抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
【課題】抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期を増強するための組成物および方法を開示する。
【解決手段】抗体ベース融合タンパク質内の、抗体部分と融合タンパク質部分の連結領域におけるアミノ酸配列の変化に基づく。連結領域におけるアミノ酸配列の変換を有する抗体ベース融合タンパク質を哺乳動物に投与すると、より長期の循環系内半減期を示す。開示された組成物および方法は、哺乳動物の腫瘍の大きさおよび転移を減少せしめるために特に有用である。
【解決手段】抗体ベース融合タンパク質内の、抗体部分と融合タンパク質部分の連結領域におけるアミノ酸配列の変化に基づく。連結領域におけるアミノ酸配列の変換を有する抗体ベース融合タンパク質を哺乳動物に投与すると、より長期の循環系内半減期を示す。開示された組成物および方法は、哺乳動物の腫瘍の大きさおよび転移を減少せしめるために特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年２月１１日に出願されたU.S.S.N. 60/181,768を優先権の基礎とし、そしてその利益を受けることを主張し、その開示は参照として本明細書に組み込む。
【０００２】
発明の分野
本発明は、全般に、融合タンパク質に関する。より詳細には、本発明は、抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期を増強する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
ヒトの疾患を処置するための抗体の使用は、十分に確立されており、そして遺伝子工学の導入によってより精巧になっている。抗体の有用性を改善するためにいくつかの技術が開発されている。これらには以下が含まれる：（１）「ハイブリドーマ」を生成するための細胞融合による、または抗体産生細胞からの抗体重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の分子クローニングによる、モノクローナル抗体の作製；（２）生体内の好ましい部位へ抗体を送達するための、抗体への他の分子、例えば、放射性同位体、毒性薬物、タンパク質毒素、およびサイトカイン、の結合；（３）生物活性を増強または低減するための抗体エフェクター機能の操作；（４）抗体ベース融合タンパク質を産生するための、他のタンパク質、例えば、毒素およびサイトカイン、と抗体との、遺伝子レベルでの連結；ならびに（５）領域を遺伝子レベルで連結して二重特異性抗体を生成する、１組または２組以上の抗体の連結。
【０００４】
タンパク質は、当技術分野において公知の方法を用いる化学的操作または遺伝子操作のいずれかによって連結され、一体化することができる。例えば、Gillies et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1428-1432（1992）；および米国特許第5,650,150号を参照。
【０００５】
しかし、組換えによって産生される抗体ベース融合タンパク質の利用は、循環系からのそれらの迅速な生体内におけるクリアランスによって制限される場合がある。例えば、抗体−サイトカイン融合タンパク質は、遊離の抗体よりも有意に短い生体内における循環系内半減期を有することが示されている。Gilliesらは、種々の抗体−サイトカイン融合タンパク質を試験した場合、試験した全ての融合タンパク質が、１．５時間未満のα相（分配相）半減期を有していたことを報告した。実際、大部分の抗体ベース融合タンパク質は、２時間経過までに、遊離抗体の血清中濃度の１０％までクリアランスされた。Gillies et al., Bioconj.Chem.4:230-235（1993）を参照されたい。
【０００６】
さらに近時において、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を低減した抗体ベース融合タンパク質が、増強された循環系内半減期を有することが示された。Ｆｃ受容体に対する低減した結合親和性、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）などの抗体エフェクタ機能を阻害するが、補体結合または抗原結合などの機能は阻害しないことも示された。Gillies et al., Cancer Res.59（9）:2159-66（1999）を参照されたい。
癌またはウイルス疾患などのいくつかのケースでは、抗体エフェクタ機能および長い循環系内半減期を維持することが望まれ得る。したがって、当該技術において、抗体ベース融合タンパク質の生体内での循環系内半減期を増強するさらなる方法に対する要求がある。
【０００７】
発明の要約
免疫グロブリンG（ＩｇＧ） 分子は、ＩｇＧのクラスの抗体に特異的な３種類のＦｃγ 受容体（ＦｃγＲ）、すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを含む、種々の細胞受容体と相互に作用し合う。それらは、ｐＨ依存的にＦｃＲｐ群の受容体とも相互作用し、中性のｐＨにおいては僅かしか相互作用しないかまたは全く相互作用しないが、ｐＨ６．０においては大きく相互作用をする。
抗体の血清中半減期は、その抗体の、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）およびＦｃ保護受容体（ＦｃＲｐ）への結合能によって影響を受ける。免疫グロブリン融合タンパク質の血清中半減期も、そのような受容体への結合能によって影響を受ける（Gillies et al., Cancer Res. 59: 2159-66（1999））。
【０００８】
本発明は、融合タンパク質内に免疫グロブリン（Ｉｇ）部分および非免疫グロブリン（非Ｉｇ）部分を有し、該２つの部分の連結部位の近傍におけるアミノ酸の変化によって、融合タンパク質の血清中半減期が顕著に増加するという驚くべき発見を開示する。該発見が驚くべきものであるのは、アミノ酸の前記変化が、Ｆｃ領域のＦｃ受容体およびＦｃ保護受容体との相互作用表面とは異なるタンパク質表面に影響を及ぼすからである。さらに、本発明の前記アミノ酸変化は、既知のＦｃ受容体およびＦｃ保護受容体が、融合タンパク質の血清中半減期を優先的に決定するものではない場合にもその効果を有する。したがって、本発明の前記アミノ酸変化は、Ｆｃ受容体および／またはＦｃ保護受容体との相互作用に影響を及ぼすアミノ酸変化と組み合わせることによって、相乗効果を奏せしめることができる。
【０００９】
本発明は、Ｆｃ受容体およびＦｃ保護受容体（ＦｃＲｐ）との相互作用表面とは異なる場所における変化の結果によって血清中半減期が改善される、免疫グロブリンを含有する融合タンパク質を提供する。本発明は、免疫グロブリン部分および第二の、非免疫グロブリンタンパク質による、改善された血清中半減期を有する融合タンパク質を産生する方法も提供する。
【００１０】
前記融合タンパク質のアミノ酸配列の変化は、好ましくはＩｇ部分および非Ｉｇ部分との連結部位のものである。融合タンパク質の前記連結領域は、Ｉｇ重鎖および非Ｉｇタンパク質の天然において生じる配列を基準にして、前記連結点から約１０個のアミノ酸より内側にあると好ましい変化を含む。アミノ酸変化によって疎水性が増大するとさらに好ましい。アミノ酸変化が、抗体部分のＣ末端リジンのアラニンまたはロイシンなどの疎水性アミノ酸への変化を含むとまたさらに好ましい。好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、Ｉｇ重鎖、好ましくは、第二の、非Ｉｇタンパク質のＮ末端側に位置するＩｇ重鎖を含む。
【００１１】
本発明の他の一態様において、融合タンパク質のＦｃＲｐに対する結合親和性は、ＦｃＲｐに接触するＦｃ部分の相互作用表面の変化によって最適化される。ＩｇＧのＦｃＲｐ受容体への結合のための重要な配列は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに存在することが報告されている。本発明によって、融合タンパク質における融合連結部位の変化をＦｃのＦｃＲｐとの相互作用表面の変化と組み合わせることによって、相乗効果が奏せられる。Ｆｃ部分のｐＨ６におけるＦｃＲｐとの相互作用を増大させることが有用である場合があり、そしてＦｃ部分のｐＨ８におけるＦｃＲｐとの相互作用を低減させることが有用である場合もある。このような修飾は、Ｆｃ受容体との接触のために必要な残基の変化またはコンフォメーションの変化の誘導による、他の重鎖残基とＦｃＲｐ受容体との接触に影響を及ぼす他の変化を含む。
【００１２】
したがって、好ましい態様において、生体内における循環系内半減期が増強された抗体ベース融合タンパク質は、Ｉｇ定常領域と第二の、非免疫グロブリンタンパク質のコード配列とをまず結合し、そして次にＩｇＧ 定常領域の、Ｉｌｅ２５３、Ｈｉｓ３１０およびＨｉｓ４３５からなる群から選択されるまたは１個または２個以上のアミノ酸、またはその近傍に変異（点変異、欠失、挿入または遺伝子再配列）を導入することによって得られる。得られる抗体ベース融合タンパク質は、未修飾の融合タンパク質より、生体内における長い循環系内半減期を有する。
【００１３】
ある条件下においては、Ｆｃ部分のあるエフェクタ機能を変異せしめることは有用である。例えば、補体の結合を排除してもよい。あるいは、またはさらに、他の態様のセットにおいては、融合タンパク質のＩｇ成分は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩの少なくとも１つとの結合親和性が低減されている、ＩｇＧの定常領域の少なくとも１つの部位を有する。例えば、ＩｇＧのガンマ４鎖を、ガンマ１鎖の代わりに用いてもよい。当該変化は、ガンマ４鎖によってより長期の血清中半減期がもたらされ、融合連結部における１または２以上の変異と相乗的に機能するという利点を有する。したがって、ＩｇＧ２もＩｇＧ１の代わりに用いてもよい。本発明の他の態様において、融合タンパク質は、変異ＩｇＧ１定常領域、例えば、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ａｓｎ２９７、またはＰｒｏ３３１の１または２以上の変異または欠失を有するＩｇＧ１ 定常領域を含む。本発明のさらなる態様において、融合タンパク質は変異ＩｇＧ３定常領域、例えば、Ｌｅｕ２８ｌ、Ｌｅｕ２８２、Ｇｌｙ２８３、Ｇｌｙ２８４、Ａｓｎ３４４、またはＰｒｏ３７８の１または２以上の変異または欠失を有するＩｇＧ３ 定常領域を含む。しかし、いくつかの適用場面において、ＡＤＣＣのようなＦｃ受容体への結合に伴うエフェクタ機能を保持しておくことは有用であり得る。
【００１４】
好ましい態様において、融合タンパク質の前記第二の、非免疫グロブリン部分はサイトカインである。本明細書における「サイトカイン」の用語は、天然由来タンパク質または組み換えタンパク質、それらの類縁体およびそれらの断片であって、そのサイトカインの受容体を有する細胞において特異的な生物的反応を解発するものとして用いられる。サイトカインは、好ましくは、細胞によって産生されるかまたは分泌され得るタンパク質である。サイトカインは、好ましくは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６およびＩＬ−１８などのインターロイキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびエリスロポエチンなどの造血因子、ＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシンなどのリンホカイン、レプチンなどの代謝経路の制御物質、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγなどのインターフェロン、ならびにケモカインを含む。好ましくは、本発明の抗体−サイトカイン融合タンパク質は、サイトカインの生物活性を示す。
【００１５】
他の好ましい態様において、融合タンパク質の前記第二の、非免疫グロブリン部分は、生物活性を有するリガンド結合タンパク質である。そのようなリガンド結合タンパク質は、例えば、（１）細胞表面における受容体−リガンド相互作用を阻害するか；または（２）血液の液相において分子（例えばサイトカイン）の生物活性を中和し、それによって、それが細胞内の標的に到達するのを妨げる。リガンド結合タンパク質は、好ましくは、ＣＤ４、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦ 受容体、またはＩＬ−１およびＩＬ−４受容体などのインターロイキン受容体を含む。
本発明の抗体−受容体融合タンパク質は、好ましくは、前記リガンド結合タンパク質の生物活性を示す。
【００１６】
さらに他の別異の好ましい態様において、融合タンパク質の前記第二の、非免疫グロブリン部分は、タンパク質毒素である。本発明の抗体−毒素融合タンパク質は、好ましくは前記タンパク質毒素の毒素活性を示す。
さらなる他の別異の好ましい態様において、融合タンパク質の前記第二の、非免疫グロブリン部分は、ホルモン、ニューロトロフィン、体重調節物質、血清タンパク質、凝固因子、プロテアーゼ、細胞外マトリクス成分、血管新生因子、抗血管新生因子、または他の分泌タンパク質または分泌ドメインである。例えば、ＣＤ２６、ＩｇＥ受容体、重合型ＩｇＡ受容体、他の抗体受容体、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、ＴｒｋＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｆｌｔ−３リガンド、エンドスタチン、アンジオスタチン、およびこれらのタンパク質のドメインである。
【００１７】
さらに他の別異の好ましい態様において、融合タンパク質の前記第二の、非免疫グロブリン部分は、非ヒトまたは非哺乳類タンパク質である。例えば、ＨＩＶ ｇｐｌ２０、ＨＩＶ Ｔａｔ、アデノウィルス、およびＲＳＶなどの他のウィルスの表面タンパク質、他のＨＩＶ成分、マラリア抗体などの寄生虫性表面タンパク質、および細菌性表面タンパク質が好ましい。これらの非ヒトタンパク質は、例えば抗原として用いてもよく、またはそれらが有用な活性を有しているという理由で用いてもよい。例えば、前記第二の、非免疫グロブリン部分は、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、または有用な酵素活性を有する他のタンパク質であってよい。
【００１８】
本発明において、非免疫グロブリン部分は、タンパク質の部分であってもよい。好ましくは、非Ｉｇタンパク質部分は、無処置のタンパク質の機能的およびまたは構造的性質を実質的に保持しているタンパク質の部分である。好ましい態様において、非Ｉｇタンパク質部分は、本明細書に記載されているタンパク質の機能的または構造的部位である。
好ましい態様において、抗体ベース融合タンパク質は、定常領域のみならず、標的である抗原に特異的な可変領域を含み、それらのうちいずれかは、ペプチド結合を介して、第二の、非免疫グロブリンに結合している。定常領域とは、通常、可変領域に対応させられる定常領域であってもよく、または、例えば異なる種からの可変領域および定常領域であってもよい。
【００１９】
前記重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインの１または２以上のあらゆる組み合わせを含んでよい。重鎖は、好ましくは、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含み、そしてより好ましくは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのみを含む。ある態様において、抗体ベースの１つの融合タンパク質は、融合した重鎖および軽鎖可変領域を有するＦｖ領域を含む。「融合タンパク質」の用語には、異なる種由来のフレームワーク領域および可変領域（すなわち、相補性決定領域）を含む結合ドメインを有する構造体も含まれ、例えばWinterらの英国特許第2,188,638号に開示されている。可変領域を含む抗体ベース融合タンパク質は、好ましくは抗原結合特異性を示す。好ましいさらに異なる態様において、抗体ベース融合タンパク質はさらに軽鎖を含む。したがって、本発明は、抗原結合特異性および抗体の活性が、サイトカインなどの第二の、非免疫グロブリンタンパク質の有効な生物活性と組み合わされた融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、第二の、非免疫グロブリンタンパク質を生体内の標的細胞に選択的に送達して、該第二の、非免疫グロブリンタンパク質をして、局所的な生物活性を発揮せしめるために用いることができる。
【００２０】
別異の好ましい態様において、抗体ベース融合タンパク質は、ペプチド結合を介して第二の、非免疫グロブリンタンパク質に結合する重鎖定常領域を含むが、重鎖可変領域を含まない。したがって、本発明は、第二の、非免疫グロブリンタンパク質の有効な生物活性を保持しているが、抗体の抗原結合特異性および活性を有しない融合タンパク質をさらに提供する。
好ましい態様において、融合タンパク質は、少なくとも１つの重鎖の部位およびジスルフィド結合によって結合した第二の、非Ｉｇタンパク質を含む２つのキメラ鎖を含む。
好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、癌、ウィルス感染、免疫障害の治療、および特定の細胞型の成長（増殖を含む）に有用である。
本発明は、上記融合タンパク質の配列をコードするＤＮＡ構造体、およびセルライン、例えばミエローマであって、これらの前記構造体によってトランスフェクトされたものを特徴とする。
これらおよび他の目的を、本明細書において開示された本発明の利点及び特長とともに、以下の説明、図面、およびクレームによって、より明確にする。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＫＳ−ＩＬ−２融合タンパク質および重鎖のＣ末端リジン部分の置換または例に記載された他の変化を含有する、種々の変異融合タンパク質の薬物動態挙動を示す。抗体または融合タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２（図１Ａ）またはヒトＦｃ（図１Ｂ）について測定した。
【図１Ｂ】ＫＳ−ＩＬ−２融合タンパク質および重鎖のＣ末端リジン部分の置換または例に記載された他の変換を含有する、種々の変異融合タンパク質の薬物動態挙動を示す。抗体または融合タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２（図１Ａ）またはヒトＦｃ（図１Ｂ）について測定した。
【図２】野生型リジンまたは抗体鎖のＣ末端にリジンからアラニンへの変異を担持するガンマ１またはガンマ４鎖を有する、ＫＳ−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態特性を示す。抗体または融合タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２部分について測定した。.
