幹細胞培養のためのマイクロキャリア
【課題】コートされたマトリックスを含み、陽電荷を有する粒子であって、それに付着した霊長類またはヒトの幹細胞の集合を可能にするサイズのものである粒子を開示する。
【解決手段】粒子は、５０μｍ〜４００μｍ、たとえば約２００μｍの最長寸法を有する、実質的に細長い、円筒形またはロッドの形状の粒子を含むことができる。それは２０μｍ〜３０μｍの断面寸法をもつことができる。霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させる方法であって、第１および第２の各粒子に付着した第１および第２の霊長類またはヒトの幹細胞を用意し、第１の霊長類またはヒトの幹細胞を第２の霊長類またはヒトの幹細胞に接触させて細胞集合体を形成させ、そしてこの集合体を培養して霊長類またはヒトの幹細胞を少なくとも１継代伝播させることを含む方法。
【解決手段】粒子は、５０μｍ〜４００μｍ、たとえば約２００μｍの最長寸法を有する、実質的に細長い、円筒形またはロッドの形状の粒子を含むことができる。それは２０μｍ〜３０μｍの断面寸法をもつことができる。霊長類またはヒトの幹細胞を伝播させる方法であって、第１および第２の各粒子に付着した第１および第２の霊長類またはヒトの幹細胞を用意し、第１の霊長類またはヒトの幹細胞を第２の霊長類またはヒトの幹細胞に接触させて細胞集合体を形成させ、そしてこの集合体を培養して霊長類またはヒトの幹細胞を少なくとも１継代伝播させることを含む方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性である方法。
【請求項２】
幹細胞が胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
幹細胞が霊長類またはヒトのものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも５継代、または少なくとも７継代、または少なくとも１０継代反復する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
マイクロキャリアがロッド形である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
マイクロキャリアがプロタミンまたはポリリジンとカップリングしている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
マイクロキャリアが親水性である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
マイクロキャリアが実質的に球形の形状を有する、請求項１〜４または６〜１４のいず
れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉｉ）において、培養物中の幹細胞の数を拡張させるのに十分な期間、幹細胞を培養する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）の幹細胞がその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｉｖ）において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも６０％について、マイクロキャリアがマトリックス中にコートされている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルにおいて、マイクロキャリアが同一マトリックス中にコートされている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の第１と第２の連続サイクルにおいて、マトリックスが異なるか、または存在しない、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が多分化能性である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２、３またはすべてを発現する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
該方法が、幹細胞を無血清培地、または幹細胞用馴化培地、またはフィーダー細胞を含まない状態で培養することを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
フィーダー細胞もマイクロキャリアに付着している、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
培養がさらに、幹細胞が付着するマイクロキャリアとは異なるマイクロキャリアに付着したフィーダー細胞を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法により得られる多分化能性幹細胞。
【請求項２８】
さらに、工程（ｉｖ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
該方法が、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該方法が、工程（ｉｖ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
さらに、多分化能性幹細胞の分化を含む方法であって、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
第１マトリックスと第２マトリックスが同一である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第１マトリックスと第２マトリックスが異なる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが同一である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが異なる、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
該方法がさらに、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
第３マトリックスが第１および第２マトリックスと異なる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
第３マトリックスが第１および第２マトリックスのいずれか１つと同一である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアと異なる、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアの１つと同一である、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法により得られる分化した細胞。
【請求項４２】
分化した細胞を培養して胚様体を形成させる、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法により得られる胚様体。
【請求項４４】
幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも７継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性であり、培養物がフィーダー細胞を含まず、各継代間で幹細胞の数が拡張し、幹細胞がヒトもしくは霊長類の胚性幹細胞またはヒトもしくは霊長類の誘導された多分化能性幹細胞である方法。
【請求項４５】
幹細胞をインビトロで培養し、かつ分化させる方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数の第１マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第１マイクロキャリアの表面は第１マトリックス中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性であり、該方法がさらに、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む方法。
【請求項４６】
幹細胞が胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
幹細胞が霊長類またはヒトのものである、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
マイクロキャリアがロッド形である、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
第１マトリックスと第２マトリックスが同一である、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
第１マトリックスと第２マトリックスが異なる、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが同一である、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが異なる、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
