心筋細胞分化誘導促進剤及びその使用方法
【課題】心筋細胞分化誘導促進剤及びその使用方法を提供すること。
【解決手段】
本発明の心筋細胞分化誘導促進剤は、アンジオテンシンII受容体拮抗薬を有効成分として含有し、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する。また、本発明の心筋細胞分化誘導促進方法は、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において間葉系幹細胞を培養することを特徴とする。さらに、本発明の間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化させる分化誘導方法は、間葉系細胞をアンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理する工程と、アンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理した前記間葉系細胞をフィーダー細胞上で培養する工程とを包含する。
ここで、アンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、テルミサルタン、バルサルタン等が挙げられる。アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において、上記間葉系幹細胞を5日以上、好ましくは2週以上、最も好ましくは2〜3週間培養する。
【解決手段】
本発明の心筋細胞分化誘導促進剤は、アンジオテンシンII受容体拮抗薬を有効成分として含有し、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する。また、本発明の心筋細胞分化誘導促進方法は、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において間葉系幹細胞を培養することを特徴とする。さらに、本発明の間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化させる分化誘導方法は、間葉系細胞をアンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理する工程と、アンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理した前記間葉系細胞をフィーダー細胞上で培養する工程とを包含する。
ここで、アンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、テルミサルタン、バルサルタン等が挙げられる。アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において、上記間葉系幹細胞を5日以上、好ましくは2週以上、最も好ましくは2〜3週間培養する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞分化誘導促進剤及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、骨芽細胞、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞等間葉系細胞への多分化能及び自己増殖能を有しているため、骨や軟骨、筋肉等の再生医療への応用が期待されている。
【０００３】
現在までに、心筋細胞に分化する能力を有する細胞として、子宮内膜、月経血、臍帯血、又は胎児付属臓器から単離された間葉系幹細胞が同定されている。この間葉系幹細胞は、フィーダー細胞との共培養により、心筋細胞に分化することが分かっている（例えば、特許文献1参照）。しかしながら、間葉系幹細胞を心筋細胞へ高い効率で分化誘導させる方法は、未だ開発されていない。
【特許文献１】国際公開番号WO2006／078034
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、心筋細胞分化誘導促進剤、及びその使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、以下の実施例に示すように、間葉系幹細胞をフィーダー細胞と共培養して心筋細胞に分化誘導させる際、予めテルミサルタン（telmisartan）又はバルサルタン（valsartan）等のアンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下で間葉系幹細胞を前処理することによって、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進できることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明にかかる心筋細胞分化誘導促進剤は、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する促進剤であって、アンジオテンシンII受容体拮抗薬を有効成分として含有する。ここで、前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、例えば、テルミサルタン(telmisartan)又はバルサルタン(valsartan)等が挙げられる。また、前記間葉系幹細胞としては、例えば、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来の間葉系幹細胞等が挙げられる。
【０００７】
本発明にかかる心筋細胞分化誘導促進方法は、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する方法であって、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において間葉系幹細胞を培養することを特徴とする。ここで、前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、例えば、テルミサルタン又はバルサルタン等が挙げられる。また、前記間葉系幹細胞としては、例えば、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来の間葉系幹細胞等が挙げられる。前記フィーダー細胞は、哺乳類胎仔由来の心筋細胞であることが好ましい。また、前記心筋細胞分化誘導促進方法においては、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において、２週間以上間葉系幹細胞を培養することが好ましい。
【０００８】
本発明にかかる間葉系幹細胞は、心筋細胞へ分化する能力を有する間葉系幹細胞であって、前記間葉系幹細胞は、アンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理されたことを特徴とする。ここで、前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、例えば、テルミサルタン又はバルサルタン等が挙げられる。また、前記間葉系幹細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来の間葉系幹細胞等が挙げられる。前記間葉系幹細胞は、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において2週間以上培養されたことが好ましい。
【０００９】
本発明にかかる分化誘導方法は、間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化させる分化誘導方法であって、前記間葉系細胞をアンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理する工程と、アンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理した前記間葉系細胞をフィーダー細胞上で培養する工程と、を包含することを特徴とする。ここで、前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、例えば、テルミサルタン又はバルサルタン等が挙げられる。また、前記間葉系幹細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来の間葉系幹細胞等が挙げられる。前記フィーダー細胞は、哺乳類胎仔由来の心筋細胞であることが好ましい。また、前記分化誘導方法においては、間葉系幹細胞が、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において、2週間以上培養されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、心筋細胞分化誘導促進剤及びその使用方法を提供することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的かつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１２】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１３】
（1）薬理作用
テルミサルタン又はバルサルタン等のアンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において骨髄由来の間葉系幹細胞を培養し、この培養後の間葉系幹細胞をフィーダー細胞である哺乳類胎仔由来の心筋細胞と共培養すると、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化を促進することができる。このことから、アンジオテンシンII受容体拮抗薬は、分化誘導前の間葉系幹細胞に作用することによって、その間葉系幹細胞の分化状態を心筋細胞の方向へ進めると考えられる。
このようなアンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、テルミサルタン、バルサルタン以外にも、ロルサルタンカリウム、カンデサルタンシレキセチル、オルメサルタンメドキソミル等が挙げられる。また、間葉系幹細胞としては、心筋細胞へ分化する能力を有する間葉系幹細胞であればよく、例えば、骨髄、末梢血、G−CSF投与後の末梢血、臍帯血、又は胎盤付属臓器由来の間葉系幹細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
（2）アンジオテンシンII受容体拮抗薬を含有する薬剤の有用性
前述の通り、アンジオテンシンII受容体拮抗薬は、分化誘導前の間葉系幹細胞に作用することによって、その間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進することができる。従って、アンジオテンシンII受容体拮抗薬を有効成分として含有する薬剤は、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進するのに有用である。
間葉系幹細胞は、それ自身、自己複製能、自己増殖能、及び多分化能を有するため、この薬剤を用いることによって、間葉系幹細胞から多量の心筋細胞を産生することが可能になる。
現在、新薬の開発において、薬物スクリーニング試験、毒性試験、安全性薬理試験等に用いることが可能な心筋細胞の供給が求められているので、本発明の心筋細胞分化誘導方法を用いれば、このような試験の実施に合わせて、十分な量の心筋細胞を確保することが可能になる。
【００１５】
（3）上記薬剤の製造
本発明のアンジオテンシンII受容体拮抗薬を有効成分として含有する薬剤としては、例えば、テルミサルタン（4'-{[4-methyl-6-(1-methyl-2-benzimidazolyl)-2-propyl-1-benzimidazolyl]methyl}-2-biphenylcarboxylic acid）、バルサルタン（(−)-N-{4-[2-(1H-Tetrazol-5-yl)phenyl]benzyl}-N-valeryl-L-valine）、ロサルタンカリウム（2-Butyl-4-chloro-1-[2'-(tetrazol-5-yl) biphenyl-4-ylmethyl]-1H -imidazole-5-methanol potassium salt）、カンデサルタンシレキセチル（(RS)-1-[(Cyclohexyloxy)carbonyloxy]ethyl 2-ethoxy-1-｛[2'-(1H-tetrazol-5-yl)biphenyl-4-yl]methyl｝-1H-benzimidazole-7-carboxylate）、オルメサルタンメドキソミル（(5-methyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl 4-(1-hydroxy-1-methylethyl)-2-propyl-1-{[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-1,1'-biphenyl-4-yl]methyl}-1H-imidazole-5-carboxylate）等が挙げられる。本発明の薬剤は、当業者に公知の技術を用いて合成してもよいし、市販のものを用いてもよい。
【００１６】
（4）間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導方法
間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する方法としては、フィーダー細胞（例えば、心筋細胞）との共培養、5-アザシチジン、DMSO、又はオキシトシンの投与等が挙げられる。
【００１７】
以下、間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する方法の一例として、間葉系幹細胞とフィーダー細胞を共培養することにより、間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する方法について述べる。
【００１８】
（i）間葉系幹細胞の調製及び前処理
間葉系幹細胞は、骨髄、末梢血、G−CSF投与後の末梢血、臍帯血、又は胎盤付属臓器等から採取することができる。なお、骨髄の採取部位は特に限定されないが、例えば、脊椎、胸骨、腸骨等の骨髄を用いることができる。
これらの材料から間葉系幹細胞を調製する際、例えば骨髄、胎盤付属臓器のように、この材料が間葉系幹細胞を巻き込んだ細胞塊になっている場合には、含まれている細胞を解離するために、材料に対してピペッティング等による物理的処理や、酵素等による化学的処理を行えばよい。酵素としては、トリプシン、コラゲナーゼ等、常法で用いられている酵素が挙げられる。また、例えば、末梢血、臍帯血等の血液から間葉系幹細胞を調製する際は、低張溶液（例えば、水等）で処理することにより、赤血球を溶血しておくことが好ましい。このように、用いる材料に対して適切な処理を行って、間葉系幹細胞を調製する。
【００１９】
次に、上記手法によって調製した間葉系肝細胞を遠心分離（500〜2000rpm、3〜10分）し、沈殿物に培地を入れて細胞浮遊液を調製する。ここで、培地は、間葉系幹細胞が培養することができる培地であれば特に限定されず、例えば、α−MEM（α-minimum essential medium）、DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）、IMDM（Isocove’s modified Dulbecco’s medium）等が挙げられる。また、培地は、5〜10％ウシ胎仔血清（FCS）を含んでいることが好ましく、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を含んでいてもよい。細胞浮遊液を培養皿に入れて、37℃、5％CO2インキュベーターで培養する。
【００２０】
次に、上記培養皿にアンジオテンシンII受容体拮抗薬を添加する。ここで、添加するアンジオテンシンII受容体拮抗薬の濃度は、例えば、テルミサルタンの場合は、0.1〜1μMの濃度であることが好ましく、0.1μMの濃度であることが特に好ましい。また、バルサルタンの場合は、0.1〜1μMの濃度であることが好ましく、0.1μMの濃度であることが特に好ましい。なお、所定の濃度のアンジオテンシンII受容体拮抗薬を作製する際は、細胞に障害を与えにくい溶媒を用いて希釈すればよく、例えば、テルミサルタンの場合は、ギ酸、メタノール、無水酢酸等の有機溶媒で希釈することが好ましく、バルサルタンの場合は、DMSO（dimethylsulfoxide）、メタノール、エタノール、アセトニトリル等の有機溶媒で希釈することが好ましく、ロサルタンカリウムの場合は、DMSO、メタノール、エタノール等の有機溶媒で希釈することが好ましく、カンデサルタンシレキセチルの場合は、DMSO、ベンジルアルコール、アセトン、酢酸等の有機溶媒で希釈することが好ましく、オルメサルタンメドキソミルの場合は、DMSO、メタノール、アセトン等の有機溶媒で希釈することが好ましい。このような条件下において、5日以上、好ましくは2週以上、最も好ましくは2〜3週間、37℃、5％CO2インキュベーターで培養する。
【００２１】
このような条件下で培養した結果、培養皿に付着した細胞を、以下の実験に用いる間葉系幹細胞とする。
【００２２】
（ii）フィーダー細胞の調製
フィーダー細胞は、間葉系幹細胞の分化誘導を起こさせることができる細胞であれば特に限定されないが、心筋細胞の初代培養細胞等が挙げられる。なお、フィーダー細胞として培養細胞を用いる場合、細胞の増殖を防ぐために、用いる培養細胞に対して、γ線照射やマイトマイシン等による処理を予め施しておいてもよい。ここでは、哺乳類胎仔由来の心筋細胞を用いたフィーダー細胞の調製方法の一例について述べる（The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004)を参照のこと）。
【００２３】
まず、胎生14〜16日目の哺乳類（例えば、マウス等）の胎仔の心臓を切除し、5〜10％ウシ胎仔血清含有DMEM培地、又は5〜10％ウシ胎仔血清含有DMEM／F−12培地に入れ、眼科用ハサミを用いて細かく切る。次に、心筋組織から心筋細胞を解離するために、組織の間質を消化するトリプシンなどの酵素を上記培養皿に入れて、37℃で5分間インキュベートする。
【００２４】
酵素処理後、上記手法によって調製した細胞を遠心分離（500〜2000rpm、3〜10分）し、沈殿物にDMEMなどの培地を入れて細胞浮遊液を調製する。また、培地は、5〜10％ウシ胎仔血清（FCS）を含んでいることが好ましく、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を含んでいてもよい。細胞浮遊液を培養皿に入れて、37℃、5％CO2インキュベーターで培養する。培養後、培養上清を吸引によって除去し、培養皿に付着した細胞を、以下の実験に用いるフィーダー細胞とする。
【００２５】
（iii）間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導
「（ii）フィーダー細胞の調製」に従って調製したフィーダー細胞上に、「（i）間葉系幹細胞の調製及び前処理」に従って調製した間葉系幹細胞を、1×101〜1×102／cm2の濃度になるように添加し、37℃、5％CO2インキュベーターで培養する。
なお、フィーダー細胞と間葉系幹細胞とを区別するために、間葉系幹細胞を予め標識しておいてもよい。標識方法としては、例えば、GFP遺伝子を間葉系幹細胞に遺伝子導入して標識したり、細胞に無害な色素を微細注入することにより標識したりする方法等が挙げられる（The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004)を参照のこと）。
【００２６】
（iv）分化誘導された心筋細胞の同定
