抗炎症活性を有するラクトバチルス分離株及びそれらの利用
【課題】抗炎症性と有用なプロバイオティックの性質を有する２種類のラクトバチルス分離株、ラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９の開示と利用。
【解決手段】上記菌株を自然界から選別し、食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０３５５及びＢＣＲＣ ９１０３４０として、そして中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）にそれぞれ受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３及びＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４で寄託した。それらと継代培養した後世代について、食品及び医薬品への応用例を示した。
【解決手段】上記菌株を自然界から選別し、食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０３５５及びＢＣＲＣ ９１０３４０として、そして中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）にそれぞれ受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３及びＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４で寄託した。それらと継代培養した後世代について、食品及び医薬品への応用例を示した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（同じ関連出願の相互参照の利用）
本出願は２００８年４月３０日に提出した台湾出願第０９７１１５８８２号の優先権を請求する。
【０００２】
（本発明の背景）
１．本発明の分野
本発明は抗炎症性活性及び有益なプロバイオティック性質を有する２種類のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）分離株、即ちラクトバチルス サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＧＭＮＬ−８９に関し、それらは食品工業発展研究所（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ））の生物資源保存研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ））にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０３５５及びＢＣＲＣ ９１０３４０として、そして中国典型培養物保蔵センター（ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ））にそれぞれ受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３及びＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４で寄託した。当該２種類の単離株及びそれらの継代培養した後世代は種々な食品生産物の製造及びリウマチ性関節炎のような炎症に関連する疾患を治療及び／又は軽減するための医薬組成物の製造に使用できる。
【背景技術】
【０００３】
２．関連する技術の説明
サイトカインは炎症、組織修復、細胞増殖、線維化、血管形成及び免疫反応を含んでいる数多くの重要な生物的プロセスに関与していることが知られている。それゆえ、サイトカインは自己免疫疾患にて重要な役割を果たしている。
【０００４】
Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎ等はリウマチ性関節炎の滑膜組織におけるサイトカインの発現及び調節を分析することによりリウマチ性関節炎の発病機序を検討した（Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ等（１９９６）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４：３９７〜４４０）。Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎ等によれば、サイトカインは主なる４種類に分類される：（１）炎症性サイトカイン；（２）免疫調節性サイトカイン；（３）走化性サイトカイン；及び（４）細胞分裂促進性サイトカイン。
【０００５】
炎症性サイトカインはヘルパーＴ１細胞（略してＴｈ１細胞）により産生される分子群であり、遅延型過敏性反応を制御する能力を有しており、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む。リューマチ性疾患にて見られる軟骨破壊はマトリックスプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）の活性で生じることが広く知られている。ＭＭＰｓは炎症性サイトカイン（ＩＬ−１又はＴＮＦ−α）に応答しやすい活性化マクロファージ及び線維芽細胞により生成する。更にＭ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ等は更にＩＬ−１又はＴＮＦ−αのコラーゲン免疫マウス又はラットへの注射、或いはＩＦＮ−γのコラーゲンＩＩ型免疫マウスの足蹠への局所注射は関節リウマチの出現を促し、当該疾患を悪化させるであろうと報告した（Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、同上）。
【０００６】
免疫調節性サイトカイン（抗炎症性サイトカインとも称する）はヘルパーＴ２細胞（略してＴｈ２細胞）から生成する分子群で、炎症性反応を阻止する能力を有し、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及び形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を含む。Ｇ．Ｇａｒｃｉａ等による論文（Ｇ．Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：３１５〜３２４）では、２種類の免疫調節性サイトカイン、ＴＧＦ−β及びＩＬ−１０はＭＭＰｓを誘導するような炎症性サイトカインの産生を阻害するばかりではなく、ＭＭＰｓ（即ち、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＴＩＭＰｓ）の天然阻害剤の産生も誘導するであろうことを報告している。更にＧ．Ｇａｒｃｉａ等はＩＬ−１０がＴｈ１細胞からのＩＦＮ−γの産生及び他の白血球群からの種々なサイトカインの産生を阻害する能力を有することが知られていることを指摘した。ＩＬ−１０はマクロファージからのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αとＩＬ−８及びＧ−ＣＳＦ（顆粒球−コロニー刺激因子）の産生及び多形核球細胞からのＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−８、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α）及びマクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１β）を阻害した。これらのサイトカイン及びケモカインの多くは関節リウマチの病理学的プラセスに関係している（Ｇ．Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９９），同上）。
【０００７】
これらの研究結果はＴｈ１細胞に関係する炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γのような）は炎症を促進し、関節リウマチを悪化させる一方、Ｔｈ２に関係する免疫調節性サイトカイン（ＩＬ−１０及びＩＬ−４のような）は炎症性サイトカインの産生を阻害することができるのみならずＴＩＭＰｓの産生も阻害して、それにより軟骨破壊を低減させる。
【０００８】
Ｊａｅ−Ｓｅｏｎ ＳｏはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉの経口投与はコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を抑制し、足の腫れ、リンパ球浸潤及び軟骨組織の破壊を軽減した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ投与はＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）反応性炎症性分子（ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＣｏｘ−２）をＣＤ４＋Ｔ細胞により低減させることを報告した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ投与は同じようにＮＦ−κＢの核及びＣＩＩ−反応性Ｔｈ−１型ＩｇＧアイソタイプＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂへの転座を低下させる一方で、ＩＬ−１０レベルを上昇制御した（Ｊａｅ−Ｓｅｏｎ Ｓｏ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４５（９）：２６９０〜２６９９；Ｅｐｕｂ ２００８ Ｆｅｂ １９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
関節リウマチがラクトバチルス分離株の投与で治療／軽減できれば、関節リウマチの患者用に安全で安価な薬剤が開発されるであろう。
【００１０】
前述の目的を達成するために、当該出願人は台湾の成人被験者の消化管試料から２種類のラクトバチルス分離株を選別した。当該２種類のラクトバチルス分離株はそれらのそれぞれの種の既知菌株とは系統発生学的に異なり、大量のＩＬ−１０、比較的少量のＩＦＮ−γ及び／又はＴＮＦ−αの発生を刺激することができる抗炎症活性を有している。それによりこれらのラクトバチルス分離株は関節リウマチを含むが、それだけに限らず炎症に関係する疾患を治療するのに有用であることが予想される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（本発明の概要）
従って、第一の態様では本発明は抗炎症性活性を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の分離菌株を提供し、当該分離した菌株は、
（ｉ）（ａ）食品工業発展研究所（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ））の生物資源保存研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ））に受託番号ＢＣＲＣ ９１０３５５として、中国典型培養保蔵センター（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ））に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３として寄託したラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６、及び
（ｂ）食品工業発展研究所（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ））の生物資源保存研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ））に受託番号ＢＣＲＣ ９１０３４０として、中国典型培養保蔵センター（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ））に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４として寄託したラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９、から選択した寄託菌株、又は（ｉｉ）当該寄託菌株（ｉ）の継代培養した後世代である。
