微生物菌体の保存方法及び微生物菌体の懸濁液
【課題】従来技術に代わる、安価で簡便な微生物菌体の保存用懸濁液及び保存方法を提供すること。
【解決手段】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を、乾燥菌体質量として4〜20質量％の濃度で分散媒中で保存することを特徴とする微生物菌体の保存方法。
【解決手段】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を、乾燥菌体質量として4〜20質量％の濃度で分散媒中で保存することを特徴とする微生物菌体の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を所定の濃度で菌体懸濁液中に保存することにより、該微生物菌体を安定に保存する方法に関する。また、本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を所定の濃度で含む菌体懸濁液に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の産生する酵素は、化学変換反応の触媒として多くの場面で使用されている。とりわけ、ニトリル基の水和又は加水分解能を有するニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ等を利用することにより、化学工業上重要なアミド、カルボン酸、α-ヒドロキシカルボン酸等を安価に製造することが可能になる。更に、光学特異的水和又は光学特異的加水分解能を持つ上記酵素を利用することにより、医薬、農薬の製造原料として重要な光学活性カルボン酸、アミノ酸、α-ヒドロキシカルボン酸等の製造も可能になる。
【０００３】
微生物酵素を触媒とする化学変換反応においては、培養及び集菌した微生物菌体を使用時まで安定に保存しておく必要がある。すなわち、雑菌が混入して、腐敗し、あるいは溶菌することで、微生物酵素の触媒能が失われたり、低下したりしないように保存しておかなければならない。そこで一般的には、安定剤、代謝阻害剤、高濃度塩類の存在下で保存することにより微生物菌体保存時の微生物酵素の失活や腐敗、溶菌を抑制し、化学変換反応に使用している。上記安定剤等を添加しない場合には、凍結や冷蔵、或いは通期撹拌により酵素の活性を維持しながら保存することが知られている。
【０００４】
例えば、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の場合、高濃度の無機塩類を含む水溶液中で保存する方法（特許文献１）、凍結により保存する方法（特許文献２）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３１６３２２４号
【特許文献２】特開２００３-２１９８７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの保存方法のうち、高濃度の無機塩類を含む水溶液を使用する方法は、後の工程で洗浄等を行う必要があるため、製品の品質に影響を与える恐れがあり、更に製造方法が煩雑になる。また、凍結により保存する方法では、凍結、融解操作が煩雑であるなど、その取り扱い性に問題があり、またその操作に伴って酵素活性が失われたり、低下したりする恐れがある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、培養、集菌して得られた微生物菌体の懸濁液を、安価でしかも安定的に保存する条件について鋭意検討した結果、菌体を４〜２０質量％の範囲の濃度に濃縮することで、これまで通常では到底考えられなかった室温下で、しかも無撹拌で溶菌や酵素の失活を起こさず、安定に保存できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を、乾燥菌体質量として４〜２０質量％の濃度で分散媒中で保存することを特徴とする微生物菌体の保存方法に関する。また、本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を乾燥菌体質量として４〜２０質量％の菌体濃度で含む、微生物菌体の懸濁液に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、菌体懸濁液に含まれる微生物菌体の濃度を一定範囲にコントロールすることにより、多量の菌体を、室温下、無撹拌でも腐敗や酵素の劣化なしにニトリルヒドラターゼ等の酵素活性を維持したまま長期間保存することが可能となる。更に、本発明によれば、微生物菌体を使用する際に洗浄を必要とせず、従来の保存方法で必要とされてきた労力やコストを大幅に削減することができ、工業的に満足し得る微生物菌体の保存方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２００９年７ 月２４日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２００９−１７３１６２号）の明細書に記載の内容を包含する。
【００１１】
本発明においてニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体は、目的とする酵素触媒を生産し菌体内に蓄積又は菌体外に分泌する性質を有するものである。この微生物には自然界より単離された微生物及び遺伝子組換え微生物が含まれる。このような微生物の代表例としては、例えば、ニトリルヒドラターゼ活性を持つロドコッカス（Rhodococcus）属、ゴルドナ（Gordona）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュードノカルディア（Pseudonocardia）属、ジオバチルス（Geobacillus）属に属する微生物菌体が挙げられる。更に、これらの微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え微生物菌体が挙げられる。中でも工業的には、ロドコッカス属、ゴルドナ属並びにこれらの微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え大腸菌及び組換えロドコッカス属細菌が好ましい。例えば、ロドコッカス属の微生物の具体例としては、特公平６-５５１４８号公報に記載されるロドコッカス・ロドクロウスＪ-１株（Rhodococcus rhodochrous J-1）が挙げられる。当該株は、受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８」として、１９８７年９月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６（以下、本明細書において同様））に寄託されている。
【００１２】
ニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して、対応するアミド化合物を生成する能力を持つ酵素をいうものである。ニトリルヒドラーゼをコードする核酸及びその配列の例としては、前記特許文献２に記載されるものが挙げられる。このような核酸は、通常の分子生物学的手法によって、微生物細胞内に導入可能である（これらの分子学的手法については、以下を参照：Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００１３】
