微生物製剤および揮発性有機化合物浄化方法
【課題】汚染物質分解微生物が土着生物の捕食を受けることなく、効率的な浄化処理を行う新規微生物製剤を用いた浄化を目的とする。
【解決手段】刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物３とを含有する微生物製剤を、汚染現場等に投与し、刺激応答性高分子の収縮を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子が収縮し、疎水性となり、汚染物質分解微生物３は土着好気性微生物５の捕食から保護され、また、汚染現場等に好気性微生物の栄養源６も同時に添加すると、土着好気性微生物５は栄養源を消費して増殖するとともに、酸素の消費を促し、汚染現場内に嫌気的状態を構築する。一定期間経過後、汚染現場等が嫌気的状態となったところで、刺激応答性高分子を親水性に変化させ、固定している汚染物質分解微生物３を開放することで、すみやかに浄化反応を開始できる微生物製剤が得られる。
【解決手段】刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物３とを含有する微生物製剤を、汚染現場等に投与し、刺激応答性高分子の収縮を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子が収縮し、疎水性となり、汚染物質分解微生物３は土着好気性微生物５の捕食から保護され、また、汚染現場等に好気性微生物の栄養源６も同時に添加すると、土着好気性微生物５は栄養源を消費して増殖するとともに、酸素の消費を促し、汚染現場内に嫌気的状態を構築する。一定期間経過後、汚染現場等が嫌気的状態となったところで、刺激応答性高分子を親水性に変化させ、固定している汚染物質分解微生物３を開放することで、すみやかに浄化反応を開始できる微生物製剤が得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に揮発性有機塩素化合物等によって汚染された土壌や地下水等の浄化に使用される微生物製剤、およびその微生物製剤を用いた浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人体や生物に対して変異原性や催奇性などの毒性を有する化学物質の拡散によって、世界的規模で化学物質汚染が拡大している。例えば、ポリ塩化ジベンゾパラジオキシンやポリ塩化ジベンゾフラン、コプラナーＰＣＢ等のいわゆるダイオキシン類は、人類が作った最悪の毒物と言われており、わが国は世界最大のダイオキシン類排出国となっている。また重油タンカーの座礁等により海洋に重油が流出し、重油に含まれるジベンゾチオフェン等の難分解性含硫多環芳香族炭化水素によって、すでに海洋生物等に深刻な影響が出ている。
【０００３】
さまざまな化学物質汚染の中で近年特に問題視されているのが、テトラクロロエチレンやトリクロロエチレン等の揮発性有機塩素化合物による汚染である。これらの物質は主に、代替フロンガスの合成原料や機械部品、電子部品の脱脂洗浄剤として汎用されてきたが、それと同時に汚染も拡大し、さまざまな浄化対策が行われている。
【０００４】
浄化対策として、揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水を汲み上げ、排水処理を行う揚水ばっ気法や、汚染現場に薬剤を投入して浄化を行う薬剤混合法（ホットソイル法）等の物理化学的浄化方法が行われている。物理化学的浄化方法は、高濃度の揮発性有機塩素化合物汚染に対しては威力を発揮するが、低濃度の汚染についてはエネルギー的、コスト的な面で効果的ではない。また薬剤を添加する方法であると、添加された薬剤による二次汚染の影響が懸念される。
【０００５】
以上のような物理化学的浄化方法の問題点に鑑み、近年新たな浄化方法として注目されているのが、微生物等によって揮発性有機塩素化合物を分解、無害化する技術、いわゆるバイオレメディエーションである。バイオレメディエーションはさらに二つの手法に大別される。その一つが、汚染現場に微生物の栄養源等を加え、土着微生物を活性化することで汚染物質の分解を促進するバイオスティミュレーションである。特に揮発性有機塩素化合物の場合、塩素置換数の多いテトラクロロエチレンは、嫌気性微生物による還元的脱塩素化反応を受けやすい物質であるため、水素等の電子供与体となる物質を添加することが多い。
【０００６】
また人為的に分解能力の高い微生物を育種し、汚染現場等に投与して浄化を行うバイオオーギュメンテーションと呼ばれる技術もある。バイオスティミュレーションは、汚染現場に微生物の栄養源を添加するのみであることから広がりをみせているが、バイオオーギュメンテーションは外来微生物を開放系で使用するため、生態系や人体への安全性が保証されておらず、地域住民の了解（パブリック・アクセプタンス）が得にくいことから、施工例が非常に少なかった。しかし、２００５年に経済産業省より「微生物によるバイオレメディエーション利用指針」が告示され、今後バイオオーギュメンテーションは大きな広がりをみせることが予想される。
【０００７】
微生物による揮発性有機塩素化合物の分解活性を大きく左右するのは、汚染現場等の環境である。一般的に、塩素置換数の多いテトラクロロエチレンは、嫌気性微生物による還元的脱塩素化反応を受けやすく、好気性微生物には分解されにくい物質である。従って、如何に汚染現場等を嫌気的状態に保つかが、浄化の成功を決定づける要因の一つとなる。
【０００８】
以下、汚染現場に酵母エキスを供給し、土着の好気性微生物を活性・増殖させることで、汚染現場を嫌気的状態にした後、嫌気性微生物に揮発性有機塩素化合物を分解させる方法について特許文献１を参照しながら説明する。
【０００９】
汚染現場に対して酵母エキスを供給すると、土着好気性微生物は酵母エキスを電子供与体、酸素を電子授与体として消費し、汚染現場を嫌気的状態にする。その後、嫌気的状態において嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を電子受容体として利用する。汚染現場にテトラクロロエチレンが存在した場合、嫌気性微生物によって逐次的な脱塩素化反応が起こり、テトラクロロエチレンからトリクロロエチレン、ジクロロエチレン、ビニルクロリドを経て、最終的に無害なエチレン等まで分解される。嫌気性微生物は揮発性有機塩素化合物を電子受容体として利用するため、適当な電子供与体があれば脱塩素化は促進される。電子供与体には酵母エキス以外にもフミン酸等があり、食品工場などからの有機廃棄物の中から、マイクロコズムの実験結果に基づいて選択され、汚染の除去に使用される。
【００１０】
しかしながら、もし土着嫌気性微生物の中で、揮発性有機塩素化合物の分解酵素遺伝子をもたない微生物、あるいは分解酵素遺伝子が発現していない微生物が、生態系の中で優先的な位置を占めている場合、汚染現場にいくら電子供与体を添加しても、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化は起こらないことになる。つまり、汚染現場を嫌気的状態にして電子供与体を添加するだけでは十分とは言えず、必要に応じて脱塩素化能力の高い外来微生物を投与し、揮発性有機塩素化合物を無害なエチレン等にまで迅速に分解処理する必要がある。
【００１１】
バイオオーギュメンテーションで問題点として、汚染現場にて汚染物質分解微生物の揮発性有機塩素化合物分解活性を維持しにくいことがある。分解活性を維持しにくいことの理由として、汚染現場の環境が分解活性を維持するのに適切でない、つまり汚染現場の酸素濃度や温度、ｐＨ等が分解活性に悪影響を与えてしまう可能性があげられる。また、汚染現場内に生育する原生動物等の土着生物によって、汚染物質分解微生物が捕食されてしまう恐れもある。汚染現場内に存在する生態系ピラミッドの中で、最も下位の生育環境にあるのが微生物であるため、汚染物質分解微生物が捕食される可能性は非常に高い。また微生物間の競合関係も無視できない。従って、汚染現場において汚染物質分解微生物の分解活性を安定させる技術が要望されている。
【００１２】
以下、土着微生物の捕食から汚染物質分解微生物を保護する手段として特許文献２を参照しながら説明する。
【００１３】
汚染物質分解微生物が土着生物から捕食されるのを防ぐため、汚染現場に捕食微生物排除剤を添加する。捕食微生物排除剤とは、捕食微生物の有する走化性を刺激する物質であり、捕食微生物はこの物質の濃度勾配を感じ取り、移動する性質がある。この性質を応用すれば、捕食微生物を汚染現場から排除することが可能となる。
【００１４】
しかしながら、捕食微生物を汚染現場から非汚染現場へ移動させるためには、移動距離間に捕食微生物排除剤の濃度勾配を作製しなければならない。しかし、実際の汚染現場において排除剤を拡散させることは容易ではなく、まして濃度勾配を作製することは困難を極める。さらに捕食微生物が非汚染環境へ移動するには膨大な時間が必要となり、現実的ではない。
【特許文献１】特開２００３−２５１３３１号公報
【特許文献２】特開平０７−０８８４６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
汚染現場に微生物の栄養源等を添加するバイオスティミュレーションでは、もし土着微生物の中で汚染物質分解酵素遺伝子をもたないもの、あるいは汚染物質分解酵素遺伝子が発現してないものが、生態系の中で優先的な地位を占めている場合、汚染現場にいくら栄養源等を添加しても、汚染物質の分解が進まないという課題がある。従って、分解活性の高い微生物を新たに添加するバイオオーギュメンテーション技術が求められている。しかし、人為的に分離、育種した汚染物質分解微生物は土着生物に捕食される可能性が高いため、安定的な浄化には課題が多い。
【００１６】
本発明はこのような従来の課題を解決するものであり、人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物の分解能を有する汚染物質分解微生物を、疎水性に保持した刺激応答性高分子で固定することによって、汚染現場等内の環境が汚染物質分解微生物に適した環境となるまで、土着生物の捕食から汚染物質分解微生物を保護することが可能となる。なお、人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物とは、動物実験を通して、人体に対して急性毒性、慢性毒性の疑われる化合物とする。また、刺激応答性高分子とともに好気性微生物の栄養源を添加し、汚染現場内の嫌気的状態とし、土着好気性微生物や原生動物等を窒息、駆除した後、刺激応答性高分子の物性を親水性に変化させて、刺激応答性高分子内に固定された汚染物質分解微生物を汚染現場に開放することで、土着生物からの捕食を受けることなく、安定した浄化が可能となる。
【００１７】
また、塩素置換数の多いテトラクロロエチレンは、嫌気性微生物による還元的脱塩素化反応を受けやすいため、揮発性有機塩素化合物の汚染現場に投与する汚染物質分解微生物としては、嫌気性微生物が好ましく、さらに汚染現場が嫌気的状態であることが求められる。しかし土壌など汚染現場の多くは好気的、あるいは微好気的状態であることが多く、投与した嫌気性微生物が汚染現場中の酸素によってダメージを受ける可能性がある。
【００１８】
本発明はこのような従来の課題を解決するものであり、好気性微生物の栄養源と刺激応答性高分子と揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物とを含有する微生物製剤を汚染現場に投入することによって、土着好気性微生物を増殖させ、汚染現場内の酸素の消費を促すことが可能となる。さらに、汚染現場が嫌気的状態へと変化するまでの一定期間は、刺激応答性高分子を疎水性に保持して汚染物質分解微生物を固定しておく。汚染現場が嫌気的状態となった後、刺激応答性高分子を親水性にし、固定している汚染物質分解微生物をすみやかに開放することで、浄化反応を開始することが可能となる。また、汚染現場を嫌気的状態とすることは土着好気性生物を窒息、駆除することも意味しているため、汚染物質分解微生物にとって理想的な環境で浄化反応を開始することが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の微生物製剤は上記目的を達成するために、人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物の分解能を有する汚染物質分解微生物を、刺激応答性高分子で固定することを特徴としたものであり、刺激応答性高分子を疎水性に保持することで汚染物質分解微生物を固定し、刺激応答性高分子を親水性と変化させることで、汚染物質分解微生物を開放することができる微生物製剤が得られる。
【００２０】
また、他の手段は、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を、刺激応答性高分子で固定することを特徴とする請求項１記載の微生物製剤としたものであり、刺激応答性高分子を疎水性に保持することで嫌気性微生物を固定し、刺激応答性高分子を親水性と変化させることで、嫌気性微生物を開放することができる微生物製剤が得られる。
【００２１】
また、他の手段は、好気性微生物の栄養源と刺激応答性高分子と揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物とを含有することを特徴とする請求項１または２記載の微生物製剤としたものでであり、微生物製剤を汚染現場に投入することによって、土着好気性微生物が栄養源を消費して増殖するとともに、酸素の消費を促す。汚染現場が嫌気的状態へと変化するまでの一定期間は、疎水性に保持した刺激応答性高分子によって、嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、汚染現場が嫌気的状態となったところで、刺激応答性高分子を親水性にし、固定している嫌気性微生物をすみやかに開放することで、浄化反応を開始することができる微生物製剤が得られる。
【００２２】
また、他の手段は、刺激応答性高分子の内側に、揮発性有機化合物の脱塩素機能を有する嫌気性微生物を含み、外側に好気性微生物の栄養源を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、土着好気性微生物が栄養源を消費すると同時に、嫌気性微生物を固定した刺激性応答高分子が汚染現場に浸透、拡散し、現場内が嫌気性状態となった時、すみやかに嫌気性微生物による浄化を行うことができる微生物製剤が得られる。
【００２３】
また、他の手段は、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を固定した刺激応答性高分子を、さらに好気性微生物の栄養源で包含することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、土着好気性微生物が栄養源をある程度消費すると、嫌気性微生物を固定した刺激応答性高分子が汚染現場に浸透、拡散し、現場内が嫌気性状態となった時、すみやかに嫌気性微生物による浄化を行うことができる微生物製剤が得られる。
【００２４】
また、他の手段は、好気性微生物の栄養源が飽和脂肪酸を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、汚染現場に投入すると、飽和脂肪酸が土着好気性微生物によって消費されるとともに、嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を脱塩素化する際の電子供与体も同時に放出され、嫌気的状態での脱塩素化反応を促すことができる微生物製剤が得られる。
