小麦種子休眠性に関与するＭＦＴ遺伝子及びその利用
【課題】種子休眠性向上遺伝子、種子休眠性向上マーカー遺伝子、種子休眠性が向上したコムギ品種を育種する方法及び種子休眠性が向上した形質転換植物体を提供する。
【解決手段】種子休眠性向上遺伝子、種子休眠性向上マーカー遺伝子、並びに、ゼンコウジコムギとその他のコムギを交配して子孫を得る交配ステップと、その子孫のゲノムＤＮＡにおいて、種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在の有無を検出する検出ステップと、検出ステップにおいて、種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在が検出された場合に、その子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断して選抜する選抜ステップとを含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法、及び、種子休眠性向上遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物体。
【解決手段】種子休眠性向上遺伝子、種子休眠性向上マーカー遺伝子、並びに、ゼンコウジコムギとその他のコムギを交配して子孫を得る交配ステップと、その子孫のゲノムＤＮＡにおいて、種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在の有無を検出する検出ステップと、検出ステップにおいて、種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在が検出された場合に、その子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断して選抜する選抜ステップとを含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法、及び、種子休眠性向上遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子休眠性向上遺伝子、種子休眠性向上マーカー遺伝子、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法及び種子休眠性が向上した形質転換植物体に関する。
【背景技術】
【０００２】
コムギなどの穀物の生産において、しばしば大きな被害をもたらす穂発芽の発生を予防することは大きな課題となっている。穂発芽とは、降雨などの影響により、収穫前の穂に実った種子が発芽してしまう現象を指し、種子の品質を著しく低下させるものである。穂発芽の発生を予防するためには、種子休眠性が高い品種の開発が必要とされており、種子休眠性に関わる遺伝子の同定やＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ、量的形質遺伝子座）マーカーの開発が求められている。ここで、種子休眠性とは、種子の発芽しにくい性質を表し、種子休眠性が高いほど発芽しにくい。
【０００３】
特許文献１には、コムギの種子休眠性に関係する遺伝子として、ＶＰ１遺伝子が報告されている。
【０００４】
コムギの種子休眠ＱＴＬに関しては多数の報告があり、これまでに少なくとも３０以上の種子休眠ＱＴＬが知られている（例えば非特許文献１を参照）。
【０００５】
非特許文献２には、シロイヌナズナの開花時期を制御する遺伝子として知られるＦＴ（Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｌｏｃｕｓ Ｔ）及びＴＦＬ１（Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｌｏｗｅｒ １）が、ＭＦＴ（Ｍｏｔｈｅｒ ｏｆ ＦＴ ａｎｄ ＴＦＬ１）遺伝子及び他の３つの遺伝子とともにＰＥＢＰ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子ファミリーを形成していることが記載されている。
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ９９／１５６６７
【非特許文献１】Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１２６，３９−４５，２００２
【非特許文献２】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，６１，５７９−５９０，２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、種子休眠性に関わる遺伝子の同定やＱＴＬマーカーの開発が求められている。そこで本発明は、コムギの種子休眠性がいかなる遺伝子の作用に起因するかを明らかにし、種子休眠性向上遺伝子及び種子休眠性向上マーカー遺伝子を提供することを目的とする。また、本発明の別の目的として、この遺伝子を用いて種子休眠性が向上したコムギ品種を育種する方法及び種子休眠性が向上した形質転換植物体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
コムギは登熟期の気温が低いほど種子休眠性が向上することが知られている。登熟とは、開花後の種子が発育し、肥大し、成熟していく過程をいう。しかしながら、登熟温度と種子における遺伝子の発現量との関係はこれまでに報告されていなかった。
【０００９】
そこで、本発明者らは、登熟時の気温が種子の胚における遺伝子発現変動に及ぼす影響を解析することにより、種子休眠性と対応して発現変動するＭＦＴ遺伝子を見出した。また、ＭＦＴ遺伝子は、登熟温度によって種子休眠性と連動して発現量が変化し、その完熟した種子の胚における発現量は、コムギ品種の種子休眠性とも強い相関を持つことを明らかにした。さらに、ＭＦＴ遺伝子は、種子休眠性が非常に高いコムギ品種として知られるゼンコウジコムギの主要な種子休眠ＱＴＬのピークと一致する位置に座乗する遺伝子であることを明らかにした。
【００１０】
すなわち本発明は、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列、（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列及び（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、且つ配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、からなる群より選択される塩基配列からなる、種子休眠性向上遺伝子を提供する。
【００１１】
配列番号１（アクセッション番号ＡＢ４５６６８８、２０１０年１０月１５日に公開予定）に記載の塩基配列は従来機能が未知であったＭＦＴ遺伝子のｃＤＮＡであり、配列番号２（アクセッション番号ＡＢ４５６６８８、２０１０年１０月１５日に公開予定）に記載のアミノ酸配列は、配列番号１のｃＤＮＡをアミノ酸に翻訳したものである。本発明者らは、ＭＦＴ遺伝子がコードするタンパク質が種子休眠性に関わる機能を持つことを初めて明らかにした。
【００１２】
本発明はまた、配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる、種子休眠性向上マーカー遺伝子を提供する。
【００１３】
配列番号３及び４に記載の塩基配列は、ＭＦＴ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列であり、種子休眠性が高いゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に存在するＭＦＴ遺伝子の塩基配列である。後述するように、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に存在するＭＦＴ遺伝子は最も作用力の強い種子休眠ＱＴＬのピークと一致するものであり、種子休眠性向上マーカー遺伝子として利用することができる。
【００１４】
別の態様において、本発明は、ゼンコウジコムギとそれ以外の品種のコムギを交配して子孫を得る交配ステップと、その子孫のゲノムＤＮＡにおいて、配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在の有無を検出する検出ステップと、検出ステップにおいて配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在が検出された場合に、その子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断して選抜する選抜ステップとを含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法を提供する。
【００１５】
この育種方法によって選抜されたコムギは、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に存在するＭＦＴ遺伝子を、その発現制御配列とともに保持しており、種子休眠性が高いことが期待できる。種子休眠性が高いコムギ品種は、穂発芽の発生を起こしにくいため、付加価値が高いコムギを安定に生産することができる。
【００１６】
本発明はまた、コムギを交配して子孫を得る交配ステップと、その子孫の種子、種子親の種子及び花粉親の種子における、種子休眠性向上遺伝子の発現量を測定する測定ステップと、測定ステップにおいて、子孫の種子における種子休眠性向上遺伝子の発現量が、種子親又は花粉親のうち、いずれか種子における種子休眠性向上遺伝子の発現量が低い親よりも高い場合に、その子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断して選抜する選抜ステップとを含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法を提供する。
【００１７】
この育種方法によって選抜されたコムギは、その種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が高いため、種子休眠性が高いことが期待できる。
【００１８】
別の態様において、本発明は、請求項１に記載の種子休眠性向上遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物体を提供する。この植物体はコムギであってもよいし、イネであってもよい。
【００１９】
このような植物体は、種子休眠性が高いため穂発芽の発生を起こしにくく、安定に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明において、種子休眠性向上遺伝子とは、従来その機能が未知であったＭＦＴ遺伝子であり、種子休眠性を向上させる機能を持つ遺伝子である。非特許文献１によれば、ＭＦＴ遺伝子はシロイヌナズナの開花時期を制御する遺伝子であるＦＴやＴＦＬ１と関連がある。そこで、ＭＦＴ遺伝子は植物の開花時期の制御に関わると予想されていた。発明者らは、この予想に反して、ＭＦＴ遺伝子は種子で発現し、開花時期の制御ではなく、種子休眠性に影響することを明らかにした。
【００２１】
種子休眠性とは、種子の発芽しにくい性質を表し、種子休眠性が高いほど発芽しにくい。種子休眠性が高ければ穂発芽の発生を予防することができ、コムギをはじめとする穀物の生産に有用である。種子休眠性は、発芽試験などによって測定することができる。発芽試験は、例えば、収穫直後の穂全体を約１５℃の水に約２４時間浸して吸水させ、続いて、吸水後の穂を密閉容器中に立て、約１５℃に設定したチャンバー内でインキュベートし、１０日後、発芽した種子の数の、穂の全種子に対する割合として測定することができる。穂発芽の発生を予防するためには、上記の方法で測定した発芽率が、１０〜０％であることが好ましく、５〜０％であることがより好ましく、０％であることが最も好ましい。
【００２２】
一つの態様において、本発明は、ゼンコウジコムギとそれ以外の品種のコムギを交配して子孫を得る交配ステップと、その子孫のゲノムＤＮＡにおいて、配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在の有無を検出する検出ステップと、検出ステップにおいて配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在が検出された場合に、その子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断する選抜ステップとを含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法を提供する。
【００２３】
ゼンコウジコムギは種子休眠性が高い品種である。コムギの全ゲノム配列は未だ決定されていないため、コムギゲノムの解析は非常に困難であるが、発明者らは、ゼンコウジコムギのゲノム上に複数のＭＦＴ遺伝子が存在し、その中でも３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子が種子の胚における発現量が高く、種子休眠性に大きく寄与していることを見出した。これは、３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子の発現制御配列が種子の胚における発現に特に適しているためだと考えられる。発明者らは、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子のゲノム配列を明らかにした。この塩基配列を配列番号３及び４に示す。発明者らは、下記に示す検討の結果、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕上には、配列番号３及び４に示す２つのＭＦＴ遺伝子が存在することを明らかにした。
【００２４】
