小粒子低比重リポ蛋白の定量法
迅速かつ簡便な小粒子ＬＤＬの分別測定法の提供。 被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白をそれ以外の低比重リポ蛋白と分離する第１工程と、分離した小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定する第２工程から成る、被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は動脈硬化症の臨床診断に重要な小粒子低比重リポ蛋白の分別定量法に関する。
【背景技術】
低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）は血液中におけるコレステロール運搬の主役であり、動脈硬化性疾患の危険因子であるが、ＬＤＬの中でも特に粒子サイズが小さく平均的なＬＤＬより高比重な、小粒子低比重リポ蛋白（以下、「小粒子ＬＤＬ」という）は動脈硬化惹起性が通常のＬＤＬより数倍高くなることが知られている。小粒子ＬＤＬの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の１つであり、分別測定することは臨床上極めて重要である。
従来の小粒子ＬＤＬ測定法は、超遠心法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法などがある。超遠心法は比重の差を利用して小粒子ＬＤＬを分離し、そのコレステロール量や蛋白量を定量する方法であり、小粒子ＬＤＬは比重１．０４０〜１．０６３に分画される（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，４８ ｐ．３３−４９，１９９３：Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１０６，ｐ．２４１−２５３，１９９４等）。しかしながら、この方法は高価な設備を必要とし、測定に非常に時間を要する。電気泳動法はポリアクリルアミドゲルを用いてＬＤＬの移動度や粒子直径を測る方法で、小粒子ＬＤＬは粒子サイズ２５．５ｎｍ以下（ＪＡＭＡ，２６０，ｐ．１９１７−２１，１９８８等）または、ＬＤＬの相対移動度（ＶＬＤＬからＬＤＬまでの移動距離をＶＬＤＬからＨＤＬまでの移動距離で除したもの）が０．４以上である（動脈硬化，２５，ｐ．６７−７０，１９９７）。しかしながら、これらの方法はＬＤＬの小粒子化の程度を測定する方法であって定量法ではない。また、一度に測定する検体数が限られており、測定に時間がかかる。最近、アガロース電気泳動において泳動後のゲルを脂質染色し、その染色パターンをコンピューター解析しリポ蛋白を定量する方法（特開２０００−３５６６４１号公報）が発明されたが、これは酸化ＬＤＬ、アセチルＬＤＬ、糖化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬなどの変性ＬＤＬを分析する方法であり、小粒子ＬＤＬは正確に測定することができない。また解析に非常に高価な装置を必要とすることから一般的でない。
従来、ＨＤＬ測定においてＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させＨＤＬを分離させるための分離剤として、ポリアニオンと２価の陽イオンを組み合わせて用いることが知られていた。例えば、デキストラン硫酸−Ｍｇ２＋を用いる方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２８，ｐ．１３７９−８８，１９８２等）、ヘパリン−Ｍｎ２＋を用いる方法（Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．．１９，ｐ．６５−７６，１９７８等）、ヘパリン−Ｃａ２＋を用いる方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１７０，ｐ．３３４−４０，１９７５等）、リンタングステン酸−Ｍｇ２＋を用いる方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２３，ｐ．８８２−８４，１９７７等）などがある。また、複数の分離剤を使用してリポ蛋白を段階的に沈殿させ、計算によりＬＤＬやＶＬＤＬの分画を測定する方法がすでに報告されている（特開平７−２９４５３２号公報、臨床病理 臨時増刊特集第２１号，８２，１９７５等）。さらに、ポリエチレングリコールを用いてＨＤＬを分離する方法も報告されている（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８ ｐ．１７７−８１ １９８１）。
さらに、従来、複数の分離剤を使用してリポ蛋白を段階的に沈殿させ、濁度の差により各リポ蛋白を測定する方法（臨床病理 臨時増刊特集第２１号，８２，１９７５等）、イオン強度の差により小粒子ＬＤＬを混濁または溶解させ吸光度の差により小粒子ＬＤＬを測定する方法（特開２００３−２８８８２号公報）などがあった。しかし、吸光度を測定しているため、特異性や精度が不十分であった。
特許文献１ 特開２０００−３５６６４１号公報
特許文献２ 特開平７−２９４５３２号公報
特許文献３ 特開２００３−２８８８２号公報
非特許文献１ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，４８，ｐ．３３−４９，１９９３
非特許文献２ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１０６，ｐ．２４１−２５３，１９９４
非特許文献３ ＪＡＭＡ，２６０，ｐ．１９１７−２１，１９８８
非特許文献４ 動脈硬化，２５，ｐ．６７−７０，１９９７
非特許文献５ Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２８，ｐ．１３７９−８８，１９８２
非特許文献６ Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．．１９，ｐ．６５−７６，１９７８
非特許文献７ Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１７０，ｐ．３３４−４０，１９７５
非特許文献８ Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２３，ｐ．８８２−８４，１９７７
非特許文献９ 臨床病理 臨時増刊特集第２１号，８２，１９７５
非特許文献１０ Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８ ｐ．１７７−８１ １９８１
【発明の開示】
本発明の目的は、迅速かつ簡便な小粒子ＬＤＬの分別測定法を提供することである。
上記のように、ポリアニオン、２価の陽イオン等を分離剤として用いてリポ蛋白中のＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させるために用いることは報告されていた。しかし、リポ蛋白の代表的な分画であるＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬはそれぞれ物性が異なるので分離剤により分離することができるが、ＬＤＬを同様の方法で亜分画に分離することは試みられていなかった。
本発明者等は小粒子ＬＤＬを分離する方法について鋭意検討を行い、被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオンを適当な濃度で作用させることにより、小粒子ＬＤＬとそれ以外のＬＤＬが分離されることを見いだした。さらに１価の陽イオンを追加して作用させた場合に、１価の陽イオンはイオン強度調整剤として作用し、より良好な小粒子ＬＤＬの分離を達成することができた。また、ポリアニオンと２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの代わりにＰＥＧを用いても同様の効果を得ることができた。
本発明者等は、ポリアニオンと２価の陽イオンおよび１価の陽イオンを組み合わせた場合、またはＰＥＧを用いた場合のそれぞれの濃度について詳細な検討を行い、これら濃度範囲を規定することで、ＬＤＬ粒子の中でも小粒子ＬＤＬ以外のＬＤＬを凝集させ小粒子ＬＤＬを分離する条件を見いだした。この反応により小粒子ＬＤＬ以外のＬＤＬは凝集物を形成し、遠心分離やフィルター処理により反応液中から取り除くことができる。さらに分離後の反応液にＬＤＬコレステロール測定用試薬またはＬＤＬ中中性脂肪測定用試薬または抗ヒトアポ蛋白Ｂ抗体を作用させることにより、小粒子ＬＤＬ中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を定量することが可能となり、本発明を完成するに至った。
上述のイオン強度の差により小粒子ＬＤＬを混濁または溶解させ吸光度の差により小粒子ＬＤＬを測定する方法（特開２００３−２８８８２号公報）と比べて、本発明では分離後の小粒子ＬＤＬをコレステロール、中性脂肪、蛋白質の形で測定するため特異性や精度において優れている。
すなわち、本発明は以下の方法およびキットを提供する。
（１） 被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白をそれ以外の低比重リポ蛋白と分離する第１工程と、分離した小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール、中性脂肪または蛋白質を測定する第２工程から成る、被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白の定量方法、
（２） 前記第１工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離にポリアニオンおよび２価の陽イオンを用いることを特徴とする（１）の方法、
（３） 前記第１工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離に、さらに１価の陽イオンを用いることを特徴とする（１）または（２）の方法、
（４） 前記第１工程で使用されるポリアニオンがヘパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリアニオンであることを特徴とする（２）または（３）の方法、
（５） 前記第１工程で使用される２価の陽イオンがＭｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋からなる群から選択される２価の陽イオンであることを特徴とする（２）から（４）のいずれかの方法、
（６） 前記第１工程で使用される１価の陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋およびＬｉ＋からなる群から選択される１価の陽イオンであることを特徴とする（３）または（５）の方法、
（７） 被検体試料にポリアニオンを添加したときのポリアニオンの最終濃度が、ヘパリンの場合１０〜２５０Ｕ／ｍＬ、デキストラン硫酸の場合０．０２〜１．２５％、リンタングステン酸の場合０．０２〜１．２５％である（４）から（６）のいずれかの方法、
（８） 被検体試料に２価の陽イオンを添加したときの２価の陽イオンの最終濃度が、Ｍｎ２＋の場合２．５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋の場合２．５〜１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋の場合１〜７５ｍｍｏｌ／Ｌである（５）から（７）のいずれかの方法、
（９） 被検体試料に１価の陽イオンを添加したときの１価の陽イオンの最終濃度が、０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである（６）から（８）のいずれかの方法、
（１０） 前記第１工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離にＰＥＧを用いることを特徴とする（１）の方法、
（１１） 被検体試料にＰＥＧを添加したときのＰＥＧの最終濃度が、２〜５％である（１０）の方法、
（１２） 前記第２工程のコレステロール測定が、分画操作を要しない低比重リポ蛋白中コレステロールの定量試薬を用いることを特徴とする（１）から（１１）のいずれかの方法、
（１３） 前記第２工程の中性脂肪測定が、分画操作を要しない低比重リポ蛋白中中性脂肪定量試薬を用いることを特徴とする（１）から（１１）のいずれかの方法、
（１４）前記第２工程の蛋白測定が、抗ヒトアポ蛋白Ｂ抗体を用いることを特徴とする（１）から（１１）のいずれかの方法、
（１５） 被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオンを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、被検体試料から小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（１６） 被検体試料に、さらに１価の陽イオンを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、（１５）の方法、
