大腸菌におけるＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＳｔｕＩメチラーゼのクローニング及び発現方法
本発明は（１）ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡとコグネイト及び非コグネイトメチラーゼをコードする単離ＤＮＡ；（２）前記単離ＤＮＡを含むベクター及び細胞；並びに（３）ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼの生産方法を含む構成に関する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
制限エンドヌクレアーゼは所定の単細胞微生物（主に真正細菌と古細菌）に天然に存在し、ウイルス及び他の寄生ＤＮＡ因子による感染からこれらの微生物を保護するように機能する酵素である。制限エンドヌクレアーゼは２本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）の特定ヌクレオチド配列（「認識配列」）と結合し、通常はその配列の内部又はその近傍のＤＮＡを開裂し、種々の寸法のＤＮＡフラグメントを生成する。インビボでは、制限フラグメントは更にエキソヌクレアーゼ消化の基質として機能し、完全分解へと導く。制限エンドヌクレアーゼは通常、修飾メチルトランスフェラーゼと呼ばれる１種以上の対応する酵素と共存している。メチルトランスフェラーゼは共存する制限エンドヌクレアーゼと同一のｄｓＤＮＡの配列と結合するが、ＤＮＡを開裂するのではなく、配列内の塩基の１個以上にメチル基を付加することにより改変する。このメチル化（「修飾」）は制限エンドヌクレアーゼが開裂配列と結合するのを妨げ、この部位を開裂に耐性にする。メチルトランスフェラーゼは共存する制限エンドヌクレアーゼの細胞解毒剤として機能し、細胞自身のＤＮＡがその制限エンドヌクレアーゼにより破壊されないように保護する。制限エンドヌクレアーゼとその対応する（コグネイト）修飾メチルトランスフェラーゼは一緒になって制限−修飾（Ｒ−Ｍ）系を形成する。
【０００２】
多種多様な制限エンドヌクレアーゼが「タイプＩＩ」制限エンドヌクレアーゼとして分類されている。これらの酵素は規定位置でＤＮＡを開裂し、ＤＮＡ分子を遺伝子クローニング及び分析に適した厳密なフラグメントに切断するために精製形態で使用することができる。タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼによる生化学的方法の精度は化学的方法により達成可能な精度を上回るため、これらの酵素は分子生物学実験室の必須試薬となっている。遺伝子分析用分子ツールとしてのこの性能において、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼは過去３３年間に生命科学に多大な影響を与えており、学術領域と商業領域の両面に変容をもたらしている。その有用性により新規制限エンドヌクレアーゼを求めて間断なく研究が促進され、多数のものが発見されている。今日では、各々異なるＤＮＡ開裂特性をもつ２２１種を上回るタイプＩＩエンドヌクレアーゼが知られている（Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：Ｄ２３０−Ｄ２３２（２００５））。（ＲＥＢＡＳＥ（登録商標），ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｒｅｂａｓｅ）。それに伴い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の非天然産生株宿主細胞でこれらをコードする遺伝子のクローニングと過剰発現によりこれらの酵素の生産と精製も改善されている。
【０００３】
各種制限酵素は類似の生物学的役割をほぼ同様に果たすと思われるので、アミノ酸配列と挙動も相互に近似していると思うかもしれない。しかし、そうではないことが実験により分かっている。意外にも、大半のタイプＩＩ制限酵素は相互に類似するどころか、個々に異なるようであり、他の制限酵素にも他の公知種の蛋白質にも似ていない。タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼは進化中の大部分で相互に独立して発生し、このような発生を何百回も繰り返しているため、今日の酵素は個別のファミリーではなく、不均一集団になっていると思われる。制限エンドヌクレアーゼにはホモダイマーとして作用するものと、モノマーとして作用するものと、ヘテロダイマーとして作用するものがある。また、対称配列に結合するものと非対称配列に結合するものがあり、連続配列に結合するものと不連続配列に結合するものがあり、単一配列に結合するものと複数配列に結合するものがある。単一のメチルトランスフェラーゼと共存するものと２種と共存するものがあり、全く共存しないものもある。２種のメチルトランスフェラーゼが存在する場合には、別個の蛋白質の場合と融合している場合がある。制限遺伝子と修飾遺伝子の順序と向きは多様であり、可能な全構成が存在する。メチルトランスフェラーゼは数種のものが存在しており、アデニンをメチル化するもの（ｍ６Ａ−ＭＴアーゼ）、シトシンをＮ−４位でメチル化するもの（ｍ４Ｃ−ＭＴアーゼ）、５位でメチル化するもの（ｍ５Ｃ−ＭＴアーゼ）がある。通常、どの修飾が特定制限エンドヌクレアーゼを阻害するか、どの種のメチルトランスフェラーゼが特定の場合にこの制限エンドヌクレアーゼと共存するか、その遺伝子順序又は向きがどうであるかについて先験的に予測する方法は存在しない。
【０００４】
制限−修飾系の間には大きな多様性が存在する。各酵素はアミノ酸配列と触媒挙動が固有であり、各酵素は固有の微生物環境に適した固有の酵素結合で存在しているため、実験者は酵素毎に固有の問題に直面する。制限エンドヌクレアーゼによっては、簡単にクローニングし、過剰発現させることができるが、大半の場合には不可能であり、ある酵素で成功しても、別の酵素には全く通用しない場合がある。ある酵素で成功しても、別の酵素での成功につながらない。
【発明の開示】
【０００５】
（発明の概要）
本発明の１態様では、ＡＧＧＣＣＴを認識することが可能な制限エンドヌクレアーゼをコードし、配列番号１に対して少なくとも６５％の配列一致度を有するポリヌクレオチド配列を含み、制限エンドヌクレアーゼは配列番号２に対して少なくとも５０％の配列一致度を有する単離ポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、このポリヌクレオチド配列は配列番号１に対して少なくとも７５％の配列一致度を有し、この制限エンドヌクレアーゼは配列番号２に対して少なくとも６０％の配列一致度を有する。本発明の別の態様では、このポリヌクレオチド配列は配列番号１に対して少なくとも９０％の配列一致度を有し、この制限エンドヌクレアーゼは配列番号２に対して少なくとも７０％の配列一致度を有する。更に、上記制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。更に、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０００６】
本発明の別の態様では、ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼにより認識されるポリヌクレオチド配列の１個以上のヌクレオチドをメチル化することが可能なメチラーゼをコードし、配列番号３に対して少なくとも６５％の配列一致度を有するポリヌクレオチドセグメントを提供する。このメチラーゼは配列番号４に対して少なくとも５０％の配列一致度を有する。別の態様では、このポリヌクレオチドセグメントは配列番号１に対して少なくとも７５％の配列一致度を有し、このメチラーゼは配列番号２に対して少なくとも６０％の配列一致度を有する。本発明の別の態様では、このポリヌクレオチドセグメントは配列番号１に対して少なくとも９０％の配列一致度を有し、このメチラーゼは配列番号２に対して少なくとも７０％の配列一致度を有する。更に、上記メチラーゼをコードするポリヌクレオチドセグメントを含むベクターを提供する。更に、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０００７】
本発明の別の態様では、ＳｔｕＩメチラーゼをコードするポリヌクレオチドセグメントを提供する。
【０００８】
別の態様では、上記制限エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された宿主細胞をエンドヌクレアーゼの発現に適した条件下で培養する段階を含む組換えＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼの生産方法を提供する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明の該当態様はＳｔｕＩＲ及びＳｔｕＩＭをコードする組換えＤＮＡに関し、および、組換えＤＮＡを含む大腸菌細胞におけるＳｔｕＩＲの発現に関する。
【００１０】
ＳｔｕＩＲ及びＳｔｕＩＭは細菌ストレプトマイセス・ツバーシディクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｃｕｓ）により産生される酵素である（Ｓｈｉｍｏｔｓｕら，Ｇｅｎｅ １１：２１９−２２５（１９８０））。ＳｔｕＩＲはｄｓＤＮＡ分子で対称なヌクレオチド（ｎｔ）配列５’−ＡＧＧＣＣＴ−３’と結合し、各鎖でＧとＣの間のＤＮＡを開裂して５’−ＡＧＧ／ＣＣＴ−３’とし、平滑末端をもつＤＮＡフラグメントを生じる（／は鎖開裂の位置を示す）。天然に存在する多数の制限エンドヌクレアーゼは保護修飾メチルトランスフェラーゼを伴う。ｓｔｕＩＭ遺伝子はｓｔｕＩＲの同定と配列決定における最初のクローニングターゲットであった。
【００１１】
Ｒ−Ｍ系クローニングの問題
（ａ）メチラーゼ遺伝子選択の失敗
米国特許第５，２００，３３３号に記載されているメチラーゼ選択法は制限−修飾系のクローニングに好適な最初のアプローチである。ストレプトマイセス・ツバーシディクスに由来するゲノムＤＮＡはＳｔｕＩＲ消化に耐性であるため、ＳｔｕＩＭが存在すると推論された。しかし、ＳｔｕＩＭのクローニングは問題があった。第１に、メチラーゼ選択に失敗した。この失敗は以下の原因が考えられる。
＊初期ライブラリーを構築するために使用した制限酵素によるｓｔｕＩＭ遺伝子内の開裂；
＊ＤＮＡフラグメントの寸法が大きいため、ライブラリーから適切なＤＮＡフラグメントをクローニングできない；
＊大腸菌におけるｓｔｕＩＭ遺伝子の発現率が低い；
＊プラスミド上のＳｔｕＩＲ開裂部位の修飾不良；
＊両者遺伝子を同一ＤＮＡフラグメントにクローニングした場合にｓｔｕＩＭ遺伝子の発現に比較してｓｔｕＩＲ遺伝子が相対的に過剰発現されるため、ｓｔｕＩＲ遺伝子毒性が生じる。
【００１２】
第２に、精製蛋白質量が少なく、蛋白質上のＮ末端が遮断されるため、ＳｔｕＩＲのＮ末端の蛋白質配列決定にも失敗した。
【００１３】
（ｂ）メチラーゼ遺伝子選択圧の増加
ＳｔｕＩＭをコードする遺伝子を発見する機会を増すために、プラスミドｐＵＣ１９のβ−ラクタマーゼ（ｂ／ａ）遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子）に２個のＳｔｕＩＲ開裂部位（ＡＧＧＣＣＴ）を挿入し、プラスミドｐＵＣ２ｉＳｔｕＩを作製した（図４）。ＳｔｕＩＭによる修飾の不在下では、このプラスミドはＡｍｐプレートでのＳｔｕＩＲ攻撃及び選択に耐えられない。従って、攻撃したゲノムＤＮＡライブラリーからプラスミドにおけるｓｔｕＩＭ遺伝子の存在を選択することができる。
【００１４】
一連のライブラリーの構築：
（ｉ）ＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３ＡＩで部分的に消化したストレプトマイセス・ツバーシディクスゲノムＤＮＡをｐＵＣ２ｉＳｔｕＩにクローニングし、ゲノムＤＮＡの重複するフラグメントを含むプラスミドライブラリーを形成した。このプラスミドライブラリーをＸＬ１０細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ ＪｏＩＩａ，ＣＡ）に形質転換した。全コロニーをプールし、プラスミドＤＮＡを抽出し、ＳｔｕＩＲで攻撃し、ＳｔｕＩＲ開裂部位の修飾が行われたか否かを調べた。部分消化ゲノムＤＮＡを含むプラスミドがＳｔｕＩＲを発現したならば、形質転換細胞は生存していないと思われる。ＳｔｕＩＭ又は非エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡを発現するプラスミドを含む細胞のみが生存し、これらのうちで、理論的にはｓｔｕＩＭ遺伝子を含む細胞のみがスーパーコイルプラスミドを含むと予想される。しかし、直鎖化プラスミドのバックグラウンドは非常に高く、ＳｔｕＩＭをコードするプラスミドを回収することはできなかった。