【図３】腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）へのヒト抗体の融合体の薬物動態特性を示す。融合タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡによって、ヒトＦｃ領域について測定した。抗体−ＴＮＦアルファ融合タンパク質のレベル（黒ダイヤ）および抗体部分のＣ末端リジンを欠失した以外の部分は同一である融合タンパク質（灰色四角）のレベルを示す。
【図４】抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の、ＦｃγＲのクラスの受容体リッチなＪ７７４細胞の膜への結合を示す。非変異ＫＳ−ＩＬ−１２融合タンパク質（黒ダイヤ）および重鎖のＣ末端リジンがアラニンに変異したＫＳ−ＩＬ−１２融合タンパク質（灰色四角）の結合を示す。
【図５】ＫＳの抗原であるヒトＥｐＣＡＭを発現するように操作した、ＣＴ２６大腸癌細胞由来の皮下腫瘍を有する、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに対する、抗体−サイトカイン融合タンパク質による処置の効果を示す。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｉｇ部分および非Ｉｇ部分間の連結部に、循環系内半減期を増大せしめる、１または２以上の変異を有する抗体融合タンパク質を提供する。本発明の変異融合タンパク質は、抗体部分の、体内における２つの既知の薬物動態決定受容体（Ｆｃ受容体およびＦｃＲｐ）のいずれとの相互作用にも影響することなく、その血清中半減期を改善することができるという有利な特性を有する。
本発明の抗体ベース融合タンパク質は総じて、免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質部位が非免疫グロブリン（非Ｉｇ）タンパク質に連結し、Ｉｇおよび非Ｉｇタンパク質間の連結部を架橋する領域のアミノ酸配列が、Ｉｇおよび非Ｉｇタンパク質の野生型アミノ酸配列と比較した場合に、少なくとも１つの変異を含んでいる。
【００２３】
一態様において、Ｉｇ部位のＣ末端領域に、少なくとも１つの変異が存在する。他の一態様においては、非Ｉｇタンパク質のＮ末端領域に、少なくとも１つの変異が存在する。さらなる一態様においては、融合タンパク質は、Ｉｇ部位のＣ末端領域に少なくとも１つの変異を含み、非Ｉｇタンパク質のＮ末端領域に少なくとも１つの変異を含む。変異は、点変異、挿入、欠失、または遺伝子再配列であってよい。好ましい態様において、前記変異は連結部の疎水性を増大せしめる。例えば、変異によって荷電またはイオン化したアミノ酸を、非荷電または疎水性アミノ酸に置換する（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇまたは他のイオン化可能残基を、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐまたは他の非荷電または疎水性残基に置換する）。
【００２４】
任意選択可能な態様において、スペーサーペプチドまたはリンカーペプチドが、Ｉｇおよび非Ｉｇタンパク質の間に挿入される。前記スペーサーペプチドまたはリンカーペプチドは、好ましくは非荷電性であり、より好ましくは非極性、およびまたは疎水性である。スペーサーペプチドまたはリンカーペプチドの長さは、好ましくは１〜約１００アミノ酸、より好ましくは１〜約５０アミノ酸、または１〜約２５アミノ酸、およびさらにより好ましくは１〜約１５アミノ酸である。本発明の他の態様において、融合タンパク質のＩｇおよび非Ｉｇ部分は、スペーサーペプチドまたはリンカーペプチドを介して連結され、そしてＩｇおよび非Ｉｇ部分の一方または両方に、少なくとも１つの変異がある。本発明の別異の態様において、Ｉｇおよび非Ｉｇ部分は、合成スペーサー、例えばＰＮＡスペーサーによって隔てられていて、それは好ましくは非荷電性であり、より好ましくは非極性であり、およびまたは疎水性である。
【００２５】
本発明においては、免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖は、可変または定常ドメインを含む免疫グロブリンタンパク質または免疫グロブリンタンパク質の部分である。Ｉｇ鎖は、好ましくは免疫グロブリン重鎖の部位であり、例えば、予め選択された細胞型に結合可能な免疫グロブリン可変領域である。好ましい態様において、Ｉｇ鎖は、定常領域のみならず、標的抗原に対して特異的な可変領域を含む。定常領域は、可変領域に通常関連する可変領域、または例えば異なる種からの可変および定常領域などの異なるものであってもよい。より好ましい態様において、Ｉｇ鎖は重鎖を含む。該重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインの１または２以上のあらゆる組み合わせを含んでよい。重鎖は、好ましくは、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含み、そしてより好ましくは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのみを含む。ある態様において、免疫グロブリンの部分は、融合した重鎖および軽鎖可変領域を有するＦｖ領域を含む。
【００２６】
本発明において、非免疫グロブリンタンパク質は、免疫グロブリンでない天然由来タンパク質、または免疫グロブリンでない合成もしくは組み換えタンパク質、または上記の任意の断片を含む。好ましい態様において、非免疫グロブリンタンパク質は、リガンド結合ドメイン、酵素ドメイン、調節ドメイン、または１または２以上の細胞因子と相互作用するドメインなどの機能的ドメインを含む。別異の態様において、非免疫グロブリンドメインは、構造ドメインまたはエピトープを含む。
好ましい態様において、Ｉｇ鎖は、遺伝子融合によって非Ｉｇタンパク質に連結されている。好ましくは、前記遺伝子融合は、合成、または組み換えであり、そして化学合成または分子生物学の標準的な手法を用いて産生される。典型的には、変異は、遺伝子融合構造体の部分として導入される。これとは別に、変異は、変異誘発に関する既知の方法（例えば、遺伝子融合構造体を放射線照射、または化学的もしくは生物的変異誘発手法に付す）を用いて後から導入してもよい。
【００２７】
本発明において、連結領域は、融合タンパク質のＩｇおよび非Ｉｇ部分間の連結点を囲む、融合タンパク質の領域である。好ましい態様において、連結領域は、Ｉｇ部分のＣ末端部位および非Ｉｇ部分のＮ末端部位を含む。一態様において、連結領域は、Ｉｇおよび非Ｉｇ部分間の連結点に挿入されたスペーサーペプチドまたはリンカーペプチドを含む。
本発明の好ましい態様において、Ｉｇ部分の変異は、Ｉｇ部分のＣ末端部位に存し、好ましくはＩｇ部分のＣ末端から約１００残基より内側に存し、より好ましくは約５０残基より内側、または約２５残基より内側に存し、およびさらにより好ましくは約１０残基より内側に存する。
本発明の好ましい態様において、Ｉｇ部分の変異は、Ｉｇ部分のＣ末端部位に存し、好ましくは非Ｉｇ部分のＮ末端から約１００残基より内側に存し、より好ましくは約５０残基より内側、または約２５残基より内側に存し、およびさらにより好ましくは約１０残基より内側に存する。
本発明の好ましい態様において、変異は、Ｉｇ部分のＣ末端領域に存するが、該変異は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）またはＦｃＲｐと相互作用するＩｇタンパク質の部分には存しない。
【００２８】
本発明による変異を有する抗体融合タンパク質は、変異を有しない、対応する抗体融合タンパク質の循環系内半減期と比較して、生体内におけるより長い循環系内半減期を有する。抗体融合タンパク質の循環系内半減期は、融合タンパク質の血清中レベルを時間の関数としてアッセイすることによって測定することができる。
実験的な証拠によって、本発明の好ましい変異の効果は、ＦｃＲまたはＦｃＲｐとの相互作用には依存しないことが示唆されている。第一に、融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる好ましい変異は、三次元構造において、ＦｃＲまたはＦｃＲｐ抗体と結合する相互作用表面の部分である領域には影響を及ぼさない。第二に、本発明の好ましい変異による血清中半減期の改善は、ＦｃＲとの相互作用をＩｇＧ−ガンマ４鎖を用いて除去した場合、およびＦｃＲｐが欠損しているβ２−マイクログロブリン変異マウスを用いた薬物動態学的研究によって、ＦｃＲｐとの相互作用を除去した場合においても生じる。第三に、本発明の好ましい変異は、Ｉｇ融合タンパク質のＪ７７４細胞のＦｃＲに対する結合には影響を及ぼさない。
【００２９】
部位特異的変異誘発解析によって、Ｆｃ受容体と相互作用するＦｃの表面は、ＣＨ２ドメインのヒンジ領域近傍に存在することが示唆されている。Ｆｃ領域のＦｃＲ相互作用表面は、３次元において、ＦｃのＣ末端から極めて遠方にある。同様な解析によって、ＦｃＲｐはＣＨ２およびＣＨ３ドメイン間の境界面に存在するアミノ酸残基と相互作用をすることが示唆されている。
ＦｃＲｐのそのリガンドとの結合は、中性または弱塩基ｐＨ（ｐＨ７．４）より、酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）において、はるかに高い親和性を示す。このことは、エンドソーム内における細胞内部移行後の抗体などのＦｃ含有分子を保護するというＦｃＲｐの機能と整合する。これらの細胞コンパートメントは、リソソームとの融合の後に酸性化され、そしてそれらのタンパク質成分は酸性プロテアーゼによって分解される。このプロセス中の膜結合型ＦｃＲｐへの結合によって、抗体の分解が妨げられ、それが細胞外へ（循環系への回帰）、または細胞層を越えて（トランスサイト−シス）再利用されることを可能にする。この後者のプロセスによって、消化管の酸性環境における乳の消化の後に、ＩｇＧは新生児腸粘膜を通過できるようになる。
【００３０】
Ｆｃ／ＦｃＲｐ複合体の構造から、ＦｃＲｐはＦｃ領域の側部に、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの両方に接触しながら結合すること、および該接触領域は、Ｆｃ領域のＣ末端に特に近接しているわけではないことが示唆される。したがって、ＦｃのＣ末端領域自体の変化が、ＦｃＲｐとの相互作用を変化させるとは予測されない。
如何なる特定の理論に束縛されることも望まないが、本発明の融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる連結領域における変異は、例１５に示すように、プロテアーゼ切断アッセイにおける融合タンパク質の切断も減じると考えられている。さらに、プロテアーゼによる消化は、融合タンパク質を含む、無処置タンパク質の体からの消失に影響するであろうと考えられている。したがって、プロテアーゼ耐性は、タンパク質の薬物動態の改善に直接寄与すると考えられる。さらに、非変性タンパク質のプロテアーゼによる消化には、アミノ酸の特定の配列の認識に加えて、未変性の構成を有する露出したアミノ酸配列へのプロテアーゼによる接近が含まれるとも考えられている。すなわち、タンパク質全体の構成に影響を及ぼし、それによってそれらの切断部位へのプロテアーゼの接近に影響を及ぼす融合連結部位における変異は、プロテアーゼ耐性および薬物動態の改善に寄与する可能性がある。さらに、特定のプロテアーゼ認識配列を変化せしめる変異は、プロテアーゼ耐性および薬物動態の改善に寄与する可能性がある。
【００３１】
本発明の変異の特長は、抗体部分のその他の変異または置換と組み合わせることによって、Ｉｇ部分の血清中半減期または他の特性を相乗的に調節することができることである。例えば、抗体融合タンパク質の循環系内半減期を増強せしめる１または２以上の本発明の変異は、抗体融合タンパク質とＦｃＲまたはＦｃＲｐとの間の相互作用に影響を及ぼす１または２以上の変異と組み合わせることができる。
さらに、本発明の変異は、広範な抗体部分および広範な非Ｉｇ融合パートナーに用いることができる。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む。非Ｉｇ融合パートナーは、サイトカイン、他の分泌タンパク質、酵素、またはリガンド結合ドメインなどの膜貫通性受容体の可溶性断片を含む。
【００３２】
本発明において、生体内における循環系内半減期が増強された抗体ベース融合タンパク質を、Ｆｃ部位自体を変更することによってさらに増強することができる。これらは、Ｉｌｅ２５３、Ｈｉｓ３１０またはＨｉｓ４３５またはその３次元構造に折り畳まれた場合に、これらの残基のイオン環境に影響し得る他の残基を含む残基であってよい。結果物であるタンパク質は、ｐＨ６およびｐＨ７．４〜８において至適結合についての試験を行うことが可能であり、そしてｐＨ６において高いレベルの結合を有するものおよびｐＨ８において低いレベルの結合を有するものが、生体内における使用のために選択される。このような変異は、本発明の連結部位変異と有効に組み合わせることができる。
【００３３】
本発明の方法および組成物は、PCT/US99/08335（WO 99/52562）に開示された血管新生阻害剤またはPCT/US99/08376（WO 99/53958）に開示されたプロスタグランジン阻害剤と共投与する場合に有用である。本発明の方法および組成物は、PCT/US00/21715に開示された複数のサイトカインタンパク質複合体において用いることもできる。本発明の方法および組成物は、PCT/US99/03966（WO 99/43713）に開示された、融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる他の変異と組み合わせると有用である。
本発明の有用な態様を合成するための限定的でない方法は、本明細書の例において記載され、インビトロおよび臨床前の生体内モデル動物の両方における薬物動態挙動のアッセイにも有用である。キメラ鎖をコードする好ましい遺伝子構造体は、５’から３’方向へ、少なくとも免疫グロブリン部位をコードするＤＮＡ断片および第二の、非免疫グロブリンタンパク質をコードするＤＮＡを含む。別異の好ましい遺伝子構造体は、５’から３’方向へ、第二の、非免疫グロブリンタンパク質をコードするＤＮＡ断片および少なくとも免疫グロブリン部位をコードするＤＮＡを含む。融合した遺伝子は、それが発現せしめられる、適切な受容細胞にトランスフェクションするための発現ベクターにおいて構築されるか、またはそれに挿入される。
【００３４】
本発明は、抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる変異を検出するための方法も提供する。該方法は、抗体ベース融合タンパク質のＩｇ部位と非Ｉｇ部位との間の連結部を架橋する領域への変異の導入を含む。変異融合タンパク質の循環系内半減期は、好ましくは、その生体内における血清中レベルを時間の関数としてモニターすることによってアッセイする。
本発明の一態様において、抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる変異は、例１５において議論するように、プロテアーゼ切断アッセイにおいて、融合タンパク質の切断を減少せしめる変異である。変異は、好ましくは、融合タンパク質のＩｇ部分および非Ｉｇ部分の間の連結部を架橋する領域における変異（例えば、上記において議論した連結部における変異）である。これとは別に、変異は、融合タンパク質のプロテアーゼによる切断を減少せしめ、融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる、あらゆる変異であってよく、このことは例１６に記載されている。したがって、本発明は、融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる変異を検出するために、タンパク質全般および好ましくはＩｇ−サイトカイン融合タンパク質における変異をスクリーニングするための方法を提供する。
【００３５】
本発明は、以下の非限定的な例によってさらに説明される。本明細書において用いられるアミノ酸残基の番号は、ＩｇＧ１アミノ酸配列を参照するものである。当業者は、他のＩｇタンパク質を含む融合タンパク質の対応する変異が、循環系内半減期を増大せしめるために有用であることを理解するであろう。
したがって、本明細書において提供される教示は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥなどの他のＩｇ分子にも適用し得る。
【００３６】
例
例１． 融合連結点におけるＬｙｓコドンの置換による抗体−ＩＬ−２ 遺伝子の構築
抗体−ＩＬ−２ 融合タンパク質の連結点におけるアミノ酸配列は、ＳｅｒＰｒｏＧｌｙＬｙｓ−ＡｌａＰｒｏＴｈｒ（配列番号１）であり、ＳｅｒＰｒｏＧｌｙＬｙｓ（配列番号２）は、抗体の重鎖の通常のカルボキシ末端であり、そしてＡｌａＰｒｏＴｈｒは、成熟ＩＬ−２のＮ末端配列である。融合連結領域における、融合タンパク質の薬物動態に関する変化の効果を決定するために、以下に記載するように変異誘導によって残基の置換または欠失を行った。
免疫サイトカインの発現ベクターは、Gillies at al.,（1998）J.Immunol. 160: 6195-6203に記載されている。重鎖をコードしているヒトガンマ−１遺伝子において、サイレント変異（ＴＣＣからＴＣＡへ）を導入することによって、翻訳停止コドンから２８０ｂｐ上流にあるＸｍａＩ制限部位を破壊した。もう１つのサイレント変異（ＴＣＴからＴＣＣへ）を、重鎖のＣ末端リジンから３残基上流のＳｅｒコドンに導入し、新たなＸｍａＩ部位配列を含んでいるTCC CCG GGT AAA（配列番号３）を作製した[Lo at al.,（1998）Protein Engineering 11: 495-500]。ＩＬ−２ｃＤＮＡを化学合成によって構築し、そしてそれが新しく、独自のＰｖｕＩＩ制限部位を含むようにした[Gillies at al,（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1428-1432]。前記ＸｍａＩ部位およびＰｖｕＩＩ部位は、ともに発現ベクターが独自のものであり、そしてそれらは、ＣＨ３およびＩＬ−２ＤＮＡの連結点にあるリジンコドンに対する変異誘発を容易にするものであった。
【００３７】
Ｌｙｓコドンの置換または欠失は、免疫サイトカインの発現ベクターのＸｍａＩ−ＰｖｕＩＩ断片を、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチド二量体と置換することによって行った。この場合、重鎖および軽鎖の可変領域は、ヒト化ＫＳ抗体由来であり、該抗体はＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）と呼ばれるヒト抗原を認識するものであった。本発明において用いたオリゴヌクレオチド二量体の配列は下記に示すが、太字のコドンが所望の変異をコードし、斜字体の配列である
【化１】
が、ＸｍａＩ部位の粘着末端およびＰｖｕＩＩ部位の平滑末端をそれぞれ表す。５’−水酸基末端を有する前記オリゴヌクレオチド二量体を、ＸｍａＩ−ＰｖｕＩＩ消化発現ベクターへの連結に用いた。５’−水酸基末端を有する前記オリゴヌクレオチドの使用によって、該オリゴヌクレオチド二量体の自己連結が排除された。
【００３８】
１．）ＬｙｓのＡｌａへの置換
【化２】
【００３９】
２．）ＬｙｓのＡｒｇへの置換
【化３】
ＮａｒＩ制限部位（ＧＧＣＧＣＣ）もサイレント変異によって導入し、組み換えクローンのスクリーニングを容易にした。
【００４０】
３．）Ｌｙｓの欠失
【化４】
【００４１】
４．）ＬｙｓのＧｌｙへの置換
【化５】
ＡｐａＩ制限部位（ＧＧＧＣＣＣ）もサイレント変異によって導入し、組み換えクローンのスクリーニングを容易にした。
【００４２】
５．）ＬｙｓのＬｅｕへの置換
【化６】
ＮａｒＩ制限部位（ＧＧＣＧＣＣ）もサイレント変異によって導入し、組み換えクローンのスクリーニングを容易にした。
【００４３】
６．）ＬｙｓのＡｌａＡｌａＡｌａへの置換
【化７】
【００４４】
７．）ＬｙｓのＣｙｓへの置換
【化８】
ＦｓｐＩ制限部位（ＴＧＣＧＣＡ）もサイレント変異によって導入し、組み換えクローンのスクリーニングを容易にした。
【００４５】
８．）ＬｙｓのＡｓｐへの置換
【化９】
Ｌｙｓコドンの種々の置換または欠失を含んでいる組み換え遺伝子構造体は、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【００４６】
例２．融合連結点においてさらなるアミノ酸残基をコードする抗体−ＩＬ−２ 遺伝子の構築
融合タンパク質中のドメインを、グリシンおよびセリンなどのアミノ酸残基を含有するフレキシブルなリンカーによって分離することは、当技術分野において普通に行われることである。ＣＨ３およびＩＬ−２のスペーシングの重要性について、以下の変異誘発実験によって調べた。異なる数のアミノ酸残基をコードしている平滑末端を有するオリゴヌクレオチド二量体を、連結によってｈｕＫＳ−ＩＬ−２発現ベクターのＳｍａＩエンドヌクレアーゼ制限部位（上記ＸｍａＩと同一の部位）に挿入した；そして、ＤＮＡシークエンシングによって、挿入が正確に配置されたことを確認した。上記において議論したように、５’−水酸基末端を有するオリゴヌクレオチド二量体を使用することによって、自己連結を排除した。
【００４７】
９．）リンカー連結を有するＬｙｓのＣｙｓへの置換
連結によって、ｈｕＫＳ−ＩＬ−２発現ベクターのＳｍａＩエンドヌクレアーゼ制限部位に、以下のリンカー（オリゴヌクレオチド二量体）を挿入した。配列ＧＣＡＴＧＣはＳｐｈＩ制限部位をコードし、それによってリンカーの挿入を含んでいる組み換え体のスクリーニングを容易にした。
5' GGCATGC GG 3'
3' C CGT ACG CC 5'
ＳｍａＩ部位（CCCGGG）へのリンカーの連結後に、融合連結部位の配列は
C CCG GCA TGC GGG GGT AAA（配列番号２０）（リンカーの配列に下線を付した）
Pro Ala Cys Gly Gly Lys（配列番号２１）
になった。
したがって、リンカーによって元のＬｙｓ残基の位置にＣｙｓ残基が挿入され、鎖間のジスルフィド結合が形成され得るようになった。元のＬｙｓ残基は、３アミノ酸残基分（ＡｌａＣｙｓＧｌｙ）押し戻された。
【００４８】
１０．）６アミノ酸残基をコードするリンカー
ｈｕＫＳ−ＩＬ−２発現ベクターのＳｍａＩエンドヌクレアーゼ制限部位に、下記のリンカー（オリゴヌクレオチド二量体）を連結によって挿入した。配列GGATCCは、ＢａｍＨＩ制限部位をコードするものであり、それによってリンカーの挿入を含んでいる組み換え体のスクリーニングを容易にした。
5' G GGT TCA GGA TCC GGA GG 3'（配列番号２２）
3' C CCA AGT CCT AGG CCT CC 5'（配列番号２３）
ＳｍａＩ部位へのリンカーの連結後に、融合連結部位の配列は
ProGlySerGlySerGlyGlyGlyLys（配列番号２４）
になった。挿入された６アミノ酸残基に下線を付した。
【００４９】
１１．）１１個のアミノ酸残基をコードするリンカー
下記のリンカー（オリゴヌクレオチド二量体）をｈｕＫＳ−ＩＬ−２発現ベクターのＳｍａＩエンドヌクレアーゼ制限部位に、連結によって挿入した。配列GGATCCは、ＢａｍＨＩ制限部位をコードし、それによってリンカーの挿入を含んでいる組み換え体のスクリーニングを容易にした。
