尿酸ホメオスタシスのコントロール
本発明は、尿酸に応答して遺伝子発現をスイッチオンまたはスイッチオフするために有用なシステムにおけるベクターおよび哺乳動物細胞に関する。本発明は、特定の実施態様において、有害な過剰の尿酸の検出および／または分解に有用な哺乳動物細胞であって、（ａ）トランス活性化ドメインまたはトランスリプレッサードメインに融合したDeinococcus radiodurans R1由来ウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲのための遺伝暗号を含むベクター；および（ｂ）該細菌性尿酸センサー−レギュレーターＨｕｃＲと特異的に結合するDeinococcus radiodurans R1由来の対応するオペレーター配列ｈｕｃＯ、プロモーター、および内因性または外因性タンパク質、例えば尿酸と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、尿酸に応答して遺伝子発現をスイッチオンまたはスイッチオフするために有用なシステムにおけるベクターおよび哺乳動物細胞に関する。
【０００２】
発明の背景
尿酸ホメオスタシスはヒトに不可欠であるが、それは、この代謝物がガン、パーキンソン病および多発性硬化症の発生を減少させる重要なラジカルスカベンジャーおよび酸化ストレス保護剤であるからである。しかしながらヒトは、進化の途中に尿酸オキシダーゼが欠如したせいで高尿酸血症の素因を有し、高尿酸血症は、腎症、腫瘍溶解症候群および痛風に関連する尿酸塩結晶沈着物の形成に有利に働く。
【０００３】
痛風は、先進工業国の人口の１％超を冒す最も一般的な炎症性関節炎であり、その有病率は、増え続ける糖質消費が肥満および過インスリン症（それはプリン代謝の最終産物である尿酸の腎クリアランスを低下させる）を促進するので、世界的に上昇傾向にある。尿酸をさらに可溶性のアラントインに変換する尿酸オキシダーゼの進化上の欠如が原因で、血中尿酸レベルはヒトにおいて特に高く、そのことは、酸化ストレス耐性を向上させ、どんどん複雑になる神経回路網への酸化的損傷を防止したことによって、ヒト科の脳進化に不可欠であった可能性がある。腎臓中の尿酸トランスポーターが血流中の尿酸レベルをレギュレーションするので、高い生理学的尿酸レベルは、典型的にはヒトによる忍容性が良好である。しかしながら、尿酸ホメオスタシスの不均衡は、高尿酸血症ならびに関節、腎臓および皮下組織における尿酸一ナトリウムの病的結晶沈着物の形成へと導く可能性があり、それが高血圧、心血管疾患、尿酸腎結石症および痛風などの尿酸関連病態をトリガーする。
【０００４】
地球上で最も放射線耐性の生物であるDeinococcus radiodurans R1は、紫外線および酸化ストレスを含めた、他の起源のＤＮＡ損傷に耐える驚くべき能力も進化させている（Daly, M.J., Nat. Rev. Microbiol. 7, 237-245 (2009)）。近年、仮説上ウリカーゼレギュレーター（ＨｕｃＲ）がD. radioduransから同定されたが、それは、酸化ストレスに対する細胞応答に重大な役割を果たすことが示唆された。D. radioduransは、哺乳動物に類似して、尿酸のラジカルスカベンジング活性を利用すると思われるが、それでも結晶化を阻止するためにそのレベルをコントロールする必要がある。ＨｕｃＲは、異なる方向で転写されるｈｕｃＲと推定上ウリカーゼとの遺伝子間領域における二分子対称（dyad-symmetrical）オペレーター部位（ｈｕｃＯ）に結合することが示され、それは、過剰な尿酸レベルがｈｕｃＯからＨｕｃＲの解離をトリガーし、ウリカーゼの発現を誘導するものの、両遺伝子が、デフォルトではＨｕｃＲによって共抑制されることを示唆している（Wilkinson, S.P. & Grove, A., J. Biol. Chem. 279, 51442-51450 (2004); J. Mol. Biol. 350, 617-630 (2005)）。
【０００５】
発明の概要
本発明は、有害な過剰の尿酸の検出および／または分解に有用な哺乳動物細胞であって、以下を含む細胞に関する。
（ａ）トランス活性化ドメインまたはトランスリプレッサードメインに融合した細菌性尿酸センサー−レギュレーターのための遺伝暗号を含むベクター；および
（ｂ）該細菌性尿酸センサー−レギュレーターと特異的に結合するオペレーター配列、プロモーター、および内因性または外因性タンパク質、例えば尿酸と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【０００６】
同様に本発明は、トランス活性化ドメインまたはトランスリプレッサードメインに融合した細菌性尿酸センサー−レギュレーターのための遺伝暗号を含むベクターそのもの、ならびに該細菌性尿酸センサー−レギュレーターと特異的に結合するオペレーター配列、プロモーター、および内因性または外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターそのものに関する。
【０００７】
特に本発明は、細菌性尿酸センサー−レギュレーターが、Deinococcus radiodurans R1由来ウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲであって、オペレーター配列がDeinococcus radiodurans R1由来の対応するオペレーター配列ｈｕｃＯである、その種の哺乳動物細胞およびその種のベクターに関する。
【０００８】
さらに本発明は、ナノコンテナまたはマイクロコンテナ中の前記哺乳動物細胞、ヒト以外の哺乳動物（場合によりナノコンテナまたはマイクロコンテナ中にその種の哺乳動物細胞を含む）、およびそのような哺乳動物細胞を使用して、尿酸の過剰または欠如によって起こる疾患を処置する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】尿酸応答性哺乳動物センサーの合成回路を示す図である。（ａ）尿酸応答性導入遺伝子発現（ＵＲＥＸ）のための発現ベクター（略語については表１参照）。（ｂ）作動中のＵＲＥＸを示す図。尿酸の不在下（−ＵＡ）でｍＵＴＳ（ＫＲＡＢ−ＨｕｃＲ）はｈｕｃＯ８に結合し、ＳＥＡＰ生成を抑制する。尿酸の存在下（＋ＵＡ）で、ｍＵＴＳはｈｕｃＯ８から解離し、ＰＵＲＥＸ８が抑制解除され、ＰＳＶ４０駆動性ＳＥＡＰ発現が生じる。（ｃ）異なるヒト細胞系におけるＰＵＲＥＸ８のｍＵＴＳ介在性抑制。ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３およびＨＴ−１０８０にｐＣＫ９（ＰＵＲＥＸ８−ＳＥＡＰ−ｐＡ）およびｐＣＫ２５（ＰｈＥＦ１α−ｍＵＴＳ−ｐＡ）を共トランスフェクションし、４８時間培養してからＳＥＡＰの発現を定量した。（ｄ）ＵＲＥＸセンサー回路の機能的評価。４×１０４個のＨｅＬａ細胞にＵＲＥＸ発現ベクターｐＣＫ９およびｐＣＫ２５を共トランスフェクションし（図１ａ参照）、５mM尿酸の存在下または不在下で４８時間培養してから、細胞培養上清中のＳＥＡＰを定量した。（ｅ〜ｇ）ヒト尿酸トランスポーターＵＲＡＴ１の存在下および不在下におけるＵＲＥＸの尿酸依存性用量反応特性を示す図である。３×１０５個のＨｅＬａ（ｅ）、ＨＥＫ−２９３（ｆ）またはＨＴ−１０８０細胞（ｇ）にＵＲＥＸセンサープラスミドｐＣＫ９およびｐＣＫ２５と（図１ａ参照）、ｐＵＲＡＴ１（ＰｈＣＭＶ−ＵＲＡＴ１−ｐＡ）または同質遺伝子対照ベクターｐｃＤＮＡ３．１のいずれかとを共トランスフェクションした。異なる濃度の尿酸を補充した培地中で、トランスフェクション後の集団を培養し、結果として得られたＳＥＡＰレベルを４８時間後にプロファイリングした。（Ｓ）ＳＥＡＰ生成；（Ｕ）尿酸濃度；（ｍＵＴＳ）哺乳動物尿酸トランスサイレンサー。
【図２】尿酸オキシダーゼ欠損マウスおよびトランスジェニックＨＥＫ−２９３における、ＵＲＥＸコントロール性ＳＥＡＰ発現の検証を示す図である。（ａ）ＵＲＥＸコントロール性ＳＥＡＰ発現のために操作されたＨｅＬａＵＲＡＴ１細胞を密着性アルギン酸−ポリＬ−リシン−アルギン酸マイクロカプセルにマイクロ封入し、（ｉ）病的尿酸レベルを示す未処置ｕｏｘ−／−マウスまたは（ｉｉ）尿酸レベルを低下させるために飲料水から１５０μg/mL（w/v）の高尿酸血症治療薬アロプリノールを摂取したｕｏｘ−／−マウスに腹腔内注射した（２×１０６個細胞／マウス、２００個細胞／カプセル）（ＵＲＥＸ）。対照埋込み物は、ＳＥＡＰの構成的発現のために遺伝子導入された細胞を含有した（対照）。細胞移植の７２時間後に、動物の血清中のＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。（ｂ）ＵＲＥＸコントロール性ＳＥＡＰ発現およびＵＲＡＴ１構成的発現ために安定的に操作されたトリプルトランスジェニックＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５細胞系の尿酸ベースの用量反応プロファイル。５×１０４個のＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５を異なる濃度の尿酸の存在下で培養し、７２時間後に培養上清中のＳＥＡＰレベルを定量した。（ｃ）ＵＲＥＸベースの尿酸センサー回路の可逆性。７２時間毎（矢印）に尿酸濃度を０から５mMに交互に変化させながら、２×１０５個のＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５細胞を１０日間培養した。（Ｃ）対照；（Ｓ）ＳＥＡＰ生成；（Ｕ）尿酸濃度；（＋Ａ）＋アロプリノール（低尿酸）；（−Ａ）−アロプリノール（高尿酸）；（ｔ）時間。
【図３】哺乳動物のAsperguillus flavus由来の操作された尿酸オキシダーゼの機能的特徴付けを示す図である。（ａ）細胞内尿酸オキシダーゼ変異体（ｍＵｏｘ）または分泌操作された尿酸オキシダーゼ変異体（ｓｍＵｏｘ）の構成的発現またはＵＲＥＸコントロール性発現によって仲介される尿酸減少のプロファイリング。２×１０５個のＨｅＬａＵＲＡＴ１細胞に、（ｉ）ｐＣＫ６５（ＰＵＲＥＸ８−ｓｍＵｏｘ−ｐＡ）および同質遺伝子対照ベクターｐｃＤＮＡ３．１、（ｉｉ）ｐＣＫ６５（ＰＵＲＥＸ８−ｓｍＵｏｘ−ｐＡ）およびｐＣＫ２５（ＰｈＥＦ１α−ｍＵＴＳ−ｐＡ）、（ｉｉｉ）ｐＣＫ６７（ＰＵＲＥＸ８−ｍＵｏｘ−ｐＡ）およびｐｃＤＮＡ３．１、または（ｉｖ）ｐＣＫ６７（ＰＵＲＥＸ８−ｍＵｏｘ−ｐＡ）およびｐＣＫ２５（ＰｈＥＦ１α−ｍＵＴＳ−ｐＡ）のいずれかを共トランスフェクションした。細胞を０．５mM尿酸と共に７２時間培養してから、培養上清中の尿酸レベルを決定した。（ｂ）尿酸分解はＵＲＥＸコントロール性ｓｍＵｏｘ発現をプロファイリングする。構成的ｓｍＵｏｘ発現（点線）またはＵＲＥＸコントロール性ｓｍＵｏｘ発現（破線）のために操作された２×１０５個のＨｅＬａＵＲＡＴ１細胞（実線）を、出発尿酸濃度０．５mMを含有する培地中で培養し、尿酸減少動態を１２０時間プロファイリングした。（ｃ，ｄ）マウスにおける病的尿酸レベルのＵＲＥＸコントロール性ｓｍＵｏｘ介在性減少。ＵＲＥＸコントロール性ｓｍＵｏｘ発現のために操作されたＨｅＬａＵＲＡＴ１細胞をマイクロ封入したものを、病的尿酸レベルを示す未処置ｕｏｘ−／−マウスまたは飲料水から１５０μg/mL（w/v）の高尿酸血症治療薬アロプリノールを摂取したｕｏｘ−／−マウスに腹腔内埋込みした（マウス１匹あたり２×１０６個細胞）（ＵＲＥＸ−ｓｍＵｏｘ）。対照埋込み物は、親ＨｅＬａＵＲＡＴ１を含有した（対照）。細胞埋込みから７２時間後の動物の血清（ｃ）および尿（２４時間採集）（ｄ）中の尿酸レベルをプロファイリングした。（ｅ〜ｇ）（ｅ）１５０μg/mL（w/v）アロプリノールを摂取したｕｏｘ−／−マウス（陽性対照）、（ｆ）ｕｏｘ−／−マウス（陰性対照）および（ｇ）ＵＲＥＸコントロール性ｓｍＵｏｘ発現のために操作されたＨｅＬａＵＲＡＴ１を埋め込まれたｕｏｘ−／−マウスの腎臓中の尿酸一ナトリウムの異方性結晶沈着物（矢印）を示す組織切片。（Ｃ）対照；（Ｕ）尿酸濃度；（ＳＵ）血清中尿酸；（ＵＵ）尿中尿酸；（＋Ａ）＋アロプリノール（低尿酸）；（−Ａ）−アロプリノール（高尿酸）；（ｔ）時間。スケールバーは１００μM。
【００１０】
発明の詳細な説明
本明細書において記載される「ＵＲＥＸ」システムは、尿酸ホメオスタシスを自己充足的に自動コントロールするためのバイオセンサーである。このシステムは、尿酸の検出および尿酸に応答するための全般的バイオセンサーとしてin vitroおよびin vivoで適用することができる。ＵＲＥＸシステムは、哺乳動物細胞中の尿酸に応答して、遺伝子発現の（ｉ）スイッチオンまたは（ｉｉ）スイッチオフのいずれかを行うために使用することができる。
【００１１】
尿酸は、式
【００１２】
【化１】
【００１３】
で示される７，９−ジヒドロ−３Ｈ−プリン−２，６，８−トリオンであり、いくつかの互変異性型で存在する。本明細書に使用されるような尿酸には、尿酸の全ての互変異性型および「尿酸塩」と呼ばれるそれらの塩が含まれる。塩は、例えば尿酸一ナトリウムまたは尿酸一カリウムまたは尿酸二カリウムである。
【００１４】
本発明は、有害な過剰の尿酸の検出および／または分解に有用な哺乳動物細胞であって、以下：
（ａ）トランス活性化ドメインまたはトランスリプレッサードメインに融合した細菌性尿酸センサー−レギュレーターのための遺伝暗号を含むベクター；および
（ｂ）該細菌性尿酸センサー−レギュレーターと特異的に結合するオペレーター配列、プロモーター、および内因性または外因性タンパク質、例えば尿酸と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター
を含む細胞に関する。
【００１５】
同様に本発明は、トランス活性化ドメインまたはトランスリプレッサードメインに融合した細菌性尿酸センサー−レギュレーターのための遺伝暗号を含むベクターそのもの、ならびに該細菌性尿酸センサー−レギュレーターに特異的に結合するオペレーター配列、プロモーター、および内因性または外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターそのものに関する。
【００１６】