該方法がさらに、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分
化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む、請求項４５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
第３マトリックスが第１および第２マトリックスと異なる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
第３マトリックスが第１および第２マトリックスの１つと同一である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアと異なる、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアの１つと同一である、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
幹細胞をインビトロで分化させる方法であって、多分化能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む方法。
【請求項５９】
幹細胞が胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
幹細胞が霊長類またはヒトのものである、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
マイクロキャリアがロッド形である、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
マトリックスが、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなる、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
マイクロキャリアがプロタミンまたはポリリジンとカップリングしている、請求項５８〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項５８〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、請求項５８〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
マイクロキャリアが親水性である、請求項５８〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
マイクロキャリアが実質的に球形の形状を有する、請求項５８〜６０または６２〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
多能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養する
ことを含み、その際、工程（ｉｉ）の後の培養物中の幹細胞が多能性である方法。
【請求項７３】
工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面がマトリックス中にコートされている、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
さらに、工程（ｉｉ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含む、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
該方法が、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
該方法が、工程（ｉｉ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含む、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
多能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも２継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多能性である方法。
【請求項７８】
工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面がマトリックス中にコートされている、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
請求項７２、７３、７７または７８のいずれか１項に記載の方法により得られる多能性幹細胞。
【請求項８０】
さらに、工程（ｉｖ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含む、請求項７７または７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
該方法が、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
該方法が、工程（ｉｖ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養
する工程を含む、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
さらに、多能性幹細胞の分化を含む方法であって、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
請求項７４〜８３のいずれか１項に記載の方法により得られる分化した細胞。
【請求項８５】
多能性幹細胞をインビトロで培養し、かつ分化させる方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数の第１マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも２継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多能性であり、該方法がさらに、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む方法。
【請求項８６】
工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面が第１マトリックス中にコートされている、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
幹細胞をインビトロで分化させる方法であって、多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む方法。
【請求項８８】
幹細胞が成体幹細胞、または多分化能性幹細胞に由来する多能性幹細胞である、請求項７２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
マイクロキャリアがロッド形である、請求項７２〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む、請求項７２〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、請求項７２〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、および
エンタクチン１の混合物を含む、請求項７２〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなる、請求項７２〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、請求項７２〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項７２〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、請求項７２〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
工程（ｉｉ）において、培養物中の幹細胞の数を拡張させるのに十分な期間、幹細胞を培養する、請求項７２〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）の幹細胞がその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる、請求項７７〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
工程（ｉｖ）において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代、少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する、請求項７７〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
