュベートした。次いで、０．１％ ＢＳＡ及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳでビーズを３回洗浄し、０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ ２ｍＬに再懸濁した。
【００７１】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）トシル活性化ビーズへの結合前及び後における、溶液中のＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体量を比較して、ＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体結合効率を評価した。総タンパク質２μｇを含有するサンプルをサンプル緩衝液に加え、１００℃で１５分間沸騰させた。サンプルを１０〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法），で分析した（データ示さず）。９０％を超える結合が確認された。
【００７２】
ＨＬＡ−Ａ２関連ペプチドの単離
Ｕ２６６細胞ペレットのアリコート（１×１０9個細胞より）を、２．５×１０7個細胞／ｍＬ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＣＨＡＰＳ（Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２２６９４７）、５μＭ ＥＤＴＡ、０．２％アジ化ナトリウム、１７．４μｇ／ｍＬ ＰＭＳＦ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、及び２錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１６９７４９８）の濃度で含有する溶解用緩衝液４０ｍＬ中、回転装置を用いて１時間４℃にて再懸濁した。可溶化液を１００，０００×ｇで１時間遠心分離した。沈殿物を捨て、上清を０．２２μｍのフィルターに通した。続いて、上清をＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体を結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（１ｍｇ ＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体／２５ｍｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、４℃で２４時間、回転装置使用）と共にインキュベートした。ビーズペレットをＤｙｎａｌ（登録商標）ＭＰＣ（商標）−１を用いて回収し、以下の４種類の洗浄緩衝液を用いて、一連の５０ｍＬ洗浄液で洗浄した。
洗浄緩衝液１：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＣＨＡＰＳ、５μＭ ＥＤＴＡ、０．２％アジ化ナトリウム、１７．４μｇ／ｍＬ ＰＭＳＦ
洗浄緩衝液２：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ
洗浄緩衝液３：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、４５０ｍＭ ＮａＣｌ
洗浄緩衝液４：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）
【００７３】
一連の４回の洗浄工程後、ＲＴで５分間、２ｍＬの１０％ ＨＡＣ（ｐＨ２．５）と共にビーズをインキュベートし、Ｄｙｎａｌ（登録商標）ＭＰＣ（商標）−１を５分間使用して、ＢＢ７．２ ＨＬＡ−Ａ２抗体を結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）からペプチドを溶出した。ビーズから溶出された物質を１．５ｍＬ容のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ製プラスチックチューブに入れ、５分間ボイルして、ＭＨＣクラスＩ、ＨＬＡ−Ａ２重鎖から任意の結合したペプチドを更に解離させた。続いて、公称の分子量カットオフが５０００ダルトンであるＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ膜（Ａｍｉｃｏｎ、カタログ番号ＵＦＣ４ＬＣＣ２５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用い、遠心分離により同時精製される重鎖及びβ２−ミクログロブリンからペプチドを分離した。使用前に、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ膜ユニットを１ｍＬの１０％酢酸で予め濡らし、１時間回転させ、両リザーバ中の全ての液体を捨てた。次いで、ビーズから溶出された物質を予め濡らしたＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ膜ユニットに移し、これを４℃で約５時間、３５００×ｇで遠心分離した。ろ液及び残余物の両方を回収した。ＭＨＣクラスＩ、ＨＬＡ−Ａ２分子（残余物）を含むペプチドを含まない画分のアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ペプチドを含まない画分は、それぞれＭＨＣクラスＩ重鎖及びβ２−ミクログロブリンに対応する４４ｋＤａ及び１２ｋＤａの予想されるバンドを有し、その純度は９５％であった（データ示さず）。ペプチド溶液（ろ液）を液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）で分析し、その後デノボペプチドシーケンス解析によりペプチドのアミノ酸配列を決定した。
