子宮頸部細胞の細胞学的解析方法
本発明は、子宮頸部細胞障害を診断し、どの患者が癌に進行する可能性があるか予見するための、癌特異的な遺伝的異常をモニターするための診断テストを提供する。遺伝的異常は、３ｑ及び／又は５ｐ標的プローブのＦＩＳＨ解析を用いた３番染色体及び５番染色体の染色体コピー数の同定によって検出される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮頸部細胞における染色体異常の解析のための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は、世界的に最も一般的で致命的な女性の癌の一種である。早期に発見されれば、子宮頸癌及びその先駆病変は効果的に治療され得る。Ｐａｐテストは子宮頸癌の一次スクリーニングであり、形態学的解析を用いて疑わしい細胞を同定する。しかし、単一の細胞診は比較的感度が低く、再現性が低く、曖昧な結果を生じることが多い。パパニコロウ（Ｐａｐ）テストの約６％は意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ；ａｔｙｐｉｃａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）と診断されて追跡検査を必要とし、またＡＳＣＵＳ患者の５〜１０％は未発見の癌である。患者のための現在のガイドラインとして、追跡Ｐａｐテスト、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）検査及び／又はコルポスコピーが挙げられる。
【０００３】
ＨＰＶ感染は子宮頸癌と関連があり、多くの患者はＡＳＣＵＳ・Ｐａｐテスト結果の後にＨＰＶの検査を受ける。高感度ＨＰＶ検査は、その感度の高さによって非常に高い陰性的中率をもたらし、検査で陰性が出た女性は子宮頸癌を発症するリスクが低い。しかし、ＨＰＶ陽性初期病変のごく一部でも高度異形成や癌に進行するため、ＨＰＶ検査の陽性的中率は限定的である。したがって、ＨＰＶの検出は、細胞形態学的評価と組み合わせたとしても特異性の低い検査である。
【０００４】
更に、Ｐａｐテストの約３％は軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ；ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ）と診断される。このような患者のための現在のガイドラインは、追加的なモニタリング及び／又はコルポスコピーを薦めている。臨床研究は、このような患者の多くがＨＰＶ＋であることを示す。
【０００５】
ＡＳＣＵＳ／ＨＰＶ＋又はＬＳＩＬ患者には、より重度の子宮頸疾患に進行し、初期検査の２年後に外科的治療を必要とする顕著なリスクがある。進行する可能性のあるこのような患者の同定を形態学とＨＰＶ感染に基づいて行うのは不可能である。患者の疾病進行リスクを予見できる、子宮頸癌の初期発生における遺伝的変化が同定された。このような異常は、ＤＮＡ量の全体的な変化（例えば、倍数性）、並びに両者共に細胞の不死に関連する３番染色体の一部、特にテロメラーゼタンパク質サブユニットをコードするＴＥＲＣ遺伝子を含む遺伝子座３ｑ２６及び５番染色体の一部、特にテロメラーゼタンパク質の別のサブユニットをコードするＴＥＲＴ遺伝子を含む５ｐ１５の両方の増幅を含む。研究は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって、マルチカラー蛍光ＤＮＡプローブが倍数性並びに３ｑ及び５ｐコピー数の両方における異常を他の方法よりも高い感度と特異性で検出できることを示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
子宮頸癌スクリーニングプログラムの実施は、先進工業国における疾病の発生と死亡とを顕著に低減させた。しかし、単一の細胞学的評価は依然として比較的低感度であり、したがって多くの場合追跡検査を必要とする。このことは、サンプリング又は解釈のミス、一部の初期病変は認識可能な表現型変化を生じ得ないという事実に起因する。浸潤頸癌は、子宮頸部異形成の発達段階を経て、頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）１、ＣＩＮ２及びＣＩＮ３並びに外科的介入を必要とする真の前癌状態の病変と考えられている上皮内癌へと発生する。しかし、全軽度異形成病変の約１５％だけがこの直線進行経路を辿る。Ｐａｐ及びＨＰＶ検査は、子宮頸部異形成又は癌の存在を決定するための間接的方法である。したがって、異形成又は癌の存在を直接的に同定し、疾病進行をモニターするための分子マーカーを用いる方法の必要性は依然として満たされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、フローサイトメトリー又は当業者に知られた他の方法によってハイブリダイゼーションを検出するため、また従来の症状が現れる数年前ではないにしろ、数ヶ月前にどの患者が癌に進行し得るか進行しそうにないか予見するために、遺伝的異常を検出するための様々な細胞学的手法を用いて子宮頸部細胞の遺伝的変化をモニターするための診断方法を提供する。
【０００８】
染色体の異数性及び特定の癌関連遺伝子のコピー数変化の可視化は、細胞学的試料のルーチンの形態学的評価の重要な補完となった。染色体の異数性とその結果生じるゲノム不均衡は、癌細胞に特異的で異なる癌腫で異なり、また疾病進行初期に起こるため、このアプローチは生物学的に有効で成功を収めた。他のヒト癌腫の大部分と同様に、子宮頸癌はゲノム不均衡の分布によって定義される。ヒトパピローマウイルスの高リスクサブタイプの感染に加えて、続く子宮頸部扁平上皮の形質転換は、他の細胞学的異常の中でも染色体腕３ｑ及び５ｐの追加的なコピーの獲得を必要とする。本発明の一態様において、軽度子宮頸部異形成における５ｐ１５増幅と共に３ｑ２６増幅の同定は、個々の病変が高度子宮頸部異形成及び癌へと進行する潜在性に関する情報を提供できる。
【０００９】
一態様において、本発明は、子宮頸部異形成又は癌を含み得る子宮頸部細胞障害の患者の状態を評価するための方法であって、患者から得られた試料において染色体３ｑにおけるゲノム増幅と、染色体５ｐにおけるゲノム増幅と、対照として７番染色体のセントロメア（ＣＥＮ７）の存在及び／又は増幅とを検出するステップを含む方法を提供する。染色体３ｑ及び染色体５ｐのゲノム増幅の検出は、患者の状態が高度子宮頸部異形成に進行したことを示す。７番染色体のゲノム増幅の検出は、子宮頸部細胞の全体的な倍数性状態を測定する。通常、７番染色体のコピー数変化は、子宮頸癌形成初期段階では生じない。７番染色体のゲノム増幅が存在する場合、これは進行性前癌及び癌に関連する状態である異数性を示す。本方法は、患者状態の軽度子宮頸部異形成から高度子宮頸部異形成又は癌状態への変化を評価できる。
【００１０】
本発明の更に別の一態様において、患者状態の軽度から高度子宮頸部異形成へのシフトをモニターするための方法が提供される。本発明の特定の態様において、開示されている方法は、患者状態の軽度子宮頸部異形成から高度子宮頸部異形成状態への変化を評価するステップと、浸潤頸癌発症リスクのある患者を同定するステップと、患者状態の軽度子宮頸部異形成維持又は患者状態の軽度子宮頸部異形成若しくは正常への回復を評価するステップとを含む。
【００１１】
特定の一態様において、本明細書に開示されている方法は、染色体３ｑ及び５ｐにおける遺伝子増幅を検出するステップに加えて、染色体１ｑ、２０ｑ、１２ｑ、１９ｑ、１１ｑ、６ｑ、１７ｐ、７、８ｑ（後期異形成において検出される）、９ｑ、１６ｑ、２ｑ、９ｐ、１０ｑ、１８ｐ及びそれらの任意の組み合わせにおける増幅を検出するステップを更に含むことができる。本発明の更に特定の態様において、３ｑ２６遺伝子座及び５ｐ１５遺伝子座における増幅が検出される。３ｑ２６及び５ｐ１５遺伝子座の検出に加えて、次の染色体座、１ｑ２１〜３１、２０ｑ１２、１２ｑ１３〜２４、１９ｑ１３、１１ｑ２１、７ｑ１１〜２２、８ｑ２４（後期異形成において検出される）、９ｑ３３〜３４、１６ｑ２３、２ｑ３２、９ｐ２２、１０ｑ２１〜２４、１８ｐ１１及びそれらの任意の組み合わせにおける増幅を検出できる。
【００１２】
本明細書に開示されている方法は、染色体３ｑ及び／若しくは染色体５ｐのゲノム増幅が試料中に存在すること、又は染色体３ｑ及び／若しくは染色体５ｐのゲノム増幅が試料中に存在しないことを決定するステップを更に含むことができる。
【００１３】
本発明の別の一態様において、開示されている染色体領域を対象とするプローブが提供され、また本発明の方法を実施するためのキットが提供される。
【００１４】
数例の例示的実施形態の上述及び他の態様は、次の説明及び添付の図面と併せて考慮するとより良く評価、理解できる。尚、次の説明は好ましい実施形態やその多くの具体的詳細を示しているが、これらは限定のためではなく説明のために記載されていると理解するべきである。実施形態の範囲内で、その精神を逸脱することなく多くの変更や修正を施すことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】３ｑ２６染色体コピー数増加増幅によって表される子宮頸癌進行ステージを説明する図である。
【図１Ｂ】３ｑ２６染色体コピー数増加増幅によって表される子宮頸癌進行ステージを説明する図である。
【図１Ｃ】３ｑ２６染色体コピー数増加増幅によって表される子宮頸癌進行ステージを説明する図である。
【図２】３ｑ２６及び５ｐ１５染色体コピー数増加増幅によって表される子宮頸癌進行ステージを説明する図である。
【図３】Ｐａｐテストに続く子宮頸癌発見のための患者管理プロセスを説明する図である。
【図４】３ｑ単独における異常に対する液状処理細胞診患者試料検査から得られた陰性結果の説明図である。
【図５】３ｑ単独における異常に対する液状処理細胞診患者試料検査から得られた陽性結果の説明図である。
【図６】３ｑ及び５ｐにおける異常に対する液状処理細胞診患者試料検査から得られた陽性結果の説明図である。
【図７】３ｑ及び５ｐにおける異常に対する液状処理細胞診患者試料検査から得られた陰性結果の説明図である。
【図８Ａ】３ｑ単独における異常に対する患者の組織生検試料検査から得られた陰性結果の説明図である。ＣＩＮ１組織生検に由来する。
【図８Ｂ】３ｑ単独における異常に対する患者の組織生検試料検査から得られた陰性結果の説明図である。ＣＩＮ２生検に由来する。
【図９Ａ】３ｑ単独における異常に対する患者の組織生検試料検査から得られた陽性結果の説明図である。ＣＩＮ１組織生検に由来する。
【図９Ｂ】３ｑ単独における異常に対する患者の組織生検試料検査から得られた陽性結果の説明図である。ＣＩＮ２組織生検に由来する。
【図９Ｃ】３ｑ単独における異常に対する患者の組織生検試料検査から得られた陽性結果の説明図である。ＣＩＮ３組織生検に由来する。
【図１０】３ｑ及び５ｐにおける異常に対する患者の組織生検試料検査から得られた結果の説明図である。
【図１１】四倍体細胞を用いた３ｑ単独における異常に対する液状処理細胞診患者試料検査の説明図である。
【図１２】四倍体細胞を用いた３ｑ及び５ｐにおける異常に対する液状処理細胞診患者試料検査の説明図である。
【図１３】他の遺伝子の中でもＴＥＲＣ遺伝子位置を含む染色体座３ｑ２６のゲノム構成と、標識ＤＮＡプローブの作製に適したＢＡＣクローンを説明する図である。
【図１４】他の遺伝子の中でもＴＥＲＴ及びＴＲＩＰ１３遺伝子位置を含む染色体座５ｐ１５のゲノム構成と、標識ＤＮＡプローブの作製に適したＢＡＣクローンを説明する図である。
【図１５】５ｐ１５．３３バンドにおけるプローブを同定するために用いられたクローンの順序と、ＴＲＩＰ１３に対する標識ＤＮＡプローブの作製に適した特異的ＢＡＣクローンを説明する図である。
【図１６Ａ】子宮頸部細胞における染色体異常を測定するための本発明の特異プローブによって標的とされ得る遺伝子のリストを説明する図である。
【図１６Ｂ】子宮頸部細胞における染色体異常を測定するための本発明の特異プローブによって標的とされ得る遺伝子のリストを説明する図である。
【図１６Ｃ】子宮頸部細胞における染色体異常を測定するための本発明の特異プローブによって標的とされ得る遺伝子のリストを説明する図である。
【図１６Ｄ】子宮頸部細胞における染色体異常を測定するための本発明の特異プローブによって標的とされ得る遺伝子のリストを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、子宮頸癌と関連する染色体領域のコピー数増加の同定に基づく。癌は遺伝病であり、遺伝子異常は罹患細胞において観察できる。異常は、遺伝子領域の増加或いは減少として遺伝子異常を測定することによって細胞学的に観察できる。また、細胞学的に観察できるにしろできないにしろ、バイオマーカー発現の測定が細胞における病状の診断上の指標となり得るように、特定の遺伝子発現の差異は癌細胞において明らかである。本明細書に記載されている方法は、染色体の異常領域と結合する蛍光標識プローブを用いて子宮頸部細胞ＤＮＡの異常を直接的に同定することができる。期待数より多い又は少ない数のシグナルが観察される場合、細胞試料を罹病と診断でき、細胞学的に観察できる前に子宮頸部異形成を診断できる。この異常を有する患者は、予後不良となる可能性があり、またより進行した子宮頸疾患を発症するリスクが高くなり得る。患者の疾病進行リスクに関してより具体的な情報を提供するために、本明細書に開示されている方法は、細胞診から得られた他の異常結果の中でもＡＳＣＵＳ／ＨＰＶ＋又はＬＳＩＬ・Ｐａｐテストの後に或いはその代わりに行うことができる。
【００１７】
本明細書において、「子宮頸部細胞障害」、「子宮頸障害」又は「子宮頸疾患」は、次の内、即ち、子宮頸癌形成、上皮内病変又は悪性に関して陰性（ＮＩＬＭ；Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｌｅｓｉｏｎ ｏｒ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞，ＨＳＩＬ（ＡＳＣ−Ｈ；Ａｔｙｐｉｃａｌ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌｓ，ＨＳＩＬ）、意義不明異型腺細胞（ＡＧＵＳ；Ａｔｙｐｉｃａｌ Ｇｌａｎｄｕｌａｒ Ｃｅｌｌｓ Ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ；Ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｌｅｓｉｏｎ）、子宮頸部異形成、前癌、前悪性病変、子宮頸癌、子宮頸腺癌、頸部扁平上皮癌、頸部上皮内腫瘍１（ＣＩＮ１）、頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ２）、頸部上皮内腫瘍３（ＣＩＮ３）、上皮内癌、浸潤頸癌及び細胞の細胞学的又は遺伝的異常の内のいずれかを意味する。また、本明細書における「疾病」、「細胞障害」又は「障害」は、細胞の細胞学的又は遺伝的異常のいずれかを含むが、これらに限定されない。
【００１８】
本方法は、疾病進行に関する予後情報並びに子宮頸部扁平上皮細胞及び腺細胞の両方に機能する柔軟性と共に、形態学的に正常細胞及び異常細胞における遺伝的異常の直接的同定を提供する。
【００１９】
コピー数増加
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の宿主ゲノムへの組込みに加えて３ｑコピー数の増加は、両者共に子宮頸部異形成の浸潤癌への進行における重要な関連事象であると思えるように、ＣＩＮ２又はＣＩＮ３の頸癌への進行に関わっている。Ｈｏｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００６ Ｄｅｃ：２１０（４）：４１２−９。より進行したステージの腫瘍又はリンパ節転移腫瘍は、３ｑ、１ｑ及び８ｑの増加並びに１１ｑ、３ｑ、６ｑ及び２ｑの減少を含む更なる染色体不均衡を有する。３ｑ１１〜ｑ２２及び３ｑ２６〜ｑｔｅｒの増加は、リンパ節転移により一般的である。Ｈｕａｎｇ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｆｏｒｍｏｓ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ．２００７ Ｎｏｖ；１０６（１１）：８９４−９０２。
【００２０】
浸潤頸癌に見られる３ｑ増加、特にヒトテロメラーゼ遺伝子（ＴＥＲＣ）における増加は、ＰａｐスメアのＴＥＲＣ増加検出における診断ツールとしてのＦＩＳＨプローブセットの開発に用いられてきた。ＴＥＲＣ増加はＣＩＮ１／ＣＩＮ２からＣＩＮ３及び浸潤癌への進行を予見し得ることが示唆されてきた。Ｈｅｓｅｌｍｅｙｅｒ−Ｈａｄｄａｄ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２００５；１６６：１２２９−１２３８。
【００２１】
５ｐもまた、癌腫で高頻度に観察される構造的変化した染色体である。Ａｔｋｉｎ，Ｎ．Ｂ １９９７ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；９５：３３−３９。Ａｒｉａｓ−Ｐｕｌｉｄｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．２００２ Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ；１：３。Ｈｕａｎｇ Ｆ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．ａｎｄ Ｃｙｔｏ．、１５７：４６−４７。Ｍａｃｖｉｌｌｅ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；５９：１４１−５０。Ｈｅｓｅｌｍｅｙｅｒ Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ；１９：２３３−４０。Ｒａｏ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．２００４ ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ；４：５。５ｐ増加は進んだステージの癌腫へと進行する際に観察され、多くの場合全腕増幅に関与する。Ｈｅｓｅｌｍｅｙｅｒ Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ；１９：２３３−４０。
【００２２】
５ｐ増幅を示した癌細胞系を用いることによって、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子をコードする５ｐ１３．３３における変化の最小領域が定義された。Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２００６；１２０：４３６−４４３。最後に、ＨＰＶ組込み部位もまた５ｐ１１〜１５にマッピングされた。Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２００６；１２０：４３６−４４３。テロメラーゼ活性は、癌細胞不死の一要素である。Ｔａｋｕｍａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．２００４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；１９：１３００−１３０４。Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，３６：４９６−５０２。Ｔｏｓｈｉｋｕｎｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ；８２；８３３−８３７。ｈＴＥＲＴは、テロメラーゼ触媒サブユニットとして同定された。Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，３６：４９６−５０２。
【００２３】
ｈＴＥＲＴ発現は頸癌等、多くの癌細胞系において観察され、特定の癌細胞系は癌性病変においてｈＴＥＲＴ発現が高いが、非癌性組織においては高くないことを示した。Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，３６：４９６−５０２。このようなディファレンシャルな発現は、頸癌よりも肝臓癌に見られ、この結果はｈＴＥＲＴ発現が肝臓癌形成の初期段階に行われたことを示唆する。Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，３６：４９６−５０２。更に、５ｐのｈＴＥＲＴ遺伝子増幅は、ＨＰＶ感染子宮頸癌におけるｈＴＥＲＴのｍＲＮＡ発現増加と密接に相関する。Ｚｈａｎｇ Ａ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；６０：６２３０−６２３５。Ｚｈａｎｇ Ａ．ｅｔ ａｌ．２００２ Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ；３４：２６９−７５。５ｐは、発癌の様々なステージにおいて構造変化する染色体として常に同定される。この構造変化はまた、５ｐにコードされたＴＥＲＴ遺伝子に常に影響すると思われる。
【００２４】
５ｐ増加は、浸潤頸癌において観察された。Ｓｃｏｔｔｏ，ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ ２００８。３ｑ、特に３ｑ２６増加と共に試料で観察される場合、これは子宮頸部異形成から浸潤頸癌へと進んだ病状進行の指標となり得る。少なくとも１種類の対照プローブ（例えばＣＥＰ３、ＣＥＮ７）及び５ｐ、特に、５ｐ１５領域のゲノムプローブと組み合わせた３ｑ、特に染色体バンド３ｑ２６領域のゲノムプローブを用いて、コピー数増加は頸部上皮内腫瘍の浸潤癌への悪性転換に先行し、ＡＳＣＵＳ又はＣＩＮ１からＣＩＮ２又はＣＩＮ３への、またＣＩＮ２又はＣＩＮ３から上皮内癌、浸潤頸癌への移行を更に伴う。更に、３ｑ及び５ｐの両方における増加の同定は、ＡＳＣＵＳ又はＣＩＮ１からＣＩＮ２又はＣＩＮ３への、またＣＩＮ２又はＣＩＮ３から上皮内癌、浸潤頸癌への促進された移行を示す。
【００２５】
本方法は、標的染色体、例えば５ｐ、３ｑ又はそれら両方共のコピー数増加を正常と比較することによる、生じ得る子宮頸部細胞障害の同定を提供する。本明細書において、「正常」は、通常は二倍体の細胞が細胞周期において四倍体相となり四倍性が観察された場合を除いた哺乳類細胞における染色体の二倍性を意味する。
【００２６】
あらゆる細胞は、２３対の染色体の正常な相補物を有し、これは二倍体として説明される状態である。しかし、細胞が増殖し細胞分裂を行う場合、細胞は染色体２３対の第二のセットを生じ、その後各セットは形成された２個の娘細胞に存在するようになる。この状態は四倍体として説明される。四倍性は、体のあらゆる組織や器官で普通に生じる自然なプロセスであるが、概して低頻度で起こる。癌の一指標は、制御不能な細胞増殖と複製である。これは通常、正常細胞における標準的な複製制御システムから細胞を逸脱させる細胞の染色体における複数の異常が原因で起こる。染色体におけるこれら複数の異常は、染色体相補物がもはや２３対ではなくそれ以外のものである異数性として説明される状態をもたらす。通常、異数体細胞は、一部染色体の余分のコピーを有し、他の染色体を失い、更に２本以上の染色体を一体に融合することによって雑種染色体を形成した細胞である。非常に活発な細胞分裂及び四倍体は、異数体細胞が発生する基礎を提供する。したがって四倍体は、異数体細胞及びより重篤な細胞障害の発生に対するより高いリスクレベルを示す変動状態となり得る。したがって、これら方法は、本明細書に開示されている方法に従って四倍性を測定し、子宮頸部細胞障害及び生じ得る子宮頸癌進行の同定を提供することができる。
【００２７】
方法
本方法は、子宮頸部異形成の診断及び予後マーカーとして用いることができる。倍数性異常及び／又は３ｑコピー数増加及び／又は５ｐコピー数増加を有する患者は、予後不良であり、より進行した子宮頸疾患を発症するリスクが高い。
【００２８】
