微生物検出用抗体
【課題】種特異的であり、かつ同一種内のすべての血清型を検出できる微生物検出用抗体とその作製法、微生物検出方法及び微生物検出用試薬キットを提供する。
【解決手段】各種の微生物について細胞内の同一機能分子、特にリボソーム蛋白質、とりわけリボソーム蛋白質Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体であって、対象微生物に特異的に反応する抗体。この抗体を用いて微生物を検出する。医薬工業品、特に細菌を中心とする微生物感染症のための診断薬として有用である。
【解決手段】各種の微生物について細胞内の同一機能分子、特にリボソーム蛋白質、とりわけリボソーム蛋白質Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体であって、対象微生物に特異的に反応する抗体。この抗体を用いて微生物を検出する。医薬工業品、特に細菌を中心とする微生物感染症のための診断薬として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の微生物、特に細菌の検出に有用な抗体、それを用いた微生物検出方法、微生物検出用試薬キット及び微生物検出用特異的抗体の作製法に関する。
本発明は、医薬品工業、特に細菌を中心とする微生物感染症のための診断薬の製造に有効に利用される。
【背景技術】
【０００２】
微生物感染症の診断は通常感染部位などでの原因菌の検出か、血清、体液中の原因菌に対する抗体の検出により確定される。特に、この診断は原因菌の検出が患者への迅速な治療を可能にする意味で重要である。
感染症原因菌の検出には原因菌の分離培養を経て、その生化学的性状をもとに菌の同定を行う培養同定法、原因菌特異的遺伝子をもとにＰＣＲ法などにより増幅し検出する遺伝子診断法、原因菌の表面抗原マーカーとの抗体の特異反応を利用して原因菌検出を行う免疫的手法に大別できるが、培養同定法、遺伝子診断法は検出結果を得るまでに時間がかかり、短時間にしかも高感度に原因菌を検出し、迅速かつ適切な患者への治療につながる点で免疫法による診断が汎用されている。
従来免疫法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体の組み合わせが使われている。
例えばクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属の場合、属特異的抗原であるリポ多糖（ＬＰＳ）の抗原決定基としての存在が知られており（非特許文献１：Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｒ．ら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２８：１０８３−８９，１９８２、Ｃａｌｄｗｅｌｌ．Ｍ．Ｄ．：Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．，４４：３０６−１４，１９８４）、様々な診断用キットにおいて特にクラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の検出用試薬抗体に利用されている。
また、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属の外膜主要蛋白質（ＭＯＭＰ；Ｍａｊｏｒ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）に対するモノクローナル抗体についてＥｌｌｅｎａ Ｍ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５９（１１），４１４７−４１５３，１９９１（非特許文献２）及びＢｙｒｏｎ Ｅ．Ｂａｔｔｅｉｇｅｒら：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５３（３），５３０−５３３，１９８６（非特許文献３）がそれぞれ報告している。
特開昭６３−２９８号公報（特許文献１）は、約４３キロダルトンのマイコプラズマ ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の膜抗原蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法をベースとする免疫検出法が記載されている。
また、特開昭６２−１４８８５９号公報（特許文献２）（特公平６−６４０６５号公報）には、ヘモフイルス インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｏｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の外膜蛋白質に対するポリクローナル抗体の作製法と作製した抗体を用いた診断方法について記載されている。
英国特許出願２１７２７０４号明細書（特許文献３）には、ナイセリア ゴノロエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）株ＢＳ４（ＮＣＴＣ １１９２２）の外膜小胞のコール酸ナトリウム抽出液から単離された約２０キロダルトンの蛋白質について記載されており、この物質を用いてハイブリドーマを調製することが開示されており、またＥＰ ４１９２３８Ａ１号（特許文献４）にはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ培養菌体を免疫源として作製され、約１４キロダルトンの蛋白質に結合可能なモノクローナル抗体とその作製方法について記載されている。また、同じＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅについてカナダ特許出願１２２０１４７号明細書（特許文献５）にはＬＰＳに対するモノクローナル抗体を用いる検出法について記載されている。
しかし、これらの抗体および検出法では、微生物に対する種特異性が十分ではなく、また同一種に存在する複数の表面抗原による血清型の全てをカバーし検出することが困難であるなどの問題点がある。
またこれらの従来の技術に用いられているマーカー抗原は各種微生物細胞において普遍的に存在する同一機能分子（例えば、同一機能の蛋白質、ＬＰＳあるいは表面多糖成分）が微生物の進化の過程で菌種ごとに変化してきた分子をマーカーとして検出するというような統一的なものでなく、１つの分子を基準として菌種間で抗原性の差を検出しようという発想に基づいた免疫診断法はいまだに知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６３−２９８号公報
【特許文献２】特開昭６２−１４８８５９号公報
【特許文献３】英国特許出願２１７２７０４号明細書
【特許文献４】ＥＰ ４１９２３８ Ａ１号
【特許文献５】カナダ特許出願１２２０１４７号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｒ．ら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２８：１０８３−８９，１９８２、Ｃａｌｄｗｅｌｌ．Ｍ．Ｄ．：Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．，４４：３０６−１４，１９８４
【非特許文献２】Ｅｌｌｅｎａ Ｍ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５９（１１），４１４７−４１５３，１９９１
【非特許文献３】Ｂｙｒｏｎ Ｅ．Ｂａｔｔｅｉｇｅｒら：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５３（３），５３０−５３３，１９８６
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、理想的な微生物の検出・免疫診断法を可能とする統一マーカー抗原としてそれぞれの微生物について同一の分子に対する抗体、特に検出したい全ての微生物について細胞内の同一機能成分分子を用いて微生物の進化の過程で変化が生じてきた部分に対する抗体、該抗体を用いた特異的でかつほぼ全ての血清型をカバーできる微生物検出方法、微生物検出用試薬キット及び微生物検出用特異抗体の作製方法を提供しようとするものである。
【０００６】
本発明者らは、全ての微生物において同一の機能が保存されている蛋白質を有用な抗原蛋白質として見出した。通常、このような蛋白質の構造変化は極めて少ないと予想される。しかし驚くべきことに、該蛋白質の抗原エピトープは微生物の種あるいは属特異的であり、該蛋白質に対する抗体は、微生物の種あるいは属特異的な識別に用いることが可能な多様性を持つと共に、対象となる微生物についてはその全ての血清型を検出しうるものであることが見出されたのである。
【０００７】
本発明者らは全ての微生物細胞に存在し、しかもそのアミノ酸構造が微生物間である程度の相違点をもつ細胞内分子、特にリボソーム蛋白質の一種であるリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２）に着目した。Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２は蛋白質合成に必須なリボソーム蛋白質としてその存在が知られている分子量約１３キロダルトンの蛋白質であり、特に大腸菌、枯草菌などいくつかの微生物でその全アミノ酸配列の解析が進んでおり、微生物間で５０％〜６５％程度のアミノ酸配列の相同性が確認されている。
【０００８】
本発明者らはこの分子が微生物間で類似しているにもかかわらずその一部に各微生物固有のアミノ酸配列等の構造部分を持つことに着目し、該蛋白質に対する抗体を利用することで様々な微生物に特異的でかつ同一菌種内の全ての血清型について検出が可能であることを見いだした。具体的には例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、ストレプトコッカス ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅについてその特異抗体を用いた微生物種の免疫法診断技術の開発を試みた結果、個々の微生物において当該蛋白質特異的な抗体が取得でき、当該抗体を用いることによりそれぞれの菌について特異的な検出が可能であるということを見いだしたことにより本発明を完成した。
【０００９】
従って本発明は、次のとおりの微生物検出用抗体、それを用いる微生物検出方法及び微生物検出用試薬キット及び微生物検出用特異的抗体の作製法に関する。
１）微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体であって、当該微生物に特異的に反応する抗体、
２）微生物のリボソーム蛋白質がＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２である、１）に記載の抗体、
３）微生物が性行為感染症（ＳＴＤ，Ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）原因微生物である１）または２）に記載の抗体、
４）微生物が呼吸器系感染症の原因微生物である１）または２）に記載の抗体、
５）呼吸器系感染症の原因微生物のがＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅである４）に記載の抗体、
６）呼吸器系感染症の原因微生物がＳｔｒｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである４）に記載の抗体、
７）性行為感染症（ＳＴＤ，Ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）微生物がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅである３）に記載の抗体、
８）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体であって、配列表配列番号：２２のアミノ酸配列において１１５番目のアラニンを含む５から３０アミノ酸の長さの連続する部分アミノ酸配列を認識する抗体である７）に記載の抗体、
９）各種の微生物について同一機能の細胞内分子に対する抗体を用いる微生物検出方法、
１０）各種の微生物について１）から８）のいずれかに記載の抗体を用いる微生物検出方法、
１１）各種の微生物について同一機能の細胞内分子に対する抗体を用いる微生物検出用試薬キット、
１２）各種の微生物について１）から８）のいずれかに記載の抗体を用いる微生物検出用試薬キット、
１３）遺伝子操作手法によりあるいは微生物からの単離精製により得られた微生物のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質、その部分ペプチド、またはその部分ペプチドに相当する合成ペプチドを免疫源とする１）から８）のいずれかに記載の抗体の作製方法。
【００１０】
以下本発明について詳細に説明する。
配列表において配列番号１及び２はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号３及び４はヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号５及び６はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号７及び８はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号９及び１０はナイセリア メニンギチヂス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号１１及び１２はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の取得に用いたＰＣＲのプライマーＤＮＡである。配列番号１３及び１４はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の取得に用いたＰＣＲのプライマーＤＮＡである。配列番号１５及び１６はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の取得に用いたＰＣＲのプライマーＤＮＡである。配列番号１７及び１８はＨａｅｍｏｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅから取得したＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号１９及び２０はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから取得したＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号２１及び２２はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅから取得したＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。
【００１１】
なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端および右端はそれぞれアミノ基（以下、Ｎ末）およびカルボキシル基末端（以下、Ｃ末）であり、また塩基配列の左端および右端はそれぞれ５'末端および３'末端である。
【００１２】
また、本発明で述べられる遺伝子操作の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書の記載方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）を挙げることができる。
【００１３】
本発明において微生物は、細菌、酵母、カビ、放線菌、リケッチア類などの微生物類全般をさすが、特に微生物感染症の診断において問題となるのは細菌の場合が多い。
本発明において、「微生物に特異的に反応する抗体」とは、微生物の種あるいは属に特異的に反応する抗体をさすが、微生物感染症の診断においては微生物の種に特異的に反応する抗体が特に有用となる。
【００１４】
本発明において、ＳＴＤの原因微生物とは、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、梅毒菌（Ｔｔｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ウレアプラズマ菌（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）などをさすがこれらの微生物に限定されるものではない。
【００１５】
本発明において、呼吸器系感染症の原因微生物とは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎かん菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ａ群溶連菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧｒｏｕｐＡ）結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、レジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、アスペルジルス属真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）などをさすがこれらの微生物に限定されるものではない。
【００１６】
本発明において抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をさし、該リボソーム蛋白質の全長あるいはその部分ペプチドを用いて作成することができる。抗体を作成するためのペプチドの長さは特に限定されないがＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体の場合、この蛋白質を特徴づけられる長さがあれば良く、好ましくは５アミノ酸以上、特に好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いれば良い。このペプチドあるいは全長蛋白質をそのまま、またはＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ−ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）やＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）といったキャリア蛋白質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、ハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得ることも可能であるが、この場合はマウスが好ましい。また該蛋白質の全長またはアミノ酸５残基以上、望ましくは８残基以上の部分ペプチドをＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）などと融合させたものを精製して、または未精製のまま、抗原として用いることもできる。成書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて、細胞に発現させた遺伝子組み換え抗体によっても作製することができる。
本発明のマーカー抗原として用いることができるＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体は、以下の３つの方法あるいはその他の類似の方法によって取得することができるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００１７】
ａ）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の遺伝子配列およびアミノ酸配列が既知の微生物については、他の微生物における該蛋白質のアミノ酸配列との類似性が少ない領域についてアミノ酸数５個から３０個ほどのペプチド断片を合成し、それを免疫原としてポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を作製することにより目的の抗体を取得することができる。
【００１８】
また、既知の該遺伝子の両端部位におけるＤＮＡ配列をプローブとしたＰＣＲ手法による遺伝子増幅、相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該遺伝子の全長配列を取得することができる。
【００１９】
その後他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティーカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の全長蛋白質が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２０】
ｂ）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列が未知の微生物については１つにはＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列が菌種間で５０〜６０％相同であることより、そのアミノ酸配列の相同部分の配列を基にしてＰＣＲ法による特定配列部分の遺伝子増幅や相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該蛋白質遺伝子を容易に取得することができる。
【００２１】
その後他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティーカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の全長蛋白質が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２２】
ｃ）あるいはＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列が未知な場合の別な方法として、既知のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列のうち微生物間で保存されている共通配列部分に相当する５〜３０アミノ酸の合成ペプチドを作製し、そのペプチド配列に対し公知の方法でポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を作製し、該抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトによって目的の微生物細胞破砕液を精製することにより高度に精製されたＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を取得することができる。
【００２３】
蛋白質の精製度が不足している場合は公知の精製手法であるイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過などの手法により精製した後作製した抗体によるウェスタンブロットなどの方法によりＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の溶出画分を同定し精製蛋白質を得ることができる。得られた精製Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗原を基にして公知の方法によりハイブリドーマあるいはポリクローナル抗体を取得しｂ）と同様に目的の微生物に特異的に反応するハイブリドーマあるいはポリクローナル抗体を選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２４】
前記ａ）〜ｃ）などの方法によって取得した本発明における各種微生物特異的な抗体は例えばポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用することにより種々の目的の微生物に特異的な検出用試薬キットを提供することができる。
【００２５】
抗体を用いる微生物検出方法とは、例えばポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともにｃａｐｔｕｒｅ抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなどの既知の免疫測定手法を利用する検出方法に相当する。
【００２６】
また、特に抗体を用いる有用な微生物検出方法として特表平７−５０９５６５号公報に記載されているシリコン、窒化珪素などにより形成された光学薄膜上で抗体反応をおこない光干渉原理等により検出するいわゆるオプティカルイムノアッセイ（ＯＩＡ，Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などが高感度な検出方法として有用である。
【００２７】
また該検出方法において必要となる微生物からの細胞内マーカー抗原の抽出方法としては、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ツイーン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）をはじめとする種々の界面活性剤を用いた抽出試薬による処理法、適当なプロテアーゼなどの酵素を用いる酵素処理法、物理的方法による微生物細胞の破砕をはじめ既知の細胞構造の破砕手法が用いられうるが、界面活性剤等の組み合わせにより微生物ごとに試薬による最適な抽出条件を設定することが望ましい。
【００２８】
また、本発明における、抗体を用いる微生物検出用試薬キットとは、当該検出方法を用いた検出用試薬キットに相当する。
【００２９】
例えば、肺炎、気管支炎、髄膜炎などの原因菌として診断意義の高いＨａｅｍｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの特異的抗体を取得する場合、本菌のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列はデータベース等の記載により公知である。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を配列表配列番号：１及び２に示す。
【００３０】
従って本菌の場合同様にＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のアミノ酸配列が公知である、例えば配列表配列番号：３及び４に示すＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの同蛋白質などとのアミノ酸配列を比較しその相同性の低い部分について５〜３０アミノ酸の合成ペプチドを合成しそのペプチドに対するＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ特異的なポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を作製することができる。
【００３１】
特にポリクローナル抗体の場合、免疫した動物の抗血清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム等で精製しＩｇＧ画分を取得した後、さらに動物の免疫に用いた合成ペプチドによるアフィニティー精製を実施することが望ましい。
【００３２】
さらにＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＤＮＡ配列からＮ末端、Ｃ末端の配列を元にしたＰＣＲプライマー、例えば配列表配列番号：１１及び１２に示すＰＣＲプライマーを設計し、その相同性を利用して、公知の方法に従い、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの培養菌体より抽出したゲノムＤＮＡを材料としてＰＣＲ法などにより増幅してくるＤＮＡ断片を取得し、その断片のＤＮＡシークエンス情報を解析することによりＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の全長遺伝子を取得することができる。
【００３３】
取得したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子は、例えばＧＳＴなどとフュージョン蛋白質遺伝子を構成し、適当な発現用プラスミドを用いて発現ベクターを構築後、大腸菌等を形質転換して該蛋白質を大量発現させうる。形質転換した大腸菌を適当量培養し、回収した菌体破砕液をＧＳＴを用いたアフィニティカラムで精製することにより、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質とＧＳＴとのフュージョン蛋白質が得られる。この蛋白質をそのまま、あるいはＧＳＴ部分をプロテアーゼなどにより切断後、抗原蛋白質として公知の手法により、複数のハイブリドーマを確立し、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌体あるいは菌体破砕液またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に特異的な反応を示す抗体を選択することにより目的の特異的モノクローナル抗体を取得することも可能である。
【００３４】
またＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅと同様に呼吸器感染症原因菌として診断意義の高いＳｔｒｅｐｕｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについてもＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列はデータベース等の記載により公知である。Ｓｔｒｅｕｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を配列表配列番号：５及び６に示す。
【００３５】
従って本菌の場合もＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの場合と同様にＳｔｒｅｕｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＤＮＡ配列からＮ末端、Ｃ末端の配列を元にしたＰＣＲプライマー、例えば配列表配列番号：１３及び１４に示すＰＣＲプライマーを設計し、以後全く同様の手法を用いてＳｔｒｅｕｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的なポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を取得することが可能である。
【００３６】
Ｓｔｒｅｕｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＡＭＳＰ−２を日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年７月２８日に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６８０７として国際寄託した。
【００３７】
また例えば淋病の原因菌でありＳＴＤの代表的な原因菌としてその診断意義が認知されているＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの場合、そのＤＮＡ、アミノ酸配列の大部分は最近米国オクラホマ大学でＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムプロジェクトにおいて決定され、該菌のＤＮＡ配列がインターネット上で公開されている。
【００３８】
公知のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＤＮＡ配列の一部配列を用いて類似配列ＤＮＡ断片の有無を検索したところＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子に該当するＤＮＡ配列が存在し、その全ＤＮＡ配列情報を取得できた。このＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列表配列番号：７及び８に示す。
【００３９】
従ってＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅとＳｔｒｅｐｕｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの場合と同様にＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＤＮＡ配列からＮ末端、Ｃ末端の配列を元にしたＰＣＲプライマー、例えば配列表配列番号：１５及び１６に示すＰＣＲプライマーを設計し、以後全く同様の手法によりＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質全部あるいは一部を抗原とするＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ特異的な目的の抗体を得ることが可能である。
【００４０】
特に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅについては同じＮｅｉｓｓｅｒｉａ属に属するＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の蛋白質遺伝子に該当する遺伝子配列がインターネット上で公開されており容易に入手可能である。このＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の全塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列表配列番号：９及び１０に示す。ここでＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅとＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の全塩基配列を比較するとアミノ酸配列の異なる部分はＮ末端から１１５番目のアミノ酸がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅはアラニンであるのに対してＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの場合はグルタミン酸であるただ１個のアミノ酸の違いだけである。従って、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを種特異的に検出することができるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗体は該当するＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＮ末端から１１５番目のアラニン及びそれを含むアミノ酸領域をエピトープとして認識する抗体であると断定できる。
【００４１】
本発明に基づき作製された抗体は、公知の測定手法であるポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともにｃａｐｔｕｒｅ抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用できる。
【００４２】
また本発明に基づき作製された抗体は全ての免疫測定手法において当該抗原蛋白質を固相あるいは液相中で捕獲するｃａｐｔｕｒｅ抗体として機能しうると同時にパーオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を公知の方法により修飾することによりいわゆる酵素標識抗体としても機能しうる。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下の例は本発明を具体的に説明するためのものであって本発明について何らその範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４４】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のクローニング
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＡＴＣＣ９３３４（ＩＩＤ９８４）株（東京大学医科学研究所より分譲、購入）をチョコレート寒天培地上に適当量植菌した後、ＣＯ2インキュベーター中で３７℃、ＣＯ2０．５％条件で２４時間培養する。生育したコロニーを最終的に５×１０9ＣＦＵ／ｍｌ前後になるようにＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ（和光純薬工業社製）に懸濁する。このうち約１．５ｍｌを微量遠心チューブに移し取り１００００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを棄てる。沈殿部分を５６７μｌのＴＥＢｕｆｆｅｒに再懸濁する。さらに３０μｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と３μｌの２０ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートする。次に１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液を８０μｌ追添し、よく混合した後６５℃で１０分間インキュベートする。次に、体積比２４／１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を７００μｌ加えよく攪拌する。この溶液を微量遠心機で１２０００ｒｐｍ、５分間（４℃コントロール下）遠心処理した後、水層画分を新しい微量遠心管に移す。そこに０．６倍量のインプロパノールを加えチューブをよく振ってＤＮＡの沈殿を形成する。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移す。
【００４５】
次に１００００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上澄みを静かに除去した後さらに１ｍｌの７０％エタノールを加えて再び５分間遠心する。再び上澄みを除去した後沈殿を１００μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解しＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓのＥ５，Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡに従って定量した。
【００４６】
このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌと配列表配列表番号：１１に示した合成オリゴヌクレオチドＡ及び配列表配列表番号：１２に示したオリゴヌクレオチドＢをそれぞれ２６０ｐｍｏｌ加え、最終容量５０μｌとした。
【００４７】
この混合物を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０を用いて、９５℃ １分、５０℃ ２分、７２℃ ３分を５サイクル行った後、９５℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。さらに制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後、市販のベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に組み込んだ。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりＧＳＴ蛋白質とのフュージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。
【００４８】
具体的には、ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１を大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。
【００４９】
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製はＰＲＩＳＭ，Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。０．５ｍｌ容のマイクロチューブに９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの０．８ｐｍｏｌ／μｌのＴ７プロモータープライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）および６．５μｌの０．１６μｇ／μｌのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μｌのミネラルオイルを重層後、９６℃３０秒、５５℃１５秒および６０℃ ４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サイクル行い、４℃で５分間保温した。反応後、８０μｌの滅菌精製水を加えて攪拌し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行った。１００μｌの水層に１０ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および３００μｌのエタノールを加えて攪拌後、室温、１４，０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行い沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで 洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０℃、２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。
【００５０】
得られた５個のクローンの内１個の配列にＰＣＲに用いたプローブと配列の相同性がありさらに他の微生物、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子配列と非常に類似したＤＮＡ配列が見いだされた。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：１７及び１８のような配列であった。この遺伝子断片は、明らかにＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子をコードするものである。
【実施例２】
【００５１】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の大腸菌での大量発現と精製
発現ベクターを組み込んだ大腸菌をＬＢ培地中で５０ｍｌ ３７℃１晩培養した。２倍濃度のＴＹ培地５００ｍｌを３７℃で１時間温めておいた。１晩培養した大腸菌液５０ｍｌを５００ｍｌの前述の培地に入れた。１時間後、１００ｍＭイソプロピルβ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）５５０μｌ入れ４時間培養後回収し、２５０ｍｌずつ遠心チューブにいれて７０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。上澄みを棄てて５０ｍＭトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）ｐＨ７．４、２５％スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）を含むＬｙｓｉｓバッファー２５ｍｌずつに溶解した。
さらに、１０％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）１．２５ｍｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ2１２５μｌを加えてプラステイックチューブに移した。１分間×５回氷冷中でｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを実施し、１２０００ｒｐｍ、１１５分間遠心後上澄みを回収した。
次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でコンディショニングしたグルタチオンアガロースカラムに前記の上澄み液を吸着させた。
次に、２０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．４、４．２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む洗浄液でカラムを２ベッドボリューム分洗浄した。その後５ｍＭのグルタチオンを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ９．６で溶出し、分画したフラクション中の蛋白質含有量を色素結合法（ブラッドフォード法；Ｂｉｏｒａｄ社）で検出し、メインフラクションを取得した。得られた精製ＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の純度は電気泳動法により確認したところ約７５％であり免疫源として充分な純度を確保できた。
【実施例３】
【００５２】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の蛋白質に対するモノクローナル抗体の作製
まずマウスの免疫についてはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗原１００μｇを２００μｌのＰＢＳに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを２００μｌ加え混合、エマルジョン化した後２００μｌを腹腔内に注射した。
さらに、２週間後、４週間後、６週間後に同様のエマルジョン抗原を腹腔内に注射し、さらに１０週間後、１４週間後に２倍濃度の抗原エマルジョン液を腹腔内注射し最終免疫から３日後に脾臓を取り出し、細胞融合に供した。
無菌的に取り出したマウスの脾細胞１０8個に対し骨髄腫細胞２×１０7個をガラスチューブに取り良く混合した後１５００ｒｐｍで５分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
細胞融合に使用した骨髄腫細胞は、ＮＳ−１系の細胞株を用い１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前から０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍｌのＭＣ−２１０、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養後、さらに１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養したものを用いた。混合した細胞サンプルに３７℃に保温した５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を３０ｍｌ加え１５００ｒｐｍで遠心、上澄み除去後３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコールを１ｍｌ加え激しく攪拌しながら２分間処理後、３７℃に保温した１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加え液を滅菌ピペットで吸引、排出しながら約５分間激しく攪拌混合した。
１０００ｒｐｍで５分間遠心、上澄み除去後さらに３０ｍｌのＨＡＴ培地を加え細胞濃度が５×１０6個／ｍｌになるように調整し攪拌均一化後、９６穴プレート型培養プレートに０．１ｍｌずつ分注し７％ＣＯ2条件下、３７℃で培養し、１日目、１週間目、２週間目にＨＡＴ培地を０．１ｍｌずつ加えた。
次に目的の抗体を生産している細胞をスクリーニングするためにＥＬＩＳＡ法による評価を実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質及びＧＳＴ蛋白質をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ濃度で希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応してブロッキングした。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％，ＰＢＳ）で洗浄し、その上に融合細胞の培養液１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した。これに、５００ｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した。
この結果、ＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質にのみ反応しＧＳＴ蛋白質には反応しない陽性ウェルが見いだされＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し２４穴プラスティックプレート中、ＨＡＴ培地で培養した。培養した融合培地を細胞数が約２０個／ｍｌになるようにＨＴ培地で希釈し５０μｌを、ＨＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０6個と９６穴培養プレート中で混合後、７％ＣＯ2条件下、３７℃で２週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を前述のＥＬＩＳＡ法にて同様に検定し、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質との反応陽性の細胞を回収した。
さらに、同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマＨＩＲＢ−１〜５の計５クローンを取得した。
【実施例４】
【００５３】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と反応するモノクローナル抗体のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよび他の微生物との反応試験
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法に従ってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的にはＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ入り）を用いて継代培養した細胞をあらかじめ２週間前に０．５ｍｌのプリスタンを腹腔内に注射したＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内に５×１０6個（ＰＢＳ中）注射し、３週間後腹水を回収し、その遠心上澄みを取得した。
取得した抗体含有液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（５ｍｌベッド，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に吸着させ、ＰＢＳで３ベッドボリューム洗浄し、ｐＨ３のクエン酸バッファーで溶出し、抗体フラクションを回収して各ハイブリドーマの生産するモノクローナル抗体を得た。
この５株のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により評価した。
抗体の評価にはサンドイッチアッセイ法を用い、作製したモノクローナル抗体はパーオキシダーゼと化学的に結合させることにより酵素標識抗体として使用した。
すなわち酵素標識は、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。ＥＬＩＳＡ反応においては０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解した市販の抗Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅポリクローナル抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社、ウサギ）を１０μｇ／ｍｌ濃度で希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。
上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％、ＰＢＳ）で洗浄し、その上に各種微生物の培養液に０．３％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により室温で５分間抽出操作をほどこした抗原液を１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去し、さらに洗浄液で洗浄後、５μｇ／ｍｌの各ペルオキシダーゼ標識抗Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し，４５０ｎｍの吸光を測定した。
その結果、表１に示すように酵素標識抗体としてハイブリドーマＨＩＲＢ−２由来のモノクローナル抗体を用いた場合、試験したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの全ての株を１０6個／ｍｌの感度で検出すると同時に他のＮｅｉｓｓｅｒｉａ属やその他の微生物について１０8個／ｍｌの高濃度でも反応性を示さずＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いることでＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。
【００５４】
【表１】
【実施例５】
【００５５】
Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のクローニング、同蛋白質の大腸菌での大量発現と精製および同蛋白質に対するモノクローナル抗体の作製。
Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＩＩＤ５５５株（東京大学医科学研究所より分譲、購入）を血液寒天培地上に適当量植菌した後、インキュベーター中、３７℃で４８時間培養する。生育したコロニーを最終的に５×１０9ＣＦＵ／ｍｌ前後になるようにＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁する。内約１．５ｍｌを微量遠心チューブに移し取り１００００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを棄てる。沈殿部分を５６７μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁する。さらに３０μｌの１０％ＳＤＳと３μｌの２０ｍｇ／ｍｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートする。次に１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液を８０μｌ追添し、よく混合した後６５℃で１０分間インキュベートする。次に、体積比２４／１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を７００μｌ加えよく攪拌する。この溶液を微量遠心機で１２０００ｒｐｍ、５分間（４℃コントロール下）遠心処理した後、水層画分を新しい微量遠心管に移す。そこに０．６倍量のイソプロパノールを加えチューブをよく振ってＤＮＡの沈殿を形成する。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移す。
次に１００００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上澄みを静かに除去した後さらに１ｍｌの７０％エタノールを加えて再び５分間遠心する。再び上澄みを除去した後沈殿を１００μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解しＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒのＥ５，Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡに従って定量した。
このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μｌ，酵素に添付のｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌと配列表配列番号：１３に示した合成オリゴヌクレオチドＣおよび、配列表配列番号：１４に示した合成オリゴヌクレオチドＤをそれぞれ２００ｐｍｏｌを加え、最終容量５０μｌとした。
この混合物を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０を用いて、９５℃ １分、５０℃ ２分、７２℃ ３分を５サイクル行った後、９５℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。さらに制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後、市販のベクターであるｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に組み込んだ。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりＧＳＴ蛋白質とのフュージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。具体的にはベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：５となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、８時間程度３７℃で振とり培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製はＰＲＩＳＭ，Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。０．５ｍｌ容のマイクロチューブに９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの０．８ｐｍｏｌ／μｌのＴ７プロモータープライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）及び６．５μｌの０．１６μｇ／μｌのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μｌのミネラルオイルを重層後、９６℃３０秒、５５℃１５秒および６０℃ ４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サイクル行い、４℃で５分間保温した。反応後、８０μｌの滅菌精製水を加えて攪拌し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行った。１００μｌの水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および３００μｌのエタノールを加えて攪拌後、室温、１４，０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行い沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０℃、２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。
得られた７個のクローンの内１個の配列にＰＣＲに用いたプローブと配列の相同性がありさらに他の微生物、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子配列と非常に類似したＤＮＡ配列が見いだされた。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：１９及び２０のような配列であった。この遺伝子断片は、明らかにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子をコードするものである。
発現ベクターを組み込んだ大腸菌を２倍濃度のＹＴ培地中で５０ｍｌ ３７℃１晩培養した。２倍濃度のＹＴ培地４５０ｍｌを３７℃で１時間温めておいた。１晩培養した大腸菌培養液５０ｍｌを４５０ｍｌの前述の培地に入れた。３７℃１時間培養後、５００ｍＭのＩＰＴＧを１００μｌ入れ、２５℃ ４時間培養後回収し、２５０ｍｌずつ遠心チューブにいれて５０００ｒｐｍ、２０分遠心した。上澄みを棄てて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、２５％ Ｓｕｃｒｏｓｅを含むＬｙｓｉｓバッファー２５ｍｌずつに溶解した。
さらに１０％ ＮＰ−４０ １．２５ｍｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ2 １２５μｌを加えてプラステイックチューブに移した。１分間×５回氷冷中でｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを実施し、１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心後上澄みを回収した。
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カラムに前記の上澄み液を吸着させた。次にＰＢＳでカラムを３ベットボリューム分洗浄した。その後１０ｍＭのグルタチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ８．０で溶出し、分画したフラクション中の蛋白質含有量を色素結合法（ブラッドフォード法；ＢｉｏＲａｄ社）で検出し、メインフラクションを取得した。メインフラクションを３Ｌ ＰＢＳに対して３回透析を行った。
得られたＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の１ｍｇ／ｍｌ溶液１０ｍｌに５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴを含むＣｌｅａｖａｇｅバッファー１ｍｌを加え、さらに２ｕ／μｌのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を１００μｌ添加して４℃で反応させることによりＧＳＴ部分をＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質部分から切り離した。
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロースカラムに反応液を通し、通過液を回収し、さらにＰＢＳを１ベッドボリューム流し、これも回収した。取得した精製Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の純度は電気泳動法により確認したところ約９０％であり免疫源として充分な純度を確保できた。
まずマウスの免疫についてはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗原１００μｇを２００μｌのＰＢＳに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを２００μｌ加え混合、エマルジョン化した後２００μｌを腹腔内に注射した。さらに２週間後、４週間後、６週間後に同様のエマルジョン抗原を腹腔内に注射し、さらに１０週間後、１４週間後に２倍濃度の抗原エマルジョン液を腹腔内注射し最終免疫から３日後に脾臓を取り出し、細胞融合に供した。
無菌的に取り出したマウスの脾細胞１０8個に対し骨髄腫細胞２×１０7個をガラスチューブに取り良く混合した後１５００ｒｐｍで５分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
細胞融合に使用した骨髄腫細胞はＮＳ−１系の細胞株を用い１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前から０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍｌのＭＣ−２１０、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養後、さらに１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養したものを用いた。混合した細胞サンプルに３７℃に保温した５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を３０ｍｌ加え１５００ｒｐｍで遠心、上澄み除去後３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコールを１ｍｌ加え激しく攪拌しながら２分間処理後、３７℃に保温した１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加え液を滅菌ピペットで吸引、排出しながら約５分間激しく攪拌混合した。