【００１２】
第二の態様では、本発明は食用材料と本発明のラクトバチルス種の分離株を含んでいる食品を提供する。
【００１３】
第三の態様では、本発明は抗炎症性活性を有し、本発明によるラクトバチルス種の分離菌株を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
第四の態様では、本発明は治療を必要とする患者に本発明のラクトバチルス種の分離株を投与することを含む、炎症が関与する疾病患者を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明の他の特徴及び利点は添付図面を参考にした好ましい実施形態の次なる詳細な説明で明らかになるであろうが、その中で、
【００１６】
【図１】図１はコラーゲン誘導関節炎に罹っていて、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６とＧＭＮＬ−８９を８週連続与えたラットから得た血清中のＩＬ−１０についてのＥＬＩＳＡ試験結果を示しているが、そこでは関節炎に罹っておらずＲＯ水を与えたラット及び関節炎を誘導されＲＯ水を与えたラットがそれぞれ対照群とプラセボ群である。
【図２】図２はコラーゲン誘導関節炎に罹っており、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６とＧＭＮＬ−８９を８週連続与えたラットから得た血清中のＩＦＮ−γについてのＥＬＩＳＡ試験結果を示しているが、そこでは関節炎に罹っておらずＲＯ水を与えたラット及び関節炎を誘導されＲＯ水を与えたラットがそれぞれ対照群とプラセボ群である。
【図３】図３はコラーゲン誘導関節炎に罹っており、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６とＧＭＮＬ−８９を８週連続与えたラットから得た血清中のＴＮＦ−αについてのＥＬＩＳＡ試験結果を示しているが、そこでは関節炎に罹っておらずＲＯ水を与えたラット及び関節炎を誘導されＲＯ水を与えたラットがそれぞれ対照群とプラセボ群である。
【図４】図４はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６の１６Ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：４）を示している。
【図５】図５は本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６及び既知の２種類のラクトバチルス サケイから、ＢＣＲＣ １２９３３とＢＣＲＣ １７５００のゲノムＤＮＡｓを鋳型として用い、Ｌａｃ Ｐ２プライマーを使用して行ったランダム増殖多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析の後に実施した１．８％アガロースゲルでの電気泳動の画像結果を示す。(Ａ)ではレーンＭ１：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）であり、レーン１：ＧＭＮＬ−７６；（Ｂ）ではレーンＭ２：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）で、レーン２：ＢＣＲＣ１２９３３；そして（Ｃ）ではレーンＭ３：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）であり、レーン３：ＢＣＲＣ１７５００である。
【図６】図６はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−８９の１６Ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：５）を示しており、そして
【図７】図７は本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−８９及び既知の５種類のラクトバチルス ロイテリのうち、ＢＣＲＣ １４６２５、ＢＣＲＣ １６０９０、ＢＣＲＣ １６０９１、ＢＣＲＣ １７４７６とＢＣＲＣ１７４７８のゲノムＤＮＡｓを鋳型として用い、Ｌａｃ Ｐ２プライマーを使用して行ったランダム増殖多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析の後に実施した１．８％アガロースゲルでの電気泳動の画像結果を示す。(Ａ)ではレーンＭ１：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）であり、レーン１：ＧＭＮＬ−８９；（Ｂ）ではレーンＭ２：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）で、レーン２：ＢＣＲＣ１４６２５；（Ｃ）ではレーンＭ３：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）であり、レーン３：ＢＣＲＣ１６０９０であり、（Ｄ）ではレーンＭ４：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）とレーン４：ＢＣＲＣ１６０９１；（Ｅ）ではレーンＭ５：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）であり、レーン５：ＢＣＲＣ１７４７６、そして（Ｆ）ではレーンＭ６：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）で、レーン６：ＢＣＲＣ１７４７８である。
【００１７】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
関節リウマチは全身的慢性疾患である。しかしながら、臨床的に使用されている薬物は関節リウマチを効果的に治療することができない。更に、当該薬剤を長期使用すると望ましくない副作用を誘導することがある。
【００１８】
加えて、以前の研究は炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのような）は炎症を促進するので関節リウマチが悪化することを示していた。Ｔｈ２細胞に関係する免疫調節性サイトカイン（ＩＬ−１０及びＩＬ−４など）は炎症性サイトカインの産生を阻害することができ、ＴＩＭＰｓの産生を誘導することで軟骨の破壊を軽減することができる。それにより、免疫調節性サイトカイン及び炎症性サイトカインの分泌を調節することで関節リウマチの治療がなされるであろうという仮説が立てられる。
【００１９】
乳酸菌、特にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌株はよく知られており、広く使用されているプロバイオティック微生物である。これらは宿主に対して多くのプロバイオティック効果を有することが知られており、例えば通常の腸内微生物叢の均衡を改善し、下痢を防止し、大腸ガンの危険性を軽減し、胃腸上皮細胞の通常の成長と機能を刺激し、ビタミンと酵素の生産の合成を促進し、そして膣症の防止と治療を行う。
【００２０】
それにより、当該出願人は関節リウマチの治療用にプロバイオティック微生物と考えられている乳酸菌から有益な抗炎症活性を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株を見出す試みを行った。
【００２１】
それにより、台湾の健康な成人被験者から得た胃腸管の標本をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の分離源として使用した。当該分離株は実験した動物の単球とそれぞれ共培養して、単球を刺激してサイトカインを分泌させた。ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γを選別標識として使用して、大量のＩＬ−１０及び比較的少量のＩＦＮ−γ及び／又はＴＮＦ−αを分泌させる能力を有している２種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株、即ちＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９を得た。こうして得た２種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株を特徴つけの目的で試験をし、同定してそれぞれラクトバチルス サケイ及びＬａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉと指定した。
【００２２】
ラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９はそれぞれ食品工業発展研究所（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ））の生物資源保存研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ））（３３１ Ｓｈｉｎ−Ｐｉｎ Ｒｏａｄ，Ｈｓｉｎｃｈｕ ｃｉｔｙ ３００，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ．）に２００７年６月１４日と２００６年１１月１４日にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０３５５及びＢＣＲＣ ９１０３４０として寄託した。これらの分離株は同様に中国典型培養物保蔵センター（ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ））（Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ，４３００７２，Ｐｅｏｐｌｅ'ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ）に２００７年１１月１９日のＢｕｄａｐｅｓｔ条約に基づきそれぞれ受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３及びＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４で寄託した。
【００２３】
本発明のラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９をコラーゲン誘導関節炎のラットに与えると、ラット血清中においてＩＬ−１０の上昇及びＩＦＮ−γとＹＮＦ−αの低下が観察された。これは本発明のラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９がラットの関節炎を軽減する能力を有することを示す。
【００２４】
ラクトバチルス サケイ ＢＣＲＣ １２９３３及びＢＣＲＣ １７５００の既知菌株及びラクトバチルス ロイテリ ＢＣＲＣ １４６２５、ＢＣＲＣ １６０９０、ＢＣＲＣ １６０９１、ＢＣＲＣ １７４７６及びＢＣＲＣ １７４７８などの既知菌株と比較すると、ラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９の体外において単球によるＩＬ−１０分泌を刺激する能力は、それが属する種の他の既知菌株より良好である。
【００２５】
上述した有用な生物的活性の点において、２種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株又はそれらの継代培養した後世代は炎症に関連する疾病の治療で可能性を有することが予期される。これにより、本発明は炎症関連疾病を治療する医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は：
（ｉ）以下から選択した少なくとも１種類の寄託した菌株：
（ａ）食品工業発展研究所（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ））の生物資源保存研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ））に受託番号ＢＣＲＣ９１０３５５として寄託し、中国典型培養物保蔵センター（ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ））に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３で寄託したラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６；及び