上記の育種方法において、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子を受け継いだ子孫は種子休眠性が高いと判断できる。そこで、子孫のゲノムＤＮＡ上に配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子が存在するか否かを検出することによって、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子を受け継いでいるか否かを判断する。このためには、例えば次のような方法を用いることができる。
【００２５】
まず、子孫のコムギからゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出方法は特に制限されないが、例えば０．１ｇ程度の若い葉を採取し、液体窒素を加えてすり鉢上で磨砕し、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて取扱説明書にしたがって抽出することができる。この操作により、数１０ｎｇ／μＬの濃度のＤＮＡ溶液約２００μＬを得ることができる。
【００２６】
続いて、得られたゲノムＤＮＡ上に配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子が存在するか否かを検出する。この検出方法は特に制限されないが、例えば配列番号３又は４に記載の塩基配列に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを行い、目的とするサイズの増幅断片が増幅されるか否かによって検出することができる。
【００２７】
発明者らは、後述するように、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子（配列番号３及び４）を区別可能な配列を同定し、この領域を特異的に増幅することができるプライマーＣＳＺＥＮＭＴＦＳＳＲ−Ｆ１（配列番号２６）及びＣＳＺＥＮＭＴＦＳＳＲ−Ｒ１（配列番号２７）を作成した。これらのプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行えば、その増幅断片の長さの違いからゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子であるか否かを区別することができる。そこで、例えば、これらのプライマーを用いたＰＣＲ解析によって、上記の子孫のコムギから抽出したゲノムＤＮＡ上にゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子が存在するか否かを判断することができる。
【００２８】
別の態様において、本発明は、コムギを交配して子孫を得る交配ステップと、その子孫の種子、種子親の種子及び花粉親の種子における、種子休眠性向上遺伝子の発現量を測定する測定ステップと、測定ステップにおいて、子孫の種子における種子休眠性向上遺伝子の発現量が、種子親又は花粉親のうち、いずれか種子における種子休眠性向上遺伝子の発現量が低い親よりも高い場合に、その子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断して選抜する選抜ステップとを含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法を提供する。
【００２９】
発明者らは、後述するように、種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が高いほど種子休眠性が高い傾向があることを明らかにした。したがって、コムギを交配した子孫の中から、その種子親及び花粉親いずれかの親のうち、その種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が低い親と比較した場合に、種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が高まった子孫を選別することにより、種子休眠性が向上したコムギを得ることができる。この場合、一般的に、種子親及び花粉親いずれかの親のうち、その種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が低い親は、種子休眠性以外の優良な形質を持つ。ここで、優良な形質とは、例えば、高収量性、良品質、耐病性などの形質である。
【００３０】
上記の育種方法の比較ステップにおいて、子孫、種子親及び花粉親の種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量を測定する。この方法は特に制限されないが、例えば次のような定量ＰＣＲによって行うことができる。
【００３１】
まず、子孫、種子親及び花粉親の種子から全ＲＮＡを抽出する。全ＲＮＡは種子の胚から抽出することが好ましい。ＲＮＡ抽出には、例えばＴｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン社）などを用いることができる。続いてこの全ＲＮＡをもとにファーストストランドｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成には、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社）を用いることができる。続いて、これらのｃＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行う。ここで、例えばグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子などのハウスキーピング遺伝子を内部標準として使用し、ＭＦＴ遺伝子の発現を定量するとよい。この場合のＭＦＴ遺伝子は、３Ａ染色体短腕に存在するものに限定する必要はなく、他の染色体から発現するＭＦＴ遺伝子も合わせて検出することが好ましい。例えば後述するＱＲＴ−ＭＴＦ−Ｆ２（配列番号１３）及びＴａＭＴＦ−Ｒ３（配列番号１４）のプライマーを用いることにより、どの染色体に由来するかに関わらず全てのＭＦＴ遺伝子をＰＣＲ増幅することが可能である。
【００３２】
得られた定量ＰＣＲの結果をもとに、種子休眠性が向上した子孫を選別する。種子親及び花粉親いずれかの親のうち、その種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が低い親と比較した場合に、種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が高まった子孫は、種子休眠性が向上したコムギであると判断することができる。
【００３３】
別の態様において、本発明はＭＦＴ遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物体を提供する。対象とする植物体は種子休眠性の向上が望まれる植物であれば特に制限されないが、実施例において後述するように、コムギやイネであってよい。この育種方法は、遺伝子導入によって、植物体におけるＭＦＴ遺伝子の発現量を増加させることにより、種子休眠性を向上させるものである。
【００３４】
まず、ＭＦＴの発現ベクターを構築する。発現ベクターは、植物体内で発現可能なプロモーター、ＭＦＴ遺伝子配列、翻訳終結配列を含む。発現ベクターはまた、必要に応じて、大腸菌における複製起点、大腸菌における選択マーカー（アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子など）、植物体における選択マーカー（カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス（ｂａｒ）耐性遺伝子など）、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列などを更に含んでもよい。
【００３５】
植物体内で発現可能なプロモーターとしては、種子特異的な発現を誘導するものであってもよく、組織に関係なく構成的に発現するものであってもよい。例えばユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、Ｅｍプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどが例示できるが、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターが好ましい。
【００３６】
コムギへの遺伝子導入は、一般的なパーティクルボンバードメント法を用いて行うことができる。例えば、金粒子にまぶしたＭＦＴの発現ベクターＤＮＡを、パーティクルボンバードメント法を用いて、小麦未熟種子から取り出した未熟胚に打ち込むことにより遺伝子導入する。続いて、遺伝子導入した未熟胚を、植物ホルモンであるオーキシンなどを含む培地で培養後、オーキシンの濃度を下げることにより、個体を再分化させて形質転換植物体を得ることができる。例えば、ビアホラス耐性遺伝子を含むＭＦＴの発現ベクターをコムギに導入した場合、導入遺伝子を取り込んだ形質転換植物体は、ビアホラス耐性となるので、ビアホラスを添加した培地を用いることにより選抜することができる。
【００３７】
イネへの遺伝子導入は、一般的なアグロバクテリウム法を用いて行うことができる。例えば、イネの種子を脱穀して次亜塩素酸で滅菌後、オーキシンを含む培地に置床し、種子由来のカルスを誘導する。続いて、このカルスを、ＭＦＴの発現ベクターを導入したアグロバクテリウムの溶液に浸してアグロバクテリウムに感染させることにより、発現ベクターのライトボーダーとレフトボーダーの間に導入されているＤＮＡを植物体の核に組み込ませる。例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＭＦＴの発現ベクターをイネに導入した場合、遺伝子を取り込んだ形質転換体は、ハイグロマイシン及びアグロバクテリウムを除菌するためのカルベニシリンなどの除菌剤を添加した培地で選抜することができる。その後、オーキシンを除いた再分化培地で培養して再分化させ、続いて、発根培地へと移し変えることにより、ＭＦＴ遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物体を得ることができる。
【００３８】
これらのＭＦＴ遺伝子を発現可能に保持する植物体は、種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が増加しており、種子休眠性が向上しているため、穂発芽の発生を予防することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。
【００４０】
〔実施例１〕
コムギ種子の登熟温度と休眠性の検討
（コムギの栽培）
コムギ品種農林６１号を温室で栽培した。開花後、コムギを複数の群に分け、温室の温度をそれぞれ１３、１５、１７、２０、２３及び２５℃に設定した。開花後所定の日数後に穂を収穫した。
【００４１】
（発芽試験）
収穫した穂を使用して発芽試験を行い、種子休眠性を検討した。発芽試験は次のようにして行った。まず、収穫直後の穂全体を１５℃の水に約２４時間浸して吸水させた。続いて、吸水後の穂を密閉容器中に立て、１５℃に設定したチャンバー内でインキュベートした。１０日後、発芽した種子の数を数え、穂の全種子を基準として種子の発芽率を測定した。試験は各組５本の穂を３組ずつ用いて行った。
【００４２】
結果を図１のグラフに示す。グラフの縦軸は発芽率を表し、横軸は種子を収穫した開花後の日数を表す。登熟温度が低くなるほど種子の発芽率が低下し、休眠性が高まることが示された。
【００４３】
〔実施例２〕
農林６１号とシロガネコムギの種子の発芽率と含水率の検討
（コムギの栽培）
コムギ品種農林６１号及びシロガネコムギを温室で栽培した。開花後、それぞれのコムギを２つの群に分け、温室の温度を１３℃及び２５℃に設定した。開花後所定の日数後に穂を収穫し、実施例１と同様にして発芽率の推移を検討した。
【００４４】
（種子の含水率の測定）
発芽率と同時に種子の含水率も測定した。含水率は種子の登熟の進行具合の目安となる。種子が完熟すると含水率が約１５％以下になり、この値は品種によってあまり変化しないことが知られている。収穫した種子を８０℃で４８時間乾燥させ、乾燥の前後の種子の質量を測定し、その質量の差から次式（１）により含水率を計算した。
含水率（質量％）＝乾燥の前後の種子の質量の差／乾燥前の種子の質量×１００…（１）
【００４５】
結果を図２のグラフに示す。グラフの縦軸は発芽率又は含水率を表し、横軸は種子を収穫した開花後の日数を表す。２５℃で登熟させたコムギに比較して１３℃で登熟させたコムギは発芽率が低下し、休眠性が高まることが示された。また、農林６１号はシロガネコムギよりも１３℃で登熟させた場合の発芽率が低く、休眠性がより高いことが示された。
【００４６】
〔実施例３〕
登熟温度が異なる完熟種子胚における遺伝子発現変動の解析
（ＲＮＡサンプルの調製）
コムギ品種農林６１号を栽培し、１３℃で登熟させて開花７６日後に収穫した種子の胚と、２５℃で登熟させて開花３４日後に収穫した種子の胚から全ＲＮＡを抽出した。また、コムギ品種シロガネコムギを栽培し、１３℃で登熟させて開花８０日後に収穫した種子の胚と、２５℃で登熟させて開花３８日後に収穫した種子の胚から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出にはＴｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン社）を用いた。抽出した全ＲＮＡの量及び純度を吸光的に測定し、ＲＮＡが分解を受けていないかアジレント２１００バイオアナライザー（アジレント・テクノロジー社）を用いて確認した。
【００４７】
（マイクロアレイ解析）