１０００ｒｐｍで５分間遠心、上澄み除去後さらに３０ｍｌのＨＡＴ培地を加え細胞濃度が５×１０6個／ｍｌになるように調整し攪拌均一化後、９６穴プレート型培養プレートに０．１ｍｌずつ分注し７％ＣＯ2条件下、３７℃で培養し、１日目、１週間目、２週間目にＨＡＴ培地を０．１ｍｌずつ加えた。
次に目的の抗体を生産している細胞をスクリーニングするためにＥＬＩＳＡ法による評価を実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したＳｔｒｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を１０μｇ／ｍｌ濃度に希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％、ＰＢＳ）で洗浄し、その上に融合細胞の培養液１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５０ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した。
この結果Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に反応する陽性ウェルが見いだされＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し２４穴プラスティックプレート中、ＨＡＴ培地で培養した。培養した融合培地を細胞数が約２０個／ｍｌになるようにＨＴ培地で希釈し５０μｌを、ＨＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０6個と９６穴培養プレート中で混合後、７％ＣＯ2条件下、３７℃で２週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を前述のＥＬＩＳＡ法にて同様に検定し、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質との反応陽性の細胞を回収した。
さらに同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマＡＭＳＰ−１〜４の計４クローンを取得した。
【実施例６】
【００５６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と反応するモノクローナル抗体のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及び他の微生物との反応試験
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的にはＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ入り）を用いて継代培養した細胞を２５ｃｍ2培養フラスコ中で２×１０5個／ｍｌ、３．３×１０5個及び５×１０5個／ｍｌ程度に無血清培地にて希釈し全容を５ｍｌとした。７％ＣＯ2、３７℃で３〜５日間増殖させ、細胞の増殖がみられたフラスコの内、元の細胞数が最も少ないものを選択し、最終的に２×１０5個／ｍｌ希釈のものが３〜４日間で２×１０6個／ｍｌに増殖するようになるまで同様の操作を繰り返し無血清培地に馴化させた。次に細菌培養用９６穴プレート中でクローニングを行い、増殖が早く抗体価の高い細胞を選択した。選択した細胞を２４穴プレートで増殖させたものを２５ｃｍ2培養フラスコ中で２×１０5個／ｍｌ程度となるように無血清培地で希釈し全容１０ｍｌとした。これを７％ＣＯ2、３７℃で３〜４日間培養し１×１０6個／ｍｌまで増殖させた後、７５ｃｍ2培養フラスコにて同様に増殖させ１×１０6個／ｍｌ、１００ｍｌを大量培養用ボトルに移した。これに無血清培地１００ｍｌを加え、攪拌しながら３７℃で２日培養後、無血清培地２００ｍｌ加えさらに２日培養した。この培養液を４本に分け各々１００ｍｌの無血清培地を添加し、２日培養し各々４００ｍｌの無血清培地を添加後さらに約６日培養した後、培養液を回収し１００００ｒｐｍ１５分の遠心により目的とする抗体を含む培養上清を取得した。培養上清は０．１％アジ化ソーダ添加後４℃で保存した。取得した抗体含有液１００ｍｌをＰＢＳで５倍に希釈後ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（５ｍｌベッド，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に吸着させ、ＰＢＳで３ベッドボリューム洗浄し、ｐＨ３のクエン酸バッファーで溶出し、抗体フラクションを回収して各ハイブリドーマの生産するモノクローナル抗体を得た。この４株のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体は特表平７−５０９５６５号公報に記載されているＯＩＡ法により評価した。
すなわちＯＩＡ法は窒化珪素の薄膜層をもつシリコンウエハー上にｃａｐｔｕｒｅ用抗体を反応させた反応用基材を作製し、これに抗原物質すなわち微生物の抽出液を一定時間反応させた後、捕捉された抗原と酵素標識した抗体（増幅試薬）とをさらに反応させ、最後に基質溶液を加えて生じた薄膜沈殿による光干渉色の濃さにより、抗原抗体反応を視覚的に判定できる方法である。
作製したモノクローナル抗体はＯＩＡ法の窒化珪素の薄膜層をもつシリコンウエハー上に固相化するｃａｐｔｕｒｅ抗体として使用し、評価した。またｄｅｔｏｃｔ抗体としては参考例に記載した種々の微生物のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と非特異的に反応しうるＡＭＧＣ−１モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで酵素標識したものを使用した。すなわち酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。
ＯＩＡ反応においては０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中のモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌ濃度に０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０で希釈した液を５０μｌずつ窒化珪素の薄膜層をもつシリコンウエハー上に添加し室温で３０分反応させた後、蒸留水で洗浄した後、使用した。
その上に各種微生物の懸濁液に０．５％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により室温で５分間抽出操作をほどこした抗原液を１５μｌ加え室温で１０分間反応後、２０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ＡＭＧＣ１抗体を１５μｌ加え室温１０分間反応を実施し、蒸留水で洗浄した後、基質溶液（ＫＰＬ社）を１５μｌずつ加え、室温で５分反応し、蒸留水で洗浄後検出シグナルの濃さを光干渉色の強さとして目視で判定した。
その結果表２に示すようにｃａｐｔｕｒｅ抗体としてハイブリドーマＡＭＳＰ−２由来のモノクローナル抗体を用いた場合、試験したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの全ての株を１０個／ｍｌの感度で検出すると同時に他の微生物について１０個／ｍｌの高濃度でも反応性を示さずＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いることでＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＡＭＳＰ−２を日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年７月２８日に受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−６８０７として国際寄託した。
【００５７】
【表２】
【実施例７】
【００５８】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のクローニング、同蛋白質の大腸菌での大量発現、精製および同蛋白質の対するモノクローナル抗体の作製。
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＩＩＤ８２１株（東京大学医科学研究所より分譲、購入）をチョコレート寒天培地上に適当量植菌した後、ＣＯ2インキュベーター中で３７℃、ＣＯ2０．５％条件で２４時間培養した。生育したコロニーを最終的に５×１０9ＣＦＵ／ｍｌ前後になるようにＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁する。そのうち約１．５ｍｌを微量遠心チューブに移し取り１００００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを棄てた。沈殿部分を５６７μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した。さらに、３０μｌの１０％ ＳＤＳと３μｌの２０ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートした。
次に１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液を８０μｌ追添しよく混合した後６５℃で１０分間インキュベートした。次に、体積比２４／１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を７００μｌ加えよく攪拌した。この溶液を微量遠心機で１２０００ｒｐｍ、５分間（４℃コントロール下）遠心処理した後、水層画分を新しい微量遠心管に移した。そこに０．６倍量のイソプロパノールを加えチューブをよく振ってＤＮＡの沈殿を形成した。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃に冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移した。
次に、１００００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上澄みを静かに除去した後さらに１ｍｌの７０％エタノールを加えて再び５分間遠心した。再び上澄みを除去した後沈殿を１００μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解しＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓのＥ５，Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡに従って定量した。このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌとＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅなどの菌のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＤＮＡ配列との類似性によりインターネット情報（オクラホマ大、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムプロジェクト公開ゲノムＤＮＡ情報）より取得したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＤＮＡ配列をもとに設計した配列表配列番号：１５に示した合成ヌクレオチドＥ及び配列表配列番号：１６に示したオリゴヌクレオチドＦをプローブとしてそれぞれ２００ｐｍｏｌを加え、最終容量５０μｌとした。
この混合物を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０を用いて、９５℃ １分、５０℃ ２分、７２℃ ３分を５サイクル行った後、９５℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。さらに制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後、市販のベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に組み込んだ。具体的にはベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１を大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製はＰＲＩＳＭ，Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。０．５ｍｌ容のマイクロチューブに９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの０．８ｐｍｏｌ／μｌのＴ７プロモータープライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）および６．５μｌの０．１６μｇ／μｌのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μｌのミネラルオイルを重層後、９６℃ ３０秒、５５℃ １５秒および６０℃ ４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サイクル行い、４℃で５分間保温した。反応後、８０μｌの滅菌精製水を加えて撹梓し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行った。１００μｌの水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び３００μｌのエタノールを加えて攪拌後、室温、１４０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行い沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０℃、２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。得られた５個のクローンの内１個の配列にＰＣＲに用いたプローブと配列の相同性がありさらに他の微生物、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子配列と非常に類似したＤＮＡ配列が見いだされた。
その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：２１及び２２に示すような配列であった。この遺伝子断片は明らかにＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子をコードするものである。
このように構築したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質発現ベクターを用いて実施例２に記載の方法と同様の方法により精製したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を取得した。
さらに、実施例３記載の方法に従いＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体に生産するハイブリドーマＧＣＲＢ−３株を取得した。
【実施例８】
【００５９】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と反応するモノクローナル抗体のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び他の微生物との反応試験
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞ＧＣＲＢ−３を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ ＦＣＳ入り）を用いて継代培養した細胞をあらかじめ２週間前に０．５ｍｌのプリスタンを腹腔内に注射したＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内に５×１０6個（ＰＢＳ中）注射し、３週間後腹水を回収し、その遠心上澄みを取得した。取得した抗体含有液をＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（５ｍｌベッド，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に吸着させ、ＰＢＳで３ベッドボリューム洗浄し、ｐＨのクエン酸バッファーで溶出し、抗体フラクションを回収してハイブリドーマの生産するモノクローナル抗体を得た。このＧＣＲＢ−３ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により評価した。
抗体の評価にはサンドイッチアッセイ法を用い、作製したモノクローナル抗体はパーオキシダーゼと化学的に結合させることにより酵素標識抗体として使用した。すなわち酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。ＥＬＩＳＡ反応においては０．０５％のアジ化ソーダを含むＰＢＳ中に溶解した市販の抗淋菌ポリクローナル抗体（ヴァイロスタット社、ウサギ）を１０μｇ／ｍｌ濃度で希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。
上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングした。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％、ＰＢＳ）で洗浄し、その上に各種微生物の培養液に０．３％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により室温で５分間抽出操作をほどこした抗原液を１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識抗Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した。
その結果、表３に示すように酵素標識抗体としてハイブリドーマＧＣＲＢ−３由来のモノクローナル抗体を用いた場合、試験したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの全ての株を１０6個／ｍｌの感度で検出すると同時に他のＮｅｉｓｓｅｒｉａ属やその他の微生物について１０8個／ｍｌの高濃度でも反応性を示さずＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いることでＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。
【００６０】
【表３】
【実施例９】
【００６１】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属特異的抗Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質モノクローナル抗体の取得
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＩＩＤ８２１株（東京大学医科学研究所より分譲、購入）をチョコレート寒天培地上に適当量植菌した後、ＣＯ2インキュベーター中、ＣＯ2濃度０．５％条件で３７℃で２４時間培養する。生育したコロニーを最終的に５×１０9ＣＦＵ／ｍｌ前後になるようにＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁する。そのうち約１．５ｍｌを微量遠心チューブに移し取り１００００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを棄てる。沈殿部分を５６７μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁する。さらに３０μｌの１０％ＳＤＳと３μｌの２０ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートする。 次に１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液を８０μｌ追添し、よく混合した後６５℃で１０分間インキュベートする。次に、体積比２４／１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を７００μｌ加えよく攪拌する。この溶液を微量遠心機で１２０００ｒｐｍ、５分間（４℃コントロール下）遠心処理した後、水層画分を新しい微量遠心管に移す。そこに０．６倍量のインプロパノールを加えチューブをよく振ってＤＮＡの沈殿を形成する。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃に冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移す。
次に１００００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上澄みを静かに除去した後さらに１ｍｌの７０％エタノールを加えて再び５分間遠心する。再び上澄みを除去した後沈殿を１００μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解しＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓのＥ５，Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡに従って定量した。
このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μｌ，酵素に添付のｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌと他菌のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＤＮＡ配列との類似性により、インターネット情報（オクラホマ大、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムプロジェクト公開ゲノムＤＮＡ情報）より取得したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＤＮＡ配列をもとに設計した配列表配列番号：１５に示した合成オリゴヌクレオチドＥおよび、配列表配列番号：１６に示した合成オリゴヌクレオチドＦをプローブとしてそれぞれ２００ｐｍｏｌを加え、最終容量５０μｌとした。
この混合物を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０を用いて、９５℃ １分、５０℃ ２分、７２℃ ３分を５サイクル行った後、９５℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。さらに制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後、市販のベクターであるｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に組み込んだ。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりＧＳＴ蛋白質とのフュージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。具体的にはベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：５となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、８時間程度３７℃で振とう培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製はＰＲＩＳＭ，Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。０．５ｍｌ容のマイクロチューブに９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの０．８ｐｍｏｌ／μｌのＴ７プロモータープライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）及び６．５μｌの０．１６μｇ／μｌのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μｌのミネラルオイルを重層後、９６℃ ３０秒、５５℃ １５秒及び６０℃ ４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サイクル行い、４℃ で５分間保温した。反応後、８０μｌの滅菌精製水を加えて攪拌し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行った。１００μｌの水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および３００μｌのエタノールを加えて攪拌後、室温、１４０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行い沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０℃、２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。
得られた４個のクローンの内１個の配列にＰＣＲに用いたプローブと配列の相同性がありさらに他の微生物、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子配列と非常に類似したＤＮＡ配列が見いだされた。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：２１及び：２２のような配列であった。この遺伝子断片は、明らかにＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子をコードするものである。
発現ベクターを組み込んだ大腸菌を２倍濃度のＹＴ培地中で５０ｍｌ ３７℃１晩培養した。２倍濃度のＹＴ培地４５０ｍｌを３７℃で１時間温めておいた。１晩培養した大腸菌培養液５０ｍｌを４５０ｍｌの前述の培地に入れた。３７℃１時間培養後、５００ｍＭのＩＰＴＧを１００μｌ入れ、２５℃４時間培養後回収し、２５０ｍｌずつ遠心チューブにいれて５０００ｒｐｍ、２０分遠心した。上澄みを棄てて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、２５％Ｓｕｃｒｏｓｅを含むＬｙｓｉｓバッファー２５ｍｌずつに溶解した。
さらに１０％ ＮＰ−４０ １．２５ｍｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ2 １２５μｌを加えてプラステイックチューブに移した。１分間×５回氷冷中でｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを実施し、１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心後上澄みを回収した。
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カラムに前記の上澄み液を吸着させた。次にＰＢＳでカラムを３ベットボリューム分洗浄した。その後１０ｍＭのグルタチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ８．０で溶出し、分画したフラクション中の蛋白質含有量を色素結合法（ブラッドフォード法；ＢｉｏＲａｄ社）で検出し、メインフラクションを取得した。メインフラクションを３Ｌ ＰＢＳに対して３回透析を行った。
得られたＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の１ｍｇ／ｍｌ溶液１０ｍｌに５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴを含むＣｌｅａｖａｇｅバッファー１ｍｌを加え、さらに２ｕ／μｌのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を１００μｌ添加して４℃で反応させることによりＧＳＴ部分をＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質部分から切り離した。
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロースカラムに反応液を通し、通過液を回収し、さらにＰＢＳを１ベッドボリューム流し、これも回収した。取得した精製Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の純度は電気泳動法により確認したところ約９０％であり免疫源として充分な純度を確保できた。
まずマウスの免疫についてはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗原１００μｇを２００μｌのＰＢＳに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを２００μｌ加え混合、エマルジョン化した後２００μｌを腹腔内に注射した。さらに２週間後、４週間後、６週間後に同様のエマルジョン抗原を腹腔内に注射し、さらに１０週間後、１４週間後に２倍濃度の抗原エマルジョン液を腹腔内注射し最終免疫から３日後に脾臓を取り出し、細胞融合に供した。
無菌的に取り出したマウスの脾細胞１０8個に対し骨髄腫細胞２×１０7個をガラスチューブに取り良く混合した後１５００ｒｐｍで５分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
細胞融合に使用した骨髄腫細胞はＮＳ−１系の細胞株を用い１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前から０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍｌのＭＣ−２１０、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養後、さらに１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養したものを用いた。混合した細胞サンプルに３７℃に保温した５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を３０ｍｌ加え１５００ｒｐｍで遠心、上澄み除去後３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコールを１ｍｌ加え激しく攪拌しながら２分間処理後、３７℃に保温した１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加え液を滅菌ピペットで吸引、排出しながら約５分間激しく攪拌混合した。
１０００ｒｐｍで５分間遠心、上澄み除去後さらに３０ｍｌのＨＡＴ培地を加え細胞濃度が５×１０6個／ｍｌになるように調整し攪拌均一化後、９６穴プレート型培養プレートに０．１ｍｌずつ分注し７％ＣＯ2条件下、３７℃で培養し、１日目、１週間目、２週間目にＨＡＴ培地を０．１ｍｌずつ加えた。
次に目的の抗体を生産している細胞をスクリーニングするためにＥＬＩＳＡ法による評価を実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を１０μｇ／ｍｌ濃度で希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％、ＰＢＳ）で洗浄し、その上に融合細胞の培養液１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５０ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した。