保存時の菌体懸濁液の濃度は、乾燥菌体として４質量％以上、好ましくは５質量％以上である。４質量％未満の低濃度の場合は、室温で活性が低下してしまうことが分かった。その原因として考えられるのは、菌濃度がある程度高く液中に密集している状態だと菌体表面に他の菌の生育を抑制する機能がある、もしくは何らかの他の菌体の生育抑制物質があるためと推察している。４質量％未満の低濃度の場合、この効果は期待できず、懸濁液中で雑菌が増殖し易くなるので、雑菌の生成する窒素酸化物などにより菌体が損傷を受けると考えられる。そして又、４質量％未満の低濃度の場合、粘性が低いので菌体が自由にブラウン運動し、菌体同士の衝突が頻繁に起こり、菌体自体が損傷して酵素の活性が低下するものとも考えられる。
従って、４質量％以上とすることにより、室温での保存安定性が良くなるが、２０質量％を超えると、菌体懸濁液の流動性が低下するために液体としての取り扱いが困難になり、保存・運搬に適さないものとなる。従って、保存時の菌体懸濁液の濃度は、乾燥菌体として４〜２０質量％、好ましくは、５〜１５質量％、より好ましくは、５〜１０質量％である。
【００１４】
「乾燥菌体」とは、実質的に水を含まない微生物菌体の乾燥物を意味するが、菌体以外の残存懸濁液成分等を含有する場合もある。乾燥菌体は、例えば、菌体懸濁液を１２０℃の乾燥機で３時間乾燥させることにより得ることができる。
【００１５】
「乾燥菌体濃度（乾燥菌体質量（％））」とは、菌体懸濁液に含まれる菌体の乾燥質量の比率により表され、具体的には、菌体懸濁液を１２０℃の乾燥機で３時間乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：菌液乾燥残渣割合[％]）から、菌体懸濁液を微生物菌体層と実質的に菌体を含まない液層に分離した際の該液層を同様に乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：上清塩濃度[％]）を差引くことにより求められる。
【００１６】
本発明において「保存」とは、タンクや容器中に菌体懸濁液を保管することを意味する。この際、タンクや容器内の濃度が偏らないように、攪拌や通気をしてもよい。濃度分布が生じにくい菌体懸濁液である場合には、攪拌や通気を行わず静置してもかまわない。本発明では、攪拌や通気が不要であるため、静置が好ましい。
【００１７】
本発明において「静置」とは、撹拌や通気をせずタンクや容器中に菌体懸濁液を保管することを意味する。保存は、室温で可能である。但し菌体及び酵素の腐敗・分解を抑制するには、分散媒が凍らない範囲でより低温であることが好ましい。具体的には氷点〜35℃、好ましくは氷点〜30℃、より好ましくは氷点〜20℃、さらに好ましくは氷点〜10℃で行われる。ここで、「氷点」とは、菌体懸濁液の固体状態と液体状態の平衡温度を意味し、懸濁液の組成（分散媒の種類、濃度、菌体の濃度等）や保存容器内の圧力によって変化する温度である。したがって、菌体懸濁液は、氷点以上の温度で保存した場合、凍らない状態で維持される。
【００１８】
保存期間は、１日間以上であればよいが、本発明の効果は３日以上保管した場合により顕著に表れるため、好ましくは、３日間以上、より好ましくは、５日間以上の長期の保存が可能である。
【００１９】
本発明の方法によって微生物菌体を保存した場合、前記微生物菌体のニトリルヒドラターゼ活性は、保存の前後において実質的に変化しない。微生物菌体のニトリルヒドラターゼ活性が、「保存の前後において実質的に変化しない」とは、保存前のニトリルヒドラターゼ活性に対し、保存後のニトリルヒドラターゼ活性が、７０％以上維持されていること、好ましくは、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％以上維持されていることを意味する。
ニトリルヒドラターゼ活性は、当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定できるが、例えば、保存開始前と保存後の基質（例えば、アクリロニトリル）に対するアクリルアミド生成反応速度を比較すること等により測定することが可能である。
【００２０】
本発明において、懸濁液の分散媒とは、保存対象となる微生物菌体の懸濁に使用する溶液を意味する。該分散媒は、好ましくは、有機酸水溶液である。当該有機酸水溶液の有機酸の濃度は任意であるが、低過ぎると酵素活性の低下を招き、一方で、高過ぎると後の工程でこれを除去する際に作業が煩雑になるため、１０〜１００mMであることが好ましい。
【００２１】
本発明に於いて分散媒の組成は、酵素活性を阻害しない有機酸水溶液であれば特に限定されない。有機酸としては、例えば、アクリル酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸等のカルボン酸類が挙げられ、中でもアクリルアミドの品質を維持する点で、アクリル酸が好ましい。
【００２２】
本発明の懸濁液の調製では、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体は、当該技術分野で公知のいずれの濃縮方法で濃縮してもよいが、好ましくは、膜分離又は遠心分離によって濃縮される。濃縮を膜分離で行う場合、０.０２〜０.４５μmの孔径を有する膜を用いることが好ましい。このような膜は、市販されており、例えば、中空糸膜モジュール（クラレ社、細孔径０.０５μm、表面積３９０００m2）等が挙げられる。また、濃縮を遠心分離で行う場合、分離板型連続遠心分離機を用いることが好ましい。
【００２３】
以下、実施例により本発明の実施方法を更に詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。以下の実施例及び比較例に於ける%表示は質量%である。
【実施例】
【００２４】
実施例１（室温保存）
培養
５００ｍｌの三角フラスコにグルコース２％、尿素１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、塩化コバルト０．０５％を含む培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを調製し、１２１℃、２０分のオートクレーブにより滅菌した。この培地にニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（Rhodococcus rhodochrous J-1：FERM BP-1 478）を接種し、３０℃、２３０ｒｐｍにて６６時間培養した。
【００２５】
菌体懸濁液の乾燥菌体質量測定
培養後の菌体懸濁液約１ｇをアルミ皿に採り秤量した。また菌体懸濁液を１２０００ｒｐｍ、２０分で遠心分離し、上清１０ｇを濾過フィルタ（アドバンテック社、細孔径０.４５μm）で濾過し、アルミ皿に受け秤量した。それぞれ乾燥器（ヤマト科学製、ＤＮ６３）にて１２０℃で３時間乾燥させた後、これらを秤量した。菌体懸濁液及び上清について、乾燥前の質量に対する乾燥後の質量を百分率で示し、乾燥菌体質量を求めた。
【００２６】
保存用菌体懸濁液の調製
培養後の微生物菌体を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）により沈降後、０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）で再懸濁・再遠心分離を３回繰り返した後、沈降菌体を再度０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）で懸濁し、乾燥菌体質量として８．０％の菌体懸濁液（実施例１）を得た。この菌体懸濁液の一部を０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液で希釈し、乾燥菌体質量が３．４％である菌体懸濁液（比較例１）を得た。
【００２７】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定
