抗体の精製方法
【課題】 抗体のＦｃ領域を高度に認識するタンパク質（Ｆｃ結合性タンパク質）をリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィーによる、抗体を高純度に精製する方法を提供すること。
【解決手段】 Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に抗体を含む溶液を添加して前記固相に前記抗体を吸着させ、前記固相に吸着した前記抗体をｐＨが３．５以下の溶出液を用いて溶出させる、抗体の精製方法により、前記課題を解決する。
【解決手段】 Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に抗体を含む溶液を添加して前記固相に前記抗体を吸着させ、前記固相に吸着した前記抗体をｐＨが３．５以下の溶出液を用いて溶出させる、抗体の精製方法により、前記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体を精製する方法に関する。特に本発明は、抗体のＦｃ領域と特異的に結合する、Ｆｃ結合性タンパク質を用いて抗体を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体はバイオテクノロジー産業の中心となる機能性タンパク質であり、抗体医薬や診断薬として広く利用されている。抗体は、遺伝子組換え技術を用いて得られる組換え動物細胞を培養することで大量に発現させることができ、発現した抗体は、細胞の分離や培養液の清澄化などの粗精製後、カラムクロマトグラフィーによる精製を経て、高純度に精製することができる。
【０００３】
カラムクロマトグラフィーによる抗体をはじめとするタンパク質の精製は、一般にイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなど分離モードが異なる各種クロマトグラフィーを組み合わせることで行なわれ、精製に用いるクロマトグラフィーの操作条件は、試行錯誤の上決定される。一方、精製対象のタンパク質と特異的に結合する物質（リガンド）を固相に固定化したものを用いた、アフィニティークロマトグラフィーによる精製も行なわれている。アフィニティークロマトグラフィーによる方法は、前述した各種クロマトグラフィーを組み合わせる方法とは異なり、夾雑物質を多く含む培養液中から一段階かつ高純度に目的タンパク質を精製可能な方法である。
【０００４】
抗体精製においては、従来より黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡ（分子量約４６０００）をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーが多く用いられている。プロテインＡは抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合する性質を有しているため、プロテインＡを固相に固定化することで抗体を高純度に精製することが可能である。しかしながらプロテインＡは病原菌である黄色ブドウ球菌由来のタンパク質であり、固定化した固相から漏れた場合における免疫原性発生のリスクが未だに否定できない。特に医薬品として抗体を製造するには、抗体発現時に用いた培養液に由来する物質や、抗体精製において混入する物質などを除去するとともに、これらの物質の安全性を徹底して高める必要がある。
【０００５】
黄色ブドウ球菌由来であるプロテインＡよりも安全性が高く、かつ抗体と特異的に結合する物質として、ヒトＦｃ受容体が知られている（例えば、非特許文献１参照）。Ｆｃ受容体は、免疫細胞の表面に存在する分子量数万のタンパク質であり、生体内で抗体と結合し免疫細胞内にシグナルを伝達し免疫機構を機能させる役割を担っている。すなわち、Ｆｃ受容体は生体内の複雑な環境においても抗体を高度に認識する機能を有する物質といえる。Ｆｃ受容体をリガンドとして固相に固定化し抗体を精製する方法についてはいくつか開示されているが（特許文献１から３参照）、抗体を高純度に精製する条件の記載はなく、未だ精製方法の確立には至ってはいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５３１０８６号公報
【特許文献２】特開２００８−２４５５８０号公報
【特許文献３】特開２０１０−１２６４３６号公報
【特許文献４】特開２００９−２７８９４８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｇ．Ｕｒｌａｎｄ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６，１９８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
抗体を製造するにあたり、前記抗体を発現可能な組換え体を培養することで得られた培養液から精製する必要があるが、精製する際、培養液由来の夾雑物質を確実に除去でき、回収率が高く、安全性が高く、かつ簡便な方法で精製できることが望まれている。しかしながら、従来より多く用いられているプロテインＡをリガンドとした場合、前述したようにプロテインＡが病原菌由来のタンパク質であることから安全性の面で疑問がある。またＦｃ受容体をリガンドとして用いた場合は、安全性はプロテインＡと比較し高いものの、抗体を高純度に精製する条件については確立されていない。
【０００９】
そこで本発明の目的は、Ｆｃ受容体といった、抗体のＦｃ領域を高度に認識するタンパク質（以下、Ｆｃ結合性タンパク質）をリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィーによる、抗体を高純度に精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に抗体を含む溶液を添加して、前記固相に前記抗体を吸着させ、前記固相に吸着した前記抗体を溶出液を用いて溶出させる、抗体の精製方法において、溶出液のｐＨを制御することで、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１２】
第一の発明は、
Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に抗体を含む溶液を添加して前記固相に前記抗体を吸着させ、
前記固相に吸着した前記抗体を溶出液を用いて溶出させる、抗体の精製方法であって、
溶出液のｐＨが３．５以下である、前記精製方法である。
【００１３】
第二の発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる前に、ｐＨ４．５以上の洗浄液を用いて前記固相に吸着した夾雑物質を除去する、第一の発明に記載の精製方法である。
【００１４】
第三の発明は、Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩであり、抗体が完全ヒト抗体またはヒト化抗体である、第一または第二の発明に記載の精製方法である。
【００１５】
第四の発明は、ヒトＦｃγＲＩが、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたタンパク質
である、第三の発明に記載の精製方法である。
【００１６】
第五の発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたヒトＦｃγＲＩを固定化した、抗体を精製するための固相である。
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
本発明の精製方法で精製する抗体は、免疫グロブリンの定常領域である、Ｆｃ領域を含むタンパク質のことをいい、免疫グロブリンそのものであってもよいし、Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質であってもよい。また、前記Ｆｃ領域には、例えばパパインなどのプロテアーゼの処理によって免疫グロブリンから生じる、ヒンジやＣＨ２ドメインやＣＨ３ドメインを含んでいてもよい。
【００１９】
Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質は、遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。前記融合タンパク質は、抗体のＦｃ領域と他のタンパク質とを直接結合させたタンパク質でもよいし、抗体のＦｃ領域と他のタンパク質との間に適当なリンカー配列を介して結合させたタンパク質でもよい。また、他のタンパク質へのＦｃ領域の融合位置は、前記他のタンパク質のＮ末端側でもよいし、Ｃ末端側でもよい。Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質は、遺伝子組換え技術を用いて得られた前記融合タンパク質を発現可能な宿主を培養することで製造することができる。前記融合タンパク質を発現させるための宿主としては、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）などの動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、大腸菌やバチルス属細菌などの細菌、パン酵母やポンベ酵母などの酵母、麹菌などのカビが例示でき、生産性を評価し、適切な宿主を選択すればよい。一例として、融合タンパク質が表面に糖鎖を必要とするタンパク質の場合、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、カビといった真核細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞がより好ましい。
【００２０】
本発明の精製方法で精製する抗体の由来に特に限定はなく、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体を例示することができるが、Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃ受容体である場合は、ヒト抗体が好ましい。本発明の精製方法で精製するヒト抗体の一例として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が例示できる。なお、ここでいうヒト抗体は、ヒト由来の抗体である完全ヒト抗体の他に、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体）に由来した最小の配列を含むキメラ抗体である、ヒト化抗体も含まれる。ヒト化抗体の一例として、抗体のうち、要求される抗原への結合特異性や親和性を決定付ける領域である超可変領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）を構成するアミノ酸残基を、非ヒト抗体の前記領域を構成するアミノ酸残基に置換した抗体があげられる。ヒト化抗体の別の例として、ヒト抗体のＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）を構成するアミノ酸残基を、前記領域を構成する非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換した抗体があげられる。なお、前記ヒト化抗体は、受容抗体やドナー抗体中には存在しないアミノ酸を含んでもよい。
【００２１】
本発明の精製方法で精製する抗体の種類に特に限定はなく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、直鎖抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））、脱フコシル抗体、およびそれらの断片が例示できる。
【００２２】
本発明の精製方法における抗体を含む溶液として、抗体を発現可能な宿主（動物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、カビなど）の培養液、抗体を発現可能な植物の破砕液、動物の乳などが例示できる。なお、抗体を含む溶液には、抗体を発現可能な宿主の細胞を含んでいてもよいし、あらかじめ前処理により前記細胞を除去してもよい。前記前処理は、遠心分離操作、精密ろ過膜や限外ろ過膜による濾過操作、といった当業者にとって周知な操作により行なえばよい。
【００２３】
本発明の精製方法において固相に固定化する（リガンドとして使用する）Ｆｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域を高度に認識し、特異的に結合するタンパク質のことをいう。Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃ受容体である場合、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩＩが例示できる。前記Ｆｃ受容体は、それぞれ、免疫細胞表面に存在し抗体（ＩｇＧ）と結合し免疫信号を細胞質内に伝達し、免疫システムを機能させる役割を担っている。前記Ｆｃ受容体のうちヒトＦｃγＲＩは、抗体と結合するα鎖と、α鎖と作用し免疫信号を細胞質内に伝達するγ鎖からなるタンパク質である。ヒトＦｃγＲＩのα鎖の概略構造を図１に示す。ヒトＦｃγＲＩのα鎖は、Ｎ末端側から、１５アミノ酸からなるシグナルペプチド（ＳＳ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目のメチオニンから１５番目のグリシンまでの領域）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目のバリンから３１３番目のイソロイシンまでの領域）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目のアルギニンから３７４番目のスレオニンまでの領域）から構成される。
【００２４】
本発明の精製方法における、リガンドとして使用するＦｃ結合性タンパク質は、必ずしもＦｃ結合性タンパク質の全領域を含むタンパク質である必要はなく、少なくとも抗体のＦｃ領域と結合可能な領域のアミノ酸残基を含むタンパク質であればよい。また、前記抗体のＦｃ領域と結合可能な領域のアミノ酸残基を含むタンパク質は、天然型のＦｃ結合性タンパク質のうち抗体のＦｃ領域と結合可能な領域のアミノ酸残基を含むタンパク質そのものであってもよいし、前記領域のアミノ酸残基のうちの一つ以上を置換、欠失、挿入したタンパク質であってもよい。なお、前記アミノ酸の置換、欠失、挿入を行なう箇所およびその数は、抗体結合活性を失わない限り任意設定が可能である。また、前記アミノ酸の置換、欠失、挿入には、ヒドロキシアミン法やＰＣＲ法といった従来より用いられる方法で行なえばよい。
【００２５】
Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩの場合、本発明の精製方法においてリガンドとして使用可能なＦｃ結合性タンパク質の第一の態様として、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの細胞外領域（図１のＥＣ領域）中にある抗体結合ドメイン領域、すなわち９５番目のプロリンから１８４番目のスレオニンまでのアミノ酸を少なくとも含むタンパク質があげられる。また、リガンドとして使用可能なＦｃ結合性タンパク質の第二の態様として、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列のうち少なくとも９５番目のプロリンから１８４番目のスレオニンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたタンパク質があげられる（特願２００９−２７４３５２号）。リガンドとして使用可能なＦｃ結合性タンパク質の第三の態様として、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの細胞外領域（図１のＥＣ領域）中の、少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質があげられる。また、リガンドとして使用可能なＦｃ結合性タンパク質の第四の態様として、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたタンパク質があげられる。前記第四の態様の具体例として、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質であって、
（ア）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換
（イ）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジンに置換
（ウ）配列番号１の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（エ）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（オ）配列番号１の６２番目のアラニンがバリンに置換