この結果Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に反応する陽性ウェルが見いだされＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し２４穴プラスティックプレート中、ＨＡＴ培地で培養した。培養した融合培地を細胞数が約２０個／ｍｌになるようにＨＴ培地で希釈し５０μｌを、ＨＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０6個と９６穴培養プレート中で混合後、７％ＣＯ2条件下、３７℃で２週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を前述のＥＬＩＳＡ法にて同様に検定し、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質との反応陽性の細胞を回収した。
さらに同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマＡＭＧＣ−５〜８の計４クローンを取得した。
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的にはＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ入り）を用いて継代培養した細胞を２５ｃｍ2培養フラスコ中で２×１０5個／ｍｌ、３．３×１０5個及び５×１０5個／ｍｌ程度に無血清培地にて希釈し全容を５ｍｌとした。７％ＣＯ2、３７℃で３〜５日間増殖させ、細胞の増殖がみられたフラスコの内、元の細胞数が最も少ないものを選択し、最終的に２×１０5個／ｍｌ希釈のものが３〜４日間で２×１０6個／ｍｌに増殖するようになるまで同様の操作を繰り返し無血清培地に馴化させた。次に細菌培養用９６穴プレート中でクローニングを行い、増殖が早く抗体価の高い細胞を選択した。選択した細胞を２４穴プレートで増殖させたものを２５ｃｍ2培養フラスコ中で２×１０5個／ｍｌ程度となるように無血清培地で希釈し全容１０ｍｌとした。これを７％ＣＯ2、３７℃で３〜４日間培養し１×１０6個／ｍｌまで増殖させた後、７５ｃｍ2培養フラスコにて同様に増殖させ１×１０6個／ｍｌ、１００ｍｌを大量培養用ボトルに移した。これに無血清培地１００ｍｌを加え、攪拌しながら３７℃で２日培養後、無血清培地２００ｍｌ加えさらに２日培養した。この培養液を４本に分け各々１００ｍｌの無血清培地を添加し、２日培養し各々４００ｍｌの無血清培地を添加後さらに約６日培養した後、培養液を回収し１００００ｒｐｍ１５分の遠心により目的とする抗体を含む培養上清を取得した。培養上清は０．１％アジ化ソーダ添加後４℃で保存した。取得した抗体含有液１００ｍｌをＰＢＳで５倍に希釈後ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（５ｍｌベッド、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に吸着させ、ＰＢＳで３ベッドボリューム洗浄し、ｐＨ３のクエン酸バッファーで溶出し、抗体フラクションを回収して各ハイブリドーマの生産するモノクローナル抗体を得た。
この４株のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体は特表平７−５０９５６５号公報に記載されているＯＩＡ法により評価した。
すなわちＯＩＡ法は窒化珪素の薄膜層をもつシリコンウエハー上にｃａｐｔｕｒｅ用抗体を反応させた反応用基材を作製し、これに抗原物質すなわち微生物の抽出液を一定時間反応させた後、捕捉された抗原と酵素標識した抗体（増幅試薬）とをさらに反応させ、最後に基質溶液を加えて生じた薄膜沈殿による光干渉色の濃さにより、抗原抗体反応を視覚的に判定できる方法である。
作製したモノクローナル抗体はＯＩＡ法の窒化珪素の薄膜層をもつシリコンウエハー上に固相化するｃａｐｔｕｒｅ抗体として使用した。またｄｅｔｅｃｔ抗体としては参考例に記載した種々の微生物のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と非特異的に反応しうるＡＭＧＣ−１モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで酵素標識したものを使用した。すなわち酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。
ＯＩＡ反応においては０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中のモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌ濃度に０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０で希釈した液を５０μｌずつ窒化珪素の薄膜層をもつシリコンウエハー上に添加し室温で３０分反応させた後、蒸留水で洗浄した後、使用した。
その上に各種微生物の懸濁液に０．５％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により室温で５分間抽出操作をほどこした抗原液を１５μｌ加え室温で１０分間反応後、２０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ＡＭＧＣ１を１５μｌ加え室温１０分間反応を実施し、蒸留水で洗浄した後、基質溶液（ＫＰＬ社）を１５μｌずつ加え、室温で５分反応し、蒸留水で洗浄後検出シグナルの濃さを光干渉色の強さとして目視で判定した。
その結果表４に示すようにｃａｐｔｕｒｅ抗体としてハイブリドーマＡＭＧＣ−８由来のモノクローナル抗体を用いた場合、１０8個／ｍｌの菌濃度で試験したＮｅｉｓｓｅｒｉａ属の全ての株を検出すると同時に他の微生物については反応性を示さず、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いることでＮｅｉｓｓｅｒｉａ属特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。
【００６２】
【表４】
【実施例１０】
【００６３】
Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化アフィニティカラムを用いたＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と特異的に反応するポリクローナル抗体の取得。
０．５％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌体抽出液の遠心上清を抗原として使用した。抗原１００μｇを含む生理食塩水溶液約１．２ｍｌにフロイントのアジュバンド１．５ｍｌを加えエマルジョン化した後、４匹のＳＰＦ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｗｈｉｔｅ Ｒａｂｂｉｔに皮下注射し免疫した。２週間おきに５〜６回免疫し、抗体価を確認した。
抗体価の確認はＥＬＩＳＡ法により実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を１０μｇ／ｍｌ濃度に希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートに分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ）で洗浄し、その上に正常ウサギ血清と免疫後のウサギ抗血清を段階希釈したもの１００μｌを加え室温で２時間反応後、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５０ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識抗ラビットＩｇＧ抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＯＰＤ溶液（Ｓｉｇｍａ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し，４９２ｎｍの吸光を測定した。
抗体価上昇を確認できたものにつき、大量採血を実施した。耳動脈から血液をガラス製遠心管に採取し、３７℃１時間放置後、４℃一晩静置した。
その後３０００ｒｐｍ５分間遠心し、上清を回収した。
得られた抗血清４ロットは４℃で保存した。
次にＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を固定化したアフィニティカラムを調製した。カラムはＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（１ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を使用した。１ｍＭ ＨＣｌ ６ｍｌでカラムを置換した後、直ちに１ｍｇ／ｍｌに調製したＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＰＢＳ溶液１ｍｌを注入し２５℃で１５分放置、これを５回繰り返し、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＰＢＳ溶液計５ｍｌをカラムに注入した。その後、ブロッキング試薬としてＢｕｆｆｅｒ Ａ（０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）を６ｍｌ、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（０．１Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４）を６ｍｌ、Ｂｕｆｆｅｒ Ａ ６ｍｌを注入し、２５℃１５分放置後、さらにＢｕｆｆｅｒ Ｂを６ｍｌ、Ｂｕｆｆｅｒ Ａを６ｍｌ、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂを６ｍｌ流した。その後ＰＢＳ６ｍｌで平衡化した。
このＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化アフィニティカラムを使用して、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理した菌体の上清を抗原として得られた抗血清中のポリクローナル抗体の精製を行った。まず該抗血清をＰＢＳで５倍に希釈し、０．４５μｍのフィルターを通した後、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎでＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化カラムに吸着させた。その後０．１ＭグリシンｐＨ２．１でカラムから溶出し、直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０で中和した後、抗体価測定法と同様のＥＬＩＳＡ法により目的とする抗体の溶出画分を回収した。次にこの画分をＰＢＳで平衡化したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化アフィニティカラムを通過させ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に反応する抗体を吸収除去させ非吸着の通過画分を回収した。
こうして精製したポリクローナル抗体は実施例６と同様にＯＩＡ法により評価した。
精製した抗体はＯＩＡ法のｃａｐｔｕｒｅ抗体として使用した。またｄｅｔｅｃｔ抗体としては参考例に記載したＡＭＧＣ−１モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで酵素標識したものを使用した。酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。
ＯＩＡ反応においては０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の精製ポリクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌ濃度に０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０で希釈した液を５０μｌずつシリコンウエハー上に添加し室温で３０分反応させた後、蒸留水で洗浄した後、使用した。
その上に各種微生物の懸濁液に０．５％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により室温で５分間抽出操作をほどこした抗原液を１５μｌを加え室温で１０分間反応後、２０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ＡＭＧＣ１を１５μｌ加え室温１０分間反応を実施し、蒸留水で洗浄した後、基質溶液（ＫＰＬ社）を１５μｌずつ加え、室温で５分反応し、蒸留水で洗浄後青色の濃さを目視で判定した。
その結果表５に示すようにｃａｐｔｕｒｅ抗体としてＡＰＨＩ２−２の精製ポリクローナル抗体を用いた場合、１０8個／ｍｌの菌濃度で試験したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを検出すると同時に他の微生物について反応性を示さず、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化アフィニティカラムで精製したポリクローナル抗体を用いることでＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。
【００６４】
【表５】
【参考例１】
【００６５】
各種の微生物のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と非特異的に反応するモノクローナル抗体の取得。
オプティカルイムノアッセイやＥＬＩＳＡでの微生物検出の際、一般的にはｃａｐｔｕｒｅ抗体とｄｅｔｅｃｔ用標識抗体で抗原をはさんで検出するいわゆるサンドイッチアッセイ法がその検出感度の高さから特に有用であるが、その場合対象微生物由来の抗原物質と特異的に反応する抗体が必要であると同時にその特異的抗体とは異なる抗原エピトープを認識するもう１種の抗体が必要である。
種々の微生物由来のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と非特異的に反応する抗体は、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と特異的に反応する抗体とのサンドイッチアッセイを構成しうる抗体として非常に有用である。
幸いＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質は種々の微生物でアミノ酸配列が相同である領域が存在するため、ここでは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅから種々の微生物のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と交差反応するモノクローナル抗体の取得を試み、一つの微生物から取得した特異性のない抗Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗体を種々の微生物のサンドイッチアッセイに共通して利用することが可能であることを見出した。
まず、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子をクローニングし、同蛋白質の大腸菌での大量発現、精製および同蛋白質の対するモノクローナル抗体を作製した。
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＩＩＤ８２１株（東京大学医科学研究所より分譲、購入）をチョコレート寒天培地上に適当量植菌した後、ＣＯ2インキュベーター中で３７℃、ＣＯ2 ０．５％条件で２４時間培養する。生育したコロニーを最終的に５×１０9ＣＦＵ／ｍｌ前後になるようにＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁する。内約１．５ｍｌを微量遠心チューブに移し取り１００００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを棄てる。沈殿部分を５６７μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁する。さらに３０μｌの１０％ＳＤＳと３μｌの２０ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートする。 次に１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液を８０μｌ追添しよく混合した後６５℃で１０分間インキュベートする。次に、体積比２４／１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を７００μｌ加えよく攪拌する。この溶液を微量遠心機で１２０００ｒｐｍ、５分間（４℃ コントロール下）遠心処理した後、水層画分を新しい微量遠心管に移す。そこに０．６倍量のインプロパノールを加えチューブをよく振ってＤＮＡの沈殿を形成する。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移す。
次に１００００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上澄みを静かに除去した後さらに１ｍｌの７０％エタノールを加えて再び５分間遠心する。再び上澄みを除去した後沈殿を１００μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解しＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓのＥ５，Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡに従って定量した。
このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌとＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅなどの菌のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＤＮＡ配列との類似性によりインターネット情報（オクラホマ大、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムプロジェクト公開ゲノムＤＮＡ情報）より取得したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＤＮＡ配列をもとに設計した配列表配列番号：１５に示した合成オリゴヌクレオチドＥおよび、配列表配列番号：１６に示した合成オリゴヌクレオチドＦをプローブとしてそれぞれ２００ｐｍｏｌを加え、最終容量５０μｌとした。
この混合物を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０を用いて、９５℃ １分、５０℃ ２分、７２℃ ３分を５サイクル行った後、９５℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。さらに制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後市販のベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に組み込んだ。具体的にはベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１を大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、８時間程度３７℃で振とう培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製はＰＲＩＳＭ，Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。０．５ｍｌ容のマイクロチューブに９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの０．８ｐｍｏｌ／μｌのＴ７プロモータープライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）及び６．５μｌの０．１６μｇ／μｌのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μｌのミネラルオイルを重層後、９６℃ ３０秒、５５℃ １５秒及び６０℃ ４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サイクル行い、４℃で５分間保温した。反応後、８０μｌの滅菌精製水を加えて攪拌し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行った。１００μｌの水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および３００μｌのエタノールを加えて攪拌後、室温１４０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行い沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０℃２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。得られた５個のクローンの内１個の配列にＰＣＲに用いたプローブと配列の相同性がありさらに他の微生物、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子配列と非常に類似したＤＮＡ配列が見いだされた。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：２１及び２２に示すような配列であった。この遺伝子断片は明らかにＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子をコードするものである。
このように構築したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＧＳＴフュージョン蛋白質発現ベクターを用いて実施例２に記載の方法と同様の方法により精製したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を取得した。さらに、実施例３記載の方法と同様の方法によりＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体に生産するハイブリドーマＡＭＧＣ１株を取得した。前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞ＡＭＧＣ１株を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的にはＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ入り）を用いて継代培養した細胞を２５ｃｍ2培養フラスコ中で２×１０5個／ｍｌ、３．３×１０5個及び５×１０5個／ｍｌ程度に無血清培地にて希釈し全容を５ｍｌとした。７％ＣＯ2、３７℃で３〜５日間増殖させ、細胞の増殖がみられたフラスコの内、元の細胞数が最も少ないものを選択し、最終的に２×１０5個／ｍｌ希釈のものが３〜４日間で２×１０6個／ｍｌに増殖するようになるまで同様の操作を繰り返し無血清培地に馴化させた。次に細菌培養用９６穴プレート中でクローニングを行い、増殖が早く抗体価の高い細胞を選択した。選択した細胞を２４穴プレートで増殖させたものを２５ｃｍ2培養フラスコ中で２×１０5個／ｍｌ程度となるように無血清培地で希釈し全容１０ｍｌとした。これを７％ＣＯ2、３７℃で３〜４日間培養し１×１０6個／ｍｌまで増殖させた後、７５ｃｍ2培養フラスコにて同様に増殖させ１×１０6個／ｍｌ、１００ｍｌを大量培養用ボトルに移した。これに無血清培地１００ｍｌを加え、攪拌しながら３７℃で２日培養後、無血清培地２００ｍｌ加えさらに２日培養した。この培養液を４本に分け各々１００ｍｌの無血清培地を添加し、２日培養し各々４００ｍｌの無血清培地を添加後さらに約６日培養した後、培養液を回収し１００００ｒｐｍ１５分の遠心により目的とする抗体を含む培養上清を取得した。培養上清は０．１％アジ化ソーダ添加後４℃で保存した。取得した抗体含有液１００ｍｌをＰＢＳで５倍に希釈後Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（５ｍｌベッドボリューム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に吸着させ、ＰＢＳで３ベッドボリューム洗浄し、ｐＨ３．０のクエン酸バッファーで溶出し、抗体フラクションを回収して各ハイブリドーマの生産するモノクローナル抗体を得た。このハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により評価した。
抗体の評価には各種の微生物由来のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を抗原として感作した９６穴プレートを用い、作製したモノクローナル抗体を反応させたあと２次抗体として抗マウスＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ３３０）を反応させ最後に酵素反応発色試薬により検出した。ＥＬＩＳＡ反応においては０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのリコンビナントＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を１μｇ／ｍｌ濃度に希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ）で洗浄し、その上にＡＭＧＣ１抗体の０．１から１μｇ／ｍｌ液１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ３３０）抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、４５００ｍの吸光を測定した。 その結果表６に示すようにハイブリドーマＡＭＧＣ１由来のモノクローナル抗体を用いた場合、この抗体がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と反応できることを確認できた。
【００６６】
【表６】
【００６７】
ここで取得されたＡＭＧＣ１抗体はオプティカルイムノアッセイやＥＬＩＳＡでの微生物検出などいわゆるサンドイッチアッセイ法による微生物検出において各微生物特異的な抗Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗体と組み合わせて用いる抗体として非常に有用である。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明によると各種の微生物について同一機能の細胞内分子に対する抗体を用いて微生物の検出を行うことで微生物を特異的になおかつ同一種内の全ての血清型の微生物を精度よく検出することができる。
このような抗体として微生物のリボソーム蛋白質、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用い、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅやＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの検出を精度良く行うことができる。 また、このような抗体を構成要素とする微生物検出用試薬キットを用いることで、微生物の検出をより汎用的に精度良く行うことができる。
また各種の微生物における同一機能の細胞内分子を抗原として用いることで、各種の微生物の検出に用いる特異的抗体を作製することができる。
【受託番号】
【００６９】
寄託した寄託機関
名称： 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名： 日本国茨城県つくば市東１丁目１−３
当該寄託機関に微生物を寄託した日付： 平成１１年（１９９９）７月２８日
当該寄託機関が寄託について付した受託番号： ＦＥＲＭ ＢＰ−６８０７
[配列表]
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々の微生物、特に細菌の検出に有用な抗体、それを用いた微生物検出方法、微生物検出用試薬キット及び微生物検出用特異的抗体の作製法に関する。
本発明は、医薬品工業、特に細菌を中心とする微生物感染症のための診断薬の製造に有効に利用される。
【背景技術】
【０００２】
微生物感染症の診断は通常感染部位などでの原因菌の検出か、血清、体液中の原因菌に対する抗体の検出により確定される。特に、この診断は原因菌の検出が患者への迅速な治療を可能にする意味で重要である。
感染症原因菌の検出には原因菌の分離培養を経て、その生化学的性状をもとに菌の同定を行う培養同定法、原因菌特異的遺伝子をもとにＰＣＲ法などにより増幅し検出する遺伝子診断法、原因菌の表面抗原マーカーとの抗体の特異反応を利用して原因菌検出を行う免疫的手法に大別できるが、培養同定法、遺伝子診断法は検出結果を得るまでに時間がかかり、短時間にしかも高感度に原因菌を検出し、迅速かつ適切な患者への治療につながる点で免疫法による診断が汎用されている。
従来免疫法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体の組み合わせが使われている。
例えばクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）属の場合、属特異的抗原であるリポ多糖（ＬＰＳ）の抗原決定基としての存在が知られており（非特許文献１：Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｒ．ら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２８：１０８３−８９，１９８２、Ｃａｌｄｗｅｌｌ．Ｍ．Ｄ．：Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．，４４：３０６−１４，１９８４）、様々な診断用キットにおいて特にクラミジア トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の検出用試薬抗体に利用されている。
また、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属の外膜主要蛋白質（ＭＯＭＰ；Ｍａｊｏｒ Ｏｕｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ）に対するモノクローナル抗体についてＥｌｌｅｎａ Ｍ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５９（１１），４１４７−４１５３，１９９１（非特許文献２）及びＢｙｒｏｎ Ｅ．Ｂａｔｔｅｉｇｅｒら：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５３（３），５３０−５３３，１９８６（非特許文献３）がそれぞれ報告している。
特開昭６３−２９８号公報（特許文献１）は、約４３キロダルトンのマイコプラズマ ニューモニア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の膜抗原蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法をベースとする免疫検出法が記載されている。
また、特開昭６２−１４８８５９号公報（特許文献２）（特公平６−６４０６５号公報）には、ヘモフイルス インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｏｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の外膜蛋白質に対するポリクローナル抗体の作製法と作製した抗体を用いた診断方法について記載されている。