【００７４】
液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）
ペプチド溶液（ＨＬＡ−Ａ２関連ペプチドを単離したろ液）を、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加することにより酸性化した。各サンプルについて脱塩／トラップを目的に１０μＬをＥｋｓｉｇｅｎｔ ｎａｎｏＬＣ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に次の設定で注入した：トラップカラム＝ＬＣ ＰａｃｋｉｎｇｓのＣ１８ Ｐｅｐｍａｐ １００、粒径５μｍ、ポア径１００Å、カラム内径３００μｍ×５ｍｍ；トラップ用移動相＝水、２％メタノール、０．０５％ ＴＦＡ；トラップ用流速＝５μＬ／分；分析カラム＝Ｖｙｄａｃ Ｅｖｅｒｅｓｔ Ｃ１８、粒径５μｍ、ポア径３００Å、カラム内径７５μｍ×１５０ｍｍ；分析移動相：Ａ＝水、２％メタノール、０．１％ギ酸；Ｂ＝１０％水、９０％アセトニトリル、０．１％ギ酸；流速＝０．２μＬ／分；分析勾配＝０〜８０分１０〜３０％ Ｂ、８０〜１２０分３０〜６０％ Ｂ。Ｍａｓｓｌｙｎｘ ４．０を備えるＭｉｃｒｏｍａｓｓ ｑＴＯＦ Ｕｌｔｉｍａ及びＥＳＩ＋モードのｎａｎｏＳｏｕｒｃｅにおいて、データ依存ＭＳ／ＭＳ取り込みを実施した。デノボペプチドシーケンス解析にはＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ ２．０を使用した。
【００７５】
抗原ペプチドの配列決定
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたデノボシーケンス解析で得られるペプチド配列は、不完全なペプチド断片化により通常は曖昧である。ペプチドがアルゴンガスと衝突するとき、全ての可能性があるフラグメントが必ず発生するわけではない。実際に、ペプチド結合の一部は、変わらずに無傷である場合がある。加えて、様々な理由（例えば、共溶出、イオン抑制、又はフラグメントが正電荷を持たない場合）により、質量分析計で全てのペプチドフラグメントを検出できるわけではない。したがって、特定のペプチドのＬＣ／ＭＳ／ＭＳスペクトルは、完全ではない場合があり、すなわち、ラダー中に欠落段階があり得る。本発明では、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ ２．０シーケンス解析ツールを用い、続いて５回の反復評価のうち少なくとも３回から得られた類似する大きさのＬＣ／ＭＳ／ＭＳピーク配列を比較することにより、及び、ペプチド配列をヒトタンパク質配列データベースと比較することにより、ペプチド配列の曖昧さを低減した。この方法で、２１個のＬＣ／ＭＳ／ＭＳピークについて、９〜１２個のアミノ酸長を有する２４種類のペプチド配列を選択した。２４種類のペプチド配列のうち１９種を既知のヒト完全長タンパク質にマッピングした（表１）。その後、完全長タンパク質中のＨＬＡ結合モチーフの探索により、コンピュータ予測された更なるペプチドを得た（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２ Ｄｅｃ １；１４９（１１）：３５８０〜７）。２４種類の実験的に同定されたペプチド、ペプチドの一部の切断部、及びコンピュータ予測されたペプチドを合成し（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ Ｉｎｃ．，Ｂｒａｄｅｎｔｏｎ，ＦＬ）、ＨＬＡ−Ａ２安定化評価法で試験し、ＣＴＬを生成してそれらの活性を標準的な51Ｃｒ遊離アッセイで試験した。ペプチド同定方法の略図は図１に示される。表１は、更なる特性評価のために合成された２４種類の選択したペプチドのリスト、及び同定された場合はその各ペプチドの関連タンパク質を示す。
【００７６】
表１
配列決定され、ＨＬＡ−Ａ２安定化及びＣＴＬ活性に対する更なる特性評価のために合成するよう選択された２４種類のペプチド。完全長タンパク質が同定されなかったペプチド配列は、遺伝子記号、タンパク質受入番号、及び完全長タンパク質のアミノ酸残基の数について空欄である。
【００７７】
【表１】
【００７８】
ＨＬＡ−Ａ２安定化評価法
クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ／ＨＬＡ−Ａ２）分子へのペプチド結合の評価は、抗原プロセシング関連トランスポーター（ＴＡＰ）欠失細胞株、Ｔ２（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＲＬ−１９９２）内で合成されるＭＨＣクラスＩ、ＨＬＡ−Ａ２分子に対するペプチドの安定化能力に基づく。ＭＨＣクラスＩ分子の安定化の程度は、添加されたペプチドの結合親和性に直接関連する（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ．１９９０ Ｊｕｌ ２７；６２（２）：２８５〜９５；Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．１９９９ Ａｕｇ；５４（２）：１８５〜９０）。