本発明の一実施形態は、染色体５ｐ及び３ｑの遺伝子座並びにＣＥＮ７を対象とするマルチカラーＦＩＳＨプローブ、特に５ｐ１５及び３ｑ２６を対象とするプローブを用いて子宮頸部の細胞学的試料におけるＤＮＡ量及び３ｑ＋５ｐコピー数変化を同定することである。好ましい一実施形態において、異なる標的のプローブは、標的を区別できるように異なる色の蛍光となるであろう。
【００２９】
本発明の一実施形態は、患者から得られた試料において染色体３ｑにおけるゲノム増幅、染色体５ｐにおけるゲノム増幅並びにＣＥＮ７の存在及び／又は増幅を検出するステップを含む、子宮頸部異形成又は癌の患者状態を評価するための方法を提供することである。染色体３ｑ及び染色体５ｐのゲノム増幅の検出は、患者状態の軽度から高度子宮頸部異形成への進行を示す。
【００３０】
本発明の方法は、患者試料における軽度から高度子宮頸部異形成状態への変化、染色体３ｑにおけるゲノム増幅、染色体５ｐにおけるゲノム増幅並びにＣＥＮ７の存在及び／又は増幅をモニターするために用いることができる。染色体３ｑ及び染色体５ｐのゲノム増幅の検出は、患者状態の高度子宮頸部異形成への進行を示す。
【００３１】
本明細書に開示されている方法は、染色体３ｑ及び５ｐにおける遺伝子増幅の検出するステップに加えて、染色体１ｑ、２０ｑ、１２ｑ、１９ｑ、１１ｑ、６ｑ、１７ｐ、７、８ｑ（後期異形成において検出される）、９ｑ、１６ｑ、２ｑ、９ｐ、１０ｑ、１８ｐ及びそれらの任意の組み合わせにおける増幅を検出するステップを更に含んでもよい。
【００３２】
本発明の特定の実施形態において、Ｃｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ領域を含む３ｑ２６遺伝子座及び５ｐ１５遺伝子座バンドにおける増幅が検出できる。本発明の更に特定の実施形態において、３ｑ２６及び５ｐ１５遺伝子座の検出に加えて、次の染色体座、即ち、１ｑ２１〜３１、２０ｑ１２、１２ｑ１３〜２４、１９ｑ１３、１１ｑ２１、７ｑ１１〜２２、８ｑ２４（後期異形成において検出される）、９ｑ３３〜３４、１６ｑ２３、２ｑ３２、９ｐ２２、１０ｑ２１〜２４、１８ｐ１１及びそれらの任意の組み合わせにおける増幅が検出できる。
【００３３】
本方法は、染色体３ｑ及び／又は染色体５ｐのゲノム増幅が試料に存在しないことを決定するステップを更に含んでもよい。異数性が発見され子宮頸部細胞障害が同定された状態と比較する場合、染色体増幅の喪失は細胞障害の回復と場合によっては疾病回復に対して暗示的となり得る。
【００３４】
本方法は、後期異形成を評価及びモニターするために用いることができ、染色体５ｐ及び８ｑ、特に８ｑ２４と共に染色体３ｑにおけるゲノム増幅を検出するステップを含む。３ｑにおける増幅と組み合わせた８ｑコピー数の増加及び／又は５ｐコピー数の増加は、頸部上皮内腫瘍の浸潤癌への悪性転換を示し、ＡＳＣＵＳ／ＣＩＮ１からＣＩＮ２／ＣＩＮ３への、またＣＩＮ２／ＣＩＮ３から上皮内癌、浸潤頸癌への移行を更に伴うことができる。更に、３ｑと５ｐの両方における増加の同定は、ＡＳＣＵＳ／ＣＩＮ１からＣＩＮ２／ＣＩＮ３への、またＣＩＮ２／ＣＩＮ３から上皮内癌、浸潤頸癌への促進された移行を示す。
【００３５】
本方法は、染色体３ｑ及び５ｐに対するプローブを含み、１ｑ、２０ｑ、１２ｑ、１９ｑ、１１ｑ、６ｑ、１７ｐ、７、８ｑ（後期異形成において検出される）、９ｑ、１６ｑ、２ｑ、９ｐ、１０ｑ、１８ｐに対するプローブ及びそれらプローブの任意の組み合わせを更に含むことができる特異プローブパネルを更に提供する。上述のプローブパネルに関する特定の実施形態において、Ｃｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ領域を含む３ｑ２６遺伝子座及び５ｐ１５遺伝子座に対するプローブに加えて、次の染色体座、即ち１ｑ２１〜３１、２０ｑ１２、１２ｑ１３〜２４、１９ｑ１３、１１ｑ２１、７ｑ１１〜２２、８ｑ２４（後期異形成において検出される）、９ｑ３３〜３４、１６ｑ２３、２ｑ３２、９ｐ２２、１０ｑ２１〜２４、１８ｐ１１及びそれらの任意の組み合わせに対するプローブを用いてもよい。
【００３６】
当業者であれば、本明細書に記載されている遺伝子座の配列に相補的な核酸プローブを調製することができる。更に、多くのこのようなプローブが市販されている。
【００３７】
最近の臨床研究は、ＨＰＶ感染の役割が肛門癌の発生であることに光を当てた。実のところ、メディケア・メディケイド・サービスセンター（ＣＭＳ）は近年、肛門標本の一連の細胞診及びＨＰＶ検査のための保険の提供を始めた。子宮頸部と肛門の発癌は、類似の細胞型とウイルスイニシエーションを含む類似の生物学的特性を備えるため、ゲノム異常及びコピー数変化は、他の遺伝子座の中でも３ｑ及び５ｐで生じる。したがって、本発明の更に別の一実施形態は、他の染色体コピー数変化の中でも３ｑ及び５ｐに対して肛門細胞標本を解析し、患者が肛門疾患に罹患し得るか決定することである。したがって、これら方法は、肛門標本に用いて肛門の発癌に関する有益な臨床情報を提供することができる。
【００３８】
プローブ
本明細書に例示されている特定の遺伝子座と特異的にハイブリダイズするプローブを同定するために、多くの方法を用いることができる。例えば、染色体特異的ライブラリーからクローンを無作為選択することによってプローブを作製し、続いてデジタル画像顕微鏡によってマッピングできる。この手順は米国特許第５，４７２，８４２号明細書に記載されている。全染色体に及ぶ様々なライブラリーも、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．から市販されている。特定の染色体座にハイブリダイズするプローブは、Ａｂｂｏｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｉｎｃ．（デスプレーンズ、イリノイ州）から市販されている。
【００３９】
簡潔に説明すると、ゲノム又は染色体特異的ＤＮＡを制限酵素で消化、或いは機械的に剪断し、少なくとも約２０ｋｂ、より好ましくは約４０ｋｂ〜３００ｋｂのＤＮＡ配列を得る。部分配列消化の技法は、本技術分野においてよく知られている。例えば、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ Ｎ．Ｙ．（１９９８）を参照。その結果生じた配列をベクターと連結し、適切な宿主に導入する。この目的に適した例示的なベクターとして、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）及びＰ１ファージが挙げられる。全染色体に及ぶ様々なライブラリーは、例えばＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓからも市販されている。
【００４０】
ひとたびプローブライブラリーが構築されると、プローブのサブセットは選択された染色体上に物理的にマッピングされる。ＦＩＳＨ及びデジタル画像解析は、クローンの所望の染色体に沿った座位決定するために用いることができる。簡潔に説明すると、例えばＦＩＴＣを蛍光プローブとして用いたＦＩＳＨによって正常細胞の中期細胞伸展物にクローンをマッピングする。染色体は、基剤組成に関係なくＤＮＡを染色する染色試薬（例えば、ＤＡＰＩ又はヨウ化プロピジウム）によって対比染色し、染色体輪郭を画定できる。染色された中期染色体は、色依存的画像変化を避けるため多色ビームスプリッターを備える蛍光顕微鏡で撮像される。様々なカラー画像がＣＣＤカメラを用いて得られ、デジタル画像はコンピューターに保存される。続いてコンピュータープログラムを用いて染色体軸を計算し、（シングルコピー配列に対して）２個のＦＩＴＣシグナルを軸に直角に突出させ、通常はｐ−テロメアである確定座位から平均断片長を計算する。このアプローチは、例えば米国特許第５，４７２，８４２号明細書に記載されている。
【００４１】
本明細書において同定された遺伝子の配列情報によって、これら遺伝子から標的配列の検出に適した高度に特異的なハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーを設計することが可能となる。上述の通り、これら遺伝子の完全配列は公知である。遺伝子内の特定ＤＮＡ配列を検出するための手段は、当業者によく知られている。例えば、遺伝子内の選択されたサブシーケンスに対して相補的になるように選択されたオリゴヌクレオチドプローブを用いることができる。或いは、配列又はサブシーケンスは、プローブを用いた検出の前に様々なＤＮＡ増幅技法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、転写増幅等による）によって増幅できる。ＤＮＡ増幅は、可能な標的サブシーケンスの更に別のコピーをもたらすことによってアッセイの感度を高める。更に、増幅プロセスにおいて標識プライマーを用いることによって、増幅するに従ってＤＮＡ配列を標識できる。
【００４２】
一実施形態において、本発明のプローブは、３ｑ２６．２バンドのＴＥＲＣ遺伝子及び５ｐ１５．３のＴＥＲＴ又はＴＲＩＰ１３の少なくとも一部を対象とし得る。特に、約４９５ｋｂの３ｑ２６領域ＴＥＲＣに対するプローブは、スペクトラム・ゴールドで標識して用いることができ、またスペクトラム・グリーン標識５ｐ１５プローブも同様である。このようなプローブは、Ａｂｂｏｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（デスプレーンズ、イリノイ州）から市販されている。なお、本発明のプローブは、Ｃｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ領域内の遺伝子や図１６Ａ〜図１６Ｄに列挙されている遺伝子等、３ｑ２６及び５ｐ１５上の任意の遺伝子並びに３ｑ２６又は５ｐ１５上の遺伝子の任意の組み合わせ又はその一部を含むことができる。
【００４３】
特定の一実施形態において、検出可能なプローブマーカーは蛍光シグナルを発するか、或いはプローブは発色することができる。プローブは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いてハイブリダイズする。ＦＩＳＨは、染色体上の特定ＤＮＡ配列の有無を検出又は座位決定するために用いられる細胞遺伝学的手法である。ＦＩＳＨは、プローブと高度な配列類似性を示す染色体部分に結合する蛍光プローブを用いる。蛍光顕微鏡は、蛍光プローブが染色体と結合する位置を発見するために用いることができる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞調製物内の特定の核酸配列の可視化を可能にする手法である。特に、ＦＩＳＨは一本鎖蛍光標識ＤＮＡプローブの相補的標的配列への正確なアニーリングを必要とする。プローブの細胞ＤＮＡ部位とのハイブリダイゼーションは、蛍光顕微鏡を用いた直接的な検出によって観察可能となる。
【００４４】
追加的な遺伝物質が検査に必要とされる例において、ゲノムはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅又は検出できる。
【００４５】
本発明の更に別の一実施形態は、本明細書に開示されている方法の実施におけるＤＮＡプローブの良好なハイブリダイゼーションのためのＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）又はＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）標本等、液状処理細胞診標本においてＦＩＳＨを行う手順を提供することである。ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）は、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（スパークス、メリーランド州）から得られる。ＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）は、Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ベッドフォード、マサチューセッツ州）から得られる。
【００４６】
本発明の更に別の一態様は、試料細胞における遺伝子増幅の検出前に、液状処理細胞診標本から扁平上皮細胞と腺細胞を分離するための抗体の使用である。細胞型の分離は、扁平上皮癌と腺癌両方の検出を改善することができ、従来のＰａｐテストでは稀にしか検出されないが、３ｑ２６増幅、５ｐ１５増幅又はそれら両方を示す頸癌の検出を改善することができる。
【００４７】
本方法は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイに用いるための蛍光標識核酸プローブであるプローブを利用できる。標識プローブパネルは、３番、５番及び７番染色体の特定領域並びに本明細書に開示されている他の染色体領域に相同なＤＮＡプローブ配列の少なくとも３色３種プローブ混合物からなることができる。
【００４８】
本明細書において、「標識（単数又は複数）」は、あらゆる組成物、例えば蛍光色素（例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド等、酵素、高電子密度試薬、磁気標識等）を非限定的に含む分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手段によって検出可能なプローブである。直接的には検出されないが間接標識の使用によって検出される標識は、ビオチン及びジオキシゲニン並びに標識抗血清又はモノクローナル抗体が利用できるハプテン及びタンパク質を含む。核酸及びプローブを標識する方法は、当業者によく知られている。好ましい標識は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおける使用に適した標識である。核酸プローブは、ハイブリダイゼーション前に検出可能に標識できる。或いは、ハイブリダイゼーション産物に結合する検出可能な標識を用いてもよい。このような検出可能な標識は、検出可能な物理的又は化学的性質を備える任意の材料を含み、イムノアッセイの分野で良く開発されている。
【００４９】
患者試料由来の子宮頸部扁平上皮及び／又は腺細胞を用いることができる本方法の更に別の実施形態は、本方法を用いて染色体異常を評価することである。
【００５０】
それぞれ異なる蛍光染色試薬によって標識された３種類のプローブを用いた、染色体異常を検出するための３色ＦＩＳＨ法の好ましい実施形態において、通常、複数の色を用いることが望ましい。前記好ましい実施形態において、目的領域にハイブリダイズする２種類の検査プローブは２種類の異なる染色試薬で標識され、別の領域とハイブリダイズする対照プローブは第三の染色試薬で標識される。それぞれが独自の染色試薬で標識されていれば、４種類以上のプローブを用いてもよい。セントロメア等、目的染色体安定領域とハイブリダイズする核酸プローブは対照プローブとして好ましく、試料間のハイブリダイゼーション効率の差を決定できる。
【００５１】
患者から採取された標本又は試料から回収、単離された細胞は、スライド上で固定することができる。標本は本技術分野において公知の様々な技法を用いて回収できる。一実施形態において、標本はＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）及び／又はＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）試料から回収できる。ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）は、子宮頸癌スクリーニングのために用いられるＰａｐテストである。ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）は、患者からＰａｐ試料を採取するための様々な採取器具を備える。その一部は着脱可能な頭部を有するが、これは試料を保持し、直接取り外してスクリーニングに用いられるバイアルに入れ、これによって１００％の試料をプロセシングに利用できるようにする。その全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する米国特許出願第１１／５２１，１４４号明細書に開示されているように、従来のＰａｐスメアと比べて高い検出率を主張するＢＤ ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）液状処理Ｐａｐテストと呼ばれる薄層細胞調製プロセスを用いた液状処理Ｐａｐテストは、着脱可能な頭部を備えるほうき状器具又はブラシ／スパチュラ等、ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）採取器具と共に用いられる。ＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）Ｐａｐは、液状処理細胞診方法である。子宮頸部細胞試料をスライド上に擦り付ける代わりにバイアル内でリンスし、これによって細胞凝集を防ぐ。細胞を実験室で分離して血液や粘膜を除去し、次に、検査する細胞を癌細胞検出実験のためにスライド上に置く。
【００５２】
試料は、ＬＥＥＰ、子宮摘出、錐体生検、ＥＣＣ等、子宮頸部生検、パンチ生検、外科処置由来の組織の分析を含んでもよい。試料は、子宮頚管、膣又は外陰部から摘出した組織又は細胞から調製できる。
【００５３】
ハイブリダイゼーション
一実施形態において、本明細書に開示されている領域は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて同定される。一般に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、次の主要なステップ、（１）解析する組織又は生物学的構造物の固定、（２）標的ＤＮＡの接近をより容易にし、非特異的結合を抑制するための、生物学的構造物のプレハイブリダイゼーション処理、（３）核酸混合物と生物学的試料又は組織の核酸とのハイブリダイゼーション、（４）ハイブリダイゼーションで結合しなかった核酸断片を除去するための、ハイブリダイゼーション後洗浄及び（５）ハイブリダイズした核酸の検出を含む。本明細書に記載の適用のためのハイブリダイゼーションプロトコールは、その全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する米国特許第６，２７７，５６３号明細書に記載されている。
【００５４】
試料において、標的ＤＮＡを一本鎖型に変性し、続いて本方法のプローブとハイブリダイズさせることができる。ハイブリダイゼーションの後、非結合プローブを一連の洗浄によって除去し、核をＤＮＡ特異的染色試薬ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で対比染色する。ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションは、水色及び金色の蛍光シグナルの可視化を可能にする適切な励起及び放射フィルターを備える蛍光顕微鏡を用いて観察できる。ＣＥＮ７、５ｐ１５及び３ｑ２６シグナルの計数は、核の顕微鏡検査によって行われる。
【００５５】
本明細書に開示されている臨床試験は、子宮頸癌早期発見のための組み合わせた数種類のバイオマーカーを用いることができ、現在の形態学に基づいたスクリーニング及び検出方法は重大な制約を有するため、この試験は重要である。３ｑ２６及び５ｐ１５の同定、とりわけ増幅及びその他の細胞遺伝学的異常の同定は、子宮頸癌発症リスクのある患者をより正確且つ精密に同定し、患者に初期治療を受けさせることができる。
【００５６】
画像解析
本発明の一実施形態は、開示されている方法の自動画像解析及び記録を提供することである。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞調製物内の特定の核酸配列の可視化を可能にする技法である。特に、ＤＮＡ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、一本鎖蛍光標識ＤＮＡプローブの相補的な標的配列への正確なアニーリングを必要とする。プローブの細胞ＤＮＡ部位へのハイブリダイゼーションは、蛍光顕微鏡を用いた直接検出によって可視化される。本明細書に記載されている方法は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの一部としての利用のための、蛍光標識された核酸プローブであるプローブを利用する。好ましい一実施形態において、プローブパネルは、３番、５番及び７番染色体の特定領域に相同なＤＮＡプローブ配列の３色３種類のプローブ混合物からなる。プローブ混合物は、染色体３ｑ２６、５ｐ１５及び７番染色体セントロメア（ＣＥＮ７）に対する遺伝子座特異的プローブからなる。
【００５７】
本発明の一実施形態は、ＦＩＳＨプローブシグナルの自動画像解析を提供することである。顕微鏡は、顕微鏡ステージ上の標本／スライド内視野のデジタル画像を自動記録させることができる。このような顕微鏡のメーカーは、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｌｅｉｃａ、Ｎｉｋｏｎ及びＯｌｙｍｐｕｓ等である。また、本方法は、とりわけＩｋｏｎｉｓｙｓ（コネチカット州）、Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ（マサチューセッツ州及びドイツ）、Ｂｉｏｉｍａｇｅｎｅ（カリフォルニア州）並びにＢｉｏｖｉｅｗ（マサチューセッツ州及びイスラエル）等の団体によって開発された顕微鏡ソフトウエアシステム等、自動画像解析のためのソフトウエアプラットフォームを提供する。このような自動システムは、患者試料の３ｑ染色体単独又は５ｐと組み合わせた異常の観察に適用できる。
【００５８】
標本から回収された細胞はスライド上で固定できる。標的ＤＮＡをその一本鎖型に変性し、続いてプローブとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションに続いて、非結合プローブを一連の洗浄によって除去することができ、核をＤＮＡ特異的染色試薬ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で対比染色する。プローブのハイブリダイゼーションは、３種類の蛍光シグナルの可視化を可能にする適切な励起及び放射フィルターを備える蛍光顕微鏡を用いて観察できる。ＣＥＮ７、５ｐ１５及び３ｑ２６シグナルの計数は、核の自動顕微鏡検査によって行われる。
【００５９】
プローブセットとＤＡＰＩ対比染色は、１００ワット水銀灯並びに次のフィルター、ＤＡＰＩ、スペクトラム・アクア（７番染色体セントロメア）、スペクトラム・グリーン（５ｐ１５における遺伝子座）及びスペクトラム・オレンジ（３ｑ２６における遺伝子座）又は本技術分野において公知で本明細書に開示の他の標識及びプローブのフィルターを備える落射蛍光顕微鏡で観察できる。ＤＡＰＩフィルターと１００×倍率によって、患者スライドの試料範囲を手早く走査し、細胞の量と質を決定できる。標的範囲の左上四分円の解析を始める。６３×油浸対物レンズを用いて視野を左から右へ、また上から下へ、同一範囲を再走査することなく走査した。本システムは、合計１０００個の細胞を計数できる。本方法は、細胞計数を自動記録するステップを更に含む。
【００６０】
スライド解析手順の臨床的な意義。標本に対するＦＩＳＨ実験手順の実施は手腕を問われるものである一方、その結果である手続分析を疾病の文脈内に置く必要があり、臨床実務に対して技術結果の妥当性を決定しなければならない。本明細書に開示されている方法は、子宮頸部細胞障害に関連する特定遺伝子座における染色体コピー数の直接的な評価となるよう考案されている。癌を発症するかなり以前に、Ｐａｐテスト等、子宮頸癌スクリーニング標本においてこのような遺伝的異常が存在することは、患者の管理及び治療と密接な関係を有する。標本のＦＩＳＨに基づく解析結果は、臨床ケアガイドライン及び手順内で考慮することができる。
【００６１】
少なくとも８００個の細胞、好ましくは１０００個の細胞における染色体コピー数の決定は、各臨床標本の十分なサンプリングとなることができる。８００個未満の細胞又は１０００個より多い細胞を本システムにおいて利用してもよい。本方法及びシステムは、サンプリング変動及びスライド作製手順の制約を克服する。本方法及びシステムは、染色体コピー数変化の有る標本と変化の無い標本との間の閾値を決定するよう、専門医療機関（ＡＣＭＧ）によって推奨された方法と一致する。Ｗｏｌｆ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｅｒｉｏｄ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ。