ニトリルヒドラターゼ活性は、上記の方法で調製した直後の菌体懸濁液（０日目）と、同様に調製した菌体懸濁液を室温（１５〜２０℃）で静置することで５日間保存したもの（５日後）を用いて、これらの懸濁液に含まれる菌体によるアクリルアミド生成反応速度から算出した。基質であるアクリロニトリルの水溶液を菌体懸濁液に添加することで反応を開始し、１０℃で１０分間振盪した後、菌体の濾過分離とリン酸添加により反応を停止させ、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ−１４Ｂ、島津製作所）で分析した。分析条件は、Ｐｏｒａｐａｃｋ ＰＳ（ウォーターズ社）を充填した１ｍガラスカラムを用い、カラム温度２１０℃、検出器は２３０℃のＦＩＤを使用した。
本発明におけるニトリルヒドラターゼの酵素活性は、1分間に菌体１ｍｇが生産するアクリルアミドの量（μｍｏｌ）として測定し、以下、０日に於ける反応速度を１００％とした相対反応速度比を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
実施例２及び３（３０℃保存）
培養
５００ｍｌの三角フラスコの代わりに３Ｌジャーファーメンター（高杉製作所製）を用いた以外は、実施例１と同様に培養した。
【００３０】
菌体懸濁液の乾燥菌体質量測定
実施例１と同様の方法で菌体懸濁液の乾燥菌体質量を測定した。
【００３１】
保存用菌体懸濁液の調製
培養後の微生物菌体は中空糸膜モジュール（クラレ社、細孔径０.０５μｍ、表面積３９０００ｍ2）を用いて濃縮後、０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）で洗浄し、乾燥菌体質量が１０．０％になるまで再度濃縮を行って、１０．０％乾燥菌体質量の菌体懸濁液（実施例２）を調製した。この菌体懸濁液の一部を０．１％アクリル酸水溶液で希釈し、乾燥菌体質量が５．０％（実施例３）、２．５％（比較例２）、０．２％（比較例３）の菌体懸濁液を調製した。
【００３２】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定
保存時の温度を３０℃とした以外は、実施例１と同様に実験を行った。０日に於ける反応速度を１００％とした３日後の相対反応速度比を表２に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
実施例４及び５
ロドコッカス ロドクロウス Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製
（１）ロドコッカス ロドクロウス Ｍ８株（以下、Ｍ８株という。）からの染色体ＤＮＡ調製
Ｍ８株(ＳＵ１７３１８１４）は、ロシア菌株センター（Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms :IBFM、Pushchino, 142290, Moscow Region, ロシア）（受託番号：ＶＫＰＭ Ｓ−９２６）から入手することができる。
Ｍ８株を１００ｍｌのＭＹＫ（０．５％ ポリペプトン、０．３％ バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ ＫＨ２ＰＯ４）培地（ｐＨ７．０）中、３０℃にて７２時間振盪培養した。培養液を遠心分離し、集菌した菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁した。懸濁液にリゾチーム８ｍｇを加えて３７℃で１〜２時間振盪した後、−２０℃で凍結した。
次に、当該懸濁液に１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加えた。さらに、当該懸濁液にプロテイナーゼＫ（メルク社）（終濃度０．１ｍｇ）を加え３７℃で１時間振盪した。次に、等量のＴＥ飽和フェノールを加え攪拌後（ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））遠心した。上層を採取し、２倍量のエタノールを加えて、ガラス棒でＤＮＡを巻きとった。その後、これを順次９０％、８０％、７０％のエタノールで遠心分離しフェノールを取り除いた。
次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃、１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるよう加え３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫ（メルク社）を加え３７℃で３０分間振盪した。これに等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。
上層をさらに等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。この操作を再度繰り返した。その後、上層に同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加えて遠心分離し、上層を回収した。次いで、上層に２倍量のエタノールを加えガラス棒でＤＮＡを巻きとって回収し、染色体ＤＮＡを得た。
（２）ＰＣＲを用いたＭ８株染色体ＤＮＡからのニトリルヒドラターゼ遺伝子の調製
Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼは非特許文献（Veiko,V.P.et al, Cloning,nucleotide sequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8, Biotekhnologiia (Mosc.) 5, 3-5 (1995)）に記載されている。Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２、配列番号４、配列番号６に示す。また、これらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５に示す。これらのヌクレオチド配列情報に基づいて、下記のＭ８−１及びＭ８−２プライマーを合成し、（１）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
＜ＰＣＲ反応溶液組成＞
鋳型ＤＮＡ（染色体ＤＮＡ） ２００ｎｇ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（宝酒造社製） ２５μｌ
プライマーＭ８−１ １０ｐｍｏｌ
プライマーＭ８−２ １０ｐｍｏｌ
＜プライマー＞
Ｍ８−１： 5‘-ggtctagaatggatggtatccacgacacaggc-3‘ （配列番号７）
Ｍ８−２： 5‘-cccctgcaggtcagtcgatgatggccatcgattc-3‘ （配列番号８）
＜反応条件＞
（９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃で３０秒）×３０サイクル
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル（同仁化学社製アガロースＩ使用；アガロース濃度０．７重量％）電気泳動に供し、１．６ｋｂの増幅断片の検出を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅ（プロメガ株式会社）を用いて精製した。