抽出した全ＲＮＡ各３００ｎｇをＬｏｗ ＲＮＡ Ｉｎｐｕｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ／Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ （アジレント・テクノロジー社）を用いて取扱説明書にしたがってＣｙ３及びＣｙ５で標識した。標識されたサンプルのｃＲＮＡ各８５０ｎｇを、コムギＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）に由来する３７８２６個のプローブを有するアジレントコムギオリゴマイクロアレイ（４４Ｋ；木原生物学研究所の注文によりアジレント・テクノロジー社が製造した）とのハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイスライドをスキャンした。スキャナーにはＧ２５０５Ｂ（アジレント・テクノロジー社）を用い、ソフトウエアにはＧ２５６５ＢＡ（アジレント・テクノロジー社）を用いた。
【００４８】
（データ解析）
得られたデータを初期設定のＦｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン ９．１；アジレント・テクノロジー社）を用いて解析した。全てのマイクロアレイ操作手順及びデータ解析は取扱説明書（アジレント・テクノロジー社）にしたがって行った。データはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３ ソフトウエア（アジレント・テクノロジー社）を用いて解析した。
【００４９】
図３に農林６１号のＲＮＡサンプルを用いて解析したデータを示す。１３℃及び２５℃で登熟させた種子の胚において、シグナル強度が５００以上の遺伝子を比較した結果、約１８００個の遺伝子が２倍以上の発現差を示した。これらの遺伝子のうち、発現変動の差が２番目に大きい遺伝子として、ＭＦＴ遺伝子が見出された。農林６１号のサンプルにおいて、１３℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量は２５℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量の１５倍であった。また、シロガネコムギのサンプルにおいて、１３℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量は２５℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量の９倍であった。
【００５０】
〔実施例４〕
定量ＰＣＲによる発現変動の確認
（ｃＤＮＡの合成）
実施例３で抽出したコムギ品種農林６１号及びシロガネコムギの全ＲＮＡをもとに、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社）を用いてファーストストランドｃＤＮＡを合成した。
【００５１】
（定量ＰＣＲ）
合成したｃＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行い、ＭＦＴ遺伝子の発現量を定量した。定量ＰＣＲ用のプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ６（ＭＢＩ社）を用いて設計した。使用したプライマー配列を表１に示す。定量ＰＣＲは７５００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライド バイオシステムズ社）及びＳＹＢＲプレミックスＥｘＴａｑキット（タカラバイオ）を用いて行った。コムギのグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を内部標準として使用した。ＰＣＲ条件は９４℃２分を１サイクル、９５℃１５秒及び６０℃１分を４０サイクルであった。得られたデータは、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ（アプライド バイオシステムズ社）の標準曲線法により解析した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
定量ＰＣＲの結果を図４に示す。マイクロアレイ解析の結果と同様に、定量ＰＣＲの結果からも、１３℃及び２５℃で登熟させた種子の胚の間で、ＭＦＴ遺伝子の発現量に差があることが確認された。農林６１号のサンプルにおいて、１３℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量は２５℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量の９倍であった。また、シロガネコムギのサンプルにおいて、１３℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量は２５℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量の１１倍であった。
【００５４】
〔実施例５〕
ＭＦＴ遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの単離
成熟した胚から抽出した全ＲＮＡをもとに合成したファーストストランドｃＤＮＡのＰＣＲにより、ＭＦＴ遺伝子のｃＤＮＡを単離した。全ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン社）を用いて抽出した。ファーストストランドｃＤＮＡ合成はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて行った。また、ＭＦＴ遺伝子の全長又は一部のゲノムＤＮＡをＰＣＲによって単離した。ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの単離に用いたＰＣＲプライマーを表２にまとめた。単離した遺伝子の塩基配列はＢｉｇＤｙｅ バージョン３．０ ターミネーター試薬（アプライド バイオシステムズ社）を用いて３１００ Ａｖａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにより決定した。決定された配列はＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ソフトウエア バージョン２．０（日立ソフトウエア）及びＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ４．１（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ社）を用いて解析した。アミノ酸配列のアラインメントはＣｌｕｓｔａｌＷ バージョン１．８３（Ｔｈｏｍｏｐｓｏｎ ら、１９９４）を用いて日本ＤＮＡデータバンクのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）で行った。アラインメントの結果はＢＯＸＳＨＡＤＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／）を用いて表示した。
【００５５】
【表２】
【００５６】
図５にコムギ品種Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（Ｔｍ）（配列番号５、アクセッション番号ＡＢ４５６６８７、２０１０年１０月１５日に公開予定）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ（Ｔｂ）（配列番号６、アクセッション番号ＡＢ４５６６８６、２０１０年１０月１５日に公開予定）、チャイニーズスプリング（ＣＳ）（配列番号７）、ゼンコウジコムギ３Ａ染色体（Ｚｅｎ（３Ａ））（配列番号２）、ゼンコウジコムギ３Ｄ染色体（Ｚｅｎ（３Ｄ））（配列番号８、アクセッション番号ＡＢ４５６６８９、２０１０年１０月１５日に公開予定）、イネ（Ｒｉｃｅ）（配列番号９）及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（配列番号１０）のＭＦＴ遺伝子のアミノ酸配列をアラインメントした結果を示す。
【００５７】
〔実施例６〕
２倍体コムギを用いたＭＦＴ遺伝子のマッピング
（マッピング集団）
ＭＦＴ遺伝子のマッピングには、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ ＫＴ３−５株（Ｔｍ）とＴｒｉｔｉｃｕｍ ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ ＫＴ１―１株（Ｔｂ）の交配により得られた組換え自殖系統の２倍体マッピング集団１１５個体を用いた。この集団は横浜市立大学木原生物学研究所において単粒系統法により作出された。２倍体コムギ集団の遺伝子型データはウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈｉｇｅｎ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｗｈｅａｔ／ｋｏｍｕｇｉ／ｔｏｐ／ｔｏｐ．ｊｓｐ）で入手可能である。
【００５８】
（ＴｍおよびＴｂのＭＦＴ遺伝子の塩基配列の決定）
Ｔｍ及びＴｂのＭＦＴ遺伝子のイントロン領域を含むゲノム配列を、プライマーＴａＭＴＦ−Ｆ３（配列番号１６）及びＴａＭＴＦ−Ｒ２（配列番号１７）を用いたＰＣＲ法により単離した。鋳型には２倍体コムギの胚から抽出したゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲ増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｗｉｔｈ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）を用いた。ＰＣＲ法により増幅された断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製し、断片を直接シークエンスするダイレクトシークエンス法により２倍体コムギＴｍおよびＴｂのＭＦＴ遺伝子の塩基配列を決定した。
【００５９】
（多型解析）
２倍体マッピング集団１１５個体全てについて、ＭＦＴ遺伝子の多型を解析した。多型解析には、ＣＡＰＳ法（Ｔｈｅ ｃｌｅａｖｅｄ−ｌｅｎｇｔｈ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ）を用いた。２倍体マッピング集団それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＴａＭＴＦ−Ｆ３（配列番号１６）及びＴａＭＴＦ−Ｒ３（配列番号１４）プライマーを用いてＰＣＲ増幅後、増幅断片を制限酵素ＨｉｎｆＩで切断し、３％Ｍｅｔａｐｈｏｒゲル（タカラバイオ社）及び０．５×ＴＢＥバッファーを用いて電気泳動し、増幅断片のサイズの違いから多型を判別した。ＰＣＲの条件は、９４℃１分を１サイクル、９４℃２０秒、６０℃３０秒及び７２℃１分を４０サイクルであった。
【００６０】
（遺伝子地図の作成）
多型解析の結果をもとに遺伝子地図を作成した。遺伝子地図は、Ｋｏｓａｍｂｉ関数（Ｋｏｓａｍｂｉ、１９４４）を用いて、ＪｏｉｎＭａｐ、バージョン３．０（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｓ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、オランダ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｏｉｎｍａｐ．ｎｌ）により作成した。また、イネホモログの染色体位置はウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＩＲＧＳＰ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）のデータを用いて決定した。Ｔｍの３Ａ染色体（３Ａｍ）の遺伝子地図を図６（Ｂ）に示す。ＭＦＴ遺伝子は、第３染色体短腕に位置することが明らかになった。この領域には、図６（Ａ）に示すように、ゼンコウジコムギの最も作用力の強い種子休眠ＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ、量的形質遺伝子座）が座乗する。
【００６１】
〔実施例７〕
６倍体コムギを用いたＭＦＴ遺伝子のマッピング
（チャイニーズスプリング及びゼンコウジコムギのＭＦＴ遺伝子の部分ゲノム配列の決定）
６倍体コムギであるゼンコウジコムギとチャイニーズスプリングのＭＦＴ遺伝子の３つのイントロン領域を含むゲノム領域の配列を決定した。これらのコムギのゲノムＤＮＡをＴａＭＴＦ−Ｆ３（配列番号１６）及びＴａＭＴＦ−Ｒ２（配列番号１７）プライマーを用いてＰＣＲ増幅後、ＴＯＰＯクローニングキット（インビトロジェン社）を用いて、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ ベクター（インビトロジェン社）にクローニングし、ケミカル法にてＴＯＰ１０コンピテントセル（インビトロジェン社）を形質転換した。続いて、得られた大腸菌を培養し、プラスミドＤＮＡを抽出して塩基配列を決定した。後述する検討の結果、ゼンコウジコムギのゲノムＤＮＡに特異的な配列であることが明らかとなったＭＦＴ遺伝子のゲノム配列を配列番号３及び４に示す。
【００６２】
（ゲノム配列の座乗染色体の決定）
