多糖類の製造方法
【課題】多糖類の加水分解を抑制でき、長期保存に適した多糖類の製造方法を提供すること。
【解決手段】
（１）多糖類を産生する微生物を培養することにより、多糖類を製造する工程、及び（２）培養終了後に、培養液と培養槽の気相部とをそれぞれ熱処理する工程を含む多糖類の製造方法。
本発明によれば、培養槽内で培養液と気相部を同時に熱処理することにより多糖類の加水分解を抑制でき、長期保存に適した多糖類を製造することができる。
【解決手段】
（１）多糖類を産生する微生物を培養することにより、多糖類を製造する工程、及び（２）培養終了後に、培養液と培養槽の気相部とをそれぞれ熱処理する工程を含む多糖類の製造方法。
本発明によれば、培養槽内で培養液と気相部を同時に熱処理することにより多糖類の加水分解を抑制でき、長期保存に適した多糖類を製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は菌の体外に多糖類を生産することが知られており、菌の種類によって多種多様な多糖類を生産する。このような多糖類は、様々な物理化学的性質や生理機能を有していることから、食品、化粧品、医療等幅広い用途で用いられており、生産性を上げるための研究が盛んになされている。なかでも、ヒアルロン酸は、医療用途（例えば、関節炎治療剤等）、化粧品用途（例えば、保湿剤等）、食品用途等、幅広く使用され、使用目的によって様々な平均分子量のものが求められている。
ヒアルロン酸は、一定の品質の製品が容易に得られることから、多くの場合、醗酵法によって製造されている。醗酵法によってヒアルロン酸を製造する場合には、薬剤等を用いて使用する微生物が本来有するヒアルロン酸分解酵素（ヒアルロニダーゼ）を発現し難いようにした変異株を培養することにより、平均分子量の大きいヒアルロン酸を取得することができる（特許文献１〜３参照）。
また、分子量低下を抑制して高分子量の製品を得る方法としては、培養液から速やかに菌体を除去する方法、例えば、培養液を希釈して濾過により菌体を除去する方法（特許文献４参照）、培養液を１０℃以下に冷却し、遠心分離により菌体を除去する方法（特許文献５参照）が知られている。
しかしながら、上記方法は、大量の培養液を速やかに処理することができる精製設備を保有している場合は可能であるが、醗酵設備に対して精製設備の能力が劣る場合には、分割して精製を強いられるので培養液を長期保存せざるを得ない。この場合、微生物の作用により、保存中に分子量低下を招き、安定的に高分子量のヒアルロン酸を得ることができない。
このような現象に対して、培養液を熱処理することにより微生物を死滅化して分子量低下を抑制する方法も知られている。例えば、醗酵液のｐＨを５．０に調整し、次いで９０℃の温度で２０分間加熱する方法（特許文献６参照）が知られている。
しかしながら、当該方法では、熱処理温度が高いために熱処理中にヒアルロン酸の加水分解が起こり、平均分子量の著しい低下を招いてしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特公平０４−６３５６号公報
【特許文献２】特公平０４−４３６３７号公報
【特許文献３】特許第２５４７９６５号公報
【特許文献４】特開平１−６７１９６号公報
【特許文献５】特許第３６３２１９７号公報
【特許文献６】特許第２５７１９０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明の主な目的は、多糖類の加水分解を抑制でき、長期保存に適した多糖類の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、乳酸菌の培養液を醗酵槽で熱処理する際、別途、醗酵槽の気相部も熱処理することにより上記課題を達成することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、（１）多糖類を産生する微生物を培養することにより、多糖類を製造する工程、及び（２）培養終了後に、培養液と培養槽の気相部とをそれぞれ熱処理する工程を含む、多糖類の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、多糖類の加水分解を抑制でき、長期保存に適した多糖類を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（１）乳酸菌及び乳酸菌由来の多糖類
本発明における乳酸菌とは、通常の培養により菌体外に多糖類を生産することができる乳酸菌のことである。当該乳酸菌は多糖生産能を有していれば種類は限定されない。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属に属する微生物、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物等を挙げることができる。
乳酸菌の生産する乳酸菌由来の多糖類には、単一の糖からなるホモ多糖と、複数の単糖や単糖誘導体からなるヘテロ多糖がある。ホモ多糖には、グルコースからなるデキストラン、βグルカン、ムタン、アルテルナン；フルクトースからなるレバン、イヌリン；ガラクトースからなるガラクタン等が知られている。
デキストランを生産する乳酸菌としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｆｕｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｏｄｅｓ等、βグルカン生産乳酸菌としては、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｍｎｏｓｕｓ等、ムタン生産乳酸菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｕｓ等、アルテルナン生産菌としては、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｏｄｅｓ等、レバン生産乳酸菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ等、イヌリン生産乳酸菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎ等、ガラクタン生産乳酸菌としては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ等が挙げられる。