回収したＰＣＲ産物はＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造）を用いてベクター（ｐＵＣ１１８／ＨｉｎｃＩＩ部位）に連結し、反応液により大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体コロニーより数クローンをＬＢ−Ａｍｐ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃で１２時間振盪培養した。培養後、この培養物を遠心分離により集菌した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （アマシャムバイオサイエンス社）を用いることにより、集菌した菌体からプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡに対し、シークエンシングキットとオートシークエンサーＣＥＱ ８０００（ベックマンコールター社）を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。
次に、得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩとＳｓｅ８３８７Ｉで切断後、０．７％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子断片（１．６ｋｂ）を回収し、プラスミドｐＳＪ０４２のＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉサイトに導入した。
得られたプラスミドをｐＳＪ−Ｎ０１Ａと命名した。
尚、ｐＳＪ０４２はロドコッカス菌においてＪ１株ニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドとして特開２００８−１５４５５２号公報に示す方法で作製されたものであり、ｐＳＪ０４２の作製に使用したｐＳＪ０２３は形質転換体ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２）として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成９年３月４日付けで寄託されている。
（３）コンピテントセルの作製
ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ １２６７４株（以下、ＡＴＣＣ １２６７４株）をＭＹＫ培地で対数増殖期前期まで培養し、細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁し、コンピテントセルを作製した。
（４）Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製
得られたプラスミドｐＳＪ−Ｎ０１Ａ ０．１μｇとＡＴＣＣ１２６７４株のコンピテントセルの菌体懸濁液各２０μｌとを混合し、各々氷冷した。キュベットに各混合液を入れ、遺伝子導入装置 Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）により２０ ＫＶ／ｃｍ、２００ ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置し、３７℃で１０分間ヒートショックを行った。その後、キュベットにＭＹＫ培地５００μｌを加え、３０ ℃、５時間静置した後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃、３日間培養した。
得られた形質転換体コロニーに含まれるプラスミドＤＮＡを確認し、この組換え菌をＭ８株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ−Ｎ０１Ａ）とした。
【００３５】
培養
実施例１と同様に培養し、組換菌体懸濁液（乾燥菌体２重量％）を得た。
【００３６】
保存用菌体懸濁液の調製
培養後の微生物培養液に、終濃度０．５重量％となるように塩化ベンゼトニウムを加えて攪拌し、４℃で３日間静置し、沈降により菌体と上清を分離した。分離した菌体を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）により沈降後０．１％アクリル酸水溶液（ｐＨ７．０にＮａＯＨで調整）で再懸濁し、乾燥菌体質量として５．４％の菌体懸濁液（実施例４）を得た。この菌体懸濁液の一部を０．１％アクリル酸水溶液（ｐＨ７．０にＮａＯＨで調整）で希釈し、乾燥菌体質量が４．０％である菌体懸濁液（実施例５）と１．０％である菌体懸濁液（比較例４）を得た。
【００３７】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定
ニトリルヒドラターゼ活性は、上記の方法で調製した直後の菌体懸濁液（０日目）と、同様に調製した菌体懸濁液を３０℃で静置することで５日間保存したもの（５日後）を用いて、実施例１と同様に測定・算出した。以下、０日に於ける反応速度を１００％とした相対反応速度比を表３に示す。
【００３８】
【表３】
【００３９】
上記実施例１から４の結果から、本発明の懸濁液を用いることにより、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を室温以上で保存した場合でも、微生物菌体のニトリルヒドラターゼは保存前の活性を維持できることが分かる。
【受託番号】
【００４０】
ロドコッカス・ロドクロウスＪ-１株（Rhodococcus rhodochrous J-1）：受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８」として、１９８７年９月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に寄託されている。
【００４１】
ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３：受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２」として、１９９７年３月４日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。
【配列表フリーテキスト】
【００４２】
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を所定の濃度で菌体懸濁液中に保存することにより、該微生物菌体を安定に保存する方法に関する。また、本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を所定の濃度で含む菌体懸濁液に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の産生する酵素は、化学変換反応の触媒として多くの場面で使用されている。とりわけ、ニトリル基の水和又は加水分解能を有するニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ等を利用することにより、化学工業上重要なアミド、カルボン酸、α-ヒドロキシカルボン酸等を安価に製造することが可能になる。更に、光学特異的水和又は光学特異的加水分解能を持つ上記酵素を利用することにより、医薬、農薬の製造原料として重要な光学活性カルボン酸、アミノ酸、α-ヒドロキシカルボン酸等の製造も可能になる。
【０００３】
微生物酵素を触媒とする化学変換反応においては、培養及び集菌した微生物菌体を使用時まで安定に保存しておく必要がある。すなわち、雑菌が混入して、腐敗し、あるいは溶菌することで、微生物酵素の触媒能が失われたり、低下したりしないように保存しておかなければならない。そこで一般的には、安定剤、代謝阻害剤、高濃度塩類の存在下で保存することにより微生物菌体保存時の微生物酵素の失活や腐敗、溶菌を抑制し、化学変換反応に使用している。上記安定剤等を添加しない場合には、凍結や冷蔵、或いは通期撹拌により酵素の活性を維持しながら保存することが知られている。