チャイニーズスプリングには、４種類のＭＦＴ遺伝子配列が存在することが明らかとなった。これらのＭＦＴ遺伝子のゲノム配列を、以下、それぞれＣＳ３（配列番号２２）、ＣＳ４（配列番号２３）、ＣＳ６（配列番号２４）、ＣＳ８（配列番号２５）と呼ぶ。これらのＭＦＴ遺伝子が、それぞれ３Ａ、３Ｂ及び３Ｄ染色体のうちのどの染色体に由来するものかを同定するため、チャイニーズスプリングの６個のダイテロソミック系統を使用して検討した。Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウエアを使用して、各ＭＦＴ遺伝子に対応する少なくとも１つのＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）プライマーセットを設計した。ＰＣＲに基づいた解析の結果、ＣＳ６遺伝子及びＣＳ３遺伝子に特異的な増幅断片が、それぞれダイテロ３ＡＬ（３Ａ染色体短腕を欠失した系統）及びダイテロ３ＤＬ（３Ｄ染色体短腕を欠失した系統）中で認められなかった。この結果から、３Ａ染色体の短腕がＣＳ６遺伝子を保持しており、３Ｄ染色体の短腕がＣＳ３遺伝子を保持していることが示唆された。
【００６３】
（ＣＳ６遺伝子に対する多型マーカーの作出）
ゼンコウジコムギの主要な種子休眠ＱＴＬは、３Ａ染色体短腕上に座乗していることから、このＣＳ６遺伝子に関して、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕上のＭＦＴ遺伝子との間で多型を検出できるマーカーを作製した。ゼンコウジコムギ及びチャイニーズスプリングの得られたすべてのＭＦＴ遺伝子ゲノム配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトを用いて並べて比較し、ＣＳ６遺伝子に特異的な配列を同定した。この結果に基づいてＣＳ６遺伝子を区別することが可能なＣＳＺＥＮＭＴＦＳＳＲ−Ｆ１（配列番号２６）及びＣＳＺＥＮＭＴＦＳＳＲ−Ｒ１（配列番号２７）プライマーを作製した。表３にプライマー配列を示す。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ゼンコウジコムギ及びチャイニーズスプリングのゲノムＤＮＡのＭＦＴ遺伝子（ＣＳ６）が増幅されるが、増幅断片の長さの違いにより、ゼンコウジコムギ及びチャイニーズスプリングのいずれに由来する塩基配列であるかを区別することができる。配列番号３に示すゼンコウジコムギのＭＦＴ遺伝子を増幅した場合の増幅断片の長さは２０５ｂｐであり、配列番号４に示すゼンコウジコムギのＭＦＴ遺伝子を増幅した場合の増幅断片の長さは２０６ｂｐである。また、チャイニーズスプリングのＭＦＴ遺伝子（ＣＳ６）を増幅した場合の増幅断片の長さは２０３ｂｐである。コムギにはほとんど多型が存在しないことが知られており、およそ２０〜２００Ｋｂｐに１つのＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）しか存在しないと言われている。したがって、配列番号３又は４に示す塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子は非常に有用であり、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子を特異的に識別することが可能である。
【００６４】
【表３】
【００６５】
（ＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ）の作製）
コムギ品種チャイニーズスプリング（ＣＳ）にゼンコウジコムギ（Ｚｅｎ）の３Ａ染色体を置換した１染色体置換系統であるＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ）を、Ｌａｗ及びＷｏｒｌａｎｄらによって報告された通常の方法により、チャイニーズスプリングのモノテロソミック３Ａ系統を反復親に用いて作製した。まず、チャイニーズスプリングのモノテロソミック３Ａをゼンコウジコムギの花粉を用いて受粉させ、その子孫の中からモノソミックなＦ１植物を根端の有糸分裂染色体標本の細胞学的な試験により同定した。ダイソミックＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ）置換を得る前に合計８回の戻し交配を行った。
【００６６】
（ＭＦＴ遺伝子のマッピング）
６倍体コムギであるチャイニーズスプリングと上記のＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ）を交配して得られたＦ２集団３８５１個体を使った精密マッピングを行った。
【００６７】
（多型の検出）
多型の検出は、ＣＳＺＥＮＭＴＦＳＳＲ−Ｆ１（配列番号２６）及びＣＳＺＥＮＭＴＦＳＳＲ−Ｒ１（配列番号２７）プライマーを用いたＰＣＲにより行った。ＰＣＲは、ゲノムＤＮＡ約１０ｎｇ（１μＬ）をＴａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ ｗｉｔｈ ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）及び各５ｐｍｏｌのプライマーを使って全容量２０μＬの系で行った。ＰＣＲのサイクル条件は、９４℃４分を１サイクル、９４℃３０秒、５５℃３０秒及び７２℃９０秒を３５サイクル、７２℃４分を１サイクルであった。
【００６８】
得られたＰＣＲ増幅断片を使用し、ＡＢＩ３７３０ｘｌ（アプライド バイオシステムズ社）のＦｒａｇｍｅｎｔ解析のプロトコールに準じてサンプルの調製を行った。具体的には、ＰＣＲ増幅断片２μＬとサイズマーカーであるＧｅｎｅＳｃａｎ ６００ＬＩＺ ０．５μＬを混ぜて、Ｈｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅで全量を２０μＬにして、９４℃５分、続いて氷上３０分処理した。反応終了後、ＡＢＩ３７３０ｘｌ（アプライド バイオシステムズ社）を用いて泳動を行った。得られた結果は、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（登録商標）４．０（アプライド バイオシステムズ社）を用いて解析した。図７に、これらの増幅断片の長さの違いを検出した例を示す。図中の点線で示す波形はサイズマーカーを表す。実線で示す波形はＰＣＲ増幅断片の長さを表す。図７（Ａ）は、チャイニーズスプリングのゲノムを検出した結果を示し、図７（Ｂ）は、上記のＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ）のゲノムを検出した結果を示す。図７（Ｃ）はチャイニーズスプリングとＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ）のヘテロ体のゲノムを検出した結果を示す。
【００６９】
解析の結果、ＭＦＴ遺伝子は、遺伝子マーカーＸｗｏｃｓ２０５とＸｂａｒｃ３１０の間に座乗していることが明らかとなった。結果を図８に示す。この座乗位置は、ゼンコウジコムギの最も作用力の強い種子休眠ＱＴＬのピークと一致した。
【００７０】
〔実施例９〕
ＭＦＴ遺伝子の発現量の品種間差の検討
様々なコムギ品種の種子の胚から全ＲＮＡを抽出し、実施例４と同様の方法により定量ＰＣＲを行い、ＭＦＴ遺伝子の発現量を比較した。図９に定量ＰＣＲの結果をグラフで示す。その結果、休眠性が比較的高い、ゼンコウジコムギ、ミナミノコムギ、東山２２号、しゅんよう及び１３℃で登熟させた農林６１号においてＭＦＴ遺伝子の発現量が多いことが示された。また、休眠性が比較的低い、チャイニーズスプリング、チホクコムギ、タイセツコムギ、東山１８号及び２５℃で登熟させた農林６１号においてＭＦＴ遺伝子の発現量が少ないことが明らかとなった。
【００７１】
〔実施例１０〕
３Ｄ染色体短腕の種子休眠ＱＴＬと３Ｄ染色体短腕のＭＦＴ遺伝子の発現の検討
発明者らは、チャイニーズスプリングの３Ｄ染色体短腕のＭＦＴ遺伝子は発現していないが、ゼンコウジコムギの３Ｄ染色体短腕のＭＦＴ遺伝子は発現していることを見出した。３Ｄ染色体短腕上のＭＦＴ遺伝子が座乗する位置においても種子休眠のＱＴＬが検出されている。そこで、コムギ品種チャイニーズスプリングとゼンコウジコムギを交配して得られたＲＩＬ集団を利用して以下の検討を行った。
【００７２】
各ＲＩＬ集団（ＲＩＬ−００１〜ＲＩＬ−０５４）の３Ｄ染色体短腕におけるＭＦＴ遺伝子座周辺のゲノムが、チャイニーズスプリングとゼンコウジコムギのいずれに由来する塩基配列であるかをそれぞれ解析した。解析結果を図９にまとめた。Ｘｗｏｃｓ２０６、Ｘｗｏｃｓ２０５、ＭＦＴ、Ｘｗｏｃｓ２１０、ｃｆｄ７９．Ｄは、コムギゲノム上のマーカー遺伝子を表しており、コムギゲノム３Ｄ染色体短腕上において、遺伝子マーカーがこの順に並んでいることを表す。図において、「ｚ」の表記は各ＲＩＬ個体におけるその遺伝子座がゼンコウジコムギの塩基配列を受け継いでいることを示し、「ｃ」の表記はチャイニーズスプリングの塩基配列を受け継いでいることを示す。「ｈ」の表記はヘテロであることを意味しており、ゼンコウジコムギとチャイニーズスプリングの塩基配列をいずれも受け継いでいることを示す。「Ｎ」及び「−」の表記は判定できなかったことを示す。
【００７３】
発明者らは、これらのＲＩＬ個体それぞれの種子の胚における、３Ｄ染色体由来のＭＦＴ遺伝子の発現を解析し、図１０に示した各ＲＩＬ個体のゲノム構造と対比させた。その結果、３Ｄ染色体におけるゼンコウジコムギ型のＭＦＴ遺伝子は種子の胚において発現しており、３Ｄ染色体におけるチャイニーズスプリング型のＭＦＴ遺伝子は発現していないことが明らかとなった。
【００７４】
〔実施例１１〕
コムギ品種ボブホワイトにおけるＭＦＴ遺伝子の強制発現
ゼンコウジコムギの３Ａ染色体由来のＭＦＴ遺伝子のコーディング領域を、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターに連結した発現ベクターを構築し、パーティクルボンバードメント法により導入した。
【００７５】
〔実施例１２〕
イネ品種日本晴におけるＭＦＴ遺伝子の強制発現
ゼンコウジコムギの３Ａ染色体由来のＭＦＴ遺伝子のコーディング領域を、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターに連結した発現ベクターを構築し、アグロバクテリウム法により導入した。その結果、遺伝子導入された形質転換植物体が約３０個体得られた。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】実施例１の結果を表すグラフである。
【図２】実施例２の結果を表すグラフである。「農６１」はコムギ品種農林６１号を表し、「シロガネ」はコムギ品種シロガネコムギを表す。
【図３】実施例３の結果を表すグラフである。
【図４】実施例４の結果を表す図である。
【図５】各種の植物のＭＦＴ遺伝子のアミノ酸配列をアラインメントした図である。
【図６】（Ａ）コムギ品種ゼンコウジコムギの種子休眠ＱＴＬを示す図である。（Ｂ）コムギ品種Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（Ｔｍ）の３Ａ染色体（３Ａｍ）の遺伝子地図である。
【図７】（Ａ）チャイニーズスプリング（ＣＳ）の３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子の多型を検出した結果である。（Ｂ）チャイニーズスプリングにゼンコウジコムギの３Ａ染色体を置換した１染色体置換系統（ＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ））における、３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子の多型を検出した結果である。（Ｃ）ヘテロ体における、３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子の多型を検出した結果である。
【図８】コムギ品種ゼンコウジコムギの３Ａ染色体の遺伝子地図である。
【図９】実施例１０の結果を表すグラフである。
【図１０】コムギ品種チャイニーズスプリングとゼンコウジコムギを交配して得られたＲＩＬ集団の３Ｄ染色体のゲノム構造を表す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種子休眠性向上遺伝子、種子休眠性向上マーカー遺伝子、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法及び種子休眠性が向上した形質転換植物体に関する。
【背景技術】
【０００２】
コムギなどの穀物の生産において、しばしば大きな被害をもたらす穂発芽の発生を予防することは大きな課題となっている。穂発芽とは、降雨などの影響により、収穫前の穂に実った種子が発芽してしまう現象を指し、種子の品質を著しく低下させるものである。穂発芽の発生を予防するためには、種子休眠性が高い品種の開発が必要とされており、種子休眠性に関わる遺伝子の同定やＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ、量的形質遺伝子座）マーカーの開発が求められている。ここで、種子休眠性とは、種子の発芽しにくい性質を表し、種子休眠性が高いほど発芽しにくい。
【０００３】
特許文献１には、コムギの種子休眠性に関係する遺伝子として、ＶＰ１遺伝子が報告されている。
【０００４】
コムギの種子休眠ＱＴＬに関しては多数の報告があり、これまでに少なくとも３０以上の種子休眠ＱＴＬが知られている（例えば非特許文献１を参照）。
【０００５】
非特許文献２には、シロイヌナズナの開花時期を制御する遺伝子として知られるＦＴ（Ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ Ｌｏｃｕｓ Ｔ）及びＴＦＬ１（Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｌｏｗｅｒ １）が、ＭＦＴ（Ｍｏｔｈｅｒ ｏｆ ＦＴ ａｎｄ ＴＦＬ１）遺伝子及び他の３つの遺伝子とともにＰＥＢＰ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子ファミリーを形成していることが記載されている。
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ９９／１５６６７