（カ）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（キ）配列番号１の６９番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（ク）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（ケ）配列番号１の７７番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（コ）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（サ）配列番号１の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（シ）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（ス）配列番号１の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（セ）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（ソ）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（タ）配列番号１の１３１番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（チ）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがロイシンに置換
（ツ）配列番号１の１５６番目のロイシンがプロリンに置換
（テ）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換
（ト）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（ナ）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（ニ）配列番号１の１９９番目のスレオニンがセリンに置換
（ヌ）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（ネ）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリンに置換
（ノ）配列番号１の２１８番目のロイシンがバリンに置換
（ハ）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（ヒ）配列番号１の２４８番目のロイシンがセリンに置換
（フ）配列番号１の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換
（ヘ）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換
のいずれかのアミノ酸置換を一つ以上含む、タンパク質があげられる（特願２０１０−０５２７８９号）。なお、前記第一から第四の態様において、細胞外領域（図１のＥＣ領域）のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳＳ領域）の全てまたは一部が含まれていてもよいし、細胞外領域（図１のＥＣ領域）のＣ末端側にある膜貫通領域（図１のＴＭ領域）の全てまたは一部や細胞内領域（図１のＣ領域）の一部が含まれていてもよい。また、ポリヒスチジンタグといった、精製などを行なうためのタグペプチドがＮ末端側またはＣ末端側に付加されていてもよい。
【００２６】
本発明の精製方法においてリガンドとして使用するＦｃ結合性タンパク質は、遺伝子組換え技術を用いて製造するのが好ましく、前記Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列や前記Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、公的データベースに公表されている配列を参考にすることができる（例えばＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。なお、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましく、コドンの使用頻度の解析には公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することができる。遺伝子組換え技術を用いてＦｃ結合性タンパク質を製造するには、前述した方法で得られたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現させる宿主に適切な発現ベクターに挿入後、前記ベクターで前記宿主を形質転換することで、Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能な宿主を調製し、前記宿主を培養することでＦｃ結合性タンパク質を製造すればよい。
【００２７】
本発明の精製方法で用いるＦｃ結合性タンパク質を固定化させる固相は、クロマトグラフィーで通常用いられる固相の中から適宜選択可能であり、固相の材料の一例として、親水性ビニルポリマー、シリカ、ガラス、アガロース、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリスチレンがあげられる。本発明の精製方法で用いる固相は、空孔の大きさおよび量が適切に制御されたものが好ましいが、メンブラン型の固相であってもよい。固相にＦｃ結合性タンパク質を固定化させるには、あらかじめ固相表面にエポキシ基、ホルミル基、アミノ基、カルボキシル基、トレシル基などの活性基を導入し、前記固相と前記Ｆｃ結合性タンパク質とを前記活性基を介して共有結合により固定化させればよい。
【００２８】
本発明の精製方法においてＦｃ結合性タンパク質を固定化した固相に抗体を吸着させるには、適切な空カラムに充填したＦｃ結合性タンパク質を固定化した固相に、抗体を含む溶液（培養液など）を適切な送液システムを用いて直接添加して吸着させればよい。固相に添加する、抗体を含む溶液のｐＨは、抗体の有するＦｃ領域が変性しない条件であれば、特に制限はないが、後述するようにｐＨ３．５以下とすると固相から抗体が溶出するため、ｐＨ４からｐＨ１０が好ましく、ｐＨ４から８がより好ましい。
【００２９】
本発明の精製方法において固相に吸着した抗体は、溶出液を用いて速やかに溶出させてもよいが、溶出させる前に洗浄液を用いて固相に吸着した夾雑物質をあらかじめ除去すると抗体の精製度が向上する点で好ましい。溶出液および洗浄液は緩衝液を用いると好ましく、そのｐＨは、後述の実施例で示すように、ｐＨ３．５以下の条件では固相に吸着した抗体の８０％以上を溶出すること、およびｐＨ４．６以上の条件では固相に吸着した抗体の数％しか溶出しないことから、溶出液のｐＨは３．５以下であり、洗浄液のｐＨは４．５以上である。特に、溶出液のｐＨを３．３以下にすると固相に吸着した抗体のほぼ全量が溶出できるため好ましい。
【００３０】
溶出液および洗浄液として用いる緩衝液には、少なくとも前記条件のｐＨが緩衝領域に入るような緩衝成分を含んでいればよく、緩衝成分の一例として、酢酸、クエン酸、ヒスチジン、リン酸、ホウ酸、アンモニウム塩（例えば、酢酸アンモニウムやコハク酸アンモニウム）、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、およびこれらの組み合わせがあげられる。なお、溶出液および洗浄液として用いる緩衝液には、必要に応じ、さらなる添加剤を含んでもよい。前記添加剤の一例として、塩、アミノ酸、カオトロープ、アルコール、界面活性剤などのタンパク質安定化剤、糖があげられる。塩は緩衝液のイオン強度を調整するために用いられ、具体的には、塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩化物、硫酸ナトリウムなどの硫酸塩、酢酸ナトリウムなどの酢酸塩、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸塩、リン酸ナトリウムなどのリン酸塩が例示できる。緩衝液に添加するアミノ酸の具体例としては、グリシン、ヒスチジン、アルギニンが例示できる。緩衝液に添加するカオトロープの具体例としては、尿素があげられる。緩衝液に添加するアルコールの具体例としては、エタノール、マンニトール、グリセロール、ベンジルアルコールがあげられる。界面活性剤は、抗体の凝集防止、または抗体と夾雑物質との非特異的相互作用もしくは結合を抑制するために用いられ、具体的には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）、ポロキサマー（商品名）（例えばポロキサマー１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ（商品名）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、ステアリルスルホベタイン、ラウリルザルコシン、ミリスチルザルコシン、リノレイルザルコシン、ステアリルザルコシン、ラウリルベタイン、ミリスチルベタイン、リノレイルベタイン、セチルベタイン、ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノレアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、イソステアラミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、イソステアラミドプロピルジメチルアミン、ココイルメチルタウリンナトリウム、オレイルメチルタウリン二ナトリウム、ＭＯＮＡＱＵＡＴ（商品名）、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０（商品名）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商品名）、ＢＲＩＪ（商品名）、Ａｔｌａｓ Ｇ２１２７（商品名）、Ｇｅｎａｐｏｌ（商品名）、ＨＥＣＡＭＥＧ（商品名）、ＬＵＢＲＯＬ ＰＸ（商品名）、ＭＥＧＡ（商品名）、ＮＰ（商品名）、ＴＨＥＳＩＴ（商品名）、ＴＯＰＰＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＤＤＭＡＵ、ＥＭＰＩＧＥＮ ＢＢ（商品名），ＡＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（商品名）、Ｃ１２Ｅ８などのイオン性または非イオン性の界面活性剤があげられる。前記界面活性剤の緩衝液への添加量は、精製する抗体および精製条件に応じて適宜決定すればよいが、一例として約０．００１％から約２０％の範囲、多くの場合約０．０１％から約１％の範囲で添加する。緩衝液に添加する糖の具体例としては、スクロース、マルトース、トレハロース、フルクトースがあげられる。
【００３１】
本発明の精製方法により溶出した抗体は、そのまま用いることもできるが、医薬品用途など、より高純度な抗体が求められる場合は、溶出した抗体を、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーといったカラムクロマトグラフィーを用いてさらに精製してもよい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の精製方法は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に抗体を含む溶液を添加して前記固相に前記抗体を吸着させ、前記固相に吸着した前記抗体を溶出液を用いて溶出させる、抗体の精製方法において、溶出液のｐＨが３．５以下であることを特徴としており、Ｆｃ領域を有した抗体を一段階の操作で高純度に精製することができる。また、本発明で使用するＦｃ結合性タンパク質の一つである、Ｆｃ受容体は従来より、抗体精製用リガンドとして用いられているプロテインＡと比較し、安全性が高いことから、本発明の精製方法は、医薬品用途といった、製品の安全性が強く求められる分野で使用する抗体の製造プロセスにおいても安心して用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩのα鎖の構造を示す図である。
【図２】ベクターｐＥＴＭａｌＥの構造を示す図である。
【図３】発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ１９の構造を示す図である。
【図４】Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルの抗体結合性を示す図である。
【図５】実施例１１で実施した、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いた精製における、模擬培養液中、カラム通過液中、および抗体回収溶液中のタンパク質純度を示すクロマトグラムを示す図である。
【図６】実施例１２で実施した、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いた精製における、模擬培養液中、カラム通過液中、および抗体回収溶液中のタンパク質純度を示すクロマトグラムを示す図である。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１ 天然型Ｆｃ結合性タンパク質発現株の調製
特許文献４に開示されている方法に従い、天然型Ｆｃ結合性タンパク質発現株を調製した。具体的な調製方法を以下に示す。
（１）天然型Ｆｃ結合性タンパク質として、ヒトＦｃγＲＩのうち細胞外領域を含む領域（具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含む領域）を選択し、当該領域をコードするポリヌクレオチドをｐＥＣＥｄｈｆｒプラスミドに挿入することで、ヒトＦｃγＲＩ発現ベクターｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒを作製した。
（２）ヒトＦｃγＲＩ発現ベクターｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒで、ｄｈｆｒ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞ＤＢＸ−１１株（非特許文献２）を形質転換した。
（３）（２）で形質転換したＣＨＯ細胞を５ｎＭのメソトレキセート（ＭＴＸ）を含む培地で培養し、増殖した細胞株をモノクローナル化後、それぞれの細胞株について抗体結合活性を測定した。抗体結合活性は、下記の方法で測定した。
（３−１）マキシソープ９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ社製）に、１０μｇ/ｍＬのヒトガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）１００μＬを各ウェルに添加し、４℃で１６時間静置することによってヒトガンマグロブリンをプレート固相に固定化した。
（３−２）ヒトガンマグロブリンを固定化したプレートを０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＴＢＳＴ）で洗浄した。
（３−３）Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ（ＰＩＥＲＣＥ社製）２００μＬを各ウェルに添加し、３０℃で２時間静置することによりブロッキング工程を行ない、Ｆｃ結合性タンパク質定量用ＥＬＩＳＡプレートを作製した。
（３−４）形質転換したＣＨＯ細胞の培養上清を適当な倍率で希釈し、（３−３）で作製したＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、３０℃で１時間反応させた。
（３−５）（３−４）の反応後、ＴＢＳＴにて洗浄し、１００００倍希釈したＨｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１００μＬを各ウェルに添加し、３０℃で１時間反応させた。
（３−６）ＴＢＳＴによりプレートを洗浄後、ＨＲＰの基質（ＴＭＢ：ナカライテスク社製）を添加し、２分間放置後、１Ｍのリン酸水溶液で反応を停止した。
（３−７）４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、定量のための標準物質として市販のヒトＦｃγＲＩ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を使用し、その吸光度との比較からＦｃ結合性タンパク質を定量した。
（４）（３）の結果得られた、Ｆｃ結合性タンパク質発現量が多い細胞株について、５０ｎＭのＭＴＸを含む培地で培養し、（３）の方法でＭＴＸ耐性を獲得した細胞株の抗体結合活性を測定した。
（５）（３）と（４）の操作を繰り返すことにより、培地中のＭＴＸ濃度を上昇させ、最終的には５μＭ（初期スクリーニング濃度の１０００倍）のＭＴＸ存在下においても増殖する細胞株、すなわち、ＭＴＸ耐性の獲得と連動し、Ｆｃ結合性タンパク質を大量に発現するＣＨＯ細胞株を調製した。
【００３６】
実施例２ 天然型Ｆｃ結合性タンパク質の調製
実施例１で調製した天然型Ｆｃ結合性タンパク質を発現する細胞株より、以下の方法で前記タンパク質の生産を行なった。
（１）実施例１で調製したＦｃ結合性タンパク質を発現するＣＨＯ細胞株を、高密度培養システムＢｅｌｌｏＣｅｌｌ（ＣＥＳＣＯ社製）を用い、５％透析ウシ胎児血清入りＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）にて培養した（３７℃、５日間）。