（ｂ）食品工業発展研究所（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ））の生物資源保存研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ））に受託番号ＢＣＲＣ９１０３４０として寄託し、中国典型培養物保蔵センター（ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ））に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４で寄託したラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９；又は
（ｉｉ）当該寄託菌株（ｉ）の継代培養した後世代、を含む。
【００２６】
本発明は同じように当該分離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株及びその継代培養した後世代の１種類を、治療を必要とする被験者に投与することを含む、被験者での炎症関連疾病を治療する方法を提供する。
【００２７】
本発明によれば、炎症関連疾病は関節リウマチ、骨粗鬆症、若年性関節リウマチ、硬直性脊椎炎、脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎及び乾癬から選ばれる（Ｅｖｅｌｉｎｅ Ｔｒａｃｈｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ，９（１）：Ｒ９，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２００７ Ｊａｎｕａｒｙ ２９．ｄｏｉ：１０．１１８６／ａｒ２１１５；Ｓｕｃｈｉｔａ Ｎａｄｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０４：３３〜３９；Ｒｉｃｈａｒｄ ＯＷｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，７：４１２〜４１７）。本発明の好ましい実施形態では、炎症関連疾病は関節リウマチである。
【００２８】
本発明の医薬組成物では、前述Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株又は継代培養の後世代そのものは薬学的に許容できる担体とともに処方され、薬物製造の技術で知られている手法を用いて経口投与に適した剤形とした。本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は以下からなる群より選択される剤形である：溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、錠剤、ピル、シロップ、座薬、トローチ、チュウインガム、カプセル、スラリーなど。
【００２９】
本明細書で使用するとき、“薬学的に許容できる担体”とは、被験者に投与したときアレルギー反応又は他の好ましからざる効果を被験者に生じない担体を称する。本発明によると、当該薬学的に許容できる担体には以下の１種類以上が含まれる：溶媒、乳化剤、懸濁剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、キレート化剤、希釈剤、ゲル化剤、保存剤、滑剤など。
【００３０】
これに加えて、本発明のラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９は胆汁塩や胃酸に抵抗性があることも見出されており、それゆえ胃腸のプロバイオティック物として使用するのに適している。例えば、これら２種類の分離株及びそれらの継代培養した後世代は食品添加物として使用でき、それは既知の方法によれば食物成分の調製時に添加されるか、又はこのものを発酵プロセス中に加えるのが望ましくない場合、当該食品成分の発酵後に加えて、ヒト又は動物で摂取するのに適する食品中にいずれの食用成分とともに処方されるようにする。
【００３１】
本発明は同様に前述のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株又はそれらの後世代と食用成分を含む食品を提供する。
【００３２】
本発明に適している食用成分には、これに限られることはないが：液体ミルク製品、例えばミルク及び濃縮ミルク；発酵ミルク、例えばヨーグルト、酸乳、冷凍ヨーグルト及び乳酸菌発酵飲料；粉乳；アイスクリーム；クリームチーズ；乾燥チーズ；豆乳；発酵豆乳；植物−果実ジュース；果物ジュース；スポーツ飲料；菓子類；ゼリー；キャンディ；特殊調製粉乳；健康食品；飼料；健康補助食品などが含まれる。
【００３３】
これに加えて、本発明の食品は凍結乾燥又は噴霧乾燥した分離菌株粉末を含有する即席食品の形であっていてもよく、それは直接消費できる。関連する食品の調製については、例えばＵＳ ６，８７２，５６５ Ｂ２、ＵＳ ７，２４４，４２４ Ｂ２、ＵＳ ７，２７０，９９４ Ｂ２、ＵＳ ７，１７２，７７７ Ｂ２及びＵＳ ６，８７２，４１１ Ｂ１を参考にすることができる。
【００３４】
本発明の食品は更に少なくとも１種類のプロバイオティック微生物を含んでいても良い。本明細書で使用いるとき、用語“プロバイオティック微生物”及び“プロバイオティックス”は同じ意味で使用されており、生きている微生物の調製物を称する。これらの微生物は、ヒト又は動物に摂取された後でも胃腸管中で残存し生存することができ、予防的又は治療的効果を及ぼすことができる。
【００３５】
本発明で使用に適しているプロバイオティック微生物には、これだけに限らないがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、酵母及びそれらの組合せが含まれる。
【００３６】
好ましくは、当該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種は以下からなる群より選ばれる：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｕｃａｓｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｕｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ及びそれらの組合せ。
【００３７】
好ましくは、当該Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は以下からなる群より選ばれる：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ及びそれらの組合せ。
【００３８】
好ましくは、当該Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種は以下からなる群よりえらばれる：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉａｃｅｔｙｌｃａｔｉｓ及びそれらの組合せ。
【００３９】
好ましくは、当該酵母は以下からなる群より選ばれる：Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅそしてそれらの組合せ。
（実施例）
【実施例１】
【００４０】
実施例１．抗炎症性活性を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の予備的選出
【００４１】
材料及び方法：
Ａ．試験を行った菌株の出所及び調製
出願人は２００２年１月にＣｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（台中，台湾）にて多くの健康な成人の胃腸管から試料を採取した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの約４００の分離株を当該試料から選択した。関節炎リウマチの治療において可能性があるプロバイオティックスを探すために、出願人は抗炎症性活性に関してＩＬ−１０を選択標識として用いて分離した菌株を分析した。
【００４２】
Ｂａｃｔｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＭＲＳブロス培地（ＤＩＦＣＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０８８１）に試験菌株を植え、そののち３７℃で１２〜１８時間嫌気性培養した。得られた細菌培養物を４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、当該沈降物を３回１×リン酸緩衝食塩水中（ＰＢＳ）で洗浄して、そののち１×ＰＢＳに懸濁した。当該得られた細菌溶液の濃度を１×ＰＢＳを用いて１〜５×１０９細胞／ｍＬに調整し（細菌数はＯＤ６００を用いて計数した、ＯＤ６００＝１．００＝５．０×１０８細胞／ｍＬ）、こうして調整した細菌溶液を１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１細胞／ｍＬの試験溶液を得るための１０倍連続希釈用の原液として使用した。
【００４３】
Ｂ．マウス脾臓単球の調製：
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＣＯ２を用いて屠殺し、当該脾臓を取り出して滅菌したガラス棒で擂り潰した。擂り潰した後、得た脾臓組織をＦｉｃｏｌｌ−ＰａｇｕｅＴＭ ＰＬＵＳ（１７−１４４１−０３、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により容量比１：１にて密度勾配遠心分離法（７２０ｇ×２０分、４℃未満）にかけた。そののち、赤血球を除去してそれによりマウス脾臓単球が得られるようにし、当該細胞の濃度を、１０％牛血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地を用いて４×１０６細胞／ｍＬに調整した。
【００４４】
Ｃ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株で刺激したマウス脾臓単球によるＩＬ−１０の評価：
９６穴培養プレートの各穴に、項目Ｂで調製した脾臓単球の４×１０６細胞／ｍＬの試料１００μＬを添加した。当該試料を実験群、標準対照群及び陽性対照群に分割した。当該実験群において、各穴に更に項目Ａで調製した試験細菌溶液の２０μＬを加えた。標準対照群では、各穴には更に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地２０μＬを加えた。当該陽性対照群では、各穴に更にリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ｓｅｒｏｔｙｐｅ０５５：Ｂ５，Ｓｉｇｍａ）を加えた。培養器中で（３７℃、５％ＣＯ２）２４時間の間培養したのち、各穴の培養溶液を取り出して遠心分離した。
マウスＩＬ−１０ ＯｐｔＥＩＡＴＭセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５５５２５２）を用いた酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を行うために当該上澄み液１００μＬを取り出した。当該実験は各群について２回繰り返した。
【００４５】
ＩＬ−１０の濃度はＥＬＩＳＡで得たＯＤ４０５値を以下の方程式に代入して、ＥＬＩＳＡ単位（％）で表した：
ＥＬＩＳＡ単位（％）＝［（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）］×１００
この式で、Ａ＝Ｌａｃｔｏｂａｔｉｌｌｕｓ分離株のＯＤ４０５値
Ｂ＝陽性対照群のＯＤ４０５値；そして
Ｃ＝標準対照群のＯＤ４０５値。
【００４６】
結果
当該実験菌株全体のうち４６菌株は、マウス脾臓単球によるより多くのＩＬ−１０分泌を刺激した。当該実験結果は表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１の実験結果によれば、当該試験菌株の生育速度、細菌数、大量生産に関する実用性などのような要素を考慮して、出願人はＧＭＮＬ−１９、ＧＭＮＬ−７６、ＧＭＮＬ−７８、ＧＭＮＬ−８９、ＧＭＮＬ−９４、ＧＭＮＬ−１０１及びＧＭＮＬ−１６１を、ヒト末梢血液単球（ヒトＰＢＭＣｓ）のＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの分泌を刺激するこれらの菌株の能力を評価する更なる実験用に選択した。