細菌性尿酸センサー−レギュレーターは、本発明の目的のために、DeinococcaceaeまたはPseudomonadaceaeによって生成されるＨｕｃＲタンパク質などの天然尿酸センサー−レギュレーターに由来または関係する。細菌性尿酸センサー−レギュレーターは、例えば、Deinococcus radiodurans R1由来転写レギュレーターＨｕｃＲ（ＤＲ＿１１５９）、Deinococcus geothermalis DSM 11300由来ＭａｒＲ型転写レギュレーターＤｇｅｏ＿２５３１、Pseudomonas mendocina ypm由来ＭａｒＲ型転写レギュレーター、Deinococcus deserti VCD115由来ＭａｒＲ型転写レギュレーターＤｅｉｄｅ＿３ｐ００２８０、およびこれら前記の天然センサー−レギュレーター由来のセンサー−レギュレーターである。この文脈で、DeinococcaceaeまたはPseudomonadaceaeによって生成されるＨｕｃＲタンパク質のような天然尿酸センサー−レギュレーター「由来の」は、アミノ酸配列が天然センサー−レギュレーターと同一であるか、または保存的アミノ置換のみを有し、アミノ酸レベルで少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％同一を維持することを意味する。本発明の目的のために、DeinococcaceaeまたはPseudomonadaceaeによって生成されるＨｕｃＲタンパク質などの天然尿酸センサー−レギュレーターに「関係する」は、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列が、少なくとも低ストリンジェンシー条件で、さらに好ましくは中ストリンジェンシー条件で、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件で天然尿酸センサー−レギュレーターにハイブリダイゼーションし、天然尿酸センサー−レギュレーター認識配列に結合することを意味する。保存的置換は、当技術分野において公知であり、とりわけDayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3に記載されている。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般に４群に分類される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、また、合同で芳香族アミノ酸として分類される。特定群の一つのアミノ酸を同じ群の別のアミノ酸に置換することは、一般に保存的置換と見なされる。本発明の目的のために、「由来する」および「関係する」には、同じアミノ酸をコードするが、目的のホスト細胞、例えば哺乳動物細胞に特に適合されたトリプレットコドンを含む、ポリヌクレオチドレベルでの化合物も含まれることが了解されている。特に哺乳動物細胞に適合されたこの種のポリヌクレオチドが、特に好ましい。
【００１７】
該細菌性尿酸センサー−レギュレーターに特異的に結合する対応するオペレーター配列は、ＨｕｃＲによって認識されるタンデムリピート含有オペレーター部位ｈｕｃＯである。考慮される他のオペレーター配列は、DeinococcaceaeまたはPseudomonadaceaeによって生成される前記センサー−レギュレーターに特異的に結合するこれらのオペレーター配列、および前記オペレーター配列に「由来」および「関係」するオペレーター配列である。本発明の目的のために、「由来する」は、センサー−レギュレーターとの目的の相互作用を減らさずに、一つまたは複数のヌクレオチド、特に１、２、３、４または５個などの１〜１２個のヌクレオチドを他のヌクレオチドに置換することができることであると了解されている。本発明による、「関係する」オペレーター配列は、少なくとも低ストリンジェンシー条件で、より好ましくは中ストリンジェンシー条件で、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件で天然オペレーター配列とハイブリダイズし、天然尿酸センサー−レギュレーターに結合する。考慮される特定のオペレーター配列は、例えば２から１００の間の、特に５から２０の間のリピートを含む、天然オペレーター配列またはそれら由来の配列のタンデムリピートである。
【００１８】
トランス活性化ドメインは、例えば、単純ヘルペスウイルスのｖｐ１６トランス活性化ドメイン、ｐ６５トランス活性化ドメイン、ヒトｅ２ｆ４トランス活性化ドメイン、ならびにＧＡＬ４、ＣＴＦ／ＮＦ１、ＡＰ２、ＩＴＦ１、Ｏｃｔ１およびＳｐＩに由来または関係するトランス活性化ドメイン、ならびにまた、米国特許第６，２８７，８１３号に挙げられたものである。
【００１９】
トランスリプレッサードメインは、例えばヒト−クルッペル関連ボックスタンパク質のｋｒａｂトランス抑制ドメインである。考慮される他のトランスリプレッサードメインは、例えばｖ−ｅｒｂＡガン遺伝子産物、甲状腺ホルモンレセプター、Ｓｓｎ６／Ｔｕｐ１タンパク質複合体、ＳＩＲＩタンパク質、ＮｅＰ１、ＴＳＦ３、ＳＦ１、ＷＴ１、Ｏｃｔ−２．１、Ｅ４ＢＰ４、ＺＦ５、ＰｈＤブロモドメインを含有する任意の転写レギュレーター、およびまた、米国特許第６，２８７，８１３号に挙げられたものに由来または関係するドメインである。
【００２０】
考慮されるプロモーターは、例えば、構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）、ヒトサイトメガロウイルス最小最初期プロモーター（ＰｈＣＭＶｍｉｎ）、構成的ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＰｈＣＭＶ）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＰｈＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＰＧＫ）、ヒト−ユビキチンプロモーター（ＰｈＵＢＣ）およびβアクチンプロモーターである。
【００２１】
本発明のベクターおよび哺乳動物細胞の文脈で考慮される内因性または外因性タンパク質は、例えば、尿酸を代謝するタンパク質、例えば尿酸およびその塩をアラントインに変換するウリカーゼ（尿酸オキシダーゼ）、または尿酸およびその塩を輸送するタンパク質、例えば哺乳動物尿酸トランスポータータンパク質、特にヒト尿酸トランスポータータンパク質１（ＵＲＡＴ１）、または尿酸の定量を可能にする、容易に検出可能なタンパク質などの、尿酸と相互作用するタンパク質である。
【００２２】
容易に検出可能なタンパク質は、例えば分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、蛍光タンパク質または強化蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰなど）、分泌型α−アミラーゼ（ＳＡＭＹ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、およびグルクロニダーゼである。
【００２３】
特に本発明は、細菌性尿酸センサー−レギュレーターがDeinococcus radiodurans R1由来のウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲであって、オペレーター配列がDeinococcus radiodurans R1由来の対応するオペレーター配列ｈｕｃＯである、この種の哺乳動物細胞およびこの種のベクターに関する。
【００２４】
例えば尿酸と相互作用するタンパク質が、Fasturec（登録商標）の商品名で販売されている治療応用可能なAspergillus flavus由来ラスブリカーゼなどの尿酸オキシダーゼ(「ウリカーゼ」)である場合、本明細書下記の対応する特定の哺乳動物細胞は、尿酸オキシダーゼ欠損マウス（痛風性関節炎および腫瘍溶解症候群のようなヒト高尿酸血症疾患のための承認された疾患モデルを意味する）において、病的尿酸レベルに応答し、非病的で酸化ストレス防御性の尿酸レベルでは導入遺伝子の発現をスイッチオフする遺伝子自動レベルコントロールシステムを意味する。
【００２５】
全身の尿酸は、強力なラジカルスカベンジャーであって、ラジカルの解毒によって身体を酸化ストレスから防御する。尿酸塩は、高く上昇したレベルの場合にだけ関節、腎臓および皮下組織中で結晶化し、痛みのある炎症ならびに高尿酸血症、腎結石および痛風性関節炎のような疾患を引き起こす。対照的に、尿酸オキシダーゼの構成的発現によって身体から尿酸を完全に除去すると、ラジカルベースの細胞および組織損傷、特に神経細胞の損傷の増加が生じるおそれがある。これは、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性疾患についての尿酸の防御性によっても示される。したがって、代謝物を病的レベルよりも下に維持することは、新規な遺伝子治療応用に向けた重要なステップである。
【００２６】
本明細書下記の特定の哺乳動物尿酸ホメオスタシスの合成コントロールネットワークは、用量依存性の尿酸オキシダーゼベースの治療応答を招く。ヒトに似た症状の高尿酸血症を発症している尿酸オキシダーゼ欠損マウスにおいて、デザイナー回路は、血中尿酸濃度を病的レベルよりも下の安定レベルに低下させ、処置された動物の腎臓中の尿酸塩結晶沈着物を減少させる。この治療ネットワークは、酸化ストレスを防御するために尿酸の基礎レベルを保ちながら尿酸の重大な蓄積を阻止することによって、尿酸ホメオスタシスの自己充足的な自動コントロールを提供する。
【００２７】
本明細書下記の哺乳動物ＵＲＥＸシステムは、また、バイオリアクターを適用したタンパク質治療薬の製造にも使用することができる。例えばオキシダーゼ／レダクターゼの酵素クラスのメンバーのようなトランスジェニック酵素の製造によって、培地中の細胞の維持および成長のために使用される化合物が酵素ベースで触媒変換され、ラジカルの放出が起こる可能性がある。誘導された酸化ストレスは、細胞の成長を阻害または生成物の安定性を抑制することによって、生成物の連続形成をかく乱するおそれがある。ＵＲＥＸシステムでこの種の酵素の発現をコントロールすると、生成物の形成は外因性尿酸の添加によって誘導され、その尿酸は、酵素発現の誘導因子として機能すると同時に、発生したラジカルと結合し、解毒することによって細胞を工程媒介性酸化ストレスから防御する。
【００２８】
本発明は、さらに、上記ベクターを安定的または一過性のいずれかでトランスフェクションされた前記ベクターを含む哺乳動物細胞、およびナノコンテナまたはマイクロコンテナ中の、例えば封入された形態のこの種の哺乳動物細胞に関する。ナノコンテナは、ウイルス、好ましくは弱毒化ウイルス、特にウイルスキャプシド、例えば哺乳動物細胞を組み入れるのに適した形状の球体またはチューブなどの合成または半合成のナノパーティクルまたはミクロパーティクル、および哺乳動物細胞を例えばアルギン酸−ポリ−Ｌ−リシンで封入することによってin situで形成されるナノコンテナまたはマイクロコンテナでありうる。適切なナノコンテナまたはマイクロコンテナの特定の例は、CELLMAX（登録商標）の商品名で製造された中空糸である。
【００２９】
本発明は、さらに、前記哺乳動物細胞、特にナノコンテナまたはマイクロコンテナ中の哺乳動物細胞を含む、ヒト以外の哺乳動物に関する。
【００３０】
本発明は、さらに、この種の哺乳動物細胞を使用して、尿酸の過剰または尿酸の欠如によって起こる疾患を処置する方法に関する。考慮される疾患は、尿酸の過剰によって起こるもの、例えば高尿酸血症、痛風、レッシュ−ナイハン症候群、腎症、および腫瘍溶解症候群、ならびに不十分なレベルの尿酸によって起こる疾患、例えばアルツハイマー、パーキンソン、および対応するガンである。特に、本発明は、尿酸の過剰または欠如によって起こる疾患を患う患者の処置方法であって、本明細書記載のナノコンテナまたはマイクロコンテナ中の哺乳動物細胞が、それを必要とする患者に埋め込まれる方法に関する。
【００３１】
好ましい態様
本発明の特に例示的な態様では、Deinococcus radiodurans R1における酸化ストレス応答を調和させるＨｕｃＲとｈｕｃＯとの間の尿酸応答性相互作用を利用して、哺乳動物細胞を尿酸に感知および応答可能にする特定の合成回路が構築される（Wilkinson, S.P. & Grove, A.、上記引用文中）。
【００３２】
本発明のこの好ましい態様は、以下の通りである：尿酸応答性発現ネットワーク（ＵＲＥＸ）が、（ｉ）哺乳動物細胞で最大発現させるためのＨｕｃＲ開始コドンの改変（ＧＴＧ→ＡＴＧ）およびコザックコンセンサス配列との融合（ｍＨｕｃＲ）、（ｉｉ）クルッペル関連ボックスタンパク質ドメインにｍＨｕｃＲのＮ−末端を融合（Bellefroid, E.J., Poncelet, D.A., Lecocq, P.J., Revelant, O. & Martial, J.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3608-3612 (1991)）させて、キメラ哺乳動物尿酸依存性トランスサイレンサーを生成させること（ｍＵＴＳ、ＫＲＡＢ−ｍＨｕｃＲ）、および（ｉｉｉ）サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）下流に８個のタンデムのｈｕｃＯモジュールを置くことによって集合された合成プロモーター（ＰＵＲＥＸ８、ＰＳＶ４０−ｈｕｃＯ８）を含む多段階操作戦略によって構築される（図１ａ）。尿酸の不在下で、ｍＵＴＳは、ｈｕｃＯ８に結合し、ＰＵＲＥＸ８からの転写をサイレンシングする（図１ｂ）。しかしながら、ｍＵＴＳは、尿酸の存在下でｈｕｃＯ８から解離することによってＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）の発現を誘導する。無尿酸培地中で成長したヒト子宮頚部腺ガン細胞（ＨｅＬａ）、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３）およびヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）に、ｐＣＫ９（ＰＵＲＥＸ８−ＳＥＡＰ−ｐＡ）と共に、構成的ヒト伸長因子１αプロモーター（ＰｈＥＦ１α□□）に推進されるｍＵＴＳ発現ベクターｐＣＫ２５（ＰｈＥＦ１α−ｍＵＴＳ−ｐＡ）を共トランスフェクションすることにより、ｍＵＴＳがＰＵＲＥＸ８に結合し、それに推進されるＳＥＡＰの発現を最大９８％サイレンシングできることを示した（図１ｃ）。トランスフェクションされた培養物への５mM尿酸の添加は、ｈｕｃＯ８からのｍＵＴＳの解離をトリガーし、ＳＥＡＰの発現を抑制解除する（図１ｄ）。