【００２５】
また、他の手段は、好気性微生物の栄養源がステアリン酸を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、汚染現場に投入すると、ステアリン酸等が土着好気性微生物によって消費されるとともに、嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を脱塩素化する際の電子供与体も徐々に放出され、嫌気的状態での脱塩素化反応を促すことができる微生物製剤が得られる。
【００２６】
また、他の手段は、刺激応答性高分子が温度応答性高分子であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以上にすることで、容易に温度応答性高分子を疎水性に保持し、嫌気性微生物を固定し、また、汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以下にすると、すみやかに温度応答性高分子が親水性へと変化し、嫌気性微生物を開放することができる微生物製剤が得られる。
【００２７】
また、他の手段は、温度応答性高分子の下限臨界溶解温度が３７℃以下であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、汚染現場内の温度を３７℃以上にすることで、容易に温度応答性高分子を疎水性に保持することができ、嫌気性微生物を固定するという作用を有する。また汚染現場内の温度を３７℃以下にすると、すみやかに温度応答性高分子が親水性へと変化することで、嫌気性微生物を開放することができる微生物製剤が得られる。
【００２８】
また、他の手段は、温度応答性高分子がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以上にすることで、容易にポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を疎水性に保ち、嫌気性微生物を固定するという作用を有する。また汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以下にすると、すみやかにポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が親水性へと変化し、嫌気性微生物を開放することができる微生物製剤が得られる。
【００２９】
また、他の手段は、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する汚染物質分解微生物が、遺伝子組換え微生物であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、脱塩素化酵素遺伝子をコードするプラスミドやトランスポゾンが導入された形質転換体、および脱塩素化酵素遺伝子を負に制御するリプレッサーをコードする遺伝子にポイントミューテーション等の手を加え、高発現処理を施した組換え体、またトランスポーターに手を加え、有機塩素化合物の取り込み能を向上させた組換え体等を用いることで、強力な脱塩素化能を持った遺伝子組換え微生物による効率的な浄化を行うことができる微生物製剤が得られる。
【００３０】
また、他の手段は、汚染物質分解微生物が、汚染物質分解能を有する微生物を少なくとも１種含む、２種以上微生物からなる複合微生物系であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、微生物間の物質の授受により、微生物間で脱塩素化能を補うことによって、安定した脱塩素化能を保持することができる微生物製剤が得られる。なお、複合微生物系がグラニュールを形成してもよいものとする。
【００３１】
また、他の手段は、揮発性有機塩素化合物がテトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、シス−１、２−ジクロロエチレン、ビニルクロライドであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、これらの化合物を脱塩素化する嫌気性微生物を汚染現場に投入する際に、現場内を嫌気的状態に促す作用と、現場内が嫌気的状態となるまでの一定期間、刺激性応答高分子によって嫌気性微生物を土着生物から保護することができる微生物製剤が得られる。
【００３２】
本発明の揮発性有機塩素化合物浄化方法は上記目的を達成するために、請求項１〜１３のいずれかに記載の微生物製剤をバイオリアクター内に添加して、揮発性有機塩素化合物を浄化する方法であって、土着好気性微生物の増殖に伴う酸素の消費によって、バイオリアクター内が嫌気的状態へと変化する一定期間、刺激応答性高分子を疎水性に保持することにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、さらにバイオリアクター内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性へと変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴としたものであり、土着好気性微生物の栄養源を添加することによって、バイオリアクター内が嫌気的状態に変化するまでの一定期間、バイオリアクター内に刺激応答性高分子の収縮を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となり、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物からの捕食から守り、また、バイオリアクター内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性に変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法であり、また、バイオリアクター内の刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となる。これにより、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることができる揮発性有機塩素化合物浄化方法が得られる。
【００３３】
また、他の手段は、バイオリアクター内の温度を制御することによって、刺激応答性高分子を疎水性から親水性へと変化させることを特徴とする請求項１４記載の揮発性有機塩素化合物浄化方法としたものであり、バイオリアクター内を刺激応答性高分子の収縮を促す温度に設定することで、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となり、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物からの捕食から守り、また、バイオリアクター内の刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となり、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることができる揮発性有機塩素化合物浄化方法が得られる。
【００３４】
また、他の手段は、請求項１〜１３のいずれかに記載の微生物製剤を汚染現場に添加して、揮発性有機塩素化合物を浄化する方法であって、土着好気性微生物の増殖に伴う酸素の消費によって、汚染現場内が嫌気的状態へと変化する一定期間、刺激応答性高分子を疎水性に保持することにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、さらに汚染現場内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性へと変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法としたものでであり、汚染現場内に刺激応答性高分子の収縮を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となり、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、また、汚染現場内の刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となり、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることができる揮発性有機塩素化合物浄化方法が得られる。
【００３５】
また、他の手段は、汚染現場の温度を制御することによって、刺激応答性高分子を疎水性から親水性へと変化させることを特徴とする請求項１６に記載の揮発性有機塩素化合物浄化方法としたものでであり、汚染現場内を刺激応答性高分子の収縮を促す温度に設定することで、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となり、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物からの捕食から守り、また、汚染現場内に刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となり、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることができる揮発性有機塩素化合物浄化方法が得られる。
【００３６】
また、他の手段は、前記汚染現場が土壌、および地下水環境であることを特徴とする請求項１６または１７に記載の揮発性有機化合物浄化方法としたものであり、これらの環境に対してボーリング等の処理を行うことにより、本発明の微生物製剤を投入することができ、原位置での浄化が可能とすることができる揮発性有機塩素化合物浄化方法が得られる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物の分解能力を有する汚染物質分解微生物を、疎水性に保持した刺激応答性高分子で固定することによって、汚染現場内の環境が汚染物質分解微生物に適した環境となるまで、土着生物の捕食から保護するという効果のある微生物製剤を提供できる。
【００３８】
また本発明によれば、好気性微生物の栄養源と刺激応答性高分子と揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物とを含有する微生物製剤を汚染現場に投入することによって、土着好気性微生物が栄養源を消費して増殖するとともに、酸素の消費を促す。このようにして汚染現場内に嫌気的状態を構築するという効果のある微生物製剤を提供できる。
【００３９】
また本発明によれば、汚染現場が嫌気的状態へと変化するまでの一定期間は、刺激応答性高分子を疎水性に保持して汚染物質分解微生物を固定しておく。汚染現場が嫌気的状態となった後、刺激応答性高分子を親水性にして、固定している汚染物質分解微生物をすみやかに開放することで、浄化反応を開始するという効果のある微生物製剤を提供できる。
【００４０】
また本発明によれば、汚染現場を嫌気的状態とすることで、土着好気性生物を窒息、駆除することができ、汚染物質分解微生物にとって理想的な環境で浄化反応を開始するという効果のある微生物製剤を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明の請求項１記載の発明は、人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物の分解能を有する汚染物質分解微生物を、刺激応答性高分子で固定したものであり、刺激応答性高分子を疎水性に保持することで汚染物質分解微生物を固定し、刺激応答性高分子を親水性と変化させることで、汚染物質分解微生物を開放するという作用を有する。
【００４２】
また、本発明の請求項２記載の発明は、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を刺激応答性高分子で固定したものであり、刺激応答性高分子を疎水性に保持することで嫌気性微生物を固定し、刺激応答性高分子を親水性と変化させることで、嫌気性微生物を開放するという作用を有する。
【００４３】
また、本発明の請求項３記載の発明は、好気性微生物の栄養源と刺激応答性高分子と揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物とを含有する微生物製剤であり、微生物製剤を汚染現場に投入することによって、土着好気性微生物が栄養源を消費して増殖するとともに、酸素の消費を促す。汚染現場が嫌気的状態へと変化するまでの一定期間は、疎水性に保持した刺激応答性高分子によって、嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、汚染現場が嫌気的状態となったところで、刺激応答性高分子を親水性にし、固定している嫌気性微生物をすみやかに開放することで、浄化反応を開始するという作用を有する。
【００４４】
また、本発明の請求項４記載の発明は、刺激応答性高分子の内側に揮発性有機塩素化合物の脱塩素機能を有する嫌気性微生物を含み、外側に好気性微生物の栄養源を備える微生物製剤であり、土着好気性微生物が栄養源を消費すると同時に、嫌気性微生物を固定した刺激性応答高分子が汚染現場に浸透、拡散し、現場内が嫌気性状態となった時、すみやかに嫌気性微生物による浄化を行うことができるという作用を有する。
【００４５】
また、本発明の請求項５記載の発明は、揮発性有機塩素機能を有する嫌気性微生物を固定した刺激応答性高分子を、さらに好気性微生物の栄養源で包含した微生物製剤であり、土着好気性微生物が栄養源をある程度消費すると、嫌気性微生物を固定した刺激応答性高分子が汚染現場に浸透、拡散し、現場内が嫌気性状態となった時、すみやかに嫌気性微生物による浄化を行うことができるという作用を有する。
【００４６】
また、本発明の請求項６記載の発明は、好気性微生物の栄養源が飽和脂肪酸を含む微生物製剤であり、汚染現場に投入すると、飽和脂肪酸が土着好気性微生物によって消費されるとともに、嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を脱塩素化する際の電子供与体も同時に放出され、嫌気的状態での脱塩素化反応を促すという作用を有する。
【００４７】
また、本発明の請求項７記載の発明は、好気性微生物の栄養源がステアリン酸を含む微生物製剤であり、汚染現場に投入すると、ステアリン酸等が土着好気性微生物によって消費されるとともに、嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を脱塩素化する際の電子供与体も徐々に放出され、嫌気的状態での脱塩素化反応を促すという作用を有する。
【００４８】
また、本発明の請求項８記載の発明は、刺激応答性高分子が温度応答性高分子である微生物製剤であり、汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以上にすることで、容易に温度応答性高分子を疎水性に保持し、嫌気性微生物を固定するという作用を有する。また汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以下にすると、すみやかに温度応答性高分子が親水性へと変化し、嫌気性微生物を開放するという作用を有する。
【００４９】