【非特許文献１】Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，１２６，３９−４５，２００２
【非特許文献２】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，６１，５７９−５９０，２００５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、種子休眠性に関わる遺伝子の同定やＱＴＬマーカーの開発が求められている。そこで本発明は、コムギの種子休眠性がいかなる遺伝子の作用に起因するかを明らかにし、種子休眠性向上遺伝子及び種子休眠性向上マーカー遺伝子を提供することを目的とする。また、本発明の別の目的として、この遺伝子を用いて種子休眠性が向上したコムギ品種を育種する方法及び種子休眠性が向上した形質転換植物体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
コムギは登熟期の気温が低いほど種子休眠性が向上することが知られている。登熟とは、開花後の種子が発育し、肥大し、成熟していく過程をいう。しかしながら、登熟温度と種子における遺伝子の発現量との関係はこれまでに報告されていなかった。
【０００９】
そこで、本発明者らは、登熟時の気温が種子の胚における遺伝子発現変動に及ぼす影響を解析することにより、種子休眠性と対応して発現変動するＭＦＴ遺伝子を見出した。また、ＭＦＴ遺伝子は、登熟温度によって種子休眠性と連動して発現量が変化し、その完熟した種子の胚における発現量は、コムギ品種の種子休眠性とも強い相関を持つことを明らかにした。さらに、ＭＦＴ遺伝子は、種子休眠性が非常に高いコムギ品種として知られるゼンコウジコムギの主要な種子休眠ＱＴＬのピークと一致する位置に座乗する遺伝子であることを明らかにした。
【００１０】
すなわち本発明は、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列、（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列及び（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、且つ配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、からなる群より選択される塩基配列からなる、種子休眠性向上遺伝子を提供する。
【００１１】
配列番号１（アクセッション番号ＡＢ４５６６８８、２０１０年１０月１５日に公開予定）に記載の塩基配列は従来機能が未知であったＭＦＴ遺伝子のｃＤＮＡであり、配列番号２（アクセッション番号ＡＢ４５６６８８、２０１０年１０月１５日に公開予定）に記載のアミノ酸配列は、配列番号１のｃＤＮＡをアミノ酸に翻訳したものである。本発明者らは、ＭＦＴ遺伝子がコードするタンパク質が種子休眠性に関わる機能を持つことを初めて明らかにした。
【００１２】
本発明はまた、配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる、種子休眠性向上マーカー遺伝子を提供する。
【００１３】
配列番号３及び４に記載の塩基配列は、ＭＦＴ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列であり、種子休眠性が高いゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に存在するＭＦＴ遺伝子の塩基配列である。後述するように、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に存在するＭＦＴ遺伝子は最も作用力の強い種子休眠ＱＴＬのピークと一致するものであり、種子休眠性向上マーカー遺伝子として利用することができる。
【００１４】
別の態様において、本発明は、ゼンコウジコムギとそれ以外の品種のコムギを交配して子孫を得る交配ステップと、その子孫のゲノムＤＮＡにおいて、配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在の有無を検出する検出ステップと、検出ステップにおいて配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在が検出された場合に、その子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断して選抜する選抜ステップとを含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法を提供する。
【００１５】
この育種方法によって選抜されたコムギは、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に存在するＭＦＴ遺伝子を、その発現制御配列とともに保持しており、種子休眠性が高いことが期待できる。種子休眠性が高いコムギ品種は、穂発芽の発生を起こしにくいため、付加価値が高いコムギを安定に生産することができる。
【００１６】
本発明はまた、コムギを交配して子孫を得る交配ステップと、その子孫の種子、種子親の種子及び花粉親の種子における、種子休眠性向上遺伝子の発現量を測定する測定ステップと、測定ステップにおいて、子孫の種子における種子休眠性向上遺伝子の発現量が、種子親又は花粉親のうち、いずれか種子における種子休眠性向上遺伝子の発現量が低い親よりも高い場合に、その子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断して選抜する選抜ステップとを含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法を提供する。
【００１７】
この育種方法によって選抜されたコムギは、その種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が高いため、種子休眠性が高いことが期待できる。
【００１８】
別の態様において、本発明は、請求項１に記載の種子休眠性向上遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物体を提供する。この植物体はコムギであってもよいし、イネであってもよい。
【００１９】
このような植物体は、種子休眠性が高いため穂発芽の発生を起こしにくく、安定に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明において、種子休眠性向上遺伝子とは、従来その機能が未知であったＭＦＴ遺伝子であり、種子休眠性を向上させる機能を持つ遺伝子である。非特許文献１によれば、ＭＦＴ遺伝子はシロイヌナズナの開花時期を制御する遺伝子であるＦＴやＴＦＬ１と関連がある。そこで、ＭＦＴ遺伝子は植物の開花時期の制御に関わると予想されていた。発明者らは、この予想に反して、ＭＦＴ遺伝子は種子で発現し、開花時期の制御ではなく、種子休眠性に影響することを明らかにした。
【００２１】
種子休眠性とは、種子の発芽しにくい性質を表し、種子休眠性が高いほど発芽しにくい。種子休眠性が高ければ穂発芽の発生を予防することができ、コムギをはじめとする穀物の生産に有用である。種子休眠性は、発芽試験などによって測定することができる。発芽試験は、例えば、収穫直後の穂全体を約１５℃の水に約２４時間浸して吸水させ、続いて、吸水後の穂を密閉容器中に立て、約１５℃に設定したチャンバー内でインキュベートし、１０日後、発芽した種子の数の、穂の全種子に対する割合として測定することができる。穂発芽の発生を予防するためには、上記の方法で測定した発芽率が、１０〜０％であることが好ましく、５〜０％であることがより好ましく、０％であることが最も好ましい。
【００２２】
一つの態様において、本発明は、ゼンコウジコムギとそれ以外の品種のコムギを交配して子孫を得る交配ステップと、その子孫のゲノムＤＮＡにおいて、配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在の有無を検出する検出ステップと、検出ステップにおいて配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在が検出された場合に、その子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断する選抜ステップとを含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法を提供する。
【００２３】
ゼンコウジコムギは種子休眠性が高い品種である。コムギの全ゲノム配列は未だ決定されていないため、コムギゲノムの解析は非常に困難であるが、発明者らは、ゼンコウジコムギのゲノム上に複数のＭＦＴ遺伝子が存在し、その中でも３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子が種子の胚における発現量が高く、種子休眠性に大きく寄与していることを見出した。これは、３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子の発現制御配列が種子の胚における発現に特に適しているためだと考えられる。発明者らは、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子のゲノム配列を明らかにした。この塩基配列を配列番号３及び４に示す。発明者らは、下記に示す検討の結果、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕上には、配列番号３及び４に示す２つのＭＦＴ遺伝子が存在することを明らかにした。
【００２４】
上記の育種方法において、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子を受け継いだ子孫は種子休眠性が高いと判断できる。そこで、子孫のゲノムＤＮＡ上に配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子が存在するか否かを検出することによって、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子を受け継いでいるか否かを判断する。このためには、例えば次のような方法を用いることができる。
【００２５】
まず、子孫のコムギからゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出方法は特に制限されないが、例えば０．１ｇ程度の若い葉を採取し、液体窒素を加えてすり鉢上で磨砕し、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて取扱説明書にしたがって抽出することができる。この操作により、数１０ｎｇ／μＬの濃度のＤＮＡ溶液約２００μＬを得ることができる。
【００２６】
続いて、得られたゲノムＤＮＡ上に配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子が存在するか否かを検出する。この検出方法は特に制限されないが、例えば配列番号３又は４に記載の塩基配列に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを行い、目的とするサイズの増幅断片が増幅されるか否かによって検出することができる。
【００２７】
発明者らは、後述するように、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子（配列番号３及び４）を区別可能な配列を同定し、この領域を特異的に増幅することができるプライマーＣＳＺＥＮＭＴＦＳＳＲ−Ｆ１（配列番号２６）及びＣＳＺＥＮＭＴＦＳＳＲ−Ｒ１（配列番号２７）を作成した。これらのプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行えば、その増幅断片の長さの違いからゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子であるか否かを区別することができる。そこで、例えば、これらのプライマーを用いたＰＣＲ解析によって、上記の子孫のコムギから抽出したゲノムＤＮＡ上にゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子が存在するか否かを判断することができる。
【００２８】
別の態様において、本発明は、コムギを交配して子孫を得る交配ステップと、その子孫の種子、種子親の種子及び花粉親の種子における、種子休眠性向上遺伝子の発現量を測定する測定ステップと、測定ステップにおいて、子孫の種子における種子休眠性向上遺伝子の発現量が、種子親又は花粉親のうち、いずれか種子における種子休眠性向上遺伝子の発現量が低い親よりも高い場合に、その子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断して選抜する選抜ステップとを含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法を提供する。
【００２９】
発明者らは、後述するように、種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が高いほど種子休眠性が高い傾向があることを明らかにした。したがって、コムギを交配した子孫の中から、その種子親及び花粉親いずれかの親のうち、その種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が低い親と比較した場合に、種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が高まった子孫を選別することにより、種子休眠性が向上したコムギを得ることができる。この場合、一般的に、種子親及び花粉親いずれかの親のうち、その種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が低い親は、種子休眠性以外の優良な形質を持つ。ここで、優良な形質とは、例えば、高収量性、良品質、耐病性などの形質である。