【００３３】
特に本発明は、細菌性尿酸センサー−レギュレーターがDeinococcus radiodurans R1由来のウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲであって、オペレーター配列が、Deinococcus radiodurans R1由来の対応するオペレーター配列ｈｕｃＯである、哺乳動物細胞およびベクターに関する。さらに好ましい態様は、ウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲがコザック−コンセンサス配列に融合しており、クルッペル関連ボックスタンパク質ドメインのＮ−末端が、ウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲに融合している態様である。他の好ましい態様は、プロモーターがサルウイルス４０プロモーターであって、Deinococcus radiodurans R1由来の好ましいオペレーター配列ｈｕｃＯを含むベクターが、ｈｕｃＯを数個のコピーで、例えば５から５０個コピーの間で、好ましくは５から２０個のコピーの間で含む態様である。最も好ましいのは、ベクターｐＣＫ２５およびｐＣＫ９、ならびにｐＣＫ９中のＳＥＡＰについてのコドンが、別の検出可能なタンパク質、例えば上に挙げた容易に検出可能なタンパク質についてのコドンに置換されたベクターである。
【００３４】
ヒトは、突然変異サイレンシングによって肝ウリカーゼを進化的に欠如しているせいで、効果的な腎尿酸クリアランスおよび尿酸ホメオスタシスの維持を尿酸陰イオントランスポーターＵＲＡＴ１に依存している（Enomoto, A. et al., Nature 417, 447-452 (2002)）。そのトランスポーターの尿酸取り込み能のせいで、ＵＲＡＴ１の異所性発現は、細胞内尿酸レベルを増加させ、結果としてＵＲＥＸの感度を増幅する可能性がある。ＵＲＥＸコントロール性のＳＥＡＰ発現のために操作され、構成的ＵＲＡＴ１発現ベクター（ｐＵＲＡＴ１）をトランスフェクションされたＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３およびＨＴ−１０８０は、無ＵＲＡＴ１細胞よりも有意に高いＳＥＡＰレベルに達し、典型的にはヒト血液中にみられる尿酸範囲内（２００〜４００μM）で特に高感度である（図１ｅ〜ｇ）。実際に、ＵＲＡＴ１およびＵＲＥＸコントロール性ＳＥＡＰ発現のために操作された、マイクロ封入されたＨｅＬａをヒト痛風性関節炎の樹立マウスモデルである尿酸オキシダーゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウスに腹腔内埋込みした７２時間後に（Wu, X. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 742-746 (1994)）、合成尿酸センサー回路は、高尿酸血症および尿酸腎症を発症しているマウス（高尿酸レベル；０．３５±０．１５U/L ＳＥＡＰ）と、認可を受けている尿酸低下性関節炎治療薬アロプリノールを飲料水から摂取した動物（低尿酸レベル；０．０２±０．１０U/L ＳＥＡＰ）とを識別するために十分な感度であった（図２ａ）。ＳＥＡＰを構成的生成している細胞で処置された対照マウスは、アロプリノールの存在下（低尿酸レベル；０．８５±０．１０U/L SEAP）または不在下（高尿酸レベル；０．９０±０．１５U/L SEAP）で不変のＳＥＡＰ発現を示す。
【００３５】
哺乳動物尿酸センサーシステムの調整能力および長期可逆性を特徴づけるために、ＵＲＥＸコントロール性のＳＥＡＰおよびＵＲＡＴ１発現のための安定なトリプルトランスジェニック−ヒト細胞系ＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５を構築する。ＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５のＳＥＡＰ発現は、正確に調整することができ、尿酸濃度の上昇に応答して漸増を示す（図２ｂ）。ＵＲＥＸコントロール性ＳＥＡＰ生成の可逆性は、尿酸濃度を０mMから５mMに７２時間毎に交互に変化させながらＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５を１０日間培養することによって評価する。ＵＲＥＸのコントロールは、完全に可逆的であり、ＳＥＡＰ生成に全く発現記憶効果を示さずにいつでもリセットすることができる（図２ｃ）。
【００３６】
ＵＲＥＸは、正確で頑健な尿酸センサーとして、病的レベルのこの代謝物を治療的にコントロールするために適する。尿酸レベルを自律的で自己充足的にフィードバックコントロールにより減少させるために、尿酸センサー回路は、尿酸をより可溶性で、腎臓で分泌可能なアラントインに変換するウリカーゼ／尿酸オキシダーゼ（Ｕｏｘ）の発現と連結される必要がある（Legoux, R. et al., J. Biol. Chem. 267, 8565-8570 (1992)）。補因子非依存性Aspergillus flavusウリカーゼは、哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されている（ｍＵｏｘ）。ｍＵｏｘは、構成的発現するか（ｐＣＫ６７、ＰＵＲＥＸ８−ｍＵｏｘ−ｐＡ）、またはｍＵＴＳによってコントロールされると（ｐＣＫ６７がｐＣＫ２５と共発現、ＰＵＲＥＸ８−ｍＵｏｘ−ｐＡ、ＰｈＥＦ１α−ｍＵＴＳ−ｐＡ）、培地中の尿酸を減少させる（０．５mM）。免疫グロブリン由来分泌シグナルとフレーム内融合させることによってｍＵｏｘを哺乳動物細胞ベースで分泌させるように操作したときの方が、尿酸の減少は効率的である（Fluri, D. et al., J. Control. Release 131, 211-219 (2008), ｓｍＵｏｘ；ＳＳＩｇｋ−ｍＵｏｘ；ｐＣＫ６５、ＰＵＲＥＸ８−ＳＳＩｇｋ−ｍＵｏｘ−ｐＡ）（図３ａ）。
【００３７】
構成的ｍＵＴＳ発現およびＰＵＲＥＸ８推進性ｓｍＵｏｘ発現のために操作されたＨｅＬａＵＲＡＴ１を１２０時間培養する間にＵＲＥＸコントロール性尿酸代謝の動態をプロファイリングする（図３ｂ）。構成的ｓｍＵｏｘ発現のために遺伝子導入された同質遺伝子ＨｅＬａＵＲＡＴ１対照細胞（ｍＵＴＳの共発現なし）は、培地から尿酸を浄化するが、ＵＲＥＸ−ｓｍＵｏｘコントロール合成回路を内部に有する細胞培養物の尿酸レベルは、０．１mM（生理学的な状況で酸化ストレス防御を提供することが公知の濃度）で横ばいになり、これは、尿酸レベルが、ＵＲＥＸコントロールを誘導してさらなる尿酸酸化をトリガーすることがもはやできない閾値濃度未満に下落したことを示している。これらのデータは、ＵＲＥＸ−ｓｍＵｏｘによる尿酸レベルの自己充足的フィードバックコントロールを確認するものであり、この合成回路が病的尿酸レベルを自動コントロール的に酸化ストレス防御範囲内まで減少させることを示している。
【００３８】
アロプリノールの不在下でヒト様尿酸腎症および痛風性関節炎症状を伴う高尿酸血症を発症しているｕｏｘ−／−マウスが、ＵＲＥＸにコントロールされてｓｍＵｏｘを発現している細胞埋込み物で処置された場合、血清および尿中のそれらの尿酸レベルは、標準的なアロプリノール療法によって達成された濃度まで降下し、一方で対照動物（ＨｅＬａＵＲＡＴ１細胞埋込み物、アロプリノールなし）は、尿酸を蓄積し、急性痛風性関節炎症状を発症する（図３ｃ、ｄ）。すべての処置群からのヘマトキシリン／エオシン染色腎切片の組織分析から、ＵＲＥＸ−ｓｍＵｏｘベースの治療用細胞埋込み物が近位尿細管中の結晶状の腎尿酸沈着物を減少させ、腎症の組織状態をほぼ完全に反転させることが確認される（図３ｅ〜ｇ）。
【００３９】
痛風性関節炎は、最も痛みのあるリウマチ疾患である。尿酸オキシダーゼ欠乏のせいで、ヒトの血中尿酸レベルは、他の哺乳動物の最大５０倍であり、このことが高尿酸血症疾患を発症するリスクを増大させる。尿酸が、ガン、パーキンソン病および多発性硬化症の発生を防止するために重要な不可欠なフリーラジカルスカベンジャーであり、酸化ストレス保護因子であるという事実は、尿酸結晶性沈着物の形成を防止する一方で十分な酸化ストレス防御を提供するように尿酸レベルを正確に調整する必要があるという理由で、痛風性関節炎の処置を特に困難にしている。尿酸媒介疾患を処置するための、臨床的に使用されている二つの主要な治療戦略がある：（ｉ）プリン代謝を遮断して内因性尿酸生成を防止するアロプリノールのようなキサンチンオキシダーゼ阻害剤の投与、または（ｉｉ）血流からの尿酸クリアランスを促進するリコンビナントAspergillus flavusウリカーゼ（例えばRasburicase（登録商標））の静脈内注射。Rasburicase（登録商標）は、主にハイリスクなガン患者における腫瘍溶解症候群を予防するために使用されるが、４０年よりも長く販売されているアロプリノールは、重大な副作用を有し、痛風の急性発作の間に服用することができず、高尿酸血症誘導腎症が進行状態に達した場合に中止しなければならない。別のキサンチンオキシダーゼ阻害剤であるフェブキソスタット（Uloric（登録商標））は、慢性高尿酸血症の処置のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって最近認可された。
【００４０】
ヒト尿酸トランスポーターと、操作されたD. radiodurans由来哺乳動物尿酸センサーおよびセンサーによってコントロールされ分泌操作されたA. flavus尿酸オキシダーゼとの機能的接続によって、マウスにおける尿酸レベルの自己充足的自動コントロールを提供する合成回路を設計する。このネットワークの独特な尿酸自動レベルコントロールの動態は、（ｉ）血中尿酸レベルの継続モニタリング、（ｉｉ）病的尿酸レベルでのコアセンサーユニットの自動誘導、（ｉｉｉ）臨床的に認可された尿酸オキシダーゼのセンサーコントロールされた発現による尿酸の迅速な減少、および（ｉｖ）酸化ストレス防御に必要な生理学的尿酸基礎レベルに達したときの自然シャットダウンを可能にする。ヒト痛風性関節炎のマウスモデルにおける尿酸レベルのＵＲＥＸベースのコントロールは、合成回路が予想通りに、そして最も重要なことには臨床的に関連する濃度範囲内で作動することを示す。ヒトにおいて、尿酸一ナトリウム結晶に起因する痛い炎症は、６．８mg/dlよりも大きい血中尿酸レベルで生じる（Terkeltaub, R., Bushinsky, D.A. & Becker, M.A., Arthritis Res. Ther. 8, S4 (2006)）。ＵＲＥＸセンサーは、この種の病的レベルを捕捉し、分泌型ウリカーゼの用量依存性発現をトリガーすることができ、結果的にそのことは、処置された動物の血流中の尿酸を約８０％、５mg/dlまで減少させる。６mg/dlよりも少ない循環レベルで、尿酸塩結晶沈着物は溶解することが知られ、患者は痛風性関節炎の臨床徴候を全く有さない。したがって、血流中の尿酸レベルを自己充足的に自動レベルコントロールするための、ＵＲＥＸベースのネットワークを内部に有する細胞埋込み物は、高尿酸血症性疾患における定期的小分子投与の代替となる予防戦略または治療的介入を意味する。
【００４１】
実験の部
ベクターの構築
全てのプラスミドおよびオリゴヌクレオチドの設計の詳細を表１に提供する。
【００４２】
【表１】
【００４３】
オリゴヌクレオチド配列中の制限エンドヌクレアーゼ特異的部位に下線を引く。オリゴヌクレオチド配列に含まれる、アニーリングする塩基対を大文字で示す。
【００４４】
略語：ＥＴ４、マクロライド依存性トランスサイレンサー；ＥＴＲ８、ＭｐｈＲ（Ａ）に特異的な八量体のオペレーターモジュール；ｈｕｃＯ、ＨｕｃＲ特異的オペレーター；ｈｕｃＯ８、ＨｕｃＲに特異的な八量体のオペレーターモジュール；ＫＲＡＢ、クルッペル関連ボックスタンパク質；ｍＨｕｃＲ、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されたDeinococcus radiodurans尿酸依存性リプレッサー；ＭｐｈＲ（Ａ）、Escherichia coliマクロライド依存性リプレッサー；ｍＵｏｘ、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された、Aspergillus flavus由来の尿酸オキシダーゼ細胞内変異体;ｐＡ、ＳＶ４０由来後期ポリアデニル化部位；ＰｈＣＭＶ、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター；ＰｈＥＦ１α、ヒト伸長因子１αプロモーター；ＰＳＶ４０、サルウイルス４０プロモーター；ＰＵＲＥＸ８、ｈｕｃＯ８を含有する尿酸誘導性プロモーター（ＰＳＶ４０−ｈｕｃＯ８）；ＳＥＡＰ、分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ；ＳＳＩｇｋ、マウスＩｇκ鎖Ｖ−１２−Ｃ領域由来分泌シグナル；ｓｍＵｏｘ、哺乳動物細胞による分泌のために操作されたｍＵｏｘ；ＵＲＡＴ１、ヒト有機陰イオン／尿酸トランスポーターＳＬＣ２２Ａ１２（溶質担体ファミリー２２メンバー１２）。
【００４５】