霊長類またはヒトの幹細胞の伝播および／または分化のための、マトリックス中にコートされたマイクロキャリアの使用であって、マイクロキャリアがＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＴＳＫｇｅｌ
Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）、ＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）およびＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）から選択される使用。
【請求項１０１】
マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、請求項１００に記載の使用。
【請求項１０２】
マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、請求項１００に記載の使用。
【請求項１０３】
多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロ懸濁培養において成長および／または分化させる際に使用するのに適切なマイクロキャリアであって、マイクロキャリアがセルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、またはコラーゲンのうち１以上を
含み、マイクロキャリアが細長い形状を有し、約２０００μｍ未満の最長寸法および約１０μｍより大きい最短寸法を有し、マイクロキャリアの表面がマトリックス中にコートされ、１個または複数の多分化能性細胞または多能性細胞がマトリックスコーティングに付着しているマイクロキャリア。
【請求項１０４】
マイクロキャリアがロッド形である、請求項１０３に記載のマイクロキャリア。
【請求項１０５】
マトリックスコーティングが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニンまたはフィブロネクチンのうち１以上を含む、請求項１０３または１０４に記載のマイクロキャリア。
【請求項１０６】
細胞が多分化能性細胞である、請求項１０３〜１０５のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
【請求項１０７】
多分化能性細胞が霊長類もしくはヒトの胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、請求項１０３〜１０６のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
【請求項１０８】
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項１０３〜１０７のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
【請求項１０９】
マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、請求項１０３〜１０８のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
【請求項１１０】
５０μｍ〜４００μｍの最長寸法を有する、請求項１０３〜１０９のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
【請求項１１１】
それに多分化能性細胞または多能性細胞が付着したそれぞれ請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載の２以上のマイクロキャリアを含む、集合体。
【請求項１１２】
多分化能性または多能性の状態を有する新たな細胞を生成するための多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロでの培養における、請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載のマイクロキャリアの使用。
【請求項１１３】
多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロ分化における、請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載のマイクロキャリアの使用。
【請求項１１４】
多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロで培養して多分化能性または多能性の状態を有する新たな細胞を生成する方法であって、多分化能性または多能性の状態を有する新たな細胞を生成するのに適切な条件下で請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載のマイクロキャリアを培養することを含む方法。
【請求項１１５】
多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロで分化させる方法であって、多分化能性細胞または多能性細胞の分化を誘導する条件下で請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載のマイクロキャリアを培養することを含む方法。
【請求項１】
幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性である方法。
【請求項２】
幹細胞が胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
幹細胞が霊長類またはヒトのものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも５継代、または少なくとも７継代、または少なくとも１０継代反復する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
マイクロキャリアがロッド形である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
マイクロキャリアがプロタミンまたはポリリジンとカップリングしている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
マイクロキャリアが親水性である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
マイクロキャリアが実質的に球形の形状を有する、請求項１〜４または６〜１４のいず
れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉｉ）において、培養物中の幹細胞の数を拡張させるのに十分な期間、幹細胞を培養する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）の幹細胞がその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｉｖ）において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも６０％について、マイクロキャリアがマトリックス中にコートされている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルにおいて、マイクロキャリアが同一マトリックス中にコートされている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の第１と第２の連続サイクルにおいて、マトリックスが異なるか、または存在しない、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が多分化能性である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２、３またはすべてを発現する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
該方法が、幹細胞を無血清培地、または幹細胞用馴化培地、またはフィーダー細胞を含まない状態で培養することを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
フィーダー細胞もマイクロキャリアに付着している、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
培養がさらに、幹細胞が付着するマイクロキャリアとは異なるマイクロキャリアに付着したフィーダー細胞を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法により得られる多分化能性幹細胞。
【請求項２８】
さらに、工程（ｉｖ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
該方法が、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該方法が、工程（ｉｖ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