【実施例２】
【００４９】
実施例２．ヒトＰＢＭＣｓによるＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの分泌を促すＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の能力の評価
【００５０】
材料と方法
Ａ．ヒトＰＢＭＣｓの調製
実験の目的に適するか検査したヒト白血球濃度（台湾献血センター）をＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ ＰＬＵＳ（１７−１４４１−０３、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により容量比１：１で４℃にて密度勾配遠心分離（７２０ｇ，２０分間）にかけた。そののち、当該赤血球を取り除いてそれによりヒトＰＢＭＣｓを得て、当該細胞濃度を１０％ＰＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて４×１０６細胞／ｍＬに調整した。
【００５１】
Ｂ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株により刺激されたヒトＰＢＭＣｓによるＩＬ−１０分泌の評価：
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株ＧＭＮＬ−１９、ＧＭＮＬ−７６、ＧＭＮＬ−７８、ＧＭＮＬ−８９、ＧＭＮＬ−９４、ＧＭＮＬ−１０１及びＧＭＮＬ−１６１のヒトＰＢＭＣｓによるＩＬ−１０の分泌を刺激する能力の評価は、実施例１の項目Ｃに関連して説明した操作手順に基本的に基づいている。１×１０８細胞／ｍＬの濃度を有する試験細菌溶液２０μＬを実験群として使用し、項目Ａで調製したヒトＰＢＭＣｓの試料の１００μＬ及びヒトＩＬ−１０ ＯｐｔＥＩＡＴＭセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５５５１５７）を用いた場合に差異が存在する。
【００５２】
Ｃ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株により刺激されたＰＢＭＣｓによるＩＦＮ−γの分泌の評価
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−１９、ＧＭＮＬ−７６、ＧＭＮＬ−７８、ＧＭＮＬ−８９、ＧＭＮＬ−９４、ＧＭＮＬ−１０１及びＧＭＮＬ−１６１のヒトＰＭＢＣｓによるＩＦＮ−γ分泌の刺激能力を以下の記述に従って分析した。
【００５３】
９６穴培養プレートの各穴にヒトＰＢＭＣｓの試料１００μＬを加えた。当該試料を実験群及び標準対照群に分割した。当該実験群では、実施例１の項目Ａで調製した試験細菌溶液（１×１０７細胞／ｍＬ）２０μＬを更に各穴に加えた。当該標準対照群では、１０％ＦＢＳを含んでいるＲＰＭＩ １６４０培地２０μＬを加えた。培養器（３７℃、５％ＣＯ２）にて２４時間の間培養したのち、各穴中の培養溶液を遠心分離した。ＢＤ ＯｐｔＥＩＡＴＭヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキットＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５５０６１２）を用いるＩＦＮ−γＥＬＩＳＡを実施するために、そこから上澄み液１００μＬを取り出した。
【００５４】
これに加えて、ヒトＰＢＭＣｓの試料に、ＰＨＡ１０μｇ／ｍＬに対してＰｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｎ（ＰＨＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ２７６９）を４×１０６細胞／ｍＬの比で加え、４８時間培養した。遠心分離（７２０ｇ×２０分、４℃）後、上澄み液を取り出して−８０℃に設定した冷凍庫に保存した。当該ＰＨＡ処理上澄み液（１００ｍＬ）をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡの分析を行うときの内部陽性対照として使用した。
【００５５】
コーティング緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４，０．７７ｍＭ ＮａＮ３，ｐＨ ９．０）で１０００倍希釈したマウス抗ヒトＩＦＮ−γ（ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５５１２２１）の１００μＬを９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭ ９６ ＭｉｃｒｏＷｅｌｌＴＭ Ｐｌａｔｅｓ，ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４４２４０４）の各穴に加えた。当該培養プレートは室温(２５℃)にて１時間４０ｒｐｍで攪伴したのち、次いで４℃で一夜培養した。
【００５６】
そののち、当該培養プレートは室温に戻し、各穴の液体を除去した。各穴を洗浄用緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）を用いて２回（各３分間）洗浄し、次いでブロッキング緩衝液（３％の牛血清アルブミンを含有しているＰＢＳ）の２００ｍＬを各穴に添加した。当該培養プレートは室温で２時間放置し、次いで当該ブロッキング緩衝液を除去し、当該洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
【００５７】
試験を行う試料の１００μＬを各穴に加え、一夜４℃で反応させた。その後、各穴の液体を除去し、各細胞を洗浄用緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有しているＰＢＳ）で２回洗浄した。続いて、希釈用緩衝液（１％のＢＳＡを含んでいるＰＢＳ）で２０００倍に希釈したビオチンマウス抗ヒトＩＦＮ−γ（ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ，Ｃａｔ，Ｎｏ．５５４５５０）の１００ｍＬを各穴に加え、室温で２時間反応させた。各穴中の液体を除去したのち、各穴は洗浄用緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含んでいるＰＢＳ）で２回洗浄した。そののち、希釈用緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で２０００倍に希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＰ，ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５５４０６５）の１００ｍＬを室温で１時間反応させた。各穴の液体を除去した後、各穴を洗浄用緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、次いで新たに調製したｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）溶液を各穴に加えた。当該培養プレートは室温で暗所に置き、３０分間反応させた。そののち、ＥＬＩＳＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｏｄｅｌ ５５０）を用い、各穴について４０５ｎｍでの吸光度を測定した。この実験は各群について２回行った。
【００５８】
ＩＦＮ−γの濃度はＥＬＩＳＡで得たＯＤ４０５の値を以下の式に代入し、ＥＬＩＳＡ単位（％）で表した：
ＥＬＩＳＡ単位（％）＝［（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）］×１００
この式で、Ａ＝Ｌａｃｔｏｂａｔｉｌｌｕｓ分離株のＯＤ４０５値
Ｂ＝内部陽性対照群のＯＤ４０５値；そして
Ｃ＝標準対照群のＯＤ４０５値である。
【００５９】
結果：
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−１９、ＧＭＮＬ−７６、ＧＭＮＬ−７８、ＧＭＮＬ−８９、ＧＭＮＬ−９４、ＧＭＮＬ−１０１及びＧＭＮＬ−１６１で刺激されたヒトＰＢＭＣｓＩＬ−１０及びＩＮＦ−γ分泌の結果はそれぞれ表２及び表３に示した。
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【００６２】
表２から、全てのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の中で、ＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９がヒトＰＢＣｓによるＩＬ−１０分泌の最大量を刺激することが分かる。これはヒトＰＢＭＣｓによるＩＬ−１０の分泌を刺激するこれらのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の能力が最大であることを示している。
【００６３】
更に表３から、全てのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の中で、ＧＭＮＬ−７８はヒトＰＢＭＣｓによる最少量のＩＦＮ−γ分泌の刺激を行い、ＧＭＮＬ−８９とＧＭＮＬ−７６がそれに次いでいることが明らかである。これはヒトＰＢＭＣｓによるＩＦＮ−γ分泌を刺激させるＧＭＮＬ−７８の能力が最少で、ＧＭＮＬ−８９とＧＭＮＬ−７６の能力も同じように極めて低いことを示している。
【００６４】
炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのような）は炎症を促進し、悪化した関節リウマチとなることが知られているが、その一方免疫調節性サイトカイン（ＩＬ−１０のような）は炎症性サイトカインの生成を阻害できることが知られている。そこで本出願人は：ヒト又は動物の単球が、より多くの免疫調節性サイトカイン及び、より少ない炎症性性サイトカインを分泌するように刺激できればヒト又は動物の関節リウマチの症状は改善できるであろうという仮説をたてた。更に、表２及び表３における結果によって、本出願人はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９は開発に関してより高い可能性を示したと考え、以下に記述した動物試験に使用した。
【実施例３】
【００６５】
実施例３．コラーゲン誘導関節炎のラットに対するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９の治療効果の評価
材料及び方法：
【００６６】
Ａ．動物：
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｔａｉｗａｎ）から購入した雄ＬＥＷ／ＳｓＮＮａｒｌラット（６週齢、体重２００〜２５０ｇ）を以下の実験で使用した。全ての動物は、温度２５±１℃で相対湿度６０±５％に保ち、明１２時間にした隔離された空調室で飼育した。当該動物は十分な水と飼料が摂食でき、試験環境で１週間馴化させた。動物の扱い及び当該実験プロトコルはＬａｂｏｒａｔｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｔａｉｗａｎの基準に適合していた。
【００６７】
Ｂ．試験菌株の調製：
Ｂａｃｔｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＭＲＳブロス培地（ＤＩＦＣＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０８８１）にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９をそれぞれ接種した。当該分離株は３７℃で増殖が飽和するまで嫌気的に培養した。３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離したあと、当該沈殿物を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）の２ｍＬと１ｍＬで２回それぞれ洗浄し、次いでそれにＰＢＳ１ｍＬを加えた。当該細菌溶液の濃度はＯＤ６００を用いて測定した。当該測定した濃度は約１．０×１０１０細胞／ｍＬであった。当該細菌溶液は次に使用するために−８０℃で保存した。
【００６８】
Ｃ．関節炎の誘導：