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト子宮頚部腺ガン細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ−２９３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）およびヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１２１）を、１０％（v/v）ウシ胎児血清（ＦＣＳ、PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Germany, Cat. No. 3302, Lot No. P251110）および１％（v/v）ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｐ／Ｓ、PAN Biotech GmbH, Cat. No. P06-07100）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Invitrogen, Basel, Switzerland, Cat. No. 52100-39）中で培養する。全種類の細胞を、５％ ＣＯ２を含有する３７℃の加湿雰囲気中で培養する。標準的なＣａＰＯ４ベースのプロトコールを用いてＨＥＫ−２９３をトランスフェクションする（Weber, W. et al., Nucleic Acids Res. 31, e71 (2003)）。ＨｅＬａも、この標準的なＣａＰＯ４ベースのプロトコールに従ってトランスフェクションしたが、但し、ＤＮＡの沈殿を細胞と共に１２時間インキュベーションしてから培地を交換する。供給業者の手順に従ってＨＴ−１０８０にＦｕＧＥＮＥ６（Roche Diagnostics AG, Basel, Switzerland, Cat. No. 11814443001）をトランスフェクションする。トランスフェクションされた細胞を、１０％（v/v）ノックアウト代用血清（ＫＯＳＲ、Invitrogen, Basel, Switzerland, Cat. No. 10828-028）、１％ Ｐ／Ｓおよび場合により尿酸（Acros Organics, Geel, Belgium, Cat. No. 171290250）を補充したＤＭＥＭ（標準培地）中で培養する。尿酸依存性用量反応特性を確立するために、６ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark）のウェル１個あたり３×１０５個の細胞を蒔き、上記のようにトランスフェクションする。細胞をトリプシン処理し（２００μlトリプシン［PAN Biotech GmbH, Cat. No. P10-023500］、５分間、３７℃）、遠心分離によって収集し（２分間、１２０×ｇ）、１．５mlの標準培地中に再懸濁する。この細胞懸濁液１００μlを、異なる濃度の尿酸を補充した９６ウェルプレートの個別のウェルに移植し、４８時間培養してから、培養上清中のレポーター遺伝子発現をプロファイリングする。
【００４６】
安定なトランスジェニック細胞系の構築
ヒト腎臓尿酸陰イオン交換体（ＵＲＡＴ１）の構成的発現のために遺伝子導入されたＨｅＬａ由来ＨｅＬａＵＲＡＴ１細胞は、ｐＵＲＡＴ１（ＰｈＣＭＶ−ＵＲＡＴ１−ｐＡ；ImaGenes, Berlin, Germany, IMAGE ID: 5183650）およびｐＺｅｏＳＶ２（ゼオシン耐性を付与；［InvivoGEN, San Diego, USA, Cat. No. ant-zn-5］）を１０：１の比で共トランスフェクション（３μgの総ＤＮＡ）することによって構築する。２００μg/ml（w/v）ゼオシンを使用した１４日の選択期間後に、細胞のクローンをエクスパンションさせ、個別のクローンを、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＵＲＡＴ１の発現についてプロファイリングする。さらなる実験のために細胞系ＨｅＬａＵＲＡＴ１を選択する。尿酸によって誘導されうるＳＥＡＰの発現を容易にする、ＨＥＫ−２９３由来のトリプルトランスジェニックＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５細胞系は、（ｉ）ｐＣＫ９（ＰＵＲＥＸ８−ＳＥＡＰ−ｐＡ）およびｐＣＫ２５（ＰｈＥＦ１α−ＫＲＡＢ−ｍＨｕｃＲ−ｐＡ、ブラストサイジン耐性を付与する構成的発現カセットも有する）（１：１の比、１０％ ＦＣＳおよび２０μg/ml（w/v）ブラストサイジン［InvivoGen, San Diego, USA, Cat. No. ant-bl-1］を含有するＤＭＥＭ中で１４日間の選択）ならびに（ｉｉ）ｐＵＲＡＴ１（ＰｈＣＭＶ−ＵＲＡＴ１−ｐＡ）およびｐＺｅｏＳＶ２（ゼオシン耐性を付与）（１０：１の比［（３μgの総ＤＮＡ］、１０％ ＦＣＳ、２０μg/ml（w/v）ブラストサイジンおよび２００μg/ml（w/v）ゼオシン（InvivoGen, San Diego, CA, USA, Cat. No. ant-zn-5）を含有するＤＭＥＭ中で１４日間選択）の連続共トランスフェクションおよびクローン選択によって構築する。個別のＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸクローンをランダムに釣り上げ、尿酸でトリガーされたＳＥＡＰの発現について評価する。さらなる研究のためにＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５を選択する。
【００４７】
分析アッセイ
標準的なｐ−ニトロフェニルホスフェートベースの光吸収の経時変化を利用して、細胞培養上清およびマウス血清中のＳＥＡＰレベルを定量する（Berger, J., Hauber, J., Hauber, R., Geiger, R. & Cullen, B.R., Gene 66, 1-10 (1988)）。Amplex（登録商標）Red尿酸／ウリカーゼアッセイキット（Invitrogen, Basel, Switzerland, Cat. No. A22181）を製造業者のプロトコールに従って使用して、細胞培養上清、マウス血清または尿中の尿酸レベルを評価する。尿酸含有試料を反応緩衝液で希釈する。ウリカーゼの添加は、尿酸からアラントイン、ＣＯ２およびＨ２Ｏ２への酵素変換をトリガーし、Ｈ２Ｏ２は、ホースラディッシュペルオキシダーゼの存在下でAmplex Red試薬と化学量論的に反応し、赤色蛍光酸化産物であるレゾルフィンを発生し、レゾルフィンは５８５nmで定量することができる。
【００４８】
in vivo方法
ヒト様痛風性関節炎症状を有する高尿酸血症を発症している尿酸オキシダーゼ欠損マウス（ｕｏｘ−／−）（Wu, X. et al.、上記引用文中）を使用して、ＵＲＥＸベースの尿酸コントロールの合成ネットワークをin vivo検証する（Charles River Laboratories, France、マウス株：ＪＡＫＳ２２２３）。ｕｏｘ−／−マウスは生後４週齢以内に死亡することから、繁殖および長期維持は、飲料水への１５０μg/mL（w/v）アロプリノール（Sigma, Cat. No. A8003）の添加を必要とする。ＵＲＥＸトランスジェニック細胞の埋込みの２週間前に、尿酸オキシダーゼ欠損マウスのアロプリノール処置を継続または中止して、血流中にそれぞれ低尿酸レベルまたは病的な高尿酸レベルを有する動物群を作出する。構成的ＵＲＡＴ１発現のために遺伝子導入されたＨｅＬａＵＲＡＴ１に、ｐＣＫ２５（ＰｈＥＦ１α−ｍＵＴＳ−ｐＡ）と、ｐＣＫ９（ＰＵＲＥＸ８−ＳＥＡＰ−ｐＡ）、ｐＳＥＡＰ２対照（ＰＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ｐＡ）またはｐＣＫ６５（ＰＵＲＥＸ８−ｓｍＵｏｘ−ｐＡ）のいずれかとを一過性共トランスフェクションし、次に、製造業者のプロトコールに従って、以下の設定を適用してInotech Encapsulator Research IE 50R（EncapBioSystems Inc., Greifensee, Switzerland）を使用して２００μmアルギン酸−（ポリ−Ｌ−リシン）−アルギン酸カプセルにマイクロ封入する（２００個の細胞／カプセル）：２００μm単一ノズル、撹拌子スピードコントロールを５ユニットに設定、２０mlシリンジで流速４１０ユニット、ノズル振動周波数１０２４Hz、カプセル分散のための電圧９００Ｖ。２×１０６個の封入細胞を含有する７００μl ＰＢＳ（１０４個のカプセル／マウス）を尿酸オキシダーゼ欠損マウスに腹腔内注射する。対照マウスに、マイクロ封入された親ＨｅＬａＵＲＡＴ１を埋め込む。埋込みの４８時間後にマウスを清潔なケージに移動させ、各処置群の尿を２４時間採取する。埋込みの７２時間後にマウスを屠殺し、それらの血液を収集し、製造業者のプロトコールに従って血清をマイクロテイナーＳＳＴチューブ（Beckton Dickinson, Plymouth, UK）中に単離する。動物を必要とする全ての実験は、欧州共同体の理事会指令（８６／６０９／ＥＥＣ）に従って行う。
【００４９】
組織検査
構成的ＵＲＡＴ１発現およびＵＲＥＸコントロール性ｓｍＵｏｘ発現のために遺伝子導入された細胞をマイクロ封入したものを埋め込まれたｕｏｘ−／−マウスの腎臓中の尿酸沈着物を顕微鏡分析するために、処置された動物を、上記飲料水から１５０μg/mL（w/v）アロプリノールを摂取している処置群およびアロプリノールを摂取していない処置群に分ける。埋込みの７日後に、マウスを屠殺し、その腎臓をＰＢＳに溶かした４％（w/v）パラホルムアルデヒド（Sigma, Cat. No. P6148）中に外植し４時間固定する。その腎臓を、ＰＢＳに溶かした１０％（w/v）スクロース（Sigma, Cat. No. S1888）中で９０分間洗浄し、トリミングし、脱水し、パラフィン包埋する。Ultracut装置（Zeiss, Feldbach, Switzerland）を使用して製造した３μm組織切片をゼラチン化マイクロスライドに移し、３７℃で一晩風乾する。キシレン中に浸すことによってパラフィンを除去した後に（３×１０min)、段々低いエタノール濃度（９０％、８０％、７０％）中で連続的にインキュベーション（１０分間）することによって組織を再水和させ、ＴＢＳ（トリス緩衝食塩水；５０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１００mM塩化ナトリウム）中で２回すすぎ、ヘマトキシリン／エオシン溶液で染色する。偏光下で試料を可視化し、Leica DMRBE顕微鏡を用いて異方性を評価する。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、尿酸に応答して遺伝子発現をスイッチオンまたはスイッチオフするために有用なシステムにおけるベクターおよび哺乳動物細胞に関する。
【０００２】
発明の背景
尿酸ホメオスタシスはヒトに不可欠であるが、それは、この代謝物がガン、パーキンソン病および多発性硬化症の発生を減少させる重要なラジカルスカベンジャーおよび酸化ストレス保護剤であるからである。しかしながらヒトは、進化の途中に尿酸オキシダーゼが欠如したせいで高尿酸血症の素因を有し、高尿酸血症は、腎症、腫瘍溶解症候群および痛風に関連する尿酸塩結晶沈着物の形成に有利に働く。
【０００３】
痛風は、先進工業国の人口の１％超を冒す最も一般的な炎症性関節炎であり、その有病率は、増え続ける糖質消費が肥満および過インスリン症（それはプリン代謝の最終産物である尿酸の腎クリアランスを低下させる）を促進するので、世界的に上昇傾向にある。尿酸をさらに可溶性のアラントインに変換する尿酸オキシダーゼの進化上の欠如が原因で、血中尿酸レベルはヒトにおいて特に高く、そのことは、酸化ストレス耐性を向上させ、どんどん複雑になる神経回路網への酸化的損傷を防止したことによって、ヒト科の脳進化に不可欠であった可能性がある。腎臓中の尿酸トランスポーターが血流中の尿酸レベルをレギュレーションするので、高い生理学的尿酸レベルは、典型的にはヒトによる忍容性が良好である。しかしながら、尿酸ホメオスタシスの不均衡は、高尿酸血症ならびに関節、腎臓および皮下組織における尿酸一ナトリウムの病的結晶沈着物の形成へと導く可能性があり、それが高血圧、心血管疾患、尿酸腎結石症および痛風などの尿酸関連病態をトリガーする。
【０００４】
地球上で最も放射線耐性の生物であるDeinococcus radiodurans R1は、紫外線および酸化ストレスを含めた、他の起源のＤＮＡ損傷に耐える驚くべき能力も進化させている（Daly, M.J., Nat. Rev. Microbiol. 7, 237-245 (2009)）。近年、仮説上ウリカーゼレギュレーター（ＨｕｃＲ）がD. radioduransから同定されたが、それは、酸化ストレスに対する細胞応答に重大な役割を果たすことが示唆された。D. radioduransは、哺乳動物に類似して、尿酸のラジカルスカベンジング活性を利用すると思われるが、それでも結晶化を阻止するためにそのレベルをコントロールする必要がある。ＨｕｃＲは、異なる方向で転写されるｈｕｃＲと推定上ウリカーゼとの遺伝子間領域における二分子対称（dyad-symmetrical）オペレーター部位（ｈｕｃＯ）に結合することが示され、それは、過剰な尿酸レベルがｈｕｃＯからＨｕｃＲの解離をトリガーし、ウリカーゼの発現を誘導するものの、両遺伝子が、デフォルトではＨｕｃＲによって共抑制されることを示唆している（Wilkinson, S.P. & Grove, A., J. Biol. Chem. 279, 51442-51450 (2004); J. Mol. Biol. 350, 617-630 (2005)）。
【０００５】
発明の概要
本発明は、有害な過剰の尿酸の検出および／または分解に有用な哺乳動物細胞であって、以下を含む細胞に関する。
（ａ）トランス活性化ドメインまたはトランスリプレッサードメインに融合した細菌性尿酸センサー−レギュレーターのための遺伝暗号を含むベクター；および
（ｂ）該細菌性尿酸センサー−レギュレーターと特異的に結合するオペレーター配列、プロモーター、および内因性または外因性タンパク質、例えば尿酸と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【０００６】
同様に本発明は、トランス活性化ドメインまたはトランスリプレッサードメインに融合した細菌性尿酸センサー−レギュレーターのための遺伝暗号を含むベクターそのもの、ならびに該細菌性尿酸センサー−レギュレーターと特異的に結合するオペレーター配列、プロモーター、および内因性または外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターそのものに関する。
【０００７】
特に本発明は、細菌性尿酸センサー−レギュレーターが、Deinococcus radiodurans R1由来ウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲであって、オペレーター配列がDeinococcus radiodurans R1由来の対応するオペレーター配列ｈｕｃＯである、その種の哺乳動物細胞およびその種のベクターに関する。
【０００８】