（２）培養した細胞株の培地を、５％透析ウシ胎児血清入りＤ−ＭＥＭ／ＥｘＣｅｌｌ３０２（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）の等量混合培地に交換し、ＢｅｌｌｏＣｅｌｌ（ＣＥＳＣＯ社製）用い、さらに培養した（３７℃、３０日間）。なお、培養中、栄養源が枯渇する前に培養上清を回収し、新たな培地と交換している。
（３）（２）の培養で得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を含む培養上清（合計１０Ｌ）を、２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で透析することで脱塩処理を施し、あらかじめ前記緩衝液で平衡化したＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ ＳＰゲル（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）３００ｍＬを充填した吸着流動床システム（ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ Ｃ−５０、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に前記脱塩処理した培養上清を添加した。
（４）２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で洗浄後、１０％ グリセロール、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりＦｃ結合性タンパク質を溶出させた。
（５）（４）で得られたＦｃ結合性タンパク質を含む画分を、２０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析し、前記緩衝液で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰゲルを充填したカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加した。
（６）２０ｍＭイミダゾールと０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、５００ｍＭ イミダゾールと０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でＦｃ結合性タンパク質を溶出させた。
【００３７】
イムノグロブリンを標準タンパク質としてブラッドフォード法（プロテインアッセイキット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）によりタンパク質の定量を行なった結果、約１０Ｌの培養上清から天然型Ｆｃ結合性タンパク質を約２０ｍｇ調製することができた。
【００３８】
実施例３ 変異型Ｆｃ結合性タンパク質発現株の調製
本実施例では、発現させるＦｃ結合性タンパク質を天然型（実施例１から２）から変異型に変更した。
【００３９】
本実施例で発現させる変異型Ｆｃ結合性タンパク質は、Ｆｃ結合性タンパク質の一つである天然型のヒトＦｃγＲＩのうち、細胞外領域にあるアミノ酸の一部を他のアミノ酸に置換したヒトＦｃγＲＩであり、具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むヒトＦｃγＲＩである。配列番号２は、配列番号１に記載の天然型ヒトＦｃγＲＩのアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、前記領域のアミノ酸のうち、以下に示す１９箇所のアミノ酸置換を行なったものである（特願２０１０−０５２７８９号）。
（ア）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換（Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ）
（イ）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジンに置換（Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ）
（ウ）配列番号１の３８番目のスレオニンがセリンに置換（Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ）
（エ）配列番号１の４６番目のロイシンがプロリンに置換（Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ）
（オ）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換（Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ）
（カ）配列番号１の６９番目のセリンがスレオニンに置換（Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ）
（キ）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換（Ａｒｇ７１Ｈｉｓ）
（ク）配列番号１の７７番目のバリンがグルタミン酸に置換（Ｖａｌ７７Ｇｌｕ）
（ケ）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換（Ａｓｎ７８Ａｓｐ）
（コ）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換（Ｉｌｅ１００Ｖａｌ）
（サ）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換（Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ）
（シ）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換（Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔ）
（ス）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換（Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ）
（セ）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換（Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ）
（ソ）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがスレオニンに置換（Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ）
（タ）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリンに置換（Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ）
（チ）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換（Ａｓｎ２４０Ａｓｐ）
（ツ）配列番号１の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換（Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓ）
（テ）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換（Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎ）
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む変異型ヒトＦｃγＲＩ（以降、ＦｃＲｍ１９とする）をコードするポリヌクレオチドを、下記に示す２段階のＰＣＲにより、配列番号３から３８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて合成した。
（１−１）表１に示す反応液を用い、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６２℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで、１段階目のＰＣＲ反応を行なった。なお、表１に記載のＤＮＡミックスは、５０ｐｍｏＬ／μＬの前記３６種類のオリゴヌクレオチド（配列番号３から３８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド）溶液を同量ずつ採取し混合した溶液である。
【００４０】
【表１】
（１−２）１段階目のＰＣＲの反応液を鋳型とし、表２に示す反応液を用い、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６５℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで、２段階目のＰＣＲ反応を行なった。なお、ＰＣＲプライマーは配列番号３９に記載の配列（５’−ＴＣＡＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’；角かっこ内は制限酵素ＮｃｏＩサイト）と配列番号４０に記載の配列（５’−ＣＣ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’；角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト）からなる各オリゴヌクレオチドを用いた。
【００４１】
【表２】
（２）２段階目のＰＣＲ産物から、アガロースゲルを用いて抽出精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、キアゲン社製）し、ＦｃＲｍ１９をコードするポリヌクレオチドを調製した。
（３）ｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミドベクターを基に、下記の方法により、ＦｃＲｍ１９を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させるためのベクターを作製した。
（３−１）配列番号４１に記載のアミノ酸配列（ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡ、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までのアミノ酸配列に相当）からなるＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製するために、配列番号４２に記載の配列（５’−ＴＡＴＡ［ＣＡＴＡＴＧ］ＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｄｅＩサイト）、配列番号４３に記載の配列（５’−ＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣ−３’）、配列番号４４に記載の配列（５’−ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧ−３’）、および配列番号４５に記載の配列（５’−ＴＴＧＴＣ［ＣＣＡＴＧＧ］ＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｃｏＩサイト）からなる各オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法により連結した。ＰＣＲ反応は表３に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なった。
【００４２】
【表３】
（３−２）（３−１）のＰＣＲ産物を鋳型とし、表１に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうＰＣＲ反応をすることで、ＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。なお、表１に記載のＤＮＡミックスは、５０ｐｍｏＬ／μＬの配列番号４２または４５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド溶液を同量ずつ採取し混合した溶液である。
（３−３）（３−２）で調製したＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションし、ヒートショック法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（３−４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、培養した形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出することで、ベクターｐＥＴＭａｌＥを調製した。ｐＥＴＭａｌＥの概略を図２に示す。
（３−５）ｐＥＴＭａｌＥベクターを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＦｃＲｍ１９をコードするポリヌクレオチドをライゲーション反応により挿入した。
（３−６）ライゲーション後、ヒートショック法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（３−７）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、定法に従いプラスミドを抽出する（Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、キアゲン社製）ことで、発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ１９を調製した。ｐＥＴＦｃＲｍ１９の概略を図３に示す。
（４）ヒートショック法によりｐＥＴＦｃＲｍ１９で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【００４３】
実施例４ 塩基配列の解析
発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ１９（図３）に挿入されているポリヌクレオチドの塩基配列を、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて解析した。なお、シークエンス用プライマーとして、配列番号４６に記載の配列（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）と配列番号４７に記載の配列（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いた。
【００４４】
解析の結果、ｐＥＴＦｃＲｍ１９に挿入されているポリヌクレオチドの配列は設計通りであることを確認した。ｐＥＴＦｃＲｍ１９に挿入されているポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号４８に、前記ポリヌクレオチドから翻訳したＭａｌＥシグナルペプチドを含めたＦｃＲｍ１９のアミノ酸配列を配列番号４９にそれぞれ示す。
【００４５】
なお、配列番号４９のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド（配列番号４１）、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでが変異型ＦｃγＲＩであるＦｃＲｍ１９（配列番号２に記載のアミノ酸配列）、３０８番目から３１３番目までのヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号４９において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔのメチオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏのプロリンは２２５番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目の位置にそれぞれある。
【００４６】
実施例５ 変異型Ｆｃ結合性タンパク質の調製
（１）実施例３で作製したＦｃＲｍ１９を発現する形質転換体（大腸菌）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２×ＴＹ液体培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養することで前培養を行なった。