【００７９】
評価において、Ｔ２細胞を、１×１０6個細胞／ｍＬの密度で、最終ペプチド濃度２００μＭ、２０μＭ、２μＭ、２００ｎＭ、２０ｎＭ、２ｎＭ、ペプチドなし（陰性対照として）を含むＲＰＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）の９６ウェルＶ底プレートにまいた。ペプチドを含む細胞を、２６℃、５％ＣＯ2で１８時間インキュベートした。１８時間後、プレートを３７℃、５％ＣＯ2に移し、更に３時間インキュベートした。プレート内の細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２．５％ＦＣＳ、１％ＮａＮ3）で１回洗浄し、続いて１μＬ／ウェルのＦＩＴＣ標識したマウス抗ヒトＨＬＡ−Ａ２抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カタログ番号５５１２８５）、１μＬ／ウェルのＰｌを添加して染色し、更に４℃で３０分間インキュベートした。染色後、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、９６ウェルプレートから９６本のマイクロチューブのラックに移した。サンプルをＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターにかけ、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてデータを分析した。
【００８０】
図２は、合成され、Ｔ２細胞におけるＨＬＡ−Ａ２分子への結合及び安定化能について評価された２４種類の選択したペプチドに関する、ペプチド濃度に対する蛍光強度中央値（ＭＦＩ）のグラフを示す。Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢＣ）のペプチドを陽性対照として用いた。Ｂ型肝炎コアペプチドは強力なＨＬＡ−Ａ２．１エピトープであり、残基数１８〜２７のコア配列である、アミノ酸ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号：７３）からなる（Ｚｈａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００７，１２１（１）：１０５〜１２）。ペプチドの結合親和性を強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）と特徴付けし、表２にまとめる。
【００８１】
表２
２４種類の選択したペプチドの相対結合親和性。
【００８２】
結合親和性は強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）と特徴付けられた。
【００８３】
【表２】
【００８４】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成
ショウジョウバエａＡＰＣをＳｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２細胞（Ｓ２細胞）から生成した。この細胞は数百のＯｒｅｇｏｎ−Ｒ（野生型）キイロショウジョウバエ（Ｏｒｅｇｏｎ−Ｒ）の胚（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ＣＲＬ−１９６３）から、発表された手順（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．１９７２ Ｖｏｌ ２７，ｐｐ．３５３〜３６５）に従って、元々は１９６９年に確立され、ＡＴＣＣに寄託されたものである（ＣＲＬ１０９７４）。Ｓ２細胞を１０％加熱不活化ウシ胎児血清を補充した市販のＳｃｈｎｅｉｄｅｒショウジョウバエ用培地で増殖した。ａＡＰＣを生成させるため、ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、及びＣＤ７０に対するヒト相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をｐＲｍＨａ−３ベクターに別々に挿入し、ＨＬＡ−Ａ２．１、Ｂ７．１、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、及びＣＤ７０のプラスミドＤＮＡの混合物（ａＡＰＣクローン１１２０について）及びｐｈｓｈｎｅｏプラスミドを用いて、リン酸カルシウム沈降法によりＳ２細胞を形質転換した（ｐＲＭＨａプラスミドベクターの構築及び使用法については米国特許第６，２２５，０４２号を参照されたい）。Ｋ５６２細胞からのＨＬＡ−Ａ２．１、Ｋ５６２細胞からのＢ７．１、ＨＬ６０細胞からのＬＦＡ−３、Ｋ５６２細胞からのＩＣＡＭ−１、及びＨＬＡ−Ａ２．１＋ＬＣＬ細胞からのＣＤ７０について既報の配列から誘導されたプライマーを使用する、逆転写ＰＣＲによる標準的な手法を用いてヒトｃＤＮＡを調製した。