害虫抵抗性管理のためのＣＲＹ１ＣａおよびＣＲＹ１Ｆａタンパク質の併用
本発明は、鱗翅目（lepidopteran）昆虫を防除するための方法および植物を含み、前記植物は、昆虫（複数可）による抵抗性の発達を遅延または抑制するため、Ｃｒｙ１Ｆａ殺虫性タンパク質とＣｒｙ１Ｃａ殺虫性タンパク質とを組み合わせて含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
人間は、トウモロコシ（corn）を食料およびエネルギー用途のために栽培する。人間は、ダイズおよびワタ等、他にも多くの作物を栽培する。昆虫は、植物を食害することによりこのような人間の努力を台無しにする。害虫（insect pest）を防除する（control）ために毎年数十億ドルが費やされ、その被害のためにさらに数十億が失われている。合成有機化学薬品の殺虫剤は、害虫防除に用いられる主要な手段であったが、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）由来の殺虫性タンパク質（insecticidal protein）等、生物殺虫剤（biological insecticide）は、いくつかの分野で重要な役割を果たしてきた。Ｂｔ殺虫性タンパク質遺伝子で形質転換することにより虫害抵抗性植物（insect-resistant plant）を作出する能力は、現代農業に革命をもたらし、殺虫性タンパク質およびその遺伝子の重要性および価値を高めた。
【０００２】
現在までに登録および商品化に成功した虫害抵抗性トランスジェニック植物を作製するため、数種類のＢｔタンパク質が用いられてきた。これらとしては、トウモロコシにおけるＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ３Ｂｂ、ワタにおけるＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２ＡｂならびにジャガイモにおけるＣｒｙ３Ａが挙げられる。
【０００３】
これらのタンパク質を発現する市販の製品は、２種のタンパク質の殺虫スペクトルの組み合わせが望ましい場合（例えば、それぞれ鱗翅目（lepidopteran）有害生物（pest）およびルートワーム（rootworm）に対する抵抗性を付与するよう組み合わせた、トウモロコシにおけるＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ３Ｂｂ）、あるいはタンパク質の独立的な作用により、感受性昆虫集団における抵抗性の発達を遅延させるためのツールとして有用となる場合（例えば、タバコバドワーム（tobacco budworm）の抵抗性管理を可能にするよう組み合わせた、ワタにおけるＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２Ａｂ）を除き、単一のタンパク質を発現する。
【０００４】
すなわち、この技術の急速かつ広範な採用をもたらした虫害抵抗性トランスジェニック植物の性質の一部はまた、有害生物集団が、これらの植物によって産生される殺虫性タンパク質に対する抵抗性を発達させ得るとの懸念も生じる。Ｂｔに基づく虫害抵抗性形質の有用性を保つための数通りの戦略が提案されてきたが、これには、緩衝帯（refuge）と組み合わせた高用量タンパク質の配置（deploying）や、異なる毒素と交互の配置またはその共配置（co-deployment）が挙げられる（McGaugheyら(1998)、「B.t. Resistance Management」Nature Biotechnol. 16:144〜146）。
【０００５】
ＩＲＭスタック（stack）において用いるために選択されるタンパク質は、あるタンパク質に対して発達した抵抗性が第二のタンパク質に対する抵抗性を付与しないように、その殺虫効果を独立的に発揮する必要がある（すなわち、タンパク質同士に交差抵抗性がない）。例えば、「タンパク質Ａ」に対する抵抗性のために選択された有害生物集団が、「タンパク質Ｂ」に対する感受性を有する場合、これは交差抵抗性がなく、タンパク質Ａとタンパク質Ｂの組み合わせが、タンパク質Ａ単独に対する抵抗性の遅延に有効であると結論することができる。
【０００６】
抵抗性昆虫集団が存在しない場合、作用機構および交差抵抗性の可能性に関係すると思われる他の特徴に基づいて評価を行うことができる。交差抵抗性を示さない可能性のある殺虫性タンパク質の同定において、受容体を介した結合の有用性が示唆されている（van Mellaertら、1999）。このアプローチに固有の交差抵抗性欠如の主要な予測因子は、殺虫性タンパク質同士が、感受性昆虫種における受容体に関して競合しないことである。
【０００７】
２種のＢｔ毒素が同一受容体に関して競合する場合において、毒素の一方が該受容体と結合しなくなるように、従って昆虫に対し殺虫性ではなくなるように該受容体が該昆虫において突然変異すれば、昆虫が、第二の毒素（同一受容体に対し競合的に結合する）に対しても同様に抵抗性となる可能性がある。すなわち、昆虫は、両方のＢｔ毒素に対し交差抵抗性であると考えられる。しかし、２種の毒素が２種の異なる受容体と結合する場合、これは、昆虫がこれら２種の毒素に対し同時に抵抗性とならないことの指標となり得る。
【０００８】
Ｃｒｙ１Ｆａは、ユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｂｎｅｒ））やフォールアーミーワーム（fall armyworm）（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））等、多くの鱗翅目（lepidopteran）有害生物種の防除において有用であり、シュガーケーンボーラー（sugarcane borer）（ＳＣＢ；ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis））に対し活性を有する。
【０００９】
Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質は、イベントＴＣ１５０７を含有するトウモロコシ植物において産生されると、ＦＡＷ防除に関し業界最高の虫害抵抗性形質をもたらした。Ｃｒｙ１Ｆａは、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ（登録商標）、ＳｍａｒｔＳｔａｘ（商標）およびＷｉｄｅＳｔｒｉｋｅ（商標）製品内にさらに配置されている。
【００１０】
受容体結合アッセイにおける検出のためのタンパク質標識に利用できる最も一般的な技法は、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質の殺虫活性を不活性化するので、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質を用いて（競合的または相同的）受容体結合試験を実行する能力は制限されている。
【００１１】
追加的なＣｒｙ毒素は、公式Ｂ．ｔ．命名委員会（official B.t. nomenclature committee）（Crickmoreら;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）のウェブサイトに列挙されている。添付の付録Ａを参照されたし。現在、ほぼ６０種の「Ｃｒｙ」毒素（Ｃｒｙ１〜Ｃｒｙ５９）主要グループと、追加的なＣｙｔ毒素およびＶＩＰ毒素等が存在する。各数字のグループの多くは、大文字のサブグループを有し、大文字のサブグループは、小文字のさらに下位のサブグループを有する（例えば、Ｃｒｙ１はＡ〜Ｌを有し、Ｃｒｙ１Ａはａ〜ｉを有する）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の簡単な要旨
本発明は、一部には、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質の殺虫活性に対する抵抗性のために選択されたフォールアーミーワーム（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）；ＦＡＷ）集団が、Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質の殺虫活性に対する抵抗性を持たないという驚くべき発見に関する。当業者であれば本開示に鑑みて認識するであろうが、これら２種の殺虫性タンパク質またはその殺虫性部分を発現する植物は、これら殺虫性タンパク質のいずれか単独に対する抵抗性発達の遅延または抑制において有用となるであろう。
【００１３】
本発明は、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃａが、ＦＡＷ由来（またはジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）（シュガーケーンボーラー；ＳＣＢ）由来）の腸（gut）受容体との結合に関して互いに競合しないとの発見によっても支えられている。
【００１４】
本発明はまた、一部には、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃ毒素を基本のペアとする３種（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド（pyramid）」に関する。好ましいピラミッドの一型は、２種の有害生物、ＦＡＷおよびＥＣＢ（ユーロピアンコーンボーラー；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis））に対する非交差抵抗性活性をもたらす少なくとも２種のタンパク質、Ｃｒｙ１ＦａとＣｒｙ１Ｃａと、Ｃｒｙ１Ａｂ等の１または複数の抗ＥＣＢ毒素とを提供する。一部の好ましいピラミッド実施形態において、選択された毒素類は、ＦＡＷに対し３種の別個の作用機序を有する。好ましいピラミッドの組み合わせは、Ｃｒｙ１ＦａとＣｒｙ１Ｃａと、Ｖｉｐ３Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１ＢｅおよびＣｒｙ１Ｅからなる群から選択される別の毒素／遺伝子とである。これら３種の毒素を産生する植物（およびその植物が植え付けられた地所（acreage））は、本発明の範囲内に含まれる。追加的な毒素／遺伝子が付け加えられてもよいが、これら特定の三重スタックは、本発明において、ＦＡＷに対する３種の作用機序を有利にかつ驚くほどに提供する。これは、緩衝帯地所（refuge acreage）の要件の縮小または除外に役立つ可能性がある。本発明はまた、一般に、単一の標的有害生物に対し互いに競合しない３種の殺虫性タンパク質（一部の好ましい実施形態においてＣｒｙタンパク質）の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】フォールアーミーワーム（ＦＡＷ）およびＣｒｙ１Ｆ抵抗性のフォールアーミーワーム（ｒＦＡＷ）の新生期幼虫にｉｎ ｖｉｔｒｏでチャレンジした（challanged）メイズ（maize）葉片の食害評定。ｐＤＡＳ５１６２による形質転換後に選択されたトランスジェニックＴ０植物は、抗体ＤＩＧ１５２ＲＰＣ１を用いたイムノブロットスクリーニングにより、ＤＩＧ−１０９を産生しない植物（図中、左側）および検出可能レベルのＤＩＧ−１０９を有する植物（図中、中央）の２群に分けた。ＤＩＧ−１０９陽性植物を発現レベルによってランク分けして並べた（左から右へ、最低から最高）。３６系統のｐＤＡＳ５１６２形質転換系統においてＤＳＭ２のＨＰ解析を完了した。遺伝子１〜２コピーとして定義される単純な組込みイベントが、試料の９５％において検出された。陽性および陰性対照植物から得られたバイオアッセイを図中右側に示す。
【図２】Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素および１２５Ｉ標識したＣｒｙ１Ｃａコア毒素による、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）ＢＢＭＶとの結合に関する競合。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
配列の簡単な説明
配列番号１：Ｃｒｙ１Ｃａコア／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシン（protoxin）キメラタンパク質、１１６４ａａ（ＤＩＧ−１５２）（ｐＭＹＣ２５４７バージョン）
配列番号２：第二のＣｒｙ１Ｃａコア／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンキメラタンパク質、１１６４ａａ（ＤＩＧ−１０９）（メイズバージョン）
配列番号３：ＤＩＧ−１０９をコードするメイズ最適化ＣＤＳ、３４９２ｂｐ
配列番号４：Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素
配列番号５：Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書において報告されている通り、トランスジェニックトウモロコシおよび他の植物（例えば、ワタやダイズ）において産生されるＣｒｙ１Ｃａ毒素は、Ｃｒｙ１Ｆａ活性に対する抵抗性を発達させたフォールアーミーワーム（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））の防除において非常に有効である。よって、本発明は、一部には、Ｃｒｙ１Ｆａ抵抗性のフォールアーミーワームが、Ｃｒｙ１Ｃａに対し感受性である（すなわち、交差抵抗性ではない）との驚くべき発見に関する。
【００１８】
本発明はまた、一部には、Ｃｒｙ１Ｃａ毒素が、植物（メイズ植物（maize）等）をＣｒｙ１Ｆａ抵抗性フォールアーミーワームによる損傷から保護するのに有効であるとの驚くべき発見に関する。この有害生物に関する考察については、例えば、Tabashnik、PNAS(2008)、105巻49号、19029〜19030を参照されたし。
【００１９】
本発明は、トウモロコシおよびその他の経済的に重要な植物種をフォールアーミーワーム摂食に起因する損傷および収量減少から保護するための、あるいはＣｒｙ１Ｆａに対する抵抗性を発達させたフォールアーミーワーム集団に対するＣｒｙ１Ｃａ毒素の使用を含む。
【００２０】
よって、本発明は、フォールアーミーワームによるＣｒｙ１Ｆａおよび／またはＣｒｙ１Ｃａに対する抵抗性の発達を抑制または緩和するためのＩＲＭスタックを教示する。
【００２１】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｃａコア毒素含有タンパク質を産生する細胞を含む、鱗翅目（lepidopteran）有害生物を防除するための組成物を提供する。
【００２２】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｃａコア毒素含有タンパク質の両方を産生するよう形質転換した宿主（ここで、上記宿主は、微生物または植物細胞である）をさらに含む。対象ポリヌクレオチド（複数可）は、好ましくは、非バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）プロモーター制御下の（プロモーターに作動可能に連結した／を含む）遺伝的構築物内に置かれる。対象ポリヌクレオチドは、植物における発現を増強するためのコドン使用を含むことができる。
【００２３】
さらに、本発明は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質を含有しＣｒｙ１Ｃａコア毒素含有タンパク質をさらに含有する有効量の組成物と、有害生物または有害生物の環境を接触させるステップを含む、鱗翅目（lepidopteran）有害生物を防除する方法を提供することを目的とする。
【００２４】
本発明は、その一実施形態において、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素含有タンパク質をコードする植物発現可能遺伝子およびＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質をコードする植物発現可能遺伝子を含むメイズ植物（および他の植物、例えばワタおよびダイズ）ならびにこのような植物の種子を含む。
【００２５】
本発明は、そのさらに別の一実施形態において、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素含有タンパク質をコードする植物発現可能遺伝子およびＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質をコードする植物発現可能遺伝子が遺伝子移入された（introgress）メイズ植物（および他の植物、例えばワタおよびダイズ）ならびにこのような植物の種子を含む。
【００２６】
（植物における可能性のあるバイオ殺虫剤（bioinsecticide）としてのＣｒｙ１Ｃの総説に関しては、Avisarら、2009を参照されたし。）Avisar D, Eilenberg H, Keller M, Reznik N, Segal M, Sneh B, Zilberstein A (2009) The Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cry1C as a potential bioinsecticide in plants. Plant Science 176:315〜324。
【００２７】
昆虫受容体。 実施例に記載されている通り、放射標識したＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質を用いた競合的受容体結合試験は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、Ｃｒｙ１Ｃａが結合するＦＡＷ昆虫組織に存在する高親和性結合部位に関して競合しないことを示す。これらの結果は、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃａタンパク質の組み合わせが、ＦＡＷ集団においてＣｒｙ１Ｆａに対する抵抗性の発達（および同様に、Ｃｒｙ１Ｃａに対する抵抗性の発達）を緩和するのに有効な手段であること、ならびに、両方のタンパク質を発現するトウモロコシ植物においてこの有害生物に対する抵抗性レベルを増加させる可能性があることを示す。
【００２８】
よって、本明細書における上述および他に記したデータに部分的に基づくと、Ｃｒｙ１ＣａおよびＣｒｙ１Ｆａタンパク質の同時産生（スタッキング）は、ＦＡＷのための高用量ＩＲＭスタックの産生に用いることができると考えられる。昆虫防除スペクトルを拡大するために、他のタンパク質をこの組み合わせに加えてもよい。例えば、トウモロコシにおいて、Ｃｒｙ１Ａｂの追加は、ユーロピアンコーンボーラー防除のためのＩＲＭピラミッドを作成するであろう。
【００２９】
別の配置オプションは、抵抗性の発達を緩和するために、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質と組み合わせたＣｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃａタンパク質の一方または両方を用いるものとなるであろう。よって、本発明の別の配置オプションは、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質の配置が、抵抗性集団発生によりシュガーケーンボーラー防除において無効となる場合、作物栽培領域においてＣｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃａタンパク質の一方または両方を用いるものとなるであろう。したがって、本発明に係る使用のための好ましい「三重スタック」または「ピラミッド」の組み合わせは、Ｃｒｙ１ＦとＣｒｙ１ＣとＣｒｙ１Ａｂである。
【００３０】
本発明はまた、一部には、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃ毒素を基本のペアとする３種（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド」に関する。好ましいピラミッドの一型は、２種の有害生物 − ＦＡＷおよびＥＣＢ（ユーロピアンコーンボーラー；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis））に対し非交差抵抗性活性を付与する少なくとも２種のタンパク質を提供する。Ｃｒｙ１Ｆはどちらの昆虫に対しても活性を有するため、これは、Ｃｒｙ１ＦａとＣｒｙ１Ｄａと、Ｃｒｙ１Ａｂ等の１または複数のＥＣＢ毒素（米国特許出願公開第２００８ ０３１１０９６号明細書を参照）とである。他のＥＣＢ毒素としては、Ｃｒｙ１Ｂｅ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２９０；２００９年１２月１６日出願を参照）、Ｃｒｙ１Ｉ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２７８；２００９年１２月１６日出願を参照）、Ｃｒｙ２Ａａ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２７８；２００９年１２月１６日出願を参照）およびＤＩＧ−３（米国特許出願公開第２０１０ ００２６９２２３号明細書を参照）が挙げられる。一部の好ましいピラミッド実施形態において、選択された毒素は、ＦＡＷに対し３種の別個の作用機序を有する。これらの好ましいピラミッドの組み合わせは、Ｃｒｙ１ＦａとＣｒｙ１Ｃａと、Ｖｉｐ３Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｄ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２５２；２００９年１２月１６日出願を参照）、Ｃｒｙ１ＢｅおよびＣｒｙ１Ｅ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２７８；２００９年１２月１６日出願を参照）からなる群から選択される別の毒素／遺伝子である。これら３種の毒素を産生する植物（およびこのような植物を植え付けた地所）は、本発明の範囲内に含まれる。追加的な毒素／遺伝子を付け加えてもよいが、これらの特定の三重スタックは、本発明において、ＦＡＷに対する３種の作用機序を有利かつ驚くほどにもたらすであろう。これは、緩衝帯地所に対する要件の縮小または除外に役立ち得る。よって、このように植え付けた１０エーカーを超える圃場（field）は、本発明の範囲内に含まれる。
【００３１】
他のＶｉｐ３毒素は、例えば、添付の付録Ａに列挙されている。これらのＧＥＮＢＡＮＫ番号を用いて、本明細書に開示または言及されている遺伝子およびタンパク質のいずれかの配列を得ることもできる。
【００３２】
米国特許第５，１８８，９６０号明細書および米国特許第５，８２７，５１４号明細書は、本発明の実施における使用に適したＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質について記載する。米国特許第６，２１８，１８８号明細書は、本発明における使用に適したＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質をコードする、植物に最適化したＤＮＡ配列について記載する。
【００３３】
本発明に記載されている毒素類の組み合わせは、鱗翅目（lepidopteran）有害生物の防除に用いることができる。成虫の鱗翅目（lepidopteran）、例えば蝶や蛾は主として花蜜を餌とし、授粉の重要なエフェクターである。ほぼ全ての鱗翅目（lepidopteran）の幼虫、すなわちイモムシは植物を餌とし、多くは深刻な有害生物である。イモムシは、植物の葉の上もしくは内側、根または茎を餌とし、植物から栄養を奪い、多くの場合植物の物理的支持構造を破壊する。さらに、イモムシは果実、織物ならびに貯蔵している穀物および小麦粉を餌とし、これら販売用の商品を台無しにし、あるいはそれらの価値を大幅に減少させる。本明細書において使用する場合、鱗翅目（lepidopteran）有害生物の言及は、幼生期を含む有害生物の様々なライフステージを意味する。
【００３４】
本発明の一部のキメラ毒素は、Ｂｔ毒素の完全Ｎ末端コア毒素部分を含み、該コア毒素部分の末端を過ぎたある点において、タンパク質は異種プロトキシン配列へと移行する。Ｎ末端の殺虫活性を有するＢｔ毒素の毒素部分は、「コア」毒素という。コア毒素セグメントから異種プロトキシンセグメントへの移行（transition）は、毒素／プロトキシン接合部（junction）付近において生じてもよいし、あるいは天然のプロトキシン部分（コア毒素部分を過ぎて延在する）が保持されて、異種プロトキシン部分への移行が下流で生じてもよい。
【００３５】
一例として、本発明のキメラ毒素の一型は、Ｃｒｙ１Ｆａの完全コア毒素部分（アミノ酸１〜６０１）および異種プロトキシン（アミノ酸６０２〜Ｃ末端）である。好ましい一実施形態において、プロトキシンを含むキメラ毒素部分は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質毒素に由来する。第二の例として、配列番号１に開示されている本発明の第二のキメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｃａの完全コア毒素部分（アミノ酸１〜６１９）および異種プロトキシン（アミノ酸６２０〜Ｃ末端）を有する。好ましい一実施形態において、プロトキシンを含むキメラ毒素部分は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質毒素に由来する。
【００３６】
当業者であれば、Ｂｔ毒素は、Ｃｒｙ１Ｆ等の特定のクラス内であっても、長さおよびコア毒素部分からプロトキシン部分への移行部の正確な位置がある程度変動し得ることを理解できるであろう。通常、Ｃｒｙ１ＣａおよびＣｒｙ１Ｆａ毒素は、約１１５０〜約１２００アミノ酸の長さである。コア毒素部分からプロトキシン部分への移行は通常、全長毒素の約５０％〜約６０％の間において生じるであろう。本発明のキメラ毒素は、このＮ末端コア毒素部分の全体（full expanse）を含むであろう。よって、キメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｆａ Ｂｔ毒素タンパク質全長の少なくとも約５０％またはＣｒｙ１Ｃａ Ｂｔ毒素タンパク質全長の少なくとも約５０％を含むであろう。これは通常、少なくとも約５９０アミノ酸となるであろう。プロトキシン部分に関しては、Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシン部分の全体は、コア毒素部分末端から分子のＣ末端へと延在する。
【００３７】
遺伝子および毒素。 本発明において有用な遺伝子および毒素は、開示されている全長配列のみならず、本明細書において特に例示されている毒素の特徴的な殺有害生物活性（pesticidal activity）を保持するこれら配列の断片、変種、変異体および融合タンパク質も含む。本明細書において使用される場合、用語、遺伝子の「変種（variant）」または「変異種（variation）」は、同一毒素をコードする、あるいは殺有害生物活性を有する同等の毒素をコードするヌクレオチド配列を意味する。本明細書において使用される場合、用語「同等の毒素（equivalent toxin）」は、標的有害生物に対し、特許請求されている毒素と同一または本質的に同一の生物活性を有する毒素を意味する。
【００３８】
本明細書において使用される場合、境界（boundary）は、「Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins」N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) 62巻：807〜813により、およそ９５％（Ｃｒｙ１Ｆａおよび１Ｃａ）、７８％（Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ｃ）ならびに４５％（Ｃｒｙ１）の配列同一性を表す。これらカットオフは、コア毒素のみ（Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ｃ毒素のため）に適用することもできる。
【００３９】
当業者であれば、活性毒素をコードする遺伝子を数通りの手段によって同定および獲得できることは明らかであろう。本明細書に例示されている特定の遺伝子または遺伝子部分は、培養物寄託機関（culture depository）に寄託されている分離株（isolate）から得ることができる。これらの遺伝子またはその部分もしくは変種は、合成により、例えば遺伝子合成装置を用いることにより構築することもできる。遺伝子の変異種は、点突然変異作製のための標準技法を用いて容易に構築することができる。また、これら遺伝子の断片は、市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いて標準的手順に従って作製することができる。例えば、Ｂａｌ３１等の酵素または部位特異的突然変異誘発を用いて、これら遺伝子の末端からヌクレオチドを系統的に切り取ることができる。様々な制限酵素を用いて活性断片をコードする遺伝子を得ることもできる。プロテアーゼを用いて、これらタンパク質毒素の活性断片を直接的に得ることができる。
【００４０】
例示した毒素の殺有害生物活性を保持する断片および同等物は、本発明の範囲内のものである。また、遺伝暗号の重複性のため、様々な異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示されているアミノ酸配列をコードし得る。同一または本質的に同一の毒素をコードするこのような代替的ＤＮＡ配列の作製は、十分に当業者の技能範囲内である。このような変種ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内のものである。本明細書において使用される場合、「本質的に同一」な配列の言及は、殺有害生物活性に実質的な影響を及ぼさないアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入を有する配列を意味する。殺有害生物活性を保持するタンパク質をコードする遺伝子の断片もまた、この定義に含まれる。
【００４１】
本発明において有用な毒素をコードする遺伝子および遺伝子部分を同定するためのさらに別の方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用によるものである。このようなプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。このような配列は、適切な標識に基づいて検出されてもよいし、あるいは国際公開第９３／１６０９４号パンフレットに記載されている通り、蛍光が内在するように作製されてもよい。当該分野でよく知られていることに、２分子間に強固な結合を形成することによってプローブ分子と核酸試料がハイブリダイズする場合、プローブと試料が実質的な相同性を有すると合理的に仮定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えば、Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press、ニューヨーク州ニューヨーク、169〜170頁に記載されている通り、当該分野でよく知られた技法によりストリンジェントな条件下で行われる。塩濃度および温度の組み合わせを数例、以下に示す（ストリンジェンシー増加順）：２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、室温；１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、４２℃；０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、４２℃；０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、６５℃。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが生じたかどうかを公知の様式において決定するための手段を提供する。このようなプローブ解析は、本発明の毒素コード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明に係るプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡ合成装置および標準的手順を用いて合成することができる。このようなヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして用いることもできる。
【００４２】
変種毒素。 本発明の特定の毒素は、本明細書において特に例示されている。これらの毒素は、本発明の毒素の単なる具体例であるため、本発明が、例示の毒素と同一または類似の殺有害生物活性（same or similar pesticidal activity）を有する変種または同等の毒素（および同等の毒素をコードするヌクレオチド配列）を含むことが容易に明らかであろう。同等の毒素は、例示の毒素とアミノ酸相同性を有するであろう。このアミノ酸相同性は通常、７５％を超え、好ましくは９０％を超え、最も好ましくは９５％を超えるであろう。アミノ酸相同性は、生物活性の原因となる、あるいは生物活性に最終的に関与する三次元配置の決定に関係する毒素の決定的領域において最も高くなるであろう。この点において、アミノ酸の置換が、活性に決定的ではない領域に存在する場合、あるいは分子の三次元配置に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である場合、特定のアミノ酸置換が許容され、これを予想することができる。例えば、アミノ酸は、次のクラス、非極性、無電荷極性、塩基性および酸性に分類することができる。あるクラスのアミノ酸が同じ種類の別のアミノ酸に交換される保存的置換は、置換が化合物の生物活性を実質的に変化させない限り、本発明の範囲内に収まる。表１は、各クラスに属するアミノ酸の具体例のリストを提示する。
【００４３】
【表１】
【００４４】
場合によっては、非保存的置換を行ってもよい。重要な要素としては、これらの置換が毒素の生物活性を顕著に損なってはならないことである。
【００４５】
組換え宿主。 本発明の毒素をコードする遺伝子は、多種多様な微生物または植物宿主へと導入することができる。毒素遺伝子の発現は、殺有害生物剤（pesticide）の細胞内産生および維持を直接的または間接的にもたらす。接合伝達（conjugal transfer）および組換え伝達（recombinant transfer）を用いて、本発明の両方の毒素を発現するＢｔ株を作製することができる。他の宿主生物を一方または両方の毒素遺伝子で形質転換し、続いて相乗効果の達成に用いることもできる。適切な微生物宿主、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）属を用いることにより、微生物を有害生物の位置（situs）に適用することができ、そこで微生物が増殖し、摂取される（be ingested）。その結果、有害生物の防除がもたらされる。あるいは、毒素遺伝子を導入した微生物は、毒素の活性を延長し、細胞を安定化する条件下で処理することができる。その後、毒性活性を保持する処理細胞は、標的有害生物の環境に適用することができる。