【００６２】
自動化方法及びシステムは、陽性標本に対して少なくとも９０％の精密性を提供し、疾病進行リスクが増加した患者を同定する。本方法及びシステムは、９５％より高い精密性を更に提供できる。
【００６３】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞調製物内の特定の核酸配列の可視化を可能にする技法である。従来、プローブシグナルの可視化は、高度な訓練を受けた作業員による手作業で行われてきた。しかし、現在の技術を適用して画像収集及び解析プロセスを自動化することが可能である。Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｌｅｉｃａ、Ｎｉｋｏｎ及びＯｌｙｍｐｕｓによって製造された顕微鏡等、今日の市場における顕微鏡によって、ユーザーは顕微鏡ステージ上の標本／スライド内の視野のデジタル画像を収集できる。これらメーカーの一部は、標本／スライドから自動画像収集を行うのに利用可能なソフトウエアを有する。更に、多くの団体（とりわけＩｋｏｎｉｓｙｓ、Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏｉｍａｇｅｎｅ、ＢｉｏＶｉｅｗ、Ａｐｅｒｉｏ、Ｖｅｎｔａｎａ）は、特に商業実験室における使用のためにソフトウエアプラットフォームを作製した。これら団体の一部は、Ｉｋｏｎｉｓｙｓ製Ｉｋｏｎｉｓｃｏｐｅ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｙｓｔｅｍや、Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ製Ｍｅｔａｆｅｒ及びＭｅｔａｃｙｔｅ等、顕微鏡プラットフォームと自動イメージングソフトウエアの両方を含むシステムを有する。
【００６４】
解析する標本の種類及びソースは、解析プロセスと手順に直接影響を与える。各組織型は独自の生物学的特性と構造を有し、その上、各々の癌は発癌率に影響を与える異なる因子によって異なるように発生する。したがって、本発明は、標本の自動画像収集及び解析のための多くの方法を提供する。
【００６５】
本システム及び方法の一実施形態は、ＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）及びＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）に加えて任意の細針生検（ＦＮＡ）、唾液又は綿棒による回収等、液状処理細胞診標本を含む顕微鏡スライド上に均一な単層細胞で置くことのできる懸濁液中の標本と共に用いられることである。この自動化方法は、ＦＩＳＨ調製スライド上の細胞に覆われた全範囲をスクリーニングし、ＤＡＰＩ染色を用いて細胞核を識別する。システムは、次にＤＡＰＩ染色領域内の各プローブシグナルを計数し、同定された各プローブのコピー数を記録する。ソフトウエアシステムは、少なくとも８００個の細胞の結果が得られるまで、細胞及び各細胞内の染色体コピー数の自動記録を続ける。８００個の細胞の閾値が得られると、ソフトウエアは、撮像計数された各細胞を、同定された各染色体コピー数に基づくカテゴリーに分類する。３ｑ２６、５ｐ１５及びＣＥＮ７の各プローブにつき２コピーを備える正常細胞は、２、２、２カテゴリーに分類される。異常細胞は、そのプローブシグナルパターンによって同定される。例えば、ＣＥＮ７プローブを２コピー、３ｑ２６プローブを５コピー、５ｐ１５プローブを３コピー備える細胞は、２、５、３カテゴリーに分類され得る。撮像された全細胞が分類されると、標本は陽性／陰性疾病閾値に対して評価することができる。自動イメージングシステムによって異常と同定された全細胞は、医者に検査結果を連絡する前に、訓練された作業員によって手作業で再検査し検証してもよい。本方法及びシステムは、自動検証を更に提供する。特定の細胞閾値数は標本の種類や収集方法によって変化し得る。更に、ソフトウエアは、生物学的特性（細胞形、細胞サイズ、核のＤＮＡ量、細胞同士の近傍性、細胞型等）又は疾病関連差異（異常数を有する遺伝子座の数、１細胞内の遺伝子座における異常の数、異常と生存又は治療応答との関係）を反映するように適用できる。本方法及びシステムは、全範囲の代わりに、スライド上の細胞に覆われた範囲の代表サンプリングに用いることができ、通常、撮像細胞の最低閾値が達成されるまで細胞密度に基づいて複数の視野又は経路を撮像することによって行われる。
【００６６】
本システム及び方法の更に別の一実施形態は、ＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）及びＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）に加えて任意の細針生検（ＦＮＡ）、唾液又は綿棒を用いた回収等、液状処理細胞診標本を含む顕微鏡スライド上に均一な単層細胞で置くことのできる懸濁液中の標本と共に用いてよいことである。この自動化方法は、ＦＩＳＨ調製スライド上の細胞に覆われた全範囲をスクリーニングし、ＤＡＰＩ染色を用いて細胞核を識別する。システムは、次にＤＡＰＩ染色領域内の各プローブシグナルを計数し、同定された各プローブのコピー数を記録する。ソフトウエアシステムは、スライド上の全細胞の結果が得られるまで、細胞及び各細胞内の染色体コピー数の自動記録を続ける。全細胞を撮像すると、ソフトウエアは、撮像計数された各細胞を、同定された各染色体のコピー数に基づくカテゴリーに分類する。例えば、３ｑ２６、５ｐ１５及びＣＥＮ７の各プローブにつき２コピーを備える正常細胞は、２、２、２カテゴリーに分類される。異常細胞は、そのプローブシグナルパターンによって同定される。例えば、ＣＥＮ７プローブを２コピー、３ｑ２６プローブを５コピー、５ｐ１５プローブを３コピー備える細胞は、２、５、３カテゴリーに分類される。全細胞を撮像、計数及び分類すると、ソフトウエアは最大数の異常を有する細胞を同定し、高度異常細胞の降順ランクに基づく順序を提供する。このような標本内の高度異常細胞のランクに基づく順序は、陽性／陰性疾病閾値に対して評価することができる。通常、自動イメージングシステムによって異常と同定された細胞は、検査結果を本技術分野において公知の方法を用いてコンピューターで医者に連絡する前に、訓練された作業員によって手作業で再検査され検証されるが、必ずしもそうとは限らない。特定の細胞閾値数は標本の種類や収集方法によって変化し得る。更に、ソフトウエアは、生物学的特性（細胞形、細胞サイズ、核のＤＮＡ量、細胞同士の近傍性、細胞型等）又は疾病関連差異（異常数を有する遺伝子座の数、１細胞内の遺伝子座における異常の数、異常と生存又は治療応答との関係）を反映するように適用できる。本実施形態は、全範囲の代わりに、スライド上の細胞に覆われた範囲の代表サンプリングに用いることができ、通常、撮像細胞の最低閾値が達成されるまで細胞密度に基づいて複数の視野又は経路を撮像することによって行われる。臨床及び疾病意義がサブセットで公知であれば、ランク順の異常細胞サブセットだけが陽性／陰性検査閾値に対して再検査され得る。通常、サブセットは標本内の最も異常な２５個又は５０個の細胞であるが、他のサブセットも標本ソース、収集法及び疾病に依存して同定及び利用され得る。
【００６７】
更に別の一実施形態は、生検や外科的処置によって得られた標本等、組織利用標本と共に用いることができる。更に、本システム及び方法は、同一の組織利用標本に由来するヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）で染色されたコンパニオンスライドを用いることができる。この自動化方法は、ＦＩＳＨ調製スライド上の組織利用標本に覆われた全範囲をスクリーニングし、ＤＡＰＩ染色を用いて細胞核を識別する。システムは、次にＤＡＰＩ染色領域内の各プローブシグナルを計数し、同定された各プローブのコピー数を記録する。ソフトウエアシステムは、組織利用標本全体が検査されるまで、細胞及び各細胞内の染色体コピー数の自動記録を続ける。続いてソフトウエアは、ＤＡＰＩ染色で識別された少なくとも２５個の核を含むスライドの小区分を評価する。小区分位置の選択は、Ｈ＆Ｅコンパニオンスライドにおける疾病指標に基づいて導かれる。通常、少なくとも２個の小区分が各標本で選択される。続いてソフトウエアは、撮像計数された各細胞を、同定された各染色体のコピー数に基づくカテゴリーに分類する。例えば、３ｑ２６、５ｐ１５及びＣＥＮ７の各プローブにつき２コピーを備える正常細胞は、２、２、２カテゴリーに分類される。異常細胞は、そのプローブシグナルパターンによって同定される。例えば、ＣＥＮ７プローブを２コピー、３ｑ２６プローブを５コピー、５ｐ１５プローブを３コピー備える細胞は、２、５、３カテゴリーに分類される。撮像された全細胞が分類されると、同定されたプローブシグナル数がシステムによって計数された全核数と比較され、一遺伝子座当たりの染色体コピー数対、計数された細胞数の比率が得られる。各染色体座の比率が決定されると、標本は陽性／陰性疾病閾値に対して評価できる。通常、自動イメージングシステムによる異常比率で同定された全標本小区分は、医者に検査結果を連絡する前に、訓練された作業員によって手作業で再検査され検証される。特定の小区分のサイズ及び計数される核の数は、標本の種類や収集方法によって変化し得る。更に、ソフトウエアは、生物学的特性（細胞形、細胞サイズ、核のＤＮＡ量、細胞同士の近傍性、細胞型、組織内の位置、細胞質の量等）又は疾病関連差異（異常数を有する遺伝子座の数、１細胞内の遺伝子座における異常の数、異常と生存又は治療応答との関係、組織利用標本における異常の位置等）を反映するように適用できる。
【００６８】
更に別の一実施形態において、本システム及び方法は、生検又は外科的処置から得られた標本等、組織利用標本と共に用いることができる。この自動化方法は、ＦＩＳＨ調製スライド上の組織利用標本に覆われた全範囲をスクリーニングし、ＤＡＰＩ染色を用いて細胞核を識別する。次にシステムは、ＤＡＰＩ染色領域内の各プローブシグナルを計数し、同定された各プローブのコピー数を記録する。ソフトウエアシステムは、組織利用標本全体が検査されるまで、細胞及び各細胞内の染色体コピー数の自動記録を続ける。続いてソフトウエアは、ＤＡＰＩ染色で識別された少なくとも２５個の核を含むスライドの小区分を評価する。通常、少なくとも２個の小区分が各標本で選択される。その後、ソフトウエアは、撮像計数された各細胞を同定された各染色体コピー数に基づくカテゴリーに分類する。例えば、３ｑ２６、５ｐ１５及びＣＥＮ７の各プローブにつき２コピーを備える正常細胞は、２、２、２カテゴリーに分類される。異常細胞は、そのプローブシグナルパターンによって同定される。例えば、ＣＥＮ７プローブを２コピー、３ｑ２６プローブを５コピー、５ｐ１５プローブを３コピー備える細胞は、２、５、３カテゴリーに分類される。撮像された全細胞が分類されると、同定されたプローブシグナル数がシステムによって計数された全核数と比較され、一遺伝子座当たりの染色体コピー数対、計数された細胞数の比率が得られる。各染色体座の比率が決定されると、標本は陽性／陰性疾病閾値に対して評価できる。通常、自動イメージングシステムによる異常比率で同定された全標本小区分は、医者に検査結果を連絡する前に、訓練された作業員によって手作業で再検査され検証される。特定の小区分のサイズ及び計数される核の数は、標本の種類や収集方法によって変化し得る。更に、ソフトウエアは、生物学的特性（細胞形、細胞サイズ、核のＤＮＡ量、細胞同士の近傍性、細胞型、組織内の位置、細胞質の量等）又は疾病関連差異（異常数を有する遺伝子座の数、１細胞内の遺伝子座における異常の数、異常と生存又は治療応答との関係、組織利用標本における異常の位置等）を反映するように適用できる。
【００６９】
スコアデータは、シグナル（例えば、３ｑ、５ｐ又はＣＥＮ７）の内いずれか１種類の数を計算し、記録された全核数で割り、その数をスコアシート上部のチャートに記録することによって解析できる。２より大きい結果は、ある所定のプローブが増幅されたとして記録、報告される。
【００７０】
スコアデータは、シグナル（３ｑ、５ｐ又はＣＥＮ７）の内いずれか１種類の数を足し、記録された全核数で割ることによって解析される。２より大きい結果は、ある所定のプローブが増幅されたと報告できる。画像は、標本ナンバー及びスライドナンバーで命名されて保存される。
【００７１】
他の実施形態において、本発明は、開示されている領域における染色体異常検出のためのキットを提供する。好ましい一実施形態において、キットは、本明細書に記載されている領域に対する１種又は複数のプローブ及び開示されているプローブの任意の組み合わせを含む。キットは、遺伝的変化の検出におけるキット内容物の使用方法を説明する取扱説明材料を追加的に含むことができる。キットは、プローブの検出を容易にする様々な標識又は標識試薬、バッファー、間期細胞伸展物、ウシ血清アルブミン及びブロッキングプローブ等の他のブロッキング試薬を含むハイブリダイゼーション試薬、細針、綿棒、アスピレーター等のサンプリング器具、ハイブリダイゼーションの陽性対照及び陰性対照並びに本技術分野において公知の他の対照の内の１つ又は複数を含むこともできる。
【００７２】
次の図及び関連実施例の例示的な説明は、本明細書、特に実施例において頻繁に用いられている特定の用語の理解を容易にするために提供されている。説明は便宜のために提供されており、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７３】
（例１）
前もって調製された薄層液状処理細胞診試料（ＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）、Ｃｙｔｙｃ、モールバラ、マサチューセッツ州）でＦＩＳＨを行った。スライドをＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）バイアルから作製し、続いてプロテアーゼ消化、ホルムアルデヒド固定、洗浄及び脱水を含む、前処理プロトコールに付した。２色複数標的の間期細胞ＦＩＳＨプローブキット（Ａｂｂｏｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いてハイブリダイゼーションを行った。キットは、ＣＥＮ７−アクア、３ｑ２６（３ｑ−オレンジ）及び５ｐ１５（５ｐ−グリーン）の遺伝子座に直接標識プローブを含む。蛍光顕微鏡を用いて細胞を解析した。
【００７４】
試料は、解析のため最小で８００個の細胞を含む。陽性検査は、異数性と、（１）解析された細胞の１．０％以上における３ｑコピー数又は５ｐコピー数の増加、（２）解析された細胞の０．９％以上における３ｑコピー数のみ増加、又は（３）解析された細胞の０．７％以上における５ｐコピー数のみ増加を示した。陰性検査は、正常な倍数性と、（１）解析された細胞の１．０％未満が３ｑコピー数と５ｐコピー数の両方の増加、（２）解析された細胞の０．９％未満が３ｑコピー数のみ増加、又は（３）解析された細胞の０．７％未満が５ｐコピー数のみ増加を示した。倍数性異常及び／又は３ｑコピー数増加試料は、予後不良及びより進行した子宮頸疾患発症リスクを有すると決定された。
【００７５】
結果は、子宮頸部異形成における診断及び予後マーカーとなり得る。倍数性異常及び／又は３ｑコピー数と５ｐコピー数の増加試料は、予後不良及び更に進行した子宮頸疾患発症リスクを有すると決定された。
【００７６】
（例２）
図６の評価。この標本は、３ｑ２６上のＴＥＲＣ遺伝子及び５ｐ１５上のＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ遺伝子座の異常コピー数を明らかにした。解析した１０００個の細胞の内、９８６個の細胞が正常であったが、８個はＴＥＲＣ（３ｑ）の余剰コピーのため異常であることが分かり、２個はＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ（５ｐ）の余剰コピーのため異常であることが分かり、４個はＴＥＲＣ及びＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ（３ｑ及び５ｐ）の余剰コピーのため異常であることが分かり、異常細胞率は１．４０％であった。
【００７７】
（例３）
図７の評価。この標本は、３ｑ２６上のＴＥＲＣ遺伝子及び５ｐ１５上のＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ遺伝子座の正常コピー数を明らかにした。解析した１０００個の細胞の内、９９８個の細胞が正常であったが、２個はＴＥＲＣ（３ｑ）の余剰コピーのため異常であることが分かり、０個はＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ（５ｐ）の余剰コピーのため異常であることが分かり、０個はＴＥＲＣ及びＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ（３ｑ及び５ｐ）の余剰コピーのため異常であることが分かり、異常細胞率は０．２０％であった。
【００７８】
（例４）
染色体領域３ｑ２６上のＴＥＲＣ遺伝子に特異的なプローブによる蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、ヒトテロメラーゼ遺伝子（ＴＥＲＣ）３ｑ２６の解析を行った。更に、ＣＥＮ７に特異的なプローブを用いてＤＮＡ倍数性を評価した。子宮頸部細胞をスライドに固定し、これら蛍光プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション解析を行って、正常細胞及び異常細胞の存在を評価した。
【００７９】
（例５）
図５の評価。この標本は、ＴＥＲＣ遺伝子の異常コピー数を明らかにした。ＴＥＲＣの異常コピー数を有する細胞の代表的な画像と共に示す。解析された１０３０個の細胞の内、１０１２個の細胞は正常であったが、１８個は異常であることが分かり、異常細胞率は１．８５％であった。
【００８０】
（例６）
図４の評価によって、ＴＥＲＣ遺伝子の正常なコピー数が明らかになった。３ｑ２６における遺伝子の増幅は検出されず、７番染色体セントロメアの評価は、正常な二倍体細胞であることを示した。これは、上に列挙されている以外の部位で生じる他の異常を除外しているわけではない。ＴＥＲＣの正常コピーを有する細胞の代表的な画像と共に示す。解析された８００個の細胞の内、７９９個の細胞は正常であったが、１個は異常であることが分かり、異常細胞率は０．１％であった。
【００８１】
（例７）
組織ＦＩＳＨ
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織標本から作製した厚さ４ミクロンの組織切片でＦＩＳＨを行った（図８及び図９）。スライドをプロテアーゼ消化、洗浄及び脱水を含む前処理プロトコールに付した。ＣＥＮ７−アクア及び３ｑ２６遺伝子座（３ｑ−オレンジ）に対する直接標識プローブ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ製のプローブ）を含む２色ＦＩＳＨプローブセットを用いてハイブリダイゼーションを行った。切片をＤＡＰＩで対比染色し、蛍光顕微鏡を用いて細胞を解析した。
【００８２】
試料当たり最小で５０個の細胞の倍数性状態を解析した。選択された細胞における３ｑ２６プローブシグナルの核に対する比率が２．０以上の場合、試料を異数性と判定した。選択された細胞における３ｑ２６プローブシグナルの核に対する比率が２未満である場合、試料を正常な倍数性を有すると判定した。倍数性異常及び／又は３ｑコピー数増加の患者は、予後不良のリスクがあり、より進行した子宮頸疾患を発症する高いリスクがあると決定した。
【００８３】
結果は、子宮頸部異形成の診断及び予後マーカーとなり得る。倍数性異常及び／又は３ｑコピー数増加の試料は、予後不良及びより進行した子宮頸疾患の発症リスクがあると決定した。
【００８４】
（例８）
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織標本から作製した厚さ４ミクロンの組織切片でＦＩＳＨを行った（図１０）。スライドをプロテアーゼ消化、洗浄及び脱水を含む前処理プロトコールに付した。３色ＦＩＳＨプローブセットを用いてハイブリダイゼーションを行った。このセットはＣＥＮ７−アクア、３ｑ２６遺伝子座（３ｑ−オレンジ）及び５ｐ１５遺伝子座（５ｐ−グリーン）に対する直接標識プローブを含む（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ製プローブ）。切片をＤＡＰＩで対比染色し、蛍光顕微鏡を用いて細胞を解析した。試料当たり最小で５０個の細胞の倍数性状態を解析した。
【００８５】
（１）選択された細胞における３ｑ２６プローブシグナルの核に対する比率が２．０以上である、（２）選択された細胞における５ｐ１５プローブシグナルの核に対する比率が２．０以上である、（３）選択された細胞における３ｑ２６及び５ｐ１５プローブシグナルの核に対する比率が２．０以上である場合、試料は異数性を有すると判定した。選択された細胞における３ｑ２６、５ｐ１５又は３ｑ２６と５ｐ１５両方のプローブシグナルの核に対する比率が２未満である場合、試料は正常な倍数性を有すると判定された。倍数性異常及び／又は３ｑコピー数の増加を有する試料は、予後不良及びより進行した子宮頸疾患発症リスクがあると決定した。
【００８６】
結果は、子宮頸部異形成の診断及び予後マーカーとなり得る。倍数性異常及び／又は３ｑ若しくは５ｐコピー数増加を有する試料は、予後不良リスク及びより進行した子宮頸疾患発症リスクがあると決定した。
【００８７】
（例９）
使用試薬の調製
１％ホルムアルデヒド溶液を調製するため、２．７ｍＬの３７％ホルムアルデヒド溶液と９７．３ｍＬの１×ＰＢＳを合わせ、最終容量１００ｍＬとする。完全に混合する。溶液をコプリンジャーに注ぐ。２×ＳＳＣを調製するため、１００ｍｌの２０×ＳＳＣと９００ｍｌのｄＨ２を合わせ、最終容量１０００ｍｌとする。
【００８８】
（例１０）
エタノール洗浄液
１００％エタノールとｄＨ２Ｏを用いて７０％、９０％希釈液を調製する。希釈液は、蒸発したり過剰使用で溶液が希釈されなければ、１週間用いることができる。使用しないときは蓋付容器で室温保存する。
【００８９】
０．４×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０を調製するため、２０ｍｌの２×ＳＳＣと７７．７ｍｌのｄＨ２Ｏ、０．３ｍｌのＮＰ−４０を合わせ、最終容量１００ｍｌとする。完全に混合する。その日の終わりに使用した溶液を捨てる。２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０を調製するために、９９．９ｍｌの２×ＳＳＣ、０．１ｍｌのＮＰ−４０を合わせ、最終容量１００ｍｌとする。完全に混合する。２×ＳＳＣを調製するため、９００ｍｌのｄＨ２Ｏと１００ｍｌの２０×ＳＳＣを合わせて最終容量１０００ｍｌとし、１×ＰＢＳは、９００ｍｌのｄＨ２Ｏと１００ｍｌの１０×ＰＢＳを合わせて最終容量１０００ｍｌとし、０．１Ｍ ＨＣｌは、１ｍｌの１Ｎ ＨＣｌと９ｍｌのｄＨ２Ｏを合わせて最終容量１００ｍｌとし、ペプシン（ストック溶液）（１００ＭＧ／ＭＬ）は、ペプシン５ｇと滅菌水５０ｍｌを合わせる。十分に混合する。氷上に維持し、５０μｌアリコートを作製し、−２０℃で保存する。ペプシン（使用溶液、新たに調製）は、９５．５ｍｌのｄＨ２Ｏと０．５ｍｌの１Ｍ ＨＣｌを合わせる。３７℃に予熱（約１５分間）する。２０マイクロリットルのストックペプシン溶液を新しいコプリンジャーに添加し、予熱した０．１Ｍ ＨＣｌを加える。
【００９０】
（例１１）
ＤＮＡハイブリダイゼーション手順