Ｋ５６２細胞はヒト赤白血病細胞株であり、ＨＬ６０細胞は前骨髄球性白血病ヒト細胞株であり、かつＨＬＡ−Ａ２．１＋ＬＣＬ細胞はエプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）である。ジェネテシンを含むＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地で培養し、安定的に形質転換された細胞を選択した。細胞のスケールアップ前に、ＣｕＳＯ４を添加して形質転換遺伝子の発現を誘導する。抗ＨＬＡ−Ａ２．１、抗Ｂ７．１、抗ＬＦＡ−３、抗ＩＣＡＭ−１、及びＣＤ７０抗体を用いるフローサイトメトリーにより発現レベルを評価する。ＣＤ８＋リンパ球の効率的なインビトロ活性化には、３０％超のショウジョウバエ細胞がＨＬＡ−Ａ２．１分子を発現しなくてはならない。ショウジョウバエ細胞は、７０〜９０％のレベルで各分子を恒常的に発現している。ショウジョウバエａＡＰＣを洗浄し、続いて１０μＭの異なる組み合わせの混合ペプチド、又は個々のペプチドと共にＲＴで４時間インキュベートした（例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号、及び同第６，７９０，６６２号、米国特許公開第２００９／００１７０００号、及び同第２００９／０００４１４２号、並びに国際公開第ＷＯ２００７／１０３００９号、を参照されたい）。続いて、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー由来の精製されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ペプチド負荷ショウジョウバエＡＰＣと共に、３７℃、５％ＣＯ2で５日間インキュベートした。５日目にヒトＩＬ−２（２０Ｕ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＩＬ−７（３０Ｕ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、ペプチド存在下における同一ドナー由来の総末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）調製物中の非ＣＤ８接着細胞を用いて、７日目及び１５日目に活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＴＬ）を２回再刺激した。
【００８５】
異なるドナー由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞、及び異なる組み合わせの混合ペプチド（１つのペプチドのみを含む組み合わせを含む）を用いて、様々なＣＴＬを生成した。例えば、２４種類の選択したペプチドを混合して、又は個々に用いて、異なる組み合わせのペプチド混合物（ＰＭ）又は個々のペプチド（Ｐ５及びＰ１４）を作製し、ペプチド負荷ショウジョウバエＡＰＣを産生した。得られたペプチド負荷ショウジョウバエＡＰＣを異なる２人のドナー（ドナー１及びドナー２）由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞とインキュベートし、１１種の異なるＣＴＬバッチ（ドナー１：ＰＭ１、ＰＭ２、ＰＭ３、ＰＭ４、及びＰ１４、ドナー２：ＰＭ１、ＰＭ２、ＰＭ３、ＰＭ４、Ｐ５、及びＰ１４）を産生した（表３）。
【００８６】
表３
１１種の異なるＣＴＬバッチ（ドナー１：ＰＭ１、ＰＭ２、ＰＭ３、ＰＭ４、及びＰ１４、ドナー２：ＰＭ１、ＰＭ２、ＰＭ３、ＰＭ４、Ｐ５、及びＰ１４）の産生に用いた混合ペプチドの組み合わせを含む組成物、及びペプチド１種のみを含む組成物。
【００８７】
【表３】
【００８８】
その後、３種のペプチド（Ｐ３、Ｐ１３、及びＰ１４）を用いて、別のＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー（ドナー１６、図５）由来のＣＴＬを生成し、混合ペプチドの組み合わせ又は個々のペプチドを用いて更なるＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞でより多くのＣＴＬを生成した（表４）。
【００８９】
表４
多くの更なるＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー由来のＣＴＬ産生に用いた混合ペプチドの組み合わせを含む組成物、及びペプチド１種のみを含む組成物。
【００９０】
【表４】
【００９１】
ＣＴＬ活性に対するクロム（51Ｃｒ）遊離アッセイ