関節炎の誘導はＹ．Ｋａｍｅｙａｍａ等がＢｏｎｅ ３５（２００４）９４８〜９５６に記述した方法を少し修正した方法を用いて実施した。牛ＩＩ型コラーゲン（略してＣＩＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１１８８）を０．０５Ｍ酢酸に溶解させ、２ｍｇ／ｍＬの濃度を有するＣＩＩ溶液とした。ＣＩＩ溶液１００μＬと完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）１００μＬからなるＣＩＩ乳化物を作成した。その後、当該ＣＩＩ乳化物の２００μＬをラットの尾に経皮的に注射した。当該ラットは最初の免疫付与後２１日目にブースター注射を行った。
【００６９】
Ｄ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株を用いた飼育：
ラットを無作為に３群の実験群（ＧＭＮＬ−７６、ＧＭＮＬ−８９及びプラセボ群）と対照群を含む４群（各群当たりｎ＝６）に分けた。当該対照群を除いて、本実施例の項目Ｃで説明した方法により他の全ての群のラットに関節炎誘発を行った。
【００７０】
ＧＭＮＬ−７６群及びＧＭＮＬ−８９群に対し、ブースター注射後７日目からの開始で、当該ラットを本実施例の項目Ｂで調製した細菌溶液（１．０×１０１０細胞／ｍＬ／日）で飼育した。プラセボ群及び対照群のラットは逆浸透（ＲＯ）水で飼育した。
【００７１】
８週連続で飼育したのち、遠心分離用に当該ラットの血液を眼窩瀉血で採取した。得られた血清はＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの濃度の測定に使用した。これに加えて、全てのラットは眼窩瀉血ののち、関節炎の以下の評価のために更に使用した。
【００７２】
Ｅ．ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの濃度の測定
ＩＬ−１０濃度の評価は、本実施例の項目Ｄで得たラット血清及びラットＩＬ−１０ ＯｐｔＥＩＡＴＭセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２６１１ＫＩ）を使用したのを除き、原則的に実施例１の項目Ｃで説明した操作手順に基づいていた。
【００７３】
ＩＦＮ−γ濃度の評価は、本実施例の項目Ｄで得たラット血清及びラットＩＦＮ−γ ＯｐｔＥＩＡＴＭセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用したのを除き、原則的に実施例２の項目Ｃで説明した操作手順に基づいていた。
【００７４】
ＴＮＦ−γ濃度の評価は、本実施例の項目Ｄで得たラット血清及びＢＤ ＯｐｔＥＩＡセットラットＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用したのを除き、原則的に実施例１の項目Ｃで説明した操作手順に基づいていた。
【００７５】
こうして得たＯＤ４０５値は、その次にＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−αの異なる既知濃度に対するそれらのＯＤ４０５値をプロットして前もって作成した相関曲線に基づいてｐｇ／ｍＬで表した濃度に変換した。
【００７６】
Ｆ．関節炎の評価
ラットでの関節炎の評価は、Ｂｏｎｅ ３５（２００４）９４８〜９５６でＫａｍｅｙａｍａ等が説明した方法に基づいていた。具体的には、各ラットの４肢の関節における腫脹及び肥大のような変化を記録し、０〜４の尺度で各肢を評点化して定量した：０は関節炎徴候なし；１は１肢が腫脹；２は３肢より多くで腫脹；肢全体が腫脹；４は全ての関節が重度の腫脹及び湾曲で、通常の歩行が妨げられる。
【００７７】
Ｇ．統計的分析：
ＳＰＳＳ統計ソフトウェア（バージョン１０．０）を用いて統計分析を行った。当該試験をした動物の全数が３０未満なので、当該実験データは試料分布に関して、対照群、ＧＭＮＬ−７６群、ＧＭＮＬ−８９群及びプラセボ群の間の差異の評価はノンパラメトリック統計法（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試験としても知られている）を用いて分析した。当該実験データは平均±標準偏差（統計有意差、ｐ＜０．０５）で表した。
【００７８】
結果：
８連続週の間飼育したラット血清中のＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの濃度をそれぞれ表４及び図１から３にて示す。これに加えて、関節炎の評価の評点結果を表４にまとめている。
【００７９】
【表４】
１：全てのデータはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いて分析した。
２：各ラットに関する関節炎の程度の評点は４肢における関節に関する全評点を集計して計算した。
３：＊：プラセボ群と比較してｐ＜０．０５。
【００８０】
表４及び図１から３より、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９でそれぞれ飼育されたＧＭＮＬ−７６群及びＧＭＮＬ−８９群におけるラットに関して、それらの血清中のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α濃度は当該プラセボ群と比較して著しく低く抑えられる一方、ＩＬ−１０の濃度は顕著に高まっていた。
【００８１】
それゆえ、当該出願人はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９は、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ−γの分泌を低減させて炎症を緩和させる傍らＴＮＦ−α分泌を抑えることができ、それによりＭＭＰｓの分泌を低下させて関節組織の軟骨の更なる破壊を防止する。これに加えて、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９は免疫調節性サイトカインであるＩＬ−１０の分泌も増加させて炎症の状態を制御可能とする。それにより、関節炎で起こった関節破壊は取り返しがつかないが、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９で飼育することでラット血清中の炎症関連ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの低下がある一方、抗炎症関連したＩＬ−１０の増加がある。これはラットでの関節炎の疾患が緩和され、悪化しないことを示す。
【実施例４】
【００８２】
実施例４．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９の同定と特性化
【００８３】
上の実施例で選択したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９を同定するために、以下の予備試験、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析及びランダム増殖多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析を実施した。
【００８４】
材料及び方法：
Ａ．予備試験：
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９に対して行った予備試験の項目には：グラム染色、形態的観察、カタラーゼ試験、移動性、好気性及び嫌気性条件での増殖が含まれる。
【００８５】
Ｂ．１６Ｓ ｒＤＮＡ 配列分析：
滅菌条件下で、分離株ＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９のおのおのを１ｍＬのＢａｃｔｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳブロス培地（ＤＩＦＣＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０８８１）に植えつけ、３７℃で一夜培養した。その後、当該細菌溶液を１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、次いで上澄み液の除去を行った。残された沈澱のおのおのを２００μＬのｄｄＨ２Ｏに懸濁し、次いで１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して上澄み液を除去した。この工程はもう一度繰り返した。最後に遠心分離でこうして得た細胞沈殿物のおのおのをｄｄＨ２Ｏの２００μＬに懸濁した。
【００８６】
ゲノムＤＮＡを含んでいる細胞懸濁物について、以下のヌクレオチド配列を有し、Ｐ．Ｓ．Ｍ．Ｙｅｕｎｇ等（２００２）による文献（Ｊ．Ｄａｉｒｙ ｓｃｉ．，８５：１０３９〜１０５１）で報告された１６Ｓ ｒＤＮＡ配列用に設計されたプライマー対（ＰＡＦプライマー及び５３６Ｒプライマー）を用いて、表５で示した反応条件下で実施するポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）にかけた。
ＰＡＦプライマー
【００８７】
【化１】
５３６Ｒプライマー
【００８８】
【化２】
【００８９】
【表５】
【００９０】
ＰＣＲの終了後、得られたＰＣＲ生成物を１．８％アガロースゲルの電気泳動にかけることで、約５００ｂｐのＰＣＲ増幅生成物が得られたかどうかを確認して、そして当該確認したＰＣＲ生成物を取り出してアガロースゲルから精製した。当該精製ＰＣＲ生成物についての配列をＧｅｎｏｍｉｃｓ ＢｉｏＳｃｉ ＆ Ｔｅｃｈ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔａｉｗａｎにより決定を行い、決定した配列の比較をしてＮＣＢＩのウエブサイトにおけるソフトウエアのヌクレオチド−ヌクレオチドＢＬＡＳＴを用いて分析した。
【００９１】
Ｃ．ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９の種を１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を用いて分析及び確認を行った後、本実施例の項目Ｂで得たＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９のゲノムＤＮＡｓを鋳型として使用して、以下のヌクレオチド配列を有していてＭ．ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ等（２００１）がＡｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：２０１１〜２０２０で報告した１０−ｍｅｒのプライマーＬａｃ Ｐ２を表６で示した反応条件下でＰＣＲを実施するために選んだ。
Ｌａｃ Ｐ２プライマー
【００９２】
【化３】
【００９３】
【表６】
【００９４】
ＰＣＲを終了後、当該増幅した生成物を１．８％アガロースゲルにおける電気泳動にかけて、次ぎに染色、紫外線下での観察及び写真撮影を行った。
【００９５】
本実験において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの７菌株を同様にＢＣＲＣ ｏｆ ｔｈｅ ＦＩＲＤＩ、Ｔａｉｗａｎから購入して比較及び分析目的についての対照として供した。当該７菌株には：
１．ラクトバチルス サケイ亜種ｓａｋｅｉ，ＢＣＲＣ １２９３３（ＡＴＣＣ ３１０６３に相当；酢漬けキャベツから単離）；
２．ラクトバチルス サケイ亜種ｃａｒｎｏｓｕｓ，ＢＣＲＣ １７５００（ＬＭＧ １７３０２に相当；生ソーセージから単離）；
３．ラクトバチルス ロイテリ，ＢＣＲＣ １４６２５（ＡＴＣＣ ２３２７２及びＤＳＭ ２００１６に相当；ヒト糞便から単離）；
４．ラクトバチルス ロイテリ，ＢＣＲＣ １６０９０（ＤＳＭ ２００１５に相当；堆肥から単離）；
５．ラクトバチルス ロイテリ，ＢＣＲＣ １６０９１（ＤＳＭ ２００５３に相当；ヒト糞便から単離）；
６．ラクトバチルス ロイテリ，ＢＣＲＣ １７４７６（ＪＣＭ １０８１に相当；ニワトリの腸から単離）；及び
７．ラクトバチルス ロイテリ，ＢＣＲＣ １７４７８（ＪＣＭ ２７６２に相当；発酵糖蜜から単離）。
【００９６】
結果：
１．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株ＧＭＮＬ−７６の同定と特性化：
（ｉ）当該予備試験の結果によると、本分離株はグラム陽性、非運動性、カタラーゼ陰性及びオキシダーゼ陰性であり、好気性及び嫌気性で成長する。