ヘテロ多糖は、単糖のグルコース、ガラクトース、ラムノース、フコース、糖誘導体であるＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルクロン酸などが少なくとも２種類以上で構成されるユニットが連なったものである。
代表的なヘテロ多糖としては、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸からなるヒアルロン酸、グルコースとガラクトースからなるケフィランが挙げられる。ヒアルロン酸生産乳酸菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等、ケフィラン生産乳酸菌としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ等が挙げられる。
ヘテロ多糖生産菌としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ等が挙げられる。
本明細書では、これらの多糖類のうち、代表してヒアルロン酸について述べる。
（２）ヒアルロン酸生産能を有する微生物
本発明では、ヒアルロン酸生産能を有する微生物としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物が好ましい。ヒアルロン酸生産能を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物は、一般に牛鼻腔粘膜、牛眼球に存在していることが知られている。本発明ではそこから単離された微生物を利用することもできる。また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属しない微生物でも、通常の遺伝子工学的手法を用いてヒアルロン酸生産能を得た微生物も使用することができる。
【０００８】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｓ等が挙げられる。その中でも、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓがより好ましい。
【０００９】
さらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の属する微生物等のヒアルロン酸生産能を有する微生物を、紫外線、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、メチルメタンスルホン酸等で処理することにより、ヒアルロニダーゼ非生産菌や非溶血性菌に改良することがより好ましい。人体または動物に悪影響を及ぼす可能性が低くなるからである。
【００１０】
前記ヒアルロニダーゼ活性及び溶血性を欠損させた菌株としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＮＨ−１３１（ＦＥＲＭ Ｐ−７５８０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＨＡ−１１６（ＡＴＣＣ３９９２０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＭＫ５（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４８７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＹＴＴ２０３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３０５）が好ましく、その中でもＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＭＫ５（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４８７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＹＴＴ２０３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３０５）が特に好ましい。
【００１１】
これらのうち、ＦＥＲＭ株については、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターより入手可能である。また、ＡＴＣＣ株については、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
（３）微生物の培養
培地は、上記微生物がヒアルロン酸を生産できる培地であれば限定されず、微生物の種類に応じた公知の培地を用いることができる。例えば、炭素源としてグルコース、フルクトース等の単糖類、乳糖、スクロース、マルトース等の二糖類、オリゴ糖類等；窒素源としてポリペプトン、酵母エキス等の有機窒素源；アルギニン、グルタミン酸、グルタミン等の遊離アミノ酸；ビタミン；無機塩類等；タンニン等のフェノール性水酸基を有するヒアルロニダーゼ阻害剤を含む（水に溶解した）培地を使用することができる。
【００１２】
当該培地は、加熱処理（加熱殺菌）を行った後に、微生物の培養に用いることができる。微生物が完全に殺菌されれば、加熱条件は限定されない。例えば、１００〜１３０℃で５〜３０分間、より好ましくは１２１℃〜１２５℃で１５〜３０分間という条件を挙げることができる。また、一部若しくは全部の成分を精密濾過による非加熱滅菌することにより使用することができる。
微生物の培養は、上記のようにして得られた培地に植菌すればよい。植菌する際の微生物の濃度は限定されず、例えば０．１〜１０（ｖ／ｖ）％、好ましくは０．２〜５（ｖ／ｖ）％、より好ましくは１（ｖ／ｖ）％程度とすればよい。
培養条件も限定されるものではないが、ｐＨを約６〜８、好ましくはｐＨを約７〜７．５、温度を３０〜４０℃程度、より好ましくは３３〜３７℃程度に制御して、好気的に培養すればよい。このようにして、微生物を培養することにより微生物がヒアルロン酸を産生し、培地中にヒアルロン酸が蓄積される。また、培養時間も限定されず、培養液の量、所望のヒアルロン酸の量に応じて適宜選択することができる。
また、前記の培養（本培養）は、必要に応じて、前培養を行った後に行うこともできる。前培養の方法も限定されず、公知の方法で行えばよい。例えば、グルコース、フルクトース等の炭素源、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス等の窒素源、ビタミン、無機塩類を含む培地中で、ｐＨを４〜８、温度を３０〜３７℃に制御して好気的に培養することが好ましい。