ＣＴＬ（エフェクター）活性を、個々のペプチドを負荷したＴ２細胞（標的）、及び標的細胞として多くの腫瘍細胞株も用いた標準的なクロム（51Ｃｒ）遊離アッセイにより測定した（Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９６８ Ｆｅｂ；１４（２）：１８１〜９６）。用量反応を起こすために、１：５で連続希釈したＣＴＬ（エフェクター）を用いると、エフェクター（Ｅ）標的（Ｔ）比（Ｅ／Ｔ）の最高値は５０：１であった。評価の前に、標的細胞（３×１０6個細胞／４％ ＦＣＳを含む１×ＰＢＳ １００μＬにおけるＴ２細胞）を、１００μＬの51Ｃｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることにより、標識した。インキュベート後、２．５％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１×Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識標的細胞を４回洗浄し、４℃において１２００〜１５００ｒｐｍで８分間回転し、１５ｍＬの新しいＭＬＲ培地（１０％ＦＣＳ、１％グルタミン（Glutamin）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％ ＨＥＰＥＳ、及び１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を含むＲＰＭＩ−１６４０）に再懸濁した。標識Ｔ２細胞の最終濃度は０．２×１０6個細胞／ｍＬであった。評価前に、１０μＭの個々のペプチドを用いて室温（Ｒ．Ｔ．）で３０分間標識Ｔ２細胞を負荷した。評価を開始するため、１００μＬのＣＴＬ（開始時濃度５×１０6個細胞／ｍＬ）を、丸底９６ウェルプレート内でＭＬＲ培地を用いて１：５に段階的に希釈し、各エフェクター細胞濃度について２回反復とした。１００μＬの異なる希釈段階のＣＴＬを含む各ウェルに、５０μＬのＫ−５６２細胞（４×１０6個細胞／ｍＬ）（ＡＴＣＣ（登録商標）番号：ＣＣＬ−２４３（商標））及び５０μＬのペプチド負荷51Ｃｒ標識Ｔ２標的細胞（０．２×１０6個細胞／ｍＬ）を加えた。プレートを３７℃、５％ ＣＯ2で４時間インキュベートし、次いで９００ｒｐｍで５分間回転し、各ウェルの上清１００μＬを51Ｃｒ計数用チューブに移し、カウントした。
【００９２】
51Ｃｒ遊離アッセイにより、９種のペプチド（Ｐ１、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１７、及びＰ２３）が２人の正常ドナー（ドナー１及びドナー２）においてＣＴＬを誘導することが示された（それぞれ図３及び図４）。３種のペプチド（Ｐ３、Ｐ１３、及びＰ１４）の組み合わせ１種を用いて別のドナー（ドナー１６）由来のＣＴＬを生成し、個々のペプチド又はペプチド混合物を負荷したＴ２細胞に対する殺細胞能を試験した（図５）。
【００９３】
続いて２４種のペプチドを用いて更なるドナー由来のＣＴＬを生成し、各ペプチドから生成されたＣＴＬの相対活性を、強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）、又は未測定（ｎ．ｄ．）として特徴付けた。各ペプチドのＣＴＬ生成に用いたドナーの総数に対する各レベルの活性を引き起こしたドナーの数の割合として、ＣＴＬ活性を決定した（表５）。
【００９４】
表５
標的細胞として個々のペプチドを負荷したＴ２細胞を用いた51Ｃｒ遊離アッセイにおけるＣＴＬ活性ＣＴＬ活性を強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）、又は未測定（ｎ．ｄ．）として特徴付け、各ペプチドのＣＴＬ生成に用いたドナーの総数に対する各レベルの活性を引き起こしたドナーの数の割合として、ＣＴＬ活性を決定した。
【００９５】
【表５】
【００９６】
更なるＣＴＬも産生し、かつＰ３、Ｐ１３、及びＰ１４ペプチドの切断バージョン（表６）、及び完全長タンパク質により同定される元のペプチド配列中のＨＬＡ結合モチーフ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２ Ｄｅｃ １；１４９（１１）：３５８０〜７）の探索により得られた、コンピュータ予測されたペプチド（表７）を用いて試験した。切断されたペプチド及びコンピュータ予測されたペプチドを合成し、ＨＬＡ−Ａ２安定化評価法で試験し、ＣＴＬを生成して51Ｃｒ遊離アッセイで試験した。ＨＬＡ−Ａ２安定化評価法における結合活性は、強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）、又は未測定（ｎ．ｄ．）と特徴付けし、また51Ｃｒ遊離アッセイにおけるＣＴＬ活性も、強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）、又は未測定（ｎ．ｄ．）と特徴付けた。Ｐ３の切断ペプチド（Ｐ３−８）（図４Ａ）、Ｐ１３の切断ペプチド（Ｐ１３−１３）（表６Ｂ）、Ｐ１４の切断ペプチド（Ｐ１４−１４及びＰ１４−１５）（表６Ｃ）、及びコンピュータ予測されたペプチド（Ｐ３−９、Ｐ３−１１、Ｐ１３−１７、Ｐ１３−１８、及びＰ１４−１９）（表７）は、正常なドナーにおいてＣＴＬの誘導が可能であった。
【００９７】
表６
ペプチドの切断バージョン、Ｐ３（Ａ）、Ｐ１３（Ｂ）、及びＰ１４（Ｃ）で生成されたＣＴＬに対する、標的細胞として個々のペプチドを負荷したＴ２細胞を用いる51Ｃｒ遊離アッセイにおけるＨＬＡ−Ａ２結合親和性及びＣＴＬ活性。ＨＬＡ−Ａ２結合親和性及びＣＴＬ活性を強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）、又は未測定（ｎ．ｄ．）として特徴付けた。
【００９８】
【表６】
【００９９】
表７
標的細胞として、完全長タンパク質により同定される元のペプチド配列中のＨＬＡ結合モチーフの探索により得られたコンピュータ予測されたペプチドを負荷したＴ２細胞を用いる51Ｃｒ遊離アッセイにおけるＨＬＡ−Ａ２結合親和性及びＣＴＬ活性。ＨＬＡ−Ａ２結合親和性及びＣＴＬ活性を強（Ｓ）、中（Ｍ）、弱（Ｗ）、なし（Ｎ）、又は未測定（ｎ．ｄ．）として特徴付けた。