また、本発明の請求項９記載の発明は、温度応答性高分子の下限臨界溶解温度が３７℃以下である微生物製剤であり、汚染現場内の温度を３７℃以上にすることで、容易に温度応答性高分子を疎水性に保持することができ、嫌気性微生物を固定するという作用を有する。また汚染現場内の温度を３７℃以下にすると、すみやかに温度応答性高分子が親水性へと変化することで、嫌気性微生物を開放するという作用を有する。
【００５０】
また、本発明の請求項１０記載の発明は、温度応答性高分子がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の微生物製剤であり、汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以上にすることで、容易にポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を疎水性に保ち、嫌気性微生物を固定するという作用を有する。また汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以下にすると、すみやかにポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が親水性へと変化し、嫌気性微生物を開放するという作用を有する。
【００５１】
また、本発明の請求項１１記載の発明は、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物が、遺伝子組換え微生物である微生物製剤であり、脱塩素化酵素遺伝子をコードするプラスミドやトランスポゾンが導入された形質転換体、および脱塩素化酵素遺伝子を負に制御するリプレッサーをコードする遺伝子にポイントミューテーション等の手を加え、高発現処理を施した組換え体、またトランスポーターに手を加え、有機塩素化合物の取り込み能を向上させた組換え体等を用いることで、強力な脱塩素化能を持った遺伝子組換え微生物による効率的な浄化を行うという作用を有する。
【００５２】
また本発明の請求項１２記載の発明は、汚染物質分解微生物が、汚染物質分解能をもつ微生物を少なくとも１種を含んだ、２種以上の微生物からなる複合微生物系を含む微生物製剤であり、微生物間の物質の授受により、微生物間で脱塩素化能を補うことによって、安定した脱塩素化能を保持できる作用を有する。なお、複合微生物系がグラニュールを形成してもよいものとする。
【００５３】
また、本発明の請求項１３記載の発明は、浄化対象の揮発性有機塩素化合物がテトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、ビニルクロライドである微生物製剤であり、これらの化合物を脱塩素化する嫌気性微生物を汚染現場に投入する際に、現場内を嫌気的状態に促す作用と、現場内が嫌気的状態となるまでの一定期間、刺激性応答高分子によって嫌気性微生物を土着生物から保護するという作用を有する。
【００５４】
また、本発明の請求項１４記載の発明は、土着好気性微生物の栄養源を添加することによって、バイオリアクター内が嫌気的状態に変化するまでの一定期間、バイオリアクター内に刺激応答性高分子の収縮を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となる。これにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物からの捕食から守るという作用を有する。さらに、バイオリアクター内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性に変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法であり、またバイオリアクター内の刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となる。これにより、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させるという作用を有する。
【００５５】
また、本発明の請求項１５記載の発明は、バイオリアクター内の温度を制御することによって、刺激応答性高分子を疎水性から親水性へと変化させることを特徴とする有機塩素化合物浄化方法であり、バイオリアクター内を刺激応答性高分子の収縮を促す温度に設定することで、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性をとなる。これにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物からの捕食から守るという作用を有する。また、バイオリアクター内の刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となる。これにより、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させるという作用を有する。
【００５６】
また、本発明の請求項１６記載の発明は、土着好気性微生物の栄養源を添加することによって汚染現場内が嫌気的状態に変化するまでの一定期間、刺激応答性高分子を疎水性に保持することにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、さらに汚染現場内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性に変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法であり、汚染現場内に刺激応答性高分子の収縮を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となる。これにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守るという作用を有する。また汚染現場内の刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となる。これにより、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させるという作用を有する。
【００５７】
また、本発明の請求項１７記載の発明は、汚染現場内の温度を制御することによって刺激応答性高分子を疎水性から親水性へと変化させることを特徴とする有機塩素化合物浄化方法であり、汚染現場内を刺激応答性高分子の収縮を促す温度に設定することで、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となる。これにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物からの捕食から守るという作用を有する。また、汚染現場内に刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となる。この作用により、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させるという作用を有する。
【００５８】
また、本発明の請求項１８記載の発明は、汚染現場が土壌および地下水環境であることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法であり、これらの環境に対してボーリング等の処理を行うことにより、本発明の微生物製剤を投入することができ、原位置での浄化が可能となるという作用を有する。
【００５９】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００６０】
（実施の形態１）
図１は、刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル１を示している。本微生物製剤の製造方法としては、まず汚染物質分解微生物を適切な培養液で培養し、対数増殖期中において、培養液を含む濃縮菌体液を作製する。濃縮菌体液はすみやかに１０〜２０％刺激応答性高分子溶液と１：１の比で混合し、長期間保存する場合は、−２０℃にて凍結保存しておく。汚染現場投入前に融解し、微生物製剤として使用する。
【００６１】
この刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル１を汚染現場に投入するとともに、刺激応答性高分子が収縮するような刺激を加えると、図２のような状態となる。
【００６２】
図２は、疎水性に保持した刺激応答性高分子２で、汚染物質分解微生物３を固定し、疎水性領域４を形成することにより、汚染物質分解微生物３が土着好気性微生物５の捕食から免れている状態を示している。この時、土着好気性微生物５は、好気性微生物の栄養源６を消費し、汚染現場等内の環境を徐々に嫌気的状態と変化させていく。
【００６３】
図３は、汚染現場内が嫌気的状態となった後、刺激応答性高分子が膨張するような刺激を加え、刺激応答性高分子２を親水性にすることにより、固定された汚染物質分解微生物３を汚染現場等に開放する様子を示している。以上の方法により、汚染物質分解微生物が土着好気性微生物の捕食を受けず、生育に適した嫌気的状態で、浄化処理することが可能となる。
【００６４】
なお、刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル１は、必要に応じてグリセロール等を添加することができる。また、嫌気的状態を確認する手段としては、一般的な酸化還元電位計を使用することができる。嫌気的状態であると判断する酸化還元電位計の数値は、−２００ｍＶ以下とする。
【００６５】
なお、本実施の形態における微生物製剤の刺激応答性高分子２として用いることができる物質は、温度応答性高分子であるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをはじめ、単独で重合したときに水中の転移温度が１０〜３７℃の温度応答性高分子でも同様の効果が得られるものである。このような温度応答性ポリマーを与えるモノマーとしては、例えばＮ‐ｎ‐プロピルアクリルアミド、Ｎ‐ｎ‐プロピルメタクリルアミド、Ｎ‐イソプロピルアクリルアミド、Ｎ‐イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ‐ジエチルアクリルアミド、Ｎ‐メチル‐Ｎ‐ｎ‐プロピルアクリルアミド、Ｎ‐メチル‐Ｎ‐イソプロピルアクリルアミド、Ｎ‐テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ‐テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、Ｎ‐エトキシプロピルアクリルアミド、Ｎ‐エトキシプロピルメタクリルアミド、Ｎ‐エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ‐１‐メチル‐２‐メトキシエチルアクリルアミド、Ｎ‐モルホリノプロピルアクリルアミド、Ｎ‐メトキシプロピルアクリルアミド、Ｎ‐メトキシプロピルメタクリルアミド、Ｎ‐イソプロポキシプロピルアクリルアミド、Ｎ‐イソプロポキシプロピルメタクリルアミド、Ｎ‐イソプロポキシエチルアクリルアミド、Ｎ‐イソプロポキシエチルメタクリルアミドなどが挙げられる。
【００６６】
また、単独で重合させた時には１０℃〜３７℃の温度応答性ポリマーを与えないが、単独重合で温度応答性ポリマーを与えるモノマーとともに共重合させることで、温度による疎水性−親水性という性質を発現するモノマーも存在する。このような共重合に用いられるモノマーとしては、例えばＮ‐エチルアクリルアミド、Ｎ‐シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ‐シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ‐メチル‐Ｎ‐エチルアクリルアミド、Ｎ‐アクリロイルピペリジン、Ｎ‐アクリロイルピロリジン、Ｎ‐エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ‐（２，２‐ジメトキシエチル）‐Ｎ‐メチルアクリルアミド、Ｎ‐１‐メチル‐２‐メトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ‐１‐メトキシメチルプロピルアクリルアミド、Ｎ‐１‐メトキシメチルプロピルメタクリルアミド、Ｎ‐（１，３‐ジオキソラン‐２‐イルメチル）‐Ｎ‐メチルアクリルアミド、Ｎ‐８‐アクリロイル‐１，４‐ジオキサ‐８‐アザ‐スピロ［４，５］デカンなどが挙げられ、同様の効果が得られるものである。また温度応答性高分子以外にも、ある刺激を加えることによって疎水性から親水性への可逆的な物性変化が起こる高分子、例えばpH、光、電気的刺激等によって可逆的な相転移挙動する物質であっても、同様の効果が得られるものである。
【００６７】
なお、本実施の形態で使用される微生物製剤の汚染物質分解微生物３として用いることができる微生物は、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する各種嫌気性微生物、具体的にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、 Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｄｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎｉｌｅ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｈａｌｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ等の各属に属する微生物等を利用しても、同様の効果が得られるものである。
【００６８】
さらに揮発性有機塩素化合物等、動物実験を通して、人体に対して急性毒性、慢性毒性の疑われる化合物を分解しうる各種微生物も用いることができるものとする。人体に対して急性毒性、慢性毒性の疑われる化合物とは、芳香族炭化水素であるベンゼン、キシレン、トルエン、また多環芳香族炭化水素であるジベンゾダイオキシン、ジベンゾチオフェン、ジベンゾフラン、ビフェニル、および多環芳香族炭化水素のクロル基、メチル基等の各種置換基が導入された化合物であるポリ塩化ジベンゾパラジオキシン、ポリ塩化ジベンゾフラン、コプラナーＰＣＢ、メチルジベンゾチオフェン、ジメチルジベンゾチオフェン等が上げられる。これらの化合物を分解する微生物としては、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、 Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ、 Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｍａｓ等の各属に属する微生物等があり、これらの微生物を利用しても同様の効果が得られるものである。
【００６９】
（実施の形態２）
図４は、温度応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル７を飽和脂肪酸８で包含した微生物製剤である。
【００７０】
上記構成において、飽和脂肪酸８は、微生物製剤を汚染現場等に投与した後、土着好気性微生物５に消費される。土着好気性微生物５の増殖に伴い、汚染現場等内の酸素が消費され、汚染現場等は徐々に嫌気的状態へと移行する。汚染現場が嫌気的状態となったことを確認した後、刺激応答性高分子２の物性を疎水性から親水性へと変化させることで、固定されている汚染物質分解微生物３を開放し、汚染現場の浄化処理を行う。好気性微生物の栄養源６としては、例えば飽和脂肪酸であるステアリン酸等、好気性微生物の代謝とともに、脱塩素化反応の電子供与体となりうる水素等を徐放するものが好ましい。