分化誘導された心筋細胞は、一つ一つの細胞の辺縁が細胞の中心方向に集合するように拍動し、収縮時に細胞質が厚くなるため、間葉系幹細胞を予めGFP等で蛍光標識しておけば、心筋細胞を細胞レベルで同定することができ、容易に心筋細胞を観察できるようになる。また、複数の細胞の拍動が同期化して、一群の細胞で拍動を打つようになることもある。分化誘導された心筋細胞はこのような特徴を有するので、顕微鏡下において、容易に同定することができる。
【００２７】
あるいは、心筋細胞に特異的なマーカーを用いて、分化誘導した心筋細胞数を測定してもよい。例えば、in situ hybridization法や免疫染色法などにより、心筋細胞に特異的なmRNAやタンパク質の発現を検出することができる。心筋細胞に特異的なマーカーとしては、例えば、Nkx2.5/Csx、GATA4、TEF-1、MEF-2C、MEF-2D、MEF-2A、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）、α−ミオシン重鎖（α-MHC）、β−ミオシン重鎖（β-MHC）、ミオシン軽鎖−2a（MLC-2a）、ミオシン軽鎖−2v（MLC-2v）、α−心筋アクチン、心筋Troponin T、connexin43（Cnx43）等が挙げられる（J. Clin. Invest., 103, 697-705 (1999)を参照のこと）が、これらに限定されない。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を用いて、以上に説明した実施態様を具体的に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。これらの実施例より、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進するためには、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において間葉系幹細胞を予め培養しておくことが有効であることが示される。
【００２９】
＜実施例1：ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導＞
本実施例では、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を用い、アンジオテンシンII受容体拮抗薬であるテルミサルタン存在下における心筋細胞への分化能について検討した。
【００３０】
（1）間葉系幹細胞の調製
当施設倫理委員会で承認されたプロトコールに従って、インフォームドコンセントを行ったボランティアに対して、骨髄液の採取を行った。
まず、骨髄提供者を臥位にし、腸骨周囲を消毒した後、無菌操作下で局所麻酔を行った。麻酔にて無痛となった事を確認した後、局所麻酔下にて骨髄穿刺針を骨髄腔まで刺入し、10ccシリンジにて骨髄液を15ccから30cc採取した。
このようにして採取した骨髄液を10％FCS（牛胎仔血清）含有α−MEM培地に懸濁した。この骨髄液を、50〜100μl/cm2の濃度になるように培養皿に播種し、37℃、5％CO2インキュベーターで培養した。培養開始2日後に、赤血球を除去するために、培地交換を行った。細胞がコンフルエントに達した後、今度は5×104cells/cm2の濃度になるように10％FCS含有DMEM培地で調製し、6cm培養皿にトランスファーした。翌日、GFP遺伝子が発現するように組み込まれたアデノウイルスをこれらの細胞に感染させ（J. Gene Med., 6, 833-845 (2004)）、数日間培養した後、蛍光共焦点顕微鏡を用いて、GFPの発現を確認した。
【００３１】
（2）アンジオテンシンII受容体拮抗薬による前処置
アンジオテンシンII受容体拮抗薬として、テルミサルタンを用いて、以下の処置を行なった。なお、予め、メタノールを用いて、1mMのテルミサルタンストック溶液を作製し、メタノールが間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導に影響がないことを確認した。
まず、GFP発現間葉系幹細胞を、0.1μMテルミサルタン及び10％FCS含有DMEM培地を用いて、37℃、5％CO2インキュベーターで2週間培養した。なお、コントロールとして、0.1μMテルミサルタンを含有しない10％FCS含有DMEM培地を培地に用いて、同様の実験を行った。
【００３２】
（3）フィーダー細胞の調製
フィーダー細胞としては、マウス胎仔由来の心筋細胞を用いた。その調製は以下のようにして行った。
まず、胎生14〜16日目の心臓を切除し、10％ウシ胎仔血清含有DMEM培地中で、眼科用ハサミを用いて、細かく切った。心筋組織から心筋細胞を解離させるために、組織の間質を消化するタンパク質分解酵素（0.05％トリプシン及び0.25mmol/L EDTA含有PBS）を培地に添加し、37℃5分間インキュベートした。
酵素処理後、遠心分離（1500rpm、3分）し、沈殿した細胞を10％ウシ胎仔血清含有DMEM培地に懸濁して細胞浮遊液を調製し、培養皿に播種して37℃でインキュベートした。30分〜3時間後、培養上清を吸引によって除去し、培養皿に付着した細胞を、以下の実験に用いた。
【００３３】
（4）ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導
アンジオテンシンII受容体拮抗薬で前処置した間葉系幹細胞を、5×104cells/cm2の濃度になるように0.1μMテルミサルタン及び10％FCS含有DMEM培地で調製した。この間葉系幹細胞を、予め5×103cells/cm2の濃度になるように培養皿に播種したマウス胎仔由来の心筋細胞の上に重層し、37℃、5％CO2インキュベーターで培養した（J. Gene Med., 6, 833-845 (2004)）。
【００３４】
（5）分化誘導した心筋細胞の評価
本実施例では、自己拍動性を心筋細胞の分化マーカーとして用い、分化誘導率として、顕微鏡下で分化した細胞の頻度をスコア化し（図において、「簡易誘導効率」ともいう）、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を評価した。
【００３５】
（i）肉眼的手法を用いた評価方法
間葉系幹細胞とフィーダー細胞である心筋細胞を共培養してから1週間後、培養皿に存在する細胞を蛍光顕微鏡下において観察した。そして、自己拍動している細胞を同定して以下のスコアを計算し、間葉系幹細胞の心筋細胞への誘導率とした。ここで、「自己拍動している細胞」とは、分化誘導された細胞の周囲辺縁が中心方向へ集合していること、GFPの発光が収縮期に強くなること、明視野において、収縮の中心部はGFPを発光しない細胞を含まないこと（フィーダー細胞を含まないこと）の全ての条件を満たす細胞のことをいう。
【００３６】
スコア0：顕微鏡下（倍率：10×4）において、培養皿に拍動性を有する細胞が認められない場合
スコア1：顕微鏡下（倍率： 10×4）において、拍動性を有する細胞が培養皿全体で数個認められるが、同期化していない場合
スコア2：顕微鏡下（倍率： 10×4）において、拍動性を有する細胞が培養皿全体で数個認められ、これらの細胞が同期化している場合（なお、全部の細胞が同期化していなくても、島状に配列した数個の細胞が同期化していれば同期化していると判断する）
スコア3：顕微鏡下（倍率：10×20）において、ランダムにある視野を観察した場合、その視野の中に必ず一つ以上の拍動性を有する細胞が認められる場合
スコア4：顕微鏡下（倍率：10×20）において、ほとんどすべての細胞に拍動性が認められる場合
(ii)結果
図1に示す通り、テルミサルタン存在下において間葉系幹細胞を培養した群（テルミサルタン+メタノール）では、5サンプルの平均スコアが3.80になり、コントロール（平均スコア：0.75）と比べて、心筋細胞への分化誘導率が5.07倍増加していた。
【００３７】
＜実施例2：ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導＞
本実施例では、ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞を用い、アンジオテンシンII受容体拮抗薬であるテルミサルタン存在下における心筋細胞への分化能について検討した。
【００３８】
（1）間葉系幹細胞の調製
出産時に子宮から脱落した臍帯を採取し、20mlのDMEM培地（1％ FCS、100U/mlペニシリン・100ng/mlストレプトマイシン、及び500U/L heparin含有）を入れた50mlポリプロピレンチューブに移した。チューブ内で臍帯を軽く洗浄した後、10cm培養皿に移した。眼科用鋏を用いて、臍帯を約1〜5mm3大に細かく切り、数分間静置した後、血液細胞が含まれる上清を除去し、再び、DMEMで洗浄した。この操作を3〜4回繰り返し、最終的に、切断された臍帯組織を10％FCS含有α−MEM培地に入れ、この組織が3〜5個/cm2の濃度になるように培養皿に静置し、37℃、5％CO2インキュベーターで培養した。その後、組織から自然に遊走してきた間葉系幹細胞を用い、実施例１と同様にGFPで標識し、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下で培養することによって、心筋細胞へ分化誘導させた。
【００３９】
（2）分化誘導した心筋細胞の評価
本実施例では、Troponin I発現を心筋細胞の分化マーカーとして用い、分化誘導率として、免疫染色によってTroponin Iを発現している細胞の頻度を算出し（Exp Cell Res., 15, 313 (12), 2550-62 (2007 Jul)）（図において「誘導率」ともいう）、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を評価した。
【００４０】
（i）免疫染色法を用いた評価方法
間葉系幹細胞とフィーダー細胞である心筋細胞を共培養してから1週間後、培養皿に存在する細胞に対して、ヒト心筋細胞に特異的なタンパク質であるTroponin Iに対する抗体（Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for human Catalogue#4T21, Hytest社）を用いて、免疫染色を行った。