（４）熱処理
培養終了後、培養液と培養槽の気相部とに対してそれぞれ熱処理を行う。ここで、「気相部」とは培養槽（微生物を培養するタンク）において液体（培地等）が占める部分を除いた気体や水蒸気等が占める部分をいう。
通常、培養の規模が大きくない（小さな装置を用いた）場合には、培養装置中の培養液を加熱することにより気相部も同時に加熱することができる。しかしながら、培養の規模が大きい場合には、培養液を加熱しただけでは気相部が十分に加熱されなかったり、外気の影響を受けて気相部が均一に十分に加熱されなかったりする。一方で、気相部も十分に加熱しようとした場合、培養液を必要以上に高温で加熱する必要があるために、培養液を加熱しすぎるために得られた多糖類が分解されてしまう。
そこで、本発明では、培養液と培養槽の気相部とをそれぞれ（別々に）加熱処理することにより、培養液中の多糖類の分解を十分に抑制し、且つ、培養液と培養槽の気相部とを十分に熱処理することができるので、長期保存に適した多糖類を製造することができる。
本明細書において、培養液と培養槽の気相部とをそれぞれ加熱するとは、培養液と培養槽の気相部とを別々に加熱することを意味する。すなわち、発酵液を加熱することにより発生した熱で発酵槽の気相部が加熱されたり、発酵槽の気相部を加熱することによって発生した熱で発酵液が加熱されたりすることは除かれる。
培養液と気相部の加熱は同じ方法で行ってもよく、異なる方法で行ってもよい。また、これらの加熱は同時に始めてもよく、加熱開始時間が異なっていてもよい。
培養液の熱処理
培養終了後、培養液は、ジャケット付き培養槽を用いた場合にはジャケットにスチームを供給して加熱する。また、内部コイル付き培養槽を用いた場合には内部コイルにスチームを供給して培養液を加熱する。
熱処理温度は、微生物が死滅化し、且つ、ヒアルロン酸の分解が抑制される５０〜７０℃とすればよい。好ましくは５５〜６５℃である。当該熱処理温度を維持する時間は、１分から３時間、より好ましくは１０分から１時間、さらに好ましくは２０分から４０分という条件を挙げることができる。
【００１３】
熱処理終了後は、スチーム供給を停止し、ジャケット又は内部コイルに冷却水を供給し、且つ、スパージャーから空気を供給して培養液を室温まで冷却すればよい。自然冷却も可能であるが、この方法により培養液を早めに冷却することにより、培養液の腐敗などを抑制することができるので好ましい。
【００１４】
気相部の熱処理
培養終了後、気相部は、気相部にスチームを供給できる配管、例えば、植菌用の配管から気相部にスチームを供給して加熱する。
【００１５】
熱処理温度は、培養中に気相部内壁、攪拌軸、バッフル、植菌用配管等に飛散した培養液中で繁殖した微生物が死滅化し、且つ、培養液の温度が過剰に上昇しない５０〜７５℃とすればよい。好ましくは５５〜７０℃である。熱処理温度を維持する時間は、１分から３時間、より好ましくは１０分から１時間、さらに好ましくは２０分から４０分という条件を挙げることができる。熱処理終了後は、スチーム供給を停止し、スパージャーから供給した空気により室温まで冷却すればよい。
【００１６】
このようにして得られたヒアルロン酸は、培養液が十分に滅菌されており、且つ、気相部も十分に滅菌されている。従って、培養槽が冷えた時に、気相部内壁等に付着していた凝縮水又は水滴が培養液に落下しても、培養槽中で菌が生存又は増殖することはなく、当該培養液を長期保存してもヒアルロン酸が加水分解されて分子量が低下するという問題は生じない。
【００１７】
（５）その他
このようにして得られたヒアルロン酸は、公知の方法により精製等を行うことができる。例えば、培地を必要に応じて（好ましくは、ヒアルロン酸濃度が０．１〜５ｇ／Ｌになるように）希釈した後、例えば遠心分離、濾過、カーボン、セライト、パーライト等を用いて菌体を除去し、菌体を除去した培地を活性炭と接触させればよい。
【００１８】
得られたヒアルロン酸の平均分子量は、公知の方法により求めることができる。例えば、極限粘度測定法、分子量既知のプルランを用いたＧＰＣ液クロ（示差屈折計）による相対分子量測定法、ＧＰＣ液クロ（示差屈折計）と光散乱検出器の組み合わせによる絶対分子量測定法等を使用することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例、比較例及び参考例により本発明をさらに詳細に説明する。
＜実施例１＞
〔工程１〕ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４８７）の培養
グルコース６（ｗ／ｖ）％、ポリペプトン−Ｎ（大日本製薬株式会社製）１．５（ｗ／ｖ）％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）０．５％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１（ｗ／ｖ）％、リン酸水素２ナトリウム０．０５（ｗ／ｖ）％、グルタミン酸ナトリウム０．０５（ｗ／ｖ）％、アデカプルロニックＬ−６１（旭電化工業製）０．０１（ｗ／ｖ）％の組成の培地を１０００Ｌのジャーファーメンター（株式会社丸菱製）に５００Ｌ入れ、ジャケットにスチームを供給して１２１℃、２０分間滅菌した。尚、グルコースは１２１℃、２０分間別滅菌して、培養開始時に一度に添加した。
前培養した該菌を１（ｖ／ｖ）％接種し、２７（ｗ／ｖ）％水酸化ナトリウムにてｐＨを７．４に連続的に制御しながら温度３７℃、攪拌数５０ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍで２４時間通気攪拌培養した。攪拌翼は、直径６０ｍｍの門型攪拌翼（醗酵槽内径との比Ｌ／Ｄ＝０．５）を使用した。
なお、前培養は、グルコース０．２質量％、ポリペプトン２．０質量％、酵母エキス０．５質量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５質量％の組成からなる培地（ｐＨ７．０）を綿栓付き５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ添加し、加熱殺菌後、同一組成の寒天プレート上に形成したストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４８７）のコロニーを一白菌耳植菌し、３０℃で１８時間培養することにより行った。
〔工程２〕培養液及び気相部の熱処理