【００９７】
（ｉｉ）本単離株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の分析結果を図４に示す。ＮＣＢＩのウエブサイトにおける遺伝子データベースと比較することで、本分離株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：４）はラクトバチルス サケイのものと最も類似していることが判明した；そして
【００９８】
（ｉｉｉ）図５にＲＡＰＤ分析結果を示す。示されたように本分離株のＰＣＲ生成物の遺伝子指紋プロファイルはラクトバチルス サケイの他の２つの既知菌株、ＢＣＲＣ １２９３３及びＢＣＲＣ １７５００のものとは異なる。
【００９９】
上記同定結果の観点では、本発明によるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株ＧＭＮＬ−７６はラクトバチルス サケイの新たな分離株と考えられる。
【０１００】
２．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−８９の同定と特性化
（ｉ）予備試験の結果によれば、本分離株はグラム陽性、非運動性、カタラーゼ陰性及びオキシダーゼ陰性であり、好気性及び嫌気性で成長する；
【０１０１】
（ｉｉ）本単離株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の分析結果を図６に示す。ＮＣＢＩのウエブサイトにおける遺伝子データベースとの比較してみると、本分離株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：５）はラクトバチルス ロイテリのものと最も類似していることが判明した；そして
【０１０２】
（ｉｉｉ）図７にＲＡＰＤ分析結果を示す。示したように本分離株のＰＣＲ生成物の遺伝子指紋プロファイルはラクトバチルス ロイテリの他の５つの既知菌株、ＢＣＲＣ１４６２５、ＢＣＲＣ １６０９０、ＢＣＲＣ １６０９１、ＢＣＲＣ １７４７６及びＢＣＲＣ １７４７８のものとは異なる。
【０１０３】
上記同定結果を考慮すると、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株はラクトバチルス ロイテリの新規分離株であると考えられる。
【０１０４】
ラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９はそれぞれＢｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ）ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ）（３３１ Ｓｈｉｈ−Ｐｉｎ Ｒｏａｄ，Ｈｓｉｎｃｈｕ ｃｉｔｙ ３００，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ）に２００７年６月１４日及び２００６年１１月１４日にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０３５５及びＢＣＲＣ ９１０３４０で寄託した。これらの分離株は同様にｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）（Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ，４３００７２，Ｐｅｏｐｌｅ'ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ）に２００７年１１月１９日のブタペスト条約に従って受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３及びＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４でそれぞれ寄託した。
【実施例５】
【０１０５】
実施例５．ラット脾臓単球によるＩＬ−１０分泌を刺激におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株ＧＭＮＬ−７６とＧＭＮＬ−８９及び既知菌株の能力の評価
【０１０６】
単球を刺激してより多くのＩＬ−１０を分泌させる能力はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９に特有な生物活性であることを示すために、これらの分離株と既知の７種の菌株（即ち、ＦＩＲＤＩから購入したラクトバチルス サケイ ＢＩＲＣ １２９３３とＢＣＲＣ １７５００及びラクトバチルス ロイテリ ＢＣＲＣ １４６２５，ＢＣＲＣ １６０９０，ＢＣＲＣ１６０９１，ＢＣＲＣ １７４７６とＢＣＲＣ １７４７８）を以下の実験で比較した。
【０１０７】
材料及び方法：
ＩＬ−１０の濃度の評価は実施例１の項目Ｃで説明した操作手順に基本的に基づいていて、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６とＧＭＮＬ−８９及び７種類の既知菌株を、当該実験を実施するのに使用した。こうして得たＯＤ４０５値は、次に標準ＩＬ−１０の異なる既知濃度に対するそれらのＯＤ４０５値をプロットして前もって作成した相関曲線に基づきｐｇ／ｍＬで表す濃度に変換した。各菌株に対する実験は２回繰り返し、実験データは平均±標準偏差で表した。
【０１０８】
結果：
以下の表７はＧＭＮＬ−７６、ＧＭＮＬ−８９及び７種類の既知菌株で刺激されたラット脾臓単球によるＩＬ−１０の分泌結果を示す。
【０１０９】
【表７】
【０１１０】
表７から、試験をした菌株全部のうち本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株ＧＭＮＬ−８９及び既知菌株ＢＣＲＣ １７４７６がラット副腎単球を刺激してＩＬ−１０を分泌させる最高の能力を有しており、ＧＭＮＬ−７６がそれに次いでいることが明らかである。表７で示した実験結果は本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株ＧＭＮＬ−８９及びＧＭＮＬ−７６は同じ種に属する他の既知種とは異なることも示している。
【実施例６】
【０１１１】
実施例６．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９についての酸耐性試験及び胆汁塩酸耐性試験
【０１１２】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９が摂取された後、ヒト消化管の厳しい環境を生き残る能力を試験するために、ヒト消化管における消化プロセスを想定した実験を実施した。
【０１１３】
材料：
１．ＭＲＳブロス（ｐＨ＝３）
ＭＲＳ粉末（ＢＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８８１３０）５５ｇをＲＯ水１Ｌに溶解して十分撹拌し、次いで１Ｍ ＨＣｌにてｐＨ値を３に調整して、１２１℃で１５分滅菌をした。得られたブロスは冷却したあと、次なる使用まで保存した。
【０１１４】
２．雄牛胆汁０．２％（ｗ／ｖ）を含んでいるＷＲＳブロス培地：
５５ｇのＭＲＳ粉末を１ＬのＲＯ水に溶解して十分に混合することでＭＲＳブロス培地を得た後、１２１℃で１５分間滅菌を行った。当該ＭＲＳブロス培地の温度が約４５℃まで下がったときに、２ｇの雄牛胆汁粉末（Ｓｉｇｍａ）を加えて十分混合すると０．２％（ｗ／ｖ）の雄牛胆汁を含んだＭＲＳブロス培地が得られ、それは次いで０．５μｍの孔を有する紙を用いてろ過した。
【０１１５】
３．ＭＲＳ寒天プレート：
５５ｇのＭＲＳ粉末を１ＬのＲＯ水中に溶解した。ＭＲＳ粉末が完全に溶解した後に１５ｇのアガロース粉末を加えた。こうして形成した混合物は次に１Ｌ血清フラスコに注ぎ、１２１℃で１５分間の滅菌を行った。当該混合物の温度が４５℃まで低下したとき、約１５〜２０ｍＬの混合物を滅菌操作条件下で各ペトリ皿に加えた。得られた混合物を冷却して次の使用のために凝固させた。
【０１１６】
方法：
Ａ．酸耐性試験：
ＭＲＳブロス培地（ｐＨ＝３）の２７ｍＬに実施例１の項目Ａで得た試験細菌溶液３ｍＬを植え付けて、それとともに混合し、次いで３７℃で３時間培養した。そののち、当該培養液の１ｍＬを取り出して滅菌水にて連続的希釈を行い、その後にスプレッドプレート法（１０−９〜１０−１）を行った。そののち、生存する細菌数を計数した。
【０１１７】
Ｂ．胆汁塩耐性試験：
酸耐性試験の終了後、当該培養液の残り２９ｍＬを４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。当該上澄み液を除去し、滅菌水３０ｍＬを加えて細菌を懸濁させた。それに引き続き、４，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離を行い、上澄み液を除去することで酸性ＭＲＳブロス培地を取除いた。次に、雄牛胆汁０．２％を含有するＭＲＳブロス培地３０ｍＬを用いて当該細菌を分散させ、次いでこうして作成した培養液を３７℃で３時間培養した。そののち、当該培養液１ｍＬを取り出し、滅菌水を用いて連続希釈して、そしてスプレッドプレート法（１０−９〜１０−１）を行った。生存細菌数を計数した。
【０１１８】
結果：
模擬ヒト代謝プロセスを行った後のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９の増殖を以下の表８に示す。
【０１１９】
【表８】
【０１２０】
表８から明らかなように、本発明の２種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株をＭＲＳブロス培地（ｐＨ＝３）で３時間培養した後におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６についての生存細菌計数は処理後で１．８３×１０５ ＣＦＵ／ｍＬである。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−８９に関しては、生存細菌細胞計数は６．８３×１０８ ＣＦＵ／ｍＬである。当該２種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株を０．２％の雄牛胆十を含有するＭＲＳブロス培地で３時間追加の培養をした後の生存細菌細胞計数は低下せず、当該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は０．２％の雄牛胆汁を含有するＭＲＳブロス培地中で優れた生存率を有していたことを示す。当該結果はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９はヒト消化管がもたらす環境圧に打ち勝つことができ、摂取後は腸に到達できて住みつけることを示す。
【０１２１】
本明細書で引用した全ての特許及び参照文献はそれらの全容につき明細書にて参考に取り込んである。不一致の場合、定義を含めて本記述が優先するであろう。
【０１２２】
本発明は上記具体的実施形態に準拠して説明したが、多くの修正及び変更が本発明の範囲と精神から逸脱せずにできることは明らかである。そこで本発明は添付請求項で示したもののみに制限されることを意図している。
【技術分野】
【０００１】
（同じ関連出願の相互参照の利用）
本出願は２００８年４月３０日に提出した台湾出願第０９７１１５８８２号の優先権を請求する。
【０００２】
（本発明の背景）
１．本発明の分野
本発明は抗炎症性活性及び有益なプロバイオティック性質を有する２種類のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）分離株、即ちラクトバチルス サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＧＭＮＬ−８９に関し、それらは食品工業発展研究所（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ））の生物資源保存研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ））にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０３５５及びＢＣＲＣ ９１０３４０として、そして中国典型培養物保蔵センター（ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ））にそれぞれ受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３及びＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４で寄託した。当該２種類の単離株及びそれらの継代培養した後世代は種々な食品生産物の製造及びリウマチ性関節炎のような炎症に関連する疾患を治療及び／又は軽減するための医薬組成物の製造に使用できる。