【００１５】
（ｉｉ）推定ｓｔｕＩＭ遺伝子の発現を強化するための手段としてＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｄａｍｓｔａｄｔ，ドイツ）から入手したＲｏｓｅｔｔａ ２株（Ｒｏｓｅｔｔａ ２株はレアｔＲＮＡ遺伝子を組込んだプラスミドを含む。）にプラスミドＤＮＡを形質転換した。Ｒｏｓｅｔｔａ ２株からプールしたプラスミドをＳｔｕＩＲで攻撃し、Ｒｏｓｅｔｔａ ２株に再導入した。合計６個のコロニーがプレート上に検出された。全６個の形質転換細胞について少量の細胞培養液を調製し、振盪器に入れて３７℃で２０時間培養した。ＳｔｕＩＲに完全に耐性のクローンが１個だけ回収された。１個の培養液（＃２）から抽出したプラスミド（ｐＳＴ２）はＳｔｕＩＲ消化に完全に耐性であった。
【００１６】
（ｉｉｉ）ＳｔｕＩＭ発現にＲｏｓｅｔｔａ ２株が必要であるか否かを調べるために、レアｔＲＮＡ遺伝子をコードするプラスミドの存在下又は不在下でプラスミドｐＳＴ２を他の大腸菌株：ＥＲ２５０２、ＥＲ２６８３、ＥＲ２５６６、ＥＲ２５２３及びＢＬ２１に形質転換した。対照として、ｐＳＴ２プラスミドも元のＲｏｓｅｔｔａ ２株に導入した。しかし、これらの形質転換細胞のうちでＳｔｕＩＲ消化に完全に耐性のプラスミドを生じたものは皆無であった。これらのプラスミドは対数期細胞又は長時間温置（＞２０時間）後の細胞から単離された。下記のようにｓｔｕＩＭを含むクローンの配列を得ることは可能であったが、このクローンは宿主細胞を毒性から保護できないので、推定制限エンドヌクレアーゼのクローニングに使用するには不十分であった。
【００１７】
ｐＳＴ２プラスミドのインサートにおけるｓｔｕＩＭ遺伝子をプライマーウォーキングにより配列決定した。１個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が同定され、ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴＸ検索によりＮ６Ａ−メチラーゼ遺伝子と類似していることが分かった。ｓｔｕＩＭ配列からの逆ＰＣＲウォーキングにより、メチラーゼ遺伝子に隣接する１個のＯＲＦは全公知遺伝子と異なることが判明した。このＯＲＦをＳｔｕＩＲの候補遺伝子とした（図３）。
【００１８】
（ｃ）ｓｔｕＩＲ遺伝子のクローニングを可能にするために不十分なＳｔｕＩＭによる保護
ｐＡＣＹＣ１８４に挿入したプラスミドｐＳＴ２からＰＣＲによりｓｔｕＩＭを増幅した。ｐＡＣＹＣ１８４を大腸菌ＥＲ２６８３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に形質転換した。１９個のプラスミドのうち６個が適切な酵素消化により正しい寸法のインサートを含んでいた。ｐＡＣＹＣ１８４又はｓｔｕＩＭにＳｔｕＩＲ部位は存在していなかったので、これらの株に由来するゲノムＤＮＡを抽出し、ＳｔｕＩＲで消化した。これらのうちでＳｔｕＩＲ消化に耐性のものは皆無であった。高コピー数プラスミドから発現されたＳｔｕＩＭは宿主ＤＮＡを完全には修飾しなかった。
【００１９】
ＳｔｕＩＲを大腸菌にクローニングするためには、ＳｔｕＩＭによる不完全な修飾に伴う問題を解決する必要があった。ＳｔｕＩＲ開裂に対する保護を達成できるか否かについて非コグネイトメチラーゼを試験した。ＳｔｕＩＲの認識部位はＡＧＧＣＣＴである。ＤＮＡをＳｔｕＩＲ消化から保護するためにＳｔｕＩＲ開裂部位の内部配列を修飾するメチラーゼは存在する。公知メチラーゼの調査後、ＨａｅＩＩＩメチラーゼ（ＧＧｍ５ＣＣ）（Ｓｌａｔｋｏら，Ｇｅｎｅ ７４：４５−５０（１９９８））、ＦｎｕＤＩメチラーゼ（米国特許第４，９８８，６２０号）（ＧＧＣＣ、修飾部位不明、５ｍＣメチル化型）及びＰｈｏＩメチラーゼ（ＧＧＣＣ、修飾部位不明、Ｎ４ｍＣメチル化型）遺伝子を選択した後、大腸菌で発現させた。３種の株に由来するゲノムＤＮＡをＳｔｕＩＲで消化した。Ｍ．ＨａｅＩＩＩとＭ．ＦｎｕＤＩを含む２種の株に由来するゲノムＤＮＡはＳｔｕＩＲ消化に耐性であった。ｐＡＣＹＣ−ｆｎｕＤＩＭから発現されたＭ．ＦｎｕＤＩを選択し、推定ｓｔｕＩＲ遺伝子を発現させるためにＥＲ２６８３宿主ＤＮＡを予備修飾した。
【００２０】
ｓｔｕＩＭに隣接するＯＲＦをＰＣＲ増幅し、ｐＵＣ１９にクローニングした。連結したプラスミドをｐＡＣＹＣ−ｆｎｕＤＩＭで予備修飾したＥＲ２６８３に形質転換した。コロニーを釣菌し、Ａｍｐとクロラムフェニコール（Ｃａｍ）を添加したＬＢ中で培養液４ｍｌとして一晩増殖させた。３８個のサンプルからの全細胞培養液をλＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼ活性について試験した。３８個の培養液のうち１６個はＳｔｕＩＲ活性が高かった。従って、このＯＲＦはｓｔｕＩＲ遺伝子であることが確認された。３個のクローン（＃６、＃７及び＃１５）のインサートを配列決定した。＃６と＃１５は野生型ｓｔｕＩＲ遺伝子であることが確認された。次に、大量培養液での安定性について株を試験した処、安定であることが判明した。組換えＳｔｕＩＲを湿潤細胞１ｇ当たり５×１０６単位のレベルで過剰発現させた。
【００２１】
要約すると、多数の問題を解決し、最終的にＳｔｕＩＲ過剰発現クローンの産生に成功した発現ストラテジーが最終的に開発された。このストラテジーは宿主ＤＮＡをＳｔｕＩ消化に対して保護するためにＭ．ＦｎｕＤＩの発現を利用するものであった。
【００２２】
ｓｔｕＩＭ及びｓｔｕＩＲ遺伝子を大腸菌にクローニングし、発現させることが可能な本明細書に記載する方法は以下の段階の１個以上を含む。これらの段階については実施例に詳述する。
【００２３】
（１）ゲノムＤＮＡの作製とＳｔｕＩゲノムＤＮＡライブラリーの構築
一般的なフェノール−クロロホルム抽出法と凍結−解凍サイクルによりストレプトマイセス・ツバーシディクスからゲノムＤＮＡを作製した。
【００２４】
次に、ゲノムＤＮＡをＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３ＡＩで部分消化した。ＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３ＡＩで消化した場合のみに１．５〜１０ｋｂのＤＮＡフラグメント寸法の良好な分布が得られた。ｂｌａ遺伝子に２個のＳｔｕＩ部位を予め組込んでおいたｐＵＣ１９ベクター（ｐＵＣ２ｉＳｔｕＩ）をＳｐｈＩとＢａｍＨＩで消化してＣＩＰで処理し、部分消化ゲノムＤＮＡ調製物を連結した。この連結したＤＮＡ混合物を使用してＸＬ−１０細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ ＪｏＩＩａ，ＣＡ）を形質転換した。２個のライブラリーの形質転換細胞をプールし、プラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡをＲｏｓｅｔｔａ ２株に導入した。Ｒｏｓｅｔｔａ ２に由来するプラスミドＤＮＡを作製し、一次プラスミドライブラリーを構築した。
【００２５】
（２）ＳｔｕＩＭメチラーゼ選択
一次プラスミドライブラリーをＳｔｕＩＲ消化により攻撃した。これらのＤＮＡ消化産物を次に大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ ２に逆形質転換した。ＳｔｕＩＲ攻撃後の形質転換細胞に６個の生存コロニーが検出された。これらの６個のコロニーに由来するプラスミドを抽出した。これらのプラスミドをＳｔｕＩＲで消化した処、１個（＃２）（ｐＳＴ２）が消化に耐性であることが判明した。
【００２６】
ｐＳＴ２プラスミドのインサートを配列決定するためにプライマーウォーキングを実施した。インサートの両端をＮｌａＩＩＩで消化し、ｐＵＣ２ｉＳｔｕＩのＳｐｈＩ部位に連結した。インサートは少なくとも４ｋｂであり、配列決定した領域間に小さいギャップを含んでいた。５’側からの１４４０ｂｐのＯＲＦはＮＣＢＩの翻訳データベースＢＬＡＳＴＸ検索によりアデニン特異的ＤＮＡメチラーゼに高度に相同であることが判明した（図２）。このインサートにおける他のＯＲＦは他の公知蛋白質に相同であり、１４４０ｂｐ ＯＲＦの過剰発現によりプラスミドはＳｔｕＩＭ消化の耐性になったので、このＯＲＦをｓｔｕＩＭ遺伝子と命名した。
【００２７】
（３）ｓｔｕＩＭ遺伝子の５’末端の上流のＤＮＡの逆ＰＣＲ増幅
プラスミドｐＳＴ２を含むＲｏｓｅｔｔａ ２株の細胞抽出液にエンドヌクレアーゼ活性は検出されなかった。ｓｔｕＩＭ遺伝子の下流配列は〜１７２４ｂｐに及び、転写調節因子とｃａａｘアミノ末端プロテアーゼファミリー蛋白質のホモログをコードする。従って、エンドヌクレアーゼ遺伝子が下流配列に位置するとは思われなかった。ｓｔｕＩＭ遺伝子の上流配列は固有であり、公知遺伝子に対して相同性をもたない。従って、更に上流の配列の延長に焦点を絞った。逆ＰＣＲと逆ＰＣＲ産物の直接配列決定によりＤＮＡ配列を更に延長させた。まずゲノムＤＮＡを個々の制限酵素で消化し、自己連結させた。得られた環状ＤＮＡ分子を逆ＰＣＲの鋳型として使用した。ｓｔｕＩＭ遺伝子の５’末端のＤＮＡ配列を使用して染色体ＤＮＡフラグメントの逆ＰＣＲ用プライマーを設計した。ＢｓｒＦＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＮｒｕＩ及びＴｓｐ５０９Ｉに由来する鋳型から逆ＰＣＲでＰＣＲ産物を作製した。これらのＰＣＲフラグメントをスピンカラムにより精製し、逆ＰＣＲプライマーにより配列決定した。
【００２８】
ＥｃｏＲＩ消化および自己連結からの鋳型は元の鋳型に９８３ｂｐの配列が付加され、７６８ｂｐの完全ＯＲＦが判明した。この遺伝子は公知遺伝子に対して相同性をもたない。これをｓｔｕＩＲの候補遺伝子とした（図３）。
【００２９】
（４）大腸菌におけるｓｔｕＩＭ遺伝子の発現
メチラーゼ遺伝子の発現はエンドヌクレアーゼ遺伝子の同時発現に不可欠であった。各種大腸菌株におけるＳｔｕＩＭの発現を調べるために、レアｔＲＮＡ遺伝子をコードするプラスミドの存在下又は不在下でプラスミドｐＳＴ２をＥＲ２５０２、ＥＲ２６８３、ＥＲ２５６６、ＥＲ２５２３、ＢＬ２１株に形質転換した。ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｄａｍｓｔａｄｔ，ドイツ）から入手したｐＲＡＲＥを含むＲｏｓｅｔｔａ ２株を対照として使用した。培養後、プラスミドを抽出し、ＳｔｕＩＲ消化に対する耐性を調べた。Ｒｏｓｅｔｔａ ２株を含む後期対数期（８時間培養）から抽出したプラスミドはＳｔｕＩＲ消化耐性を殆ど示さなかった。静止期（２４時間）からのプラスミドはＳｔｕＩＲ消化耐性が高く、約８０％保護を達成することができた。元のｐＳＴ２は完全にＳｔｕＩＲ消化耐性であった（＞９５％保護）。実験の不一致はいくつかの理由により説明することができる。１）未知宿主突然変異がｓｔｕＩＭ遺伝子発現を助長した；２）細胞が複製を停止し、メチラーゼ発現が持続する条件下でｐＳＴ２プラスミドを含む細胞の培養期間が延びた；３）レアｔＲＮＡの同時発現によるｓｔｕＩＭ遺伝子発現強化が僅かであった。
【００３０】
ｓｔｕＩＭをＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、低コピー数プラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。ｐＡＣＹＣ−ｓｔｕＩＭを含む細胞からゲノムＤＮＡを作製し、ＳｔｕＩＲで消化した。ゲノムＤＮＡをＳｔｕＩＲで開裂した。従って、ｐＡＣＹＣ−ｓｔｕＩＭはＳｔｕＩＲ過剰発現に使用することができない。ＳｔｕＩＲ発現用宿主ＤＮＡを保護するために非コグネイトメチラーゼを使用しようと試みた。
【００３１】
（５）ＳｔｕＩＭ発現用予備修飾大腸菌株の樹立