5' G GGT TCA GGC TCT GGA TCA GGG TCC GGA TCC GG 3'（配列番号２５）
3' C CCA AGT CCG AGA CCT AGT CCC AGG CCT AGG CC 5'（配列番号２６）
ＳｍａＩ部位へのリンカーの連結後に、融合連結部位の配列は
ProGlySerGlySerGlySerGlySerGlySerGlyGlyLys（配列番号２７）
になった。挿入された１１個のアミノ酸残基に下線を付した。
【００５０】
例３．融合連結点におけるＰｒｏコドンの置換による、抗体−ＩＬ−２遺伝子の構築
ＣＨ３のカルボキシ末端に存する配列ＰｒｏＧｌｙＬｙｓ中のプロリンを、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＧｌｙ、および他のアミノ酸に変異せしめた。これは、２５塩基対であるＫＳ−ＩＬ−２発現ベクターのＳａｐＩ−ＳｍａＩ断片を、所望の変化をコードするオリゴヌクレオチド二量体によって置換して行った。下記オリゴヌクレオチド二量体は、それぞれＳａｐＩ粘着末端（３塩基のオーバーハング）および平滑末端（制限断片のＳｍａＩへの連結のため）を有する。Ｐｒｏコドンにおける置換を太字で表した。これらの置換が融合タンパク質の薬物動態に対して有意な影響を及ぼさなかったことから、Ｐｒｏ残基は、融合タンパク質の薬物動態に対して有意な影響を及ぼさないことが示された。
【００５１】
１２.）ＰｒｏのＡｌａへの置換
【化１０】
【００５２】
１３.）ＰｒｏのＬｅｕへの置換
【化１１】
【００５３】
１２．）ＰｒｏのＧｌｙへの置換
【化１２】
【００５４】
例４． ｈｕ１４．１８−（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２ＤＮＡ の構築
ＬｙｓのＡｌａへの置換の抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態に対する影響が、ｈｕＫＳ抗体に限定されないことを示すために、本発明者らは異なる抗体であるヒト化１４．１８（ｈｕ１４．１８）を選択したが、これは多くのヒト腫瘍細胞表面に過剰発現したガングリオシドであるＧＤ２を認識するものであった。ｈｕ１４．１８−（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２の発現ベクターは、上記のように構築した。
【００５５】
例５． ｈｕＫＳ−（Ｌｙｓ欠失）−ＴＮＦαＤＮＡ
Ｌｙｓ残基の抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態に対する効果が、他のサイトカインにも適用し得ることを示すために、本発明者らは異なるサイトカインであるＴＮＦαを選択した。ＴＮＦαの完全なｃＤＮＡ配列は、Nedwin at al.のNucleic Acids Res.（1985）13: 6361-6373において報告され、そして抗体−ＴＮＦαの発現も、Gillies at al. の Bioconjugate Chem.（1993）4: 230-235に記載されている。抗体−ＴＮＦαの融合連結部は、ＳｅｒＰｒｏＧｌｙＬｙｓ−ＶａｌＡｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒ（配列番号３４）の配列を有し、ここでＶａｌは、成熟ＴＮＦαのＮ末端残基である。ｈｕＫＳ−ＴＮＦαと比較するために、ｈｕＫＳ−（Ｌｙｓ欠失）−ＴＮＦαをコードするＤＮＡをオーバーラッッピングＰＣＲ法[Daugherty at al.,（1991）Nucleic Acids Res. 19: 2471-2476] によって、Ｌｙｓ残基の欠失をコードする変異プライマーを用いて構築した。したがって、結果物である、ｈｕＫＳ−（Ｌｙｓ欠失）−ＴＮＦαの発現ベクターは、融合連結部においてペプチド配列ＳｅｒＰｒｏＧｌｙ−ＶａｌＡｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒ（配列番号３５）をコードする。本新規発明によるこの融合タンパク質の他の変更には、連結領域の総電荷をさらに減じるために、ＴＮＦのアミノ末端配列におけるＡｒｇ残基の除去を含み得る。
【００５６】
例６．ｈｕＫＳ−（ＥＵ）−（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２ＤＮＡの構築
上記例において述べた抗体−サイトカイン融合タンパク質は全て、ミエローマＨ鎖によって表されるヒトＩｇＧ１のあるアロタイプであるＫＯＬをベースにした。ＬｙｓのＡｌａへの置換の抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態における効果がＫＯＬに限定されるものではないことを示すために、本発明者らは、ミエローマＨ鎖によって表される異なるＩｇＧｌのアロタイプであるＥＵを選択した。ＥＵアロタイプは、ＫＯＬアロタイプとは定常領域の３アミノ酸残基が異なる。ＥＵアロタイプはＣＨ１末端部にＬｙｓ−２２９を含み、そしてＡｓｐ３５６およびＬｅｕ−３５８をＣＨ３開始部に含む。ＫＯＬアロタイプは、Ａｒｇ−２２９、Ｇｌｕ−３５６およびＭｅｔ−３５８を、対応する位置に含む。ＥＵアロタイプをコードするＤＮＡは、ＫＯＬのＤＮＡの変異によって、オーバーラッピングＰＣＲ法を用いて作製した。結果物であるＥＵのＤＮＡを用い、対応するＫＯＬのＤＮＡ断片の置換によって、ｈｕＫＳ−（ＥＵ）−（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２を産生する発現ベクターを作製した。
【００５７】
例７．細胞のトランスフェクションおよびタンパク質の発現
一時的なトランスフェクションのために、Lipofectamine Plus（Life Technologies、Gaithersburg、MD）を用い、供給者のプロトコールに従い、リポフェクションによってBaby Hamster Kidney（ＢＨＫ）細胞にプラスミドを導入した。
安定的にトランスフェクトされたクローンを得るため、プラスミドＤＮＡをマウスミエローマＮＳ／０細胞に、エレクトロポレーションによって導入した。ＮＳ／０細胞を、ウシ胎児血清１０％、２ｍＭグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを加えたDulbeccoの改変Eagle's培地によって培養した。約５×１０６個の細胞をＰＢＳによって１回洗浄し、０．５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。次に、直線化したプラスミドＤＮＡ１０μｇを細胞とともに、Gene Pulser Cuvette（電極間隔０．４ｃｍ、ＢｉｏＲａｄ）内、氷上にて１０分間インキュベートした。０．２５Ｖおよび５００μＦの条件下、Gene Pulser（BioRad、Hercules、CA）を用いてエレクトロポレーションを行った。細胞を氷上にて１０分間回復させた後、それを増殖培地に再懸濁し、そして２枚の９６穴プレートに植え付けた。トランスフェクションの２日後にメトトレキセート（ＭＴＸ）１００ｎＭを導入し、その存在下における増殖によって、安定的にトランスフェクトされたクローンを選択した。細胞に３日に１回、２回から３回以上、栄養を与え、そしてＭＴＸ耐性クローンが２〜３週間のうちに現れた。クローンからの上清を、抗ＦｃＥＬＩＳＡによってアッセイし、産生能が高いものを検出した。高産生クローンを単離し、そしてＭＴＸを１００ｎＭ含有する増殖培地において増殖させた。
【００５８】
ゲル電気泳動によるルーチンの特性評価のため、調整した培地中の抗体−サイトカイン融合タンパク質をProtein A Sepharose（Repligen、Cambridge、MA）において捕捉し、そして次に、２−メルカプトエタノールを含むかまたは含まないタンパク質サンプル緩衝液中にてボイルすることによって溶出せしめた。ＳＤＳゲルによる電気泳動の後、タンパク質のバンドをクーマシー染色によって可視化した。抗体の重鎖−ＩＬ−２および軽鎖は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、それぞれ６７ｋＤおよび２８ｋＤの分子量を有することが明らかになった。
精製のため、Protein A Sepharoseに結合した融合タンパク質を、リン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ３、および１５０ｍＭのＮａＣｌ）中にて溶出せしめた。そして、溶出液は、０．１ＮのＮａＯＨによって直ちに中和した。
【００５９】
例８．ＥＬＩＳＡ法
ＭＴＸ耐性クローンおよび他の試験サンプルの、上清中のタンパク質産物の濃度を決定するためにＥＬＩＳＡを用いた。抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡは、ヤギの抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖の両方に抗する）を用いる捕捉ステップおよびＦｃ断片特異的である、ヤギの抗ヒトＩｇＧ 西洋ワサビペルオキシダーゼ結合性 Ｆ（ａｂ’）２断片を用いる検出ステップからなる。したがって、抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡによって、ヒトＩｇＧが、抗体自体としてまたはサイトカイン融合タンパク質として定量される。無処置の抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の濃度を決定するために、ＩＬ−２検出ＥＬＩＳＡを用いた。ヤギの抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖の両方に抗する）を用いる同一の捕捉ステップからなるが、検出ステップにはＩＬ−２に対して方向付けられた検出抗体を用いる。いくつかの実験においては、捕捉抗体の代わりにＥＰＣＡＭを用いてＫＳ−ＩＬ−２融合タンパク質を検出したが、それはＫＳ抗体がＥＰＣＡＭを認識するからである。いくつかの実験においては、市販のヒトＩＬ−２ＥＬＩＳＡ検出キット（R & D Systems）を用いた。ＩＬ−２検出抗体を含む異なるＥＬＩＳＡ法の全てによって、同様な結果が得られた。しかし、図１Ａおよび図１Ｂの対比から示されるように、薬物動態の後半の時点においては、ヒトＦｃ免疫反応物質と比較すると、ＩＬ２免疫反応物質の減少が漸増している。この影響は、最も好ましくない薬物動態を有する融合タンパク質において最も顕著である。
抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡについて、下記に詳細に記載した。
【００６０】
Ａ．コーティングプレート
ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬのAffiniPureヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson Immuno Research Laboratories、West Grove、PA）によって、そして９６穴プレートに１００μｌ／穴（Nunc-Immuno plate Maxisorp）でコートした。コートしたプレートは、蓋をして、４℃で一晩インキュベートした。続いて、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０）のＰＢＳ溶液によって４回洗浄し、そして１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清のＰＢＳ溶液によって、２００μｌ／穴の割合でブロッキングした。前記ブロッキング緩衝液とともに３７℃において２時間インキュベートした後、プレートを０．０５％ＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液によって４回洗浄し、ペーパータオル上にてたたきながら乾燥した。
【００６１】
Ｂ．試験サンプルおよび２次抗体とのインキュベーション
試験サンプルを、１％ＢＳＡ／１％ヒツジ血清／０．０５％ＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液を含有するサンプル緩衝液中において適切な濃度に希釈した。濃度がわかっているキメラ抗体（ヒトＦｃとの）によって、標準曲線を得た。標準曲線を得るに際しては、１２５ｎｇ／ｍｌ〜３．９ｎｇ／ｍｌの範囲の標準曲線が得られるように、サンプル緩衝液を連続的に希釈した。希釈したサンプルおよび標準液を１００μｌ／穴の割合でプレートに添加し、そしてプレートを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを８回、０．０５％ＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液によって洗浄した。次に、それぞれの穴に、２次抗体である、サンプル緩衝液中にて約１：１２０，０００に希釈した、Ｆｃ断片に特異的なヤギ抗ヒトＩｇＧの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合AffiniPure F（ａｂ’）２断片（Jackson Immuno Research）を１００μｌ添加した。２次抗体の正確な希釈率は、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧのそれぞれのロットに対して決定しなければならない。３７℃における２時間インキュベーションの後、プレートを０．０５％ＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液にて８回洗浄した。
【００６２】
Ｃ．発色
１００μｌ／穴の割合で基質溶液を添加した。基質溶液は、ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、１タブレット）３０ｍｇを、０．０２５Ｍクエン酸／０．０５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ５であり、直前に添加したＨ２Ｏ２を含有する緩衝液に溶解せしめて調製した。暗黒の室温下にて、３０分間発色させた。発色時間は、コートしたプレート、２次抗体などのロット間の変動に応じて変化させた。標準曲線における色の発色を観察して反応の停止時期を決定した。反応の停止は、４Ｎ Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／穴添加することによって行った。プレートは、４９０および６５０ｎｍの両方にセットし、６５０ｎｍにおけるバックグラウンドＯＤから４９０ｎｍにおけるＯＤを減じるようにプログラムしたプレートリーダーによって読み取った。
【００６３】
例９．融合連結部に変化を有する抗体−サイトカイン融合タンパク質の薬物動態挙動
融合タンパク質の薬物動態挙動の試験を、Ｂａｌｂ／ｃマウスへの静脈内注射の後に行った。マウスから眼窩後方出血（retro-orbital bleeding）によって採血し、そしてエッペンドルフ製微小遠心管内において、４℃にて保存した。場合によって、２種の異なるＥＬＩＳＡ法を用いて、種々の時点において血中に残存しているヒト抗体の量および第二の、融合非−Ｉｇタンパク質の量の両方を測定した。これとは別に、非Ｉｇ部分の存在を、薬物動態の時点におけるウェスタンブロット分析によって推測した。
【００６４】
前記例において記載した手法を用いて、ＫＳ（ガンマ１）−ＩＬ−２融合変異タンパク質をマウスに注射し、そして血清中半減期に対する効果を決定した。いくつかの結果を図１および図２に示す。さらに、抗体重鎖のＣ末端リジン欠失の効果を、抗体が異なる結合特異性を有するＩｇＧ（ガンマ１）−ＩＬ−２融合体において調べた。１４．１８（Ｌｙｓ→Ａｌａ）−ＩＬ−２の薬物動態特性は、１４．１８−ＩＬ−２より優れ、その改善の程度は、ＫＳ（Ｌｙｓ→Ａｌａ）−ＩＬ−２をＫＳ−ＩＬ−２と比較した場合の改善度合いと同程度であった。
抗体−ＩＬ−２融合体において、薬物動態特性に対する、重鎖Ｃ末端リジンに影響を及ぼす変異の効果の序列は（最高から最低の順で）：Ｌｙｓ→Ｌｅｕ〜Ｌｙｓ→Ａｌａ〜Ｌｙｓ→Ａｌａ３＞Ｌｙｓ→（欠失）＞Ｌｙｓ→Ａｓｐ〜Ｌｙｓ→Ｇｌｙ＞Ｌｙｓ→（無変化）〜Ｌｙｓ→Ｃｙｓ＞Ｌｙｓ→Ａｒｇであった。
【００６５】
ＫＳ（Ｌｙｓ→除去）−ＴＮＦアルファの薬物動態特性は、ＫＳ−ＴＮＦαに比して有意に改善されていた（図３）。ＫＳ−ＴＮＦアルファ融合タンパク質の薬物動態学的プロファイルは、ヒト抗体レベルをＦｃＥＬＩＳＡによって測定した場合、最初の３０分以内に、検出されるタンパク質のレベルが急激に減少し、続いてヒトＦｃ反応物質のレベルが緩やかに上昇するという点で通常とは異なっていた。この効果の再現性は高かった。
ウェスタンブロッティングによって薬物動態サンプルを分析した場合、ヒトＦｃ交差反応性物質は、無損傷抗体の形態であることが見出された；ＴＮＦ部分は切断され、失われていた。しかし、Ｃ末端リジンを欠失したＫＳ−ＴＮＦアルファ融合タンパク質の同様な分析によって、このタンパク質は、優占的に無損傷形態で、ＴＮＦを未だ有して存在することが示唆された。
【００６６】
さらに、成熟ＴＮＦアルファ配列の最初の８個のアミノ酸を欠失しているＫＳ−ＴＮＦα融合タンパク質を発現させた。欠失型ＫＳ−ＴＮＦアルファ融合タンパク質の薬物動態特性は、成熟ＴＮＦ配列の全てを有する対応するタンパク質より優れていた。これは、恐らく、連結領域の疎水性を増大せしめる、成熟ＴＮＦの＋２位に存する荷電Ａｒｇ残基を除去したことによるものである。
ＫＯＬからＥＵへの、ＫＳ（Ｌｙｓ→Ａｌａ）−ＩＬ−２およびＫＳ−ＩＬ−２タンパク質の重鎖定常領域の変化は、いずれのタンパク質の薬物動態特性に対しても効果がなかった。
これらの結果は、総じて、連結部の変異によって、Ｉｇ融合タンパク質の薬物動態特性は有意に改善されることを示唆している。該効果は多岐にわたる抗体、およびＩｇ部分に融合された、多岐にわたる非Ｉｇタンパク質において認められた。
【００６７】
例１０．融合連結点における変異とＩｇタイプのガンマ１からガンマ４への変換とを組み合わせることは、ＦｃＲｐ機能とは独立して血清中半減期の相乗的増大につながる
ヒトガンマ４Ｆｃ領域のＦｃ受容体への結合は弱い。その結果、ガンマ４Ｆｃ領域を含む融合タンパク質は、ガンマ１鎖を有する融合タンパク質と比べて、一般に優れた薬物動態特性を有する。Ｆｃ受容体に対する効果、ＦｃＲｐ相互作用、またはこれらの両方を介して、連結部における変異が、薬物動態に影響を及ぼすのかを明らかにするために、連結部に変異を有するかまたは有しない、ガンマ１含有融合タンパク質およびガンマ４含有融合タンパク質の薬物動態特性を、ＦｃＲｐが正常であるかまたはそれが欠損しているマウスにおいて調べた。図２に、これらの薬物動態実験の結果を示した。
図２は、ＫＳ（ガンマ１）−ＩＬ−２融合タンパク質、ＫＳ（ガンマ４）−ＩＬ−２融合タンパク質、ＫＳ（ガンマ１）（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２融合タンパク質、およびＫＳ（ガンマ４）（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態挙動を示している。正常のマウスおよびベータ２マイクログロブリン欠損マウスによって調べた。
【００６８】
これらのデータによって、正常のマウスにおいては、ＩｇＧ−ガンマ１抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態は、抗体部分のＣ末端にＬｙｓのＡｌａへの変異を導入することによって改善されることが示唆された。同様に、ＩｇＧ−ガンマ４ 抗体ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態は、ＬｙｓのＡｌａへの変異を導入することによって改善された。これらのデータは、連結部の変異によって、Ｆｃ受容体への結合を低減することによって既に薬物動態を改善せしめた、融合タンパク質の薬物動態が改善されることを示唆している。
図２は、ＦｃＲｐの必須のサブユニットであるベータ２マイクログロブリンタンパク質（Junghans and Anderson, Proc. Nat Acad. Sci.（1996）93: 5512-5516）を欠損しているマウスに、同じタンパク質を注射した場合の、該タンパク質の薬物動態的特性も示している。したがって、これらの変異マウスは、ＦｃＲｐ活性を欠損している。その結果、該変異マウスにおける抗体の異化は、正常のマウスより、約１０倍速かった。
【００６９】
図２のデータによって、ＫＳ（ガンマ１）抗体、ＫＳ（ガンマ１）−ＩＬ−２融合タンパク質、ＫＳ（ガンマ４）−ＩＬ−２融合タンパク質、ＫＳ（ガンマ１）（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２融合タンパク質、およびＫＳ（ガンマ４）（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２融合タンパク質は、いずれもベータ２マイクログロブリン変異マウスにおいて、野生型マウスより速く異化されることが示唆された。しかし、血清中半減期の相対的序列は、いずれの系統のマウスにおいても同様であった：非融合抗体が最も優れた薬物動態を有し、ＫＳ（ガンマ４）（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２融合タンパク質、ＫＳ（ガンマ１）（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２融合タンパク質、ＫＳ（ガンマ４）−ＩＬ−２融合タンパク質がこれに次ぎ、ＫＳ（ガンマ１）−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態特性が最も劣っていた。連結部変異が、融合タンパク質のＦｃＲｐとの相互作用を変化させることによってのみ効果を有するものであれば、ＦｃＲｐ機能非存在下においては、該連結部変異は薬物動態に対して影響を及ぼさなかったはずである。
【００７０】
例１１．無処置抗体の連結領域の変異は、血清中半減期に対する効果を有しない
無処置の、非融合ＫＳ抗体の重鎖をコードしている遺伝子における変異によって、Ｃ末端リジンをアラニンに変換する操作を行った。野生型および変異型ＫＳを発現させ、さらに上記の方法によって精製し、そして薬物動態特性を比較した。野生型および変異型抗体の薬物動態挙動は、分別することができないことが見出された。
【００７１】
例１２．融合連結部における変異を有するかまたは有しない抗体融合タンパク質によるＦｃ受容体への結合
標準的な手法を用いて、ＫＳ−ＩＬ−２およびＫＳ（Ｋ−Ａ）−ＩＬ−２のＦｃ受容体への結合を調べた。変異による効果は見出せなかった。融合タンパク質を発現させ、さらに上記の方法によって精製し、そしてＦｃ受容体を発現する固定したＪ７７４細胞へのそれらの結合能を調べた。結果を図４に示す。
【００７２】
例１３．連結部変異を含む抗体−サイトカイン融合タンパク質による、哺乳動物における大腸癌の処置
連結部変異を有するサイトカイン−抗体融合タンパク質が、哺乳動物における大腸癌腫の処置において有利な効果を有するか否かを試験するために、以下の実験を行った。ＣＴ２６は、Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来の大腸癌腫セルラインである。標準的な遺伝工学的手法によって、該セルラインを、ＫＳ抗体が認識する抗原であるヒト真皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現するように操作した；前記細胞はＣＴ２６／ＥｐＣＡＭ細胞（Gillies at al. Journal of Immunology（1998）160: 6195-6203）と称せられている。
Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、２×１０６個のＣＴ２６／ＥｐＣＡＭ細胞を皮下接種した。腫瘍の体積が、約５０〜２００立方ミリメートルに達したとき、マウスをランダムに７頭ずつの３群に分けて、その後の調査に供した。０日目から、ＰＢＳ、ＩｇＧ１重鎖（ＫＳ−ＩＬ２ガンマ１）を有する約１０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２、またはＩｇＧl 重鎖ならびに上記例に記載したＬｙｓの Ａｌａへの変異（ＫＳ−ＩＬ２ガンマ１[Ｌｙｓ to Ａｌａ]）を有する約１０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２で、腫瘍担持マウスを処理した。マウスへの処理は、静脈内投与によって、日に１回ずつ、５日間にわたって行った。腫瘍の大きさは、ノギスによって測定した。
【００７３】
このような実験の１つの結果を図５に示す。この実験において、ＫＳ−ＩＬ２ガンマ１によって、全てではないが、多くの腫瘍の大きさを有意に減少した。７頭のＫＳ−ＩＬ２ガンマ１処理個体群のうち６頭において、２１日目には、腫瘍はまだ測定可能な大きさであった。しかし、ＫＳ−ＩＬ２ガンマ１（Ｌｙｓ to Ａｌａ）処理個体群においては、腫瘍は収縮し、７頭全ての個体において、２１日目までに腫瘍は測定不能になり、そして１６日目までに、測定可能な個体は７頭のマウス中僅か２頭になった。図５中、黒ダイヤは、コントロールとして０、１、２、３、および４日目にＰＢＳを注射したマウスの平均腫瘍サイズを示す。黒丸は、１０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２ガンマ１で処置したマウスの平均腫瘍サイズを示す。静脈注射を行った。ｘ軸は、最初の注射からの経過日数を示す；ｙ軸は、平均腫瘍サイズを、立方ミリリットルによって示す。
【００７４】
例１４．連結部変異を含有する抗体−サイトカイン融合タンパク質の処置による、哺乳類における転移の阻害
抗体−サイトカイン融合タンパク質が、腫瘍細胞の転移性増殖を阻害できるか否かを試験するために、以下の実験を行った。ルイス肺癌腫（ＬＬＣ）は、Ｃ５７／Ｂ１６マウス由来の肺癌腫セルラインである。標準的な遺伝工学的手法によって、該セルラインを、ＫＳ抗体が認識する抗原であるヒト上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現するように改変した；前記細胞はＬＬＣ／ＥｐＣＡＭ細胞と称せられている。
Ｃ５７／Ｂ１６ マウスに、１×１０６個のＬＬＣ／ＥｐＣＡＭ細胞を静脈内注射した。５日後に、マウスをランダムに６頭ずつの３群に分け、ＰＢＳ、約２０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２、または約２０マイクログラムのＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２（Ｉｇ部分のＣ末端にＬｙｓの Ａｌａへの変異を有するＫＳ−ＩＬ２）のいずれかで処置した。２４日後に転移を定量した。下表に示すように、ＰＢＳ処置群は、肺に多数の転移を有していた。ＫＳ−γ１−ＩＬ２処置個体群においては、転移数は有意に少なかった。しかし、ＫＳ−γｌ−Ａｌａ−ＩＬ２処置個体群における転移は、ＫＳ−γ１−ＩＬ２処理個体群よりはるかに少数であり、そして一個体においては、転移は全く検出されなかった。
【００７５】
【表１】
総合すると、例１３および１４は、抗体−サイトカイン融合タンパク質によって、原発の部位における腫瘍細胞の増殖のみならず、転移の定着も阻害できることを示している。さらに、これらの結果から、抗体−サイトカイン融合タンパク質によって、大腸癌および肺癌などの種々の異なるタイプの腫瘍に起因する疾患を阻害することもできる。しかも、リンカー領域に少なくとも１つのアミノ酸変化を有する本発明による抗体−サイトカイン融合タンパク質は、転移および腫瘍の増殖を、リンカー領域にアミノ酸変化を有しない抗体−サイトカイン融合タンパク質より効果的に阻害する。
【００７６】
例１５．連結部変異を有する抗体融合タンパク質の、プロテアーゼ耐性のアッセイ
連結部変異を有する抗体−サイトカイン融合タンパク質が、プロテアーゼによる消化に対して、より感受性が高いか低いかを明確にするために、精製したＫＳ−ＩＬ２およびＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を、種々のプロテアーゼによって種々の回数にわたって処理し、結果物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
１つの実験においては、４マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２およびＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を０．１ｍＵまたは０．４ｍＵのCathepsin D（Enzyme Systems、Livermore、California）によって、３７℃において約１６時間にわたり処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。緩衝液の条件は、製造者の指示によるものを用いた。０．４ｍＵのCathepsin DによってＫＳ−ＩＬ２を処理した場合、約５０％のＫＳ−ＩＬ２重鎖が、種々のより小さい分子量の形態に変換された。優占的な消化産物は、ＫＳ−ＩＬ２重鎖より僅かに小さい分子量を有していたが、ＫＳ重鎖よりはるかに大きかった。この結果から、Cathepsin Dによる切断の大部分は、重鎖−ＩＬ２連結部位には起こらなかったことが示唆された。
【００７７】
対照的に、ＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を、０．４ｍＵのCathepsin D とともに同一の条件でインキュベーションした場合には、Cathepsin Dによる切断程度ははるかに小さく、そしてＫＳ−ＩＬ２の主たる分解産物の分子量のバンドは、本質的に検出不可能であった。
第二の実験においては、４マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２およびＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を２５ｍＵまたは５０ｍＵのCathepsin L（Enzyme Systems、Livermore、California） によって、３７℃において約１６時間にわたり処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。緩衝液の条件は、製造者の指示によるものを用いた。ＫＳ−ＩＬ２を５０ｍＵのCathepsin Lで処理した場合、大部分のＫＳ−ＩＬ２重鎖は、種々のより小さい分子量の形態に変換された。優占的な消化産物は、ＫＳ重鎖とほぼ同一の分子量を有していた。この結果から、Cathepsin Ｌによる切断の大部分は、重鎖−ＩＬ２連結部近傍または該部位に起こったことが示唆された。
対照的に、ＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を、５０ｍＵのCathepsin Lとともに同一の条件でインキュベーションした場合には、Cathepsin Ｌによる切断程度ははるかに小さく、そしてＫＳ−ＩＬ２の主たる分解産物の分子量のバンドは、依然として、観察された分子量種の主たるものであった。
【００７８】
第三の実験においては、４マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２およびＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を０．０４ｍＵ、０．１ｍＵまたは０．２ｍＵのプラスミン（Sigma,
St. Louis、Minnesota）によって、３７℃において約１６時間にわたり処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。緩衝液の条件は、製造者の指示によるものを用いた。０．０４ｍＵのプラスミンによってＫＳ−ＩＬ２を処理した場合、約３／４のＫＳ−ＩＬ２重鎖が、より小さい分子量の形態に変換され、その見かけの分子量はＫＳ重鎖の分子量より約３０個のアミノ酸の分大きかった。０．２ｍＵのプラスミンによってＫＳ−ＩＬ２を処理した場合、本質的に全てのＫＳ−ＩＬ2 重鎖は、見かけの分子量がＫＳ重鎖の分子量より約３０個のアミノ酸の分大きい、分子量がより小さい形態に変換された。これらの結果から、プラスミンによるＫＳ−ＩＬ２の切断の大部分は、重鎖−ＩＬ２連結部位の近傍に生じ、重鎖−ＩＬ２連結部位には生じなかったことが示唆される。
【００７９】
対照的に、ＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を、０．０４ｍＵのプラスミンとともに同一の条件でインキュベーションした場合には、プラスミンによる切断はほとんど検出不能であった。ＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を０．２ｍＵのプラスミンとともにインキュベーションした場合には、いくつかの非切断産物が検出された。さらに、ＫＳ−ＩＬ２重鎖をプラスミンによって切断した場合には、ＫＳ−ＩＬ２重鎖より約９０アミノ酸の分大きい種が、有意な程度に蓄積した；プラスミンによるＫＳ−ＩＬ２の消化においては、この＋９０種は、恐らく、低分子量の＋３０種に迅速に切断され、その結果蓄積することはなかった。しかし、ＬｙｓのＡｌａへの変異によって、プラスミン存在下において、無傷のＫＳ−ＩＬ２は安定化した。それぞれの場合において、抗体の軽鎖は、用いられた条件下において切断されなかった。
総合すると、これらの結果から、ＬｙｓのＡｌａへの変異によって、プロテアーゼによる切断に対する一般的な耐性が生じ、変異部位に起こるものではない切断に対する耐性も生じた。如何なる特定の理論に束縛されることも望まないが、ＬｙｓのＡｌａへの変異によって、ＫＳのＩＬ−２部分のプロテアーゼに対する耐性は、より大きくなるのかもしれない。プロテアーゼは、抗体融合タンパク質の薬物動態において、重要な役割を果たすかもしれない。例えば、抗体融合タンパク質が、Ｆｃ受容体を有している細胞に取り込まれ、初期のエンドソームに移送された場合、その抗体部分は、用いられるタンパク質分解条件に耐性を有するかもしれないが、融合のパートナー部分はより感受性が高く、その結果、抗体融合タンパク質は、部分的に、または完全に消化される可能性がある。
【００８０】
例１６．抗体融合タンパク質の変異の評価における、プロテアーゼによる消化の使用
本例は、タンパク質の薬物動態特性を改善するための一般的な方法を提供する。タンパク質の薬物動態特性を試験し、そしてそのプロテアーゼ感受性も試験する。変異体タンパク質を作製し、タンパク質分解に対するより優れた耐性のための試験を行う。次に、タンパク質分解耐性を増強したそれらの変異体について、薬物動態特性の試験を行う。薬物動態特性が改善されているタンパク質分解耐性タンパク質の割合は、変異体タンパク質全体より大きいことが見出される。薬物動態特性が改善されている変異体タンパク質の中には、Ｎ架橋性グリコシレーションの導入のような、コード配列の調査によって推測される、タンパク質の構造を大きく変化させない１種または２種以上のアミノ酸置換を有するものがある。
変異体タンパク質は、例えば発現構造体の変異誘発および個々の変異体タンパク質を発現するクローンの単離によって作製する。あらゆる変異誘発手法が用いられ、それは部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および関連する遺伝子から雑種配列を作製せしめる変異誘発手法を含む。
これらのアッセイにおいて、エンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼの使用は有用である。如何なる特定の理論に束縛されることも望まないが、ある種のタンパク質、特に腎臓による濾過作用によって除去されないタンパク質の薬物動態は、エンドサイトーシスの際に生じるタンパク質分解によって決定されると考えられる。
【００８１】
トリプシン、キモトリプシン、プラスミンなどの細胞外プロテアーゼ、他の消化プロテアーゼ、凝固因子などの他の血清プロテアーゼ、および組織特異的なプロテアーゼの使用も有用である。例えば、腫瘍特異的プロテアーゼは、変異体タンパク質の試験を行い、改善された薬物動態特性および腫瘍内の微細環境中における安定性を有するそれらの変異体タンパク質を特定する場合に用いられる。他の例においては、経口的に送達される必要があるタンパク質に関し、それらの胃腸管内に存在する酵素であるトリプシンおよびキモトリプシンなどに対する耐性についての試験が行われる。胃腸管内酵素に対する耐性が増強されたタンパク質は、薬物動態も改善され、ＡＵＣ（曲線下面積：Area Under the Curve）が大きいことなどが見出される。
例えば、抗体の部分または全体を有する融合タンパク質をコードする発現構造体を変異させる。クローンを作製し、対応するタンパク質を発現せしめ、そして個々にまたは小さいプールとして、前記タンパク質の相対的プロテアーゼ感受性に関する試験を行う。プロテアーゼ耐性が増強されている変異体抗体融合タンパク質について、次に薬物動態特性の試験を行うと、改善された薬物動態特性を有しているプロテアーゼ耐性抗体融合タンパク質は、有意な数にのぼる。改良変異体融合タンパク質をコードする核酸配をシークエンスすることによって、いくつかの改良変異体は、融合タンパク質連結部以外の部位に、増強されたタンパク質分解耐性および改善された薬物動態の表現形を生じせしめる変異を含んでいることが見出される。
【００８２】
均等物
本発明は、他の特定の形態によって、本発明の思想および特徴から乖離することなく実施され得る。したがって、前述した態様は、如何なる点においても、本明細書中に記載されている発明を説明するものであって、限定するものではないと解されるべきものである。すなわち、本発明の範囲は、付随するクレームによって示されるものであって前記記載によって示されるものではなく、また、クレームの意味の範囲および均等の範囲を逸脱しないあらゆる変形は、クレームに含まれることを意図している。
【００８３】
引用文献による導入
本明細書において開示された各特許文献および科学刊行物の全体は、本出願に引用文献として組み入れられる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年２月１１日に出願されたU.S.S.N. 60/181,768を優先権の基礎とし、そしてその利益を受けることを主張し、その開示は参照として本明細書に組み込む。
【０００２】
発明の分野
本発明は、全般に、融合タンパク質に関する。より詳細には、本発明は、抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期を増強する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
ヒトの疾患を処置するための抗体の使用は、十分に確立されており、そして遺伝子工学の導入によってより精巧になっている。抗体の有用性を改善するためにいくつかの技術が開発されている。これらには以下が含まれる：（１）「ハイブリドーマ」を生成するための細胞融合による、または抗体産生細胞からの抗体重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の分子クローニングによる、モノクローナル抗体の作製；（２）生体内の好ましい部位へ抗体を送達するための、抗体への他の分子、例えば、放射性同位体、毒性薬物、タンパク質毒素、およびサイトカイン、の結合；（３）生物活性を増強または低減するための抗体エフェクター機能の操作；（４）抗体ベース融合タンパク質を産生するための、他のタンパク質、例えば、毒素およびサイトカイン、と抗体との、遺伝子レベルでの連結；ならびに（５）領域を遺伝子レベルで連結して二重特異性抗体を生成する、１組または２組以上の抗体の連結。
【０００４】
タンパク質は、当技術分野において公知の方法を用いる化学的操作または遺伝子操作のいずれかによって連結され、一体化することができる。例えば、Gillies et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1428-1432（1992）；および米国特許第5,650,150号を参照。
【０００５】
しかし、組換えによって産生される抗体ベース融合タンパク質の利用は、循環系からのそれらの迅速な生体内におけるクリアランスによって制限される場合がある。例えば、抗体−サイトカイン融合タンパク質は、遊離の抗体よりも有意に短い生体内における循環系内半減期を有することが示されている。Gilliesらは、種々の抗体−サイトカイン融合タンパク質を試験した場合、試験した全ての融合タンパク質が、１．５時間未満のα相（分配相）半減期を有していたことを報告した。実際、大部分の抗体ベース融合タンパク質は、２時間経過までに、遊離抗体の血清中濃度の１０％までクリアランスされた。Gillies et al., Bioconj.Chem.4:230-235（1993）を参照されたい。
【０００６】
さらに近時において、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を低減した抗体ベース融合タンパク質が、増強された循環系内半減期を有することが示された。Ｆｃ受容体に対する低減した結合親和性、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）などの抗体エフェクタ機能を阻害するが、補体結合または抗原結合などの機能は阻害しないことも示された。Gillies et al., Cancer Res.59（9）:2159-66（1999）を参照されたい。
癌またはウイルス疾患などのいくつかのケースでは、抗体エフェクタ機能および長い循環系内半減期を維持することが望まれ得る。したがって、当該技術において、抗体ベース融合タンパク質の生体内での循環系内半減期を増強するさらなる方法に対する要求がある。
【０００７】
発明の要約
免疫グロブリンG（ＩｇＧ） 分子は、ＩｇＧのクラスの抗体に特異的な３種類のＦｃγ 受容体（ＦｃγＲ）、すなわち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを含む、種々の細胞受容体と相互に作用し合う。それらは、ｐＨ依存的にＦｃＲｐ群の受容体とも相互作用し、中性のｐＨにおいては僅かしか相互作用しないかまたは全く相互作用しないが、ｐＨ６．０においては大きく相互作用をする。
抗体の血清中半減期は、その抗体の、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）およびＦｃ保護受容体（ＦｃＲｐ）への結合能によって影響を受ける。免疫グロブリン融合タンパク質の血清中半減期も、そのような受容体への結合能によって影響を受ける（Gillies et al., Cancer Res. 59: 2159-66（1999））。
【０００８】
本発明は、融合タンパク質内に免疫グロブリン（Ｉｇ）部分および非免疫グロブリン（非Ｉｇ）部分を有し、該２つの部分の連結部位の近傍におけるアミノ酸の変化によって、融合タンパク質の血清中半減期が顕著に増加するという驚くべき発見を開示する。該発見が驚くべきものであるのは、アミノ酸の前記変化が、Ｆｃ領域のＦｃ受容体およびＦｃ保護受容体との相互作用表面とは異なるタンパク質表面に影響を及ぼすからである。さらに、本発明の前記アミノ酸変化は、既知のＦｃ受容体およびＦｃ保護受容体が、融合タンパク質の血清中半減期を優先的に決定するものではない場合にもその効果を有する。したがって、本発明の前記アミノ酸変化は、Ｆｃ受容体および／またはＦｃ保護受容体との相互作用に影響を及ぼすアミノ酸変化と組み合わせることによって、相乗効果を奏せしめることができる。
【０００９】
本発明は、Ｆｃ受容体およびＦｃ保護受容体（ＦｃＲｐ）との相互作用表面とは異なる場所における変化の結果によって血清中半減期が改善される、免疫グロブリンを含有する融合タンパク質を提供する。本発明は、免疫グロブリン部分および第二の、非免疫グロブリンタンパク質による、改善された血清中半減期を有する融合タンパク質を産生する方法も提供する。
【００１０】
前記融合タンパク質のアミノ酸配列の変化は、好ましくはＩｇ部分および非Ｉｇ部分との連結部位のものである。融合タンパク質の前記連結領域は、Ｉｇ重鎖および非Ｉｇタンパク質の天然において生じる配列を基準にして、前記連結点から約１０個のアミノ酸より内側にあると好ましい変化を含む。アミノ酸変化によって疎水性が増大するとさらに好ましい。アミノ酸変化が、抗体部分のＣ末端リジンのアラニンまたはロイシンなどの疎水性アミノ酸への変化を含むとまたさらに好ましい。好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、Ｉｇ重鎖、好ましくは、第二の、非Ｉｇタンパク質のＮ末端側に位置するＩｇ重鎖を含む。
【００１１】
本発明の他の一態様において、融合タンパク質のＦｃＲｐに対する結合親和性は、ＦｃＲｐに接触するＦｃ部分の相互作用表面の変化によって最適化される。ＩｇＧのＦｃＲｐ受容体への結合のための重要な配列は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに存在することが報告されている。本発明によって、融合タンパク質における融合連結部位の変化をＦｃのＦｃＲｐとの相互作用表面の変化と組み合わせることによって、相乗効果が奏せられる。Ｆｃ部分のｐＨ６におけるＦｃＲｐとの相互作用を増大させることが有用である場合があり、そしてＦｃ部分のｐＨ８におけるＦｃＲｐとの相互作用を低減させることが有用である場合もある。このような修飾は、Ｆｃ受容体との接触のために必要な残基の変化またはコンフォメーションの変化の誘導による、他の重鎖残基とＦｃＲｐ受容体との接触に影響を及ぼす他の変化を含む。
【００１２】
したがって、好ましい態様において、生体内における循環系内半減期が増強された抗体ベース融合タンパク質は、Ｉｇ定常領域と第二の、非免疫グロブリンタンパク質のコード配列とをまず結合し、そして次にＩｇＧ 定常領域の、Ｉｌｅ２５３、Ｈｉｓ３１０およびＨｉｓ４３５からなる群から選択されるまたは１個または２個以上のアミノ酸、またはその近傍に変異（点変異、欠失、挿入または遺伝子再配列）を導入することによって得られる。得られる抗体ベース融合タンパク質は、未修飾の融合タンパク質より、生体内における長い循環系内半減期を有する。
【００１３】