英国特許出願２１７２７０４号明細書（特許文献３）には、ナイセリア ゴノロエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）株ＢＳ４（ＮＣＴＣ １１９２２）の外膜小胞のコール酸ナトリウム抽出液から単離された約２０キロダルトンの蛋白質について記載されており、この物質を用いてハイブリドーマを調製することが開示されており、またＥＰ ４１９２３８Ａ１号（特許文献４）にはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ培養菌体を免疫源として作製され、約１４キロダルトンの蛋白質に結合可能なモノクローナル抗体とその作製方法について記載されている。また、同じＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅについてカナダ特許出願１２２０１４７号明細書（特許文献５）にはＬＰＳに対するモノクローナル抗体を用いる検出法について記載されている。
しかし、これらの抗体および検出法では、微生物に対する種特異性が十分ではなく、また同一種に存在する複数の表面抗原による血清型の全てをカバーし検出することが困難であるなどの問題点がある。
またこれらの従来の技術に用いられているマーカー抗原は各種微生物細胞において普遍的に存在する同一機能分子（例えば、同一機能の蛋白質、ＬＰＳあるいは表面多糖成分）が微生物の進化の過程で菌種ごとに変化してきた分子をマーカーとして検出するというような統一的なものでなく、１つの分子を基準として菌種間で抗原性の差を検出しようという発想に基づいた免疫診断法はいまだに知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６３−２９８号公報
【特許文献２】特開昭６２−１４８８５９号公報
【特許文献３】英国特許出願２１７２７０４号明細書
【特許文献４】ＥＰ ４１９２３８ Ａ１号
【特許文献５】カナダ特許出願１２２０１４７号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｒ．ら：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２８：１０８３−８９，１９８２、Ｃａｌｄｗｅｌｌ．Ｍ．Ｄ．：Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．，４４：３０６−１４，１９８４
【非特許文献２】Ｅｌｌｅｎａ Ｍ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎら：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５９（１１），４１４７−４１５３，１９９１
【非特許文献３】Ｂｙｒｏｎ Ｅ．Ｂａｔｔｅｉｇｅｒら：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５３（３），５３０−５３３，１９８６
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、理想的な微生物の検出・免疫診断法を可能とする統一マーカー抗原としてそれぞれの微生物について同一の分子に対する抗体、特に検出したい全ての微生物について細胞内の同一機能成分分子を用いて微生物の進化の過程で変化が生じてきた部分に対する抗体、該抗体を用いた特異的でかつほぼ全ての血清型をカバーできる微生物検出方法、微生物検出用試薬キット及び微生物検出用特異抗体の作製方法を提供しようとするものである。
【０００６】
本発明者らは、全ての微生物において同一の機能が保存されている蛋白質を有用な抗原蛋白質として見出した。通常、このような蛋白質の構造変化は極めて少ないと予想される。しかし驚くべきことに、該蛋白質の抗原エピトープは微生物の種あるいは属特異的であり、該蛋白質に対する抗体は、微生物の種あるいは属特異的な識別に用いることが可能な多様性を持つと共に、対象となる微生物についてはその全ての血清型を検出しうるものであることが見出されたのである。
【０００７】
本発明者らは全ての微生物細胞に存在し、しかもそのアミノ酸構造が微生物間である程度の相違点をもつ細胞内分子、特にリボソーム蛋白質の一種であるリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２）に着目した。Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２は蛋白質合成に必須なリボソーム蛋白質としてその存在が知られている分子量約１３キロダルトンの蛋白質であり、特に大腸菌、枯草菌などいくつかの微生物でその全アミノ酸配列の解析が進んでおり、微生物間で５０％〜６５％程度のアミノ酸配列の相同性が確認されている。
【０００８】
本発明者らはこの分子が微生物間で類似しているにもかかわらずその一部に各微生物固有のアミノ酸配列等の構造部分を持つことに着目し、該蛋白質に対する抗体を利用することで様々な微生物に特異的でかつ同一菌種内の全ての血清型について検出が可能であることを見いだした。具体的には例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、ストレプトコッカス ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅについてその特異抗体を用いた微生物種の免疫法診断技術の開発を試みた結果、個々の微生物において当該蛋白質特異的な抗体が取得でき、当該抗体を用いることによりそれぞれの菌について特異的な検出が可能であるということを見いだしたことにより本発明を完成した。
【０００９】
従って本発明は、次のとおりの微生物検出用抗体、それを用いる微生物検出方法及び微生物検出用試薬キット及び微生物検出用特異的抗体の作製法に関する。
１）微生物のリボソーム蛋白質に対する抗体であって、当該微生物に特異的に反応する抗体、
２）微生物のリボソーム蛋白質がＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２である、１）に記載の抗体、
３）微生物が性行為感染症（ＳＴＤ，Ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）原因微生物である１）または２）に記載の抗体、
４）微生物が呼吸器系感染症の原因微生物である１）または２）に記載の抗体、
５）呼吸器系感染症の原因微生物のがＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅである４）に記載の抗体、
６）呼吸器系感染症の原因微生物がＳｔｒｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである４）に記載の抗体、
７）性行為感染症（ＳＴＤ，Ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）微生物がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅである３）に記載の抗体、
８）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体であって、配列表配列番号：２２のアミノ酸配列において１１５番目のアラニンを含む５から３０アミノ酸の長さの連続する部分アミノ酸配列を認識する抗体である７）に記載の抗体、
９）各種の微生物について同一機能の細胞内分子に対する抗体を用いる微生物検出方法、
１０）各種の微生物について１）から８）のいずれかに記載の抗体を用いる微生物検出方法、
１１）各種の微生物について同一機能の細胞内分子に対する抗体を用いる微生物検出用試薬キット、
１２）各種の微生物について１）から８）のいずれかに記載の抗体を用いる微生物検出用試薬キット、
１３）遺伝子操作手法によりあるいは微生物からの単離精製により得られた微生物のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質、その部分ペプチド、またはその部分ペプチドに相当する合成ペプチドを免疫源とする１）から８）のいずれかに記載の抗体の作製方法。
【００１０】
以下本発明について詳細に説明する。
配列表において配列番号１及び２はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号３及び４はヘリコバクター ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号５及び６はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号７及び８はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号９及び１０はナイセリア メニンギチヂス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号１１及び１２はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の取得に用いたＰＣＲのプライマーＤＮＡである。配列番号１３及び１４はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の取得に用いたＰＣＲのプライマーＤＮＡである。配列番号１５及び１６はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の取得に用いたＰＣＲのプライマーＤＮＡである。配列番号１７及び１８はＨａｅｍｏｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅから取得したＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号１９及び２０はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅから取得したＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。配列番号２１及び２２はＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅから取得したＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列である。
【００１１】
なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端および右端はそれぞれアミノ基（以下、Ｎ末）およびカルボキシル基末端（以下、Ｃ末）であり、また塩基配列の左端および右端はそれぞれ５'末端および３'末端である。
【００１２】
また、本発明で述べられる遺伝子操作の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書の記載方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）を挙げることができる。
【００１３】
本発明において微生物は、細菌、酵母、カビ、放線菌、リケッチア類などの微生物類全般をさすが、特に微生物感染症の診断において問題となるのは細菌の場合が多い。
本発明において、「微生物に特異的に反応する抗体」とは、微生物の種あるいは属に特異的に反応する抗体をさすが、微生物感染症の診断においては微生物の種に特異的に反応する抗体が特に有用となる。
【００１４】
本発明において、ＳＴＤの原因微生物とは、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンジダ菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、梅毒菌（Ｔｔｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ウレアプラズマ菌（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）などをさすがこれらの微生物に限定されるものではない。
【００１５】
本発明において、呼吸器系感染症の原因微生物とは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、肺炎かん菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ａ群溶連菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧｒｏｕｐＡ）結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、レジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、アスペルジルス属真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）などをさすがこれらの微生物に限定されるものではない。
【００１６】
本発明において抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をさし、該リボソーム蛋白質の全長あるいはその部分ペプチドを用いて作成することができる。抗体を作成するためのペプチドの長さは特に限定されないがＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体の場合、この蛋白質を特徴づけられる長さがあれば良く、好ましくは５アミノ酸以上、特に好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いれば良い。このペプチドあるいは全長蛋白質をそのまま、またはＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ−ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）やＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）といったキャリア蛋白質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、ハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法によりモノクローナル抗体を得ることも可能であるが、この場合はマウスが好ましい。また該蛋白質の全長またはアミノ酸５残基以上、望ましくは８残基以上の部分ペプチドをＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）などと融合させたものを精製して、または未精製のまま、抗原として用いることもできる。成書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて、細胞に発現させた遺伝子組み換え抗体によっても作製することができる。
本発明のマーカー抗原として用いることができるＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体は、以下の３つの方法あるいはその他の類似の方法によって取得することができるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００１７】
ａ）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の遺伝子配列およびアミノ酸配列が既知の微生物については、他の微生物における該蛋白質のアミノ酸配列との類似性が少ない領域についてアミノ酸数５個から３０個ほどのペプチド断片を合成し、それを免疫原としてポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を作製することにより目的の抗体を取得することができる。
【００１８】
また、既知の該遺伝子の両端部位におけるＤＮＡ配列をプローブとしたＰＣＲ手法による遺伝子増幅、相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該遺伝子の全長配列を取得することができる。
【００１９】
その後他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティーカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の全長蛋白質が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２０】
ｂ）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列が未知の微生物については１つにはＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列が菌種間で５０〜６０％相同であることより、そのアミノ酸配列の相同部分の配列を基にしてＰＣＲ法による特定配列部分の遺伝子増幅や相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該蛋白質遺伝子を容易に取得することができる。
【００２１】
その後他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティーカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の全長蛋白質が抗原となるため微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。従って、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する微生物とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２２】
ｃ）あるいはＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列が未知な場合の別な方法として、既知のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列のうち微生物間で保存されている共通配列部分に相当する５〜３０アミノ酸の合成ペプチドを作製し、そのペプチド配列に対し公知の方法でポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を作製し、該抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトによって目的の微生物細胞破砕液を精製することにより高度に精製されたＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を取得することができる。
【００２３】
蛋白質の精製度が不足している場合は公知の精製手法であるイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過などの手法により精製した後作製した抗体によるウェスタンブロットなどの方法によりＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の溶出画分を同定し精製蛋白質を得ることができる。得られた精製Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗原を基にして公知の方法によりハイブリドーマあるいはポリクローナル抗体を取得しｂ）と同様に目的の微生物に特異的に反応するハイブリドーマあるいはポリクローナル抗体を選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２４】
前記ａ）〜ｃ）などの方法によって取得した本発明における各種微生物特異的な抗体は例えばポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用することにより種々の目的の微生物に特異的な検出用試薬キットを提供することができる。
【００２５】
抗体を用いる微生物検出方法とは、例えばポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともにｃａｐｔｕｒｅ抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなどの既知の免疫測定手法を利用する検出方法に相当する。
【００２６】
また、特に抗体を用いる有用な微生物検出方法として特表平７−５０９５６５号公報に記載されているシリコン、窒化珪素などにより形成された光学薄膜上で抗体反応をおこない光干渉原理等により検出するいわゆるオプティカルイムノアッセイ（ＯＩＡ，Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などが高感度な検出方法として有用である。
【００２７】
また該検出方法において必要となる微生物からの細胞内マーカー抗原の抽出方法としては、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、ツイーン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）をはじめとする種々の界面活性剤を用いた抽出試薬による処理法、適当なプロテアーゼなどの酵素を用いる酵素処理法、物理的方法による微生物細胞の破砕をはじめ既知の細胞構造の破砕手法が用いられうるが、界面活性剤等の組み合わせにより微生物ごとに試薬による最適な抽出条件を設定することが望ましい。
【００２８】
また、本発明における、抗体を用いる微生物検出用試薬キットとは、当該検出方法を用いた検出用試薬キットに相当する。
【００２９】
例えば、肺炎、気管支炎、髄膜炎などの原因菌として診断意義の高いＨａｅｍｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの特異的抗体を取得する場合、本菌のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列はデータベース等の記載により公知である。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を配列表配列番号：１及び２に示す。
【００３０】
従って本菌の場合同様にＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のアミノ酸配列が公知である、例えば配列表配列番号：３及び４に示すＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの同蛋白質などとのアミノ酸配列を比較しその相同性の低い部分について５〜３０アミノ酸の合成ペプチドを合成しそのペプチドに対するＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ特異的なポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を作製することができる。
【００３１】
特にポリクローナル抗体の場合、免疫した動物の抗血清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム等で精製しＩｇＧ画分を取得した後、さらに動物の免疫に用いた合成ペプチドによるアフィニティー精製を実施することが望ましい。
【００３２】
さらにＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＤＮＡ配列からＮ末端、Ｃ末端の配列を元にしたＰＣＲプライマー、例えば配列表配列番号：１１及び１２に示すＰＣＲプライマーを設計し、その相同性を利用して、公知の方法に従い、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの培養菌体より抽出したゲノムＤＮＡを材料としてＰＣＲ法などにより増幅してくるＤＮＡ断片を取得し、その断片のＤＮＡシークエンス情報を解析することによりＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の全長遺伝子を取得することができる。
【００３３】
取得したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子は、例えばＧＳＴなどとフュージョン蛋白質遺伝子を構成し、適当な発現用プラスミドを用いて発現ベクターを構築後、大腸菌等を形質転換して該蛋白質を大量発現させうる。形質転換した大腸菌を適当量培養し、回収した菌体破砕液をＧＳＴを用いたアフィニティカラムで精製することにより、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質とＧＳＴとのフュージョン蛋白質が得られる。この蛋白質をそのまま、あるいはＧＳＴ部分をプロテアーゼなどにより切断後、抗原蛋白質として公知の手法により、複数のハイブリドーマを確立し、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌体あるいは菌体破砕液またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に特異的な反応を示す抗体を選択することにより目的の特異的モノクローナル抗体を取得することも可能である。
【００３４】
またＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅと同様に呼吸器感染症原因菌として診断意義の高いＳｔｒｅｐｕｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについてもＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列はデータベース等の記載により公知である。Ｓｔｒｅｕｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を配列表配列番号：５及び６に示す。
【００３５】
従って本菌の場合もＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの場合と同様にＳｔｒｅｕｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＤＮＡ配列からＮ末端、Ｃ末端の配列を元にしたＰＣＲプライマー、例えば配列表配列番号：１３及び１４に示すＰＣＲプライマーを設計し、以後全く同様の手法を用いてＳｔｒｅｕｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的なポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を取得することが可能である。
【００３６】
Ｓｔｒｅｕｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＡＭＳＰ−２を日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年７月２８日に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６８０７として国際寄託した。
【００３７】
また例えば淋病の原因菌でありＳＴＤの代表的な原因菌としてその診断意義が認知されているＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの場合、そのＤＮＡ、アミノ酸配列の大部分は最近米国オクラホマ大学でＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムプロジェクトにおいて決定され、該菌のＤＮＡ配列がインターネット上で公開されている。
【００３８】
公知のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＤＮＡ配列の一部配列を用いて類似配列ＤＮＡ断片の有無を検索したところＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子に該当するＤＮＡ配列が存在し、その全ＤＮＡ配列情報を取得できた。このＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列表配列番号：７及び８に示す。
【００３９】
従ってＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅとＳｔｒｅｐｕｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの場合と同様にＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＤＮＡ配列からＮ末端、Ｃ末端の配列を元にしたＰＣＲプライマー、例えば配列表配列番号：１５及び１６に示すＰＣＲプライマーを設計し、以後全く同様の手法によりＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質全部あるいは一部を抗原とするＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ特異的な目的の抗体を得ることが可能である。
【００４０】
特に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅについては同じＮｅｉｓｓｅｒｉａ属に属するＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の蛋白質遺伝子に該当する遺伝子配列がインターネット上で公開されており容易に入手可能である。このＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の全塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列表配列番号：９及び１０に示す。ここでＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅとＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の全塩基配列を比較するとアミノ酸配列の異なる部分はＮ末端から１１５番目のアミノ酸がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅはアラニンであるのに対してＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの場合はグルタミン酸であるただ１個のアミノ酸の違いだけである。従って、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅを種特異的に検出することができるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗体は該当するＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＮ末端から１１５番目のアラニン及びそれを含むアミノ酸領域をエピトープとして認識する抗体であると断定できる。
【００４１】
本発明に基づき作製された抗体は、公知の測定手法であるポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるＥＬＩＳＡ法、既存のイムノクロマト法、着色粒子もしくは発色能を有する粒子、または酵素もしくは蛍光体でラベルされた該抗体とともにｃａｐｔｕｒｅ抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチアッセイなど既知の全ての免疫測定手法に利用できる。
【００４２】
また本発明に基づき作製された抗体は全ての免疫測定手法において当該抗原蛋白質を固相あるいは液相中で捕獲するｃａｐｔｕｒｅ抗体として機能しうると同時にパーオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を公知の方法により修飾することによりいわゆる酵素標識抗体としても機能しうる。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下の例は本発明を具体的に説明するためのものであって本発明について何らその範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４４】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のクローニング