【００４１】
まず、1％HCL含有70％エタノールで洗浄したスライドグラスに、10倍希釈したPoly-L-Lysine溶液 (P8920, Sigma社)を上層し、室温で5分間放置した後、Poly-L-Lysine溶液を除去し、スライドグラスを十分乾燥することによって、免疫染色を行うスライドグラスをリジンコートした。次に、間葉系幹細胞とフィーダー細胞である心筋細胞を共培養した後の細胞を0.25mmol/L EDTA含有PBSで剥がし、遠心分離（1500rpm、3分）し、沈殿した細胞を10％ウシ胎仔血清含有DMEM培地に入れて細胞浮遊液を調製した。この細胞浮遊液を、リジンコートしたスライドグラスの上にのせて1時間放置し、スライドグラスに細胞を接着させた後、4％ホルムアルデヒド溶液を用いて細胞を固定し、0.02％ Triton-X含有PBS溶液に20分間浸して、細胞膜を破壊した。一次抗体として、抗ヒト心筋Troponin I抗体（#4T21 Lot 98/10-T21-C2 HyTest, Euro, Finland、HyTest社、400倍希釈）を上層し、保湿しながら冷蔵庫内で1日反応させた後、PBSで洗浄し、次に、二次抗体として、TRITC結合抗マウスIgG抗体（Sigma社、200倍希釈）を上層し、保湿しながら室温で30分反応させた。細胞をPBSで洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡（FV1000, Olympus社）を用いて観察した。
【００４２】
（ii）結果
図2に示す通り、テルミサルタン存在下において間葉系幹細胞を培養した群（テルミサルタン+メタノール）では、18.9%のヒト臍帯由来の間葉系幹細胞にTroponin-Iが発現していた。一方、テルミサルタン非存在下で培養したコントロールでは4.5%であった。
このように、テルミサルタン処理によって、ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞の、心筋細胞への分化誘導率は4.2倍増加した。
【００４３】
＜実施例3：ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導＞
本実施例では、ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞を用い、アンジオテンシンII受容体拮抗薬であるテルミサルタン又はバルサルタン存在下における心筋細胞への分化能について検討した。
【００４４】
（1）間葉系幹細胞の調製
出産時に子宮から脱落した胎盤を採取し、20mlのDMEM培地（1％ FCS、100ng/mlストレプトマイシン、100U/mlペニシリン、及び500U/l heparin含有）を入れた50mlポリプロピレンチューブに入れた。チューブ内で胎盤を軽く洗浄した後、10cm培養皿に移した。眼科用鋏を用いて、胎盤を約1〜5mm3大に細かく切り、数分間静置した後、血液細胞が含まれる上清を除去し、再び、DMEMで洗浄した。この操作を3〜4回繰り返し、最終的に、細かく切断された胎盤組織を10％FCS含有α−MEM (α-modified MEM)培地に浸した状態で、3〜5個/cm2の密度になるように培養皿に静置し、37℃、5％CO2インキュベーターで培養した。その後、組織から自然に遊走してきた間葉系幹細胞を用い、実施例１と同様にGFPで標識し、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下で培養することによって、心筋細胞へ分化誘導させた。
【００４５】
（2）分化誘導した心筋細胞の評価
本実施例では、実施例1に記載の自己拍動性と実施例2に記載のTroponin I発現の両方を分化マーカーとして用い、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を評価した。アンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、テルミサルタン又はバルサルタンを用いた。なお、0.1μMバルサルタン−10％FCS含有DMEM培地は、バルサルタンを10％FCS含有DMEM培地に直接溶かすことによって作製した。
【００４６】
（i）肉眼的手法を用いた評価方法及び結果
実施例1に記載の方法と同様に、スコアを用いて各培養皿の平均値を分化誘導率として算出した。
図3に示す通り、バルサルタン存在下において間葉系幹細胞を培養した群では5サンプルの平均スコアが2.0になり、バルサルタン非存在下で培養したコントロール（平均スコア：0.2）と比べて、心筋細胞への分化誘導率が10倍増加していた。
【００４７】
（ii）免疫染色法を用いた評価方法及び結果
実施例2に記載の方法と同様に、GFP陽性細胞中のTroponin I発現細胞の割合を分化誘導率として算出した。
図4に示す通り、テルミサルタン存在下において間葉系幹細胞を培養した群（テルミサルタン+メタノール）では、37.10％のヒト胎盤由来の間葉系幹細胞にTroponin-Iが発現していた。一方、テルミサルタン非存在下で培養したコントロールでは20.40%であった。このように、ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞の、心筋細胞への分化誘導率は1.82倍増加した。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の一実施形態において、肉眼的手法を用いて、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導率を算出した結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態において、免疫染色法を用いて、ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導率を算出した結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態において、肉眼的手法を用いて、ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導率を算出した結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態において、免疫染色法を用いて、ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導率を算出した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞分化誘導促進剤及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞は、骨芽細胞、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞等間葉系細胞への多分化能及び自己増殖能を有しているため、骨や軟骨、筋肉等の再生医療への応用が期待されている。
【０００３】
現在までに、心筋細胞に分化する能力を有する細胞として、子宮内膜、月経血、臍帯血、又は胎児付属臓器から単離された間葉系幹細胞が同定されている。この間葉系幹細胞は、フィーダー細胞との共培養により、心筋細胞に分化することが分かっている（例えば、特許文献1参照）。しかしながら、間葉系幹細胞を心筋細胞へ高い効率で分化誘導させる方法は、未だ開発されていない。
【特許文献１】国際公開番号WO2006／078034
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、心筋細胞分化誘導促進剤、及びその使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、以下の実施例に示すように、間葉系幹細胞をフィーダー細胞と共培養して心筋細胞に分化誘導させる際、予めテルミサルタン（telmisartan）又はバルサルタン（valsartan）等のアンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下で間葉系幹細胞を前処理することによって、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進できることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明にかかる心筋細胞分化誘導促進剤は、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する促進剤であって、アンジオテンシンII受容体拮抗薬を有効成分として含有する。ここで、前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、例えば、テルミサルタン(telmisartan)又はバルサルタン(valsartan)等が挙げられる。また、前記間葉系幹細胞としては、例えば、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来の間葉系幹細胞等が挙げられる。
【０００７】
本発明にかかる心筋細胞分化誘導促進方法は、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する方法であって、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において間葉系幹細胞を培養することを特徴とする。ここで、前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、例えば、テルミサルタン又はバルサルタン等が挙げられる。また、前記間葉系幹細胞としては、例えば、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来の間葉系幹細胞等が挙げられる。前記フィーダー細胞は、哺乳類胎仔由来の心筋細胞であることが好ましい。また、前記心筋細胞分化誘導促進方法においては、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において、２週間以上間葉系幹細胞を培養することが好ましい。