ある条件下においては、Ｆｃ部分のあるエフェクタ機能を変異せしめることは有用である。例えば、補体の結合を排除してもよい。あるいは、またはさらに、他の態様のセットにおいては、融合タンパク質のＩｇ成分は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩの少なくとも１つとの結合親和性が低減されている、ＩｇＧの定常領域の少なくとも１つの部位を有する。例えば、ＩｇＧのガンマ４鎖を、ガンマ１鎖の代わりに用いてもよい。当該変化は、ガンマ４鎖によってより長期の血清中半減期がもたらされ、融合連結部における１または２以上の変異と相乗的に機能するという利点を有する。したがって、ＩｇＧ２もＩｇＧ１の代わりに用いてもよい。本発明の他の態様において、融合タンパク質は、変異ＩｇＧ１定常領域、例えば、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ａｓｎ２９７、またはＰｒｏ３３１の１または２以上の変異または欠失を有するＩｇＧ１ 定常領域を含む。本発明のさらなる態様において、融合タンパク質は変異ＩｇＧ３定常領域、例えば、Ｌｅｕ２８ｌ、Ｌｅｕ２８２、Ｇｌｙ２８３、Ｇｌｙ２８４、Ａｓｎ３４４、またはＰｒｏ３７８の１または２以上の変異または欠失を有するＩｇＧ３ 定常領域を含む。しかし、いくつかの適用場面において、ＡＤＣＣのようなＦｃ受容体への結合に伴うエフェクタ機能を保持しておくことは有用であり得る。
【００１４】
好ましい態様において、融合タンパク質の前記第二の、非免疫グロブリン部分はサイトカインである。本明細書における「サイトカイン」の用語は、天然由来タンパク質または組み換えタンパク質、それらの類縁体およびそれらの断片であって、そのサイトカインの受容体を有する細胞において特異的な生物的反応を解発するものとして用いられる。サイトカインは、好ましくは、細胞によって産生されるかまたは分泌され得るタンパク質である。サイトカインは、好ましくは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６およびＩＬ−１８などのインターロイキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびエリスロポエチンなどの造血因子、ＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、リンホトキシンなどのリンホカイン、レプチンなどの代謝経路の制御物質、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγなどのインターフェロン、ならびにケモカインを含む。好ましくは、本発明の抗体−サイトカイン融合タンパク質は、サイトカインの生物活性を示す。
【００１５】
他の好ましい態様において、融合タンパク質の前記第二の、非免疫グロブリン部分は、生物活性を有するリガンド結合タンパク質である。そのようなリガンド結合タンパク質は、例えば、（１）細胞表面における受容体−リガンド相互作用を阻害するか；または（２）血液の液相において分子（例えばサイトカイン）の生物活性を中和し、それによって、それが細胞内の標的に到達するのを妨げる。リガンド結合タンパク質は、好ましくは、ＣＤ４、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦ 受容体、またはＩＬ−１およびＩＬ−４受容体などのインターロイキン受容体を含む。
本発明の抗体−受容体融合タンパク質は、好ましくは、前記リガンド結合タンパク質の生物活性を示す。
【００１６】
さらに他の別異の好ましい態様において、融合タンパク質の前記第二の、非免疫グロブリン部分は、タンパク質毒素である。本発明の抗体−毒素融合タンパク質は、好ましくは前記タンパク質毒素の毒素活性を示す。
さらなる他の別異の好ましい態様において、融合タンパク質の前記第二の、非免疫グロブリン部分は、ホルモン、ニューロトロフィン、体重調節物質、血清タンパク質、凝固因子、プロテアーゼ、細胞外マトリクス成分、血管新生因子、抗血管新生因子、または他の分泌タンパク質または分泌ドメインである。例えば、ＣＤ２６、ＩｇＥ受容体、重合型ＩｇＡ受容体、他の抗体受容体、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、ＴｒｋＡ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｆｌｔ−３リガンド、エンドスタチン、アンジオスタチン、およびこれらのタンパク質のドメインである。
【００１７】
さらに他の別異の好ましい態様において、融合タンパク質の前記第二の、非免疫グロブリン部分は、非ヒトまたは非哺乳類タンパク質である。例えば、ＨＩＶ ｇｐｌ２０、ＨＩＶ Ｔａｔ、アデノウィルス、およびＲＳＶなどの他のウィルスの表面タンパク質、他のＨＩＶ成分、マラリア抗体などの寄生虫性表面タンパク質、および細菌性表面タンパク質が好ましい。これらの非ヒトタンパク質は、例えば抗原として用いてもよく、またはそれらが有用な活性を有しているという理由で用いてもよい。例えば、前記第二の、非免疫グロブリン部分は、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、または有用な酵素活性を有する他のタンパク質であってよい。
【００１８】
本発明において、非免疫グロブリン部分は、タンパク質の部分であってもよい。好ましくは、非Ｉｇタンパク質部分は、無処置のタンパク質の機能的およびまたは構造的性質を実質的に保持しているタンパク質の部分である。好ましい態様において、非Ｉｇタンパク質部分は、本明細書に記載されているタンパク質の機能的または構造的部位である。
好ましい態様において、抗体ベース融合タンパク質は、定常領域のみならず、標的である抗原に特異的な可変領域を含み、それらのうちいずれかは、ペプチド結合を介して、第二の、非免疫グロブリンに結合している。定常領域とは、通常、可変領域に対応させられる定常領域であってもよく、または、例えば異なる種からの可変領域および定常領域であってもよい。
【００１９】
前記重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインの１または２以上のあらゆる組み合わせを含んでよい。重鎖は、好ましくは、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含み、そしてより好ましくは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのみを含む。ある態様において、抗体ベースの１つの融合タンパク質は、融合した重鎖および軽鎖可変領域を有するＦｖ領域を含む。「融合タンパク質」の用語には、異なる種由来のフレームワーク領域および可変領域（すなわち、相補性決定領域）を含む結合ドメインを有する構造体も含まれ、例えばWinterらの英国特許第2,188,638号に開示されている。可変領域を含む抗体ベース融合タンパク質は、好ましくは抗原結合特異性を示す。好ましいさらに異なる態様において、抗体ベース融合タンパク質はさらに軽鎖を含む。したがって、本発明は、抗原結合特異性および抗体の活性が、サイトカインなどの第二の、非免疫グロブリンタンパク質の有効な生物活性と組み合わされた融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、第二の、非免疫グロブリンタンパク質を生体内の標的細胞に選択的に送達して、該第二の、非免疫グロブリンタンパク質をして、局所的な生物活性を発揮せしめるために用いることができる。
【００２０】
別異の好ましい態様において、抗体ベース融合タンパク質は、ペプチド結合を介して第二の、非免疫グロブリンタンパク質に結合する重鎖定常領域を含むが、重鎖可変領域を含まない。したがって、本発明は、第二の、非免疫グロブリンタンパク質の有効な生物活性を保持しているが、抗体の抗原結合特異性および活性を有しない融合タンパク質をさらに提供する。
好ましい態様において、融合タンパク質は、少なくとも１つの重鎖の部位およびジスルフィド結合によって結合した第二の、非Ｉｇタンパク質を含む２つのキメラ鎖を含む。
好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、癌、ウィルス感染、免疫障害の治療、および特定の細胞型の成長（増殖を含む）に有用である。
本発明は、上記融合タンパク質の配列をコードするＤＮＡ構造体、およびセルライン、例えばミエローマであって、これらの前記構造体によってトランスフェクトされたものを特徴とする。
これらおよび他の目的を、本明細書において開示された本発明の利点及び特長とともに、以下の説明、図面、およびクレームによって、より明確にする。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＫＳ−ＩＬ−２融合タンパク質および重鎖のＣ末端リジン部分の置換または例に記載された他の変化を含有する、種々の変異融合タンパク質の薬物動態挙動を示す。抗体または融合タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２（図１Ａ）またはヒトＦｃ（図１Ｂ）について測定した。
【図１Ｂ】ＫＳ−ＩＬ−２融合タンパク質および重鎖のＣ末端リジン部分の置換または例に記載された他の変換を含有する、種々の変異融合タンパク質の薬物動態挙動を示す。抗体または融合タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２（図１Ａ）またはヒトＦｃ（図１Ｂ）について測定した。
【図２】野生型リジンまたは抗体鎖のＣ末端にリジンからアラニンへの変異を担持するガンマ１またはガンマ４鎖を有する、ＫＳ−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態特性を示す。抗体または融合タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２部分について測定した。.
【図３】腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）へのヒト抗体の融合体の薬物動態特性を示す。融合タンパク質のレベルは、ＥＬＩＳＡによって、ヒトＦｃ領域について測定した。抗体−ＴＮＦアルファ融合タンパク質のレベル（黒ダイヤ）および抗体部分のＣ末端リジンを欠失した以外の部分は同一である融合タンパク質（灰色四角）のレベルを示す。
【図４】抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の、ＦｃγＲのクラスの受容体リッチなＪ７７４細胞の膜への結合を示す。非変異ＫＳ−ＩＬ−１２融合タンパク質（黒ダイヤ）および重鎖のＣ末端リジンがアラニンに変異したＫＳ−ＩＬ−１２融合タンパク質（灰色四角）の結合を示す。
【図５】ＫＳの抗原であるヒトＥｐＣＡＭを発現するように操作した、ＣＴ２６大腸癌細胞由来の皮下腫瘍を有する、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに対する、抗体−サイトカイン融合タンパク質による処置の効果を示す。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｉｇ部分および非Ｉｇ部分間の連結部に、循環系内半減期を増大せしめる、１または２以上の変異を有する抗体融合タンパク質を提供する。本発明の変異融合タンパク質は、抗体部分の、体内における２つの既知の薬物動態決定受容体（Ｆｃ受容体およびＦｃＲｐ）のいずれとの相互作用にも影響することなく、その血清中半減期を改善することができるという有利な特性を有する。
本発明の抗体ベース融合タンパク質は総じて、免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質部位が非免疫グロブリン（非Ｉｇ）タンパク質に連結し、Ｉｇおよび非Ｉｇタンパク質間の連結部を架橋する領域のアミノ酸配列が、Ｉｇおよび非Ｉｇタンパク質の野生型アミノ酸配列と比較した場合に、少なくとも１つの変異を含んでいる。
【００２３】
一態様において、Ｉｇ部位のＣ末端領域に、少なくとも１つの変異が存在する。他の一態様においては、非Ｉｇタンパク質のＮ末端領域に、少なくとも１つの変異が存在する。さらなる一態様においては、融合タンパク質は、Ｉｇ部位のＣ末端領域に少なくとも１つの変異を含み、非Ｉｇタンパク質のＮ末端領域に少なくとも１つの変異を含む。変異は、点変異、挿入、欠失、または遺伝子再配列であってよい。好ましい態様において、前記変異は連結部の疎水性を増大せしめる。例えば、変異によって荷電またはイオン化したアミノ酸を、非荷電または疎水性アミノ酸に置換する（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇまたは他のイオン化可能残基を、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐまたは他の非荷電または疎水性残基に置換する）。
【００２４】
任意選択可能な態様において、スペーサーペプチドまたはリンカーペプチドが、Ｉｇおよび非Ｉｇタンパク質の間に挿入される。前記スペーサーペプチドまたはリンカーペプチドは、好ましくは非荷電性であり、より好ましくは非極性、およびまたは疎水性である。スペーサーペプチドまたはリンカーペプチドの長さは、好ましくは１〜約１００アミノ酸、より好ましくは１〜約５０アミノ酸、または１〜約２５アミノ酸、およびさらにより好ましくは１〜約１５アミノ酸である。本発明の他の態様において、融合タンパク質のＩｇおよび非Ｉｇ部分は、スペーサーペプチドまたはリンカーペプチドを介して連結され、そしてＩｇおよび非Ｉｇ部分の一方または両方に、少なくとも１つの変異がある。本発明の別異の態様において、Ｉｇおよび非Ｉｇ部分は、合成スペーサー、例えばＰＮＡスペーサーによって隔てられていて、それは好ましくは非荷電性であり、より好ましくは非極性であり、およびまたは疎水性である。
【００２５】
本発明においては、免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖は、可変または定常ドメインを含む免疫グロブリンタンパク質または免疫グロブリンタンパク質の部分である。Ｉｇ鎖は、好ましくは免疫グロブリン重鎖の部位であり、例えば、予め選択された細胞型に結合可能な免疫グロブリン可変領域である。好ましい態様において、Ｉｇ鎖は、定常領域のみならず、標的抗原に対して特異的な可変領域を含む。定常領域は、可変領域に通常関連する可変領域、または例えば異なる種からの可変および定常領域などの異なるものであってもよい。より好ましい態様において、Ｉｇ鎖は重鎖を含む。該重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインの１または２以上のあらゆる組み合わせを含んでよい。重鎖は、好ましくは、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含み、そしてより好ましくは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのみを含む。ある態様において、免疫グロブリンの部分は、融合した重鎖および軽鎖可変領域を有するＦｖ領域を含む。
【００２６】
本発明において、非免疫グロブリンタンパク質は、免疫グロブリンでない天然由来タンパク質、または免疫グロブリンでない合成もしくは組み換えタンパク質、または上記の任意の断片を含む。好ましい態様において、非免疫グロブリンタンパク質は、リガンド結合ドメイン、酵素ドメイン、調節ドメイン、または１または２以上の細胞因子と相互作用するドメインなどの機能的ドメインを含む。別異の態様において、非免疫グロブリンドメインは、構造ドメインまたはエピトープを含む。
好ましい態様において、Ｉｇ鎖は、遺伝子融合によって非Ｉｇタンパク質に連結されている。好ましくは、前記遺伝子融合は、合成、または組み換えであり、そして化学合成または分子生物学の標準的な手法を用いて産生される。典型的には、変異は、遺伝子融合構造体の部分として導入される。これとは別に、変異は、変異誘発に関する既知の方法（例えば、遺伝子融合構造体を放射線照射、または化学的もしくは生物的変異誘発手法に付す）を用いて後から導入してもよい。
【００２７】
本発明において、連結領域は、融合タンパク質のＩｇおよび非Ｉｇ部分間の連結点を囲む、融合タンパク質の領域である。好ましい態様において、連結領域は、Ｉｇ部分のＣ末端部位および非Ｉｇ部分のＮ末端部位を含む。一態様において、連結領域は、Ｉｇおよび非Ｉｇ部分間の連結点に挿入されたスペーサーペプチドまたはリンカーペプチドを含む。
本発明の好ましい態様において、Ｉｇ部分の変異は、Ｉｇ部分のＣ末端部位に存し、好ましくはＩｇ部分のＣ末端から約１００残基より内側に存し、より好ましくは約５０残基より内側、または約２５残基より内側に存し、およびさらにより好ましくは約１０残基より内側に存する。
本発明の好ましい態様において、Ｉｇ部分の変異は、Ｉｇ部分のＣ末端部位に存し、好ましくは非Ｉｇ部分のＮ末端から約１００残基より内側に存し、より好ましくは約５０残基より内側、または約２５残基より内側に存し、およびさらにより好ましくは約１０残基より内側に存する。
本発明の好ましい態様において、変異は、Ｉｇ部分のＣ末端領域に存するが、該変異は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）またはＦｃＲｐと相互作用するＩｇタンパク質の部分には存しない。
【００２８】
本発明による変異を有する抗体融合タンパク質は、変異を有しない、対応する抗体融合タンパク質の循環系内半減期と比較して、生体内におけるより長い循環系内半減期を有する。抗体融合タンパク質の循環系内半減期は、融合タンパク質の血清中レベルを時間の関数としてアッセイすることによって測定することができる。
実験的な証拠によって、本発明の好ましい変異の効果は、ＦｃＲまたはＦｃＲｐとの相互作用には依存しないことが示唆されている。第一に、融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる好ましい変異は、三次元構造において、ＦｃＲまたはＦｃＲｐ抗体と結合する相互作用表面の部分である領域には影響を及ぼさない。第二に、本発明の好ましい変異による血清中半減期の改善は、ＦｃＲとの相互作用をＩｇＧ−ガンマ４鎖を用いて除去した場合、およびＦｃＲｐが欠損しているβ２−マイクログロブリン変異マウスを用いた薬物動態学的研究によって、ＦｃＲｐとの相互作用を除去した場合においても生じる。第三に、本発明の好ましい変異は、Ｉｇ融合タンパク質のＪ７７４細胞のＦｃＲに対する結合には影響を及ぼさない。
【００２９】
部位特異的変異誘発解析によって、Ｆｃ受容体と相互作用するＦｃの表面は、ＣＨ２ドメインのヒンジ領域近傍に存在することが示唆されている。Ｆｃ領域のＦｃＲ相互作用表面は、３次元において、ＦｃのＣ末端から極めて遠方にある。同様な解析によって、ＦｃＲｐはＣＨ２およびＣＨ３ドメイン間の境界面に存在するアミノ酸残基と相互作用をすることが示唆されている。
ＦｃＲｐのそのリガンドとの結合は、中性または弱塩基ｐＨ（ｐＨ７．４）より、酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）において、はるかに高い親和性を示す。このことは、エンドソーム内における細胞内部移行後の抗体などのＦｃ含有分子を保護するというＦｃＲｐの機能と整合する。これらの細胞コンパートメントは、リソソームとの融合の後に酸性化され、そしてそれらのタンパク質成分は酸性プロテアーゼによって分解される。このプロセス中の膜結合型ＦｃＲｐへの結合によって、抗体の分解が妨げられ、それが細胞外へ（循環系への回帰）、または細胞層を越えて（トランスサイト−シス）再利用されることを可能にする。この後者のプロセスによって、消化管の酸性環境における乳の消化の後に、ＩｇＧは新生児腸粘膜を通過できるようになる。
【００３０】
Ｆｃ／ＦｃＲｐ複合体の構造から、ＦｃＲｐはＦｃ領域の側部に、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの両方に接触しながら結合すること、および該接触領域は、Ｆｃ領域のＣ末端に特に近接しているわけではないことが示唆される。したがって、ＦｃのＣ末端領域自体の変化が、ＦｃＲｐとの相互作用を変化させるとは予測されない。
如何なる特定の理論に束縛されることも望まないが、本発明の融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる連結領域における変異は、例１５に示すように、プロテアーゼ切断アッセイにおける融合タンパク質の切断も減じると考えられている。さらに、プロテアーゼによる消化は、融合タンパク質を含む、無処置タンパク質の体からの消失に影響するであろうと考えられている。したがって、プロテアーゼ耐性は、タンパク質の薬物動態の改善に直接寄与すると考えられる。さらに、非変性タンパク質のプロテアーゼによる消化には、アミノ酸の特定の配列の認識に加えて、未変性の構成を有する露出したアミノ酸配列へのプロテアーゼによる接近が含まれるとも考えられている。すなわち、タンパク質全体の構成に影響を及ぼし、それによってそれらの切断部位へのプロテアーゼの接近に影響を及ぼす融合連結部位における変異は、プロテアーゼ耐性および薬物動態の改善に寄与する可能性がある。さらに、特定のプロテアーゼ認識配列を変化せしめる変異は、プロテアーゼ耐性および薬物動態の改善に寄与する可能性がある。
【００３１】
本発明の変異の特長は、抗体部分のその他の変異または置換と組み合わせることによって、Ｉｇ部分の血清中半減期または他の特性を相乗的に調節することができることである。例えば、抗体融合タンパク質の循環系内半減期を増強せしめる１または２以上の本発明の変異は、抗体融合タンパク質とＦｃＲまたはＦｃＲｐとの間の相互作用に影響を及ぼす１または２以上の変異と組み合わせることができる。
さらに、本発明の変異は、広範な抗体部分および広範な非Ｉｇ融合パートナーに用いることができる。免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む。非Ｉｇ融合パートナーは、サイトカイン、他の分泌タンパク質、酵素、またはリガンド結合ドメインなどの膜貫通性受容体の可溶性断片を含む。
【００３２】
本発明において、生体内における循環系内半減期が増強された抗体ベース融合タンパク質を、Ｆｃ部位自体を変更することによってさらに増強することができる。これらは、Ｉｌｅ２５３、Ｈｉｓ３１０またはＨｉｓ４３５またはその３次元構造に折り畳まれた場合に、これらの残基のイオン環境に影響し得る他の残基を含む残基であってよい。結果物であるタンパク質は、ｐＨ６およびｐＨ７．４〜８において至適結合についての試験を行うことが可能であり、そしてｐＨ６において高いレベルの結合を有するものおよびｐＨ８において低いレベルの結合を有するものが、生体内における使用のために選択される。このような変異は、本発明の連結部位変異と有効に組み合わせることができる。
【００３３】
本発明の方法および組成物は、PCT/US99/08335（WO 99/52562）に開示された血管新生阻害剤またはPCT/US99/08376（WO 99/53958）に開示されたプロスタグランジン阻害剤と共投与する場合に有用である。本発明の方法および組成物は、PCT/US00/21715に開示された複数のサイトカインタンパク質複合体において用いることもできる。本発明の方法および組成物は、PCT/US99/03966（WO 99/43713）に開示された、融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる他の変異と組み合わせると有用である。
本発明の有用な態様を合成するための限定的でない方法は、本明細書の例において記載され、インビトロおよび臨床前の生体内モデル動物の両方における薬物動態挙動のアッセイにも有用である。キメラ鎖をコードする好ましい遺伝子構造体は、５’から３’方向へ、少なくとも免疫グロブリン部位をコードするＤＮＡ断片および第二の、非免疫グロブリンタンパク質をコードするＤＮＡを含む。別異の好ましい遺伝子構造体は、５’から３’方向へ、第二の、非免疫グロブリンタンパク質をコードするＤＮＡ断片および少なくとも免疫グロブリン部位をコードするＤＮＡを含む。融合した遺伝子は、それが発現せしめられる、適切な受容細胞にトランスフェクションするための発現ベクターにおいて構築されるか、またはそれに挿入される。