【背景技術】
【０００３】
２．関連する技術の説明
サイトカインは炎症、組織修復、細胞増殖、線維化、血管形成及び免疫反応を含んでいる数多くの重要な生物的プロセスに関与していることが知られている。それゆえ、サイトカインは自己免疫疾患にて重要な役割を果たしている。
【０００４】
Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎ等はリウマチ性関節炎の滑膜組織におけるサイトカインの発現及び調節を分析することによりリウマチ性関節炎の発病機序を検討した（Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ等（１９９６）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４：３９７〜４４０）。Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎ等によれば、サイトカインは主なる４種類に分類される：（１）炎症性サイトカイン；（２）免疫調節性サイトカイン；（３）走化性サイトカイン；及び（４）細胞分裂促進性サイトカイン。
【０００５】
炎症性サイトカインはヘルパーＴ１細胞（略してＴｈ１細胞）により産生される分子群であり、遅延型過敏性反応を制御する能力を有しており、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む。リューマチ性疾患にて見られる軟骨破壊はマトリックスプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）の活性で生じることが広く知られている。ＭＭＰｓは炎症性サイトカイン（ＩＬ−１又はＴＮＦ−α）に応答しやすい活性化マクロファージ及び線維芽細胞により生成する。更にＭ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ等は更にＩＬ−１又はＴＮＦ−αのコラーゲン免疫マウス又はラットへの注射、或いはＩＦＮ−γのコラーゲンＩＩ型免疫マウスの足蹠への局所注射は関節リウマチの出現を促し、当該疾患を悪化させるであろうと報告した（Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、同上）。
【０００６】
免疫調節性サイトカイン（抗炎症性サイトカインとも称する）はヘルパーＴ２細胞（略してＴｈ２細胞）から生成する分子群で、炎症性反応を阻止する能力を有し、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３及び形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）を含む。Ｇ．Ｇａｒｃｉａ等による論文（Ｇ．Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：３１５〜３２４）では、２種類の免疫調節性サイトカイン、ＴＧＦ−β及びＩＬ−１０はＭＭＰｓを誘導するような炎症性サイトカインの産生を阻害するばかりではなく、ＭＭＰｓ（即ち、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＴＩＭＰｓ）の天然阻害剤の産生も誘導するであろうことを報告している。更にＧ．Ｇａｒｃｉａ等はＩＬ−１０がＴｈ１細胞からのＩＦＮ−γの産生及び他の白血球群からの種々なサイトカインの産生を阻害する能力を有することが知られていることを指摘した。ＩＬ−１０はマクロファージからのＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αとＩＬ−８及びＧ−ＣＳＦ（顆粒球−コロニー刺激因子）の産生及び多形核球細胞からのＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＬ−８、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α）及びマクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１β）を阻害した。これらのサイトカイン及びケモカインの多くは関節リウマチの病理学的プラセスに関係している（Ｇ．Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９９），同上）。
【０００７】
これらの研究結果はＴｈ１細胞に関係する炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γのような）は炎症を促進し、関節リウマチを悪化させる一方、Ｔｈ２に関係する免疫調節性サイトカイン（ＩＬ−１０及びＩＬ−４のような）は炎症性サイトカインの産生を阻害することができるのみならずＴＩＭＰｓの産生も阻害して、それにより軟骨破壊を低減させる。
【０００８】
Ｊａｅ−Ｓｅｏｎ ＳｏはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉの経口投与はコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を抑制し、足の腫れ、リンパ球浸潤及び軟骨組織の破壊を軽減した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ投与はＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）反応性炎症性分子（ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＣｏｘ−２）をＣＤ４＋Ｔ細胞により低減させることを報告した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ投与は同じようにＮＦ−κＢの核及びＣＩＩ−反応性Ｔｈ−１型ＩｇＧアイソタイプＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂへの転座を低下させる一方で、ＩＬ−１０レベルを上昇制御した（Ｊａｅ−Ｓｅｏｎ Ｓｏ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４５（９）：２６９０〜２６９９；Ｅｐｕｂ ２００８ Ｆｅｂ １９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
関節リウマチがラクトバチルス分離株の投与で治療／軽減できれば、関節リウマチの患者用に安全で安価な薬剤が開発されるであろう。
【００１０】
前述の目的を達成するために、当該出願人は台湾の成人被験者の消化管試料から２種類のラクトバチルス分離株を選別した。当該２種類のラクトバチルス分離株はそれらのそれぞれの種の既知菌株とは系統発生学的に異なり、大量のＩＬ−１０、比較的少量のＩＦＮ−γ及び／又はＴＮＦ−αの発生を刺激することができる抗炎症活性を有している。それによりこれらのラクトバチルス分離株は関節リウマチを含むが、それだけに限らず炎症に関係する疾患を治療するのに有用であることが予想される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（本発明の概要）
従って、第一の態様では本発明は抗炎症性活性を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の分離菌株を提供し、当該分離した菌株は、
（ｉ）（ａ）食品工業発展研究所（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ））の生物資源保存研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ））に受託番号ＢＣＲＣ ９１０３５５として、中国典型培養保蔵センター（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ））に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３として寄託したラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６、及び
（ｂ）食品工業発展研究所（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ））の生物資源保存研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ））に受託番号ＢＣＲＣ ９１０３４０として、中国典型培養保蔵センター（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ））に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４として寄託したラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９、から選択した寄託菌株、又は（ｉｉ）当該寄託菌株（ｉ）の継代培養した後世代である。
【００１２】
第二の態様では、本発明は食用材料と本発明のラクトバチルス種の分離株を含んでいる食品を提供する。
【００１３】
第三の態様では、本発明は抗炎症性活性を有し、本発明によるラクトバチルス種の分離菌株を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
第四の態様では、本発明は治療を必要とする患者に本発明のラクトバチルス種の分離株を投与することを含む、炎症が関与する疾病患者を治療する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明の他の特徴及び利点は添付図面を参考にした好ましい実施形態の次なる詳細な説明で明らかになるであろうが、その中で、
【００１６】
【図１】図１はコラーゲン誘導関節炎に罹っていて、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６とＧＭＮＬ−８９を８週連続与えたラットから得た血清中のＩＬ−１０についてのＥＬＩＳＡ試験結果を示しているが、そこでは関節炎に罹っておらずＲＯ水を与えたラット及び関節炎を誘導されＲＯ水を与えたラットがそれぞれ対照群とプラセボ群である。
【図２】図２はコラーゲン誘導関節炎に罹っており、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６とＧＭＮＬ−８９を８週連続与えたラットから得た血清中のＩＦＮ−γについてのＥＬＩＳＡ試験結果を示しているが、そこでは関節炎に罹っておらずＲＯ水を与えたラット及び関節炎を誘導されＲＯ水を与えたラットがそれぞれ対照群とプラセボ群である。
【図３】図３はコラーゲン誘導関節炎に罹っており、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６とＧＭＮＬ−８９を８週連続与えたラットから得た血清中のＴＮＦ−αについてのＥＬＩＳＡ試験結果を示しているが、そこでは関節炎に罹っておらずＲＯ水を与えたラット及び関節炎を誘導されＲＯ水を与えたラットがそれぞれ対照群とプラセボ群である。
【図４】図４はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６の１６Ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：４）を示している。
【図５】図５は本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６及び既知の２種類のラクトバチルス サケイから、ＢＣＲＣ １２９３３とＢＣＲＣ １７５００のゲノムＤＮＡｓを鋳型として用い、Ｌａｃ Ｐ２プライマーを使用して行ったランダム増殖多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析の後に実施した１．８％アガロースゲルでの電気泳動の画像結果を示す。(Ａ)ではレーンＭ１：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）であり、レーン１：ＧＭＮＬ−７６；（Ｂ）ではレーンＭ２：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）で、レーン２：ＢＣＲＣ１２９３３；そして（Ｃ）ではレーンＭ３：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）であり、レーン３：ＢＣＲＣ１７５００である。