１日目の手順。１．スライドをＴＨＩＮＰＲＥＰマシン（ＴＨＩＮＰＲＥＰ ２０００ ＳＯＰを指す）上に調製し、２．必要な全試薬を調製、予熱し、３．スライドを２×ＳＳＣに５分間、室温で置き、４．スライドをプロテアーゼ溶液に１０分間、３７℃で置き（消化ステップ）、５．スライドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に５分間ＲＴで置き（洗浄）、６．スライドを１％ホルムアルデヒドに５分間ＲＴで置き（固定）、７．スライドを１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に５分間ＲＴで置き（洗浄）、８．スライドを７０％ＥｔＯＨに１分間ＲＴで置き、９．スライドを９０％ＥｔＯＨに１分間ＲＴで置き、１０．スライドを１００％ＥｔＯＨに１分間ＲＴで置き、１１．スライドを乾燥させ、１２．ＤＮＡプローブをボルテックス攪拌し、遠心分離し、適切な容量に分注し、１３．１０μｌのプローブを各標的範囲に添加し、１４．２２ｍｍ四方のガラス製カバーガラスを被せてラバーセメントで封入し、１５．７２℃で２分間変性させ、１６．スライドを湿室に置いて３７℃で１４〜１６時間（一晩）インキュベートした。
【００９１】
２日目の手順。洗浄液を調製、予熱した。１．湿室からスライドを取り出し、２．ラバーセメントを穏やかに取り除き、スライドを２×ＳＳＣにＲＴで浸してカバーガラスを外し、３．スライドを０．４×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０に１分間、６５℃で置き、４．スライドを取り出し、２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０にＲＴで、１分間置き、５．スライドを取り出し、引き出しの暗所に垂直に置いて乾かし、６．標的範囲上にＤＡＰＩ／抗退色剤溶液を１滴加え、ＤＡＰＩ溶液上に気泡が入らないようカバーガラス（２２×５０ｍｍ）を置き、７．シグナル計数前にスライドを暗所に保存した。
【００９２】
（例１２）
解析
ＤＮＡプローブセット及びＤＡＰＩ対比染色は、１００ワット水銀灯並びに次のフィルター、ＤＡＰＩ、スペクトラム・アクア（７番染色体セントロメア）、スペクトラム・オレンジ（３ｑ２６の遺伝子座）及びスペクトラム・グリーン（５ｐ１５の遺伝子座）を備えた落射蛍光顕微鏡で観察するべきである。ＤＡＰＩフィルター及び１００×倍率を用いて患者スライドの試料範囲を手早く走査し、細胞の量と質を決定した。標的範囲の左上四分円の解析を開始した。６３×油浸対物レンズを用いて視野を左から右に、上から下に、同一範囲を再走査することなく走査した。合計１０００個の細胞を（１個又は２個の読み取り機を用いて）計数した。このステップはハイスループット解析のため自動化できる。スペクトラム・オレンジフィルターを用いた走査を開始した。正常な２個の３ｑ２６プローブシグナルを有する細胞を計数し、記録した。３ｑ２６を走査した各視野内をスペクトラム・グリーンフィルターに切換え、５ｐ１５プローブシグナルのため視野を再走査した。３個以上の３ｑ２６又は５ｐ１５シグナルを有する細胞を発見した場合、アクアチャンネルに反転してＣＥＮ７シグナルを計数した。３個以上の３ｑ２６又は５ｐ１５シグナルを有するいずれの細胞も異常である。細胞計数をスコアシートの適切な列に記入した。４個の３ｑ２６又は５ｐ１５及び４個のＣＥＮ７シグナルを有する細胞は、四倍体であり、適切に記録した。この解析方法を２色プローブパネルを用いて行う場合、走査、イメージング及びシグナル記録を実際の２色プローブパネルが反映されるよう修正した。図７における標本の評価によって、染色体領域３ｑ２６及び５ｐ１５の正常コピー数が明らかになった。解析した多くの細胞において、３ｑ２６及び５ｐ１５の遺伝子座の増幅は検出されず、７番染色体セントロメアの評価によって正常な二倍体標本であることが示された。
【００９３】
（例１３）
自動解析及び評価のための方法及び標本選択
細胞診、ＨＰＶ検査及び２色法検査が陰性結果である、ＮｅｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｘ検査集団内で合計二十（２０）個の標本を同定した。更に、これら２０標本は全て、解析における変動を最小化するため計数された合計１０００個の細胞を有する。三重陰性標本は疾病陰性であると考えられ、したがってＦＩＳＨによって同定された異常細胞は、いずれも「偽陽性」であると考えられる。２０標本に多くの「偽陽性」細胞が決定されると、記載されているＢＥＴＡＩＮＶ計算は、正常と異常標本間の閾値を決定するために用いることができる。
【００９４】
結果。２０個の三重陰性標本に対するＦＩＳＨ検査の結果を再検査し、標本毎の各染色体座の「偽陽性」細胞の合計数を同定した。標本は、ＦＩＳＨによって３ｑ２６と５ｐ１５の両遺伝子座に亘って異常であると同定された、標本当たり最大数の観察された「偽陽性」細胞である、５個の細胞を有していた。この観察はＢＥＴＡＩＮＶ計算に用いられ、正常標本と異常標本との間の閾値を９５％信頼で決定した。この方程式に入力された細胞合計数は、１０００であった。ＢＥＴＡＩＮＶ計算は０．０１０４（１．０％）、即ち計数された細胞１０００個の内１０個の閾値を返した。閾値も９９％信頼で決定し、これは０．０１２９（１．３％）即ち細胞１０００個の内１３個に相当する。
【００９５】
更に、２０個の三重陰性標本に対するＦＩＳＨ検査の結果を再検査し、標本毎の染色体座５ｐ１５のみ「偽陽性」細胞の合計数を同定した。標本は、ＦＩＳＨによって５ｐ１５異常であると同定された、標本当たり最大数の観察された「偽陽性」細胞である３個の細胞を含んでいた。この観察をＢＥＴＡＩＮＶ計算に用いて、正常標本と異常標本との間の閾値を９５％信頼で決定した。方程式に入力した細胞合計数はＮＤ１０１０７Ｂ由来の１０００であった。ＢＥＴＡＩＮＶ計算は０．００７７（０．７％）、即ち計数された細胞１０００個の内７個の閾値を返した。閾値も９９％信頼で決定し、これは０．００９９（０．９％）、即ち細胞１０００個の内９個に相当した。
【００９６】
ＡＣＭＧガイドラインを用いて、Ｃｅｒｖｉｃａｌ ＤＮＡ Ｄｔｅｘ診断アッセイのために正常標本と異常標本との間の閾値を決定した。９５％信頼を用いて、閾値は細胞１０００個の内１０個、即ち標本当たり１．０％が異常細胞であると決定した。したがって、ＦＩＳＨによる１．０％以上の異常細胞率の標本はいずれも異常であり、進行リスクの高い患者を同定した。この場合、陽性の診断検査結果が出されるであろう。標本が標本当たり１．０％未満の異常細胞を有することが判明した場合、陰性の診断検査報告が提出されるであろう。
【００９７】
（例１４）
生検標本の子宮頸部ＦＩＳＨ
用いることができる試薬は、チオシアン酸ナトリウム（Ｋｒｅａｔｅｃｈ ＬＫ−０６４Ａ）、キシレン（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ ８６６８−０４、５００ｍｌ）、プロテイナーゼ細菌型ＸＸＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｐ８０３８、１００ｍｌ）である。使用試薬の調製を次に示す。前処理溶液（１Ｍチオシアン酸ナトリウム）を、２ｇのチオシアン酸ナトリウムと５０ｍｌの脱イオン水で使用毎に新しく調製し、８０℃に温めた。プロテイナーゼＫは、０．０２５ｇのプロテイナーゼＫを１ｍｌの水に懸濁して最長１週間まで−２０℃で保存した２５ｍｇ／ｍｌストック溶液を用いた。５００μｌのプロテイナーゼＫストック溶液と４９．５ｍｌの２×ＳＳＣで使用毎に新しく調製し、４５℃に温めた。２×ＳＳＣは、１００ｍｌの２０×ＳＳＣと９００ｍｌのｄＨ２Ｏで最終容量１０００ｍｌとした。エタノール洗浄液は、１００％エタノールとｄＨ２Ｏを用いた７０％と９０％の希釈液である。希釈液は、蒸発したり、過剰な使用のため溶液が希釈されたりしない限り、１週間用いることができ、また使用中でないときは蓋付容器で室温保存できる。プローブ混合物は、１×ＴＥＲＣ−スペクトラム・ゴールド、１×Ｃｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ−スペクトラム・グリーン、０．１×ＣＥＰ７−スペクトラム・アクアである。２×ＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（６５℃で予熱）を調製するため、２０ｍｌの２×ＳＳＣ、７７．７ｍｌのｄＨ２Ｏ、０．３ｍｌのＮＰ−４０を合わせ、最終容量１００ｍｌとする。完全に混合する。
【００９８】
１日目の手順。（１）６０分間、６５℃でベークする。（２）切片をキシレンで２×１０分間脱パラフィンする。（３）１００％ＥｔＯＨで２×５分間脱水する。（４）風乾する。（５）スライドを予熱した前処理溶液で８分間、８０℃でインキュベートする。（６）脱イオン水で３分間、室温で洗浄する。（７）スライドを７０％、９０％、１００％ＥｔＯＨで各１分間脱水する。（８）風乾する。（９）スライドを２×ＳＳＣで５分間インキュベートする。（１０）スライドを予熱したプロテイナーゼＫ溶液で１０分間、４５℃でインキュベートする［ステップ５〜１０の代わりに、スライドを予熱したプロテイナーゼＫ溶液で５５分間、４５℃でインキュベートし、ステップ１１に進んで続ける］。（１１）スライドを２×ＳＳＣで５分間リンスする。（１２）スライドを７０％、９０％、１００％ＥｔＯＨで各１分間脱水する。（１３）風乾する。（１４）プローブ混合液（短時間遠沈した）を置き、カバーガラスをかけ、ラバーセメントで封じる。比例サイズのカバーガラスを用いる組織切片に対して実用的となるように小型のカバーガラスを用いる。組織切片は気泡が入り易いが、スライド上の切片に置いたプローブ混合液を直接ピペッティングすることによって最小限に抑えられることを留意する。（１５）７２℃、５分間共変性させる。（１６）３７℃湿室で一晩インキュベートする。
【００９９】
２日目の手順。（１）洗浄液２×ＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を６５℃で予熱する。（２）カバーガラスを引き剥がさずに、スライドを２×ＳＳＣに浸してカバーガラスを浮かせて外し、剪断を最小限に抑える。（３）スライドを２×ＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で６５℃、各回５分間を２回洗浄する。（４）スライドを２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０で１分間、室温でリンスする。（５）スライドを取り出し、引き出しの暗所に垂直に置いて乾燥させる。（６）抗退色剤ｗ／ＤＡＰＩを載せ、カバーガラス（２４×５０ｍｍ）をかけ、スライドを４℃で保存する。
【０１００】
上述のある特定の実施形態の説明は、このような特定の実施形態を一般概念から逸脱することなく、他者が現在の知識を用いることによって様々な適用のために容易に修正又は適合できる十分な情報を提供し、したがってこのような適合及び修正は、開示されている実施形態の均等の意義及び範囲内で理解するべきであり、理解することを目的とする。本明細書において用いられている語法又は専門用語は説明を目的とし、限定を目的としないことを理解するべきである。図面及び明細書において例示的実施形態が開示され、特定の用語が用いられていても、これは別のことが記載されていない限り一般的で説明的な意味でのみ用いられ、限定を目的とせず、したがって特許請求の範囲は殆ど限定されない。更に、当業者であれば、本明細書に記述されている方法の特定のステップを別の順に並べても、或いはステップを組み合わせてもよいことを理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本明細書に開示されている特定の実施形態に限定されないことが意図されている。
【０１０１】
本文に引用されている各特許出願及び特許のみならず、各特許出願及び特許に引用されている各文書又は参考文献（各交付特許の審査手続き中の「特許出願引用文書」を含む）や、ＰＣＴ及び外国出願、或いはこれら特許出願及び特許のいずれかに相当する及び／又は優先権を主張する特許や、各特許出願引用文書に引用又は参照されている各文書は、これにより本明細書の一部を構成するものとしてここに明確に援用する。より一般には、文書又は参考文献は、特許請求の範囲の前の参考文献リストか、或いは文章そのものにおいて本文で引用され、これら文書又は参考文献（「本明細書に引用されている参考文献」）のそれぞれは、本明細書に引用されている参考文献のそれぞれに引用されている各文書又は参考文献（任意のメーカー仕様書、取扱説明書を含む）と共に、これにより本明細書の一部を構成するものとしてここに明確に援用する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮頸部細胞における染色体異常の解析のための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌は、世界的に最も一般的で致命的な女性の癌の一種である。早期に発見されれば、子宮頸癌及びその先駆病変は効果的に治療され得る。Ｐａｐテストは子宮頸癌の一次スクリーニングであり、形態学的解析を用いて疑わしい細胞を同定する。しかし、単一の細胞診は比較的感度が低く、再現性が低く、曖昧な結果を生じることが多い。パパニコロウ（Ｐａｐ）テストの約６％は意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ；ａｔｙｐｉｃａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）と診断されて追跡検査を必要とし、またＡＳＣＵＳ患者の５〜１０％は未発見の癌である。患者のための現在のガイドラインとして、追跡Ｐａｐテスト、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）検査及び／又はコルポスコピーが挙げられる。
【０００３】
ＨＰＶ感染は子宮頸癌と関連があり、多くの患者はＡＳＣＵＳ・Ｐａｐテスト結果の後にＨＰＶの検査を受ける。高感度ＨＰＶ検査は、その感度の高さによって非常に高い陰性的中率をもたらし、検査で陰性が出た女性は子宮頸癌を発症するリスクが低い。しかし、ＨＰＶ陽性初期病変のごく一部でも高度異形成や癌に進行するため、ＨＰＶ検査の陽性的中率は限定的である。したがって、ＨＰＶの検出は、細胞形態学的評価と組み合わせたとしても特異性の低い検査である。
【０００４】
更に、Ｐａｐテストの約３％は軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ；ｌｏｗ−ｇｒａｄｅ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ）と診断される。このような患者のための現在のガイドラインは、追加的なモニタリング及び／又はコルポスコピーを薦めている。臨床研究は、このような患者の多くがＨＰＶ＋であることを示す。
【０００５】
ＡＳＣＵＳ／ＨＰＶ＋又はＬＳＩＬ患者には、より重度の子宮頸疾患に進行し、初期検査の２年後に外科的治療を必要とする顕著なリスクがある。進行する可能性のあるこのような患者の同定を形態学とＨＰＶ感染に基づいて行うのは不可能である。患者の疾病進行リスクを予見できる、子宮頸癌の初期発生における遺伝的変化が同定された。このような異常は、ＤＮＡ量の全体的な変化（例えば、倍数性）、並びに両者共に細胞の不死に関連する３番染色体の一部、特にテロメラーゼタンパク質サブユニットをコードするＴＥＲＣ遺伝子を含む遺伝子座３ｑ２６及び５番染色体の一部、特にテロメラーゼタンパク質の別のサブユニットをコードするＴＥＲＴ遺伝子を含む５ｐ１５の両方の増幅を含む。研究は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって、マルチカラー蛍光ＤＮＡプローブが倍数性並びに３ｑ及び５ｐコピー数の両方における異常を他の方法よりも高い感度と特異性で検出できることを示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
子宮頸癌スクリーニングプログラムの実施は、先進工業国における疾病の発生と死亡とを顕著に低減させた。しかし、単一の細胞学的評価は依然として比較的低感度であり、したがって多くの場合追跡検査を必要とする。このことは、サンプリング又は解釈のミス、一部の初期病変は認識可能な表現型変化を生じ得ないという事実に起因する。浸潤頸癌は、子宮頸部異形成の発達段階を経て、頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）１、ＣＩＮ２及びＣＩＮ３並びに外科的介入を必要とする真の前癌状態の病変と考えられている上皮内癌へと発生する。しかし、全軽度異形成病変の約１５％だけがこの直線進行経路を辿る。Ｐａｐ及びＨＰＶ検査は、子宮頸部異形成又は癌の存在を決定するための間接的方法である。したがって、異形成又は癌の存在を直接的に同定し、疾病進行をモニターするための分子マーカーを用いる方法の必要性は依然として満たされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、フローサイトメトリー又は当業者に知られた他の方法によってハイブリダイゼーションを検出するため、また従来の症状が現れる数年前ではないにしろ、数ヶ月前にどの患者が癌に進行し得るか進行しそうにないか予見するために、遺伝的異常を検出するための様々な細胞学的手法を用いて子宮頸部細胞の遺伝的変化をモニターするための診断方法を提供する。
【０００８】
染色体の異数性及び特定の癌関連遺伝子のコピー数変化の可視化は、細胞学的試料のルーチンの形態学的評価の重要な補完となった。染色体の異数性とその結果生じるゲノム不均衡は、癌細胞に特異的で異なる癌腫で異なり、また疾病進行初期に起こるため、このアプローチは生物学的に有効で成功を収めた。他のヒト癌腫の大部分と同様に、子宮頸癌はゲノム不均衡の分布によって定義される。ヒトパピローマウイルスの高リスクサブタイプの感染に加えて、続く子宮頸部扁平上皮の形質転換は、他の細胞学的異常の中でも染色体腕３ｑ及び５ｐの追加的なコピーの獲得を必要とする。本発明の一態様において、軽度子宮頸部異形成における５ｐ１５増幅と共に３ｑ２６増幅の同定は、個々の病変が高度子宮頸部異形成及び癌へと進行する潜在性に関する情報を提供できる。
【０００９】
一態様において、本発明は、子宮頸部異形成又は癌を含み得る子宮頸部細胞障害の患者の状態を評価するための方法であって、患者から得られた試料において染色体３ｑにおけるゲノム増幅と、染色体５ｐにおけるゲノム増幅と、対照として７番染色体のセントロメア（ＣＥＮ７）の存在及び／又は増幅とを検出するステップを含む方法を提供する。染色体３ｑ及び染色体５ｐのゲノム増幅の検出は、患者の状態が高度子宮頸部異形成に進行したことを示す。７番染色体のゲノム増幅の検出は、子宮頸部細胞の全体的な倍数性状態を測定する。通常、７番染色体のコピー数変化は、子宮頸癌形成初期段階では生じない。７番染色体のゲノム増幅が存在する場合、これは進行性前癌及び癌に関連する状態である異数性を示す。本方法は、患者状態の軽度子宮頸部異形成から高度子宮頸部異形成又は癌状態への変化を評価できる。
【００１０】
本発明の更に別の一態様において、患者状態の軽度から高度子宮頸部異形成へのシフトをモニターするための方法が提供される。本発明の特定の態様において、開示されている方法は、患者状態の軽度子宮頸部異形成から高度子宮頸部異形成状態への変化を評価するステップと、浸潤頸癌発症リスクのある患者を同定するステップと、患者状態の軽度子宮頸部異形成維持又は患者状態の軽度子宮頸部異形成若しくは正常への回復を評価するステップとを含む。
【００１１】
特定の一態様において、本明細書に開示されている方法は、染色体３ｑ及び５ｐにおける遺伝子増幅を検出するステップに加えて、染色体１ｑ、２０ｑ、１２ｑ、１９ｑ、１１ｑ、６ｑ、１７ｐ、７、８ｑ（後期異形成において検出される）、９ｑ、１６ｑ、２ｑ、９ｐ、１０ｑ、１８ｐ及びそれらの任意の組み合わせにおける増幅を検出するステップを更に含むことができる。本発明の更に特定の態様において、３ｑ２６遺伝子座及び５ｐ１５遺伝子座における増幅が検出される。３ｑ２６及び５ｐ１５遺伝子座の検出に加えて、次の染色体座、１ｑ２１〜３１、２０ｑ１２、１２ｑ１３〜２４、１９ｑ１３、１１ｑ２１、７ｑ１１〜２２、８ｑ２４（後期異形成において検出される）、９ｑ３３〜３４、１６ｑ２３、２ｑ３２、９ｐ２２、１０ｑ２１〜２４、１８ｐ１１及びそれらの任意の組み合わせにおける増幅を検出できる。
【００１２】
本明細書に開示されている方法は、染色体３ｑ及び／若しくは染色体５ｐのゲノム増幅が試料中に存在すること、又は染色体３ｑ及び／若しくは染色体５ｐのゲノム増幅が試料中に存在しないことを決定するステップを更に含むことができる。
【００１３】
本発明の別の一態様において、開示されている染色体領域を対象とするプローブが提供され、また本発明の方法を実施するためのキットが提供される。
【００１４】
数例の例示的実施形態の上述及び他の態様は、次の説明及び添付の図面と併せて考慮するとより良く評価、理解できる。尚、次の説明は好ましい実施形態やその多くの具体的詳細を示しているが、これらは限定のためではなく説明のために記載されていると理解するべきである。実施形態の範囲内で、その精神を逸脱することなく多くの変更や修正を施すことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】３ｑ２６染色体コピー数増加増幅によって表される子宮頸癌進行ステージを説明する図である。
【図１Ｂ】３ｑ２６染色体コピー数増加増幅によって表される子宮頸癌進行ステージを説明する図である。
【図１Ｃ】３ｑ２６染色体コピー数増加増幅によって表される子宮頸癌進行ステージを説明する図である。
【図２】３ｑ２６及び５ｐ１５染色体コピー数増加増幅によって表される子宮頸癌進行ステージを説明する図である。
【図３】Ｐａｐテストに続く子宮頸癌発見のための患者管理プロセスを説明する図である。
【図４】３ｑ単独における異常に対する液状処理細胞診患者試料検査から得られた陰性結果の説明図である。
【図５】３ｑ単独における異常に対する液状処理細胞診患者試料検査から得られた陽性結果の説明図である。
【図６】３ｑ及び５ｐにおける異常に対する液状処理細胞診患者試料検査から得られた陽性結果の説明図である。
【図７】３ｑ及び５ｐにおける異常に対する液状処理細胞診患者試料検査から得られた陰性結果の説明図である。
【図８Ａ】３ｑ単独における異常に対する患者の組織生検試料検査から得られた陰性結果の説明図である。ＣＩＮ１組織生検に由来する。
【図８Ｂ】３ｑ単独における異常に対する患者の組織生検試料検査から得られた陰性結果の説明図である。ＣＩＮ２生検に由来する。
【図９Ａ】３ｑ単独における異常に対する患者の組織生検試料検査から得られた陽性結果の説明図である。ＣＩＮ１組織生検に由来する。
【図９Ｂ】３ｑ単独における異常に対する患者の組織生検試料検査から得られた陽性結果の説明図である。ＣＩＮ２組織生検に由来する。
【図９Ｃ】３ｑ単独における異常に対する患者の組織生検試料検査から得られた陽性結果の説明図である。ＣＩＮ３組織生検に由来する。
【図１０】３ｑ及び５ｐにおける異常に対する患者の組織生検試料検査から得られた結果の説明図である。
【図１１】四倍体細胞を用いた３ｑ単独における異常に対する液状処理細胞診患者試料検査の説明図である。
【図１２】四倍体細胞を用いた３ｑ及び５ｐにおける異常に対する液状処理細胞診患者試料検査の説明図である。
【図１３】他の遺伝子の中でもＴＥＲＣ遺伝子位置を含む染色体座３ｑ２６のゲノム構成と、標識ＤＮＡプローブの作製に適したＢＡＣクローンを説明する図である。
【図１４】他の遺伝子の中でもＴＥＲＴ及びＴＲＩＰ１３遺伝子位置を含む染色体座５ｐ１５のゲノム構成と、標識ＤＮＡプローブの作製に適したＢＡＣクローンを説明する図である。
【図１５】５ｐ１５．３３バンドにおけるプローブを同定するために用いられたクローンの順序と、ＴＲＩＰ１３に対する標識ＤＮＡプローブの作製に適した特異的ＢＡＣクローンを説明する図である。
【図１６Ａ】子宮頸部細胞における染色体異常を測定するための本発明の特異プローブによって標的とされ得る遺伝子のリストを説明する図である。
【図１６Ｂ】子宮頸部細胞における染色体異常を測定するための本発明の特異プローブによって標的とされ得る遺伝子のリストを説明する図である。
【図１６Ｃ】子宮頸部細胞における染色体異常を測定するための本発明の特異プローブによって標的とされ得る遺伝子のリストを説明する図である。