【０１００】
【表７】
【０１０１】
更に、４種の異なる腫瘍細胞株、Ｕ２６６（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１９６）、ＩＦＮ−α処理したＵ２６６、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８０８３、及びＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１４８４（図６）に対する殺細胞能について、３種の異なるペプチド（Ｐ３、Ｐ１３、及びＰ１４）の組み合わせにより生成したＣＴＬを試験した。３種の異なるペプチドの組み合わせにより生成されたＣＴＬは、細胞株Ｕ２６６、ＩＦＮ−α処理したＵ２６６、及びＣＣＬ−８０８３を死滅させたが、ＣＣＬ−１４８４を死滅させなかった。細胞株ＣＣＬ−１４８４はＭＸ−１及びＤＮＭＬ−１を発現しているが、ＭＨＣクラスＩを発現しておらず、これによりＣＴＬによる殺細胞はＭＨＣ依存性であることが示される。
【０１０２】
細胞可溶化物のウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングを用い、それぞれ２種の同定されたペプチドＰ１４及びＰ１３に対応する、２種のタンパク質、インターフェロン誘導型ＭＸタンパク質（ＭＸ１）及びダイナミン１様タンパク質（ＤＮＭ１Ｌ）の発現を定量した。ヤギ抗ヒトＭＸ１ポリクローナル抗体（カタログ番号ｓｃ−３４１２８）及びロバ抗ヤギＡｐ結合抗体をＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。マウス抗ヒトＤＮＭ１Ｌポリクローナル抗体（カタログ番号ＮＢ１１０−５５２３７）及び抗マウスＡＰ結合抗体をＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入した。細胞可溶化物を新たに培養された細胞から作製した。簡潔に言うと、細胞を採取して１×ＰＢＳで３回洗浄し、細胞ペレットを溶解用緩衝液（ＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｍ細胞溶解試薬、Ｓｉｇｍａ、Ｃ２９７８−５０、１×１０8個細胞／ｍＬ）に再懸濁し、４℃で１時間回転した。可溶化物を遠心分離により澄明にし、細胞可溶化物中のタンパク質濃度をＢＣＡ法で測定した。３μｇの細胞可溶化物を１０〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜に転写した。抗ＭＸ１及び抗ＤＮＭ１Ｌ抗体を用いてブロットを精査し、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＷＢ７１０４）を用いて検出した。ウェスタンブロッティングの結果により、ＭＸ１はほとんどの腫瘍細胞で発現しており、細胞のＩＦＮα処理後に発現が上昇することが示された。正常なヒトドナー由来のＰＢＭＣでは、ＭＸ１の発現は検出されなかった。ウェスタンブロッティングにより、ＤＮＭ１Ｌが全ての細胞種で発現していることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔリンパ球を活性化可能な合成ペプチドであって、該合成ペプチドが、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、該活性化Ｔリンパ球が多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である、合成ペプチド。
【請求項２】
Ｔリンパ球を活性化可能な少なくとも１つの抗原ペプチドを含む組成物であって、該抗原ペプチドが、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、該活性化Ｔリンパ球が多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である、組成物。
【請求項３】
多発性骨髄腫と診断された患者に投与するための活性化Ｔリンパ球を作製する方法であって、該方法が、
（ａ）抗原ペプチド負荷ショウジョウバエ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、少なくとも１つの抗原ペプチドをショウジョウバエａＡＰＣに負荷することにより調製する工程であって、該抗原ペプチドが、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む工程と、
（ｂ）前記患者からＴリンパ球を単離する工程と、
（ｃ）該Ｔリンパ球を該抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣと接触させる工程と、
（ｄ）活性化Ｔリンパ球を生成する工程であって、該活性化Ｔリンパ球が多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である工程と、
（ｅ）前記患者に戻し投与するために該活性化Ｔリンパ球を回収する工程とを含む、方法。
【請求項４】
