抗ヘプシジン−２５選択的抗体およびその使用
ヒトヘプシジン−２５のＮ末端に結合し、ポリペプチドに対して高親和性かつ選択性を有するように特徴付けられるモノクローナル抗体が提供される。本発明の抗体は、ヒトにおける血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させ、ヒト被検体における貧血などの種々の障害を治療するのに有用である。本発明の抗体はまた、サンドイッチＥＬＩＳＡなどの解析ツールとして有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬分野、特にヒトヘプシジン−２５に対する抗体の分野である。より具体的には、本発明は、抗ヘプシジン−２５選択的抗体を、それを必要とする患者に投与することによる、貧血などの特定の疾患の治療に関する。本発明はさらに、ヘプシジン−２５を検出および／または高レベルのヘプシジン−２５によって特徴付けられる疾患状態を診断するための方法ならびにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞によって主に発現されるポリペプチドである、ヒトヘプシジンは、腸からの鉄吸収、マクロファージによって再利用する鉄、および肝臓の鉄貯蔵からの鉄動員を負に調節する重要な鉄調節タンパク質であると考えられている。ヘプシジンの過剰生産は、貧血の病態生理および／または慢性疾患の貧血において重要な役割を果たすように見える。
【０００３】
現在、貧血および／または慢性疾患の貧血のための適切かつ効果的な治療は限定されている。特に、エリスロポエチン投与が、全ての患者の約５０％のみに効果的であり、望ましくない副作用に関連する。さらに、輸血は、汚染、感染および鉄過剰負荷のために望ましくない。
【０００４】
ヒトヘプシジンは、典型的なＮ末端の２４アミノ酸の小胞体標的シグナル配列、およびコンセンサスのフリン切断部位を有する３５アミノ酸のプロ領域、直後にＣ末端の２５アミノ酸の生物活性鉄調節ホルモンを含む８４アミノ酸プレプロペプチド（ヘプシジン−２５、配列番号１）としてコードされる。ヘプシジン−２０（例えばヒトに関して、配列番号１のアミノ酸６〜２５）およびヘプシジン−２２（例えばヒトに関して、配列番号１のアミノ酸４〜２５）などのヘプシジンの様々なＮ末端切断型もまた、インビボにおいて形成することが知られている。しかしながら、ヘプシジン−２５は、（これのみではないが）ヒトにおけるヘプシジンの大部分の生理学的に関連した形態であると考えられる。前駆体または切断型とは対照的に、ヘプシジン−２５の濃度を選択的に調節する治療が特に望まれる。特に、前駆体または切断型とは対照的にヘプシジン−２５に選択的に結合する抗体は、高レベルのヘプシジン−２５に関連する障害の治療または診断において多くの利点を与える。例えば、非選択的ヘプシジン抗体と比較して、高親和性のヘプシジン−２５選択的抗体は、ヘプシジンの生理学的に関連しない形態に治療抗体が結合しないため、副作用の危険性を減少させ、有効な治療に必要とされる臨床用量は、より低くなる。ヘプシジンに対する非ヒトポリクローナルおよびモノクローナル抗体は以前に報告されている（例えば、特許文献１、特許文献２および特許文献３を参照のこと）が、ヘプシジン−２５に選択的に結合するモノクローナル抗体についての重要な必要性が当該技術分野において依然として存在する。従って、本発明の一態様は、ヘプシジン−２５を含むアミノ酸１〜７内のヒトヘプシジン−２５に選択的に結合する抗体の提供である。そのような抗体は、貧血などの疾患、状態または障害を治療するために、ヒトにおける血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるのに有用である。
【０００５】
さらに、ヘプシジンについての既存の免疫学的検定は、活性な生理学的に関連するヘプシジン−２５と不活性な生理学的に関連しないヘプシジン種とを区別しない（例えば非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３を参照のこと）。現在、ヘプシジン−２５についての選択的アッセイに一般に利用可能な唯一の方法は、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）または種々のヘプシジンの形態の分離を必要とする同様の煩雑な方法を含む（例えば非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６を参照のこと）。それらのアッセイは正確かつ精密であり得るが、必要とされるそれらの複雑性、費用、および高いレベルの操作者の専門知識により、それらの慣用の実施が妨げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００１９３３９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／０２２４１８６号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８／０２１３２７７号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｅｍｎａ，Ｅ．Ｈ．ら，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２００８年，９３（１），ｐ．９０−７
【非特許文献２】Ｒｏｅ Ｍ．Ａ．ら，Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ．，２００７年，９７，ｐ．５４４−９
【非特許文献３】Ｌｕｕｋｋｏｎｅｎ Ｓ．およびＰｕｎｎｏｎｅｎ Ｋ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ．，２００６年，４４，１３６１−２
【非特許文献４】Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｊ．Ａ．ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００５年，３８，Ｓ１３−Ｓ１７
【非特許文献５】Ｍｕｒｐｈｙら，Ｂｌｏｏｄ，２００７年，１１０，ｐ１０４８−５４
【非特許文献６】Ｋｅｍｎａ，Ｅ．Ｈ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２００７年，５３，ｐ６２０−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、ヘプシジン−２５の検出または測定のための免疫学的検定におけるそれらの適用のための高親和性でヒトヘプシジン−２５に選択的に結合する抗体についての重要な必要性も存在する。従って、本発明の別の態様は、哺乳動物組織および生体液中のヘプシジン−２５の検出および測定のための比較的簡単で、さらに高度に感受性があり、強力で、選択的な免疫学的検定においてヘプシジン−２５選択的抗体を用いる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ヘプシジン−２５を含むアミノ酸１〜７内のヒトヘプシジン−２５に選択的に結合する抗体を提供する。一実施形態において、本発明の抗体は、関連する前駆体および切断ポリペプチドとは対照的に、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに選択的に結合し、（ｉ）配列番号９、１０、１１、３２、３３および３４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号１２、１３、１４、３５、３６および３７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｉｉｉ）配列番号４５、１３、１４、３５、３６および３７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号１２、１３、１４、３８、３６および３７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｖ）配列番号１５、１０、１６、３９、４０および４１にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｖｉ）配列番号２０、２１、２２、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｖｉｉ）配列番号２０、２１、２３、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｖｉｉｉ）配列番号２４、２５、２３、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｉｘ）配列番号２６、２５、２７、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；ならびに（ｘ）配列番号２６、２５、２８、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３からなる群より選択される６つのＣＤＲを含む。
【００１０】
別の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトヘプシジン−２５、すなわち配列番号１のＤＴＨＦＰＩＣまたは齧歯動物ヘプシジン−２５（配列番号２もしくは３）のＤＴＮＦＰＩＣを含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに結合する。好ましくは、本発明の抗体は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」）ポリペプチドおよび重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」）ポリペプチドを含み、ここで、（ｉ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号４８および４９に示すアミノ酸配列を有するか；（ｉｉ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５０および５１に示すアミノ酸配列を有するか；（ｉｉｉ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５２および５１に示すアミノ酸配列を有するか；（ｉｖ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号５３および５４に示すアミノ酸配列を有するか；（ｖ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号５５および５６に示すアミノ酸配列を有するか；（ｖｉ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号５９および５８に示すアミノ酸配列を有するか；（ｖｉｉ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号６０および５８に示すアミノ酸配列を有するか；（ｖｉｉｉ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号６１および５８に示すアミノ酸配列を有するか；（ｉｘ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号６２および５８に示すアミノ酸配列を有するか；または（ｘ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号６３および５８に示すアミノ酸配列を有する。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、本発明の抗体をコードする単離された核酸分子；必要に応じて、ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結された、本発明の抗体をコードする核酸分子を含むベクター；本発明の抗体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞；本発明の抗体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、それによって、核酸が発現する工程、および必要に応じて、宿主細胞培地から抗体を回収する工程を含む本発明の抗体を産生するためのプロセスを提供する。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、本発明の抗体および薬理学的に許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬組成物は、本発明のモノクローナル抗体の均一または実質的に均一な集団および薬理学的に許容可能な担体または希釈剤を含む。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、治療に使用するための成熟ヒトヘプシジンに選択的に結合するヒト遺伝子操作モノクローナル抗体を提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象における貧血を治療または予防する際に使用するための成熟ヒトヘプシジンに選択的に結合するヒト遺伝子操作モノクローナル抗体を提供する。
【００１５】
本発明はまた、医薬の調製のための成熟ヒトヘプシジンに選択的に結合するヒト遺伝子操作モノクローナル抗体の使用を具現化する。本発明はさらに、動物、好ましくは哺乳動物種、より好ましくはヒト対象における血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるための方法において成熟ヒトヘプシジンに選択的に結合するヒト遺伝子操作モノクローナル抗体の使用を具現化する。
【００１６】
本発明はさらに、血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる方法を提供し、その方法は、それを必要とするヒト対象に、成熟ヒトヘプシジンに結合する有効量のヒト遺伝子操作モノクローナル抗体を投与する工程を含む。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、限定されないが、貧血、例えば感染、炎症、慢性疾患および／または癌に起因する貧血を含む、血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットの増加から利益を受ける、ヒト対象における疾患、状態または障害を治療するための方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、哺乳動物から得られる組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−２５の量を測定するための方法を提供し、その方法は、以下の工程：（ｉ）前記動物から組織または生体液のサンプルを得る工程；（ｉｉ）前記サンプルを、ヘプシジン−２５選択的抗体またはそのフラグメントと接触させる工程；および（ｉｉｉ）定量的、半定量的または定性的手段によって、直接的または間接的に前記サンプル中のヘプシジン−２５の量を検出する工程を含む。
【００１９】
別の実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物から得た組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−２５タンパク質の量を定量化するのに有用であり、（ｉ）固体支持体を、配列番号１、配列番号３（マウス５〜２５）または配列番号２（ラット５〜２５）を含むアミノ酸５〜２５内に含まれるエピトープに結合する一次抗体でコーティングする工程；（ｉｉ）前記哺乳動物から組織または生体液の試験サンプルを得る工程；（ｉｉｉ）試験サンプルを、抗体でコーティングされた固体支持体に付与する工程；（ｉｉｉ）任意のヘプシジンの存在により、ヘプシジン−一次抗体が結合するための適切な条件下でヘプシジン−一次抗体複合体を形成させる工程；（ｉｖ）未結合のサンプルを除去する工程；（ｖ）ヒトまたは齧歯動物ヘプシジン−２５、すなわちそれぞれＤＴＨＦＰＩＣまたはＤＴＮＦＰＩＣを含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに結合する二次抗体を、固体支持体に付与する工程；（ｖｉ）任意のヘプシジン−２５の存在により、任意のヘプシジン−２５−一次抗体複合体に結合する二次抗体のための適切な条件下で二次抗体−ヘプシジン−２５−一次抗体複合体を形成させる工程；（ｖ）未結合の二次抗体を除去する工程；ならびに（ｖｉ）二次抗体の存在または非存在を検出する工程を含む。二次抗体の存在または非存在は、直接的または間接的のいずれかで検出されてもよく、定量的、半定量的、または定性的に測定されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、抗ヘプシジン−２５選択的Ｍａｂ ３．２３を用いてヒト血清から免疫沈降したヒトヘプシジンの形態のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。シグナル１は、インタクトなヒトヘプシジン−２５の予想される質量と一致する質量（およそ２７９０ダルトン（Ｄａ）の分子量（ＭＷ））を有する。シグナル２は、インタクトなヒトヘプシジン−２０の予想される質量と一致する質量（２１９２ＤａのＭＷ）を有する。クロマトグラムが示すように、抗ヘプシジン−２５ Ｍａｂ３．２３は、検出可能な量のヘプシジン−２５および非常に少ない量のヘプシジン−２０に結合した。Ｍａｂ ３．２３は、検出可能なレベルのヘプシジン−２２（ＭＷ ２４３６Ｄａ）、ヘプシジン−２４（ＭＷ ２６７４Ｄａ）またはプロヘプシジン（ＭＷ ６９２９ Ｄａ）に結合するように見えなかった。マススペクトルは、以下の実施例６に本質的に記載されるサンプルマトリクスとしてａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ペプチドマトリクス）を用いる、陽イオン、線形モード法を利用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で生成された。
【図２】図２は、関連領域（ＭＷ ２０００〜３０００Ｄａ）における図１に示すマススペクトルの拡大図を示す。クロマトグラムが示すように、Ｍａｂ ３．２３は、ヘプシジン−２５（シグナル１）に結合し、非常に少ない程度でヘプシジン−２０（シグナル２）に結合した。抗ヘプシジン選択的Ｍａｂ ３．２３は、検出可能なレベルのヘプシジン−２２（ＭＷ ２４３６Ｄａ）またはヘプシジン−２４（ＭＷ ２６７４Ｄａ）に結合するように見えなかった。
【図３】図３は、抗ヘプシジン−２５選択的Ｍａｂ ５Ｅ８を用いてヒト血清から免疫沈降されたヒトヘプシジンの形態のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。シグナル１は、インタクトなヒトヘプシジン−２５（２７９０Ｄａ）の予想される質量と一致する質量を有する。クロマトグラムが示すように、抗ヘプシジン−２５ Ｍａｂ ５Ｅ８は、検出可能な量のヘプシジン−２５のみに結合した。マススペクトルは、以下の実施例６に本質的に記載されるサンプルマトリクスとしてａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ペプチドマトリクス）を用いる、陽イオン、線形モード法を利用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で生成された。
【図４】図４は、関連領域（ＭＷ ２０００〜３０００Ｄａ）における図１に示すマススペクトルの拡大図を示す。クロマトグラムが示すように、Ｍａｂ ５Ｅ８は、検出可能な量のヘプシジン−２５（シグナル１）に結合した。Ｍａｂ ５Ｅ８は、検出可能なレベルのヘプシジン−２０（２１９２ＤａのＭＷ）、ヘプシジン−２２（２４３６ＤａのＭＷ）、ヘプシジン−２４（２６７４ＤａのＭＷ）、またはプロヘプシジン（６９２９ＤａのＭＷ）に結合しなかった。
【図５】図５は、１０μｇ／Ｌ（１０ｎｇ／ｍＬ）の濃度で開始する合成されたヘプシジン−２５（黒丸）を連続希釈し、実施例８に記載されるＭＳＤ免疫学的検定を実施することによって生成されたヘプシジン−２５についての検量線のグラフを示す。ＭＳＤ免疫学的検定はヘプシジン−２５に特異的であり、ヘプシジン−２０（黒三角）またはヘプシジン−２２（白丸）を認識しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の略語が本明細書中で使用される：ＡＣＮ：アセトニトリル、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＤＴＴ：ジチオスレイトール、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法、ＩＭＡＣ：固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、ＩＰＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、Ｍａｂ：モノクローナル抗体、Ｍａｂｓ：複数のモノクローナル抗体、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＳＰＲ：表面プラズモン共鳴、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸。この文献に使用される全てのアミノ酸の略語は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（Ｂ）（２）に記載されるように米国特許商標局によって受容されているものである。
【００２２】
本発明は、ヘプシジン−２５を含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープを標的化することによってヘプシジン−２５に選択的に結合する抗体を提供する。そのような抗体は、貧血などの疾患、状態または障害の治療のために、ヒトにおける血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるのに有用である。さらに、本発明は、哺乳動物の組織および生体液におけるヘプシジン−２５の検出および／または測定のために、比較的簡単で、さらに高度に感受性があり、選択的な免疫学的検定において、そのような抗体を使用する方法を提供する。
【００２３】
本明細書に使用される場合、用語「ヘプシジン」とは、哺乳動物において存在することが知られているヘプシジンタンパク質の任意の形態を指す。本明細書に使用される場合、用語「成熟ヘプシジン」とは、哺乳動物において発現されるヘプシジンタンパク質の任意の成熟な生物学的形態を指す。本明細書に使用される場合、用語「ヒトヘプシジン」とは、ヒトに存在するヘプシジンタンパク質の任意の形態を指す。本明細書に使用される場合、用語「ヒトヘプシジン−２５」とは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するヒトヘプシジンの成熟形態を指す。
【００２４】
抗体の一般構造は当該技術分野において非常に周知である。ＩｇＧタイプの抗体に関して、鎖内および鎖間ジスルフィド結合によって架橋される４つのアミノ酸鎖（２つの「重」鎖および２つの「軽」鎖）が存在する。特定の生物学的系において発現される場合、未修飾のヒトＦｃ配列を有する抗体は、Ｆｃ領域においてグリコシル化される。抗体は同様に他の位置においてグリコシル化され得る。抗体のサブユニット構造および三次元配置は当該技術分野において周知である。各々の重鎖は、Ｎ末端の重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」）および重鎖定常領域（「ＨＣＣＲ」）から構成される。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡに関して３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）；ならびにＩｇＭおよびＩｇＥに関して４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）から構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中で「ＬＣＶＲ」）および軽鎖定常領域（「ＬＣＣＲ」）から構成される。
【００２５】
各々の軽／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存される散在した領域に細分され得る。各々のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に並ぶ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。本明細書中で、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３」と呼ばれ、軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３」と呼ばれる。ＣＤＲは抗原と特異的相互作用を形成する大部分の残基を含む。各ドメインに対するアミノ酸の指定は、周知の慣用法に従う（例えば、Ｋａｂａｔ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。
【００２６】
本発明の抗体は、免疫グロブリンクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）のいずれかから選択される重鎖定常領域を有し得る。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトまたはマウスＩｇＧ Ｆｃ領域に由来する定常領域を含む。
【００２７】
用語「モノクローナル抗体」とは、例えば任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む、単一のコピーまたはクローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法ではない。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、均一または実質的に均一の集団中に存在する。
【００２８】
本発明の抗体はインタクトであり得る。すなわち、任意の短縮形態が抗原結合部分を含み、抗原結合能力を保有する場合、そのような抗体のＦｃ領域、または一部もしくはフラグメントを含む、完全または十分な長さの定常領域を含む。そのような短縮形態としては、例えば、開示される抗ヘプシジン−２５選択的抗体のＣＤＲまたは可変領域を含むＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。さらに、そのような短縮形態の抗体は、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲをコードするＤＮＡとリンカー配列とを結合することによって産生され得る一本鎖Ｆｖフラグメントであり得る（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ２６９−３１５，１９９４を参照のこと）。フラグメントまたは部分が指定されているか否かに関わらず、本明細書に使用される用語「抗体」は、他に示されない限り、そのようなフラグメントまたは部分および一本鎖形態を含む。タンパク質部分またはタンパク質フラグメントが、ヘプシジン−２５に選択的に結合し、インビボまたはインビトロにおける哺乳動物のヘプシジン−２５の１つ以上の生物活性特性を中和する能力を保有する限り、それは用語「抗体」に含まれる。
【００２９】
本発明の抗体は、当該技術分野において周知の技術、例えば組み換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術またはそのような技術の組み合わせあるいは当該技術分野において容易に知られる他の技術を用いて産生され得る（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５：１６２８−５０（１９９９）およびＦｅｌｌｏｕｓｅ，Ｆ．Ａ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３７３（４）：９２４−４０（２００７）を参照のこと）。
【００３０】
以下の表１および表２は本発明の抗体についての好適なＣＤＲを示す。
【００３１】
【表１】
＊Ｘ１はＶまたはＡであり、Ｘ２はＹまたはＳであり、Ｘ３はＮまたはＨであり、Ｘ４はＮ、ＧまたはＹであり、Ｘ５はＳ、ＲまたはＰであり、Ｘ６はＳまたはＰであり、Ｘ７はＶ、Ｈ、ＩまたはＦであり、Ｘ８はＴまたはＶである。
【００３２】
【表２】
＊Ｘ９はＦ、ＹまたはＬであり、Ｘ１０はＳまたはＮであり、Ｘ１１はＴまたはＳであり、Ｘ１２はＹまたはＰであり、Ｘ１３はＩまたはＦであり、Ｘ１４はＶ、またはＩであり、Ｘ１５はＤまたはＧであり、Ｘ１６はＡまたはＮであり、Ｘ１７はＳまたはＹであり、Ｘ１８はＡまたはＴであり、Ｘ１９はＧまたはＨであり、Ｘ２０はＳまたはＮであり、Ｘ２１はＴまたはＳであり、Ｘ２２はＳ、ＡまたはＹである。
【００３３】
本発明は、限定されないが、
ａ）以下を含む軽鎖可変領域；
ｉ）配列番号６、９、１２、４５、１５、１７、２０、２４および２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１；
ｉｉ）配列番号７、１０、１３、１８、２１および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２；および
ｉｉｉ）配列番号８、１１、１４、１６、１９、２２、２３、１７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３；ならびに
ｂ）以下を含む重鎖可変領域；
ｉ）配列番号２９、３２、３５、３８、３９および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１；
ｉｉ）配列番号３０、３３、３６、４０および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２；および
ｉｉｉ）配列番号３１、２４、２７、４１および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、
を含む抗体を含む。
【００３４】
あるいは、本発明の好適な抗体は、
ａ）以下を含むＬＣＶＲ；
ｉ）配列番号９、１２、２０および２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１；
ｉｉ）配列番号１０、１３、２１および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２；および
ｉｉｉ）配列番号１１、１４、２３および２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３；ならびに
ｂ）以下を含むＨＣＶＲ；
ｉ）配列番号３２、３５および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１；
ｉｉ）配列番号３３、３６および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２；および
ｉｉｉ）配列番号３４、３７および４４に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、
を含む。
【００３５】
本発明の別の好適な抗体は、配列番号２０、２１、２２、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３６】
本発明の別の好適な抗体は、配列番号２６、２５、２８、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３７】
本発明の別の好適な抗体は、配列番号２４、２５、２３、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３８】
本発明のより好適な抗体は、配列番号２６、２５、２７、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３９】
本発明のさらにより好適な抗体は、配列番号９、１０、１１、３２、３３および３４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００４０】
本発明のさらにより好適な抗体は、配列番号１２、１３、１４、３５、３６および３７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００４１】
本発明のさらにより好適な抗体は、配列番号４５、１３、１４、３５、３６および３７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００４２】
本発明の最も好適な抗体は、配列番号２０、２１、２３、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００４３】
本発明の最も好適な抗体は、配列番号１２、１３、１４、３８、３６および３７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００４４】
本発明の最も好適な抗体は、配列番号１５、１０、１６、３９、４０および４１にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００４５】
本発明の好適な抗体は、配列番号４６、４８、５０、５２、５３、５５、５７、５９、６０、６１、６２および６３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。本発明の別の好適な抗体は、配列番号４７、４９、５１、５４、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。本発明の別の好適な抗体は、配列番号５９のＬＣＶＲおよび配列番号５８のＨＣＶＲを含む。本発明の別の好適な抗体は、配列番号６０のＬＣＶＲおよび配列番号５８のＨＣＶＲを含む。本発明の別の好適な抗体は、配列番号６１のＬＣＶＲおよび配列番号５８のＨＣＶＲを含む。本発明の別の好適な抗体は、配列番号６２のＬＣＶＲおよび配列番号５８のＨＣＶＲを含む。本発明の別の好適な抗体は、配列番号６３のＬＣＶＲおよび配列番号５８のＨＣＶＲを含む。本発明の最も好適な抗体は、配列番号４８のＬＣＶＲおよび配列番号４９のＨＣＶＲを含む。本発明の別の最も好適な抗体は、配列番号５５のＬＣＶＲおよび配列番号５６のＨＣＶＲを含む。このようなＬＣＶＲは、好ましくは、軽鎖または重鎖定常領域に連結される。