【０００８】
本発明にかかる間葉系幹細胞は、心筋細胞へ分化する能力を有する間葉系幹細胞であって、前記間葉系幹細胞は、アンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理されたことを特徴とする。ここで、前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、例えば、テルミサルタン又はバルサルタン等が挙げられる。また、前記間葉系幹細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来の間葉系幹細胞等が挙げられる。前記間葉系幹細胞は、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において2週間以上培養されたことが好ましい。
【０００９】
本発明にかかる分化誘導方法は、間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化させる分化誘導方法であって、前記間葉系細胞をアンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理する工程と、アンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理した前記間葉系細胞をフィーダー細胞上で培養する工程と、を包含することを特徴とする。ここで、前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、例えば、テルミサルタン又はバルサルタン等が挙げられる。また、前記間葉系幹細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来の間葉系幹細胞等が挙げられる。前記フィーダー細胞は、哺乳類胎仔由来の心筋細胞であることが好ましい。また、前記分化誘導方法においては、間葉系幹細胞が、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において、2週間以上培養されることが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、心筋細胞分化誘導促進剤及びその使用方法を提供することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的かつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１２】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１３】
（1）薬理作用
テルミサルタン又はバルサルタン等のアンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において骨髄由来の間葉系幹細胞を培養し、この培養後の間葉系幹細胞をフィーダー細胞である哺乳類胎仔由来の心筋細胞と共培養すると、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化を促進することができる。このことから、アンジオテンシンII受容体拮抗薬は、分化誘導前の間葉系幹細胞に作用することによって、その間葉系幹細胞の分化状態を心筋細胞の方向へ進めると考えられる。
このようなアンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、テルミサルタン、バルサルタン以外にも、ロルサルタンカリウム、カンデサルタンシレキセチル、オルメサルタンメドキソミル等が挙げられる。また、間葉系幹細胞としては、心筋細胞へ分化する能力を有する間葉系幹細胞であればよく、例えば、骨髄、末梢血、G−CSF投与後の末梢血、臍帯血、又は胎盤付属臓器由来の間葉系幹細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
（2）アンジオテンシンII受容体拮抗薬を含有する薬剤の有用性
前述の通り、アンジオテンシンII受容体拮抗薬は、分化誘導前の間葉系幹細胞に作用することによって、その間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進することができる。従って、アンジオテンシンII受容体拮抗薬を有効成分として含有する薬剤は、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進するのに有用である。
間葉系幹細胞は、それ自身、自己複製能、自己増殖能、及び多分化能を有するため、この薬剤を用いることによって、間葉系幹細胞から多量の心筋細胞を産生することが可能になる。
現在、新薬の開発において、薬物スクリーニング試験、毒性試験、安全性薬理試験等に用いることが可能な心筋細胞の供給が求められているので、本発明の心筋細胞分化誘導方法を用いれば、このような試験の実施に合わせて、十分な量の心筋細胞を確保することが可能になる。
【００１５】
（3）上記薬剤の製造
本発明のアンジオテンシンII受容体拮抗薬を有効成分として含有する薬剤としては、例えば、テルミサルタン（4'-{[4-methyl-6-(1-methyl-2-benzimidazolyl)-2-propyl-1-benzimidazolyl]methyl}-2-biphenylcarboxylic acid）、バルサルタン（(−)-N-{4-[2-(1H-Tetrazol-5-yl)phenyl]benzyl}-N-valeryl-L-valine）、ロサルタンカリウム（2-Butyl-4-chloro-1-[2'-(tetrazol-5-yl) biphenyl-4-ylmethyl]-1H -imidazole-5-methanol potassium salt）、カンデサルタンシレキセチル（(RS)-1-[(Cyclohexyloxy)carbonyloxy]ethyl 2-ethoxy-1-｛[2'-(1H-tetrazol-5-yl)biphenyl-4-yl]methyl｝-1H-benzimidazole-7-carboxylate）、オルメサルタンメドキソミル（(5-methyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl 4-(1-hydroxy-1-methylethyl)-2-propyl-1-{[2'-(1H-tetrazol-5-yl)-1,1'-biphenyl-4-yl]methyl}-1H-imidazole-5-carboxylate）等が挙げられる。本発明の薬剤は、当業者に公知の技術を用いて合成してもよいし、市販のものを用いてもよい。
【００１６】
（4）間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導方法
間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する方法としては、フィーダー細胞（例えば、心筋細胞）との共培養、5-アザシチジン、DMSO、又はオキシトシンの投与等が挙げられる。
【００１７】
以下、間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する方法の一例として、間葉系幹細胞とフィーダー細胞を共培養することにより、間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化誘導する方法について述べる。
【００１８】
（i）間葉系幹細胞の調製及び前処理
間葉系幹細胞は、骨髄、末梢血、G−CSF投与後の末梢血、臍帯血、又は胎盤付属臓器等から採取することができる。なお、骨髄の採取部位は特に限定されないが、例えば、脊椎、胸骨、腸骨等の骨髄を用いることができる。
これらの材料から間葉系幹細胞を調製する際、例えば骨髄、胎盤付属臓器のように、この材料が間葉系幹細胞を巻き込んだ細胞塊になっている場合には、含まれている細胞を解離するために、材料に対してピペッティング等による物理的処理や、酵素等による化学的処理を行えばよい。酵素としては、トリプシン、コラゲナーゼ等、常法で用いられている酵素が挙げられる。また、例えば、末梢血、臍帯血等の血液から間葉系幹細胞を調製する際は、低張溶液（例えば、水等）で処理することにより、赤血球を溶血しておくことが好ましい。このように、用いる材料に対して適切な処理を行って、間葉系幹細胞を調製する。
【００１９】
次に、上記手法によって調製した間葉系肝細胞を遠心分離（500〜2000rpm、3〜10分）し、沈殿物に培地を入れて細胞浮遊液を調製する。ここで、培地は、間葉系幹細胞が培養することができる培地であれば特に限定されず、例えば、α−MEM（α-minimum essential medium）、DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）、IMDM（Isocove’s modified Dulbecco’s medium）等が挙げられる。また、培地は、5〜10％ウシ胎仔血清（FCS）を含んでいることが好ましく、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を含んでいてもよい。細胞浮遊液を培養皿に入れて、37℃、5％CO2インキュベーターで培養する。
【００２０】
次に、上記培養皿にアンジオテンシンII受容体拮抗薬を添加する。ここで、添加するアンジオテンシンII受容体拮抗薬の濃度は、例えば、テルミサルタンの場合は、0.1〜1μMの濃度であることが好ましく、0.1μMの濃度であることが特に好ましい。また、バルサルタンの場合は、0.1〜1μMの濃度であることが好ましく、0.1μMの濃度であることが特に好ましい。なお、所定の濃度のアンジオテンシンII受容体拮抗薬を作製する際は、細胞に障害を与えにくい溶媒を用いて希釈すればよく、例えば、テルミサルタンの場合は、ギ酸、メタノール、無水酢酸等の有機溶媒で希釈することが好ましく、バルサルタンの場合は、DMSO（dimethylsulfoxide）、メタノール、エタノール、アセトニトリル等の有機溶媒で希釈することが好ましく、ロサルタンカリウムの場合は、DMSO、メタノール、エタノール等の有機溶媒で希釈することが好ましく、カンデサルタンシレキセチルの場合は、DMSO、ベンジルアルコール、アセトン、酢酸等の有機溶媒で希釈することが好ましく、オルメサルタンメドキソミルの場合は、DMSO、メタノール、アセトン等の有機溶媒で希釈することが好ましい。このような条件下において、5日以上、好ましくは2週以上、最も好ましくは2〜3週間、37℃、5％CO2インキュベーターで培養する。