【図１６Ｄ】子宮頸部細胞における染色体異常を測定するための本発明の特異プローブによって標的とされ得る遺伝子のリストを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、子宮頸癌と関連する染色体領域のコピー数増加の同定に基づく。癌は遺伝病であり、遺伝子異常は罹患細胞において観察できる。異常は、遺伝子領域の増加或いは減少として遺伝子異常を測定することによって細胞学的に観察できる。また、細胞学的に観察できるにしろできないにしろ、バイオマーカー発現の測定が細胞における病状の診断上の指標となり得るように、特定の遺伝子発現の差異は癌細胞において明らかである。本明細書に記載されている方法は、染色体の異常領域と結合する蛍光標識プローブを用いて子宮頸部細胞ＤＮＡの異常を直接的に同定することができる。期待数より多い又は少ない数のシグナルが観察される場合、細胞試料を罹病と診断でき、細胞学的に観察できる前に子宮頸部異形成を診断できる。この異常を有する患者は、予後不良となる可能性があり、またより進行した子宮頸疾患を発症するリスクが高くなり得る。患者の疾病進行リスクに関してより具体的な情報を提供するために、本明細書に開示されている方法は、細胞診から得られた他の異常結果の中でもＡＳＣＵＳ／ＨＰＶ＋又はＬＳＩＬ・Ｐａｐテストの後に或いはその代わりに行うことができる。
【００１７】
本明細書において、「子宮頸部細胞障害」、「子宮頸障害」又は「子宮頸疾患」は、次の内、即ち、子宮頸癌形成、上皮内病変又は悪性に関して陰性（ＮＩＬＭ；Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｌｅｓｉｏｎ ｏｒ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞，ＨＳＩＬ（ＡＳＣ−Ｈ；Ａｔｙｐｉｃａｌ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌｓ，ＨＳＩＬ）、意義不明異型腺細胞（ＡＧＵＳ；Ａｔｙｐｉｃａｌ Ｇｌａｎｄｕｌａｒ Ｃｅｌｌｓ Ｕｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ；Ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｌｅｓｉｏｎ）、子宮頸部異形成、前癌、前悪性病変、子宮頸癌、子宮頸腺癌、頸部扁平上皮癌、頸部上皮内腫瘍１（ＣＩＮ１）、頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ２）、頸部上皮内腫瘍３（ＣＩＮ３）、上皮内癌、浸潤頸癌及び細胞の細胞学的又は遺伝的異常の内のいずれかを意味する。また、本明細書における「疾病」、「細胞障害」又は「障害」は、細胞の細胞学的又は遺伝的異常のいずれかを含むが、これらに限定されない。
【００１８】
本方法は、疾病進行に関する予後情報並びに子宮頸部扁平上皮細胞及び腺細胞の両方に機能する柔軟性と共に、形態学的に正常細胞及び異常細胞における遺伝的異常の直接的同定を提供する。
【００１９】
コピー数増加
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の宿主ゲノムへの組込みに加えて３ｑコピー数の増加は、両者共に子宮頸部異形成の浸潤癌への進行における重要な関連事象であると思えるように、ＣＩＮ２又はＣＩＮ３の頸癌への進行に関わっている。Ｈｏｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００６ Ｄｅｃ：２１０（４）：４１２−９。より進行したステージの腫瘍又はリンパ節転移腫瘍は、３ｑ、１ｑ及び８ｑの増加並びに１１ｑ、３ｑ、６ｑ及び２ｑの減少を含む更なる染色体不均衡を有する。３ｑ１１〜ｑ２２及び３ｑ２６〜ｑｔｅｒの増加は、リンパ節転移により一般的である。Ｈｕａｎｇ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｆｏｒｍｏｓ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ．２００７ Ｎｏｖ；１０６（１１）：８９４−９０２。
【００２０】
浸潤頸癌に見られる３ｑ増加、特にヒトテロメラーゼ遺伝子（ＴＥＲＣ）における増加は、ＰａｐスメアのＴＥＲＣ増加検出における診断ツールとしてのＦＩＳＨプローブセットの開発に用いられてきた。ＴＥＲＣ増加はＣＩＮ１／ＣＩＮ２からＣＩＮ３及び浸潤癌への進行を予見し得ることが示唆されてきた。Ｈｅｓｅｌｍｅｙｅｒ−Ｈａｄｄａｄ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２００５；１６６：１２２９−１２３８。
【００２１】
５ｐもまた、癌腫で高頻度に観察される構造的変化した染色体である。Ａｔｋｉｎ，Ｎ．Ｂ １９９７ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；９５：３３−３９。Ａｒｉａｓ−Ｐｕｌｉｄｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．２００２ Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ；１：３。Ｈｕａｎｇ Ｆ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎ．ａｎｄ Ｃｙｔｏ．、１５７：４６−４７。Ｍａｃｖｉｌｌｅ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；５９：１４１−５０。Ｈｅｓｅｌｍｅｙｅｒ Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ；１９：２３３−４０。Ｒａｏ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．２００４ ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ；４：５。５ｐ増加は進んだステージの癌腫へと進行する際に観察され、多くの場合全腕増幅に関与する。Ｈｅｓｅｌｍｅｙｅｒ Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９９７ Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ；１９：２３３−４０。
【００２２】
５ｐ増幅を示した癌細胞系を用いることによって、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子をコードする５ｐ１３．３３における変化の最小領域が定義された。Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２００６；１２０：４３６−４４３。最後に、ＨＰＶ組込み部位もまた５ｐ１１〜１５にマッピングされた。Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２００６；１２０：４３６−４４３。テロメラーゼ活性は、癌細胞不死の一要素である。Ｔａｋｕｍａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．２００４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ；１９：１３００−１３０４。Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，３６：４９６−５０２。Ｔｏｓｈｉｋｕｎｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ；８２；８３３−８３７。ｈＴＥＲＴは、テロメラーゼ触媒サブユニットとして同定された。Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，３６：４９６−５０２。
【００２３】
ｈＴＥＲＴ発現は頸癌等、多くの癌細胞系において観察され、特定の癌細胞系は癌性病変においてｈＴＥＲＴ発現が高いが、非癌性組織においては高くないことを示した。Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，３６：４９６−５０２。このようなディファレンシャルな発現は、頸癌よりも肝臓癌に見られ、この結果はｈＴＥＲＴ発現が肝臓癌形成の初期段階に行われたことを示唆する。Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，３６：４９６−５０２。更に、５ｐのｈＴＥＲＴ遺伝子増幅は、ＨＰＶ感染子宮頸癌におけるｈＴＥＲＴのｍＲＮＡ発現増加と密接に相関する。Ｚｈａｎｇ Ａ．ｅｔ ａｌ．２０００ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；６０：６２３０−６２３５。Ｚｈａｎｇ Ａ．ｅｔ ａｌ．２００２ Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ；３４：２６９−７５。５ｐは、発癌の様々なステージにおいて構造変化する染色体として常に同定される。この構造変化はまた、５ｐにコードされたＴＥＲＴ遺伝子に常に影響すると思われる。
【００２４】
５ｐ増加は、浸潤頸癌において観察された。Ｓｃｏｔｔｏ，ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ ２００８。３ｑ、特に３ｑ２６増加と共に試料で観察される場合、これは子宮頸部異形成から浸潤頸癌へと進んだ病状進行の指標となり得る。少なくとも１種類の対照プローブ（例えばＣＥＰ３、ＣＥＮ７）及び５ｐ、特に、５ｐ１５領域のゲノムプローブと組み合わせた３ｑ、特に染色体バンド３ｑ２６領域のゲノムプローブを用いて、コピー数増加は頸部上皮内腫瘍の浸潤癌への悪性転換に先行し、ＡＳＣＵＳ又はＣＩＮ１からＣＩＮ２又はＣＩＮ３への、またＣＩＮ２又はＣＩＮ３から上皮内癌、浸潤頸癌への移行を更に伴う。更に、３ｑ及び５ｐの両方における増加の同定は、ＡＳＣＵＳ又はＣＩＮ１からＣＩＮ２又はＣＩＮ３への、またＣＩＮ２又はＣＩＮ３から上皮内癌、浸潤頸癌への促進された移行を示す。
【００２５】
本方法は、標的染色体、例えば５ｐ、３ｑ又はそれら両方共のコピー数増加を正常と比較することによる、生じ得る子宮頸部細胞障害の同定を提供する。本明細書において、「正常」は、通常は二倍体の細胞が細胞周期において四倍体相となり四倍性が観察された場合を除いた哺乳類細胞における染色体の二倍性を意味する。
【００２６】
あらゆる細胞は、２３対の染色体の正常な相補物を有し、これは二倍体として説明される状態である。しかし、細胞が増殖し細胞分裂を行う場合、細胞は染色体２３対の第二のセットを生じ、その後各セットは形成された２個の娘細胞に存在するようになる。この状態は四倍体として説明される。四倍性は、体のあらゆる組織や器官で普通に生じる自然なプロセスであるが、概して低頻度で起こる。癌の一指標は、制御不能な細胞増殖と複製である。これは通常、正常細胞における標準的な複製制御システムから細胞を逸脱させる細胞の染色体における複数の異常が原因で起こる。染色体におけるこれら複数の異常は、染色体相補物がもはや２３対ではなくそれ以外のものである異数性として説明される状態をもたらす。通常、異数体細胞は、一部染色体の余分のコピーを有し、他の染色体を失い、更に２本以上の染色体を一体に融合することによって雑種染色体を形成した細胞である。非常に活発な細胞分裂及び四倍体は、異数体細胞が発生する基礎を提供する。したがって四倍体は、異数体細胞及びより重篤な細胞障害の発生に対するより高いリスクレベルを示す変動状態となり得る。したがって、これら方法は、本明細書に開示されている方法に従って四倍性を測定し、子宮頸部細胞障害及び生じ得る子宮頸癌進行の同定を提供することができる。
【００２７】
方法
本方法は、子宮頸部異形成の診断及び予後マーカーとして用いることができる。倍数性異常及び／又は３ｑコピー数増加及び／又は５ｐコピー数増加を有する患者は、予後不良であり、より進行した子宮頸疾患を発症するリスクが高い。
【００２８】
本発明の一実施形態は、染色体５ｐ及び３ｑの遺伝子座並びにＣＥＮ７を対象とするマルチカラーＦＩＳＨプローブ、特に５ｐ１５及び３ｑ２６を対象とするプローブを用いて子宮頸部の細胞学的試料におけるＤＮＡ量及び３ｑ＋５ｐコピー数変化を同定することである。好ましい一実施形態において、異なる標的のプローブは、標的を区別できるように異なる色の蛍光となるであろう。
【００２９】
本発明の一実施形態は、患者から得られた試料において染色体３ｑにおけるゲノム増幅、染色体５ｐにおけるゲノム増幅並びにＣＥＮ７の存在及び／又は増幅を検出するステップを含む、子宮頸部異形成又は癌の患者状態を評価するための方法を提供することである。染色体３ｑ及び染色体５ｐのゲノム増幅の検出は、患者状態の軽度から高度子宮頸部異形成への進行を示す。
【００３０】
本発明の方法は、患者試料における軽度から高度子宮頸部異形成状態への変化、染色体３ｑにおけるゲノム増幅、染色体５ｐにおけるゲノム増幅並びにＣＥＮ７の存在及び／又は増幅をモニターするために用いることができる。染色体３ｑ及び染色体５ｐのゲノム増幅の検出は、患者状態の高度子宮頸部異形成への進行を示す。
【００３１】
本明細書に開示されている方法は、染色体３ｑ及び５ｐにおける遺伝子増幅の検出するステップに加えて、染色体１ｑ、２０ｑ、１２ｑ、１９ｑ、１１ｑ、６ｑ、１７ｐ、７、８ｑ（後期異形成において検出される）、９ｑ、１６ｑ、２ｑ、９ｐ、１０ｑ、１８ｐ及びそれらの任意の組み合わせにおける増幅を検出するステップを更に含んでもよい。
【００３２】
本発明の特定の実施形態において、Ｃｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ領域を含む３ｑ２６遺伝子座及び５ｐ１５遺伝子座バンドにおける増幅が検出できる。本発明の更に特定の実施形態において、３ｑ２６及び５ｐ１５遺伝子座の検出に加えて、次の染色体座、即ち、１ｑ２１〜３１、２０ｑ１２、１２ｑ１３〜２４、１９ｑ１３、１１ｑ２１、７ｑ１１〜２２、８ｑ２４（後期異形成において検出される）、９ｑ３３〜３４、１６ｑ２３、２ｑ３２、９ｐ２２、１０ｑ２１〜２４、１８ｐ１１及びそれらの任意の組み合わせにおける増幅が検出できる。
【００３３】
本方法は、染色体３ｑ及び／又は染色体５ｐのゲノム増幅が試料に存在しないことを決定するステップを更に含んでもよい。異数性が発見され子宮頸部細胞障害が同定された状態と比較する場合、染色体増幅の喪失は細胞障害の回復と場合によっては疾病回復に対して暗示的となり得る。
【００３４】
本方法は、後期異形成を評価及びモニターするために用いることができ、染色体５ｐ及び８ｑ、特に８ｑ２４と共に染色体３ｑにおけるゲノム増幅を検出するステップを含む。３ｑにおける増幅と組み合わせた８ｑコピー数の増加及び／又は５ｐコピー数の増加は、頸部上皮内腫瘍の浸潤癌への悪性転換を示し、ＡＳＣＵＳ／ＣＩＮ１からＣＩＮ２／ＣＩＮ３への、またＣＩＮ２／ＣＩＮ３から上皮内癌、浸潤頸癌への移行を更に伴うことができる。更に、３ｑと５ｐの両方における増加の同定は、ＡＳＣＵＳ／ＣＩＮ１からＣＩＮ２／ＣＩＮ３への、またＣＩＮ２／ＣＩＮ３から上皮内癌、浸潤頸癌への促進された移行を示す。
【００３５】
本方法は、染色体３ｑ及び５ｐに対するプローブを含み、１ｑ、２０ｑ、１２ｑ、１９ｑ、１１ｑ、６ｑ、１７ｐ、７、８ｑ（後期異形成において検出される）、９ｑ、１６ｑ、２ｑ、９ｐ、１０ｑ、１８ｐに対するプローブ及びそれらプローブの任意の組み合わせを更に含むことができる特異プローブパネルを更に提供する。上述のプローブパネルに関する特定の実施形態において、Ｃｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ領域を含む３ｑ２６遺伝子座及び５ｐ１５遺伝子座に対するプローブに加えて、次の染色体座、即ち１ｑ２１〜３１、２０ｑ１２、１２ｑ１３〜２４、１９ｑ１３、１１ｑ２１、７ｑ１１〜２２、８ｑ２４（後期異形成において検出される）、９ｑ３３〜３４、１６ｑ２３、２ｑ３２、９ｐ２２、１０ｑ２１〜２４、１８ｐ１１及びそれらの任意の組み合わせに対するプローブを用いてもよい。
【００３６】
当業者であれば、本明細書に記載されている遺伝子座の配列に相補的な核酸プローブを調製することができる。更に、多くのこのようなプローブが市販されている。
【００３７】
最近の臨床研究は、ＨＰＶ感染の役割が肛門癌の発生であることに光を当てた。実のところ、メディケア・メディケイド・サービスセンター（ＣＭＳ）は近年、肛門標本の一連の細胞診及びＨＰＶ検査のための保険の提供を始めた。子宮頸部と肛門の発癌は、類似の細胞型とウイルスイニシエーションを含む類似の生物学的特性を備えるため、ゲノム異常及びコピー数変化は、他の遺伝子座の中でも３ｑ及び５ｐで生じる。したがって、本発明の更に別の一実施形態は、他の染色体コピー数変化の中でも３ｑ及び５ｐに対して肛門細胞標本を解析し、患者が肛門疾患に罹患し得るか決定することである。したがって、これら方法は、肛門標本に用いて肛門の発癌に関する有益な臨床情報を提供することができる。
【００３８】
プローブ
本明細書に例示されている特定の遺伝子座と特異的にハイブリダイズするプローブを同定するために、多くの方法を用いることができる。例えば、染色体特異的ライブラリーからクローンを無作為選択することによってプローブを作製し、続いてデジタル画像顕微鏡によってマッピングできる。この手順は米国特許第５，４７２，８４２号明細書に記載されている。全染色体に及ぶ様々なライブラリーも、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．から市販されている。特定の染色体座にハイブリダイズするプローブは、Ａｂｂｏｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｉｎｃ．（デスプレーンズ、イリノイ州）から市販されている。
【００３９】
簡潔に説明すると、ゲノム又は染色体特異的ＤＮＡを制限酵素で消化、或いは機械的に剪断し、少なくとも約２０ｋｂ、より好ましくは約４０ｋｂ〜３００ｋｂのＤＮＡ配列を得る。部分配列消化の技法は、本技術分野においてよく知られている。例えば、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ Ｎ．Ｙ．（１９９８）を参照。その結果生じた配列をベクターと連結し、適切な宿主に導入する。この目的に適した例示的なベクターとして、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）及びＰ１ファージが挙げられる。全染色体に及ぶ様々なライブラリーは、例えばＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓからも市販されている。
【００４０】
ひとたびプローブライブラリーが構築されると、プローブのサブセットは選択された染色体上に物理的にマッピングされる。ＦＩＳＨ及びデジタル画像解析は、クローンの所望の染色体に沿った座位決定するために用いることができる。簡潔に説明すると、例えばＦＩＴＣを蛍光プローブとして用いたＦＩＳＨによって正常細胞の中期細胞伸展物にクローンをマッピングする。染色体は、基剤組成に関係なくＤＮＡを染色する染色試薬（例えば、ＤＡＰＩ又はヨウ化プロピジウム）によって対比染色し、染色体輪郭を画定できる。染色された中期染色体は、色依存的画像変化を避けるため多色ビームスプリッターを備える蛍光顕微鏡で撮像される。様々なカラー画像がＣＣＤカメラを用いて得られ、デジタル画像はコンピューターに保存される。続いてコンピュータープログラムを用いて染色体軸を計算し、（シングルコピー配列に対して）２個のＦＩＴＣシグナルを軸に直角に突出させ、通常はｐ−テロメアである確定座位から平均断片長を計算する。このアプローチは、例えば米国特許第５，４７２，８４２号明細書に記載されている。
【００４１】
本明細書において同定された遺伝子の配列情報によって、これら遺伝子から標的配列の検出に適した高度に特異的なハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーを設計することが可能となる。上述の通り、これら遺伝子の完全配列は公知である。遺伝子内の特定ＤＮＡ配列を検出するための手段は、当業者によく知られている。例えば、遺伝子内の選択されたサブシーケンスに対して相補的になるように選択されたオリゴヌクレオチドプローブを用いることができる。或いは、配列又はサブシーケンスは、プローブを用いた検出の前に様々なＤＮＡ増幅技法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、転写増幅等による）によって増幅できる。ＤＮＡ増幅は、可能な標的サブシーケンスの更に別のコピーをもたらすことによってアッセイの感度を高める。更に、増幅プロセスにおいて標識プライマーを用いることによって、増幅するに従ってＤＮＡ配列を標識できる。
【００４２】
一実施形態において、本発明のプローブは、３ｑ２６．２バンドのＴＥＲＣ遺伝子及び５ｐ１５．３のＴＥＲＴ又はＴＲＩＰ１３の少なくとも一部を対象とし得る。特に、約４９５ｋｂの３ｑ２６領域ＴＥＲＣに対するプローブは、スペクトラム・ゴールドで標識して用いることができ、またスペクトラム・グリーン標識５ｐ１５プローブも同様である。このようなプローブは、Ａｂｂｏｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（デスプレーンズ、イリノイ州）から市販されている。なお、本発明のプローブは、Ｃｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ領域内の遺伝子や図１６Ａ〜図１６Ｄに列挙されている遺伝子等、３ｑ２６及び５ｐ１５上の任意の遺伝子並びに３ｑ２６又は５ｐ１５上の遺伝子の任意の組み合わせ又はその一部を含むことができる。
【００４３】
特定の一実施形態において、検出可能なプローブマーカーは蛍光シグナルを発するか、或いはプローブは発色することができる。プローブは、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いてハイブリダイズする。ＦＩＳＨは、染色体上の特定ＤＮＡ配列の有無を検出又は座位決定するために用いられる細胞遺伝学的手法である。ＦＩＳＨは、プローブと高度な配列類似性を示す染色体部分に結合する蛍光プローブを用いる。蛍光顕微鏡は、蛍光プローブが染色体と結合する位置を発見するために用いることができる。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞調製物内の特定の核酸配列の可視化を可能にする手法である。特に、ＦＩＳＨは一本鎖蛍光標識ＤＮＡプローブの相補的標的配列への正確なアニーリングを必要とする。プローブの細胞ＤＮＡ部位とのハイブリダイゼーションは、蛍光顕微鏡を用いた直接的な検出によって観察可能となる。
【００４４】
追加的な遺伝物質が検査に必要とされる例において、ゲノムはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅又は検出できる。
【００４５】
本発明の更に別の一実施形態は、本明細書に開示されている方法の実施におけるＤＮＡプローブの良好なハイブリダイゼーションのためのＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）又はＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）標本等、液状処理細胞診標本においてＦＩＳＨを行う手順を提供することである。ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）は、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（スパークス、メリーランド州）から得られる。ＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）は、Ｈｏｌｏｇｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ベッドフォード、マサチューセッツ州）から得られる。
【００４６】