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＡＴＣＣ９３３４（ＩＩＤ９８４）株（東京大学医科学研究所より分譲、購入）をチョコレート寒天培地上に適当量植菌した後、ＣＯ2インキュベーター中で３７℃、ＣＯ2０．５％条件で２４時間培養する。生育したコロニーを最終的に５×１０9ＣＦＵ／ｍｌ前後になるようにＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ（和光純薬工業社製）に懸濁する。このうち約１．５ｍｌを微量遠心チューブに移し取り１００００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを棄てる。沈殿部分を５６７μｌのＴＥＢｕｆｆｅｒに再懸濁する。さらに３０μｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と３μｌの２０ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートする。次に１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液を８０μｌ追添し、よく混合した後６５℃で１０分間インキュベートする。次に、体積比２４／１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を７００μｌ加えよく攪拌する。この溶液を微量遠心機で１２０００ｒｐｍ、５分間（４℃コントロール下）遠心処理した後、水層画分を新しい微量遠心管に移す。そこに０．６倍量のインプロパノールを加えチューブをよく振ってＤＮＡの沈殿を形成する。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移す。
【００４５】
次に１００００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上澄みを静かに除去した後さらに１ｍｌの７０％エタノールを加えて再び５分間遠心する。再び上澄みを除去した後沈殿を１００μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解しＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓのＥ５，Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡに従って定量した。
【００４６】
このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌと配列表配列表番号：１１に示した合成オリゴヌクレオチドＡ及び配列表配列表番号：１２に示したオリゴヌクレオチドＢをそれぞれ２６０ｐｍｏｌ加え、最終容量５０μｌとした。
【００４７】
この混合物を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０を用いて、９５℃ １分、５０℃ ２分、７２℃ ３分を５サイクル行った後、９５℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。さらに制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後、市販のベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に組み込んだ。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりＧＳＴ蛋白質とのフュージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。
【００４８】
具体的には、ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１を大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。
【００４９】
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製はＰＲＩＳＭ，Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。０．５ｍｌ容のマイクロチューブに９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの０．８ｐｍｏｌ／μｌのＴ７プロモータープライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）および６．５μｌの０．１６μｇ／μｌのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μｌのミネラルオイルを重層後、９６℃３０秒、５５℃１５秒および６０℃ ４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サイクル行い、４℃で５分間保温した。反応後、８０μｌの滅菌精製水を加えて攪拌し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行った。１００μｌの水層に１０ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および３００μｌのエタノールを加えて攪拌後、室温、１４，０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行い沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで 洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０℃、２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。
【００５０】
得られた５個のクローンの内１個の配列にＰＣＲに用いたプローブと配列の相同性がありさらに他の微生物、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子配列と非常に類似したＤＮＡ配列が見いだされた。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：１７及び１８のような配列であった。この遺伝子断片は、明らかにＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子をコードするものである。
【実施例２】
【００５１】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子の大腸菌での大量発現と精製
発現ベクターを組み込んだ大腸菌をＬＢ培地中で５０ｍｌ ３７℃１晩培養した。２倍濃度のＴＹ培地５００ｍｌを３７℃で１時間温めておいた。１晩培養した大腸菌液５０ｍｌを５００ｍｌの前述の培地に入れた。１時間後、１００ｍＭイソプロピルβ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）５５０μｌ入れ４時間培養後回収し、２５０ｍｌずつ遠心チューブにいれて７０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。上澄みを棄てて５０ｍＭトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）ｐＨ７．４、２５％スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）を含むＬｙｓｉｓバッファー２５ｍｌずつに溶解した。
さらに、１０％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）１．２５ｍｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ2１２５μｌを加えてプラステイックチューブに移した。１分間×５回氷冷中でｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを実施し、１２０００ｒｐｍ、１１５分間遠心後上澄みを回収した。
次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でコンディショニングしたグルタチオンアガロースカラムに前記の上澄み液を吸着させた。
次に、２０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．４、４．２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む洗浄液でカラムを２ベッドボリューム分洗浄した。その後５ｍＭのグルタチオンを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ９．６で溶出し、分画したフラクション中の蛋白質含有量を色素結合法（ブラッドフォード法；Ｂｉｏｒａｄ社）で検出し、メインフラクションを取得した。得られた精製ＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の純度は電気泳動法により確認したところ約７５％であり免疫源として充分な純度を確保できた。
【実施例３】
【００５２】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の蛋白質に対するモノクローナル抗体の作製
まずマウスの免疫についてはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗原１００μｇを２００μｌのＰＢＳに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを２００μｌ加え混合、エマルジョン化した後２００μｌを腹腔内に注射した。
さらに、２週間後、４週間後、６週間後に同様のエマルジョン抗原を腹腔内に注射し、さらに１０週間後、１４週間後に２倍濃度の抗原エマルジョン液を腹腔内注射し最終免疫から３日後に脾臓を取り出し、細胞融合に供した。
無菌的に取り出したマウスの脾細胞１０8個に対し骨髄腫細胞２×１０7個をガラスチューブに取り良く混合した後１５００ｒｐｍで５分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
細胞融合に使用した骨髄腫細胞は、ＮＳ−１系の細胞株を用い１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前から０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍｌのＭＣ−２１０、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養後、さらに１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養したものを用いた。混合した細胞サンプルに３７℃に保温した５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を３０ｍｌ加え１５００ｒｐｍで遠心、上澄み除去後３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコールを１ｍｌ加え激しく攪拌しながら２分間処理後、３７℃に保温した１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加え液を滅菌ピペットで吸引、排出しながら約５分間激しく攪拌混合した。
１０００ｒｐｍで５分間遠心、上澄み除去後さらに３０ｍｌのＨＡＴ培地を加え細胞濃度が５×１０6個／ｍｌになるように調整し攪拌均一化後、９６穴プレート型培養プレートに０．１ｍｌずつ分注し７％ＣＯ2条件下、３７℃で培養し、１日目、１週間目、２週間目にＨＡＴ培地を０．１ｍｌずつ加えた。
次に目的の抗体を生産している細胞をスクリーニングするためにＥＬＩＳＡ法による評価を実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質及びＧＳＴ蛋白質をそれぞれ１０μｇ／ｍｌ濃度で希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応してブロッキングした。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％，ＰＢＳ）で洗浄し、その上に融合細胞の培養液１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した。これに、５００ｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した。
この結果、ＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質にのみ反応しＧＳＴ蛋白質には反応しない陽性ウェルが見いだされＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し２４穴プラスティックプレート中、ＨＡＴ培地で培養した。培養した融合培地を細胞数が約２０個／ｍｌになるようにＨＴ培地で希釈し５０μｌを、ＨＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０6個と９６穴培養プレート中で混合後、７％ＣＯ2条件下、３７℃で２週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を前述のＥＬＩＳＡ法にて同様に検定し、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質との反応陽性の細胞を回収した。
さらに、同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマＨＩＲＢ−１〜５の計５クローンを取得した。
【実施例４】
【００５３】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と反応するモノクローナル抗体のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよび他の微生物との反応試験
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法に従ってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的にはＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ入り）を用いて継代培養した細胞をあらかじめ２週間前に０．５ｍｌのプリスタンを腹腔内に注射したＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内に５×１０6個（ＰＢＳ中）注射し、３週間後腹水を回収し、その遠心上澄みを取得した。
取得した抗体含有液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（５ｍｌベッド，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に吸着させ、ＰＢＳで３ベッドボリューム洗浄し、ｐＨ３のクエン酸バッファーで溶出し、抗体フラクションを回収して各ハイブリドーマの生産するモノクローナル抗体を得た。
この５株のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により評価した。
抗体の評価にはサンドイッチアッセイ法を用い、作製したモノクローナル抗体はパーオキシダーゼと化学的に結合させることにより酵素標識抗体として使用した。
すなわち酵素標識は、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。ＥＬＩＳＡ反応においては０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解した市販の抗Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅポリクローナル抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社、ウサギ）を１０μｇ／ｍｌ濃度で希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。
上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％、ＰＢＳ）で洗浄し、その上に各種微生物の培養液に０．３％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により室温で５分間抽出操作をほどこした抗原液を１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去し、さらに洗浄液で洗浄後、５μｇ／ｍｌの各ペルオキシダーゼ標識抗Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し，４５０ｎｍの吸光を測定した。
その結果、表１に示すように酵素標識抗体としてハイブリドーマＨＩＲＢ−２由来のモノクローナル抗体を用いた場合、試験したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの全ての株を１０6個／ｍｌの感度で検出すると同時に他のＮｅｉｓｓｅｒｉａ属やその他の微生物について１０8個／ｍｌの高濃度でも反応性を示さずＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いることでＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。
【００５４】
【表１】
【実施例５】
【００５５】
Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のクローニング、同蛋白質の大腸菌での大量発現と精製および同蛋白質に対するモノクローナル抗体の作製。
Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＩＩＤ５５５株（東京大学医科学研究所より分譲、購入）を血液寒天培地上に適当量植菌した後、インキュベーター中、３７℃で４８時間培養する。生育したコロニーを最終的に５×１０9ＣＦＵ／ｍｌ前後になるようにＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁する。内約１．５ｍｌを微量遠心チューブに移し取り１００００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを棄てる。沈殿部分を５６７μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁する。さらに３０μｌの１０％ＳＤＳと３μｌの２０ｍｇ／ｍｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートする。次に１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液を８０μｌ追添し、よく混合した後６５℃で１０分間インキュベートする。次に、体積比２４／１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を７００μｌ加えよく攪拌する。この溶液を微量遠心機で１２０００ｒｐｍ、５分間（４℃コントロール下）遠心処理した後、水層画分を新しい微量遠心管に移す。そこに０．６倍量のイソプロパノールを加えチューブをよく振ってＤＮＡの沈殿を形成する。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移す。
次に１００００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上澄みを静かに除去した後さらに１ｍｌの７０％エタノールを加えて再び５分間遠心する。再び上澄みを除去した後沈殿を１００μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解しＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒのＥ５，Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡに従って定量した。
このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μｌ，酵素に添付のｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌと配列表配列番号：１３に示した合成オリゴヌクレオチドＣおよび、配列表配列番号：１４に示した合成オリゴヌクレオチドＤをそれぞれ２００ｐｍｏｌを加え、最終容量５０μｌとした。
この混合物を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０を用いて、９５℃ １分、５０℃ ２分、７２℃ ３分を５サイクル行った後、９５℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。さらに制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後、市販のベクターであるｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に組み込んだ。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりＧＳＴ蛋白質とのフュージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。具体的にはベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：５となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、８時間程度３７℃で振とり培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製はＰＲＩＳＭ，Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。０．５ｍｌ容のマイクロチューブに９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの０．８ｐｍｏｌ／μｌのＴ７プロモータープライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）及び６．５μｌの０．１６μｇ／μｌのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μｌのミネラルオイルを重層後、９６℃３０秒、５５℃１５秒および６０℃ ４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サイクル行い、４℃で５分間保温した。反応後、８０μｌの滅菌精製水を加えて攪拌し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行った。１００μｌの水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および３００μｌのエタノールを加えて攪拌後、室温、１４，０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行い沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０℃、２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。
得られた７個のクローンの内１個の配列にＰＣＲに用いたプローブと配列の相同性がありさらに他の微生物、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子配列と非常に類似したＤＮＡ配列が見いだされた。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：１９及び２０のような配列であった。この遺伝子断片は、明らかにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子をコードするものである。
発現ベクターを組み込んだ大腸菌を２倍濃度のＹＴ培地中で５０ｍｌ ３７℃１晩培養した。２倍濃度のＹＴ培地４５０ｍｌを３７℃で１時間温めておいた。１晩培養した大腸菌培養液５０ｍｌを４５０ｍｌの前述の培地に入れた。３７℃１時間培養後、５００ｍＭのＩＰＴＧを１００μｌ入れ、２５℃ ４時間培養後回収し、２５０ｍｌずつ遠心チューブにいれて５０００ｒｐｍ、２０分遠心した。上澄みを棄てて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、２５％ Ｓｕｃｒｏｓｅを含むＬｙｓｉｓバッファー２５ｍｌずつに溶解した。
さらに１０％ ＮＰ−４０ １．２５ｍｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ2 １２５μｌを加えてプラステイックチューブに移した。１分間×５回氷冷中でｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを実施し、１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心後上澄みを回収した。
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カラムに前記の上澄み液を吸着させた。次にＰＢＳでカラムを３ベットボリューム分洗浄した。その後１０ｍＭのグルタチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ８．０で溶出し、分画したフラクション中の蛋白質含有量を色素結合法（ブラッドフォード法；ＢｉｏＲａｄ社）で検出し、メインフラクションを取得した。メインフラクションを３Ｌ ＰＢＳに対して３回透析を行った。
得られたＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の１ｍｇ／ｍｌ溶液１０ｍｌに５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴを含むＣｌｅａｖａｇｅバッファー１ｍｌを加え、さらに２ｕ／μｌのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を１００μｌ添加して４℃で反応させることによりＧＳＴ部分をＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質部分から切り離した。
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロースカラムに反応液を通し、通過液を回収し、さらにＰＢＳを１ベッドボリューム流し、これも回収した。取得した精製Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の純度は電気泳動法により確認したところ約９０％であり免疫源として充分な純度を確保できた。
まずマウスの免疫についてはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗原１００μｇを２００μｌのＰＢＳに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを２００μｌ加え混合、エマルジョン化した後２００μｌを腹腔内に注射した。さらに２週間後、４週間後、６週間後に同様のエマルジョン抗原を腹腔内に注射し、さらに１０週間後、１４週間後に２倍濃度の抗原エマルジョン液を腹腔内注射し最終免疫から３日後に脾臓を取り出し、細胞融合に供した。
無菌的に取り出したマウスの脾細胞１０8個に対し骨髄腫細胞２×１０7個をガラスチューブに取り良く混合した後１５００ｒｐｍで５分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
細胞融合に使用した骨髄腫細胞はＮＳ−１系の細胞株を用い１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前から０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍｌのＭＣ−２１０、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養後、さらに１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養したものを用いた。混合した細胞サンプルに３７℃に保温した５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を３０ｍｌ加え１５００ｒｐｍで遠心、上澄み除去後３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコールを１ｍｌ加え激しく攪拌しながら２分間処理後、３７℃に保温した１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加え液を滅菌ピペットで吸引、排出しながら約５分間激しく攪拌混合した。
１０００ｒｐｍで５分間遠心、上澄み除去後さらに３０ｍｌのＨＡＴ培地を加え細胞濃度が５×１０6個／ｍｌになるように調整し攪拌均一化後、９６穴プレート型培養プレートに０．１ｍｌずつ分注し７％ＣＯ2条件下、３７℃で培養し、１日目、１週間目、２週間目にＨＡＴ培地を０．１ｍｌずつ加えた。
次に目的の抗体を生産している細胞をスクリーニングするためにＥＬＩＳＡ法による評価を実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したＳｔｒｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を１０μｇ／ｍｌ濃度に希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％、ＰＢＳ）で洗浄し、その上に融合細胞の培養液１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５０ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した。
この結果Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に反応する陽性ウェルが見いだされＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し２４穴プラスティックプレート中、ＨＡＴ培地で培養した。培養した融合培地を細胞数が約２０個／ｍｌになるようにＨＴ培地で希釈し５０μｌを、ＨＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０6個と９６穴培養プレート中で混合後、７％ＣＯ2条件下、３７℃で２週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を前述のＥＬＩＳＡ法にて同様に検定し、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質との反応陽性の細胞を回収した。
さらに同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマＡＭＳＰ−１〜４の計４クローンを取得した。
【実施例６】
【００５６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と反応するモノクローナル抗体のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及び他の微生物との反応試験