（１７） ポリアニオンがヘパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリアニオンであることを特徴とする（１５）または（１６）の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（１８） ２価の陽イオンがＭｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋からなる群から選択される２価の陽イオンであることを特徴とする（１５）から（１７）のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（１９） １価の陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋およびＬｉ＋からなる群から選択される１価の陽イオンであることを特徴とする（１５）から（１８）のいずれかに記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（２０）被検体試料にポリアニオンを添加したときのポリアニオンの最終濃度が、ヘパリンの場合１０〜２５０Ｕ／ｍＬ、デキストラン硫酸の場合０．０２〜１．２５％、リンタングステン酸の場合０．０２〜１．２５％である（１７）から（１９）のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（２１） 被検体試料に２価の陽イオンを添加したときの２価の陽イオンの最終濃度が、はＭｎ２＋の場合２．５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋の場合２．５〜１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋の場合１〜７５ｍｍｏｌ／Ｌである（１８）から（２０）のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（２２） 被検体試料に１価の陽イオンを添加したときの１価の陽イオンの最終濃度が、０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである（１９）から（２１）のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（２３） 被検体試料にＰＥＧを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、被検体試料から小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（２４）被検体試料にＰＥＧを添加したときのＰＥＧの最終濃度が２〜５％である（２３）の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（２５）ポリアニオンおよび２価の陽イオンを含む分離剤および低比重リポ蛋白測定試薬を含む、小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定することによる小粒子低比重リポ蛋白測定用キット、
（２６） 分離剤が、さらに１価の陽イオンを含む（２５）の小粒子低比重リポ蛋白測定用キット、
（２７） ＰＥＧを含む分離剤および低比重リポ蛋白測定試薬を含む、小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定することによる小粒子低比重リポ蛋白測定用キット、
（２８） ポリアニオンがヘパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリアニオンであることを特徴とする（２５）または（１６）のキット、
（２９） ２価の陽イオンがＭｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋からなる群から選択される２価の陽イオンであり，１価の陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋およびＬｉ＋からなる群から選択される１価の陽イオンであであることを特徴とする（２６）または（２８）のキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−３５５１１９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の第１工程の方法を示す図である。
図２は、実施例１における本発明の第一工程の効果を示す図である。
図３は、実施例２における本発明法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。
図４は、実施例３における本発明法による小粒子ＬＤＬ中アポＢの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中アポＢの測定値との相関性を示す図である。
図５は、実施例４における本発明法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。
図６は、実施例５における本発明法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。
図７は、実施例６における本発明法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。
図８は、実施例７における本発明法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。
図９は、実施例８における本発明法による小粒子ＬＤＬ中中性脂肪の測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中中性脂肪の測定値との相関性を示す図である。
図１０は、実施例９における本発明法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、第１工程および第２工程からなる。第１工程では被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオンからなる分離液、ポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンからなる分離液またはＰＥＧを添加し、一定時間反応後ＶＬＤＬおよび小粒子ＬＤＬ以外のＬＤＬを凝集させ、遠心分離やフィルターにより除去する。続く第２工程では小粒子ＬＤＬ中のコレステロールや中性脂肪や蛋白質を定量する。第１工程では上記リポ蛋白除去後の溶液中に小粒子ＬＤＬの他ＨＤＬが残るが、ＬＤＬコレステロール測定試薬またはＬＤＬ中の中性脂肪測定試薬または抗ヒトアポＢ抗体を作用させることにより、小粒子ＬＤＬの成分のみを分別測定することができる。
上述のように、リポタンパク質は大きくＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬの分画に分けられ、ＬＤＬはさらに小粒子ＬＤＬとそれ以外の亜分画に分けられる。小粒子ＬＤＬをＳＬＤＬ（ｓｍａｌｌ ＬＤＬ）、Ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ、ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと呼ぶこともあり、またそれ以外のＬＤＬをＬＬＤＬ（ｌａｒｇｅ ＬＤＬ）、Ｌｉｇｈｔ ＬＤＬと呼ぶこともある。これらの分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。その粒子サイズの直径は、報告者により異なるがＶＬＤＬが３０ｎｍ〜８０ｎｍ（３０ｎｍ〜７５ｎｍ）で、ＬＤＬが２２ｎｍ〜２８ｎｍ（１９ｎｍ〜３０ｎｍ）、ＨＤＬが直径７〜１０ｎｍである。比重は、ＶＬＤＬが１．００６以下、ＬＤＬが１．０１９〜１．０６３、ＨＤＬが１．０６３〜１．２１である。ＬＤＬ粒子直径はグラジエントゲル電気泳動（ＧＧＥ）（ＪＡＭＡ，２６０，ｐ．１９１７−２１，１９８８）、ＮＭＲ（ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＬＩＰＯＰＲＯＴＥＩＮ ＴＥＳＴＩＮＧ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｎａｄｅｒ Ｒｉｆａｉ他編、ｐ．６０９−６２３、ＡＡＣＣ ＰＲＥＳＳ：ＴｈｅＦａｔｓ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｕｍｍｅｒ ２００２、ＬＶＤＤ １５ ＹＥＡＲ ＡＮＮＩＶＥＲＳＡＲＹ ＩＳＳＵＥ、Ｖｏｌｕｍｅ ＡＶＩ Ｎｏ．３、ｐ．１５−１６）により測定でき、比重は超遠心分離による分析（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１０６，ｐ．２４１−２５３，１９９４：Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，８３，ｐ．５９，１９９０）に基づいて決定できる。
本発明の方法で測定しようとする小粒子ＬＤＬは、一般的にはＬＤＬ画分のうち直径が約２２．０〜約２５．５ｎｍの亜分画、比重１．０４０〜１．０６３の亜分画を指す。ＬＤＬを大きさにより亜分画に分けているのは、ＬＤＬのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、ＬＤＬの中でもより悪性度が高いので、ＬＤＬの中でも小さいものを分別測定する必要があったからである。ＬＤＬ内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものが特に悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重１．０４０〜１．０６３という値も小粒子ＬＤＬの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえるＬＤＬの比重範囲１．０１９〜１．０６３を中央点で分けたものである。例えば、別の報告では１．０４４〜１．０６０に分画される（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：１０６ ２４１−２５３ １９９４）。小粒子ＬＤＬの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合の小粒子ＬＤＬの存在が臨床的な悪性度と関連している。
本発明において、小粒子ＬＤＬという場合、ＬＤＬのうち比重が小さいものであって、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外のＬＤＬよりも大きいもの、好ましくはＬＤＬの比重範囲のうち中央点より上の比重範囲に属するもの、さらに好ましくは比重１．０４０〜１．０６３の範囲に属するＬＤＬをいう。
本発明の方法で用いる被検体試料は、血清または血漿、好ましくは血清である。第１工程において、適当な体積の被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオン、またはポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンをポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの最終濃度が特定の範囲内になるように添加する。小粒子ＬＤＬとそれ以外のＬＤＬの分離はポリアニオンと２価の陽イオンの存在下で行うことができるが、さらに１価の陽イオンを存在させることにより１価の陽イオンがイオン強度調整剤として作用し、より良好な小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分の分離を達成することができる。この際、特定の濃度のポリアニオンおよび２価の陽イオンからなる分離液、または特定の濃度のポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンからなる分離液をあらかじめ調製しておいて、これを添加してもよいし、特定の濃度のポリアニオンおよび２価の陽イオンおよび１価の陽イオンを別々に調整しておいて、それぞれを別々に添加してもよい。別々に添加する場合の被検体試料への添加順序は限定されない。ポリアニオンおよび２価の陽イオンからなる分離剤、またはポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンからなる分離液を用いる場合、分離液の溶媒として、精製水、生理食塩水および各種緩衝液を用いることができる。分離液のｐＨは３〜８が好ましい。
第１工程で用いるポリアニオンとしてはヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などを好適に用いることができる。被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオン、またはポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンを添加した後のポリアニオンの最終濃度は濃度はヘパリンの場合１０〜２５０Ｕ／ｍＬ、リンタングステン酸の場合０．０２〜１．２５％、デキストラン硫酸の場合０．０２〜１．２５％が好ましい。
第１工程で用いる２価金属イオンにはＭｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋を用いることができ、好適にはＭｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋が用いられる。被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオンを添加した後の２価の陽イオンの最終濃度は、ポリアニオンとしてヘパリンを用いた場合のＭｎ２＋濃度は７．５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋濃度は４０〜１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度は５０〜７５ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、リンタングステン酸を用いた場合のＭｎ２＋濃度は２．５〜７．５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋濃度は２．５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度は１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。デキストラン硫酸を用いた場合のＭｎ２＋濃度は２．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋濃度は７．５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度は５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
また、さらに第１工程で１価の陽イオンを用いる場合、１価金属イオンにはＮａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋を好適に用いることができる。１価の陽イオンの最終濃度は、０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌが望ましい。