【００４６】
本発明の好適なモノクローナル抗体は、本明細書中で４Ｃ１１、１Ｇ８、１Ｂ４、１Ｅ３、３Ａ９、２、５Ｅ８、ＯＢ３、ＯＢ１、ＯＨ４およびＯＥ１と称される。Ｍａｂｓ ４Ｃ１１、１Ｇ８、１Ｂ４、１Ｅ３、３Ａ９、５Ｅ８、ＯＢ３、ＯＢ１、ＯＨ４、ＯＥ１、３．１２、３．２３および／またはその種々のフラグメントをコードするアミノ酸配列の配列番号を、以下の表３に提供する。
【００４７】
【表３】
【００４８】
用語「エピトープ」とは、抗体の抗原結合領域の１つ以上において抗体によって認識され、結合され得る分子の部分を指す。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。好ましくは、本発明の抗体は、成熟ヘプシジンのＮ末端でエピトープに結合する。より好ましくは、本発明の抗体は、ヘプシジン−２５を含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに結合する。より好ましくは、本発明の抗体は、ヒトヘプシジン−２５のＮ末端に結合する。さらにより好ましくは、本発明の抗体は、ヒトヘプシジン−２５を含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに結合する。最も好ましくは、本発明の抗体は、配列番号１のアミノ酸ＤＴＨＦＰＩＣ内に含まれるエピトープに結合する。
【００４９】
本明細書に使用される場合、用語「結合親和性（ＫＤ）」は、特定の抗原−抗体相互作用の解離速度を指すことが意図される。ＫＤは、解離速度、いわゆる「オフレート（ｋｏｆｆ）」と、会合速度、すなわち「オンレート（ｋｏｎ）」との比である。従って、ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎと等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。ＫＤが小さくなれば、結合親和性は強くなるということになる。従って、１μＭのＫＤは、１ｎＭのＫＤと比べて弱い結合親和性を示す。ＫＤ値は、当該技術分野において公知の方法によって得られ得る。
【００５０】
本明細書に使用される場合、本発明の抗ヘプシジン−２５抗体に対して言及される用語「選択的」とは、抗体が、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、同じ哺乳動物種に存在するヘプシジン−２５の少なくとも１つの前駆体型および／またはヘプシジン−２５の少なくとも１つのＮ末端切断型に結合するより、約１０００倍、５００倍、２００倍、１００倍、５０倍、１０倍または約５倍低いＫＤでヘプシジン−２５に結合する抗体を指す。さらに、または代替的に、本明細書の以下の実施例４〜８に記載される免疫学的検定および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によってアッセイされる場合、本発明のヘプシジン−２５選択的抗体はヘプシジン−２５に結合するが、哺乳動物種に存在するヘプシジン−２５の少なくとも１つの前駆体型および／またはヘプシジン−２５の少なくとも１つのＮ末端切断型に結合しないか、またはごくわずかしか結合しない。好ましくは、ヘプシジン−２５の前駆体型はプロヘプシジンであり、より好ましくはヒトプロヘプシジンであり、最も好ましくは配列番号９０に示すアミノ酸配列からなるヒトプロヘプシジンである。好ましくは、ヘプシジン−２５のＮ末端切断型は、ヒトヘプシジン−２０（すなわち配列番号１のアミノ酸６〜２５）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号１のアミノ酸４〜２５）である。
【００５１】
用語「検出する」または「検出」は、標的分子の定量的、半定量的または定性的測定を含むように広範囲の意味で使用される。一態様において、本明細書に記載される方法は、生物学的サンプル中の特定のヘプシジンポリペプチドの存在または非存在を決定するだけであってもよく、これによって、ヘプシジンポリペプチドは、上記の方法によってアッセイされる場合、サンプル中で検出可能であるか、または検出不能である。
【００５２】
本発明の抗体に言及される用語「生物活性」は、限定されないが、エピトープまたは抗原結合親和性、インビボおよび／またはインビトロでの抗体の安定性、例えばヒト対象に投与される場合、抗体の免疫特性、ならびに／あるいは限定されないが炎症の動物モデル、例えばＩＬ−６により誘発される炎症チャレンジアッセイにおける血清鉄レベル異常調節の阻害を含む、インビボもしくはインビトロにおけるヘプシジン−２５の生物学的活性を中和または拮抗する能力を含む。上述の性質または特性は、限定されないが、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫学的検定（ＩＧＥＮ）、蛍光消光、蛍光ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、限定されないがＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーを用いるＳＰＲ解析を含むＳＰＲ解析、制限のないインビトロおよびインビボでの中和アッセイを含む、当該技術分野で認識されている技術を用いて観察または測定され得る（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第２００６／０６２６８５号を参照のこと）。
【００５３】
ヘプシジンに言及される用語「生物活性」は、限定されないが、その受容体のフェロポーチンを含む、限定されないが、別のタンパク質に対するヘプシジンの特異的結合、ヘプシジンにより誘発されるフェロポーチンの内在化および／または分解などのヘプシジンの１つ以上のフェロポーチンにより媒介される機能（例えば、Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．ら，Ｈｅｐｃｉｄｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｉｒｏｎ Ｅｆｆｌｕｘ ｂｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ ａｎｄ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｉｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６，２０９０−２０９３（２００４）を参照のこと）、フェロポーチンにより媒介される鉄排出のヘプシジン調節、ヒトにおける血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットのヘプシジンにより誘発される減少、タンパク質安定性、すなわちヘプシジンにより影響を受けるインビボまたはインビボでの別のタンパク質のレベルまたは活性、ならびにヘプシジンの発現レベルおよび／または組織分布を含む。
【００５４】
本明細書に使用される場合、本発明の抗体の生物活性に対して言及される用語「阻害する」または「中和する」とは、限定されないが、ヒト、ラットまたはマウスのヘプシジン−２５の生物活性を含む、ヘプシジンの生物活性を実質的に拮抗し、妨げ、防ぎ、抑制し、遅延し、分解し、除去し、停止し、減少し、または反転する抗体の能力を意味する。
【００５５】
用語「対象」および「患者」は、本明細書で交換可能に使用され、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。特定の実施形態において、患者は、ヘプシジンの減少されたレベル、ヘプシジン生物活性の減少、および／または血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットの増加から利益を受ける疾患、障害、または状態を有する。
【００５６】
本明細書に使用される場合、抗体とヘプシジンポリペプチドとの間の結合に対して言及される用語「特異的に結合する」とは、抗体が、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約５００ｎＭ未満のＫＤでヘプシジンポリペプチドに結合することを意味する。
【００５７】
一実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約８００ｐＭ未満の、ヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有する。好ましくは、本発明の抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンポリペプチドに特異的に結合する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および４）に特異的に結合する。
【００５８】
一実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約８００ｐＭ未満の、ヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有し、ｉ）抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、少なくとも約２００倍、約１００倍、約５０倍、約１０倍、または約５倍高い、ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対するＫＤを有するか、あるいはｉｉ）ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対する抗体の結合は、実施例４〜７に記載される免疫学的検定および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって検出可能でないか、またはごくわずかしか検出できない。好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンポリペプチドに特異的に結合する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号２および３）に特異的に結合する。
【００５９】
別の実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有し、ｉ）抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、少なくとも約２００倍、約１００倍、約５０倍、約１０倍、または約５倍高い、ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対するＫＤを有するか、あるいはｉｉ）ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対する抗体の結合は、実施例４〜７に記載される免疫学的検定および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって検出可能でないか、またはごくわずかしか検出できない。好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンポリペプチドに特異的に結合する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および２）に特異的に結合する。
【００６０】
一実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満または約８００ｐＭ未満の、ヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有する。好ましくは、本発明の抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンポリペプチドに対して約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに対して約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に対して約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および２）に対して約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有する。好ましくは、本発明の抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンに対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および２）に対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。
【００６２】
一実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約８００ｐＭ未満の、ヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有し、ｉ）抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、少なくとも約２００倍、約１００倍、約５０倍、約１０倍または約５倍高い、ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対するＫＤを有するか、あるいはｉｉ）ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対する抗体の結合は、実施例４〜７に記載される免疫学的検定および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって検出可能でないか、またはごくわずかしか検出できない。好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンポリペプチドに対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および２）に対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫｄを有する。
【００６３】
別の実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有し、ｉ）抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、少なくとも約２００倍、約１００倍、約５０倍、約１０倍または約５倍高い、ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対するＫＤを有するか、あるいはｉｉ）ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対する抗体の結合は、実施例４〜７に記載される免疫学的検定および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって検出可能でないか、またはごくわずかしか検出できない。好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンポリペプチドに対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および２）に対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。
【００６４】
（抗体発現）
標準的な分子生物学技術が、組み換え発現ベクターを調製するため、宿主細胞をトランスフェクトするため、形質転換体を選択するため、本発明の抗体を産生する宿主細胞株を単離するため、それらの宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収するために使用される。
【００６５】
本発明はまた、本発明の抗ヘプシジン抗体を発現する宿主細胞に関する。当該技術分野において公知の多種多様の宿主発現系は、原核生物（細菌）および真核生物発現系（酵母、バキュロウイルス、植物、哺乳動物および他の動物細胞、トランスジェニック動物、およびハイブリドーマ細胞など）、ならびにファージディスプレイ発現系を含む、本発明の抗体を発現させるために使用され得る。
【００６６】
本発明の抗体は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の組み換え発現によって調製され得る。抗体を組み換えて発現するために、宿主細胞は、抗体の免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを保有する１つ以上の組み換え発現ベクターで形質転換、形質導入、感染などをされ、それによって、軽鎖および／または重鎖が宿主細胞中に発現される。重鎖および軽鎖は、それらが１つのベクター中で作動可能に連結される異なるプロモーターから独立して発現され得るか、または重鎖および軽鎖は、それらが２つのベクター（１つが重鎖を発現し、もう１つが軽鎖を発現する）中で作動可能に連結される異なるプロモーターから独立して発現され得る。必要に応じて、重鎖および軽鎖は異なる宿主細胞で発現されてもよい。
【００６７】
宿主細胞はまた、従来の技術によって、インタクトな抗体の部分またはフラグメント、例えばＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子を産生するために使用され得る。例えば、本発明の抗体の軽鎖または重鎖のいずれかをコードするＤＮＡで宿主細胞をトランスフェクトすることが望まれてもよい。組み換えＤＮＡ技術はまた、ヒトヘプシジン−２５に対する結合に必要でない軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードする一部または全てのＤＮＡを取り除くために使用されてもよい。このような切断ＤＮＡ分子から発現される分子もまた、本発明の抗体に含まれる。
【００６８】
本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。好ましくは、本発明の宿主細胞は、本発明の核酸分子を含む１つ以上のベクターまたは構築物を含む。例えば、本発明の宿主細胞は、本発明のベクターが導入される細胞であり、そのベクターは、本発明の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチドおよび／または本発明のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、本発明の２つのベクターが導入される宿主細胞を提供し、１つは本発明の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含み、もう１つは本発明の抗体に存在するＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含み、各々は、エンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなど由来（例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメント））に作動可能に連結されて、遺伝子の高レベルの転写を駆動する。
【００６９】
一旦発現されると、本発明のインタクトな抗体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態は、硫安沈殿法、イオン交換、アフィニティー（例えばプロテインＡ）、逆相、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当該技術分野の標準的な方法によって精製され得る。薬理学的使用のために、少なくとも約９０％、約９２％、約９４％または約９６％均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、約９８％〜約９９％またはそれ以上の均一性が最も好ましい。一旦、部分的または所望の場合、均一的に精製されると、次いで、本明細書に指示されるように、滅菌抗体が治療的に使用され得る。
【００７０】
（ヒト遺伝子操作抗体）
好ましくは、治療目的のために使用される本発明の抗体は、抗体が免疫反応を引き起こす可能性を減少させるために、（抗体に存在する範囲で）ヒト由来のフレームワークおよび定常領域の配列を有する。ヒト遺伝子操作抗体は、それらが治療適用に有益であり、ヒト対象に投与される場合、マウス起源の抗体またはマウス起源の部分を含む抗体で頻繁に観察されるヒト抗マウス抗体反応の可能性を減少させるので、特に興味深い。好ましくは、注入されるヒト遺伝子操作抗体は、例えばマウス抗体より、むしろ天然のヒト抗体に近い半減期を有し得るので、より少ない用量かつ少ない頻度で対象に投与できる。
【００７１】
本明細書に使用される場合、用語「ヒト遺伝子操作抗体」とは、少なくとも一部がヒト起源である抗体を指す。例えば、ヒト遺伝子操作抗体は、マウスなどの非ヒト起源の抗体由来の部分、および例えば従来の技術（例えば合成）によって化学的に一緒に結合されるか、または遺伝子操作技術を用いて隣接ポリペプチドとして調製されるヒト起源の抗体由来の部分を含んでもよい。
【００７２】
好ましくは、「ヒト遺伝子操作抗体」は、親抗体、すなわち非ヒト抗体、好ましくはマウスＦａｂ ４Ｃ１１などのマウスＭａｂもしくはそのフラグメントが起源であるか、またはそれらに由来するＣＤＲを有し、一方、存在する範囲でフレームワークおよび定常領域（または有意もしくは実質的なその部分、すなわち少なくとも約９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％）は、前記抗体がヒト細胞で産生するか否かに関わらず、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン領域（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅを参照のこと）またはその組み換え体もしくは変異型で生じる核酸配列情報によってコードされる。好ましくは、ヒト遺伝子操作抗体の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲは、ヒト遺伝子操作抗体が誘導される非ヒト親抗体のＣＤＲから最適化されて、スクリーニングアッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイによって確認され得る、所望の特性、例えば向上した特異性、親和性または中和を生じる。好ましくは、本発明の抗体における最適なＣＤＲは、親マウスＦａｂ ４Ｃ１１、３Ａ９、または５Ｅ８に存在するものと比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。親マウスＦａｂ ４Ｃ１１、３Ａ９または５Ｅ８のものと比較した場合、本発明のヒト遺伝子操作抗体のＣＤＲにおける特定のアミノ酸置換は、抗体の不安定性の可能性を減少させる（例えば、１つ以上のＣＤＲ Ａｓｎ残基の除去）か、または（例えばＩＭＭＵＮＯＦＩＬＴＥＲ（商標）技術（Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｒｏｖｉａ，ＣＡ）によって予測されるように）ヒト対象に投与される場合、抗体の免疫原性の可能性を減少させる。
【００７３】
ヒト遺伝子操作抗体は、好ましくは、非ヒト抗体由来の最小配列を含む。ヒト遺伝子操作抗体は、受容抗体にも、あるいは親抗体から導入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含んでもよい。ヒト遺伝子操作抗体は、当該技術分野における慣例の使用方法を用いてインビトロでの突然変異に供されてもよく、それによって、ヒト遺伝子操作組み換え抗体のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列に関連するものに由来するが、インビボにおいてヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内の天然に存在し得ない配列となる。ヒト遺伝子操作組み換え抗体のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲフレームワーク領域のそのようなアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９８％、またはより好ましくは少なくとも９９％、または最も好ましくは１００％同一であると意図される。
【００７４】
好ましい実施形態において、本発明のヒト遺伝子操作抗体は、ヒト生殖細胞系列軽鎖フレームワーク配列およびヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク配列を含む（例えば、国際公開第２００５／００５６０４号を参照のこと）。
【００７５】
ヒト遺伝子操作抗体を生成するために当該技術分野において利用可能な複数の方法が存在する（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第２００６／０６０４６９３５；Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２８６９（１９９１）；Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４（１９８８）を参照のこと）。例えば、ヒト遺伝子操作抗体は、選択的にヘプシジン−２５に結合する親抗体（例えば成熟抗体またはハイブリドーマによって作製された抗体）のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードする核酸配列を得て、前記ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（非ヒト）中のＣＤＲを同定し、そのようなＣＤＲコード核酸配列を選択されたヒトフレームワークコード核酸配列に移植することによって生成されてもよい。必要に応じて、ＣＤＲ領域をフレームワーク領域に移植する前にＣＤＲ内の１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換するために、ＣＤＲ領域は、ランダムにまたは特定の位置で変異することによって最適化されてもよい。あるいは、ＣＤＲ領域は、当業者に利用可能な方法を用いてヒトフレームワーク領域への挿入後に最適化されてもよい。
【００７６】
ＣＤＲをコードする配列が選択されたヒトフレームワークコード配列に移植された後、次いで、ヒト遺伝子操作可変重鎖および可変軽鎖配列をコードする得られたＤＮＡ配列が、ヘプシジン−２５を結合するヒト遺伝子操作抗体を生成するために発現される。ヒト遺伝子操作ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、完全な抗ヘプシジン−２５抗体分子の一部として、すなわちヒト定常領域配列との融合タンパク質として発現されてもよい。しかしながら、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列はまた、例えば、ヒト遺伝子操作抗ヘプシジン−２５ＦｖまたはＦａｂを生成するために定常配列の存在下で発現されてもよい（例えば、Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｊ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：３７−４５（１９９７）およびＷａｔｋｉｎｓ，Ｊら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６：１６９−１７７，（１９９８）を参照のこと）。
【００７７】
（診断用途）
本発明の抗体は、ヘプシジン−２５によって促進される疾患および状態に対する性質の評価、ならびにそれらを患っている患者におけるそのような疾患および状態の検出および診断のために、組織または生体液中のヘプシジン−２５の量を正確に検出または測定するための手段を提供する。例えば、本発明のヘプシジン−２５選択的抗体は、感受性が高く、信頼できる免疫学的検定（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫拡散法、またはＳＰＲアッセイなどの免疫検出アッセイ）に導入され得る。同様に、本発明のヘプシジン−２５選択的抗体はまた、組織または生体液サンプルの免疫組織化学的（ＩＨＣ）および免疫蛍光（ＩＦ）アッセイに有用である。そのような分析は、ヘプシジン−２５の異常レベルを検出し、それによって、ヘプシジン−２５によって促進される疾患および状態を診断するために使用されてもよい。より具体的には、本発明は、患者由来の組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−２５のレベルを測定し、サンプル中のヘプシジン−２５のレベルと、１つ以上のコントロール個体由来の対応するサンプル中のヘプシジン−２５のレベルまたは基準物とを比較し、それによって、ヘプシジン−２５の異常レベルに関連する疾患状態を検出することによって、患者におけるヘプシジン−２５に関連する疾患または状態を診断する方法を提供する。疾患状態は、減少した血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットに関連する１つ以上の遺伝性疾患または非遺伝性疾患を含んでもよい。好ましくは、疾患状態は、貧血に関連する１つ以上の遺伝性疾患または非遺伝性疾患を含んでもよい。
【００７８】
患者における疾患または状態に関連するヘプシジン−２５をモニターする方法もまた、提供される。その方法は、第１の時点においてヘプシジン−２５に関連する疾患または状態の危険性を被っている患者由来の組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−２５のレベルを測定する工程；１つ以上の異なる時点において患者由来の組織または生体液の１つ以上のサンプル中のヘプシジン−２５のレベルを測定する工程；異なる時点において測定されるヘプシジン−２５のレベルを比較し、それによって、ヘプシジン−２５により測定される疾患または状態をモニターする工程を含む。
【００７９】
本発明のヘプシジン−２５選択的抗体は、ハイスループット方法に適用される場合に特に有用である。そのような方法は、マイクロチップおよびマイクロアレイ法を含み、それによって、多くのサンプルが、マイクロプレートまたはスライド、あるいは当該技術分野において公知の他のアッセイ基板上で試験され得る。
【００８０】
生物学的サンプル中のヘプシジン−２５の存在またはそのレベルは、抗原−抗体複合体を形成するために適切な条件下で生物学的サンプルと、例えば本発明の抗体とを混合することによって規定され得る。抗体は、結合または未結合の抗体の検出を容易にするために検出可能な部分で直接的またはより好ましくは間接的に標識される。免疫複合体形成の検出の様々な方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット法（例えばドッロブロット、スロットブロット、ウェスタンブロットなど）、間接免疫蛍光法技術および例えばＳＰＲなどの物理的パラメーターの変化の検出に依存する方法などがある。このような適用には、生物学的サンプル、例えばヒトの生体液または細胞もしくは組織抽出物中のヘプシジンを検出するために検出可能な部分に結合される本発明のヘプシジン−２５選択的抗体を利用する方法が含まれる。本発明の抗体は、検出可能な部分での修飾を含むか、または含まないそのようなアッセイに使用され得る。検出可能な部分で修飾される場合、本発明の抗体は、検出可能な部分の共有または非共有結合によって修飾され得る。本明細書に使用される場合、用語「検出可能」は、公知の分析技術を用いて、検出器によって物質を同定または追跡することを可能にする物質（複合体、化合物または部分）の特徴を記載する。検出可能な部分の代表的な例としては、限定されないが、発色団、蛍光部分、リン光性部分、発光部分、放射性部分、種々の酵素（例えばアルカリホスファターゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼ）、磁性部分（例えば反磁性、常磁性および強磁性物質）、および重金属群、ならびに任意の他の公知の検出可能な部分が挙げられる。形成される抗体−抗原標準複合体の量は、例えば、光度または比色分析手段などの当該技術分野において公知の種々の方法によって定量されてもよい。好ましくは、本発明の抗体は、修飾せずに使用される。すなわち、当該技術分野において周知の方法に従って間接的に標識される。
【００８１】
本発明は、生物学的サンプル中のヘプシジン−２５タンパク質を検出するための方法を具現化し、本発明の抗体がヘプシジン−２５タンパク質に結合できるのに十分な条件下かつ時間で、前記抗体と生物学的サンプルとをインキュベートする工程、および前記結合を検出する工程を含む。好ましくは、抗体は、５Ｅ８、ＯＨ４および／またはＯＢ３である。生物学的サンプル中のヘプシジン−２５タンパク質を検出するための好ましい方法は、サンドイッチＥＬＩＳＡであり、本発明の一次抗体がヘプシジン−２５タンパク質に結合できるのに十分な条件下かつ時間で、前記抗体と生物学的サンプルとをインキュベートする工程、未結合サンプルを除去する工程、配列番号１のアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに選択的に結合する二次抗体を付与する工程、未結合の二次抗体を除去する工程、および前記二次抗体の結合を検出する工程を含む。好ましくは、一次抗体は３．２３または３．１２であり、二次抗体はＯＨ４またはＯＢ３である。抗ヘプシジンＭａｂ ３．２３は、２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含み、軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号８２に示すアミノ酸配列を有し、重鎖ポリペプチドの各々は配列番号８３に示すアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する。抗ヘプシジンＭａｂ ３．１２は、２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含み、軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号８４に示すアミノ酸配列を有し、重鎖ポリペプチドの各々は配列番号８５に示すアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する。生物学的サンプル中のヘプシジン−２５タンパク質を検出するためのより好ましい方法はサンドイッチＥＬＩＳＡであり、一次抗体がヘプシジンタンパク質に結合できるのに十分な条件下かつ時間で、ヘプシジンのアミノ酸５〜２５内に含まれるエピトープに特異的に結合する前記抗体と、生物学的サンプルとをインキュベートする工程、未結合サンプルを除去する工程、ヘプシジン−２５のアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに結合する二次抗体を付与する工程、未結合の二次抗体を除去する工程、および前記二次抗体の結合の存在または非存在を検出する工程を含む。好ましくは、一次抗体は３．２３または３．１２であり、二次抗体はＯＨ４またはＯＢ３である。より好ましくは、二次抗体は標識されず、結合は当該技術分野において公知の方法に従って間接的に検出される。