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的にはＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ入り）を用いて継代培養した細胞を２５ｃｍ2培養フラスコ中で２×１０5個／ｍｌ、３．３×１０5個及び５×１０5個／ｍｌ程度に無血清培地にて希釈し全容を５ｍｌとした。７％ＣＯ2、３７℃で３〜５日間増殖させ、細胞の増殖がみられたフラスコの内、元の細胞数が最も少ないものを選択し、最終的に２×１０5個／ｍｌ希釈のものが３〜４日間で２×１０6個／ｍｌに増殖するようになるまで同様の操作を繰り返し無血清培地に馴化させた。次に細菌培養用９６穴プレート中でクローニングを行い、増殖が早く抗体価の高い細胞を選択した。選択した細胞を２４穴プレートで増殖させたものを２５ｃｍ2培養フラスコ中で２×１０5個／ｍｌ程度となるように無血清培地で希釈し全容１０ｍｌとした。これを７％ＣＯ2、３７℃で３〜４日間培養し１×１０6個／ｍｌまで増殖させた後、７５ｃｍ2培養フラスコにて同様に増殖させ１×１０6個／ｍｌ、１００ｍｌを大量培養用ボトルに移した。これに無血清培地１００ｍｌを加え、攪拌しながら３７℃で２日培養後、無血清培地２００ｍｌ加えさらに２日培養した。この培養液を４本に分け各々１００ｍｌの無血清培地を添加し、２日培養し各々４００ｍｌの無血清培地を添加後さらに約６日培養した後、培養液を回収し１００００ｒｐｍ１５分の遠心により目的とする抗体を含む培養上清を取得した。培養上清は０．１％アジ化ソーダ添加後４℃で保存した。取得した抗体含有液１００ｍｌをＰＢＳで５倍に希釈後ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（５ｍｌベッド，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に吸着させ、ＰＢＳで３ベッドボリューム洗浄し、ｐＨ３のクエン酸バッファーで溶出し、抗体フラクションを回収して各ハイブリドーマの生産するモノクローナル抗体を得た。この４株のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体は特表平７−５０９５６５号公報に記載されているＯＩＡ法により評価した。
すなわちＯＩＡ法は窒化珪素の薄膜層をもつシリコンウエハー上にｃａｐｔｕｒｅ用抗体を反応させた反応用基材を作製し、これに抗原物質すなわち微生物の抽出液を一定時間反応させた後、捕捉された抗原と酵素標識した抗体（増幅試薬）とをさらに反応させ、最後に基質溶液を加えて生じた薄膜沈殿による光干渉色の濃さにより、抗原抗体反応を視覚的に判定できる方法である。
作製したモノクローナル抗体はＯＩＡ法の窒化珪素の薄膜層をもつシリコンウエハー上に固相化するｃａｐｔｕｒｅ抗体として使用し、評価した。またｄｅｔｏｃｔ抗体としては参考例に記載した種々の微生物のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と非特異的に反応しうるＡＭＧＣ−１モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで酵素標識したものを使用した。すなわち酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。
ＯＩＡ反応においては０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中のモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌ濃度に０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０で希釈した液を５０μｌずつ窒化珪素の薄膜層をもつシリコンウエハー上に添加し室温で３０分反応させた後、蒸留水で洗浄した後、使用した。
その上に各種微生物の懸濁液に０．５％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により室温で５分間抽出操作をほどこした抗原液を１５μｌ加え室温で１０分間反応後、２０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ＡＭＧＣ１抗体を１５μｌ加え室温１０分間反応を実施し、蒸留水で洗浄した後、基質溶液（ＫＰＬ社）を１５μｌずつ加え、室温で５分反応し、蒸留水で洗浄後検出シグナルの濃さを光干渉色の強さとして目視で判定した。
その結果表２に示すようにｃａｐｔｕｒｅ抗体としてハイブリドーマＡＭＳＰ−２由来のモノクローナル抗体を用いた場合、試験したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの全ての株を１０個／ｍｌの感度で検出すると同時に他の微生物について１０個／ｍｌの高濃度でも反応性を示さずＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いることでＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＡＭＳＰ−２を日本国通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１１年７月２８日に受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−６８０７として国際寄託した。
【００５７】
【表２】
【実施例７】
【００５８】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子のクローニング、同蛋白質の大腸菌での大量発現、精製および同蛋白質の対するモノクローナル抗体の作製。
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＩＩＤ８２１株（東京大学医科学研究所より分譲、購入）をチョコレート寒天培地上に適当量植菌した後、ＣＯ2インキュベーター中で３７℃、ＣＯ2０．５％条件で２４時間培養した。生育したコロニーを最終的に５×１０9ＣＦＵ／ｍｌ前後になるようにＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁する。そのうち約１．５ｍｌを微量遠心チューブに移し取り１００００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを棄てた。沈殿部分を５６７μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した。さらに、３０μｌの１０％ ＳＤＳと３μｌの２０ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートした。
次に１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液を８０μｌ追添しよく混合した後６５℃で１０分間インキュベートした。次に、体積比２４／１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を７００μｌ加えよく攪拌した。この溶液を微量遠心機で１２０００ｒｐｍ、５分間（４℃コントロール下）遠心処理した後、水層画分を新しい微量遠心管に移した。そこに０．６倍量のイソプロパノールを加えチューブをよく振ってＤＮＡの沈殿を形成した。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃に冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移した。
次に、１００００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上澄みを静かに除去した後さらに１ｍｌの７０％エタノールを加えて再び５分間遠心した。再び上澄みを除去した後沈殿を１００μｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解しＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓのＥ５，Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡに従って定量した。このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌとＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅなどの菌のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＤＮＡ配列との類似性によりインターネット情報（オクラホマ大、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムプロジェクト公開ゲノムＤＮＡ情報）より取得したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＤＮＡ配列をもとに設計した配列表配列番号：１５に示した合成ヌクレオチドＥ及び配列表配列番号：１６に示したオリゴヌクレオチドＦをプローブとしてそれぞれ２００ｐｍｏｌを加え、最終容量５０μｌとした。
この混合物を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０を用いて、９５℃ １分、５０℃ ２分、７２℃ ３分を５サイクル行った後、９５℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。さらに制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後、市販のベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に組み込んだ。具体的にはベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１を大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製はＰＲＩＳＭ，Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。０．５ｍｌ容のマイクロチューブに９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの０．８ｐｍｏｌ／μｌのＴ７プロモータープライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）および６．５μｌの０．１６μｇ／μｌのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μｌのミネラルオイルを重層後、９６℃ ３０秒、５５℃ １５秒および６０℃ ４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サイクル行い、４℃で５分間保温した。反応後、８０μｌの滅菌精製水を加えて撹梓し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行った。１００μｌの水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び３００μｌのエタノールを加えて攪拌後、室温、１４０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行い沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０℃、２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。得られた５個のクローンの内１個の配列にＰＣＲに用いたプローブと配列の相同性がありさらに他の微生物、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子配列と非常に類似したＤＮＡ配列が見いだされた。
その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：２１及び２２に示すような配列であった。この遺伝子断片は明らかにＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子をコードするものである。
このように構築したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質発現ベクターを用いて実施例２に記載の方法と同様の方法により精製したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を取得した。
さらに、実施例３記載の方法に従いＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体に生産するハイブリドーマＧＣＲＢ−３株を取得した。
【実施例８】
【００５９】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と反応するモノクローナル抗体のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ及び他の微生物との反応試験
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞ＧＣＲＢ−３を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的には、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ ＦＣＳ入り）を用いて継代培養した細胞をあらかじめ２週間前に０．５ｍｌのプリスタンを腹腔内に注射したＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内に５×１０6個（ＰＢＳ中）注射し、３週間後腹水を回収し、その遠心上澄みを取得した。取得した抗体含有液をＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（５ｍｌベッド，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に吸着させ、ＰＢＳで３ベッドボリューム洗浄し、ｐＨのクエン酸バッファーで溶出し、抗体フラクションを回収してハイブリドーマの生産するモノクローナル抗体を得た。このＧＣＲＢ−３ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により評価した。
抗体の評価にはサンドイッチアッセイ法を用い、作製したモノクローナル抗体はパーオキシダーゼと化学的に結合させることにより酵素標識抗体として使用した。すなわち酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。ＥＬＩＳＡ反応においては０．０５％のアジ化ソーダを含むＰＢＳ中に溶解した市販の抗淋菌ポリクローナル抗体（ヴァイロスタット社、ウサギ）を１０μｇ／ｍｌ濃度で希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。
上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングした。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％、ＰＢＳ）で洗浄し、その上に各種微生物の培養液に０．３％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により室温で５分間抽出操作をほどこした抗原液を１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識抗Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した。
その結果、表３に示すように酵素標識抗体としてハイブリドーマＧＣＲＢ−３由来のモノクローナル抗体を用いた場合、試験したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの全ての株を１０6個／ｍｌの感度で検出すると同時に他のＮｅｉｓｓｅｒｉａ属やその他の微生物について１０8個／ｍｌの高濃度でも反応性を示さずＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いることでＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。
【００６０】
【表３】
【実施例９】
【００６１】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属特異的抗Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質モノクローナル抗体の取得
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＩＩＤ８２１株（東京大学医科学研究所より分譲、購入）をチョコレート寒天培地上に適当量植菌した後、ＣＯ2インキュベーター中、ＣＯ2濃度０．５％条件で３７℃で２４時間培養する。生育したコロニーを最終的に５×１０9ＣＦＵ／ｍｌ前後になるようにＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁する。そのうち約１．５ｍｌを微量遠心チューブに移し取り１００００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを棄てる。沈殿部分を５６７μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁する。さらに３０μｌの１０％ＳＤＳと３μｌの２０ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートする。 次に１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液を８０μｌ追添し、よく混合した後６５℃で１０分間インキュベートする。次に、体積比２４／１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を７００μｌ加えよく攪拌する。この溶液を微量遠心機で１２０００ｒｐｍ、５分間（４℃コントロール下）遠心処理した後、水層画分を新しい微量遠心管に移す。そこに０．６倍量のインプロパノールを加えチューブをよく振ってＤＮＡの沈殿を形成する。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃に冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移す。
次に１００００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上澄みを静かに除去した後さらに１ｍｌの７０％エタノールを加えて再び５分間遠心する。再び上澄みを除去した後沈殿を１００μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解しＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓのＥ５，Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡに従って定量した。
このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μｌ，酵素に添付のｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌと他菌のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＤＮＡ配列との類似性により、インターネット情報（オクラホマ大、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムプロジェクト公開ゲノムＤＮＡ情報）より取得したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＤＮＡ配列をもとに設計した配列表配列番号：１５に示した合成オリゴヌクレオチドＥおよび、配列表配列番号：１６に示した合成オリゴヌクレオチドＦをプローブとしてそれぞれ２００ｐｍｏｌを加え、最終容量５０μｌとした。
この混合物を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０を用いて、９５℃ １分、５０℃ ２分、７２℃ ３分を５サイクル行った後、９５℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。さらに制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後、市販のベクターであるｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に組み込んだ。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりＧＳＴ蛋白質とのフュージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。具体的にはベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：５となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、８時間程度３７℃で振とう培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製はＰＲＩＳＭ，Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。０．５ｍｌ容のマイクロチューブに９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの０．８ｐｍｏｌ／μｌのＴ７プロモータープライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）及び６．５μｌの０．１６μｇ／μｌのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μｌのミネラルオイルを重層後、９６℃ ３０秒、５５℃ １５秒及び６０℃ ４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サイクル行い、４℃ で５分間保温した。反応後、８０μｌの滅菌精製水を加えて攪拌し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行った。１００μｌの水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および３００μｌのエタノールを加えて攪拌後、室温、１４０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行い沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０℃、２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。
得られた４個のクローンの内１個の配列にＰＣＲに用いたプローブと配列の相同性がありさらに他の微生物、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子配列と非常に類似したＤＮＡ配列が見いだされた。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：２１及び：２２のような配列であった。この遺伝子断片は、明らかにＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子をコードするものである。
発現ベクターを組み込んだ大腸菌を２倍濃度のＹＴ培地中で５０ｍｌ ３７℃１晩培養した。２倍濃度のＹＴ培地４５０ｍｌを３７℃で１時間温めておいた。１晩培養した大腸菌培養液５０ｍｌを４５０ｍｌの前述の培地に入れた。３７℃１時間培養後、５００ｍＭのＩＰＴＧを１００μｌ入れ、２５℃４時間培養後回収し、２５０ｍｌずつ遠心チューブにいれて５０００ｒｐｍ、２０分遠心した。上澄みを棄てて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、２５％Ｓｕｃｒｏｓｅを含むＬｙｓｉｓバッファー２５ｍｌずつに溶解した。
さらに１０％ ＮＰ−４０ １．２５ｍｌ、１Ｍ ＭｇＣｌ2 １２５μｌを加えてプラステイックチューブに移した。１分間×５回氷冷中でｓｏｎｉｃａｔｉｏｎを実施し、１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心後上澄みを回収した。
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）カラムに前記の上澄み液を吸着させた。次にＰＢＳでカラムを３ベットボリューム分洗浄した。その後１０ｍＭのグルタチオンを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ８．０で溶出し、分画したフラクション中の蛋白質含有量を色素結合法（ブラッドフォード法；ＢｉｏＲａｄ社）で検出し、メインフラクションを取得した。メインフラクションを３Ｌ ＰＢＳに対して３回透析を行った。
得られたＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の１ｍｇ／ｍｌ溶液１０ｍｌに５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴを含むＣｌｅａｖａｇｅバッファー１ｍｌを加え、さらに２ｕ／μｌのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を１００μｌ添加して４℃で反応させることによりＧＳＴ部分をＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質部分から切り離した。
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロースカラムに反応液を通し、通過液を回収し、さらにＰＢＳを１ベッドボリューム流し、これも回収した。取得した精製Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２の純度は電気泳動法により確認したところ約９０％であり免疫源として充分な純度を確保できた。
まずマウスの免疫についてはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗原１００μｇを２００μｌのＰＢＳに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを２００μｌ加え混合、エマルジョン化した後２００μｌを腹腔内に注射した。さらに２週間後、４週間後、６週間後に同様のエマルジョン抗原を腹腔内に注射し、さらに１０週間後、１４週間後に２倍濃度の抗原エマルジョン液を腹腔内注射し最終免疫から３日後に脾臓を取り出し、細胞融合に供した。
無菌的に取り出したマウスの脾細胞１０8個に対し骨髄腫細胞２×１０7個をガラスチューブに取り良く混合した後１５００ｒｐｍで５分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
細胞融合に使用した骨髄腫細胞はＮＳ−１系の細胞株を用い１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前から０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍｌのＭＣ−２１０、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養後、さらに１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養したものを用いた。混合した細胞サンプルに３７℃に保温した５０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を３０ｍｌ加え１５００ｒｐｍで遠心、上澄み除去後３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコールを１ｍｌ加え激しく攪拌しながら２分間処理後、３７℃に保温した１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加え液を滅菌ピペットで吸引、排出しながら約５分間激しく攪拌混合した。
１０００ｒｐｍで５分間遠心、上澄み除去後さらに３０ｍｌのＨＡＴ培地を加え細胞濃度が５×１０6個／ｍｌになるように調整し攪拌均一化後、９６穴プレート型培養プレートに０．１ｍｌずつ分注し７％ＣＯ2条件下、３７℃で培養し、１日目、１週間目、２週間目にＨＡＴ培地を０．１ｍｌずつ加えた。
次に目的の抗体を生産している細胞をスクリーニングするためにＥＬＩＳＡ法による評価を実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を１０μｇ／ｍｌ濃度で希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０２％、ＰＢＳ）で洗浄し、その上に融合細胞の培養液１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５０ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した。
この結果Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に反応する陽性ウェルが見いだされＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し２４穴プラスティックプレート中、ＨＡＴ培地で培養した。培養した融合培地を細胞数が約２０個／ｍｌになるようにＨＴ培地で希釈し５０μｌを、ＨＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０6個と９６穴培養プレート中で混合後、７％ＣＯ2条件下、３７℃で２週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を前述のＥＬＩＳＡ法にて同様に検定し、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質との反応陽性の細胞を回収した。
さらに同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマＡＭＧＣ−５〜８の計４クローンを取得した。
前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的にはＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ入り）を用いて継代培養した細胞を２５ｃｍ2培養フラスコ中で２×１０5個／ｍｌ、３．３×１０5個及び５×１０5個／ｍｌ程度に無血清培地にて希釈し全容を５ｍｌとした。７％ＣＯ2、３７℃で３〜５日間増殖させ、細胞の増殖がみられたフラスコの内、元の細胞数が最も少ないものを選択し、最終的に２×１０5個／ｍｌ希釈のものが３〜４日間で２×１０6個／ｍｌに増殖するようになるまで同様の操作を繰り返し無血清培地に馴化させた。次に細菌培養用９６穴プレート中でクローニングを行い、増殖が早く抗体価の高い細胞を選択した。選択した細胞を２４穴プレートで増殖させたものを２５ｃｍ2培養フラスコ中で２×１０5個／ｍｌ程度となるように無血清培地で希釈し全容１０ｍｌとした。これを７％ＣＯ2、３７℃で３〜４日間培養し１×１０6個／ｍｌまで増殖させた後、７５ｃｍ2培養フラスコにて同様に増殖させ１×１０6個／ｍｌ、１００ｍｌを大量培養用ボトルに移した。これに無血清培地１００ｍｌを加え、攪拌しながら３７℃で２日培養後、無血清培地２００ｍｌ加えさらに２日培養した。この培養液を４本に分け各々１００ｍｌの無血清培地を添加し、２日培養し各々４００ｍｌの無血清培地を添加後さらに約６日培養した後、培養液を回収し１００００ｒｐｍ１５分の遠心により目的とする抗体を含む培養上清を取得した。培養上清は０．１％アジ化ソーダ添加後４℃で保存した。取得した抗体含有液１００ｍｌをＰＢＳで５倍に希釈後ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（５ｍｌベッド、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に吸着させ、ＰＢＳで３ベッドボリューム洗浄し、ｐＨ３のクエン酸バッファーで溶出し、抗体フラクションを回収して各ハイブリドーマの生産するモノクローナル抗体を得た。
この４株のハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体は特表平７−５０９５６５号公報に記載されているＯＩＡ法により評価した。
すなわちＯＩＡ法は窒化珪素の薄膜層をもつシリコンウエハー上にｃａｐｔｕｒｅ用抗体を反応させた反応用基材を作製し、これに抗原物質すなわち微生物の抽出液を一定時間反応させた後、捕捉された抗原と酵素標識した抗体（増幅試薬）とをさらに反応させ、最後に基質溶液を加えて生じた薄膜沈殿による光干渉色の濃さにより、抗原抗体反応を視覚的に判定できる方法である。