例えば、被検体試料１００μＬにポリアニオンと２価の陽イオンを含む分離剤、またはポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンを含む分離剤１００μＬを添加する。この際の、分離剤中のポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの濃度は被検体試料と分離剤を混合したときのポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの濃度が上記最終濃度になるように調製しておけばよい。分離剤中のポリアニオンの濃度は、ヘパリンの場合２０〜５００Ｕ／ｍＬ、リンタングステン酸の場合０．０４〜２．５％、デキストラン硫酸の場合０．０４〜２．５％が好ましい。また、分離剤中の２価陽イオンの濃度は、ポリアニオンとしてヘパリンを用いた場合のＭｎ２＋濃度は１５〜７０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋濃度は８０〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度は１００〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、リンタングステン酸を用いた場合のＭｎ２＋濃度は５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋濃度は５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度は２〜６０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。デキストラン硫酸を用いた場合のＭｎ２＋濃度は５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋濃度は１５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度は１０〜４０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。１価の陽イオンの濃度は０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオン、またはポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンを添加した後、反応混液を攪拌し、第１工程の反応を行わせる。
第１工程での反応は２℃〜４５℃の温度で行うことが好ましく、２０℃〜３７℃で行うことがさらに好ましい。
第１工程での反応は１分〜３０分間の時間で行うことが好ましく、５分〜１５分間の時間で行うことがさらに好ましい。
なお、第１工程において被検体試料に添加するポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの至適濃度はポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの種類の組み合わせによっても変わり、また被検体試料のｐＨ、イオン強度等の条件によっても変わってくる。従って、本発明の第１工程の反応を行う場合、常に同じ比重範囲のものが得られるとは限らず、特に上述の一般的に小粒子ＬＤＬの比重範囲とされている１．０４０〜１．０６３のものが得られるとは限らない。但し、上記濃度条件で第１工程の反応を行えば、ほぼ同等の比重を有するＬＤＬが得られ、そのＬＤＬは上記定義のＬＤＬに含まれる。さらに、小粒子ＬＤＬの比重を１．０４０〜１．０６３に固定して考えた場合であって、本発明の第１工程により得られるＬＤＬの比重がこの範囲から若干ずれたとしても、そのずれは大きくない。またＬＤＬ全体における比較的小粒子のＬＤＬを含んでいることには変わりはないので、本発明の第１工程により得られる小粒子ＬＤＬの量は、ある被検体の動脈硬化を罹患するリスクを反映している。
第１工程の小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分の分離は、ポリアニオンおよび２価の陽イオン、またはポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの代わりにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を被検体試料に添加することによっても行うことができる。この際に用いられるＰＥＧの分子量は、４，０００〜２０，０００が望ましく、ＰＥＧの最終濃度は４〜１０％が望ましい。
第１工程の反応が終了した後、遠心分離を行い上清を得ることにより、小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分を採取することができる。この際の遠心分離条件は、９，０００ｇ〜３６，０００ｇで１〜３０分である。
また、第１工程の反応が終了した後、反応混液をフィルターにかけてもパススルーとして小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分を採取することができる。フィルターは圧力を加えてろ過するタイプのものであっても、遠心操作によりろ過するタイプのものであってもよい。この際用いるフィルターの分画サイズは、０．１０〜０．８０μｍであり、例えば、市販のマイレクス、ウルトラフリー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製），ミニザルト（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製），ＤＩＳＭＩＣ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製），ＨＴタフリン・アクロディスク・シリンジフィルター（ＰＡＬＬ Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）等を用いることができる。
第１工程で得られた小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分中のＬＤＬのみを測定することにより、被検体試料中の小粒子ＬＤＬを定量することができる。
この際、ＬＤＬの測定は、ＬＤＬ中のコレステロールを測定するか、ＬＤＬ中の中性脂肪を測定するか、ＬＤＬ中のアポＢタンパク質を測定することにより行える。
第２工程で用いられる分画操作を要しないＬＤＬコレステロール測定方法としていくつかの方法（特開平１１−３１８４９６号公報、特開２００２−２０２３１４号公報、特開平１０−０８０３００号公報、特開平０９−３１３２００号公報、特開平１１−１５５５９５号公報、特許第３２５６２４１号公報）等があるが、これらを好適に用いることができる。
例えば、特開平１１−３１８４９６号公報の記載に従って、以下のようにして第１工程で得られた小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分中のＬＤＬを定量することができる。第１工程で得られた小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分を試料とし、ＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤の存在下でコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、試料中のＬＤＬ以外のリポタンパク質を消去し（ステップＡ）、次いで試料中の残存ＬＤＬを定量することができる（ステップＢ）。この際、ＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤としては、ＨＬＢ値が１３以上１５以下のポリアルキレンオキサイド誘導体が挙げられ、具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１３以上１５以下の化合物がある。ステップＡで用いられる上記界面活性剤の濃度は、０．１〜１０ｇ／Ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは０．５〜５．０ｇ／Ｌ程度である。過酸化水素を消去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼを用いてフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と過酸化水素を反応させて無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。ステップＡの反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、由来としてはシュードモナス属細菌から生成されるものが効果的である。また、コレステロールオキシダーゼの濃度は０．１〜０．７Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、細菌や酵母由来のものを用いることが好ましい。さらに、カタラーゼの濃度は４０〜１００Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合のペルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍＬが好ましく、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物の濃度としては０．４〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。ステップＢでは、被検試料中の残存コレステロールを定量する。これは、例えば、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤を加え、第１工程で加えたコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより行なうことができる。この際ＬＤＬに作用する界面活性剤としてＨＬＢ値が１１以上１３未満のポリアルキレンオキサイド誘導体が挙げられ、具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１１以上１３未満の化合物が挙げられる。ステップＢのその他の好ましい反応条件は、第１工程における好ましい反応条件と同様である。
ＬＤＬを測定するための測定キットが市販されており、これらの市販の測定キットを利用して、ＬＤＬを測定してもよい。市販のキットとしては、例えばＬＤＬ−ＥＸ（Ｎ）（デンカ生研）がある。
第２工程で用いられる分画操作を要しないＬＤＬ中の中性脂肪測定方法としていくつかの方法（ＷＯ００／４３５３７号公報）等があるが、これらを好適に用いることができる。
第２工程で用いられる抗ヒトアポＢ抗体を作用させる方法としていくつかの方法（特許第２６３８１３７号公報，特開平０２−６４４５８号公報）等があるが、これらを好適に用いることができる。
本発明には、小粒子ＬＤＬを含む画分を分離するための第１工程を行うための試薬および分離した小粒子ＬＤＬを測定するための試薬を含むキットも包含される。該キットは、例えば、上述のＬＤＬ測定試薬キットならびにポリアニオンおよび２価の陽イオン（またはポリアニオンと２価の陽イオンを含む分離剤）等を含む。該キットはさらに遠心分離用チューブ、小粒子ＬＤＬ分離用フィルターを含んでいてもよい。また、該キットは、ポリアニオンおよび２価の陽イオンに加えて１価の陽イオンを含んでいてもよく、この場合ポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンを含む分離剤としてこれらの物質を含んでいてもよい。さらに、該キットは、ポリアニオンおよび２価の陽イオンの代わりにポリエチレングリコールを含んでいてもよい。
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
電気泳動法により小粒子ＬＤＬを多く含むことが確認される検体及びそれ以外のＬＤＬを多く含む検体を用いて第一工程の効果を求めた。血清５０μＬに６０Ｕ／ｍＬヘパリンナトリウム及び４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２からなる分離液５０μＬを添加し、２５℃で１５分間反応させた。その後１８，５００ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を回収し、市販のディスク型ポリアクリルアミドゲルリポフォーを用いて反応性を比較した。分離液と反応前の血清は等量の生理食塩水にて希釈した後泳動した。図１に本発明の第１工程の方法を示す図を、図２に結果を示す。図２は正常なＬＤＬのみが選択的に取り除かれていることを示している。図２中、レーンＮｏ．１は小粒子ＬＤＬ以外のＬＤＬを多く含む検体の反応前の泳動結果を、レーンＮｏ．２は小粒子ＬＤＬを多く含む検体の反応前の泳動結果を、レーンＮｏ．３は小粒子ＬＤＬ以外のＬＤＬを多く含む検体の反応後の泳動結果を、レーンＮｏ．４は小粒子ＬＤＬを多く含む検体の反応後の泳動結果を示す。
【実施例２】
血清を試料とし、本発明法により小粒子ＬＤＬを測定し、その測定値を超遠心法によって得られる値と比較した。この結果を図３に示す。
すなわち、検体１００μＬに３００Ｕ／ｍＬヘパリンナトリウム及び１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる分離液１００μＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。その後１８，５００ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を回収し、市販されているキットＬＤＬ−ＥＸ（Ｎ）（デンカ生研社製）を使用して日立７１７０型自動分析装置によって小粒子ＬＤＬ中のコレステロールを測定した。超遠心法は血清と比重液を混合後、遠心を行い比重１．０４０〜１．０６３の分画を回収し、コレステロールを測定して小粒子ＬＤＬ中コレステロール値とした。図３に示すように本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例３】