【００４６】
Ｂｔ毒素遺伝子が、適切なベクターを介して微生物宿主に導入され、前記宿主が、生きた状態で環境に適用される場合、特定の宿主微生物を用いることが必要不可欠である。１以上の対象作物の「植物圏（phytosphere）」（葉面（phylloplane）、葉圏（phyllosphere）、根圏および／または根面（rhizoplane））に生息することが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物および他の昆虫生息地）中で野生型微生物と首尾よく競合でき、ポリペプチド型殺有害生物剤を発現する遺伝子の安定的な維持および発現をもたらし、望ましくは、殺有害生物剤の環境による分解および不活性化からの保護の改善をもたらすよう選択される。
【００４７】
多数の微生物は、多種多様な重要作物の葉面（植物の葉の表面）および／または根圏（植物の根の周囲の土壌）に生息することが知られている。これらの微生物は、細菌、藻類および真菌を含む。細菌、例えばシュードモナス（Pseudomonas）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、メチロフィリウス（Methylophilius）属、アグロバクテナム（Agrobactenum）、アセトバクター（Acetobacter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属, アルスロバクター（Arthrobacter）属, アゾトバクター（Azotobacter）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属およびアルカリゲネス（Alcaligenes）属；真菌、特に酵母、例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属およびアウレオバシジウム（Aureobasidium）属等の微生物がとりわけ重要である。シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテニウム・ツメファシエンス（Agrobactenium tumefaciens）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、リゾビウム・メリオティ（Rhizobium melioti）、アルカリゲネス・エントロファス（Alcaligenes entrophus）およびアゾトバクター・ビンランジー（Azotobacter vinlandii）等の植物圏細菌種；ならびにロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、Ｒ．グルチニス（R. glutinis）、Ｒ．マリナ（R. marina）、Ｒ．アウランティアカ（R. aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、Ｃ．ジフルエンス（C. diffluens）、Ｃ．ロウレンティ（C. laurentii）、サッカロマイセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、Ｓ．プレトリエンシス（S. pretoriensis）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、スポロボロマイセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）、Ｓ．オドルス（S. odorus）、クリベロマイセス・ベロナエ（Kluyveromyces veronae）およびアウレオバシジウム・ポルランス（Aureobasidium pollulans）等の植物圏酵母種がとりわけ重要である。色素性微生物（pigmented microorganism）がとりわけ重要である。
【００４８】
遺伝子の安定的な維持および発現を可能にする条件下で、毒素をコードするＢｔ遺伝子を微生物宿主に導入するための多種多様な方法を用いることができる。これらの方法は、当業者によく知られており、例えば、本明細書において参照により援用する米国特許第５１３５８６７号明細書に記載されている。
【００４９】
細胞の処理。 Ｂｔ毒素を発現するバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）または組換え細胞は、毒素活性を延長し、細胞を安定化するよう処理することができる。生成された殺有害生物剤マイクロカプセルは、安定化された細胞構造内にＢｔ毒素（単数または複数）を含み、マイクロカプセルが標的有害生物の環境に置かれたときに毒素を保護する。適切な宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれかを含むことができるが、通常、哺乳動物等、高等生物に対し毒性の物質を産生しない細胞に限定されている。しかし、毒性物質が不安定である、あるいは適用レベルが哺乳動物宿主に対するあらゆる毒性の可能性を回避できる程十分に低い場合、高等生物に対し毒性の物質を産生する生物を用いることができる。宿主として、原核生物および真菌等の下等真核生物がとりわけ重要であろう。
【００５０】
細胞は、通常はインタクトであり、場合によっては胞子を用いてもよいが、処理される場合は胞子型ではなくむしろ実質的に増殖型である。
【００５１】
微生物細胞、例えば、Ｂ．ｔ．毒素遺伝子（単数または複数）を含有する微生物の処理は、その技法が毒素の性質に悪影響を及ぼさず、細胞の毒素保護能力を減少させない限りにおいて、化学的または物理的手段により、あるいは化学的および／または物理的手段の組み合わせにより行うことができる。化学試薬の例として、ハロゲン化剤、具体的には原子番号１７〜８０のハロゲンが挙げられる。より具体的には、ヨウ素を穏和な条件下、十分な時間を用いて、所望の結果を得ることができる。他の適切な技法として、グルタルアルデヒド等のアルデヒド；塩化ゼフィラン（zephiran chloride）および塩化セチルピリジニウム（cetylpyridinium chloride）等の抗感染薬；イソプロピルおよびエタノール等のアルコール；ルゴールヨウ素液（Lugol iodine）、ブアン固定液、様々な酸およびヘリー（Helly）固定液等の様々な組織学的固定液（Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967を参照）；または細胞が宿主環境へと投与される場合、細胞において産生される毒素の活性を保存および延長する物理的（熱）因子および化学薬品（physical (heat) and chemical agents）の組み合わせによる処理が挙げられる。物理的手段の例として、ガンマ線およびＸ線等の短波長放射線、凍結、ＵＶ照射、凍結乾燥その他が挙げられる。微生物細胞処理のための方法は、本明細書において参照により援用する米国特許第４，６９５，４５５号および第４，６９５，４６２号明細書に開示されている。
【００５２】
細胞は、一般に、環境条件に対する抵抗性を増強させる、増強された構造上の安定性を有するであろう。殺有害生物剤がプロ型（proform）である場合、細胞処理方法は、標的有害生物病原体による殺有害生物剤のプロ型から成熟型へのプロセシングを阻害しないように選択するべきである。例えば、ホルムアルデヒドは、タンパク質を架橋するため、ポリペプチド型殺有害生物剤のプロ型のプロセシングを阻害し得る。処理方法は、毒素のバイオアベイラビリティまたは生物活性の少なくとも実質的な部分を保持すべきである。
【００５３】
産生目的の宿主細胞選択におけるとりわけ重要な特徴は、Ｂ．ｔ．遺伝子（単数または複数）の宿主への導入し易さ、発現系の利用可能性、発現効率、宿主における殺有害生物剤の安定性および補助的遺伝能力の存在（presence of auxiliary genetic capability）を含む。殺有害生物剤マイクロカプセルとして用いるための重要な特徴は、厚い細胞壁、色素沈着および細胞内パッケージングまたは封入体形成；水性環境における生存；哺乳動物毒性の欠如；有害生物が摂取するための誘引性；毒素を損うことのない殺傷および固定の容易さ（ease of killing and fixing without damage to the toxin）；その他等、殺有害生物剤のための保護的な性質を含む。他の検討事項は、製剤および取り扱いの容易さ、経済的側面、保存安定性その他を含む。
【００５４】
細胞の増殖。 Ｂ．ｔ．殺虫性遺伝子（単数または複数）を含有する細胞性宿主は、ＤＮＡ構築物が選択優位性を与える任意の好都合な栄養培地中で増殖させることができ、実質的全細胞または全細胞がＢ．ｔ．遺伝子を保持するような選択培地を提供する。続いて、これらの細胞を従来の手法に従って収集することができる。あるいは、細胞を収集前に処理することができる。
【００５５】
本発明の毒素を産生するＢ．ｔ．細胞は、標準技術の培地および発酵技法を用いて培養することができる。発酵サイクルが完了し次第、細菌は、先ず、当該分野でよく知られた手段によりＢ．ｔ．胞子および結晶を発酵ブロスから分離することにより収集することができる。回収されたＢ．ｔ．胞子および結晶は、界面活性剤、分散剤、不活性担体ならびに取り扱いおよび特定の標的有害生物への適用を容易にする他の成分の添加により、可湿性粉末、原液（liquid concentrate）、顆粒または他の製剤へと処方することができる。これらの製剤および適用手順は全て当該分野でよく知られている。
【００５６】
製剤。 誘引物質ならびにＢ．ｔ．分離株の胞子、結晶および毒素を含有する処方された餌用顆粒、または本明細書に開示されているＢ．ｔ．分離株から得ることができる遺伝子を含む組換え微生物は、土壌に適用することができる。処方された産物は、種子コーティングとして、あるいは作物サイクルのより後期において根の処理または全草（total plant）処理として適用することもできる。Ｂ．ｔ．細胞による植物および土壌の処理は、無機ミネラル（フィロケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩その他）または植物材料（粉末化したトウモロコシの穂軸、籾殻、クルミの殻その他）等、様々な不活性材料と混合することにより可湿性粉末、顆粒または粉塵（dust）として利用することもできる。製剤は、展着剤接着剤アジュバント（spreader-sticker adjuvant）、安定化剤、他の殺有害生物添加剤または界面活性剤を含むことができる。液体製剤は、水性ベースであっても非水性であってもよく、泡、ジェル、懸濁液、乳剤（emulsifiable concentrate）その他として利用することができる。成分は、レオロジー剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤またはポリマーを含むことができる。
【００５７】
当業者であれば理解できるように、殺有害生物濃度は、特定の製剤の性質、特に濃縮液であるか直接用いるかに依存して大きく変動し得る。殺有害生物剤は、少なくとも１重量％存在し、１００重量％であってもよい。乾燥製剤は、約１〜９５重量％の殺有害生物剤を有するが、液体製剤は一般に、液相における約１〜６０重量％の固体となる。製剤は一般に、約１０２〜約１０４細胞／ｍｇを有する。これらの製剤は、１ヘクタール当り約５０ｍｇ（液体または乾燥）から１ｋｇ以上で投与される。
【００５８】
製剤は、噴霧（spraying）、散布（dusting）、撒布（sprinkling）その他により鱗翅目（lepidopteran）有害生物の環境、例えば、葉または土壌に適用することができる。
【００５９】
植物の形質転換。 本発明の殺虫性タンパク質の産生のための好ましい組換え宿主は、形質転換植物である。本明細書に開示されている通り、Ｂｔ毒素タンパク質をコードする遺伝子は、当該分野でよく知られた様々な技法を用いて植物細胞へと挿入することができる。例えば、大腸菌（Escherichia coli）における複製システムおよび形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む多数のクローニングベクターが、外来遺伝子の高等植物への挿入の準備に利用できる。ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４をとりわけ含む。したがって、Ｂｔ毒素タンパク質をコードする配列を有するＤＮＡ断片は、ベクターの適切な制限部位に挿入することができる。その結果生じたプラスミドを大腸菌（E. coli）の形質転換に用いる。大腸菌（E. coli）細胞を適切な栄養培地中で培養し、続いて収集し溶解する。プラスミドを回収する。解析方法として一般に、配列解析、制限酵素解析（restriction analysis）、電気泳動その他の生化学的・分子生物学的方法が行われる。各操作の後、用いたＤＮＡ配列を切断し、次のＤＮＡ配列と連結することができる。各プラスミド配列は、同一または他のプラスミドにクローニングすることができる。所望の遺伝子の植物への挿入方法に応じて、他のＤＮＡ配列が必要となり得る。例えば、ＴｉまたはＲｉプラスミドが植物細胞の形質転換に用いられる場合、ＴｉまたはＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右側境界（right border）、多くの場合右および左側境界は、挿入される遺伝子のフランキング領域として連結している必要がある。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は、集中的に研究されてきており、欧州特許第１２０５１６号明細書、Lee and Gelvin（2008）、Hoekema（1985）、Fraleyら（1986）およびAnら（1985）に十分に記載されており、当該分野において十分に確立されている。
【００６０】
挿入ＤＮＡは、一旦植物ゲノムに組み込まれると、比較的安定的になる。形質転換ベクターは通常、とりわけビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシンまたはハイグロマイシン等、殺生物剤または抗生物質に対する抵抗性を形質転換植物細胞に付与する選択可能なマーカーを含有する。したがって、個々に用いたマーカーは、挿入ＤＮＡを含有しない細胞よりも形質転換細胞の選択を可能にする。
【００６１】
ＤＮＡを植物宿主細胞に挿入するために多数の技法を利用できる。これらの技法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換の媒体（transformation agent）として用いたＴ−ＤＮＡによる形質転換、融合、インジェクション、遺伝子銃（biolistics）（微粒子銃）またはエレクトロポレーションと、他の可能な方法を含む。アグロバクテリウム細菌（Agrobacteria）が形質転換に用いられる場合、挿入されるＤＮＡは、特殊なプラスミド、すなわち中間型ベクター（intermediate vector）またはバイナリーベクターのいずれかにクローニングする必要がある。中間型ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ内の配列と相同的な配列による相同組換えによりＴｉまたはＲｉプラスミドに組込むことができる。ＴｉまたはＲｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの伝達に必要とされるｖｉｒ領域も含む。中間型ベクターは、アグロバクテリウム細菌において自己複製できない。中間型ベクターは、ヘルパープラスミド（接合（conjugation））によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に伝達することができる。バイナリーベクターは、大腸菌（E. coli）とアグロバクテリウム細菌の両方において自己複製できる。これは、右側および左側のＴ−ＤＮＡ境界領域によって画定される選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。これは、アグロバクテリウム細菌へと直接的に形質転換することができる（Holstersら、1978）。宿主細胞として用いるアグロバクテリウム（Agrobacterium）属は、ｖｉｒ領域を有するプラスミドを含む必要がある。ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞への伝達に必要である。追加的なＴ−ＤＮＡを含有してよい。このように形質転換された細菌は、植物細胞の形質転換に用いられる。植物外植片は、ＤＮＡの植物細胞への伝達のためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）と共に有利に培養することができる。次に、選択用の抗生物質または殺生物剤を含有し得る適切な培地において、感染した植物材料（例えば、葉片、茎のセグメント、根、さらにはプロトプラストまたは懸濁培養細胞）から植物体全体（whole plant）を再生させることができる。次に、このようにして得られた植物を挿入ＤＮＡの存在に関して試験することができる。インジェクションおよびエレクトロポレーションの場合、プラスミドに関して特段の定めはない。例えばｐＵＣ派生体等、通常のプラスミドを用いることが可能である。
【００６２】
形質転換細胞は、通常の様式で植物内において増殖する。これは、生殖細胞を形成し、形質転換された形質（複数可）を子孫植物に伝達することができる。このような植物は、通常の様式で育成し、同一の形質転換された遺伝要素または他の遺伝要素を有する植物と交雑することができる。その結果生じたハイブリッド個体は、対応する表現型上の性質を有する。
【００６３】
本発明の好ましい一実施形態において、植物は、コドン使用が植物に最適化された遺伝子で形質転換される。例えば、本明細書において参照により援用する米国特許第５３８０８３１号明細書を参照されたし。本明細書において数例の切断型毒素が例示されているが、Ｂｔ技術分野においてよく知られていることに、１３０ｋＤａ型（全長）毒素は、コア毒素であるＮ末端側半分およびプロトキシン「テール部（tail）」であるＣ末端側半分を有する。よって、適切な「テール部」は、本発明の切断型／コア毒素と共に用いることができる。例えば、米国特許第６２１８１８８号明細書および米国特許第６６７３９９０号明細書を参照されたし。さらに、植物において用いるための合成Ｂｔ遺伝子を作製するための方法は、当該分野において公知である（Stewart and Burgin、2007）。好ましい形質転換植物の非限定的な一例として、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質をコードする植物発現可能遺伝子を含み、Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質をコードする第二の植物発現可能遺伝子をさらに含む稔性を有するメイズ植物が挙げられる。
【００６４】
Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃａにより決定される形質（複数可）の自殖（inbred）メイズ系統への伝達（または遺伝子移入（introgression））は、反復（recurrent）選択育種、例えば戻し交雑により達成することができる。この場合、先ず、所望の反復親を、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ｃにより決定される形質の適切な遺伝子（複数可）を有するドナー自殖系（非反復親）と交雑する。次に、この交雑の子孫を反復親と戻し交配し、続いてその結果生じた子孫において、非反復親から伝達される所望の形質（複数可）を選択する。所望の形質（複数可）を選択しつつ反復親と戻し交雑してから３世代、好ましくは４世代、より好ましくは５世代以上の後、子孫は、伝達された形質（複数可）を制御する遺伝子座に関してヘテロ接合型となるが、他の遺伝子に関しては大部分またはほぼ全てが反復親と同様のものとなる（例えば、Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops、第４版、172〜175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development、１巻: Theory and Technique、360〜376を参照）。
【００６５】
害虫抵抗性管理（Insect Resistance Management）（ＩＲＭ）戦略。例えば、Roushらは、殺虫性トランスジェニック作物の管理のための、「ピラミッド化（pyramiding）」または「スタッキング」とも称される２毒素戦略について概要を述べる（The Royal Society、Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353、1777〜1786）。
【００６６】
米国環境保護局（the United States Environmental Protection Agency）は、そのウェブサイト（epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm）において、標的有害生物に対し活性を有する単一のＢｔタンパク質を産生するトランスジェニック作物と共に用いるための、非トランスジェニック（すなわち、非Ｂ．ｔ．）緩衝帯（非Ｂｔ作物／トウモロコシの区画またはブロック）を設置するための次の要件を公開する。
【００６７】
「コーンボーラーから保護されたＢｔ（Ｃｒｙ１ＡｂまたはＣｒｙ１Ｆ）トウモロコシ製品のための特定の構造化された要件は次の通りである：
構造化された緩衝帯：コーンベルトにおける非鱗翅目（lepidopteran）Ｂｔトウモロコシ緩衝帯、２０％
コットンベルトにおける非鱗翅目（lepidopteran）Ｂｔ緩衝帯、５０％
ブロック
内部（すなわち、Ｂｔ圃場内）
外部（すなわち、任意交配を最大限に高めるための、Ｂｔ圃場の１／２マイル（可能であれば１／４マイル）以内にある別の圃場）
圃場内帯状地（strip）
帯状地は、幼虫移動の効果を低減するために少なくとも４列幅（rows wide）（好ましくは６列）である必要がある」
【００６８】
さらに、全米トウモロコシ生産者協会（National Corn Growers Association）も、そのウェブサイト：
（ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn）
において、緩衝帯要件に関する同様の指針、例えば次の事項を提示する。
「コーンボーラーＩＲＭの要件：
− 緩衝帯ハイブリッドをトウモロコシ畑の少なくとも２０％に植えること
− ワタ生産区域において、緩衝帯は５０％でなければならない
− 緩衝帯ハイブリッドの１／２マイル以内に植えなければならない
− 緩衝帯はＢｔ圃場内に帯状地として配置する（plant）ことができる；緩衝帯帯状地は、少なくとも４列幅でなければならない
− 標的昆虫に対して経済的閾値（economic threshold）に達した場合のみ、緩衝帯を従来の殺有害生物剤で処理してよい
− Ｂｔベースの噴霧可能な殺虫剤は、緩衝帯トウモロコシに用いることができない
− Ｂｔトウモロコシの農場毎に適切な緩衝帯を配置しなければならない」
【００６９】
Ｒｏｕｓｈらによって記述された通り（例えば、１７８０および１７８４頁右段）、それぞれ標的有害生物に対して有効であり、交差抵抗性がほとんどないまたは全くない２種の異なるタンパク質のスタッキングまたはピラミッド化は、より小規模の緩衝帯の使用を可能にする。Ｒｏｕｓｈは、成功したスタックにおける１０％未満の緩衝帯の緩衝帯サイズは、単一（非ピラミッド化）形質における約５０％の緩衝帯に匹敵する抵抗性管理をもたらし得ることを示唆する。現在利用できるピラミッド化したＢｔトウモロコシ製品に対し、米国環境保護局は、単一形質の製品（概して２０％）よりも有意に少ない（概して５％）非Ｂｔトウモロコシの構造化された緩衝帯の植え付けを要求する。
【００７０】
Ｒｏｕｓｈら（上記参照）および米国特許第６，５５１，９６２号明細書にさらに記載されている通り、圃場における様々な幾何学的植え付けパターン（geometric planting pattern）（上述）や種子同梱袋（in-bag seed mixture）等、緩衝帯のＩＲＭ効果を提供する様々な方法が存在する。
【００７１】
上述のパーセンテージまたは類似の緩衝帯比率は、対象の二重もしくは三重スタックまたはピラミッドに用いることができる。単一の標的有害生物に対し３種の作用機序を備える三重スタックに関して、目標はゼロ緩衝帯（または例えば５％未満の緩衝帯）である。これは、商業的地所、例えば１０エーカーを超えるものに特に当てはまる。
【００７２】
本明細書に参照または引用されているあらゆる特許、特許出願、仮出願および刊行物は、本明細書に明示されている教示と不一致とならない範囲まで、その全体が参照により援用される。
【００７３】
次に、本発明の実施のための手順を説明する実施例を示す。これらの実施例は、限定的なものとして解釈するべきではない。他に断りがなければ、あらゆるパーセンテージは重量で表し、あらゆる溶媒混合物の割合は容量で表す。あらゆる温度はセ氏で表す。
【００７４】
特に示唆または暗示されていなければ、「a」、「an」および「the」との用語は、本明細書において「少なくとも１個」を示す。
【実施例１】
【００７５】
キメラＣｒｙ１Ｃａコア毒素およびＣｒｙ１Ａｂプロトキシンの設計
キメラ毒素。 別のＣｒｙ毒素のプロトキシンセグメントと融合したあるＣｒｙ毒素のコア毒素ドメインを利用するキメラタンパク質は、例えば、米国特許第５５９３８８１号明細書および米国特許第５９３２２０９号明細書において以前に報告された。Ｃｒｙ１Ｃａ３デルタエンドトキシンタンパク質配列は、ＣｒｙＩＣ（ｂ）という旧い用語でＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ２２３４３として寄託されている。
【００７６】
本発明のＣｒｙ１Ｃａキメラタンパク質変種は、コア毒素セグメントの末端を過ぎたある点で異種デルタエンドトキシンプロトキシンセグメントと融合した、Ｃｒｙ１Ｃａ３殺虫性毒素に由来するＮ末端コア毒素セグメントを含むキメラ毒素を含む。コア毒素から異種プロトキシンセグメントへの移行は、天然のコア毒素／プロトキシン接合部付近において生じても、あるいは天然のプロトキシン部分（コア毒素セグメントを過ぎて延在する）が保持されて、異種プロトキシンへの移行が下流で生じてもよい。変種様式において、コア毒素およびプロトキシンセグメントは、その元となる天然の毒素のアミノ酸配列を正確に含んでいてもよいし、あるいは互いが融合したときにセグメントの生物学的機能を減少させずに増強できるようなアミノ酸の付加、欠失または置換を含んでいてもよい。
【００７７】
例えば、本発明のキメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｃａ３に由来するコア毒素セグメントと、異種プロトキシンとを含む。本発明の好ましい一実施形態において、Ｃｒｙ１Ｃａ３に由来するコア毒素セグメント（６１９アミノ酸）は、Ｃｒｙ１Ａｂデルタ−エンドトキシンに由来するプロトキシンセグメントを含む異種セグメント（５４５アミノ酸）と融合される。本明細書においてＤＩＧ−１５２というキメラタンパク質の１１６４アミノ酸配列は、配列番号１として開示されている。本発明の第二の好ましい実施形態は、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素セグメント（６１９アミノ酸）が、Ｃｒｙ１Ａｂに由来する第二の５４５アミノ酸プロトキシンセグメントと連結したキメラタンパク質を含む。ＤＩＧ−１０９という第二のキメラタンパク質の１１６４アミノ酸配列は、配列番号２（メイズ最適化バージョン）として開示されている。Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素変種およびＣｒｙ１Ａｂに由来するプロトキシンを含む他のキメラ融合体が、本発明の範囲内のものであることを理解されたし。
【００７８】
ＤＩＧ−１５２およびＤＩＧ−１０９キメラタンパク質が、配列の単一のポジション（アミノ酸６２０、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントをＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントと連結する部分）のみ異なり、互いに本質的に機能的に同等であることに留意されたい。
【実施例２】
【００７９】
キメラＣｒｙ１Ｃａコア／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンタンパク質をコードする発現プラスミドの構築およびシュードモナス（Pseudomonas）属における発現
全長ＤＩＧ−１５２キメラタンパク質（配列番号１に開示）を産生するよう設計されたシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）（Ｐｆ）発現構築物ｐＭＹＣ２５４７の構築において、標準クローニング法（例えば、Sambrookら（1989）およびAusubelら（1995）ならびにそれらの最新情報に記載）を用いた。米国特許第５１６９７６０号明細書に開示されている改変型ｌａｃオペロンを挿入されたシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）株ＭＢ２１４（株ＭＢ１０１の派生体；Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）次亜種（biovar）Ｉ）において、タンパク質産生を行った。基礎クローニング戦略は、その結果プラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ウィスコンシン州ミルウォーキー）由来のＰｔａｃプロモーターおよびｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターの発現制御下にＤＮＡ断片が置かれるような、ＤＩＧ−１５２をコードするＤＮＡ断片のプラスミドベクターへのサブクローニングを必要とした。このようなプラスミドの一型をｐＭＹＣ２５４７と命名し、このプラスミドを有するＭＢ２１４分離株をＤｐｆ１０８と命名した。
【００８０】
シェイカーフラスコ（Shake Flask）における増殖および発現解析。 特性評価および昆虫バイオアッセイのためのＤＩＧ−１５２タンパク質の産生は、シェイカーフラスコで増殖したＰ．フルオレッセンス（P. fluorescens）株Ｄｐｆ１０８により達成した。米国特許第５５２７８８３号明細書に以前に記載された通り、Ｐｔａｃプロモーター駆動によるＤＩＧ−１５２タンパク質産生を行った。微生物学的操作の詳細は、参照により本明細書において援用するSquiresら（2004）、米国特許出願第２００６０００８８７７号明細書、米国特許出願第２００８０１９３９７４号明細書および米国特許出願第２００８００５８２６２号明細書に見出すことができる。２４時間、３０°における最初のインキュベーションを振盪しつつ行った後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により発現を誘導した。誘導時および誘導後の様々な時点で培養物を試料採取した。６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）により細胞密度を測定した。
【００８１】
シェイカーフラスコ試料の細胞分画およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 各試料採取時点において、試料の細胞密度をＯＤ６００＝２０となるよう調整し、１ｍＬアリコートを１４０００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを−８０°で凍結した。ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）細菌タンパク質抽出溶液（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、凍結したシェイカーフラスコ細胞ペレット試料から得られた可溶性および不溶性画分を作製した。各細胞ペレットを１ｍＬのＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）溶液に再懸濁し、さらに溶解バッファー中に１：４希釈し、振盪しつつ室温で３０分間インキュベートした。ライセートを１４，０００ｒｐｍで２０分間、４°にて遠心分離し、上清を可溶性画分として回収した。次に、ペレット（不溶性画分）を等容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。
【００８２】
β−メルカプトエタノールを含有する２×レムリ（Laemmli）サンプルバッファー（Sambrookら、上記参照）と１：１で試料を混合し、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ１２％ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ハーキュリーズ）にローディングする前に５分間煮沸した。推奨されるＸＴ ＭＯＰＳバッファー中で電気泳動を行った。メーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のプロトコールに従ってバイオセーフ（Bio-Safe）クーマシー染色によりゲルを染色し、Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈイメージングシステム（カリフォルニア州サンリアンドロ）を用いて撮像した。
【００８３】
封入体調製。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）によって立証されたように不溶性Ｂｔ殺虫性タンパク質を産生するＰ．フルオレッセンス（P. fluorescens）発酵由来の細胞において、ＤＩＧ−１５２タンパク質封入体（ＩＢ）調製を行った。３７°のウォーターバスにおいてＰ．フルオレッセンス（P. fluorescens）発酵ペレットを解凍した。細胞を２５％ｗ／ｖとなるよう溶解バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム塩（エチレンジアミン四酢酸）、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）；５ｍＬ／Ｌの細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ＃Ｐ８４６５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を使用直前に添加］に再懸濁した。最低設定の手持ち式ホモジナイザー（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅａｒｏｒ、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ．、オクラホマ州バートルズビル）を用いて細胞を懸濁した。リゾチーム（Ｓｉｇｍａ Ｌ７６５１を２５ｍｇ、ニワトリ卵白製）を金属スパチュラで混合することによって細胞懸濁液に添加し、懸濁液を室温で１時間インキュベートした。懸濁液を氷上で１５分間冷却し、次にＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０（１分間セッション、５０％デューティサイクル、３０％出力を２回）を用いて超音波処理した。細胞の溶解を顕微鏡でチェックした。さらに２５ｍｇのリゾチームを必要に応じて添加し、インキュベーションおよび超音波処理を繰り返した。顕微鏡により細胞溶解を確認した後、ライセートを１１，５００×ｇで２５分間（４°）遠心分離してＩＢペレットを形成し、上清を廃棄した。ＩＢペレットを１００ｍＬの溶解バッファーに再懸濁し、上述通り手持ち式撹拌機によりホモジナイズして遠心分離した。上清が無色となり、ＩＢペレットが堅固で色がオフホワイトとなるまで、再懸濁（５０ｍＬの溶解バッファー中に）、ホモジナイズ、超音波処理および遠心分離によりＩＢペレットを繰り返し洗浄した。最後の洗浄において、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する滅菌濾過（０．２２μｍ）した蒸留水中にＩＢペレットを再懸濁し、遠心分離した。２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する滅菌濾過した蒸留水中に最後のペレットを再懸濁し、１ｍＬアリコートとして−８０°で保存した。