【００８２】
本発明はまた、ヘプシジン−２５を含む疑いのあるサンプルをスクリーニングするための組成物、方法およびキットを提供する。そのようなスクリーニングは、そのようなポリペプチドを含むか、または生成する疑いのある患者サンプル、または実験サンプルで実施されてもよい。キットは、本発明のヘプシジン−２５選択的抗体を含んでもよい。キットは、サンプルと、本発明のヘプシジン−２５選択的抗体との間の相互作用を検出するための適切なバッファーおよび試薬を含んでもよい。提供される試薬は、抗マウスＩｇＧ抗体などの本発明の抗体と結合または相互作用できる放射性標識、蛍光標識、または酵素標識された薬剤であり得る。
【００８３】
キットの試薬は、溶液として提供されるか、固体支持体に結合されるか、または乾燥粉末として提供されてもよい。試薬が溶液で提供される場合、好ましくは、溶液は水溶液である。好ましくは、試薬が固体支持体に結合される場合、固体支持体は、クロマトグラフ媒体、複数のウェルを有する試験プレート、または顕微鏡スライドであってもよい。提供される試薬が乾燥粉末である場合、粉末は適切な溶媒の添加によって再構成されてもよく、ウェルとしてキットに提供されてもよい。
【００８４】
本発明のキットは一般にバイアルを含む容器で提供され、その中に抗体、抗原または検出試薬が入られてもよく、好ましくは適切に等分されてもよい。本発明のキットはまた、典型的に、商業用販売のための抗体、抗原および試薬容器を含むための手段を含む。そのような容器はプラスチック容器を含んでもよく、その中に所望のバイアルが保持され、さらに１つ以上の必要な化学物質、例えば、クロマトグラフィー物質、溶媒および溶離剤、試験管、洗浄剤、抗体および検出反応のための化学物質が保持される。
【００８５】
（治療的使用）
ヘプシジン−２５により促進される疾患または状態は、それらを必要とする患者に、（１）ヒトヘプシジン−２５、すなわちＤＴＨＦＰＩＣ（配列番号５）、および／または（２）マウスヘプシジン−２５、すなわちＤＴＮＦＰＩＣ（配列番号８６）を含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに結合するヘプシジン−２５選択的抗体の二次抗体を含む医薬組成物を投与することによって予防または治療され得る。
【００８６】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、有効量がそれを必要とするヒト被検体に投与される場合、ヒトにおける血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるために使用され得る。さらに、本発明の抗体は、状態、疾患、または障害の治療に有用であり得、ここで、ヘプシジン−２５の存在は、望まれない病理学的効果またはヘプシジン−２５のレベルの減少を引き起こすか、またはそれらの原因となるか、あるいはヘプシジン生物活性はヒト被検体における治療的有用性を有する。そのような状態、疾患または障害は、限定されないが、感染、炎症、慢性疾患および癌に起因する貧血を含む、貧血を含む。被検体は男性であっても女性であってもよい。好ましくは、ヒト被検体は、望ましくない、低い血清鉄レベル、低い網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを有するか、またはそれらを有する危険性がある。より好ましくは、ヒト被検体は、限定されないが、感染、炎症、慢性疾患および／または癌に起因する貧血を含む、貧血の危険性があるか、またはそれを患っている。
【００８７】
さらに、本発明の抗体の使用は、限定されないが、感染、炎症、慢性疾患、および癌に起因する貧血を含む、貧血の治療または予防のための医薬の製造に使用するためのものである。
【００８８】
本発明のヘプシジン−２５選択的抗体はまた、ヘプシジン−２５により促進される疾患および状態の予防および治療に有用である。本発明の抗ヘプシジン−２５選択的Ｍａｂｓは、ヘプシジン−２５に対する受動免疫のための医薬組成物において処方され得る。本発明のＭＡｂｓの機能的フラグメント、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびヘプシジン−２５に選択的に結合する能力を保有する任意のフラグメントなどもまた、医薬組成物に組み込まれて、治療に適用されてもよい。
【００８９】
さらに、本発明のヘプシジン−２５選択的Ｍａｂｓは、ヘプシジン−２５により促進される疾患および状態の進行をモニターするために免疫学的検定に適用されてもよく、ここで、ヘプシジン−２５のレベルまたは量は、処置または治療の成功、あるいは疾患または状態の進行の指標を提供する。
【００９０】
さらに、本発明のＭａｂｓは、ヘプシジン−２５により促進される疾患または状態を患っている患者のヘプシジン−２５遮断治療を評価する方法において有用である。その方法は、以下の工程：
ａ）治療の初期段階前または治療の初期段階中の患者から生体液の第１のサンプルを得る工程；
ｂ）免疫学的検定法によって第１のサンプル中のヘプシジン−２５のレベルを測定する工程；
ｃ）治療が効果を有するうちの適切な時間の後に、患者から生体液の第２のサンプルを得る工程；
ｄ）免疫学的検定法によって第２のサンプル中のヘプシジン−２５の量を測定する工程；
ｅ）ヘプシジン−２５結合または遮断治療の効果を測定するために、第１のサンプル中のヘプシジン−２５の測定された量と、第２のサンプル中のヘプシジン−２５の量とを比較する工程、を含む。
【００９１】
患者におけるヘプシジン−２５結合治療または遮断治療を評価するために適用される上記の方法は、特に臨床診療において有益であり、１つの治療計画または別の治療計画で開始するタイミングの決定は、患者の転帰に重要であり得る。本発明の方法は、それらの重要な決定の基礎となる情報を提供する。その方法は、治療の初期段階前、または治療の初期段階中のヘプシジン−２５の量の測定を提供し、そして、特に治療が有効になり始めると予想される場合、治療の開始後、１回以上の期間におけるヘプシジン−２５の１つ以上の測定を提供する。
【００９２】
ヘプシジン−２５遮断治療は、抗ヘプシジン−２５選択的抗体の患者への受動投与であってもよい。抗ヘプシジン−２５選択的抗体は、キメラヒト／非ヒト抗体、ヒト化または完全なヒトモノクローナル抗ヘプシジン−２５選択的抗体、あるいはヘプシジン−２５結合に機能的な任意のヘプシジン−２５選択的抗体フラグメントであってもよい。
【００９３】
免疫複合体形成を検出する様々な方法は、当該技術分野において周知であり、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット法（例えばドッロブロット、スロットブロット、ウェスタンブロットなど）、間接免疫蛍光法技術および例えばＳＰＲなどの物理的パラメーターの変化の検出に依存する方法がある。１つの広範に使用される方法において、免疫複合体形成は、放射性標識または酵素タグ（例えばアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）などの標識の使用により検出される。さらなる利点は、二次抗体または当該技術分野において周知の方法に従う、ビオチン化リガンドを結合するためのアビジン結合分子などの二次結合リガンドの使用により得ることができる。
【００９４】
本明細書に使用される場合、用語「治療」および「治療する」とは、例えば、本明細書に記載される疾患、状態、または障害、その症状、あるいはそれに対する性質を、例えば、治療、軽減、変化、作用、制御、停止、改善、または防止するための治療効果を与える目的で、本明細書に記載される疾患、状態、または障害、そのような疾患、状態、または障害の症状、あるいはそのような疾患、状態、または障害に対する性質を有する患者に物質を投与することを指す。好ましくは、治療される患者は哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。投薬計画は、最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように調節され得る。例えば、単一のボーラスが投与されてもよく、数回に分割した用量が時間にわたって投与されてもよいか、または用量は比例的に減少されるか、もしくは治療状況の緊急性によって示される場合、増加されてもよい。
【００９５】
（医薬組成物）
本発明の抗体は、ヒト被検体への投与に適切な医薬組成物に組み込まれ得る。本発明の抗体は、ヒト被検体に単独あるいは単回または複数回投与量で薬理学的に許容可能な担体および／または希釈剤と併せて投与されてもよい。そのような医薬組成物は、選択される投与様式に適切であるように設計され、薬理学的に許容可能な希釈剤、担体、および／または賦形剤、例えば分散剤、バッファー、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などが必要に応じて使用される。前記組成物は、当該技術分野において公知の従来技術に従って設計されてもよい。
【００９６】
医薬組成物のための適切な担体は、本発明のＭａｂと混合される場合、分子の活性を保持し、被検体の免疫系と反応しない、任意の物質を含む。
【００９７】
本発明の抗ヘプシジン−２５Ｍａｂを含む医薬組成物は、標準的な投与技術を用いて本明細書に記載される病状、例えば貧血障害の危険性があるか、またはそれらを示す被検体に投与され得る。
【００９８】
本明細書に使用される場合、用語「有効量」とは、所望の治療結果を達成するために、（投薬量および期間および投与手段について）必要な量を指す。抗体の有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、体重などの要因、および個体において所望の反応を引き起こすための抗体または抗体部分の能力に従って変化させてもよい。有効量はまた、抗体のあらゆる毒性または有害作用を、治療的に有益な効果が上回るものである。
【００９９】
有効量は少なくとも最少量であるが、被検体に対して治療的有益性を与えるのに必要である活性剤の毒性量より少ない。つまり、本発明の抗体の有効量または治療的に有効な量は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、（ｉ）血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるか、あるいは（ｉｉ）ヘプシジン−２５の存在が望ましくない病理学的作用を引き起こすか、またはその原因となる状態、障害または疾患を治療するか、あるいは（ｉｉｉ）ヘプシジン−２５のレベルまたはヘプシジン生物活性の減少が、限定されないが、感染、炎症、慢性疾患、および／または癌に起因する貧血を含む、限定されないが、慢性疾患の貧血を含む、限定されないが、貧血を含む、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて有益な治療効果を生じる、量である。本発明の抗体の有効量は、単回投与または複数回投与で投与されてもよい。さらに、本発明の抗体の有効量は、２回以上投与されなくても、有効量より少ない複数回用量で投与されてもよい。
【０１００】
医薬分野において周知のように、任意の１人の被検体のための投薬量は、投与頻度および投与経路、全体的な健康、および同時に投与されている他の薬物を含む、多くの要因に依存する。用量はさらに、疾患の種類および重篤性に非常に依存し得る。典型的な用量は、例えば、約０．１〜約１００ｍｇ；好ましくは約１〜約１００ｍｇ；より好ましくは約５〜約５０ｍｇの範囲であり得るが、しかし、この例示的範囲の上下の用量も、特に上述の要因を考慮して想定される。日常の非経口投薬計画は、全体重の約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１００μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。進行は定期評価によりモニターされてもよく、それに応じて用量が調節される。
【０１０１】
抗体のこれらの提案される量は多くの治療的決定に従う。適切な用量および計画を選択する際の重要な要因は、得られる結果である。この状況において考慮するための要因は、特に治療される障害、個々の患者の臨床状態、障害の原因、抗体の送達部位、抗体の特定の種類、投与方法、投与計画および投与頻度、ならびに医師に公知の他の要因を含む。
【０１０２】
本発明の抗体の投与経路は、経口、非経口、吸入または局所的であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、非経口投与に適切な医薬組成物に組み込まれてもよい。本明細書に使用される場合、用語、非経口は、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣内、または腹腔内投与を含む。静脈内または腹腔内または皮下注射による非経口送達が好ましい。皮下注射が最も好ましい。そのような注射のための適切な賦形剤は当該技術分野において周知である。
【０１０３】
医薬組成物は、典型的に、例えば、密閉されたバイアル、シリンジまたは他の送達装置、例えばペンを含む、与えられる容器中での製造および貯蔵条件下で、無菌かつ安定でなければならない。従って、医薬組成物は、製剤作製後に濾過滅菌され得るか、または微生物学的に受容可能に作製され得る。
【０１０４】
以下の実施例は例示の目的のみのために与えられ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１０５】
（実施例１ ヒトヘプシジン−２５の生成）
商業的供給源（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ））から取得するかまたは当技術分野で公知の種々の合成または組み換え技術により、ヒトヘプシジン−２５を生成することができる。例えば、ヘプシジン−２５の２５アミノ酸を含み、かつ、配列番号９５に示すようなアミノ酸配列を有する融合タンパク質を、大腸菌で発現する。３７℃にて１ｍＭのＩＰＴＧを用いる誘導の３〜６時間後にヒトヘプシジン−２５融合タンパク質を発現する３リットルの大腸菌から、封入体を単離する。封入体をバッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓおよび８Ｍの尿素（ｐＨ８．０））に溶かす。上清を固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム（２０ｍＬ樹脂）に通す。カラムを吸光度が基準値に戻るまでバッファーＡで洗浄し、結合したポリペプチドをバッファーＡ内の０．５Ｍのイミダゾールによりカラムから溶出されたバッチとする。ヒトヘプシジン−２５融合タンパク質をプールし、５０ｍＭのＤＴＴで還元する。その後、プールされた物質を、２Ｍの尿素、３ｍＭのシステイン、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）内で最終タンパク質濃度が５０μｇ／ｍＬ未満になるように希釈することにより、この融合タンパク質をリフォールディングする。この物質を室温にて攪拌し、４８時間空気中で酸化させる。酸化ポリペプチドを流速５ｍＬ／分にてＩＭＡＣカラム（２０ｍＬ）に通し、ヒトヘプシジン−２５融合タンパク質をバッファーＡ内の０．５Ｍイミダゾールによりカラムから溶出されたバッチにする。ヒトヘプシジン−２５融合タンパク質を含有するプールされた画分を濃縮し、５０ｍＭのＴｒｉｓ、４Ｍの尿素、ｐＨ８．０で流速３ｍＬ／分にて平衡化されたサイジングカラム（例えば、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＸＫ２６／６０）に通す。溶出された単量体融合タンパク質をプールし、次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２Ｍの尿素、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．０に希釈し、その後、エンテロキナーゼで切断して、配列番号１のヒトヘプシジン−２５を生成する。未切断のヒトヘプシジン−２５融合タンパク質を、受動ＩＭＡＣクロマトグラフィー（上記の概略参照）により除去する。次いで、ＩＭＡＣカラムからの通過物（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）をＣ−１８逆相カラム上に流速４．０ｍＬ／分にて負荷する。カラムを吸光度が基準値に戻るまで０．１％のＴＦＡ入り水で洗浄し、結合したポリペプチドを、０．５％／分の速度で０．１％のＴＦＡを含む２０％〜４０％のＡＣＮの線形勾配によりカラムから溶出する。ヒトヘプシジン−２５ポリペプチドを含有する画分をプールし、Ｎ末端アミノ酸配列分析およびマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）により分析する。
【０１０６】
また、ラット、マウス、および、カニクイザルのヘプシジン−２５と種々のＮ末端切断型のヒトヘプシジン−２５（ヘプシジン２２およびヘプシジン２０を含む）をコードするポリペプチドを、ヒトヘプシジン−２５について説明したように基本的に生成した。
【０１０７】
（実施例２ Ｎ末端ヘプシジン−２５抗体の生成）
５個のアミノ酸ペプチドリンカー（すなわち、ＧＰＧＰＧ）でＯＶＡペプチド（アミノ酸３２３〜３３６）配列（すなわち、完全長免疫原ＤＴＨＦＰＩＣＧＰＧＰＧＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥ（配列番号８７））に結合させたＮ末端ヘプシジンペプチド（配列番号１のアミノ酸１〜７）を用いてマウスに免疫性を与え、これらのマウスから脾臓を２７日目に回収する。Ａｇ＋およびＩｇＧ＋メモリーと胚中心細胞について１ウェルあたり１細胞においてＢ細胞をソートし、ＥＬ４Ｂ細胞と２週間共培養する。その後、得られたＩｇＧ含有上清を１．４倍に希釈し、以下の３つのＥＬＩＳＡフォーマットに従ってスクリーニングする。（１）９６ウェルプレートを、ＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮ（商標）結合タンパク質（すなわち、脱グリコシル化されかつ等電的中性型（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｎｅｕｔｒａｌ ｆｏｒｍ）のアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ））を用いて、２μｇ／ｍＬの炭酸バッファー中で一晩コーティングする。非特異的結合部位をカゼインで１時間ブロックする。その後、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、１００ｎＭのビオチン化ヘプシジンを１時間プレート上でインキュベートする。プレートを再度上述のように洗浄する。その後、培養物からのＩｇＧ上清を１時間インキュベートし、プレートを洗浄する。ヘプシジン−２５抗体の特異的結合を０．５μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧのＦｃγアルカリホスファターゼにより検出する。アルカリホスファターゼ活性を、適当量のＰＭＰ／ＡＭＰ基質（６ｍｇ／ｍｌのフェノールフタレイン一リン酸（ＰＭＰ）入り０．５ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ１０．２、２％の２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、０．１％のＮａＮ３）を加えることにより測定し、５６０ｎｍにおける吸光度の量を測定する。（２）９６ウェルプレートを、ヤギ抗マウスカッパＩｇＧを用いて、２μｇ／ｍｌにて炭酸バッファー中で一晩コーティングする。その後、非特異的結合部位をカゼインで１時間ブロックする。プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、培養物からのＩｇＧ上清を１時間インキュベートする。その後、ビオチン化ヘプシジン−２５（１００ｎＭ）を１時間プレート上でインキュベートし、プレートを再度上述のように洗浄する。その後、捕捉した抗体に対するヘプシジン−２５の特異的結合を、１μｇ／ｍｌのＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮ−ＡＰ（商標）、ＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮ（商標）−アルカリホスファターゼ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を加えることにより検出し、アルカリホスファターゼ活性をＰＭＰ／ＡＭＰ基質を加えることにより検出し、５６０ｎｍにおける吸光度を測定する。（３）９６ウェルプレートを１００ｎＭのヘプシジン−２５入り水を用いて一晩３７℃にてコーティングする。その後、非特異的結合部位をカゼインで１時間ブロックし、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄する。その後、培養物からのＩｇＧ上清を１時間インキュベートし、プレートを再度上述のように洗浄する。Ｎ末端ヘプシジン−２５抗体の特異的結合を０．５μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧのＦｃγアルカリホスファターゼにより検出する。アルカリホスファターゼ活性をＰＭＰ／ＡＭＰ基質で測定し、５６０ｎｍにおける吸光度の量を測定する。
【０１０８】
次いで、ヘプシジン−２５（例えば、３Ａ９、４Ｃ１１および５Ｅ８）のＮ末端に特異的なマウス抗体を発現するＢ細胞を用いてＲＮＡを単離し、可変領域をＲＴ−ＰＣＲにより増幅させ、市販のマウスＩｇＧ１ベクターまたは重鎖および軽鎖それぞれへ連続的にクローン化する。一時的に発現されたマウス抗体を、ＳＰＲを用いてＮ末端ヘプシジン−２５特異的抗体として確認した。
【０１０９】
（実施例３ ＳＰＲを用いる抗ヘプシジンＦａｂｓおよびＭａｂｓの親和結合測定）
ＳＰＲバイオセンサー（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００）を、抗体（例えば、本明細書に開示された抗体）の結合反応速度および親和性を測定するために用いることができる。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システムは、ＳＰＲの光学的性質を利用して、デキストランバイオセンサーマトリクス内の相互作用分子のタンパク質濃度における変化を検出する。特に指定のない限り、全ての試薬および物質をＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ（Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入する。全ての測定を２５℃にて行う。サンプルをＨＢＳ−ＥＰバッファー（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に溶解する。ヒトカッパでＦａｂｓを捕捉するために、ヤギ抗ヒトカッパを、アミン結合キットを用いて、５０００〜１００００反応単位（Ｒｕｓ）のレベルにてＣＭ５センサーチップの１〜４のフローセル上に固定する。マウスＩｇＧ１でＭａｂｓを捕捉するために、ヤギ抗マウスＦｃガンマを、アミン結合キットを用いて、５０００〜１００００ＲｕｓのレベルにてＣＭ５センサーチップの１〜４のフローセル上に固定する。ヒトＩｇＧ４で抗体を捕捉するために、タンパク質Ａを、アミン結合キットを用いて、４００〜７００ＲｕｓのレベルにてＣＭ４センサーチップの１〜４のフローセル上に固定する。大腸菌のペリプラズマから調製されたＦａｂｓおよび哺乳動物細胞培養物から調製されたＭａｂｓを、複数の分析サイクルを用いて評価する。各サイクルは、以下のステップからなる。２００〜１０００Ｒｕｓの捕捉を目指してＦａｂまたはＭａｂを約１０μＬ／分にて０．３〜２分間注入し、実施例１において上述したように取得された種々の濃度のヒトヘプシジン−２５（６００ｎＭ〜０．１ｎＭ）を５０μＬ／分にて２分間注入し、次いで、２〜１０分間解離し、そして、３０μＬの１０ｍＭの塩酸グリシン、ｐＨ１．５を用いて再生する。測定は２５℃にて取得され、各サイクルにおける会合速度および解離速度を、ＢＩＡ評価ソフトウェア内の「１：１の物質移動を伴う」結合モデルを用いて評価する。
【０１１０】
マウスモノクローナル抗体３Ａ９、４Ｃ１１、５Ｅ８、ＯＢ３、ＯＨ４、ＯＢ１およびＯＥ１は、約３６ｎＭ〜約１ｎＭの親和性（ＫＤ）でヒトヘプシジン−２５と結合することを示す。マウスモノクローナル抗体ＯＨ４は、約１．２ｎＭのＫＤでヒトヘプシジン−２５と結合するが、ヒトヘプシジン２０またはヒトヘプシジン２２とは検出可能に結合しない。マウスモノクローナル抗体５Ｅ８は、ヒトヘプシジン−２５と結合するが、マウスまたはラットのヘプシジン−２５とは検出可能に結合しない。マウスモノクローナル抗体４Ｃ１１は、ヒト、マウス、およびラットのヘプシジン−２５と結合し、より低い程度で、ヒトヘプシジン２２（約２０９ｎＭ）と結合するが、ヒトヘプシジン２０とは結合しない。
【０１１１】
（実施例４ ヒトヘプシジン−２５と同時結合するＭａｂｓペアの同定）
ＳＰＲ分析によりヒトヘプシジン−２５に対する高親和性結合を示したヒトヘプシジン−２５を含むアミノ酸１〜７に対して産生されたモノクローナル抗体を、Ｍａｂ３．２３とともにヒトヘプシジン−２５に同時結合する能力について試験した。
【０１１２】
つまり、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００上で、ヤギ抗マウスＩｇＧ１ Ｆｃポリクローナル抗体を、５０００〜１５０００反応単位（Ｒｕ）にてＣＭ５チップのフローセル１〜４上に固定した。Ｍａｂ ５Ｅ８をフローセル２上で捕捉し、Ｍａｂ ４Ｃ１１をフローセル３上で捕捉し、Ｍａｂ ３Ａ９をフローセル４上で捕捉した。フローセル１を参照フローセルとして用いた。次いで、全てのフローセルにヒトヘプシジン−２５を注入した。フローセル上に固定されたＭａｂｓ ５Ｅ８、４Ｃ１１および３Ａ９を有するフローセルは全て、ヒトヘプシジン−２５に対するそれらＭａｂｓの結合を示すＲｕｓの増加を示した。次に、全てのフローセルにＭａｂ ３．２３を注入した。フローセル２のみ、フローセル上に固定されたＭａｂ ５Ｅ８を有し、Ｍａｂｓ ５Ｅ８および３．２３によりヒトヘプシジン−２５と同時結合することを示した。
【０１１３】
加えて、Ｍａｂｓ Ｈｕ２２、３．２３、３．１２、およびネガティブコントロールヒトＩｇＧ４抗体を、１０００〜４０００ＲｕｓにてセンサーチップＣＭ４チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）の別個のフローセル上で固定した。次いで、フローセルにヒトヘプシジン−２５を注入した。次に、フローセルにＭａｂ ５Ｅ８を注入した。フローセル上に固定されたＭａｂｓ Ｈｕ２２、３．２３、および３．１２を有するフローセルは、ヒトヘプシジン−２５の結合と、その後、Ｍａｂ ５Ｅ８の同時結合を示した。フローセル上に固定したネガティブコントロールヒトＩｇＧ４を有するフローセルは、ヒトヘプシン２５またはＭａｂ ５Ｅ８のいずれにも結合を示さなかった。更に、Ｍａｂ ５Ｅ８は、ヒトのアミノ酸１〜７およびマウスのヘプシジン−２５（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ ＴＸ；ｃａｔ．＃Ｈｅｐｃ１３−Ｓ）から構成されるＫＬＨ複合ペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗血清、または、それらのＩｇＧ精製調製物（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；ｃａｔ．＃Ｈｅｐｃ１３−Ａ）のいずれに対しても、ヒトヘプシジン−２５と同時結合しなかった。
【０１１４】
（実施例５ ヒトヘプシジン−２５の測定のためのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ）
マルチウェルプレートのウェルを、炭酸−重炭酸コーティングバッファー、ｐＨ９．４０（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ）中で２ｍｇ／Ｌの濃度にてＭａｂ ３．２３を用い、室温にて１時間コーティングする。次に、ウェルを吸引し、ＴＢＳＴ（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０／Ｌを含む１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有するＴＲＩＳ緩衝化生理食塩水）で３回洗浄する。次いで、ウェルをＴＢＳ−カゼインブロッキングバッファー（カトン（Ｋａｔｈｏｎ）抗菌剤を含む１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１％のカゼイン、ｐＨ７．４（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｃａｔ．＃３７５３２）で１時間ブロックする。次に、１００μＬのヘプシジン−２５標準（５０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４０、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍＬ／ＬのＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００非イオン界面活性剤（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐ．，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、および、５ｍｍｏｌ／Ｌのエチレングリコ−四酢酸（ＥＧＴＡ）からなる、アッセイバッファー中の種々の濃度における合成されたヒトヘプシジン−２５）をウェルのセットに加えて、較正曲線を生成する。その後、血清サンプルをアッセイバッファー中で１：２０に希釈し、その個々のウェルに加え、ＥＬＩＳＡプレートを室温にて１時間インキュベートする。吸引後、ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬの１：１０００希釈ビオンチン化抗ヘプシジン−２５Ｍａｂ ５Ｅ８を１ｍｇ／ｍｌにてウェルに加え、室温にて１時間インキュベートする。吸引後、ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬのポリ−ストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ）をウェルに加え、室温にて３０分間インキュベートする。その後、ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄する。最後のＴＢＳＴの吸引後、１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン発色基質（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ）をウェルに加え、室温にて３０分間インキュベートする。反応を等量の２Ｎリン酸で停止し、プレートを４５０ｎｍにて読み取る。
【０１１５】
４０人の正常患者および癌患者からのヘプシジン−２５の血清濃度を、５〜６５６μｇ／Ｌの範囲で上述のサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定し、測定されたヘプシジン−２５の血清濃度を標準ＬＣ／ＭＳアッセイ（ｒ＝０．９８，ｐ＜０．０００１）（Ｍｕｒｐｈｙら（２００７）を参照）を用いて直接相関させた。また、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ， ＮＪ））から得られた健康なドナー（５０人の男性および５０人の女性、年齢は１８歳から６６歳であり、平均年齢３７歳）からの１００個のヒト血清サンプルは、１〜７９μｇ／ｍｌより少ない範囲のヘプシジン−２５濃度を有すると決定した。加えて、サンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒトヘプシジン−２５コントロールペプチドが用量依存的に少なくとも１ｎｇ／ｍｌまで減ることを検出した。一方、ヒトヘプシジン−２５コントロールペプチド（２ｎｇ／ｍｌ以下）、および、ヒト血清サンプルポジティブコントロール内（すなわち、ＬＣ／ＭＳアッセイによりヘプシジン−２５を含有することが予め決定される）の内因性ヘプシジン−２５のどちらも、Ｍａｂ ５Ｅ８を（ｉ）ヒトのアミノ酸１〜７およびマウスのヘプシジン−２５（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ ＴＸ；ｃａｔ．＃Ｈｅｐｃ１３−Ｓ）からなるＫＬＨ結合ペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗血清、または、（ｉｉ）そのＩｇＧ精製調製物（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；ｃａｔ．＃Ｈｅｐｃ１３−Ａ）で置換した場合、同様のアッセイにおいて検出可能ではない。更に、ヘプシジン−２５標準、および、ヒト血清サンプルポジティブコントロールのどちらも、ＨＥＰＣ−１３−Ｓ抗血清またはそのＩｇＧ精製調製物を（ｉ）アッセイプレート（すなわち、捕捉抗体として）の別個のウェル上でコーティングしたか、（ｉｉ）ビオチン結合検出抗体としてアッセイに加えたか、または、（ｉｉｉ）未結合検出抗体としてアッセイに加えた場合（すなわち、抗ウサギＩｇＧ二次抗体を用いてそれらの結合を連続的にアッセイした状態）、検出可能ではなかった。