【００３０】
上記の育種方法の比較ステップにおいて、子孫、種子親及び花粉親の種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量を測定する。この方法は特に制限されないが、例えば次のような定量ＰＣＲによって行うことができる。
【００３１】
まず、子孫、種子親及び花粉親の種子から全ＲＮＡを抽出する。全ＲＮＡは種子の胚から抽出することが好ましい。ＲＮＡ抽出には、例えばＴｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン社）などを用いることができる。続いてこの全ＲＮＡをもとにファーストストランドｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成には、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社）を用いることができる。続いて、これらのｃＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行う。ここで、例えばグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子などのハウスキーピング遺伝子を内部標準として使用し、ＭＦＴ遺伝子の発現を定量するとよい。この場合のＭＦＴ遺伝子は、３Ａ染色体短腕に存在するものに限定する必要はなく、他の染色体から発現するＭＦＴ遺伝子も合わせて検出することが好ましい。例えば後述するＱＲＴ−ＭＴＦ−Ｆ２（配列番号１３）及びＴａＭＴＦ−Ｒ３（配列番号１４）のプライマーを用いることにより、どの染色体に由来するかに関わらず全てのＭＦＴ遺伝子をＰＣＲ増幅することが可能である。
【００３２】
得られた定量ＰＣＲの結果をもとに、種子休眠性が向上した子孫を選別する。種子親及び花粉親いずれかの親のうち、その種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が低い親と比較した場合に、種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が高まった子孫は、種子休眠性が向上したコムギであると判断することができる。
【００３３】
別の態様において、本発明はＭＦＴ遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物体を提供する。対象とする植物体は種子休眠性の向上が望まれる植物であれば特に制限されないが、実施例において後述するように、コムギやイネであってよい。この育種方法は、遺伝子導入によって、植物体におけるＭＦＴ遺伝子の発現量を増加させることにより、種子休眠性を向上させるものである。
【００３４】
まず、ＭＦＴの発現ベクターを構築する。発現ベクターは、植物体内で発現可能なプロモーター、ＭＦＴ遺伝子配列、翻訳終結配列を含む。発現ベクターはまた、必要に応じて、大腸菌における複製起点、大腸菌における選択マーカー（アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子など）、植物体における選択マーカー（カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス（ｂａｒ）耐性遺伝子など）、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列などを更に含んでもよい。
【００３５】
植物体内で発現可能なプロモーターとしては、種子特異的な発現を誘導するものであってもよく、組織に関係なく構成的に発現するものであってもよい。例えばユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、Ｅｍプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどが例示できるが、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターが好ましい。
【００３６】
コムギへの遺伝子導入は、一般的なパーティクルボンバードメント法を用いて行うことができる。例えば、金粒子にまぶしたＭＦＴの発現ベクターＤＮＡを、パーティクルボンバードメント法を用いて、小麦未熟種子から取り出した未熟胚に打ち込むことにより遺伝子導入する。続いて、遺伝子導入した未熟胚を、植物ホルモンであるオーキシンなどを含む培地で培養後、オーキシンの濃度を下げることにより、個体を再分化させて形質転換植物体を得ることができる。例えば、ビアホラス耐性遺伝子を含むＭＦＴの発現ベクターをコムギに導入した場合、導入遺伝子を取り込んだ形質転換植物体は、ビアホラス耐性となるので、ビアホラスを添加した培地を用いることにより選抜することができる。
【００３７】
イネへの遺伝子導入は、一般的なアグロバクテリウム法を用いて行うことができる。例えば、イネの種子を脱穀して次亜塩素酸で滅菌後、オーキシンを含む培地に置床し、種子由来のカルスを誘導する。続いて、このカルスを、ＭＦＴの発現ベクターを導入したアグロバクテリウムの溶液に浸してアグロバクテリウムに感染させることにより、発現ベクターのライトボーダーとレフトボーダーの間に導入されているＤＮＡを植物体の核に組み込ませる。例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＭＦＴの発現ベクターをイネに導入した場合、遺伝子を取り込んだ形質転換体は、ハイグロマイシン及びアグロバクテリウムを除菌するためのカルベニシリンなどの除菌剤を添加した培地で選抜することができる。その後、オーキシンを除いた再分化培地で培養して再分化させ、続いて、発根培地へと移し変えることにより、ＭＦＴ遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物体を得ることができる。
【００３８】
これらのＭＦＴ遺伝子を発現可能に保持する植物体は、種子におけるＭＦＴ遺伝子の発現量が増加しており、種子休眠性が向上しているため、穂発芽の発生を予防することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。
【００４０】
〔実施例１〕
コムギ種子の登熟温度と休眠性の検討
（コムギの栽培）
コムギ品種農林６１号を温室で栽培した。開花後、コムギを複数の群に分け、温室の温度をそれぞれ１３、１５、１７、２０、２３及び２５℃に設定した。開花後所定の日数後に穂を収穫した。
【００４１】
（発芽試験）
収穫した穂を使用して発芽試験を行い、種子休眠性を検討した。発芽試験は次のようにして行った。まず、収穫直後の穂全体を１５℃の水に約２４時間浸して吸水させた。続いて、吸水後の穂を密閉容器中に立て、１５℃に設定したチャンバー内でインキュベートした。１０日後、発芽した種子の数を数え、穂の全種子を基準として種子の発芽率を測定した。試験は各組５本の穂を３組ずつ用いて行った。
【００４２】
結果を図１のグラフに示す。グラフの縦軸は発芽率を表し、横軸は種子を収穫した開花後の日数を表す。登熟温度が低くなるほど種子の発芽率が低下し、休眠性が高まることが示された。
【００４３】
〔実施例２〕
農林６１号とシロガネコムギの種子の発芽率と含水率の検討
（コムギの栽培）
コムギ品種農林６１号及びシロガネコムギを温室で栽培した。開花後、それぞれのコムギを２つの群に分け、温室の温度を１３℃及び２５℃に設定した。開花後所定の日数後に穂を収穫し、実施例１と同様にして発芽率の推移を検討した。
【００４４】
（種子の含水率の測定）
発芽率と同時に種子の含水率も測定した。含水率は種子の登熟の進行具合の目安となる。種子が完熟すると含水率が約１５％以下になり、この値は品種によってあまり変化しないことが知られている。収穫した種子を８０℃で４８時間乾燥させ、乾燥の前後の種子の質量を測定し、その質量の差から次式（１）により含水率を計算した。
含水率（質量％）＝乾燥の前後の種子の質量の差／乾燥前の種子の質量×１００…（１）
【００４５】
結果を図２のグラフに示す。グラフの縦軸は発芽率又は含水率を表し、横軸は種子を収穫した開花後の日数を表す。２５℃で登熟させたコムギに比較して１３℃で登熟させたコムギは発芽率が低下し、休眠性が高まることが示された。また、農林６１号はシロガネコムギよりも１３℃で登熟させた場合の発芽率が低く、休眠性がより高いことが示された。
【００４６】
〔実施例３〕
登熟温度が異なる完熟種子胚における遺伝子発現変動の解析
（ＲＮＡサンプルの調製）
コムギ品種農林６１号を栽培し、１３℃で登熟させて開花７６日後に収穫した種子の胚と、２５℃で登熟させて開花３４日後に収穫した種子の胚から全ＲＮＡを抽出した。また、コムギ品種シロガネコムギを栽培し、１３℃で登熟させて開花８０日後に収穫した種子の胚と、２５℃で登熟させて開花３８日後に収穫した種子の胚から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出にはＴｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン社）を用いた。抽出した全ＲＮＡの量及び純度を吸光的に測定し、ＲＮＡが分解を受けていないかアジレント２１００バイオアナライザー（アジレント・テクノロジー社）を用いて確認した。
【００４７】
（マイクロアレイ解析）
抽出した全ＲＮＡ各３００ｎｇをＬｏｗ ＲＮＡ Ｉｎｐｕｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ／Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ （アジレント・テクノロジー社）を用いて取扱説明書にしたがってＣｙ３及びＣｙ５で標識した。標識されたサンプルのｃＲＮＡ各８５０ｎｇを、コムギＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）に由来する３７８２６個のプローブを有するアジレントコムギオリゴマイクロアレイ（４４Ｋ；木原生物学研究所の注文によりアジレント・テクノロジー社が製造した）とのハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイスライドをスキャンした。スキャナーにはＧ２５０５Ｂ（アジレント・テクノロジー社）を用い、ソフトウエアにはＧ２５６５ＢＡ（アジレント・テクノロジー社）を用いた。
【００４８】
（データ解析）
得られたデータを初期設定のＦｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン ９．１；アジレント・テクノロジー社）を用いて解析した。全てのマイクロアレイ操作手順及びデータ解析は取扱説明書（アジレント・テクノロジー社）にしたがって行った。データはＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ ＧＸ ７．３ ソフトウエア（アジレント・テクノロジー社）を用いて解析した。
【００４９】
図３に農林６１号のＲＮＡサンプルを用いて解析したデータを示す。１３℃及び２５℃で登熟させた種子の胚において、シグナル強度が５００以上の遺伝子を比較した結果、約１８００個の遺伝子が２倍以上の発現差を示した。これらの遺伝子のうち、発現変動の差が２番目に大きい遺伝子として、ＭＦＴ遺伝子が見出された。農林６１号のサンプルにおいて、１３℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量は２５℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量の１５倍であった。また、シロガネコムギのサンプルにおいて、１３℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量は２５℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量の９倍であった。
【００５０】
〔実施例４〕
定量ＰＣＲによる発現変動の確認
（ｃＤＮＡの合成）
実施例３で抽出したコムギ品種農林６１号及びシロガネコムギの全ＲＮＡをもとに、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社）を用いてファーストストランドｃＤＮＡを合成した。
【００５１】
（定量ＰＣＲ）
合成したｃＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行い、ＭＦＴ遺伝子の発現量を定量した。定量ＰＣＲ用のプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ６（ＭＢＩ社）を用いて設計した。使用したプライマー配列を表１に示す。定量ＰＣＲは７５００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライド バイオシステムズ社）及びＳＹＢＲプレミックスＥｘＴａｑキット（タカラバイオ）を用いて行った。コムギのグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を内部標準として使用した。ＰＣＲ条件は９４℃２分を１サイクル、９５℃１５秒及び６０℃１分を４０サイクルであった。得られたデータは、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ（アプライド バイオシステムズ社）の標準曲線法により解析した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