さらに、多分化能性幹細胞の分化を含む方法であって、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
第１マトリックスと第２マトリックスが同一である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第１マトリックスと第２マトリックスが異なる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが同一である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが異なる、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
該方法がさらに、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
第３マトリックスが第１および第２マトリックスと異なる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
第３マトリックスが第１および第２マトリックスのいずれか１つと同一である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアと異なる、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアの１つと同一である、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法により得られる分化した細胞。
【請求項４２】
分化した細胞を培養して胚様体を形成させる、請求項２８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法により得られる胚様体。
【請求項４４】
幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも７継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性であり、培養物がフィーダー細胞を含まず、各継代間で幹細胞の数が拡張し、幹細胞がヒトもしくは霊長類の胚性幹細胞またはヒトもしくは霊長類の誘導された多分化能性幹細胞である方法。
【請求項４５】
幹細胞をインビトロで培養し、かつ分化させる方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数の第１マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第１マイクロキャリアの表面は第１マトリックス中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性であり、該方法がさらに、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む方法。
【請求項４６】
幹細胞が胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
幹細胞が霊長類またはヒトのものである、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
マイクロキャリアがロッド形である、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
第１マトリックスと第２マトリックスが同一である、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
第１マトリックスと第２マトリックスが異なる、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが同一である、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
第１マイクロキャリアと第２マイクロキャリアが異なる、請求項４５〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
該方法がさらに、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分
化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む、請求項４５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
第３マトリックスが第１および第２マトリックスと異なる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
第３マトリックスが第１および第２マトリックスの１つと同一である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアと異なる、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
第３マイクロキャリアが第１および第２マイクロキャリアの１つと同一である、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
幹細胞をインビトロで分化させる方法であって、多分化能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はマトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む方法。
【請求項５９】
幹細胞が胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
幹細胞が霊長類またはヒトのものである、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
マイクロキャリアがロッド形である、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
マトリックスが、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなる、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、請求項５８〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
マイクロキャリアがプロタミンまたはポリリジンとカップリングしている、請求項５８〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項５８〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、請求項５８〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
マイクロキャリアが親水性である、請求項５８〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
マイクロキャリアが実質的に球形の形状を有する、請求項５８〜６０または６２〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
多能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養する
ことを含み、その際、工程（ｉｉ）の後の培養物中の幹細胞が多能性である方法。
【請求項７３】
工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面がマトリックス中にコートされている、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
さらに、工程（ｉｉ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含む、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
該方法が、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
該方法が、工程（ｉｉ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含む、請求項７２〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
多能性幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも２継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多能性である方法。
【請求項７８】
工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面がマトリックス中にコートされている、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
請求項７２、７３、７７または７８のいずれか１項に記載の方法により得られる多能性幹細胞。