【０１１６】
ヒトヘプシジン−２５コントロールペプチドおよびヒト血清ポジティブコントロールサンプル中の内因性ヘプシジン−２５は、サンドイッチＥＬＩＳＡがＭａｂ ５Ｅ８を捕捉抗体として用い、かつ、ＫＬＨ結合１３アミノ酸成熟ヒトヘプシジンＣ末端ペプチド（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ；ｃａｔ．＃ＨＥＰＣ１２−Ａ）に対して産生された市販のウサギポリクローナルＩｇＧとペアで用いた場合、検出されなかった。
【０１１７】
（実施例６ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いた抗ヘプシジン抗体の選択性の決定）
バイオマーカーの臨床の慣例の診断は、主に免疫学的定量的技術（例えば、ＥＬＩＳＡ）に基づく。これらの方法は、小さい抗原または抗原アイソフォームに適用できないことが多い（Ｓｐａｒｂｉｅｒ，Ｋ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ，Ｐｏｓｔｅｒ Ｖ２８−Ｓ，（２００８）；およびＧｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｊ．Ａ．ら（２００５））。ＭａｂｓまたはＦａｂｓは、サンプル減少後に実行された、抗体結合ヘプシジンポリペプチドで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって、ヒト血清から、前駆体またはそれらの切断型よりも内因性ヘプシジン−２５を選択的に免疫沈降させるそれらの能力について評価され得る。
【０１１８】
抗ヒトヘプシジンＭａｂｓまたはＦａｂｓを、炭酸−重炭酸（ｐＨ９．４）バッファー中で１時間室温にて２ｍｇ／Ｌの濃度において、９６−ウェル標準ＥＬＩＳＡプレートの別個のウェル上にコーティングする。次いで、ウェルを吸引し、ＴＢＳＴで３回洗浄する。既知量のヘプシジン−２５（アッセイバッファー中で希釈された）を含有するヒト血清サンプルを、１００μｌ／ウェルで１時間室温にて加える。ウェルを吸引し、ＴＢＳＴで３回洗浄する。捕捉されたヘプシジンポリペプチドを、４０μＬ／ウェルの０．１％ギ酸を５分間室温にて加えることにより溶出する。溶出されたサンプルを収集し、Ｃ４ ＺｉｐＴｉｐ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、すなわち、フェムトモルからピコモルのタンパク質またはペプチドを理想的には２５，０００分子量から１００，０００分子量の範囲で精製しかつ濃縮するためのクロマトグラフィー媒体を敷き詰めた状態の１０μＬピペットチップ、を用いて濃縮する。１マイクロリットルの２分の１のサンプルをＭＡＬＤＩ標的上にスポットし、等量のマトリクス溶液（５０％アセトニトリル、アルファ−シアン−４−ヒドロキシ桂皮酸で飽和された０．１％ＴＦＡ）をサンプルに加える。サンプルを乾燥し、線形モードで操作される４７００ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析する。
【０１１９】
直前に上述したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメトリーを実質的に用いて行われた実験は、Ｍａｂ ３．２３がヘプシジン−２５に結合し、より低い程度でヘプシジン−２０に結合したことを示した（図１および２）。Ｍａｂ ３．２３は、検出可能なレベルのヘプシジン−２２（分子量２４３６Ｄａ）、ヘプシジン−２４（分子量２６７４Ｄａ）、またはプロヘプシジン（分子量６９２９Ｄａ）と結合することを示さなかった（当然ながら、試験された血清サンプルは期待量のヒトヘプシジンのこれらの形態を含むものと仮定する）。
【０１２０】
ヒト血清中のどのヘプシジン種がＭａｂ ５Ｅ８により結合されるかを決定するために、類似の実験を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメトリーを用いて行った。これらの実験は、Ｍａｂ ５Ｅ８がヒト血清中のヘプシジン−２５のみに結合したことを決定した（図３および４）。重要なことに、ヘプシジン−２０、ヘプシジン−２２、プロヘプシジン、または他のヘプシジン種のいずれも、再度Ｍａｂ ５Ｅ８に結合しなかった（血清サンプル中に予想通りヒトヘプシジンのこれらの種が存在していたものと仮定する）。
【０１２１】
したがって、Ｍａｂ ５Ｅ８またはそれら由来の抗体もしくは限定されないがＭａｂ ＯＨ４を含むそれらに関連する抗体を用いる免疫学的検定は、ヒトヘプシジン−２５（ヒト血清中のヘプシジンの活性な生理学的に関連した形態）に対して、高度に特異的かつ選択的である。特異性および／または選択性における更なる改善が、Ｍａｂ ５Ｅ８またはそれら由来の抗体もしくは限定されないがＭａｂ ＯＨ４を含むそれらに関連する抗体ならびにＭａｂ ３．２３、Ｍａｂ ３．１２またはそれら由来の抗体もしくはそれらに関連する抗体の使用を組み合わせた、ヒトヘプシジン−２５に対する免疫学的検定において期待されている。
【０１２２】
（実施例７ （抗体の直接標識を用いずに）ヒトヘプシジン−２５を測定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ）
サンドイッチＥＬＩＳＡを、（ｉ）標識した結合抗体を非標識のＯＨ４と置換すること、および（ｉｉ）ＯＨ４の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体を用いて間接的に検出することを除いて、実施例５のように行う。
【０１２３】
上述のようにサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるＭａｂ３．２３および非標識のＭａｂ ＯＨ４を用いて、ヒトヘプシジン−２５を、約０．２ｎｇ／ｍＬの感度にてヒト血清において選択的に検出した。
【０１２４】
（実施例８ ヒトヘプシジン−２５を測定するためのメソスケールディスカバリーサンドイッチ免疫アッセイ）
【０１２５】
ヒトヘプシジン−２５メソスケールディスカバリー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（ＭＳＤ）免疫アッセイを上述の試薬を用いて構築した。つまり、１ｍｇのＭａｂ ＯＨ４を、５０％のグリセロール中に希釈した市販のキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を用いてビオチン化し、必要となるまで−２０℃で保存した。ストレプトアビジンコーティングされかつブロックされたＥＬＩＳＡプレートのウェルを、２ｍｇ／Ｌの濃度にてビオチン化Ｍａｂ ＯＨ４とともに１時間インキュベートした。その後、ウェルを吸引し、ＴＢＳＴ（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４０、１ｍＬのＴｗｅｅｎ２０／Ｌを含む１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）で３回洗浄した。次に、１００μＬのヘプシジン標準（５０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４０、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍＬ／ＬのＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、および５ｍｍｏｌ／ＬのＥＧＴＡからなるアッセイバッファー中の種々の濃度の合成されたヘプシジン−２５タンパク質）を、較正曲線を生成するためにウェルに加えた。同時に、血清サンプルを、アッセイバッファー中で１：２０に希釈し、それらの個々のウェルに加え、ＥＬＩＳＡプレートを１時間室温にてインキュベートした。吸引後、ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬの１：１０００希釈のルテニウムで標識したＭａｂ ３．２３を１ｍｇ／ｍｌにてウェルに加えて、１時間室温にてインキュベートした。吸引後、ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、ウェルにわたって電圧を通し各ウェルからルテニウム電気化学発光を記録するＭＳＤリーダーを用いてＥＬＩＳＡプレートを発現させた。ＭＳＤソフトウェアおよびシグマプロット（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）バージョン８．０をＥＬＩＳＡの較正曲線におけるフィッティングのために用いた。
【０１２６】
ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイにおける抗体の最適なペアを、捕捉抗体としてＭａｂ ＯＨ４と、結合抗体としてＭａｂ ３．２３とがペアになるように決定した。合成ヘプシジン−２５タンパク質を１０μｇ／Ｌの濃度にて調製し、標準曲線を生成するために連続的に希釈した。図５に示すように、ＥＬＩＳＡは、許容可能なダイナミックレンジ、バックグラウンド、および感度を有することが見出された。ゼロ較正器からの３つの標準偏差評価に基づいて、免疫アッセイが、ＬＣ／ＭＳ型アッセイ（Ｍｕｒｐｈｙら（２００７））により測定される場合、ヒト血清ヘプシジン−２５のレベルの予め推定した測定値に基づいて、ヒト血清ヘプシジン−２５のレベルを測定するのに十分な感度以上を有するべきことを示す、０．０１μｇ／Ｌよりも良くなるように、免疫アッセイの感度を決定した。また、図２にグラフ化されたデータは、ヘプシジン−２０またはヘプシジン−２２が検出できないため、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイがヘプシジン−２５に対して選択的であることを示す。加えて、組み換え標準および実際のヒト血清サンプルに関する免疫アッセイ希釈曲線を平行になるように決定し、免疫アッセイは、ヒト血清サンプルについて優れた希釈直線性を示した（データは示さず）。
【０１２７】
ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイ法の選択性および感度を、上述した代表的なＬＣ／ＭＳアッセイ（Ｍｕｒｐｈｙら（２００７））と比較した。より具体的には、健常者および癌患者の混合物由来の５２個のヒト血清サンプルを、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイと、ヘプシジン−２５に対して特異的であることを示した上述したＬＣ／ＭＳアッセイ（Ｍｕｒｐｈｙら（２００７））の両方を用いて分析した。この比較からの結果は、ＭＳＤ免疫アッセイを用いて決定されたヘプシジン−２５の値が、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイがヒト血清サンプル中のヘプシジン−２５を特異的かつ選択的に測定することを裏付ける（データは示さず）、ＬＣ／ＭＳヘプシジン−２５アッセイの値（ｒ＝０．９８、ｐ＜０．００００１）と、非常に高度に相関したことを示した。
【０１２８】
ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイのいくつかのパラメーターを、ヒト血清サンプルを用いて評価した。より具体的には、凍結融解安定性を、４つの異なる血清サンプルを試験することにより評価した。これらの結果は、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイが、５回の凍結融解サイクル後であっても、一貫して８０〜１２０％のヘプシジン−２５の回収を有する凍結融解安定性を持つことを示した。凍結融解サイクルの個々の結果は、以下のとおりであった。サンプルＡの場合、それぞれ０．１６、０．１６、０．１７、０．１７、０．１７、および０．１７μｇ／Ｌ；サンプルＢの場合、それぞれ４．５、４．４、４．６、４．６、４．６、および４．４μｇ／Ｌ；サンプルＣの場合、それぞれ８．９、９．６、９．７、９．７、９．９、および９．６μｇ／Ｌ；サンプルＤの場合、それぞれ１５．１、１５．１、１５．４、１５．７、１５．４、および１５．４μｇ／Ｌ。ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイの正確性は、０．１６、４．５、および１５．１μｇ／Ｌの内因性ヘプシジン−２５を含有するヒト血清サンプルを用いて評価した。内部（ｉｎｔｒａ）アッセイ（ｎ＝２０）の正確性結果（ＣＶ）は、それぞれ上述のレベルにおいて、試験されたヘプシジン−２５の全濃度において許容可能な正確性を示す、３．４％、４．５％、および３．５％であった。
【０１２９】
ヒト血清に加えられた合成ヘプシジン−２５タンパク質の回収を評価するために、合成ヘプシジン−２５タンパク質を３つの異なるヒト血清サンプル（各サンプルは、非常に低い濃度の内因性ヘプシジン−２５を含有する）に、それぞれ２５０、２５、２．５、および０．２５μｇ／Ｌの濃度にて加えた。これらのサンプルを、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイを用いて分析した。平均（ＳＤ）結果は、試験されたヘプシジン−２５の全レベルにて８０〜１２０％の回収を示す、それぞれ２８７（６）μｇ／Ｌ、２４．２（０．２）μｇ／Ｌ、２．０（０．１）μｇ／Ｌ、および０．２３（０．０１）μｇ／Ｌであった。
【０１３０】
ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイの標準範囲は、正常な健康の志願者（５０人の男性および５０人の女性）からの１００個の血清サンプルを実施することにより確定した。これらサンプルのヘプシジン−２５の値の範囲は、０．０２μｇ／Ｌ〜２５μｇ／Ｌであり、平均値は３．０±０．５μｇ／Ｌであり、ＬＣ／ＭＳアッセイを用いる正常なヒトにおいて予め報告されたヘプシジン−２５のレベルと一致した（ＭｕｒｐｈｙらＢｌｏｏｄ，１１０：１０４８−５４（２００７）を参照）。
【０１３１】
興味深いことに、正常なヒト対象におけるヘプシジン−２５のレベルは、男性（４．２±０．８μｇ／Ｌ）と比較して女性（１．８±０．４μｇ／Ｌ）の方が有意に（ｐ＜０．０１）低いことが見出された。また、これらの正常な対象におけるヘプシジン−２５のレベルは、血清フェリチン濃度と比較したところ、血清フェリチンレベル（ｒ＝０．７１，ｐ＜０．００１）（データは示さず）と直接相関していることが見出された。
【０１３２】
最後に、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイによりそれぞれ決定された、癌患者（ｎ＝３４）の血清におけるヘプシジン−２５のレベルを、正常な健康の志願者（ｎ＝１００）の血清におけるヘプシジン−２５のレベルと比較した。この比較結果は、ヘプシジン−２５のレベルが正常なコントロール（３．０±０．５μｇ／Ｌ）（データは示さず）と比較して、癌を有する患者において有意に（ｐ＜０．００１）上昇した（７０．９±１０．４μｇ／Ｌ）ことを示した。興味深いことに、血液学的悪性腫瘍（８３．３±１１．９μｇ／Ｌ）および非血液学的悪性腫瘍（５８．４±１７μｇ／Ｌ）の両方を有する患者コホートは、正常なコントロール（両方についてｐ＜０．００１）と比較して、それぞれ有意にヘプシジン−２５のレベルを上昇させたことを示し、これは、上昇したヘプシジン−２５のレベルが癌関連貧血において重要な役割を担い得ることを示唆し得る（データは示さず）。
【０１３３】
ヘプシジン−２５に対して非特異的でありかつプロヘプシジンおよび他の非関連ヘプシジン種と交差反応し得る、既知のＥＬＩＳＡ法と比較して、本明細書において開示されたＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイは、ヒト血清において特異的かつ選択的にヘプシジン−２５のレベルを測定し、上述したヘプシジン−２５についての代表的な方法であるＬＣ／ＭＳアッセイとよく相関する。ヒト血清ヘプシジンのレベルを測定するためのＬＣ／ＭＳ型法を超えるＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイの１つの利点とは、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイが、ほとんどの臨床検査室において実施できることである。これは、一般的に複雑な実験や高度に専門化された操作者の専門知識がＬＣ／ＭＳ型アッセイを慣例的に行うのに必要とされるが、本ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイがどちらも必要としないことによる。加えて、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイは、ＬＣ／ＭＳアッセイよりも非常に高度にハイスループットである可能性を有するはずである。したがって、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイは、ヒト対象におけるヘプシジン−２５のレベルを選択的に測定するよう慣例的に、臨床的に利用され得る方法を提供する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬分野、特にヒトヘプシジン−２５に対する抗体の分野である。より具体的には、本発明は、抗ヘプシジン−２５選択的抗体を、それを必要とする患者に投与することによる、貧血などの特定の疾患の治療に関する。本発明はさらに、ヘプシジン−２５を検出および／または高レベルのヘプシジン−２５によって特徴付けられる疾患状態を診断するための方法ならびにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞によって主に発現されるポリペプチドである、ヒトヘプシジンは、腸からの鉄吸収、マクロファージによって再利用する鉄、および肝臓の鉄貯蔵からの鉄動員を負に調節する重要な鉄調節タンパク質であると考えられている。ヘプシジンの過剰生産は、貧血の病態生理および／または慢性疾患の貧血において重要な役割を果たすように見える。
【０００３】
現在、貧血および／または慢性疾患の貧血のための適切かつ効果的な治療は限定されている。特に、エリスロポエチン投与が、全ての患者の約５０％のみに効果的であり、望ましくない副作用に関連する。さらに、輸血は、汚染、感染および鉄過剰負荷のために望ましくない。
【０００４】
ヒトヘプシジンは、典型的なＮ末端の２４アミノ酸の小胞体標的シグナル配列、およびコンセンサスのフリン切断部位を有する３５アミノ酸のプロ領域、直後にＣ末端の２５アミノ酸の生物活性鉄調節ホルモンを含む８４アミノ酸プレプロペプチド（ヘプシジン−２５、配列番号１）としてコードされる。ヘプシジン−２０（例えばヒトに関して、配列番号１のアミノ酸６〜２５）およびヘプシジン−２２（例えばヒトに関して、配列番号１のアミノ酸４〜２５）などのヘプシジンの様々なＮ末端切断型もまた、インビボにおいて形成することが知られている。しかしながら、ヘプシジン−２５は、（これのみではないが）ヒトにおけるヘプシジンの大部分の生理学的に関連した形態であると考えられる。前駆体または切断型とは対照的に、ヘプシジン−２５の濃度を選択的に調節する治療が特に望まれる。特に、前駆体または切断型とは対照的にヘプシジン−２５に選択的に結合する抗体は、高レベルのヘプシジン−２５に関連する障害の治療または診断において多くの利点を与える。例えば、非選択的ヘプシジン抗体と比較して、高親和性のヘプシジン−２５選択的抗体は、ヘプシジンの生理学的に関連しない形態に治療抗体が結合しないため、副作用の危険性を減少させ、有効な治療に必要とされる臨床用量は、より低くなる。ヘプシジンに対する非ヒトポリクローナルおよびモノクローナル抗体は以前に報告されている（例えば、特許文献１、特許文献２および特許文献３を参照のこと）が、ヘプシジン−２５に選択的に結合するモノクローナル抗体についての重要な必要性が当該技術分野において依然として存在する。従って、本発明の一態様は、ヘプシジン−２５を含むアミノ酸１〜７内のヒトヘプシジン−２５に選択的に結合する抗体の提供である。そのような抗体は、貧血などの疾患、状態または障害を治療するために、ヒトにおける血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるのに有用である。
【０００５】
さらに、ヘプシジンについての既存の免疫学的検定は、活性な生理学的に関連するヘプシジン−２５と不活性な生理学的に関連しないヘプシジン種とを区別しない（例えば非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３を参照のこと）。現在、ヘプシジン−２５についての選択的アッセイに一般に利用可能な唯一の方法は、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）または種々のヘプシジンの形態の分離を必要とする同様の煩雑な方法を含む（例えば非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６を参照のこと）。それらのアッセイは正確かつ精密であり得るが、必要とされるそれらの複雑性、費用、および高いレベルの操作者の専門知識により、それらの慣用の実施が妨げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／００１９３３９号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／０２２４１８６号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８／０２１３２７７号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｅｍｎａ，Ｅ．Ｈ．ら，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２００８年，９３（１），ｐ．９０−７
【非特許文献２】Ｒｏｅ Ｍ．Ａ．ら，Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ．，２００７年，９７，ｐ．５４４−９
【非特許文献３】Ｌｕｕｋｋｏｎｅｎ Ｓ．およびＰｕｎｎｏｎｅｎ Ｋ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ｌａｂ Ｍｅｄ．，２００６年，４４，１３６１−２
【非特許文献４】Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｊ．Ａ．ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００５年，３８，Ｓ１３−Ｓ１７
【非特許文献５】Ｍｕｒｐｈｙら，Ｂｌｏｏｄ，２００７年，１１０，ｐ１０４８−５４
【非特許文献６】Ｋｅｍｎａ，Ｅ．Ｈ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２００７年，５３，ｐ６２０−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、ヘプシジン−２５の検出または測定のための免疫学的検定におけるそれらの適用のための高親和性でヒトヘプシジン−２５に選択的に結合する抗体についての重要な必要性も存在する。従って、本発明の別の態様は、哺乳動物組織および生体液中のヘプシジン−２５の検出および測定のための比較的簡単で、さらに高度に感受性があり、強力で、選択的な免疫学的検定においてヘプシジン−２５選択的抗体を用いる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ヘプシジン−２５を含むアミノ酸１〜７内のヒトヘプシジン−２５に選択的に結合する抗体を提供する。一実施形態において、本発明の抗体は、関連する前駆体および切断ポリペプチドとは対照的に、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに選択的に結合し、（ｉ）配列番号９、１０、１１、３２、３３および３４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｉｉ）配列番号１２、１３、１４、３５、３６および３７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｉｉｉ）配列番号４５、１３、１４、３５、３６および３７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｉｖ）配列番号１２、１３、１４、３８、３６および３７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｖ）配列番号１５、１０、１６、３９、４０および４１にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｖｉ）配列番号２０、２１、２２、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｖｉｉ）配列番号２０、２１、２３、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｖｉｉｉ）配列番号２４、２５、２３、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；（ｉｘ）配列番号２６、２５、２７、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３；ならびに（ｘ）配列番号２６、２５、２８、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３からなる群より選択される６つのＣＤＲを含む。
【００１０】
別の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトヘプシジン−２５、すなわち配列番号１のＤＴＨＦＰＩＣまたは齧歯動物ヘプシジン−２５（配列番号２もしくは３）のＤＴＮＦＰＩＣを含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに結合する。好ましくは、本発明の抗体は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」）ポリペプチドおよび重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」）ポリペプチドを含み、ここで、（ｉ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号４８および４９に示すアミノ酸配列を有するか；（ｉｉ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５０および５１に示すアミノ酸配列を有するか；（ｉｉｉ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５２および５１に示すアミノ酸配列を有するか；（ｉｖ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号５３および５４に示すアミノ酸配列を有するか；（ｖ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号５５および５６に示すアミノ酸配列を有するか；（ｖｉ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号５９および５８に示すアミノ酸配列を有するか；（ｖｉｉ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号６０および５８に示すアミノ酸配列を有するか；（ｖｉｉｉ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号６１および５８に示すアミノ酸配列を有するか；（ｉｘ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号６２および５８に示すアミノ酸配列を有するか；または（ｘ）ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ配列番号６３および５８に示すアミノ酸配列を有する。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、本発明の抗体をコードする単離された核酸分子；必要に応じて、ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結された、本発明の抗体をコードする核酸分子を含むベクター；本発明の抗体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞；本発明の抗体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、それによって、核酸が発現する工程、および必要に応じて、宿主細胞培地から抗体を回収する工程を含む本発明の抗体を産生するためのプロセスを提供する。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、本発明の抗体および薬理学的に許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、医薬組成物は、本発明のモノクローナル抗体の均一または実質的に均一な集団および薬理学的に許容可能な担体または希釈剤を含む。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、治療に使用するための成熟ヒトヘプシジンに選択的に結合するヒト遺伝子操作モノクローナル抗体を提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象における貧血を治療または予防する際に使用するための成熟ヒトヘプシジンに選択的に結合するヒト遺伝子操作モノクローナル抗体を提供する。
【００１５】
本発明はまた、医薬の調製のための成熟ヒトヘプシジンに選択的に結合するヒト遺伝子操作モノクローナル抗体の使用を具現化する。本発明はさらに、動物、好ましくは哺乳動物種、より好ましくはヒト対象における血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるための方法において成熟ヒトヘプシジンに選択的に結合するヒト遺伝子操作モノクローナル抗体の使用を具現化する。
【００１６】
本発明はさらに、血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる方法を提供し、その方法は、それを必要とするヒト対象に、成熟ヒトヘプシジンに結合する有効量のヒト遺伝子操作モノクローナル抗体を投与する工程を含む。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、限定されないが、貧血、例えば感染、炎症、慢性疾患および／または癌に起因する貧血を含む、血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットの増加から利益を受ける、ヒト対象における疾患、状態または障害を治療するための方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、哺乳動物から得られる組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−２５の量を測定するための方法を提供し、その方法は、以下の工程：（ｉ）前記動物から組織または生体液のサンプルを得る工程；（ｉｉ）前記サンプルを、ヘプシジン−２５選択的抗体またはそのフラグメントと接触させる工程；および（ｉｉｉ）定量的、半定量的または定性的手段によって、直接的または間接的に前記サンプル中のヘプシジン−２５の量を検出する工程を含む。
【００１９】
別の実施形態において、本発明の抗体は、哺乳動物から得た組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−２５タンパク質の量を定量化するのに有用であり、（ｉ）固体支持体を、配列番号１、配列番号３（マウス５〜２５）または配列番号２（ラット５〜２５）を含むアミノ酸５〜２５内に含まれるエピトープに結合する一次抗体でコーティングする工程；（ｉｉ）前記哺乳動物から組織または生体液の試験サンプルを得る工程；（ｉｉｉ）試験サンプルを、抗体でコーティングされた固体支持体に付与する工程；（ｉｉｉ）任意のヘプシジンの存在により、ヘプシジン−一次抗体が結合するための適切な条件下でヘプシジン−一次抗体複合体を形成させる工程；（ｉｖ）未結合のサンプルを除去する工程；（ｖ）ヒトまたは齧歯動物ヘプシジン−２５、すなわちそれぞれＤＴＨＦＰＩＣまたはＤＴＮＦＰＩＣを含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに結合する二次抗体を、固体支持体に付与する工程；（ｖｉ）任意のヘプシジン−２５の存在により、任意のヘプシジン−２５−一次抗体複合体に結合する二次抗体のための適切な条件下で二次抗体−ヘプシジン−２５−一次抗体複合体を形成させる工程；（ｖ）未結合の二次抗体を除去する工程；ならびに（ｖｉ）二次抗体の存在または非存在を検出する工程を含む。二次抗体の存在または非存在は、直接的または間接的のいずれかで検出されてもよく、定量的、半定量的、または定性的に測定されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、抗ヘプシジン−２５選択的Ｍａｂ ３．２３を用いてヒト血清から免疫沈降したヒトヘプシジンの形態のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。シグナル１は、インタクトなヒトヘプシジン−２５の予想される質量と一致する質量（およそ２７９０ダルトン（Ｄａ）の分子量（ＭＷ））を有する。シグナル２は、インタクトなヒトヘプシジン−２０の予想される質量と一致する質量（２１９２ＤａのＭＷ）を有する。クロマトグラムが示すように、抗ヘプシジン−２５ Ｍａｂ３．２３は、検出可能な量のヘプシジン−２５および非常に少ない量のヘプシジン−２０に結合した。Ｍａｂ ３．２３は、検出可能なレベルのヘプシジン−２２（ＭＷ ２４３６Ｄａ）、ヘプシジン−２４（ＭＷ ２６７４Ｄａ）またはプロヘプシジン（ＭＷ ６９２９ Ｄａ）に結合するように見えなかった。マススペクトルは、以下の実施例６に本質的に記載されるサンプルマトリクスとしてａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ペプチドマトリクス）を用いる、陽イオン、線形モード法を利用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で生成された。