本発明の更に別の一態様は、試料細胞における遺伝子増幅の検出前に、液状処理細胞診標本から扁平上皮細胞と腺細胞を分離するための抗体の使用である。細胞型の分離は、扁平上皮癌と腺癌両方の検出を改善することができ、従来のＰａｐテストでは稀にしか検出されないが、３ｑ２６増幅、５ｐ１５増幅又はそれら両方を示す頸癌の検出を改善することができる。
【００４７】
本方法は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイに用いるための蛍光標識核酸プローブであるプローブを利用できる。標識プローブパネルは、３番、５番及び７番染色体の特定領域並びに本明細書に開示されている他の染色体領域に相同なＤＮＡプローブ配列の少なくとも３色３種プローブ混合物からなることができる。
【００４８】
本明細書において、「標識（単数又は複数）」は、あらゆる組成物、例えば蛍光色素（例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド等、酵素、高電子密度試薬、磁気標識等）を非限定的に含む分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手段によって検出可能なプローブである。直接的には検出されないが間接標識の使用によって検出される標識は、ビオチン及びジオキシゲニン並びに標識抗血清又はモノクローナル抗体が利用できるハプテン及びタンパク質を含む。核酸及びプローブを標識する方法は、当業者によく知られている。好ましい標識は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおける使用に適した標識である。核酸プローブは、ハイブリダイゼーション前に検出可能に標識できる。或いは、ハイブリダイゼーション産物に結合する検出可能な標識を用いてもよい。このような検出可能な標識は、検出可能な物理的又は化学的性質を備える任意の材料を含み、イムノアッセイの分野で良く開発されている。
【００４９】
患者試料由来の子宮頸部扁平上皮及び／又は腺細胞を用いることができる本方法の更に別の実施形態は、本方法を用いて染色体異常を評価することである。
【００５０】
それぞれ異なる蛍光染色試薬によって標識された３種類のプローブを用いた、染色体異常を検出するための３色ＦＩＳＨ法の好ましい実施形態において、通常、複数の色を用いることが望ましい。前記好ましい実施形態において、目的領域にハイブリダイズする２種類の検査プローブは２種類の異なる染色試薬で標識され、別の領域とハイブリダイズする対照プローブは第三の染色試薬で標識される。それぞれが独自の染色試薬で標識されていれば、４種類以上のプローブを用いてもよい。セントロメア等、目的染色体安定領域とハイブリダイズする核酸プローブは対照プローブとして好ましく、試料間のハイブリダイゼーション効率の差を決定できる。
【００５１】
患者から採取された標本又は試料から回収、単離された細胞は、スライド上で固定することができる。標本は本技術分野において公知の様々な技法を用いて回収できる。一実施形態において、標本はＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）及び／又はＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）試料から回収できる。ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）は、子宮頸癌スクリーニングのために用いられるＰａｐテストである。ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）は、患者からＰａｐ試料を採取するための様々な採取器具を備える。その一部は着脱可能な頭部を有するが、これは試料を保持し、直接取り外してスクリーニングに用いられるバイアルに入れ、これによって１００％の試料をプロセシングに利用できるようにする。その全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する米国特許出願第１１／５２１，１４４号明細書に開示されているように、従来のＰａｐスメアと比べて高い検出率を主張するＢＤ ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）液状処理Ｐａｐテストと呼ばれる薄層細胞調製プロセスを用いた液状処理Ｐａｐテストは、着脱可能な頭部を備えるほうき状器具又はブラシ／スパチュラ等、ＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）採取器具と共に用いられる。ＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）Ｐａｐは、液状処理細胞診方法である。子宮頸部細胞試料をスライド上に擦り付ける代わりにバイアル内でリンスし、これによって細胞凝集を防ぐ。細胞を実験室で分離して血液や粘膜を除去し、次に、検査する細胞を癌細胞検出実験のためにスライド上に置く。
【００５２】
試料は、ＬＥＥＰ、子宮摘出、錐体生検、ＥＣＣ等、子宮頸部生検、パンチ生検、外科処置由来の組織の分析を含んでもよい。試料は、子宮頚管、膣又は外陰部から摘出した組織又は細胞から調製できる。
【００５３】
ハイブリダイゼーション
一実施形態において、本明細書に開示されている領域は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて同定される。一般に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、次の主要なステップ、（１）解析する組織又は生物学的構造物の固定、（２）標的ＤＮＡの接近をより容易にし、非特異的結合を抑制するための、生物学的構造物のプレハイブリダイゼーション処理、（３）核酸混合物と生物学的試料又は組織の核酸とのハイブリダイゼーション、（４）ハイブリダイゼーションで結合しなかった核酸断片を除去するための、ハイブリダイゼーション後洗浄及び（５）ハイブリダイズした核酸の検出を含む。本明細書に記載の適用のためのハイブリダイゼーションプロトコールは、その全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する米国特許第６，２７７，５６３号明細書に記載されている。
【００５４】
試料において、標的ＤＮＡを一本鎖型に変性し、続いて本方法のプローブとハイブリダイズさせることができる。ハイブリダイゼーションの後、非結合プローブを一連の洗浄によって除去し、核をＤＮＡ特異的染色試薬ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で対比染色する。ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションは、水色及び金色の蛍光シグナルの可視化を可能にする適切な励起及び放射フィルターを備える蛍光顕微鏡を用いて観察できる。ＣＥＮ７、５ｐ１５及び３ｑ２６シグナルの計数は、核の顕微鏡検査によって行われる。
【００５５】
本明細書に開示されている臨床試験は、子宮頸癌早期発見のための組み合わせた数種類のバイオマーカーを用いることができ、現在の形態学に基づいたスクリーニング及び検出方法は重大な制約を有するため、この試験は重要である。３ｑ２６及び５ｐ１５の同定、とりわけ増幅及びその他の細胞遺伝学的異常の同定は、子宮頸癌発症リスクのある患者をより正確且つ精密に同定し、患者に初期治療を受けさせることができる。
【００５６】
画像解析
本発明の一実施形態は、開示されている方法の自動画像解析及び記録を提供することである。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞調製物内の特定の核酸配列の可視化を可能にする技法である。特に、ＤＮＡ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、一本鎖蛍光標識ＤＮＡプローブの相補的な標的配列への正確なアニーリングを必要とする。プローブの細胞ＤＮＡ部位へのハイブリダイゼーションは、蛍光顕微鏡を用いた直接検出によって可視化される。本明細書に記載されている方法は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの一部としての利用のための、蛍光標識された核酸プローブであるプローブを利用する。好ましい一実施形態において、プローブパネルは、３番、５番及び７番染色体の特定領域に相同なＤＮＡプローブ配列の３色３種類のプローブ混合物からなる。プローブ混合物は、染色体３ｑ２６、５ｐ１５及び７番染色体セントロメア（ＣＥＮ７）に対する遺伝子座特異的プローブからなる。
【００５７】
本発明の一実施形態は、ＦＩＳＨプローブシグナルの自動画像解析を提供することである。顕微鏡は、顕微鏡ステージ上の標本／スライド内視野のデジタル画像を自動記録させることができる。このような顕微鏡のメーカーは、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｌｅｉｃａ、Ｎｉｋｏｎ及びＯｌｙｍｐｕｓ等である。また、本方法は、とりわけＩｋｏｎｉｓｙｓ（コネチカット州）、Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ（マサチューセッツ州及びドイツ）、Ｂｉｏｉｍａｇｅｎｅ（カリフォルニア州）並びにＢｉｏｖｉｅｗ（マサチューセッツ州及びイスラエル）等の団体によって開発された顕微鏡ソフトウエアシステム等、自動画像解析のためのソフトウエアプラットフォームを提供する。このような自動システムは、患者試料の３ｑ染色体単独又は５ｐと組み合わせた異常の観察に適用できる。
【００５８】
標本から回収された細胞はスライド上で固定できる。標的ＤＮＡをその一本鎖型に変性し、続いてプローブとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションに続いて、非結合プローブを一連の洗浄によって除去することができ、核をＤＮＡ特異的染色試薬ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で対比染色する。プローブのハイブリダイゼーションは、３種類の蛍光シグナルの可視化を可能にする適切な励起及び放射フィルターを備える蛍光顕微鏡を用いて観察できる。ＣＥＮ７、５ｐ１５及び３ｑ２６シグナルの計数は、核の自動顕微鏡検査によって行われる。
【００５９】
プローブセットとＤＡＰＩ対比染色は、１００ワット水銀灯並びに次のフィルター、ＤＡＰＩ、スペクトラム・アクア（７番染色体セントロメア）、スペクトラム・グリーン（５ｐ１５における遺伝子座）及びスペクトラム・オレンジ（３ｑ２６における遺伝子座）又は本技術分野において公知で本明細書に開示の他の標識及びプローブのフィルターを備える落射蛍光顕微鏡で観察できる。ＤＡＰＩフィルターと１００×倍率によって、患者スライドの試料範囲を手早く走査し、細胞の量と質を決定できる。標的範囲の左上四分円の解析を始める。６３×油浸対物レンズを用いて視野を左から右へ、また上から下へ、同一範囲を再走査することなく走査した。本システムは、合計１０００個の細胞を計数できる。本方法は、細胞計数を自動記録するステップを更に含む。
【００６０】
スライド解析手順の臨床的な意義。標本に対するＦＩＳＨ実験手順の実施は手腕を問われるものである一方、その結果である手続分析を疾病の文脈内に置く必要があり、臨床実務に対して技術結果の妥当性を決定しなければならない。本明細書に開示されている方法は、子宮頸部細胞障害に関連する特定遺伝子座における染色体コピー数の直接的な評価となるよう考案されている。癌を発症するかなり以前に、Ｐａｐテスト等、子宮頸癌スクリーニング標本においてこのような遺伝的異常が存在することは、患者の管理及び治療と密接な関係を有する。標本のＦＩＳＨに基づく解析結果は、臨床ケアガイドライン及び手順内で考慮することができる。
【００６１】
少なくとも８００個の細胞、好ましくは１０００個の細胞における染色体コピー数の決定は、各臨床標本の十分なサンプリングとなることができる。８００個未満の細胞又は１０００個より多い細胞を本システムにおいて利用してもよい。本方法及びシステムは、サンプリング変動及びスライド作製手順の制約を克服する。本方法及びシステムは、染色体コピー数変化の有る標本と変化の無い標本との間の閾値を決定するよう、専門医療機関（ＡＣＭＧ）によって推奨された方法と一致する。Ｗｏｌｆ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｐｅｒｉｏｄ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ。
【００６２】
自動化方法及びシステムは、陽性標本に対して少なくとも９０％の精密性を提供し、疾病進行リスクが増加した患者を同定する。本方法及びシステムは、９５％より高い精密性を更に提供できる。
【００６３】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞調製物内の特定の核酸配列の可視化を可能にする技法である。従来、プローブシグナルの可視化は、高度な訓練を受けた作業員による手作業で行われてきた。しかし、現在の技術を適用して画像収集及び解析プロセスを自動化することが可能である。Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｌｅｉｃａ、Ｎｉｋｏｎ及びＯｌｙｍｐｕｓによって製造された顕微鏡等、今日の市場における顕微鏡によって、ユーザーは顕微鏡ステージ上の標本／スライド内の視野のデジタル画像を収集できる。これらメーカーの一部は、標本／スライドから自動画像収集を行うのに利用可能なソフトウエアを有する。更に、多くの団体（とりわけＩｋｏｎｉｓｙｓ、Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｉｏｉｍａｇｅｎｅ、ＢｉｏＶｉｅｗ、Ａｐｅｒｉｏ、Ｖｅｎｔａｎａ）は、特に商業実験室における使用のためにソフトウエアプラットフォームを作製した。これら団体の一部は、Ｉｋｏｎｉｓｙｓ製Ｉｋｏｎｉｓｃｏｐｅ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｙｓｔｅｍや、Ｍｅｔａｓｙｓｔｅｍｓ製Ｍｅｔａｆｅｒ及びＭｅｔａｃｙｔｅ等、顕微鏡プラットフォームと自動イメージングソフトウエアの両方を含むシステムを有する。
【００６４】
解析する標本の種類及びソースは、解析プロセスと手順に直接影響を与える。各組織型は独自の生物学的特性と構造を有し、その上、各々の癌は発癌率に影響を与える異なる因子によって異なるように発生する。したがって、本発明は、標本の自動画像収集及び解析のための多くの方法を提供する。
【００６５】
本システム及び方法の一実施形態は、ＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）及びＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）に加えて任意の細針生検（ＦＮＡ）、唾液又は綿棒による回収等、液状処理細胞診標本を含む顕微鏡スライド上に均一な単層細胞で置くことのできる懸濁液中の標本と共に用いられることである。この自動化方法は、ＦＩＳＨ調製スライド上の細胞に覆われた全範囲をスクリーニングし、ＤＡＰＩ染色を用いて細胞核を識別する。システムは、次にＤＡＰＩ染色領域内の各プローブシグナルを計数し、同定された各プローブのコピー数を記録する。ソフトウエアシステムは、少なくとも８００個の細胞の結果が得られるまで、細胞及び各細胞内の染色体コピー数の自動記録を続ける。８００個の細胞の閾値が得られると、ソフトウエアは、撮像計数された各細胞を、同定された各染色体コピー数に基づくカテゴリーに分類する。３ｑ２６、５ｐ１５及びＣＥＮ７の各プローブにつき２コピーを備える正常細胞は、２、２、２カテゴリーに分類される。異常細胞は、そのプローブシグナルパターンによって同定される。例えば、ＣＥＮ７プローブを２コピー、３ｑ２６プローブを５コピー、５ｐ１５プローブを３コピー備える細胞は、２、５、３カテゴリーに分類され得る。撮像された全細胞が分類されると、標本は陽性／陰性疾病閾値に対して評価することができる。自動イメージングシステムによって異常と同定された全細胞は、医者に検査結果を連絡する前に、訓練された作業員によって手作業で再検査し検証してもよい。本方法及びシステムは、自動検証を更に提供する。特定の細胞閾値数は標本の種類や収集方法によって変化し得る。更に、ソフトウエアは、生物学的特性（細胞形、細胞サイズ、核のＤＮＡ量、細胞同士の近傍性、細胞型等）又は疾病関連差異（異常数を有する遺伝子座の数、１細胞内の遺伝子座における異常の数、異常と生存又は治療応答との関係）を反映するように適用できる。本方法及びシステムは、全範囲の代わりに、スライド上の細胞に覆われた範囲の代表サンプリングに用いることができ、通常、撮像細胞の最低閾値が達成されるまで細胞密度に基づいて複数の視野又は経路を撮像することによって行われる。
【００６６】
本システム及び方法の更に別の一実施形態は、ＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）及びＳＵＲＥＰＡＴＨ（登録商標）に加えて任意の細針生検（ＦＮＡ）、唾液又は綿棒を用いた回収等、液状処理細胞診標本を含む顕微鏡スライド上に均一な単層細胞で置くことのできる懸濁液中の標本と共に用いてよいことである。この自動化方法は、ＦＩＳＨ調製スライド上の細胞に覆われた全範囲をスクリーニングし、ＤＡＰＩ染色を用いて細胞核を識別する。システムは、次にＤＡＰＩ染色領域内の各プローブシグナルを計数し、同定された各プローブのコピー数を記録する。ソフトウエアシステムは、スライド上の全細胞の結果が得られるまで、細胞及び各細胞内の染色体コピー数の自動記録を続ける。全細胞を撮像すると、ソフトウエアは、撮像計数された各細胞を、同定された各染色体のコピー数に基づくカテゴリーに分類する。例えば、３ｑ２６、５ｐ１５及びＣＥＮ７の各プローブにつき２コピーを備える正常細胞は、２、２、２カテゴリーに分類される。異常細胞は、そのプローブシグナルパターンによって同定される。例えば、ＣＥＮ７プローブを２コピー、３ｑ２６プローブを５コピー、５ｐ１５プローブを３コピー備える細胞は、２、５、３カテゴリーに分類される。全細胞を撮像、計数及び分類すると、ソフトウエアは最大数の異常を有する細胞を同定し、高度異常細胞の降順ランクに基づく順序を提供する。このような標本内の高度異常細胞のランクに基づく順序は、陽性／陰性疾病閾値に対して評価することができる。通常、自動イメージングシステムによって異常と同定された細胞は、検査結果を本技術分野において公知の方法を用いてコンピューターで医者に連絡する前に、訓練された作業員によって手作業で再検査され検証されるが、必ずしもそうとは限らない。特定の細胞閾値数は標本の種類や収集方法によって変化し得る。更に、ソフトウエアは、生物学的特性（細胞形、細胞サイズ、核のＤＮＡ量、細胞同士の近傍性、細胞型等）又は疾病関連差異（異常数を有する遺伝子座の数、１細胞内の遺伝子座における異常の数、異常と生存又は治療応答との関係）を反映するように適用できる。本実施形態は、全範囲の代わりに、スライド上の細胞に覆われた範囲の代表サンプリングに用いることができ、通常、撮像細胞の最低閾値が達成されるまで細胞密度に基づいて複数の視野又は経路を撮像することによって行われる。臨床及び疾病意義がサブセットで公知であれば、ランク順の異常細胞サブセットだけが陽性／陰性検査閾値に対して再検査され得る。通常、サブセットは標本内の最も異常な２５個又は５０個の細胞であるが、他のサブセットも標本ソース、収集法及び疾病に依存して同定及び利用され得る。
【００６７】
更に別の一実施形態は、生検や外科的処置によって得られた標本等、組織利用標本と共に用いることができる。更に、本システム及び方法は、同一の組織利用標本に由来するヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）で染色されたコンパニオンスライドを用いることができる。この自動化方法は、ＦＩＳＨ調製スライド上の組織利用標本に覆われた全範囲をスクリーニングし、ＤＡＰＩ染色を用いて細胞核を識別する。システムは、次にＤＡＰＩ染色領域内の各プローブシグナルを計数し、同定された各プローブのコピー数を記録する。ソフトウエアシステムは、組織利用標本全体が検査されるまで、細胞及び各細胞内の染色体コピー数の自動記録を続ける。続いてソフトウエアは、ＤＡＰＩ染色で識別された少なくとも２５個の核を含むスライドの小区分を評価する。小区分位置の選択は、Ｈ＆Ｅコンパニオンスライドにおける疾病指標に基づいて導かれる。通常、少なくとも２個の小区分が各標本で選択される。続いてソフトウエアは、撮像計数された各細胞を、同定された各染色体のコピー数に基づくカテゴリーに分類する。例えば、３ｑ２６、５ｐ１５及びＣＥＮ７の各プローブにつき２コピーを備える正常細胞は、２、２、２カテゴリーに分類される。異常細胞は、そのプローブシグナルパターンによって同定される。例えば、ＣＥＮ７プローブを２コピー、３ｑ２６プローブを５コピー、５ｐ１５プローブを３コピー備える細胞は、２、５、３カテゴリーに分類される。撮像された全細胞が分類されると、同定されたプローブシグナル数がシステムによって計数された全核数と比較され、一遺伝子座当たりの染色体コピー数対、計数された細胞数の比率が得られる。各染色体座の比率が決定されると、標本は陽性／陰性疾病閾値に対して評価できる。通常、自動イメージングシステムによる異常比率で同定された全標本小区分は、医者に検査結果を連絡する前に、訓練された作業員によって手作業で再検査され検証される。特定の小区分のサイズ及び計数される核の数は、標本の種類や収集方法によって変化し得る。更に、ソフトウエアは、生物学的特性（細胞形、細胞サイズ、核のＤＮＡ量、細胞同士の近傍性、細胞型、組織内の位置、細胞質の量等）又は疾病関連差異（異常数を有する遺伝子座の数、１細胞内の遺伝子座における異常の数、異常と生存又は治療応答との関係、組織利用標本における異常の位置等）を反映するように適用できる。
【００６８】
更に別の一実施形態において、本システム及び方法は、生検又は外科的処置から得られた標本等、組織利用標本と共に用いることができる。この自動化方法は、ＦＩＳＨ調製スライド上の組織利用標本に覆われた全範囲をスクリーニングし、ＤＡＰＩ染色を用いて細胞核を識別する。次にシステムは、ＤＡＰＩ染色領域内の各プローブシグナルを計数し、同定された各プローブのコピー数を記録する。ソフトウエアシステムは、組織利用標本全体が検査されるまで、細胞及び各細胞内の染色体コピー数の自動記録を続ける。続いてソフトウエアは、ＤＡＰＩ染色で識別された少なくとも２５個の核を含むスライドの小区分を評価する。通常、少なくとも２個の小区分が各標本で選択される。その後、ソフトウエアは、撮像計数された各細胞を同定された各染色体コピー数に基づくカテゴリーに分類する。例えば、３ｑ２６、５ｐ１５及びＣＥＮ７の各プローブにつき２コピーを備える正常細胞は、２、２、２カテゴリーに分類される。異常細胞は、そのプローブシグナルパターンによって同定される。例えば、ＣＥＮ７プローブを２コピー、３ｑ２６プローブを５コピー、５ｐ１５プローブを３コピー備える細胞は、２、５、３カテゴリーに分類される。撮像された全細胞が分類されると、同定されたプローブシグナル数がシステムによって計数された全核数と比較され、一遺伝子座当たりの染色体コピー数対、計数された細胞数の比率が得られる。各染色体座の比率が決定されると、標本は陽性／陰性疾病閾値に対して評価できる。通常、自動イメージングシステムによる異常比率で同定された全標本小区分は、医者に検査結果を連絡する前に、訓練された作業員によって手作業で再検査され検証される。特定の小区分のサイズ及び計数される核の数は、標本の種類や収集方法によって変化し得る。更に、ソフトウエアは、生物学的特性（細胞形、細胞サイズ、核のＤＮＡ量、細胞同士の近傍性、細胞型、組織内の位置、細胞質の量等）又は疾病関連差異（異常数を有する遺伝子座の数、１細胞内の遺伝子座における異常の数、異常と生存又は治療応答との関係、組織利用標本における異常の位置等）を反映するように適用できる。
【００６９】
スコアデータは、シグナル（例えば、３ｑ、５ｐ又はＣＥＮ７）の内いずれか１種類の数を計算し、記録された全核数で割り、その数をスコアシート上部のチャートに記録することによって解析できる。２より大きい結果は、ある所定のプローブが増幅されたとして記録、報告される。
【００７０】