前記回収工程で回収された有効量の活性化Ｔリンパ球を前記患者に投与する工程を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの抗原ペプチドが２つ以上の抗原ペプチドの混合物である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記２つ以上の抗原ペプチドの混合物が、配列番号：３、配列番号：１３、及び配列番号：１４を含有する組成物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化Ｔリンパ球を再刺激する工程を更に含み、前記再刺激手順が、
（ａ）前記活性化Ｔリンパ球を、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−ｇ、及びＴＮＦ−αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインと接触させ、これにより活性化Ｔ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進する工程と、
（ｂ）前記活性化Ｔ細胞を、照射した自己非ＣＤ８＋細胞、接着性非ＣＤ８＋細胞、又は抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣとインキュベートし、これにより再刺激された活性化Ｔリンパ球を生成する工程とを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記再刺激手順が、
（ａ）前記活性化Ｔリンパ球を、ＩＬ−２と、ＩＬ−７、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１からなる群から選択される少なくとも１つの別のサイトカインとの組み合わせと接触させ、これにより活性化Ｔ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進する工程と、
（ｂ）前記活性化Ｔ細胞を、照射した自己非ＣＤ８＋細胞、接着性非ＣＤ８＋細胞、又は抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣとインキュベートし、これにより再刺激された活性化Ｔリンパ球を生成する工程とを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記再刺激手順が、濃度１〜１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２；濃度１〜１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−７、濃度１〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５及び濃度１〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１の存在下で、前記活性化Ｔリンパ球を抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣと接触させる工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１】
Ｔリンパ球を活性化可能な合成ペプチドであって、該合成ペプチドが、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、該活性化Ｔリンパ球が多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である、合成ペプチド。
【請求項２】
Ｔリンパ球を活性化可能な少なくとも１つの抗原ペプチドを含む組成物であって、該抗原ペプチドが、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、該活性化Ｔリンパ球が多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である、組成物。
【請求項３】
多発性骨髄腫と診断された患者に投与するための活性化Ｔリンパ球を作製する方法であって、該方法が、
（ａ）抗原ペプチド負荷ショウジョウバエ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を、少なくとも１つの抗原ペプチドをショウジョウバエａＡＰＣに負荷することにより調製する工程であって、該抗原ペプチドが、ＳＬＶＬＮＬＬＥＬ（配列番号：３）、ＫＮＰＶＬＬＫＩＬ（配列番号：７）、ＮＬＬＰＫＬＨＶＶ（配列番号：９）、ＦＬＬＰＨＰＧＬＱＶ（配列番号：１０）、ＬＬＮＭＰＰＡＨＬＫ（配列番号：１１）、ＴＬＶＤＬＰＧＭＴＫＶ（配列番号：１３）、ＴＬＩＤＬＰＧＩＴＲＶ（配列番号：１４）、ＬＳＬＤＳＳＬＳＳＬＬ（配列番号：１７）、ＬＬＬＤＶＡＹＧＡＶＱＡ（配列番号：２２）、ＦＬＡＳＥＳＬＬＫＧＡＬ（配列番号：２３）、ＬＶＬＮＬＬＥ（配列番号：３２）、ＴＬＶＤＬＰＧＭ（配列番号：４０）、ＩＤＬＰＧＩＴＲ（配列番号：６１）、ＷＬＴＶＬＦＩＦＲＩ（配列番号：６６）、ＬＶＹＬＧＨＶＩＹＬ（配列番号：６７）、ＦＶＰＥＶＳＦＥＬ（配列番号：７０）、及びＦＱＭＥＱＩＶＹＣ（配列番号：７２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む工程と、