ｐＡＣＹＣ又はｐＵＣから発現させたＳｔｕＩＭは宿主ＤＮＡを完全には保護しなかったので、他の非コグネイトメチラーゼをＤＮＡ修飾について試験した。ＳｔｕＩＭの認識部位はＡＧＧＣＣＴである。認識部位の内部配列を修飾するこれらのメチラーゼはこの配列を修飾し、ＳｔｕＩＲ消化から保護することができると考えられる。ＨａｅＩＩＩメチラーゼ（ＧＧｍ５ＣＣ）（Ｓｌａｔｋｏら，Ｇｅｎｅ ７４：４５−５０（１９９８））、ＦｎｕＤＩメチラーゼ（ＧＧＣＣ、修飾部位不明、５ｍＣメチル化型）及びＰｈｏＩメチラーゼ（ＧＧＣＣ、修飾部位不明、Ｎ４ｍＣメチル化型）遺伝子を大腸菌で発現させた。ＥＲ１３９８［ｐＬＪｈａｅＩＩＩＭ１０１−１］、ＥＲ１３９８［ｐＭＭｈａｅＩＩＩＲＭ１２７−１、ｐＡＣＹＣ１８４ｆｎｕＤＩＭ］及びＥＲ２５６６［ｐＥＴ２１ａｐｈｏＩＲ及びｐＬＧ３３９ｐｈｏＩＭ］株からゲノムＤＮＡを作製し、ＳｔｕＩＲで消化した。ｈａｅＩＩＩＭ又はｆｎｕＤＩＭを含む株に由来するゲノムＤＮＡはＳｔｕＩＭ消化に耐性であり、ｐｈｏＩＭ宿主から単離したＤＮＡはＳｔｕＩＲ消化に感受性であった。推定ｓｔｕＩＭ遺伝子の発現用宿主ＤＮＡを予備修飾するためにＥＲ２６８３［ｐＡＣＹＣ−ｆｎｕＤＩＭ］を選択した。
【００３２】
（６）大腸菌におけるｓｔｕＩＲ遺伝子の発現
ｓｔｕＩＭ遺伝子に隣接するＯＲＦをＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化し、適合可能な末端でｐＵＣ１９と連結した。連結したプラスミドをｐＡＣＹＣ−ｆｎｕＤＩＭで予備修飾したＥＲ２６８３に形質転換した。コロニーを釣菌し、ＡｍｐとＣａｍを添加したＬＢ ４ｍｌ中で一晩増殖させた。３８個のサンプルからの一晩細胞培養液１０μｌをＮＥＢバッファー２（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中、３７℃で３０分間λＤＮＡに対するＳｔｕＩＲ活性について試験した。３８個のサンプルのうち１６個はλＤＮＡを完全に消化し、ＯＲＦはｓｔｕＩＲ遺伝子であることが確認された。ｐＵＣ１９ベクターに由来するプライマーを使用して３個のクローン（＃６、＃７及び＃１５）を配列決定した。＃６と＃１５のインサートは野生型ｓｔｕＩＲ遺伝子であることが確認された。次に、大量培養液（細胞１０ｍｌを一晩培養液１Ｌから新鮮培養液１Ｌに継代）で株の安定性を試験した処、安定であることが判明した。プラスミドは良好に維持された。ＳｔｕＩＲの最終発現効率は湿潤細胞１ｇ当たり５×１０６単位であることが判明した。
【００３３】
同定されたＳｔｕＩＲのアミノ酸配列から、国際出願Ｐｃｔ／ＵＳ０６／３０４１９に記載のアプローチを使用してデータベースを検索し、Ｅ＝ｅ−０２未満の期待値を使用してＳｔｕＩＲのアイソシゾマー又はネオシゾマーに対応する関連アミノ酸配列を同定することができる。
【００３４】
なお、メチラーゼと制限エンドヌクレアーゼを別々のプラスミドでＤＮＡによりコードしたが、同一プロモーター（例えばｌａｃプロモーター）又は異なるプロモーター（例えばメチラーゼにｔｅｔプロモーターと制限エンドヌクレアーゼにｌａｃプロモーター）の制御下で同一プラスミドに両方の遺伝子を挿入することも可能であった。
【００３５】
以下、実施例により本発明を更に例証する。これらの実施例は本発明を理解しやすくするために記載するものであり、本発明を限定すると解釈すべきではない。
【００３６】
上記及び下記に引用する全文献は言及により本明細書に組込む。
【実施例１】
【００３７】
ｓｔｕＩ Ｒ−Ｍ系の大腸菌クローニング
１．ゲノムＤＮＡの作製
ストレプトマイセス・ツバーシディクス１５ｇから以下の段階によりゲノムＤＮＡを作製した。
ａ．０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７）３５ｍｌに細胞ペースト１５ｇを再懸濁する。
ｂ．０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１ ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）に２ｍｇ／ｍｌ新鮮リゾチーム２５ｍｌを加える。３７℃で１時間温置する。
ｃ．Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｋを０．１ｍｇ／ｍｌまで３７℃で１時間加える。
ｄ．ＳＤＳを０．１％まで加える（１０％ストック６ｍｌ）。
ｅ．８％サルコシル溶液６ｍｌを加える。
ｆ．凍結解凍を３回行う。
ｇ．５５℃で１時間温置する。
ｈ．フェノール−ＣＨＣｌ３抽出を３回、ＣＨＣｌ３抽出を２回行う。
ｉ．緩衝液を２回交換しながらＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ４Ｌで４℃にて透析する。
ｊ．ＲＮａｓｅＡ（１ｍＭ）０．５ｍｌを３７℃にて１時間加える。
ｋ．０．８％アガロースゲルでＤＮＡ ３０μｌを泳動させる。この手順によりゲノムＤＮＡ６４０μｇが得られた。ゲノムＤＮＡの寸法はゲル上で１０ｋｂよりも著しく大きかった。
【００３８】
２．プラスミドｐＵＣ２ｉＳｔｕＩの構築
可能なメチラーゼの選択用ベクターを構築するために、プライマー：
【００３９】
【化１】
（ＳｔｕＩＲ開裂部位（ＡＧＧＣＣＴ）を下線で示す）を使用して逆ＰＣＲを２ラウンド行うことにより２個のＳｔｕＩＲ開裂部位をｐＵＣ１９のｂｌａ（Ａｍｐ耐性）遺伝子に組込んだ。
【００４０】
ＰＣＲは以下のように実施した。０．２５μｌのｐＵＣ１９をＰＣＲ１のＰＣＲ鋳型とし、１μｌのｐＵＣ１９（ＳｔｕＩ）を第２ラウンドのＰＣＲ鋳型とした。０、２及び６ｍＭ ＭｇＳＯ４を添加した１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）にプライマー８０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ ４００μＭ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）４単位を加えた。ＰＣＲ条件は９４℃で５分後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で２分４２秒を１８サイクル繰返し、最終温置２分４２秒とした。
【００４１】
第１対のＰＣＲプライマーはｂｌａ（Ａｍｐ耐性）遺伝子にＹ１０３Ａ突然変異を導入すると同時に、ＳｃａＩ部位を除去した。第２対のＰＣＲプライマーによる突然変異はサイレント突然変異である。最終ベクターをＳｔｕＩＲで２回消化し、プラスミドを含む大腸菌細胞を通常のアンピシリンプレートに平板接種することができる（５０〜１００μｇ／ｍｌ）。このプラスミドをｐＵＣ２ｉＳｔｕＩと命名した（図４）。
【００４２】
３．ゲノムＤＮＡの制限消化とゲノムＤＮＡライブラリーの構築
各種単位の制限酵素ＡｐｏＩ（Ｒ／ＡＡＴＴＹ）、ＮｌａＩＩＩ（／ＣＡＴＧ）及びＳａｕ３ＡＩ（／ＧＡＴＣ）を使用してゲノムＤＮＡ ４μｇを制限部分消化した。消化したＤＮＡ ０．５μｇを０．８％アガロースゲルで分析した。ＮｌａＩＩＩとＳａｕ３ＡＩのみから１．５ｋｂ〜１０ｋｂのＤＮＡフラグメントの十分なスペクトルが得られた。同一酵素で消化したサンプルをプールした。１．５ｋｂ〜１０ｋｂの部分を低融点ゲルからゲル精製した。ＮｌａＩＩＩとＳａｕ３ＡＩで部分消化したゲノムＤＮＡをＳｐｈＩとＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ２ｉＳｔｕＩに夫々連結した。連結したＤＮＡを使用してＤＮＡｓｅ Ｉ欠損宿主ＸＬ−１０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ ＪｏＩＩａ，ＣＡ）を形質転換した。各ライブラリーから約２００，０００個のＡｍｐＲ形質転換細胞が得られた。コロニーを集めてプールし、プラスミドを抽出した。ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｄａｍｓｔａｄｔ，ドイツ）から入手したＲｏｓｅｔｔａ ２株にこの混合プラスミド１μｌを形質転換した。プラスミドを再び抽出し、一次プラスミドライブラリーを形成した。
【００４３】
４．メチラーゼ選択法によるｓｔｕＩＭ遺伝子クローニング
各種量の一次プラスミドＤＮＡライブラリー（１μｌから１／２５６μｌ）をＳｔｕＩ ２００単位で３７℃にて１時間攻撃した。消化したＤＮＡを大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ ２に形質転換し、混合ライブラリーから６個のＡｍｐＲ生存細胞を得た。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ法（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によりこれらの生存細胞からプラスミドＤＮＡを作製した。抽出したプラスミドをＳｔｕＩＲで消化した。５個のコロニー（＃１、＃２、＃４、＃５、＃６）はＳｔｕＩＲ消化に耐性であることが判明した。＃２（ｐＳＴ２）はＳｃａＩＲ消化にも耐性であった。他のクローンは汚染性ＤＮＡからの疑陽性であった。ｐＳＴ２プラスミドが確かに所望部位を含んでいることを検証するために、２種のプライマー：
【００４４】
【化２】
を使用してＰＣＲを実施した。
【００４５】
１μｌのｐＳＴ２を鋳型とし、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）にプライマー８０ｐｍｏｌ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ４単位、ｄＮＴＰ各４００μＭを加え、９４℃で５分後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で２分を２５サイクルの条件とした。ＰＣＲ産物は２０７３ｂｐフラグメントであった。ｐＳＴ２とこのＰＣＲ産物をＳｔｕＩＲで消化した処、ｐＳＴ２プラスミドはＳｔｕＩＲ消化に耐性であったが、ＰＣＲ産物はＳｔｕＩＲ消化に感受性であった。この結果、ｐＳＴ２は恐らくＳｔｕＩＭにより修飾されたためにＳｔｕＩＲ消化に対して耐性になった２個のＳｔｕＩ部位を含むことが確認された。
【００４６】
両方向からプラスミドｐＳＴ２のインサートのプライマーウォーキングシーケンシングを３ラウンド実施した処、４７９アミノ酸の蛋白質をコードする１４４０ｂｐのＯＲＦが判明した。このＯＲＦはＮ６Ａ特異的メチラーゼに相同であった。他の隣接ＯＲＦは転写調節因子又はｃａａｘアミノ末端プロテアーゼファミリー蛋白質と相同であった。１４４０ｂｐ ＯＲＦはｓｔｕＩＭであった（図２）。
【００４７】
５．ｓｔｕＩＲの同定
ストレプトマイセス・ツバーシディクスゲノムＤＮＡ各１μｇをＡｇｅＩ、ＡｌｕＩ、ＢｆａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＫａｓＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｒｕＩ、ＴａｑＩ及びＴｓｐ５０９Ｉで消化した。これらの全酵素はｓｔｕＩＭの上流配列の近傍に１個の部位をもつという理由で選択した。消化したＤＮＡを１×Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎバッファー（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２００単位の存在下に２ｎｇ／μｌ濃度で自己連結させた。連結したＤＮＡをスピンカラムにより５０μｌまで濃縮した。各々１０μｌを逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）の鋳型として使用した。逆ＰＣＲでは以下のプライマー：
【００４８】
【化３】
を使用した。
【００４９】
以下のＰＣＲ条件を使用した。鋳型１０μｌを使用し、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）にプライマー８０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ ４００μＭ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ−）４単位を加えた。反応条件は９４℃で５分後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒及び７２℃で２分を３０サイクルとした。ＢｓｒＦＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＮｒｕＩ及びＴｓｐ５０９Ｉに由来する鋳型からＰＣＲフラグメントを生成し、精製した。これらのＰＣＲフラグメントをスピンカラムにより精製し、逆ＰＣＲプライマーにより配列決定した。
【００５０】
ＥｃｏＲＩ消化からの鋳型は元の鋳型配列に９８３ｂｐの新規配列を付加した。２５５アミノ酸の蛋白質をコードする７６８ｂｐの完全ＯＲＦが同定された。これはＧｅｎＢａｎｋのいずれの公知遺伝子にも相同ではない。これをｓｔｕＩＲの候補遺伝子とした（図４）。