（２）前培養液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２×ＴＹ培地（５００ｍＬ）に添加し、３７℃で振とう培養した。培養開始１．５時間後に培養温度を２０℃に切り換えるとともにＩＰＴＧを終濃度０．０１ｍＭとなるよう添加し、引き続き２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養終了後、遠心分離操作（１００００ｒｐｍ、２０分間）により得られた湿菌体を、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）および２０ｍＭ イミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、タンパク質抽出液を調製するために４℃に冷却しながら超音波破砕処理した。
（４）超音波破砕処理液を遠心分離操作（１００００×ｇ、２０分、４℃）により、破砕物からＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を遠心上清として回収した。
（５）遠心上清を５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および２０ｍＭ イミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したニッケルキレートカラム（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に添加し、前記緩衝液で洗浄後、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および５００ｍＭ イミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、吸着したＦｃ結合性タンパク質を溶出した。
（６）（５）の溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭ ＮａＣｌと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加し、前記緩衝液で洗浄後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０と１０％ グリセリンを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でＦｃ結合性タンパク質を溶出した。なお溶出する際、あらかじめ溶出量の１／４量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を入れた試験管に集めることで、溶出液をただちに中和した。
（７）溶出したタンパク質の純度を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびクマシーブリリアントブルー染色（ＣＢＢ染色）により確認し、抗体結合活性の確認は実施例１の方法と同様に行なった。
【００４７】
結果、大腸菌培養液１Ｌから精製Ｆｃ結合性タンパク質を約５ｍｇ調製できた。
【００４８】
実施例６ 天然型Ｆｃ結合性タンパク質固定化カラムの作製
実施例２で調製した天然型Ｆｃ結合性タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとしての性能を評価するために、前記タンパク質をクロマトグラフィー用ゲルに固定化した。
（１）実施例２で調製した天然型Ｆｃ結合性タンパク質溶液１０００μＬ（濃度：１２．１ｍｇ／ｍＬ）に、エポキシトヨパールゲル（東ソー社製）０．５ｇ（乾燥重量）と３Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１５００μＬとを添加し、２５℃で１６時間反応した。エポキシトヨパールへの天然型Ｆｃ結合性タンパク質の固定化量を、ＨＰＬＣ法［カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−ＳＴＡＴ（３．０ｍｍＩＤ×３．５ｃｍ、東ソー社製）、溶離液Ａ：２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、溶離液Ｂ：１Ｍ ＮａＣｌを含む溶離液Ａ、溶出条件：１０分間の直線濃度勾配；Ｂ ０％からＢ １００％、検出：ＵＶ２２０ｎｍ］により反応液中の残存量を求めることで算出した結果、投入した天然型Ｆｃ結合性タンパク質の約８０％以上がエポキシトヨパールゲルと反応しており、固定化が良好であることを確認した。
（２）固定化反応終了後、ゲルスラリーをフィルター付きのカラムに移して余分な反応液をろ過して除去した。
（３）水、引き続き２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をそれぞれ（２）のカラムに通液してゲルを充分に洗浄後、空カラムに天然型Ｆｃ結合性タンパク質を固定化したエポキシトヨパールゲル５００μＬ容量を充填した。
【００４９】
実施例７ 天然型Ｆｃ結合性タンパク質固定化カラムの抗体結合性
（１）実施例６で作製した天然型Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル（Ｆｃ結合性タンパク質の固定化量：２０ｍｇ／ｍＬゲル）を充填したカラム（５００μＬ容量）に、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を５ｍＬ添加し、引き続き５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したヒトポリクローナル抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）を３０ｍｇ添加し、１０分間静置した。
（２）５０ｍＭ リン酸緩衝液にて充分に洗浄することで未吸着の抗体をカラムから溶出させた後、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をカラムに添加することで、ゲルに吸着した抗体を溶出させた。溶出液中の抗体濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１％濃度の抗体液の２８０ｎｍにおける吸光度（光路長：１０ｍｍ）１４．０を基に算出した。結果、ゲル１ｍＬあたり約２２．０ｍｇの抗体を吸着したことが判明した。
【００５０】
実施例８ 変異型Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルの作製
実施例５で調製した変異型Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）のアフィニティクロマトグラフィー用リガンドとしての性能を評価するために、前記タンパク質をクロマトグラフィー用ゲルに固定化した。
（１）実施例５で調製したＦｃＲｍ１９溶液５５０μＬ（濃度：４．６ｍｇ／ｍＬ）に、エポキシトヨパールゲル（東ソー社製）０．１５ｇ（乾燥重量）と３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１７５μＬを添加し、２０℃で１４時間反応させた。エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ１９の固定化量を、ＨＰＬＣ法［カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−ＳＴＡＴ（３．０ｍｍＩＤ×３．５ｃｍ、東ソー社製）、溶離液Ａ：２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、溶離液Ｂ：１Ｍ ＮａＣｌを含む溶離液Ａ、溶出条件：１０分間の直線濃度勾配；Ｂ ０％からＢ １００％、検出：ＵＶ２２０ｎｍ］により反応液中の残存量を求めることで算出した結果、投入したＦｃＲｍ１９の約９０％以上がエポキシトヨパールゲルと反応しており、固定化が良好であることを確認した。
（２）固定化反応終了後、ゲルスラリーをフィルター付きのカラムに移して余分な反応液をろ過して除去した。
（３）水、引き続き２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をそれぞれ（２）のカラムに通液してゲルを充分に洗浄後、ＦｃＲｍ１９を固定化したエポキシトヨパールゲル１５０μＬ容量を空カラムに充填した。
【００５１】
実施例９ 変異型Ｆｃ結合性タンパク質固定化カラムの抗体結合性
（１）実施例８で作製した変異型Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲル（ＦｃＲｍ１９の固定化量：１５ｍｇ/ｍＬゲル）を充填したカラム（１５０μＬ容量）に、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を５ｍＬ添加し、引き続き５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したヒトポリクローナル抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）を１５ｍｇ添加し、１０分間静置した。
（２）５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて充分に洗浄することで未吸着の抗体をカラムから溶出させた後、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をカラムに添加することで、ゲルに吸着した抗体を溶出させた。溶出液中の抗体濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１％濃度の抗体液の２８０ｎｍにおける吸光度（光路長：１０ｍｍ）１４．０を基に算出した。結果、ゲル１ｍＬあたり約１８．０ｍｇの抗体を吸着したことが判明した。
【００５２】
実施例１０ Ｆｃ結合性タンパク質固定化カラムの吸着特性
（１）実施例８で作製した変異型Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲル（ＦｃＲｍ１９の固定化量：１５ｍｇ／ｍＬゲル）を充填したカラム（１５０μＬ容量）に、実施例９と同量のヒトポリクローナル抗体を添加し、ゲルに吸着させた。
（２）５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて充分に洗浄することで未吸着の抗体をカラムから溶出させた後、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０からｐＨ４．６）をそれぞれカラムに添加し、ゲルから溶出した液を分取した（以降、抗体溶出液１とする）。
（３）最後に５０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をカラムに添加することで、ゲルに吸着したままの抗体を完全に溶出させた（以降、抗体溶出液２とする）。
【００５３】
分取した抗体溶出液１および２のタンパク質濃度をブラッドフォード法にてそれぞれ定量し、各ｐＨにおける抗体溶出割合を算出した。結果を図４に示す。図４からわかるように、クエン酸緩衝液のｐＨが３．５以下であればゲルに吸着した抗体の８０％以上を回収できることがわかり、特にｐＨを３．３以下にするとゲルに吸着した抗体をほぼ全量回収できることがわかる。一方、ｐＨが４．６ではゲルに吸着した抗体の数％しか溶出していないことから、ゲルに吸着した抗体を溶出する前に、ゲルに非特異的に吸着した夾雑物質を除去する操作（洗浄操作）を行なう場合、洗浄液のｐＨを４．５以上にすると、ゲルに吸着した抗体を溶出させることなく夾雑物質を除去できることがわかる。
【００５４】
実施例１１ 変異型Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる抗体精製（その１）
（１）模擬培養液として、ＣＨＯ細胞（ＤＢＸ−１１株）を、１０％のウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）を含むα−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地で常法に従い培養し、これにヒトポリクローナル抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）１ｍｇ／ｍＬとなるよう添加したものを調製した。
（２）模擬培養液を遠心分離操作（１００００ｒｐｍ、１０分）することにより、培養液中のＣＨＯ細胞を取り除いた。
（３）あらかじめ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した、実施例８で作製した変異型Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲルを充填したカラムに、（２）の遠心上清１０ｍＬ添加した。
（４）０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄することで、ゲルに非特異的に吸着する夾雑成分を取り除いた後、５０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でゲルに吸着した抗体を溶出させた。なお、溶出液はただちに５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析することで、ｐＨを中性に戻した（抗体回収溶液）。
（５）模擬培養液、カラム通過液および抗体回収溶液をサイズ排除クロマトグラフィー［カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ ７．８ｍｍＩＤｘ３０ｃｍ（東ソー社製）、溶離液：１５０ｍＭのＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、流速：１．０ｍｌ／分、検出波長：２８０ｎｍ］による成分分析で各液中のタンパク質組成を確認した。
【００５５】
結果を図５に示す。図５からわかるように、模擬培養液から選択的にヒト抗体を回収可能であることを確認した。
【００５６】
実施例１２ 変異型Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる抗体精製（その２）
（１）以下に示す方法により、模擬培養液を調製した。
（１−１）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＢＬ２１（ＤＥ３）株を１００ｍＬのＬＢ培地を添加した５００ｍＬ容量のバッフル付き三角フラスコに接種し、３７℃にてＯＤ３．０になるまで振とう培養した。この大腸菌培養液から遠心分離操作（８０００ｒｐｍ、１５分間）により大腸菌菌体を回収した。
（１−２）得られた菌体を５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＬに懸濁し、超音波破砕法により菌体を破砕した。
（１−３）菌体破砕液から遠心分離操作（１２０００ｒｐｍ、１５分間）により遠心上清（大腸菌タンパク質抽出液）を得た。
（１−４）遠心上清にヒトポリクローナル抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）を１ｍｇ／ｍＬの終濃度となるように添加したものを模擬培養液とした。
（２）あらかじめ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した、実施例８で作製した変異型Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲルを充填したカラムに、模擬培養液１０ｍＬ添加した。
（３）０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄することで、ゲルに非特異的に吸着する夾雑成分を取り除き、さらに０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄した後、５０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でゲルに吸着した抗体を溶出させた。なお、溶出液はただちに５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析することで、ｐＨを中性に戻した（抗体回収溶液）。
（４）模擬培養液、カラム通過液および抗体回収溶液を、実施例１１と同様のサイズ排除クロマトグラフィーによる成分分析で各液中のタンパク質組成を確認した。
【００５７】
結果を図６に示した。図６からわかるように、模擬培養液から選択的にヒト抗体を回収可能であることを確認した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体を精製する方法に関する。特に本発明は、抗体のＦｃ領域と特異的に結合する、Ｆｃ結合性タンパク質を用いて抗体を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体はバイオテクノロジー産業の中心となる機能性タンパク質であり、抗体医薬や診断薬として広く利用されている。抗体は、遺伝子組換え技術を用いて得られる組換え動物細胞を培養することで大量に発現させることができ、発現した抗体は、細胞の分離や培養液の清澄化などの粗精製後、カラムクロマトグラフィーによる精製を経て、高純度に精製することができる。
【０００３】