【図２】図２は、関連領域（ＭＷ ２０００〜３０００Ｄａ）における図１に示すマススペクトルの拡大図を示す。クロマトグラムが示すように、Ｍａｂ ３．２３は、ヘプシジン−２５（シグナル１）に結合し、非常に少ない程度でヘプシジン−２０（シグナル２）に結合した。抗ヘプシジン選択的Ｍａｂ ３．２３は、検出可能なレベルのヘプシジン−２２（ＭＷ ２４３６Ｄａ）またはヘプシジン−２４（ＭＷ ２６７４Ｄａ）に結合するように見えなかった。
【図３】図３は、抗ヘプシジン−２５選択的Ｍａｂ ５Ｅ８を用いてヒト血清から免疫沈降されたヒトヘプシジンの形態のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを示す。シグナル１は、インタクトなヒトヘプシジン−２５（２７９０Ｄａ）の予想される質量と一致する質量を有する。クロマトグラムが示すように、抗ヘプシジン−２５ Ｍａｂ ５Ｅ８は、検出可能な量のヘプシジン−２５のみに結合した。マススペクトルは、以下の実施例６に本質的に記載されるサンプルマトリクスとしてａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ペプチドマトリクス）を用いる、陽イオン、線形モード法を利用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で生成された。
【図４】図４は、関連領域（ＭＷ ２０００〜３０００Ｄａ）における図１に示すマススペクトルの拡大図を示す。クロマトグラムが示すように、Ｍａｂ ５Ｅ８は、検出可能な量のヘプシジン−２５（シグナル１）に結合した。Ｍａｂ ５Ｅ８は、検出可能なレベルのヘプシジン−２０（２１９２ＤａのＭＷ）、ヘプシジン−２２（２４３６ＤａのＭＷ）、ヘプシジン−２４（２６７４ＤａのＭＷ）、またはプロヘプシジン（６９２９ＤａのＭＷ）に結合しなかった。
【図５】図５は、１０μｇ／Ｌ（１０ｎｇ／ｍＬ）の濃度で開始する合成されたヘプシジン−２５（黒丸）を連続希釈し、実施例８に記載されるＭＳＤ免疫学的検定を実施することによって生成されたヘプシジン−２５についての検量線のグラフを示す。ＭＳＤ免疫学的検定はヘプシジン−２５に特異的であり、ヘプシジン−２０（黒三角）またはヘプシジン−２２（白丸）を認識しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の略語が本明細書中で使用される：ＡＣＮ：アセトニトリル、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＤＴＴ：ジチオスレイトール、ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法、ＩＭＡＣ：固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、ＩＰＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、Ｍａｂ：モノクローナル抗体、Ｍａｂｓ：複数のモノクローナル抗体、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＳＰＲ：表面プラズモン共鳴、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸。この文献に使用される全てのアミノ酸の略語は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２（Ｂ）（２）に記載されるように米国特許商標局によって受容されているものである。
【００２２】
本発明は、ヘプシジン−２５を含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープを標的化することによってヘプシジン−２５に選択的に結合する抗体を提供する。そのような抗体は、貧血などの疾患、状態または障害の治療のために、ヒトにおける血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるのに有用である。さらに、本発明は、哺乳動物の組織および生体液におけるヘプシジン−２５の検出および／または測定のために、比較的簡単で、さらに高度に感受性があり、選択的な免疫学的検定において、そのような抗体を使用する方法を提供する。
【００２３】
本明細書に使用される場合、用語「ヘプシジン」とは、哺乳動物において存在することが知られているヘプシジンタンパク質の任意の形態を指す。本明細書に使用される場合、用語「成熟ヘプシジン」とは、哺乳動物において発現されるヘプシジンタンパク質の任意の成熟な生物学的形態を指す。本明細書に使用される場合、用語「ヒトヘプシジン」とは、ヒトに存在するヘプシジンタンパク質の任意の形態を指す。本明細書に使用される場合、用語「ヒトヘプシジン−２５」とは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するヒトヘプシジンの成熟形態を指す。
【００２４】
抗体の一般構造は当該技術分野において非常に周知である。ＩｇＧタイプの抗体に関して、鎖内および鎖間ジスルフィド結合によって架橋される４つのアミノ酸鎖（２つの「重」鎖および２つの「軽」鎖）が存在する。特定の生物学的系において発現される場合、未修飾のヒトＦｃ配列を有する抗体は、Ｆｃ領域においてグリコシル化される。抗体は同様に他の位置においてグリコシル化され得る。抗体のサブユニット構造および三次元配置は当該技術分野において周知である。各々の重鎖は、Ｎ末端の重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」）および重鎖定常領域（「ＨＣＣＲ」）から構成される。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡに関して３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）；ならびにＩｇＭおよびＩｇＥに関して４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）から構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中で「ＬＣＶＲ」）および軽鎖定常領域（「ＬＣＣＲ」）から構成される。
【００２５】
各々の軽／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存される散在した領域に細分され得る。各々のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に並ぶ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。本明細書中で、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３」と呼ばれ、軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３」と呼ばれる。ＣＤＲは抗原と特異的相互作用を形成する大部分の残基を含む。各ドメインに対するアミノ酸の指定は、周知の慣用法に従う（例えば、Ｋａｂａｔ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。
【００２６】
本発明の抗体は、免疫グロブリンクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）のいずれかから選択される重鎖定常領域を有し得る。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトまたはマウスＩｇＧ Ｆｃ領域に由来する定常領域を含む。
【００２７】
用語「モノクローナル抗体」とは、例えば任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む、単一のコピーまたはクローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法ではない。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、均一または実質的に均一の集団中に存在する。
【００２８】
本発明の抗体はインタクトであり得る。すなわち、任意の短縮形態が抗原結合部分を含み、抗原結合能力を保有する場合、そのような抗体のＦｃ領域、または一部もしくはフラグメントを含む、完全または十分な長さの定常領域を含む。そのような短縮形態としては、例えば、開示される抗ヘプシジン−２５選択的抗体のＣＤＲまたは可変領域を含むＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。さらに、そのような短縮形態の抗体は、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲをコードするＤＮＡとリンカー配列とを結合することによって産生され得る一本鎖Ｆｖフラグメントであり得る（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ２６９−３１５，１９９４を参照のこと）。フラグメントまたは部分が指定されているか否かに関わらず、本明細書に使用される用語「抗体」は、他に示されない限り、そのようなフラグメントまたは部分および一本鎖形態を含む。タンパク質部分またはタンパク質フラグメントが、ヘプシジン−２５に選択的に結合し、インビボまたはインビトロにおける哺乳動物のヘプシジン−２５の１つ以上の生物活性特性を中和する能力を保有する限り、それは用語「抗体」に含まれる。
【００２９】
本発明の抗体は、当該技術分野において周知の技術、例えば組み換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術またはそのような技術の組み合わせあるいは当該技術分野において容易に知られる他の技術を用いて産生され得る（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４５：１６２８−５０（１９９９）およびＦｅｌｌｏｕｓｅ，Ｆ．Ａ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３７３（４）：９２４−４０（２００７）を参照のこと）。
【００３０】
以下の表１および表２は本発明の抗体についての好適なＣＤＲを示す。
【００３１】
【表１】
＊Ｘ１はＶまたはＡであり、Ｘ２はＹまたはＳであり、Ｘ３はＮまたはＨであり、Ｘ４はＮ、ＧまたはＹであり、Ｘ５はＳ、ＲまたはＰであり、Ｘ６はＳまたはＰであり、Ｘ７はＶ、Ｈ、ＩまたはＦであり、Ｘ８はＴまたはＶである。
【００３２】
【表２】
＊Ｘ９はＦ、ＹまたはＬであり、Ｘ１０はＳまたはＮであり、Ｘ１１はＴまたはＳであり、Ｘ１２はＹまたはＰであり、Ｘ１３はＩまたはＦであり、Ｘ１４はＶ、またはＩであり、Ｘ１５はＤまたはＧであり、Ｘ１６はＡまたはＮであり、Ｘ１７はＳまたはＹであり、Ｘ１８はＡまたはＴであり、Ｘ１９はＧまたはＨであり、Ｘ２０はＳまたはＮであり、Ｘ２１はＴまたはＳであり、Ｘ２２はＳ、ＡまたはＹである。
【００３３】
本発明は、限定されないが、
ａ）以下を含む軽鎖可変領域；
ｉ）配列番号６、９、１２、４５、１５、１７、２０、２４および２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１；
ｉｉ）配列番号７、１０、１３、１８、２１および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２；および
ｉｉｉ）配列番号８、１１、１４、１６、１９、２２、２３、１７および２８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３；ならびに
ｂ）以下を含む重鎖可変領域；
ｉ）配列番号２９、３２、３５、３８、３９および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１；
ｉｉ）配列番号３０、３３、３６、４０および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２；および
ｉｉｉ）配列番号３１、２４、２７、４１および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、
を含む抗体を含む。
【００３４】
あるいは、本発明の好適な抗体は、
ａ）以下を含むＬＣＶＲ；
ｉ）配列番号９、１２、２０および２６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１；
ｉｉ）配列番号１０、１３、２１および２５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２；および
ｉｉｉ）配列番号１１、１４、２３および２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３；ならびに
ｂ）以下を含むＨＣＶＲ；
ｉ）配列番号３２、３５および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１；
ｉｉ）配列番号３３、３６および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２；および
ｉｉｉ）配列番号３４、３７および４４に示すアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、
を含む。
【００３５】
本発明の別の好適な抗体は、配列番号２０、２１、２２、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３６】
本発明の別の好適な抗体は、配列番号２６、２５、２８、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３７】
本発明の別の好適な抗体は、配列番号２４、２５、２３、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３８】
本発明のより好適な抗体は、配列番号２６、２５、２７、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００３９】
本発明のさらにより好適な抗体は、配列番号９、１０、１１、３２、３３および３４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００４０】
本発明のさらにより好適な抗体は、配列番号１２、１３、１４、３５、３６および３７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００４１】
本発明のさらにより好適な抗体は、配列番号４５、１３、１４、３５、３６および３７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００４２】
本発明の最も好適な抗体は、配列番号２０、２１、２３、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００４３】
本発明の最も好適な抗体は、配列番号１２、１３、１４、３８、３６および３７にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００４４】
本発明の最も好適な抗体は、配列番号１５、１０、１６、３９、４０および４１にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。
【００４５】
本発明の好適な抗体は、配列番号４６、４８、５０、５２、５３、５５、５７、５９、６０、６１、６２および６３からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。本発明の別の好適な抗体は、配列番号４７、４９、５１、５４、５６および５８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。本発明の別の好適な抗体は、配列番号５９のＬＣＶＲおよび配列番号５８のＨＣＶＲを含む。本発明の別の好適な抗体は、配列番号６０のＬＣＶＲおよび配列番号５８のＨＣＶＲを含む。本発明の別の好適な抗体は、配列番号６１のＬＣＶＲおよび配列番号５８のＨＣＶＲを含む。本発明の別の好適な抗体は、配列番号６２のＬＣＶＲおよび配列番号５８のＨＣＶＲを含む。本発明の別の好適な抗体は、配列番号６３のＬＣＶＲおよび配列番号５８のＨＣＶＲを含む。本発明の最も好適な抗体は、配列番号４８のＬＣＶＲおよび配列番号４９のＨＣＶＲを含む。本発明の別の最も好適な抗体は、配列番号５５のＬＣＶＲおよび配列番号５６のＨＣＶＲを含む。このようなＬＣＶＲは、好ましくは、軽鎖または重鎖定常領域に連結される。
【００４６】
本発明の好適なモノクローナル抗体は、本明細書中で４Ｃ１１、１Ｇ８、１Ｂ４、１Ｅ３、３Ａ９、２、５Ｅ８、ＯＢ３、ＯＢ１、ＯＨ４およびＯＥ１と称される。Ｍａｂｓ ４Ｃ１１、１Ｇ８、１Ｂ４、１Ｅ３、３Ａ９、５Ｅ８、ＯＢ３、ＯＢ１、ＯＨ４、ＯＥ１、３．１２、３．２３および／またはその種々のフラグメントをコードするアミノ酸配列の配列番号を、以下の表３に提供する。
【００４７】
【表３】
【００４８】
用語「エピトープ」とは、抗体の抗原結合領域の１つ以上において抗体によって認識され、結合され得る分子の部分を指す。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。好ましくは、本発明の抗体は、成熟ヘプシジンのＮ末端でエピトープに結合する。より好ましくは、本発明の抗体は、ヘプシジン−２５を含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに結合する。より好ましくは、本発明の抗体は、ヒトヘプシジン−２５のＮ末端に結合する。さらにより好ましくは、本発明の抗体は、ヒトヘプシジン−２５を含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに結合する。最も好ましくは、本発明の抗体は、配列番号１のアミノ酸ＤＴＨＦＰＩＣ内に含まれるエピトープに結合する。
【００４９】
本明細書に使用される場合、用語「結合親和性（ＫＤ）」は、特定の抗原−抗体相互作用の解離速度を指すことが意図される。ＫＤは、解離速度、いわゆる「オフレート（ｋｏｆｆ）」と、会合速度、すなわち「オンレート（ｋｏｎ）」との比である。従って、ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎと等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。ＫＤが小さくなれば、結合親和性は強くなるということになる。従って、１μＭのＫＤは、１ｎＭのＫＤと比べて弱い結合親和性を示す。ＫＤ値は、当該技術分野において公知の方法によって得られ得る。
【００５０】
本明細書に使用される場合、本発明の抗ヘプシジン−２５抗体に対して言及される用語「選択的」とは、抗体が、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、同じ哺乳動物種に存在するヘプシジン−２５の少なくとも１つの前駆体型および／またはヘプシジン−２５の少なくとも１つのＮ末端切断型に結合するより、約１０００倍、５００倍、２００倍、１００倍、５０倍、１０倍または約５倍低いＫＤでヘプシジン−２５に結合する抗体を指す。さらに、または代替的に、本明細書の以下の実施例４〜８に記載される免疫学的検定および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によってアッセイされる場合、本発明のヘプシジン−２５選択的抗体はヘプシジン−２５に結合するが、哺乳動物種に存在するヘプシジン−２５の少なくとも１つの前駆体型および／またはヘプシジン−２５の少なくとも１つのＮ末端切断型に結合しないか、またはごくわずかしか結合しない。好ましくは、ヘプシジン−２５の前駆体型はプロヘプシジンであり、より好ましくはヒトプロヘプシジンであり、最も好ましくは配列番号９０に示すアミノ酸配列からなるヒトプロヘプシジンである。好ましくは、ヘプシジン−２５のＮ末端切断型は、ヒトヘプシジン−２０（すなわち配列番号１のアミノ酸６〜２５）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号１のアミノ酸４〜２５）である。
【００５１】
用語「検出する」または「検出」は、標的分子の定量的、半定量的または定性的測定を含むように広範囲の意味で使用される。一態様において、本明細書に記載される方法は、生物学的サンプル中の特定のヘプシジンポリペプチドの存在または非存在を決定するだけであってもよく、これによって、ヘプシジンポリペプチドは、上記の方法によってアッセイされる場合、サンプル中で検出可能であるか、または検出不能である。
【００５２】
本発明の抗体に言及される用語「生物活性」は、限定されないが、エピトープまたは抗原結合親和性、インビボおよび／またはインビトロでの抗体の安定性、例えばヒト対象に投与される場合、抗体の免疫特性、ならびに／あるいは限定されないが炎症の動物モデル、例えばＩＬ−６により誘発される炎症チャレンジアッセイにおける血清鉄レベル異常調節の阻害を含む、インビボもしくはインビトロにおけるヘプシジン−２５の生物学的活性を中和または拮抗する能力を含む。上述の性質または特性は、限定されないが、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫学的検定（ＩＧＥＮ）、蛍光消光、蛍光ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、限定されないがＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーを用いるＳＰＲ解析を含むＳＰＲ解析、制限のないインビトロおよびインビボでの中和アッセイを含む、当該技術分野で認識されている技術を用いて観察または測定され得る（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第２００６／０６２６８５号を参照のこと）。
【００５３】
ヘプシジンに言及される用語「生物活性」は、限定されないが、その受容体のフェロポーチンを含む、限定されないが、別のタンパク質に対するヘプシジンの特異的結合、ヘプシジンにより誘発されるフェロポーチンの内在化および／または分解などのヘプシジンの１つ以上のフェロポーチンにより媒介される機能（例えば、Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．ら，Ｈｅｐｃｉｄｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｉｒｏｎ Ｅｆｆｌｕｘ ｂｙ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ ａｎｄ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｉｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６，２０９０−２０９３（２００４）を参照のこと）、フェロポーチンにより媒介される鉄排出のヘプシジン調節、ヒトにおける血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットのヘプシジンにより誘発される減少、タンパク質安定性、すなわちヘプシジンにより影響を受けるインビボまたはインビボでの別のタンパク質のレベルまたは活性、ならびにヘプシジンの発現レベルおよび／または組織分布を含む。
【００５４】
本明細書に使用される場合、本発明の抗体の生物活性に対して言及される用語「阻害する」または「中和する」とは、限定されないが、ヒト、ラットまたはマウスのヘプシジン−２５の生物活性を含む、ヘプシジンの生物活性を実質的に拮抗し、妨げ、防ぎ、抑制し、遅延し、分解し、除去し、停止し、減少し、または反転する抗体の能力を意味する。
【００５５】
用語「対象」および「患者」は、本明細書で交換可能に使用され、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。特定の実施形態において、患者は、ヘプシジンの減少されたレベル、ヘプシジン生物活性の減少、および／または血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットの増加から利益を受ける疾患、障害、または状態を有する。
【００５６】
本明細書に使用される場合、抗体とヘプシジンポリペプチドとの間の結合に対して言及される用語「特異的に結合する」とは、抗体が、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約５００ｎＭ未満のＫＤでヘプシジンポリペプチドに結合することを意味する。
【００５７】
一実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約８００ｐＭ未満の、ヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有する。好ましくは、本発明の抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンポリペプチドに特異的に結合する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および４）に特異的に結合する。
【００５８】
一実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約８００ｐＭ未満の、ヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有し、ｉ）抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、少なくとも約２００倍、約１００倍、約５０倍、約１０倍、または約５倍高い、ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対するＫＤを有するか、あるいはｉｉ）ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対する抗体の結合は、実施例４〜７に記載される免疫学的検定および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって検出可能でないか、またはごくわずかしか検出できない。好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンポリペプチドに特異的に結合する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号２および３）に特異的に結合する。
【００５９】
別の実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有し、ｉ）抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、少なくとも約２００倍、約１００倍、約５０倍、約１０倍、または約５倍高い、ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対するＫＤを有するか、あるいはｉｉ）ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対する抗体の結合は、実施例４〜７に記載される免疫学的検定および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって検出可能でないか、またはごくわずかしか検出できない。好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンポリペプチドに特異的に結合する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に特異的に結合する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および２）に特異的に結合する。
【００６０】
一実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満または約８００ｐＭ未満の、ヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有する。好ましくは、本発明の抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンポリペプチドに対して約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに対して約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に対して約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および２）に対して約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。
【００６１】
別の実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有する。好ましくは、本発明の抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンに対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および２）に対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。
【００６２】
一実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約８００ｐＭ未満の、ヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有し、ｉ）抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、少なくとも約２００倍、約１００倍、約５０倍、約１０倍または約５倍高い、ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対するＫＤを有するか、あるいはｉｉ）ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対する抗体の結合は、実施例４〜７に記載される免疫学的検定および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって検出可能でないか、またはごくわずかしか検出できない。好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンポリペプチドに対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および２）に対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫｄを有する。
【００６３】
別の実施形態において、本発明の抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のヒトヘプシジン−２５（配列番号１）に対するＫＤを有し、ｉ）抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、少なくとも約２００倍、約１００倍、約５０倍、約１０倍または約５倍高い、ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対するＫＤを有するか、あるいはｉｉ）ヒトプロヘプシジン、ヒトヘプシジン−２０（配列番号８８）またはヒトヘプシジン−２２（配列番号８９）に対する抗体の結合は、実施例４〜７に記載される免疫学的検定および／またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって検出可能でないか、またはごくわずかしか検出できない。好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、非ヒト哺乳動物種の少なくとも１つの成熟ヘプシジンポリペプチドに対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。より好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウス、ラットおよびカニクイザルのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３、２および４）からなる群より選択される少なくとも１つのヘプシジン−２５ポリペプチドに対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、カニクイザルのヘプシジン−２５（配列番号４）に対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。さらにより好ましくは、抗体はまた、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、マウスおよび／またはラットのヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および２）に対して、約１００ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約８００ｐＭの間、約５０ｎＭ〜約１ｎＭの間、または約３５ｎＭ〜１ｎＭの間のＫＤを有する。
【００６４】
（抗体発現）