【００５１】
６．ＳｔｕＩＲ発現用予備修飾大腸菌株の樹立
ＳｔｕＩＭの発現用として最初にＲｏｓｅｔｔａ ２株（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄａｍｓｔａｄｔ，ドイツ）を選択したのは、レアｔＲＮＡの供給により遺伝子発現が増加する可能性があるためであった。この株はベースプラスミドｐＲＡＲＥ２を含む。このプラスミドがＳｔｕＩＭの発現に必要であったか否かを調べるために、ｐＲＡＲＥ２を抽出し、他の大腸菌株：ＥＲ２５０２、ＥＲ２６８３、ＥＲ２５６６、ＥＲ２５２３、ＢＬ２１に形質転換した。プラスミドｐＳＴ２をＥＲ２５０２、ＥＲ２６８３、ＥＲ２５６６、ＥＲ２５２３及びＢＬ２１に形質転換した。ベースプラスミドｐＲＡＲＥ２を含む宿主株と含まない宿主株をＳｔｕＩＲ開裂部位修飾について比較した（Ｒｏｓｅｔｔａ ２株を対照として使用）。意外にも、ＳｔｕＩＲ消化に完全に耐性であったのは元のｐＳＴ２のみであった。新たに形質転換したＲｏｓｅｔｔａ ２株を含む他の株はＳｔｕＩＲ消化に対して部分的に耐性のプラスミドを生じた。ｐＲＡＲＥ２プラスミドはＳｔｕＩＭの発現を強化しないと思われた。細胞培養物の長さはＳｔｕＩＲ開裂部位修飾に重要な役割を果たさなかった。振盪器で細胞を＞２４時間温置した処、ＳｔｕＩＲ消化に対するプラスミドの耐性は増加することが判明した。（ｐＲＡＲＥ２を含まない）宿主細胞ＥＲ２５０２から単離したｓｔｕＩＭ遺伝子をもつプラスミドではＳｔｕＩＲ消化に対する約８０％の耐性が達成された。ｓｔｕＩＭ遺伝子のクローニングの成功は３つの理由が考えられる。１）ｐＲＡＲＥ２同時発現プラスミドの使用（これは重要な段階でないことが判明した）；２）未知宿主細胞突然変異がｓｔｕＩＭ遺伝子発現を助長した；３）ｐＳＴ２を含む細胞の静止期細胞培養の延長。
【００５２】
ｓｔｕＩＭ遺伝子をＰＣＲ増幅し、以下のプライマー：
【００５３】
【化４】
によりｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。
【００５４】
ＰＣＲは以下の条件で実施した。１μｌのｐＳＴ２を使用し、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファーにプライマー８０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ ４００μＭ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）４単位を加えた。反応条件は９４℃で５分後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で１分３０秒を２５サイクルとした。その後、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、適合可能な末端でｐＡＣＹＣ１８４に連結した。連結したプラスミドをＥＲ２６８３に形質転換し、Ｃａｍを添加したプレートに平板接種した。プラスミド１９個について正しい寸法のインサートを含むか否かについて分析した。このうち６個（＃３、＃４、＃５、＃９、＃１６及び＃１７）はＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ消化により正しい寸法のインサートを含んでいた。他方、これらのプラスミドを含む細胞に由来するゲノムＤＮＡをＳｔｕＩ消化に対して試験した処、ＳｔｕＩＲ消化に耐性のものは皆無であった。ｐＡＣＹＣ−ｓｔｕＩＭはＳｔｕＩＲの発現に使用できないと推論された。
【００５５】
他の非コグネイトメチラーゼを宿主ＤＮＡの修飾／保護について試験した。ＳｔｕＩＲの認識部位はＡＧＧＣＣＴである。内部配列を修飾する非コグネイトメチラーゼはこの配列をＳｔｕＩＲ消化から保護することができると考えられる。ＨａｅＩＩＩメチラーゼ（ＧＧｍ５ＣＣ）、ＦｎｕＤＩメチラーゼ（ＧＧＣＣ、修飾部位不明、５ｍＣメチル化型）及びＰｈｏＩメチラーゼ（ＧＧＣＣ、修飾部位不明、Ｎ４ｍＣメチル化型）遺伝子を大腸菌で発現させた。ｐＬＪｈａｅＩＩＩＭ１０１−１を含むＥＲ１３９８、ｐＭＭｈａｅＩＩＩＲＭ１２７−１とｐＡＣＹＣ１８４ｆｎｕＤＩＭを含むＥＲ１３９８、及びｐＥＴ２１ａｐｈｏＩＲとｐＬＧ３３９ｐｈｏＩＭを含むＥＲ２５６６の各種株に由来するゲノムＤＮＡをＳｔｕＩＲで消化した。ｈａｅＩＩＩＭとｆｎｕＤＩＭを含む株に由来するゲノムＤＮＡはＳｔｕＩＲ消化に耐性であり、ｐｈｏＩＭを含む株はＳｔｕＩＲ消化に感受性であった。プラスミドｐＡＣＹＣ−ｆｎｕＤＩＭをＥＲ２６８３に導入し、予備修飾株を作製した。ゲノムＤＮＡを再び抽出し、ＳｔｕＩＲ消化について試験した。これはＳｔｕＩＲ消化に耐性であった。
【００５６】
７．大腸菌におけるのｓｔｕＩＲの過剰発現
ｓｔｕＩＭに隣接するＯＲＦをＰＣＲ増幅した。
【００５７】
【化５】
【００５８】
ＰＣＲ条件は以下の通りとした。ストレプトマイセス・ツバーシディクスゲノムＤＮＡ１０μｌを使用し、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファーにプライマー８０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ ４００μＭ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ４単位を加えた。反応条件は９４℃で５分を１サイクル；９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４６秒を２５サイクルとした。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化し、同一酵素対で消化したｐＵＣ１９に連結した。連結したプラスミドをｐＡＣＹＣ−ｆｎｕＤＩＭで予備修飾したＥＲ２６８３に形質転換した。ＡｍｐとＣａｍを添加したＬＢ寒天に形質転換細胞を平板接種した。コロニーを釣菌し、ＡｍｐとＣａｍを添加したＬＢ ４ｍｌ中で一晩増殖させた。３８個のサンプルからの一晩細胞培養液１０μｌをＮＥＢバッファー２中、３７℃にて３０分間λＤＮＡに対するＳｔｕＩＲ活性を試験した。３８個のサンプルのうち１６個（＃６、＃７、＃１３、＃１５、＃１７、＃１８、＃１９、＃２０、＃２２、＃２３、＃２６、＃２７、＃３０、＃３４、＃３７及び＃３８）はλＤＮＡを完全に消化することができる。ｐＵＣ１９ベクターに由来するプライマー（Ｓ１２３３Ｓ及びＳ１２２４Ｓ）を使用して３個のクローン（＃６、＃７及び＃１５）のインサートを配列決定した。＃６と＃１５のインサートは野生型ｓｔｕＩＲであることが確認された。次に、一晩培養液１Ｌから新鮮培養液１Ｌに細胞１０ｍｌを継代することにより大量培養液で株の安定性を試験した。ＳｔｕＩＲ発現株を培養液２５Ｌで構成的発現で増殖させた。一晩培養後、ＳｔｕＩの最終発現レベルは湿潤細胞１ｇ当たり〜５×１０６単位であることが判明した（図５）。
【実施例２】
【００５９】
ＳｔｕＩＲのアミノ酸配列を使用して関連制限エンドヌクレアーゼを同定する方法
ＳｔｕＩＲのアミノ酸配列を使用して蛋白質間（ｂｌａｓｔｐ）ＢＬＡＳＴ検索又は蛋白質と翻訳データベース間（ｔｂｌａｓｔｎ）のＢＬＡＳＴ検索を実施する。例えば、このような検索はＮＣＢＩウェブサーバー：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／を介してｂｌａｓｔｐ（又はｔｂｌａｓｔｎ）プログラムを選択し、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して期待値＝１０、ワードサイズ＝３から構成される標準設定値とＥｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１のギャップコストを使用し、「全生物」のＮＲ（非冗長）データベースを検索することにより実施することができる。これらのパラメーターは多少異なる検索結果が得られるように当業者が変更することができる。
【００６０】
ＢＬＡＳＴ検索により復元された出力を試験し、ｅ−０２未満の期待値スコアを生じる配列を調べる。これらの配列はＲＥであると推定される。
【００６１】
同定された推定ＲＥの配列コンテキストを試験し、推定エンドヌクレアーゼに隣接又は近接（１又は２ＯＲＦ以内）する推定ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが存在するか否かを調べる。このようなメチルトランスフェラーゼが存在する場合には、公知エンドヌクレアーゼ配列を使用して同定される配列がエンドヌクレアーゼである可能性が高い。
【００６２】
ＳｔｕＩＲと新規に同定された配列の類似性レベルから、２つの配列がアイソシゾマーであるか（例えばＥ＜ｅ−５０の高類似度）又は近縁ではあるが異なる配列を認識する（低類似度）かを予想することができる。
【００６３】
図５に示すように、配列から蛋白質を発現させてこの蛋白質のエンドヌクレアーゼ分解機能を試験する任意従来方法により、同定された配列を試験し、この配列が機能的ＲＥをコードするか否かを調べる。例えば、同定された配列をＰＣＲにより増幅すればよい。その後、遺伝子を無細胞インビトロ転写／翻訳系で発現させ、生成された蛋白質のエンドヌクレアーゼ活性を試験してもよいし、遺伝子をベクターに導入し、大腸菌等の宿主細胞にクローニングしてもよい。形質転換した宿主細胞を次に増殖させ、同定されたエンドヌクレアーゼ遺伝子に蛋白質を発現させ、無細胞溶解液を調製し、エンドヌクレアーゼ活性を試験する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子（ｓｔｕＩＲ）とＳｔｕＩメチラーゼ遺伝子（ｓｔｕＩＭ）からなるＳｔｕＩ Ｒ−Ｍ系の遺伝子構成を示す。
【図２】１４４０ｂｐのｓｔｕＩＭ（配列番号３）とコードされたＳｔｕＩＭアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図３】７６８ｂｐのｓｔｕＩＲ（配列番号１）とコードされたＳｔｕＲＩアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４】２個のＳｔｕＩ部位を含むクローニングベクターｐＵＣ２ｉＳｔｕＩのマップを示す。
【図５】細胞抽出液における組換えＳｔｕＩＲ活性を示す。λＤＮＡを基質として使用した。レーン１は１ｋｂ ＤＮＡマーカーである。レーン２−９は１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１６００倍、３２００倍、６４００倍、１２８００倍、２５６００倍に希釈した細胞抽出液３μｌを制限消化に加えた。レーン１２はλＤＮＡを天然ＳｔｕＩで消化した。
【背景技術】
【０００１】
制限エンドヌクレアーゼは所定の単細胞微生物（主に真正細菌と古細菌）に天然に存在し、ウイルス及び他の寄生ＤＮＡ因子による感染からこれらの微生物を保護するように機能する酵素である。制限エンドヌクレアーゼは２本鎖ＤＮＡ分子（ｄｓＤＮＡ）の特定ヌクレオチド配列（「認識配列」）と結合し、通常はその配列の内部又はその近傍のＤＮＡを開裂し、種々の寸法のＤＮＡフラグメントを生成する。インビボでは、制限フラグメントは更にエキソヌクレアーゼ消化の基質として機能し、完全分解へと導く。制限エンドヌクレアーゼは通常、修飾メチルトランスフェラーゼと呼ばれる１種以上の対応する酵素と共存している。メチルトランスフェラーゼは共存する制限エンドヌクレアーゼと同一のｄｓＤＮＡの配列と結合するが、ＤＮＡを開裂するのではなく、配列内の塩基の１個以上にメチル基を付加することにより改変する。このメチル化（「修飾」）は制限エンドヌクレアーゼが開裂配列と結合するのを妨げ、この部位を開裂に耐性にする。メチルトランスフェラーゼは共存する制限エンドヌクレアーゼの細胞解毒剤として機能し、細胞自身のＤＮＡがその制限エンドヌクレアーゼにより破壊されないように保護する。制限エンドヌクレアーゼとその対応する（コグネイト）修飾メチルトランスフェラーゼは一緒になって制限−修飾（Ｒ−Ｍ）系を形成する。
【０００２】