定量ＰＣＲの結果を図４に示す。マイクロアレイ解析の結果と同様に、定量ＰＣＲの結果からも、１３℃及び２５℃で登熟させた種子の胚の間で、ＭＦＴ遺伝子の発現量に差があることが確認された。農林６１号のサンプルにおいて、１３℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量は２５℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量の９倍であった。また、シロガネコムギのサンプルにおいて、１３℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量は２５℃で登熟させた種子におけるＭＦＴの発現量の１１倍であった。
【００５４】
〔実施例５〕
ＭＦＴ遺伝子のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの単離
成熟した胚から抽出した全ＲＮＡをもとに合成したファーストストランドｃＤＮＡのＰＣＲにより、ＭＦＴ遺伝子のｃＤＮＡを単離した。全ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン社）を用いて抽出した。ファーストストランドｃＤＮＡ合成はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いて行った。また、ＭＦＴ遺伝子の全長又は一部のゲノムＤＮＡをＰＣＲによって単離した。ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの単離に用いたＰＣＲプライマーを表２にまとめた。単離した遺伝子の塩基配列はＢｉｇＤｙｅ バージョン３．０ ターミネーター試薬（アプライド バイオシステムズ社）を用いて３１００ Ａｖａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒにより決定した。決定された配列はＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ソフトウエア バージョン２．０（日立ソフトウエア）及びＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ４．１（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ社）を用いて解析した。アミノ酸配列のアラインメントはＣｌｕｓｔａｌＷ バージョン１．８３（Ｔｈｏｍｏｐｓｏｎ ら、１９９４）を用いて日本ＤＮＡデータバンクのウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）で行った。アラインメントの結果はＢＯＸＳＨＡＤＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／）を用いて表示した。
【００５５】
【表２】
【００５６】
図５にコムギ品種Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（Ｔｍ）（配列番号５、アクセッション番号ＡＢ４５６６８７、２０１０年１０月１５日に公開予定）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ（Ｔｂ）（配列番号６、アクセッション番号ＡＢ４５６６８６、２０１０年１０月１５日に公開予定）、チャイニーズスプリング（ＣＳ）（配列番号７）、ゼンコウジコムギ３Ａ染色体（Ｚｅｎ（３Ａ））（配列番号２）、ゼンコウジコムギ３Ｄ染色体（Ｚｅｎ（３Ｄ））（配列番号８、アクセッション番号ＡＢ４５６６８９、２０１０年１０月１５日に公開予定）、イネ（Ｒｉｃｅ）（配列番号９）及びシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（配列番号１０）のＭＦＴ遺伝子のアミノ酸配列をアラインメントした結果を示す。
【００５７】
〔実施例６〕
２倍体コムギを用いたＭＦＴ遺伝子のマッピング
（マッピング集団）
ＭＦＴ遺伝子のマッピングには、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ ＫＴ３−５株（Ｔｍ）とＴｒｉｔｉｃｕｍ ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ ＫＴ１―１株（Ｔｂ）の交配により得られた組換え自殖系統の２倍体マッピング集団１１５個体を用いた。この集団は横浜市立大学木原生物学研究所において単粒系統法により作出された。２倍体コムギ集団の遺伝子型データはウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈｉｇｅｎ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｗｈｅａｔ／ｋｏｍｕｇｉ／ｔｏｐ／ｔｏｐ．ｊｓｐ）で入手可能である。
【００５８】
（ＴｍおよびＴｂのＭＦＴ遺伝子の塩基配列の決定）
Ｔｍ及びＴｂのＭＦＴ遺伝子のイントロン領域を含むゲノム配列を、プライマーＴａＭＴＦ−Ｆ３（配列番号１６）及びＴａＭＴＦ−Ｒ２（配列番号１７）を用いたＰＣＲ法により単離した。鋳型には２倍体コムギの胚から抽出したゲノムＤＮＡを用い、ＰＣＲ増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｗｉｔｈ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）を用いた。ＰＣＲ法により増幅された断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で精製し、断片を直接シークエンスするダイレクトシークエンス法により２倍体コムギＴｍおよびＴｂのＭＦＴ遺伝子の塩基配列を決定した。
【００５９】
（多型解析）
２倍体マッピング集団１１５個体全てについて、ＭＦＴ遺伝子の多型を解析した。多型解析には、ＣＡＰＳ法（Ｔｈｅ ｃｌｅａｖｅｄ−ｌｅｎｇｔｈ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ）を用いた。２倍体マッピング集団それぞれのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＴａＭＴＦ−Ｆ３（配列番号１６）及びＴａＭＴＦ−Ｒ３（配列番号１４）プライマーを用いてＰＣＲ増幅後、増幅断片を制限酵素ＨｉｎｆＩで切断し、３％Ｍｅｔａｐｈｏｒゲル（タカラバイオ社）及び０．５×ＴＢＥバッファーを用いて電気泳動し、増幅断片のサイズの違いから多型を判別した。ＰＣＲの条件は、９４℃１分を１サイクル、９４℃２０秒、６０℃３０秒及び７２℃１分を４０サイクルであった。
【００６０】
（遺伝子地図の作成）
多型解析の結果をもとに遺伝子地図を作成した。遺伝子地図は、Ｋｏｓａｍｂｉ関数（Ｋｏｓａｍｂｉ、１９４４）を用いて、ＪｏｉｎＭａｐ、バージョン３．０（Ｂｉｏｍｅｔｒｉｓ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、オランダ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｏｉｎｍａｐ．ｎｌ）により作成した。また、イネホモログの染色体位置はウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｒｇｐ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＩＲＧＳＰ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）のデータを用いて決定した。Ｔｍの３Ａ染色体（３Ａｍ）の遺伝子地図を図６（Ｂ）に示す。ＭＦＴ遺伝子は、第３染色体短腕に位置することが明らかになった。この領域には、図６（Ａ）に示すように、ゼンコウジコムギの最も作用力の強い種子休眠ＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｔｒａｉｔ ｌｏｃｉ、量的形質遺伝子座）が座乗する。
【００６１】
〔実施例７〕
６倍体コムギを用いたＭＦＴ遺伝子のマッピング
（チャイニーズスプリング及びゼンコウジコムギのＭＦＴ遺伝子の部分ゲノム配列の決定）
６倍体コムギであるゼンコウジコムギとチャイニーズスプリングのＭＦＴ遺伝子の３つのイントロン領域を含むゲノム領域の配列を決定した。これらのコムギのゲノムＤＮＡをＴａＭＴＦ−Ｆ３（配列番号１６）及びＴａＭＴＦ−Ｒ２（配列番号１７）プライマーを用いてＰＣＲ増幅後、ＴＯＰＯクローニングキット（インビトロジェン社）を用いて、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ ベクター（インビトロジェン社）にクローニングし、ケミカル法にてＴＯＰ１０コンピテントセル（インビトロジェン社）を形質転換した。続いて、得られた大腸菌を培養し、プラスミドＤＮＡを抽出して塩基配列を決定した。後述する検討の結果、ゼンコウジコムギのゲノムＤＮＡに特異的な配列であることが明らかとなったＭＦＴ遺伝子のゲノム配列を配列番号３及び４に示す。
【００６２】
（ゲノム配列の座乗染色体の決定）
チャイニーズスプリングには、４種類のＭＦＴ遺伝子配列が存在することが明らかとなった。これらのＭＦＴ遺伝子のゲノム配列を、以下、それぞれＣＳ３（配列番号２２）、ＣＳ４（配列番号２３）、ＣＳ６（配列番号２４）、ＣＳ８（配列番号２５）と呼ぶ。これらのＭＦＴ遺伝子が、それぞれ３Ａ、３Ｂ及び３Ｄ染色体のうちのどの染色体に由来するものかを同定するため、チャイニーズスプリングの６個のダイテロソミック系統を使用して検討した。Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウエアを使用して、各ＭＦＴ遺伝子に対応する少なくとも１つのＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ）プライマーセットを設計した。ＰＣＲに基づいた解析の結果、ＣＳ６遺伝子及びＣＳ３遺伝子に特異的な増幅断片が、それぞれダイテロ３ＡＬ（３Ａ染色体短腕を欠失した系統）及びダイテロ３ＤＬ（３Ｄ染色体短腕を欠失した系統）中で認められなかった。この結果から、３Ａ染色体の短腕がＣＳ６遺伝子を保持しており、３Ｄ染色体の短腕がＣＳ３遺伝子を保持していることが示唆された。
【００６３】
（ＣＳ６遺伝子に対する多型マーカーの作出）
ゼンコウジコムギの主要な種子休眠ＱＴＬは、３Ａ染色体短腕上に座乗していることから、このＣＳ６遺伝子に関して、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕上のＭＦＴ遺伝子との間で多型を検出できるマーカーを作製した。ゼンコウジコムギ及びチャイニーズスプリングの得られたすべてのＭＦＴ遺伝子ゲノム配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトを用いて並べて比較し、ＣＳ６遺伝子に特異的な配列を同定した。この結果に基づいてＣＳ６遺伝子を区別することが可能なＣＳＺＥＮＭＴＦＳＳＲ−Ｆ１（配列番号２６）及びＣＳＺＥＮＭＴＦＳＳＲ−Ｒ１（配列番号２７）プライマーを作製した。表３にプライマー配列を示す。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより、ゼンコウジコムギ及びチャイニーズスプリングのゲノムＤＮＡのＭＦＴ遺伝子（ＣＳ６）が増幅されるが、増幅断片の長さの違いにより、ゼンコウジコムギ及びチャイニーズスプリングのいずれに由来する塩基配列であるかを区別することができる。配列番号３に示すゼンコウジコムギのＭＦＴ遺伝子を増幅した場合の増幅断片の長さは２０５ｂｐであり、配列番号４に示すゼンコウジコムギのＭＦＴ遺伝子を増幅した場合の増幅断片の長さは２０６ｂｐである。また、チャイニーズスプリングのＭＦＴ遺伝子（ＣＳ６）を増幅した場合の増幅断片の長さは２０３ｂｐである。コムギにはほとんど多型が存在しないことが知られており、およそ２０〜２００Ｋｂｐに１つのＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）しか存在しないと言われている。したがって、配列番号３又は４に示す塩基配列からなる種子休眠性向上マーカー遺伝子は非常に有用であり、ゼンコウジコムギの３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子を特異的に識別することが可能である。
【００６４】
【表３】
【００６５】
（ＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ）の作製）
コムギ品種チャイニーズスプリング（ＣＳ）にゼンコウジコムギ（Ｚｅｎ）の３Ａ染色体を置換した１染色体置換系統であるＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ）を、Ｌａｗ及びＷｏｒｌａｎｄらによって報告された通常の方法により、チャイニーズスプリングのモノテロソミック３Ａ系統を反復親に用いて作製した。まず、チャイニーズスプリングのモノテロソミック３Ａをゼンコウジコムギの花粉を用いて受粉させ、その子孫の中からモノソミックなＦ１植物を根端の有糸分裂染色体標本の細胞学的な試験により同定した。ダイソミックＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ）置換を得る前に合計８回の戻し交配を行った。
【００６６】
（ＭＦＴ遺伝子のマッピング）
６倍体コムギであるチャイニーズスプリングと上記のＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ）を交配して得られたＦ２集団３８５１個体を使った精密マッピングを行った。
【００６７】
（多型の検出）