【０００４】
例えば、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物の場合、高濃度の無機塩類を含む水溶液中で保存する方法（特許文献１）、凍結により保存する方法（特許文献２）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３１６３２２４号
【特許文献２】特開２００３-２１９８７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの保存方法のうち、高濃度の無機塩類を含む水溶液を使用する方法は、後の工程で洗浄等を行う必要があるため、製品の品質に影響を与える恐れがあり、更に製造方法が煩雑になる。また、凍結により保存する方法では、凍結、融解操作が煩雑であるなど、その取り扱い性に問題があり、またその操作に伴って酵素活性が失われたり、低下したりする恐れがある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、培養、集菌して得られた微生物菌体の懸濁液を、安価でしかも安定的に保存する条件について鋭意検討した結果、菌体を４〜２０質量％の範囲の濃度に濃縮することで、これまで通常では到底考えられなかった室温下で、しかも無撹拌で溶菌や酵素の失活を起こさず、安定に保存できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を、乾燥菌体質量として４〜２０質量％の濃度で分散媒中で保存することを特徴とする微生物菌体の保存方法に関する。また、本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を乾燥菌体質量として４〜２０質量％の菌体濃度で含む、微生物菌体の懸濁液に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、菌体懸濁液に含まれる微生物菌体の濃度を一定範囲にコントロールすることにより、多量の菌体を、室温下、無撹拌でも腐敗や酵素の劣化なしにニトリルヒドラターゼ等の酵素活性を維持したまま長期間保存することが可能となる。更に、本発明によれば、微生物菌体を使用する際に洗浄を必要とせず、従来の保存方法で必要とされてきた労力やコストを大幅に削減することができ、工業的に満足し得る微生物菌体の保存方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２００９年７ 月２４日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２００９−１７３１６２号）の明細書に記載の内容を包含する。
【００１１】
本発明においてニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体は、目的とする酵素触媒を生産し菌体内に蓄積又は菌体外に分泌する性質を有するものである。この微生物には自然界より単離された微生物及び遺伝子組換え微生物が含まれる。このような微生物の代表例としては、例えば、ニトリルヒドラターゼ活性を持つロドコッカス（Rhodococcus）属、ゴルドナ（Gordona）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュードノカルディア（Pseudonocardia）属、ジオバチルス（Geobacillus）属に属する微生物菌体が挙げられる。更に、これらの微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え微生物菌体が挙げられる。中でも工業的には、ロドコッカス属、ゴルドナ属並びにこれらの微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え大腸菌及び組換えロドコッカス属細菌が好ましい。例えば、ロドコッカス属の微生物の具体例としては、特公平６-５５１４８号公報に記載されるロドコッカス・ロドクロウスＪ-１株（Rhodococcus rhodochrous J-1）が挙げられる。当該株は、受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８」として、１９８７年９月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６（以下、本明細書において同様））に寄託されている。
【００１２】
ニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して、対応するアミド化合物を生成する能力を持つ酵素をいうものである。ニトリルヒドラーゼをコードする核酸及びその配列の例としては、前記特許文献２に記載されるものが挙げられる。このような核酸は、通常の分子生物学的手法によって、微生物細胞内に導入可能である（これらの分子学的手法については、以下を参照：Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
【００１３】
保存時の菌体懸濁液の濃度は、乾燥菌体として４質量％以上、好ましくは５質量％以上である。４質量％未満の低濃度の場合は、室温で活性が低下してしまうことが分かった。その原因として考えられるのは、菌濃度がある程度高く液中に密集している状態だと菌体表面に他の菌の生育を抑制する機能がある、もしくは何らかの他の菌体の生育抑制物質があるためと推察している。４質量％未満の低濃度の場合、この効果は期待できず、懸濁液中で雑菌が増殖し易くなるので、雑菌の生成する窒素酸化物などにより菌体が損傷を受けると考えられる。そして又、４質量％未満の低濃度の場合、粘性が低いので菌体が自由にブラウン運動し、菌体同士の衝突が頻繁に起こり、菌体自体が損傷して酵素の活性が低下するものとも考えられる。
従って、４質量％以上とすることにより、室温での保存安定性が良くなるが、２０質量％を超えると、菌体懸濁液の流動性が低下するために液体としての取り扱いが困難になり、保存・運搬に適さないものとなる。従って、保存時の菌体懸濁液の濃度は、乾燥菌体として４〜２０質量％、好ましくは、５〜１５質量％、より好ましくは、５〜１０質量％である。
【００１４】
「乾燥菌体」とは、実質的に水を含まない微生物菌体の乾燥物を意味するが、菌体以外の残存懸濁液成分等を含有する場合もある。乾燥菌体は、例えば、菌体懸濁液を１２０℃の乾燥機で３時間乾燥させることにより得ることができる。
【００１５】
「乾燥菌体濃度（乾燥菌体質量（％））」とは、菌体懸濁液に含まれる菌体の乾燥質量の比率により表され、具体的には、菌体懸濁液を１２０℃の乾燥機で３時間乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：菌液乾燥残渣割合[％]）から、菌体懸濁液を微生物菌体層と実質的に菌体を含まない液層に分離した際の該液層を同様に乾燥させた時の乾燥前後の質量比（百分率：上清塩濃度[％]）を差引くことにより求められる。
【００１６】
本発明において「保存」とは、タンクや容器中に菌体懸濁液を保管することを意味する。この際、タンクや容器内の濃度が偏らないように、攪拌や通気をしてもよい。濃度分布が生じにくい菌体懸濁液である場合には、攪拌や通気を行わず静置してもかまわない。本発明では、攪拌や通気が不要であるため、静置が好ましい。
【００１７】
本発明において「静置」とは、撹拌や通気をせずタンクや容器中に菌体懸濁液を保管することを意味する。保存は、室温で可能である。但し菌体及び酵素の腐敗・分解を抑制するには、分散媒が凍らない範囲でより低温であることが好ましい。具体的には氷点〜35℃、好ましくは氷点〜30℃、より好ましくは氷点〜20℃、さらに好ましくは氷点〜10℃で行われる。ここで、「氷点」とは、菌体懸濁液の固体状態と液体状態の平衡温度を意味し、懸濁液の組成（分散媒の種類、濃度、菌体の濃度等）や保存容器内の圧力によって変化する温度である。したがって、菌体懸濁液は、氷点以上の温度で保存した場合、凍らない状態で維持される。