【００３４】
本発明は、抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる変異を検出するための方法も提供する。該方法は、抗体ベース融合タンパク質のＩｇ部位と非Ｉｇ部位との間の連結部を架橋する領域への変異の導入を含む。変異融合タンパク質の循環系内半減期は、好ましくは、その生体内における血清中レベルを時間の関数としてモニターすることによってアッセイする。
本発明の一態様において、抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる変異は、例１５において議論するように、プロテアーゼ切断アッセイにおいて、融合タンパク質の切断を減少せしめる変異である。変異は、好ましくは、融合タンパク質のＩｇ部分および非Ｉｇ部分の間の連結部を架橋する領域における変異（例えば、上記において議論した連結部における変異）である。これとは別に、変異は、融合タンパク質のプロテアーゼによる切断を減少せしめ、融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる、あらゆる変異であってよく、このことは例１６に記載されている。したがって、本発明は、融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる変異を検出するために、タンパク質全般および好ましくはＩｇ−サイトカイン融合タンパク質における変異をスクリーニングするための方法を提供する。
【００３５】
本発明は、以下の非限定的な例によってさらに説明される。本明細書において用いられるアミノ酸残基の番号は、ＩｇＧ１アミノ酸配列を参照するものである。当業者は、他のＩｇタンパク質を含む融合タンパク質の対応する変異が、循環系内半減期を増大せしめるために有用であることを理解するであろう。
したがって、本明細書において提供される教示は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥなどの他のＩｇ分子にも適用し得る。
【００３６】
例
例１． 融合連結点におけるＬｙｓコドンの置換による抗体−ＩＬ−２ 遺伝子の構築
抗体−ＩＬ−２ 融合タンパク質の連結点におけるアミノ酸配列は、ＳｅｒＰｒｏＧｌｙＬｙｓ−ＡｌａＰｒｏＴｈｒ（配列番号１）であり、ＳｅｒＰｒｏＧｌｙＬｙｓ（配列番号２）は、抗体の重鎖の通常のカルボキシ末端であり、そしてＡｌａＰｒｏＴｈｒは、成熟ＩＬ−２のＮ末端配列である。融合連結領域における、融合タンパク質の薬物動態に関する変化の効果を決定するために、以下に記載するように変異誘導によって残基の置換または欠失を行った。
免疫サイトカインの発現ベクターは、Gillies at al.,（1998）J.Immunol. 160: 6195-6203に記載されている。重鎖をコードしているヒトガンマ−１遺伝子において、サイレント変異（ＴＣＣからＴＣＡへ）を導入することによって、翻訳停止コドンから２８０ｂｐ上流にあるＸｍａＩ制限部位を破壊した。もう１つのサイレント変異（ＴＣＴからＴＣＣへ）を、重鎖のＣ末端リジンから３残基上流のＳｅｒコドンに導入し、新たなＸｍａＩ部位配列を含んでいるTCC CCG GGT AAA（配列番号３）を作製した[Lo at al.,（1998）Protein Engineering 11: 495-500]。ＩＬ−２ｃＤＮＡを化学合成によって構築し、そしてそれが新しく、独自のＰｖｕＩＩ制限部位を含むようにした[Gillies at al,（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1428-1432]。前記ＸｍａＩ部位およびＰｖｕＩＩ部位は、ともに発現ベクターが独自のものであり、そしてそれらは、ＣＨ３およびＩＬ−２ＤＮＡの連結点にあるリジンコドンに対する変異誘発を容易にするものであった。
【００３７】
Ｌｙｓコドンの置換または欠失は、免疫サイトカインの発現ベクターのＸｍａＩ−ＰｖｕＩＩ断片を、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチド二量体と置換することによって行った。この場合、重鎖および軽鎖の可変領域は、ヒト化ＫＳ抗体由来であり、該抗体はＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）と呼ばれるヒト抗原を認識するものであった。本発明において用いたオリゴヌクレオチド二量体の配列は下記に示すが、太字のコドンが所望の変異をコードし、斜字体の配列である
【化１】
が、ＸｍａＩ部位の粘着末端およびＰｖｕＩＩ部位の平滑末端をそれぞれ表す。５’−水酸基末端を有する前記オリゴヌクレオチド二量体を、ＸｍａＩ−ＰｖｕＩＩ消化発現ベクターへの連結に用いた。５’−水酸基末端を有する前記オリゴヌクレオチドの使用によって、該オリゴヌクレオチド二量体の自己連結が排除された。
【００３８】
１．）ＬｙｓのＡｌａへの置換
【化２】
【００３９】
２．）ＬｙｓのＡｒｇへの置換
【化３】
ＮａｒＩ制限部位（ＧＧＣＧＣＣ）もサイレント変異によって導入し、組み換えクローンのスクリーニングを容易にした。
【００４０】
３．）Ｌｙｓの欠失
【化４】
【００４１】
４．）ＬｙｓのＧｌｙへの置換
【化５】
ＡｐａＩ制限部位（ＧＧＧＣＣＣ）もサイレント変異によって導入し、組み換えクローンのスクリーニングを容易にした。
【００４２】
５．）ＬｙｓのＬｅｕへの置換
【化６】
ＮａｒＩ制限部位（ＧＧＣＧＣＣ）もサイレント変異によって導入し、組み換えクローンのスクリーニングを容易にした。
【００４３】
６．）ＬｙｓのＡｌａＡｌａＡｌａへの置換
【化７】
【００４４】
７．）ＬｙｓのＣｙｓへの置換
【化８】
ＦｓｐＩ制限部位（ＴＧＣＧＣＡ）もサイレント変異によって導入し、組み換えクローンのスクリーニングを容易にした。
【００４５】
８．）ＬｙｓのＡｓｐへの置換
【化９】
Ｌｙｓコドンの種々の置換または欠失を含んでいる組み換え遺伝子構造体は、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【００４６】
例２．融合連結点においてさらなるアミノ酸残基をコードする抗体−ＩＬ−２ 遺伝子の構築
融合タンパク質中のドメインを、グリシンおよびセリンなどのアミノ酸残基を含有するフレキシブルなリンカーによって分離することは、当技術分野において普通に行われることである。ＣＨ３およびＩＬ−２のスペーシングの重要性について、以下の変異誘発実験によって調べた。異なる数のアミノ酸残基をコードしている平滑末端を有するオリゴヌクレオチド二量体を、連結によってｈｕＫＳ−ＩＬ−２発現ベクターのＳｍａＩエンドヌクレアーゼ制限部位（上記ＸｍａＩと同一の部位）に挿入した；そして、ＤＮＡシークエンシングによって、挿入が正確に配置されたことを確認した。上記において議論したように、５’−水酸基末端を有するオリゴヌクレオチド二量体を使用することによって、自己連結を排除した。
【００４７】
９．）リンカー連結を有するＬｙｓのＣｙｓへの置換
連結によって、ｈｕＫＳ−ＩＬ−２発現ベクターのＳｍａＩエンドヌクレアーゼ制限部位に、以下のリンカー（オリゴヌクレオチド二量体）を挿入した。配列ＧＣＡＴＧＣはＳｐｈＩ制限部位をコードし、それによってリンカーの挿入を含んでいる組み換え体のスクリーニングを容易にした。
5' GGCATGC GG 3'
3' C CGT ACG CC 5'
ＳｍａＩ部位（CCCGGG）へのリンカーの連結後に、融合連結部位の配列は
C CCG GCA TGC GGG GGT AAA（配列番号２０）（リンカーの配列に下線を付した）
Pro Ala Cys Gly Gly Lys（配列番号２１）
になった。
したがって、リンカーによって元のＬｙｓ残基の位置にＣｙｓ残基が挿入され、鎖間のジスルフィド結合が形成され得るようになった。元のＬｙｓ残基は、３アミノ酸残基分（ＡｌａＣｙｓＧｌｙ）押し戻された。
【００４８】
１０．）６アミノ酸残基をコードするリンカー
ｈｕＫＳ−ＩＬ−２発現ベクターのＳｍａＩエンドヌクレアーゼ制限部位に、下記のリンカー（オリゴヌクレオチド二量体）を連結によって挿入した。配列GGATCCは、ＢａｍＨＩ制限部位をコードするものであり、それによってリンカーの挿入を含んでいる組み換え体のスクリーニングを容易にした。
5' G GGT TCA GGA TCC GGA GG 3'（配列番号２２）
3' C CCA AGT CCT AGG CCT CC 5'（配列番号２３）
ＳｍａＩ部位へのリンカーの連結後に、融合連結部位の配列は
ProGlySerGlySerGlyGlyGlyLys（配列番号２４）
になった。挿入された６アミノ酸残基に下線を付した。
【００４９】
１１．）１１個のアミノ酸残基をコードするリンカー
下記のリンカー（オリゴヌクレオチド二量体）をｈｕＫＳ−ＩＬ−２発現ベクターのＳｍａＩエンドヌクレアーゼ制限部位に、連結によって挿入した。配列GGATCCは、ＢａｍＨＩ制限部位をコードし、それによってリンカーの挿入を含んでいる組み換え体のスクリーニングを容易にした。
5' G GGT TCA GGC TCT GGA TCA GGG TCC GGA TCC GG 3'（配列番号２５）
3' C CCA AGT CCG AGA CCT AGT CCC AGG CCT AGG CC 5'（配列番号２６）
ＳｍａＩ部位へのリンカーの連結後に、融合連結部位の配列は
ProGlySerGlySerGlySerGlySerGlySerGlyGlyLys（配列番号２７）
になった。挿入された１１個のアミノ酸残基に下線を付した。
【００５０】
例３．融合連結点におけるＰｒｏコドンの置換による、抗体−ＩＬ−２遺伝子の構築
ＣＨ３のカルボキシ末端に存する配列ＰｒｏＧｌｙＬｙｓ中のプロリンを、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＧｌｙ、および他のアミノ酸に変異せしめた。これは、２５塩基対であるＫＳ−ＩＬ−２発現ベクターのＳａｐＩ−ＳｍａＩ断片を、所望の変化をコードするオリゴヌクレオチド二量体によって置換して行った。下記オリゴヌクレオチド二量体は、それぞれＳａｐＩ粘着末端（３塩基のオーバーハング）および平滑末端（制限断片のＳｍａＩへの連結のため）を有する。Ｐｒｏコドンにおける置換を太字で表した。これらの置換が融合タンパク質の薬物動態に対して有意な影響を及ぼさなかったことから、Ｐｒｏ残基は、融合タンパク質の薬物動態に対して有意な影響を及ぼさないことが示された。
【００５１】
１２.）ＰｒｏのＡｌａへの置換
【化１０】
【００５２】
１３.）ＰｒｏのＬｅｕへの置換
【化１１】
【００５３】
１２．）ＰｒｏのＧｌｙへの置換
【化１２】
【００５４】
例４． ｈｕ１４．１８−（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２ＤＮＡ の構築
ＬｙｓのＡｌａへの置換の抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態に対する影響が、ｈｕＫＳ抗体に限定されないことを示すために、本発明者らは異なる抗体であるヒト化１４．１８（ｈｕ１４．１８）を選択したが、これは多くのヒト腫瘍細胞表面に過剰発現したガングリオシドであるＧＤ２を認識するものであった。ｈｕ１４．１８−（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２の発現ベクターは、上記のように構築した。
【００５５】
例５． ｈｕＫＳ−（Ｌｙｓ欠失）−ＴＮＦαＤＮＡ
Ｌｙｓ残基の抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態に対する効果が、他のサイトカインにも適用し得ることを示すために、本発明者らは異なるサイトカインであるＴＮＦαを選択した。ＴＮＦαの完全なｃＤＮＡ配列は、Nedwin at al.のNucleic Acids Res.（1985）13: 6361-6373において報告され、そして抗体−ＴＮＦαの発現も、Gillies at al. の Bioconjugate Chem.（1993）4: 230-235に記載されている。抗体−ＴＮＦαの融合連結部は、ＳｅｒＰｒｏＧｌｙＬｙｓ−ＶａｌＡｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒ（配列番号３４）の配列を有し、ここでＶａｌは、成熟ＴＮＦαのＮ末端残基である。ｈｕＫＳ−ＴＮＦαと比較するために、ｈｕＫＳ−（Ｌｙｓ欠失）−ＴＮＦαをコードするＤＮＡをオーバーラッッピングＰＣＲ法[Daugherty at al.,（1991）Nucleic Acids Res. 19: 2471-2476] によって、Ｌｙｓ残基の欠失をコードする変異プライマーを用いて構築した。したがって、結果物である、ｈｕＫＳ−（Ｌｙｓ欠失）−ＴＮＦαの発現ベクターは、融合連結部においてペプチド配列ＳｅｒＰｒｏＧｌｙ−ＶａｌＡｒｇＳｅｒＳｅｒＳｅｒ（配列番号３５）をコードする。本新規発明によるこの融合タンパク質の他の変更には、連結領域の総電荷をさらに減じるために、ＴＮＦのアミノ末端配列におけるＡｒｇ残基の除去を含み得る。
【００５６】
例６．ｈｕＫＳ−（ＥＵ）−（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２ＤＮＡの構築
上記例において述べた抗体−サイトカイン融合タンパク質は全て、ミエローマＨ鎖によって表されるヒトＩｇＧ１のあるアロタイプであるＫＯＬをベースにした。ＬｙｓのＡｌａへの置換の抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態における効果がＫＯＬに限定されるものではないことを示すために、本発明者らは、ミエローマＨ鎖によって表される異なるＩｇＧｌのアロタイプであるＥＵを選択した。ＥＵアロタイプは、ＫＯＬアロタイプとは定常領域の３アミノ酸残基が異なる。ＥＵアロタイプはＣＨ１末端部にＬｙｓ−２２９を含み、そしてＡｓｐ３５６およびＬｅｕ−３５８をＣＨ３開始部に含む。ＫＯＬアロタイプは、Ａｒｇ−２２９、Ｇｌｕ−３５６およびＭｅｔ−３５８を、対応する位置に含む。ＥＵアロタイプをコードするＤＮＡは、ＫＯＬのＤＮＡの変異によって、オーバーラッピングＰＣＲ法を用いて作製した。結果物であるＥＵのＤＮＡを用い、対応するＫＯＬのＤＮＡ断片の置換によって、ｈｕＫＳ−（ＥＵ）−（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２を産生する発現ベクターを作製した。
【００５７】
例７．細胞のトランスフェクションおよびタンパク質の発現
一時的なトランスフェクションのために、Lipofectamine Plus（Life Technologies、Gaithersburg、MD）を用い、供給者のプロトコールに従い、リポフェクションによってBaby Hamster Kidney（ＢＨＫ）細胞にプラスミドを導入した。
安定的にトランスフェクトされたクローンを得るため、プラスミドＤＮＡをマウスミエローマＮＳ／０細胞に、エレクトロポレーションによって導入した。ＮＳ／０細胞を、ウシ胎児血清１０％、２ｍＭグルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを加えたDulbeccoの改変Eagle's培地によって培養した。約５×１０６個の細胞をＰＢＳによって１回洗浄し、０．５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。次に、直線化したプラスミドＤＮＡ１０μｇを細胞とともに、Gene Pulser Cuvette（電極間隔０．４ｃｍ、ＢｉｏＲａｄ）内、氷上にて１０分間インキュベートした。０．２５Ｖおよび５００μＦの条件下、Gene Pulser（BioRad、Hercules、CA）を用いてエレクトロポレーションを行った。細胞を氷上にて１０分間回復させた後、それを増殖培地に再懸濁し、そして２枚の９６穴プレートに植え付けた。トランスフェクションの２日後にメトトレキセート（ＭＴＸ）１００ｎＭを導入し、その存在下における増殖によって、安定的にトランスフェクトされたクローンを選択した。細胞に３日に１回、２回から３回以上、栄養を与え、そしてＭＴＸ耐性クローンが２〜３週間のうちに現れた。クローンからの上清を、抗ＦｃＥＬＩＳＡによってアッセイし、産生能が高いものを検出した。高産生クローンを単離し、そしてＭＴＸを１００ｎＭ含有する増殖培地において増殖させた。
【００５８】
ゲル電気泳動によるルーチンの特性評価のため、調整した培地中の抗体−サイトカイン融合タンパク質をProtein A Sepharose（Repligen、Cambridge、MA）において捕捉し、そして次に、２−メルカプトエタノールを含むかまたは含まないタンパク質サンプル緩衝液中にてボイルすることによって溶出せしめた。ＳＤＳゲルによる電気泳動の後、タンパク質のバンドをクーマシー染色によって可視化した。抗体の重鎖−ＩＬ−２および軽鎖は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、それぞれ６７ｋＤおよび２８ｋＤの分子量を有することが明らかになった。
精製のため、Protein A Sepharoseに結合した融合タンパク質を、リン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ３、および１５０ｍＭのＮａＣｌ）中にて溶出せしめた。そして、溶出液は、０．１ＮのＮａＯＨによって直ちに中和した。
【００５９】
例８．ＥＬＩＳＡ法
ＭＴＸ耐性クローンおよび他の試験サンプルの、上清中のタンパク質産物の濃度を決定するためにＥＬＩＳＡを用いた。抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡは、ヤギの抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖の両方に抗する）を用いる捕捉ステップおよびＦｃ断片特異的である、ヤギの抗ヒトＩｇＧ 西洋ワサビペルオキシダーゼ結合性 Ｆ（ａｂ’）２断片を用いる検出ステップからなる。したがって、抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡによって、ヒトＩｇＧが、抗体自体としてまたはサイトカイン融合タンパク質として定量される。無処置の抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の濃度を決定するために、ＩＬ−２検出ＥＬＩＳＡを用いた。ヤギの抗ヒトＩｇＧ（重鎖および軽鎖の両方に抗する）を用いる同一の捕捉ステップからなるが、検出ステップにはＩＬ−２に対して方向付けられた検出抗体を用いる。いくつかの実験においては、捕捉抗体の代わりにＥＰＣＡＭを用いてＫＳ−ＩＬ−２融合タンパク質を検出したが、それはＫＳ抗体がＥＰＣＡＭを認識するからである。いくつかの実験においては、市販のヒトＩＬ−２ＥＬＩＳＡ検出キット（R & D Systems）を用いた。ＩＬ−２検出抗体を含む異なるＥＬＩＳＡ法の全てによって、同様な結果が得られた。しかし、図１Ａおよび図１Ｂの対比から示されるように、薬物動態の後半の時点においては、ヒトＦｃ免疫反応物質と比較すると、ＩＬ２免疫反応物質の減少が漸増している。この影響は、最も好ましくない薬物動態を有する融合タンパク質において最も顕著である。
抗ｈｕＦｃＥＬＩＳＡについて、下記に詳細に記載した。
【００６０】
Ａ．コーティングプレート
ＥＬＩＳＡプレートは、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬのAffiniPureヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson Immuno Research Laboratories、West Grove、PA）によって、そして９６穴プレートに１００μｌ／穴（Nunc-Immuno plate Maxisorp）でコートした。コートしたプレートは、蓋をして、４℃で一晩インキュベートした。続いて、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０）のＰＢＳ溶液によって４回洗浄し、そして１％ＢＳＡ／１％ヤギ血清のＰＢＳ溶液によって、２００μｌ／穴の割合でブロッキングした。前記ブロッキング緩衝液とともに３７℃において２時間インキュベートした後、プレートを０．０５％ＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液によって４回洗浄し、ペーパータオル上にてたたきながら乾燥した。
【００６１】
Ｂ．試験サンプルおよび２次抗体とのインキュベーション
試験サンプルを、１％ＢＳＡ／１％ヒツジ血清／０．０５％ＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液を含有するサンプル緩衝液中において適切な濃度に希釈した。濃度がわかっているキメラ抗体（ヒトＦｃとの）によって、標準曲線を得た。標準曲線を得るに際しては、１２５ｎｇ／ｍｌ〜３．９ｎｇ／ｍｌの範囲の標準曲線が得られるように、サンプル緩衝液を連続的に希釈した。希釈したサンプルおよび標準液を１００μｌ／穴の割合でプレートに添加し、そしてプレートを３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを８回、０．０５％ＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液によって洗浄した。次に、それぞれの穴に、２次抗体である、サンプル緩衝液中にて約１：１２０，０００に希釈した、Ｆｃ断片に特異的なヤギ抗ヒトＩｇＧの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合AffiniPure F（ａｂ’）２断片（Jackson Immuno Research）を１００μｌ添加した。２次抗体の正確な希釈率は、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧのそれぞれのロットに対して決定しなければならない。３７℃における２時間インキュベーションの後、プレートを０．０５％ＴｗｅｅｎのＰＢＳ溶液にて８回洗浄した。
【００６２】
Ｃ．発色
１００μｌ／穴の割合で基質溶液を添加した。基質溶液は、ＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩、１タブレット）３０ｍｇを、０．０２５Ｍクエン酸／０．０５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ５であり、直前に添加したＨ２Ｏ２を含有する緩衝液に溶解せしめて調製した。暗黒の室温下にて、３０分間発色させた。発色時間は、コートしたプレート、２次抗体などのロット間の変動に応じて変化させた。標準曲線における色の発色を観察して反応の停止時期を決定した。反応の停止は、４Ｎ Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／穴添加することによって行った。プレートは、４９０および６５０ｎｍの両方にセットし、６５０ｎｍにおけるバックグラウンドＯＤから４９０ｎｍにおけるＯＤを減じるようにプログラムしたプレートリーダーによって読み取った。
【００６３】
例９．融合連結部に変化を有する抗体−サイトカイン融合タンパク質の薬物動態挙動