作製したモノクローナル抗体はＯＩＡ法の窒化珪素の薄膜層をもつシリコンウエハー上に固相化するｃａｐｔｕｒｅ抗体として使用した。またｄｅｔｅｃｔ抗体としては参考例に記載した種々の微生物のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と非特異的に反応しうるＡＭＧＣ−１モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで酵素標識したものを使用した。すなわち酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。
ＯＩＡ反応においては０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中のモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌ濃度に０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０で希釈した液を５０μｌずつ窒化珪素の薄膜層をもつシリコンウエハー上に添加し室温で３０分反応させた後、蒸留水で洗浄した後、使用した。
その上に各種微生物の懸濁液に０．５％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により室温で５分間抽出操作をほどこした抗原液を１５μｌ加え室温で１０分間反応後、２０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ＡＭＧＣ１を１５μｌ加え室温１０分間反応を実施し、蒸留水で洗浄した後、基質溶液（ＫＰＬ社）を１５μｌずつ加え、室温で５分反応し、蒸留水で洗浄後検出シグナルの濃さを光干渉色の強さとして目視で判定した。
その結果表４に示すようにｃａｐｔｕｒｅ抗体としてハイブリドーマＡＭＧＣ−８由来のモノクローナル抗体を用いた場合、１０8個／ｍｌの菌濃度で試験したＮｅｉｓｓｅｒｉａ属の全ての株を検出すると同時に他の微生物については反応性を示さず、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いることでＮｅｉｓｓｅｒｉａ属特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。
【００６２】
【表４】
【実施例１０】
【００６３】
Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化アフィニティカラムを用いたＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と特異的に反応するポリクローナル抗体の取得。
０．５％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌体抽出液の遠心上清を抗原として使用した。抗原１００μｇを含む生理食塩水溶液約１．２ｍｌにフロイントのアジュバンド１．５ｍｌを加えエマルジョン化した後、４匹のＳＰＦ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｗｈｉｔｅ Ｒａｂｂｉｔに皮下注射し免疫した。２週間おきに５〜６回免疫し、抗体価を確認した。
抗体価の確認はＥＬＩＳＡ法により実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を１０μｇ／ｍｌ濃度に希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートに分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ）で洗浄し、その上に正常ウサギ血清と免疫後のウサギ抗血清を段階希釈したもの１００μｌを加え室温で２時間反応後、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５０ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識抗ラビットＩｇＧ抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＯＰＤ溶液（Ｓｉｇｍａ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し，４９２ｎｍの吸光を測定した。
抗体価上昇を確認できたものにつき、大量採血を実施した。耳動脈から血液をガラス製遠心管に採取し、３７℃１時間放置後、４℃一晩静置した。
その後３０００ｒｐｍ５分間遠心し、上清を回収した。
得られた抗血清４ロットは４℃で保存した。
次にＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を固定化したアフィニティカラムを調製した。カラムはＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ（１ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を使用した。１ｍＭ ＨＣｌ ６ｍｌでカラムを置換した後、直ちに１ｍｇ／ｍｌに調製したＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＰＢＳ溶液１ｍｌを注入し２５℃で１５分放置、これを５回繰り返し、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質のＰＢＳ溶液計５ｍｌをカラムに注入した。その後、ブロッキング試薬としてＢｕｆｆｅｒ Ａ（０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）を６ｍｌ、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（０．１Ｍ酢酸、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４）を６ｍｌ、Ｂｕｆｆｅｒ Ａ ６ｍｌを注入し、２５℃１５分放置後、さらにＢｕｆｆｅｒ Ｂを６ｍｌ、Ｂｕｆｆｅｒ Ａを６ｍｌ、Ｂｕｆｆｅｒ Ｂを６ｍｌ流した。その後ＰＢＳ６ｍｌで平衡化した。
このＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化アフィニティカラムを使用して、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理した菌体の上清を抗原として得られた抗血清中のポリクローナル抗体の精製を行った。まず該抗血清をＰＢＳで５倍に希釈し、０．４５μｍのフィルターを通した後、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎでＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化カラムに吸着させた。その後０．１ＭグリシンｐＨ２．１でカラムから溶出し、直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０で中和した後、抗体価測定法と同様のＥＬＩＳＡ法により目的とする抗体の溶出画分を回収した。次にこの画分をＰＢＳで平衡化したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化アフィニティカラムを通過させ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に反応する抗体を吸収除去させ非吸着の通過画分を回収した。
こうして精製したポリクローナル抗体は実施例６と同様にＯＩＡ法により評価した。
精製した抗体はＯＩＡ法のｃａｐｔｕｒｅ抗体として使用した。またｄｅｔｅｃｔ抗体としては参考例に記載したＡＭＧＣ−１モノクローナル抗体をパーオキシダーゼで酵素標識したものを使用した。酵素標識はホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＳｉｇｍａグレードＶＩ）を用い結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用しＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３２（１９８３），６８−７３に述べられている方法に従って行った。
ＯＩＡ反応においては０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中の精製ポリクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌ濃度に０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０で希釈した液を５０μｌずつシリコンウエハー上に添加し室温で３０分反応させた後、蒸留水で洗浄した後、使用した。
その上に各種微生物の懸濁液に０．５％濃度のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により室温で５分間抽出操作をほどこした抗原液を１５μｌを加え室温で１０分間反応後、２０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識ＡＭＧＣ１を１５μｌ加え室温１０分間反応を実施し、蒸留水で洗浄した後、基質溶液（ＫＰＬ社）を１５μｌずつ加え、室温で５分反応し、蒸留水で洗浄後青色の濃さを目視で判定した。
その結果表５に示すようにｃａｐｔｕｒｅ抗体としてＡＰＨＩ２−２の精製ポリクローナル抗体を用いた場合、１０8個／ｍｌの菌濃度で試験したＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを検出すると同時に他の微生物について反応性を示さず、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質固定化アフィニティカラムで精製したポリクローナル抗体を用いることでＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ特異的な反応性をもつ抗体を取得したことが明確に確認できた。
【００６４】
【表５】
【参考例１】
【００６５】
各種の微生物のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と非特異的に反応するモノクローナル抗体の取得。
オプティカルイムノアッセイやＥＬＩＳＡでの微生物検出の際、一般的にはｃａｐｔｕｒｅ抗体とｄｅｔｅｃｔ用標識抗体で抗原をはさんで検出するいわゆるサンドイッチアッセイ法がその検出感度の高さから特に有用であるが、その場合対象微生物由来の抗原物質と特異的に反応する抗体が必要であると同時にその特異的抗体とは異なる抗原エピトープを認識するもう１種の抗体が必要である。
種々の微生物由来のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と非特異的に反応する抗体は、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と特異的に反応する抗体とのサンドイッチアッセイを構成しうる抗体として非常に有用である。
幸いＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質は種々の微生物でアミノ酸配列が相同である領域が存在するため、ここでは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅから種々の微生物のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と交差反応するモノクローナル抗体の取得を試み、一つの微生物から取得した特異性のない抗Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗体を種々の微生物のサンドイッチアッセイに共通して利用することが可能であることを見出した。
まず、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子をクローニングし、同蛋白質の大腸菌での大量発現、精製および同蛋白質の対するモノクローナル抗体を作製した。
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＩＩＤ８２１株（東京大学医科学研究所より分譲、購入）をチョコレート寒天培地上に適当量植菌した後、ＣＯ2インキュベーター中で３７℃、ＣＯ2 ０．５％条件で２４時間培養する。生育したコロニーを最終的に５×１０9ＣＦＵ／ｍｌ前後になるようにＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁する。内約１．５ｍｌを微量遠心チューブに移し取り１００００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを棄てる。沈殿部分を５６７μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁する。さらに３０μｌの１０％ＳＤＳと３μｌの２０ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートする。 次に１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液を８０μｌ追添しよく混合した後６５℃で１０分間インキュベートする。次に、体積比２４／１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を７００μｌ加えよく攪拌する。この溶液を微量遠心機で１２０００ｒｐｍ、５分間（４℃ コントロール下）遠心処理した後、水層画分を新しい微量遠心管に移す。そこに０．６倍量のインプロパノールを加えチューブをよく振ってＤＮＡの沈殿を形成する。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍｌの７０％エタノール（−２０℃冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移す。
次に１００００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上澄みを静かに除去した後さらに１ｍｌの７０％エタノールを加えて再び５分間遠心する。再び上澄みを除去した後沈殿を１００μｌのＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解しＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＰｒｅｓｓのＥ５，Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡに従って定量した。
このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μｌ、酵素に添付のｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌとＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅなどの菌のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＤＮＡ配列との類似性によりインターネット情報（オクラホマ大、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムプロジェクト公開ゲノムＤＮＡ情報）より取得したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＤＮＡ配列をもとに設計した配列表配列番号：１５に示した合成オリゴヌクレオチドＥおよび、配列表配列番号：１６に示した合成オリゴヌクレオチドＦをプローブとしてそれぞれ２００ｐｍｏｌを加え、最終容量５０μｌとした。
この混合物を、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０を用いて、９５℃ １分、５０℃ ２分、７２℃ ３分を５サイクル行った後、９５℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。さらに制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後市販のベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に組み込んだ。具体的にはベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１を大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、８時間程度３７℃で振とう培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製はＰＲＩＳＭ，Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。０．５ｍｌ容のマイクロチューブに９．５μｌの反応ストック液、４．０μｌの０．８ｐｍｏｌ／μｌのＴ７プロモータープライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）及び６．５μｌの０．１６μｇ／μｌのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μｌのミネラルオイルを重層後、９６℃ ３０秒、５５℃ １５秒及び６０℃ ４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サイクル行い、４℃で５分間保温した。反応後、８０μｌの滅菌精製水を加えて攪拌し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行った。１００μｌの水層に１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および３００μｌのエタノールを加えて攪拌後、室温１４０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行い沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μｌの１０ｍＭのＥＤＴＡを含むホルムアミドに溶解して９０℃２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。得られた５個のクローンの内１個の配列にＰＣＲに用いたプローブと配列の相同性がありさらに他の微生物、例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２遺伝子配列と非常に類似したＤＮＡ配列が見いだされた。その構造遺伝子部分の全塩基配列及び対応するアミノ酸配列は配列表配列番号：２１及び２２に示すような配列であった。この遺伝子断片は明らかにＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質の遺伝子をコードするものである。
このように構築したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２ ＧＳＴフュージョン蛋白質発現ベクターを用いて実施例２に記載の方法と同様の方法により精製したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＧＳＴフュージョンＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を取得した。さらに、実施例３記載の方法と同様の方法によりＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質に対するモノクローナル抗体に生産するハイブリドーマＡＭＧＣ１株を取得した。前述のようにして取得した陽性ハイブリドーマ細胞ＡＭＧＣ１株を用いて定法にしたがってモノクローナル抗体を生産回収した。
具体的にはＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＣＳ入り）を用いて継代培養した細胞を２５ｃｍ2培養フラスコ中で２×１０5個／ｍｌ、３．３×１０5個及び５×１０5個／ｍｌ程度に無血清培地にて希釈し全容を５ｍｌとした。７％ＣＯ2、３７℃で３〜５日間増殖させ、細胞の増殖がみられたフラスコの内、元の細胞数が最も少ないものを選択し、最終的に２×１０5個／ｍｌ希釈のものが３〜４日間で２×１０6個／ｍｌに増殖するようになるまで同様の操作を繰り返し無血清培地に馴化させた。次に細菌培養用９６穴プレート中でクローニングを行い、増殖が早く抗体価の高い細胞を選択した。選択した細胞を２４穴プレートで増殖させたものを２５ｃｍ2培養フラスコ中で２×１０5個／ｍｌ程度となるように無血清培地で希釈し全容１０ｍｌとした。これを７％ＣＯ2、３７℃で３〜４日間培養し１×１０6個／ｍｌまで増殖させた後、７５ｃｍ2培養フラスコにて同様に増殖させ１×１０6個／ｍｌ、１００ｍｌを大量培養用ボトルに移した。これに無血清培地１００ｍｌを加え、攪拌しながら３７℃で２日培養後、無血清培地２００ｍｌ加えさらに２日培養した。この培養液を４本に分け各々１００ｍｌの無血清培地を添加し、２日培養し各々４００ｍｌの無血清培地を添加後さらに約６日培養した後、培養液を回収し１００００ｒｐｍ１５分の遠心により目的とする抗体を含む培養上清を取得した。培養上清は０．１％アジ化ソーダ添加後４℃で保存した。取得した抗体含有液１００ｍｌをＰＢＳで５倍に希釈後Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（５ｍｌベッドボリューム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に吸着させ、ＰＢＳで３ベッドボリューム洗浄し、ｐＨ３．０のクエン酸バッファーで溶出し、抗体フラクションを回収して各ハイブリドーマの生産するモノクローナル抗体を得た。このハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ法により評価した。
抗体の評価には各種の微生物由来のＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を抗原として感作した９６穴プレートを用い、作製したモノクローナル抗体を反応させたあと２次抗体として抗マウスＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ３３０）を反応させ最後に酵素反応発色試薬により検出した。ＥＬＩＳＡ反応においては０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのリコンビナントＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質を１μｇ／ｍｌ濃度に希釈した液を１００μｌずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μｌ添加し室温で１時間反応しブロッキングする。上澄み除去後洗浄液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ）で洗浄し、その上にＡＭＧＣ１抗体の０．１から１μｇ／ｍｌ液１００μｌを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＧのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識（ＭＢＬ社製、Ｃｏｄｅ３３０）抗体液を１００μｌ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後ＴＭＢ溶液（ＫＰＬ社）を１００μｌずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、４５００ｍの吸光を測定した。 その結果表６に示すようにハイブリドーマＡＭＧＣ１由来のモノクローナル抗体を用いた場合、この抗体がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質と反応できることを確認できた。
【００６６】
【表６】
【００６７】
ここで取得されたＡＭＧＣ１抗体はオプティカルイムノアッセイやＥＬＩＳＡでの微生物検出などいわゆるサンドイッチアッセイ法による微生物検出において各微生物特異的な抗Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２蛋白質抗体と組み合わせて用いる抗体として非常に有用である。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明によると各種の微生物について同一機能の細胞内分子に対する抗体を用いて微生物の検出を行うことで微生物を特異的になおかつ同一種内の全ての血清型の微生物を精度よく検出することができる。
このような抗体として微生物のリボソーム蛋白質、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用い、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅやＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅの検出を精度良く行うことができる。 また、このような抗体を構成要素とする微生物検出用試薬キットを用いることで、微生物の検出をより汎用的に精度良く行うことができる。
また各種の微生物における同一機能の細胞内分子を抗原として用いることで、各種の微生物の検出に用いる特異的抗体を作製することができる。
【受託番号】
【００６９】
寄託した寄託機関
名称： 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名： 日本国茨城県つくば市東１丁目１−３
当該寄託機関に微生物を寄託した日付： 平成１１年（１９９９）７月２８日
当該寄託機関が寄託について付した受託番号： ＦＥＲＭ ＢＰ−６８０７
[配列表]
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を有することを特徴とするモノクローナル抗体の作製方法。
（１）遺伝子操作手法によりあるいは細菌からの単離精製により得られた細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を免疫源として、細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
（２）上記（１）で得られたハイブリドーマから、さらに、当該細菌の全長リボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に特異的に反応し、該細菌を他の細菌と種あるいは属で識別できるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
（３）上記（２）で得られたハイブリドーマから抗体を取得する工程
【請求項２】
細菌が性行為感染症（ＳＴＤ、Ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）原因細菌である請求項１に記載のモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項３】
細菌が呼吸器系感染症原因細菌である請求項１に記載のモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項４】
呼吸器系感染症原因細菌がＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅである請求項３に記載のモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項５】
呼吸器系感染症原因細菌がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである請求項３に記載のモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項６】
性行為感染症（ＳＴＤ、Ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）原因細菌がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅである請求項２に記載のモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項７】
抗体がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体であって、配列表配列番号：２２のアミノ酸配列において１１５番目のアラニンを含む５から３０アミノ酸の長さの連続する部分アミノ酸配列を認識する抗体である請求項６に記載のモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項１】
以下の工程を有することを特徴とするモノクローナル抗体の作製方法。
（１）遺伝子操作手法によりあるいは細菌からの単離精製により得られた細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２を免疫源として、細菌のリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
（２）上記（１）で得られたハイブリドーマから、さらに、当該細菌の全長リボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に特異的に反応し、該細菌を他の細菌と種あるいは属で識別できるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程
（３）上記（２）で得られたハイブリドーマから抗体を取得する工程
【請求項２】
細菌が性行為感染症（ＳＴＤ、Ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）原因細菌である請求項１に記載のモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項３】
細菌が呼吸器系感染症原因細菌である請求項１に記載のモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項４】
呼吸器系感染症原因細菌がＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅである請求項３に記載のモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項５】
呼吸器系感染症原因細菌がＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである請求項３に記載のモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項６】
性行為感染症（ＳＴＤ、Ｓｅｘｕａｌｌｙ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）原因細菌がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅである請求項２に記載のモノクローナル抗体の作製方法。
【請求項７】
抗体がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体であって、配列表配列番号：２２のアミノ酸配列において１１５番目のアラニンを含む５から３０アミノ酸の長さの連続する部分アミノ酸配列を認識する抗体である請求項６に記載のモノクローナル抗体の作製方法。
【公開番号】特開２０１０−２６８８００（Ｐ２０１０−２６８８００Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４７１２２（Ｐ２０１０−１４７１２２）
【出願日】平成２２年６月２９日（２０１０．６．２９）
【分割の表示】特願２０００−５６２３９９（Ｐ２０００−５６２３９９）の分割
【原出願日】平成１１年７月３０日（１９９９．７．３０）
【出願人】（０００００００３３）旭化成株式会社 (901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２９日（２０１０．６．２９）
【分割の表示】特願２０００−５６２３９９（Ｐ２０００−５６２３９９）の分割
【原出願日】平成１１年７月３０日（１９９９．７．３０）
【出願人】（０００００００３３）旭化成株式会社 (901)
【Ｆターム（参考）】
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