【００８４】
ＩＢペレットの１ｍＬアリコートを解凍し、滅菌濾過した蒸留水で１：２０希釈することによって、ＩＢ標本におけるタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析および定量化を行った。次に、希釈した試料を４×還元性サンプルバッファー［２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、４０％グリセロール（ｖ／ｖ）、０．４％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）、８％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）および８％β−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）］において煮沸し、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン、１２＋２ウエルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にローディングし、１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳバッファー（ＢｉｏＲａｄ）で泳動した。６０分間２００ボルトにてゲルを泳動し、続いてクーマシーブルー（４５％メタノール、１０％酢酸中の５０％Ｇ−２５０／５０％Ｒ−２５０）で染色し、蒸留水中の７％酢酸、５％メタノールで脱染した（destain）。標準曲線を作成するための同一ゲルで泳動したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準試料に対してバンドの濃度測定値を比較することによって、標的バンドの定量化を行った。
【００８５】
封入体の可溶化。 ＰｆクローンＤＰｆ１０８から得られた６ｍＬのＤＩＧ−１５２封入体懸濁液を、エッペンドルフモデル５４１５Ｃ微量遠心管（microfuge）（およそ１４，０００×ｇ）の最高設定で遠心分離し、封入物をペレット化した。保存バッファー上清を除去し、５０ｍＬコニカルチューブにおいて２５ｍＬの１００ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ１１と交換した。ピペットを用いて封入物を再懸濁し、ボルテックス攪拌して完全に混合した。穏やかな揺動プラットフォーム上にチューブを４°で一晩置き、標的タンパク質を抽出した。抽出物を３０，０００×ｇで３０分間４°にて遠心分離し、その結果得られた上清を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心分離フィルター装置（３０，０００分子量カットオフ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて５倍に濃縮した。次に、使い捨てＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、サンプルバッファーを１０ｍＭ ＣＡＰＳ［３−（シクロヘキサミノ（cyclohexamino））１−プロパンスルホン酸］ｐＨ１０に交換した。
【００８６】
封入体タンパク質の可溶化およびトリプシン活性化。 場合によっては、ＰｆクローンＤＰｆ１０８から得られたＤＩＧ−１５２封入体懸濁液を最高設定のエッペンドルフモデル５４１５Ｃ微量遠心管（およそ１４，０００×ｇ）で遠心分離して、封入物をペレット化した。保存バッファー上清を除去し、１００ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ１１と交換して、およそ５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得た。チューブを室温で３時間揺動して、タンパク質を完全に可溶化した。５％〜１０％（ｗ：ｗ、ＩＢ粉末の初期重量に基づく）に相当する量のトリプシンを添加し、一晩４°で揺動しつつインキュベーションすることにより、あるいは９０〜１２０分間室温で揺動することにより消化を達成した。１０，０００×ｇで１５分間遠心分離することにより不溶性物質を除去し、上清をＭｏｎｏＱ陰イオン交換カラム（１０ｍｍ×１０ｃｍ）にアプライした。２５カラム容量にわたる０％〜１００％１Ｍ ＮａＣｌ勾配により、活性化ＤＩＧ−１５２タンパク質を溶出した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定、下を参照）。活性化タンパク質を含有する画分をプールし、必要であれば上述通りにＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心分離フィルター装置を用いて１０ｍＬ未満に濃縮した。次に、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するバッファーにおいて、材料をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（１６ｍｍ×６０ｃｍ）に通した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、活性化（酵素により切断）タンパク質が、６５〜７０ｍＬで溶出することが決定された。活性化タンパク質を含有する画分をプールし、上述通り遠心分離濃縮器を用いて濃縮した。
【００８７】
ゲル電気泳動。 還元剤として５ｍＭ ＤＴＴを含有するＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に１：５０希釈し、９５°で４分間加熱することによって、濃縮したタンパク質標本を電気泳動用に調製した。０．２μｇから２μｇ／レーン範囲の５種のＢＳＡ標準（標準曲線作成用）と並行して、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルの２回複製したレーンに試料をローディングした。追跡用色素がゲル底辺に到達するまで、ＭＯＰＳ ＳＤＳランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２００Ｖの電圧を印加した。４５％メタノール、１０％酢酸中の０．２％クーマシーブルーＧ−２５０でゲルを染色し、先ず４５％メタノール、１０％酢酸で短時間、次にバックグラウンドが消えるまでの時間、７％酢酸、５％メタノールで脱染した。脱染後、ＢｉｏＲａｄ Ｆｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒによりゲルを走査した。この機器のＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェアｖ．４．５．２を用いて、染色されたタンパク質バンドからバックグラウンドを差し引いた量を得て、原液（stock solurion）におけるキメラＤＩＧ−１５２タンパク質濃度の算出に用いるＢＳＡ標準曲線を作成した。
【実施例３】
【００８８】
シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）において産生されたＤＩＧ−１５２タンパク質の殺虫活性
フォールアーミーワーム（ＦＡＷ、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（J.E.Smith））の幼虫およびＣｒｙ１Ｆ抵抗性ＦＡＷ（ｒＦＡＷ）の幼虫においてＤＩＧ−１５２タンパク質の殺虫活性を立証した。
【００８９】
試料調製およびバイオアッセイ。 透析またはＰＤ−１０カラム等、交換法により、封入体標本（天然の全長タンパク質またはトリプシン活性化したタンパク質）を１０ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ１０バッファーに移した。次に、１０ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ１０で試料を適切に希釈し、全バイオアッセイは、このバッファーからなる対照処理を含み、これは死亡率または成長阻害のバックグラウンドチェックとして役立てた。
【００９０】
ＢＳＡを用いたゲル電気泳動によりゲル濃度測定用の標準曲線を作成して、バイオアッセイバッファーにおけるタンパク質濃度を評価し、上述通りＢｉｏＲａｄイメージングシステムを用いて測定した。クーマシーブルーに基づく染色によりゲルマトリックスにおけるタンパク質を染色し、読み取り前に脱染した。
【００９１】
人工昆虫飼料で飼育した新生期の鱗翅目（lepidopteran）幼虫を用いて実行したバイオアッセイにおける殺虫活性に関し、精製タンパク質を試験した。民間の昆虫飼育会社（commercial insectary）（Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州カーライル）によって維持されたコロニーから得られた卵からＦＡＷの幼虫を孵化した。非売（non-commercial）のコロニー（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、インディアナ州インディアナポリス）から収集した卵からｒＦＡＷの幼虫を孵化した。
【００９２】
昆虫バイオアッセイ用に特別に設計された１２８ウエルプラスチックトレイにおいて（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニュージャージー州ピットマン）バイオアッセイを行った。各ウエルには、１．０ｍＬの複数種鱗翅目（Lepidoptera）用飼料（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、アーカンソー州レイクビレッジ）が入れられた。各ウエルの飼料表面１．５ｃｍ２上に４０μＬのタンパク質試料アリコートをピペットで移した（すなわち２６．７μＬ／ｃｍ２）。ウエルの表面面積１平方センチメートル当りのＤＩＧ−１５２タンパク質の量（ｎｇ）として飼料濃度を算出した。飼料表面上の液体が蒸発する、あるいは飼料中に吸収されるまで、処理したトレイをドラフト内に保持した。
【００９３】
孵化（eclosion）の数時間以内に、湿らせたラクダの毛のブラシで個々の幼虫を持ち上げ、処理した飼料上にウエル当り幼虫一匹を置いた。次に、ガス交換できるよう通気した透明プラスチックの粘着シート（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で虫の入ったウエルを密封した。管理された環境条件下［２８°、およそ４０％相対湿度（ＲＨ）、１６時間：８時間（明：暗）］でバイオアッセイトレイを５日間保持し、その後、各タンパク質試料に曝露された昆虫全数、死んだ昆虫の数および生存昆虫の重量を記録した。処理毎にパーセント死亡率およびパーセント成長阻害を算出した。次の通りパーセント成長阻害（ＧＩ）を算出した：
％ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］×１００
（式中、ＴＷＩＴは処理における昆虫総重量（Total Weight of Insects in the Treatment）であり、
ＴＮＩＴは処理における昆虫全数（Total Number of Insects in the Treatment）であり、
ＴＷＩＢＣはバックグラウンドチェック（バッファー対照）における昆虫総重量（Total Weight of Insects in the Background Check）であり、
ＴＮＩＢＣはバックグラウンドチェック（バッファー対照）における昆虫全数（Total Number of Insects in the Background Check）である）
【００９４】
ＧＩ５０を、％ＧＩ値が５０である飼料中のキメラＤＩＧ−１５２タンパク質濃度として決定した。ＬＣ５０（５０％致死濃度）を、試験昆虫の５０％が死滅した飼料中のＤＩＧ−１５２タンパク質の濃度として記録した。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ、ノースカロライナ州ケーリー）を用いて統計解析（一元配置分散分析（One-way ANOVA））を行った。
【００９５】
表２は、フォールアーミーワーム昆虫幼虫におけるＤＩＧ−１５２タンパク質の摂取バイオアッセイの結果を提示する。
【００９６】
【表２】
【００９７】
本発明のＤＩＧ−１５２タンパク質の特色は、ＤＩＧ−１５２タンパク質の摂取後にフォールアーミーワーム（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））新生期幼虫の成長が阻害されることである。さらに、Ｃｒｙ１Ｆａによる中毒症に対し抵抗性を有するフォールアーミーワーム幼虫は、ＤＩＧ−１５２活性に対し野生型フォールアーミーワーム幼虫と同様の感受性を有する。これらＣｒｙ１Ｆａ抵抗性昆虫のＣｒｙ１Ｃａに対する感受性の意義は、上により詳細に記載されている。
【実施例４】
【００９８】
ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードするメイズコドン最適化配列の設計
植物分子生物学分野の当業者であれば、複数のＤＮＡ配列が、単一のアミノ酸配列をコードするよう設計できることを理解するであろう。対象タンパク質のコード領域の発現を増加させる一般的な手段は、そのコドン組成が、遺伝子を発現させる予定の宿主の全体的なコドン組成と類似するような仕方でコード領域を仕立てることである。合成遺伝子の設計および産生に関する指針は、例えば、国際公開第１９９７／１３４０２号パンフレットおよび米国特許第５３８０８３１号明細書に見出すことができる。
【００９９】
トランスジェニック単子葉植物においてＤＩＧ−１０９キメラ殺虫性タンパク質を産生するよう、メイズコドンバイアスを有するＤＮＡ配列を設計して合成した。ＧｅｎＢａｎｋ（ワールドワイドウェブ：ncbi.nlm.nih.gov）に寄託された配列から得た７０６種のタンパク質コード配列から、メイズ（Zea mays L.）のコドン使用表（codon usage table）を算出した。該アミノ酸の全コドン使用の約１０％未満を用いた重複性コドンを全て省略した後、加重平均メイズコドンセットを算出した。次式を用いて各コドンの加重平均表示を算出した：
Ｃ１の加重平均％＝１／（％Ｃ１＋％Ｃ２＋％Ｃ３＋その他）×％Ｃ１×１００
（式中、Ｃ１は問題のコドンであり、％Ｃ２、％Ｃ３、その他は、残りの同義コドンの平均％使用値を表す）
【０１００】
配列番号２の１１６４アミノ酸ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードするメイズコドン最適化ＤＮＡ配列を得るため、その結果得られるＤＮＡ配列が、メイズ最適化コドンバイアス表の全体的なコドン組成を有するように、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントをコードする天然のｃｒｙ１Ｃａ ＤＮＡ配列に対してコドン置換を行った。同様の様式において、その結果生じるＤＮＡ配列が、メイズに最適化したコドンバイアス表の全体的なコドン組成を有するように、Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードする天然のｃｒｙ１Ａｂ ＤＮＡ配列に対してコドン置換を行った。植物細胞においてコード領域のＲＮＡ安定性、転写または翻訳に干渉し得る望ましくない制限酵素認識部位、潜在的な植物イントロンスプライス部位、Ａ／ＴまたはＣ／Ｇ残基の長い配列（long run）および他のモチーフを排除するよう、配列に対するさらなる緻密化を行った。所望の制限酵素認識部位を導入するよう、また長い内部オープンリーディングフレーム（＋１以外のフレーム）を排除するよう、他の変更を行った。およそのところメイズに偏向したコドン組成（maize-biased codon composition）を保持する制約下で、これらの変更を全て行った。完全メイズコドン最適化配列（ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする）を配列番号３として開示する。民間業者（ＤＮＡ２．０、カリフォルニア州メンロパーク）によりＤＮＡ断片の合成を行った。
【実施例５】
【０１０１】
ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする植物発現可能遺伝子を含有する植物形質転換ベクターの構築
アグロバクテリウム（Agrobacterium）スーパーバイナリーシステム（日本たばこ産業、日本、東京）は、単子葉植物宿主の形質転換に簡便に用いられる。スーパーバイナリーシステムは、多重クローニング部位によって隔てられた右側Ｔ−ＤＮＡ境界反復（ＲＢ）および左側Ｔ−ＤＮＡ境界反復（ＬＢ）の配列を含有するｐＳＢ１１シャトルベクタープラスミドを利用する。標準ＤＮＡクローニング法によりｐＳＢ１１の派生体（ｐＤＡＢ７６９１という）を調製した。プラスミドｐＤＡＢ７６９１は、メイズユビキチン１プロモーターと関連イントロン１（米国特許第５５１０４７４号明細書）およびメイズＰｅｒ５ ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（米国特許第７１７９９０２号明細書）による転写調節下において、メイズに最適化したＤＩＧ−１０９コード配列（ＣＤＳ；すなわち、配列番号３）を含有する。さらに、ｐＤＡＢ７６９１は、イネアクチン１プロモーターと関連イントロン１（米国特許第５６４１８７６号明細書）およびメイズリパーゼ３’ＵＴＲ（米国特許第７１７９９０２号明細書）による転写調節下において、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＤＳＭ２ ＣＤＳ（国際公開第２００８／０７０８４５（Ａ２）号パンフレット）を含む植物選択可能マーカー遺伝子を含有する。ｐＤＡＢ７６９１ Ｔ−領域の構成要素の物理的配置を次に簡便に例示する：
ＲＢ＞メイズＵｂｉ１プロモーター：ＤＩＧ−１０９ ＣＤＳ：メイズＰｅｒ５ ３’ＵＴＲ＞イネＡｃｔ１プロモーター：ＤＳＭ２ ＣＤＳ：メイズＬｉｐ ３’ＵＴＲ＞ＬＢ
【０１０２】
標準ＤＮＡクローニング法によりｐＳＢ１１の第二の派生体（ｐＤＡＢ１００２７６という）を調製した。プラスミドｐＤＡＢ１００２７６は、メイズユビキチン１プロモーターと関連イントロン１およびメイズＰｅｒ５ ３’ＵＴＲによる転写調節下において、メイズに最適化したＤＩＧ−１０９コード配列（ＣＤＳ；すなわち、配列番号３）を含有する。さらに、ｐＤＡＢ１００２７６は、メイズユビキチン１プロモーターと関連イントロン１およびメイズリパーゼ３’ＵＴＲによる転写調節下において、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＡＡＤ１ ＣＤＳ（米国特許出願第２００９００９３３６６号明細書）を含む植物選択可能マーカー遺伝子を含有する。ｐＤＡＢ１００２７６ Ｔ−領域の構成要素の物理的配置を次に簡便に例示する：
ＲＢ＞メイズＵｂｉ１プロモーター：ＤＩＧ−１０９ ＣＤＳ：メイズ Ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲ＞メイズＵｂｉ１プロモーター：ＡＡＤ−１ ＣＤＳ：メイズＬｉｐ ３’ＵＴＲ＞ＬＢ
【０１０３】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換の準備を行うため、プラスミドｐＤＡＢ７６９１またはプラスミドｐＤＡＢ１００２７６を有する大腸菌（Escherichia coli）クローニング株ＤＨ５αの細胞を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天培地（ｇ／Ｌ：Ｂａｃｔｏトリプトン、１０；Ｂａｃｔｏ酵母エキス、５；ＮａＣｌ、１０；寒天、１５）上に３７°で一晩増殖させた。接合動員（conjugal mobilizing）プラスミドｐＲＫ２０１３を含有する株ＤＨ５α細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天上に増殖させた。インキュベーション後、プレートを４°に置き、プラスミドｐＳＢ１を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＬＢＡ４４０４の準備が整うのを待った。
【実施例６】
【０１０４】
スーパーバイナリーベクター作製のためのアグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換
プラスミドｐＳＢ１を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＬＢＡ４４０４を利用するアグロバクテリウム（Agrobacterium）スーパーバイナリーシステムは、単子葉植物宿主の形質転換に簡便に用いられる。スーパーバイナリーベクターを構築し検証するための手順は、ｐＳＢ１の操作マニュアル（日本たばこ産業）に記載されている通り十分に確立されている。標準微生物学的および分子生物学的方法を用いて、プラスミドｐＳＢ１およびｐＤＡＢ７６９１を含む同時組み込み体（cointegrant）プラスミドであるスーパーバイナリープラスミドｐＤＡＳ５１６２ならびにプラスミドｐＳＢ１およびｐＤＡＢ１００２７６を含む同時組み込み体プラスミドであるスーパーバイナリープラスミドｐＤＡＳ５８４８を作製し検証した。
【実施例７】
【０１０５】
メイズ植物におけるＤＩＧ−１０９タンパク質の産生
アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介したメイズの形質転換。 ９５％Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ３６０無土壌成長培地（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、ワシントン州ベルビュー）および５％埴壌土（clay/loam soil）の混合物の入った５ガロンポットに、Ｈｉ−ＩＩ Ｆ１交雑種（Armstrongら、1991）から得た種子を播いた。高圧ナトリウムおよびメタルハライドランプの組み合わせを用いた１６時間明期：８時間暗期の光周期の温室で植物を育成した。管理された同胞受粉（sib-pollination）を行って、形質転換用の未成熟Ｆ２胚を得た。受粉およそ８〜１０日後、未成熟胚が１．０ｍｍ〜２．０ｍｍの間のサイズになったときにメイズ雌穂を収集した。
【０１０６】
感染および共培養。 メイズ雌穂の外皮を剥き（dehusk）、液体石鹸でこすり洗い、２０％の市販漂白剤（５％次亜塩素酸ナトリウム含）に約２０分間浸漬し、続いて滅菌水で３回リンスすることによって表面殺菌した。ループ１または２掻きの細菌［１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、１０ｍｇ／Ｌテトラサイクリンおよび２５０ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを含有するＹＥＰ固体培地（ｇ／Ｌ：Ｂａｃｔｏ酵母エキス、１０；Ｂａｃｔｏペプトン、１０；ＮａＣｌ、５；寒天、１５）上で２〜３日間２８°で増殖］を、１００μＭアセトシリンゴンを含有する液体感染培地［ＬＳ基本培地（Linsmaier and Skoog、1965）、Ｎ６ビタミン（Chuら、1975）、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、６８．５ｇ／Ｌショ糖、３６．０ｇ／Ｌグルコース、６ｍＭ Ｌ−プロリン、ｐＨ５．２］５ｍＬに移すことにより、ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする遺伝子およびＤＳＭ２植物選択可能マーカー遺伝子を含有するスーパーバイナリーベクターであるｐＤＡＳ５１６２を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）細胞の懸濁液を調製した。
【０１０７】
あるいは、上述通りに増殖させたループ１または２掻きの細菌を、１００〜２００μＭアセトシリンゴンを含有する液体感染培地５ｍＬに移すことにより、ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする遺伝子およびＡＡＤ−１植物選択可能マーカー遺伝子を有するスーパーバイナリーベクターであるｐＤＡＳ５８４８を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）細胞の懸濁液を調製した。
【０１０８】
いずれの場合においても、均一な懸濁液が得られるまで溶液をボルテックス攪拌し、紫色フィルターによるＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計を用いて最終密度が２００Ｋｌｅｔｔ単位になるよう（ｐＤＡＳ５１６２形質転換用）、あるいは５５０ｎｍにおいて１．２の光学密度になるよう（ｐＤＡＳ５８４８形質転換用）濃度を調整した。２ｍＬの感染培地の入った微量遠心チューブ内に未成熟胚を直接単離した。培地を除去し、１ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液と交換し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）／胚溶液を５〜１０分間室温でインキュベートした。次に、１００μＭアセトシリンゴンを含有する（ｐＤＡＳ５１６２形質転換体用）、あるいは１００〜２００μＭアセトシリンゴンを含有する（ｐＤＡＳ５８４８形質転換体用）共培養培地［ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０．０ｇ／Ｌショ糖、６ｍＭ Ｌ−プロリン、０．８５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３、２．８ｇ／Ｌジェランガム（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カンザス州レネックサ）、ｐＨ５．８］へと胚を移し、３〜４日間２０°暗所で共培養した。
【０１０９】
共培養後、ＭＳ塩およびビタミン、６ｍＭ Ｌ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ、３０ｇ／Ｌショ糖、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、０．８５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮ０３、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシム、２．８ｇ／Ｌジェランガム、ｐＨ５．８を含有する静置（resting）培地に胚を移した。およそ７日後、３ｍｇ／Ｌビアラホス（ｐＤＡＳ５１６２形質転換体用）を補給したあるいは１００ｎＭハロキシホップを補給した（ｐＤＡＳ５８４８形質転換体用）（選択培地）同じ培地へと胚を移した。およそ８週間後に形質転換した分離株を同定し、再生および解析のため、２週間間隔で新鮮な選択培地へと移すことによって大きく増やした。
【０１１０】
再生および種子生産。 再生のため、３ｍｇ／Ｌビアラホスを補給した（ｐＤＡＳ５１６２形質転換体用）あるいは１００ｎＭハロキシホップを補給した（ｐＤＡＳ５８４８形質転換体用）「２８」誘導培地（ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／Ｌショ糖、５ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシム、２．５ｇ／Ｌジェランガム、ｐＨ５．７）へと培養物を移した。インキュベーションを微光条件（１４μＥｍ−２ｓ−１）下で１週間、続いて強光条件（およそ８９μＥｍ−２ｓ−１）下で１週間行った。その後「３６」再生培地（植物成長調節物質を欠く以外は誘導培地と同一）へと組織を移した。小植物は、丈が３〜５ｃｍになったときにＳＨＧＡ培地［（Schenk and Hildebrandt (1972) salts and vitamins; PhytoTechnologies Labr.）、１．０ｇ／Ｌミオイノシトール、１０ｇ／Ｌショ糖および２．０ｇ／Ｌジェランガム、ｐＨ５．８］を含有するガラス培養管へと移し、シュートおよび根をさらに成長および発達させた。植物を先に記載したものと同じ土壌混合物に移植し、温室内で開花するまで育成した。種子生産のための管理された受粉を行った。
【０１１１】
メイズ形質転換分野の当業者であれば、他の植物発現可能選択可能マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を用いる場合、メイズ形質転換および形質転換植物の選択のために他の方法を利用できることを理解するであろう。
【実施例８】
【０１１２】
ＤＩＧ−１０９タンパク質を産生するメイズ植物の生化学的解析および昆虫バイオアッセイ
トランスジェニックメイズ植物におけるＤＩＧ−１０９タンパク質の産生を、若い植物体（Ｔ０世代）の葉から抽出したタンパク質において調査した。ディープウエル９６クラスターチューブボックス（Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｔ＃３９５７）の試料チューブ内に直径６ｍｍのメイズリーフディスクを２枚置き、解析の日まで−８０°で凍結した。解析時に、２個の４．５ｍｍ亜鉛コーティングしたＤａｉｓｙ（商標）ＢＢを、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水；Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃ＢＰ６６５−１）プラス０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０から構成される２００μＬの抽出バッファーと共に各（凍結）チューブに加えた。各チューブの蓋をし、ボックスを最大設定のビーズミル（Ｋｌｅｃｏ（商標）４−９６粉砕機；Ｇａｒｃｉａ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、カリフォルニア州バイセリア）内に３分間置いた。微粉砕した試料を５分間、２，５００×ｇで遠心分離し、可溶性タンパク質を含有する上清をイムノアッセイに用いた。
【０１１３】
抽出したメイズ葉タンパク質のイムノブロット解析は、ＤＩＧ１５２ＲＰＣ１ポリクローナル抗体（トリプシン活性化Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質で免疫化したウサギから調製）が、非トランスジェニック植物体の葉から抽出されたタンパク質と交差反応しないことを明らかにした。ｐＤＡＳ５１６２で形質転換した植物の抽出物において、ＤＩＧ１５２ＰＲＣ１抗体により数個のタンパク質種が検出された。
【０１１４】
ｐＤＡＳ５１６２による形質転換によってメイズに導入された導入遺伝子は、全長ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードするが、メイズ細胞内のタンパク質分解活性により、新生タンパク質が、大量の安定的でより小さい分子量の分子種にプロセシングされることは明らかである。
【０１１５】
フォールアーミーワーム（ＦＡＷ、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（J.E. Smith））の新生期幼虫およびＣｒｙ１Ｆ抵抗性ＦＡＷ（ｒＦＡＷ）幼虫を用いて、ｐＤＡＳ５１６２構築物で形質転換し、独立的に単離したトランスジェニックメイズ植物体から収集した葉の昆虫毒性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。民間の昆虫飼育会社（Ｂｅｎｚｏｎ）からＦＡＷ卵を入手し、ｒＦＡＷ卵は、非売の集団（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）から得た。植物体を実験室から温室に移植してからおよそ２週間後に、温室で育成したＴ０植物体から葉セグメント試料を昆虫バイオアッセイ用に採取した。各植物体から２枚の葉片（それぞれおよそ１平方インチ）を、３２ウエルトレイ（ＣＤ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の別個のウエルの約３ｍＬの凝固した２％寒天の上に置いた。複数種鱗翅目（lepidopteran）用飼料（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）上で卵を孵化し、２４時間齢未満のときに新生期の幼虫を選択した。ラクダの毛の絵筆を用いて葉セグメント当りおよそ１０匹の幼虫を各ウエル内に慎重に置いた。虫の入ったトレイをトレイ付属の穿孔処理した蓋で密封し、続いて２８°、４０％ＲＨ、１６時間明期：８時間暗期で３日間保持した。試験の終わりに各葉片のパーセント損傷（％ＤＡＭ）を記録した。損傷評点を平均化し、どの植物体において各種試験昆虫による損傷が最も少ないかの決定に用いた。全昆虫に対し、試験を数回複製して行った。
【０１１６】
ＪＭＰ統計ソフトウェア（ＳＡＳ、ノースカロライナ州ケーリー）を用いて昆虫の種類毎の各植物体の％ＤＡＭスコアを平均化し、データを解析した。「ＸによるＹの適合」モデルを一元配置分散分析解析に用いた。必要に応じてテューキー・クレーマー平均離隔（means separation）を用いて、処理毎の平均％ＤＡＭスコア間の有意差を解析した。ほぼ同齢の対照植物から得られた％ＤＡＭスコアとの比較を行った。Ｃｒｙ１Ｆａ Ｂ．ｔ．毒素を生成する市販のＨｅｒｃｕｌｅｘ Ｉ（商標）ハイブリッドの種子から陽性対照植物を育成した。陰性対照（すなわち非形質転換植物）をＨｉ ＩＩおよびＢ１０４系統ならびにＨｅｒｃｕｌｅｘ Ｉ（商標）Ｉｓｏｌｉｎｅ（Ｈｅｒｃｕｌｅｘ Ｉ（商標）ハイブリッドの非Ｃｒｙ含有親）によって表した。
【０１１７】
図１は、このような昆虫バイオアッセイ試験において得られた結果をまとめる。トランスジェニック葉におけるＤＩＧ−１０９産生と％ＤＡＭ評点との間に正の相関があるということは、驚くべき知見である。ＦＡＷに関し、Ｆ＝３５．３；ｄ．ｆ．＝１，３３；Ｐ＜０．０００１；ｒ２＝０．５２であり、ｒＦＡＷに関し、Ｆ＝２５．３；ｄ．ｆ．＝１，３３；Ｐ＜０．０００１；ｒ２＝０．４３である。Ｃｒｙ１Ｆａ Ｂ．ｔ．毒素による中毒症に対し抵抗性を有するフォールアーミーワーム幼虫であっても、ＤＩＧ−１０９ Ｂ．ｔ．毒素により摂食抑制されることは、さらに驚くべき新しい知見である。
【０１１８】