多型の検出は、ＣＳＺＥＮＭＴＦＳＳＲ−Ｆ１（配列番号２６）及びＣＳＺＥＮＭＴＦＳＳＲ−Ｒ１（配列番号２７）プライマーを用いたＰＣＲにより行った。ＰＣＲは、ゲノムＤＮＡ約１０ｎｇ（１μＬ）をＴａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ ｗｉｔｈ ＧＣ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）及び各５ｐｍｏｌのプライマーを使って全容量２０μＬの系で行った。ＰＣＲのサイクル条件は、９４℃４分を１サイクル、９４℃３０秒、５５℃３０秒及び７２℃９０秒を３５サイクル、７２℃４分を１サイクルであった。
【００６８】
得られたＰＣＲ増幅断片を使用し、ＡＢＩ３７３０ｘｌ（アプライド バイオシステムズ社）のＦｒａｇｍｅｎｔ解析のプロトコールに準じてサンプルの調製を行った。具体的には、ＰＣＲ増幅断片２μＬとサイズマーカーであるＧｅｎｅＳｃａｎ ６００ＬＩＺ ０．５μＬを混ぜて、Ｈｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅで全量を２０μＬにして、９４℃５分、続いて氷上３０分処理した。反応終了後、ＡＢＩ３７３０ｘｌ（アプライド バイオシステムズ社）を用いて泳動を行った。得られた結果は、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（登録商標）４．０（アプライド バイオシステムズ社）を用いて解析した。図７に、これらの増幅断片の長さの違いを検出した例を示す。図中の点線で示す波形はサイズマーカーを表す。実線で示す波形はＰＣＲ増幅断片の長さを表す。図７（Ａ）は、チャイニーズスプリングのゲノムを検出した結果を示し、図７（Ｂ）は、上記のＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ）のゲノムを検出した結果を示す。図７（Ｃ）はチャイニーズスプリングとＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ）のヘテロ体のゲノムを検出した結果を示す。
【００６９】
解析の結果、ＭＦＴ遺伝子は、遺伝子マーカーＸｗｏｃｓ２０５とＸｂａｒｃ３１０の間に座乗していることが明らかとなった。結果を図８に示す。この座乗位置は、ゼンコウジコムギの最も作用力の強い種子休眠ＱＴＬのピークと一致した。
【００７０】
〔実施例９〕
ＭＦＴ遺伝子の発現量の品種間差の検討
様々なコムギ品種の種子の胚から全ＲＮＡを抽出し、実施例４と同様の方法により定量ＰＣＲを行い、ＭＦＴ遺伝子の発現量を比較した。図９に定量ＰＣＲの結果をグラフで示す。その結果、休眠性が比較的高い、ゼンコウジコムギ、ミナミノコムギ、東山２２号、しゅんよう及び１３℃で登熟させた農林６１号においてＭＦＴ遺伝子の発現量が多いことが示された。また、休眠性が比較的低い、チャイニーズスプリング、チホクコムギ、タイセツコムギ、東山１８号及び２５℃で登熟させた農林６１号においてＭＦＴ遺伝子の発現量が少ないことが明らかとなった。
【００７１】
〔実施例１０〕
３Ｄ染色体短腕の種子休眠ＱＴＬと３Ｄ染色体短腕のＭＦＴ遺伝子の発現の検討
発明者らは、チャイニーズスプリングの３Ｄ染色体短腕のＭＦＴ遺伝子は発現していないが、ゼンコウジコムギの３Ｄ染色体短腕のＭＦＴ遺伝子は発現していることを見出した。３Ｄ染色体短腕上のＭＦＴ遺伝子が座乗する位置においても種子休眠のＱＴＬが検出されている。そこで、コムギ品種チャイニーズスプリングとゼンコウジコムギを交配して得られたＲＩＬ集団を利用して以下の検討を行った。
【００７２】
各ＲＩＬ集団（ＲＩＬ−００１〜ＲＩＬ−０５４）の３Ｄ染色体短腕におけるＭＦＴ遺伝子座周辺のゲノムが、チャイニーズスプリングとゼンコウジコムギのいずれに由来する塩基配列であるかをそれぞれ解析した。解析結果を図９にまとめた。Ｘｗｏｃｓ２０６、Ｘｗｏｃｓ２０５、ＭＦＴ、Ｘｗｏｃｓ２１０、ｃｆｄ７９．Ｄは、コムギゲノム上のマーカー遺伝子を表しており、コムギゲノム３Ｄ染色体短腕上において、遺伝子マーカーがこの順に並んでいることを表す。図において、「ｚ」の表記は各ＲＩＬ個体におけるその遺伝子座がゼンコウジコムギの塩基配列を受け継いでいることを示し、「ｃ」の表記はチャイニーズスプリングの塩基配列を受け継いでいることを示す。「ｈ」の表記はヘテロであることを意味しており、ゼンコウジコムギとチャイニーズスプリングの塩基配列をいずれも受け継いでいることを示す。「Ｎ」及び「−」の表記は判定できなかったことを示す。
【００７３】
発明者らは、これらのＲＩＬ個体それぞれの種子の胚における、３Ｄ染色体由来のＭＦＴ遺伝子の発現を解析し、図１０に示した各ＲＩＬ個体のゲノム構造と対比させた。その結果、３Ｄ染色体におけるゼンコウジコムギ型のＭＦＴ遺伝子は種子の胚において発現しており、３Ｄ染色体におけるチャイニーズスプリング型のＭＦＴ遺伝子は発現していないことが明らかとなった。
【００７４】
〔実施例１１〕
コムギ品種ボブホワイトにおけるＭＦＴ遺伝子の強制発現
ゼンコウジコムギの３Ａ染色体由来のＭＦＴ遺伝子のコーディング領域を、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターに連結した発現ベクターを構築し、パーティクルボンバードメント法により導入した。
【００７５】
〔実施例１２〕
イネ品種日本晴におけるＭＦＴ遺伝子の強制発現
ゼンコウジコムギの３Ａ染色体由来のＭＦＴ遺伝子のコーディング領域を、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターに連結した発現ベクターを構築し、アグロバクテリウム法により導入した。その結果、遺伝子導入された形質転換植物体が約３０個体得られた。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】実施例１の結果を表すグラフである。
【図２】実施例２の結果を表すグラフである。「農６１」はコムギ品種農林６１号を表し、「シロガネ」はコムギ品種シロガネコムギを表す。
【図３】実施例３の結果を表すグラフである。
【図４】実施例４の結果を表す図である。
【図５】各種の植物のＭＦＴ遺伝子のアミノ酸配列をアラインメントした図である。
【図６】（Ａ）コムギ品種ゼンコウジコムギの種子休眠ＱＴＬを示す図である。（Ｂ）コムギ品種Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（Ｔｍ）の３Ａ染色体（３Ａｍ）の遺伝子地図である。
【図７】（Ａ）チャイニーズスプリング（ＣＳ）の３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子の多型を検出した結果である。（Ｂ）チャイニーズスプリングにゼンコウジコムギの３Ａ染色体を置換した１染色体置換系統（ＣＳ（Ｚｅｎ３Ａ））における、３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子の多型を検出した結果である。（Ｃ）ヘテロ体における、３Ａ染色体短腕に座乗するＭＦＴ遺伝子の多型を検出した結果である。
【図８】コムギ品種ゼンコウジコムギの３Ａ染色体の遺伝子地図である。
【図９】実施例１０の結果を表すグラフである。
【図１０】コムギ品種チャイニーズスプリングとゼンコウジコムギを交配して得られたＲＩＬ集団の３Ｄ染色体のゲノム構造を表す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、且つ配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
からなる群より選択される塩基配列からなる、種子休眠性向上遺伝子。
【請求項２】
配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる、種子休眠性向上マーカー遺伝子。
【請求項３】
ゼンコウジコムギとそれ以外の品種のコムギを交配して子孫を得る交配ステップと、
当該子孫のゲノムＤＮＡにおいて、請求項２に記載の種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在の有無を検出する検出ステップと、
検出ステップにおいて請求項２に記載の種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在が検出された場合に、前記子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断して選抜する選抜ステップと
を含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法。
【請求項４】
コムギを交配して子孫を得る交配ステップと、
当該子孫の種子、種子親の種子及び花粉親の種子における、請求項１に記載の種子休眠性向上遺伝子の発現量を測定する測定ステップと、
測定ステップにおいて、子孫の種子における種子休眠性向上遺伝子の発現量が、種子親又は花粉親のうち、いずれか種子における種子休眠性向上遺伝子の発現量が低い親よりも高い場合に、当該子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断して選抜する選抜ステップと
を含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法。
【請求項５】
請求項１に記載の種子休眠性向上遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物体。
【請求項６】
コムギである、請求項５に記載の形質転換植物体。
【請求項７】
イネである、請求項５に記載の形質転換植物体。
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列、
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有し、且つ配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
からなる群より選択される塩基配列からなる、種子休眠性向上遺伝子。
【請求項２】
配列番号３又は４に記載の塩基配列からなる、種子休眠性向上マーカー遺伝子。
【請求項３】
ゼンコウジコムギとそれ以外の品種のコムギを交配して子孫を得る交配ステップと、
当該子孫のゲノムＤＮＡにおいて、請求項２に記載の種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在の有無を検出する検出ステップと、
検出ステップにおいて請求項２に記載の種子休眠性向上マーカー遺伝子の存在が検出された場合に、前記子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断して選抜する選抜ステップと
を含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法。
【請求項４】
コムギを交配して子孫を得る交配ステップと、
当該子孫の種子、種子親の種子及び花粉親の種子における、請求項１に記載の種子休眠性向上遺伝子の発現量を測定する測定ステップと、
測定ステップにおいて、子孫の種子における種子休眠性向上遺伝子の発現量が、種子親又は花粉親のうち、いずれか種子における種子休眠性向上遺伝子の発現量が低い親よりも高い場合に、当該子孫を種子休眠性が向上したコムギ品種であると判断して選抜する選抜ステップと
を含む、種子休眠性が向上したコムギ品種の育種方法。
【請求項５】
請求項１に記載の種子休眠性向上遺伝子を発現可能に保持する形質転換植物体。
【請求項６】
コムギである、請求項５に記載の形質転換植物体。
【請求項７】
イネである、請求項５に記載の形質転換植物体。
【図１】
【図２】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図３】
【図５】
【図２】
【図４】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図３】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−７５０８８（Ｐ２０１０−７５０８８Ａ）
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２４６４１４（Ｐ２００８−２４６４１４）
【出願日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名： 日本育種学会 第１１３回講演会 主催者名： 日本育種学会 開催日： ２００８年３月２８日
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、農林水産省、プロジェクト研究「アグリ・ゲノム研究の総合的な推進」（有用遺伝子活用のためのイネゲノム研究・ゲノム育種による効率的品種育成技術の開発）委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【出願人】（５０４３０００８８）国立大学法人帯広畜産大学 (96)
【出願人】（５０５１５５５２８）公立大学法人横浜市立大学 (101)
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名： 日本育種学会 第１１３回講演会 主催者名： 日本育種学会 開催日： ２００８年３月２８日
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度、農林水産省、プロジェクト研究「アグリ・ゲノム研究の総合的な推進」（有用遺伝子活用のためのイネゲノム研究・ゲノム育種による効率的品種育成技術の開発）委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【出願人】（５０４３０００８８）国立大学法人帯広畜産大学 (96)
【出願人】（５０５１５５５２８）公立大学法人横浜市立大学 (101)
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【Ｆターム（参考）】
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