血清からなる検体１００μＬに平均分子量５０００の１．５％デキストラン硫酸ナトリウム及び４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる分離液１００μＬを添加し、２５℃で１０分間反応させた。その後１８，５００ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を回収し、抗ヒトアポＢ抗体を用いた免疫比濁法（第一化学薬品 アポＢオート・Ｎ「第一」を使用）によって小粒子ＬＤＬ中のアポＢ量を測定した。超遠心法は血清と比重液を混合後、遠心を行い比重１．０４０〜１．０６３の分画を回収し、アポＢを測定して小粒子ＬＤＬ中アポＢ値とした。その結果を図４に示す。図４に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例４】
実施例２において、分離液を０．３％リンタングステン酸ナトリウム及び７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２とする以外は同様の試薬を用いて同様の操作を行い、本発明法による測定値と超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図５に示す。図５に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例５】
実施例２において、分離液を４０Ｕ／ｍＬヘパリンナトリウム及び３０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２とする以外は同様の試薬を用いて同様の操作を行い、本発明法による測定値と超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図６に示す。図６に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例６】
実施例２において、分離液を５００Ｕ／ｍＬヘパリンナトリウム及び１４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２及び３４ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌとする以外は同様の試薬を用いて同様の操作を行い、本発明法による測定値と超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図７に示す。図７に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例７】
実施例２において、分離液を８％ＰＥＧ（分子量６，０００）とする以外は同様の試薬を用いて同様の操作を行い、本発明法による測定値と超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図８に示す。図８に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例８】
血清からなる検体１００μＬに１５０Ｕ／ｍＬヘパリンＮａ及び９０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる分離液１００μＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。その後１８，５００ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を回収し、ＬＤＬ中中性脂肪測定試薬によって小粒子ＬＤＬ中の中性脂肪を測定した。超遠心法は血清と比重液を混合後、遠心を行い比重１．０４０〜１．０６３の分画を回収し、中性脂肪を測定して小粒子ＬＤＬ中中性脂肪値とした。その結果を図９に示す。図９に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例９】
血清からなる検体１００μＬに１５０Ｕ／ｍＬヘパリンＮａ及び９０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる分離液１００μＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。その後遠心タイプのフィルター濾過（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社のＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ（０．１μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ）を使用）を用いて１０，０００ｇで１分間遠心分離を行い、ろ液を回収後、小粒子ＬＤＬ中のコレステロールを測定し超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図１０に示す。図１０に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば簡便な操作で小粒子ＬＤＬをそれ以外のＬＤＬと分離することができ、小粒子ＬＤＬ中のコレステロールまたは中性脂肪またはアポＢを分別測定することができるため臨床上極めて有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【技術分野】
本発明は動脈硬化症の臨床診断に重要な小粒子低比重リポ蛋白の分別定量法に関する。
【背景技術】
低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）は血液中におけるコレステロール運搬の主役であり、動脈硬化性疾患の危険因子であるが、ＬＤＬの中でも特に粒子サイズが小さく平均的なＬＤＬより高比重な、小粒子低比重リポ蛋白（以下、「小粒子ＬＤＬ」という）は動脈硬化惹起性が通常のＬＤＬより数倍高くなることが知られている。小粒子ＬＤＬの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の１つであり、分別測定することは臨床上極めて重要である。
従来の小粒子ＬＤＬ測定法は、超遠心法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法などがある。超遠心法は比重の差を利用して小粒子ＬＤＬを分離し、そのコレステロール量や蛋白量を定量する方法であり、小粒子ＬＤＬは比重１．０４０〜１．０６３に分画される（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，４８ ｐ．３３−４９，１９９３：Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１０６，ｐ．２４１−２５３，１９９４等）。しかしながら、この方法は高価な設備を必要とし、測定に非常に時間を要する。電気泳動法はポリアクリルアミドゲルを用いてＬＤＬの移動度や粒子直径を測る方法で、小粒子ＬＤＬは粒子サイズ２５．５ｎｍ以下（ＪＡＭＡ，２６０，ｐ．１９１７−２１，１９８８等）または、ＬＤＬの相対移動度（ＶＬＤＬからＬＤＬまでの移動距離をＶＬＤＬからＨＤＬまでの移動距離で除したもの）が０．４以上である（動脈硬化，２５，ｐ．６７−７０，１９９７）。しかしながら、これらの方法はＬＤＬの小粒子化の程度を測定する方法であって定量法ではない。また、一度に測定する検体数が限られており、測定に時間がかかる。最近、アガロース電気泳動において泳動後のゲルを脂質染色し、その染色パターンをコンピューター解析しリポ蛋白を定量する方法（特開２０００−３５６６４１号公報）が発明されたが、これは酸化ＬＤＬ、アセチルＬＤＬ、糖化ＬＤＬ、ＭＤＡ−ＬＤＬなどの変性ＬＤＬを分析する方法であり、小粒子ＬＤＬは正確に測定することができない。また解析に非常に高価な装置を必要とすることから一般的でない。
従来、ＨＤＬ測定においてＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させＨＤＬを分離させるための分離剤として、ポリアニオンと２価の陽イオンを組み合わせて用いることが知られていた。例えば、デキストラン硫酸−Ｍｇ２＋を用いる方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２８，ｐ．１３７９−８８，１９８２等）、ヘパリン−Ｍｎ２＋を用いる方法（Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．．１９，ｐ．６５−７６，１９７８等）、ヘパリン−Ｃａ２＋を用いる方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１７０，ｐ．３３４−４０，１９７５等）、リンタングステン酸−Ｍｇ２＋を用いる方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２３，ｐ．８８２−８４，１９７７等）などがある。また、複数の分離剤を使用してリポ蛋白を段階的に沈殿させ、計算によりＬＤＬやＶＬＤＬの分画を測定する方法がすでに報告されている（特開平７−２９４５３２号公報、臨床病理 臨時増刊特集第２１号，８２，１９７５等）。さらに、ポリエチレングリコールを用いてＨＤＬを分離する方法も報告されている（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８ ｐ．１７７−８１ １９８１）。
さらに、従来、複数の分離剤を使用してリポ蛋白を段階的に沈殿させ、濁度の差により各リポ蛋白を測定する方法（臨床病理 臨時増刊特集第２１号，８２，１９７５等）、イオン強度の差により小粒子ＬＤＬを混濁または溶解させ吸光度の差により小粒子ＬＤＬを測定する方法（特開２００３−２８８８２号公報）などがあった。しかし、吸光度を測定しているため、特異性や精度が不十分であった。
特許文献１ 特開２０００−３５６６４１号公報
特許文献２ 特開平７−２９４５３２号公報
特許文献３ 特開２００３−２８８８２号公報
非特許文献１ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，４８，ｐ．３３−４９，１９９３
非特許文献２ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１０６，ｐ．２４１−２５３，１９９４
非特許文献３ ＪＡＭＡ，２６０，ｐ．１９１７−２１，１９８８
非特許文献４ 動脈硬化，２５，ｐ．６７−７０，１９９７
非特許文献５ Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２８，ｐ．１３７９−８８，１９８２
非特許文献６ Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．．１９，ｐ．６５−７６，１９７８
非特許文献７ Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１７０，ｐ．３３４−４０，１９７５
非特許文献８ Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２３，ｐ．８８２−８４，１９７７
非特許文献９ 臨床病理 臨時増刊特集第２１号，８２，１９７５
非特許文献１０ Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８ ｐ．１７７−８１ １９８１
【発明の開示】
本発明の目的は、迅速かつ簡便な小粒子ＬＤＬの分別測定法を提供することである。
上記のように、ポリアニオン、２価の陽イオン等を分離剤として用いてリポ蛋白中のＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させるために用いることは報告されていた。しかし、リポ蛋白の代表的な分画であるＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬはそれぞれ物性が異なるので分離剤により分離することができるが、ＬＤＬを同様の方法で亜分画に分離することは試みられていなかった。
本発明者等は小粒子ＬＤＬを分離する方法について鋭意検討を行い、被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオンを適当な濃度で作用させることにより、小粒子ＬＤＬとそれ以外のＬＤＬが分離されることを見いだした。さらに１価の陽イオンを追加して作用させた場合に、１価の陽イオンはイオン強度調整剤として作用し、より良好な小粒子ＬＤＬの分離を達成することができた。また、ポリアニオンと２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの代わりにＰＥＧを用いても同様の効果を得ることができた。
本発明者等は、ポリアニオンと２価の陽イオンおよび１価の陽イオンを組み合わせた場合、またはＰＥＧを用いた場合のそれぞれの濃度について詳細な検討を行い、これら濃度範囲を規定することで、ＬＤＬ粒子の中でも小粒子ＬＤＬ以外のＬＤＬを凝集させ小粒子ＬＤＬを分離する条件を見いだした。この反応により小粒子ＬＤＬ以外のＬＤＬは凝集物を形成し、遠心分離やフィルター処理により反応液中から取り除くことができる。さらに分離後の反応液にＬＤＬコレステロール測定用試薬またはＬＤＬ中中性脂肪測定用試薬または抗ヒトアポ蛋白Ｂ抗体を作用させることにより、小粒子ＬＤＬ中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を定量することが可能となり、本発明を完成するに至った。
上述のイオン強度の差により小粒子ＬＤＬを混濁または溶解させ吸光度の差により小粒子ＬＤＬを測定する方法（特開２００３−２８８８２号公報）と比べて、本発明では分離後の小粒子ＬＤＬをコレステロール、中性脂肪、蛋白質の形で測定するため特異性や精度において優れている。
すなわち、本発明は以下の方法およびキットを提供する。
（１） 被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白をそれ以外の低比重リポ蛋白と分離する第１工程と、分離した小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール、中性脂肪または蛋白質を測定する第２工程から成る、被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白の定量方法、