さらに本発明は、ナノコンテナまたはマイクロコンテナ中の前記哺乳動物細胞、ヒト以外の哺乳動物（場合によりナノコンテナまたはマイクロコンテナ中にその種の哺乳動物細胞を含む）、およびそのような哺乳動物細胞を使用して、尿酸の過剰または欠如によって起こる疾患を処置する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】尿酸応答性哺乳動物センサーの合成回路を示す図である。（ａ）尿酸応答性導入遺伝子発現（ＵＲＥＸ）のための発現ベクター（略語については表１参照）。（ｂ）作動中のＵＲＥＸを示す図。尿酸の不在下（−ＵＡ）でｍＵＴＳ（ＫＲＡＢ−ＨｕｃＲ）はｈｕｃＯ８に結合し、ＳＥＡＰ生成を抑制する。尿酸の存在下（＋ＵＡ）で、ｍＵＴＳはｈｕｃＯ８から解離し、ＰＵＲＥＸ８が抑制解除され、ＰＳＶ４０駆動性ＳＥＡＰ発現が生じる。（ｃ）異なるヒト細胞系におけるＰＵＲＥＸ８のｍＵＴＳ介在性抑制。ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３およびＨＴ−１０８０にｐＣＫ９（ＰＵＲＥＸ８−ＳＥＡＰ−ｐＡ）およびｐＣＫ２５（ＰｈＥＦ１α−ｍＵＴＳ−ｐＡ）を共トランスフェクションし、４８時間培養してからＳＥＡＰの発現を定量した。（ｄ）ＵＲＥＸセンサー回路の機能的評価。４×１０４個のＨｅＬａ細胞にＵＲＥＸ発現ベクターｐＣＫ９およびｐＣＫ２５を共トランスフェクションし（図１ａ参照）、５mM尿酸の存在下または不在下で４８時間培養してから、細胞培養上清中のＳＥＡＰを定量した。（ｅ〜ｇ）ヒト尿酸トランスポーターＵＲＡＴ１の存在下および不在下におけるＵＲＥＸの尿酸依存性用量反応特性を示す図である。３×１０５個のＨｅＬａ（ｅ）、ＨＥＫ−２９３（ｆ）またはＨＴ−１０８０細胞（ｇ）にＵＲＥＸセンサープラスミドｐＣＫ９およびｐＣＫ２５と（図１ａ参照）、ｐＵＲＡＴ１（ＰｈＣＭＶ−ＵＲＡＴ１−ｐＡ）または同質遺伝子対照ベクターｐｃＤＮＡ３．１のいずれかとを共トランスフェクションした。異なる濃度の尿酸を補充した培地中で、トランスフェクション後の集団を培養し、結果として得られたＳＥＡＰレベルを４８時間後にプロファイリングした。（Ｓ）ＳＥＡＰ生成；（Ｕ）尿酸濃度；（ｍＵＴＳ）哺乳動物尿酸トランスサイレンサー。
【図２】尿酸オキシダーゼ欠損マウスおよびトランスジェニックＨＥＫ−２９３における、ＵＲＥＸコントロール性ＳＥＡＰ発現の検証を示す図である。（ａ）ＵＲＥＸコントロール性ＳＥＡＰ発現のために操作されたＨｅＬａＵＲＡＴ１細胞を密着性アルギン酸−ポリＬ−リシン−アルギン酸マイクロカプセルにマイクロ封入し、（ｉ）病的尿酸レベルを示す未処置ｕｏｘ−／−マウスまたは（ｉｉ）尿酸レベルを低下させるために飲料水から１５０μg/mL（w/v）の高尿酸血症治療薬アロプリノールを摂取したｕｏｘ−／−マウスに腹腔内注射した（２×１０６個細胞／マウス、２００個細胞／カプセル）（ＵＲＥＸ）。対照埋込み物は、ＳＥＡＰの構成的発現のために遺伝子導入された細胞を含有した（対照）。細胞移植の７２時間後に、動物の血清中のＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。（ｂ）ＵＲＥＸコントロール性ＳＥＡＰ発現およびＵＲＡＴ１構成的発現ために安定的に操作されたトリプルトランスジェニックＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５細胞系の尿酸ベースの用量反応プロファイル。５×１０４個のＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５を異なる濃度の尿酸の存在下で培養し、７２時間後に培養上清中のＳＥＡＰレベルを定量した。（ｃ）ＵＲＥＸベースの尿酸センサー回路の可逆性。７２時間毎（矢印）に尿酸濃度を０から５mMに交互に変化させながら、２×１０５個のＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５細胞を１０日間培養した。（Ｃ）対照；（Ｓ）ＳＥＡＰ生成；（Ｕ）尿酸濃度；（＋Ａ）＋アロプリノール（低尿酸）；（−Ａ）−アロプリノール（高尿酸）；（ｔ）時間。
【図３】哺乳動物のAsperguillus flavus由来の操作された尿酸オキシダーゼの機能的特徴付けを示す図である。（ａ）細胞内尿酸オキシダーゼ変異体（ｍＵｏｘ）または分泌操作された尿酸オキシダーゼ変異体（ｓｍＵｏｘ）の構成的発現またはＵＲＥＸコントロール性発現によって仲介される尿酸減少のプロファイリング。２×１０５個のＨｅＬａＵＲＡＴ１細胞に、（ｉ）ｐＣＫ６５（ＰＵＲＥＸ８−ｓｍＵｏｘ−ｐＡ）および同質遺伝子対照ベクターｐｃＤＮＡ３．１、（ｉｉ）ｐＣＫ６５（ＰＵＲＥＸ８−ｓｍＵｏｘ−ｐＡ）およびｐＣＫ２５（ＰｈＥＦ１α−ｍＵＴＳ−ｐＡ）、（ｉｉｉ）ｐＣＫ６７（ＰＵＲＥＸ８−ｍＵｏｘ−ｐＡ）およびｐｃＤＮＡ３．１、または（ｉｖ）ｐＣＫ６７（ＰＵＲＥＸ８−ｍＵｏｘ−ｐＡ）およびｐＣＫ２５（ＰｈＥＦ１α−ｍＵＴＳ−ｐＡ）のいずれかを共トランスフェクションした。細胞を０．５mM尿酸と共に７２時間培養してから、培養上清中の尿酸レベルを決定した。（ｂ）尿酸分解はＵＲＥＸコントロール性ｓｍＵｏｘ発現をプロファイリングする。構成的ｓｍＵｏｘ発現（点線）またはＵＲＥＸコントロール性ｓｍＵｏｘ発現（破線）のために操作された２×１０５個のＨｅＬａＵＲＡＴ１細胞（実線）を、出発尿酸濃度０．５mMを含有する培地中で培養し、尿酸減少動態を１２０時間プロファイリングした。（ｃ，ｄ）マウスにおける病的尿酸レベルのＵＲＥＸコントロール性ｓｍＵｏｘ介在性減少。ＵＲＥＸコントロール性ｓｍＵｏｘ発現のために操作されたＨｅＬａＵＲＡＴ１細胞をマイクロ封入したものを、病的尿酸レベルを示す未処置ｕｏｘ−／−マウスまたは飲料水から１５０μg/mL（w/v）の高尿酸血症治療薬アロプリノールを摂取したｕｏｘ−／−マウスに腹腔内埋込みした（マウス１匹あたり２×１０６個細胞）（ＵＲＥＸ−ｓｍＵｏｘ）。対照埋込み物は、親ＨｅＬａＵＲＡＴ１を含有した（対照）。細胞埋込みから７２時間後の動物の血清（ｃ）および尿（２４時間採集）（ｄ）中の尿酸レベルをプロファイリングした。（ｅ〜ｇ）（ｅ）１５０μg/mL（w/v）アロプリノールを摂取したｕｏｘ−／−マウス（陽性対照）、（ｆ）ｕｏｘ−／−マウス（陰性対照）および（ｇ）ＵＲＥＸコントロール性ｓｍＵｏｘ発現のために操作されたＨｅＬａＵＲＡＴ１を埋め込まれたｕｏｘ−／−マウスの腎臓中の尿酸一ナトリウムの異方性結晶沈着物（矢印）を示す組織切片。（Ｃ）対照；（Ｕ）尿酸濃度；（ＳＵ）血清中尿酸；（ＵＵ）尿中尿酸；（＋Ａ）＋アロプリノール（低尿酸）；（−Ａ）−アロプリノール（高尿酸）；（ｔ）時間。スケールバーは１００μM。
【００１０】
発明の詳細な説明
本明細書において記載される「ＵＲＥＸ」システムは、尿酸ホメオスタシスを自己充足的に自動コントロールするためのバイオセンサーである。このシステムは、尿酸の検出および尿酸に応答するための全般的バイオセンサーとしてin vitroおよびin vivoで適用することができる。ＵＲＥＸシステムは、哺乳動物細胞中の尿酸に応答して、遺伝子発現の（ｉ）スイッチオンまたは（ｉｉ）スイッチオフのいずれかを行うために使用することができる。
【００１１】
尿酸は、式
【００１２】
【化１】
【００１３】
で示される７，９−ジヒドロ−３Ｈ−プリン−２，６，８−トリオンであり、いくつかの互変異性型で存在する。本明細書に使用されるような尿酸には、尿酸の全ての互変異性型および「尿酸塩」と呼ばれるそれらの塩が含まれる。塩は、例えば尿酸一ナトリウムまたは尿酸一カリウムまたは尿酸二カリウムである。
【００１４】
本発明は、有害な過剰の尿酸の検出および／または分解に有用な哺乳動物細胞であって、以下：
（ａ）トランス活性化ドメインまたはトランスリプレッサードメインに融合した細菌性尿酸センサー−レギュレーターのための遺伝暗号を含むベクター；および
（ｂ）該細菌性尿酸センサー−レギュレーターと特異的に結合するオペレーター配列、プロモーター、および内因性または外因性タンパク質、例えば尿酸と相互作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター
を含む細胞に関する。
【００１５】
同様に本発明は、トランス活性化ドメインまたはトランスリプレッサードメインに融合した細菌性尿酸センサー−レギュレーターのための遺伝暗号を含むベクターそのもの、ならびに該細菌性尿酸センサー−レギュレーターに特異的に結合するオペレーター配列、プロモーター、および内因性または外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターそのものに関する。
【００１６】
細菌性尿酸センサー−レギュレーターは、本発明の目的のために、DeinococcaceaeまたはPseudomonadaceaeによって生成されるＨｕｃＲタンパク質などの天然尿酸センサー−レギュレーターに由来または関係する。細菌性尿酸センサー−レギュレーターは、例えば、Deinococcus radiodurans R1由来転写レギュレーターＨｕｃＲ（ＤＲ＿１１５９）、Deinococcus geothermalis DSM 11300由来ＭａｒＲ型転写レギュレーターＤｇｅｏ＿２５３１、Pseudomonas mendocina ypm由来ＭａｒＲ型転写レギュレーター、Deinococcus deserti VCD115由来ＭａｒＲ型転写レギュレーターＤｅｉｄｅ＿３ｐ００２８０、およびこれら前記の天然センサー−レギュレーター由来のセンサー−レギュレーターである。この文脈で、DeinococcaceaeまたはPseudomonadaceaeによって生成されるＨｕｃＲタンパク質のような天然尿酸センサー−レギュレーター「由来の」は、アミノ酸配列が天然センサー−レギュレーターと同一であるか、または保存的アミノ置換のみを有し、アミノ酸レベルで少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％同一を維持することを意味する。本発明の目的のために、DeinococcaceaeまたはPseudomonadaceaeによって生成されるＨｕｃＲタンパク質などの天然尿酸センサー−レギュレーターに「関係する」は、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列が、少なくとも低ストリンジェンシー条件で、さらに好ましくは中ストリンジェンシー条件で、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件で天然尿酸センサー−レギュレーターにハイブリダイゼーションし、天然尿酸センサー−レギュレーター認識配列に結合することを意味する。保存的置換は、当技術分野において公知であり、とりわけDayhof, M.D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. 5, Sup. 3に記載されている。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般に４群に分類される：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、また、合同で芳香族アミノ酸として分類される。特定群の一つのアミノ酸を同じ群の別のアミノ酸に置換することは、一般に保存的置換と見なされる。本発明の目的のために、「由来する」および「関係する」には、同じアミノ酸をコードするが、目的のホスト細胞、例えば哺乳動物細胞に特に適合されたトリプレットコドンを含む、ポリヌクレオチドレベルでの化合物も含まれることが了解されている。特に哺乳動物細胞に適合されたこの種のポリヌクレオチドが、特に好ましい。
【００１７】
該細菌性尿酸センサー−レギュレーターに特異的に結合する対応するオペレーター配列は、ＨｕｃＲによって認識されるタンデムリピート含有オペレーター部位ｈｕｃＯである。考慮される他のオペレーター配列は、DeinococcaceaeまたはPseudomonadaceaeによって生成される前記センサー−レギュレーターに特異的に結合するこれらのオペレーター配列、および前記オペレーター配列に「由来」および「関係」するオペレーター配列である。本発明の目的のために、「由来する」は、センサー−レギュレーターとの目的の相互作用を減らさずに、一つまたは複数のヌクレオチド、特に１、２、３、４または５個などの１〜１２個のヌクレオチドを他のヌクレオチドに置換することができることであると了解されている。本発明による、「関係する」オペレーター配列は、少なくとも低ストリンジェンシー条件で、より好ましくは中ストリンジェンシー条件で、最も好ましくは高ストリンジェンシー条件で天然オペレーター配列とハイブリダイズし、天然尿酸センサー−レギュレーターに結合する。考慮される特定のオペレーター配列は、例えば２から１００の間の、特に５から２０の間のリピートを含む、天然オペレーター配列またはそれら由来の配列のタンデムリピートである。
【００１８】
トランス活性化ドメインは、例えば、単純ヘルペスウイルスのｖｐ１６トランス活性化ドメイン、ｐ６５トランス活性化ドメイン、ヒトｅ２ｆ４トランス活性化ドメイン、ならびにＧＡＬ４、ＣＴＦ／ＮＦ１、ＡＰ２、ＩＴＦ１、Ｏｃｔ１およびＳｐＩに由来または関係するトランス活性化ドメイン、ならびにまた、米国特許第６，２８７，８１３号に挙げられたものである。
【００１９】
トランスリプレッサードメインは、例えばヒト−クルッペル関連ボックスタンパク質のｋｒａｂトランス抑制ドメインである。考慮される他のトランスリプレッサードメインは、例えばｖ−ｅｒｂＡガン遺伝子産物、甲状腺ホルモンレセプター、Ｓｓｎ６／Ｔｕｐ１タンパク質複合体、ＳＩＲＩタンパク質、ＮｅＰ１、ＴＳＦ３、ＳＦ１、ＷＴ１、Ｏｃｔ−２．１、Ｅ４ＢＰ４、ＺＦ５、ＰｈＤブロモドメインを含有する任意の転写レギュレーター、およびまた、米国特許第６，２８７，８１３号に挙げられたものに由来または関係するドメインである。
【００２０】
考慮されるプロモーターは、例えば、構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）、ヒトサイトメガロウイルス最小最初期プロモーター（ＰｈＣＭＶｍｉｎ）、構成的ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＰｈＣＭＶ）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＰｈＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＰＧＫ）、ヒト−ユビキチンプロモーター（ＰｈＵＢＣ）およびβアクチンプロモーターである。
【００２１】