カラムクロマトグラフィーによる抗体をはじめとするタンパク質の精製は、一般にイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなど分離モードが異なる各種クロマトグラフィーを組み合わせることで行なわれ、精製に用いるクロマトグラフィーの操作条件は、試行錯誤の上決定される。一方、精製対象のタンパク質と特異的に結合する物質（リガンド）を固相に固定化したものを用いた、アフィニティークロマトグラフィーによる精製も行なわれている。アフィニティークロマトグラフィーによる方法は、前述した各種クロマトグラフィーを組み合わせる方法とは異なり、夾雑物質を多く含む培養液中から一段階かつ高純度に目的タンパク質を精製可能な方法である。
【０００４】
抗体精製においては、従来より黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のプロテインＡ（分子量約４６０００）をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーが多く用いられている。プロテインＡは抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合する性質を有しているため、プロテインＡを固相に固定化することで抗体を高純度に精製することが可能である。しかしながらプロテインＡは病原菌である黄色ブドウ球菌由来のタンパク質であり、固定化した固相から漏れた場合における免疫原性発生のリスクが未だに否定できない。特に医薬品として抗体を製造するには、抗体発現時に用いた培養液に由来する物質や、抗体精製において混入する物質などを除去するとともに、これらの物質の安全性を徹底して高める必要がある。
【０００５】
黄色ブドウ球菌由来であるプロテインＡよりも安全性が高く、かつ抗体と特異的に結合する物質として、ヒトＦｃ受容体が知られている（例えば、非特許文献１参照）。Ｆｃ受容体は、免疫細胞の表面に存在する分子量数万のタンパク質であり、生体内で抗体と結合し免疫細胞内にシグナルを伝達し免疫機構を機能させる役割を担っている。すなわち、Ｆｃ受容体は生体内の複雑な環境においても抗体を高度に認識する機能を有する物質といえる。Ｆｃ受容体をリガンドとして固相に固定化し抗体を精製する方法についてはいくつか開示されているが（特許文献１から３参照）、抗体を高純度に精製する条件の記載はなく、未だ精製方法の確立には至ってはいない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５３１０８６号公報
【特許文献２】特開２００８−２４５５８０号公報
【特許文献３】特開２０１０−１２６４３６号公報
【特許文献４】特開２００９−２７８９４８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｇ．Ｕｒｌａｎｄ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６，１９８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
抗体を製造するにあたり、前記抗体を発現可能な組換え体を培養することで得られた培養液から精製する必要があるが、精製する際、培養液由来の夾雑物質を確実に除去でき、回収率が高く、安全性が高く、かつ簡便な方法で精製できることが望まれている。しかしながら、従来より多く用いられているプロテインＡをリガンドとした場合、前述したようにプロテインＡが病原菌由来のタンパク質であることから安全性の面で疑問がある。またＦｃ受容体をリガンドとして用いた場合は、安全性はプロテインＡと比較し高いものの、抗体を高純度に精製する条件については確立されていない。
【０００９】
そこで本発明の目的は、Ｆｃ受容体といった、抗体のＦｃ領域を高度に認識するタンパク質（以下、Ｆｃ結合性タンパク質）をリガンドとしたアフィニティクロマトグラフィーによる、抗体を高純度に精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に抗体を含む溶液を添加して、前記固相に前記抗体を吸着させ、前記固相に吸着した前記抗体を溶出液を用いて溶出させる、抗体の精製方法において、溶出液のｐＨを制御することで、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１２】
第一の発明は、
Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に抗体を含む溶液を添加して前記固相に前記抗体を吸着させ、
前記固相に吸着した前記抗体を溶出液を用いて溶出させる、抗体の精製方法であって、
溶出液のｐＨが３．５以下である、前記精製方法である。
【００１３】
第二の発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる前に、ｐＨ４．５以上の洗浄液を用いて前記固相に吸着した夾雑物質を除去する、第一の発明に記載の精製方法である。
【００１４】
第三の発明は、Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩであり、抗体が完全ヒト抗体またはヒト化抗体である、第一または第二の発明に記載の精製方法である。
【００１５】
第四の発明は、ヒトＦｃγＲＩが、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたタンパク質
である、第三の発明に記載の精製方法である。
【００１６】
第五の発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたヒトＦｃγＲＩを固定化した、抗体を精製するための固相である。
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
本発明の精製方法で精製する抗体は、免疫グロブリンの定常領域である、Ｆｃ領域を含むタンパク質のことをいい、免疫グロブリンそのものであってもよいし、Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質であってもよい。また、前記Ｆｃ領域には、例えばパパインなどのプロテアーゼの処理によって免疫グロブリンから生じる、ヒンジやＣＨ２ドメインやＣＨ３ドメインを含んでいてもよい。
【００１９】
Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質は、遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。前記融合タンパク質は、抗体のＦｃ領域と他のタンパク質とを直接結合させたタンパク質でもよいし、抗体のＦｃ領域と他のタンパク質との間に適当なリンカー配列を介して結合させたタンパク質でもよい。また、他のタンパク質へのＦｃ領域の融合位置は、前記他のタンパク質のＮ末端側でもよいし、Ｃ末端側でもよい。Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質は、遺伝子組換え技術を用いて得られた前記融合タンパク質を発現可能な宿主を培養することで製造することができる。前記融合タンパク質を発現させるための宿主としては、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）などの動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、大腸菌やバチルス属細菌などの細菌、パン酵母やポンベ酵母などの酵母、麹菌などのカビが例示でき、生産性を評価し、適切な宿主を選択すればよい。一例として、融合タンパク質が表面に糖鎖を必要とするタンパク質の場合、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、カビといった真核細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞がより好ましい。
【００２０】
本発明の精製方法で精製する抗体の由来に特に限定はなく、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ラクダ抗体を例示することができるが、Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃ受容体である場合は、ヒト抗体が好ましい。本発明の精製方法で精製するヒト抗体の一例として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が例示できる。なお、ここでいうヒト抗体は、ヒト由来の抗体である完全ヒト抗体の他に、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体）に由来した最小の配列を含むキメラ抗体である、ヒト化抗体も含まれる。ヒト化抗体の一例として、抗体のうち、要求される抗原への結合特異性や親和性を決定付ける領域である超可変領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）を構成するアミノ酸残基を、非ヒト抗体の前記領域を構成するアミノ酸残基に置換した抗体があげられる。ヒト化抗体の別の例として、ヒト抗体のＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）を構成するアミノ酸残基を、前記領域を構成する非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換した抗体があげられる。なお、前記ヒト化抗体は、受容抗体やドナー抗体中には存在しないアミノ酸を含んでもよい。
【００２１】
本発明の精製方法で精製する抗体の種類に特に限定はなく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、直鎖抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））、脱フコシル抗体、およびそれらの断片が例示できる。
【００２２】
本発明の精製方法における抗体を含む溶液として、抗体を発現可能な宿主（動物細胞、昆虫細胞、細菌、酵母、カビなど）の培養液、抗体を発現可能な植物の破砕液、動物の乳などが例示できる。なお、抗体を含む溶液には、抗体を発現可能な宿主の細胞を含んでいてもよいし、あらかじめ前処理により前記細胞を除去してもよい。前記前処理は、遠心分離操作、精密ろ過膜や限外ろ過膜による濾過操作、といった当業者にとって周知な操作により行なえばよい。
【００２３】
本発明の精製方法において固相に固定化する（リガンドとして使用する）Ｆｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域を高度に認識し、特異的に結合するタンパク質のことをいう。Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃ受容体である場合、ヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩＩが例示できる。前記Ｆｃ受容体は、それぞれ、免疫細胞表面に存在し抗体（ＩｇＧ）と結合し免疫信号を細胞質内に伝達し、免疫システムを機能させる役割を担っている。前記Ｆｃ受容体のうちヒトＦｃγＲＩは、抗体と結合するα鎖と、α鎖と作用し免疫信号を細胞質内に伝達するγ鎖からなるタンパク質である。ヒトＦｃγＲＩのα鎖の概略構造を図１に示す。ヒトＦｃγＲＩのα鎖は、Ｎ末端側から、１５アミノ酸からなるシグナルペプチド（ＳＳ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目のメチオニンから１５番目のグリシンまでの領域）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目のバリンから３１３番目のイソロイシンまでの領域）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目のアルギニンから３７４番目のスレオニンまでの領域）から構成される。
【００２４】
本発明の精製方法における、リガンドとして使用するＦｃ結合性タンパク質は、必ずしもＦｃ結合性タンパク質の全領域を含むタンパク質である必要はなく、少なくとも抗体のＦｃ領域と結合可能な領域のアミノ酸残基を含むタンパク質であればよい。また、前記抗体のＦｃ領域と結合可能な領域のアミノ酸残基を含むタンパク質は、天然型のＦｃ結合性タンパク質のうち抗体のＦｃ領域と結合可能な領域のアミノ酸残基を含むタンパク質そのものであってもよいし、前記領域のアミノ酸残基のうちの一つ以上を置換、欠失、挿入したタンパク質であってもよい。なお、前記アミノ酸の置換、欠失、挿入を行なう箇所およびその数は、抗体結合活性を失わない限り任意設定が可能である。また、前記アミノ酸の置換、欠失、挿入には、ヒドロキシアミン法やＰＣＲ法といった従来より用いられる方法で行なえばよい。
【００２５】
Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩの場合、本発明の精製方法においてリガンドとして使用可能なＦｃ結合性タンパク質の第一の態様として、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの細胞外領域（図１のＥＣ領域）中にある抗体結合ドメイン領域、すなわち９５番目のプロリンから１８４番目のスレオニンまでのアミノ酸を少なくとも含むタンパク質があげられる。また、リガンドとして使用可能なＦｃ結合性タンパク質の第二の態様として、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列のうち少なくとも９５番目のプロリンから１８４番目のスレオニンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたタンパク質があげられる（特願２００９−２７４３５２号）。リガンドとして使用可能なＦｃ結合性タンパク質の第三の態様として、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの細胞外領域（図１のＥＣ領域）中の、少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質があげられる。また、リガンドとして使用可能なＦｃ結合性タンパク質の第四の態様として、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたタンパク質があげられる。前記第四の態様の具体例として、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質であって、
（ア）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換
（イ）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジンに置換
（ウ）配列番号１の３８番目のスレオニンがアラニンまたはセリンに置換
（エ）配列番号１の４６番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（オ）配列番号１の６２番目のアラニンがバリンに置換
（カ）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（キ）配列番号１の６９番目のセリンがフェニルアラニンまたはスレオニンに置換
（ク）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（ケ）配列番号１の７７番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（コ）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（サ）配列番号１の９４番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（シ）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（ス）配列番号１の１１０番目のセリンがアスパラギンに置換
（セ）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（ソ）配列番号１の１２５番目のヒスチジンがアルギニンに置換
（タ）配列番号１の１３１番目のロイシンがアルギニンまたはプロリンに置換
（チ）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがロイシンに置換
（ツ）配列番号１の１５６番目のロイシンがプロリンに置換
（テ）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換
（ト）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（ナ）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（ニ）配列番号１の１９９番目のスレオニンがセリンに置換
（ヌ）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがリジン、セリンまたはスレオニンに置換
（ネ）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリンに置換
（ノ）配列番号１の２１８番目のロイシンがバリンに置換
（ハ）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（ヒ）配列番号１の２４８番目のロイシンがセリンに置換