メイズの他の害虫を同様の様式で試験できることが理解できる。これらの有害生物として、アグロミザ・パルビコルニス（Agromyza parvicornis）（コーンブロットリーフマイナー（corn blot leafminer））、アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）（タマナヤガ（black cutworm））、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ベルベットビーンキャタピラー（velvetbean caterpillar））、ジアトレア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）（サウスウェスタンコーンボーラー（southwestern corn borer））、ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）（シュガーケーンボーラー）、モロコシマダラメイガ（Elasmopalpus lignosellus）（レサーコーンストークボーラー（lesser cornstalk borer））、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（コーンイヤーワーム（corn earworm））、ニセアメリカタバコガ（Heliothis virescens）（タバコバドワーム）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（ユーロピアンコーンボーラー）、Ｃｒｙ１Ｆ抵抗性Ｏ．ヌビラリス（O. nubilalis）、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）（コナガ（diamondback moth））、Ｃｒｙ１−抵抗性Ｐ．キシロステラ（P. xylostella）、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）（ビートアワヨトウ（beet armyworm））およびイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）（キャベツルーパー（cabbage looper））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
ｐＤＡＳ５８４８で形質転換したトランスジェニックメイズ植物（Ｔ０世代）も昆虫バイオアッセイおよび免疫解析により調査した。市販のＣｒｙ１Ｃ ＥＬＩＳＡ検出キット（Ｅｎｖｉｒｏｌｏｇｉｘ（商標）、マサチューセッツ州ポートランド；Ｃａｔ＃ＡＰ００７）を用いて葉抽出物におけるＤＩＧ−１０９タンパク質量を定量化し、検出されたＤＩＧ−１０９タンパク質レベルを百万分の一（ｐｐｍ；１ｐｐｍは、抽出物における全可溶性タンパク質１ｍｇ当り１ｎｇのＤＩＧ−１０９タンパク質を表す）として表示した。
【０１２０】
ＦＡＷおよびｒＦＡＷによる食害を次の通り分類する。０＝損傷なしまたは針穴状の摂食マーク数個、１＝２５％〜５０％の葉が食害、２＝葉の大部分が消費または葉は残されていない。保護された植物は、損傷スコアが０．６７以下の植物である。
【０１２１】
表３におけるデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイにおいて、Ｔ０植物におけるＥＬＩＳＡにより検出されたＤＩＧ−１０９タンパク質種の存在とフォールアーミーワーム幼虫によって行われる食害の制御との間に正の相関があることを示す。最高検出レベルのＤＩＧ−１０９タンパク質を有する植物（植物体５８４８−００５．４）は、最低値の葉食害スコアを有した。１９０〜２３０ｐｐｍの範囲のより低レベルの検出可能ＤＩＧ−１０９タンパク質を有する植物体から得られた葉も、平均損傷スコア１．７および１．８を有する陰性対照植物（すなわち、非形質転換対照Ｂ１０４およびＨｉ ＩＩ）から得られた葉に観察されるものよりも食害が少なかった。調査した全ｐＤＡＳ５８４８葉において、検出された主要なＤＩＧ−１０９タンパク質種は、およそのサイズが６０ｋＤａおよび５５ｋＤａのペプチドダブレットを含んでいた。
【０１２２】
【表３】
【０１２３】
よって、本発明の特色は、ＤＩＧ−１０９タンパク質がメイズ植物において産生されると、植物にフォールアーミーワーム幼虫およびＣｒｙ１Ｆ抵抗性フォールアーミーワーム幼虫による食害に対する抵抗性を付与することである。
【実施例９】
【０１２４】
スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の単離された刷子縁膜小胞を用いたＣｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質の競合的結合実験
次の実施例は、昆虫腸組織における推定受容体に対するＣｒｙ１コア毒素タンパク質の競合結合を評価する。１２５Ｉ標識したＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質が、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（フォールアーミーワーム）から調製した刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）と高い親和性で結合すること、および、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、この結合と競合しないことが示される。
【０１２５】
Ｃｒｙタンパク質の精製。 実施例２に記載されている通り、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）発現株においてＣｒｙ１Ｃａコア毒素およびＣｒｙ１Ａｂプロトキシンを含むキメラタンパク質をコードする遺伝子を発現させた。同様の様式において、ＰｆシステムにおいてＣｒｙ１Ｆａコア毒素（６０３アミノ酸）およびＣｒｙ１Ａｂプロトキシン（５４５アミノ酸）を含むキメラタンパク質をコードする遺伝子を発現させた。実施例２の方法によりタンパク質を精製し、全長タンパク質から活性化コア毒素を生成するためのトリプシン消化を行い、実施例２の方法により生成物を精製した。トリプシンによりプロセシングされた（活性化コア毒素）タンパク質の標本は、＞９５％純度であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実験的に決定した通りおよそ６５ｋＤａの分子量を有していた。
【０１２６】
例えば、Sambrookら（1989）およびAusubelら（1995）ならびにそれらの最新情報に教示されている通り、タンパク質定量化およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の標準方法を用いた。
【０１２７】
可溶化ＢＢＭＶの調製および分画。 終齢スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）幼虫を一晩絶食させ、続いて氷上で１５分間冷やした後に解剖した。外皮に付着した後腸を後に残し、中腸組織を体腔から取り出した。サプライヤーの推奨通りに希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ−２７１４）を補給した９×容量の氷冷ホモジナイズバッファー（３００ｍＭマンニトール、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１７ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ７．５）中に中腸を置いた。ガラス組織ホモジナイザーを１５往復して組織をホモジナイズした。Wolfersberger（1993）のＭｇＣｌ２沈殿法によりＢＢＭＶを調製した。すなわち、等容量の３００ｍＭマンニトール中の２４ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液を中腸ホモジネートと混合し、５分間攪拌し、氷上に１５分間静置した。溶液を２，５００×ｇで１５分間、４°にて遠心分離した。上清を取り分け、ペレットを元の容量の０．５×希釈したホモジナイズバッファーに懸濁し、再度遠心分離した。２種の上清を組み合わせ、２７，０００×ｇで３０分間、４°にて遠心分離してＢＢＭＶ画分を生成した。タンパク質濃度が約３ｍｇ／ｍＬとなるようペレットをＢＢＭＶ保存バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）に懸濁した。標準物質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてタンパク質濃度を決定した。試料の凍結前に、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商標）ＤＡＬＰ−２５０アルカリホスファターゼアッセイキット（Ｇｅｎｔａｕｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ベルギー、カンペンホウト）を用い、メーカーの説明書に従ってアルカリホスファターゼ決定（ＢＢＭＶ画分のマーカー酵素）を行った。この酵素の特異的活性は、通常、出発時の中腸ホモジネート画分に見られるものと比べて７倍増加した。ＢＢＭＶを２５０μＬ試料にアリコート分注し、液体窒素中で瞬時に凍結し、−８０°で保存した。
【０１２８】
電気泳動。 還元性（すなわち、５％β−メルカプトエタノール、ＢＭＥ中）かつ変性（すなわち、２％ＳＤＳの存在下５分間９０°で加熱）条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の解析を行った。４％〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ；カリフォルニア州ハーキュリーズ）のウエルにタンパク質をローディングし、２００ボルト、６０分間で分離した。クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＢｉｏＲａｄ）で１時間染色することによりタンパク質バンドを検出し、７％酢酸中の５％メタノール溶液で脱染した。ＢｉｏＲａｄ Ｆｌｕｒｏ−Ｓ Ｍｕｌｔｉ Ｉｍａｇｅｒ（商標）を用いてゲルを撮像して（image）、解析した。ゲルの１ウエルにローディングしたＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質ラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）試料において観察される公知の分子量のタンパク質の移動度と比較することにより、タンパク質バンドの相対分子量を決定した。
【０１２９】
Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質のヨウ素化。 精製したＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅヨウ素化ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）を用いてヨウ素化した。すなわち、２種のヨウ素化ビーズを５００μＬのＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、１００μＬのＰＢＳと共に１．５ｍＬ遠心分離チューブ内に入れた。０．５ｍＣｉの１２５Ｉ標識したヨウ化ナトリウムを添加し、成分を５分間、室温で反応させ、続いて１μｇのＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質を溶液に添加し、さらに３〜５分間反応させた。溶液をヨウ素化ビーズからピペットで採取し、５０ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０、１ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび５％グリセロールで平衡化したＺｅｂａ（商標）スピンカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にアプライすることにより反応を終結した。ヨウ素化ビーズを１０μＬのＰＢＳで２回洗浄し、洗浄溶液もＺｅｂａ（商標）脱塩カラムにアプライした。１，０００×ｇで２分間遠心分離することにより、スピンカラムを通して放射性溶液を溶出した。次に１２５Ｉ放射標識したＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質を、５０ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび５％グリセロールに対して透析した。
【０１３０】
イメージング。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびホスホロイメージング（phosphorimaging）により、ヨウ素化Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質の放射性純度を決定した。すなわち、ＢｉｏＲａｄゲル乾燥装置を用いて、メーカーの説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを乾燥させた。ゲルをＭｙｌａｒフィルム（１２μｍ厚）にラップし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓストレージホスホロスクリーン（storage phosphor screen）（３５ｃｍ×４３ｃｍ）に１時間曝露することにより、乾燥ゲルを撮像した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ８２０ホスホロイメージャー（phosphorimager）を用いてプレートを現像し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ソフトウェアを用いて画像を解析した。
【実施例１０】
【０１３１】
１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１コア毒素タンパク質とスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）由来のＢＢＭＶとの結合
１２５Ｉ放射標識Ｃｒｙ１Ａｃコア毒素タンパク質を用いて飽和曲線を作成し、Ｃｒｙ１ＣａおよびＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質による結合アッセイにおいて用いるためのＢＢＭＶタンパク質の最適量を決定した。０．５ｎＭの１２５Ｉ放射標識Ｃｒｙ１Ａｃコア毒素タンパク質を結合バッファー（８ｍＭ ＮａＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中で１時間２８°で、０μｇ／ｍＬから５００μｇ／ｍＬ（総容量０．５ｍＬ）範囲のＢＢＭＶタンパク質量とインキュベートした。１５０μＬの反応混合物を３重で別個の１．５ｍＬ遠心分離チューブに試料採取し、試料を１４，０００×ｇで８分間、室温にて遠心分離することにより、ＢＢＭＶタンパク質と結合した１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ａｃコア毒素タンパク質を非結合画分から分離した。上清を穏やかに除去し、ペレットを氷冷した結合バッファーで３回洗浄した。ペレットを含有する遠心分離チューブの底を切り取り、１３×７５ｍｍガラス培養チューブ内に置き、試料をそれぞれガンマカウンターにおいて５分間計数した。得られたＣＰＭ（１分間当りの計数）マイナスバックグラウンドＣＰＭ（ＢＢＭＶタンパク質なしの反応）をＢＢＭＶタンパク質濃度に対してプロットした。同様に他の結果に応じて、結合アッセイにおいて用いるためのＢＢＭＶタンパク質の最適濃度を１５０μｇ／ｍＬと決定した。
【実施例１１】
【０１３２】
コア毒素タンパク質Ｃｒｙ１ＣａおよびＣｒｙ１Ｆａを用いたＳ．フルギペルダ（S. frugiperda）由来ＢＢＭＶとの競合的結合アッセイ
１５０μｇ／ｍＬ ＢＢＭＶタンパク質および０．５ｎＭの１２５Ｉ放射標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質を用いて、相同および異種競合結合アッセイを行った。反応混合物に添加した競合的非放射標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の濃度、０．０４５ｎＭから１０００ｎＭ範囲を、放射性Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質と同時に添加し、真の結合競合を確定した。インキュベーションを１時間２８°で行い、ＢＢＭＶと結合（特異的結合）した１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質量を上の記載通りに測定した。非特異的結合は、１，０００ｎＭの非放射標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質の存在下において得られた計数によって表される。１００パーセントの合計結合は、競合相手であるＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が全く存在しない場合の結合の量であると考えられた。
【０１３３】
１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質を用いた受容体結合アッセイは、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、この放射標識リガンドをそのＳ．フルギペルダ（S. frugiperda）由来ＢＢＭＶにおける結合部位から置き換える能力を決定した。結果（図２）は、３００ｎＭ（放射性結合リガンドの濃度の６００倍）もの高濃度のＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、結合した１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質をその受容体タンパク質（複数可）から置き換えないことを示す。予想通り、非標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質は、放射標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質をその結合タンパク質（複数可）から置き換えることができ、５ｎＭで５０％の置き代わりが起こるＳ字形用量反応曲線を示す。
【０１３４】
よって、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質が、Ｓ．フルギペルダ（S. frugiperda）ＢＢＭＶにおけるＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質と結合しない結合部位と相互作用することが示唆される。
【０１３５】
図２を参照されたし。Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素および１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素による、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）ＢＢＭＶとの結合に関する競合。
【実施例１２】
【０１３６】
Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質およびビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質のジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）ＢＢＭＶに対する競合的結合
次の実施例は、Ｃｒｙ１コア毒素タンパク質と昆虫腸組織における推定受容体との競合結合を評価する。ビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）（シュガーケーンボーラー）から調製される刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）と高親和性で結合すること、および、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質が、この結合と競合しないことが示される。
【０１３７】
可溶化ＢＢＭＶの調製および分画。 終齢Ｄ．サッカラリス（D. saccharalis）幼虫を一晩絶食させ、続いて氷上で１５分間冷やした後に解剖した。実施例１０に開示されている方法に従ってＢＢＭＶ標本を作製した。
【０１３８】
Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質のヨウ素化は、昆虫摂食バイオアッセイにおいてタンパク質を不活性化するため、１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を用いた競合結合アッセイの結果は、生物学的関連性が限定的となる可能性がある。対照的に、ビオチン化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質は、昆虫に対するその毒性を保持することが見出された。さらに、非ビオチン化（競合）Ｃｒｙコア毒素タンパク質の存在下における、この（ビオチン化）タンパク質と受容体との相互作用を測定することが可能である。このような競合実験は、ＢＢＭＶタンパク質を電気泳動し、試料全体をＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオライド）膜に転写した後に、ビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質と、Ｄ．サッカラリス（D. saccharalis）ＢＢＭＶにおける受容体との結合を検出することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたアビジンを増強化学発光試薬と組み合わせて用いて、ビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を視覚化した。
【０１３９】
Ｐｉｅｒｃｅ ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質をビオチンで標識した。すなわち、４０μＬのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（１０ｍｇ／ｍＬジメチルスルホキシド）を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．２中のＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質（２．０ｍｇ／ｍＬ）５００μＬに添加した。反応液を４°で一晩インキュベートし、続いてＺｅｂａ（商標）脱塩カラムを用いて未反応のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを除去した。Ｐｉｅｒｃｅ ＨＡＢＡ−アビジン置き換えアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をメーカーの記載通りに用いて、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質へのビオチン取り込みを測定した。
【０１４０】
５００倍過剰の非標識Ｃｒｙ１ＦａまたはＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質の存在下または不在下において、ビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質（２．５ｎＭ）をＤ．サッカラリス（D. saccharalis）から調製した０．２ｍｇのＢＢＭＶと［総容量１．０ｍＬ］１時間２８°でインキュベートした。１６，０００×ｇ、１０分間の遠心分離により非結合ビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を除去し、その結果得られたペレットを氷冷した結合バッファーで３回洗浄した。ペレットを１５μＬの４×レムリサンプルバッファーに懸濁し、ボルテックス攪拌し、超音波処理して完全可溶化を確実にし、９０°で３分間加熱した。全試料を４％〜２０％Ｔｒｉｓグリシンゲルにローディングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、サプライヤーの説明書（ＢｉｏＲａｄ）が推奨する通りにＰＶＤＦ膜上に電気的に転写した。１，０００ｎｇのＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質およびＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質も、陰性対照としてゲルで泳動した。１：１５，０００希釈したアビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼと、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ溶液とＬｕｍｉｎａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｒ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１８５９６７４および１８５９６７５）の１：１混合液を用いた増強化学発光により、ビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を視覚化した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ｖ．４．５．２ソフトウェアを備えるＢｉｏｒａｄ Ｆｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒを用いてバンドを記録した。
【０１４１】
結果は、Ｄ．サッカラリス（D. saccharalis）ＢＢＭＶにおける受容体と結合したビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の検出を立証し、５００倍過剰濃度の非ビオチン化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、結合したビオチン化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質をその受容体（複数可）から完全に置き換えることをさらに示した。対照的に、５００倍過剰濃度のＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質は、結合したビオチン化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を置き換えることができず、この結果は、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質が、Ｄ．サッカラリス（D. saccharalis）ＢＢＭＶにおけるＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質結合部位（複数可）と競合しないことを示唆した。よって、Ｓ．フルギペルダ（S. frugiperda）のＢＢＭＶにより得られた結果と同じく、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質とＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質が、Ｄ．サッカラリス（D. saccharalis）ＢＢＭＶにおける別個の結合部位と結合することが示唆される。
【０１４２】
（参考文献）
【表４】
【０１４３】
【表５】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
人間は、トウモロコシ（corn）を食料およびエネルギー用途のために栽培する。人間は、ダイズおよびワタ等、他にも多くの作物を栽培する。昆虫は、植物を食害することによりこのような人間の努力を台無しにする。害虫（insect pest）を防除する（control）ために毎年数十億ドルが費やされ、その被害のためにさらに数十億が失われている。合成有機化学薬品の殺虫剤は、害虫防除に用いられる主要な手段であったが、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂｔ）由来の殺虫性タンパク質（insecticidal protein）等、生物殺虫剤（biological insecticide）は、いくつかの分野で重要な役割を果たしてきた。Ｂｔ殺虫性タンパク質遺伝子で形質転換することにより虫害抵抗性植物（insect-resistant plant）を作出する能力は、現代農業に革命をもたらし、殺虫性タンパク質およびその遺伝子の重要性および価値を高めた。
【０００２】
現在までに登録および商品化に成功した虫害抵抗性トランスジェニック植物を作製するため、数種類のＢｔタンパク質が用いられてきた。これらとしては、トウモロコシにおけるＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ３Ｂｂ、ワタにおけるＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２ＡｂならびにジャガイモにおけるＣｒｙ３Ａが挙げられる。
【０００３】
これらのタンパク質を発現する市販の製品は、２種のタンパク質の殺虫スペクトルの組み合わせが望ましい場合（例えば、それぞれ鱗翅目（lepidopteran）有害生物（pest）およびルートワーム（rootworm）に対する抵抗性を付与するよう組み合わせた、トウモロコシにおけるＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ３Ｂｂ）、あるいはタンパク質の独立的な作用により、感受性昆虫集団における抵抗性の発達を遅延させるためのツールとして有用となる場合（例えば、タバコバドワーム（tobacco budworm）の抵抗性管理を可能にするよう組み合わせた、ワタにおけるＣｒｙ１ＡｃおよびＣｒｙ２Ａｂ）を除き、単一のタンパク質を発現する。
【０００４】
すなわち、この技術の急速かつ広範な採用をもたらした虫害抵抗性トランスジェニック植物の性質の一部はまた、有害生物集団が、これらの植物によって産生される殺虫性タンパク質に対する抵抗性を発達させ得るとの懸念も生じる。Ｂｔに基づく虫害抵抗性形質の有用性を保つための数通りの戦略が提案されてきたが、これには、緩衝帯（refuge）と組み合わせた高用量タンパク質の配置（deploying）や、異なる毒素と交互の配置またはその共配置（co-deployment）が挙げられる（McGaugheyら(1998)、「B.t. Resistance Management」Nature Biotechnol. 16:144〜146）。
【０００５】
ＩＲＭスタック（stack）において用いるために選択されるタンパク質は、あるタンパク質に対して発達した抵抗性が第二のタンパク質に対する抵抗性を付与しないように、その殺虫効果を独立的に発揮する必要がある（すなわち、タンパク質同士に交差抵抗性がない）。例えば、「タンパク質Ａ」に対する抵抗性のために選択された有害生物集団が、「タンパク質Ｂ」に対する感受性を有する場合、これは交差抵抗性がなく、タンパク質Ａとタンパク質Ｂの組み合わせが、タンパク質Ａ単独に対する抵抗性の遅延に有効であると結論することができる。
【０００６】
抵抗性昆虫集団が存在しない場合、作用機構および交差抵抗性の可能性に関係すると思われる他の特徴に基づいて評価を行うことができる。交差抵抗性を示さない可能性のある殺虫性タンパク質の同定において、受容体を介した結合の有用性が示唆されている（van Mellaertら、1999）。このアプローチに固有の交差抵抗性欠如の主要な予測因子は、殺虫性タンパク質同士が、感受性昆虫種における受容体に関して競合しないことである。
【０００７】
２種のＢｔ毒素が同一受容体に関して競合する場合において、毒素の一方が該受容体と結合しなくなるように、従って昆虫に対し殺虫性ではなくなるように該受容体が該昆虫において突然変異すれば、昆虫が、第二の毒素（同一受容体に対し競合的に結合する）に対しても同様に抵抗性となる可能性がある。すなわち、昆虫は、両方のＢｔ毒素に対し交差抵抗性であると考えられる。しかし、２種の毒素が２種の異なる受容体と結合する場合、これは、昆虫がこれら２種の毒素に対し同時に抵抗性とならないことの指標となり得る。
【０００８】
Ｃｒｙ１Ｆａは、ユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）（ＥＣＢ；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｂｎｅｒ））やフォールアーミーワーム（fall armyworm）（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））等、多くの鱗翅目（lepidopteran）有害生物種の防除において有用であり、シュガーケーンボーラー（sugarcane borer）（ＳＣＢ；ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis））に対し活性を有する。
【０００９】
Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質は、イベントＴＣ１５０７を含有するトウモロコシ植物において産生されると、ＦＡＷ防除に関し業界最高の虫害抵抗性形質をもたらした。Ｃｒｙ１Ｆａは、Ｈｅｒｃｕｌｅｘ（登録商標）、ＳｍａｒｔＳｔａｘ（商標）およびＷｉｄｅＳｔｒｉｋｅ（商標）製品内にさらに配置されている。
【００１０】
受容体結合アッセイにおける検出のためのタンパク質標識に利用できる最も一般的な技法は、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質の殺虫活性を不活性化するので、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質を用いて（競合的または相同的）受容体結合試験を実行する能力は制限されている。
【００１１】
追加的なＣｒｙ毒素は、公式Ｂ．ｔ．命名委員会（official B.t. nomenclature committee）（Crickmoreら;lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/）のウェブサイトに列挙されている。添付の付録Ａを参照されたし。現在、ほぼ６０種の「Ｃｒｙ」毒素（Ｃｒｙ１〜Ｃｒｙ５９）主要グループと、追加的なＣｙｔ毒素およびＶＩＰ毒素等が存在する。各数字のグループの多くは、大文字のサブグループを有し、大文字のサブグループは、小文字のさらに下位のサブグループを有する（例えば、Ｃｒｙ１はＡ〜Ｌを有し、Ｃｒｙ１Ａはａ〜ｉを有する）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の簡単な要旨