スコアデータは、シグナル（３ｑ、５ｐ又はＣＥＮ７）の内いずれか１種類の数を足し、記録された全核数で割ることによって解析される。２より大きい結果は、ある所定のプローブが増幅されたと報告できる。画像は、標本ナンバー及びスライドナンバーで命名されて保存される。
【００７１】
他の実施形態において、本発明は、開示されている領域における染色体異常検出のためのキットを提供する。好ましい一実施形態において、キットは、本明細書に記載されている領域に対する１種又は複数のプローブ及び開示されているプローブの任意の組み合わせを含む。キットは、遺伝的変化の検出におけるキット内容物の使用方法を説明する取扱説明材料を追加的に含むことができる。キットは、プローブの検出を容易にする様々な標識又は標識試薬、バッファー、間期細胞伸展物、ウシ血清アルブミン及びブロッキングプローブ等の他のブロッキング試薬を含むハイブリダイゼーション試薬、細針、綿棒、アスピレーター等のサンプリング器具、ハイブリダイゼーションの陽性対照及び陰性対照並びに本技術分野において公知の他の対照の内の１つ又は複数を含むこともできる。
【００７２】
次の図及び関連実施例の例示的な説明は、本明細書、特に実施例において頻繁に用いられている特定の用語の理解を容易にするために提供されている。説明は便宜のために提供されており、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７３】
（例１）
前もって調製された薄層液状処理細胞診試料（ＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）、Ｃｙｔｙｃ、モールバラ、マサチューセッツ州）でＦＩＳＨを行った。スライドをＴＨＩＮＰＲＥＰ（登録商標）バイアルから作製し、続いてプロテアーゼ消化、ホルムアルデヒド固定、洗浄及び脱水を含む、前処理プロトコールに付した。２色複数標的の間期細胞ＦＩＳＨプローブキット（Ａｂｂｏｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を用いてハイブリダイゼーションを行った。キットは、ＣＥＮ７−アクア、３ｑ２６（３ｑ−オレンジ）及び５ｐ１５（５ｐ−グリーン）の遺伝子座に直接標識プローブを含む。蛍光顕微鏡を用いて細胞を解析した。
【００７４】
試料は、解析のため最小で８００個の細胞を含む。陽性検査は、異数性と、（１）解析された細胞の１．０％以上における３ｑコピー数又は５ｐコピー数の増加、（２）解析された細胞の０．９％以上における３ｑコピー数のみ増加、又は（３）解析された細胞の０．７％以上における５ｐコピー数のみ増加を示した。陰性検査は、正常な倍数性と、（１）解析された細胞の１．０％未満が３ｑコピー数と５ｐコピー数の両方の増加、（２）解析された細胞の０．９％未満が３ｑコピー数のみ増加、又は（３）解析された細胞の０．７％未満が５ｐコピー数のみ増加を示した。倍数性異常及び／又は３ｑコピー数増加試料は、予後不良及びより進行した子宮頸疾患発症リスクを有すると決定された。
【００７５】
結果は、子宮頸部異形成における診断及び予後マーカーとなり得る。倍数性異常及び／又は３ｑコピー数と５ｐコピー数の増加試料は、予後不良及び更に進行した子宮頸疾患発症リスクを有すると決定された。
【００７６】
（例２）
図６の評価。この標本は、３ｑ２６上のＴＥＲＣ遺伝子及び５ｐ１５上のＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ遺伝子座の異常コピー数を明らかにした。解析した１０００個の細胞の内、９８６個の細胞が正常であったが、８個はＴＥＲＣ（３ｑ）の余剰コピーのため異常であることが分かり、２個はＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ（５ｐ）の余剰コピーのため異常であることが分かり、４個はＴＥＲＣ及びＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ（３ｑ及び５ｐ）の余剰コピーのため異常であることが分かり、異常細胞率は１．４０％であった。
【００７７】
（例３）
図７の評価。この標本は、３ｑ２６上のＴＥＲＣ遺伝子及び５ｐ１５上のＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ遺伝子座の正常コピー数を明らかにした。解析した１０００個の細胞の内、９９８個の細胞が正常であったが、２個はＴＥＲＣ（３ｑ）の余剰コピーのため異常であることが分かり、０個はＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ（５ｐ）の余剰コピーのため異常であることが分かり、０個はＴＥＲＣ及びＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ（３ｑ及び５ｐ）の余剰コピーのため異常であることが分かり、異常細胞率は０．２０％であった。
【００７８】
（例４）
染色体領域３ｑ２６上のＴＥＲＣ遺伝子に特異的なプローブによる蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、ヒトテロメラーゼ遺伝子（ＴＥＲＣ）３ｑ２６の解析を行った。更に、ＣＥＮ７に特異的なプローブを用いてＤＮＡ倍数性を評価した。子宮頸部細胞をスライドに固定し、これら蛍光プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション解析を行って、正常細胞及び異常細胞の存在を評価した。
【００７９】
（例５）
図５の評価。この標本は、ＴＥＲＣ遺伝子の異常コピー数を明らかにした。ＴＥＲＣの異常コピー数を有する細胞の代表的な画像と共に示す。解析された１０３０個の細胞の内、１０１２個の細胞は正常であったが、１８個は異常であることが分かり、異常細胞率は１．８５％であった。
【００８０】
（例６）
図４の評価によって、ＴＥＲＣ遺伝子の正常なコピー数が明らかになった。３ｑ２６における遺伝子の増幅は検出されず、７番染色体セントロメアの評価は、正常な二倍体細胞であることを示した。これは、上に列挙されている以外の部位で生じる他の異常を除外しているわけではない。ＴＥＲＣの正常コピーを有する細胞の代表的な画像と共に示す。解析された８００個の細胞の内、７９９個の細胞は正常であったが、１個は異常であることが分かり、異常細胞率は０．１％であった。
【００８１】
（例７）
組織ＦＩＳＨ
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織標本から作製した厚さ４ミクロンの組織切片でＦＩＳＨを行った（図８及び図９）。スライドをプロテアーゼ消化、洗浄及び脱水を含む前処理プロトコールに付した。ＣＥＮ７−アクア及び３ｑ２６遺伝子座（３ｑ−オレンジ）に対する直接標識プローブ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ製のプローブ）を含む２色ＦＩＳＨプローブセットを用いてハイブリダイゼーションを行った。切片をＤＡＰＩで対比染色し、蛍光顕微鏡を用いて細胞を解析した。
【００８２】
試料当たり最小で５０個の細胞の倍数性状態を解析した。選択された細胞における３ｑ２６プローブシグナルの核に対する比率が２．０以上の場合、試料を異数性と判定した。選択された細胞における３ｑ２６プローブシグナルの核に対する比率が２未満である場合、試料を正常な倍数性を有すると判定した。倍数性異常及び／又は３ｑコピー数増加の患者は、予後不良のリスクがあり、より進行した子宮頸疾患を発症する高いリスクがあると決定した。
【００８３】
結果は、子宮頸部異形成の診断及び予後マーカーとなり得る。倍数性異常及び／又は３ｑコピー数増加の試料は、予後不良及びより進行した子宮頸疾患の発症リスクがあると決定した。
【００８４】
（例８）
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織標本から作製した厚さ４ミクロンの組織切片でＦＩＳＨを行った（図１０）。スライドをプロテアーゼ消化、洗浄及び脱水を含む前処理プロトコールに付した。３色ＦＩＳＨプローブセットを用いてハイブリダイゼーションを行った。このセットはＣＥＮ７−アクア、３ｑ２６遺伝子座（３ｑ−オレンジ）及び５ｐ１５遺伝子座（５ｐ−グリーン）に対する直接標識プローブを含む（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ製プローブ）。切片をＤＡＰＩで対比染色し、蛍光顕微鏡を用いて細胞を解析した。試料当たり最小で５０個の細胞の倍数性状態を解析した。
【００８５】
（１）選択された細胞における３ｑ２６プローブシグナルの核に対する比率が２．０以上である、（２）選択された細胞における５ｐ１５プローブシグナルの核に対する比率が２．０以上である、（３）選択された細胞における３ｑ２６及び５ｐ１５プローブシグナルの核に対する比率が２．０以上である場合、試料は異数性を有すると判定した。選択された細胞における３ｑ２６、５ｐ１５又は３ｑ２６と５ｐ１５両方のプローブシグナルの核に対する比率が２未満である場合、試料は正常な倍数性を有すると判定された。倍数性異常及び／又は３ｑコピー数の増加を有する試料は、予後不良及びより進行した子宮頸疾患発症リスクがあると決定した。
【００８６】
結果は、子宮頸部異形成の診断及び予後マーカーとなり得る。倍数性異常及び／又は３ｑ若しくは５ｐコピー数増加を有する試料は、予後不良リスク及びより進行した子宮頸疾患発症リスクがあると決定した。
【００８７】
（例９）
使用試薬の調製
１％ホルムアルデヒド溶液を調製するため、２．７ｍＬの３７％ホルムアルデヒド溶液と９７．３ｍＬの１×ＰＢＳを合わせ、最終容量１００ｍＬとする。完全に混合する。溶液をコプリンジャーに注ぐ。２×ＳＳＣを調製するため、１００ｍｌの２０×ＳＳＣと９００ｍｌのｄＨ２を合わせ、最終容量１０００ｍｌとする。
【００８８】
（例１０）
エタノール洗浄液
１００％エタノールとｄＨ２Ｏを用いて７０％、９０％希釈液を調製する。希釈液は、蒸発したり過剰使用で溶液が希釈されなければ、１週間用いることができる。使用しないときは蓋付容器で室温保存する。
【００８９】
０．４×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０を調製するため、２０ｍｌの２×ＳＳＣと７７．７ｍｌのｄＨ２Ｏ、０．３ｍｌのＮＰ−４０を合わせ、最終容量１００ｍｌとする。完全に混合する。その日の終わりに使用した溶液を捨てる。２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０を調製するために、９９．９ｍｌの２×ＳＳＣ、０．１ｍｌのＮＰ−４０を合わせ、最終容量１００ｍｌとする。完全に混合する。２×ＳＳＣを調製するため、９００ｍｌのｄＨ２Ｏと１００ｍｌの２０×ＳＳＣを合わせて最終容量１０００ｍｌとし、１×ＰＢＳは、９００ｍｌのｄＨ２Ｏと１００ｍｌの１０×ＰＢＳを合わせて最終容量１０００ｍｌとし、０．１Ｍ ＨＣｌは、１ｍｌの１Ｎ ＨＣｌと９ｍｌのｄＨ２Ｏを合わせて最終容量１００ｍｌとし、ペプシン（ストック溶液）（１００ＭＧ／ＭＬ）は、ペプシン５ｇと滅菌水５０ｍｌを合わせる。十分に混合する。氷上に維持し、５０μｌアリコートを作製し、−２０℃で保存する。ペプシン（使用溶液、新たに調製）は、９５．５ｍｌのｄＨ２Ｏと０．５ｍｌの１Ｍ ＨＣｌを合わせる。３７℃に予熱（約１５分間）する。２０マイクロリットルのストックペプシン溶液を新しいコプリンジャーに添加し、予熱した０．１Ｍ ＨＣｌを加える。
【００９０】
（例１１）
ＤＮＡハイブリダイゼーション手順
１日目の手順。１．スライドをＴＨＩＮＰＲＥＰマシン（ＴＨＩＮＰＲＥＰ ２０００ ＳＯＰを指す）上に調製し、２．必要な全試薬を調製、予熱し、３．スライドを２×ＳＳＣに５分間、室温で置き、４．スライドをプロテアーゼ溶液に１０分間、３７℃で置き（消化ステップ）、５．スライドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に５分間ＲＴで置き（洗浄）、６．スライドを１％ホルムアルデヒドに５分間ＲＴで置き（固定）、７．スライドを１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に５分間ＲＴで置き（洗浄）、８．スライドを７０％ＥｔＯＨに１分間ＲＴで置き、９．スライドを９０％ＥｔＯＨに１分間ＲＴで置き、１０．スライドを１００％ＥｔＯＨに１分間ＲＴで置き、１１．スライドを乾燥させ、１２．ＤＮＡプローブをボルテックス攪拌し、遠心分離し、適切な容量に分注し、１３．１０μｌのプローブを各標的範囲に添加し、１４．２２ｍｍ四方のガラス製カバーガラスを被せてラバーセメントで封入し、１５．７２℃で２分間変性させ、１６．スライドを湿室に置いて３７℃で１４〜１６時間（一晩）インキュベートした。
【００９１】
２日目の手順。洗浄液を調製、予熱した。１．湿室からスライドを取り出し、２．ラバーセメントを穏やかに取り除き、スライドを２×ＳＳＣにＲＴで浸してカバーガラスを外し、３．スライドを０．４×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０に１分間、６５℃で置き、４．スライドを取り出し、２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０にＲＴで、１分間置き、５．スライドを取り出し、引き出しの暗所に垂直に置いて乾かし、６．標的範囲上にＤＡＰＩ／抗退色剤溶液を１滴加え、ＤＡＰＩ溶液上に気泡が入らないようカバーガラス（２２×５０ｍｍ）を置き、７．シグナル計数前にスライドを暗所に保存した。
【００９２】
（例１２）
解析
ＤＮＡプローブセット及びＤＡＰＩ対比染色は、１００ワット水銀灯並びに次のフィルター、ＤＡＰＩ、スペクトラム・アクア（７番染色体セントロメア）、スペクトラム・オレンジ（３ｑ２６の遺伝子座）及びスペクトラム・グリーン（５ｐ１５の遺伝子座）を備えた落射蛍光顕微鏡で観察するべきである。ＤＡＰＩフィルター及び１００×倍率を用いて患者スライドの試料範囲を手早く走査し、細胞の量と質を決定した。標的範囲の左上四分円の解析を開始した。６３×油浸対物レンズを用いて視野を左から右に、上から下に、同一範囲を再走査することなく走査した。合計１０００個の細胞を（１個又は２個の読み取り機を用いて）計数した。このステップはハイスループット解析のため自動化できる。スペクトラム・オレンジフィルターを用いた走査を開始した。正常な２個の３ｑ２６プローブシグナルを有する細胞を計数し、記録した。３ｑ２６を走査した各視野内をスペクトラム・グリーンフィルターに切換え、５ｐ１５プローブシグナルのため視野を再走査した。３個以上の３ｑ２６又は５ｐ１５シグナルを有する細胞を発見した場合、アクアチャンネルに反転してＣＥＮ７シグナルを計数した。３個以上の３ｑ２６又は５ｐ１５シグナルを有するいずれの細胞も異常である。細胞計数をスコアシートの適切な列に記入した。４個の３ｑ２６又は５ｐ１５及び４個のＣＥＮ７シグナルを有する細胞は、四倍体であり、適切に記録した。この解析方法を２色プローブパネルを用いて行う場合、走査、イメージング及びシグナル記録を実際の２色プローブパネルが反映されるよう修正した。図７における標本の評価によって、染色体領域３ｑ２６及び５ｐ１５の正常コピー数が明らかになった。解析した多くの細胞において、３ｑ２６及び５ｐ１５の遺伝子座の増幅は検出されず、７番染色体セントロメアの評価によって正常な二倍体標本であることが示された。
【００９３】
（例１３）
自動解析及び評価のための方法及び標本選択
細胞診、ＨＰＶ検査及び２色法検査が陰性結果である、ＮｅｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｘ検査集団内で合計二十（２０）個の標本を同定した。更に、これら２０標本は全て、解析における変動を最小化するため計数された合計１０００個の細胞を有する。三重陰性標本は疾病陰性であると考えられ、したがってＦＩＳＨによって同定された異常細胞は、いずれも「偽陽性」であると考えられる。２０標本に多くの「偽陽性」細胞が決定されると、記載されているＢＥＴＡＩＮＶ計算は、正常と異常標本間の閾値を決定するために用いることができる。
【００９４】
結果。２０個の三重陰性標本に対するＦＩＳＨ検査の結果を再検査し、標本毎の各染色体座の「偽陽性」細胞の合計数を同定した。標本は、ＦＩＳＨによって３ｑ２６と５ｐ１５の両遺伝子座に亘って異常であると同定された、標本当たり最大数の観察された「偽陽性」細胞である、５個の細胞を有していた。この観察はＢＥＴＡＩＮＶ計算に用いられ、正常標本と異常標本との間の閾値を９５％信頼で決定した。この方程式に入力された細胞合計数は、１０００であった。ＢＥＴＡＩＮＶ計算は０．０１０４（１．０％）、即ち計数された細胞１０００個の内１０個の閾値を返した。閾値も９９％信頼で決定し、これは０．０１２９（１．３％）即ち細胞１０００個の内１３個に相当する。
【００９５】
更に、２０個の三重陰性標本に対するＦＩＳＨ検査の結果を再検査し、標本毎の染色体座５ｐ１５のみ「偽陽性」細胞の合計数を同定した。標本は、ＦＩＳＨによって５ｐ１５異常であると同定された、標本当たり最大数の観察された「偽陽性」細胞である３個の細胞を含んでいた。この観察をＢＥＴＡＩＮＶ計算に用いて、正常標本と異常標本との間の閾値を９５％信頼で決定した。方程式に入力した細胞合計数はＮＤ１０１０７Ｂ由来の１０００であった。ＢＥＴＡＩＮＶ計算は０．００７７（０．７％）、即ち計数された細胞１０００個の内７個の閾値を返した。閾値も９９％信頼で決定し、これは０．００９９（０．９％）、即ち細胞１０００個の内９個に相当した。
【００９６】
ＡＣＭＧガイドラインを用いて、Ｃｅｒｖｉｃａｌ ＤＮＡ Ｄｔｅｘ診断アッセイのために正常標本と異常標本との間の閾値を決定した。９５％信頼を用いて、閾値は細胞１０００個の内１０個、即ち標本当たり１．０％が異常細胞であると決定した。したがって、ＦＩＳＨによる１．０％以上の異常細胞率の標本はいずれも異常であり、進行リスクの高い患者を同定した。この場合、陽性の診断検査結果が出されるであろう。標本が標本当たり１．０％未満の異常細胞を有することが判明した場合、陰性の診断検査報告が提出されるであろう。
【００９７】
（例１４）
生検標本の子宮頸部ＦＩＳＨ
用いることができる試薬は、チオシアン酸ナトリウム（Ｋｒｅａｔｅｃｈ ＬＫ−０６４Ａ）、キシレン（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ ８６６８−０４、５００ｍｌ）、プロテイナーゼ細菌型ＸＸＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｐ８０３８、１００ｍｌ）である。使用試薬の調製を次に示す。前処理溶液（１Ｍチオシアン酸ナトリウム）を、２ｇのチオシアン酸ナトリウムと５０ｍｌの脱イオン水で使用毎に新しく調製し、８０℃に温めた。プロテイナーゼＫは、０．０２５ｇのプロテイナーゼＫを１ｍｌの水に懸濁して最長１週間まで−２０℃で保存した２５ｍｇ／ｍｌストック溶液を用いた。５００μｌのプロテイナーゼＫストック溶液と４９．５ｍｌの２×ＳＳＣで使用毎に新しく調製し、４５℃に温めた。２×ＳＳＣは、１００ｍｌの２０×ＳＳＣと９００ｍｌのｄＨ２Ｏで最終容量１０００ｍｌとした。エタノール洗浄液は、１００％エタノールとｄＨ２Ｏを用いた７０％と９０％の希釈液である。希釈液は、蒸発したり、過剰な使用のため溶液が希釈されたりしない限り、１週間用いることができ、また使用中でないときは蓋付容器で室温保存できる。プローブ混合物は、１×ＴＥＲＣ−スペクトラム・ゴールド、１×Ｃｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ−スペクトラム・グリーン、０．１×ＣＥＰ７−スペクトラム・アクアである。２×ＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（６５℃で予熱）を調製するため、２０ｍｌの２×ＳＳＣ、７７．７ｍｌのｄＨ２Ｏ、０．３ｍｌのＮＰ−４０を合わせ、最終容量１００ｍｌとする。完全に混合する。
【００９８】
１日目の手順。（１）６０分間、６５℃でベークする。（２）切片をキシレンで２×１０分間脱パラフィンする。（３）１００％ＥｔＯＨで２×５分間脱水する。（４）風乾する。（５）スライドを予熱した前処理溶液で８分間、８０℃でインキュベートする。（６）脱イオン水で３分間、室温で洗浄する。（７）スライドを７０％、９０％、１００％ＥｔＯＨで各１分間脱水する。（８）風乾する。（９）スライドを２×ＳＳＣで５分間インキュベートする。（１０）スライドを予熱したプロテイナーゼＫ溶液で１０分間、４５℃でインキュベートする［ステップ５〜１０の代わりに、スライドを予熱したプロテイナーゼＫ溶液で５５分間、４５℃でインキュベートし、ステップ１１に進んで続ける］。（１１）スライドを２×ＳＳＣで５分間リンスする。（１２）スライドを７０％、９０％、１００％ＥｔＯＨで各１分間脱水する。（１３）風乾する。（１４）プローブ混合液（短時間遠沈した）を置き、カバーガラスをかけ、ラバーセメントで封じる。比例サイズのカバーガラスを用いる組織切片に対して実用的となるように小型のカバーガラスを用いる。組織切片は気泡が入り易いが、スライド上の切片に置いたプローブ混合液を直接ピペッティングすることによって最小限に抑えられることを留意する。（１５）７２℃、５分間共変性させる。（１６）３７℃湿室で一晩インキュベートする。
【００９９】
２日目の手順。（１）洗浄液２×ＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を６５℃で予熱する。（２）カバーガラスを引き剥がさずに、スライドを２×ＳＳＣに浸してカバーガラスを浮かせて外し、剪断を最小限に抑える。（３）スライドを２×ＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で６５℃、各回５分間を２回洗浄する。（４）スライドを２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０で１分間、室温でリンスする。（５）スライドを取り出し、引き出しの暗所に垂直に置いて乾燥させる。（６）抗退色剤ｗ／ＤＡＰＩを載せ、カバーガラス（２４×５０ｍｍ）をかけ、スライドを４℃で保存する。
【０１００】
上述のある特定の実施形態の説明は、このような特定の実施形態を一般概念から逸脱することなく、他者が現在の知識を用いることによって様々な適用のために容易に修正又は適合できる十分な情報を提供し、したがってこのような適合及び修正は、開示されている実施形態の均等の意義及び範囲内で理解するべきであり、理解することを目的とする。本明細書において用いられている語法又は専門用語は説明を目的とし、限定を目的としないことを理解するべきである。図面及び明細書において例示的実施形態が開示され、特定の用語が用いられていても、これは別のことが記載されていない限り一般的で説明的な意味でのみ用いられ、限定を目的とせず、したがって特許請求の範囲は殆ど限定されない。更に、当業者であれば、本明細書に記述されている方法の特定のステップを別の順に並べても、或いはステップを組み合わせてもよいことを理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本明細書に開示されている特定の実施形態に限定されないことが意図されている。
【０１０１】
本文に引用されている各特許出願及び特許のみならず、各特許出願及び特許に引用されている各文書又は参考文献（各交付特許の審査手続き中の「特許出願引用文書」を含む）や、ＰＣＴ及び外国出願、或いはこれら特許出願及び特許のいずれかに相当する及び／又は優先権を主張する特許や、各特許出願引用文書に引用又は参照されている各文書は、これにより本明細書の一部を構成するものとしてここに明確に援用する。より一般には、文書又は参考文献は、特許請求の範囲の前の参考文献リストか、或いは文章そのものにおいて本文で引用され、これら文書又は参考文献（「本明細書に引用されている参考文献」）のそれぞれは、本明細書に引用されている参考文献のそれぞれに引用されている各文書又は参考文献（任意のメーカー仕様書、取扱説明書を含む）と共に、これにより本明細書の一部を構成するものとしてここに明確に援用する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料における子宮頸部細胞障害の存在を決定するために染色体異常を検出するための方法であって、