（フ）配列番号１の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換
（ヘ）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換
のいずれかのアミノ酸置換を一つ以上含む、タンパク質があげられる（特願２０１０−０５２７８９号）。なお、前記第一から第四の態様において、細胞外領域（図１のＥＣ領域）のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳＳ領域）の全てまたは一部が含まれていてもよいし、細胞外領域（図１のＥＣ領域）のＣ末端側にある膜貫通領域（図１のＴＭ領域）の全てまたは一部や細胞内領域（図１のＣ領域）の一部が含まれていてもよい。また、ポリヒスチジンタグといった、精製などを行なうためのタグペプチドがＮ末端側またはＣ末端側に付加されていてもよい。
【００２６】
本発明の精製方法においてリガンドとして使用するＦｃ結合性タンパク質は、遺伝子組換え技術を用いて製造するのが好ましく、前記Ｆｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列や前記Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、公的データベースに公表されている配列を参考にすることができる（例えばＮＣＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。なお、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際は、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましく、コドンの使用頻度の解析には公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することができる。遺伝子組換え技術を用いてＦｃ結合性タンパク質を製造するには、前述した方法で得られたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現させる宿主に適切な発現ベクターに挿入後、前記ベクターで前記宿主を形質転換することで、Ｆｃ結合性タンパク質を発現可能な宿主を調製し、前記宿主を培養することでＦｃ結合性タンパク質を製造すればよい。
【００２７】
本発明の精製方法で用いるＦｃ結合性タンパク質を固定化させる固相は、クロマトグラフィーで通常用いられる固相の中から適宜選択可能であり、固相の材料の一例として、親水性ビニルポリマー、シリカ、ガラス、アガロース、セルロース、ハイドロキシアパタイト、ポリスチレンがあげられる。本発明の精製方法で用いる固相は、空孔の大きさおよび量が適切に制御されたものが好ましいが、メンブラン型の固相であってもよい。固相にＦｃ結合性タンパク質を固定化させるには、あらかじめ固相表面にエポキシ基、ホルミル基、アミノ基、カルボキシル基、トレシル基などの活性基を導入し、前記固相と前記Ｆｃ結合性タンパク質とを前記活性基を介して共有結合により固定化させればよい。
【００２８】
本発明の精製方法においてＦｃ結合性タンパク質を固定化した固相に抗体を吸着させるには、適切な空カラムに充填したＦｃ結合性タンパク質を固定化した固相に、抗体を含む溶液（培養液など）を適切な送液システムを用いて直接添加して吸着させればよい。固相に添加する、抗体を含む溶液のｐＨは、抗体の有するＦｃ領域が変性しない条件であれば、特に制限はないが、後述するようにｐＨ３．５以下とすると固相から抗体が溶出するため、ｐＨ４からｐＨ１０が好ましく、ｐＨ４から８がより好ましい。
【００２９】
本発明の精製方法において固相に吸着した抗体は、溶出液を用いて速やかに溶出させてもよいが、溶出させる前に洗浄液を用いて固相に吸着した夾雑物質をあらかじめ除去すると抗体の精製度が向上する点で好ましい。溶出液および洗浄液は緩衝液を用いると好ましく、そのｐＨは、後述の実施例で示すように、ｐＨ３．５以下の条件では固相に吸着した抗体の８０％以上を溶出すること、およびｐＨ４．６以上の条件では固相に吸着した抗体の数％しか溶出しないことから、溶出液のｐＨは３．５以下であり、洗浄液のｐＨは４．５以上である。特に、溶出液のｐＨを３．３以下にすると固相に吸着した抗体のほぼ全量が溶出できるため好ましい。
【００３０】
溶出液および洗浄液として用いる緩衝液には、少なくとも前記条件のｐＨが緩衝領域に入るような緩衝成分を含んでいればよく、緩衝成分の一例として、酢酸、クエン酸、ヒスチジン、リン酸、ホウ酸、アンモニウム塩（例えば、酢酸アンモニウムやコハク酸アンモニウム）、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、およびこれらの組み合わせがあげられる。なお、溶出液および洗浄液として用いる緩衝液には、必要に応じ、さらなる添加剤を含んでもよい。前記添加剤の一例として、塩、アミノ酸、カオトロープ、アルコール、界面活性剤などのタンパク質安定化剤、糖があげられる。塩は緩衝液のイオン強度を調整するために用いられ、具体的には、塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩化物、硫酸ナトリウムなどの硫酸塩、酢酸ナトリウムなどの酢酸塩、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸塩、リン酸ナトリウムなどのリン酸塩が例示できる。緩衝液に添加するアミノ酸の具体例としては、グリシン、ヒスチジン、アルギニンが例示できる。緩衝液に添加するカオトロープの具体例としては、尿素があげられる。緩衝液に添加するアルコールの具体例としては、エタノール、マンニトール、グリセロール、ベンジルアルコールがあげられる。界面活性剤は、抗体の凝集防止、または抗体と夾雑物質との非特異的相互作用もしくは結合を抑制するために用いられ、具体的には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０または８０）、ポロキサマー（商品名）（例えばポロキサマー１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ（商品名）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、オクチルグリコシドナトリウム、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、ステアリルスルホベタイン、ラウリルザルコシン、ミリスチルザルコシン、リノレイルザルコシン、ステアリルザルコシン、ラウリルベタイン、ミリスチルベタイン、リノレイルベタイン、セチルベタイン、ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノレアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、イソステアラミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、イソステアラミドプロピルジメチルアミン、ココイルメチルタウリンナトリウム、オレイルメチルタウリン二ナトリウム、ＭＯＮＡＱＵＡＴ（商品名）、Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０（商品名）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商品名）、ＢＲＩＪ（商品名）、Ａｔｌａｓ Ｇ２１２７（商品名）、Ｇｅｎａｐｏｌ（商品名）、ＨＥＣＡＭＥＧ（商品名）、ＬＵＢＲＯＬ ＰＸ（商品名）、ＭＥＧＡ（商品名）、ＮＰ（商品名）、ＴＨＥＳＩＴ（商品名）、ＴＯＰＰＳ、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＤＤＭＡＵ、ＥＭＰＩＧＥＮ ＢＢ（商品名），ＡＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（商品名）、Ｃ１２Ｅ８などのイオン性または非イオン性の界面活性剤があげられる。前記界面活性剤の緩衝液への添加量は、精製する抗体および精製条件に応じて適宜決定すればよいが、一例として約０．００１％から約２０％の範囲、多くの場合約０．０１％から約１％の範囲で添加する。緩衝液に添加する糖の具体例としては、スクロース、マルトース、トレハロース、フルクトースがあげられる。
【００３１】
本発明の精製方法により溶出した抗体は、そのまま用いることもできるが、医薬品用途など、より高純度な抗体が求められる場合は、溶出した抗体を、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーといったカラムクロマトグラフィーを用いてさらに精製してもよい。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の精製方法は、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に抗体を含む溶液を添加して前記固相に前記抗体を吸着させ、前記固相に吸着した前記抗体を溶出液を用いて溶出させる、抗体の精製方法において、溶出液のｐＨが３．５以下であることを特徴としており、Ｆｃ領域を有した抗体を一段階の操作で高純度に精製することができる。また、本発明で使用するＦｃ結合性タンパク質の一つである、Ｆｃ受容体は従来より、抗体精製用リガンドとして用いられているプロテインＡと比較し、安全性が高いことから、本発明の精製方法は、医薬品用途といった、製品の安全性が強く求められる分野で使用する抗体の製造プロセスにおいても安心して用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩのα鎖の構造を示す図である。
【図２】ベクターｐＥＴＭａｌＥの構造を示す図である。
【図３】発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ１９の構造を示す図である。
【図４】Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルの抗体結合性を示す図である。
【図５】実施例１１で実施した、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いた精製における、模擬培養液中、カラム通過液中、および抗体回収溶液中のタンパク質純度を示すクロマトグラムを示す図である。
【図６】実施例１２で実施した、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを用いた精製における、模擬培養液中、カラム通過液中、および抗体回収溶液中のタンパク質純度を示すクロマトグラムを示す図である。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
実施例１ 天然型Ｆｃ結合性タンパク質発現株の調製
特許文献４に開示されている方法に従い、天然型Ｆｃ結合性タンパク質発現株を調製した。具体的な調製方法を以下に示す。
（１）天然型Ｆｃ結合性タンパク質として、ヒトＦｃγＲＩのうち細胞外領域を含む領域（具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含む領域）を選択し、当該領域をコードするポリヌクレオチドをｐＥＣＥｄｈｆｒプラスミドに挿入することで、ヒトＦｃγＲＩ発現ベクターｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒを作製した。
（２）ヒトＦｃγＲＩ発現ベクターｐＥＣＥＦｃＲｄｈｆｒで、ｄｈｆｒ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞ＤＢＸ−１１株（非特許文献２）を形質転換した。
（３）（２）で形質転換したＣＨＯ細胞を５ｎＭのメソトレキセート（ＭＴＸ）を含む培地で培養し、増殖した細胞株をモノクローナル化後、それぞれの細胞株について抗体結合活性を測定した。抗体結合活性は、下記の方法で測定した。
（３−１）マキシソープ９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ社製）に、１０μｇ/ｍＬのヒトガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）１００μＬを各ウェルに添加し、４℃で１６時間静置することによってヒトガンマグロブリンをプレート固相に固定化した。
（３−２）ヒトガンマグロブリンを固定化したプレートを０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＴＢＳＴ）で洗浄した。
（３−３）Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ（ＰＩＥＲＣＥ社製）２００μＬを各ウェルに添加し、３０℃で２時間静置することによりブロッキング工程を行ない、Ｆｃ結合性タンパク質定量用ＥＬＩＳＡプレートを作製した。
（３−４）形質転換したＣＨＯ細胞の培養上清を適当な倍率で希釈し、（３−３）で作製したＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μＬずつ添加し、３０℃で１時間反応させた。
（３−５）（３−４）の反応後、ＴＢＳＴにて洗浄し、１００００倍希釈したＨｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）１００μＬを各ウェルに添加し、３０℃で１時間反応させた。
（３−６）ＴＢＳＴによりプレートを洗浄後、ＨＲＰの基質（ＴＭＢ：ナカライテスク社製）を添加し、２分間放置後、１Ｍのリン酸水溶液で反応を停止した。
（３−７）４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、定量のための標準物質として市販のヒトＦｃγＲＩ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を使用し、その吸光度との比較からＦｃ結合性タンパク質を定量した。
（４）（３）の結果得られた、Ｆｃ結合性タンパク質発現量が多い細胞株について、５０ｎＭのＭＴＸを含む培地で培養し、（３）の方法でＭＴＸ耐性を獲得した細胞株の抗体結合活性を測定した。
（５）（３）と（４）の操作を繰り返すことにより、培地中のＭＴＸ濃度を上昇させ、最終的には５μＭ（初期スクリーニング濃度の１０００倍）のＭＴＸ存在下においても増殖する細胞株、すなわち、ＭＴＸ耐性の獲得と連動し、Ｆｃ結合性タンパク質を大量に発現するＣＨＯ細胞株を調製した。
【００３６】
実施例２ 天然型Ｆｃ結合性タンパク質の調製
実施例１で調製した天然型Ｆｃ結合性タンパク質を発現する細胞株より、以下の方法で前記タンパク質の生産を行なった。
（１）実施例１で調製したＦｃ結合性タンパク質を発現するＣＨＯ細胞株を、高密度培養システムＢｅｌｌｏＣｅｌｌ（ＣＥＳＣＯ社製）を用い、５％透析ウシ胎児血清入りＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）にて培養した（３７℃、５日間）。
（２）培養した細胞株の培地を、５％透析ウシ胎児血清入りＤ−ＭＥＭ／ＥｘＣｅｌｌ３０２（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）の等量混合培地に交換し、ＢｅｌｌｏＣｅｌｌ（ＣＥＳＣＯ社製）用い、さらに培養した（３７℃、３０日間）。なお、培養中、栄養源が枯渇する前に培養上清を回収し、新たな培地と交換している。
（３）（２）の培養で得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を含む培養上清（合計１０Ｌ）を、２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で透析することで脱塩処理を施し、あらかじめ前記緩衝液で平衡化したＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ ＳＰゲル（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）３００ｍＬを充填した吸着流動床システム（ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ Ｃ−５０、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に前記脱塩処理した培養上清を添加した。
（４）２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で洗浄後、１０％ グリセロール、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりＦｃ結合性タンパク質を溶出させた。
（５）（４）で得られたＦｃ結合性タンパク質を含む画分を、２０ｍＭ イミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析し、前記緩衝液で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰゲルを充填したカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加した。