本発明は、一部には、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質の殺虫活性に対する抵抗性のために選択されたフォールアーミーワーム（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）；ＦＡＷ）集団が、Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質の殺虫活性に対する抵抗性を持たないという驚くべき発見に関する。当業者であれば本開示に鑑みて認識するであろうが、これら２種の殺虫性タンパク質またはその殺虫性部分を発現する植物は、これら殺虫性タンパク質のいずれか単独に対する抵抗性発達の遅延または抑制において有用となるであろう。
【００１３】
本発明は、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃａが、ＦＡＷ由来（またはジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）（シュガーケーンボーラー；ＳＣＢ）由来）の腸（gut）受容体との結合に関して互いに競合しないとの発見によっても支えられている。
【００１４】
本発明はまた、一部には、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃ毒素を基本のペアとする３種（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド（pyramid）」に関する。好ましいピラミッドの一型は、２種の有害生物、ＦＡＷおよびＥＣＢ（ユーロピアンコーンボーラー；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis））に対する非交差抵抗性活性をもたらす少なくとも２種のタンパク質、Ｃｒｙ１ＦａとＣｒｙ１Ｃａと、Ｃｒｙ１Ａｂ等の１または複数の抗ＥＣＢ毒素とを提供する。一部の好ましいピラミッド実施形態において、選択された毒素類は、ＦＡＷに対し３種の別個の作用機序を有する。好ましいピラミッドの組み合わせは、Ｃｒｙ１ＦａとＣｒｙ１Ｃａと、Ｖｉｐ３Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１ＢｅおよびＣｒｙ１Ｅからなる群から選択される別の毒素／遺伝子とである。これら３種の毒素を産生する植物（およびその植物が植え付けられた地所（acreage））は、本発明の範囲内に含まれる。追加的な毒素／遺伝子が付け加えられてもよいが、これら特定の三重スタックは、本発明において、ＦＡＷに対する３種の作用機序を有利にかつ驚くほどに提供する。これは、緩衝帯地所（refuge acreage）の要件の縮小または除外に役立つ可能性がある。本発明はまた、一般に、単一の標的有害生物に対し互いに競合しない３種の殺虫性タンパク質（一部の好ましい実施形態においてＣｒｙタンパク質）の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】フォールアーミーワーム（ＦＡＷ）およびＣｒｙ１Ｆ抵抗性のフォールアーミーワーム（ｒＦＡＷ）の新生期幼虫にｉｎ ｖｉｔｒｏでチャレンジした（challanged）メイズ（maize）葉片の食害評定。ｐＤＡＳ５１６２による形質転換後に選択されたトランスジェニックＴ０植物は、抗体ＤＩＧ１５２ＲＰＣ１を用いたイムノブロットスクリーニングにより、ＤＩＧ−１０９を産生しない植物（図中、左側）および検出可能レベルのＤＩＧ−１０９を有する植物（図中、中央）の２群に分けた。ＤＩＧ−１０９陽性植物を発現レベルによってランク分けして並べた（左から右へ、最低から最高）。３６系統のｐＤＡＳ５１６２形質転換系統においてＤＳＭ２のＨＰ解析を完了した。遺伝子１〜２コピーとして定義される単純な組込みイベントが、試料の９５％において検出された。陽性および陰性対照植物から得られたバイオアッセイを図中右側に示す。
【図２】Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素および１２５Ｉ標識したＣｒｙ１Ｃａコア毒素による、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）ＢＢＭＶとの結合に関する競合。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
配列の簡単な説明
配列番号１：Ｃｒｙ１Ｃａコア／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシン（protoxin）キメラタンパク質、１１６４ａａ（ＤＩＧ−１５２）（ｐＭＹＣ２５４７バージョン）
配列番号２：第二のＣｒｙ１Ｃａコア／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンキメラタンパク質、１１６４ａａ（ＤＩＧ−１０９）（メイズバージョン）
配列番号３：ＤＩＧ−１０９をコードするメイズ最適化ＣＤＳ、３４９２ｂｐ
配列番号４：Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素
配列番号５：Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素
【００１７】
発明の詳細な説明
本明細書において報告されている通り、トランスジェニックトウモロコシおよび他の植物（例えば、ワタやダイズ）において産生されるＣｒｙ１Ｃａ毒素は、Ｃｒｙ１Ｆａ活性に対する抵抗性を発達させたフォールアーミーワーム（ＦＡＷ；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））の防除において非常に有効である。よって、本発明は、一部には、Ｃｒｙ１Ｆａ抵抗性のフォールアーミーワームが、Ｃｒｙ１Ｃａに対し感受性である（すなわち、交差抵抗性ではない）との驚くべき発見に関する。
【００１８】
本発明はまた、一部には、Ｃｒｙ１Ｃａ毒素が、植物（メイズ植物（maize）等）をＣｒｙ１Ｆａ抵抗性フォールアーミーワームによる損傷から保護するのに有効であるとの驚くべき発見に関する。この有害生物に関する考察については、例えば、Tabashnik、PNAS(2008)、105巻49号、19029〜19030を参照されたし。
【００１９】
本発明は、トウモロコシおよびその他の経済的に重要な植物種をフォールアーミーワーム摂食に起因する損傷および収量減少から保護するための、あるいはＣｒｙ１Ｆａに対する抵抗性を発達させたフォールアーミーワーム集団に対するＣｒｙ１Ｃａ毒素の使用を含む。
【００２０】
よって、本発明は、フォールアーミーワームによるＣｒｙ１Ｆａおよび／またはＣｒｙ１Ｃａに対する抵抗性の発達を抑制または緩和するためのＩＲＭスタックを教示する。
【００２１】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｃａコア毒素含有タンパク質を産生する細胞を含む、鱗翅目（lepidopteran）有害生物を防除するための組成物を提供する。
【００２２】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｃａコア毒素含有タンパク質の両方を産生するよう形質転換した宿主（ここで、上記宿主は、微生物または植物細胞である）をさらに含む。対象ポリヌクレオチド（複数可）は、好ましくは、非バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）プロモーター制御下の（プロモーターに作動可能に連結した／を含む）遺伝的構築物内に置かれる。対象ポリヌクレオチドは、植物における発現を増強するためのコドン使用を含むことができる。
【００２３】
さらに、本発明は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質を含有しＣｒｙ１Ｃａコア毒素含有タンパク質をさらに含有する有効量の組成物と、有害生物または有害生物の環境を接触させるステップを含む、鱗翅目（lepidopteran）有害生物を防除する方法を提供することを目的とする。
【００２４】
本発明は、その一実施形態において、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素含有タンパク質をコードする植物発現可能遺伝子およびＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質をコードする植物発現可能遺伝子を含むメイズ植物（および他の植物、例えばワタおよびダイズ）ならびにこのような植物の種子を含む。
【００２５】
本発明は、そのさらに別の一実施形態において、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素含有タンパク質をコードする植物発現可能遺伝子およびＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質をコードする植物発現可能遺伝子が遺伝子移入された（introgress）メイズ植物（および他の植物、例えばワタおよびダイズ）ならびにこのような植物の種子を含む。
【００２６】
（植物における可能性のあるバイオ殺虫剤（bioinsecticide）としてのＣｒｙ１Ｃの総説に関しては、Avisarら、2009を参照されたし。）Avisar D, Eilenberg H, Keller M, Reznik N, Segal M, Sneh B, Zilberstein A (2009) The Bacillus thuringiensis delta-endotoxin Cry1C as a potential bioinsecticide in plants. Plant Science 176:315〜324。
【００２７】
昆虫受容体。 実施例に記載されている通り、放射標識したＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質を用いた競合的受容体結合試験は、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、Ｃｒｙ１Ｃａが結合するＦＡＷ昆虫組織に存在する高親和性結合部位に関して競合しないことを示す。これらの結果は、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃａタンパク質の組み合わせが、ＦＡＷ集団においてＣｒｙ１Ｆａに対する抵抗性の発達（および同様に、Ｃｒｙ１Ｃａに対する抵抗性の発達）を緩和するのに有効な手段であること、ならびに、両方のタンパク質を発現するトウモロコシ植物においてこの有害生物に対する抵抗性レベルを増加させる可能性があることを示す。
【００２８】
よって、本明細書における上述および他に記したデータに部分的に基づくと、Ｃｒｙ１ＣａおよびＣｒｙ１Ｆａタンパク質の同時産生（スタッキング）は、ＦＡＷのための高用量ＩＲＭスタックの産生に用いることができると考えられる。昆虫防除スペクトルを拡大するために、他のタンパク質をこの組み合わせに加えてもよい。例えば、トウモロコシにおいて、Ｃｒｙ１Ａｂの追加は、ユーロピアンコーンボーラー防除のためのＩＲＭピラミッドを作成するであろう。
【００２９】
別の配置オプションは、抵抗性の発達を緩和するために、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質と組み合わせたＣｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃａタンパク質の一方または両方を用いるものとなるであろう。よって、本発明の別の配置オプションは、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質の配置が、抵抗性集団発生によりシュガーケーンボーラー防除において無効となる場合、作物栽培領域においてＣｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃａタンパク質の一方または両方を用いるものとなるであろう。したがって、本発明に係る使用のための好ましい「三重スタック」または「ピラミッド」の組み合わせは、Ｃｒｙ１ＦとＣｒｙ１ＣとＣｒｙ１Ａｂである。
【００３０】
本発明はまた、一部には、Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃ毒素を基本のペアとする３種（以上）の毒素の三重スタックまたは「ピラミッド」に関する。好ましいピラミッドの一型は、２種の有害生物 − ＦＡＷおよびＥＣＢ（ユーロピアンコーンボーラー；オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis））に対し非交差抵抗性活性を付与する少なくとも２種のタンパク質を提供する。Ｃｒｙ１Ｆはどちらの昆虫に対しても活性を有するため、これは、Ｃｒｙ１ＦａとＣｒｙ１Ｄａと、Ｃｒｙ１Ａｂ等の１または複数のＥＣＢ毒素（米国特許出願公開第２００８ ０３１１０９６号明細書を参照）とである。他のＥＣＢ毒素としては、Ｃｒｙ１Ｂｅ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２９０；２００９年１２月１６日出願を参照）、Ｃｒｙ１Ｉ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２７８；２００９年１２月１６日出願を参照）、Ｃｒｙ２Ａａ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２７８；２００９年１２月１６日出願を参照）およびＤＩＧ−３（米国特許出願公開第２０１０ ００２６９２２３号明細書を参照）が挙げられる。一部の好ましいピラミッド実施形態において、選択された毒素は、ＦＡＷに対し３種の別個の作用機序を有する。これらの好ましいピラミッドの組み合わせは、Ｃｒｙ１ＦａとＣｒｙ１Ｃａと、Ｖｉｐ３Ａｂ、Ｃｒｙ１Ｄ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２５２；２００９年１２月１６日出願を参照）、Ｃｒｙ１ＢｅおよびＣｒｙ１Ｅ（ＵＳＳＮ６１／２８４，２７８；２００９年１２月１６日出願を参照）からなる群から選択される別の毒素／遺伝子である。これら３種の毒素を産生する植物（およびこのような植物を植え付けた地所）は、本発明の範囲内に含まれる。追加的な毒素／遺伝子を付け加えてもよいが、これらの特定の三重スタックは、本発明において、ＦＡＷに対する３種の作用機序を有利かつ驚くほどにもたらすであろう。これは、緩衝帯地所に対する要件の縮小または除外に役立ち得る。よって、このように植え付けた１０エーカーを超える圃場（field）は、本発明の範囲内に含まれる。
【００３１】
他のＶｉｐ３毒素は、例えば、添付の付録Ａに列挙されている。これらのＧＥＮＢＡＮＫ番号を用いて、本明細書に開示または言及されている遺伝子およびタンパク質のいずれかの配列を得ることもできる。
【００３２】
米国特許第５，１８８，９６０号明細書および米国特許第５，８２７，５１４号明細書は、本発明の実施における使用に適したＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質について記載する。米国特許第６，２１８，１８８号明細書は、本発明における使用に適したＣｒｙ１Ｆａコア毒素含有タンパク質をコードする、植物に最適化したＤＮＡ配列について記載する。
【００３３】
本発明に記載されている毒素類の組み合わせは、鱗翅目（lepidopteran）有害生物の防除に用いることができる。成虫の鱗翅目（lepidopteran）、例えば蝶や蛾は主として花蜜を餌とし、授粉の重要なエフェクターである。ほぼ全ての鱗翅目（lepidopteran）の幼虫、すなわちイモムシは植物を餌とし、多くは深刻な有害生物である。イモムシは、植物の葉の上もしくは内側、根または茎を餌とし、植物から栄養を奪い、多くの場合植物の物理的支持構造を破壊する。さらに、イモムシは果実、織物ならびに貯蔵している穀物および小麦粉を餌とし、これら販売用の商品を台無しにし、あるいはそれらの価値を大幅に減少させる。本明細書において使用する場合、鱗翅目（lepidopteran）有害生物の言及は、幼生期を含む有害生物の様々なライフステージを意味する。
【００３４】
本発明の一部のキメラ毒素は、Ｂｔ毒素の完全Ｎ末端コア毒素部分を含み、該コア毒素部分の末端を過ぎたある点において、タンパク質は異種プロトキシン配列へと移行する。Ｎ末端の殺虫活性を有するＢｔ毒素の毒素部分は、「コア」毒素という。コア毒素セグメントから異種プロトキシンセグメントへの移行（transition）は、毒素／プロトキシン接合部（junction）付近において生じてもよいし、あるいは天然のプロトキシン部分（コア毒素部分を過ぎて延在する）が保持されて、異種プロトキシン部分への移行が下流で生じてもよい。
【００３５】
一例として、本発明のキメラ毒素の一型は、Ｃｒｙ１Ｆａの完全コア毒素部分（アミノ酸１〜６０１）および異種プロトキシン（アミノ酸６０２〜Ｃ末端）である。好ましい一実施形態において、プロトキシンを含むキメラ毒素部分は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質毒素に由来する。第二の例として、配列番号１に開示されている本発明の第二のキメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｃａの完全コア毒素部分（アミノ酸１〜６１９）および異種プロトキシン（アミノ酸６２０〜Ｃ末端）を有する。好ましい一実施形態において、プロトキシンを含むキメラ毒素部分は、Ｃｒｙ１Ａｂタンパク質毒素に由来する。
【００３６】
当業者であれば、Ｂｔ毒素は、Ｃｒｙ１Ｆ等の特定のクラス内であっても、長さおよびコア毒素部分からプロトキシン部分への移行部の正確な位置がある程度変動し得ることを理解できるであろう。通常、Ｃｒｙ１ＣａおよびＣｒｙ１Ｆａ毒素は、約１１５０〜約１２００アミノ酸の長さである。コア毒素部分からプロトキシン部分への移行は通常、全長毒素の約５０％〜約６０％の間において生じるであろう。本発明のキメラ毒素は、このＮ末端コア毒素部分の全体（full expanse）を含むであろう。よって、キメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｆａ Ｂｔ毒素タンパク質全長の少なくとも約５０％またはＣｒｙ１Ｃａ Ｂｔ毒素タンパク質全長の少なくとも約５０％を含むであろう。これは通常、少なくとも約５９０アミノ酸となるであろう。プロトキシン部分に関しては、Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシン部分の全体は、コア毒素部分末端から分子のＣ末端へと延在する。
【００３７】
遺伝子および毒素。 本発明において有用な遺伝子および毒素は、開示されている全長配列のみならず、本明細書において特に例示されている毒素の特徴的な殺有害生物活性（pesticidal activity）を保持するこれら配列の断片、変種、変異体および融合タンパク質も含む。本明細書において使用される場合、用語、遺伝子の「変種（variant）」または「変異種（variation）」は、同一毒素をコードする、あるいは殺有害生物活性を有する同等の毒素をコードするヌクレオチド配列を意味する。本明細書において使用される場合、用語「同等の毒素（equivalent toxin）」は、標的有害生物に対し、特許請求されている毒素と同一または本質的に同一の生物活性を有する毒素を意味する。
【００３８】
本明細書において使用される場合、境界（boundary）は、「Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins」N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) 62巻：807〜813により、およそ９５％（Ｃｒｙ１Ｆａおよび１Ｃａ）、７８％（Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ｃ）ならびに４５％（Ｃｒｙ１）の配列同一性を表す。これらカットオフは、コア毒素のみ（Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ｃ毒素のため）に適用することもできる。
【００３９】
当業者であれば、活性毒素をコードする遺伝子を数通りの手段によって同定および獲得できることは明らかであろう。本明細書に例示されている特定の遺伝子または遺伝子部分は、培養物寄託機関（culture depository）に寄託されている分離株（isolate）から得ることができる。これらの遺伝子またはその部分もしくは変種は、合成により、例えば遺伝子合成装置を用いることにより構築することもできる。遺伝子の変異種は、点突然変異作製のための標準技法を用いて容易に構築することができる。また、これら遺伝子の断片は、市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを用いて標準的手順に従って作製することができる。例えば、Ｂａｌ３１等の酵素または部位特異的突然変異誘発を用いて、これら遺伝子の末端からヌクレオチドを系統的に切り取ることができる。様々な制限酵素を用いて活性断片をコードする遺伝子を得ることもできる。プロテアーゼを用いて、これらタンパク質毒素の活性断片を直接的に得ることができる。
【００４０】
例示した毒素の殺有害生物活性を保持する断片および同等物は、本発明の範囲内のものである。また、遺伝暗号の重複性のため、様々な異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示されているアミノ酸配列をコードし得る。同一または本質的に同一の毒素をコードするこのような代替的ＤＮＡ配列の作製は、十分に当業者の技能範囲内である。このような変種ＤＮＡ配列は、本発明の範囲内のものである。本明細書において使用される場合、「本質的に同一」な配列の言及は、殺有害生物活性に実質的な影響を及ぼさないアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入を有する配列を意味する。殺有害生物活性を保持するタンパク質をコードする遺伝子の断片もまた、この定義に含まれる。
【００４１】
本発明において有用な毒素をコードする遺伝子および遺伝子部分を同定するためのさらに別の方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用によるものである。このようなプローブは、検出可能なヌクレオチド配列である。このような配列は、適切な標識に基づいて検出されてもよいし、あるいは国際公開第９３／１６０９４号パンフレットに記載されている通り、蛍光が内在するように作製されてもよい。当該分野でよく知られていることに、２分子間に強固な結合を形成することによってプローブ分子と核酸試料がハイブリダイズする場合、プローブと試料が実質的な相同性を有すると合理的に仮定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えば、Keller, G. H., M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press、ニューヨーク州ニューヨーク、169〜170頁に記載されている通り、当該分野でよく知られた技法によりストリンジェントな条件下で行われる。塩濃度および温度の組み合わせを数例、以下に示す（ストリンジェンシー増加順）：２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、室温；１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、４２℃；０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、４２℃；０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、６５℃。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが生じたかどうかを公知の様式において決定するための手段を提供する。このようなプローブ解析は、本発明の毒素コード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明に係るプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡ合成装置および標準的手順を用いて合成することができる。このようなヌクレオチド配列は、本発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして用いることもできる。
【００４２】
変種毒素。 本発明の特定の毒素は、本明細書において特に例示されている。これらの毒素は、本発明の毒素の単なる具体例であるため、本発明が、例示の毒素と同一または類似の殺有害生物活性（same or similar pesticidal activity）を有する変種または同等の毒素（および同等の毒素をコードするヌクレオチド配列）を含むことが容易に明らかであろう。同等の毒素は、例示の毒素とアミノ酸相同性を有するであろう。このアミノ酸相同性は通常、７５％を超え、好ましくは９０％を超え、最も好ましくは９５％を超えるであろう。アミノ酸相同性は、生物活性の原因となる、あるいは生物活性に最終的に関与する三次元配置の決定に関係する毒素の決定的領域において最も高くなるであろう。この点において、アミノ酸の置換が、活性に決定的ではない領域に存在する場合、あるいは分子の三次元配置に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換である場合、特定のアミノ酸置換が許容され、これを予想することができる。例えば、アミノ酸は、次のクラス、非極性、無電荷極性、塩基性および酸性に分類することができる。あるクラスのアミノ酸が同じ種類の別のアミノ酸に交換される保存的置換は、置換が化合物の生物活性を実質的に変化させない限り、本発明の範囲内に収まる。表１は、各クラスに属するアミノ酸の具体例のリストを提示する。
【００４３】
【表１】
【００４４】
場合によっては、非保存的置換を行ってもよい。重要な要素としては、これらの置換が毒素の生物活性を顕著に損なってはならないことである。
【００４５】
組換え宿主。 本発明の毒素をコードする遺伝子は、多種多様な微生物または植物宿主へと導入することができる。毒素遺伝子の発現は、殺有害生物剤（pesticide）の細胞内産生および維持を直接的または間接的にもたらす。接合伝達（conjugal transfer）および組換え伝達（recombinant transfer）を用いて、本発明の両方の毒素を発現するＢｔ株を作製することができる。他の宿主生物を一方または両方の毒素遺伝子で形質転換し、続いて相乗効果の達成に用いることもできる。適切な微生物宿主、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）属を用いることにより、微生物を有害生物の位置（situs）に適用することができ、そこで微生物が増殖し、摂取される（be ingested）。その結果、有害生物の防除がもたらされる。あるいは、毒素遺伝子を導入した微生物は、毒素の活性を延長し、細胞を安定化する条件下で処理することができる。その後、毒性活性を保持する処理細胞は、標的有害生物の環境に適用することができる。
【００４６】
Ｂｔ毒素遺伝子が、適切なベクターを介して微生物宿主に導入され、前記宿主が、生きた状態で環境に適用される場合、特定の宿主微生物を用いることが必要不可欠である。１以上の対象作物の「植物圏（phytosphere）」（葉面（phylloplane）、葉圏（phyllosphere）、根圏および／または根面（rhizoplane））に生息することが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物および他の昆虫生息地）中で野生型微生物と首尾よく競合でき、ポリペプチド型殺有害生物剤を発現する遺伝子の安定的な維持および発現をもたらし、望ましくは、殺有害生物剤の環境による分解および不活性化からの保護の改善をもたらすよう選択される。
【００４７】
多数の微生物は、多種多様な重要作物の葉面（植物の葉の表面）および／または根圏（植物の根の周囲の土壌）に生息することが知られている。これらの微生物は、細菌、藻類および真菌を含む。細菌、例えばシュードモナス（Pseudomonas）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、メチロフィリウス（Methylophilius）属、アグロバクテナム（Agrobactenum）、アセトバクター（Acetobacter）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属, アルスロバクター（Arthrobacter）属, アゾトバクター（Azotobacter）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属およびアルカリゲネス（Alcaligenes）属；真菌、特に酵母、例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、クリベロマイセス（Kluyveromyces）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属およびアウレオバシジウム（Aureobasidium）属等の微生物がとりわけ重要である。シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテニウム・ツメファシエンス（Agrobactenium tumefaciens）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、リゾビウム・メリオティ（Rhizobium melioti）、アルカリゲネス・エントロファス（Alcaligenes entrophus）およびアゾトバクター・ビンランジー（Azotobacter vinlandii）等の植物圏細菌種；ならびにロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、Ｒ．グルチニス（R. glutinis）、Ｒ．マリナ（R. marina）、Ｒ．アウランティアカ（R. aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、Ｃ．ジフルエンス（C. diffluens）、Ｃ．ロウレンティ（C. laurentii）、サッカロマイセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、Ｓ．プレトリエンシス（S. pretoriensis）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、スポロボロマイセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）、Ｓ．オドルス（S. odorus）、クリベロマイセス・ベロナエ（Kluyveromyces veronae）およびアウレオバシジウム・ポルランス（Aureobasidium pollulans）等の植物圏酵母種がとりわけ重要である。色素性微生物（pigmented microorganism）がとりわけ重要である。
【００４８】
遺伝子の安定的な維持および発現を可能にする条件下で、毒素をコードするＢｔ遺伝子を微生物宿主に導入するための多種多様な方法を用いることができる。これらの方法は、当業者によく知られており、例えば、本明細書において参照により援用する米国特許第５１３５８６７号明細書に記載されている。
【００４９】
細胞の処理。 Ｂｔ毒素を発現するバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）または組換え細胞は、毒素活性を延長し、細胞を安定化するよう処理することができる。生成された殺有害生物剤マイクロカプセルは、安定化された細胞構造内にＢｔ毒素（単数または複数）を含み、マイクロカプセルが標的有害生物の環境に置かれたときに毒素を保護する。適切な宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれかを含むことができるが、通常、哺乳動物等、高等生物に対し毒性の物質を産生しない細胞に限定されている。しかし、毒性物質が不安定である、あるいは適用レベルが哺乳動物宿主に対するあらゆる毒性の可能性を回避できる程十分に低い場合、高等生物に対し毒性の物質を産生する生物を用いることができる。宿主として、原核生物および真菌等の下等真核生物がとりわけ重要であろう。
【００５０】
細胞は、通常はインタクトであり、場合によっては胞子を用いてもよいが、処理される場合は胞子型ではなくむしろ実質的に増殖型である。
【００５１】
微生物細胞、例えば、Ｂ．ｔ．毒素遺伝子（単数または複数）を含有する微生物の処理は、その技法が毒素の性質に悪影響を及ぼさず、細胞の毒素保護能力を減少させない限りにおいて、化学的または物理的手段により、あるいは化学的および／または物理的手段の組み合わせにより行うことができる。化学試薬の例として、ハロゲン化剤、具体的には原子番号１７〜８０のハロゲンが挙げられる。より具体的には、ヨウ素を穏和な条件下、十分な時間を用いて、所望の結果を得ることができる。他の適切な技法として、グルタルアルデヒド等のアルデヒド；塩化ゼフィラン（zephiran chloride）および塩化セチルピリジニウム（cetylpyridinium chloride）等の抗感染薬；イソプロピルおよびエタノール等のアルコール；ルゴールヨウ素液（Lugol iodine）、ブアン固定液、様々な酸およびヘリー（Helly）固定液等の様々な組織学的固定液（Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967を参照）；または細胞が宿主環境へと投与される場合、細胞において産生される毒素の活性を保存および延長する物理的（熱）因子および化学薬品（physical (heat) and chemical agents）の組み合わせによる処理が挙げられる。物理的手段の例として、ガンマ線およびＸ線等の短波長放射線、凍結、ＵＶ照射、凍結乾燥その他が挙げられる。微生物細胞処理のための方法は、本明細書において参照により援用する米国特許第４，６９５，４５５号および第４，６９５，４６２号明細書に開示されている。
【００５２】
細胞は、一般に、環境条件に対する抵抗性を増強させる、増強された構造上の安定性を有するであろう。殺有害生物剤がプロ型（proform）である場合、細胞処理方法は、標的有害生物病原体による殺有害生物剤のプロ型から成熟型へのプロセシングを阻害しないように選択するべきである。例えば、ホルムアルデヒドは、タンパク質を架橋するため、ポリペプチド型殺有害生物剤のプロ型のプロセシングを阻害し得る。処理方法は、毒素のバイオアベイラビリティまたは生物活性の少なくとも実質的な部分を保持すべきである。
【００５３】
産生目的の宿主細胞選択におけるとりわけ重要な特徴は、Ｂ．ｔ．遺伝子（単数または複数）の宿主への導入し易さ、発現系の利用可能性、発現効率、宿主における殺有害生物剤の安定性および補助的遺伝能力の存在（presence of auxiliary genetic capability）を含む。殺有害生物剤マイクロカプセルとして用いるための重要な特徴は、厚い細胞壁、色素沈着および細胞内パッケージングまたは封入体形成；水性環境における生存；哺乳動物毒性の欠如；有害生物が摂取するための誘引性；毒素を損うことのない殺傷および固定の容易さ（ease of killing and fixing without damage to the toxin）；その他等、殺有害生物剤のための保護的な性質を含む。他の検討事項は、製剤および取り扱いの容易さ、経済的側面、保存安定性その他を含む。