融合タンパク質の薬物動態挙動の試験を、Ｂａｌｂ／ｃマウスへの静脈内注射の後に行った。マウスから眼窩後方出血（retro-orbital bleeding）によって採血し、そしてエッペンドルフ製微小遠心管内において、４℃にて保存した。場合によって、２種の異なるＥＬＩＳＡ法を用いて、種々の時点において血中に残存しているヒト抗体の量および第二の、融合非−Ｉｇタンパク質の量の両方を測定した。これとは別に、非Ｉｇ部分の存在を、薬物動態の時点におけるウェスタンブロット分析によって推測した。
【００６４】
前記例において記載した手法を用いて、ＫＳ（ガンマ１）−ＩＬ−２融合変異タンパク質をマウスに注射し、そして血清中半減期に対する効果を決定した。いくつかの結果を図１および図２に示す。さらに、抗体重鎖のＣ末端リジン欠失の効果を、抗体が異なる結合特異性を有するＩｇＧ（ガンマ１）−ＩＬ−２融合体において調べた。１４．１８（Ｌｙｓ→Ａｌａ）−ＩＬ−２の薬物動態特性は、１４．１８−ＩＬ−２より優れ、その改善の程度は、ＫＳ（Ｌｙｓ→Ａｌａ）−ＩＬ−２をＫＳ−ＩＬ−２と比較した場合の改善度合いと同程度であった。
抗体−ＩＬ−２融合体において、薬物動態特性に対する、重鎖Ｃ末端リジンに影響を及ぼす変異の効果の序列は（最高から最低の順で）：Ｌｙｓ→Ｌｅｕ〜Ｌｙｓ→Ａｌａ〜Ｌｙｓ→Ａｌａ３＞Ｌｙｓ→（欠失）＞Ｌｙｓ→Ａｓｐ〜Ｌｙｓ→Ｇｌｙ＞Ｌｙｓ→（無変化）〜Ｌｙｓ→Ｃｙｓ＞Ｌｙｓ→Ａｒｇであった。
【００６５】
ＫＳ（Ｌｙｓ→除去）−ＴＮＦアルファの薬物動態特性は、ＫＳ−ＴＮＦαに比して有意に改善されていた（図３）。ＫＳ−ＴＮＦアルファ融合タンパク質の薬物動態学的プロファイルは、ヒト抗体レベルをＦｃＥＬＩＳＡによって測定した場合、最初の３０分以内に、検出されるタンパク質のレベルが急激に減少し、続いてヒトＦｃ反応物質のレベルが緩やかに上昇するという点で通常とは異なっていた。この効果の再現性は高かった。
ウェスタンブロッティングによって薬物動態サンプルを分析した場合、ヒトＦｃ交差反応性物質は、無損傷抗体の形態であることが見出された；ＴＮＦ部分は切断され、失われていた。しかし、Ｃ末端リジンを欠失したＫＳ−ＴＮＦアルファ融合タンパク質の同様な分析によって、このタンパク質は、優占的に無損傷形態で、ＴＮＦを未だ有して存在することが示唆された。
【００６６】
さらに、成熟ＴＮＦアルファ配列の最初の８個のアミノ酸を欠失しているＫＳ−ＴＮＦα融合タンパク質を発現させた。欠失型ＫＳ−ＴＮＦアルファ融合タンパク質の薬物動態特性は、成熟ＴＮＦ配列の全てを有する対応するタンパク質より優れていた。これは、恐らく、連結領域の疎水性を増大せしめる、成熟ＴＮＦの＋２位に存する荷電Ａｒｇ残基を除去したことによるものである。
ＫＯＬからＥＵへの、ＫＳ（Ｌｙｓ→Ａｌａ）−ＩＬ−２およびＫＳ−ＩＬ−２タンパク質の重鎖定常領域の変化は、いずれのタンパク質の薬物動態特性に対しても効果がなかった。
これらの結果は、総じて、連結部の変異によって、Ｉｇ融合タンパク質の薬物動態特性は有意に改善されることを示唆している。該効果は多岐にわたる抗体、およびＩｇ部分に融合された、多岐にわたる非Ｉｇタンパク質において認められた。
【００６７】
例１０．融合連結点における変異とＩｇタイプのガンマ１からガンマ４への変換とを組み合わせることは、ＦｃＲｐ機能とは独立して血清中半減期の相乗的増大につながる
ヒトガンマ４Ｆｃ領域のＦｃ受容体への結合は弱い。その結果、ガンマ４Ｆｃ領域を含む融合タンパク質は、ガンマ１鎖を有する融合タンパク質と比べて、一般に優れた薬物動態特性を有する。Ｆｃ受容体に対する効果、ＦｃＲｐ相互作用、またはこれらの両方を介して、連結部における変異が、薬物動態に影響を及ぼすのかを明らかにするために、連結部に変異を有するかまたは有しない、ガンマ１含有融合タンパク質およびガンマ４含有融合タンパク質の薬物動態特性を、ＦｃＲｐが正常であるかまたはそれが欠損しているマウスにおいて調べた。図２に、これらの薬物動態実験の結果を示した。
図２は、ＫＳ（ガンマ１）−ＩＬ−２融合タンパク質、ＫＳ（ガンマ４）−ＩＬ−２融合タンパク質、ＫＳ（ガンマ１）（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２融合タンパク質、およびＫＳ（ガンマ４）（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態挙動を示している。正常のマウスおよびベータ２マイクログロブリン欠損マウスによって調べた。
【００６８】
これらのデータによって、正常のマウスにおいては、ＩｇＧ−ガンマ１抗体−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態は、抗体部分のＣ末端にＬｙｓのＡｌａへの変異を導入することによって改善されることが示唆された。同様に、ＩｇＧ−ガンマ４ 抗体ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態は、ＬｙｓのＡｌａへの変異を導入することによって改善された。これらのデータは、連結部の変異によって、Ｆｃ受容体への結合を低減することによって既に薬物動態を改善せしめた、融合タンパク質の薬物動態が改善されることを示唆している。
図２は、ＦｃＲｐの必須のサブユニットであるベータ２マイクログロブリンタンパク質（Junghans and Anderson, Proc. Nat Acad. Sci.（1996）93: 5512-5516）を欠損しているマウスに、同じタンパク質を注射した場合の、該タンパク質の薬物動態的特性も示している。したがって、これらの変異マウスは、ＦｃＲｐ活性を欠損している。その結果、該変異マウスにおける抗体の異化は、正常のマウスより、約１０倍速かった。
【００６９】
図２のデータによって、ＫＳ（ガンマ１）抗体、ＫＳ（ガンマ１）−ＩＬ−２融合タンパク質、ＫＳ（ガンマ４）−ＩＬ−２融合タンパク質、ＫＳ（ガンマ１）（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２融合タンパク質、およびＫＳ（ガンマ４）（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２融合タンパク質は、いずれもベータ２マイクログロブリン変異マウスにおいて、野生型マウスより速く異化されることが示唆された。しかし、血清中半減期の相対的序列は、いずれの系統のマウスにおいても同様であった：非融合抗体が最も優れた薬物動態を有し、ＫＳ（ガンマ４）（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２融合タンパク質、ＫＳ（ガンマ１）（Ｌｙｓ to Ａｌａ）−ＩＬ−２融合タンパク質、ＫＳ（ガンマ４）−ＩＬ−２融合タンパク質がこれに次ぎ、ＫＳ（ガンマ１）−ＩＬ−２融合タンパク質の薬物動態特性が最も劣っていた。連結部変異が、融合タンパク質のＦｃＲｐとの相互作用を変化させることによってのみ効果を有するものであれば、ＦｃＲｐ機能非存在下においては、該連結部変異は薬物動態に対して影響を及ぼさなかったはずである。
【００７０】
例１１．無処置抗体の連結領域の変異は、血清中半減期に対する効果を有しない
無処置の、非融合ＫＳ抗体の重鎖をコードしている遺伝子における変異によって、Ｃ末端リジンをアラニンに変換する操作を行った。野生型および変異型ＫＳを発現させ、さらに上記の方法によって精製し、そして薬物動態特性を比較した。野生型および変異型抗体の薬物動態挙動は、分別することができないことが見出された。
【００７１】
例１２．融合連結部における変異を有するかまたは有しない抗体融合タンパク質によるＦｃ受容体への結合
標準的な手法を用いて、ＫＳ−ＩＬ−２およびＫＳ（Ｋ−Ａ）−ＩＬ−２のＦｃ受容体への結合を調べた。変異による効果は見出せなかった。融合タンパク質を発現させ、さらに上記の方法によって精製し、そしてＦｃ受容体を発現する固定したＪ７７４細胞へのそれらの結合能を調べた。結果を図４に示す。
【００７２】
例１３．連結部変異を含む抗体−サイトカイン融合タンパク質による、哺乳動物における大腸癌の処置
連結部変異を有するサイトカイン−抗体融合タンパク質が、哺乳動物における大腸癌腫の処置において有利な効果を有するか否かを試験するために、以下の実験を行った。ＣＴ２６は、Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来の大腸癌腫セルラインである。標準的な遺伝工学的手法によって、該セルラインを、ＫＳ抗体が認識する抗原であるヒト真皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現するように操作した；前記細胞はＣＴ２６／ＥｐＣＡＭ細胞（Gillies at al. Journal of Immunology（1998）160: 6195-6203）と称せられている。
Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、２×１０６個のＣＴ２６／ＥｐＣＡＭ細胞を皮下接種した。腫瘍の体積が、約５０〜２００立方ミリメートルに達したとき、マウスをランダムに７頭ずつの３群に分けて、その後の調査に供した。０日目から、ＰＢＳ、ＩｇＧ１重鎖（ＫＳ−ＩＬ２ガンマ１）を有する約１０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２、またはＩｇＧl 重鎖ならびに上記例に記載したＬｙｓの Ａｌａへの変異（ＫＳ−ＩＬ２ガンマ１[Ｌｙｓ to Ａｌａ]）を有する約１０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２で、腫瘍担持マウスを処理した。マウスへの処理は、静脈内投与によって、日に１回ずつ、５日間にわたって行った。腫瘍の大きさは、ノギスによって測定した。
【００７３】
このような実験の１つの結果を図５に示す。この実験において、ＫＳ−ＩＬ２ガンマ１によって、全てではないが、多くの腫瘍の大きさを有意に減少した。７頭のＫＳ−ＩＬ２ガンマ１処理個体群のうち６頭において、２１日目には、腫瘍はまだ測定可能な大きさであった。しかし、ＫＳ−ＩＬ２ガンマ１（Ｌｙｓ to Ａｌａ）処理個体群においては、腫瘍は収縮し、７頭全ての個体において、２１日目までに腫瘍は測定不能になり、そして１６日目までに、測定可能な個体は７頭のマウス中僅か２頭になった。図５中、黒ダイヤは、コントロールとして０、１、２、３、および４日目にＰＢＳを注射したマウスの平均腫瘍サイズを示す。黒丸は、１０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２ガンマ１で処置したマウスの平均腫瘍サイズを示す。静脈注射を行った。ｘ軸は、最初の注射からの経過日数を示す；ｙ軸は、平均腫瘍サイズを、立方ミリリットルによって示す。
【００７４】
例１４．連結部変異を含有する抗体−サイトカイン融合タンパク質の処置による、哺乳類における転移の阻害
抗体−サイトカイン融合タンパク質が、腫瘍細胞の転移性増殖を阻害できるか否かを試験するために、以下の実験を行った。ルイス肺癌腫（ＬＬＣ）は、Ｃ５７／Ｂ１６マウス由来の肺癌腫セルラインである。標準的な遺伝工学的手法によって、該セルラインを、ＫＳ抗体が認識する抗原であるヒト上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を発現するように改変した；前記細胞はＬＬＣ／ＥｐＣＡＭ細胞と称せられている。
Ｃ５７／Ｂ１６ マウスに、１×１０６個のＬＬＣ／ＥｐＣＡＭ細胞を静脈内注射した。５日後に、マウスをランダムに６頭ずつの３群に分け、ＰＢＳ、約２０マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２、または約２０マイクログラムのＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２（Ｉｇ部分のＣ末端にＬｙｓの Ａｌａへの変異を有するＫＳ−ＩＬ２）のいずれかで処置した。２４日後に転移を定量した。下表に示すように、ＰＢＳ処置群は、肺に多数の転移を有していた。ＫＳ−γ１−ＩＬ２処置個体群においては、転移数は有意に少なかった。しかし、ＫＳ−γｌ−Ａｌａ−ＩＬ２処置個体群における転移は、ＫＳ−γ１−ＩＬ２処理個体群よりはるかに少数であり、そして一個体においては、転移は全く検出されなかった。
【００７５】
【表１】
総合すると、例１３および１４は、抗体−サイトカイン融合タンパク質によって、原発の部位における腫瘍細胞の増殖のみならず、転移の定着も阻害できることを示している。さらに、これらの結果から、抗体−サイトカイン融合タンパク質によって、大腸癌および肺癌などの種々の異なるタイプの腫瘍に起因する疾患を阻害することもできる。しかも、リンカー領域に少なくとも１つのアミノ酸変化を有する本発明による抗体−サイトカイン融合タンパク質は、転移および腫瘍の増殖を、リンカー領域にアミノ酸変化を有しない抗体−サイトカイン融合タンパク質より効果的に阻害する。
【００７６】
例１５．連結部変異を有する抗体融合タンパク質の、プロテアーゼ耐性のアッセイ
連結部変異を有する抗体−サイトカイン融合タンパク質が、プロテアーゼによる消化に対して、より感受性が高いか低いかを明確にするために、精製したＫＳ−ＩＬ２およびＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を、種々のプロテアーゼによって種々の回数にわたって処理し、結果物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
１つの実験においては、４マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２およびＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を０．１ｍＵまたは０．４ｍＵのCathepsin D（Enzyme Systems、Livermore、California）によって、３７℃において約１６時間にわたり処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。緩衝液の条件は、製造者の指示によるものを用いた。０．４ｍＵのCathepsin DによってＫＳ−ＩＬ２を処理した場合、約５０％のＫＳ−ＩＬ２重鎖が、種々のより小さい分子量の形態に変換された。優占的な消化産物は、ＫＳ−ＩＬ２重鎖より僅かに小さい分子量を有していたが、ＫＳ重鎖よりはるかに大きかった。この結果から、Cathepsin Dによる切断の大部分は、重鎖−ＩＬ２連結部位には起こらなかったことが示唆された。
【００７７】
対照的に、ＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を、０．４ｍＵのCathepsin D とともに同一の条件でインキュベーションした場合には、Cathepsin Dによる切断程度ははるかに小さく、そしてＫＳ−ＩＬ２の主たる分解産物の分子量のバンドは、本質的に検出不可能であった。
第二の実験においては、４マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２およびＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を２５ｍＵまたは５０ｍＵのCathepsin L（Enzyme Systems、Livermore、California） によって、３７℃において約１６時間にわたり処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。緩衝液の条件は、製造者の指示によるものを用いた。ＫＳ−ＩＬ２を５０ｍＵのCathepsin Lで処理した場合、大部分のＫＳ−ＩＬ２重鎖は、種々のより小さい分子量の形態に変換された。優占的な消化産物は、ＫＳ重鎖とほぼ同一の分子量を有していた。この結果から、Cathepsin Ｌによる切断の大部分は、重鎖−ＩＬ２連結部近傍または該部位に起こったことが示唆された。
対照的に、ＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を、５０ｍＵのCathepsin Lとともに同一の条件でインキュベーションした場合には、Cathepsin Ｌによる切断程度ははるかに小さく、そしてＫＳ−ＩＬ２の主たる分解産物の分子量のバンドは、依然として、観察された分子量種の主たるものであった。
【００７８】
第三の実験においては、４マイクログラムのＫＳ−ＩＬ２およびＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を０．０４ｍＵ、０．１ｍＵまたは０．２ｍＵのプラスミン（Sigma,
St. Louis、Minnesota）によって、３７℃において約１６時間にわたり処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。緩衝液の条件は、製造者の指示によるものを用いた。０．０４ｍＵのプラスミンによってＫＳ−ＩＬ２を処理した場合、約３／４のＫＳ−ＩＬ２重鎖が、より小さい分子量の形態に変換され、その見かけの分子量はＫＳ重鎖の分子量より約３０個のアミノ酸の分大きかった。０．２ｍＵのプラスミンによってＫＳ−ＩＬ２を処理した場合、本質的に全てのＫＳ−ＩＬ2 重鎖は、見かけの分子量がＫＳ重鎖の分子量より約３０個のアミノ酸の分大きい、分子量がより小さい形態に変換された。これらの結果から、プラスミンによるＫＳ−ＩＬ２の切断の大部分は、重鎖−ＩＬ２連結部位の近傍に生じ、重鎖−ＩＬ２連結部位には生じなかったことが示唆される。
【００７９】
対照的に、ＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を、０．０４ｍＵのプラスミンとともに同一の条件でインキュベーションした場合には、プラスミンによる切断はほとんど検出不能であった。ＫＳ−Ａｌａ−ＩＬ２を０．２ｍＵのプラスミンとともにインキュベーションした場合には、いくつかの非切断産物が検出された。さらに、ＫＳ−ＩＬ２重鎖をプラスミンによって切断した場合には、ＫＳ−ＩＬ２重鎖より約９０アミノ酸の分大きい種が、有意な程度に蓄積した；プラスミンによるＫＳ−ＩＬ２の消化においては、この＋９０種は、恐らく、低分子量の＋３０種に迅速に切断され、その結果蓄積することはなかった。しかし、ＬｙｓのＡｌａへの変異によって、プラスミン存在下において、無傷のＫＳ−ＩＬ２は安定化した。それぞれの場合において、抗体の軽鎖は、用いられた条件下において切断されなかった。
総合すると、これらの結果から、ＬｙｓのＡｌａへの変異によって、プロテアーゼによる切断に対する一般的な耐性が生じ、変異部位に起こるものではない切断に対する耐性も生じた。如何なる特定の理論に束縛されることも望まないが、ＬｙｓのＡｌａへの変異によって、ＫＳのＩＬ−２部分のプロテアーゼに対する耐性は、より大きくなるのかもしれない。プロテアーゼは、抗体融合タンパク質の薬物動態において、重要な役割を果たすかもしれない。例えば、抗体融合タンパク質が、Ｆｃ受容体を有している細胞に取り込まれ、初期のエンドソームに移送された場合、その抗体部分は、用いられるタンパク質分解条件に耐性を有するかもしれないが、融合のパートナー部分はより感受性が高く、その結果、抗体融合タンパク質は、部分的に、または完全に消化される可能性がある。
【００８０】
例１６．抗体融合タンパク質の変異の評価における、プロテアーゼによる消化の使用
本例は、タンパク質の薬物動態特性を改善するための一般的な方法を提供する。タンパク質の薬物動態特性を試験し、そしてそのプロテアーゼ感受性も試験する。変異体タンパク質を作製し、タンパク質分解に対するより優れた耐性のための試験を行う。次に、タンパク質分解耐性を増強したそれらの変異体について、薬物動態特性の試験を行う。薬物動態特性が改善されているタンパク質分解耐性タンパク質の割合は、変異体タンパク質全体より大きいことが見出される。薬物動態特性が改善されている変異体タンパク質の中には、Ｎ架橋性グリコシレーションの導入のような、コード配列の調査によって推測される、タンパク質の構造を大きく変化させない１種または２種以上のアミノ酸置換を有するものがある。
変異体タンパク質は、例えば発現構造体の変異誘発および個々の変異体タンパク質を発現するクローンの単離によって作製する。あらゆる変異誘発手法が用いられ、それは部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および関連する遺伝子から雑種配列を作製せしめる変異誘発手法を含む。
これらのアッセイにおいて、エンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼの使用は有用である。如何なる特定の理論に束縛されることも望まないが、ある種のタンパク質、特に腎臓による濾過作用によって除去されないタンパク質の薬物動態は、エンドサイトーシスの際に生じるタンパク質分解によって決定されると考えられる。
【００８１】
トリプシン、キモトリプシン、プラスミンなどの細胞外プロテアーゼ、他の消化プロテアーゼ、凝固因子などの他の血清プロテアーゼ、および組織特異的なプロテアーゼの使用も有用である。例えば、腫瘍特異的プロテアーゼは、変異体タンパク質の試験を行い、改善された薬物動態特性および腫瘍内の微細環境中における安定性を有するそれらの変異体タンパク質を特定する場合に用いられる。他の例においては、経口的に送達される必要があるタンパク質に関し、それらの胃腸管内に存在する酵素であるトリプシンおよびキモトリプシンなどに対する耐性についての試験が行われる。胃腸管内酵素に対する耐性が増強されたタンパク質は、薬物動態も改善され、ＡＵＣ（曲線下面積：Area Under the Curve）が大きいことなどが見出される。
例えば、抗体の部分または全体を有する融合タンパク質をコードする発現構造体を変異させる。クローンを作製し、対応するタンパク質を発現せしめ、そして個々にまたは小さいプールとして、前記タンパク質の相対的プロテアーゼ感受性に関する試験を行う。プロテアーゼ耐性が増強されている変異体抗体融合タンパク質について、次に薬物動態特性の試験を行うと、改善された薬物動態特性を有しているプロテアーゼ耐性抗体融合タンパク質は、有意な数にのぼる。改良変異体融合タンパク質をコードする核酸配をシークエンスすることによって、いくつかの改良変異体は、融合タンパク質連結部以外の部位に、増強されたタンパク質分解耐性および改善された薬物動態の表現形を生じせしめる変異を含んでいることが見出される。
【００８２】
均等物
本発明は、他の特定の形態によって、本発明の思想および特徴から乖離することなく実施され得る。したがって、前述した態様は、如何なる点においても、本明細書中に記載されている発明を説明するものであって、限定するものではないと解されるべきものである。すなわち、本発明の範囲は、付随するクレームによって示されるものであって前記記載によって示されるものではなく、また、クレームの意味の範囲および均等の範囲を逸脱しないあらゆる変形は、クレームに含まれることを意図している。
【００８３】
引用文献による導入
本明細書において開示された各特許文献および科学刊行物の全体は、本出願に引用文献として組み入れられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非Ｉｇタンパク質に、連結点を介して結合した免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖を含む抗体ベース融合タンパク質であって、該抗体ベース融合タンパク質は、前記連結点から１０個のアミノ酸より内側であって、該Ｉｇ鎖または前記非Ｉｇタンパク質にアミノ酸変化を含み、かつ、前記抗体ベース融合タンパク質は、前記アミノ酸変化を有しない対応する抗体ベース融合タンパク質より長い循環系内半減期を生体内において有する、前記抗体ベース融合タンパク質。