培養終了後、攪拌のみ継続しながら、ジャーファーメンター外面の下部から上部に掛けて約６割を覆っているジャケットにスチームを供給し、約２０分掛けて培養液の温度が６０℃に到達した時点でジャケットへのスチーム供給を停止した。同時に、気相部には植菌ラインからスチームを供給し、約２０分掛けて気相部の温度が７０℃になったところで気相部へのスチーム供給を停止した。スチーム停止後３０分間この状態を維持した。余熱で培養液温度は６２℃を、気相部温度は７０℃を維持した。次に、ジャケットに冷却水を供給して約１．５時間掛けて培養液温度を２０℃まで冷却した。この状態を２０時間維持した。
〔工程３〕培養液の処理
（イ）前記工程２で熱処理した培養液（ヒアルロン酸含有液）を、イオン交換水を用いて１０倍に希釈し、その２．５Ｌ水溶液のｐＨを４に調整後、活性炭（武田薬品社製の白鷺ＲＷ５０−Ｔ）を５ｇ、パーライト（三井金属鉱業株式会社のロカヘルプ♯４０９）を３０ｇ添加して、１時間処理し、ヌッチェを用いて濾過した。
（ロ）前記工程２で熱処理した培養液（ヒアルロン酸含有液）を、２５℃で２週間保存した。その後、イオン交換水を用いて１０倍に希釈し、その２．５Ｌ水溶液のｐＨを４に調整後、活性炭（武田薬品社製の白鷺ＲＷ５０−Ｔ）を５ｇ、パーライト（三井金属鉱業株式会社のロカヘルプ♯４０９）を３０ｇ添加して、１時間処理し、ヌッチェを用いて濾過した。
〔工程４〕ヒアルロン酸ナトリウム結晶の取得
前記工程２で調整したヒアルロン酸含有液各１Ｌに、食塩３ｇを溶解、ｐＨ７に調整後、２−プロパノール６Ｌで析出を行い、４０℃で真空乾燥し、０．５ｇのヒアルロン酸ナトリウム結晶を得た。
【００２０】
〔試験例１〕生菌数の測定
（Ｉ）寒天プレート作製
グルコース１（ｗ／ｖ）％、ポリペプトン−Ｎ（大日本製薬株式会社製）０．５（ｗ／ｖ）％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）０．３％、麦芽エキス（オリエンタル酵母工業製）０．３％、寒天２（ｗ／ｖ）％、ｐH７．２に調整した培地を、１２１℃、２０分間オートクレブした。寒天が固結しない内に、クリーンベンチ内でシャーレに各２０ｍｌ分注して固結させ寒天プレートを作製した。
（ＩＩ）シャーレの培養
熱処理前の培養液は、滅菌した生理食塩水で１０億倍に希釈し、その０．１ｍｌを寒天表面に注ぎ、コンラージ棒で均一に塗布した。
【００２１】
熱処理後の培養液は、滅菌した生理食塩水で１０倍に希釈し、その１ｍｌを寒天表面に注ぎ、コンラージ棒で均一に塗布した。さらに、原液１ｍｌを寒天培地に注ぎ、コンラージ棒で均一に塗布した。
【００２２】
塗布後のシャーレは、３０℃のふ卵器に入れて、４８時間培養した。培養後、シャーレに形成されたコロニーを計測して（肉眼で数えた）生菌数を測定した。結果を表１に示した。
【００２３】
〔試験例２〕ヒアルロン酸平均分子量の測定
ヒアルロン酸ナトリウム結晶約４ｍｇを純水５ｍｌに溶解し、分析用サンプルとしてＧＰＣカラムを用いた液体クロマトグラフィ−（島津製作所社製）により相対平均分子量を算出した。
（i）使用機器
島津高速液体クロマトグラフＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅＧＰＣシステム
システムコントローラ：ＣＢＭ−２０Ａ
液送ユニット：ＬＣ−２０ＡＤ
オンラインデガッサ：ＤＧＵ−２０Ａ３
オートサンプラ：ＳＩＬ−２０ＡＣ
カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ
示差屈折率検出器：ＲＩＤ−１０Ａ
ＬＣワークステーション：ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖｅｒ．１．２４ＳＰ１＋
（ii）分析条件
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ｏｈｐａｋ ＳＢ−８０６Ｍ ＨＱ
ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ｏｈｐａｋ ＳＰ−Ｇ
溶離液：５０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム水溶液
流量：１．００ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０．０℃
（iii）検量線作成用多糖類
平均分子量５９００、９６００、２１１００、４７１００、１０７０００、２０００００、３７５０００、７０８０００のプルラン（Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−８２ Ｌｏｔ Ｎｏ８１００１）を用いて検量線を作成した。
【００２４】
結果を表１に示した。
＜比較例１＞
培養液の熱処理時に気相部にスチームを供給しなかった以外は、実施例１と同様の操作を実施した。結果を表１に示した。
＜比較例２＞
培養液の熱処理温度を３５分掛けて７５℃に設定し、気相部にスチームを供給しなかった以外は、実施例１と同様の操作を実施した。結果を表１に示した。
＜参考例＞
培養液の熱処理をしなかった以外は、実施例１と同様の操作を実施した。結果を表１に示した。
【００２５】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は菌の体外に多糖類を生産することが知られており、菌の種類によって多種多様な多糖類を生産する。このような多糖類は、様々な物理化学的性質や生理機能を有していることから、食品、化粧品、医療等幅広い用途で用いられており、生産性を上げるための研究が盛んになされている。なかでも、ヒアルロン酸は、医療用途（例えば、関節炎治療剤等）、化粧品用途（例えば、保湿剤等）、食品用途等、幅広く使用され、使用目的によって様々な平均分子量のものが求められている。
ヒアルロン酸は、一定の品質の製品が容易に得られることから、多くの場合、醗酵法によって製造されている。醗酵法によってヒアルロン酸を製造する場合には、薬剤等を用いて使用する微生物が本来有するヒアルロン酸分解酵素（ヒアルロニダーゼ）を発現し難いようにした変異株を培養することにより、平均分子量の大きいヒアルロン酸を取得することができる（特許文献１〜３参照）。
また、分子量低下を抑制して高分子量の製品を得る方法としては、培養液から速やかに菌体を除去する方法、例えば、培養液を希釈して濾過により菌体を除去する方法（特許文献４参照）、培養液を１０℃以下に冷却し、遠心分離により菌体を除去する方法（特許文献５参照）が知られている。