【００７１】
本実施の形態で使用される微生物製剤の製造方法としては、飽和脂肪酸等の固体状物質を担体として、刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル１が流出しないように固定されている方法ならば構わない。例えば、混合ゲル１を担体内部に閉じ込める包括固定化法や、担体を多孔質処理し、減圧下で担体の孔隙内に刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル１を封入する方法等がある。
【００７２】
なお、本微生物製剤の好気性微生物の栄養源６として用いる物質は、飽和脂肪酸であるステアリン酸等、好気性微生物の代謝とともに、脱塩素化反応の電子供与体となりうる水素等を徐放するものが好ましい。例えばカプリン酸、ラウリン酸、ミリシチン酸、パルミチン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、ベヘニン酸、およびこれら脂肪酸の混合物でも同様の効果が得られるものとする。
【００７３】
また脂肪酸と１価アルコールのエステル、脂肪酸と多価アルコールのエステルまたはその誘導体、脂肪酸とグリセリンのエステル、脂肪アミン、脂肪酸アマイド等でも同様の効果が得られるものとする。
【００７４】
また好気性微生物の栄養源６は、必ずしも刺激応答性高分子２と汚染物質分解微生物３の混合ゲル１を担持している必要はなく、好気性微生物の栄養源６を単独で汚染現場等に添加し、汚染現場を嫌気的状態とした後に刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル１を添加してもよい。従って好気性微生物の栄養源６は、固体状のものに限定されるものではなく、グリセリン等を含むゲル状のもの、ソルビトール等を含む液体状のものでも同様の効果が得られるものである。
【００７５】
（実施の形態３）
図５は、温度応答性高分子であるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）と汚染物質分解微生物との混合ゲル９が、ステアリン酸１０内に注入された微生物製剤を示している。ステアリン酸１０は円柱の中心部が空洞となるように製造され、その円柱状のステアリン酸１０をポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）と汚染物質混合分解微生物との混合ゲル９に浸漬させ、図５のような微生物製剤が製造される。使用前は−２０℃程度で凍結保存しておく。汚染現場等をポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の下限臨界溶解温度である３２℃以上に保った状態で投入すると、ステアリン酸１０内に固定されている混合ゲル９が徐々に汚染現場等に拡散する。土着好気性微生物５は、ステアリン酸１０を消費しながら、電子供与体である水素を産生する。土着好気性微生物５の増殖によって、汚染現場等内の環境が嫌気的状態となった時、汚染現場内を３２℃以下にすることによって、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が収縮から膨張するようになり、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）内に固定されていた汚染物質分解微生物３が汚染現場に拡散し、浄化処理を開始する。
【００７６】
（実施の形態４）
図６は、汚染物質分解能を強化した遺伝子組換え微生物１３を示している。
【００７７】
微生物内の汚染物質分解酵素遺伝子の一部は常時発現している訳ではなく、リプレッサー１２による制御を受けている場合がある。もし、汚染物質分解酵素遺伝子を負に制御するリプレッサー１２が存在する場合、リプレッサー１２を破壊し、負の制御を解くことによって、汚染物質分解酵素遺伝子を常時発現させることが可能となる。逆方向繰返し配列と抗生物質耐性遺伝子を保有するトランンポゾン１１を、トランスポザーゼとともに、エレクトロポレーション等により汚染物質分解微生物に導入し、ランダムな遺伝子破壊を行う。トランスポゾン１１が正常に挿入された株を抗生物質で選択し、変異株ライブラリーを作製する。変異株ライブラリーより目的株をスクリーニングすることによって、汚染物質分解能を強化された遺伝子組換え微生物を取得することができる。
【００７８】
（実施の形態５）
図７は、温度応答性高分子で固定した複合微生物系１７をバイオリアクター内に添加して、浄化処理を行う方法を示している。複合微生物系１７は揮発性有機塩素化合物を脱塩素化する能力を有しているものとする。まず、ポンプ等によって揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水を汲み上げ、地下水流入管１４を通って嫌気バイオリアクター槽１６に搬送する。地下水を嫌気バイオリアクター槽１６に搬送する前に、地下水流入管１４の途中に設置されたニクロムヒーター１５によって、地下水をある程度温めておく。嫌気バイオリアクター槽１６内にもニクロムヒーター１５が設置されており、さらにライザー管１８によって、嫌気バイオリアクター槽１６内の地下水にエアーリフト効果を与えることで、地下水が緩やかに循環した状態となっているため、嫌気バイオリアクター槽１６内は均一な温度に保つことができる。浄化初期段階は、嫌気バイオリアクター槽１６内の温度を下限臨界溶解温度以上に保った状態にしておき、温度応答性高分子によって固定された複合微生物系１７と土着好気性微生物の栄養源を添加する。土着好気性微生物が栄養源を消費するとともに、嫌気バイオリアクター内の酸素を消費し、リアクター内を徐々に嫌気的状態とする。嫌気バイオリアクター内に設置された酸化還元電極の測定値が−２００ｍＶ以下となったことを確認した後、リアクター内の温度を下限臨界溶解温度以下に低下させることで、温度応答性高分子に固定された複合微生物系１７を開放することにより、揮発性有機塩素化合物の還元的脱塩素化反応を促す。
【００７９】
揮発性有機塩素化合物の中で、塩素置換数の多いテトラクロロエチレン等は、嫌気性微生物による還元的脱塩素化反応を受けやすい。一方で、テトラクロロエチレンの分解産物であるシス−１、２−ジクロロエチレンやビニルクロリドは、好気性微生物によって消費されやすい傾向にある。従って、嫌気バイオリアクター槽１６内で完全に脱塩素化しきれなかった揮発性有機塩素化合物は、次の好気バイオリアクター槽２０に搬送される。また嫌気バイオリアクター槽１６内で揮発してしまった有機塩素化合物は、排気管１９を通って再び好気バイオリアクター槽２０に送られる。好気バイオリアクター槽２０は空気流入管２１を備え、常時地下水中の酸素濃度が高い状態を維持している。ここで、嫌気バイオリアクター槽１６で処理しきれなかった有機塩素化合物を完全に分解処理する。なお、好気バイオリアクター槽２０内で揮発した有機塩素化合物、呼吸により生成した二酸化炭素等は、活性炭フィルターを通して無害化され、排気する。処理後の地下水は、排水管を通して、再び汚染現場に戻される。
【００８０】
（実施の形態６）
図８は、本発明に係る微生物製剤は土壌環境２５や地下水環境２６に存在する汚染物質をｉｎ ｓｉｔｕにて浄化する方法と、汚染物質を含む土壌や地下水等をバイオリアクター２７に運搬した後、バイオリアクター２７へ微生物製剤を添加し、ｏｎ ｓｉｔｅもしくはｅｘ ｓｉｔｕで浄化処理する方法を示している。
【００８１】
本発明に係る微生物製剤の注入方法としては、一般的な方法が適用可能である。その方法は特に制限されるものではないが、微生物製剤が汚染現場まで到達し、汚染現場の環境が浄化に適した状態に変化するまでは、刺激応答性高分子が疎水性である必要がある。従って、刺激応答性高分子が温度応答性高分子である場合には、注入から汚染物質分解微生物を開放するまで、温度応答性高分子の下限臨界溶解温度以上に保持しなければならない。汚染現場等が下限臨界溶解温度以上である場合には、汚染物質分解微生物開放時に汚染現場内およびバイオリアクター２７内の温度を下げるために、低温の水、および低温の嫌気性微生物の脱塩素化に必要な因子を含むものをポンプ２８で注入すればよい。
【００８２】
しかし多くの場合、汚染現場等は下限臨界溶解温度以下であるため、温度応答性高分子を水等とともに汚染現場に投入する前に、ニクロムヒーター３０で下限臨界溶解温度以上にする。微生物製剤を汚染現場に投入した後は、ブロア等によって汚染現場に温風の風を送る等の処置により、現場内を下限臨界溶解温度以上に保つこともできる。また、汚染現場内が嫌気的状態であることを確認した後は、汚染現場に下限臨界溶解温度以下の水等を注入することによって、温度応答性高分子に固定された嫌気性微生物を開放させるとともに、水等によって汚染現場内に拡散させる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物の分解能を有する汚染物質分解微生物を、疎水性に保持した刺激応答性高分子で固定することによって、汚染現場内の環境が汚染物質分解微生物に適した環境となるまで、土着生物の捕食から保護する機能を有する微生物製剤であり、狙ったポイントに高濃度の微生物を注入、開放することができるため、浄化槽、廃水処理場等にも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明の実施の形態１における微生物製剤を示す図
【図２】本発明の実施の形態１において、刺激応答性高分子が収縮している状態を示す図
【図３】本発明の実施の形態１において、刺激応答性高分子が膨張している状態を示す図
【図４】本発明の実施の形態２における微生物製剤の断面図を示す図
【図５】本発明の実施の形態３における微生物製剤の構造を示す図
【図６】本発明の実施の形態４における遺伝子組換え微生物の作製方法を示す図
【図７】本発明の実施の形態５におけるバイオリアクターでの微生物製剤の使用方法を示す図
【図８】本発明の実施の形態６における汚染現場での微生物製剤の使用方法を示す図
【符号の説明】
【００８５】
１ 刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル
２ 刺激応答性高分子
３ 汚染物質分解微生物
４ 疎水性領域
５ 土着好気性微生物
６ 好気性微生物の栄養源
７ 温度応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル
８ 飽和脂肪酸
９ ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）と汚染物質分解微生物との混合ゲル
１０ ステアリン酸
１１ トランスポゾン
１２ リプレッサー
１３ 遺伝子組換え微生物
１４ 地下水流入管
１５ ニクロムヒーター
１６ 嫌気バイオリアクター槽
１７ 複合微生物系
１８ ライザー管
１９ 排気管
２０ 好気バイオリアクター槽
２１ 空気流入管
２２ 空気
２３ 活性炭フィルター
２４ 排水管
２５ 土壌環境
２６ 地下水環境
２７ バイオリアクター
２８ ポンプ
２９ 汚染現場
３０ ニクロムヒーター
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に揮発性有機塩素化合物等によって汚染された土壌や地下水等の浄化に使用される微生物製剤、およびその微生物製剤を用いた浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人体や生物に対して変異原性や催奇性などの毒性を有する化学物質の拡散によって、世界的規模で化学物質汚染が拡大している。例えば、ポリ塩化ジベンゾパラジオキシンやポリ塩化ジベンゾフラン、コプラナーＰＣＢ等のいわゆるダイオキシン類は、人類が作った最悪の毒物と言われており、わが国は世界最大のダイオキシン類排出国となっている。また重油タンカーの座礁等により海洋に重油が流出し、重油に含まれるジベンゾチオフェン等の難分解性含硫多環芳香族炭化水素によって、すでに海洋生物等に深刻な影響が出ている。
【０００３】
さまざまな化学物質汚染の中で近年特に問題視されているのが、テトラクロロエチレンやトリクロロエチレン等の揮発性有機塩素化合物による汚染である。これらの物質は主に、代替フロンガスの合成原料や機械部品、電子部品の脱脂洗浄剤として汎用されてきたが、それと同時に汚染も拡大し、さまざまな浄化対策が行われている。
【０００４】
浄化対策として、揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水を汲み上げ、排水処理を行う揚水ばっ気法や、汚染現場に薬剤を投入して浄化を行う薬剤混合法（ホットソイル法）等の物理化学的浄化方法が行われている。物理化学的浄化方法は、高濃度の揮発性有機塩素化合物汚染に対しては威力を発揮するが、低濃度の汚染についてはエネルギー的、コスト的な面で効果的ではない。また薬剤を添加する方法であると、添加された薬剤による二次汚染の影響が懸念される。
【０００５】
以上のような物理化学的浄化方法の問題点に鑑み、近年新たな浄化方法として注目されているのが、微生物等によって揮発性有機塩素化合物を分解、無害化する技術、いわゆるバイオレメディエーションである。バイオレメディエーションはさらに二つの手法に大別される。その一つが、汚染現場に微生物の栄養源等を加え、土着微生物を活性化することで汚染物質の分解を促進するバイオスティミュレーションである。特に揮発性有機塩素化合物の場合、塩素置換数の多いテトラクロロエチレンは、嫌気性微生物による還元的脱塩素化反応を受けやすい物質であるため、水素等の電子供与体となる物質を添加することが多い。
【０００６】
また人為的に分解能力の高い微生物を育種し、汚染現場等に投与して浄化を行うバイオオーギュメンテーションと呼ばれる技術もある。バイオスティミュレーションは、汚染現場に微生物の栄養源を添加するのみであることから広がりをみせているが、バイオオーギュメンテーションは外来微生物を開放系で使用するため、生態系や人体への安全性が保証されておらず、地域住民の了解（パブリック・アクセプタンス）が得にくいことから、施工例が非常に少なかった。しかし、２００５年に経済産業省より「微生物によるバイオレメディエーション利用指針」が告示され、今後バイオオーギュメンテーションは大きな広がりをみせることが予想される。
【０００７】
微生物による揮発性有機塩素化合物の分解活性を大きく左右するのは、汚染現場等の環境である。一般的に、塩素置換数の多いテトラクロロエチレンは、嫌気性微生物による還元的脱塩素化反応を受けやすく、好気性微生物には分解されにくい物質である。従って、如何に汚染現場等を嫌気的状態に保つかが、浄化の成功を決定づける要因の一つとなる。
【０００８】
以下、汚染現場に酵母エキスを供給し、土着の好気性微生物を活性・増殖させることで、汚染現場を嫌気的状態にした後、嫌気性微生物に揮発性有機塩素化合物を分解させる方法について特許文献１を参照しながら説明する。
【０００９】
汚染現場に対して酵母エキスを供給すると、土着好気性微生物は酵母エキスを電子供与体、酸素を電子授与体として消費し、汚染現場を嫌気的状態にする。その後、嫌気的状態において嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を電子受容体として利用する。汚染現場にテトラクロロエチレンが存在した場合、嫌気性微生物によって逐次的な脱塩素化反応が起こり、テトラクロロエチレンからトリクロロエチレン、ジクロロエチレン、ビニルクロリドを経て、最終的に無害なエチレン等まで分解される。嫌気性微生物は揮発性有機塩素化合物を電子受容体として利用するため、適当な電子供与体があれば脱塩素化は促進される。電子供与体には酵母エキス以外にもフミン酸等があり、食品工場などからの有機廃棄物の中から、マイクロコズムの実験結果に基づいて選択され、汚染の除去に使用される。