【００２１】
このような条件下で培養した結果、培養皿に付着した細胞を、以下の実験に用いる間葉系幹細胞とする。
【００２２】
（ii）フィーダー細胞の調製
フィーダー細胞は、間葉系幹細胞の分化誘導を起こさせることができる細胞であれば特に限定されないが、心筋細胞の初代培養細胞等が挙げられる。なお、フィーダー細胞として培養細胞を用いる場合、細胞の増殖を防ぐために、用いる培養細胞に対して、γ線照射やマイトマイシン等による処理を予め施しておいてもよい。ここでは、哺乳類胎仔由来の心筋細胞を用いたフィーダー細胞の調製方法の一例について述べる（The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004)を参照のこと）。
【００２３】
まず、胎生14〜16日目の哺乳類（例えば、マウス等）の胎仔の心臓を切除し、5〜10％ウシ胎仔血清含有DMEM培地、又は5〜10％ウシ胎仔血清含有DMEM／F−12培地に入れ、眼科用ハサミを用いて細かく切る。次に、心筋組織から心筋細胞を解離するために、組織の間質を消化するトリプシンなどの酵素を上記培養皿に入れて、37℃で5分間インキュベートする。
【００２４】
酵素処理後、上記手法によって調製した細胞を遠心分離（500〜2000rpm、3〜10分）し、沈殿物にDMEMなどの培地を入れて細胞浮遊液を調製する。また、培地は、5〜10％ウシ胎仔血清（FCS）を含んでいることが好ましく、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を含んでいてもよい。細胞浮遊液を培養皿に入れて、37℃、5％CO2インキュベーターで培養する。培養後、培養上清を吸引によって除去し、培養皿に付着した細胞を、以下の実験に用いるフィーダー細胞とする。
【００２５】
（iii）間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導
「（ii）フィーダー細胞の調製」に従って調製したフィーダー細胞上に、「（i）間葉系幹細胞の調製及び前処理」に従って調製した間葉系幹細胞を、1×101〜1×102／cm2の濃度になるように添加し、37℃、5％CO2インキュベーターで培養する。
なお、フィーダー細胞と間葉系幹細胞とを区別するために、間葉系幹細胞を予め標識しておいてもよい。標識方法としては、例えば、GFP遺伝子を間葉系幹細胞に遺伝子導入して標識したり、細胞に無害な色素を微細注入することにより標識したりする方法等が挙げられる（The Journal of Gene Medicine, 6, 833-845 (2004)を参照のこと）。
【００２６】
（iv）分化誘導された心筋細胞の同定
分化誘導された心筋細胞は、一つ一つの細胞の辺縁が細胞の中心方向に集合するように拍動し、収縮時に細胞質が厚くなるため、間葉系幹細胞を予めGFP等で蛍光標識しておけば、心筋細胞を細胞レベルで同定することができ、容易に心筋細胞を観察できるようになる。また、複数の細胞の拍動が同期化して、一群の細胞で拍動を打つようになることもある。分化誘導された心筋細胞はこのような特徴を有するので、顕微鏡下において、容易に同定することができる。
【００２７】
あるいは、心筋細胞に特異的なマーカーを用いて、分化誘導した心筋細胞数を測定してもよい。例えば、in situ hybridization法や免疫染色法などにより、心筋細胞に特異的なmRNAやタンパク質の発現を検出することができる。心筋細胞に特異的なマーカーとしては、例えば、Nkx2.5/Csx、GATA4、TEF-1、MEF-2C、MEF-2D、MEF-2A、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）、α−ミオシン重鎖（α-MHC）、β−ミオシン重鎖（β-MHC）、ミオシン軽鎖−2a（MLC-2a）、ミオシン軽鎖−2v（MLC-2v）、α−心筋アクチン、心筋Troponin T、connexin43（Cnx43）等が挙げられる（J. Clin. Invest., 103, 697-705 (1999)を参照のこと）が、これらに限定されない。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例を用いて、以上に説明した実施態様を具体的に説明するが、これは例示であって、本発明をこの実施例に限定するものではない。これらの実施例より、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進するためには、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において間葉系幹細胞を予め培養しておくことが有効であることが示される。
【００２９】
＜実施例1：ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導＞
本実施例では、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞を用い、アンジオテンシンII受容体拮抗薬であるテルミサルタン存在下における心筋細胞への分化能について検討した。
【００３０】
（1）間葉系幹細胞の調製
当施設倫理委員会で承認されたプロトコールに従って、インフォームドコンセントを行ったボランティアに対して、骨髄液の採取を行った。
まず、骨髄提供者を臥位にし、腸骨周囲を消毒した後、無菌操作下で局所麻酔を行った。麻酔にて無痛となった事を確認した後、局所麻酔下にて骨髄穿刺針を骨髄腔まで刺入し、10ccシリンジにて骨髄液を15ccから30cc採取した。
このようにして採取した骨髄液を10％FCS（牛胎仔血清）含有α−MEM培地に懸濁した。この骨髄液を、50〜100μl/cm2の濃度になるように培養皿に播種し、37℃、5％CO2インキュベーターで培養した。培養開始2日後に、赤血球を除去するために、培地交換を行った。細胞がコンフルエントに達した後、今度は5×104cells/cm2の濃度になるように10％FCS含有DMEM培地で調製し、6cm培養皿にトランスファーした。翌日、GFP遺伝子が発現するように組み込まれたアデノウイルスをこれらの細胞に感染させ（J. Gene Med., 6, 833-845 (2004)）、数日間培養した後、蛍光共焦点顕微鏡を用いて、GFPの発現を確認した。
【００３１】
（2）アンジオテンシンII受容体拮抗薬による前処置
アンジオテンシンII受容体拮抗薬として、テルミサルタンを用いて、以下の処置を行なった。なお、予め、メタノールを用いて、1mMのテルミサルタンストック溶液を作製し、メタノールが間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導に影響がないことを確認した。
まず、GFP発現間葉系幹細胞を、0.1μMテルミサルタン及び10％FCS含有DMEM培地を用いて、37℃、5％CO2インキュベーターで2週間培養した。なお、コントロールとして、0.1μMテルミサルタンを含有しない10％FCS含有DMEM培地を培地に用いて、同様の実験を行った。
【００３２】
（3）フィーダー細胞の調製
フィーダー細胞としては、マウス胎仔由来の心筋細胞を用いた。その調製は以下のようにして行った。
まず、胎生14〜16日目の心臓を切除し、10％ウシ胎仔血清含有DMEM培地中で、眼科用ハサミを用いて、細かく切った。心筋組織から心筋細胞を解離させるために、組織の間質を消化するタンパク質分解酵素（0.05％トリプシン及び0.25mmol/L EDTA含有PBS）を培地に添加し、37℃5分間インキュベートした。
酵素処理後、遠心分離（1500rpm、3分）し、沈殿した細胞を10％ウシ胎仔血清含有DMEM培地に懸濁して細胞浮遊液を調製し、培養皿に播種して37℃でインキュベートした。30分〜3時間後、培養上清を吸引によって除去し、培養皿に付着した細胞を、以下の実験に用いた。
【００３３】
（4）ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導
アンジオテンシンII受容体拮抗薬で前処置した間葉系幹細胞を、5×104cells/cm2の濃度になるように0.1μMテルミサルタン及び10％FCS含有DMEM培地で調製した。この間葉系幹細胞を、予め5×103cells/cm2の濃度になるように培養皿に播種したマウス胎仔由来の心筋細胞の上に重層し、37℃、5％CO2インキュベーターで培養した（J. Gene Med., 6, 833-845 (2004)）。
【００３４】
（5）分化誘導した心筋細胞の評価
本実施例では、自己拍動性を心筋細胞の分化マーカーとして用い、分化誘導率として、顕微鏡下で分化した細胞の頻度をスコア化し（図において、「簡易誘導効率」ともいう）、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を評価した。
【００３５】
（i）肉眼的手法を用いた評価方法
間葉系幹細胞とフィーダー細胞である心筋細胞を共培養してから1週間後、培養皿に存在する細胞を蛍光顕微鏡下において観察した。そして、自己拍動している細胞を同定して以下のスコアを計算し、間葉系幹細胞の心筋細胞への誘導率とした。ここで、「自己拍動している細胞」とは、分化誘導された細胞の周囲辺縁が中心方向へ集合していること、GFPの発光が収縮期に強くなること、明視野において、収縮の中心部はGFPを発光しない細胞を含まないこと（フィーダー細胞を含まないこと）の全ての条件を満たす細胞のことをいう。
【００３６】