（２） 前記第１工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離にポリアニオンおよび２価の陽イオンを用いることを特徴とする（１）の方法、
（３） 前記第１工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離に、さらに１価の陽イオンを用いることを特徴とする（１）または（２）の方法、
（４） 前記第１工程で使用されるポリアニオンがヘパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリアニオンであることを特徴とする（２）または（３）の方法、
（５） 前記第１工程で使用される２価の陽イオンがＭｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋からなる群から選択される２価の陽イオンであることを特徴とする（２）から（４）のいずれかの方法、
（６） 前記第１工程で使用される１価の陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋およびＬｉ＋からなる群から選択される１価の陽イオンであることを特徴とする（３）または（５）の方法、
（７） 被検体試料にポリアニオンを添加したときのポリアニオンの最終濃度が、ヘパリンの場合１０〜２５０Ｕ／ｍＬ、デキストラン硫酸の場合０．０２〜１．２５％、リンタングステン酸の場合０．０２〜１．２５％である（４）から（６）のいずれかの方法、
（８） 被検体試料に２価の陽イオンを添加したときの２価の陽イオンの最終濃度が、Ｍｎ２＋の場合２．５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋の場合２．５〜１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋の場合１〜７５ｍｍｏｌ／Ｌである（５）から（７）のいずれかの方法、
（９） 被検体試料に１価の陽イオンを添加したときの１価の陽イオンの最終濃度が、０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである（６）から（８）のいずれかの方法、
（１０） 前記第１工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離にＰＥＧを用いることを特徴とする（１）の方法、
（１１） 被検体試料にＰＥＧを添加したときのＰＥＧの最終濃度が、２〜５％である（１０）の方法、
（１２） 前記第２工程のコレステロール測定が、分画操作を要しない低比重リポ蛋白中コレステロールの定量試薬を用いることを特徴とする（１）から（１１）のいずれかの方法、
（１３） 前記第２工程の中性脂肪測定が、分画操作を要しない低比重リポ蛋白中中性脂肪定量試薬を用いることを特徴とする（１）から（１１）のいずれかの方法、
（１４）前記第２工程の蛋白測定が、抗ヒトアポ蛋白Ｂ抗体を用いることを特徴とする（１）から（１１）のいずれかの方法、
（１５） 被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオンを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、被検体試料から小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（１６） 被検体試料に、さらに１価の陽イオンを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、（１５）の方法、
（１７） ポリアニオンがヘパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリアニオンであることを特徴とする（１５）または（１６）の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（１８） ２価の陽イオンがＭｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋からなる群から選択される２価の陽イオンであることを特徴とする（１５）から（１７）のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（１９） １価の陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋およびＬｉ＋からなる群から選択される１価の陽イオンであることを特徴とする（１５）から（１８）のいずれかに記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（２０）被検体試料にポリアニオンを添加したときのポリアニオンの最終濃度が、ヘパリンの場合１０〜２５０Ｕ／ｍＬ、デキストラン硫酸の場合０．０２〜１．２５％、リンタングステン酸の場合０．０２〜１．２５％である（１７）から（１９）のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（２１） 被検体試料に２価の陽イオンを添加したときの２価の陽イオンの最終濃度が、はＭｎ２＋の場合２．５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋の場合２．５〜１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋の場合１〜７５ｍｍｏｌ／Ｌである（１８）から（２０）のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（２２） 被検体試料に１価の陽イオンを添加したときの１価の陽イオンの最終濃度が、０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである（１９）から（２１）のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（２３） 被検体試料にＰＥＧを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、被検体試料から小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（２４）被検体試料にＰＥＧを添加したときのＰＥＧの最終濃度が２〜５％である（２３）の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、
（２５）ポリアニオンおよび２価の陽イオンを含む分離剤および低比重リポ蛋白測定試薬を含む、小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定することによる小粒子低比重リポ蛋白測定用キット、
（２６） 分離剤が、さらに１価の陽イオンを含む（２５）の小粒子低比重リポ蛋白測定用キット、
（２７） ＰＥＧを含む分離剤および低比重リポ蛋白測定試薬を含む、小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定することによる小粒子低比重リポ蛋白測定用キット、
（２８） ポリアニオンがヘパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリアニオンであることを特徴とする（２５）または（１６）のキット、
（２９） ２価の陽イオンがＭｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋からなる群から選択される２価の陽イオンであり，１価の陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋およびＬｉ＋からなる群から選択される１価の陽イオンであであることを特徴とする（２６）または（２８）のキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００２−３５５１１９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の第１工程の方法を示す図である。
図２は、実施例１における本発明の第一工程の効果を示す図である。
図３は、実施例２における本発明法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。
図４は、実施例３における本発明法による小粒子ＬＤＬ中アポＢの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中アポＢの測定値との相関性を示す図である。
図５は、実施例４における本発明法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。
図６は、実施例５における本発明法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。
図７は、実施例６における本発明法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。
図８は、実施例７における本発明法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。
図９は、実施例８における本発明法による小粒子ＬＤＬ中中性脂肪の測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中中性脂肪の測定値との相関性を示す図である。
図１０は、実施例９における本発明法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子ＬＤＬ中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の方法は、第１工程および第２工程からなる。第１工程では被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオンからなる分離液、ポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンからなる分離液またはＰＥＧを添加し、一定時間反応後ＶＬＤＬおよび小粒子ＬＤＬ以外のＬＤＬを凝集させ、遠心分離やフィルターにより除去する。続く第２工程では小粒子ＬＤＬ中のコレステロールや中性脂肪や蛋白質を定量する。第１工程では上記リポ蛋白除去後の溶液中に小粒子ＬＤＬの他ＨＤＬが残るが、ＬＤＬコレステロール測定試薬またはＬＤＬ中の中性脂肪測定試薬または抗ヒトアポＢ抗体を作用させることにより、小粒子ＬＤＬの成分のみを分別測定することができる。
上述のように、リポタンパク質は大きくＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬの分画に分けられ、ＬＤＬはさらに小粒子ＬＤＬとそれ以外の亜分画に分けられる。小粒子ＬＤＬをＳＬＤＬ（ｓｍａｌｌ ＬＤＬ）、Ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ、ｄｅｎｓｅ ＬＤＬと呼ぶこともあり、またそれ以外のＬＤＬをＬＬＤＬ（ｌａｒｇｅ ＬＤＬ）、Ｌｉｇｈｔ ＬＤＬと呼ぶこともある。これらの分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。その粒子サイズの直径は、報告者により異なるがＶＬＤＬが３０ｎｍ〜８０ｎｍ（３０ｎｍ〜７５ｎｍ）で、ＬＤＬが２２ｎｍ〜２８ｎｍ（１９ｎｍ〜３０ｎｍ）、ＨＤＬが直径７〜１０ｎｍである。比重は、ＶＬＤＬが１．００６以下、ＬＤＬが１．０１９〜１．０６３、ＨＤＬが１．０６３〜１．２１である。ＬＤＬ粒子直径はグラジエントゲル電気泳動（ＧＧＥ）（ＪＡＭＡ，２６０，ｐ．１９１７−２１，１９８８）、ＮＭＲ（ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＬＩＰＯＰＲＯＴＥＩＮ ＴＥＳＴＩＮＧ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｎａｄｅｒ Ｒｉｆａｉ他編、ｐ．６０９−６２３、ＡＡＣＣ ＰＲＥＳＳ：ＴｈｅＦａｔｓ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｕｍｍｅｒ ２００２、ＬＶＤＤ １５ ＹＥＡＲ ＡＮＮＩＶＥＲＳＡＲＹ ＩＳＳＵＥ、Ｖｏｌｕｍｅ ＡＶＩ Ｎｏ．３、ｐ．１５−１６）により測定でき、比重は超遠心分離による分析（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，１０６，ｐ．２４１−２５３，１９９４：Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，８３，ｐ．５９，１９９０）に基づいて決定できる。
本発明の方法で測定しようとする小粒子ＬＤＬは、一般的にはＬＤＬ画分のうち直径が約２２．０〜約２５．５ｎｍの亜分画、比重１．０４０〜１．０６３の亜分画を指す。ＬＤＬを大きさにより亜分画に分けているのは、ＬＤＬのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、ＬＤＬの中でもより悪性度が高いので、ＬＤＬの中でも小さいものを分別測定する必要があったからである。ＬＤＬ内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものが特に悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重１．０４０〜１．０６３という値も小粒子ＬＤＬの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえるＬＤＬの比重範囲１．０１９〜１．０６３を中央点で分けたものである。例えば、別の報告では１．０４４〜１．０６０に分画される（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：１０６ ２４１−２５３ １９９４）。小粒子ＬＤＬの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合の小粒子ＬＤＬの存在が臨床的な悪性度と関連している。
本発明において、小粒子ＬＤＬという場合、ＬＤＬのうち比重が小さいものであって、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外のＬＤＬよりも大きいもの、好ましくはＬＤＬの比重範囲のうち中央点より上の比重範囲に属するもの、さらに好ましくは比重１．０４０〜１．０６３の範囲に属するＬＤＬをいう。