【請求項２】
アミノ酸変化が、抗体ベース融合タンパク質の疎水性を増大せしめる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
Ｉｇ鎖が、非Ｉｇタンパク質のＮ末端側にある、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
変化が、Ｉｇ鎖のＣ末端アミノ酸を変化せしめる、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
非Ｉｇタンパク質が、分泌タンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
非Ｉｇタンパク質が、分泌タンパク質の成熟型である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
Ｉｇ鎖がＩｇ重鎖の部分を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
Ｉｇ鎖が、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の定常領域のＣＨ２ドメインを少なくとも含む、請求項７に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項９】
Ｉｇ鎖が、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ａｓｎ２９７、およびＰｒｏ３３１からなる群から選択される１または２以上のアミノ酸における変異または欠失を有するＩｇＧ１定常領域の、少なくとも１つの部位を含む、請求項７に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｉｇ鎖が、Ｌｅｕ２８ｌ、Ｌｅｕ２８２、Ｇｌｙ２８３、Ｇｌｙ２８４、Ａｓｎ３４４、およびＰｒｏ３７８からなる群から選択される１または２以上のアミノ酸における変異または欠失を有するＩｇＧ３定常領域の、少なくとも１つの部位を含む、請求項７に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｉｇ鎖が、免疫グロブリン保護受容体への結合親和性を有する、請求項７に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１２】
Ｉｇ鎖が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択されるＦｃ受容体に対して、実質的に低減された結合親和性を有する、請求項７に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１３】
非Ｉｇタンパク質が、サイトカイン、リガンド結合タンパク質、およびタンパク質毒素からなる群から選択される、請求項７に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１４】
サイトカインが、腫瘍壊死因子、インターロイキン、およびリンホカインからなる群から選択される、請求項１３に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１５】
腫瘍壊死因子が、腫瘍壊死因子アルファである、請求項１４に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１６】
インターロイキンが、インターロイキン−２である、請求項１４に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１７】
リンホカインが、リンホトキシンまたはコロニー刺激因子である、請求項１４に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１８】
コロニー刺激因子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項１１に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１９】
リガンド結合タンパク質が、ＣＤ４、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦ受容体、およびインターロイキン受容体からなる群から選択される、請求項１３に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項２０】
非Ｉｇタンパク質に連結点を介して結合したＩｇ鎖を有する抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる方法であって、置換、除去、挿入または他の方法によって、前記連結点もしくは該連結点の近傍においてアミノ酸を変化せしめるステップを含む、前記方法。
【請求項２１】
融合タンパク質が、重鎖の部位を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
融合タンパク質が、少なくともＩｇＧ２またはＩｇＧ４定常領域のＣＨ２ドメインを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
融合タンパク質が、Ｆｃ保護受容体との相互作用に影響する変異を有する重鎖の部分を含む、請求項２０、２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｉｇ鎖と非Ｉｇタンパク質との間にリンカーを有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
変化が、１個または２個以上のアミノ酸の置換である、請求項４、５、６、または７に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
抗体ベース融合タンパク質であって、
ａ）Ｉｇ鎖を含む第一のポリペプチド、および、
ｂ）非Ｉｇタンパク質を含む第二のポリペプチド、
とを含み、前記第一のポリペプチドは、前記第二のポリペプチドに連結されて少なくとも１つの変異を有する連結領域を形成し、そして前記融合タンパク質は、前記変異を有しない連結領域を有する融合タンパク質より長い循環系内半減期を有する、前記抗体ベース融合タンパク質。
【請求項２７】
変異が、第一のポリペプチドのＣ末端部位に存在する、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
変異が、第二のポリペプチドのＮ末端部位に存在する、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
変異が、第一のポリペプチドのＣ末端部位における第一の変異および第二のポリペプチドのＮ末端部位における第二の変異を含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
Ｃ末端部位が、第一のポリペプチドのＣ末端アミノ酸を１〜１００個含む、請求項２７または２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
Ｃ末端部位が、第一のポリペプチドのＣ末端アミノ酸を１〜１０個含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
Ｎ末端部位が、第二のポリペプチドのＮ末端アミノ酸を１〜１００個含む、請求項２８または２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
Ｎ末端部位が、第二のポリペプチドのＮ末端アミノ酸を１〜１０個含む、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
Ｉｇが、ＩｇＧ１である、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
変異が、点変異、欠失、挿入および再配列からなる群から選択される、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
第一のポリペプチドのＣ末端残基が、非イオン化側鎖を有するアミノ酸に変異している
、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
Ｃ末端残基が、非リジンアミノ酸である、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
連結領域が、第一のポリペプチドのＣ末端領域および第二のポリペプチドのＮ末端領域からなり、そして変異が、前記Ｃ末端領域およびＮ末端領域の一方に存在する、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
連結領域が、スペーサーペプチドまたはリンカーペプチドを含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
変異が、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドの間のスペーサーペプチドまたはリンカーペプチドの存在からなる、請求項３９に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
変異が、ＦｃＲまたはＦｃＲｐと相互作用しない領域に存する、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
Ｉｇ部分および非Ｉｇ部分を有する抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる変異を検出するための方法であって、以下のステップ：
ａ）Ｉｇ部分と非Ｉｇ部分との間の連結を架橋せしめる領域に、変異を導入するステップ；
ｂ）変異を有する抗体ベース融合タンパク質と有しない抗体ベース融合タンパク質の血清半減期を比較するステップ；および
ｃ）前記抗体ベース融合タンパク質の血清中半減期を増加せしめる変異を選択するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法によって検出された変異を含む、抗体ベース融合タンパク質。
【請求項４４】
請求項２６に記載の抗体ベース融合タンパク質を患者に投与するステップを含む、病気を治療するための方法。
【請求項４５】
疎水性または非極性アミノ酸を、付加または置換によって前記連結部位またはその近傍に導入した、請求項１、２６、または３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
アミノ酸が、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、およびＧｌｙからなる群から選択される、請求項４５に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
アミノ酸が、Ａｌａである、請求項４８に記載の融合タンパク質。
【請求項１】
非Ｉｇタンパク質に、連結点を介して結合した免疫グロブリン（Ｉｇ）鎖を含む抗体ベース融合タンパク質であって、該抗体ベース融合タンパク質は、前記連結点から１０個のアミノ酸より内側であって、該Ｉｇ鎖または前記非Ｉｇタンパク質にアミノ酸変化を含み、かつ、前記抗体ベース融合タンパク質は、前記アミノ酸変化を有しない対応する抗体ベース融合タンパク質より長い循環系内半減期を生体内において有する、前記抗体ベース融合タンパク質。
【請求項２】
アミノ酸変化が、抗体ベース融合タンパク質の疎水性を増大せしめる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
Ｉｇ鎖が、非Ｉｇタンパク質のＮ末端側にある、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
変化が、Ｉｇ鎖のＣ末端アミノ酸を変化せしめる、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
非Ｉｇタンパク質が、分泌タンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
非Ｉｇタンパク質が、分泌タンパク質の成熟型である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
Ｉｇ鎖がＩｇ重鎖の部分を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
Ｉｇ鎖が、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の定常領域のＣＨ２ドメインを少なくとも含む、請求項７に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項９】
Ｉｇ鎖が、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ａｓｎ２９７、およびＰｒｏ３３１からなる群から選択される１または２以上のアミノ酸における変異または欠失を有するＩｇＧ１定常領域の、少なくとも１つの部位を含む、請求項７に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｉｇ鎖が、Ｌｅｕ２８ｌ、Ｌｅｕ２８２、Ｇｌｙ２８３、Ｇｌｙ２８４、Ａｓｎ３４４、およびＰｒｏ３７８からなる群から選択される１または２以上のアミノ酸における変異または欠失を有するＩｇＧ３定常領域の、少なくとも１つの部位を含む、請求項７に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｉｇ鎖が、免疫グロブリン保護受容体への結合親和性を有する、請求項７に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１２】
Ｉｇ鎖が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択されるＦｃ受容体に対して、実質的に低減された結合親和性を有する、請求項７に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１３】
非Ｉｇタンパク質が、サイトカイン、リガンド結合タンパク質、およびタンパク質毒素からなる群から選択される、請求項７に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１４】
サイトカインが、腫瘍壊死因子、インターロイキン、およびリンホカインからなる群から選択される、請求項１３に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１５】
腫瘍壊死因子が、腫瘍壊死因子アルファである、請求項１４に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１６】
インターロイキンが、インターロイキン−２である、請求項１４に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１７】
リンホカインが、リンホトキシンまたはコロニー刺激因子である、請求項１４に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１８】
コロニー刺激因子が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である、請求項１１に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項１９】
リガンド結合タンパク質が、ＣＤ４、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦ受容体、およびインターロイキン受容体からなる群から選択される、請求項１３に記載の抗体ベース融合タンパク質。
【請求項２０】
非Ｉｇタンパク質に連結点を介して結合したＩｇ鎖を有する抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる方法であって、置換、除去、挿入または他の方法によって、前記連結点もしくは該連結点の近傍においてアミノ酸を変化せしめるステップを含む、前記方法。
【請求項２１】
融合タンパク質が、重鎖の部位を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
融合タンパク質が、少なくともＩｇＧ２またはＩｇＧ４定常領域のＣＨ２ドメインを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
融合タンパク質が、Ｆｃ保護受容体との相互作用に影響する変異を有する重鎖の部分を含む、請求項２０、２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｉｇ鎖と非Ｉｇタンパク質との間にリンカーを有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
変化が、１個または２個以上のアミノ酸の置換である、請求項４、５、６、または７に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
抗体ベース融合タンパク質であって、
ａ）Ｉｇ鎖を含む第一のポリペプチド、および、
ｂ）非Ｉｇタンパク質を含む第二のポリペプチド、
とを含み、前記第一のポリペプチドは、前記第二のポリペプチドに連結されて少なくとも１つの変異を有する連結領域を形成し、そして前記融合タンパク質は、前記変異を有しない連結領域を有する融合タンパク質より長い循環系内半減期を有する、前記抗体ベース融合タンパク質。
【請求項２７】
変異が、第一のポリペプチドのＣ末端部位に存在する、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
変異が、第二のポリペプチドのＮ末端部位に存在する、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
変異が、第一のポリペプチドのＣ末端部位における第一の変異および第二のポリペプチドのＮ末端部位における第二の変異を含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
Ｃ末端部位が、第一のポリペプチドのＣ末端アミノ酸を１〜１００個含む、請求項２７または２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
Ｃ末端部位が、第一のポリペプチドのＣ末端アミノ酸を１〜１０個含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
Ｎ末端部位が、第二のポリペプチドのＮ末端アミノ酸を１〜１００個含む、請求項２８または２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
Ｎ末端部位が、第二のポリペプチドのＮ末端アミノ酸を１〜１０個含む、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
Ｉｇが、ＩｇＧ１である、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
変異が、点変異、欠失、挿入および再配列からなる群から選択される、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
第一のポリペプチドのＣ末端残基が、非イオン化側鎖を有するアミノ酸に変異している
、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
Ｃ末端残基が、非リジンアミノ酸である、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
連結領域が、第一のポリペプチドのＣ末端領域および第二のポリペプチドのＮ末端領域からなり、そして変異が、前記Ｃ末端領域およびＮ末端領域の一方に存在する、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
連結領域が、スペーサーペプチドまたはリンカーペプチドを含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
変異が、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドの間のスペーサーペプチドまたはリンカーペプチドの存在からなる、請求項３９に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
変異が、ＦｃＲまたはＦｃＲｐと相互作用しない領域に存する、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
Ｉｇ部分および非Ｉｇ部分を有する抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期を増大せしめる変異を検出するための方法であって、以下のステップ：
ａ）Ｉｇ部分と非Ｉｇ部分との間の連結を架橋せしめる領域に、変異を導入するステップ；
ｂ）変異を有する抗体ベース融合タンパク質と有しない抗体ベース融合タンパク質の血清半減期を比較するステップ；および
ｃ）前記抗体ベース融合タンパク質の血清中半減期を増加せしめる変異を選択するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法によって検出された変異を含む、抗体ベース融合タンパク質。
【請求項４４】
請求項２６に記載の抗体ベース融合タンパク質を患者に投与するステップを含む、病気を治療するための方法。
【請求項４５】
疎水性または非極性アミノ酸を、付加または置換によって前記連結部位またはその近傍に導入した、請求項１、２６、または３６に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
アミノ酸が、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、およびＧｌｙからなる群から選択される、請求項４５に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
アミノ酸が、Ａｌａである、請求項４８に記載の融合タンパク質。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１７６９６９（Ｐ２０１２−１７６９６９Ａ）
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１０８３９４（Ｐ２０１２−１０８３９４）
【出願日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【分割の表示】特願２００１−５５８１０３（Ｐ２００１−５５８１０３）の分割
【原出願日】平成１３年２月９日（２００１．２．９）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【分割の表示】特願２００１−５５８１０３（Ｐ２００１−５５８１０３）の分割
【原出願日】平成１３年２月９日（２００１．２．９）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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