【００５４】
細胞の増殖。 Ｂ．ｔ．殺虫性遺伝子（単数または複数）を含有する細胞性宿主は、ＤＮＡ構築物が選択優位性を与える任意の好都合な栄養培地中で増殖させることができ、実質的全細胞または全細胞がＢ．ｔ．遺伝子を保持するような選択培地を提供する。続いて、これらの細胞を従来の手法に従って収集することができる。あるいは、細胞を収集前に処理することができる。
【００５５】
本発明の毒素を産生するＢ．ｔ．細胞は、標準技術の培地および発酵技法を用いて培養することができる。発酵サイクルが完了し次第、細菌は、先ず、当該分野でよく知られた手段によりＢ．ｔ．胞子および結晶を発酵ブロスから分離することにより収集することができる。回収されたＢ．ｔ．胞子および結晶は、界面活性剤、分散剤、不活性担体ならびに取り扱いおよび特定の標的有害生物への適用を容易にする他の成分の添加により、可湿性粉末、原液（liquid concentrate）、顆粒または他の製剤へと処方することができる。これらの製剤および適用手順は全て当該分野でよく知られている。
【００５６】
製剤。 誘引物質ならびにＢ．ｔ．分離株の胞子、結晶および毒素を含有する処方された餌用顆粒、または本明細書に開示されているＢ．ｔ．分離株から得ることができる遺伝子を含む組換え微生物は、土壌に適用することができる。処方された産物は、種子コーティングとして、あるいは作物サイクルのより後期において根の処理または全草（total plant）処理として適用することもできる。Ｂ．ｔ．細胞による植物および土壌の処理は、無機ミネラル（フィロケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩その他）または植物材料（粉末化したトウモロコシの穂軸、籾殻、クルミの殻その他）等、様々な不活性材料と混合することにより可湿性粉末、顆粒または粉塵（dust）として利用することもできる。製剤は、展着剤接着剤アジュバント（spreader-sticker adjuvant）、安定化剤、他の殺有害生物添加剤または界面活性剤を含むことができる。液体製剤は、水性ベースであっても非水性であってもよく、泡、ジェル、懸濁液、乳剤（emulsifiable concentrate）その他として利用することができる。成分は、レオロジー剤、界面活性剤、乳化剤、分散剤またはポリマーを含むことができる。
【００５７】
当業者であれば理解できるように、殺有害生物濃度は、特定の製剤の性質、特に濃縮液であるか直接用いるかに依存して大きく変動し得る。殺有害生物剤は、少なくとも１重量％存在し、１００重量％であってもよい。乾燥製剤は、約１〜９５重量％の殺有害生物剤を有するが、液体製剤は一般に、液相における約１〜６０重量％の固体となる。製剤は一般に、約１０２〜約１０４細胞／ｍｇを有する。これらの製剤は、１ヘクタール当り約５０ｍｇ（液体または乾燥）から１ｋｇ以上で投与される。
【００５８】
製剤は、噴霧（spraying）、散布（dusting）、撒布（sprinkling）その他により鱗翅目（lepidopteran）有害生物の環境、例えば、葉または土壌に適用することができる。
【００５９】
植物の形質転換。 本発明の殺虫性タンパク質の産生のための好ましい組換え宿主は、形質転換植物である。本明細書に開示されている通り、Ｂｔ毒素タンパク質をコードする遺伝子は、当該分野でよく知られた様々な技法を用いて植物細胞へと挿入することができる。例えば、大腸菌（Escherichia coli）における複製システムおよび形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含む多数のクローニングベクターが、外来遺伝子の高等植物への挿入の準備に利用できる。ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４をとりわけ含む。したがって、Ｂｔ毒素タンパク質をコードする配列を有するＤＮＡ断片は、ベクターの適切な制限部位に挿入することができる。その結果生じたプラスミドを大腸菌（E. coli）の形質転換に用いる。大腸菌（E. coli）細胞を適切な栄養培地中で培養し、続いて収集し溶解する。プラスミドを回収する。解析方法として一般に、配列解析、制限酵素解析（restriction analysis）、電気泳動その他の生化学的・分子生物学的方法が行われる。各操作の後、用いたＤＮＡ配列を切断し、次のＤＮＡ配列と連結することができる。各プラスミド配列は、同一または他のプラスミドにクローニングすることができる。所望の遺伝子の植物への挿入方法に応じて、他のＤＮＡ配列が必要となり得る。例えば、ＴｉまたはＲｉプラスミドが植物細胞の形質転換に用いられる場合、ＴｉまたはＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右側境界（right border）、多くの場合右および左側境界は、挿入される遺伝子のフランキング領域として連結している必要がある。植物細胞の形質転換のためのＴ−ＤＮＡの使用は、集中的に研究されてきており、欧州特許第１２０５１６号明細書、Lee and Gelvin（2008）、Hoekema（1985）、Fraleyら（1986）およびAnら（1985）に十分に記載されており、当該分野において十分に確立されている。
【００６０】
挿入ＤＮＡは、一旦植物ゲノムに組み込まれると、比較的安定的になる。形質転換ベクターは通常、とりわけビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシンまたはハイグロマイシン等、殺生物剤または抗生物質に対する抵抗性を形質転換植物細胞に付与する選択可能なマーカーを含有する。したがって、個々に用いたマーカーは、挿入ＤＮＡを含有しない細胞よりも形質転換細胞の選択を可能にする。
【００６１】
ＤＮＡを植物宿主細胞に挿入するために多数の技法を利用できる。これらの技法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換の媒体（transformation agent）として用いたＴ−ＤＮＡによる形質転換、融合、インジェクション、遺伝子銃（biolistics）（微粒子銃）またはエレクトロポレーションと、他の可能な方法を含む。アグロバクテリウム細菌（Agrobacteria）が形質転換に用いられる場合、挿入されるＤＮＡは、特殊なプラスミド、すなわち中間型ベクター（intermediate vector）またはバイナリーベクターのいずれかにクローニングする必要がある。中間型ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ内の配列と相同的な配列による相同組換えによりＴｉまたはＲｉプラスミドに組込むことができる。ＴｉまたはＲｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡの伝達に必要とされるｖｉｒ領域も含む。中間型ベクターは、アグロバクテリウム細菌において自己複製できない。中間型ベクターは、ヘルパープラスミド（接合（conjugation））によりアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に伝達することができる。バイナリーベクターは、大腸菌（E. coli）とアグロバクテリウム細菌の両方において自己複製できる。これは、右側および左側のＴ−ＤＮＡ境界領域によって画定される選択マーカー遺伝子およびリンカーまたはポリリンカーを含む。これは、アグロバクテリウム細菌へと直接的に形質転換することができる（Holstersら、1978）。宿主細胞として用いるアグロバクテリウム（Agrobacterium）属は、ｖｉｒ領域を有するプラスミドを含む必要がある。ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞への伝達に必要である。追加的なＴ−ＤＮＡを含有してよい。このように形質転換された細菌は、植物細胞の形質転換に用いられる。植物外植片は、ＤＮＡの植物細胞への伝達のためにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）と共に有利に培養することができる。次に、選択用の抗生物質または殺生物剤を含有し得る適切な培地において、感染した植物材料（例えば、葉片、茎のセグメント、根、さらにはプロトプラストまたは懸濁培養細胞）から植物体全体（whole plant）を再生させることができる。次に、このようにして得られた植物を挿入ＤＮＡの存在に関して試験することができる。インジェクションおよびエレクトロポレーションの場合、プラスミドに関して特段の定めはない。例えばｐＵＣ派生体等、通常のプラスミドを用いることが可能である。
【００６２】
形質転換細胞は、通常の様式で植物内において増殖する。これは、生殖細胞を形成し、形質転換された形質（複数可）を子孫植物に伝達することができる。このような植物は、通常の様式で育成し、同一の形質転換された遺伝要素または他の遺伝要素を有する植物と交雑することができる。その結果生じたハイブリッド個体は、対応する表現型上の性質を有する。
【００６３】
本発明の好ましい一実施形態において、植物は、コドン使用が植物に最適化された遺伝子で形質転換される。例えば、本明細書において参照により援用する米国特許第５３８０８３１号明細書を参照されたし。本明細書において数例の切断型毒素が例示されているが、Ｂｔ技術分野においてよく知られていることに、１３０ｋＤａ型（全長）毒素は、コア毒素であるＮ末端側半分およびプロトキシン「テール部（tail）」であるＣ末端側半分を有する。よって、適切な「テール部」は、本発明の切断型／コア毒素と共に用いることができる。例えば、米国特許第６２１８１８８号明細書および米国特許第６６７３９９０号明細書を参照されたし。さらに、植物において用いるための合成Ｂｔ遺伝子を作製するための方法は、当該分野において公知である（Stewart and Burgin、2007）。好ましい形質転換植物の非限定的な一例として、Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質をコードする植物発現可能遺伝子を含み、Ｃｒｙ１Ｃａタンパク質をコードする第二の植物発現可能遺伝子をさらに含む稔性を有するメイズ植物が挙げられる。
【００６４】
Ｃｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃａにより決定される形質（複数可）の自殖（inbred）メイズ系統への伝達（または遺伝子移入（introgression））は、反復（recurrent）選択育種、例えば戻し交雑により達成することができる。この場合、先ず、所望の反復親を、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ｃにより決定される形質の適切な遺伝子（複数可）を有するドナー自殖系（非反復親）と交雑する。次に、この交雑の子孫を反復親と戻し交配し、続いてその結果生じた子孫において、非反復親から伝達される所望の形質（複数可）を選択する。所望の形質（複数可）を選択しつつ反復親と戻し交雑してから３世代、好ましくは４世代、より好ましくは５世代以上の後、子孫は、伝達された形質（複数可）を制御する遺伝子座に関してヘテロ接合型となるが、他の遺伝子に関しては大部分またはほぼ全てが反復親と同様のものとなる（例えば、Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops、第４版、172〜175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development、１巻: Theory and Technique、360〜376を参照）。
【００６５】
害虫抵抗性管理（Insect Resistance Management）（ＩＲＭ）戦略。例えば、Roushらは、殺虫性トランスジェニック作物の管理のための、「ピラミッド化（pyramiding）」または「スタッキング」とも称される２毒素戦略について概要を述べる（The Royal Society、Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353、1777〜1786）。
【００６６】
米国環境保護局（the United States Environmental Protection Agency）は、そのウェブサイト（epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm）において、標的有害生物に対し活性を有する単一のＢｔタンパク質を産生するトランスジェニック作物と共に用いるための、非トランスジェニック（すなわち、非Ｂ．ｔ．）緩衝帯（非Ｂｔ作物／トウモロコシの区画またはブロック）を設置するための次の要件を公開する。
【００６７】
「コーンボーラーから保護されたＢｔ（Ｃｒｙ１ＡｂまたはＣｒｙ１Ｆ）トウモロコシ製品のための特定の構造化された要件は次の通りである：
構造化された緩衝帯：コーンベルトにおける非鱗翅目（lepidopteran）Ｂｔトウモロコシ緩衝帯、２０％
コットンベルトにおける非鱗翅目（lepidopteran）Ｂｔ緩衝帯、５０％
ブロック
内部（すなわち、Ｂｔ圃場内）
外部（すなわち、任意交配を最大限に高めるための、Ｂｔ圃場の１／２マイル（可能であれば１／４マイル）以内にある別の圃場）
圃場内帯状地（strip）
帯状地は、幼虫移動の効果を低減するために少なくとも４列幅（rows wide）（好ましくは６列）である必要がある」
【００６８】
さらに、全米トウモロコシ生産者協会（National Corn Growers Association）も、そのウェブサイト：
（ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn）
において、緩衝帯要件に関する同様の指針、例えば次の事項を提示する。
「コーンボーラーＩＲＭの要件：
− 緩衝帯ハイブリッドをトウモロコシ畑の少なくとも２０％に植えること
− ワタ生産区域において、緩衝帯は５０％でなければならない
− 緩衝帯ハイブリッドの１／２マイル以内に植えなければならない
− 緩衝帯はＢｔ圃場内に帯状地として配置する（plant）ことができる；緩衝帯帯状地は、少なくとも４列幅でなければならない
− 標的昆虫に対して経済的閾値（economic threshold）に達した場合のみ、緩衝帯を従来の殺有害生物剤で処理してよい
− Ｂｔベースの噴霧可能な殺虫剤は、緩衝帯トウモロコシに用いることができない
− Ｂｔトウモロコシの農場毎に適切な緩衝帯を配置しなければならない」
【００６９】
Ｒｏｕｓｈらによって記述された通り（例えば、１７８０および１７８４頁右段）、それぞれ標的有害生物に対して有効であり、交差抵抗性がほとんどないまたは全くない２種の異なるタンパク質のスタッキングまたはピラミッド化は、より小規模の緩衝帯の使用を可能にする。Ｒｏｕｓｈは、成功したスタックにおける１０％未満の緩衝帯の緩衝帯サイズは、単一（非ピラミッド化）形質における約５０％の緩衝帯に匹敵する抵抗性管理をもたらし得ることを示唆する。現在利用できるピラミッド化したＢｔトウモロコシ製品に対し、米国環境保護局は、単一形質の製品（概して２０％）よりも有意に少ない（概して５％）非Ｂｔトウモロコシの構造化された緩衝帯の植え付けを要求する。
【００７０】
Ｒｏｕｓｈら（上記参照）および米国特許第６，５５１，９６２号明細書にさらに記載されている通り、圃場における様々な幾何学的植え付けパターン（geometric planting pattern）（上述）や種子同梱袋（in-bag seed mixture）等、緩衝帯のＩＲＭ効果を提供する様々な方法が存在する。
【００７１】
上述のパーセンテージまたは類似の緩衝帯比率は、対象の二重もしくは三重スタックまたはピラミッドに用いることができる。単一の標的有害生物に対し３種の作用機序を備える三重スタックに関して、目標はゼロ緩衝帯（または例えば５％未満の緩衝帯）である。これは、商業的地所、例えば１０エーカーを超えるものに特に当てはまる。
【００７２】
本明細書に参照または引用されているあらゆる特許、特許出願、仮出願および刊行物は、本明細書に明示されている教示と不一致とならない範囲まで、その全体が参照により援用される。
【００７３】
次に、本発明の実施のための手順を説明する実施例を示す。これらの実施例は、限定的なものとして解釈するべきではない。他に断りがなければ、あらゆるパーセンテージは重量で表し、あらゆる溶媒混合物の割合は容量で表す。あらゆる温度はセ氏で表す。
【００７４】
特に示唆または暗示されていなければ、「a」、「an」および「the」との用語は、本明細書において「少なくとも１個」を示す。
【実施例１】
【００７５】
キメラＣｒｙ１Ｃａコア毒素およびＣｒｙ１Ａｂプロトキシンの設計
キメラ毒素。 別のＣｒｙ毒素のプロトキシンセグメントと融合したあるＣｒｙ毒素のコア毒素ドメインを利用するキメラタンパク質は、例えば、米国特許第５５９３８８１号明細書および米国特許第５９３２２０９号明細書において以前に報告された。Ｃｒｙ１Ｃａ３デルタエンドトキシンタンパク質配列は、ＣｒｙＩＣ（ｂ）という旧い用語でＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ２２３４３として寄託されている。
【００７６】
本発明のＣｒｙ１Ｃａキメラタンパク質変種は、コア毒素セグメントの末端を過ぎたある点で異種デルタエンドトキシンプロトキシンセグメントと融合した、Ｃｒｙ１Ｃａ３殺虫性毒素に由来するＮ末端コア毒素セグメントを含むキメラ毒素を含む。コア毒素から異種プロトキシンセグメントへの移行は、天然のコア毒素／プロトキシン接合部付近において生じても、あるいは天然のプロトキシン部分（コア毒素セグメントを過ぎて延在する）が保持されて、異種プロトキシンへの移行が下流で生じてもよい。変種様式において、コア毒素およびプロトキシンセグメントは、その元となる天然の毒素のアミノ酸配列を正確に含んでいてもよいし、あるいは互いが融合したときにセグメントの生物学的機能を減少させずに増強できるようなアミノ酸の付加、欠失または置換を含んでいてもよい。
【００７７】
例えば、本発明のキメラ毒素は、Ｃｒｙ１Ｃａ３に由来するコア毒素セグメントと、異種プロトキシンとを含む。本発明の好ましい一実施形態において、Ｃｒｙ１Ｃａ３に由来するコア毒素セグメント（６１９アミノ酸）は、Ｃｒｙ１Ａｂデルタ−エンドトキシンに由来するプロトキシンセグメントを含む異種セグメント（５４５アミノ酸）と融合される。本明細書においてＤＩＧ−１５２というキメラタンパク質の１１６４アミノ酸配列は、配列番号１として開示されている。本発明の第二の好ましい実施形態は、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素セグメント（６１９アミノ酸）が、Ｃｒｙ１Ａｂに由来する第二の５４５アミノ酸プロトキシンセグメントと連結したキメラタンパク質を含む。ＤＩＧ−１０９という第二のキメラタンパク質の１１６４アミノ酸配列は、配列番号２（メイズ最適化バージョン）として開示されている。Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素変種およびＣｒｙ１Ａｂに由来するプロトキシンを含む他のキメラ融合体が、本発明の範囲内のものであることを理解されたし。
【００７８】
ＤＩＧ−１５２およびＤＩＧ−１０９キメラタンパク質が、配列の単一のポジション（アミノ酸６２０、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントをＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントと連結する部分）のみ異なり、互いに本質的に機能的に同等であることに留意されたい。
【実施例２】
【００７９】
キメラＣｒｙ１Ｃａコア／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンタンパク質をコードする発現プラスミドの構築およびシュードモナス（Pseudomonas）属における発現
全長ＤＩＧ−１５２キメラタンパク質（配列番号１に開示）を産生するよう設計されたシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）（Ｐｆ）発現構築物ｐＭＹＣ２５４７の構築において、標準クローニング法（例えば、Sambrookら（1989）およびAusubelら（1995）ならびにそれらの最新情報に記載）を用いた。米国特許第５１６９７６０号明細書に開示されている改変型ｌａｃオペロンを挿入されたシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）株ＭＢ２１４（株ＭＢ１０１の派生体；Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）次亜種（biovar）Ｉ）において、タンパク質産生を行った。基礎クローニング戦略は、その結果プラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ウィスコンシン州ミルウォーキー）由来のＰｔａｃプロモーターおよびｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターの発現制御下にＤＮＡ断片が置かれるような、ＤＩＧ−１５２をコードするＤＮＡ断片のプラスミドベクターへのサブクローニングを必要とした。このようなプラスミドの一型をｐＭＹＣ２５４７と命名し、このプラスミドを有するＭＢ２１４分離株をＤｐｆ１０８と命名した。
【００８０】
シェイカーフラスコ（Shake Flask）における増殖および発現解析。 特性評価および昆虫バイオアッセイのためのＤＩＧ−１５２タンパク質の産生は、シェイカーフラスコで増殖したＰ．フルオレッセンス（P. fluorescens）株Ｄｐｆ１０８により達成した。米国特許第５５２７８８３号明細書に以前に記載された通り、Ｐｔａｃプロモーター駆動によるＤＩＧ−１５２タンパク質産生を行った。微生物学的操作の詳細は、参照により本明細書において援用するSquiresら（2004）、米国特許出願第２００６０００８８７７号明細書、米国特許出願第２００８０１９３９７４号明細書および米国特許出願第２００８００５８２６２号明細書に見出すことができる。２４時間、３０°における最初のインキュベーションを振盪しつつ行った後、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により発現を誘導した。誘導時および誘導後の様々な時点で培養物を試料採取した。６００ｎｍの光学密度（ＯＤ６００）により細胞密度を測定した。
【００８１】
シェイカーフラスコ試料の細胞分画およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 各試料採取時点において、試料の細胞密度をＯＤ６００＝２０となるよう調整し、１ｍＬアリコートを１４０００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを−８０°で凍結した。ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）細菌タンパク質抽出溶液（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、凍結したシェイカーフラスコ細胞ペレット試料から得られた可溶性および不溶性画分を作製した。各細胞ペレットを１ｍＬのＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）溶液に再懸濁し、さらに溶解バッファー中に１：４希釈し、振盪しつつ室温で３０分間インキュベートした。ライセートを１４，０００ｒｐｍで２０分間、４°にて遠心分離し、上清を可溶性画分として回収した。次に、ペレット（不溶性画分）を等容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。
【００８２】
β−メルカプトエタノールを含有する２×レムリ（Laemmli）サンプルバッファー（Sambrookら、上記参照）と１：１で試料を混合し、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ１２％ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ハーキュリーズ）にローディングする前に５分間煮沸した。推奨されるＸＴ ＭＯＰＳバッファー中で電気泳動を行った。メーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のプロトコールに従ってバイオセーフ（Bio-Safe）クーマシー染色によりゲルを染色し、Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈイメージングシステム（カリフォルニア州サンリアンドロ）を用いて撮像した。
【００８３】
封入体調製。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）によって立証されたように不溶性Ｂｔ殺虫性タンパク質を産生するＰ．フルオレッセンス（P. fluorescens）発酵由来の細胞において、ＤＩＧ−１５２タンパク質封入体（ＩＢ）調製を行った。３７°のウォーターバスにおいてＰ．フルオレッセンス（P. fluorescens）発酵ペレットを解凍した。細胞を２５％ｗ／ｖとなるよう溶解バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム塩（エチレンジアミン四酢酸）、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）；５ｍＬ／Ｌの細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル（カタログ＃Ｐ８４６５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を使用直前に添加］に再懸濁した。最低設定の手持ち式ホモジナイザー（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅａｒｏｒ、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ．、オクラホマ州バートルズビル）を用いて細胞を懸濁した。リゾチーム（Ｓｉｇｍａ Ｌ７６５１を２５ｍｇ、ニワトリ卵白製）を金属スパチュラで混合することによって細胞懸濁液に添加し、懸濁液を室温で１時間インキュベートした。懸濁液を氷上で１５分間冷却し、次にＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０（１分間セッション、５０％デューティサイクル、３０％出力を２回）を用いて超音波処理した。細胞の溶解を顕微鏡でチェックした。さらに２５ｍｇのリゾチームを必要に応じて添加し、インキュベーションおよび超音波処理を繰り返した。顕微鏡により細胞溶解を確認した後、ライセートを１１，５００×ｇで２５分間（４°）遠心分離してＩＢペレットを形成し、上清を廃棄した。ＩＢペレットを１００ｍＬの溶解バッファーに再懸濁し、上述通り手持ち式撹拌機によりホモジナイズして遠心分離した。上清が無色となり、ＩＢペレットが堅固で色がオフホワイトとなるまで、再懸濁（５０ｍＬの溶解バッファー中に）、ホモジナイズ、超音波処理および遠心分離によりＩＢペレットを繰り返し洗浄した。最後の洗浄において、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する滅菌濾過（０．２２μｍ）した蒸留水中にＩＢペレットを再懸濁し、遠心分離した。２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する滅菌濾過した蒸留水中に最後のペレットを再懸濁し、１ｍＬアリコートとして−８０°で保存した。
【００８４】
ＩＢペレットの１ｍＬアリコートを解凍し、滅菌濾過した蒸留水で１：２０希釈することによって、ＩＢ標本におけるタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析および定量化を行った。次に、希釈した試料を４×還元性サンプルバッファー［２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、４０％グリセロール（ｖ／ｖ）、０．４％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）、８％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）および８％β−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）］において煮沸し、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン、１２＋２ウエルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にローディングし、１×Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳバッファー（ＢｉｏＲａｄ）で泳動した。６０分間２００ボルトにてゲルを泳動し、続いてクーマシーブルー（４５％メタノール、１０％酢酸中の５０％Ｇ−２５０／５０％Ｒ−２５０）で染色し、蒸留水中の７％酢酸、５％メタノールで脱染した（destain）。標準曲線を作成するための同一ゲルで泳動したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準試料に対してバンドの濃度測定値を比較することによって、標的バンドの定量化を行った。
【００８５】
封入体の可溶化。 ＰｆクローンＤＰｆ１０８から得られた６ｍＬのＤＩＧ−１５２封入体懸濁液を、エッペンドルフモデル５４１５Ｃ微量遠心管（microfuge）（およそ１４，０００×ｇ）の最高設定で遠心分離し、封入物をペレット化した。保存バッファー上清を除去し、５０ｍＬコニカルチューブにおいて２５ｍＬの１００ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ１１と交換した。ピペットを用いて封入物を再懸濁し、ボルテックス攪拌して完全に混合した。穏やかな揺動プラットフォーム上にチューブを４°で一晩置き、標的タンパク質を抽出した。抽出物を３０，０００×ｇで３０分間４°にて遠心分離し、その結果得られた上清を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心分離フィルター装置（３０，０００分子量カットオフ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて５倍に濃縮した。次に、使い捨てＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、サンプルバッファーを１０ｍＭ ＣＡＰＳ［３−（シクロヘキサミノ（cyclohexamino））１−プロパンスルホン酸］ｐＨ１０に交換した。
【００８６】
封入体タンパク質の可溶化およびトリプシン活性化。 場合によっては、ＰｆクローンＤＰｆ１０８から得られたＤＩＧ−１５２封入体懸濁液を最高設定のエッペンドルフモデル５４１５Ｃ微量遠心管（およそ１４，０００×ｇ）で遠心分離して、封入物をペレット化した。保存バッファー上清を除去し、１００ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ１１と交換して、およそ５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得た。チューブを室温で３時間揺動して、タンパク質を完全に可溶化した。５％〜１０％（ｗ：ｗ、ＩＢ粉末の初期重量に基づく）に相当する量のトリプシンを添加し、一晩４°で揺動しつつインキュベーションすることにより、あるいは９０〜１２０分間室温で揺動することにより消化を達成した。１０，０００×ｇで１５分間遠心分離することにより不溶性物質を除去し、上清をＭｏｎｏＱ陰イオン交換カラム（１０ｍｍ×１０ｃｍ）にアプライした。２５カラム容量にわたる０％〜１００％１Ｍ ＮａＣｌ勾配により、活性化ＤＩＧ−１５２タンパク質を溶出した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定、下を参照）。活性化タンパク質を含有する画分をプールし、必要であれば上述通りにＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心分離フィルター装置を用いて１０ｍＬ未満に濃縮した。次に、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するバッファーにおいて、材料をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（１６ｍｍ×６０ｃｍ）に通した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、活性化（酵素により切断）タンパク質が、６５〜７０ｍＬで溶出することが決定された。活性化タンパク質を含有する画分をプールし、上述通り遠心分離濃縮器を用いて濃縮した。
【００８７】
ゲル電気泳動。 還元剤として５ｍＭ ＤＴＴを含有するＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に１：５０希釈し、９５°で４分間加熱することによって、濃縮したタンパク質標本を電気泳動用に調製した。０．２μｇから２μｇ／レーン範囲の５種のＢＳＡ標準（標準曲線作成用）と並行して、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルの２回複製したレーンに試料をローディングした。追跡用色素がゲル底辺に到達するまで、ＭＯＰＳ ＳＤＳランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２００Ｖの電圧を印加した。４５％メタノール、１０％酢酸中の０．２％クーマシーブルーＧ−２５０でゲルを染色し、先ず４５％メタノール、１０％酢酸で短時間、次にバックグラウンドが消えるまでの時間、７％酢酸、５％メタノールで脱染した。脱染後、ＢｉｏＲａｄ Ｆｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒによりゲルを走査した。この機器のＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェアｖ．４．５．２を用いて、染色されたタンパク質バンドからバックグラウンドを差し引いた量を得て、原液（stock solurion）におけるキメラＤＩＧ−１５２タンパク質濃度の算出に用いるＢＳＡ標準曲線を作成した。
【実施例３】
【００８８】
シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）において産生されたＤＩＧ−１５２タンパク質の殺虫活性
フォールアーミーワーム（ＦＡＷ、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（J.E.Smith））の幼虫およびＣｒｙ１Ｆ抵抗性ＦＡＷ（ｒＦＡＷ）の幼虫においてＤＩＧ−１５２タンパク質の殺虫活性を立証した。
【００８９】