【００１０】
しかしながら、もし土着嫌気性微生物の中で、揮発性有機塩素化合物の分解酵素遺伝子をもたない微生物、あるいは分解酵素遺伝子が発現していない微生物が、生態系の中で優先的な位置を占めている場合、汚染現場にいくら電子供与体を添加しても、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化は起こらないことになる。つまり、汚染現場を嫌気的状態にして電子供与体を添加するだけでは十分とは言えず、必要に応じて脱塩素化能力の高い外来微生物を投与し、揮発性有機塩素化合物を無害なエチレン等にまで迅速に分解処理する必要がある。
【００１１】
バイオオーギュメンテーションで問題点として、汚染現場にて汚染物質分解微生物の揮発性有機塩素化合物分解活性を維持しにくいことがある。分解活性を維持しにくいことの理由として、汚染現場の環境が分解活性を維持するのに適切でない、つまり汚染現場の酸素濃度や温度、ｐＨ等が分解活性に悪影響を与えてしまう可能性があげられる。また、汚染現場内に生育する原生動物等の土着生物によって、汚染物質分解微生物が捕食されてしまう恐れもある。汚染現場内に存在する生態系ピラミッドの中で、最も下位の生育環境にあるのが微生物であるため、汚染物質分解微生物が捕食される可能性は非常に高い。また微生物間の競合関係も無視できない。従って、汚染現場において汚染物質分解微生物の分解活性を安定させる技術が要望されている。
【００１２】
以下、土着微生物の捕食から汚染物質分解微生物を保護する手段として特許文献２を参照しながら説明する。
【００１３】
汚染物質分解微生物が土着生物から捕食されるのを防ぐため、汚染現場に捕食微生物排除剤を添加する。捕食微生物排除剤とは、捕食微生物の有する走化性を刺激する物質であり、捕食微生物はこの物質の濃度勾配を感じ取り、移動する性質がある。この性質を応用すれば、捕食微生物を汚染現場から排除することが可能となる。
【００１４】
しかしながら、捕食微生物を汚染現場から非汚染現場へ移動させるためには、移動距離間に捕食微生物排除剤の濃度勾配を作製しなければならない。しかし、実際の汚染現場において排除剤を拡散させることは容易ではなく、まして濃度勾配を作製することは困難を極める。さらに捕食微生物が非汚染環境へ移動するには膨大な時間が必要となり、現実的ではない。
【特許文献１】特開２００３−２５１３３１号公報
【特許文献２】特開平０７−０８８４６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
汚染現場に微生物の栄養源等を添加するバイオスティミュレーションでは、もし土着微生物の中で汚染物質分解酵素遺伝子をもたないもの、あるいは汚染物質分解酵素遺伝子が発現してないものが、生態系の中で優先的な地位を占めている場合、汚染現場にいくら栄養源等を添加しても、汚染物質の分解が進まないという課題がある。従って、分解活性の高い微生物を新たに添加するバイオオーギュメンテーション技術が求められている。しかし、人為的に分離、育種した汚染物質分解微生物は土着生物に捕食される可能性が高いため、安定的な浄化には課題が多い。
【００１６】
本発明はこのような従来の課題を解決するものであり、人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物の分解能を有する汚染物質分解微生物を、疎水性に保持した刺激応答性高分子で固定することによって、汚染現場等内の環境が汚染物質分解微生物に適した環境となるまで、土着生物の捕食から汚染物質分解微生物を保護することが可能となる。なお、人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物とは、動物実験を通して、人体に対して急性毒性、慢性毒性の疑われる化合物とする。また、刺激応答性高分子とともに好気性微生物の栄養源を添加し、汚染現場内の嫌気的状態とし、土着好気性微生物や原生動物等を窒息、駆除した後、刺激応答性高分子の物性を親水性に変化させて、刺激応答性高分子内に固定された汚染物質分解微生物を汚染現場に開放することで、土着生物からの捕食を受けることなく、安定した浄化が可能となる。
【００１７】
また、塩素置換数の多いテトラクロロエチレンは、嫌気性微生物による還元的脱塩素化反応を受けやすいため、揮発性有機塩素化合物の汚染現場に投与する汚染物質分解微生物としては、嫌気性微生物が好ましく、さらに汚染現場が嫌気的状態であることが求められる。しかし土壌など汚染現場の多くは好気的、あるいは微好気的状態であることが多く、投与した嫌気性微生物が汚染現場中の酸素によってダメージを受ける可能性がある。
【００１８】
本発明はこのような従来の課題を解決するものであり、好気性微生物の栄養源と刺激応答性高分子と揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物とを含有する微生物製剤を汚染現場に投入することによって、土着好気性微生物を増殖させ、汚染現場内の酸素の消費を促すことが可能となる。さらに、汚染現場が嫌気的状態へと変化するまでの一定期間は、刺激応答性高分子を疎水性に保持して汚染物質分解微生物を固定しておく。汚染現場が嫌気的状態となった後、刺激応答性高分子を親水性にし、固定している汚染物質分解微生物をすみやかに開放することで、浄化反応を開始することが可能となる。また、汚染現場を嫌気的状態とすることは土着好気性生物を窒息、駆除することも意味しているため、汚染物質分解微生物にとって理想的な環境で浄化反応を開始することが可能となる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の微生物製剤は上記目的を達成するために、人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物の分解能を有する汚染物質分解微生物を、刺激応答性高分子で固定することを特徴としたものであり、刺激応答性高分子を疎水性に保持することで汚染物質分解微生物を固定し、刺激応答性高分子を親水性と変化させることで、汚染物質分解微生物を開放することができる微生物製剤が得られる。
【００２０】
また、他の手段は、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を、刺激応答性高分子で固定することを特徴とする請求項１記載の微生物製剤としたものであり、刺激応答性高分子を疎水性に保持することで嫌気性微生物を固定し、刺激応答性高分子を親水性と変化させることで、嫌気性微生物を開放することができる微生物製剤が得られる。
【００２１】
また、他の手段は、好気性微生物の栄養源と刺激応答性高分子と揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物とを含有することを特徴とする請求項１または２記載の微生物製剤としたものでであり、微生物製剤を汚染現場に投入することによって、土着好気性微生物が栄養源を消費して増殖するとともに、酸素の消費を促す。汚染現場が嫌気的状態へと変化するまでの一定期間は、疎水性に保持した刺激応答性高分子によって、嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、汚染現場が嫌気的状態となったところで、刺激応答性高分子を親水性にし、固定している嫌気性微生物をすみやかに開放することで、浄化反応を開始することができる微生物製剤が得られる。
【００２２】
また、他の手段は、刺激応答性高分子の内側に、揮発性有機化合物の脱塩素機能を有する嫌気性微生物を含み、外側に好気性微生物の栄養源を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、土着好気性微生物が栄養源を消費すると同時に、嫌気性微生物を固定した刺激性応答高分子が汚染現場に浸透、拡散し、現場内が嫌気性状態となった時、すみやかに嫌気性微生物による浄化を行うことができる微生物製剤が得られる。
【００２３】
また、他の手段は、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を固定した刺激応答性高分子を、さらに好気性微生物の栄養源で包含することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、土着好気性微生物が栄養源をある程度消費すると、嫌気性微生物を固定した刺激応答性高分子が汚染現場に浸透、拡散し、現場内が嫌気性状態となった時、すみやかに嫌気性微生物による浄化を行うことができる微生物製剤が得られる。
【００２４】
また、他の手段は、好気性微生物の栄養源が飽和脂肪酸を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、汚染現場に投入すると、飽和脂肪酸が土着好気性微生物によって消費されるとともに、嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を脱塩素化する際の電子供与体も同時に放出され、嫌気的状態での脱塩素化反応を促すことができる微生物製剤が得られる。
【００２５】
また、他の手段は、好気性微生物の栄養源がステアリン酸を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、汚染現場に投入すると、ステアリン酸等が土着好気性微生物によって消費されるとともに、嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を脱塩素化する際の電子供与体も徐々に放出され、嫌気的状態での脱塩素化反応を促すことができる微生物製剤が得られる。
【００２６】
また、他の手段は、刺激応答性高分子が温度応答性高分子であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以上にすることで、容易に温度応答性高分子を疎水性に保持し、嫌気性微生物を固定し、また、汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以下にすると、すみやかに温度応答性高分子が親水性へと変化し、嫌気性微生物を開放することができる微生物製剤が得られる。
【００２７】
また、他の手段は、温度応答性高分子の下限臨界溶解温度が３７℃以下であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、汚染現場内の温度を３７℃以上にすることで、容易に温度応答性高分子を疎水性に保持することができ、嫌気性微生物を固定するという作用を有する。また汚染現場内の温度を３７℃以下にすると、すみやかに温度応答性高分子が親水性へと変化することで、嫌気性微生物を開放することができる微生物製剤が得られる。
【００２８】
また、他の手段は、温度応答性高分子がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以上にすることで、容易にポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を疎水性に保ち、嫌気性微生物を固定するという作用を有する。また汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以下にすると、すみやかにポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が親水性へと変化し、嫌気性微生物を開放することができる微生物製剤が得られる。
【００２９】
また、他の手段は、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する汚染物質分解微生物が、遺伝子組換え微生物であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、脱塩素化酵素遺伝子をコードするプラスミドやトランスポゾンが導入された形質転換体、および脱塩素化酵素遺伝子を負に制御するリプレッサーをコードする遺伝子にポイントミューテーション等の手を加え、高発現処理を施した組換え体、またトランスポーターに手を加え、有機塩素化合物の取り込み能を向上させた組換え体等を用いることで、強力な脱塩素化能を持った遺伝子組換え微生物による効率的な浄化を行うことができる微生物製剤が得られる。
【００３０】
また、他の手段は、汚染物質分解微生物が、汚染物質分解能を有する微生物を少なくとも１種含む、２種以上微生物からなる複合微生物系であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、微生物間の物質の授受により、微生物間で脱塩素化能を補うことによって、安定した脱塩素化能を保持することができる微生物製剤が得られる。なお、複合微生物系がグラニュールを形成してもよいものとする。
【００３１】
また、他の手段は、揮発性有機塩素化合物がテトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、シス−１、２−ジクロロエチレン、ビニルクロライドであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の微生物製剤としたものであり、これらの化合物を脱塩素化する嫌気性微生物を汚染現場に投入する際に、現場内を嫌気的状態に促す作用と、現場内が嫌気的状態となるまでの一定期間、刺激性応答高分子によって嫌気性微生物を土着生物から保護することができる微生物製剤が得られる。
【００３２】
本発明の揮発性有機塩素化合物浄化方法は上記目的を達成するために、請求項１〜１３のいずれかに記載の微生物製剤をバイオリアクター内に添加して、揮発性有機塩素化合物を浄化する方法であって、土着好気性微生物の増殖に伴う酸素の消費によって、バイオリアクター内が嫌気的状態へと変化する一定期間、刺激応答性高分子を疎水性に保持することにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、さらにバイオリアクター内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性へと変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴としたものであり、土着好気性微生物の栄養源を添加することによって、バイオリアクター内が嫌気的状態に変化するまでの一定期間、バイオリアクター内に刺激応答性高分子の収縮を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となり、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物からの捕食から守り、また、バイオリアクター内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性に変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法であり、また、バイオリアクター内の刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となる。これにより、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることができる揮発性有機塩素化合物浄化方法が得られる。