（ｂ）前記患者からＴリンパ球を単離する工程と、
（ｃ）該Ｔリンパ球を該抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣと接触させる工程と、
（ｄ）活性化Ｔリンパ球を生成する工程であって、該活性化Ｔリンパ球が多発性骨髄腫癌細胞に対して細胞傷害性である工程と、
（ｅ）前記患者に戻し投与するために該活性化Ｔリンパ球を回収する工程とを含む、方法。
【請求項４】
前記回収工程で回収された有効量の活性化Ｔリンパ球を前記患者に投与する工程を更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの抗原ペプチドが２つ以上の抗原ペプチドの混合物である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記２つ以上の抗原ペプチドの混合物が、配列番号：３、配列番号：１３、及び配列番号：１４を含有する組成物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化Ｔリンパ球を再刺激する工程を更に含み、前記再刺激手順が、
（ａ）前記活性化Ｔリンパ球を、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−ｇ、及びＴＮＦ−αからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインと接触させ、これにより活性化Ｔ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進する工程と、
（ｂ）前記活性化Ｔ細胞を、照射した自己非ＣＤ８＋細胞、接着性非ＣＤ８＋細胞、又は抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣとインキュベートし、これにより再刺激された活性化Ｔリンパ球を生成する工程とを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記再刺激手順が、
（ａ）前記活性化Ｔリンパ球を、ＩＬ−２と、ＩＬ−７、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１からなる群から選択される少なくとも１つの別のサイトカインとの組み合わせと接触させ、これにより活性化Ｔ細胞の成長、増殖、及び／又は分化を促進する工程と、
（ｂ）前記活性化Ｔ細胞を、照射した自己非ＣＤ８＋細胞、接着性非ＣＤ８＋細胞、又は抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣとインキュベートし、これにより再刺激された活性化Ｔリンパ球を生成する工程とを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記再刺激手順が、濃度１〜１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２；濃度１〜１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−７、濃度１〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５及び濃度１〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１の存在下で、前記活性化Ｔリンパ球を抗原ペプチド負荷ショウジョウバエａＡＰＣと接触させる工程を含む、請求項８に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５０５２９６（Ｐ２０１３−５０５２９６Ａ）
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３０９５５（Ｐ２０１２−５３０９５５）
【出願日】平成２２年９月２０日（２０１０．９．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４９４６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３７８５９
【国際公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（３９７０６０１７５）ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． (28)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２０日（２０１０．９．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４９４６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３７８５９
【国際公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【出願人】（３９７０６０１７５）ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． (28)
【Ｆターム（参考）】
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