しかしながら、上記方法は、大量の培養液を速やかに処理することができる精製設備を保有している場合は可能であるが、醗酵設備に対して精製設備の能力が劣る場合には、分割して精製を強いられるので培養液を長期保存せざるを得ない。この場合、微生物の作用により、保存中に分子量低下を招き、安定的に高分子量のヒアルロン酸を得ることができない。
このような現象に対して、培養液を熱処理することにより微生物を死滅化して分子量低下を抑制する方法も知られている。例えば、醗酵液のｐＨを５．０に調整し、次いで９０℃の温度で２０分間加熱する方法（特許文献６参照）が知られている。
しかしながら、当該方法では、熱処理温度が高いために熱処理中にヒアルロン酸の加水分解が起こり、平均分子量の著しい低下を招いてしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特公平０４−６３５６号公報
【特許文献２】特公平０４−４３６３７号公報
【特許文献３】特許第２５４７９６５号公報
【特許文献４】特開平１−６７１９６号公報
【特許文献５】特許第３６３２１９７号公報
【特許文献６】特許第２５７１９０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明の主な目的は、多糖類の加水分解を抑制でき、長期保存に適した多糖類の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、乳酸菌の培養液を醗酵槽で熱処理する際、別途、醗酵槽の気相部も熱処理することにより上記課題を達成することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、（１）多糖類を産生する微生物を培養することにより、多糖類を製造する工程、及び（２）培養終了後に、培養液と培養槽の気相部とをそれぞれ熱処理する工程を含む、多糖類の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、多糖類の加水分解を抑制でき、長期保存に適した多糖類を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（１）乳酸菌及び乳酸菌由来の多糖類
本発明における乳酸菌とは、通常の培養により菌体外に多糖類を生産することができる乳酸菌のことである。当該乳酸菌は多糖生産能を有していれば種類は限定されない。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属に属する微生物、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物等を挙げることができる。
乳酸菌の生産する乳酸菌由来の多糖類には、単一の糖からなるホモ多糖と、複数の単糖や単糖誘導体からなるヘテロ多糖がある。ホモ多糖には、グルコースからなるデキストラン、βグルカン、ムタン、アルテルナン；フルクトースからなるレバン、イヌリン；ガラクトースからなるガラクタン等が知られている。
デキストランを生産する乳酸菌としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｎｆｕｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｏｄｅｓ等、βグルカン生産乳酸菌としては、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｍｎｏｓｕｓ等、ムタン生産乳酸菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｕｓ等、アルテルナン生産菌としては、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｏｄｅｓ等、レバン生産乳酸菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ等、イヌリン生産乳酸菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎ等、ガラクタン生産乳酸菌としては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ等が挙げられる。
ヘテロ多糖は、単糖のグルコース、ガラクトース、ラムノース、フコース、糖誘導体であるＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グルクロン酸などが少なくとも２種類以上で構成されるユニットが連なったものである。
代表的なヘテロ多糖としては、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸からなるヒアルロン酸、グルコースとガラクトースからなるケフィランが挙げられる。ヒアルロン酸生産乳酸菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等、ケフィラン生産乳酸菌としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ等が挙げられる。
ヘテロ多糖生産菌としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ等が挙げられる。
本明細書では、これらの多糖類のうち、代表してヒアルロン酸について述べる。
（２）ヒアルロン酸生産能を有する微生物
本発明では、ヒアルロン酸生産能を有する微生物としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物が好ましい。ヒアルロン酸生産能を有するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物は、一般に牛鼻腔粘膜、牛眼球に存在していることが知られている。本発明ではそこから単離された微生物を利用することもできる。また、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属しない微生物でも、通常の遺伝子工学的手法を用いてヒアルロン酸生産能を得た微生物も使用することができる。
【０００８】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｓ等が挙げられる。その中でも、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓがより好ましい。
【０００９】