【００１８】
保存期間は、１日間以上であればよいが、本発明の効果は３日以上保管した場合により顕著に表れるため、好ましくは、３日間以上、より好ましくは、５日間以上の長期の保存が可能である。
【００１９】
本発明の方法によって微生物菌体を保存した場合、前記微生物菌体のニトリルヒドラターゼ活性は、保存の前後において実質的に変化しない。微生物菌体のニトリルヒドラターゼ活性が、「保存の前後において実質的に変化しない」とは、保存前のニトリルヒドラターゼ活性に対し、保存後のニトリルヒドラターゼ活性が、７０％以上維持されていること、好ましくは、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％以上維持されていることを意味する。
ニトリルヒドラターゼ活性は、当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定できるが、例えば、保存開始前と保存後の基質（例えば、アクリロニトリル）に対するアクリルアミド生成反応速度を比較すること等により測定することが可能である。
【００２０】
本発明において、懸濁液の分散媒とは、保存対象となる微生物菌体の懸濁に使用する溶液を意味する。該分散媒は、好ましくは、有機酸水溶液である。当該有機酸水溶液の有機酸の濃度は任意であるが、低過ぎると酵素活性の低下を招き、一方で、高過ぎると後の工程でこれを除去する際に作業が煩雑になるため、１０〜１００mMであることが好ましい。
【００２１】
本発明に於いて分散媒の組成は、酵素活性を阻害しない有機酸水溶液であれば特に限定されない。有機酸としては、例えば、アクリル酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸等のカルボン酸類が挙げられ、中でもアクリルアミドの品質を維持する点で、アクリル酸が好ましい。
【００２２】
本発明の懸濁液の調製では、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体は、当該技術分野で公知のいずれの濃縮方法で濃縮してもよいが、好ましくは、膜分離又は遠心分離によって濃縮される。濃縮を膜分離で行う場合、０.０２〜０.４５μmの孔径を有する膜を用いることが好ましい。このような膜は、市販されており、例えば、中空糸膜モジュール（クラレ社、細孔径０.０５μm、表面積３９０００m2）等が挙げられる。また、濃縮を遠心分離で行う場合、分離板型連続遠心分離機を用いることが好ましい。
【００２３】
以下、実施例により本発明の実施方法を更に詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。以下の実施例及び比較例に於ける%表示は質量%である。
【実施例】
【００２４】
実施例１（室温保存）
培養
５００ｍｌの三角フラスコにグルコース２％、尿素１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、塩化コバルト０．０５％を含む培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを調製し、１２１℃、２０分のオートクレーブにより滅菌した。この培地にニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（Rhodococcus rhodochrous J-1：FERM BP-1 478）を接種し、３０℃、２３０ｒｐｍにて６６時間培養した。
【００２５】
菌体懸濁液の乾燥菌体質量測定
培養後の菌体懸濁液約１ｇをアルミ皿に採り秤量した。また菌体懸濁液を１２０００ｒｐｍ、２０分で遠心分離し、上清１０ｇを濾過フィルタ（アドバンテック社、細孔径０.４５μm）で濾過し、アルミ皿に受け秤量した。それぞれ乾燥器（ヤマト科学製、ＤＮ６３）にて１２０℃で３時間乾燥させた後、これらを秤量した。菌体懸濁液及び上清について、乾燥前の質量に対する乾燥後の質量を百分率で示し、乾燥菌体質量を求めた。
【００２６】
保存用菌体懸濁液の調製
培養後の微生物菌体を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）により沈降後、０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）で再懸濁・再遠心分離を３回繰り返した後、沈降菌体を再度０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）で懸濁し、乾燥菌体質量として８．０％の菌体懸濁液（実施例１）を得た。この菌体懸濁液の一部を０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液で希釈し、乾燥菌体質量が３．４％である菌体懸濁液（比較例１）を得た。
【００２７】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定
ニトリルヒドラターゼ活性は、上記の方法で調製した直後の菌体懸濁液（０日目）と、同様に調製した菌体懸濁液を室温（１５〜２０℃）で静置することで５日間保存したもの（５日後）を用いて、これらの懸濁液に含まれる菌体によるアクリルアミド生成反応速度から算出した。基質であるアクリロニトリルの水溶液を菌体懸濁液に添加することで反応を開始し、１０℃で１０分間振盪した後、菌体の濾過分離とリン酸添加により反応を停止させ、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ−１４Ｂ、島津製作所）で分析した。分析条件は、Ｐｏｒａｐａｃｋ ＰＳ（ウォーターズ社）を充填した１ｍガラスカラムを用い、カラム温度２１０℃、検出器は２３０℃のＦＩＤを使用した。
本発明におけるニトリルヒドラターゼの酵素活性は、1分間に菌体１ｍｇが生産するアクリルアミドの量（μｍｏｌ）として測定し、以下、０日に於ける反応速度を１００％とした相対反応速度比を表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
実施例２及び３（３０℃保存）
培養
５００ｍｌの三角フラスコの代わりに３Ｌジャーファーメンター（高杉製作所製）を用いた以外は、実施例１と同様に培養した。
【００３０】
菌体懸濁液の乾燥菌体質量測定
実施例１と同様の方法で菌体懸濁液の乾燥菌体質量を測定した。
【００３１】
保存用菌体懸濁液の調製
培養後の微生物菌体は中空糸膜モジュール（クラレ社、細孔径０.０５μｍ、表面積３９０００ｍ2）を用いて濃縮後、０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）で洗浄し、乾燥菌体質量が１０．０％になるまで再度濃縮を行って、１０．０％乾燥菌体質量の菌体懸濁液（実施例２）を調製した。この菌体懸濁液の一部を０．１％アクリル酸水溶液で希釈し、乾燥菌体質量が５．０％（実施例３）、２．５％（比較例２）、０．２％（比較例３）の菌体懸濁液を調製した。
【００３２】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定
保存時の温度を３０℃とした以外は、実施例１と同様に実験を行った。０日に於ける反応速度を１００％とした３日後の相対反応速度比を表２に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
実施例４及び５