本発明の方法で用いる被検体試料は、血清または血漿、好ましくは血清である。第１工程において、適当な体積の被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオン、またはポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンをポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの最終濃度が特定の範囲内になるように添加する。小粒子ＬＤＬとそれ以外のＬＤＬの分離はポリアニオンと２価の陽イオンの存在下で行うことができるが、さらに１価の陽イオンを存在させることにより１価の陽イオンがイオン強度調整剤として作用し、より良好な小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分の分離を達成することができる。この際、特定の濃度のポリアニオンおよび２価の陽イオンからなる分離液、または特定の濃度のポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンからなる分離液をあらかじめ調製しておいて、これを添加してもよいし、特定の濃度のポリアニオンおよび２価の陽イオンおよび１価の陽イオンを別々に調整しておいて、それぞれを別々に添加してもよい。別々に添加する場合の被検体試料への添加順序は限定されない。ポリアニオンおよび２価の陽イオンからなる分離剤、またはポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンからなる分離液を用いる場合、分離液の溶媒として、精製水、生理食塩水および各種緩衝液を用いることができる。分離液のｐＨは３〜８が好ましい。
第１工程で用いるポリアニオンとしてはヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などを好適に用いることができる。被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオン、またはポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンを添加した後のポリアニオンの最終濃度は濃度はヘパリンの場合１０〜２５０Ｕ／ｍＬ、リンタングステン酸の場合０．０２〜１．２５％、デキストラン硫酸の場合０．０２〜１．２５％が好ましい。
第１工程で用いる２価金属イオンにはＭｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋を用いることができ、好適にはＭｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋が用いられる。被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオンを添加した後の２価の陽イオンの最終濃度は、ポリアニオンとしてヘパリンを用いた場合のＭｎ２＋濃度は７．５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋濃度は４０〜１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度は５０〜７５ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、リンタングステン酸を用いた場合のＭｎ２＋濃度は２．５〜７．５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋濃度は２．５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度は１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。デキストラン硫酸を用いた場合のＭｎ２＋濃度は２．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋濃度は７．５〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度は５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
また、さらに第１工程で１価の陽イオンを用いる場合、１価金属イオンにはＮａ＋、Ｋ＋、Ｌｉ＋を好適に用いることができる。１価の陽イオンの最終濃度は、０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌが望ましい。
例えば、被検体試料１００μＬにポリアニオンと２価の陽イオンを含む分離剤、またはポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンを含む分離剤１００μＬを添加する。この際の、分離剤中のポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの濃度は被検体試料と分離剤を混合したときのポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの濃度が上記最終濃度になるように調製しておけばよい。分離剤中のポリアニオンの濃度は、ヘパリンの場合２０〜５００Ｕ／ｍＬ、リンタングステン酸の場合０．０４〜２．５％、デキストラン硫酸の場合０．０４〜２．５％が好ましい。また、分離剤中の２価陽イオンの濃度は、ポリアニオンとしてヘパリンを用いた場合のＭｎ２＋濃度は１５〜７０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋濃度は８０〜２５０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度は１００〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、リンタングステン酸を用いた場合のＭｎ２＋濃度は５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋濃度は５〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度は２〜６０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。デキストラン硫酸を用いた場合のＭｎ２＋濃度は５〜２０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋濃度は１５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋濃度は１０〜４０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。１価の陽イオンの濃度は０〜１００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオン、またはポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンを添加した後、反応混液を攪拌し、第１工程の反応を行わせる。
第１工程での反応は２℃〜４５℃の温度で行うことが好ましく、２０℃〜３７℃で行うことがさらに好ましい。
第１工程での反応は１分〜３０分間の時間で行うことが好ましく、５分〜１５分間の時間で行うことがさらに好ましい。
なお、第１工程において被検体試料に添加するポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの至適濃度はポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの種類の組み合わせによっても変わり、また被検体試料のｐＨ、イオン強度等の条件によっても変わってくる。従って、本発明の第１工程の反応を行う場合、常に同じ比重範囲のものが得られるとは限らず、特に上述の一般的に小粒子ＬＤＬの比重範囲とされている１．０４０〜１．０６３のものが得られるとは限らない。但し、上記濃度条件で第１工程の反応を行えば、ほぼ同等の比重を有するＬＤＬが得られ、そのＬＤＬは上記定義のＬＤＬに含まれる。さらに、小粒子ＬＤＬの比重を１．０４０〜１．０６３に固定して考えた場合であって、本発明の第１工程により得られるＬＤＬの比重がこの範囲から若干ずれたとしても、そのずれは大きくない。またＬＤＬ全体における比較的小粒子のＬＤＬを含んでいることには変わりはないので、本発明の第１工程により得られる小粒子ＬＤＬの量は、ある被検体の動脈硬化を罹患するリスクを反映している。
第１工程の小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分の分離は、ポリアニオンおよび２価の陽イオン、またはポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンの代わりにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を被検体試料に添加することによっても行うことができる。この際に用いられるＰＥＧの分子量は、４，０００〜２０，０００が望ましく、ＰＥＧの最終濃度は４〜１０％が望ましい。
第１工程の反応が終了した後、遠心分離を行い上清を得ることにより、小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分を採取することができる。この際の遠心分離条件は、９，０００ｇ〜３６，０００ｇで１〜３０分である。
また、第１工程の反応が終了した後、反応混液をフィルターにかけてもパススルーとして小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分を採取することができる。フィルターは圧力を加えてろ過するタイプのものであっても、遠心操作によりろ過するタイプのものであってもよい。この際用いるフィルターの分画サイズは、０．１０〜０．８０μｍであり、例えば、市販のマイレクス、ウルトラフリー（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製），ミニザルト（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製），ＤＩＳＭＩＣ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製），ＨＴタフリン・アクロディスク・シリンジフィルター（ＰＡＬＬ Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）等を用いることができる。
第１工程で得られた小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分中のＬＤＬのみを測定することにより、被検体試料中の小粒子ＬＤＬを定量することができる。
この際、ＬＤＬの測定は、ＬＤＬ中のコレステロールを測定するか、ＬＤＬ中の中性脂肪を測定するか、ＬＤＬ中のアポＢタンパク質を測定することにより行える。
第２工程で用いられる分画操作を要しないＬＤＬコレステロール測定方法としていくつかの方法（特開平１１−３１８４９６号公報、特開２００２−２０２３１４号公報、特開平１０−０８０３００号公報、特開平０９−３１３２００号公報、特開平１１−１５５５９５号公報、特許第３２５６２４１号公報）等があるが、これらを好適に用いることができる。
例えば、特開平１１−３１８４９６号公報の記載に従って、以下のようにして第１工程で得られた小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分中のＬＤＬを定量することができる。第１工程で得られた小粒子ＬＤＬおよびＨＤＬを含む画分を試料とし、ＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤の存在下でコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、試料中のＬＤＬ以外のリポタンパク質を消去し（ステップＡ）、次いで試料中の残存ＬＤＬを定量することができる（ステップＢ）。この際、ＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤としては、ＨＬＢ値が１３以上１５以下のポリアルキレンオキサイド誘導体が挙げられ、具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１３以上１５以下の化合物がある。ステップＡで用いられる上記界面活性剤の濃度は、０．１〜１０ｇ／Ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは０．５〜５．０ｇ／Ｌ程度である。過酸化水素を消去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルオキシダーゼを用いてフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と過酸化水素を反応させて無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。ステップＡの反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は０．２〜１．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、由来としてはシュードモナス属細菌から生成されるものが効果的である。また、コレステロールオキシダーゼの濃度は０．１〜０．７Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、細菌や酵母由来のものを用いることが好ましい。さらに、カタラーゼの濃度は４０〜１００Ｕ／ｍＬ程度が好ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合のペルオキシダーゼの濃度は０．４〜１．０Ｕ／ｍＬが好ましく、フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物の濃度としては０．４〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。ステップＢでは、被検試料中の残存コレステロールを定量する。これは、例えば、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤を加え、第１工程で加えたコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより行なうことができる。この際ＬＤＬに作用する界面活性剤としてＨＬＢ値が１１以上１３未満のポリアルキレンオキサイド誘導体が挙げられ、具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等でＨＬＢ値が１１以上１３未満の化合物が挙げられる。ステップＢのその他の好ましい反応条件は、第１工程における好ましい反応条件と同様である。