本発明のベクターおよび哺乳動物細胞の文脈で考慮される内因性または外因性タンパク質は、例えば、尿酸を代謝するタンパク質、例えば尿酸およびその塩をアラントインに変換するウリカーゼ（尿酸オキシダーゼ）、または尿酸およびその塩を輸送するタンパク質、例えば哺乳動物尿酸トランスポータータンパク質、特にヒト尿酸トランスポータータンパク質１（ＵＲＡＴ１）、または尿酸の定量を可能にする、容易に検出可能なタンパク質などの、尿酸と相互作用するタンパク質である。
【００２２】
容易に検出可能なタンパク質は、例えば分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、蛍光タンパク質または強化蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰなど）、分泌型α−アミラーゼ（ＳＡＭＹ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、およびグルクロニダーゼである。
【００２３】
特に本発明は、細菌性尿酸センサー−レギュレーターがDeinococcus radiodurans R1由来のウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲであって、オペレーター配列がDeinococcus radiodurans R1由来の対応するオペレーター配列ｈｕｃＯである、この種の哺乳動物細胞およびこの種のベクターに関する。
【００２４】
例えば尿酸と相互作用するタンパク質が、Fasturec（登録商標）の商品名で販売されている治療応用可能なAspergillus flavus由来ラスブリカーゼなどの尿酸オキシダーゼ(「ウリカーゼ」)である場合、本明細書下記の対応する特定の哺乳動物細胞は、尿酸オキシダーゼ欠損マウス（痛風性関節炎および腫瘍溶解症候群のようなヒト高尿酸血症疾患のための承認された疾患モデルを意味する）において、病的尿酸レベルに応答し、非病的で酸化ストレス防御性の尿酸レベルでは導入遺伝子の発現をスイッチオフする遺伝子自動レベルコントロールシステムを意味する。
【００２５】
全身の尿酸は、強力なラジカルスカベンジャーであって、ラジカルの解毒によって身体を酸化ストレスから防御する。尿酸塩は、高く上昇したレベルの場合にだけ関節、腎臓および皮下組織中で結晶化し、痛みのある炎症ならびに高尿酸血症、腎結石および痛風性関節炎のような疾患を引き起こす。対照的に、尿酸オキシダーゼの構成的発現によって身体から尿酸を完全に除去すると、ラジカルベースの細胞および組織損傷、特に神経細胞の損傷の増加が生じるおそれがある。これは、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性疾患についての尿酸の防御性によっても示される。したがって、代謝物を病的レベルよりも下に維持することは、新規な遺伝子治療応用に向けた重要なステップである。
【００２６】
本明細書下記の特定の哺乳動物尿酸ホメオスタシスの合成コントロールネットワークは、用量依存性の尿酸オキシダーゼベースの治療応答を招く。ヒトに似た症状の高尿酸血症を発症している尿酸オキシダーゼ欠損マウスにおいて、デザイナー回路は、血中尿酸濃度を病的レベルよりも下の安定レベルに低下させ、処置された動物の腎臓中の尿酸塩結晶沈着物を減少させる。この治療ネットワークは、酸化ストレスを防御するために尿酸の基礎レベルを保ちながら尿酸の重大な蓄積を阻止することによって、尿酸ホメオスタシスの自己充足的な自動コントロールを提供する。
【００２７】
本明細書下記の哺乳動物ＵＲＥＸシステムは、また、バイオリアクターを適用したタンパク質治療薬の製造にも使用することができる。例えばオキシダーゼ／レダクターゼの酵素クラスのメンバーのようなトランスジェニック酵素の製造によって、培地中の細胞の維持および成長のために使用される化合物が酵素ベースで触媒変換され、ラジカルの放出が起こる可能性がある。誘導された酸化ストレスは、細胞の成長を阻害または生成物の安定性を抑制することによって、生成物の連続形成をかく乱するおそれがある。ＵＲＥＸシステムでこの種の酵素の発現をコントロールすると、生成物の形成は外因性尿酸の添加によって誘導され、その尿酸は、酵素発現の誘導因子として機能すると同時に、発生したラジカルと結合し、解毒することによって細胞を工程媒介性酸化ストレスから防御する。
【００２８】
本発明は、さらに、上記ベクターを安定的または一過性のいずれかでトランスフェクションされた前記ベクターを含む哺乳動物細胞、およびナノコンテナまたはマイクロコンテナ中の、例えば封入された形態のこの種の哺乳動物細胞に関する。ナノコンテナは、ウイルス、好ましくは弱毒化ウイルス、特にウイルスキャプシド、例えば哺乳動物細胞を組み入れるのに適した形状の球体またはチューブなどの合成または半合成のナノパーティクルまたはミクロパーティクル、および哺乳動物細胞を例えばアルギン酸−ポリ−Ｌ−リシンで封入することによってin situで形成されるナノコンテナまたはマイクロコンテナでありうる。適切なナノコンテナまたはマイクロコンテナの特定の例は、CELLMAX（登録商標）の商品名で製造された中空糸である。
【００２９】
本発明は、さらに、前記哺乳動物細胞、特にナノコンテナまたはマイクロコンテナ中の哺乳動物細胞を含む、ヒト以外の哺乳動物に関する。
【００３０】
本発明は、さらに、この種の哺乳動物細胞を使用して、尿酸の過剰または尿酸の欠如によって起こる疾患を処置する方法に関する。考慮される疾患は、尿酸の過剰によって起こるもの、例えば高尿酸血症、痛風、レッシュ−ナイハン症候群、腎症、および腫瘍溶解症候群、ならびに不十分なレベルの尿酸によって起こる疾患、例えばアルツハイマー、パーキンソン、および対応するガンである。特に、本発明は、尿酸の過剰または欠如によって起こる疾患を患う患者の処置方法であって、本明細書記載のナノコンテナまたはマイクロコンテナ中の哺乳動物細胞が、それを必要とする患者に埋め込まれる方法に関する。
【００３１】
好ましい態様
本発明の特に例示的な態様では、Deinococcus radiodurans R1における酸化ストレス応答を調和させるＨｕｃＲとｈｕｃＯとの間の尿酸応答性相互作用を利用して、哺乳動物細胞を尿酸に感知および応答可能にする特定の合成回路が構築される（Wilkinson, S.P. & Grove, A.、上記引用文中）。
【００３２】
本発明のこの好ましい態様は、以下の通りである：尿酸応答性発現ネットワーク（ＵＲＥＸ）が、（ｉ）哺乳動物細胞で最大発現させるためのＨｕｃＲ開始コドンの改変（ＧＴＧ→ＡＴＧ）およびコザックコンセンサス配列との融合（ｍＨｕｃＲ）、（ｉｉ）クルッペル関連ボックスタンパク質ドメインにｍＨｕｃＲのＮ−末端を融合（Bellefroid, E.J., Poncelet, D.A., Lecocq, P.J., Revelant, O. & Martial, J.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3608-3612 (1991)）させて、キメラ哺乳動物尿酸依存性トランスサイレンサーを生成させること（ｍＵＴＳ、ＫＲＡＢ−ｍＨｕｃＲ）、および（ｉｉｉ）サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）下流に８個のタンデムのｈｕｃＯモジュールを置くことによって集合された合成プロモーター（ＰＵＲＥＸ８、ＰＳＶ４０−ｈｕｃＯ８）を含む多段階操作戦略によって構築される（図１ａ）。尿酸の不在下で、ｍＵＴＳは、ｈｕｃＯ８に結合し、ＰＵＲＥＸ８からの転写をサイレンシングする（図１ｂ）。しかしながら、ｍＵＴＳは、尿酸の存在下でｈｕｃＯ８から解離することによってＳＥＡＰ（分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ）の発現を誘導する。無尿酸培地中で成長したヒト子宮頚部腺ガン細胞（ＨｅＬａ）、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３）およびヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０）に、ｐＣＫ９（ＰＵＲＥＸ８−ＳＥＡＰ−ｐＡ）と共に、構成的ヒト伸長因子１αプロモーター（ＰｈＥＦ１α□□）に推進されるｍＵＴＳ発現ベクターｐＣＫ２５（ＰｈＥＦ１α−ｍＵＴＳ−ｐＡ）を共トランスフェクションすることにより、ｍＵＴＳがＰＵＲＥＸ８に結合し、それに推進されるＳＥＡＰの発現を最大９８％サイレンシングできることを示した（図１ｃ）。トランスフェクションされた培養物への５mM尿酸の添加は、ｈｕｃＯ８からのｍＵＴＳの解離をトリガーし、ＳＥＡＰの発現を抑制解除する（図１ｄ）。
【００３３】
特に本発明は、細菌性尿酸センサー−レギュレーターがDeinococcus radiodurans R1由来のウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲであって、オペレーター配列が、Deinococcus radiodurans R1由来の対応するオペレーター配列ｈｕｃＯである、哺乳動物細胞およびベクターに関する。さらに好ましい態様は、ウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲがコザック−コンセンサス配列に融合しており、クルッペル関連ボックスタンパク質ドメインのＮ−末端が、ウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲに融合している態様である。他の好ましい態様は、プロモーターがサルウイルス４０プロモーターであって、Deinococcus radiodurans R1由来の好ましいオペレーター配列ｈｕｃＯを含むベクターが、ｈｕｃＯを数個のコピーで、例えば５から５０個コピーの間で、好ましくは５から２０個のコピーの間で含む態様である。最も好ましいのは、ベクターｐＣＫ２５およびｐＣＫ９、ならびにｐＣＫ９中のＳＥＡＰについてのコドンが、別の検出可能なタンパク質、例えば上に挙げた容易に検出可能なタンパク質についてのコドンに置換されたベクターである。
【００３４】
ヒトは、突然変異サイレンシングによって肝ウリカーゼを進化的に欠如しているせいで、効果的な腎尿酸クリアランスおよび尿酸ホメオスタシスの維持を尿酸陰イオントランスポーターＵＲＡＴ１に依存している（Enomoto, A. et al., Nature 417, 447-452 (2002)）。そのトランスポーターの尿酸取り込み能のせいで、ＵＲＡＴ１の異所性発現は、細胞内尿酸レベルを増加させ、結果としてＵＲＥＸの感度を増幅する可能性がある。ＵＲＥＸコントロール性のＳＥＡＰ発現のために操作され、構成的ＵＲＡＴ１発現ベクター（ｐＵＲＡＴ１）をトランスフェクションされたＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３およびＨＴ−１０８０は、無ＵＲＡＴ１細胞よりも有意に高いＳＥＡＰレベルに達し、典型的にはヒト血液中にみられる尿酸範囲内（２００〜４００μM）で特に高感度である（図１ｅ〜ｇ）。実際に、ＵＲＡＴ１およびＵＲＥＸコントロール性ＳＥＡＰ発現のために操作された、マイクロ封入されたＨｅＬａをヒト痛風性関節炎の樹立マウスモデルである尿酸オキシダーゼ欠損（ｕｏｘ−／−）マウスに腹腔内埋込みした７２時間後に（Wu, X. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 742-746 (1994)）、合成尿酸センサー回路は、高尿酸血症および尿酸腎症を発症しているマウス（高尿酸レベル；０．３５±０．１５U/L ＳＥＡＰ）と、認可を受けている尿酸低下性関節炎治療薬アロプリノールを飲料水から摂取した動物（低尿酸レベル；０．０２±０．１０U/L ＳＥＡＰ）とを識別するために十分な感度であった（図２ａ）。ＳＥＡＰを構成的生成している細胞で処置された対照マウスは、アロプリノールの存在下（低尿酸レベル；０．８５±０．１０U/L SEAP）または不在下（高尿酸レベル；０．９０±０．１５U/L SEAP）で不変のＳＥＡＰ発現を示す。
【００３５】
哺乳動物尿酸センサーシステムの調整能力および長期可逆性を特徴づけるために、ＵＲＥＸコントロール性のＳＥＡＰおよびＵＲＡＴ１発現のための安定なトリプルトランスジェニック−ヒト細胞系ＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５を構築する。ＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５のＳＥＡＰ発現は、正確に調整することができ、尿酸濃度の上昇に応答して漸増を示す（図２ｂ）。ＵＲＥＸコントロール性ＳＥＡＰ生成の可逆性は、尿酸濃度を０mMから５mMに７２時間毎に交互に変化させながらＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５を１０日間培養することによって評価する。ＵＲＥＸのコントロールは、完全に可逆的であり、ＳＥＡＰ生成に全く発現記憶効果を示さずにいつでもリセットすることができる（図２ｃ）。
【００３６】
ＵＲＥＸは、正確で頑健な尿酸センサーとして、病的レベルのこの代謝物を治療的にコントロールするために適する。尿酸レベルを自律的で自己充足的にフィードバックコントロールにより減少させるために、尿酸センサー回路は、尿酸をより可溶性で、腎臓で分泌可能なアラントインに変換するウリカーゼ／尿酸オキシダーゼ（Ｕｏｘ）の発現と連結される必要がある（Legoux, R. et al., J. Biol. Chem. 267, 8565-8570 (1992)）。補因子非依存性Aspergillus flavusウリカーゼは、哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されている（ｍＵｏｘ）。ｍＵｏｘは、構成的発現するか（ｐＣＫ６７、ＰＵＲＥＸ８−ｍＵｏｘ−ｐＡ）、またはｍＵＴＳによってコントロールされると（ｐＣＫ６７がｐＣＫ２５と共発現、ＰＵＲＥＸ８−ｍＵｏｘ−ｐＡ、ＰｈＥＦ１α−ｍＵＴＳ−ｐＡ）、培地中の尿酸を減少させる（０．５mM）。免疫グロブリン由来分泌シグナルとフレーム内融合させることによってｍＵｏｘを哺乳動物細胞ベースで分泌させるように操作したときの方が、尿酸の減少は効率的である（Fluri, D. et al., J. Control. Release 131, 211-219 (2008), ｓｍＵｏｘ；ＳＳＩｇｋ−ｍＵｏｘ；ｐＣＫ６５、ＰＵＲＥＸ８−ＳＳＩｇｋ−ｍＵｏｘ−ｐＡ）（図３ａ）。