さらに、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の属する微生物等のヒアルロン酸生産能を有する微生物を、紫外線、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、メチルメタンスルホン酸等で処理することにより、ヒアルロニダーゼ非生産菌や非溶血性菌に改良することがより好ましい。人体または動物に悪影響を及ぼす可能性が低くなるからである。
【００１０】
前記ヒアルロニダーゼ活性及び溶血性を欠損させた菌株としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＮＨ−１３１（ＦＥＲＭ Ｐ−７５８０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＨＡ−１１６（ＡＴＣＣ３９９２０）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＭＫ５（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４８７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＹＴＴ２０３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３０５）が好ましく、その中でもＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＭＫ５（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４８７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＹＴＴ２０３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３０５）が特に好ましい。
【００１１】
これらのうち、ＦＥＲＭ株については、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターより入手可能である。また、ＡＴＣＣ株については、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
（３）微生物の培養
培地は、上記微生物がヒアルロン酸を生産できる培地であれば限定されず、微生物の種類に応じた公知の培地を用いることができる。例えば、炭素源としてグルコース、フルクトース等の単糖類、乳糖、スクロース、マルトース等の二糖類、オリゴ糖類等；窒素源としてポリペプトン、酵母エキス等の有機窒素源；アルギニン、グルタミン酸、グルタミン等の遊離アミノ酸；ビタミン；無機塩類等；タンニン等のフェノール性水酸基を有するヒアルロニダーゼ阻害剤を含む（水に溶解した）培地を使用することができる。
【００１２】
当該培地は、加熱処理（加熱殺菌）を行った後に、微生物の培養に用いることができる。微生物が完全に殺菌されれば、加熱条件は限定されない。例えば、１００〜１３０℃で５〜３０分間、より好ましくは１２１℃〜１２５℃で１５〜３０分間という条件を挙げることができる。また、一部若しくは全部の成分を精密濾過による非加熱滅菌することにより使用することができる。
微生物の培養は、上記のようにして得られた培地に植菌すればよい。植菌する際の微生物の濃度は限定されず、例えば０．１〜１０（ｖ／ｖ）％、好ましくは０．２〜５（ｖ／ｖ）％、より好ましくは１（ｖ／ｖ）％程度とすればよい。
培養条件も限定されるものではないが、ｐＨを約６〜８、好ましくはｐＨを約７〜７．５、温度を３０〜４０℃程度、より好ましくは３３〜３７℃程度に制御して、好気的に培養すればよい。このようにして、微生物を培養することにより微生物がヒアルロン酸を産生し、培地中にヒアルロン酸が蓄積される。また、培養時間も限定されず、培養液の量、所望のヒアルロン酸の量に応じて適宜選択することができる。
また、前記の培養（本培養）は、必要に応じて、前培養を行った後に行うこともできる。前培養の方法も限定されず、公知の方法で行えばよい。例えば、グルコース、フルクトース等の炭素源、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス等の窒素源、ビタミン、無機塩類を含む培地中で、ｐＨを４〜８、温度を３０〜３７℃に制御して好気的に培養することが好ましい。
（４）熱処理
培養終了後、培養液と培養槽の気相部とに対してそれぞれ熱処理を行う。ここで、「気相部」とは培養槽（微生物を培養するタンク）において液体（培地等）が占める部分を除いた気体や水蒸気等が占める部分をいう。
通常、培養の規模が大きくない（小さな装置を用いた）場合には、培養装置中の培養液を加熱することにより気相部も同時に加熱することができる。しかしながら、培養の規模が大きい場合には、培養液を加熱しただけでは気相部が十分に加熱されなかったり、外気の影響を受けて気相部が均一に十分に加熱されなかったりする。一方で、気相部も十分に加熱しようとした場合、培養液を必要以上に高温で加熱する必要があるために、培養液を加熱しすぎるために得られた多糖類が分解されてしまう。
そこで、本発明では、培養液と培養槽の気相部とをそれぞれ（別々に）加熱処理することにより、培養液中の多糖類の分解を十分に抑制し、且つ、培養液と培養槽の気相部とを十分に熱処理することができるので、長期保存に適した多糖類を製造することができる。
本明細書において、培養液と培養槽の気相部とをそれぞれ加熱するとは、培養液と培養槽の気相部とを別々に加熱することを意味する。すなわち、発酵液を加熱することにより発生した熱で発酵槽の気相部が加熱されたり、発酵槽の気相部を加熱することによって発生した熱で発酵液が加熱されたりすることは除かれる。
培養液と気相部の加熱は同じ方法で行ってもよく、異なる方法で行ってもよい。また、これらの加熱は同時に始めてもよく、加熱開始時間が異なっていてもよい。
培養液の熱処理
培養終了後、培養液は、ジャケット付き培養槽を用いた場合にはジャケットにスチームを供給して加熱する。また、内部コイル付き培養槽を用いた場合には内部コイルにスチームを供給して培養液を加熱する。
熱処理温度は、微生物が死滅化し、且つ、ヒアルロン酸の分解が抑制される５０〜７０℃とすればよい。好ましくは５５〜６５℃である。当該熱処理温度を維持する時間は、１分から３時間、より好ましくは１０分から１時間、さらに好ましくは２０分から４０分という条件を挙げることができる。
【００１３】