【請求項８０】
さらに、工程（ｉｖ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含む、請求項７７または７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
該方法が、幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
該方法が、工程（ｉｖ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養
する工程を含む、請求項７７〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
さらに、多能性幹細胞の分化を含む方法であって、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
請求項７４〜８３のいずれか１項に記載の方法により得られる分化した細胞。
【請求項８５】
多能性幹細胞をインビトロで培養し、かつ分化させる方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数の第１マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し；
（ｉｉ）マイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも２継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多能性であり、該方法がさらに、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する
ことを含む方法。
【請求項８６】
工程（ｉ）においてマイクロキャリアの表面が第１マトリックス中にコートされている、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
幹細胞をインビトロで分化させる方法であって、多能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず、そしてマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養することを含む方法。
【請求項８８】
幹細胞が成体幹細胞、または多分化能性幹細胞に由来する多能性幹細胞である、請求項７２〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
マイクロキャリアがロッド形である、請求項７２〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
マトリックスが細胞外マトリックス成分を含む、請求項７２〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、請求項７２〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、および
エンタクチン１の混合物を含む、請求項７２〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、あるいはそれらからなる、請求項７２〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
マイクロキャリアがマクロ多孔質またはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、請求項７２〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項７２〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、請求項７２〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
工程（ｉｉ）において、培養物中の幹細胞の数を拡張させるのに十分な期間、幹細胞を培養する、請求項７２〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）の幹細胞がその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる、請求項７７〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
工程（ｉｖ）において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも３継代、少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代のいずれか反復する、請求項７７〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
霊長類またはヒトの幹細胞の伝播および／または分化のための、マトリックス中にコートされたマイクロキャリアの使用であって、マイクロキャリアがＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＤＥ−５３（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＱＡ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）、ＴＳＫｇｅｌ
Ｔｒｅｓｙｌ−５Ｐｗ（東ソー）またはＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０（東ソー）、ＳＭ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）およびＳＨ１０１０（Ｂｌｕｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）から選択される使用。
【請求項１０１】
マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸のうち１以上を含む、請求項１００に記載の使用。
【請求項１０２】
マトリックスが、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン１の混合物を含む、請求項１００に記載の使用。
【請求項１０３】
多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロ懸濁培養において成長および／または分化させる際に使用するのに適切なマイクロキャリアであって、マイクロキャリアがセルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、またはコラーゲンのうち１以上を
含み、マイクロキャリアが細長い形状を有し、約２０００μｍ未満の最長寸法および約１０μｍより大きい最短寸法を有し、マイクロキャリアの表面がマトリックス中にコートされ、１個または複数の多分化能性細胞または多能性細胞がマトリックスコーティングに付着しているマイクロキャリア。
【請求項１０４】
マイクロキャリアがロッド形である、請求項１０３に記載のマイクロキャリア。
【請求項１０５】
マトリックスコーティングが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニンまたはフィブロネクチンのうち１以上を含む、請求項１０３または１０４に記載のマイクロキャリア。
【請求項１０６】
細胞が多分化能性細胞である、請求項１０３〜１０５のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
【請求項１０７】
多分化能性細胞が霊長類もしくはヒトの胚性幹細胞または誘導された多分化能性幹細胞である、請求項１０３〜１０６のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
【請求項１０８】
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項１０３〜１０７のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
【請求項１０９】
マイクロキャリアが表面陽電荷を有する、請求項１０３〜１０８のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
【請求項１１０】
５０μｍ〜４００μｍの最長寸法を有する、請求項１０３〜１０９のいずれか１項に記載のマイクロキャリア。
【請求項１１１】
それに多分化能性細胞または多能性細胞が付着したそれぞれ請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載の２以上のマイクロキャリアを含む、集合体。
【請求項１１２】
多分化能性または多能性の状態を有する新たな細胞を生成するための多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロでの培養における、請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載のマイクロキャリアの使用。