スコア0：顕微鏡下（倍率：10×4）において、培養皿に拍動性を有する細胞が認められない場合
スコア1：顕微鏡下（倍率： 10×4）において、拍動性を有する細胞が培養皿全体で数個認められるが、同期化していない場合
スコア2：顕微鏡下（倍率： 10×4）において、拍動性を有する細胞が培養皿全体で数個認められ、これらの細胞が同期化している場合（なお、全部の細胞が同期化していなくても、島状に配列した数個の細胞が同期化していれば同期化していると判断する）
スコア3：顕微鏡下（倍率：10×20）において、ランダムにある視野を観察した場合、その視野の中に必ず一つ以上の拍動性を有する細胞が認められる場合
スコア4：顕微鏡下（倍率：10×20）において、ほとんどすべての細胞に拍動性が認められる場合
(ii)結果
図1に示す通り、テルミサルタン存在下において間葉系幹細胞を培養した群（テルミサルタン+メタノール）では、5サンプルの平均スコアが3.80になり、コントロール（平均スコア：0.75）と比べて、心筋細胞への分化誘導率が5.07倍増加していた。
【００３７】
＜実施例2：ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導＞
本実施例では、ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞を用い、アンジオテンシンII受容体拮抗薬であるテルミサルタン存在下における心筋細胞への分化能について検討した。
【００３８】
（1）間葉系幹細胞の調製
出産時に子宮から脱落した臍帯を採取し、20mlのDMEM培地（1％ FCS、100U/mlペニシリン・100ng/mlストレプトマイシン、及び500U/L heparin含有）を入れた50mlポリプロピレンチューブに移した。チューブ内で臍帯を軽く洗浄した後、10cm培養皿に移した。眼科用鋏を用いて、臍帯を約1〜5mm3大に細かく切り、数分間静置した後、血液細胞が含まれる上清を除去し、再び、DMEMで洗浄した。この操作を3〜4回繰り返し、最終的に、切断された臍帯組織を10％FCS含有α−MEM培地に入れ、この組織が3〜5個/cm2の濃度になるように培養皿に静置し、37℃、5％CO2インキュベーターで培養した。その後、組織から自然に遊走してきた間葉系幹細胞を用い、実施例１と同様にGFPで標識し、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下で培養することによって、心筋細胞へ分化誘導させた。
【００３９】
（2）分化誘導した心筋細胞の評価
本実施例では、Troponin I発現を心筋細胞の分化マーカーとして用い、分化誘導率として、免疫染色によってTroponin Iを発現している細胞の頻度を算出し（Exp Cell Res., 15, 313 (12), 2550-62 (2007 Jul)）（図において「誘導率」ともいう）、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を評価した。
【００４０】
（i）免疫染色法を用いた評価方法
間葉系幹細胞とフィーダー細胞である心筋細胞を共培養してから1週間後、培養皿に存在する細胞に対して、ヒト心筋細胞に特異的なタンパク質であるTroponin Iに対する抗体（Monoclonal mouse anti-cardiac Troponin I for human Catalogue#4T21, Hytest社）を用いて、免疫染色を行った。
【００４１】
まず、1％HCL含有70％エタノールで洗浄したスライドグラスに、10倍希釈したPoly-L-Lysine溶液 (P8920, Sigma社)を上層し、室温で5分間放置した後、Poly-L-Lysine溶液を除去し、スライドグラスを十分乾燥することによって、免疫染色を行うスライドグラスをリジンコートした。次に、間葉系幹細胞とフィーダー細胞である心筋細胞を共培養した後の細胞を0.25mmol/L EDTA含有PBSで剥がし、遠心分離（1500rpm、3分）し、沈殿した細胞を10％ウシ胎仔血清含有DMEM培地に入れて細胞浮遊液を調製した。この細胞浮遊液を、リジンコートしたスライドグラスの上にのせて1時間放置し、スライドグラスに細胞を接着させた後、4％ホルムアルデヒド溶液を用いて細胞を固定し、0.02％ Triton-X含有PBS溶液に20分間浸して、細胞膜を破壊した。一次抗体として、抗ヒト心筋Troponin I抗体（#4T21 Lot 98/10-T21-C2 HyTest, Euro, Finland、HyTest社、400倍希釈）を上層し、保湿しながら冷蔵庫内で1日反応させた後、PBSで洗浄し、次に、二次抗体として、TRITC結合抗マウスIgG抗体（Sigma社、200倍希釈）を上層し、保湿しながら室温で30分反応させた。細胞をPBSで洗浄後、共焦点レーザー顕微鏡（FV1000, Olympus社）を用いて観察した。
【００４２】
（ii）結果
図2に示す通り、テルミサルタン存在下において間葉系幹細胞を培養した群（テルミサルタン+メタノール）では、18.9%のヒト臍帯由来の間葉系幹細胞にTroponin-Iが発現していた。一方、テルミサルタン非存在下で培養したコントロールでは4.5%であった。
このように、テルミサルタン処理によって、ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞の、心筋細胞への分化誘導率は4.2倍増加した。
【００４３】
＜実施例3：ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導＞
本実施例では、ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞を用い、アンジオテンシンII受容体拮抗薬であるテルミサルタン又はバルサルタン存在下における心筋細胞への分化能について検討した。
【００４４】
（1）間葉系幹細胞の調製
出産時に子宮から脱落した胎盤を採取し、20mlのDMEM培地（1％ FCS、100ng/mlストレプトマイシン、100U/mlペニシリン、及び500U/l heparin含有）を入れた50mlポリプロピレンチューブに入れた。チューブ内で胎盤を軽く洗浄した後、10cm培養皿に移した。眼科用鋏を用いて、胎盤を約1〜5mm3大に細かく切り、数分間静置した後、血液細胞が含まれる上清を除去し、再び、DMEMで洗浄した。この操作を3〜4回繰り返し、最終的に、細かく切断された胎盤組織を10％FCS含有α−MEM (α-modified MEM)培地に浸した状態で、3〜5個/cm2の密度になるように培養皿に静置し、37℃、5％CO2インキュベーターで培養した。その後、組織から自然に遊走してきた間葉系幹細胞を用い、実施例１と同様にGFPで標識し、アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下で培養することによって、心筋細胞へ分化誘導させた。
【００４５】
（2）分化誘導した心筋細胞の評価
本実施例では、実施例1に記載の自己拍動性と実施例2に記載のTroponin I発現の両方を分化マーカーとして用い、間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を評価した。アンジオテンシンII受容体拮抗薬としては、テルミサルタン又はバルサルタンを用いた。なお、0.1μMバルサルタン−10％FCS含有DMEM培地は、バルサルタンを10％FCS含有DMEM培地に直接溶かすことによって作製した。
【００４６】
（i）肉眼的手法を用いた評価方法及び結果
実施例1に記載の方法と同様に、スコアを用いて各培養皿の平均値を分化誘導率として算出した。
図3に示す通り、バルサルタン存在下において間葉系幹細胞を培養した群では5サンプルの平均スコアが2.0になり、バルサルタン非存在下で培養したコントロール（平均スコア：0.2）と比べて、心筋細胞への分化誘導率が10倍増加していた。
【００４７】
（ii）免疫染色法を用いた評価方法及び結果
実施例2に記載の方法と同様に、GFP陽性細胞中のTroponin I発現細胞の割合を分化誘導率として算出した。
図4に示す通り、テルミサルタン存在下において間葉系幹細胞を培養した群（テルミサルタン+メタノール）では、37.10％のヒト胎盤由来の間葉系幹細胞にTroponin-Iが発現していた。一方、テルミサルタン非存在下で培養したコントロールでは20.40%であった。このように、ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞の、心筋細胞への分化誘導率は1.82倍増加した。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の一実施形態において、肉眼的手法を用いて、ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導率を算出した結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態において、免疫染色法を用いて、ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導率を算出した結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施形態において、肉眼的手法を用いて、ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導率を算出した結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態において、免疫染色法を用いて、ヒト胎盤由来の間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導率を算出した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する促進剤であって、
アンジオテンシンII受容体拮抗薬を有効成分として含有する心筋細胞分化誘導促進剤。
【請求項２】