熱処理終了後は、スチーム供給を停止し、ジャケット又は内部コイルに冷却水を供給し、且つ、スパージャーから空気を供給して培養液を室温まで冷却すればよい。自然冷却も可能であるが、この方法により培養液を早めに冷却することにより、培養液の腐敗などを抑制することができるので好ましい。
【００１４】
気相部の熱処理
培養終了後、気相部は、気相部にスチームを供給できる配管、例えば、植菌用の配管から気相部にスチームを供給して加熱する。
【００１５】
熱処理温度は、培養中に気相部内壁、攪拌軸、バッフル、植菌用配管等に飛散した培養液中で繁殖した微生物が死滅化し、且つ、培養液の温度が過剰に上昇しない５０〜７５℃とすればよい。好ましくは５５〜７０℃である。熱処理温度を維持する時間は、１分から３時間、より好ましくは１０分から１時間、さらに好ましくは２０分から４０分という条件を挙げることができる。熱処理終了後は、スチーム供給を停止し、スパージャーから供給した空気により室温まで冷却すればよい。
【００１６】
このようにして得られたヒアルロン酸は、培養液が十分に滅菌されており、且つ、気相部も十分に滅菌されている。従って、培養槽が冷えた時に、気相部内壁等に付着していた凝縮水又は水滴が培養液に落下しても、培養槽中で菌が生存又は増殖することはなく、当該培養液を長期保存してもヒアルロン酸が加水分解されて分子量が低下するという問題は生じない。
【００１７】
（５）その他
このようにして得られたヒアルロン酸は、公知の方法により精製等を行うことができる。例えば、培地を必要に応じて（好ましくは、ヒアルロン酸濃度が０．１〜５ｇ／Ｌになるように）希釈した後、例えば遠心分離、濾過、カーボン、セライト、パーライト等を用いて菌体を除去し、菌体を除去した培地を活性炭と接触させればよい。
【００１８】
得られたヒアルロン酸の平均分子量は、公知の方法により求めることができる。例えば、極限粘度測定法、分子量既知のプルランを用いたＧＰＣ液クロ（示差屈折計）による相対分子量測定法、ＧＰＣ液クロ（示差屈折計）と光散乱検出器の組み合わせによる絶対分子量測定法等を使用することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例、比較例及び参考例により本発明をさらに詳細に説明する。
＜実施例１＞
〔工程１〕ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４８７）の培養
グルコース６（ｗ／ｖ）％、ポリペプトン−Ｎ（大日本製薬株式会社製）１．５（ｗ／ｖ）％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）０．５％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１（ｗ／ｖ）％、リン酸水素２ナトリウム０．０５（ｗ／ｖ）％、グルタミン酸ナトリウム０．０５（ｗ／ｖ）％、アデカプルロニックＬ−６１（旭電化工業製）０．０１（ｗ／ｖ）％の組成の培地を１０００Ｌのジャーファーメンター（株式会社丸菱製）に５００Ｌ入れ、ジャケットにスチームを供給して１２１℃、２０分間滅菌した。尚、グルコースは１２１℃、２０分間別滅菌して、培養開始時に一度に添加した。
前培養した該菌を１（ｖ／ｖ）％接種し、２７（ｗ／ｖ）％水酸化ナトリウムにてｐＨを７．４に連続的に制御しながら温度３７℃、攪拌数５０ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍで２４時間通気攪拌培養した。攪拌翼は、直径６０ｍｍの門型攪拌翼（醗酵槽内径との比Ｌ／Ｄ＝０．５）を使用した。
なお、前培養は、グルコース０．２質量％、ポリペプトン２．０質量％、酵母エキス０．５質量％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５質量％の組成からなる培地（ｐＨ７．０）を綿栓付き５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ添加し、加熱殺菌後、同一組成の寒天プレート上に形成したストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４８７）のコロニーを一白菌耳植菌し、３０℃で１８時間培養することにより行った。
〔工程２〕培養液及び気相部の熱処理
培養終了後、攪拌のみ継続しながら、ジャーファーメンター外面の下部から上部に掛けて約６割を覆っているジャケットにスチームを供給し、約２０分掛けて培養液の温度が６０℃に到達した時点でジャケットへのスチーム供給を停止した。同時に、気相部には植菌ラインからスチームを供給し、約２０分掛けて気相部の温度が７０℃になったところで気相部へのスチーム供給を停止した。スチーム停止後３０分間この状態を維持した。余熱で培養液温度は６２℃を、気相部温度は７０℃を維持した。次に、ジャケットに冷却水を供給して約１．５時間掛けて培養液温度を２０℃まで冷却した。この状態を２０時間維持した。
〔工程３〕培養液の処理
（イ）前記工程２で熱処理した培養液（ヒアルロン酸含有液）を、イオン交換水を用いて１０倍に希釈し、その２．５Ｌ水溶液のｐＨを４に調整後、活性炭（武田薬品社製の白鷺ＲＷ５０−Ｔ）を５ｇ、パーライト（三井金属鉱業株式会社のロカヘルプ♯４０９）を３０ｇ添加して、１時間処理し、ヌッチェを用いて濾過した。
（ロ）前記工程２で熱処理した培養液（ヒアルロン酸含有液）を、２５℃で２週間保存した。その後、イオン交換水を用いて１０倍に希釈し、その２．５Ｌ水溶液のｐＨを４に調整後、活性炭（武田薬品社製の白鷺ＲＷ５０−Ｔ）を５ｇ、パーライト（三井金属鉱業株式会社のロカヘルプ♯４０９）を３０ｇ添加して、１時間処理し、ヌッチェを用いて濾過した。
〔工程４〕ヒアルロン酸ナトリウム結晶の取得
前記工程２で調整したヒアルロン酸含有液各１Ｌに、食塩３ｇを溶解、ｐＨ７に調整後、２−プロパノール６Ｌで析出を行い、４０℃で真空乾燥し、０．５ｇのヒアルロン酸ナトリウム結晶を得た。
【００２０】
〔試験例１〕生菌数の測定
（Ｉ）寒天プレート作製
グルコース１（ｗ／ｖ）％、ポリペプトン−Ｎ（大日本製薬株式会社製）０．５（ｗ／ｖ）％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）０．３％、麦芽エキス（オリエンタル酵母工業製）０．３％、寒天２（ｗ／ｖ）％、ｐH７．２に調整した培地を、１２１℃、２０分間オートクレブした。寒天が固結しない内に、クリーンベンチ内でシャーレに各２０ｍｌ分注して固結させ寒天プレートを作製した。