【００３７】
構成的ｍＵＴＳ発現およびＰＵＲＥＸ８推進性ｓｍＵｏｘ発現のために操作されたＨｅＬａＵＲＡＴ１を１２０時間培養する間にＵＲＥＸコントロール性尿酸代謝の動態をプロファイリングする（図３ｂ）。構成的ｓｍＵｏｘ発現のために遺伝子導入された同質遺伝子ＨｅＬａＵＲＡＴ１対照細胞（ｍＵＴＳの共発現なし）は、培地から尿酸を浄化するが、ＵＲＥＸ−ｓｍＵｏｘコントロール合成回路を内部に有する細胞培養物の尿酸レベルは、０．１mM（生理学的な状況で酸化ストレス防御を提供することが公知の濃度）で横ばいになり、これは、尿酸レベルが、ＵＲＥＸコントロールを誘導してさらなる尿酸酸化をトリガーすることがもはやできない閾値濃度未満に下落したことを示している。これらのデータは、ＵＲＥＸ−ｓｍＵｏｘによる尿酸レベルの自己充足的フィードバックコントロールを確認するものであり、この合成回路が病的尿酸レベルを自動コントロール的に酸化ストレス防御範囲内まで減少させることを示している。
【００３８】
アロプリノールの不在下でヒト様尿酸腎症および痛風性関節炎症状を伴う高尿酸血症を発症しているｕｏｘ−／−マウスが、ＵＲＥＸにコントロールされてｓｍＵｏｘを発現している細胞埋込み物で処置された場合、血清および尿中のそれらの尿酸レベルは、標準的なアロプリノール療法によって達成された濃度まで降下し、一方で対照動物（ＨｅＬａＵＲＡＴ１細胞埋込み物、アロプリノールなし）は、尿酸を蓄積し、急性痛風性関節炎症状を発症する（図３ｃ、ｄ）。すべての処置群からのヘマトキシリン／エオシン染色腎切片の組織分析から、ＵＲＥＸ−ｓｍＵｏｘベースの治療用細胞埋込み物が近位尿細管中の結晶状の腎尿酸沈着物を減少させ、腎症の組織状態をほぼ完全に反転させることが確認される（図３ｅ〜ｇ）。
【００３９】
痛風性関節炎は、最も痛みのあるリウマチ疾患である。尿酸オキシダーゼ欠乏のせいで、ヒトの血中尿酸レベルは、他の哺乳動物の最大５０倍であり、このことが高尿酸血症疾患を発症するリスクを増大させる。尿酸が、ガン、パーキンソン病および多発性硬化症の発生を防止するために重要な不可欠なフリーラジカルスカベンジャーであり、酸化ストレス保護因子であるという事実は、尿酸結晶性沈着物の形成を防止する一方で十分な酸化ストレス防御を提供するように尿酸レベルを正確に調整する必要があるという理由で、痛風性関節炎の処置を特に困難にしている。尿酸媒介疾患を処置するための、臨床的に使用されている二つの主要な治療戦略がある：（ｉ）プリン代謝を遮断して内因性尿酸生成を防止するアロプリノールのようなキサンチンオキシダーゼ阻害剤の投与、または（ｉｉ）血流からの尿酸クリアランスを促進するリコンビナントAspergillus flavusウリカーゼ（例えばRasburicase（登録商標））の静脈内注射。Rasburicase（登録商標）は、主にハイリスクなガン患者における腫瘍溶解症候群を予防するために使用されるが、４０年よりも長く販売されているアロプリノールは、重大な副作用を有し、痛風の急性発作の間に服用することができず、高尿酸血症誘導腎症が進行状態に達した場合に中止しなければならない。別のキサンチンオキシダーゼ阻害剤であるフェブキソスタット（Uloric（登録商標））は、慢性高尿酸血症の処置のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって最近認可された。
【００４０】
ヒト尿酸トランスポーターと、操作されたD. radiodurans由来哺乳動物尿酸センサーおよびセンサーによってコントロールされ分泌操作されたA. flavus尿酸オキシダーゼとの機能的接続によって、マウスにおける尿酸レベルの自己充足的自動コントロールを提供する合成回路を設計する。このネットワークの独特な尿酸自動レベルコントロールの動態は、（ｉ）血中尿酸レベルの継続モニタリング、（ｉｉ）病的尿酸レベルでのコアセンサーユニットの自動誘導、（ｉｉｉ）臨床的に認可された尿酸オキシダーゼのセンサーコントロールされた発現による尿酸の迅速な減少、および（ｉｖ）酸化ストレス防御に必要な生理学的尿酸基礎レベルに達したときの自然シャットダウンを可能にする。ヒト痛風性関節炎のマウスモデルにおける尿酸レベルのＵＲＥＸベースのコントロールは、合成回路が予想通りに、そして最も重要なことには臨床的に関連する濃度範囲内で作動することを示す。ヒトにおいて、尿酸一ナトリウム結晶に起因する痛い炎症は、６．８mg/dlよりも大きい血中尿酸レベルで生じる（Terkeltaub, R., Bushinsky, D.A. & Becker, M.A., Arthritis Res. Ther. 8, S4 (2006)）。ＵＲＥＸセンサーは、この種の病的レベルを捕捉し、分泌型ウリカーゼの用量依存性発現をトリガーすることができ、結果的にそのことは、処置された動物の血流中の尿酸を約８０％、５mg/dlまで減少させる。６mg/dlよりも少ない循環レベルで、尿酸塩結晶沈着物は溶解することが知られ、患者は痛風性関節炎の臨床徴候を全く有さない。したがって、血流中の尿酸レベルを自己充足的に自動レベルコントロールするための、ＵＲＥＸベースのネットワークを内部に有する細胞埋込み物は、高尿酸血症性疾患における定期的小分子投与の代替となる予防戦略または治療的介入を意味する。
【００４１】
実験の部
ベクターの構築
全てのプラスミドおよびオリゴヌクレオチドの設計の詳細を表１に提供する。
【００４２】
【表１】
【００４３】
オリゴヌクレオチド配列中の制限エンドヌクレアーゼ特異的部位に下線を引く。オリゴヌクレオチド配列に含まれる、アニーリングする塩基対を大文字で示す。
【００４４】
略語：ＥＴ４、マクロライド依存性トランスサイレンサー；ＥＴＲ８、ＭｐｈＲ（Ａ）に特異的な八量体のオペレーターモジュール；ｈｕｃＯ、ＨｕｃＲ特異的オペレーター；ｈｕｃＯ８、ＨｕｃＲに特異的な八量体のオペレーターモジュール；ＫＲＡＢ、クルッペル関連ボックスタンパク質；ｍＨｕｃＲ、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されたDeinococcus radiodurans尿酸依存性リプレッサー；ＭｐｈＲ（Ａ）、Escherichia coliマクロライド依存性リプレッサー；ｍＵｏｘ、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された、Aspergillus flavus由来の尿酸オキシダーゼ細胞内変異体;ｐＡ、ＳＶ４０由来後期ポリアデニル化部位；ＰｈＣＭＶ、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター；ＰｈＥＦ１α、ヒト伸長因子１αプロモーター；ＰＳＶ４０、サルウイルス４０プロモーター；ＰＵＲＥＸ８、ｈｕｃＯ８を含有する尿酸誘導性プロモーター（ＰＳＶ４０−ｈｕｃＯ８）；ＳＥＡＰ、分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼ；ＳＳＩｇｋ、マウスＩｇκ鎖Ｖ−１２−Ｃ領域由来分泌シグナル；ｓｍＵｏｘ、哺乳動物細胞による分泌のために操作されたｍＵｏｘ；ＵＲＡＴ１、ヒト有機陰イオン／尿酸トランスポーターＳＬＣ２２Ａ１２（溶質担体ファミリー２２メンバー１２）。
【００４５】
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト子宮頚部腺ガン細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ−２９３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）およびヒト線維肉腫細胞（ＨＴ−１０８０、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１２１）を、１０％（v/v）ウシ胎児血清（ＦＣＳ、PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Germany, Cat. No. 3302, Lot No. P251110）および１％（v/v）ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｐ／Ｓ、PAN Biotech GmbH, Cat. No. P06-07100）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Invitrogen, Basel, Switzerland, Cat. No. 52100-39）中で培養する。全種類の細胞を、５％ ＣＯ２を含有する３７℃の加湿雰囲気中で培養する。標準的なＣａＰＯ４ベースのプロトコールを用いてＨＥＫ−２９３をトランスフェクションする（Weber, W. et al., Nucleic Acids Res. 31, e71 (2003)）。ＨｅＬａも、この標準的なＣａＰＯ４ベースのプロトコールに従ってトランスフェクションしたが、但し、ＤＮＡの沈殿を細胞と共に１２時間インキュベーションしてから培地を交換する。供給業者の手順に従ってＨＴ−１０８０にＦｕＧＥＮＥ６（Roche Diagnostics AG, Basel, Switzerland, Cat. No. 11814443001）をトランスフェクションする。トランスフェクションされた細胞を、１０％（v/v）ノックアウト代用血清（ＫＯＳＲ、Invitrogen, Basel, Switzerland, Cat. No. 10828-028）、１％ Ｐ／Ｓおよび場合により尿酸（Acros Organics, Geel, Belgium, Cat. No. 171290250）を補充したＤＭＥＭ（標準培地）中で培養する。尿酸依存性用量反応特性を確立するために、６ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark）のウェル１個あたり３×１０５個の細胞を蒔き、上記のようにトランスフェクションする。細胞をトリプシン処理し（２００μlトリプシン［PAN Biotech GmbH, Cat. No. P10-023500］、５分間、３７℃）、遠心分離によって収集し（２分間、１２０×ｇ）、１．５mlの標準培地中に再懸濁する。この細胞懸濁液１００μlを、異なる濃度の尿酸を補充した９６ウェルプレートの個別のウェルに移植し、４８時間培養してから、培養上清中のレポーター遺伝子発現をプロファイリングする。
【００４６】
安定なトランスジェニック細胞系の構築
ヒト腎臓尿酸陰イオン交換体（ＵＲＡＴ１）の構成的発現のために遺伝子導入されたＨｅＬａ由来ＨｅＬａＵＲＡＴ１細胞は、ｐＵＲＡＴ１（ＰｈＣＭＶ−ＵＲＡＴ１−ｐＡ；ImaGenes, Berlin, Germany, IMAGE ID: 5183650）およびｐＺｅｏＳＶ２（ゼオシン耐性を付与；［InvivoGEN, San Diego, USA, Cat. No. ant-zn-5］）を１０：１の比で共トランスフェクション（３μgの総ＤＮＡ）することによって構築する。２００μg/ml（w/v）ゼオシンを使用した１４日の選択期間後に、細胞のクローンをエクスパンションさせ、個別のクローンを、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＵＲＡＴ１の発現についてプロファイリングする。さらなる実験のために細胞系ＨｅＬａＵＲＡＴ１を選択する。尿酸によって誘導されうるＳＥＡＰの発現を容易にする、ＨＥＫ−２９３由来のトリプルトランスジェニックＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５細胞系は、（ｉ）ｐＣＫ９（ＰＵＲＥＸ８−ＳＥＡＰ−ｐＡ）およびｐＣＫ２５（ＰｈＥＦ１α−ＫＲＡＢ−ｍＨｕｃＲ−ｐＡ、ブラストサイジン耐性を付与する構成的発現カセットも有する）（１：１の比、１０％ ＦＣＳおよび２０μg/ml（w/v）ブラストサイジン［InvivoGen, San Diego, USA, Cat. No. ant-bl-1］を含有するＤＭＥＭ中で１４日間の選択）ならびに（ｉｉ）ｐＵＲＡＴ１（ＰｈＣＭＶ−ＵＲＡＴ１−ｐＡ）およびｐＺｅｏＳＶ２（ゼオシン耐性を付与）（１０：１の比［（３μgの総ＤＮＡ］、１０％ ＦＣＳ、２０μg/ml（w/v）ブラストサイジンおよび２００μg/ml（w/v）ゼオシン（InvivoGen, San Diego, CA, USA, Cat. No. ant-zn-5）を含有するＤＭＥＭ中で１４日間選択）の連続共トランスフェクションおよびクローン選択によって構築する。個別のＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸクローンをランダムに釣り上げ、尿酸でトリガーされたＳＥＡＰの発現について評価する。さらなる研究のためにＨＥＫ−２９３ＵＲＥＸ１５を選択する。
【００４７】
分析アッセイ
標準的なｐ−ニトロフェニルホスフェートベースの光吸収の経時変化を利用して、細胞培養上清およびマウス血清中のＳＥＡＰレベルを定量する（Berger, J., Hauber, J., Hauber, R., Geiger, R. & Cullen, B.R., Gene 66, 1-10 (1988)）。Amplex（登録商標）Red尿酸／ウリカーゼアッセイキット（Invitrogen, Basel, Switzerland, Cat. No. A22181）を製造業者のプロトコールに従って使用して、細胞培養上清、マウス血清または尿中の尿酸レベルを評価する。尿酸含有試料を反応緩衝液で希釈する。ウリカーゼの添加は、尿酸からアラントイン、ＣＯ２およびＨ２Ｏ２への酵素変換をトリガーし、Ｈ２Ｏ２は、ホースラディッシュペルオキシダーゼの存在下でAmplex Red試薬と化学量論的に反応し、赤色蛍光酸化産物であるレゾルフィンを発生し、レゾルフィンは５８５nmで定量することができる。
【００４８】
in vivo方法