ＬＤＬを測定するための測定キットが市販されており、これらの市販の測定キットを利用して、ＬＤＬを測定してもよい。市販のキットとしては、例えばＬＤＬ−ＥＸ（Ｎ）（デンカ生研）がある。
第２工程で用いられる分画操作を要しないＬＤＬ中の中性脂肪測定方法としていくつかの方法（ＷＯ００／４３５３７号公報）等があるが、これらを好適に用いることができる。
第２工程で用いられる抗ヒトアポＢ抗体を作用させる方法としていくつかの方法（特許第２６３８１３７号公報，特開平０２−６４４５８号公報）等があるが、これらを好適に用いることができる。
本発明には、小粒子ＬＤＬを含む画分を分離するための第１工程を行うための試薬および分離した小粒子ＬＤＬを測定するための試薬を含むキットも包含される。該キットは、例えば、上述のＬＤＬ測定試薬キットならびにポリアニオンおよび２価の陽イオン（またはポリアニオンと２価の陽イオンを含む分離剤）等を含む。該キットはさらに遠心分離用チューブ、小粒子ＬＤＬ分離用フィルターを含んでいてもよい。また、該キットは、ポリアニオンおよび２価の陽イオンに加えて１価の陽イオンを含んでいてもよく、この場合ポリアニオン、２価の陽イオンおよび１価の陽イオンを含む分離剤としてこれらの物質を含んでいてもよい。さらに、該キットは、ポリアニオンおよび２価の陽イオンの代わりにポリエチレングリコールを含んでいてもよい。
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
電気泳動法により小粒子ＬＤＬを多く含むことが確認される検体及びそれ以外のＬＤＬを多く含む検体を用いて第一工程の効果を求めた。血清５０μＬに６０Ｕ／ｍＬヘパリンナトリウム及び４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２からなる分離液５０μＬを添加し、２５℃で１５分間反応させた。その後１８，５００ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を回収し、市販のディスク型ポリアクリルアミドゲルリポフォーを用いて反応性を比較した。分離液と反応前の血清は等量の生理食塩水にて希釈した後泳動した。図１に本発明の第１工程の方法を示す図を、図２に結果を示す。図２は正常なＬＤＬのみが選択的に取り除かれていることを示している。図２中、レーンＮｏ．１は小粒子ＬＤＬ以外のＬＤＬを多く含む検体の反応前の泳動結果を、レーンＮｏ．２は小粒子ＬＤＬを多く含む検体の反応前の泳動結果を、レーンＮｏ．３は小粒子ＬＤＬ以外のＬＤＬを多く含む検体の反応後の泳動結果を、レーンＮｏ．４は小粒子ＬＤＬを多く含む検体の反応後の泳動結果を示す。
【実施例２】
血清を試料とし、本発明法により小粒子ＬＤＬを測定し、その測定値を超遠心法によって得られる値と比較した。この結果を図３に示す。
すなわち、検体１００μＬに３００Ｕ／ｍＬヘパリンナトリウム及び１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる分離液１００μＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。その後１８，５００ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を回収し、市販されているキットＬＤＬ−ＥＸ（Ｎ）（デンカ生研社製）を使用して日立７１７０型自動分析装置によって小粒子ＬＤＬ中のコレステロールを測定した。超遠心法は血清と比重液を混合後、遠心を行い比重１．０４０〜１．０６３の分画を回収し、コレステロールを測定して小粒子ＬＤＬ中コレステロール値とした。図３に示すように本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例３】
血清からなる検体１００μＬに平均分子量５０００の１．５％デキストラン硫酸ナトリウム及び４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる分離液１００μＬを添加し、２５℃で１０分間反応させた。その後１８，５００ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を回収し、抗ヒトアポＢ抗体を用いた免疫比濁法（第一化学薬品 アポＢオート・Ｎ「第一」を使用）によって小粒子ＬＤＬ中のアポＢ量を測定した。超遠心法は血清と比重液を混合後、遠心を行い比重１．０４０〜１．０６３の分画を回収し、アポＢを測定して小粒子ＬＤＬ中アポＢ値とした。その結果を図４に示す。図４に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例４】
実施例２において、分離液を０．３％リンタングステン酸ナトリウム及び７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２とする以外は同様の試薬を用いて同様の操作を行い、本発明法による測定値と超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図５に示す。図５に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例５】
実施例２において、分離液を４０Ｕ／ｍＬヘパリンナトリウム及び３０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｎＣｌ２とする以外は同様の試薬を用いて同様の操作を行い、本発明法による測定値と超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図６に示す。図６に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例６】
実施例２において、分離液を５００Ｕ／ｍＬヘパリンナトリウム及び１４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２及び３４ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌとする以外は同様の試薬を用いて同様の操作を行い、本発明法による測定値と超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図７に示す。図７に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例７】
実施例２において、分離液を８％ＰＥＧ（分子量６，０００）とする以外は同様の試薬を用いて同様の操作を行い、本発明法による測定値と超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図８に示す。図８に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例８】
血清からなる検体１００μＬに１５０Ｕ／ｍＬヘパリンＮａ及び９０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる分離液１００μＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。その後１８，５００ｇで１５分間遠心分離を行い、上清を回収し、ＬＤＬ中中性脂肪測定試薬によって小粒子ＬＤＬ中の中性脂肪を測定した。超遠心法は血清と比重液を混合後、遠心を行い比重１．０４０〜１．０６３の分画を回収し、中性脂肪を測定して小粒子ＬＤＬ中中性脂肪値とした。その結果を図９に示す。図９に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
【実施例９】
血清からなる検体１００μＬに１５０Ｕ／ｍＬヘパリンＮａ及び９０ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２からなる分離液１００μＬを添加し、３７℃で１０分間反応させた。その後遠心タイプのフィルター濾過（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社のＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ（０．１μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ）を使用）を用いて１０，０００ｇで１分間遠心分離を行い、ろ液を回収後、小粒子ＬＤＬ中のコレステロールを測定し超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図１０に示す。図１０に示すように、実施例２と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
本発明によれば簡便な操作で小粒子ＬＤＬをそれ以外のＬＤＬと分離することができ、小粒子ＬＤＬ中のコレステロールまたは中性脂肪またはアポＢを分別測定することができるため臨床上極めて有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白をそれ以外の低比重リポ蛋白と分離する第１工程と、分離した小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール、中性脂肪または蛋白質を測定する第２工程から成る、被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白の定量方法。
【請求項２】
前記第１工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離にポリアニオンおよび２価の陽イオンを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離に、さらに１価の陽イオンを用いることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記第１工程で使用されるポリアニオンがヘパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリアニオンであることを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１工程で使用される２価の陽イオンがＭｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋からなる群から選択される２価の陽イオンであることを特徴とする請求項２から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１工程で使用される１価の陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋およびＬｉ＋からなる群から選択される１価の陽イオンであることを特徴とする請求項３から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
被検体試料にポリアニオンを添加したときのポリアニオンの最終濃度が、ヘパリンの場合１０〜２５０Ｕ／ｍＬ、デキストラン硫酸の場合０．０２〜１．２５％、リンタングステン酸の場合０．０２〜１．２５％である請求項４から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
被検体試料に２価の陽イオンを添加したときの２価の陽イオンの最終濃度が、Ｍｎ２＋の場合２．５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋の場合２．５〜１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋の場合１〜７５ｍｍｏｌ／Ｌである請求項５から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
被検体試料に１価の陽イオンを添加したときの１価の陽イオンの最終濃度が、０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである請求項６から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離にＰＥＧを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
被検体試料にＰＥＧを添加したときのＰＥＧの最終濃度が、２〜５％である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記第２工程のコレステロール測定が、分画操作を要しない低比重リポ蛋白中コレステロールの定量試薬を用いることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２工程の中性脂肪測定が、分画操作を要しない低比重リポ蛋白中中性脂肪の定量試薬を用いることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２工程の蛋白測定が、抗ヒトアポ蛋白Ｂ抗体を用いることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオンを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、被検体試料から小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項１６】
被検体試料に、さらに１価の陽イオンを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ポリアニオンがヘパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリアニオンであることを特徴とする請求項１５または１６に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項１８】