標準的な分子生物学技術が、組み換え発現ベクターを調製するため、宿主細胞をトランスフェクトするため、形質転換体を選択するため、本発明の抗体を産生する宿主細胞株を単離するため、それらの宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収するために使用される。
【００６５】
本発明はまた、本発明の抗ヘプシジン抗体を発現する宿主細胞に関する。当該技術分野において公知の多種多様の宿主発現系は、原核生物（細菌）および真核生物発現系（酵母、バキュロウイルス、植物、哺乳動物および他の動物細胞、トランスジェニック動物、およびハイブリドーマ細胞など）、ならびにファージディスプレイ発現系を含む、本発明の抗体を発現させるために使用され得る。
【００６６】
本発明の抗体は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の組み換え発現によって調製され得る。抗体を組み換えて発現するために、宿主細胞は、抗体の免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを保有する１つ以上の組み換え発現ベクターで形質転換、形質導入、感染などをされ、それによって、軽鎖および／または重鎖が宿主細胞中に発現される。重鎖および軽鎖は、それらが１つのベクター中で作動可能に連結される異なるプロモーターから独立して発現され得るか、または重鎖および軽鎖は、それらが２つのベクター（１つが重鎖を発現し、もう１つが軽鎖を発現する）中で作動可能に連結される異なるプロモーターから独立して発現され得る。必要に応じて、重鎖および軽鎖は異なる宿主細胞で発現されてもよい。
【００６７】
宿主細胞はまた、従来の技術によって、インタクトな抗体の部分またはフラグメント、例えばＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子を産生するために使用され得る。例えば、本発明の抗体の軽鎖または重鎖のいずれかをコードするＤＮＡで宿主細胞をトランスフェクトすることが望まれてもよい。組み換えＤＮＡ技術はまた、ヒトヘプシジン−２５に対する結合に必要でない軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードする一部または全てのＤＮＡを取り除くために使用されてもよい。このような切断ＤＮＡ分子から発現される分子もまた、本発明の抗体に含まれる。
【００６８】
本発明は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。好ましくは、本発明の宿主細胞は、本発明の核酸分子を含む１つ以上のベクターまたは構築物を含む。例えば、本発明の宿主細胞は、本発明のベクターが導入される細胞であり、そのベクターは、本発明の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチドおよび／または本発明のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、本発明の２つのベクターが導入される宿主細胞を提供し、１つは本発明の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含み、もう１つは本発明の抗体に存在するＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチドを含み、各々は、エンハンサー／プロモーター調節エレメント（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなど由来（例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメント））に作動可能に連結されて、遺伝子の高レベルの転写を駆動する。
【００６９】
一旦発現されると、本発明のインタクトな抗体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態は、硫安沈殿法、イオン交換、アフィニティー（例えばプロテインＡ）、逆相、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当該技術分野の標準的な方法によって精製され得る。薬理学的使用のために、少なくとも約９０％、約９２％、約９４％または約９６％均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、約９８％〜約９９％またはそれ以上の均一性が最も好ましい。一旦、部分的または所望の場合、均一的に精製されると、次いで、本明細書に指示されるように、滅菌抗体が治療的に使用され得る。
【００７０】
（ヒト遺伝子操作抗体）
好ましくは、治療目的のために使用される本発明の抗体は、抗体が免疫反応を引き起こす可能性を減少させるために、（抗体に存在する範囲で）ヒト由来のフレームワークおよび定常領域の配列を有する。ヒト遺伝子操作抗体は、それらが治療適用に有益であり、ヒト対象に投与される場合、マウス起源の抗体またはマウス起源の部分を含む抗体で頻繁に観察されるヒト抗マウス抗体反応の可能性を減少させるので、特に興味深い。好ましくは、注入されるヒト遺伝子操作抗体は、例えばマウス抗体より、むしろ天然のヒト抗体に近い半減期を有し得るので、より少ない用量かつ少ない頻度で対象に投与できる。
【００７１】
本明細書に使用される場合、用語「ヒト遺伝子操作抗体」とは、少なくとも一部がヒト起源である抗体を指す。例えば、ヒト遺伝子操作抗体は、マウスなどの非ヒト起源の抗体由来の部分、および例えば従来の技術（例えば合成）によって化学的に一緒に結合されるか、または遺伝子操作技術を用いて隣接ポリペプチドとして調製されるヒト起源の抗体由来の部分を含んでもよい。
【００７２】
好ましくは、「ヒト遺伝子操作抗体」は、親抗体、すなわち非ヒト抗体、好ましくはマウスＦａｂ ４Ｃ１１などのマウスＭａｂもしくはそのフラグメントが起源であるか、またはそれらに由来するＣＤＲを有し、一方、存在する範囲でフレームワークおよび定常領域（または有意もしくは実質的なその部分、すなわち少なくとも約９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％）は、前記抗体がヒト細胞で産生するか否かに関わらず、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン領域（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅを参照のこと）またはその組み換え体もしくは変異型で生じる核酸配列情報によってコードされる。好ましくは、ヒト遺伝子操作抗体の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲは、ヒト遺伝子操作抗体が誘導される非ヒト親抗体のＣＤＲから最適化されて、スクリーニングアッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイによって確認され得る、所望の特性、例えば向上した特異性、親和性または中和を生じる。好ましくは、本発明の抗体における最適なＣＤＲは、親マウスＦａｂ ４Ｃ１１、３Ａ９、または５Ｅ８に存在するものと比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。親マウスＦａｂ ４Ｃ１１、３Ａ９または５Ｅ８のものと比較した場合、本発明のヒト遺伝子操作抗体のＣＤＲにおける特定のアミノ酸置換は、抗体の不安定性の可能性を減少させる（例えば、１つ以上のＣＤＲ Ａｓｎ残基の除去）か、または（例えばＩＭＭＵＮＯＦＩＬＴＥＲ（商標）技術（Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｒｏｖｉａ，ＣＡ）によって予測されるように）ヒト対象に投与される場合、抗体の免疫原性の可能性を減少させる。
【００７３】
ヒト遺伝子操作抗体は、好ましくは、非ヒト抗体由来の最小配列を含む。ヒト遺伝子操作抗体は、受容抗体にも、あるいは親抗体から導入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含んでもよい。ヒト遺伝子操作抗体は、当該技術分野における慣例の使用方法を用いてインビトロでの突然変異に供されてもよく、それによって、ヒト遺伝子操作組み換え抗体のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列に関連するものに由来するが、インビボにおいてヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内の天然に存在し得ない配列となる。ヒト遺伝子操作組み換え抗体のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲフレームワーク領域のそのようなアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列配列と少なくとも約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９８％、またはより好ましくは少なくとも９９％、または最も好ましくは１００％同一であると意図される。
【００７４】
好ましい実施形態において、本発明のヒト遺伝子操作抗体は、ヒト生殖細胞系列軽鎖フレームワーク配列およびヒト生殖細胞系列重鎖フレームワーク配列を含む（例えば、国際公開第２００５／００５６０４号を参照のこと）。
【００７５】
ヒト遺伝子操作抗体を生成するために当該技術分野において利用可能な複数の方法が存在する（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第２００６／０６０４６９３５；Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２８６９（１９９１）；Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４（１９８８）を参照のこと）。例えば、ヒト遺伝子操作抗体は、選択的にヘプシジン−２５に結合する親抗体（例えば成熟抗体またはハイブリドーマによって作製された抗体）のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードする核酸配列を得て、前記ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ（非ヒト）中のＣＤＲを同定し、そのようなＣＤＲコード核酸配列を選択されたヒトフレームワークコード核酸配列に移植することによって生成されてもよい。必要に応じて、ＣＤＲ領域をフレームワーク領域に移植する前にＣＤＲ内の１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換するために、ＣＤＲ領域は、ランダムにまたは特定の位置で変異することによって最適化されてもよい。あるいは、ＣＤＲ領域は、当業者に利用可能な方法を用いてヒトフレームワーク領域への挿入後に最適化されてもよい。
【００７６】
ＣＤＲをコードする配列が選択されたヒトフレームワークコード配列に移植された後、次いで、ヒト遺伝子操作可変重鎖および可変軽鎖配列をコードする得られたＤＮＡ配列が、ヘプシジン−２５を結合するヒト遺伝子操作抗体を生成するために発現される。ヒト遺伝子操作ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、完全な抗ヘプシジン−２５抗体分子の一部として、すなわちヒト定常領域配列との融合タンパク質として発現されてもよい。しかしながら、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列はまた、例えば、ヒト遺伝子操作抗ヘプシジン−２５ＦｖまたはＦａｂを生成するために定常配列の存在下で発現されてもよい（例えば、Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｊ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：３７−４５（１９９７）およびＷａｔｋｉｎｓ，Ｊら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６：１６９−１７７，（１９９８）を参照のこと）。
【００７７】
（診断用途）
本発明の抗体は、ヘプシジン−２５によって促進される疾患および状態に対する性質の評価、ならびにそれらを患っている患者におけるそのような疾患および状態の検出および診断のために、組織または生体液中のヘプシジン−２５の量を正確に検出または測定するための手段を提供する。例えば、本発明のヘプシジン−２５選択的抗体は、感受性が高く、信頼できる免疫学的検定（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫拡散法、またはＳＰＲアッセイなどの免疫検出アッセイ）に導入され得る。同様に、本発明のヘプシジン−２５選択的抗体はまた、組織または生体液サンプルの免疫組織化学的（ＩＨＣ）および免疫蛍光（ＩＦ）アッセイに有用である。そのような分析は、ヘプシジン−２５の異常レベルを検出し、それによって、ヘプシジン−２５によって促進される疾患および状態を診断するために使用されてもよい。より具体的には、本発明は、患者由来の組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−２５のレベルを測定し、サンプル中のヘプシジン−２５のレベルと、１つ以上のコントロール個体由来の対応するサンプル中のヘプシジン−２５のレベルまたは基準物とを比較し、それによって、ヘプシジン−２５の異常レベルに関連する疾患状態を検出することによって、患者におけるヘプシジン−２５に関連する疾患または状態を診断する方法を提供する。疾患状態は、減少した血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットに関連する１つ以上の遺伝性疾患または非遺伝性疾患を含んでもよい。好ましくは、疾患状態は、貧血に関連する１つ以上の遺伝性疾患または非遺伝性疾患を含んでもよい。
【００７８】
患者における疾患または状態に関連するヘプシジン−２５をモニターする方法もまた、提供される。その方法は、第１の時点においてヘプシジン−２５に関連する疾患または状態の危険性を被っている患者由来の組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−２５のレベルを測定する工程；１つ以上の異なる時点において患者由来の組織または生体液の１つ以上のサンプル中のヘプシジン−２５のレベルを測定する工程；異なる時点において測定されるヘプシジン−２５のレベルを比較し、それによって、ヘプシジン−２５により測定される疾患または状態をモニターする工程を含む。
【００７９】
本発明のヘプシジン−２５選択的抗体は、ハイスループット方法に適用される場合に特に有用である。そのような方法は、マイクロチップおよびマイクロアレイ法を含み、それによって、多くのサンプルが、マイクロプレートまたはスライド、あるいは当該技術分野において公知の他のアッセイ基板上で試験され得る。
【００８０】
生物学的サンプル中のヘプシジン−２５の存在またはそのレベルは、抗原−抗体複合体を形成するために適切な条件下で生物学的サンプルと、例えば本発明の抗体とを混合することによって規定され得る。抗体は、結合または未結合の抗体の検出を容易にするために検出可能な部分で直接的またはより好ましくは間接的に標識される。免疫複合体形成の検出の様々な方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット法（例えばドッロブロット、スロットブロット、ウェスタンブロットなど）、間接免疫蛍光法技術および例えばＳＰＲなどの物理的パラメーターの変化の検出に依存する方法などがある。このような適用には、生物学的サンプル、例えばヒトの生体液または細胞もしくは組織抽出物中のヘプシジンを検出するために検出可能な部分に結合される本発明のヘプシジン−２５選択的抗体を利用する方法が含まれる。本発明の抗体は、検出可能な部分での修飾を含むか、または含まないそのようなアッセイに使用され得る。検出可能な部分で修飾される場合、本発明の抗体は、検出可能な部分の共有または非共有結合によって修飾され得る。本明細書に使用される場合、用語「検出可能」は、公知の分析技術を用いて、検出器によって物質を同定または追跡することを可能にする物質（複合体、化合物または部分）の特徴を記載する。検出可能な部分の代表的な例としては、限定されないが、発色団、蛍光部分、リン光性部分、発光部分、放射性部分、種々の酵素（例えばアルカリホスファターゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼ）、磁性部分（例えば反磁性、常磁性および強磁性物質）、および重金属群、ならびに任意の他の公知の検出可能な部分が挙げられる。形成される抗体−抗原標準複合体の量は、例えば、光度または比色分析手段などの当該技術分野において公知の種々の方法によって定量されてもよい。好ましくは、本発明の抗体は、修飾せずに使用される。すなわち、当該技術分野において周知の方法に従って間接的に標識される。
【００８１】
本発明は、生物学的サンプル中のヘプシジン−２５タンパク質を検出するための方法を具現化し、本発明の抗体がヘプシジン−２５タンパク質に結合できるのに十分な条件下かつ時間で、前記抗体と生物学的サンプルとをインキュベートする工程、および前記結合を検出する工程を含む。好ましくは、抗体は、５Ｅ８、ＯＨ４および／またはＯＢ３である。生物学的サンプル中のヘプシジン−２５タンパク質を検出するための好ましい方法は、サンドイッチＥＬＩＳＡであり、本発明の一次抗体がヘプシジン−２５タンパク質に結合できるのに十分な条件下かつ時間で、前記抗体と生物学的サンプルとをインキュベートする工程、未結合サンプルを除去する工程、配列番号１のアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに選択的に結合する二次抗体を付与する工程、未結合の二次抗体を除去する工程、および前記二次抗体の結合を検出する工程を含む。好ましくは、一次抗体は３．２３または３．１２であり、二次抗体はＯＨ４またはＯＢ３である。抗ヘプシジンＭａｂ ３．２３は、２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含み、軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号８２に示すアミノ酸配列を有し、重鎖ポリペプチドの各々は配列番号８３に示すアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する。抗ヘプシジンＭａｂ ３．１２は、２つの軽鎖ポリペプチドおよび２つの重鎖ポリペプチドを含み、軽鎖ポリペプチドの各々は配列番号８４に示すアミノ酸配列を有し、重鎖ポリペプチドの各々は配列番号８５に示すアミノ酸配列を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する。生物学的サンプル中のヘプシジン−２５タンパク質を検出するためのより好ましい方法はサンドイッチＥＬＩＳＡであり、一次抗体がヘプシジンタンパク質に結合できるのに十分な条件下かつ時間で、ヘプシジンのアミノ酸５〜２５内に含まれるエピトープに特異的に結合する前記抗体と、生物学的サンプルとをインキュベートする工程、未結合サンプルを除去する工程、ヘプシジン−２５のアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに結合する二次抗体を付与する工程、未結合の二次抗体を除去する工程、および前記二次抗体の結合の存在または非存在を検出する工程を含む。好ましくは、一次抗体は３．２３または３．１２であり、二次抗体はＯＨ４またはＯＢ３である。より好ましくは、二次抗体は標識されず、結合は当該技術分野において公知の方法に従って間接的に検出される。
【００８２】
本発明はまた、ヘプシジン−２５を含む疑いのあるサンプルをスクリーニングするための組成物、方法およびキットを提供する。そのようなスクリーニングは、そのようなポリペプチドを含むか、または生成する疑いのある患者サンプル、または実験サンプルで実施されてもよい。キットは、本発明のヘプシジン−２５選択的抗体を含んでもよい。キットは、サンプルと、本発明のヘプシジン−２５選択的抗体との間の相互作用を検出するための適切なバッファーおよび試薬を含んでもよい。提供される試薬は、抗マウスＩｇＧ抗体などの本発明の抗体と結合または相互作用できる放射性標識、蛍光標識、または酵素標識された薬剤であり得る。
【００８３】
キットの試薬は、溶液として提供されるか、固体支持体に結合されるか、または乾燥粉末として提供されてもよい。試薬が溶液で提供される場合、好ましくは、溶液は水溶液である。好ましくは、試薬が固体支持体に結合される場合、固体支持体は、クロマトグラフ媒体、複数のウェルを有する試験プレート、または顕微鏡スライドであってもよい。提供される試薬が乾燥粉末である場合、粉末は適切な溶媒の添加によって再構成されてもよく、ウェルとしてキットに提供されてもよい。
【００８４】
本発明のキットは一般にバイアルを含む容器で提供され、その中に抗体、抗原または検出試薬が入られてもよく、好ましくは適切に等分されてもよい。本発明のキットはまた、典型的に、商業用販売のための抗体、抗原および試薬容器を含むための手段を含む。そのような容器はプラスチック容器を含んでもよく、その中に所望のバイアルが保持され、さらに１つ以上の必要な化学物質、例えば、クロマトグラフィー物質、溶媒および溶離剤、試験管、洗浄剤、抗体および検出反応のための化学物質が保持される。
【００８５】
（治療的使用）
ヘプシジン−２５により促進される疾患または状態は、それらを必要とする患者に、（１）ヒトヘプシジン−２５、すなわちＤＴＨＦＰＩＣ（配列番号５）、および／または（２）マウスヘプシジン−２５、すなわちＤＴＮＦＰＩＣ（配列番号８６）を含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープに結合するヘプシジン−２５選択的抗体の二次抗体を含む医薬組成物を投与することによって予防または治療され得る。
【００８６】
本発明の抗体を含む医薬組成物は、有効量がそれを必要とするヒト被検体に投与される場合、ヒトにおける血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるために使用され得る。さらに、本発明の抗体は、状態、疾患、または障害の治療に有用であり得、ここで、ヘプシジン−２５の存在は、望まれない病理学的効果またはヘプシジン−２５のレベルの減少を引き起こすか、またはそれらの原因となるか、あるいはヘプシジン生物活性はヒト被検体における治療的有用性を有する。そのような状態、疾患または障害は、限定されないが、感染、炎症、慢性疾患および癌に起因する貧血を含む、貧血を含む。被検体は男性であっても女性であってもよい。好ましくは、ヒト被検体は、望ましくない、低い血清鉄レベル、低い網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを有するか、またはそれらを有する危険性がある。より好ましくは、ヒト被検体は、限定されないが、感染、炎症、慢性疾患および／または癌に起因する貧血を含む、貧血の危険性があるか、またはそれを患っている。
【００８７】
さらに、本発明の抗体の使用は、限定されないが、感染、炎症、慢性疾患、および癌に起因する貧血を含む、貧血の治療または予防のための医薬の製造に使用するためのものである。
【００８８】
本発明のヘプシジン−２５選択的抗体はまた、ヘプシジン−２５により促進される疾患および状態の予防および治療に有用である。本発明の抗ヘプシジン−２５選択的Ｍａｂｓは、ヘプシジン−２５に対する受動免疫のための医薬組成物において処方され得る。本発明のＭＡｂｓの機能的フラグメント、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびヘプシジン−２５に選択的に結合する能力を保有する任意のフラグメントなどもまた、医薬組成物に組み込まれて、治療に適用されてもよい。
【００８９】
さらに、本発明のヘプシジン−２５選択的Ｍａｂｓは、ヘプシジン−２５により促進される疾患および状態の進行をモニターするために免疫学的検定に適用されてもよく、ここで、ヘプシジン−２５のレベルまたは量は、処置または治療の成功、あるいは疾患または状態の進行の指標を提供する。
【００９０】
さらに、本発明のＭａｂｓは、ヘプシジン−２５により促進される疾患または状態を患っている患者のヘプシジン−２５遮断治療を評価する方法において有用である。その方法は、以下の工程：
ａ）治療の初期段階前または治療の初期段階中の患者から生体液の第１のサンプルを得る工程；
ｂ）免疫学的検定法によって第１のサンプル中のヘプシジン−２５のレベルを測定する工程；
ｃ）治療が効果を有するうちの適切な時間の後に、患者から生体液の第２のサンプルを得る工程；
ｄ）免疫学的検定法によって第２のサンプル中のヘプシジン−２５の量を測定する工程；
ｅ）ヘプシジン−２５結合または遮断治療の効果を測定するために、第１のサンプル中のヘプシジン−２５の測定された量と、第２のサンプル中のヘプシジン−２５の量とを比較する工程、を含む。
【００９１】
患者におけるヘプシジン−２５結合治療または遮断治療を評価するために適用される上記の方法は、特に臨床診療において有益であり、１つの治療計画または別の治療計画で開始するタイミングの決定は、患者の転帰に重要であり得る。本発明の方法は、それらの重要な決定の基礎となる情報を提供する。その方法は、治療の初期段階前、または治療の初期段階中のヘプシジン−２５の量の測定を提供し、そして、特に治療が有効になり始めると予想される場合、治療の開始後、１回以上の期間におけるヘプシジン−２５の１つ以上の測定を提供する。
【００９２】
ヘプシジン−２５遮断治療は、抗ヘプシジン−２５選択的抗体の患者への受動投与であってもよい。抗ヘプシジン−２５選択的抗体は、キメラヒト／非ヒト抗体、ヒト化または完全なヒトモノクローナル抗ヘプシジン−２５選択的抗体、あるいはヘプシジン−２５結合に機能的な任意のヘプシジン−２５選択的抗体フラグメントであってもよい。
【００９３】
免疫複合体形成を検出する様々な方法は、当該技術分野において周知であり、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット法（例えばドッロブロット、スロットブロット、ウェスタンブロットなど）、間接免疫蛍光法技術および例えばＳＰＲなどの物理的パラメーターの変化の検出に依存する方法がある。１つの広範に使用される方法において、免疫複合体形成は、放射性標識または酵素タグ（例えばアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）などの標識の使用により検出される。さらなる利点は、二次抗体または当該技術分野において周知の方法に従う、ビオチン化リガンドを結合するためのアビジン結合分子などの二次結合リガンドの使用により得ることができる。
【００９４】
本明細書に使用される場合、用語「治療」および「治療する」とは、例えば、本明細書に記載される疾患、状態、または障害、その症状、あるいはそれに対する性質を、例えば、治療、軽減、変化、作用、制御、停止、改善、または防止するための治療効果を与える目的で、本明細書に記載される疾患、状態、または障害、そのような疾患、状態、または障害の症状、あるいはそのような疾患、状態、または障害に対する性質を有する患者に物質を投与することを指す。好ましくは、治療される患者は哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。投薬計画は、最適な所望の反応（例えば治療反応）を提供するように調節され得る。例えば、単一のボーラスが投与されてもよく、数回に分割した用量が時間にわたって投与されてもよいか、または用量は比例的に減少されるか、もしくは治療状況の緊急性によって示される場合、増加されてもよい。
【００９５】
（医薬組成物）
本発明の抗体は、ヒト被検体への投与に適切な医薬組成物に組み込まれ得る。本発明の抗体は、ヒト被検体に単独あるいは単回または複数回投与量で薬理学的に許容可能な担体および／または希釈剤と併せて投与されてもよい。そのような医薬組成物は、選択される投与様式に適切であるように設計され、薬理学的に許容可能な希釈剤、担体、および／または賦形剤、例えば分散剤、バッファー、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などが必要に応じて使用される。前記組成物は、当該技術分野において公知の従来技術に従って設計されてもよい。
【００９６】
医薬組成物のための適切な担体は、本発明のＭａｂと混合される場合、分子の活性を保持し、被検体の免疫系と反応しない、任意の物質を含む。
【００９７】
本発明の抗ヘプシジン−２５Ｍａｂを含む医薬組成物は、標準的な投与技術を用いて本明細書に記載される病状、例えば貧血障害の危険性があるか、またはそれらを示す被検体に投与され得る。
【００９８】
本明細書に使用される場合、用語「有効量」とは、所望の治療結果を達成するために、（投薬量および期間および投与手段について）必要な量を指す。抗体の有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、体重などの要因、および個体において所望の反応を引き起こすための抗体または抗体部分の能力に従って変化させてもよい。有効量はまた、抗体のあらゆる毒性または有害作用を、治療的に有益な効果が上回るものである。
【００９９】
有効量は少なくとも最少量であるが、被検体に対して治療的有益性を与えるのに必要である活性剤の毒性量より少ない。つまり、本発明の抗体の有効量または治療的に有効な量は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、（ｉ）血清鉄レベル、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるか、あるいは（ｉｉ）ヘプシジン−２５の存在が望ましくない病理学的作用を引き起こすか、またはその原因となる状態、障害または疾患を治療するか、あるいは（ｉｉｉ）ヘプシジン−２５のレベルまたはヘプシジン生物活性の減少が、限定されないが、感染、炎症、慢性疾患、および／または癌に起因する貧血を含む、限定されないが、慢性疾患の貧血を含む、限定されないが、貧血を含む、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて有益な治療効果を生じる、量である。本発明の抗体の有効量は、単回投与または複数回投与で投与されてもよい。さらに、本発明の抗体の有効量は、２回以上投与されなくても、有効量より少ない複数回用量で投与されてもよい。
【０１００】
医薬分野において周知のように、任意の１人の被検体のための投薬量は、投与頻度および投与経路、全体的な健康、および同時に投与されている他の薬物を含む、多くの要因に依存する。用量はさらに、疾患の種類および重篤性に非常に依存し得る。典型的な用量は、例えば、約０．１〜約１００ｍｇ；好ましくは約１〜約１００ｍｇ；より好ましくは約５〜約５０ｍｇの範囲であり得るが、しかし、この例示的範囲の上下の用量も、特に上述の要因を考慮して想定される。日常の非経口投薬計画は、全体重の約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１００μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。進行は定期評価によりモニターされてもよく、それに応じて用量が調節される。
【０１０１】
抗体のこれらの提案される量は多くの治療的決定に従う。適切な用量および計画を選択する際の重要な要因は、得られる結果である。この状況において考慮するための要因は、特に治療される障害、個々の患者の臨床状態、障害の原因、抗体の送達部位、抗体の特定の種類、投与方法、投与計画および投与頻度、ならびに医師に公知の他の要因を含む。
【０１０２】
本発明の抗体の投与経路は、経口、非経口、吸入または局所的であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、非経口投与に適切な医薬組成物に組み込まれてもよい。本明細書に使用される場合、用語、非経口は、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣内、または腹腔内投与を含む。静脈内または腹腔内または皮下注射による非経口送達が好ましい。皮下注射が最も好ましい。そのような注射のための適切な賦形剤は当該技術分野において周知である。
【０１０３】
医薬組成物は、典型的に、例えば、密閉されたバイアル、シリンジまたは他の送達装置、例えばペンを含む、与えられる容器中での製造および貯蔵条件下で、無菌かつ安定でなければならない。従って、医薬組成物は、製剤作製後に濾過滅菌され得るか、または微生物学的に受容可能に作製され得る。
【０１０４】
以下の実施例は例示の目的のみのために与えられ、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１０５】
（実施例１ ヒトヘプシジン−２５の生成）