【００３３】
また、他の手段は、バイオリアクター内の温度を制御することによって、刺激応答性高分子を疎水性から親水性へと変化させることを特徴とする請求項１４記載の揮発性有機塩素化合物浄化方法としたものであり、バイオリアクター内を刺激応答性高分子の収縮を促す温度に設定することで、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となり、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物からの捕食から守り、また、バイオリアクター内の刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となり、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることができる揮発性有機塩素化合物浄化方法が得られる。
【００３４】
また、他の手段は、請求項１〜１３のいずれかに記載の微生物製剤を汚染現場に添加して、揮発性有機塩素化合物を浄化する方法であって、土着好気性微生物の増殖に伴う酸素の消費によって、汚染現場内が嫌気的状態へと変化する一定期間、刺激応答性高分子を疎水性に保持することにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、さらに汚染現場内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性へと変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法としたものでであり、汚染現場内に刺激応答性高分子の収縮を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となり、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、また、汚染現場内の刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となり、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることができる揮発性有機塩素化合物浄化方法が得られる。
【００３５】
また、他の手段は、汚染現場の温度を制御することによって、刺激応答性高分子を疎水性から親水性へと変化させることを特徴とする請求項１６に記載の揮発性有機塩素化合物浄化方法としたものでであり、汚染現場内を刺激応答性高分子の収縮を促す温度に設定することで、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となり、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物からの捕食から守り、また、汚染現場内に刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となり、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることができる揮発性有機塩素化合物浄化方法が得られる。
【００３６】
また、他の手段は、前記汚染現場が土壌、および地下水環境であることを特徴とする請求項１６または１７に記載の揮発性有機化合物浄化方法としたものであり、これらの環境に対してボーリング等の処理を行うことにより、本発明の微生物製剤を投入することができ、原位置での浄化が可能とすることができる揮発性有機塩素化合物浄化方法が得られる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物の分解能力を有する汚染物質分解微生物を、疎水性に保持した刺激応答性高分子で固定することによって、汚染現場内の環境が汚染物質分解微生物に適した環境となるまで、土着生物の捕食から保護するという効果のある微生物製剤を提供できる。
【００３８】
また本発明によれば、好気性微生物の栄養源と刺激応答性高分子と揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物とを含有する微生物製剤を汚染現場に投入することによって、土着好気性微生物が栄養源を消費して増殖するとともに、酸素の消費を促す。このようにして汚染現場内に嫌気的状態を構築するという効果のある微生物製剤を提供できる。
【００３９】
また本発明によれば、汚染現場が嫌気的状態へと変化するまでの一定期間は、刺激応答性高分子を疎水性に保持して汚染物質分解微生物を固定しておく。汚染現場が嫌気的状態となった後、刺激応答性高分子を親水性にして、固定している汚染物質分解微生物をすみやかに開放することで、浄化反応を開始するという効果のある微生物製剤を提供できる。
【００４０】
また本発明によれば、汚染現場を嫌気的状態とすることで、土着好気性生物を窒息、駆除することができ、汚染物質分解微生物にとって理想的な環境で浄化反応を開始するという効果のある微生物製剤を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明の請求項１記載の発明は、人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物の分解能を有する汚染物質分解微生物を、刺激応答性高分子で固定したものであり、刺激応答性高分子を疎水性に保持することで汚染物質分解微生物を固定し、刺激応答性高分子を親水性と変化させることで、汚染物質分解微生物を開放するという作用を有する。
【００４２】
また、本発明の請求項２記載の発明は、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を刺激応答性高分子で固定したものであり、刺激応答性高分子を疎水性に保持することで嫌気性微生物を固定し、刺激応答性高分子を親水性と変化させることで、嫌気性微生物を開放するという作用を有する。
【００４３】
また、本発明の請求項３記載の発明は、好気性微生物の栄養源と刺激応答性高分子と揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物とを含有する微生物製剤であり、微生物製剤を汚染現場に投入することによって、土着好気性微生物が栄養源を消費して増殖するとともに、酸素の消費を促す。汚染現場が嫌気的状態へと変化するまでの一定期間は、疎水性に保持した刺激応答性高分子によって、嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、汚染現場が嫌気的状態となったところで、刺激応答性高分子を親水性にし、固定している嫌気性微生物をすみやかに開放することで、浄化反応を開始するという作用を有する。
【００４４】
また、本発明の請求項４記載の発明は、刺激応答性高分子の内側に揮発性有機塩素化合物の脱塩素機能を有する嫌気性微生物を含み、外側に好気性微生物の栄養源を備える微生物製剤であり、土着好気性微生物が栄養源を消費すると同時に、嫌気性微生物を固定した刺激性応答高分子が汚染現場に浸透、拡散し、現場内が嫌気性状態となった時、すみやかに嫌気性微生物による浄化を行うことができるという作用を有する。
【００４５】
また、本発明の請求項５記載の発明は、揮発性有機塩素機能を有する嫌気性微生物を固定した刺激応答性高分子を、さらに好気性微生物の栄養源で包含した微生物製剤であり、土着好気性微生物が栄養源をある程度消費すると、嫌気性微生物を固定した刺激応答性高分子が汚染現場に浸透、拡散し、現場内が嫌気性状態となった時、すみやかに嫌気性微生物による浄化を行うことができるという作用を有する。
【００４６】
また、本発明の請求項６記載の発明は、好気性微生物の栄養源が飽和脂肪酸を含む微生物製剤であり、汚染現場に投入すると、飽和脂肪酸が土着好気性微生物によって消費されるとともに、嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を脱塩素化する際の電子供与体も同時に放出され、嫌気的状態での脱塩素化反応を促すという作用を有する。
【００４７】
また、本発明の請求項７記載の発明は、好気性微生物の栄養源がステアリン酸を含む微生物製剤であり、汚染現場に投入すると、ステアリン酸等が土着好気性微生物によって消費されるとともに、嫌気性微生物が揮発性有機塩素化合物を脱塩素化する際の電子供与体も徐々に放出され、嫌気的状態での脱塩素化反応を促すという作用を有する。
【００４８】
また、本発明の請求項８記載の発明は、刺激応答性高分子が温度応答性高分子である微生物製剤であり、汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以上にすることで、容易に温度応答性高分子を疎水性に保持し、嫌気性微生物を固定するという作用を有する。また汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以下にすると、すみやかに温度応答性高分子が親水性へと変化し、嫌気性微生物を開放するという作用を有する。
【００４９】
また、本発明の請求項９記載の発明は、温度応答性高分子の下限臨界溶解温度が３７℃以下である微生物製剤であり、汚染現場内の温度を３７℃以上にすることで、容易に温度応答性高分子を疎水性に保持することができ、嫌気性微生物を固定するという作用を有する。また汚染現場内の温度を３７℃以下にすると、すみやかに温度応答性高分子が親水性へと変化することで、嫌気性微生物を開放するという作用を有する。
【００５０】
また、本発明の請求項１０記載の発明は、温度応答性高分子がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の微生物製剤であり、汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以上にすることで、容易にポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を疎水性に保ち、嫌気性微生物を固定するという作用を有する。また汚染現場内の温度を下限臨界溶解温度以下にすると、すみやかにポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が親水性へと変化し、嫌気性微生物を開放するという作用を有する。
【００５１】
また、本発明の請求項１１記載の発明は、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物が、遺伝子組換え微生物である微生物製剤であり、脱塩素化酵素遺伝子をコードするプラスミドやトランスポゾンが導入された形質転換体、および脱塩素化酵素遺伝子を負に制御するリプレッサーをコードする遺伝子にポイントミューテーション等の手を加え、高発現処理を施した組換え体、またトランスポーターに手を加え、有機塩素化合物の取り込み能を向上させた組換え体等を用いることで、強力な脱塩素化能を持った遺伝子組換え微生物による効率的な浄化を行うという作用を有する。
【００５２】
また本発明の請求項１２記載の発明は、汚染物質分解微生物が、汚染物質分解能をもつ微生物を少なくとも１種を含んだ、２種以上の微生物からなる複合微生物系を含む微生物製剤であり、微生物間の物質の授受により、微生物間で脱塩素化能を補うことによって、安定した脱塩素化能を保持できる作用を有する。なお、複合微生物系がグラニュールを形成してもよいものとする。
【００５３】
また、本発明の請求項１３記載の発明は、浄化対象の揮発性有機塩素化合物がテトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、ビニルクロライドである微生物製剤であり、これらの化合物を脱塩素化する嫌気性微生物を汚染現場に投入する際に、現場内を嫌気的状態に促す作用と、現場内が嫌気的状態となるまでの一定期間、刺激性応答高分子によって嫌気性微生物を土着生物から保護するという作用を有する。
【００５４】
また、本発明の請求項１４記載の発明は、土着好気性微生物の栄養源を添加することによって、バイオリアクター内が嫌気的状態に変化するまでの一定期間、バイオリアクター内に刺激応答性高分子の収縮を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となる。これにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物からの捕食から守るという作用を有する。さらに、バイオリアクター内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性に変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法であり、またバイオリアクター内の刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となる。これにより、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させるという作用を有する。
【００５５】
また、本発明の請求項１５記載の発明は、バイオリアクター内の温度を制御することによって、刺激応答性高分子を疎水性から親水性へと変化させることを特徴とする有機塩素化合物浄化方法であり、バイオリアクター内を刺激応答性高分子の収縮を促す温度に設定することで、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性をとなる。これにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物からの捕食から守るという作用を有する。また、バイオリアクター内の刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となる。これにより、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させるという作用を有する。
【００５６】
また、本発明の請求項１６記載の発明は、土着好気性微生物の栄養源を添加することによって汚染現場内が嫌気的状態に変化するまでの一定期間、刺激応答性高分子を疎水性に保持することにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、さらに汚染現場内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性に変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法であり、汚染現場内に刺激応答性高分子の収縮を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となる。これにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守るという作用を有する。また汚染現場内の刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となる。これにより、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させるという作用を有する。
【００５７】