２価の陽イオンがＭｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋からなる群から選択される２価の陽イオンであることを特徴とする請求項１５から１７のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項１９】
１価の陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋およびＬｉ＋からなる群から選択される１価の陽イオンであることを特徴とする請求項１５から１８のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項２０】
被検体試料にポリアニオンを添加したときのポリアニオンの最終濃度が、ヘパリンの場合１０〜２５０Ｕ／ｍＬ、デキストラン硫酸の場合０．０２〜１．２５％、リンタングステン酸の場合０．０２〜１．２５％である請求項１７から１９のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項２１】
被検体試料に２価の陽イオンを添加したときの２価の陽イオンの最終濃度が、Ｍｎ２＋の場合２．５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋の場合２．５〜１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋の場合１〜７５ｍｍｏｌ／Ｌである請求項１８から２０のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項２２】
被検体試料に１価の陽イオンを添加したときの１価の陽イオンの最終濃度が、０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである請求項１９から２１のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項２３】
被検体試料にＰＥＧを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、被検体試料から小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項２４】
被検体試料にＰＥＧを添加したときのＰＥＧの最終濃度が２〜５％である請求項２３記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項２５】
ポリアニオンおよび２価の陽イオンを含む分離剤および低比重リポ蛋白測定試薬を含む、小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定することによる小粒子低比重リポ蛋白測定用キット。
【請求項２６】
分離剤が、さらに１価の陽イオンを含む請求項２５記載の小粒子低比重リポ蛋白測定用キット。
【請求項２７】
ＰＥＧを含む分離剤および低比重リポ蛋白測定試薬を含む、小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定することによる小粒子低比重リポ蛋白測定用キット。
【請求項２８】
ポリアニオンがヘパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリアニオンであることを特徴とする請求項２５または２６記載のキット。
【請求項２９】
２価の陽イオンがＭｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋からなる群から選択される２価の陽イオンであり，１価の陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋およびＬｉ＋からなる群から選択される１価の陽イオンであることを特徴とする請求項２６または２８に記載のキット。
【請求項１】
被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白をそれ以外の低比重リポ蛋白と分離する第１工程と、分離した小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール、中性脂肪または蛋白質を測定する第２工程から成る、被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白の定量方法。
【請求項２】
前記第１工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離にポリアニオンおよび２価の陽イオンを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離に、さらに１価の陽イオンを用いることを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記第１工程で使用されるポリアニオンがヘパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリアニオンであることを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１工程で使用される２価の陽イオンがＭｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋からなる群から選択される２価の陽イオンであることを特徴とする請求項２から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１工程で使用される１価の陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋およびＬｉ＋からなる群から選択される１価の陽イオンであることを特徴とする請求項３から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
被検体試料にポリアニオンを添加したときのポリアニオンの最終濃度が、ヘパリンの場合１０〜２５０Ｕ／ｍＬ、デキストラン硫酸の場合０．０２〜１．２５％、リンタングステン酸の場合０．０２〜１．２５％である請求項４から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
被検体試料に２価の陽イオンを添加したときの２価の陽イオンの最終濃度が、Ｍｎ２＋の場合２．５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋の場合２．５〜１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋の場合１〜７５ｍｍｏｌ／Ｌである請求項５から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
被検体試料に１価の陽イオンを添加したときの１価の陽イオンの最終濃度が、０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである請求項６から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離にＰＥＧを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
被検体試料にＰＥＧを添加したときのＰＥＧの最終濃度が、２〜５％である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記第２工程のコレステロール測定が、分画操作を要しない低比重リポ蛋白中コレステロールの定量試薬を用いることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２工程の中性脂肪測定が、分画操作を要しない低比重リポ蛋白中中性脂肪の定量試薬を用いることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２工程の蛋白測定が、抗ヒトアポ蛋白Ｂ抗体を用いることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
被検体試料にポリアニオンおよび２価の陽イオンを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、被検体試料から小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項１６】
被検体試料に、さらに１価の陽イオンを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ポリアニオンがヘパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリアニオンであることを特徴とする請求項１５または１６に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項１８】
２価の陽イオンがＭｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋からなる群から選択される２価の陽イオンであることを特徴とする請求項１５から１７のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項１９】
１価の陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋およびＬｉ＋からなる群から選択される１価の陽イオンであることを特徴とする請求項１５から１８のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項２０】
被検体試料にポリアニオンを添加したときのポリアニオンの最終濃度が、ヘパリンの場合１０〜２５０Ｕ／ｍＬ、デキストラン硫酸の場合０．０２〜１．２５％、リンタングステン酸の場合０．０２〜１．２５％である請求項１７から１９のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項２１】
被検体試料に２価の陽イオンを添加したときの２価の陽イオンの最終濃度が、Ｍｎ２＋の場合２．５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｍｇ２＋の場合２．５〜１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｃａ２＋の場合１〜７５ｍｍｏｌ／Ｌである請求項１８から２０のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項２２】
被検体試料に１価の陽イオンを添加したときの１価の陽イオンの最終濃度が、０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌである請求項１９から２１のいずれか１項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項２３】
被検体試料にＰＥＧを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、被検体試料から小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項２４】
被検体試料にＰＥＧを添加したときのＰＥＧの最終濃度が２〜５％である請求項２３記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。
【請求項２５】
ポリアニオンおよび２価の陽イオンを含む分離剤および低比重リポ蛋白測定試薬を含む、小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定することによる小粒子低比重リポ蛋白測定用キット。
【請求項２６】
分離剤が、さらに１価の陽イオンを含む請求項２５記載の小粒子低比重リポ蛋白測定用キット。
【請求項２７】
ＰＥＧを含む分離剤および低比重リポ蛋白測定試薬を含む、小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定することによる小粒子低比重リポ蛋白測定用キット。
【請求項２８】
ポリアニオンがヘパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリアニオンであることを特徴とする請求項２５または２６記載のキット。
【請求項２９】
２価の陽イオンがＭｎ２＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋からなる群から選択される２価の陽イオンであり，１価の陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋およびＬｉ＋からなる群から選択される１価の陽イオンであることを特徴とする請求項２６または２８に記載のキット。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５３５００
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【発行日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５８４２７（Ｐ２００４−５５８４２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５６３３
【国際出願日】平成１５年１２月５日（２００３．１２．５）
【出願人】（５９１１２５３７１）デンカ生研株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年６月２４日（２００４．６．２４）
【発行日】平成１８年４月１３日（２００６．４．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５６３３
【国際出願日】平成１５年１２月５日（２００３．１２．５）
【出願人】（５９１１２５３７１）デンカ生研株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
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