【請求項１１３】
多分化能性細胞または多能性細胞のインビトロ分化における、請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載のマイクロキャリアの使用。
【請求項１１４】
多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロで培養して多分化能性または多能性の状態を有する新たな細胞を生成する方法であって、多分化能性または多能性の状態を有する新たな細胞を生成するのに適切な条件下で請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載のマイクロキャリアを培養することを含む方法。
【請求項１１５】
多分化能性細胞または多能性細胞をインビトロで分化させる方法であって、多分化能性細胞または多能性細胞の分化を誘導する条件下で請求項１０３〜１１０のいずれか１項に記載のマイクロキャリアを培養することを含む方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１８】
【図１９】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２３】
【図２４】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２６Ｃ】
【図２７】
【図３３】
【図３４Ａ】
【図３４Ｂ】
【図３５】
【図３８】
【図４１−１】
【図４１−２】
【図４３Ａ】
【図４３Ｂ】
【図４４−１】
【図４４−２】
【図４６Ａ】
【図４６Ｂ】
【図４８Ａ】
【図４８Ｂ】
【図４９】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図８５】
【図８６】
【図８７】
【図８８】
【図８９】
【図９０】
【図９１】
【図９３】
【図９４】
【図９５】
【図９７】
【図９８】
【図９９】
【図１００】
【図１０５】
【図１０６】
【図１０７】
【図１０８】
【図１０９】
【図１１３】
【図１１４】
【図１１７】
【図１１８】
【図１１９】
【図１２１】
【図１２２】
【図１２５】
【図１２６】
【図１２７】
【図１３２】
【図１３３】
【図１３４】
【図１３５】
【図１３６】
【図１３７】
【図１３８】
【図１４１】
【図１４２】
【図１４３】
【図１４４】
【図１４５】
【図１４６】
【図１４７】
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【図１４９】
【図１５０】
【図１５１】
【図１５２】
【図１５３】
【図１５４】
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【図１５６】
【図１５７】
【図１５９】
【図１６０】
【図１６１】
【図１６３】
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【図１６７】
【図１６９】
【図１７０】
【図１７１】
【図１７２】
【図１７３】
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【図１７９】
【図１８０】
【図１８１】
【図１８２】
【図１８３】
【図１８４】
【図１８５】
【図１８７】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図９】
【図１０Ｂ】
【図２０】
【図２２】
【図２５】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３６−１】
【図３６−２】
【図３７】
【図３９−１】
【図３９−２】
【図４０】
【図４２】
【図４５】
【図４７Ａ】
【図４７Ｂ】
【図５０】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図７２】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図８３】
【図８４】
【図９２】
【図９６】
【図１０１】
【図１０２】
【図１０３】
【図１０４】
【図１１０】
【図１１１】
【図１１２】
【図１１５】
【図１１６】
【図１２０】
【図１２３】
【図１２４】
【図１２８】
【図１２９】
【図１３０】
【図１３１】
【図１３９】
【図１４０】
【図１５８】
【図１６２】
【図１６４】
【図１６６】
【図１６８】
【図１８６】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図１０Ａ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１８】
【図１９】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２３】
【図２４】
【図２６Ａ】
【図２６Ｂ】
【図２６Ｃ】
【図２７】
【図３３】
【図３４Ａ】
【図３４Ｂ】
【図３５】
【図３８】
【図４１−１】
【図４１−２】
【図４３Ａ】
【図４３Ｂ】
【図４４−１】
【図４４−２】
【図４６Ａ】
【図４６Ｂ】
【図４８Ａ】
【図４８Ｂ】
【図４９】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７９】
【図８０】
【図８１】
【図８２】
【図８５】
【図８６】
【図８７】
【図８８】
【図８９】
【図９０】
【図９１】
【図９３】
【図９４】
【図９５】
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【図１００】
【図１０５】
【図１０６】
【図１０７】
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【図１０９】
【図１１３】
【図１１４】
【図１１７】
【図１１８】
【図１１９】
【図１２１】
【図１２２】
【図１２５】
【図１２６】
【図１２７】
【図１３２】
【図１３３】
【図１３４】
【図１３５】
【図１３６】
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【図１４１】
【図１４２】
【図１４３】
【図１４４】
【図１４５】
【図１４６】
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【図１４８】
【図１４９】
【図１５０】
【図１５１】
【図１５２】
【図１５３】
【図１５４】
【図１５５】
【図１５６】
【図１５７】
【図１５９】
【図１６０】
【図１６１】
【図１６３】
【図１６５】
【図１６７】
【図１６９】
【図１７０】
【図１７１】
【図１７２】
【図１７３】
【図１７４】
【図１７５】
【図１７６】
【図１７７】
【図１７８】
【図１７９】
【図１８０】
【図１８１】
【図１８２】
【図１８３】
【図１８４】
【図１８５】
【図１８７】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図９】
【図１０Ｂ】
【図２０】
【図２２】
【図２５】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３６−１】
【図３６−２】
【図３７】
【図３９−１】
【図３９−２】
【図４０】
【図４２】
【図４５】
【図４７Ａ】
【図４７Ｂ】
【図５０】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図７２】
【図７６】
【図７７】
【図７８】
【図８３】
【図８４】
【図９２】
【図９６】
【図１０１】
【図１０２】
【図１０３】
【図１０４】
【図１１０】
【図１１１】
【図１１２】
【図１１５】
【図１１６】
【図１２０】
【図１２３】
【図１２４】
【図１２８】
【図１２９】
【図１３０】
【図１３１】
【図１３９】
【図１４０】
【図１５８】
【図１６２】
【図１６４】
【図１６６】
【図１６８】
【図１８６】
【公開番号】特開２０１２−１４７７９３（Ｐ２０１２−１４７７９３Ａ）
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−７９８７３（Ｐ２０１２−７９８７３）
【出願日】平成２４年３月３０日（２０１２．３．３０）
【分割の表示】特願２０１１−５００７４４（Ｐ２０１１−５００７４４）の分割
【原出願日】平成２１年３月１７日（２００９．３．１７）
【出願人】（５０３２３１８８２）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (179)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年３月３０日（２０１２．３．３０）
【分割の表示】特願２０１１−５００７４４（Ｐ２０１１−５００７４４）の分割
【原出願日】平成２１年３月１７日（２００９．３．１７）
【出願人】（５０３２３１８８２）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (179)
【Ｆターム（参考）】
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