（６）２０ｍＭイミダゾールと０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、５００ｍＭ イミダゾールと０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でＦｃ結合性タンパク質を溶出させた。
【００３７】
イムノグロブリンを標準タンパク質としてブラッドフォード法（プロテインアッセイキット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）によりタンパク質の定量を行なった結果、約１０Ｌの培養上清から天然型Ｆｃ結合性タンパク質を約２０ｍｇ調製することができた。
【００３８】
実施例３ 変異型Ｆｃ結合性タンパク質発現株の調製
本実施例では、発現させるＦｃ結合性タンパク質を天然型（実施例１から２）から変異型に変更した。
【００３９】
本実施例で発現させる変異型Ｆｃ結合性タンパク質は、Ｆｃ結合性タンパク質の一つである天然型のヒトＦｃγＲＩのうち、細胞外領域にあるアミノ酸の一部を他のアミノ酸に置換したヒトＦｃγＲＩであり、具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むヒトＦｃγＲＩである。配列番号２は、配列番号１に記載の天然型ヒトＦｃγＲＩのアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、前記領域のアミノ酸のうち、以下に示す１９箇所のアミノ酸置換を行なったものである（特願２０１０−０５２７８９号）。
（ア）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換（Ｔｈｒ２０Ｐｒｏ）
（イ）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジンに置換（Ｔｈｒ２５Ｌｙｓ）
（ウ）配列番号１の３８番目のスレオニンがセリンに置換（Ｔｈｒ３８Ｓｅｒ）
（エ）配列番号１の４６番目のロイシンがプロリンに置換（Ｌｅｕ４６Ｐｒｏ）
（オ）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換（Ｔｈｒ６３Ｉｌｅ）
（カ）配列番号１の６９番目のセリンがスレオニンに置換（Ｓｅｒ６９Ｔｈｒ）
（キ）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換（Ａｒｇ７１Ｈｉｓ）
（ク）配列番号１の７７番目のバリンがグルタミン酸に置換（Ｖａｌ７７Ｇｌｕ）
（ケ）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換（Ａｓｎ７８Ａｓｐ）
（コ）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換（Ｉｌｅ１００Ｖａｌ）
（サ）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換（Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕ）
（シ）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがメチオニンに置換（Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔ）
（ス）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換（Ａｓｎ１６３Ｓｅｒ）
（セ）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換（Ａｓｎ１９５Ｔｈｒ）
（ソ）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがスレオニンに置換（Ａｓｎ２０６Ｔｈｒ）
（タ）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリンに置換（Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏ）
（チ）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換（Ａｓｎ２４０Ａｓｐ）
（ツ）配列番号１の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換（Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓ）
（テ）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換（Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎ）
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む変異型ヒトＦｃγＲＩ（以降、ＦｃＲｍ１９とする）をコードするポリヌクレオチドを、下記に示す２段階のＰＣＲにより、配列番号３から３８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて合成した。
（１−１）表１に示す反応液を用い、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６２℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで、１段階目のＰＣＲ反応を行なった。なお、表１に記載のＤＮＡミックスは、５０ｐｍｏＬ／μＬの前記３６種類のオリゴヌクレオチド（配列番号３から３８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド）溶液を同量ずつ採取し混合した溶液である。
【００４０】
【表１】
（１−２）１段階目のＰＣＲの反応液を鋳型とし、表２に示す反応液を用い、９４℃で５分間熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ、６５℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで、２段階目のＰＣＲ反応を行なった。なお、ＰＣＲプライマーは配列番号３９に記載の配列（５’−ＴＣＡＧ［ＣＣＡＴＧＧ］ＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’；角かっこ内は制限酵素ＮｃｏＩサイト）と配列番号４０に記載の配列（５’−ＣＣ［ＡＡＧＣＴＴ］ＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧ−３’；角かっこ内は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩサイト）からなる各オリゴヌクレオチドを用いた。
【００４１】
【表２】
（２）２段階目のＰＣＲ産物から、アガロースゲルを用いて抽出精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、キアゲン社製）し、ＦｃＲｍ１９をコードするポリヌクレオチドを調製した。
（３）ｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミドベクターを基に、下記の方法により、ＦｃＲｍ１９を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させるためのベクターを作製した。
（３−１）配列番号４１に記載のアミノ酸配列（ＭＫＩＫＴＧＡＲＩＬＡＬＳＡＬＴＴＭＭＦＳＡＳＡＬＡ、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９の１番目から２６番目までのアミノ酸配列に相当）からなるＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製するために、配列番号４２に記載の配列（５’−ＴＡＴＡ［ＣＡＴＡＴＧ］ＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｄｅＩサイト）、配列番号４３に記載の配列（５’−ＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣ−３’）、配列番号４４に記載の配列（５’−ＡＴＣＧＴＣＧＴＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＧＴＧＣＡＣＣＴＧ−３’）、および配列番号４５に記載の配列（５’−ＴＴＧＴＣ［ＣＣＡＴＧＧ］ＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧ−３’；角かっこ内の塩基は制限酵素ＮｃｏＩサイト）からなる各オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法により連結した。ＰＣＲ反応は表３に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なった。
【００４２】
【表３】
（３−２）（３−１）のＰＣＲ産物を鋳型とし、表１に示す反応液を用い、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうＰＣＲ反応をすることで、ＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製した。なお、表１に記載のＤＮＡミックスは、５０ｐｍｏＬ／μＬの配列番号４２または４５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド溶液を同量ずつ採取し混合した溶液である。
（３−３）（３−２）で調製したＭａｌＥシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを、制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩとＮｃｏＩで消化したｐＥＴ２６ｂ（＋）プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションし、ヒートショック法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（３−４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、培養した形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出することで、ベクターｐＥＴＭａｌＥを調製した。ｐＥＴＭａｌＥの概略を図２に示す。
（３−５）ｐＥＴＭａｌＥベクターを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＦｃＲｍ１９をコードするポリヌクレオチドをライゲーション反応により挿入した。
（３−６）ライゲーション後、ヒートショック法により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（３−７）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、定法に従いプラスミドを抽出する（Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、キアゲン社製）ことで、発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ１９を調製した。ｐＥＴＦｃＲｍ１９の概略を図３に示す。
（４）ヒートショック法によりｐＥＴＦｃＲｍ１９で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
【００４３】
実施例４ 塩基配列の解析
発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ１９（図３）に挿入されているポリヌクレオチドの塩基配列を、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて解析した。なお、シークエンス用プライマーとして、配列番号４６に記載の配列（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）と配列番号４７に記載の配列（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）からなる各オリゴヌクレオチドを用いた。
【００４４】
解析の結果、ｐＥＴＦｃＲｍ１９に挿入されているポリヌクレオチドの配列は設計通りであることを確認した。ｐＥＴＦｃＲｍ１９に挿入されているポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号４８に、前記ポリヌクレオチドから翻訳したＭａｌＥシグナルペプチドを含めたＦｃＲｍ１９のアミノ酸配列を配列番号４９にそれぞれ示す。
【００４５】
なお、配列番号４９のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド（配列番号４１）、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のバリンまでが変異型ＦｃγＲＩであるＦｃＲｍ１９（配列番号２に記載のアミノ酸配列）、３０８番目から３１３番目までのヒスチジンがポリヒスチジンタグである。また、置換アミノ酸であるＴｈｒ２０Ｐｒｏのプロリンは配列番号４９において３８番目、Ｔｈｒ２５Ｌｙｓのリジンは４３番目、Ｔｈｒ３８Ｓｅｒのセリンは５６番目、Ｌｅｕ４６Ｐｒｏのプロリンは６４番目、Ｔｈｒ６３Ｉｌｅのイソロイシンは８１番目、Ｓｅｒ６９Ｔｈｒのスレオニンは８７番目、Ａｒｇ７１Ｈｉｓのヒスチジンは８９番目、Ｖａｌ７７Ｇｌｕのグルタミン酸は９５番目、Ａｓｎ７８Ａｓｐのアスパラギン酸は９６番目、Ｉｌｅ１００Ｖａｌのバリンは１１８番目、Ｐｈｅ１１４Ｌｅｕのロイシンは１３２番目、Ｉｌｅ１６０Ｍｅｔのメチオニンは１７８番目、Ａｓｎ１６３Ｓｅｒのセリンは１８１番目、Ａｓｎ１９５Ｔｈｒのスレオニンは２１３番目、Ａｓｎ２０６Ｔｈｒのスレオニンは２２４番目、Ｌｅｕ２０７Ｐｒｏのプロリンは２２５番目、Ａｓｎ２４０Ａｓｐのアスパラギン酸は２５８番目、Ｌｅｕ２８３Ｈｉｓのヒスチジンは３０１番目、Ｌｅｕ２８５Ｇｌｎのグルタミンは３０３番目の位置にそれぞれある。
【００４６】
実施例５ 変異型Ｆｃ結合性タンパク質の調製
（１）実施例３で作製したＦｃＲｍ１９を発現する形質転換体（大腸菌）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２×ＴＹ液体培地に接種し、３７℃で一晩振とう培養することで前培養を行なった。
（２）前培養液を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２×ＴＹ培地（５００ｍＬ）に添加し、３７℃で振とう培養した。培養開始１．５時間後に培養温度を２０℃に切り換えるとともにＩＰＴＧを終濃度０．０１ｍＭとなるよう添加し、引き続き２０℃で一晩振とう培養した。
（３）培養終了後、遠心分離操作（１００００ｒｐｍ、２０分間）により得られた湿菌体を、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）および２０ｍＭ イミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、タンパク質抽出液を調製するために４℃に冷却しながら超音波破砕処理した。
（４）超音波破砕処理液を遠心分離操作（１００００×ｇ、２０分、４℃）により、破砕物からＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を遠心上清として回収した。
（５）遠心上清を５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および２０ｍＭ イミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したニッケルキレートカラム（Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に添加し、前記緩衝液で洗浄後、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０および５００ｍＭ イミダゾールを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、吸着したＦｃ結合性タンパク質を溶出した。
（６）（５）の溶出液を、あらかじめ１５０ｍＭ ＮａＣｌと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加し、前記緩衝液で洗浄後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０と１０％ グリセリンを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でＦｃ結合性タンパク質を溶出した。なお溶出する際、あらかじめ溶出量の１／４量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を入れた試験管に集めることで、溶出液をただちに中和した。