商業的供給源（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ））から取得するかまたは当技術分野で公知の種々の合成または組み換え技術により、ヒトヘプシジン−２５を生成することができる。例えば、ヘプシジン−２５の２５アミノ酸を含み、かつ、配列番号９５に示すようなアミノ酸配列を有する融合タンパク質を、大腸菌で発現する。３７℃にて１ｍＭのＩＰＴＧを用いる誘導の３〜６時間後にヒトヘプシジン−２５融合タンパク質を発現する３リットルの大腸菌から、封入体を単離する。封入体をバッファーＡ（５０ｍＭのＴｒｉｓおよび８Ｍの尿素（ｐＨ８．０））に溶かす。上清を固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム（２０ｍＬ樹脂）に通す。カラムを吸光度が基準値に戻るまでバッファーＡで洗浄し、結合したポリペプチドをバッファーＡ内の０．５Ｍのイミダゾールによりカラムから溶出されたバッチとする。ヒトヘプシジン−２５融合タンパク質をプールし、５０ｍＭのＤＴＴで還元する。その後、プールされた物質を、２Ｍの尿素、３ｍＭのシステイン、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）内で最終タンパク質濃度が５０μｇ／ｍＬ未満になるように希釈することにより、この融合タンパク質をリフォールディングする。この物質を室温にて攪拌し、４８時間空気中で酸化させる。酸化ポリペプチドを流速５ｍＬ／分にてＩＭＡＣカラム（２０ｍＬ）に通し、ヒトヘプシジン−２５融合タンパク質をバッファーＡ内の０．５Ｍイミダゾールによりカラムから溶出されたバッチにする。ヒトヘプシジン−２５融合タンパク質を含有するプールされた画分を濃縮し、５０ｍＭのＴｒｉｓ、４Ｍの尿素、ｐＨ８．０で流速３ｍＬ／分にて平衡化されたサイジングカラム（例えば、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＸＫ２６／６０）に通す。溶出された単量体融合タンパク質をプールし、次いで、５０ｍＭのＴｒｉｓ、２Ｍの尿素、５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．０に希釈し、その後、エンテロキナーゼで切断して、配列番号１のヒトヘプシジン−２５を生成する。未切断のヒトヘプシジン−２５融合タンパク質を、受動ＩＭＡＣクロマトグラフィー（上記の概略参照）により除去する。次いで、ＩＭＡＣカラムからの通過物（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）をＣ−１８逆相カラム上に流速４．０ｍＬ／分にて負荷する。カラムを吸光度が基準値に戻るまで０．１％のＴＦＡ入り水で洗浄し、結合したポリペプチドを、０．５％／分の速度で０．１％のＴＦＡを含む２０％〜４０％のＡＣＮの線形勾配によりカラムから溶出する。ヒトヘプシジン−２５ポリペプチドを含有する画分をプールし、Ｎ末端アミノ酸配列分析およびマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）により分析する。
【０１０６】
また、ラット、マウス、および、カニクイザルのヘプシジン−２５と種々のＮ末端切断型のヒトヘプシジン−２５（ヘプシジン２２およびヘプシジン２０を含む）をコードするポリペプチドを、ヒトヘプシジン−２５について説明したように基本的に生成した。
【０１０７】
（実施例２ Ｎ末端ヘプシジン−２５抗体の生成）
５個のアミノ酸ペプチドリンカー（すなわち、ＧＰＧＰＧ）でＯＶＡペプチド（アミノ酸３２３〜３３６）配列（すなわち、完全長免疫原ＤＴＨＦＰＩＣＧＰＧＰＧＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥ（配列番号８７））に結合させたＮ末端ヘプシジンペプチド（配列番号１のアミノ酸１〜７）を用いてマウスに免疫性を与え、これらのマウスから脾臓を２７日目に回収する。Ａｇ＋およびＩｇＧ＋メモリーと胚中心細胞について１ウェルあたり１細胞においてＢ細胞をソートし、ＥＬ４Ｂ細胞と２週間共培養する。その後、得られたＩｇＧ含有上清を１．４倍に希釈し、以下の３つのＥＬＩＳＡフォーマットに従ってスクリーニングする。（１）９６ウェルプレートを、ＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮ（商標）結合タンパク質（すなわち、脱グリコシル化されかつ等電的中性型（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｎｅｕｔｒａｌ ｆｏｒｍ）のアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ））を用いて、２μｇ／ｍＬの炭酸バッファー中で一晩コーティングする。非特異的結合部位をカゼインで１時間ブロックする。その後、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、１００ｎＭのビオチン化ヘプシジンを１時間プレート上でインキュベートする。プレートを再度上述のように洗浄する。その後、培養物からのＩｇＧ上清を１時間インキュベートし、プレートを洗浄する。ヘプシジン−２５抗体の特異的結合を０．５μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧのＦｃγアルカリホスファターゼにより検出する。アルカリホスファターゼ活性を、適当量のＰＭＰ／ＡＭＰ基質（６ｍｇ／ｍｌのフェノールフタレイン一リン酸（ＰＭＰ）入り０．５ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ１０．２、２％の２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、０．１％のＮａＮ３）を加えることにより測定し、５６０ｎｍにおける吸光度の量を測定する。（２）９６ウェルプレートを、ヤギ抗マウスカッパＩｇＧを用いて、２μｇ／ｍｌにて炭酸バッファー中で一晩コーティングする。その後、非特異的結合部位をカゼインで１時間ブロックする。プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、培養物からのＩｇＧ上清を１時間インキュベートする。その後、ビオチン化ヘプシジン−２５（１００ｎＭ）を１時間プレート上でインキュベートし、プレートを再度上述のように洗浄する。その後、捕捉した抗体に対するヘプシジン−２５の特異的結合を、１μｇ／ｍｌのＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮ−ＡＰ（商標）、ＮＥＵＴＲＡＶＩＤＩＮ（商標）−アルカリホスファターゼ結合体（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を加えることにより検出し、アルカリホスファターゼ活性をＰＭＰ／ＡＭＰ基質を加えることにより検出し、５６０ｎｍにおける吸光度を測定する。（３）９６ウェルプレートを１００ｎＭのヘプシジン−２５入り水を用いて一晩３７℃にてコーティングする。その後、非特異的結合部位をカゼインで１時間ブロックし、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄する。その後、培養物からのＩｇＧ上清を１時間インキュベートし、プレートを再度上述のように洗浄する。Ｎ末端ヘプシジン−２５抗体の特異的結合を０．５μｇ／ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧのＦｃγアルカリホスファターゼにより検出する。アルカリホスファターゼ活性をＰＭＰ／ＡＭＰ基質で測定し、５６０ｎｍにおける吸光度の量を測定する。
【０１０８】
次いで、ヘプシジン−２５（例えば、３Ａ９、４Ｃ１１および５Ｅ８）のＮ末端に特異的なマウス抗体を発現するＢ細胞を用いてＲＮＡを単離し、可変領域をＲＴ−ＰＣＲにより増幅させ、市販のマウスＩｇＧ１ベクターまたは重鎖および軽鎖それぞれへ連続的にクローン化する。一時的に発現されたマウス抗体を、ＳＰＲを用いてＮ末端ヘプシジン−２５特異的抗体として確認した。
【０１０９】
（実施例３ ＳＰＲを用いる抗ヘプシジンＦａｂｓおよびＭａｂｓの親和結合測定）
ＳＰＲバイオセンサー（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００）を、抗体（例えば、本明細書に開示された抗体）の結合反応速度および親和性を測定するために用いることができる。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システムは、ＳＰＲの光学的性質を利用して、デキストランバイオセンサーマトリクス内の相互作用分子のタンパク質濃度における変化を検出する。特に指定のない限り、全ての試薬および物質をＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ＡＢ（Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入する。全ての測定を２５℃にて行う。サンプルをＨＢＳ−ＥＰバッファー（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）に溶解する。ヒトカッパでＦａｂｓを捕捉するために、ヤギ抗ヒトカッパを、アミン結合キットを用いて、５０００〜１００００反応単位（Ｒｕｓ）のレベルにてＣＭ５センサーチップの１〜４のフローセル上に固定する。マウスＩｇＧ１でＭａｂｓを捕捉するために、ヤギ抗マウスＦｃガンマを、アミン結合キットを用いて、５０００〜１００００ＲｕｓのレベルにてＣＭ５センサーチップの１〜４のフローセル上に固定する。ヒトＩｇＧ４で抗体を捕捉するために、タンパク質Ａを、アミン結合キットを用いて、４００〜７００ＲｕｓのレベルにてＣＭ４センサーチップの１〜４のフローセル上に固定する。大腸菌のペリプラズマから調製されたＦａｂｓおよび哺乳動物細胞培養物から調製されたＭａｂｓを、複数の分析サイクルを用いて評価する。各サイクルは、以下のステップからなる。２００〜１０００Ｒｕｓの捕捉を目指してＦａｂまたはＭａｂを約１０μＬ／分にて０．３〜２分間注入し、実施例１において上述したように取得された種々の濃度のヒトヘプシジン−２５（６００ｎＭ〜０．１ｎＭ）を５０μＬ／分にて２分間注入し、次いで、２〜１０分間解離し、そして、３０μＬの１０ｍＭの塩酸グリシン、ｐＨ１．５を用いて再生する。測定は２５℃にて取得され、各サイクルにおける会合速度および解離速度を、ＢＩＡ評価ソフトウェア内の「１：１の物質移動を伴う」結合モデルを用いて評価する。
【０１１０】
マウスモノクローナル抗体３Ａ９、４Ｃ１１、５Ｅ８、ＯＢ３、ＯＨ４、ＯＢ１およびＯＥ１は、約３６ｎＭ〜約１ｎＭの親和性（ＫＤ）でヒトヘプシジン−２５と結合することを示す。マウスモノクローナル抗体ＯＨ４は、約１．２ｎＭのＫＤでヒトヘプシジン−２５と結合するが、ヒトヘプシジン２０またはヒトヘプシジン２２とは検出可能に結合しない。マウスモノクローナル抗体５Ｅ８は、ヒトヘプシジン−２５と結合するが、マウスまたはラットのヘプシジン−２５とは検出可能に結合しない。マウスモノクローナル抗体４Ｃ１１は、ヒト、マウス、およびラットのヘプシジン−２５と結合し、より低い程度で、ヒトヘプシジン２２（約２０９ｎＭ）と結合するが、ヒトヘプシジン２０とは結合しない。
【０１１１】
（実施例４ ヒトヘプシジン−２５と同時結合するＭａｂｓペアの同定）
ＳＰＲ分析によりヒトヘプシジン−２５に対する高親和性結合を示したヒトヘプシジン−２５を含むアミノ酸１〜７に対して産生されたモノクローナル抗体を、Ｍａｂ３．２３とともにヒトヘプシジン−２５に同時結合する能力について試験した。
【０１１２】
つまり、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００上で、ヤギ抗マウスＩｇＧ１ Ｆｃポリクローナル抗体を、５０００〜１５０００反応単位（Ｒｕ）にてＣＭ５チップのフローセル１〜４上に固定した。Ｍａｂ ５Ｅ８をフローセル２上で捕捉し、Ｍａｂ ４Ｃ１１をフローセル３上で捕捉し、Ｍａｂ ３Ａ９をフローセル４上で捕捉した。フローセル１を参照フローセルとして用いた。次いで、全てのフローセルにヒトヘプシジン−２５を注入した。フローセル上に固定されたＭａｂｓ ５Ｅ８、４Ｃ１１および３Ａ９を有するフローセルは全て、ヒトヘプシジン−２５に対するそれらＭａｂｓの結合を示すＲｕｓの増加を示した。次に、全てのフローセルにＭａｂ ３．２３を注入した。フローセル２のみ、フローセル上に固定されたＭａｂ ５Ｅ８を有し、Ｍａｂｓ ５Ｅ８および３．２３によりヒトヘプシジン−２５と同時結合することを示した。
【０１１３】
加えて、Ｍａｂｓ Ｈｕ２２、３．２３、３．１２、およびネガティブコントロールヒトＩｇＧ４抗体を、１０００〜４０００ＲｕｓにてセンサーチップＣＭ４チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）の別個のフローセル上で固定した。次いで、フローセルにヒトヘプシジン−２５を注入した。次に、フローセルにＭａｂ ５Ｅ８を注入した。フローセル上に固定されたＭａｂｓ Ｈｕ２２、３．２３、および３．１２を有するフローセルは、ヒトヘプシジン−２５の結合と、その後、Ｍａｂ ５Ｅ８の同時結合を示した。フローセル上に固定したネガティブコントロールヒトＩｇＧ４を有するフローセルは、ヒトヘプシン２５またはＭａｂ ５Ｅ８のいずれにも結合を示さなかった。更に、Ｍａｂ ５Ｅ８は、ヒトのアミノ酸１〜７およびマウスのヘプシジン−２５（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ ＴＸ；ｃａｔ．＃Ｈｅｐｃ１３−Ｓ）から構成されるＫＬＨ複合ペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗血清、または、それらのＩｇＧ精製調製物（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；ｃａｔ．＃Ｈｅｐｃ１３−Ａ）のいずれに対しても、ヒトヘプシジン−２５と同時結合しなかった。
【０１１４】
（実施例５ ヒトヘプシジン−２５の測定のためのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ）
マルチウェルプレートのウェルを、炭酸−重炭酸コーティングバッファー、ｐＨ９．４０（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ）中で２ｍｇ／Ｌの濃度にてＭａｂ ３．２３を用い、室温にて１時間コーティングする。次に、ウェルを吸引し、ＴＢＳＴ（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１ｍＬのＴｗｅｅｎ−２０／Ｌを含む１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有するＴＲＩＳ緩衝化生理食塩水）で３回洗浄する。次いで、ウェルをＴＢＳ−カゼインブロッキングバッファー（カトン（Ｋａｔｈｏｎ）抗菌剤を含む１５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１％のカゼイン、ｐＨ７．４（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｃａｔ．＃３７５３２）で１時間ブロックする。次に、１００μＬのヘプシジン−２５標準（５０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４０、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍＬ／ＬのＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００非イオン界面活性剤（Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐ．，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、および、５ｍｍｏｌ／Ｌのエチレングリコ−四酢酸（ＥＧＴＡ）からなる、アッセイバッファー中の種々の濃度における合成されたヒトヘプシジン−２５）をウェルのセットに加えて、較正曲線を生成する。その後、血清サンプルをアッセイバッファー中で１：２０に希釈し、その個々のウェルに加え、ＥＬＩＳＡプレートを室温にて１時間インキュベートする。吸引後、ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬの１：１０００希釈ビオンチン化抗ヘプシジン−２５Ｍａｂ ５Ｅ８を１ｍｇ／ｍｌにてウェルに加え、室温にて１時間インキュベートする。吸引後、ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬのポリ−ストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ）をウェルに加え、室温にて３０分間インキュベートする。その後、ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄する。最後のＴＢＳＴの吸引後、１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン発色基質（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ）をウェルに加え、室温にて３０分間インキュベートする。反応を等量の２Ｎリン酸で停止し、プレートを４５０ｎｍにて読み取る。
【０１１５】
４０人の正常患者および癌患者からのヘプシジン−２５の血清濃度を、５〜６５６μｇ／Ｌの範囲で上述のサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定し、測定されたヘプシジン−２５の血清濃度を標準ＬＣ／ＭＳアッセイ（ｒ＝０．９８，ｐ＜０．０００１）（Ｍｕｒｐｈｙら（２００７）を参照）を用いて直接相関させた。また、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ， ＮＪ））から得られた健康なドナー（５０人の男性および５０人の女性、年齢は１８歳から６６歳であり、平均年齢３７歳）からの１００個のヒト血清サンプルは、１〜７９μｇ／ｍｌより少ない範囲のヘプシジン−２５濃度を有すると決定した。加えて、サンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒトヘプシジン−２５コントロールペプチドが用量依存的に少なくとも１ｎｇ／ｍｌまで減ることを検出した。一方、ヒトヘプシジン−２５コントロールペプチド（２ｎｇ／ｍｌ以下）、および、ヒト血清サンプルポジティブコントロール内（すなわち、ＬＣ／ＭＳアッセイによりヘプシジン−２５を含有することが予め決定される）の内因性ヘプシジン−２５のどちらも、Ｍａｂ ５Ｅ８を（ｉ）ヒトのアミノ酸１〜７およびマウスのヘプシジン−２５（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ ＴＸ；ｃａｔ．＃Ｈｅｐｃ１３−Ｓ）からなるＫＬＨ結合ペプチドに対して産生されたウサギポリクローナル抗血清、または、（ｉｉ）そのＩｇＧ精製調製物（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；ｃａｔ．＃Ｈｅｐｃ１３−Ａ）で置換した場合、同様のアッセイにおいて検出可能ではない。更に、ヘプシジン−２５標準、および、ヒト血清サンプルポジティブコントロールのどちらも、ＨＥＰＣ−１３−Ｓ抗血清またはそのＩｇＧ精製調製物を（ｉ）アッセイプレート（すなわち、捕捉抗体として）の別個のウェル上でコーティングしたか、（ｉｉ）ビオチン結合検出抗体としてアッセイに加えたか、または、（ｉｉｉ）未結合検出抗体としてアッセイに加えた場合（すなわち、抗ウサギＩｇＧ二次抗体を用いてそれらの結合を連続的にアッセイした状態）、検出可能ではなかった。
【０１１６】
ヒトヘプシジン−２５コントロールペプチドおよびヒト血清ポジティブコントロールサンプル中の内因性ヘプシジン−２５は、サンドイッチＥＬＩＳＡがＭａｂ ５Ｅ８を捕捉抗体として用い、かつ、ＫＬＨ結合１３アミノ酸成熟ヒトヘプシジンＣ末端ペプチド（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ；ｃａｔ．＃ＨＥＰＣ１２−Ａ）に対して産生された市販のウサギポリクローナルＩｇＧとペアで用いた場合、検出されなかった。
【０１１７】
（実施例６ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いた抗ヘプシジン抗体の選択性の決定）
バイオマーカーの臨床の慣例の診断は、主に免疫学的定量的技術（例えば、ＥＬＩＳＡ）に基づく。これらの方法は、小さい抗原または抗原アイソフォームに適用できないことが多い（Ｓｐａｒｂｉｅｒ，Ｋ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ，Ｐｏｓｔｅｒ Ｖ２８−Ｓ，（２００８）；およびＧｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｊ．Ａ．ら（２００５））。ＭａｂｓまたはＦａｂｓは、サンプル減少後に実行された、抗体結合ヘプシジンポリペプチドで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって、ヒト血清から、前駆体またはそれらの切断型よりも内因性ヘプシジン−２５を選択的に免疫沈降させるそれらの能力について評価され得る。
【０１１８】
抗ヒトヘプシジンＭａｂｓまたはＦａｂｓを、炭酸−重炭酸（ｐＨ９．４）バッファー中で１時間室温にて２ｍｇ／Ｌの濃度において、９６−ウェル標準ＥＬＩＳＡプレートの別個のウェル上にコーティングする。次いで、ウェルを吸引し、ＴＢＳＴで３回洗浄する。既知量のヘプシジン−２５（アッセイバッファー中で希釈された）を含有するヒト血清サンプルを、１００μｌ／ウェルで１時間室温にて加える。ウェルを吸引し、ＴＢＳＴで３回洗浄する。捕捉されたヘプシジンポリペプチドを、４０μＬ／ウェルの０．１％ギ酸を５分間室温にて加えることにより溶出する。溶出されたサンプルを収集し、Ｃ４ ＺｉｐＴｉｐ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、すなわち、フェムトモルからピコモルのタンパク質またはペプチドを理想的には２５，０００分子量から１００，０００分子量の範囲で精製しかつ濃縮するためのクロマトグラフィー媒体を敷き詰めた状態の１０μＬピペットチップ、を用いて濃縮する。１マイクロリットルの２分の１のサンプルをＭＡＬＤＩ標的上にスポットし、等量のマトリクス溶液（５０％アセトニトリル、アルファ−シアン−４−ヒドロキシ桂皮酸で飽和された０．１％ＴＦＡ）をサンプルに加える。サンプルを乾燥し、線形モードで操作される４７００ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析する。
【０１１９】
直前に上述したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメトリーを実質的に用いて行われた実験は、Ｍａｂ ３．２３がヘプシジン−２５に結合し、より低い程度でヘプシジン−２０に結合したことを示した（図１および２）。Ｍａｂ ３．２３は、検出可能なレベルのヘプシジン−２２（分子量２４３６Ｄａ）、ヘプシジン−２４（分子量２６７４Ｄａ）、またはプロヘプシジン（分子量６９２９Ｄａ）と結合することを示さなかった（当然ながら、試験された血清サンプルは期待量のヒトヘプシジンのこれらの形態を含むものと仮定する）。
【０１２０】
ヒト血清中のどのヘプシジン種がＭａｂ ５Ｅ８により結合されるかを決定するために、類似の実験を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトロメトリーを用いて行った。これらの実験は、Ｍａｂ ５Ｅ８がヒト血清中のヘプシジン−２５のみに結合したことを決定した（図３および４）。重要なことに、ヘプシジン−２０、ヘプシジン−２２、プロヘプシジン、または他のヘプシジン種のいずれも、再度Ｍａｂ ５Ｅ８に結合しなかった（血清サンプル中に予想通りヒトヘプシジンのこれらの種が存在していたものと仮定する）。
【０１２１】
したがって、Ｍａｂ ５Ｅ８またはそれら由来の抗体もしくは限定されないがＭａｂ ＯＨ４を含むそれらに関連する抗体を用いる免疫学的検定は、ヒトヘプシジン−２５（ヒト血清中のヘプシジンの活性な生理学的に関連した形態）に対して、高度に特異的かつ選択的である。特異性および／または選択性における更なる改善が、Ｍａｂ ５Ｅ８またはそれら由来の抗体もしくは限定されないがＭａｂ ＯＨ４を含むそれらに関連する抗体ならびにＭａｂ ３．２３、Ｍａｂ ３．１２またはそれら由来の抗体もしくはそれらに関連する抗体の使用を組み合わせた、ヒトヘプシジン−２５に対する免疫学的検定において期待されている。
【０１２２】
（実施例７ （抗体の直接標識を用いずに）ヒトヘプシジン−２５を測定するためのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ）
サンドイッチＥＬＩＳＡを、（ｉ）標識した結合抗体を非標識のＯＨ４と置換すること、および（ｉｉ）ＯＨ４の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体を用いて間接的に検出することを除いて、実施例５のように行う。
【０１２３】
上述のようにサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるＭａｂ３．２３および非標識のＭａｂ ＯＨ４を用いて、ヒトヘプシジン−２５を、約０．２ｎｇ／ｍＬの感度にてヒト血清において選択的に検出した。
【０１２４】
（実施例８ ヒトヘプシジン−２５を測定するためのメソスケールディスカバリーサンドイッチ免疫アッセイ）
【０１２５】
ヒトヘプシジン−２５メソスケールディスカバリー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）（ＭＳＤ）免疫アッセイを上述の試薬を用いて構築した。つまり、１ｍｇのＭａｂ ＯＨ４を、５０％のグリセロール中に希釈した市販のキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＩＬ）を用いてビオチン化し、必要となるまで−２０℃で保存した。ストレプトアビジンコーティングされかつブロックされたＥＬＩＳＡプレートのウェルを、２ｍｇ／Ｌの濃度にてビオチン化Ｍａｂ ＯＨ４とともに１時間インキュベートした。その後、ウェルを吸引し、ＴＢＳＴ（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４０、１ｍＬのＴｗｅｅｎ２０／Ｌを含む１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含有するＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）で３回洗浄した。次に、１００μＬのヘプシジン標準（５０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４０、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍＬ／ＬのＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、および５ｍｍｏｌ／ＬのＥＧＴＡからなるアッセイバッファー中の種々の濃度の合成されたヘプシジン−２５タンパク質）を、較正曲線を生成するためにウェルに加えた。同時に、血清サンプルを、アッセイバッファー中で１：２０に希釈し、それらの個々のウェルに加え、ＥＬＩＳＡプレートを１時間室温にてインキュベートした。吸引後、ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬの１：１０００希釈のルテニウムで標識したＭａｂ ３．２３を１ｍｇ／ｍｌにてウェルに加えて、１時間室温にてインキュベートした。吸引後、ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、ウェルにわたって電圧を通し各ウェルからルテニウム電気化学発光を記録するＭＳＤリーダーを用いてＥＬＩＳＡプレートを発現させた。ＭＳＤソフトウェアおよびシグマプロット（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）バージョン８．０をＥＬＩＳＡの較正曲線におけるフィッティングのために用いた。
【０１２６】
ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイにおける抗体の最適なペアを、捕捉抗体としてＭａｂ ＯＨ４と、結合抗体としてＭａｂ ３．２３とがペアになるように決定した。合成ヘプシジン−２５タンパク質を１０μｇ／Ｌの濃度にて調製し、標準曲線を生成するために連続的に希釈した。図５に示すように、ＥＬＩＳＡは、許容可能なダイナミックレンジ、バックグラウンド、および感度を有することが見出された。ゼロ較正器からの３つの標準偏差評価に基づいて、免疫アッセイが、ＬＣ／ＭＳ型アッセイ（Ｍｕｒｐｈｙら（２００７））により測定される場合、ヒト血清ヘプシジン−２５のレベルの予め推定した測定値に基づいて、ヒト血清ヘプシジン−２５のレベルを測定するのに十分な感度以上を有するべきことを示す、０．０１μｇ／Ｌよりも良くなるように、免疫アッセイの感度を決定した。また、図２にグラフ化されたデータは、ヘプシジン−２０またはヘプシジン−２２が検出できないため、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイがヘプシジン−２５に対して選択的であることを示す。加えて、組み換え標準および実際のヒト血清サンプルに関する免疫アッセイ希釈曲線を平行になるように決定し、免疫アッセイは、ヒト血清サンプルについて優れた希釈直線性を示した（データは示さず）。
【０１２７】
ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイ法の選択性および感度を、上述した代表的なＬＣ／ＭＳアッセイ（Ｍｕｒｐｈｙら（２００７））と比較した。より具体的には、健常者および癌患者の混合物由来の５２個のヒト血清サンプルを、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイと、ヘプシジン−２５に対して特異的であることを示した上述したＬＣ／ＭＳアッセイ（Ｍｕｒｐｈｙら（２００７））の両方を用いて分析した。この比較からの結果は、ＭＳＤ免疫アッセイを用いて決定されたヘプシジン−２５の値が、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイがヒト血清サンプル中のヘプシジン−２５を特異的かつ選択的に測定することを裏付ける（データは示さず）、ＬＣ／ＭＳヘプシジン−２５アッセイの値（ｒ＝０．９８、ｐ＜０．００００１）と、非常に高度に相関したことを示した。
【０１２８】
ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイのいくつかのパラメーターを、ヒト血清サンプルを用いて評価した。より具体的には、凍結融解安定性を、４つの異なる血清サンプルを試験することにより評価した。これらの結果は、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイが、５回の凍結融解サイクル後であっても、一貫して８０〜１２０％のヘプシジン−２５の回収を有する凍結融解安定性を持つことを示した。凍結融解サイクルの個々の結果は、以下のとおりであった。サンプルＡの場合、それぞれ０．１６、０．１６、０．１７、０．１７、０．１７、および０．１７μｇ／Ｌ；サンプルＢの場合、それぞれ４．５、４．４、４．６、４．６、４．６、および４．４μｇ／Ｌ；サンプルＣの場合、それぞれ８．９、９．６、９．７、９．７、９．９、および９．６μｇ／Ｌ；サンプルＤの場合、それぞれ１５．１、１５．１、１５．４、１５．７、１５．４、および１５．４μｇ／Ｌ。ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイの正確性は、０．１６、４．５、および１５．１μｇ／Ｌの内因性ヘプシジン−２５を含有するヒト血清サンプルを用いて評価した。内部（ｉｎｔｒａ）アッセイ（ｎ＝２０）の正確性結果（ＣＶ）は、それぞれ上述のレベルにおいて、試験されたヘプシジン−２５の全濃度において許容可能な正確性を示す、３．４％、４．５％、および３．５％であった。
【０１２９】
ヒト血清に加えられた合成ヘプシジン−２５タンパク質の回収を評価するために、合成ヘプシジン−２５タンパク質を３つの異なるヒト血清サンプル（各サンプルは、非常に低い濃度の内因性ヘプシジン−２５を含有する）に、それぞれ２５０、２５、２．５、および０．２５μｇ／Ｌの濃度にて加えた。これらのサンプルを、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイを用いて分析した。平均（ＳＤ）結果は、試験されたヘプシジン−２５の全レベルにて８０〜１２０％の回収を示す、それぞれ２８７（６）μｇ／Ｌ、２４．２（０．２）μｇ／Ｌ、２．０（０．１）μｇ／Ｌ、および０．２３（０．０１）μｇ／Ｌであった。
【０１３０】
ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイの標準範囲は、正常な健康の志願者（５０人の男性および５０人の女性）からの１００個の血清サンプルを実施することにより確定した。これらサンプルのヘプシジン−２５の値の範囲は、０．０２μｇ／Ｌ〜２５μｇ／Ｌであり、平均値は３．０±０．５μｇ／Ｌであり、ＬＣ／ＭＳアッセイを用いる正常なヒトにおいて予め報告されたヘプシジン−２５のレベルと一致した（ＭｕｒｐｈｙらＢｌｏｏｄ，１１０：１０４８−５４（２００７）を参照）。
【０１３１】
興味深いことに、正常なヒト対象におけるヘプシジン−２５のレベルは、男性（４．２±０．８μｇ／Ｌ）と比較して女性（１．８±０．４μｇ／Ｌ）の方が有意に（ｐ＜０．０１）低いことが見出された。また、これらの正常な対象におけるヘプシジン−２５のレベルは、血清フェリチン濃度と比較したところ、血清フェリチンレベル（ｒ＝０．７１，ｐ＜０．００１）（データは示さず）と直接相関していることが見出された。
【０１３２】
最後に、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイによりそれぞれ決定された、癌患者（ｎ＝３４）の血清におけるヘプシジン−２５のレベルを、正常な健康の志願者（ｎ＝１００）の血清におけるヘプシジン−２５のレベルと比較した。この比較結果は、ヘプシジン−２５のレベルが正常なコントロール（３．０±０．５μｇ／Ｌ）（データは示さず）と比較して、癌を有する患者において有意に（ｐ＜０．００１）上昇した（７０．９±１０．４μｇ／Ｌ）ことを示した。興味深いことに、血液学的悪性腫瘍（８３．３±１１．９μｇ／Ｌ）および非血液学的悪性腫瘍（５８．４±１７μｇ／Ｌ）の両方を有する患者コホートは、正常なコントロール（両方についてｐ＜０．００１）と比較して、それぞれ有意にヘプシジン−２５のレベルを上昇させたことを示し、これは、上昇したヘプシジン−２５のレベルが癌関連貧血において重要な役割を担い得ることを示唆し得る（データは示さず）。
【０１３３】