多種多様な制限エンドヌクレアーゼが「タイプＩＩ」制限エンドヌクレアーゼとして分類されている。これらの酵素は規定位置でＤＮＡを開裂し、ＤＮＡ分子を遺伝子クローニング及び分析に適した厳密なフラグメントに切断するために精製形態で使用することができる。タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼによる生化学的方法の精度は化学的方法により達成可能な精度を上回るため、これらの酵素は分子生物学実験室の必須試薬となっている。遺伝子分析用分子ツールとしてのこの性能において、タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼは過去３３年間に生命科学に多大な影響を与えており、学術領域と商業領域の両面に変容をもたらしている。その有用性により新規制限エンドヌクレアーゼを求めて間断なく研究が促進され、多数のものが発見されている。今日では、各々異なるＤＮＡ開裂特性をもつ２２１種を上回るタイプＩＩエンドヌクレアーゼが知られている（Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：Ｄ２３０−Ｄ２３２（２００５））。（ＲＥＢＡＳＥ（登録商標），ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｒｅｂａｓｅ）。それに伴い、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の非天然産生株宿主細胞でこれらをコードする遺伝子のクローニングと過剰発現によりこれらの酵素の生産と精製も改善されている。
【０００３】
各種制限酵素は類似の生物学的役割をほぼ同様に果たすと思われるので、アミノ酸配列と挙動も相互に近似していると思うかもしれない。しかし、そうではないことが実験により分かっている。意外にも、大半のタイプＩＩ制限酵素は相互に類似するどころか、個々に異なるようであり、他の制限酵素にも他の公知種の蛋白質にも似ていない。タイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼは進化中の大部分で相互に独立して発生し、このような発生を何百回も繰り返しているため、今日の酵素は個別のファミリーではなく、不均一集団になっていると思われる。制限エンドヌクレアーゼにはホモダイマーとして作用するものと、モノマーとして作用するものと、ヘテロダイマーとして作用するものがある。また、対称配列に結合するものと非対称配列に結合するものがあり、連続配列に結合するものと不連続配列に結合するものがあり、単一配列に結合するものと複数配列に結合するものがある。単一のメチルトランスフェラーゼと共存するものと２種と共存するものがあり、全く共存しないものもある。２種のメチルトランスフェラーゼが存在する場合には、別個の蛋白質の場合と融合している場合がある。制限遺伝子と修飾遺伝子の順序と向きは多様であり、可能な全構成が存在する。メチルトランスフェラーゼは数種のものが存在しており、アデニンをメチル化するもの（ｍ６Ａ−ＭＴアーゼ）、シトシンをＮ−４位でメチル化するもの（ｍ４Ｃ−ＭＴアーゼ）、５位でメチル化するもの（ｍ５Ｃ−ＭＴアーゼ）がある。通常、どの修飾が特定制限エンドヌクレアーゼを阻害するか、どの種のメチルトランスフェラーゼが特定の場合にこの制限エンドヌクレアーゼと共存するか、その遺伝子順序又は向きがどうであるかについて先験的に予測する方法は存在しない。
【０００４】
制限−修飾系の間には大きな多様性が存在する。各酵素はアミノ酸配列と触媒挙動が固有であり、各酵素は固有の微生物環境に適した固有の酵素結合で存在しているため、実験者は酵素毎に固有の問題に直面する。制限エンドヌクレアーゼによっては、簡単にクローニングし、過剰発現させることができるが、大半の場合には不可能であり、ある酵素で成功しても、別の酵素には全く通用しない場合がある。ある酵素で成功しても、別の酵素での成功につながらない。
【発明の開示】
【０００５】
（発明の概要）
本発明の１態様では、ＡＧＧＣＣＴを認識することが可能な制限エンドヌクレアーゼをコードし、配列番号１に対して少なくとも６５％の配列一致度を有するポリヌクレオチド配列を含み、制限エンドヌクレアーゼは配列番号２に対して少なくとも５０％の配列一致度を有する単離ポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、このポリヌクレオチド配列は配列番号１に対して少なくとも７５％の配列一致度を有し、この制限エンドヌクレアーゼは配列番号２に対して少なくとも６０％の配列一致度を有する。本発明の別の態様では、このポリヌクレオチド配列は配列番号１に対して少なくとも９０％の配列一致度を有し、この制限エンドヌクレアーゼは配列番号２に対して少なくとも７０％の配列一致度を有する。更に、上記制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。更に、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０００６】
本発明の別の態様では、ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼにより認識されるポリヌクレオチド配列の１個以上のヌクレオチドをメチル化することが可能なメチラーゼをコードし、配列番号３に対して少なくとも６５％の配列一致度を有するポリヌクレオチドセグメントを提供する。このメチラーゼは配列番号４に対して少なくとも５０％の配列一致度を有する。別の態様では、このポリヌクレオチドセグメントは配列番号１に対して少なくとも７５％の配列一致度を有し、このメチラーゼは配列番号２に対して少なくとも６０％の配列一致度を有する。本発明の別の態様では、このポリヌクレオチドセグメントは配列番号１に対して少なくとも９０％の配列一致度を有し、このメチラーゼは配列番号２に対して少なくとも７０％の配列一致度を有する。更に、上記メチラーゼをコードするポリヌクレオチドセグメントを含むベクターを提供する。更に、前記ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
【０００７】
本発明の別の態様では、ＳｔｕＩメチラーゼをコードするポリヌクレオチドセグメントを提供する。
【０００８】
別の態様では、上記制限エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された宿主細胞をエンドヌクレアーゼの発現に適した条件下で培養する段階を含む組換えＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼの生産方法を提供する。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明の該当態様はＳｔｕＩＲ及びＳｔｕＩＭをコードする組換えＤＮＡに関し、および、組換えＤＮＡを含む大腸菌細胞におけるＳｔｕＩＲの発現に関する。
【００１０】
ＳｔｕＩＲ及びＳｔｕＩＭは細菌ストレプトマイセス・ツバーシディクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｃｕｓ）により産生される酵素である（Ｓｈｉｍｏｔｓｕら，Ｇｅｎｅ １１：２１９−２２５（１９８０））。ＳｔｕＩＲはｄｓＤＮＡ分子で対称なヌクレオチド（ｎｔ）配列５’−ＡＧＧＣＣＴ−３’と結合し、各鎖でＧとＣの間のＤＮＡを開裂して５’−ＡＧＧ／ＣＣＴ−３’とし、平滑末端をもつＤＮＡフラグメントを生じる（／は鎖開裂の位置を示す）。天然に存在する多数の制限エンドヌクレアーゼは保護修飾メチルトランスフェラーゼを伴う。ｓｔｕＩＭ遺伝子はｓｔｕＩＲの同定と配列決定における最初のクローニングターゲットであった。
【００１１】
Ｒ−Ｍ系クローニングの問題
（ａ）メチラーゼ遺伝子選択の失敗
米国特許第５，２００，３３３号に記載されているメチラーゼ選択法は制限−修飾系のクローニングに好適な最初のアプローチである。ストレプトマイセス・ツバーシディクスに由来するゲノムＤＮＡはＳｔｕＩＲ消化に耐性であるため、ＳｔｕＩＭが存在すると推論された。しかし、ＳｔｕＩＭのクローニングは問題があった。第１に、メチラーゼ選択に失敗した。この失敗は以下の原因が考えられる。
＊初期ライブラリーを構築するために使用した制限酵素によるｓｔｕＩＭ遺伝子内の開裂；
＊ＤＮＡフラグメントの寸法が大きいため、ライブラリーから適切なＤＮＡフラグメントをクローニングできない；
＊大腸菌におけるｓｔｕＩＭ遺伝子の発現率が低い；
＊プラスミド上のＳｔｕＩＲ開裂部位の修飾不良；
＊両者遺伝子を同一ＤＮＡフラグメントにクローニングした場合にｓｔｕＩＭ遺伝子の発現に比較してｓｔｕＩＲ遺伝子が相対的に過剰発現されるため、ｓｔｕＩＲ遺伝子毒性が生じる。
【００１２】
第２に、精製蛋白質量が少なく、蛋白質上のＮ末端が遮断されるため、ＳｔｕＩＲのＮ末端の蛋白質配列決定にも失敗した。
【００１３】
（ｂ）メチラーゼ遺伝子選択圧の増加
ＳｔｕＩＭをコードする遺伝子を発見する機会を増すために、プラスミドｐＵＣ１９のβ−ラクタマーゼ（ｂ／ａ）遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子）に２個のＳｔｕＩＲ開裂部位（ＡＧＧＣＣＴ）を挿入し、プラスミドｐＵＣ２ｉＳｔｕＩを作製した（図４）。ＳｔｕＩＭによる修飾の不在下では、このプラスミドはＡｍｐプレートでのＳｔｕＩＲ攻撃及び選択に耐えられない。従って、攻撃したゲノムＤＮＡライブラリーからプラスミドにおけるｓｔｕＩＭ遺伝子の存在を選択することができる。
【００１４】
一連のライブラリーの構築：
（ｉ）ＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３ＡＩで部分的に消化したストレプトマイセス・ツバーシディクスゲノムＤＮＡをｐＵＣ２ｉＳｔｕＩにクローニングし、ゲノムＤＮＡの重複するフラグメントを含むプラスミドライブラリーを形成した。このプラスミドライブラリーをＸＬ１０細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ ＪｏＩＩａ，ＣＡ）に形質転換した。全コロニーをプールし、プラスミドＤＮＡを抽出し、ＳｔｕＩＲで攻撃し、ＳｔｕＩＲ開裂部位の修飾が行われたか否かを調べた。部分消化ゲノムＤＮＡを含むプラスミドがＳｔｕＩＲを発現したならば、形質転換細胞は生存していないと思われる。ＳｔｕＩＭ又は非エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡを発現するプラスミドを含む細胞のみが生存し、これらのうちで、理論的にはｓｔｕＩＭ遺伝子を含む細胞のみがスーパーコイルプラスミドを含むと予想される。しかし、直鎖化プラスミドのバックグラウンドは非常に高く、ＳｔｕＩＭをコードするプラスミドを回収することはできなかった。
【００１５】
（ｉｉ）推定ｓｔｕＩＭ遺伝子の発現を強化するための手段としてＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｄａｍｓｔａｄｔ，ドイツ）から入手したＲｏｓｅｔｔａ ２株（Ｒｏｓｅｔｔａ ２株はレアｔＲＮＡ遺伝子を組込んだプラスミドを含む。）にプラスミドＤＮＡを形質転換した。Ｒｏｓｅｔｔａ ２株からプールしたプラスミドをＳｔｕＩＲで攻撃し、Ｒｏｓｅｔｔａ ２株に再導入した。合計６個のコロニーがプレート上に検出された。全６個の形質転換細胞について少量の細胞培養液を調製し、振盪器に入れて３７℃で２０時間培養した。ＳｔｕＩＲに完全に耐性のクローンが１個だけ回収された。１個の培養液（＃２）から抽出したプラスミド（ｐＳＴ２）はＳｔｕＩＲ消化に完全に耐性であった。
【００１６】
（ｉｉｉ）ＳｔｕＩＭ発現にＲｏｓｅｔｔａ ２株が必要であるか否かを調べるために、レアｔＲＮＡ遺伝子をコードするプラスミドの存在下又は不在下でプラスミドｐＳＴ２を他の大腸菌株：ＥＲ２５０２、ＥＲ２６８３、ＥＲ２５６６、ＥＲ２５２３及びＢＬ２１に形質転換した。対照として、ｐＳＴ２プラスミドも元のＲｏｓｅｔｔａ ２株に導入した。しかし、これらの形質転換細胞のうちでＳｔｕＩＲ消化に完全に耐性のプラスミドを生じたものは皆無であった。これらのプラスミドは対数期細胞又は長時間温置（＞２０時間）後の細胞から単離された。下記のようにｓｔｕＩＭを含むクローンの配列を得ることは可能であったが、このクローンは宿主細胞を毒性から保護できないので、推定制限エンドヌクレアーゼのクローニングに使用するには不十分であった。
【００１７】
ｐＳＴ２プラスミドのインサートにおけるｓｔｕＩＭ遺伝子をプライマーウォーキングにより配列決定した。１個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が同定され、ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴＸ検索によりＮ６Ａ−メチラーゼ遺伝子と類似していることが分かった。ｓｔｕＩＭ配列からの逆ＰＣＲウォーキングにより、メチラーゼ遺伝子に隣接する１個のＯＲＦは全公知遺伝子と異なることが判明した。このＯＲＦをＳｔｕＩＲの候補遺伝子とした（図３）。
【００１８】