また、本発明の請求項１７記載の発明は、汚染現場内の温度を制御することによって刺激応答性高分子を疎水性から親水性へと変化させることを特徴とする有機塩素化合物浄化方法であり、汚染現場内を刺激応答性高分子の収縮を促す温度に設定することで、刺激応答性高分子が水分子との結合を解いて収縮し、疎水性となる。これにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物からの捕食から守るという作用を有する。また、汚染現場内に刺激応答性高分子の膨張を促す刺激を加えることによって、刺激応答性高分子の特定部位が水分子と結合し、親水性となる。この作用により、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させるという作用を有する。
【００５８】
また、本発明の請求項１８記載の発明は、汚染現場が土壌および地下水環境であることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法であり、これらの環境に対してボーリング等の処理を行うことにより、本発明の微生物製剤を投入することができ、原位置での浄化が可能となるという作用を有する。
【００５９】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００６０】
（実施の形態１）
図１は、刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル１を示している。本微生物製剤の製造方法としては、まず汚染物質分解微生物を適切な培養液で培養し、対数増殖期中において、培養液を含む濃縮菌体液を作製する。濃縮菌体液はすみやかに１０〜２０％刺激応答性高分子溶液と１：１の比で混合し、長期間保存する場合は、−２０℃にて凍結保存しておく。汚染現場投入前に融解し、微生物製剤として使用する。
【００６１】
この刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル１を汚染現場に投入するとともに、刺激応答性高分子が収縮するような刺激を加えると、図２のような状態となる。
【００６２】
図２は、疎水性に保持した刺激応答性高分子２で、汚染物質分解微生物３を固定し、疎水性領域４を形成することにより、汚染物質分解微生物３が土着好気性微生物５の捕食から免れている状態を示している。この時、土着好気性微生物５は、好気性微生物の栄養源６を消費し、汚染現場等内の環境を徐々に嫌気的状態と変化させていく。
【００６３】
図３は、汚染現場内が嫌気的状態となった後、刺激応答性高分子が膨張するような刺激を加え、刺激応答性高分子２を親水性にすることにより、固定された汚染物質分解微生物３を汚染現場等に開放する様子を示している。以上の方法により、汚染物質分解微生物が土着好気性微生物の捕食を受けず、生育に適した嫌気的状態で、浄化処理することが可能となる。
【００６４】
なお、刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル１は、必要に応じてグリセロール等を添加することができる。また、嫌気的状態を確認する手段としては、一般的な酸化還元電位計を使用することができる。嫌気的状態であると判断する酸化還元電位計の数値は、−２００ｍＶ以下とする。
【００６５】
なお、本実施の形態における微生物製剤の刺激応答性高分子２として用いることができる物質は、温度応答性高分子であるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをはじめ、単独で重合したときに水中の転移温度が１０〜３７℃の温度応答性高分子でも同様の効果が得られるものである。このような温度応答性ポリマーを与えるモノマーとしては、例えばＮ‐ｎ‐プロピルアクリルアミド、Ｎ‐ｎ‐プロピルメタクリルアミド、Ｎ‐イソプロピルアクリルアミド、Ｎ‐イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ‐ジエチルアクリルアミド、Ｎ‐メチル‐Ｎ‐ｎ‐プロピルアクリルアミド、Ｎ‐メチル‐Ｎ‐イソプロピルアクリルアミド、Ｎ‐テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ‐テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、Ｎ‐エトキシプロピルアクリルアミド、Ｎ‐エトキシプロピルメタクリルアミド、Ｎ‐エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ‐１‐メチル‐２‐メトキシエチルアクリルアミド、Ｎ‐モルホリノプロピルアクリルアミド、Ｎ‐メトキシプロピルアクリルアミド、Ｎ‐メトキシプロピルメタクリルアミド、Ｎ‐イソプロポキシプロピルアクリルアミド、Ｎ‐イソプロポキシプロピルメタクリルアミド、Ｎ‐イソプロポキシエチルアクリルアミド、Ｎ‐イソプロポキシエチルメタクリルアミドなどが挙げられる。
【００６６】
また、単独で重合させた時には１０℃〜３７℃の温度応答性ポリマーを与えないが、単独重合で温度応答性ポリマーを与えるモノマーとともに共重合させることで、温度による疎水性−親水性という性質を発現するモノマーも存在する。このような共重合に用いられるモノマーとしては、例えばＮ‐エチルアクリルアミド、Ｎ‐シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ‐シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ‐メチル‐Ｎ‐エチルアクリルアミド、Ｎ‐アクリロイルピペリジン、Ｎ‐アクリロイルピロリジン、Ｎ‐エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ‐（２，２‐ジメトキシエチル）‐Ｎ‐メチルアクリルアミド、Ｎ‐１‐メチル‐２‐メトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ‐１‐メトキシメチルプロピルアクリルアミド、Ｎ‐１‐メトキシメチルプロピルメタクリルアミド、Ｎ‐（１，３‐ジオキソラン‐２‐イルメチル）‐Ｎ‐メチルアクリルアミド、Ｎ‐８‐アクリロイル‐１，４‐ジオキサ‐８‐アザ‐スピロ［４，５］デカンなどが挙げられ、同様の効果が得られるものである。また温度応答性高分子以外にも、ある刺激を加えることによって疎水性から親水性への可逆的な物性変化が起こる高分子、例えばpH、光、電気的刺激等によって可逆的な相転移挙動する物質であっても、同様の効果が得られるものである。
【００６７】
なお、本実施の形態で使用される微生物製剤の汚染物質分解微生物３として用いることができる微生物は、揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する各種嫌気性微生物、具体的にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、 Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｄｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｏｎｉｌｅ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｈａｌｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ等の各属に属する微生物等を利用しても、同様の効果が得られるものである。
【００６８】
さらに揮発性有機塩素化合物等、動物実験を通して、人体に対して急性毒性、慢性毒性の疑われる化合物を分解しうる各種微生物も用いることができるものとする。人体に対して急性毒性、慢性毒性の疑われる化合物とは、芳香族炭化水素であるベンゼン、キシレン、トルエン、また多環芳香族炭化水素であるジベンゾダイオキシン、ジベンゾチオフェン、ジベンゾフラン、ビフェニル、および多環芳香族炭化水素のクロル基、メチル基等の各種置換基が導入された化合物であるポリ塩化ジベンゾパラジオキシン、ポリ塩化ジベンゾフラン、コプラナーＰＣＢ、メチルジベンゾチオフェン、ジメチルジベンゾチオフェン等が上げられる。これらの化合物を分解する微生物としては、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、 Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、 Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、 Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓ、 Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｍａｓ等の各属に属する微生物等があり、これらの微生物を利用しても同様の効果が得られるものである。
【００６９】
（実施の形態２）
図４は、温度応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル７を飽和脂肪酸８で包含した微生物製剤である。
【００７０】
上記構成において、飽和脂肪酸８は、微生物製剤を汚染現場等に投与した後、土着好気性微生物５に消費される。土着好気性微生物５の増殖に伴い、汚染現場等内の酸素が消費され、汚染現場等は徐々に嫌気的状態へと移行する。汚染現場が嫌気的状態となったことを確認した後、刺激応答性高分子２の物性を疎水性から親水性へと変化させることで、固定されている汚染物質分解微生物３を開放し、汚染現場の浄化処理を行う。好気性微生物の栄養源６としては、例えば飽和脂肪酸であるステアリン酸等、好気性微生物の代謝とともに、脱塩素化反応の電子供与体となりうる水素等を徐放するものが好ましい。
【００７１】
本実施の形態で使用される微生物製剤の製造方法としては、飽和脂肪酸等の固体状物質を担体として、刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル１が流出しないように固定されている方法ならば構わない。例えば、混合ゲル１を担体内部に閉じ込める包括固定化法や、担体を多孔質処理し、減圧下で担体の孔隙内に刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル１を封入する方法等がある。
【００７２】
なお、本微生物製剤の好気性微生物の栄養源６として用いる物質は、飽和脂肪酸であるステアリン酸等、好気性微生物の代謝とともに、脱塩素化反応の電子供与体となりうる水素等を徐放するものが好ましい。例えばカプリン酸、ラウリン酸、ミリシチン酸、パルミチン酸、アラキジン酸、リグノセリン酸、ベヘニン酸、およびこれら脂肪酸の混合物でも同様の効果が得られるものとする。
【００７３】
また脂肪酸と１価アルコールのエステル、脂肪酸と多価アルコールのエステルまたはその誘導体、脂肪酸とグリセリンのエステル、脂肪アミン、脂肪酸アマイド等でも同様の効果が得られるものとする。
【００７４】
また好気性微生物の栄養源６は、必ずしも刺激応答性高分子２と汚染物質分解微生物３の混合ゲル１を担持している必要はなく、好気性微生物の栄養源６を単独で汚染現場等に添加し、汚染現場を嫌気的状態とした後に刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル１を添加してもよい。従って好気性微生物の栄養源６は、固体状のものに限定されるものではなく、グリセリン等を含むゲル状のもの、ソルビトール等を含む液体状のものでも同様の効果が得られるものである。
【００７５】
（実施の形態３）
図５は、温度応答性高分子であるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）と汚染物質分解微生物との混合ゲル９が、ステアリン酸１０内に注入された微生物製剤を示している。ステアリン酸１０は円柱の中心部が空洞となるように製造され、その円柱状のステアリン酸１０をポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）と汚染物質混合分解微生物との混合ゲル９に浸漬させ、図５のような微生物製剤が製造される。使用前は−２０℃程度で凍結保存しておく。汚染現場等をポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の下限臨界溶解温度である３２℃以上に保った状態で投入すると、ステアリン酸１０内に固定されている混合ゲル９が徐々に汚染現場等に拡散する。土着好気性微生物５は、ステアリン酸１０を消費しながら、電子供与体である水素を産生する。土着好気性微生物５の増殖によって、汚染現場等内の環境が嫌気的状態となった時、汚染現場内を３２℃以下にすることによって、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が収縮から膨張するようになり、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）内に固定されていた汚染物質分解微生物３が汚染現場に拡散し、浄化処理を開始する。
【００７６】
（実施の形態４）
図６は、汚染物質分解能を強化した遺伝子組換え微生物１３を示している。
【００７７】
微生物内の汚染物質分解酵素遺伝子の一部は常時発現している訳ではなく、リプレッサー１２による制御を受けている場合がある。もし、汚染物質分解酵素遺伝子を負に制御するリプレッサー１２が存在する場合、リプレッサー１２を破壊し、負の制御を解くことによって、汚染物質分解酵素遺伝子を常時発現させることが可能となる。逆方向繰返し配列と抗生物質耐性遺伝子を保有するトランンポゾン１１を、トランスポザーゼとともに、エレクトロポレーション等により汚染物質分解微生物に導入し、ランダムな遺伝子破壊を行う。トランスポゾン１１が正常に挿入された株を抗生物質で選択し、変異株ライブラリーを作製する。変異株ライブラリーより目的株をスクリーニングすることによって、汚染物質分解能を強化された遺伝子組換え微生物を取得することができる。
【００７８】
（実施の形態５）
図７は、温度応答性高分子で固定した複合微生物系１７をバイオリアクター内に添加して、浄化処理を行う方法を示している。複合微生物系１７は揮発性有機塩素化合物を脱塩素化する能力を有しているものとする。まず、ポンプ等によって揮発性有機塩素化合物で汚染された地下水を汲み上げ、地下水流入管１４を通って嫌気バイオリアクター槽１６に搬送する。地下水を嫌気バイオリアクター槽１６に搬送する前に、地下水流入管１４の途中に設置されたニクロムヒーター１５によって、地下水をある程度温めておく。嫌気バイオリアクター槽１６内にもニクロムヒーター１５が設置されており、さらにライザー管１８によって、嫌気バイオリアクター槽１６内の地下水にエアーリフト効果を与えることで、地下水が緩やかに循環した状態となっているため、嫌気バイオリアクター槽１６内は均一な温度に保つことができる。浄化初期段階は、嫌気バイオリアクター槽１６内の温度を下限臨界溶解温度以上に保った状態にしておき、温度応答性高分子によって固定された複合微生物系１７と土着好気性微生物の栄養源を添加する。土着好気性微生物が栄養源を消費するとともに、嫌気バイオリアクター内の酸素を消費し、リアクター内を徐々に嫌気的状態とする。嫌気バイオリアクター内に設置された酸化還元電極の測定値が−２００ｍＶ以下となったことを確認した後、リアクター内の温度を下限臨界溶解温度以下に低下させることで、温度応答性高分子に固定された複合微生物系１７を開放することにより、揮発性有機塩素化合物の還元的脱塩素化反応を促す。
【００７９】