ヘプシジン−２５に対して非特異的でありかつプロヘプシジンおよび他の非関連ヘプシジン種と交差反応し得る、既知のＥＬＩＳＡ法と比較して、本明細書において開示されたＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイは、ヒト血清において特異的かつ選択的にヘプシジン−２５のレベルを測定し、上述したヘプシジン−２５についての代表的な方法であるＬＣ／ＭＳアッセイとよく相関する。ヒト血清ヘプシジンのレベルを測定するためのＬＣ／ＭＳ型法を超えるＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイの１つの利点とは、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイが、ほとんどの臨床検査室において実施できることである。これは、一般的に複雑な実験や高度に専門化された操作者の専門知識がＬＣ／ＭＳ型アッセイを慣例的に行うのに必要とされるが、本ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイがどちらも必要としないことによる。加えて、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイは、ＬＣ／ＭＳアッセイよりも非常に高度にハイスループットである可能性を有するはずである。したがって、ＭＳＤサンドイッチ免疫アッセイは、ヒト対象におけるヘプシジン−２５のレベルを選択的に測定するよう慣例的に、臨床的に利用され得る方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約５０ｎＭから約８００ｐＭの間のＫＤで、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトヘプシジン−２５に選択的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、前記抗体が前記ヒトヘプシジン−２５に結合するより少なくとも約１０倍高いＫＤで、プロヘプシジンおよびヒトヘプシジン−２０に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、前記抗体が前記ヒトヘプシジン−２５に結合するより少なくとも５０倍高いＫＤで、プロヘプシジンおよびヒトヘプシジン−２０に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、前記抗体が前記ヒトヘプシジン−２５に結合するより少なくとも１００倍高いＫＤで、プロヘプシジンおよびヒトヘプシジン−２０に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約２００ｎＭより高いＫＤで、ヒトヘプシジン−２２に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約５００ｎＭ未満のＫＤで、マウスおよび／またはラットヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および４）にさらに結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
（ｉ）配列番号９、１０、１１、３２、３３および３４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号１２、１３、１４、３５、３６および３７に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号４５、１３、１４、３５、３６および３７に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号１２、１３、１４、３８、３６および３７に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号１５、１０、１６、３９、４０および４１に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉ）配列番号２０、２１、２２、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）配列番号２０、２１、２３、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号２４、２５、２３、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｘ）配列番号２６、２５、２７、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；ならびに
（ｘ）配列番号２６、２５、２８、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、
からなる群より選択される６つのＣＤＲを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ヘプシジン−２５に選択的に結合し、
（ｉ）配列番号９、１０、１１、３２、３３および３４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号１２、１３、１４、３５、３６および３７に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号４５、１３、１４、３５、３６および３７に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号１２、１３、１４、３８、３６および３７に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号１５、１０、１６、３９、４０および４１に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉ）配列番号２０、２１、２２、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）配列番号２０、２１、２３、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号２４、２５、２３、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｘ）配列番号２６、２５、２７、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；ならびに
（ｘ）配列番号２６、２５、２８、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、
からなる群より選択される６つのＣＤＲを含む、モノクローナル抗体。
【請求項９】
ヒト遺伝子操作モノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体はフラグメントである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）ポリペプチドおよび重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）ポリペプチドを含むモノクローナル抗体であって、
（ｉ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号４８および４９に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｉｉ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５０および５１に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｉｉｉ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５２および５１に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｉｖ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５３および５４に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｖ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５５および５６に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｖｉ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５９および５８に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｖｉｉ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号６０および５８に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｖｉｉｉ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号６１および５８に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｉｘ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号６２および５８に示すアミノ酸配列を有するか；あるいは
（ｘ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲは、それぞれ配列番号６３および５８に示すアミノ酸配列を有する、モノクローナル抗体。
【請求項１２】
１つ以上の薬理学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
治療に使用するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１４】
貧血を治療するための医薬の製造のための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１５】
ヒト被検体における血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる方法に使用するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
ヒト被検体における血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるための医薬の製造のための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１７】
ヒト被検体における血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる方法における使用のための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１８】
ヒト被検体に有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を投与する工程を含む、血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる方法。
【請求項１９】
貧血の治療を必要とするヒト被検体における貧血を治療する方法であって、前記ヒト被検体に有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−２５の量を測定するための方法であって、
（ｉ）前記組織または生体液のサンプルを得る工程と、
（ｉｉ）前記サンプルを、約５０ｎｍから約８００ｐＭの間のＫＤで、配列番号１を含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープ、ならびに２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、少なくとも約１０倍高いＫＤで、プロヘプシジンおよびヒトヘプシジン−２０に結合する抗体またはそのフラグメントと接触させる工程と、
（ｉｉｉ）定量的、半定量的または定性的に、前記サンプル中の前記抗体またはフラグメントに結合するヘプシジン−２５の量を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項２１】
前記抗体または抗体フラグメントは、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約２００ｎＭより高いＫＤで、ヒトヘプシジン−２２にさらに結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−２５タンパク質の量を定量化するための方法であって、
（ｉ）固体支持体を、（ａ）配列番号１を含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープ、または（ｂ）配列番号１を含むアミノ酸５〜２５内に含まれるエピトープに結合する一次抗体でコーティングする工程と、
（ｉｉ）前記サンプルを、前記抗体でコーティングされた固体支持体に付与する工程と、
（ｉｉｉ）未結合のサンプルを除去する工程と、
（ｉｖ）前記一次抗体がエピトープ（ａ）に結合する場合、エピトープ（ｂ）に結合する二次抗体を前記固体支持体に付与する工程、または前記一次抗体がエピトープ（ｂ）に結合する場合、エピトープ（ａ）に結合する二次抗体を前記固体支持体に付与する工程と、
（ｖ）未結合の二次抗体を除去する工程と、
（ｖｉ）定量的、半定量的または定性的に、前記サンプル中の前記二次抗体に結合されたヘプシジン−２５の量を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項２３】
エピトープ（ａ）に結合する前記抗体は、
（ｉ）配列番号２０、２１、２２、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号２０、２１、２３、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号２４、２５、２３、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号２６、２５、２７、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号２６、２５、２８、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、
からなる群より選択される６つのＣＤＲをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
エピトープ（ａ）に結合する前記抗体は、
（ｉ）配列番号５９および５８にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ；
（ｉｉ）配列番号６０および５８にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ；
（ｉｉｉ）配列番号６１および５８にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ；
（ｉｖ）配列番号６２および５８にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ；
（ｖ）配列番号６３および５８にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ、
からなる群より選択されるＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
エピトープ（ａ）に結合する前記抗体は、Ｍａｂ ５Ｅ８、Ｍａｂ ＯＢ１、Ｍａｂ ＯＢ ３、Ｍａｂ ＯＨ４およびＭａｂ ＯＥ１からなる群より選択される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
エピトープ（ｂ）に結合する前記抗体は、配列番号８２および８３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
エピトープ（ｂ）に結合する抗体は、配列番号８４および８５に示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記一次抗体または前記二次抗体のみが検出可能な部分で標識される、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出は間接的である、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルは、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、唾液、汗、腹水、リンパ液、嚢胞液、母乳、創傷液、またはそれらに由来し、前記サンプルは、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオイムノアッセイ、沈澱反応または蛍光免疫測定法において、前記抗体またはそのフラグメントと接触する、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を含む、ヘプシジン−２５を検出または定量化するためのキット。
【請求項１】
２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約５０ｎＭから約８００ｐＭの間のＫＤで、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるヒトヘプシジン−２５に選択的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、前記抗体が前記ヒトヘプシジン−２５に結合するより少なくとも約１０倍高いＫＤで、プロヘプシジンおよびヒトヘプシジン−２０に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、前記抗体が前記ヒトヘプシジン−２５に結合するより少なくとも５０倍高いＫＤで、プロヘプシジンおよびヒトヘプシジン−２０に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、前記抗体が前記ヒトヘプシジン−２５に結合するより少なくとも１００倍高いＫＤで、プロヘプシジンおよびヒトヘプシジン−２０に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約２００ｎＭより高いＫＤで、ヒトヘプシジン−２２に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約５００ｎＭ未満のＫＤで、マウスおよび／またはラットヘプシジン−２５（それぞれ配列番号３および４）にさらに結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
（ｉ）配列番号９、１０、１１、３２、３３および３４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号１２、１３、１４、３５、３６および３７に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号４５、１３、１４、３５、３６および３７に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号１２、１３、１４、３８、３６および３７に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号１５、１０、１６、３９、４０および４１に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉ）配列番号２０、２１、２２、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）配列番号２０、２１、２３、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号２４、２５、２３、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｘ）配列番号２６、２５、２７、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；ならびに
（ｘ）配列番号２６、２５、２８、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、
からなる群より選択される６つのＣＤＲを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ヘプシジン−２５に選択的に結合し、
（ｉ）配列番号９、１０、１１、３２、３３および３４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号１２、１３、１４、３５、３６および３７に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号４５、１３、１４、３５、３６および３７に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号１２、１３、１４、３８、３６および３７に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号１５、１０、１６、３９、４０および４１に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉ）配列番号２０、２１、２２、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉ）配列番号２０、２１、２３、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖｉｉｉ）配列番号２４、２５、２３、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｘ）配列番号２６、２５、２７、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；ならびに
（ｘ）配列番号２６、２５、２８、４２、４３および４４に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、
からなる群より選択される６つのＣＤＲを含む、モノクローナル抗体。
【請求項９】
ヒト遺伝子操作モノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体はフラグメントである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）ポリペプチドおよび重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）ポリペプチドを含むモノクローナル抗体であって、
（ｉ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号４８および４９に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｉｉ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５０および５１に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｉｉｉ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５２および５１に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｉｖ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５３および５４に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｖ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５５および５６に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｖｉ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号５９および５８に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｖｉｉ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号６０および５８に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｖｉｉｉ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号６１および５８に示すアミノ酸配列を有するか；
（ｉｘ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲポリペプチドは、それぞれ配列番号６２および５８に示すアミノ酸配列を有するか；あるいは
（ｘ）前記ＬＣＶＲおよび前記ＨＣＶＲは、それぞれ配列番号６３および５８に示すアミノ酸配列を有する、モノクローナル抗体。
【請求項１２】
１つ以上の薬理学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
治療に使用するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１４】
貧血を治療するための医薬の製造のための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１５】
ヒト被検体における血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる方法に使用するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
ヒト被検体における血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させるための医薬の製造のための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１７】
ヒト被検体における血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる方法における使用のための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１８】
ヒト被検体に有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を投与する工程を含む、血清鉄濃度、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットを増加させる方法。
【請求項１９】
貧血の治療を必要とするヒト被検体における貧血を治療する方法であって、前記ヒト被検体に有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−２５の量を測定するための方法であって、
（ｉ）前記組織または生体液のサンプルを得る工程と、
（ｉｉ）前記サンプルを、約５０ｎｍから約８００ｐＭの間のＫＤで、配列番号１を含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープ、ならびに２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、少なくとも約１０倍高いＫＤで、プロヘプシジンおよびヒトヘプシジン−２０に結合する抗体またはそのフラグメントと接触させる工程と、
（ｉｉｉ）定量的、半定量的または定性的に、前記サンプル中の前記抗体またはフラグメントに結合するヘプシジン−２５の量を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項２１】
前記抗体または抗体フラグメントは、２５℃にてＳＰＲによって測定される場合、約２００ｎＭより高いＫＤで、ヒトヘプシジン−２２にさらに結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
組織または生体液のサンプル中のヘプシジン−２５タンパク質の量を定量化するための方法であって、
（ｉ）固体支持体を、（ａ）配列番号１を含むアミノ酸１〜７内に含まれるエピトープ、または（ｂ）配列番号１を含むアミノ酸５〜２５内に含まれるエピトープに結合する一次抗体でコーティングする工程と、
（ｉｉ）前記サンプルを、前記抗体でコーティングされた固体支持体に付与する工程と、
（ｉｉｉ）未結合のサンプルを除去する工程と、
（ｉｖ）前記一次抗体がエピトープ（ａ）に結合する場合、エピトープ（ｂ）に結合する二次抗体を前記固体支持体に付与する工程、または前記一次抗体がエピトープ（ｂ）に結合する場合、エピトープ（ａ）に結合する二次抗体を前記固体支持体に付与する工程と、
（ｖ）未結合の二次抗体を除去する工程と、
（ｖｉ）定量的、半定量的または定性的に、前記サンプル中の前記二次抗体に結合されたヘプシジン−２５の量を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項２３】
エピトープ（ａ）に結合する前記抗体は、
（ｉ）配列番号２０、２１、２２、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号２０、２１、２３、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号２４、２５、２３、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号２６、２５、２７、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号２６、２５、２８、４２、４３および４４にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、
からなる群より選択される６つのＣＤＲをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
エピトープ（ａ）に結合する前記抗体は、
（ｉ）配列番号５９および５８にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ；
（ｉｉ）配列番号６０および５８にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ；
（ｉｉｉ）配列番号６１および５８にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ；
（ｉｖ）配列番号６２および５８にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ；
（ｖ）配列番号６３および５８にそれぞれ示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ、
からなる群より選択されるＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
エピトープ（ａ）に結合する前記抗体は、Ｍａｂ ５Ｅ８、Ｍａｂ ＯＢ１、Ｍａｂ ＯＢ ３、Ｍａｂ ＯＨ４およびＭａｂ ＯＥ１からなる群より選択される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
エピトープ（ｂ）に結合する前記抗体は、配列番号８２および８３に示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
エピトープ（ｂ）に結合する抗体は、配列番号８４および８５に示すアミノ酸配列を有するＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記一次抗体または前記二次抗体のみが検出可能な部分で標識される、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出は間接的である、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルは、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、唾液、汗、腹水、リンパ液、嚢胞液、母乳、創傷液、またはそれらに由来し、前記サンプルは、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオイムノアッセイ、沈澱反応または蛍光免疫測定法において、前記抗体またはそのフラグメントと接触する、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体を含む、ヘプシジン−２５を検出または定量化するためのキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１１−５３０５１４（Ｐ２０１１−５３０５１４Ａ）
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２２１１９（Ｐ２０１１−５２２１１９）
【出願日】平成２１年７月２９日（２００９．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５２０４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１７０７０
【国際公開日】平成２２年２月１１日（２０１０．２．１１）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１２月２２日（２０１１．１２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２９日（２００９．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５２０４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０１７０７０
【国際公開日】平成２２年２月１１日（２０１０．２．１１）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
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