（ｃ）ｓｔｕＩＲ遺伝子のクローニングを可能にするために不十分なＳｔｕＩＭによる保護
ｐＡＣＹＣ１８４に挿入したプラスミドｐＳＴ２からＰＣＲによりｓｔｕＩＭを増幅した。ｐＡＣＹＣ１８４を大腸菌ＥＲ２６８３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（ＮＥＢ），Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）に形質転換した。１９個のプラスミドのうち６個が適切な酵素消化により正しい寸法のインサートを含んでいた。ｐＡＣＹＣ１８４又はｓｔｕＩＭにＳｔｕＩＲ部位は存在していなかったので、これらの株に由来するゲノムＤＮＡを抽出し、ＳｔｕＩＲで消化した。これらのうちでＳｔｕＩＲ消化に耐性のものは皆無であった。高コピー数プラスミドから発現されたＳｔｕＩＭは宿主ＤＮＡを完全には修飾しなかった。
【００１９】
ＳｔｕＩＲを大腸菌にクローニングするためには、ＳｔｕＩＭによる不完全な修飾に伴う問題を解決する必要があった。ＳｔｕＩＲ開裂に対する保護を達成できるか否かについて非コグネイトメチラーゼを試験した。ＳｔｕＩＲの認識部位はＡＧＧＣＣＴである。ＤＮＡをＳｔｕＩＲ消化から保護するためにＳｔｕＩＲ開裂部位の内部配列を修飾するメチラーゼは存在する。公知メチラーゼの調査後、ＨａｅＩＩＩメチラーゼ（ＧＧｍ５ＣＣ）（Ｓｌａｔｋｏら，Ｇｅｎｅ ７４：４５−５０（１９９８））、ＦｎｕＤＩメチラーゼ（米国特許第４，９８８，６２０号）（ＧＧＣＣ、修飾部位不明、５ｍＣメチル化型）及びＰｈｏＩメチラーゼ（ＧＧＣＣ、修飾部位不明、Ｎ４ｍＣメチル化型）遺伝子を選択した後、大腸菌で発現させた。３種の株に由来するゲノムＤＮＡをＳｔｕＩＲで消化した。Ｍ．ＨａｅＩＩＩとＭ．ＦｎｕＤＩを含む２種の株に由来するゲノムＤＮＡはＳｔｕＩＲ消化に耐性であった。ｐＡＣＹＣ−ｆｎｕＤＩＭから発現されたＭ．ＦｎｕＤＩを選択し、推定ｓｔｕＩＲ遺伝子を発現させるためにＥＲ２６８３宿主ＤＮＡを予備修飾した。
【００２０】
ｓｔｕＩＭに隣接するＯＲＦをＰＣＲ増幅し、ｐＵＣ１９にクローニングした。連結したプラスミドをｐＡＣＹＣ−ｆｎｕＤＩＭで予備修飾したＥＲ２６８３に形質転換した。コロニーを釣菌し、Ａｍｐとクロラムフェニコール（Ｃａｍ）を添加したＬＢ中で培養液４ｍｌとして一晩増殖させた。３８個のサンプルからの全細胞培養液をλＤＮＡに対するエンドヌクレアーゼ活性について試験した。３８個の培養液のうち１６個はＳｔｕＩＲ活性が高かった。従って、このＯＲＦはｓｔｕＩＲ遺伝子であることが確認された。３個のクローン（＃６、＃７及び＃１５）のインサートを配列決定した。＃６と＃１５は野生型ｓｔｕＩＲ遺伝子であることが確認された。次に、大量培養液での安定性について株を試験した処、安定であることが判明した。組換えＳｔｕＩＲを湿潤細胞１ｇ当たり５×１０６単位のレベルで過剰発現させた。
【００２１】
要約すると、多数の問題を解決し、最終的にＳｔｕＩＲ過剰発現クローンの産生に成功した発現ストラテジーが最終的に開発された。このストラテジーは宿主ＤＮＡをＳｔｕＩ消化に対して保護するためにＭ．ＦｎｕＤＩの発現を利用するものであった。
【００２２】
ｓｔｕＩＭ及びｓｔｕＩＲ遺伝子を大腸菌にクローニングし、発現させることが可能な本明細書に記載する方法は以下の段階の１個以上を含む。これらの段階については実施例に詳述する。
【００２３】
（１）ゲノムＤＮＡの作製とＳｔｕＩゲノムＤＮＡライブラリーの構築
一般的なフェノール−クロロホルム抽出法と凍結−解凍サイクルによりストレプトマイセス・ツバーシディクスからゲノムＤＮＡを作製した。
【００２４】
次に、ゲノムＤＮＡをＡｐｏＩ、ＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３ＡＩで部分消化した。ＮｌａＩＩＩ及びＳａｕ３ＡＩで消化した場合のみに１．５〜１０ｋｂのＤＮＡフラグメント寸法の良好な分布が得られた。ｂｌａ遺伝子に２個のＳｔｕＩ部位を予め組込んでおいたｐＵＣ１９ベクター（ｐＵＣ２ｉＳｔｕＩ）をＳｐｈＩとＢａｍＨＩで消化してＣＩＰで処理し、部分消化ゲノムＤＮＡ調製物を連結した。この連結したＤＮＡ混合物を使用してＸＬ−１０細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ ＪｏＩＩａ，ＣＡ）を形質転換した。２個のライブラリーの形質転換細胞をプールし、プラスミドＤＮＡを抽出した。プラスミドＤＮＡをＲｏｓｅｔｔａ ２株に導入した。Ｒｏｓｅｔｔａ ２に由来するプラスミドＤＮＡを作製し、一次プラスミドライブラリーを構築した。
【００２５】
（２）ＳｔｕＩＭメチラーゼ選択
一次プラスミドライブラリーをＳｔｕＩＲ消化により攻撃した。これらのＤＮＡ消化産物を次に大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ ２に逆形質転換した。ＳｔｕＩＲ攻撃後の形質転換細胞に６個の生存コロニーが検出された。これらの６個のコロニーに由来するプラスミドを抽出した。これらのプラスミドをＳｔｕＩＲで消化した処、１個（＃２）（ｐＳＴ２）が消化に耐性であることが判明した。
【００２６】
ｐＳＴ２プラスミドのインサートを配列決定するためにプライマーウォーキングを実施した。インサートの両端をＮｌａＩＩＩで消化し、ｐＵＣ２ｉＳｔｕＩのＳｐｈＩ部位に連結した。インサートは少なくとも４ｋｂであり、配列決定した領域間に小さいギャップを含んでいた。５’側からの１４４０ｂｐのＯＲＦはＮＣＢＩの翻訳データベースＢＬＡＳＴＸ検索によりアデニン特異的ＤＮＡメチラーゼに高度に相同であることが判明した（図２）。このインサートにおける他のＯＲＦは他の公知蛋白質に相同であり、１４４０ｂｐ ＯＲＦの過剰発現によりプラスミドはＳｔｕＩＭ消化の耐性になったので、このＯＲＦをｓｔｕＩＭ遺伝子と命名した。
【００２７】
（３）ｓｔｕＩＭ遺伝子の５’末端の上流のＤＮＡの逆ＰＣＲ増幅
プラスミドｐＳＴ２を含むＲｏｓｅｔｔａ ２株の細胞抽出液にエンドヌクレアーゼ活性は検出されなかった。ｓｔｕＩＭ遺伝子の下流配列は〜１７２４ｂｐに及び、転写調節因子とｃａａｘアミノ末端プロテアーゼファミリー蛋白質のホモログをコードする。従って、エンドヌクレアーゼ遺伝子が下流配列に位置するとは思われなかった。ｓｔｕＩＭ遺伝子の上流配列は固有であり、公知遺伝子に対して相同性をもたない。従って、更に上流の配列の延長に焦点を絞った。逆ＰＣＲと逆ＰＣＲ産物の直接配列決定によりＤＮＡ配列を更に延長させた。まずゲノムＤＮＡを個々の制限酵素で消化し、自己連結させた。得られた環状ＤＮＡ分子を逆ＰＣＲの鋳型として使用した。ｓｔｕＩＭ遺伝子の５’末端のＤＮＡ配列を使用して染色体ＤＮＡフラグメントの逆ＰＣＲ用プライマーを設計した。ＢｓｒＦＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＮｒｕＩ及びＴｓｐ５０９Ｉに由来する鋳型から逆ＰＣＲでＰＣＲ産物を作製した。これらのＰＣＲフラグメントをスピンカラムにより精製し、逆ＰＣＲプライマーにより配列決定した。
【００２８】
ＥｃｏＲＩ消化および自己連結からの鋳型は元の鋳型に９８３ｂｐの配列が付加され、７６８ｂｐの完全ＯＲＦが判明した。この遺伝子は公知遺伝子に対して相同性をもたない。これをｓｔｕＩＲの候補遺伝子とした（図３）。
【００２９】
（４）大腸菌におけるｓｔｕＩＭ遺伝子の発現
メチラーゼ遺伝子の発現はエンドヌクレアーゼ遺伝子の同時発現に不可欠であった。各種大腸菌株におけるＳｔｕＩＭの発現を調べるために、レアｔＲＮＡ遺伝子をコードするプラスミドの存在下又は不在下でプラスミドｐＳＴ２をＥＲ２５０２、ＥＲ２６８３、ＥＲ２５６６、ＥＲ２５２３、ＢＬ２１株に形質転換した。ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｄａｍｓｔａｄｔ，ドイツ）から入手したｐＲＡＲＥを含むＲｏｓｅｔｔａ ２株を対照として使用した。培養後、プラスミドを抽出し、ＳｔｕＩＲ消化に対する耐性を調べた。Ｒｏｓｅｔｔａ ２株を含む後期対数期（８時間培養）から抽出したプラスミドはＳｔｕＩＲ消化耐性を殆ど示さなかった。静止期（２４時間）からのプラスミドはＳｔｕＩＲ消化耐性が高く、約８０％保護を達成することができた。元のｐＳＴ２は完全にＳｔｕＩＲ消化耐性であった（＞９５％保護）。実験の不一致はいくつかの理由により説明することができる。１）未知宿主突然変異がｓｔｕＩＭ遺伝子発現を助長した；２）細胞が複製を停止し、メチラーゼ発現が持続する条件下でｐＳＴ２プラスミドを含む細胞の培養期間が延びた；３）レアｔＲＮＡの同時発現によるｓｔｕＩＭ遺伝子発現強化が僅かであった。
【００３０】
ｓｔｕＩＭをＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、低コピー数プラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。ｐＡＣＹＣ−ｓｔｕＩＭを含む細胞からゲノムＤＮＡを作製し、ＳｔｕＩＲで消化した。ゲノムＤＮＡをＳｔｕＩＲで開裂した。従って、ｐＡＣＹＣ−ｓｔｕＩＭはＳｔｕＩＲ過剰発現に使用することができない。ＳｔｕＩＲ発現用宿主ＤＮＡを保護するために非コグネイトメチラーゼを使用しようと試みた。
【００３１】
（５）ＳｔｕＩＭ発現用予備修飾大腸菌株の樹立
ｐＡＣＹＣ又はｐＵＣから発現させたＳｔｕＩＭは宿主ＤＮＡを完全には保護しなかったので、他の非コグネイトメチラーゼをＤＮＡ修飾について試験した。ＳｔｕＩＭの認識部位はＡＧＧＣＣＴである。認識部位の内部配列を修飾するこれらのメチラーゼはこの配列を修飾し、ＳｔｕＩＲ消化から保護することができると考えられる。ＨａｅＩＩＩメチラーゼ（ＧＧｍ５ＣＣ）（Ｓｌａｔｋｏら，Ｇｅｎｅ ７４：４５−５０（１９９８））、ＦｎｕＤＩメチラーゼ（ＧＧＣＣ、修飾部位不明、５ｍＣメチル化型）及びＰｈｏＩメチラーゼ（ＧＧＣＣ、修飾部位不明、Ｎ４ｍＣメチル化型）遺伝子を大腸菌で発現させた。ＥＲ１３９８［ｐＬＪｈａｅＩＩＩＭ１０１−１］、ＥＲ１３９８［ｐＭＭｈａｅＩＩＩＲＭ１２７−１、ｐＡＣＹＣ１８４ｆｎｕＤＩＭ］及びＥＲ２５６６［ｐＥＴ２１ａｐｈｏＩＲ及びｐＬＧ３３９ｐｈｏＩＭ］株からゲノムＤＮＡを作製し、ＳｔｕＩＲで消化した。ｈａｅＩＩＩＭ又はｆｎｕＤＩＭを含む株に由来するゲノムＤＮＡはＳｔｕＩＭ消化に耐性であり、ｐｈｏＩＭ宿主から単離したＤＮＡはＳｔｕＩＲ消化に感受性であった。推定ｓｔｕＩＭ遺伝子の発現用宿主ＤＮＡを予備修飾するためにＥＲ２６８３［ｐＡＣＹＣ−ｆｎｕＤＩＭ］を選択した。
【００３２】
（６）大腸菌におけるｓｔｕＩＲ遺伝子の発現
ｓｔｕＩＭ遺伝子に隣接するＯＲＦをＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化し、適合可能な末端でｐＵＣ１９と連結した。連結したプラスミドをｐＡＣＹＣ−ｆｎｕＤＩＭで予備修飾したＥＲ２６８３に形質転換した。コロニーを釣菌し、ＡｍｐとＣａｍを添加したＬＢ ４ｍｌ中で一晩増殖させた。３８個のサンプルからの一晩細胞培養液１０μｌをＮＥＢバッファー２（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中、３７℃で３０分間λＤＮＡに対するＳｔｕＩＲ活性について試験した。３８個のサンプルのうち１６個はλＤＮＡを完全に消化し、ＯＲＦはｓｔｕＩＲ遺伝子であることが確認された。ｐＵＣ１９ベクターに由来するプライマーを使用して３個のクローン（＃６、＃７及び＃１５）を配列決定した。＃６と＃１５のインサートは野生型ｓｔｕＩＲ遺伝子であることが確認された。次に、大量培養液（細胞１０ｍｌを一晩培養液１Ｌから新鮮培養液１Ｌに継代）で株の安定性を試験した処、安定であることが判明した。プラスミドは良好に維持された。ＳｔｕＩＲの最終発現効率は湿潤細胞１ｇ当たり５×１０６単位であることが判明した。
【００３３】
同定されたＳｔｕＩＲのアミノ酸配列から、国際出願Ｐｃｔ／ＵＳ０６／３０４１９に記載のアプローチを使用してデータベースを検索し、Ｅ＝ｅ−０２未満の期待値を使用してＳｔｕＩＲのアイソシゾマー又はネオシゾマーに対応する関連アミノ酸配列を同定することができる。
【００３４】
なお、メチラーゼと制限エンドヌクレアーゼを別々のプラスミドでＤＮＡによりコードしたが、同一プロモーター（例えばｌａｃプロモーター）又は異なるプロモーター（例えばメチラーゼにｔｅｔプロモーターと制限エンドヌクレアーゼにｌａｃプロモーター）の制御下で同一プラスミドに両方の遺伝子を挿入することも可能であった。
【００３５】
以下、実施例により本発明を更に例証する。これらの実施例は本発明を理解しやすくするために記載するものであり、本発明を限定すると解釈すべきではない。