患者試料を染色体５ｐにおける標的核酸配列に結合する核酸プローブとハイブリダイズさせるステップと、
患者試料を７番染色体セントロメア（ＣＥＮ７）に結合する核酸対照プローブとハイブリダイズさせるステップと、
染色体５ｐ及びＣＥＮ７におけるハイブリダイゼーション複合体の形成を検出するステップであって、前記ハイブリダイゼーション複合体の検出が、正常細胞と比べて染色体コピー数の増加を示し、子宮頸部細胞障害の存在と相関するステップと
を含む上記方法。
【請求項２】
試料における子宮頸部細胞障害の存在を決定するために染色体異常を検出するための方法であって、
患者試料を染色体３ｑにおける標的核酸配列に結合する核酸プローブとハイブリダイズさせるステップと、
患者試料を７番染色体セントロメア（ＣＥＮ７）配列に結合する核酸対照プローブとハイブリダイズさせるステップと、
染色体３ｑ及びＣＥＮ７におけるハイブリダイゼーション複合体の形成を検出するステップであって、前記ハイブリダイゼーション複合体の検出が、正常細胞と比べて染色体コピー数の増加を示し、子宮頸部細胞障害の存在と相関するステップと
を含む上記方法。
【請求項３】
試料における子宮頸部細胞障害の存在を決定するために染色体異常を検出するための方法であって、
患者試料を染色体３ｑにおける標的核酸配列に結合する核酸プローブとハイブリダイズさせるステップと、
患者試料を染色体５ｐにおける標的核酸に結合する核酸プローブとハイブリダイズさせるステップと、
患者試料を７番染色体セントロメア（ＣＥＮ７）に結合する核酸対照プローブとハイブリダイズさせるステップと、
染色体５ｐ、染色体３ｑ及びＣＥＮ７におけるハイブリダイゼーション複合体の形成を検出するステップであって、前記ハイブリダイゼーション複合体の検出が、正常細胞と比べて染色体コピー数の増加を示し、子宮頸疾患の存在と相関するステップと
を含む上記方法。
【請求項４】
前記子宮頸部細胞障害が、子宮頸癌形成、上皮内病変又は悪性に関して陰性（ＮＩＬＭ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞ＨＳＩＬ（ＡＳＣ−Ｈ）、意義不明異型腺細胞（ＡＧＵＳ）、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、子宮頸部異形成、前癌、前悪性病変、子宮頸癌、子宮頸腺癌、頸部扁平上皮癌、頸部上皮内腫瘍１（ＣＩＮ１）、頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ２）、頸部上皮内腫瘍３（ＣＩＮ３）、上皮内癌及び浸潤頸癌からなる群から選択される１つ又は複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記子宮頸部細胞障害が、子宮頸癌形成、上皮内病変又は悪性に関して陰性（ＮＩＬＭ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞ＨＳＩＬ（ＡＳＣ−Ｈ）、意義不明異型腺細胞（ＡＧＵＳ）、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、子宮頸部異形成、前癌、前悪性病変、子宮頸癌、子宮頸腺癌、頸部扁平上皮癌、頸部上皮内腫瘍１（ＣＩＮ１）、頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ２）、頸部上皮内腫瘍３（ＣＩＮ３）、上皮内癌及び浸潤頸癌からなる群から選択される１つ又は複数を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記子宮頸部細胞障害が、子宮頸癌形成、上皮内病変又は悪性に関して陰性（ＮＩＬＭ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞ＨＳＩＬ（ＡＳＣ−Ｈ）、意義不明異型腺細胞（ＡＧＵＳ）、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、子宮頸部異形成、前癌、前悪性病変、子宮頸癌、子宮頸腺癌、頸部扁平上皮癌、頸部上皮内腫瘍１（ＣＩＮ１）、頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ２）、頸部上皮内腫瘍３（ＣＩＮ３）、上皮内癌及び浸潤頸癌からなる群から選択される１つ又は複数を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
プローブが５ｐ１５における標的核酸と結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
プローブが３ｑ２７又は３ｑ２６における標的核酸と結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
プローブが５ｐ１５及び３ｑ２６における標的核酸配列と結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
プローブが５ｐ１５及び３ｑ２６における標的核酸と結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
プローブが５ｐ１５及び３ｑ２６における標的核酸配列と結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
５ｐにおける標的核酸配列が、５ｐ１５．３３、５ｐ１５．３２、５ｐ１５．３１、５ｐ１５．２、５ｐ１５．１又はそれらの任意の部分若しくは組み合わせからなる群から選択される遺伝子座における標的を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１３】
３ｑにおける標的核酸配列が、３ｑ２６．１、３ｑ２６．２、３ｑ２６．３１、３ｑ２６．３２、３ｑ２６．３３からなる群から選択される遺伝子座における標的を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項１４】
染色体腕５ｐにおける標的核酸配列がＴＥＲＴ遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１５】
染色体腕３ｑにおける標的核酸配列がＴＥＲＣ由来の核酸配列を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項１６】
染色体腕５ｐにおける標的核酸配列がＴＲＩＰ１３由来の核酸配列を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１７】
標的核酸がＰＩＣ３ＣＡ又はＧＬＵＴ２を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項１８】
標的核酸配列が５ｐ１５におけるＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ遺伝子座に存在する、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１９】
１ｑ、２０ｑ、１２ｑ、１９ｑ、１１ｑ、６ｑ、１７ｐ、７、８ｑ、９ｑ、１６ｑ、２ｑ、９ｐ、１０ｑ、１８ｐ及びそれらの任意の組み合わせを含む１つ又は複数の腕を標的とするプローブを更に含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２０】
１ｑ２１〜３１、２０ｑ１２、１２ｑ１３〜２４、１９ｑ１３、１１ｑ２１、７ｑ１１〜２２、８ｑ２４、９ｑ３３〜３４、１６ｑ２３、２ｑ３２、９ｐ２２、１０ｑ２１〜２４、１８ｐ１１及びそれらの任意の組み合わせを含む１つ又は複数の領域を標的とするプローブを更に含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２１】
四倍性が観察される、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２２】
ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ＣＧＨ、アレイＣＧＨ又はフローサイトメトリーを用いた検出を更に含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２３】
試料が、子宮、子宮頚管、膣、膣円蓋、外陰部、卵巣又は卵管から採取された細胞を含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２４】
試料が中期細胞又は間期細胞を含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２５】
子宮頸部細胞を含む試料が、ｐａｐスメア、薄層細胞診標本、薄層懸濁液、細針吸引、組織標本、パンチ生検、ループ式電気焼灼切除術（ＬＥＥＰ）、錐体生検、子宮摘出、子宮頚管内掻爬術（ＥＣＣ）から得られた試料である、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２６】
試料がヒトパピローマウイルス感染陽性患者に由来する、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１、２又は３に記載の染色体変化を検出するためのキット。
【請求項２８】
請求項１、２又は３に記載の方法のステップを含む、患者状態のシフトを評価するための方法。
【請求項２９】
軽度から高度子宮頸部異形成又は癌への患者状態の変化を決定するステップを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１、２又は３に記載の方法のステップを含む、子宮頸部細胞障害を発症する患者のリスク、素因又は可能性を決定するための方法。
【請求項３１】
請求項１、２又は３に記載の方法のステップを含む、軽度子宮頸部異形成又は正常への患者状態の維持又は回復を評価するための方法。
【請求項３２】
請求項１、２又は３に記載の方法を含む、病状が、子宮頸癌形成、上皮内病変又は悪性に関して陰性（ＮＩＬＭ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞ＨＳＩＬ（ＡＳＣ−Ｈ）、意義不明異型腺細胞（ＡＧＵＳ）、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、子宮頸部異形成、前癌、前悪性病変、子宮頸癌、子宮頸腺癌、頸部扁平上皮癌、頸部上皮内腫瘍１（ＣＩＮ１）、頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ２）、頸部上皮内腫瘍３（ＣＩＮ３）、上皮内癌及び浸潤頸癌からなる群から選択される１つ又は複数であることを確認するための方法。
【請求項３３】
子宮頸部細胞障害の成功的治療を検出、確認又は検証する、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項３４】
子宮頸部細胞障害の範囲及び／又は重症度を定量化する、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出ステップがハイブリダイゼーション複合体の自動イメージング解析を更に含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項１】
試料における子宮頸部細胞障害の存在を決定するために染色体異常を検出するための方法であって、
患者試料を染色体５ｐにおける標的核酸配列に結合する核酸プローブとハイブリダイズさせるステップと、
患者試料を７番染色体セントロメア（ＣＥＮ７）に結合する核酸対照プローブとハイブリダイズさせるステップと、
染色体５ｐ及びＣＥＮ７におけるハイブリダイゼーション複合体の形成を検出するステップであって、前記ハイブリダイゼーション複合体の検出が、正常細胞と比べて染色体コピー数の増加を示し、子宮頸部細胞障害の存在と相関するステップと
を含む上記方法。
【請求項２】
試料における子宮頸部細胞障害の存在を決定するために染色体異常を検出するための方法であって、
患者試料を染色体３ｑにおける標的核酸配列に結合する核酸プローブとハイブリダイズさせるステップと、
患者試料を７番染色体セントロメア（ＣＥＮ７）配列に結合する核酸対照プローブとハイブリダイズさせるステップと、
染色体３ｑ及びＣＥＮ７におけるハイブリダイゼーション複合体の形成を検出するステップであって、前記ハイブリダイゼーション複合体の検出が、正常細胞と比べて染色体コピー数の増加を示し、子宮頸部細胞障害の存在と相関するステップと
を含む上記方法。
【請求項３】
試料における子宮頸部細胞障害の存在を決定するために染色体異常を検出するための方法であって、
患者試料を染色体３ｑにおける標的核酸配列に結合する核酸プローブとハイブリダイズさせるステップと、
患者試料を染色体５ｐにおける標的核酸に結合する核酸プローブとハイブリダイズさせるステップと、
患者試料を７番染色体セントロメア（ＣＥＮ７）に結合する核酸対照プローブとハイブリダイズさせるステップと、
染色体５ｐ、染色体３ｑ及びＣＥＮ７におけるハイブリダイゼーション複合体の形成を検出するステップであって、前記ハイブリダイゼーション複合体の検出が、正常細胞と比べて染色体コピー数の増加を示し、子宮頸疾患の存在と相関するステップと
を含む上記方法。
【請求項４】
前記子宮頸部細胞障害が、子宮頸癌形成、上皮内病変又は悪性に関して陰性（ＮＩＬＭ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞ＨＳＩＬ（ＡＳＣ−Ｈ）、意義不明異型腺細胞（ＡＧＵＳ）、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、子宮頸部異形成、前癌、前悪性病変、子宮頸癌、子宮頸腺癌、頸部扁平上皮癌、頸部上皮内腫瘍１（ＣＩＮ１）、頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ２）、頸部上皮内腫瘍３（ＣＩＮ３）、上皮内癌及び浸潤頸癌からなる群から選択される１つ又は複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記子宮頸部細胞障害が、子宮頸癌形成、上皮内病変又は悪性に関して陰性（ＮＩＬＭ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞ＨＳＩＬ（ＡＳＣ−Ｈ）、意義不明異型腺細胞（ＡＧＵＳ）、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、子宮頸部異形成、前癌、前悪性病変、子宮頸癌、子宮頸腺癌、頸部扁平上皮癌、頸部上皮内腫瘍１（ＣＩＮ１）、頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ２）、頸部上皮内腫瘍３（ＣＩＮ３）、上皮内癌及び浸潤頸癌からなる群から選択される１つ又は複数を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記子宮頸部細胞障害が、子宮頸癌形成、上皮内病変又は悪性に関して陰性（ＮＩＬＭ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞ＨＳＩＬ（ＡＳＣ−Ｈ）、意義不明異型腺細胞（ＡＧＵＳ）、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、子宮頸部異形成、前癌、前悪性病変、子宮頸癌、子宮頸腺癌、頸部扁平上皮癌、頸部上皮内腫瘍１（ＣＩＮ１）、頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ２）、頸部上皮内腫瘍３（ＣＩＮ３）、上皮内癌及び浸潤頸癌からなる群から選択される１つ又は複数を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
プローブが５ｐ１５における標的核酸と結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
プローブが３ｑ２７又は３ｑ２６における標的核酸と結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
プローブが５ｐ１５及び３ｑ２６における標的核酸配列と結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
プローブが５ｐ１５及び３ｑ２６における標的核酸と結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
プローブが５ｐ１５及び３ｑ２６における標的核酸配列と結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
５ｐにおける標的核酸配列が、５ｐ１５．３３、５ｐ１５．３２、５ｐ１５．３１、５ｐ１５．２、５ｐ１５．１又はそれらの任意の部分若しくは組み合わせからなる群から選択される遺伝子座における標的を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１３】
３ｑにおける標的核酸配列が、３ｑ２６．１、３ｑ２６．２、３ｑ２６．３１、３ｑ２６．３２、３ｑ２６．３３からなる群から選択される遺伝子座における標的を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項１４】
染色体腕５ｐにおける標的核酸配列がＴＥＲＴ遺伝子由来の核酸配列を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１５】
染色体腕３ｑにおける標的核酸配列がＴＥＲＣ由来の核酸配列を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項１６】
染色体腕５ｐにおける標的核酸配列がＴＲＩＰ１３由来の核酸配列を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１７】
標的核酸がＰＩＣ３ＣＡ又はＧＬＵＴ２を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項１８】
標的核酸配列が５ｐ１５におけるＣｒｉ ｄｕ Ｃｈａｔ遺伝子座に存在する、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１９】
１ｑ、２０ｑ、１２ｑ、１９ｑ、１１ｑ、６ｑ、１７ｐ、７、８ｑ、９ｑ、１６ｑ、２ｑ、９ｐ、１０ｑ、１８ｐ及びそれらの任意の組み合わせを含む１つ又は複数の腕を標的とするプローブを更に含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２０】
１ｑ２１〜３１、２０ｑ１２、１２ｑ１３〜２４、１９ｑ１３、１１ｑ２１、７ｑ１１〜２２、８ｑ２４、９ｑ３３〜３４、１６ｑ２３、２ｑ３２、９ｐ２２、１０ｑ２１〜２４、１８ｐ１１及びそれらの任意の組み合わせを含む１つ又は複数の領域を標的とするプローブを更に含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２１】
四倍性が観察される、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２２】
ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ＣＧＨ、アレイＣＧＨ又はフローサイトメトリーを用いた検出を更に含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２３】
試料が、子宮、子宮頚管、膣、膣円蓋、外陰部、卵巣又は卵管から採取された細胞を含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２４】
試料が中期細胞又は間期細胞を含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２５】
子宮頸部細胞を含む試料が、ｐａｐスメア、薄層細胞診標本、薄層懸濁液、細針吸引、組織標本、パンチ生検、ループ式電気焼灼切除術（ＬＥＥＰ）、錐体生検、子宮摘出、子宮頚管内掻爬術（ＥＣＣ）から得られた試料である、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２６】
試料がヒトパピローマウイルス感染陽性患者に由来する、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１、２又は３に記載の染色体変化を検出するためのキット。
【請求項２８】
請求項１、２又は３に記載の方法のステップを含む、患者状態のシフトを評価するための方法。
【請求項２９】
軽度から高度子宮頸部異形成又は癌への患者状態の変化を決定するステップを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１、２又は３に記載の方法のステップを含む、子宮頸部細胞障害を発症する患者のリスク、素因又は可能性を決定するための方法。
【請求項３１】
請求項１、２又は３に記載の方法のステップを含む、軽度子宮頸部異形成又は正常への患者状態の維持又は回復を評価するための方法。
【請求項３２】
請求項１、２又は３に記載の方法を含む、病状が、子宮頸癌形成、上皮内病変又は悪性に関して陰性（ＮＩＬＭ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣ−ＵＳ）、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞ＨＳＩＬ（ＡＳＣ−Ｈ）、意義不明異型腺細胞（ＡＧＵＳ）、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、子宮頸部異形成、前癌、前悪性病変、子宮頸癌、子宮頸腺癌、頸部扁平上皮癌、頸部上皮内腫瘍１（ＣＩＮ１）、頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ２）、頸部上皮内腫瘍３（ＣＩＮ３）、上皮内癌及び浸潤頸癌からなる群から選択される１つ又は複数であることを確認するための方法。
【請求項３３】
子宮頸部細胞障害の成功的治療を検出、確認又は検証する、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項３４】
子宮頸部細胞障害の範囲及び／又は重症度を定量化する、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出ステップがハイブリダイゼーション複合体の自動イメージング解析を更に含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１１−５２８５６８（Ｐ２０１１−５２８５６８Ａ）
【公表日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２０１４１（Ｐ２０１１−５２０１４１）
【出願日】平成２１年７月２１日（２００９．７．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５１３０１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１１６８３
【国際公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【出願人】（５１１０１８０８８）ネオディアグノスティックス、インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２１日（２００９．７．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５１３０１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１１６８３
【国際公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【出願人】（５１１０１８０８８）ネオディアグノスティックス、インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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