ヒト様痛風性関節炎症状を有する高尿酸血症を発症している尿酸オキシダーゼ欠損マウス（ｕｏｘ−／−）（Wu, X. et al.、上記引用文中）を使用して、ＵＲＥＸベースの尿酸コントロールの合成ネットワークをin vivo検証する（Charles River Laboratories, France、マウス株：ＪＡＫＳ２２２３）。ｕｏｘ−／−マウスは生後４週齢以内に死亡することから、繁殖および長期維持は、飲料水への１５０μg/mL（w/v）アロプリノール（Sigma, Cat. No. A8003）の添加を必要とする。ＵＲＥＸトランスジェニック細胞の埋込みの２週間前に、尿酸オキシダーゼ欠損マウスのアロプリノール処置を継続または中止して、血流中にそれぞれ低尿酸レベルまたは病的な高尿酸レベルを有する動物群を作出する。構成的ＵＲＡＴ１発現のために遺伝子導入されたＨｅＬａＵＲＡＴ１に、ｐＣＫ２５（ＰｈＥＦ１α−ｍＵＴＳ−ｐＡ）と、ｐＣＫ９（ＰＵＲＥＸ８−ＳＥＡＰ−ｐＡ）、ｐＳＥＡＰ２対照（ＰＳＶ４０−ＳＥＡＰ−ｐＡ）またはｐＣＫ６５（ＰＵＲＥＸ８−ｓｍＵｏｘ−ｐＡ）のいずれかとを一過性共トランスフェクションし、次に、製造業者のプロトコールに従って、以下の設定を適用してInotech Encapsulator Research IE 50R（EncapBioSystems Inc., Greifensee, Switzerland）を使用して２００μmアルギン酸−（ポリ−Ｌ−リシン）−アルギン酸カプセルにマイクロ封入する（２００個の細胞／カプセル）：２００μm単一ノズル、撹拌子スピードコントロールを５ユニットに設定、２０mlシリンジで流速４１０ユニット、ノズル振動周波数１０２４Hz、カプセル分散のための電圧９００Ｖ。２×１０６個の封入細胞を含有する７００μl ＰＢＳ（１０４個のカプセル／マウス）を尿酸オキシダーゼ欠損マウスに腹腔内注射する。対照マウスに、マイクロ封入された親ＨｅＬａＵＲＡＴ１を埋め込む。埋込みの４８時間後にマウスを清潔なケージに移動させ、各処置群の尿を２４時間採取する。埋込みの７２時間後にマウスを屠殺し、それらの血液を収集し、製造業者のプロトコールに従って血清をマイクロテイナーＳＳＴチューブ（Beckton Dickinson, Plymouth, UK）中に単離する。動物を必要とする全ての実験は、欧州共同体の理事会指令（８６／６０９／ＥＥＣ）に従って行う。
【００４９】
組織検査
構成的ＵＲＡＴ１発現およびＵＲＥＸコントロール性ｓｍＵｏｘ発現のために遺伝子導入された細胞をマイクロ封入したものを埋め込まれたｕｏｘ−／−マウスの腎臓中の尿酸沈着物を顕微鏡分析するために、処置された動物を、上記飲料水から１５０μg/mL（w/v）アロプリノールを摂取している処置群およびアロプリノールを摂取していない処置群に分ける。埋込みの７日後に、マウスを屠殺し、その腎臓をＰＢＳに溶かした４％（w/v）パラホルムアルデヒド（Sigma, Cat. No. P6148）中に外植し４時間固定する。その腎臓を、ＰＢＳに溶かした１０％（w/v）スクロース（Sigma, Cat. No. S1888）中で９０分間洗浄し、トリミングし、脱水し、パラフィン包埋する。Ultracut装置（Zeiss, Feldbach, Switzerland）を使用して製造した３μm組織切片をゼラチン化マイクロスライドに移し、３７℃で一晩風乾する。キシレン中に浸すことによってパラフィンを除去した後に（３×１０min)、段々低いエタノール濃度（９０％、８０％、７０％）中で連続的にインキュベーション（１０分間）することによって組織を再水和させ、ＴＢＳ（トリス緩衝食塩水；５０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１００mM塩化ナトリウム）中で２回すすぎ、ヘマトキシリン／エオシン溶液で染色する。偏光下で試料を可視化し、Leica DMRBE顕微鏡を用いて異方性を評価する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス活性化ドメインまたはトランスリプレッサードメインに融合した細菌性尿酸センサー−レギュレーターのための遺伝暗号を含むベクター。
【請求項２】
細菌性尿酸センサー−レギュレーターが、Deinococcus radiodurans R1由来ウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲ、Deinococcus geothermalis DSM 11300由来ＭａｒＲ型転写レギュレーターＤｇｅｏ＿２５３１、Pseudomonas mendocina ypm由来ＭａｒＲ型転写レギュレーター、Deinococcus deserti VCD115由来ＭａｒＲ型転写レギュレーターＤｅｉｄｅ＿３ｐ００２８０、またはそれらに由来するセンサー−レギュレーターである、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
細菌性尿酸センサー−レギュレーターが、Deinococcus radiodurans R1由来ウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲである、請求項１記載のベクター。
【請求項４】
トランス活性化ドメインが、単純ヘルペスウイルスのｖｐ１６トランス活性化ドメイン、ｐ６５トランス活性化ドメイン、ヒトｅ２ｆ４トランス活性化ドメイン、ならびにＧＡＬ４、ＣＴＦ／ＮＦ１、ＡＰ２、ＩＴＦ１、Ｏｃｔ１およびＳｐＩに由来または関係するトランス活性化ドメインから成る群より選択される、請求項１、２または３記載のベクター。
【請求項５】
トランスリプレッサードメインが、ヒト−クルッペル関連ボックスタンパク質のｋｒａｂトランス抑制ドメイン、ならびにｖ−ｅｒｂＡガン遺伝子生成物、甲状腺ホルモンレセプター、Ｓｓｎ６／Ｔｕｐ１タンパク質複合体、ＳＩＲＩタンパク質、ＮｅＰ１、ＴＳＦ３、ＳＦ１、ＷＴ１、Ｏｃｔ−２．１、Ｅ４ＢＰ４、およびＺＦ５に由来または関係するトランスリプレッサードメインから成る群より選択される、請求項１、２または３記載のベクター。
【請求項６】
細菌性尿酸センサー−レギュレーターと特異的に結合するオペレーター配列、プロモーター、およびタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
オペレーター配列が、Deinococcus radiodurans R1由来センサー−レギュレーターＨｕｃＲ、Deinococcus geothermalis DSM 11300由来Ｄｇｅｏ＿２５３１、Pseudomonas mendocina ypm由来ＭａｒＲ型転写レギュレーター、もしくはDeinococcus deserti VCD115由来Ｄｅｉｄｅ＿３ｐ００２８０に特異的に結合するDeinococcaceaeまたはPseudomonadaceaeによって生成されるオペレーター配列、またはそれらに由来するオペレーター配列である、請求項６記載のベクター。
【請求項８】
オペレーター配列が、Deinococcus radiodurans R1由来オペレーター配列ｈｕｃＯである、請求項６記載のベクター。
【請求項９】
プロモーターが、構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）、最小ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＰｈＣＭＶｍｉｎ）、構成的ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＰｈＣＭＶ）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＰｈＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＰＧＫ）、ヒト−ユビキチンプロモーター（ＰｈＵＢＣ）およびβアクチンプロモーターから成る群より選択される、請求項６、７または８記載のベクター。
【請求項１０】
タンパク質が、ウリカーゼまたは尿酸トランスポータータンパク質である、請求項６〜９のいずれか記載のベクター。
【請求項１１】
タンパク質が、分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼである、請求項６〜９のいずれか記載のベクター。
【請求項１２】
有害な過剰の尿酸の検出および／または分解に有用な哺乳動物細胞であって、以下を含む細胞：
（ａ）請求項１〜５のいずれか記載のベクター；および
（ｂ）請求項６〜１１のいずれか記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載の哺乳動物細胞を含むナノコンテナまたはマイクロコンテナ。
【請求項１４】
請求項１２記載の哺乳動物細胞を含む、ヒト以外の哺乳動物。
【請求項１５】
請求項１２記載の哺乳動物細胞を使用して、尿酸の過剰または欠如によって起こる疾患を処置する方法。
【請求項１】
トランス活性化ドメインまたはトランスリプレッサードメインに融合した細菌性尿酸センサー−レギュレーターのための遺伝暗号を含むベクター。
【請求項２】
細菌性尿酸センサー−レギュレーターが、Deinococcus radiodurans R1由来ウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲ、Deinococcus geothermalis DSM 11300由来ＭａｒＲ型転写レギュレーターＤｇｅｏ＿２５３１、Pseudomonas mendocina ypm由来ＭａｒＲ型転写レギュレーター、Deinococcus deserti VCD115由来ＭａｒＲ型転写レギュレーターＤｅｉｄｅ＿３ｐ００２８０、またはそれらに由来するセンサー−レギュレーターである、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
細菌性尿酸センサー−レギュレーターが、Deinococcus radiodurans R1由来ウリカーゼセンサー−レギュレーターＨｕｃＲである、請求項１記載のベクター。
【請求項４】
トランス活性化ドメインが、単純ヘルペスウイルスのｖｐ１６トランス活性化ドメイン、ｐ６５トランス活性化ドメイン、ヒトｅ２ｆ４トランス活性化ドメイン、ならびにＧＡＬ４、ＣＴＦ／ＮＦ１、ＡＰ２、ＩＴＦ１、Ｏｃｔ１およびＳｐＩに由来または関係するトランス活性化ドメインから成る群より選択される、請求項１、２または３記載のベクター。
【請求項５】
トランスリプレッサードメインが、ヒト−クルッペル関連ボックスタンパク質のｋｒａｂトランス抑制ドメイン、ならびにｖ−ｅｒｂＡガン遺伝子生成物、甲状腺ホルモンレセプター、Ｓｓｎ６／Ｔｕｐ１タンパク質複合体、ＳＩＲＩタンパク質、ＮｅＰ１、ＴＳＦ３、ＳＦ１、ＷＴ１、Ｏｃｔ−２．１、Ｅ４ＢＰ４、およびＺＦ５に由来または関係するトランスリプレッサードメインから成る群より選択される、請求項１、２または３記載のベクター。
【請求項６】
細菌性尿酸センサー−レギュレーターと特異的に結合するオペレーター配列、プロモーター、およびタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
オペレーター配列が、Deinococcus radiodurans R1由来センサー−レギュレーターＨｕｃＲ、Deinococcus geothermalis DSM 11300由来Ｄｇｅｏ＿２５３１、Pseudomonas mendocina ypm由来ＭａｒＲ型転写レギュレーター、もしくはDeinococcus deserti VCD115由来Ｄｅｉｄｅ＿３ｐ００２８０に特異的に結合するDeinococcaceaeまたはPseudomonadaceaeによって生成されるオペレーター配列、またはそれらに由来するオペレーター配列である、請求項６記載のベクター。
【請求項８】
オペレーター配列が、Deinococcus radiodurans R1由来オペレーター配列ｈｕｃＯである、請求項６記載のベクター。
【請求項９】
プロモーターが、構成的サルウイルス４０プロモーター（ＰＳＶ４０）、最小ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＰｈＣＭＶｍｉｎ）、構成的ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＰｈＣＭＶ）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＰｈＥＦ１α）、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＰＧＫ）、ヒト−ユビキチンプロモーター（ＰｈＵＢＣ）およびβアクチンプロモーターから成る群より選択される、請求項６、７または８記載のベクター。
【請求項１０】
タンパク質が、ウリカーゼまたは尿酸トランスポータータンパク質である、請求項６〜９のいずれか記載のベクター。
【請求項１１】
タンパク質が、分泌型ヒト胎盤性アルカリホスファターゼである、請求項６〜９のいずれか記載のベクター。
【請求項１２】
有害な過剰の尿酸の検出および／または分解に有用な哺乳動物細胞であって、以下を含む細胞：
（ａ）請求項１〜５のいずれか記載のベクター；および
（ｂ）請求項６〜１１のいずれか記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載の哺乳動物細胞を含むナノコンテナまたはマイクロコンテナ。
【請求項１４】
請求項１２記載の哺乳動物細胞を含む、ヒト以外の哺乳動物。
【請求項１５】
請求項１２記載の哺乳動物細胞を使用して、尿酸の過剰または欠如によって起こる疾患を処置する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５２７２１９（Ｐ２０１２−５２７２１９Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１１６６（Ｐ２０１２−５１１１６６）
【出願日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００２７８３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３３２９８
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５０８１３９０００）
【氏名又は名称原語表記】ＥＴＨ Ｚｕｒｉｃｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００２７８３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３３２９８
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５０８１３９０００）
【氏名又は名称原語表記】ＥＴＨ Ｚｕｒｉｃｈ
【Ｆターム（参考）】
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