【００３６】
上記及び下記に引用する全文献は言及により本明細書に組込む。
【実施例１】
【００３７】
ｓｔｕＩ Ｒ−Ｍ系の大腸菌クローニング
１．ゲノムＤＮＡの作製
ストレプトマイセス・ツバーシディクス１５ｇから以下の段階によりゲノムＤＮＡを作製した。
ａ．０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７）３５ｍｌに細胞ペースト１５ｇを再懸濁する。
ｂ．０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１ ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）に２ｍｇ／ｍｌ新鮮リゾチーム２５ｍｌを加える。３７℃で１時間温置する。
ｃ．Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｋを０．１ｍｇ／ｍｌまで３７℃で１時間加える。
ｄ．ＳＤＳを０．１％まで加える（１０％ストック６ｍｌ）。
ｅ．８％サルコシル溶液６ｍｌを加える。
ｆ．凍結解凍を３回行う。
ｇ．５５℃で１時間温置する。
ｈ．フェノール−ＣＨＣｌ３抽出を３回、ＣＨＣｌ３抽出を２回行う。
ｉ．緩衝液を２回交換しながらＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ４Ｌで４℃にて透析する。
ｊ．ＲＮａｓｅＡ（１ｍＭ）０．５ｍｌを３７℃にて１時間加える。
ｋ．０．８％アガロースゲルでＤＮＡ ３０μｌを泳動させる。この手順によりゲノムＤＮＡ６４０μｇが得られた。ゲノムＤＮＡの寸法はゲル上で１０ｋｂよりも著しく大きかった。
【００３８】
２．プラスミドｐＵＣ２ｉＳｔｕＩの構築
可能なメチラーゼの選択用ベクターを構築するために、プライマー：
【００３９】
【化１】
（ＳｔｕＩＲ開裂部位（ＡＧＧＣＣＴ）を下線で示す）を使用して逆ＰＣＲを２ラウンド行うことにより２個のＳｔｕＩＲ開裂部位をｐＵＣ１９のｂｌａ（Ａｍｐ耐性）遺伝子に組込んだ。
【００４０】
ＰＣＲは以下のように実施した。０．２５μｌのｐＵＣ１９をＰＣＲ１のＰＣＲ鋳型とし、１μｌのｐＵＣ１９（ＳｔｕＩ）を第２ラウンドのＰＣＲ鋳型とした。０、２及び６ｍＭ ＭｇＳＯ４を添加した１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）にプライマー８０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ ４００μＭ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）４単位を加えた。ＰＣＲ条件は９４℃で５分後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で２分４２秒を１８サイクル繰返し、最終温置２分４２秒とした。
【００４１】
第１対のＰＣＲプライマーはｂｌａ（Ａｍｐ耐性）遺伝子にＹ１０３Ａ突然変異を導入すると同時に、ＳｃａＩ部位を除去した。第２対のＰＣＲプライマーによる突然変異はサイレント突然変異である。最終ベクターをＳｔｕＩＲで２回消化し、プラスミドを含む大腸菌細胞を通常のアンピシリンプレートに平板接種することができる（５０〜１００μｇ／ｍｌ）。このプラスミドをｐＵＣ２ｉＳｔｕＩと命名した（図４）。
【００４２】
３．ゲノムＤＮＡの制限消化とゲノムＤＮＡライブラリーの構築
各種単位の制限酵素ＡｐｏＩ（Ｒ／ＡＡＴＴＹ）、ＮｌａＩＩＩ（／ＣＡＴＧ）及びＳａｕ３ＡＩ（／ＧＡＴＣ）を使用してゲノムＤＮＡ ４μｇを制限部分消化した。消化したＤＮＡ ０．５μｇを０．８％アガロースゲルで分析した。ＮｌａＩＩＩとＳａｕ３ＡＩのみから１．５ｋｂ〜１０ｋｂのＤＮＡフラグメントの十分なスペクトルが得られた。同一酵素で消化したサンプルをプールした。１．５ｋｂ〜１０ｋｂの部分を低融点ゲルからゲル精製した。ＮｌａＩＩＩとＳａｕ３ＡＩで部分消化したゲノムＤＮＡをＳｐｈＩとＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ２ｉＳｔｕＩに夫々連結した。連結したＤＮＡを使用してＤＮＡｓｅ Ｉ欠損宿主ＸＬ−１０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ ＪｏＩＩａ，ＣＡ）を形質転換した。各ライブラリーから約２００，０００個のＡｍｐＲ形質転換細胞が得られた。コロニーを集めてプールし、プラスミドを抽出した。ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｄａｍｓｔａｄｔ，ドイツ）から入手したＲｏｓｅｔｔａ ２株にこの混合プラスミド１μｌを形質転換した。プラスミドを再び抽出し、一次プラスミドライブラリーを形成した。
【００４３】
４．メチラーゼ選択法によるｓｔｕＩＭ遺伝子クローニング
各種量の一次プラスミドＤＮＡライブラリー（１μｌから１／２５６μｌ）をＳｔｕＩ ２００単位で３７℃にて１時間攻撃した。消化したＤＮＡを大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ ２に形質転換し、混合ライブラリーから６個のＡｍｐＲ生存細胞を得た。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ法（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によりこれらの生存細胞からプラスミドＤＮＡを作製した。抽出したプラスミドをＳｔｕＩＲで消化した。５個のコロニー（＃１、＃２、＃４、＃５、＃６）はＳｔｕＩＲ消化に耐性であることが判明した。＃２（ｐＳＴ２）はＳｃａＩＲ消化にも耐性であった。他のクローンは汚染性ＤＮＡからの疑陽性であった。ｐＳＴ２プラスミドが確かに所望部位を含んでいることを検証するために、２種のプライマー：
【００４４】
【化２】
を使用してＰＣＲを実施した。
【００４５】
１μｌのｐＳＴ２を鋳型とし、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）にプライマー８０ｐｍｏｌ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ４単位、ｄＮＴＰ各４００μＭを加え、９４℃で５分後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で２分を２５サイクルの条件とした。ＰＣＲ産物は２０７３ｂｐフラグメントであった。ｐＳＴ２とこのＰＣＲ産物をＳｔｕＩＲで消化した処、ｐＳＴ２プラスミドはＳｔｕＩＲ消化に耐性であったが、ＰＣＲ産物はＳｔｕＩＲ消化に感受性であった。この結果、ｐＳＴ２は恐らくＳｔｕＩＭにより修飾されたためにＳｔｕＩＲ消化に対して耐性になった２個のＳｔｕＩ部位を含むことが確認された。
【００４６】
両方向からプラスミドｐＳＴ２のインサートのプライマーウォーキングシーケンシングを３ラウンド実施した処、４７９アミノ酸の蛋白質をコードする１４４０ｂｐのＯＲＦが判明した。このＯＲＦはＮ６Ａ特異的メチラーゼに相同であった。他の隣接ＯＲＦは転写調節因子又はｃａａｘアミノ末端プロテアーゼファミリー蛋白質と相同であった。１４４０ｂｐ ＯＲＦはｓｔｕＩＭであった（図２）。
【００４７】
５．ｓｔｕＩＲの同定
ストレプトマイセス・ツバーシディクスゲノムＤＮＡ各１μｇをＡｇｅＩ、ＡｌｕＩ、ＢｆａＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＫａｓＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｒｕＩ、ＴａｑＩ及びＴｓｐ５０９Ｉで消化した。これらの全酵素はｓｔｕＩＭの上流配列の近傍に１個の部位をもつという理由で選択した。消化したＤＮＡを１×Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎバッファー（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）中、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２００単位の存在下に２ｎｇ／μｌ濃度で自己連結させた。連結したＤＮＡをスピンカラムにより５０μｌまで濃縮した。各々１０μｌを逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）の鋳型として使用した。逆ＰＣＲでは以下のプライマー：
【００４８】
【化３】
を使用した。
【００４９】
以下のＰＣＲ条件を使用した。鋳型１０μｌを使用し、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌバッファー（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）にプライマー８０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ ４００μＭ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）（ｅｘｏ−）４単位を加えた。反応条件は９４℃で５分後、９４℃で３０秒、６５℃で３０秒及び７２℃で２分を３０サイクルとした。ＢｓｒＦＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＮｒｕＩ及びＴｓｐ５０９Ｉに由来する鋳型からＰＣＲフラグメントを生成し、精製した。これらのＰＣＲフラグメントをスピンカラムにより精製し、逆ＰＣＲプライマーにより配列決定した。
【００５０】
ＥｃｏＲＩ消化からの鋳型は元の鋳型配列に９８３ｂｐの新規配列を付加した。２５５アミノ酸の蛋白質をコードする７６８ｂｐの完全ＯＲＦが同定された。これはＧｅｎＢａｎｋのいずれの公知遺伝子にも相同ではない。これをｓｔｕＩＲの候補遺伝子とした（図４）。
【００５１】
６．ＳｔｕＩＲ発現用予備修飾大腸菌株の樹立
ＳｔｕＩＭの発現用として最初にＲｏｓｅｔｔａ ２株（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄａｍｓｔａｄｔ，ドイツ）を選択したのは、レアｔＲＮＡの供給により遺伝子発現が増加する可能性があるためであった。この株はベースプラスミドｐＲＡＲＥ２を含む。このプラスミドがＳｔｕＩＭの発現に必要であったか否かを調べるために、ｐＲＡＲＥ２を抽出し、他の大腸菌株：ＥＲ２５０２、ＥＲ２６８３、ＥＲ２５６６、ＥＲ２５２３、ＢＬ２１に形質転換した。プラスミドｐＳＴ２をＥＲ２５０２、ＥＲ２６８３、ＥＲ２５６６、ＥＲ２５２３及びＢＬ２１に形質転換した。ベースプラスミドｐＲＡＲＥ２を含む宿主株と含まない宿主株をＳｔｕＩＲ開裂部位修飾について比較した（Ｒｏｓｅｔｔａ ２株を対照として使用）。意外にも、ＳｔｕＩＲ消化に完全に耐性であったのは元のｐＳＴ２のみであった。新たに形質転換したＲｏｓｅｔｔａ ２株を含む他の株はＳｔｕＩＲ消化に対して部分的に耐性のプラスミドを生じた。ｐＲＡＲＥ２プラスミドはＳｔｕＩＭの発現を強化しないと思われた。細胞培養物の長さはＳｔｕＩＲ開裂部位修飾に重要な役割を果たさなかった。振盪器で細胞を＞２４時間温置した処、ＳｔｕＩＲ消化に対するプラスミドの耐性は増加することが判明した。（ｐＲＡＲＥ２を含まない）宿主細胞ＥＲ２５０２から単離したｓｔｕＩＭ遺伝子をもつプラスミドではＳｔｕＩＲ消化に対する約８０％の耐性が達成された。ｓｔｕＩＭ遺伝子のクローニングの成功は３つの理由が考えられる。１）ｐＲＡＲＥ２同時発現プラスミドの使用（これは重要な段階でないことが判明した）；２）未知宿主細胞突然変異がｓｔｕＩＭ遺伝子発現を助長した；３）ｐＳＴ２を含む細胞の静止期細胞培養の延長。
【００５２】
ｓｔｕＩＭ遺伝子をＰＣＲ増幅し、以下のプライマー：
【００５３】
【化４】
によりｐＡＣＹＣ１８４にクローニングした。
【００５４】