ロドコッカス ロドクロウス Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製
（１）ロドコッカス ロドクロウス Ｍ８株（以下、Ｍ８株という。）からの染色体ＤＮＡ調製
Ｍ８株(ＳＵ１７３１８１４）は、ロシア菌株センター（Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms :IBFM、Pushchino, 142290, Moscow Region, ロシア）（受託番号：ＶＫＰＭ Ｓ−９２６）から入手することができる。
Ｍ８株を１００ｍｌのＭＹＫ（０．５％ ポリペプトン、０．３％ バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ ＫＨ２ＰＯ４）培地（ｐＨ７．０）中、３０℃にて７２時間振盪培養した。培養液を遠心分離し、集菌した菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍｌに懸濁した。懸濁液にリゾチーム８ｍｇを加えて３７℃で１〜２時間振盪した後、−２０℃で凍結した。
次に、当該懸濁液に１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加えた。さらに、当該懸濁液にプロテイナーゼＫ（メルク社）（終濃度０．１ｍｇ）を加え３７℃で１時間振盪した。次に、等量のＴＥ飽和フェノールを加え攪拌後（ＴＥ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））遠心した。上層を採取し、２倍量のエタノールを加えて、ガラス棒でＤＮＡを巻きとった。その後、これを順次９０％、８０％、７０％のエタノールで遠心分離しフェノールを取り除いた。
次に、ＤＮＡを３ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃、１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍｌになるよう加え３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫ（メルク社）を加え３７℃で３０分間振盪した。これに等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。
上層をさらに等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。この操作を再度繰り返した。その後、上層に同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加えて遠心分離し、上層を回収した。次いで、上層に２倍量のエタノールを加えガラス棒でＤＮＡを巻きとって回収し、染色体ＤＮＡを得た。
（２）ＰＣＲを用いたＭ８株染色体ＤＮＡからのニトリルヒドラターゼ遺伝子の調製
Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼは非特許文献（Veiko,V.P.et al, Cloning,nucleotide sequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8, Biotekhnologiia (Mosc.) 5, 3-5 (1995)）に記載されている。Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼのβサブユニット、αサブユニット、アクチベーターのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２、配列番号４、配列番号６に示す。また、これらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５に示す。これらのヌクレオチド配列情報に基づいて、下記のＭ８−１及びＭ８−２プライマーを合成し、（１）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
＜ＰＣＲ反応溶液組成＞
鋳型ＤＮＡ（染色体ＤＮＡ） ２００ｎｇ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（宝酒造社製） ２５μｌ
プライマーＭ８−１ １０ｐｍｏｌ
プライマーＭ８−２ １０ｐｍｏｌ
＜プライマー＞
Ｍ８−１： 5‘-ggtctagaatggatggtatccacgacacaggc-3‘ （配列番号７）
Ｍ８−２： 5‘-cccctgcaggtcagtcgatgatggccatcgattc-3‘ （配列番号８）
＜反応条件＞
（９８℃ １０秒、５５℃ ５秒、７２℃で３０秒）×３０サイクル
ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを０．７％アガロースゲル（同仁化学社製アガロースＩ使用；アガロース濃度０．７重量％）電気泳動に供し、１．６ｋｂの増幅断片の検出を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅ（プロメガ株式会社）を用いて精製した。
回収したＰＣＲ産物はＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造）を用いてベクター（ｐＵＣ１１８／ＨｉｎｃＩＩ部位）に連結し、反応液により大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体コロニーより数クローンをＬＢ−Ａｍｐ培地１．５ｍｌに接種し、３７℃で１２時間振盪培養した。培養後、この培養物を遠心分離により集菌した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （アマシャムバイオサイエンス社）を用いることにより、集菌した菌体からプラスミドＤＮＡを抽出した。得られたプラスミドＤＮＡに対し、シークエンシングキットとオートシークエンサーＣＥＱ ８０００（ベックマンコールター社）を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。
次に、得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩとＳｓｅ８３８７Ｉで切断後、０．７％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子断片（１．６ｋｂ）を回収し、プラスミドｐＳＪ０４２のＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉサイトに導入した。
得られたプラスミドをｐＳＪ−Ｎ０１Ａと命名した。
尚、ｐＳＪ０４２はロドコッカス菌においてＪ１株ニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドとして特開２００８−１５４５５２号公報に示す方法で作製されたものであり、ｐＳＪ０４２の作製に使用したｐＳＪ０２３は形質転換体ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２）として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成９年３月４日付けで寄託されている。
（３）コンピテントセルの作製
ロドコッカス・ロドクロウスＡＴＣＣ １２６７４株（以下、ＡＴＣＣ １２６７４株）をＭＹＫ培地で対数増殖期前期まで培養し、細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁し、コンピテントセルを作製した。
（４）Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製