揮発性有機塩素化合物の中で、塩素置換数の多いテトラクロロエチレン等は、嫌気性微生物による還元的脱塩素化反応を受けやすい。一方で、テトラクロロエチレンの分解産物であるシス−１、２−ジクロロエチレンやビニルクロリドは、好気性微生物によって消費されやすい傾向にある。従って、嫌気バイオリアクター槽１６内で完全に脱塩素化しきれなかった揮発性有機塩素化合物は、次の好気バイオリアクター槽２０に搬送される。また嫌気バイオリアクター槽１６内で揮発してしまった有機塩素化合物は、排気管１９を通って再び好気バイオリアクター槽２０に送られる。好気バイオリアクター槽２０は空気流入管２１を備え、常時地下水中の酸素濃度が高い状態を維持している。ここで、嫌気バイオリアクター槽１６で処理しきれなかった有機塩素化合物を完全に分解処理する。なお、好気バイオリアクター槽２０内で揮発した有機塩素化合物、呼吸により生成した二酸化炭素等は、活性炭フィルターを通して無害化され、排気する。処理後の地下水は、排水管を通して、再び汚染現場に戻される。
【００８０】
（実施の形態６）
図８は、本発明に係る微生物製剤は土壌環境２５や地下水環境２６に存在する汚染物質をｉｎ ｓｉｔｕにて浄化する方法と、汚染物質を含む土壌や地下水等をバイオリアクター２７に運搬した後、バイオリアクター２７へ微生物製剤を添加し、ｏｎ ｓｉｔｅもしくはｅｘ ｓｉｔｕで浄化処理する方法を示している。
【００８１】
本発明に係る微生物製剤の注入方法としては、一般的な方法が適用可能である。その方法は特に制限されるものではないが、微生物製剤が汚染現場まで到達し、汚染現場の環境が浄化に適した状態に変化するまでは、刺激応答性高分子が疎水性である必要がある。従って、刺激応答性高分子が温度応答性高分子である場合には、注入から汚染物質分解微生物を開放するまで、温度応答性高分子の下限臨界溶解温度以上に保持しなければならない。汚染現場等が下限臨界溶解温度以上である場合には、汚染物質分解微生物開放時に汚染現場内およびバイオリアクター２７内の温度を下げるために、低温の水、および低温の嫌気性微生物の脱塩素化に必要な因子を含むものをポンプ２８で注入すればよい。
【００８２】
しかし多くの場合、汚染現場等は下限臨界溶解温度以下であるため、温度応答性高分子を水等とともに汚染現場に投入する前に、ニクロムヒーター３０で下限臨界溶解温度以上にする。微生物製剤を汚染現場に投入した後は、ブロア等によって汚染現場に温風の風を送る等の処置により、現場内を下限臨界溶解温度以上に保つこともできる。また、汚染現場内が嫌気的状態であることを確認した後は、汚染現場に下限臨界溶解温度以下の水等を注入することによって、温度応答性高分子に固定された嫌気性微生物を開放させるとともに、水等によって汚染現場内に拡散させる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物の分解能を有する汚染物質分解微生物を、疎水性に保持した刺激応答性高分子で固定することによって、汚染現場内の環境が汚染物質分解微生物に適した環境となるまで、土着生物の捕食から保護する機能を有する微生物製剤であり、狙ったポイントに高濃度の微生物を注入、開放することができるため、浄化槽、廃水処理場等にも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】本発明の実施の形態１における微生物製剤を示す図
【図２】本発明の実施の形態１において、刺激応答性高分子が収縮している状態を示す図
【図３】本発明の実施の形態１において、刺激応答性高分子が膨張している状態を示す図
【図４】本発明の実施の形態２における微生物製剤の断面図を示す図
【図５】本発明の実施の形態３における微生物製剤の構造を示す図
【図６】本発明の実施の形態４における遺伝子組換え微生物の作製方法を示す図
【図７】本発明の実施の形態５におけるバイオリアクターでの微生物製剤の使用方法を示す図
【図８】本発明の実施の形態６における汚染現場での微生物製剤の使用方法を示す図
【符号の説明】
【００８５】
１ 刺激応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル
２ 刺激応答性高分子
３ 汚染物質分解微生物
４ 疎水性領域
５ 土着好気性微生物
６ 好気性微生物の栄養源
７ 温度応答性高分子と汚染物質分解微生物との混合ゲル
８ 飽和脂肪酸
９ ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）と汚染物質分解微生物との混合ゲル
１０ ステアリン酸
１１ トランスポゾン
１２ リプレッサー
１３ 遺伝子組換え微生物
１４ 地下水流入管
１５ ニクロムヒーター
１６ 嫌気バイオリアクター槽
１７ 複合微生物系
１８ ライザー管
１９ 排気管
２０ 好気バイオリアクター槽
２１ 空気流入管
２２ 空気
２３ 活性炭フィルター
２４ 排水管
２５ 土壌環境
２６ 地下水環境
２７ バイオリアクター
２８ ポンプ
２９ 汚染現場
３０ ニクロムヒーター
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物の分解能を有する汚染物質分解微生物を、刺激応答性高分子で固定することを特徴とする微生物製剤。
【請求項２】
揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を、刺激応答性高分子で固定することを特徴とする請求項１記載の微生物製剤。
【請求項３】
好気性微生物の栄養源と刺激応答性高分子と揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物とを含有することを特徴とする請求項１または２記載の微生物製剤。
【請求項４】
刺激応答性高分子の内側に、揮発性有機化合物の脱塩素機能を有する嫌気性微生物を含み、外側に好気性微生物の栄養源を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項５】
揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を固定した刺激応答性高分子を、さらに好気性微生物の栄養源で包含することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項６】
好気性微生物の栄養源が飽和脂肪酸を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項７】
好気性微生物の栄養源がステアリン酸を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項８】
刺激応答性高分子が温度応答性高分子であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項９】
温度応答性高分子の下限臨界溶解温度が３７℃以下であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項１０】
温度応答性高分子がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項１１】
揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する汚染物質分解微生物が、遺伝子組換え微生物であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項１２】
汚染物質分解微生物が、汚染物質分解能を有する微生物を少なくとも１種含む、２種以上微生物からなる複合微生物系であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項１３】
揮発性有機塩素化合物がテトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、ビニルクロライドであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の微生物製剤をバイオリアクター内に添加して、揮発性有機塩素化合物を浄化する方法であって、土着好気性微生物の増殖に伴う酸素の消費によって、バイオリアクター内が嫌気的状態へと変化する一定期間、刺激応答性高分子を疎水性に保持することにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、さらにバイオリアクター内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性へと変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法。
【請求項１５】
バイオリアクター内の温度を制御することによって、刺激応答性高分子を疎水性から親水性へと変化させることを特徴とする請求項１４記載の揮発性有機塩素化合物浄化方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載の微生物製剤を汚染現場に添加して、揮発性有機塩素化合物を浄化する方法であって、土着好気性微生物の増殖に伴う酸素の消費によって、汚染現場内が嫌気的状態へと変化する一定期間、刺激応答性高分子を疎水性に保持することにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、さらに汚染現場内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性へと変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法。
【請求項１７】
汚染現場の温度を制御することによって、刺激応答性高分子を疎水性から親水性へと変化させることを特徴とする請求項１６に記載の揮発性有機塩素化合物浄化方法。
【請求項１８】
前記汚染現場が土壌、および地下水環境であることを特徴とする請求項１６または１７に記載の揮発性有機化合物浄化方法。
【請求項１】
人体もしくは生物に対して毒性が認められる化合物の分解能を有する汚染物質分解微生物を、刺激応答性高分子で固定することを特徴とする微生物製剤。
【請求項２】
揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を、刺激応答性高分子で固定することを特徴とする請求項１記載の微生物製剤。
【請求項３】
好気性微生物の栄養源と刺激応答性高分子と揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物とを含有することを特徴とする請求項１または２記載の微生物製剤。
【請求項４】
刺激応答性高分子の内側に、揮発性有機化合物の脱塩素機能を有する嫌気性微生物を含み、外側に好気性微生物の栄養源を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項５】
揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を固定した刺激応答性高分子を、さらに好気性微生物の栄養源で包含することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項６】
好気性微生物の栄養源が飽和脂肪酸を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項７】
好気性微生物の栄養源がステアリン酸を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項８】
刺激応答性高分子が温度応答性高分子であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項９】
温度応答性高分子の下限臨界溶解温度が３７℃以下であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項１０】
温度応答性高分子がポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項１１】
揮発性有機塩素化合物の脱塩素化機能を有する汚染物質分解微生物が、遺伝子組換え微生物であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項１２】
汚染物質分解微生物が、汚染物質分解能を有する微生物を少なくとも１種含む、２種以上微生物からなる複合微生物系であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項１３】
揮発性有機塩素化合物がテトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレン、ビニルクロライドであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の微生物製剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の微生物製剤をバイオリアクター内に添加して、揮発性有機塩素化合物を浄化する方法であって、土着好気性微生物の増殖に伴う酸素の消費によって、バイオリアクター内が嫌気的状態へと変化する一定期間、刺激応答性高分子を疎水性に保持することにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、さらにバイオリアクター内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性へと変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法。
【請求項１５】
バイオリアクター内の温度を制御することによって、刺激応答性高分子を疎水性から親水性へと変化させることを特徴とする請求項１４記載の揮発性有機塩素化合物浄化方法。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかに記載の微生物製剤を汚染現場に添加して、揮発性有機塩素化合物を浄化する方法であって、土着好気性微生物の増殖に伴う酸素の消費によって、汚染現場内が嫌気的状態へと変化する一定期間、刺激応答性高分子を疎水性に保持することにより、有機塩素化合物脱塩素化機能を有する嫌気性微生物を土着生物の捕食から守り、さらに汚染現場内が嫌気的状態へ変化した後に、刺激応答性高分子を親水性へと変化させることで、刺激応答性高分子内に固定された嫌気性微生物を開放させることを特徴とする揮発性有機塩素化合物浄化方法。
【請求項１７】
汚染現場の温度を制御することによって、刺激応答性高分子を疎水性から親水性へと変化させることを特徴とする請求項１６に記載の揮発性有機塩素化合物浄化方法。
【請求項１８】
前記汚染現場が土壌、および地下水環境であることを特徴とする請求項１６または１７に記載の揮発性有機化合物浄化方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−１０４９１６（Ｐ２００７−１０４９１６Ａ）
【公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２９６３１７（Ｐ２００５−２９６３１７）
【出願日】平成１７年１０月１１日（２００５．１０．１１）
【出願人】（０００００５８２１）松下電器産業株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月１１日（２００５．１０．１１）
【出願人】（０００００５８２１）松下電器産業株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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