ＰＣＲは以下の条件で実施した。１μｌのｐＳＴ２を使用し、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファーにプライマー８０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ ４００μＭ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）４単位を加えた。反応条件は９４℃で５分後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で１分３０秒を２５サイクルとした。その後、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、適合可能な末端でｐＡＣＹＣ１８４に連結した。連結したプラスミドをＥＲ２６８３に形質転換し、Ｃａｍを添加したプレートに平板接種した。プラスミド１９個について正しい寸法のインサートを含むか否かについて分析した。このうち６個（＃３、＃４、＃５、＃９、＃１６及び＃１７）はＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ消化により正しい寸法のインサートを含んでいた。他方、これらのプラスミドを含む細胞に由来するゲノムＤＮＡをＳｔｕＩ消化に対して試験した処、ＳｔｕＩＲ消化に耐性のものは皆無であった。ｐＡＣＹＣ−ｓｔｕＩＭはＳｔｕＩＲの発現に使用できないと推論された。
【００５５】
他の非コグネイトメチラーゼを宿主ＤＮＡの修飾／保護について試験した。ＳｔｕＩＲの認識部位はＡＧＧＣＣＴである。内部配列を修飾する非コグネイトメチラーゼはこの配列をＳｔｕＩＲ消化から保護することができると考えられる。ＨａｅＩＩＩメチラーゼ（ＧＧｍ５ＣＣ）、ＦｎｕＤＩメチラーゼ（ＧＧＣＣ、修飾部位不明、５ｍＣメチル化型）及びＰｈｏＩメチラーゼ（ＧＧＣＣ、修飾部位不明、Ｎ４ｍＣメチル化型）遺伝子を大腸菌で発現させた。ｐＬＪｈａｅＩＩＩＭ１０１−１を含むＥＲ１３９８、ｐＭＭｈａｅＩＩＩＲＭ１２７−１とｐＡＣＹＣ１８４ｆｎｕＤＩＭを含むＥＲ１３９８、及びｐＥＴ２１ａｐｈｏＩＲとｐＬＧ３３９ｐｈｏＩＭを含むＥＲ２５６６の各種株に由来するゲノムＤＮＡをＳｔｕＩＲで消化した。ｈａｅＩＩＩＭとｆｎｕＤＩＭを含む株に由来するゲノムＤＮＡはＳｔｕＩＲ消化に耐性であり、ｐｈｏＩＭを含む株はＳｔｕＩＲ消化に感受性であった。プラスミドｐＡＣＹＣ−ｆｎｕＤＩＭをＥＲ２６８３に導入し、予備修飾株を作製した。ゲノムＤＮＡを再び抽出し、ＳｔｕＩＲ消化について試験した。これはＳｔｕＩＲ消化に耐性であった。
【００５６】
７．大腸菌におけるのｓｔｕＩＲの過剰発現
ｓｔｕＩＭに隣接するＯＲＦをＰＣＲ増幅した。
【００５７】
【化５】
【００５８】
ＰＣＲ条件は以下の通りとした。ストレプトマイセス・ツバーシディクスゲノムＤＮＡ１０μｌを使用し、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファーにプライマー８０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ ４００μＭ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ４単位を加えた。反応条件は９４℃で５分を１サイクル；９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４６秒を２５サイクルとした。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化し、同一酵素対で消化したｐＵＣ１９に連結した。連結したプラスミドをｐＡＣＹＣ−ｆｎｕＤＩＭで予備修飾したＥＲ２６８３に形質転換した。ＡｍｐとＣａｍを添加したＬＢ寒天に形質転換細胞を平板接種した。コロニーを釣菌し、ＡｍｐとＣａｍを添加したＬＢ ４ｍｌ中で一晩増殖させた。３８個のサンプルからの一晩細胞培養液１０μｌをＮＥＢバッファー２中、３７℃にて３０分間λＤＮＡに対するＳｔｕＩＲ活性を試験した。３８個のサンプルのうち１６個（＃６、＃７、＃１３、＃１５、＃１７、＃１８、＃１９、＃２０、＃２２、＃２３、＃２６、＃２７、＃３０、＃３４、＃３７及び＃３８）はλＤＮＡを完全に消化することができる。ｐＵＣ１９ベクターに由来するプライマー（Ｓ１２３３Ｓ及びＳ１２２４Ｓ）を使用して３個のクローン（＃６、＃７及び＃１５）のインサートを配列決定した。＃６と＃１５のインサートは野生型ｓｔｕＩＲであることが確認された。次に、一晩培養液１Ｌから新鮮培養液１Ｌに細胞１０ｍｌを継代することにより大量培養液で株の安定性を試験した。ＳｔｕＩＲ発現株を培養液２５Ｌで構成的発現で増殖させた。一晩培養後、ＳｔｕＩの最終発現レベルは湿潤細胞１ｇ当たり〜５×１０６単位であることが判明した（図５）。
【実施例２】
【００５９】
ＳｔｕＩＲのアミノ酸配列を使用して関連制限エンドヌクレアーゼを同定する方法
ＳｔｕＩＲのアミノ酸配列を使用して蛋白質間（ｂｌａｓｔｐ）ＢＬＡＳＴ検索又は蛋白質と翻訳データベース間（ｔｂｌａｓｔｎ）のＢＬＡＳＴ検索を実施する。例えば、このような検索はＮＣＢＩウェブサーバー：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／を介してｂｌａｓｔｐ（又はｔｂｌａｓｔｎ）プログラムを選択し、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して期待値＝１０、ワードサイズ＝３から構成される標準設定値とＥｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１のギャップコストを使用し、「全生物」のＮＲ（非冗長）データベースを検索することにより実施することができる。これらのパラメーターは多少異なる検索結果が得られるように当業者が変更することができる。
【００６０】
ＢＬＡＳＴ検索により復元された出力を試験し、ｅ−０２未満の期待値スコアを生じる配列を調べる。これらの配列はＲＥであると推定される。
【００６１】
同定された推定ＲＥの配列コンテキストを試験し、推定エンドヌクレアーゼに隣接又は近接（１又は２ＯＲＦ以内）する推定ＤＮＡメチルトランスフェラーゼが存在するか否かを調べる。このようなメチルトランスフェラーゼが存在する場合には、公知エンドヌクレアーゼ配列を使用して同定される配列がエンドヌクレアーゼである可能性が高い。
【００６２】
ＳｔｕＩＲと新規に同定された配列の類似性レベルから、２つの配列がアイソシゾマーであるか（例えばＥ＜ｅ−５０の高類似度）又は近縁ではあるが異なる配列を認識する（低類似度）かを予想することができる。
【００６３】
図５に示すように、配列から蛋白質を発現させてこの蛋白質のエンドヌクレアーゼ分解機能を試験する任意従来方法により、同定された配列を試験し、この配列が機能的ＲＥをコードするか否かを調べる。例えば、同定された配列をＰＣＲにより増幅すればよい。その後、遺伝子を無細胞インビトロ転写／翻訳系で発現させ、生成された蛋白質のエンドヌクレアーゼ活性を試験してもよいし、遺伝子をベクターに導入し、大腸菌等の宿主細胞にクローニングしてもよい。形質転換した宿主細胞を次に増殖させ、同定されたエンドヌクレアーゼ遺伝子に蛋白質を発現させ、無細胞溶解液を調製し、エンドヌクレアーゼ活性を試験する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子（ｓｔｕＩＲ）とＳｔｕＩメチラーゼ遺伝子（ｓｔｕＩＭ）からなるＳｔｕＩ Ｒ−Ｍ系の遺伝子構成を示す。
【図２】１４４０ｂｐのｓｔｕＩＭ（配列番号３）とコードされたＳｔｕＩＭアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図３】７６８ｂｐのｓｔｕＩＲ（配列番号１）とコードされたＳｔｕＲＩアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図４】２個のＳｔｕＩ部位を含むクローニングベクターｐＵＣ２ｉＳｔｕＩのマップを示す。
【図５】細胞抽出液における組換えＳｔｕＩＲ活性を示す。λＤＮＡを基質として使用した。レーン１は１ｋｂ ＤＮＡマーカーである。レーン２−９は１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１６００倍、３２００倍、６４００倍、１２８００倍、２５６００倍に希釈した細胞抽出液３μｌを制限消化に加えた。レーン１２はλＤＮＡを天然ＳｔｕＩで消化した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＧＧＣＣＴを認識することが可能な制限エンドヌクレアーゼをコードし、配列番号１に対して少なくとも６５％の配列一致度をもつヌクレオチド配列を含み、該制限エンドヌクレアーゼは配列番号２に対して少なくとも５０％の配列一致度を有する単離ＤＮＡ。
【請求項２】
ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＳｔｕＩＲ）により認識されるヌクレオチド配列における１個以上のヌクレオチドをメチル化することが可能なメチラーゼをコードし、配列番号３に対して少なくとも６５％の配列一致度を有し、該メチラーゼは配列番号４に対して少なくとも５０％の配列一致度を有するＤＮＡセグメント。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡセグメントを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のＤＮＡセグメントを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
請求項２に記載のメチラーゼをコードするＤＮＡセグメントで形質転換された請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下で請求項３に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を培養する段階を含む、組換えＳｔｕＩＲの生産方法。
【請求項１】
ＡＧＧＣＣＴを認識することが可能な制限エンドヌクレアーゼをコードし、配列番号１に対して少なくとも６５％の配列一致度をもつヌクレオチド配列を含み、該制限エンドヌクレアーゼは配列番号２に対して少なくとも５０％の配列一致度を有する単離ＤＮＡ。
【請求項２】
ＳｔｕＩ制限エンドヌクレアーゼ（ＳｔｕＩＲ）により認識されるヌクレオチド配列における１個以上のヌクレオチドをメチル化することが可能なメチラーゼをコードし、配列番号３に対して少なくとも６５％の配列一致度を有し、該メチラーゼは配列番号４に対して少なくとも５０％の配列一致度を有するＤＮＡセグメント。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡセグメントを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項２に記載のＤＮＡセグメントを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項６】
請求項２に記載のメチラーゼをコードするＤＮＡセグメントで形質転換された請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下で請求項３に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を培養する段階を含む、組換えＳｔｕＩＲの生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００９−５２８８３９（Ｐ２００９−５２８８３９Ａ）
【公表日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５８２９９（Ｐ２００８−５５８２９９）
【出願日】平成１９年２月２７日（２００７．２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００５０９９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０３０６１
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５９１０２１９７０）ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２７日（２００７．２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００５０９９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０３０６１
【国際公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【出願人】（５９１０２１９７０）ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド (18)
【Ｆターム（参考）】
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