試料調製およびバイオアッセイ。 透析またはＰＤ−１０カラム等、交換法により、封入体標本（天然の全長タンパク質またはトリプシン活性化したタンパク質）を１０ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ１０バッファーに移した。次に、１０ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ１０で試料を適切に希釈し、全バイオアッセイは、このバッファーからなる対照処理を含み、これは死亡率または成長阻害のバックグラウンドチェックとして役立てた。
【００９０】
ＢＳＡを用いたゲル電気泳動によりゲル濃度測定用の標準曲線を作成して、バイオアッセイバッファーにおけるタンパク質濃度を評価し、上述通りＢｉｏＲａｄイメージングシステムを用いて測定した。クーマシーブルーに基づく染色によりゲルマトリックスにおけるタンパク質を染色し、読み取り前に脱染した。
【００９１】
人工昆虫飼料で飼育した新生期の鱗翅目（lepidopteran）幼虫を用いて実行したバイオアッセイにおける殺虫活性に関し、精製タンパク質を試験した。民間の昆虫飼育会社（commercial insectary）（Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州カーライル）によって維持されたコロニーから得られた卵からＦＡＷの幼虫を孵化した。非売（non-commercial）のコロニー（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、インディアナ州インディアナポリス）から収集した卵からｒＦＡＷの幼虫を孵化した。
【００９２】
昆虫バイオアッセイ用に特別に設計された１２８ウエルプラスチックトレイにおいて（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニュージャージー州ピットマン）バイオアッセイを行った。各ウエルには、１．０ｍＬの複数種鱗翅目（Lepidoptera）用飼料（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、アーカンソー州レイクビレッジ）が入れられた。各ウエルの飼料表面１．５ｃｍ２上に４０μＬのタンパク質試料アリコートをピペットで移した（すなわち２６．７μＬ／ｃｍ２）。ウエルの表面面積１平方センチメートル当りのＤＩＧ−１５２タンパク質の量（ｎｇ）として飼料濃度を算出した。飼料表面上の液体が蒸発する、あるいは飼料中に吸収されるまで、処理したトレイをドラフト内に保持した。
【００９３】
孵化（eclosion）の数時間以内に、湿らせたラクダの毛のブラシで個々の幼虫を持ち上げ、処理した飼料上にウエル当り幼虫一匹を置いた。次に、ガス交換できるよう通気した透明プラスチックの粘着シート（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で虫の入ったウエルを密封した。管理された環境条件下［２８°、およそ４０％相対湿度（ＲＨ）、１６時間：８時間（明：暗）］でバイオアッセイトレイを５日間保持し、その後、各タンパク質試料に曝露された昆虫全数、死んだ昆虫の数および生存昆虫の重量を記録した。処理毎にパーセント死亡率およびパーセント成長阻害を算出した。次の通りパーセント成長阻害（ＧＩ）を算出した：
％ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］×１００
（式中、ＴＷＩＴは処理における昆虫総重量（Total Weight of Insects in the Treatment）であり、
ＴＮＩＴは処理における昆虫全数（Total Number of Insects in the Treatment）であり、
ＴＷＩＢＣはバックグラウンドチェック（バッファー対照）における昆虫総重量（Total Weight of Insects in the Background Check）であり、
ＴＮＩＢＣはバックグラウンドチェック（バッファー対照）における昆虫全数（Total Number of Insects in the Background Check）である）
【００９４】
ＧＩ５０を、％ＧＩ値が５０である飼料中のキメラＤＩＧ−１５２タンパク質濃度として決定した。ＬＣ５０（５０％致死濃度）を、試験昆虫の５０％が死滅した飼料中のＤＩＧ−１５２タンパク質の濃度として記録した。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ、ノースカロライナ州ケーリー）を用いて統計解析（一元配置分散分析（One-way ANOVA））を行った。
【００９５】
表２は、フォールアーミーワーム昆虫幼虫におけるＤＩＧ−１５２タンパク質の摂取バイオアッセイの結果を提示する。
【００９６】
【表２】
【００９７】
本発明のＤＩＧ−１５２タンパク質の特色は、ＤＩＧ−１５２タンパク質の摂取後にフォールアーミーワーム（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））新生期幼虫の成長が阻害されることである。さらに、Ｃｒｙ１Ｆａによる中毒症に対し抵抗性を有するフォールアーミーワーム幼虫は、ＤＩＧ−１５２活性に対し野生型フォールアーミーワーム幼虫と同様の感受性を有する。これらＣｒｙ１Ｆａ抵抗性昆虫のＣｒｙ１Ｃａに対する感受性の意義は、上により詳細に記載されている。
【実施例４】
【００９８】
ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードするメイズコドン最適化配列の設計
植物分子生物学分野の当業者であれば、複数のＤＮＡ配列が、単一のアミノ酸配列をコードするよう設計できることを理解するであろう。対象タンパク質のコード領域の発現を増加させる一般的な手段は、そのコドン組成が、遺伝子を発現させる予定の宿主の全体的なコドン組成と類似するような仕方でコード領域を仕立てることである。合成遺伝子の設計および産生に関する指針は、例えば、国際公開第１９９７／１３４０２号パンフレットおよび米国特許第５３８０８３１号明細書に見出すことができる。
【００９９】
トランスジェニック単子葉植物においてＤＩＧ−１０９キメラ殺虫性タンパク質を産生するよう、メイズコドンバイアスを有するＤＮＡ配列を設計して合成した。ＧｅｎＢａｎｋ（ワールドワイドウェブ：ncbi.nlm.nih.gov）に寄託された配列から得た７０６種のタンパク質コード配列から、メイズ（Zea mays L.）のコドン使用表（codon usage table）を算出した。該アミノ酸の全コドン使用の約１０％未満を用いた重複性コドンを全て省略した後、加重平均メイズコドンセットを算出した。次式を用いて各コドンの加重平均表示を算出した：
Ｃ１の加重平均％＝１／（％Ｃ１＋％Ｃ２＋％Ｃ３＋その他）×％Ｃ１×１００
（式中、Ｃ１は問題のコドンであり、％Ｃ２、％Ｃ３、その他は、残りの同義コドンの平均％使用値を表す）
【０１００】
配列番号２の１１６４アミノ酸ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードするメイズコドン最適化ＤＮＡ配列を得るため、その結果得られるＤＮＡ配列が、メイズ最適化コドンバイアス表の全体的なコドン組成を有するように、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素セグメントをコードする天然のｃｒｙ１Ｃａ ＤＮＡ配列に対してコドン置換を行った。同様の様式において、その結果生じるＤＮＡ配列が、メイズに最適化したコドンバイアス表の全体的なコドン組成を有するように、Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードする天然のｃｒｙ１Ａｂ ＤＮＡ配列に対してコドン置換を行った。植物細胞においてコード領域のＲＮＡ安定性、転写または翻訳に干渉し得る望ましくない制限酵素認識部位、潜在的な植物イントロンスプライス部位、Ａ／ＴまたはＣ／Ｇ残基の長い配列（long run）および他のモチーフを排除するよう、配列に対するさらなる緻密化を行った。所望の制限酵素認識部位を導入するよう、また長い内部オープンリーディングフレーム（＋１以外のフレーム）を排除するよう、他の変更を行った。およそのところメイズに偏向したコドン組成（maize-biased codon composition）を保持する制約下で、これらの変更を全て行った。完全メイズコドン最適化配列（ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする）を配列番号３として開示する。民間業者（ＤＮＡ２．０、カリフォルニア州メンロパーク）によりＤＮＡ断片の合成を行った。
【実施例５】
【０１０１】
ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする植物発現可能遺伝子を含有する植物形質転換ベクターの構築
アグロバクテリウム（Agrobacterium）スーパーバイナリーシステム（日本たばこ産業、日本、東京）は、単子葉植物宿主の形質転換に簡便に用いられる。スーパーバイナリーシステムは、多重クローニング部位によって隔てられた右側Ｔ−ＤＮＡ境界反復（ＲＢ）および左側Ｔ−ＤＮＡ境界反復（ＬＢ）の配列を含有するｐＳＢ１１シャトルベクタープラスミドを利用する。標準ＤＮＡクローニング法によりｐＳＢ１１の派生体（ｐＤＡＢ７６９１という）を調製した。プラスミドｐＤＡＢ７６９１は、メイズユビキチン１プロモーターと関連イントロン１（米国特許第５５１０４７４号明細書）およびメイズＰｅｒ５ ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）（米国特許第７１７９９０２号明細書）による転写調節下において、メイズに最適化したＤＩＧ−１０９コード配列（ＣＤＳ；すなわち、配列番号３）を含有する。さらに、ｐＤＡＢ７６９１は、イネアクチン１プロモーターと関連イントロン１（米国特許第５６４１８７６号明細書）およびメイズリパーゼ３’ＵＴＲ（米国特許第７１７９９０２号明細書）による転写調節下において、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＤＳＭ２ ＣＤＳ（国際公開第２００８／０７０８４５（Ａ２）号パンフレット）を含む植物選択可能マーカー遺伝子を含有する。ｐＤＡＢ７６９１ Ｔ−領域の構成要素の物理的配置を次に簡便に例示する：
ＲＢ＞メイズＵｂｉ１プロモーター：ＤＩＧ−１０９ ＣＤＳ：メイズＰｅｒ５ ３’ＵＴＲ＞イネＡｃｔ１プロモーター：ＤＳＭ２ ＣＤＳ：メイズＬｉｐ ３’ＵＴＲ＞ＬＢ
【０１０２】
標準ＤＮＡクローニング法によりｐＳＢ１１の第二の派生体（ｐＤＡＢ１００２７６という）を調製した。プラスミドｐＤＡＢ１００２７６は、メイズユビキチン１プロモーターと関連イントロン１およびメイズＰｅｒ５ ３’ＵＴＲによる転写調節下において、メイズに最適化したＤＩＧ−１０９コード配列（ＣＤＳ；すなわち、配列番号３）を含有する。さらに、ｐＤＡＢ１００２７６は、メイズユビキチン１プロモーターと関連イントロン１およびメイズリパーゼ３’ＵＴＲによる転写調節下において、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＡＡＤ１ ＣＤＳ（米国特許出願第２００９００９３３６６号明細書）を含む植物選択可能マーカー遺伝子を含有する。ｐＤＡＢ１００２７６ Ｔ−領域の構成要素の物理的配置を次に簡便に例示する：
ＲＢ＞メイズＵｂｉ１プロモーター：ＤＩＧ−１０９ ＣＤＳ：メイズ Ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲ＞メイズＵｂｉ１プロモーター：ＡＡＤ−１ ＣＤＳ：メイズＬｉｐ ３’ＵＴＲ＞ＬＢ
【０１０３】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換の準備を行うため、プラスミドｐＤＡＢ７６９１またはプラスミドｐＤＡＢ１００２７６を有する大腸菌（Escherichia coli）クローニング株ＤＨ５αの細胞を、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天培地（ｇ／Ｌ：Ｂａｃｔｏトリプトン、１０；Ｂａｃｔｏ酵母エキス、５；ＮａＣｌ、１０；寒天、１５）上に３７°で一晩増殖させた。接合動員（conjugal mobilizing）プラスミドｐＲＫ２０１３を含有する株ＤＨ５α細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天上に増殖させた。インキュベーション後、プレートを４°に置き、プラスミドｐＳＢ１を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＬＢＡ４４０４の準備が整うのを待った。
【実施例６】
【０１０４】
スーパーバイナリーベクター作製のためのアグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換
プラスミドｐＳＢ１を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＬＢＡ４４０４を利用するアグロバクテリウム（Agrobacterium）スーパーバイナリーシステムは、単子葉植物宿主の形質転換に簡便に用いられる。スーパーバイナリーベクターを構築し検証するための手順は、ｐＳＢ１の操作マニュアル（日本たばこ産業）に記載されている通り十分に確立されている。標準微生物学的および分子生物学的方法を用いて、プラスミドｐＳＢ１およびｐＤＡＢ７６９１を含む同時組み込み体（cointegrant）プラスミドであるスーパーバイナリープラスミドｐＤＡＳ５１６２ならびにプラスミドｐＳＢ１およびｐＤＡＢ１００２７６を含む同時組み込み体プラスミドであるスーパーバイナリープラスミドｐＤＡＳ５８４８を作製し検証した。
【実施例７】
【０１０５】
メイズ植物におけるＤＩＧ−１０９タンパク質の産生
アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介したメイズの形質転換。 ９５％Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ３６０無土壌成長培地（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、ワシントン州ベルビュー）および５％埴壌土（clay/loam soil）の混合物の入った５ガロンポットに、Ｈｉ−ＩＩ Ｆ１交雑種（Armstrongら、1991）から得た種子を播いた。高圧ナトリウムおよびメタルハライドランプの組み合わせを用いた１６時間明期：８時間暗期の光周期の温室で植物を育成した。管理された同胞受粉（sib-pollination）を行って、形質転換用の未成熟Ｆ２胚を得た。受粉およそ８〜１０日後、未成熟胚が１．０ｍｍ〜２．０ｍｍの間のサイズになったときにメイズ雌穂を収集した。
【０１０６】
感染および共培養。 メイズ雌穂の外皮を剥き（dehusk）、液体石鹸でこすり洗い、２０％の市販漂白剤（５％次亜塩素酸ナトリウム含）に約２０分間浸漬し、続いて滅菌水で３回リンスすることによって表面殺菌した。ループ１または２掻きの細菌［１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、１０ｍｇ／Ｌテトラサイクリンおよび２５０ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを含有するＹＥＰ固体培地（ｇ／Ｌ：Ｂａｃｔｏ酵母エキス、１０；Ｂａｃｔｏペプトン、１０；ＮａＣｌ、５；寒天、１５）上で２〜３日間２８°で増殖］を、１００μＭアセトシリンゴンを含有する液体感染培地［ＬＳ基本培地（Linsmaier and Skoog、1965）、Ｎ６ビタミン（Chuら、1975）、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、６８．５ｇ／Ｌショ糖、３６．０ｇ／Ｌグルコース、６ｍＭ Ｌ−プロリン、ｐＨ５．２］５ｍＬに移すことにより、ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする遺伝子およびＤＳＭ２植物選択可能マーカー遺伝子を含有するスーパーバイナリーベクターであるｐＤＡＳ５１６２を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）細胞の懸濁液を調製した。
【０１０７】
あるいは、上述通りに増殖させたループ１または２掻きの細菌を、１００〜２００μＭアセトシリンゴンを含有する液体感染培地５ｍＬに移すことにより、ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードする遺伝子およびＡＡＤ−１植物選択可能マーカー遺伝子を有するスーパーバイナリーベクターであるｐＤＡＳ５８４８を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）細胞の懸濁液を調製した。
【０１０８】
いずれの場合においても、均一な懸濁液が得られるまで溶液をボルテックス攪拌し、紫色フィルターによるＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計を用いて最終密度が２００Ｋｌｅｔｔ単位になるよう（ｐＤＡＳ５１６２形質転換用）、あるいは５５０ｎｍにおいて１．２の光学密度になるよう（ｐＤＡＳ５８４８形質転換用）濃度を調整した。２ｍＬの感染培地の入った微量遠心チューブ内に未成熟胚を直接単離した。培地を除去し、１ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液と交換し、アグロバクテリウム（Agrobacterium）／胚溶液を５〜１０分間室温でインキュベートした。次に、１００μＭアセトシリンゴンを含有する（ｐＤＡＳ５１６２形質転換体用）、あるいは１００〜２００μＭアセトシリンゴンを含有する（ｐＤＡＳ５８４８形質転換体用）共培養培地［ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０．０ｇ／Ｌショ糖、６ｍＭ Ｌ−プロリン、０．８５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３、２．８ｇ／Ｌジェランガム（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カンザス州レネックサ）、ｐＨ５．８］へと胚を移し、３〜４日間２０°暗所で共培養した。
【０１０９】
共培養後、ＭＳ塩およびビタミン、６ｍＭ Ｌ−プロリン、１００ｍｇ／Ｌミオイノシトール、５００ｍｇ／Ｌ ＭＥＳ、３０ｇ／Ｌショ糖、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、０．８５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮ０３、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシム、２．８ｇ／Ｌジェランガム、ｐＨ５．８を含有する静置（resting）培地に胚を移した。およそ７日後、３ｍｇ／Ｌビアラホス（ｐＤＡＳ５１６２形質転換体用）を補給したあるいは１００ｎＭハロキシホップを補給した（ｐＤＡＳ５８４８形質転換体用）（選択培地）同じ培地へと胚を移した。およそ８週間後に形質転換した分離株を同定し、再生および解析のため、２週間間隔で新鮮な選択培地へと移すことによって大きく増やした。
【０１１０】
再生および種子生産。 再生のため、３ｍｇ／Ｌビアラホスを補給した（ｐＤＡＳ５１６２形質転換体用）あるいは１００ｎＭハロキシホップを補給した（ｐＤＡＳ５８４８形質転換体用）「２８」誘導培地（ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／Ｌショ糖、５ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシム、２．５ｇ／Ｌジェランガム、ｐＨ５．７）へと培養物を移した。インキュベーションを微光条件（１４μＥｍ−２ｓ−１）下で１週間、続いて強光条件（およそ８９μＥｍ−２ｓ−１）下で１週間行った。その後「３６」再生培地（植物成長調節物質を欠く以外は誘導培地と同一）へと組織を移した。小植物は、丈が３〜５ｃｍになったときにＳＨＧＡ培地［（Schenk and Hildebrandt (1972) salts and vitamins; PhytoTechnologies Labr.）、１．０ｇ／Ｌミオイノシトール、１０ｇ／Ｌショ糖および２．０ｇ／Ｌジェランガム、ｐＨ５．８］を含有するガラス培養管へと移し、シュートおよび根をさらに成長および発達させた。植物を先に記載したものと同じ土壌混合物に移植し、温室内で開花するまで育成した。種子生産のための管理された受粉を行った。
【０１１１】
メイズ形質転換分野の当業者であれば、他の植物発現可能選択可能マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を用いる場合、メイズ形質転換および形質転換植物の選択のために他の方法を利用できることを理解するであろう。
【実施例８】
【０１１２】
ＤＩＧ−１０９タンパク質を産生するメイズ植物の生化学的解析および昆虫バイオアッセイ
トランスジェニックメイズ植物におけるＤＩＧ−１０９タンパク質の産生を、若い植物体（Ｔ０世代）の葉から抽出したタンパク質において調査した。ディープウエル９６クラスターチューブボックス（Ｃｏｓｔａｒ Ｃａｔ＃３９５７）の試料チューブ内に直径６ｍｍのメイズリーフディスクを２枚置き、解析の日まで−８０°で凍結した。解析時に、２個の４．５ｍｍ亜鉛コーティングしたＤａｉｓｙ（商標）ＢＢを、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水；Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ＃ＢＰ６６５−１）プラス０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０から構成される２００μＬの抽出バッファーと共に各（凍結）チューブに加えた。各チューブの蓋をし、ボックスを最大設定のビーズミル（Ｋｌｅｃｏ（商標）４−９６粉砕機；Ｇａｒｃｉａ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、カリフォルニア州バイセリア）内に３分間置いた。微粉砕した試料を５分間、２，５００×ｇで遠心分離し、可溶性タンパク質を含有する上清をイムノアッセイに用いた。
【０１１３】
抽出したメイズ葉タンパク質のイムノブロット解析は、ＤＩＧ１５２ＲＰＣ１ポリクローナル抗体（トリプシン活性化Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質で免疫化したウサギから調製）が、非トランスジェニック植物体の葉から抽出されたタンパク質と交差反応しないことを明らかにした。ｐＤＡＳ５１６２で形質転換した植物の抽出物において、ＤＩＧ１５２ＰＲＣ１抗体により数個のタンパク質種が検出された。
【０１１４】
ｐＤＡＳ５１６２による形質転換によってメイズに導入された導入遺伝子は、全長ＤＩＧ−１０９タンパク質をコードするが、メイズ細胞内のタンパク質分解活性により、新生タンパク質が、大量の安定的でより小さい分子量の分子種にプロセシングされることは明らかである。
【０１１５】
フォールアーミーワーム（ＦＡＷ、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（J.E. Smith））の新生期幼虫およびＣｒｙ１Ｆ抵抗性ＦＡＷ（ｒＦＡＷ）幼虫を用いて、ｐＤＡＳ５１６２構築物で形質転換し、独立的に単離したトランスジェニックメイズ植物体から収集した葉の昆虫毒性をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。民間の昆虫飼育会社（Ｂｅｎｚｏｎ）からＦＡＷ卵を入手し、ｒＦＡＷ卵は、非売の集団（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）から得た。植物体を実験室から温室に移植してからおよそ２週間後に、温室で育成したＴ０植物体から葉セグメント試料を昆虫バイオアッセイ用に採取した。各植物体から２枚の葉片（それぞれおよそ１平方インチ）を、３２ウエルトレイ（ＣＤ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の別個のウエルの約３ｍＬの凝固した２％寒天の上に置いた。複数種鱗翅目（lepidopteran）用飼料（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）上で卵を孵化し、２４時間齢未満のときに新生期の幼虫を選択した。ラクダの毛の絵筆を用いて葉セグメント当りおよそ１０匹の幼虫を各ウエル内に慎重に置いた。虫の入ったトレイをトレイ付属の穿孔処理した蓋で密封し、続いて２８°、４０％ＲＨ、１６時間明期：８時間暗期で３日間保持した。試験の終わりに各葉片のパーセント損傷（％ＤＡＭ）を記録した。損傷評点を平均化し、どの植物体において各種試験昆虫による損傷が最も少ないかの決定に用いた。全昆虫に対し、試験を数回複製して行った。
【０１１６】
ＪＭＰ統計ソフトウェア（ＳＡＳ、ノースカロライナ州ケーリー）を用いて昆虫の種類毎の各植物体の％ＤＡＭスコアを平均化し、データを解析した。「ＸによるＹの適合」モデルを一元配置分散分析解析に用いた。必要に応じてテューキー・クレーマー平均離隔（means separation）を用いて、処理毎の平均％ＤＡＭスコア間の有意差を解析した。ほぼ同齢の対照植物から得られた％ＤＡＭスコアとの比較を行った。Ｃｒｙ１Ｆａ Ｂ．ｔ．毒素を生成する市販のＨｅｒｃｕｌｅｘ Ｉ（商標）ハイブリッドの種子から陽性対照植物を育成した。陰性対照（すなわち非形質転換植物）をＨｉ ＩＩおよびＢ１０４系統ならびにＨｅｒｃｕｌｅｘ Ｉ（商標）Ｉｓｏｌｉｎｅ（Ｈｅｒｃｕｌｅｘ Ｉ（商標）ハイブリッドの非Ｃｒｙ含有親）によって表した。
【０１１７】
図１は、このような昆虫バイオアッセイ試験において得られた結果をまとめる。トランスジェニック葉におけるＤＩＧ−１０９産生と％ＤＡＭ評点との間に正の相関があるということは、驚くべき知見である。ＦＡＷに関し、Ｆ＝３５．３；ｄ．ｆ．＝１，３３；Ｐ＜０．０００１；ｒ２＝０．５２であり、ｒＦＡＷに関し、Ｆ＝２５．３；ｄ．ｆ．＝１，３３；Ｐ＜０．０００１；ｒ２＝０．４３である。Ｃｒｙ１Ｆａ Ｂ．ｔ．毒素による中毒症に対し抵抗性を有するフォールアーミーワーム幼虫であっても、ＤＩＧ−１０９ Ｂ．ｔ．毒素により摂食抑制されることは、さらに驚くべき新しい知見である。
【０１１８】
メイズの他の害虫を同様の様式で試験できることが理解できる。これらの有害生物として、アグロミザ・パルビコルニス（Agromyza parvicornis）（コーンブロットリーフマイナー（corn blot leafminer））、アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）（タマナヤガ（black cutworm））、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）（ベルベットビーンキャタピラー（velvetbean caterpillar））、ジアトレア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）（サウスウェスタンコーンボーラー（southwestern corn borer））、ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）（シュガーケーンボーラー）、モロコシマダラメイガ（Elasmopalpus lignosellus）（レサーコーンストークボーラー（lesser cornstalk borer））、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（コーンイヤーワーム（corn earworm））、ニセアメリカタバコガ（Heliothis virescens）（タバコバドワーム）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（ユーロピアンコーンボーラー）、Ｃｒｙ１Ｆ抵抗性Ｏ．ヌビラリス（O. nubilalis）、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）（コナガ（diamondback moth））、Ｃｒｙ１−抵抗性Ｐ．キシロステラ（P. xylostella）、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）（ビートアワヨトウ（beet armyworm））およびイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）（キャベツルーパー（cabbage looper））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
ｐＤＡＳ５８４８で形質転換したトランスジェニックメイズ植物（Ｔ０世代）も昆虫バイオアッセイおよび免疫解析により調査した。市販のＣｒｙ１Ｃ ＥＬＩＳＡ検出キット（Ｅｎｖｉｒｏｌｏｇｉｘ（商標）、マサチューセッツ州ポートランド；Ｃａｔ＃ＡＰ００７）を用いて葉抽出物におけるＤＩＧ−１０９タンパク質量を定量化し、検出されたＤＩＧ−１０９タンパク質レベルを百万分の一（ｐｐｍ；１ｐｐｍは、抽出物における全可溶性タンパク質１ｍｇ当り１ｎｇのＤＩＧ−１０９タンパク質を表す）として表示した。
【０１２０】
ＦＡＷおよびｒＦＡＷによる食害を次の通り分類する。０＝損傷なしまたは針穴状の摂食マーク数個、１＝２５％〜５０％の葉が食害、２＝葉の大部分が消費または葉は残されていない。保護された植物は、損傷スコアが０．６７以下の植物である。
【０１２１】
表３におけるデータは、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイにおいて、Ｔ０植物におけるＥＬＩＳＡにより検出されたＤＩＧ−１０９タンパク質種の存在とフォールアーミーワーム幼虫によって行われる食害の制御との間に正の相関があることを示す。最高検出レベルのＤＩＧ−１０９タンパク質を有する植物（植物体５８４８−００５．４）は、最低値の葉食害スコアを有した。１９０〜２３０ｐｐｍの範囲のより低レベルの検出可能ＤＩＧ−１０９タンパク質を有する植物体から得られた葉も、平均損傷スコア１．７および１．８を有する陰性対照植物（すなわち、非形質転換対照Ｂ１０４およびＨｉ ＩＩ）から得られた葉に観察されるものよりも食害が少なかった。調査した全ｐＤＡＳ５８４８葉において、検出された主要なＤＩＧ−１０９タンパク質種は、およそのサイズが６０ｋＤａおよび５５ｋＤａのペプチドダブレットを含んでいた。
【０１２２】
【表３】
【０１２３】
よって、本発明の特色は、ＤＩＧ−１０９タンパク質がメイズ植物において産生されると、植物にフォールアーミーワーム幼虫およびＣｒｙ１Ｆ抵抗性フォールアーミーワーム幼虫による食害に対する抵抗性を付与することである。
【実施例９】
【０１２４】
スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）の単離された刷子縁膜小胞を用いたＣｒｙ１ＦａおよびＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質の競合的結合実験
次の実施例は、昆虫腸組織における推定受容体に対するＣｒｙ１コア毒素タンパク質の競合結合を評価する。１２５Ｉ標識したＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質が、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（フォールアーミーワーム）から調製した刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）と高い親和性で結合すること、および、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、この結合と競合しないことが示される。
【０１２５】
Ｃｒｙタンパク質の精製。 実施例２に記載されている通り、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）発現株においてＣｒｙ１Ｃａコア毒素およびＣｒｙ１Ａｂプロトキシンを含むキメラタンパク質をコードする遺伝子を発現させた。同様の様式において、ＰｆシステムにおいてＣｒｙ１Ｆａコア毒素（６０３アミノ酸）およびＣｒｙ１Ａｂプロトキシン（５４５アミノ酸）を含むキメラタンパク質をコードする遺伝子を発現させた。実施例２の方法によりタンパク質を精製し、全長タンパク質から活性化コア毒素を生成するためのトリプシン消化を行い、実施例２の方法により生成物を精製した。トリプシンによりプロセシングされた（活性化コア毒素）タンパク質の標本は、＞９５％純度であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより実験的に決定した通りおよそ６５ｋＤａの分子量を有していた。
【０１２６】
例えば、Sambrookら（1989）およびAusubelら（1995）ならびにそれらの最新情報に教示されている通り、タンパク質定量化およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の標準方法を用いた。
【０１２７】
可溶化ＢＢＭＶの調製および分画。 終齢スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）幼虫を一晩絶食させ、続いて氷上で１５分間冷やした後に解剖した。外皮に付着した後腸を後に残し、中腸組織を体腔から取り出した。サプライヤーの推奨通りに希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ−２７１４）を補給した９×容量の氷冷ホモジナイズバッファー（３００ｍＭマンニトール、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１７ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ７．５）中に中腸を置いた。ガラス組織ホモジナイザーを１５往復して組織をホモジナイズした。Wolfersberger（1993）のＭｇＣｌ２沈殿法によりＢＢＭＶを調製した。すなわち、等容量の３００ｍＭマンニトール中の２４ｍＭ ＭｇＣｌ２溶液を中腸ホモジネートと混合し、５分間攪拌し、氷上に１５分間静置した。溶液を２，５００×ｇで１５分間、４°にて遠心分離した。上清を取り分け、ペレットを元の容量の０．５×希釈したホモジナイズバッファーに懸濁し、再度遠心分離した。２種の上清を組み合わせ、２７，０００×ｇで３０分間、４°にて遠心分離してＢＢＭＶ画分を生成した。タンパク質濃度が約３ｍｇ／ｍＬとなるようペレットをＢＢＭＶ保存バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）に懸濁した。標準物質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてタンパク質濃度を決定した。試料の凍結前に、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商標）ＤＡＬＰ−２５０アルカリホスファターゼアッセイキット（Ｇｅｎｔａｕｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ベルギー、カンペンホウト）を用い、メーカーの説明書に従ってアルカリホスファターゼ決定（ＢＢＭＶ画分のマーカー酵素）を行った。この酵素の特異的活性は、通常、出発時の中腸ホモジネート画分に見られるものと比べて７倍増加した。ＢＢＭＶを２５０μＬ試料にアリコート分注し、液体窒素中で瞬時に凍結し、−８０°で保存した。