（７）溶出したタンパク質の純度を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびクマシーブリリアントブルー染色（ＣＢＢ染色）により確認し、抗体結合活性の確認は実施例１の方法と同様に行なった。
【００４７】
結果、大腸菌培養液１Ｌから精製Ｆｃ結合性タンパク質を約５ｍｇ調製できた。
【００４８】
実施例６ 天然型Ｆｃ結合性タンパク質固定化カラムの作製
実施例２で調製した天然型Ｆｃ結合性タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとしての性能を評価するために、前記タンパク質をクロマトグラフィー用ゲルに固定化した。
（１）実施例２で調製した天然型Ｆｃ結合性タンパク質溶液１０００μＬ（濃度：１２．１ｍｇ／ｍＬ）に、エポキシトヨパールゲル（東ソー社製）０．５ｇ（乾燥重量）と３Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１５００μＬとを添加し、２５℃で１６時間反応した。エポキシトヨパールへの天然型Ｆｃ結合性タンパク質の固定化量を、ＨＰＬＣ法［カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−ＳＴＡＴ（３．０ｍｍＩＤ×３．５ｃｍ、東ソー社製）、溶離液Ａ：２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、溶離液Ｂ：１Ｍ ＮａＣｌを含む溶離液Ａ、溶出条件：１０分間の直線濃度勾配；Ｂ ０％からＢ １００％、検出：ＵＶ２２０ｎｍ］により反応液中の残存量を求めることで算出した結果、投入した天然型Ｆｃ結合性タンパク質の約８０％以上がエポキシトヨパールゲルと反応しており、固定化が良好であることを確認した。
（２）固定化反応終了後、ゲルスラリーをフィルター付きのカラムに移して余分な反応液をろ過して除去した。
（３）水、引き続き２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をそれぞれ（２）のカラムに通液してゲルを充分に洗浄後、空カラムに天然型Ｆｃ結合性タンパク質を固定化したエポキシトヨパールゲル５００μＬ容量を充填した。
【００４９】
実施例７ 天然型Ｆｃ結合性タンパク質固定化カラムの抗体結合性
（１）実施例６で作製した天然型Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル（Ｆｃ結合性タンパク質の固定化量：２０ｍｇ／ｍＬゲル）を充填したカラム（５００μＬ容量）に、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を５ｍＬ添加し、引き続き５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したヒトポリクローナル抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）を３０ｍｇ添加し、１０分間静置した。
（２）５０ｍＭ リン酸緩衝液にて充分に洗浄することで未吸着の抗体をカラムから溶出させた後、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をカラムに添加することで、ゲルに吸着した抗体を溶出させた。溶出液中の抗体濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１％濃度の抗体液の２８０ｎｍにおける吸光度（光路長：１０ｍｍ）１４．０を基に算出した。結果、ゲル１ｍＬあたり約２２．０ｍｇの抗体を吸着したことが判明した。
【００５０】
実施例８ 変異型Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルの作製
実施例５で調製した変異型Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）のアフィニティクロマトグラフィー用リガンドとしての性能を評価するために、前記タンパク質をクロマトグラフィー用ゲルに固定化した。
（１）実施例５で調製したＦｃＲｍ１９溶液５５０μＬ（濃度：４．６ｍｇ／ｍＬ）に、エポキシトヨパールゲル（東ソー社製）０．１５ｇ（乾燥重量）と３Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１７５μＬを添加し、２０℃で１４時間反応させた。エポキシトヨパールへのＦｃＲｍ１９の固定化量を、ＨＰＬＣ法［カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−ＳＴＡＴ（３．０ｍｍＩＤ×３．５ｃｍ、東ソー社製）、溶離液Ａ：２０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、溶離液Ｂ：１Ｍ ＮａＣｌを含む溶離液Ａ、溶出条件：１０分間の直線濃度勾配；Ｂ ０％からＢ １００％、検出：ＵＶ２２０ｎｍ］により反応液中の残存量を求めることで算出した結果、投入したＦｃＲｍ１９の約９０％以上がエポキシトヨパールゲルと反応しており、固定化が良好であることを確認した。
（２）固定化反応終了後、ゲルスラリーをフィルター付きのカラムに移して余分な反応液をろ過して除去した。
（３）水、引き続き２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をそれぞれ（２）のカラムに通液してゲルを充分に洗浄後、ＦｃＲｍ１９を固定化したエポキシトヨパールゲル１５０μＬ容量を空カラムに充填した。
【００５１】
実施例９ 変異型Ｆｃ結合性タンパク質固定化カラムの抗体結合性
（１）実施例８で作製した変異型Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲル（ＦｃＲｍ１９の固定化量：１５ｍｇ/ｍＬゲル）を充填したカラム（１５０μＬ容量）に、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を５ｍＬ添加し、引き続き５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したヒトポリクローナル抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）を１５ｍｇ添加し、１０分間静置した。
（２）５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて充分に洗浄することで未吸着の抗体をカラムから溶出させた後、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をカラムに添加することで、ゲルに吸着した抗体を溶出させた。溶出液中の抗体濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定し、１％濃度の抗体液の２８０ｎｍにおける吸光度（光路長：１０ｍｍ）１４．０を基に算出した。結果、ゲル１ｍＬあたり約１８．０ｍｇの抗体を吸着したことが判明した。
【００５２】
実施例１０ Ｆｃ結合性タンパク質固定化カラムの吸着特性
（１）実施例８で作製した変異型Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲル（ＦｃＲｍ１９の固定化量：１５ｍｇ／ｍＬゲル）を充填したカラム（１５０μＬ容量）に、実施例９と同量のヒトポリクローナル抗体を添加し、ゲルに吸着させた。
（２）５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて充分に洗浄することで未吸着の抗体をカラムから溶出させた後、１００ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０からｐＨ４．６）をそれぞれカラムに添加し、ゲルから溶出した液を分取した（以降、抗体溶出液１とする）。
（３）最後に５０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をカラムに添加することで、ゲルに吸着したままの抗体を完全に溶出させた（以降、抗体溶出液２とする）。
【００５３】
分取した抗体溶出液１および２のタンパク質濃度をブラッドフォード法にてそれぞれ定量し、各ｐＨにおける抗体溶出割合を算出した。結果を図４に示す。図４からわかるように、クエン酸緩衝液のｐＨが３．５以下であればゲルに吸着した抗体の８０％以上を回収できることがわかり、特にｐＨを３．３以下にするとゲルに吸着した抗体をほぼ全量回収できることがわかる。一方、ｐＨが４．６ではゲルに吸着した抗体の数％しか溶出していないことから、ゲルに吸着した抗体を溶出する前に、ゲルに非特異的に吸着した夾雑物質を除去する操作（洗浄操作）を行なう場合、洗浄液のｐＨを４．５以上にすると、ゲルに吸着した抗体を溶出させることなく夾雑物質を除去できることがわかる。
【００５４】
実施例１１ 変異型Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる抗体精製（その１）
（１）模擬培養液として、ＣＨＯ細胞（ＤＢＸ−１１株）を、１０％のウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）を含むα−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地で常法に従い培養し、これにヒトポリクローナル抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）１ｍｇ／ｍＬとなるよう添加したものを調製した。
（２）模擬培養液を遠心分離操作（１００００ｒｐｍ、１０分）することにより、培養液中のＣＨＯ細胞を取り除いた。
（３）あらかじめ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した、実施例８で作製した変異型Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲルを充填したカラムに、（２）の遠心上清１０ｍＬ添加した。
（４）０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄することで、ゲルに非特異的に吸着する夾雑成分を取り除いた後、５０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でゲルに吸着した抗体を溶出させた。なお、溶出液はただちに５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析することで、ｐＨを中性に戻した（抗体回収溶液）。
（５）模擬培養液、カラム通過液および抗体回収溶液をサイズ排除クロマトグラフィー［カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ ７．８ｍｍＩＤｘ３０ｃｍ（東ソー社製）、溶離液：１５０ｍＭのＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、流速：１．０ｍｌ／分、検出波長：２８０ｎｍ］による成分分析で各液中のタンパク質組成を確認した。
【００５５】
結果を図５に示す。図５からわかるように、模擬培養液から選択的にヒト抗体を回収可能であることを確認した。
【００５６】
実施例１２ 変異型Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルによる抗体精製（その２）
（１）以下に示す方法により、模擬培養液を調製した。
（１−１）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＢＬ２１（ＤＥ３）株を１００ｍＬのＬＢ培地を添加した５００ｍＬ容量のバッフル付き三角フラスコに接種し、３７℃にてＯＤ３．０になるまで振とう培養した。この大腸菌培養液から遠心分離操作（８０００ｒｐｍ、１５分間）により大腸菌菌体を回収した。
（１−２）得られた菌体を５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＬに懸濁し、超音波破砕法により菌体を破砕した。
（１−３）菌体破砕液から遠心分離操作（１２０００ｒｐｍ、１５分間）により遠心上清（大腸菌タンパク質抽出液）を得た。
（１−４）遠心上清にヒトポリクローナル抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）を１ｍｇ／ｍＬの終濃度となるように添加したものを模擬培養液とした。
（２）あらかじめ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した、実施例８で作製した変異型Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ１９）固定化ゲルを充填したカラムに、模擬培養液１０ｍＬ添加した。
（３）０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄することで、ゲルに非特異的に吸着する夾雑成分を取り除き、さらに０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄した後、５０ｍＭ クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でゲルに吸着した抗体を溶出させた。なお、溶出液はただちに５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析することで、ｐＨを中性に戻した（抗体回収溶液）。
（４）模擬培養液、カラム通過液および抗体回収溶液を、実施例１１と同様のサイズ排除クロマトグラフィーによる成分分析で各液中のタンパク質組成を確認した。
【００５７】
結果を図６に示した。図６からわかるように、模擬培養液から選択的にヒト抗体を回収可能であることを確認した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に抗体を含む溶液を添加して前記固相に前記抗体を吸着させ、
前記固相に吸着した前記抗体を溶出液を用いて溶出させる、抗体の精製方法であって、
溶出液のｐＨが３．５以下である、前記精製方法。
【請求項２】
Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる前に、ｐＨ４．５以上の洗浄液を用いて前記固相に吸着した夾雑物質を除去する、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩであり、抗体が完全ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
ヒトＦｃγＲＩが、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたタンパク質、
である、請求項３に記載の精製方法。
【請求項５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたヒトＦｃγＲＩを固定化した、抗体を精製するための固相。
【請求項１】
Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に抗体を含む溶液を添加して前記固相に前記抗体を吸着させ、
前記固相に吸着した前記抗体を溶出液を用いて溶出させる、抗体の精製方法であって、
溶出液のｐＨが３．５以下である、前記精製方法。
【請求項２】
Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した固相に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる前に、ｐＨ４．５以上の洗浄液を用いて前記固相に吸着した夾雑物質を除去する、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
Ｆｃ結合性タンパク質がヒトＦｃγＲＩであり、抗体が完全ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
ヒトＦｃγＲＩが、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含むタンパク質、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたタンパク質、
である、請求項３に記載の精製方法。
【請求項５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸を含み、かつ前記アミノ酸のうちの一つ以上が他のアミノ酸に置換されたヒトＦｃγＲＩを固定化した、抗体を精製するための固相。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−７２０９１（Ｐ２０１２−７２０９１Ａ）
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１８９６５（Ｐ２０１０−２１８９６５）
【出願日】平成２２年９月２９日（２０１０．９．２９）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２９日（２０１０．９．２９）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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