得られたプラスミドｐＳＪ−Ｎ０１Ａ ０．１μｇとＡＴＣＣ１２６７４株のコンピテントセルの菌体懸濁液各２０μｌとを混合し、各々氷冷した。キュベットに各混合液を入れ、遺伝子導入装置 Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）により２０ ＫＶ／ｃｍ、２００ ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下１０分静置し、３７℃で１０分間ヒートショックを行った。その後、キュベットにＭＹＫ培地５００μｌを加え、３０ ℃、５時間静置した後、５０μｇ／ｍｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃、３日間培養した。
得られた形質転換体コロニーに含まれるプラスミドＤＮＡを確認し、この組換え菌をＭ８株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ−Ｎ０１Ａ）とした。
【００３５】
培養
実施例１と同様に培養し、組換菌体懸濁液（乾燥菌体２重量％）を得た。
【００３６】
保存用菌体懸濁液の調製
培養後の微生物培養液に、終濃度０．５重量％となるように塩化ベンゼトニウムを加えて攪拌し、４℃で３日間静置し、沈降により菌体と上清を分離した。分離した菌体を５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で懸濁し、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）により沈降後０．１％アクリル酸水溶液（ｐＨ７．０にＮａＯＨで調整）で再懸濁し、乾燥菌体質量として５．４％の菌体懸濁液（実施例４）を得た。この菌体懸濁液の一部を０．１％アクリル酸水溶液（ｐＨ７．０にＮａＯＨで調整）で希釈し、乾燥菌体質量が４．０％である菌体懸濁液（実施例５）と１．０％である菌体懸濁液（比較例４）を得た。
【００３７】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定
ニトリルヒドラターゼ活性は、上記の方法で調製した直後の菌体懸濁液（０日目）と、同様に調製した菌体懸濁液を３０℃で静置することで５日間保存したもの（５日後）を用いて、実施例１と同様に測定・算出した。以下、０日に於ける反応速度を１００％とした相対反応速度比を表３に示す。
【００３８】
【表３】
【００３９】
上記実施例１から４の結果から、本発明の懸濁液を用いることにより、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を室温以上で保存した場合でも、微生物菌体のニトリルヒドラターゼは保存前の活性を維持できることが分かる。
【受託番号】
【００４０】
ロドコッカス・ロドクロウスＪ-１株（Rhodococcus rhodochrous J-1）：受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８」として、１９８７年９月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に寄託されている。
【００４１】
ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＳＪ０２３：受託番号「ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３２」として、１９９７年３月４日に独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されている。
【配列表フリーテキスト】
【００４２】
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を、乾燥菌体質量として４〜２０質量％の濃度で分散媒中で保存することを特徴とする微生物菌体の保存方法。
【請求項２】
前記保存は、３５℃以下で且つ凍らない状態で静置保存するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分散媒が有機酸水溶液である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記有機酸がアクリル酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物菌体のニトリルヒドラターゼ活性が、保存の前後において実質的に変化しないことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物がロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物がロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（Rhodococcus rhodochrous J-1）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）又はロドコッカス・ロドクロウスＭ８株（受託番号：ＶＫＰＭ Ｓ−９２６）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を乾燥菌体質量として４〜２０質量％の菌体濃度で含む、微生物菌体の懸濁液。
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を、乾燥菌体質量として４〜２０質量％の濃度で分散媒中で保存することを特徴とする微生物菌体の保存方法。
【請求項２】
前記保存は、３５℃以下で且つ凍らない状態で静置保存するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分散媒が有機酸水溶液である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記有機酸がアクリル酸である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物菌体のニトリルヒドラターゼ活性が、保存の前後において実質的に変化しないことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物がロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物がロドコッカス・ロドクロウスＪ−１株（Rhodococcus rhodochrous J-1）（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）又はロドコッカス・ロドクロウスＭ８株（受託番号：ＶＫＰＭ Ｓ−９２６）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を乾燥菌体質量として４〜２０質量％の菌体濃度で含む、微生物菌体の懸濁液。
【公開番号】特開２０１１−４１５６３（Ｐ２０１１−４１５６３Ａ）
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６６６７１（Ｐ２０１０−１６６６７１）
【出願日】平成２２年７月２６日（２０１０．７．２６）
【出願人】（３０１０５７９２３）ダイヤニトリックス株式会社 (127)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２６日（２０１０．７．２６）
【出願人】（３０１０５７９２３）ダイヤニトリックス株式会社 (127)
【Ｆターム（参考）】
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