前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬が、テルミサルタン（telmisartan）又はバルサルタン（valsartan）であることを特徴とする請求項１に記載の心筋細胞分化誘導促進剤。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞が、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来であることを特徴とする請求項１又は２に記載の心筋細胞分化誘導促進剤。
【請求項４】
間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する方法であって、
アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において間葉系幹細胞を培養すること、
を特徴とする心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項５】
前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬が、テルミサルタン又はバルサルタンであることを特徴とする請求項４に記載の心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項６】
前記間葉系幹細胞が、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来であることを特徴とする請求項４又は５に記載の心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項７】
前記フィーダー細胞が、哺乳類胎仔由来の心筋細胞であることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項８】
前記間葉系幹細胞が、前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において、２週間以上培養されることを特徴とする請求項４〜７のいずれかに記載の心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項９】
心筋細胞へ分化する能力を有する間葉系幹細胞であって、
前記間葉系幹細胞は、アンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理されたことを特徴とする間葉系幹細胞。
【請求項１０】
前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬が、テルミサルタン又はバルサルタンであることを特徴とする請求項９に記載の間葉系幹細胞。
【請求項１１】
前記間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の間葉系幹細胞。
【請求項１２】
前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において２週間以上培養されたことを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の間葉系幹細胞。
【請求項１３】
間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化させる分化誘導方法であって、
前記間葉系細胞をアンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理する工程と、
アンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理した前記間葉系細胞をフィーダー細胞上で培養する工程と、
を包含する分化誘導方法。
【請求項１４】
前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬が、テルミサルタン又はバルサルタンであることを特徴とする請求項１３に記載の分化誘導方法。
【請求項１５】
前記間葉系幹細胞が、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の分化誘導方法。
【請求項１６】
前記フィーダー細胞が、哺乳類胎仔由来の心筋細胞であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の分化誘導方法。
【請求項１７】
前記間葉系幹細胞が、前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において、２週間以上培養されることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載の分化誘導方法。
【請求項１】
間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する促進剤であって、
アンジオテンシンII受容体拮抗薬を有効成分として含有する心筋細胞分化誘導促進剤。
【請求項２】
前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬が、テルミサルタン（telmisartan）又はバルサルタン（valsartan）であることを特徴とする請求項１に記載の心筋細胞分化誘導促進剤。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞が、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来であることを特徴とする請求項１又は２に記載の心筋細胞分化誘導促進剤。
【請求項４】
間葉系幹細胞の心筋細胞への分化誘導を促進する方法であって、
アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において間葉系幹細胞を培養すること、
を特徴とする心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項５】
前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬が、テルミサルタン又はバルサルタンであることを特徴とする請求項４に記載の心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項６】
前記間葉系幹細胞が、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来であることを特徴とする請求項４又は５に記載の心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項７】
前記フィーダー細胞が、哺乳類胎仔由来の心筋細胞であることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項８】
前記間葉系幹細胞が、前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において、２週間以上培養されることを特徴とする請求項４〜７のいずれかに記載の心筋細胞分化誘導促進方法。
【請求項９】
心筋細胞へ分化する能力を有する間葉系幹細胞であって、
前記間葉系幹細胞は、アンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理されたことを特徴とする間葉系幹細胞。
【請求項１０】
前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬が、テルミサルタン又はバルサルタンであることを特徴とする請求項９に記載の間葉系幹細胞。
【請求項１１】
前記間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の間葉系幹細胞。
【請求項１２】
前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において２週間以上培養されたことを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の間葉系幹細胞。
【請求項１３】
間葉系幹細胞を心筋細胞へ分化させる分化誘導方法であって、
前記間葉系細胞をアンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理する工程と、
アンジオテンシンII受容体拮抗薬で処理した前記間葉系細胞をフィーダー細胞上で培養する工程と、
を包含する分化誘導方法。
【請求項１４】
前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬が、テルミサルタン又はバルサルタンであることを特徴とする請求項１３に記載の分化誘導方法。
【請求項１５】
前記間葉系幹細胞が、骨髄、臍帯血、又は胎盤由来であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の分化誘導方法。
【請求項１６】
前記フィーダー細胞が、哺乳類胎仔由来の心筋細胞であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の分化誘導方法。
【請求項１７】
前記間葉系幹細胞が、前記アンジオテンシンII受容体拮抗薬存在下において、２週間以上培養されることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載の分化誘導方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−１３６２０９（Ｐ２００９−１３６２０９Ａ）
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１５９２０（Ｐ２００７−３１５９２０）
【出願日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
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