（ＩＩ）シャーレの培養
熱処理前の培養液は、滅菌した生理食塩水で１０億倍に希釈し、その０．１ｍｌを寒天表面に注ぎ、コンラージ棒で均一に塗布した。
【００２１】
熱処理後の培養液は、滅菌した生理食塩水で１０倍に希釈し、その１ｍｌを寒天表面に注ぎ、コンラージ棒で均一に塗布した。さらに、原液１ｍｌを寒天培地に注ぎ、コンラージ棒で均一に塗布した。
【００２２】
塗布後のシャーレは、３０℃のふ卵器に入れて、４８時間培養した。培養後、シャーレに形成されたコロニーを計測して（肉眼で数えた）生菌数を測定した。結果を表１に示した。
【００２３】
〔試験例２〕ヒアルロン酸平均分子量の測定
ヒアルロン酸ナトリウム結晶約４ｍｇを純水５ｍｌに溶解し、分析用サンプルとしてＧＰＣカラムを用いた液体クロマトグラフィ−（島津製作所社製）により相対平均分子量を算出した。
（i）使用機器
島津高速液体クロマトグラフＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅＧＰＣシステム
システムコントローラ：ＣＢＭ−２０Ａ
液送ユニット：ＬＣ−２０ＡＤ
オンラインデガッサ：ＤＧＵ−２０Ａ３
オートサンプラ：ＳＩＬ−２０ＡＣ
カラムオーブン：ＣＴＯ−２０Ａ
示差屈折率検出器：ＲＩＤ−１０Ａ
ＬＣワークステーション：ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖｅｒ．１．２４ＳＰ１＋
（ii）分析条件
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ｏｈｐａｋ ＳＢ−８０６Ｍ ＨＱ
ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ｏｈｐａｋ ＳＰ−Ｇ
溶離液：５０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸ナトリウム水溶液
流量：１．００ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０．０℃
（iii）検量線作成用多糖類
平均分子量５９００、９６００、２１１００、４７１００、１０７０００、２０００００、３７５０００、７０８０００のプルラン（Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−８２ Ｌｏｔ Ｎｏ８１００１）を用いて検量線を作成した。
【００２４】
結果を表１に示した。
＜比較例１＞
培養液の熱処理時に気相部にスチームを供給しなかった以外は、実施例１と同様の操作を実施した。結果を表１に示した。
＜比較例２＞
培養液の熱処理温度を３５分掛けて７５℃に設定し、気相部にスチームを供給しなかった以外は、実施例１と同様の操作を実施した。結果を表１に示した。
＜参考例＞
培養液の熱処理をしなかった以外は、実施例１と同様の操作を実施した。結果を表１に示した。
【００２５】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む多糖類の製造方法。
（１）多糖類を産生する微生物を培養することにより、多糖類を製造する工程、
（２）培養終了後に、培養液と培養槽の気相部とをそれぞれ熱処理する工程
【請求項２】
培養液と気相部の熱処理温度がそれぞれ５０〜７０℃である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
多糖類を産生する微生物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属に属する微生物、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物からなる群から選ばれる少なくとも一種の乳酸菌である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
乳酸菌が、ヒアルロン酸生産能を有する微生物である請求項３記載の方法。
【請求項５】
ヒアルロン酸生産能を有する微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓである請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＭＫ５（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４８７）である請求項５記載の方法。
【請求項１】
以下の工程を含む多糖類の製造方法。
（１）多糖類を産生する微生物を培養することにより、多糖類を製造する工程、
（２）培養終了後に、培養液と培養槽の気相部とをそれぞれ熱処理する工程
【請求項２】
培養液と気相部の熱処理温度がそれぞれ５０〜７０℃である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
多糖類を産生する微生物が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属に属する微生物、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物からなる群から選ばれる少なくとも一種の乳酸菌である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
乳酸菌が、ヒアルロン酸生産能を有する微生物である請求項３記載の方法。
【請求項５】
ヒアルロン酸生産能を有する微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓである請求項４記載の方法。
【請求項６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ ＭＫ５（ＦＥＲＭ Ｐ−２１４８７）である請求項５記載の方法。
【公開番号】特開２０１１−１１６８２５（Ｐ２０１１−１１６８２５Ａ）
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７３５７５（Ｐ２００９−２７３５７５）
【出願日】平成２１年１２月１日（２００９．１２．１）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１日（２００９．１２．１）
【出願人】（０００００６０３５）三菱レイヨン株式会社 (2,875)
【Ｆターム（参考）】
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