【０１２８】
電気泳動。 還元性（すなわち、５％β−メルカプトエタノール、ＢＭＥ中）かつ変性（すなわち、２％ＳＤＳの存在下５分間９０°で加熱）条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の解析を行った。４％〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ；カリフォルニア州ハーキュリーズ）のウエルにタンパク質をローディングし、２００ボルト、６０分間で分離した。クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ＢｉｏＲａｄ）で１時間染色することによりタンパク質バンドを検出し、７％酢酸中の５％メタノール溶液で脱染した。ＢｉｏＲａｄ Ｆｌｕｒｏ−Ｓ Ｍｕｌｔｉ Ｉｍａｇｅｒ（商標）を用いてゲルを撮像して（image）、解析した。ゲルの１ウエルにローディングしたＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）タンパク質ラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）試料において観察される公知の分子量のタンパク質の移動度と比較することにより、タンパク質バンドの相対分子量を決定した。
【０１２９】
Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質のヨウ素化。 精製したＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅヨウ素化ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）を用いてヨウ素化した。すなわち、２種のヨウ素化ビーズを５００μＬのＰＢＳ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で２回洗浄し、１００μＬのＰＢＳと共に１．５ｍＬ遠心分離チューブ内に入れた。０．５ｍＣｉの１２５Ｉ標識したヨウ化ナトリウムを添加し、成分を５分間、室温で反応させ、続いて１μｇのＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質を溶液に添加し、さらに３〜５分間反応させた。溶液をヨウ素化ビーズからピペットで採取し、５０ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０、１ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび５％グリセロールで平衡化したＺｅｂａ（商標）スピンカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にアプライすることにより反応を終結した。ヨウ素化ビーズを１０μＬのＰＢＳで２回洗浄し、洗浄溶液もＺｅｂａ（商標）脱塩カラムにアプライした。１，０００×ｇで２分間遠心分離することにより、スピンカラムを通して放射性溶液を溶出した。次に１２５Ｉ放射標識したＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質を、５０ｍＭ ＣＡＰＳ、ｐＨ１０．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび５％グリセロールに対して透析した。
【０１３０】
イメージング。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびホスホロイメージング（phosphorimaging）により、ヨウ素化Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質の放射性純度を決定した。すなわち、ＢｉｏＲａｄゲル乾燥装置を用いて、メーカーの説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを乾燥させた。ゲルをＭｙｌａｒフィルム（１２μｍ厚）にラップし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓストレージホスホロスクリーン（storage phosphor screen）（３５ｃｍ×４３ｃｍ）に１時間曝露することにより、乾燥ゲルを撮像した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ８２０ホスホロイメージャー（phosphorimager）を用いてプレートを現像し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ソフトウェアを用いて画像を解析した。
【実施例１０】
【０１３１】
１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１コア毒素タンパク質とスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）由来のＢＢＭＶとの結合
１２５Ｉ放射標識Ｃｒｙ１Ａｃコア毒素タンパク質を用いて飽和曲線を作成し、Ｃｒｙ１ＣａおよびＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質による結合アッセイにおいて用いるためのＢＢＭＶタンパク質の最適量を決定した。０．５ｎＭの１２５Ｉ放射標識Ｃｒｙ１Ａｃコア毒素タンパク質を結合バッファー（８ｍＭ ＮａＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中で１時間２８°で、０μｇ／ｍＬから５００μｇ／ｍＬ（総容量０．５ｍＬ）範囲のＢＢＭＶタンパク質量とインキュベートした。１５０μＬの反応混合物を３重で別個の１．５ｍＬ遠心分離チューブに試料採取し、試料を１４，０００×ｇで８分間、室温にて遠心分離することにより、ＢＢＭＶタンパク質と結合した１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ａｃコア毒素タンパク質を非結合画分から分離した。上清を穏やかに除去し、ペレットを氷冷した結合バッファーで３回洗浄した。ペレットを含有する遠心分離チューブの底を切り取り、１３×７５ｍｍガラス培養チューブ内に置き、試料をそれぞれガンマカウンターにおいて５分間計数した。得られたＣＰＭ（１分間当りの計数）マイナスバックグラウンドＣＰＭ（ＢＢＭＶタンパク質なしの反応）をＢＢＭＶタンパク質濃度に対してプロットした。同様に他の結果に応じて、結合アッセイにおいて用いるためのＢＢＭＶタンパク質の最適濃度を１５０μｇ／ｍＬと決定した。
【実施例１１】
【０１３２】
コア毒素タンパク質Ｃｒｙ１ＣａおよびＣｒｙ１Ｆａを用いたＳ．フルギペルダ（S. frugiperda）由来ＢＢＭＶとの競合的結合アッセイ
１５０μｇ／ｍＬ ＢＢＭＶタンパク質および０．５ｎＭの１２５Ｉ放射標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質を用いて、相同および異種競合結合アッセイを行った。反応混合物に添加した競合的非放射標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の濃度、０．０４５ｎＭから１０００ｎＭ範囲を、放射性Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質と同時に添加し、真の結合競合を確定した。インキュベーションを１時間２８°で行い、ＢＢＭＶと結合（特異的結合）した１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質量を上の記載通りに測定した。非特異的結合は、１，０００ｎＭの非放射標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質の存在下において得られた計数によって表される。１００パーセントの合計結合は、競合相手であるＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が全く存在しない場合の結合の量であると考えられた。
【０１３３】
１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質を用いた受容体結合アッセイは、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、この放射標識リガンドをそのＳ．フルギペルダ（S. frugiperda）由来ＢＢＭＶにおける結合部位から置き換える能力を決定した。結果（図２）は、３００ｎＭ（放射性結合リガンドの濃度の６００倍）もの高濃度のＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、結合した１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質をその受容体タンパク質（複数可）から置き換えないことを示す。予想通り、非標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質は、放射標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質をその結合タンパク質（複数可）から置き換えることができ、５ｎＭで５０％の置き代わりが起こるＳ字形用量反応曲線を示す。
【０１３４】
よって、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質が、Ｓ．フルギペルダ（S. frugiperda）ＢＢＭＶにおけるＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質と結合しない結合部位と相互作用することが示唆される。
【０１３５】
図２を参照されたし。Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素および１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素による、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）ＢＢＭＶとの結合に関する競合。
【実施例１２】
【０１３６】
Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質およびビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質のジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）ＢＢＭＶに対する競合的結合
次の実施例は、Ｃｒｙ１コア毒素タンパク質と昆虫腸組織における推定受容体との競合結合を評価する。ビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、ジアトラエア・サッカラリス（Diatraea saccharalis）（シュガーケーンボーラー）から調製される刷子縁膜小胞（ＢＢＭＶ）と高親和性で結合すること、および、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質が、この結合と競合しないことが示される。
【０１３７】
可溶化ＢＢＭＶの調製および分画。 終齢Ｄ．サッカラリス（D. saccharalis）幼虫を一晩絶食させ、続いて氷上で１５分間冷やした後に解剖した。実施例１０に開示されている方法に従ってＢＢＭＶ標本を作製した。
【０１３８】
Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質のヨウ素化は、昆虫摂食バイオアッセイにおいてタンパク質を不活性化するため、１２５Ｉ標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を用いた競合結合アッセイの結果は、生物学的関連性が限定的となる可能性がある。対照的に、ビオチン化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質は、昆虫に対するその毒性を保持することが見出された。さらに、非ビオチン化（競合）Ｃｒｙコア毒素タンパク質の存在下における、この（ビオチン化）タンパク質と受容体との相互作用を測定することが可能である。このような競合実験は、ＢＢＭＶタンパク質を電気泳動し、試料全体をＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオライド）膜に転写した後に、ビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質と、Ｄ．サッカラリス（D. saccharalis）ＢＢＭＶにおける受容体との結合を検出することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたアビジンを増強化学発光試薬と組み合わせて用いて、ビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を視覚化した。
【０１３９】
Ｐｉｅｒｃｅ ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質をビオチンで標識した。すなわち、４０μＬのスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（１０ｍｇ／ｍＬジメチルスルホキシド）を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．２中のＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質（２．０ｍｇ／ｍＬ）５００μＬに添加した。反応液を４°で一晩インキュベートし、続いてＺｅｂａ（商標）脱塩カラムを用いて未反応のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを除去した。Ｐｉｅｒｃｅ ＨＡＢＡ−アビジン置き換えアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をメーカーの記載通りに用いて、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質へのビオチン取り込みを測定した。
【０１４０】
５００倍過剰の非標識Ｃｒｙ１ＦａまたはＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質の存在下または不在下において、ビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質（２．５ｎＭ）をＤ．サッカラリス（D. saccharalis）から調製した０．２ｍｇのＢＢＭＶと［総容量１．０ｍＬ］１時間２８°でインキュベートした。１６，０００×ｇ、１０分間の遠心分離により非結合ビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を除去し、その結果得られたペレットを氷冷した結合バッファーで３回洗浄した。ペレットを１５μＬの４×レムリサンプルバッファーに懸濁し、ボルテックス攪拌し、超音波処理して完全可溶化を確実にし、９０°で３分間加熱した。全試料を４％〜２０％Ｔｒｉｓグリシンゲルにローディングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、サプライヤーの説明書（ＢｉｏＲａｄ）が推奨する通りにＰＶＤＦ膜上に電気的に転写した。１，０００ｎｇのＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質およびＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質も、陰性対照としてゲルで泳動した。１：１５，０００希釈したアビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼと、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ溶液とＬｕｍｉｎａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｒ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１８５９６７４および１８５９６７５）の１：１混合液を用いた増強化学発光により、ビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を視覚化した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ｖ．４．５．２ソフトウェアを備えるＢｉｏｒａｄ Ｆｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒを用いてバンドを記録した。
【０１４１】
結果は、Ｄ．サッカラリス（D. saccharalis）ＢＢＭＶにおける受容体と結合したビオチン標識Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質の検出を立証し、５００倍過剰濃度の非ビオチン化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質が、結合したビオチン化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質をその受容体（複数可）から完全に置き換えることをさらに示した。対照的に、５００倍過剰濃度のＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質は、結合したビオチン化Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質を置き換えることができず、この結果は、Ｃｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質が、Ｄ．サッカラリス（D. saccharalis）ＢＢＭＶにおけるＣｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質結合部位（複数可）と競合しないことを示唆した。よって、Ｓ．フルギペルダ（S. frugiperda）のＢＢＭＶにより得られた結果と同じく、Ｃｒｙ１Ｆａコア毒素タンパク質とＣｒｙ１Ｃａコア毒素タンパク質が、Ｄ．サッカラリス（D. saccharalis）ＢＢＭＶにおける別個の結合部位と結合することが示唆される。
【０１４２】
（参考文献）
【表４】
【０１４３】
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｒｙ１Ｃ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡおよびＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡを含むトランスジェニック植物。
【請求項２】
請求項１に記載の植物の種子。
【請求項３】
Ｃｒｙ１Ｃ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡおよびＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡが、前記植物に遺伝子移入された、請求項１に記載の植物。
【請求項４】
請求項３に記載の植物の種子。
【請求項５】
非Ｂｔ緩衝帯植物および請求項１に記載の複数の植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の４０％未満を構成する、圃場。
【請求項６】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の３０％未満を構成する、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項７】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の２０％未満を構成する、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項８】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の１０％未満を構成する、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項９】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の５％未満を構成する、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項１０】
前記緩衝帯植物がブロックまたは帯状地にある、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項１１】
非Ｂｔ緩衝帯植物からの緩衝帯種子および請求項４に記載の複数の種子を含む種子の混合物であって、前記緩衝帯種子は前記混合物の全ての種子の４０％未満を構成する、種子の混合物。
【請求項１２】
前記緩衝帯種子が前記混合物の全ての種子の３０％未満を構成する、請求項１１に記載の種子の混合物。
【請求項１３】
前記緩衝帯種子が前記混合物の全ての種子の２０％未満を構成する、請求項１１に記載の種子の混合物。
【請求項１４】
前記緩衝帯種子が前記混合物の全ての種子の１０％未満を構成する、請求項１１に記載の種子の混合物。
【請求項１５】
前記緩衝帯種子が前記混合物の全ての種子の５％未満を構成する、請求項１１に記載の種子の混合物。
【請求項１６】
昆虫によるＣｒｙ毒素への抵抗性の発達を管理する方法であって、種子を播いて請求項５に記載の植物の圃場を作製するステップを含む、前記方法。
【請求項１７】
Ｃｒｙ１Ａｂコア毒素含有タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
非Ｂｔ緩衝帯植物および請求項１７に記載の複数のトランスジェニック植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の約２０％未満を構成する、圃場。
【請求項１９】
請求項１７に記載の複数の植物を含む植物の圃場であって、約１０％未満の緩衝帯植物を含む圃場。
【請求項２０】
昆虫によるＣｒｙ毒素への抵抗性の発達を管理する方法であって、種子を播いて請求項１９に記載の植物の圃場を作製するステップを含む、前記方法。
【請求項２１】
Ｃｒｙ１Ｆコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｃコア毒素含有タンパク質の両方の有効量を発現する細胞を含む、鱗翅目（lepidopteran）有害生物を防除するための組成物。
【請求項２２】
Ｃｒｙ１Ｆコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｃコア毒素含有タンパク質の両方を発現するように形質転換された宿主を含む請求項２１に記載の組成物であって、前記宿主が、微生物または植物細胞である、組成物。
【請求項２３】
鱗翅目（lepidopteran）有害生物を防除する方法であって、前記有害生物または前記有害生物の環境に、有効量の請求項２１に記載の組成物を提示する（presenting）ステップを含む、前記方法。
【請求項２４】
同じ標的昆虫に対して殺虫性である３つの殺虫性Ｃｒｙタンパク質を生成するトランスジェニック植物であって、前記昆虫は前記Ｃｒｙタンパク質のいずれか１つへの抵抗性を発達させる能力を有し、各前記Ｃｒｙタンパク質は前記標的昆虫の異なる腸受容体に結合する、トランスジェニック植物。
【請求項２５】
前記昆虫がフォールアーミーワームである、請求項２４に記載の植物。
【請求項２６】
Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質とＣｒｙ１Ｃａタンパク質と、Ｖｉｐ３Ａ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１ＢｅおよびＣｒｙ１Ｅタンパク質からなる群から選択される第三のタンパク質とを生成するトランスジェニック植物。
【請求項２７】
昆虫によるＣｒｙ毒素への抵抗性の発達を管理する方法であって、種子を播いて請求項２６に記載の植物の圃場を作製するステップを含む、前記方法。
【請求項２８】
非Ｂｔ緩衝帯植物および請求項２６に記載の複数の植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の約１０％未満を構成する、圃場。
【請求項２９】
約５％未満の緩衝帯植物を含む、請求項２８に記載の圃場。
【請求項３０】
昆虫によるＣｒｙ毒素への抵抗性の発達を管理する方法であって、種子を播いて請求項２８または２９に記載の植物の圃場を作製するステップを含む、前記方法。
【請求項３１】
非Ｂｔ緩衝帯植物からの緩衝帯種子および請求項２６に記載の植物からの複数の種子を含む種子の混合物であって、前記緩衝帯種子は前記混合物の全ての種子の１０％未満を構成する、種子の混合物。
【請求項３２】
前記植物が１０エーカーよりも多くを占める、請求項５、１８および２８のいずれかに記載の圃場。
【請求項３３】
前記植物がトウモロコシ、ダイズおよびワタからなる群から選択される、請求項１、２、１７、２４および２６のいずれかに記載の植物。
【請求項３４】
前記植物がメイズ植物である、請求項１、２、１７、２４および２６のいずれかに記載の植物。
【請求項３５】
請求項１、２、１７、２４、２６、３３および３４のいずれかに記載の植物の植物細胞であって、前記植物細胞が、前記Ｃｒｙ１Ｃ殺虫性タンパク質をコードする前記ＤＮＡと、前記Ｃｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質をコードする前記ＤＮＡとを含み、前記Ｃｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質が、配列番号４と少なくとも９９％同一であり、前記Ｃｒｙ１Ｃ殺虫性タンパク質が、配列番号５と少なくとも９９％同一である、植物細胞。
【請求項３６】
前記Ｃｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質が配列番号４を含み、前記Ｃｒｙ１Ｃ殺虫性タンパク質が配列番号５を含む、請求項１、２、１７、２４、２６、３３および３４のいずれかに記載の植物。
【請求項１】
Ｃｒｙ１Ｃ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡおよびＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡを含むトランスジェニック植物。
【請求項２】
請求項１に記載の植物の種子。
【請求項３】
Ｃｒｙ１Ｃ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡおよびＣｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質をコードするＤＮＡが、前記植物に遺伝子移入された、請求項１に記載の植物。
【請求項４】
請求項３に記載の植物の種子。
【請求項５】
非Ｂｔ緩衝帯植物および請求項１に記載の複数の植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の４０％未満を構成する、圃場。
【請求項６】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の３０％未満を構成する、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項７】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の２０％未満を構成する、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項８】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の１０％未満を構成する、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項９】
前記緩衝帯植物が前記圃場の全ての作物植物の５％未満を構成する、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項１０】
前記緩衝帯植物がブロックまたは帯状地にある、請求項５に記載の植物の圃場。
【請求項１１】
非Ｂｔ緩衝帯植物からの緩衝帯種子および請求項４に記載の複数の種子を含む種子の混合物であって、前記緩衝帯種子は前記混合物の全ての種子の４０％未満を構成する、種子の混合物。
【請求項１２】
前記緩衝帯種子が前記混合物の全ての種子の３０％未満を構成する、請求項１１に記載の種子の混合物。
【請求項１３】
前記緩衝帯種子が前記混合物の全ての種子の２０％未満を構成する、請求項１１に記載の種子の混合物。
【請求項１４】
前記緩衝帯種子が前記混合物の全ての種子の１０％未満を構成する、請求項１１に記載の種子の混合物。
【請求項１５】
前記緩衝帯種子が前記混合物の全ての種子の５％未満を構成する、請求項１１に記載の種子の混合物。
【請求項１６】
昆虫によるＣｒｙ毒素への抵抗性の発達を管理する方法であって、種子を播いて請求項５に記載の植物の圃場を作製するステップを含む、前記方法。
【請求項１７】
Ｃｒｙ１Ａｂコア毒素含有タンパク質をコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
非Ｂｔ緩衝帯植物および請求項１７に記載の複数のトランスジェニック植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の約２０％未満を構成する、圃場。
【請求項１９】
請求項１７に記載の複数の植物を含む植物の圃場であって、約１０％未満の緩衝帯植物を含む圃場。
【請求項２０】
昆虫によるＣｒｙ毒素への抵抗性の発達を管理する方法であって、種子を播いて請求項１９に記載の植物の圃場を作製するステップを含む、前記方法。
【請求項２１】
Ｃｒｙ１Ｆコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｃコア毒素含有タンパク質の両方の有効量を発現する細胞を含む、鱗翅目（lepidopteran）有害生物を防除するための組成物。
【請求項２２】
Ｃｒｙ１Ｆコア毒素含有タンパク質およびＣｒｙ１Ｃコア毒素含有タンパク質の両方を発現するように形質転換された宿主を含む請求項２１に記載の組成物であって、前記宿主が、微生物または植物細胞である、組成物。
【請求項２３】
鱗翅目（lepidopteran）有害生物を防除する方法であって、前記有害生物または前記有害生物の環境に、有効量の請求項２１に記載の組成物を提示する（presenting）ステップを含む、前記方法。
【請求項２４】
同じ標的昆虫に対して殺虫性である３つの殺虫性Ｃｒｙタンパク質を生成するトランスジェニック植物であって、前記昆虫は前記Ｃｒｙタンパク質のいずれか１つへの抵抗性を発達させる能力を有し、各前記Ｃｒｙタンパク質は前記標的昆虫の異なる腸受容体に結合する、トランスジェニック植物。
【請求項２５】
前記昆虫がフォールアーミーワームである、請求項２４に記載の植物。
【請求項２６】
Ｃｒｙ１Ｆａタンパク質とＣｒｙ１Ｃａタンパク質と、Ｖｉｐ３Ａ、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１ＢｅおよびＣｒｙ１Ｅタンパク質からなる群から選択される第三のタンパク質とを生成するトランスジェニック植物。
【請求項２７】
昆虫によるＣｒｙ毒素への抵抗性の発達を管理する方法であって、種子を播いて請求項２６に記載の植物の圃場を作製するステップを含む、前記方法。
【請求項２８】
非Ｂｔ緩衝帯植物および請求項２６に記載の複数の植物を含む植物の圃場であって、前記緩衝帯植物は前記圃場の全ての作物植物の約１０％未満を構成する、圃場。
【請求項２９】
約５％未満の緩衝帯植物を含む、請求項２８に記載の圃場。
【請求項３０】
昆虫によるＣｒｙ毒素への抵抗性の発達を管理する方法であって、種子を播いて請求項２８または２９に記載の植物の圃場を作製するステップを含む、前記方法。
【請求項３１】
非Ｂｔ緩衝帯植物からの緩衝帯種子および請求項２６に記載の植物からの複数の種子を含む種子の混合物であって、前記緩衝帯種子は前記混合物の全ての種子の１０％未満を構成する、種子の混合物。
【請求項３２】
前記植物が１０エーカーよりも多くを占める、請求項５、１８および２８のいずれかに記載の圃場。
【請求項３３】
前記植物がトウモロコシ、ダイズおよびワタからなる群から選択される、請求項１、２、１７、２４および２６のいずれかに記載の植物。
【請求項３４】
前記植物がメイズ植物である、請求項１、２、１７、２４および２６のいずれかに記載の植物。
【請求項３５】
請求項１、２、１７、２４、２６、３３および３４のいずれかに記載の植物の植物細胞であって、前記植物細胞が、前記Ｃｒｙ１Ｃ殺虫性タンパク質をコードする前記ＤＮＡと、前記Ｃｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質をコードする前記ＤＮＡとを含み、前記Ｃｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質が、配列番号４と少なくとも９９％同一であり、前記Ｃｒｙ１Ｃ殺虫性タンパク質が、配列番号５と少なくとも９９％同一である、植物細胞。
【請求項３６】
前記Ｃｒｙ１Ｆ殺虫性タンパク質が配列番号４を含み、前記Ｃｒｙ１Ｃ殺虫性タンパク質が配列番号５を含む、請求項１、２、１７、２４、２６、３３および３４のいずれかに記載の植物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５１４７６９（Ｐ２０１３−５１４７６９Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４４８４０（Ｐ２０１２−５４４８４０）
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０８１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７５５８８
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５０１０３５３０９）ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー (197)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０８１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７５５８８
【国際公開日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【出願人】（５０１０３５３０９）ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー (197)
【Ｆターム（参考）】
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