【図６】図６はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−８９の１６Ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：５）を示しており、そして
【図７】図７は本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−８９及び既知の５種類のラクトバチルス ロイテリのうち、ＢＣＲＣ １４６２５、ＢＣＲＣ １６０９０、ＢＣＲＣ １６０９１、ＢＣＲＣ １７４７６とＢＣＲＣ１７４７８のゲノムＤＮＡｓを鋳型として用い、Ｌａｃ Ｐ２プライマーを使用して行ったランダム増殖多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析の後に実施した１．８％アガロースゲルでの電気泳動の画像結果を示す。(Ａ)ではレーンＭ１：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）であり、レーン１：ＧＭＮＬ−８９；（Ｂ）ではレーンＭ２：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）で、レーン２：ＢＣＲＣ１４６２５；（Ｃ）ではレーンＭ３：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）であり、レーン３：ＢＣＲＣ１６０９０であり、（Ｄ）ではレーンＭ４：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）とレーン４：ＢＣＲＣ１６０９１；（Ｅ）ではレーンＭ５：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）であり、レーン５：ＢＣＲＣ１７４７６、そして（Ｆ）ではレーンＭ６：ＤＮＡラダー（１００〜３０００ｂｐ）で、レーン６：ＢＣＲＣ１７４７８である。
【００１７】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
関節リウマチは全身的慢性疾患である。しかしながら、臨床的に使用されている薬物は関節リウマチを効果的に治療することができない。更に、当該薬剤を長期使用すると望ましくない副作用を誘導することがある。
【００１８】
加えて、以前の研究は炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのような）は炎症を促進するので関節リウマチが悪化することを示していた。Ｔｈ２細胞に関係する免疫調節性サイトカイン（ＩＬ−１０及びＩＬ−４など）は炎症性サイトカインの産生を阻害することができ、ＴＩＭＰｓの産生を誘導することで軟骨の破壊を軽減することができる。それにより、免疫調節性サイトカイン及び炎症性サイトカインの分泌を調節することで関節リウマチの治療がなされるであろうという仮説が立てられる。
【００１９】
乳酸菌、特にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌株はよく知られており、広く使用されているプロバイオティック微生物である。これらは宿主に対して多くのプロバイオティック効果を有することが知られており、例えば通常の腸内微生物叢の均衡を改善し、下痢を防止し、大腸ガンの危険性を軽減し、胃腸上皮細胞の通常の成長と機能を刺激し、ビタミンと酵素の生産の合成を促進し、そして膣症の防止と治療を行う。
【００２０】
それにより、当該出願人は関節リウマチの治療用にプロバイオティック微生物と考えられている乳酸菌から有益な抗炎症活性を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株を見出す試みを行った。
【００２１】
それにより、台湾の健康な成人被験者から得た胃腸管の標本をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の分離源として使用した。当該分離株は実験した動物の単球とそれぞれ共培養して、単球を刺激してサイトカインを分泌させた。ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γを選別標識として使用して、大量のＩＬ−１０及び比較的少量のＩＦＮ−γ及び／又はＴＮＦ−αを分泌させる能力を有している２種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株、即ちＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９を得た。こうして得た２種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株を特徴つけの目的で試験をし、同定してそれぞれラクトバチルス サケイ及びＬａｃｔｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉと指定した。
【００２２】
ラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９はそれぞれ食品工業発展研究所（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ））の生物資源保存研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ））（３３１ Ｓｈｉｎ−Ｐｉｎ Ｒｏａｄ，Ｈｓｉｎｃｈｕ ｃｉｔｙ ３００，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ．）に２００７年６月１４日と２００６年１１月１４日にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０３５５及びＢＣＲＣ ９１０３４０として寄託した。これらの分離株は同様に中国典型培養物保蔵センター（ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ））（Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ，４３００７２，Ｐｅｏｐｌｅ'ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ）に２００７年１１月１９日のＢｕｄａｐｅｓｔ条約に基づきそれぞれ受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３及びＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４で寄託した。
【００２３】
本発明のラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９をコラーゲン誘導関節炎のラットに与えると、ラット血清中においてＩＬ−１０の上昇及びＩＦＮ−γとＹＮＦ−αの低下が観察された。これは本発明のラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９がラットの関節炎を軽減する能力を有することを示す。
【００２４】
ラクトバチルス サケイ ＢＣＲＣ １２９３３及びＢＣＲＣ １７５００の既知菌株及びラクトバチルス ロイテリ ＢＣＲＣ １４６２５、ＢＣＲＣ １６０９０、ＢＣＲＣ １６０９１、ＢＣＲＣ １７４７６及びＢＣＲＣ １７４７８などの既知菌株と比較すると、ラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９の体外において単球によるＩＬ−１０分泌を刺激する能力は、それが属する種の他の既知菌株より良好である。
【００２５】
上述した有用な生物的活性の点において、２種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株又はそれらの継代培養した後世代は炎症に関連する疾病の治療で可能性を有することが予期される。これにより、本発明は炎症関連疾病を治療する医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は：
（ｉ）以下から選択した少なくとも１種類の寄託した菌株：
（ａ）食品工業発展研究所（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ））の生物資源保存研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ））に受託番号ＢＣＲＣ９１０３５５として寄託し、中国典型培養物保蔵センター（ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ））に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３で寄託したラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６；及び
（ｂ）食品工業発展研究所（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ））の生物資源保存研究センター（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ））に受託番号ＢＣＲＣ９１０３４０として寄託し、中国典型培養物保蔵センター（ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ））に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４で寄託したラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９；又は
（ｉｉ）当該寄託菌株（ｉ）の継代培養した後世代、を含む。
【００２６】
本発明は同じように当該分離したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌株及びその継代培養した後世代の１種類を、治療を必要とする被験者に投与することを含む、被験者での炎症関連疾病を治療する方法を提供する。
【００２７】
本発明によれば、炎症関連疾病は関節リウマチ、骨粗鬆症、若年性関節リウマチ、硬直性脊椎炎、脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎及び乾癬から選ばれる（Ｅｖｅｌｉｎｅ Ｔｒａｃｈｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ，９（１）：Ｒ９，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２００７ Ｊａｎｕａｒｙ ２９．ｄｏｉ：１０．１１８６／ａｒ２１１５；Ｓｕｃｈｉｔａ Ｎａｄｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０４：３３〜３９；Ｒｉｃｈａｒｄ ＯＷｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，７：４１２〜４１７）。本発明の好ましい実施形態では、炎症関連疾病は関節リウマチである。
【００２８】
本発明の医薬組成物では、前述Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株又は継代培養の後世代そのものは薬学的に許容できる担体とともに処方され、薬物製造の技術で知られている手法を用いて経口投与に適した剤形とした。本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は以下からなる群より選択される剤形である：溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、錠剤、ピル、シロップ、座薬、トローチ、チュウインガム、カプセル、スラリーなど。
【００２９】
本明細書で使用するとき、“薬学的に許容できる担体”とは、被験者に投与したときアレルギー反応又は他の好ましからざる効果を被験者に生じない担体を称する。本発明によると、当該薬学的に許容できる担体には以下の１種類以上が含まれる：溶媒、乳化剤、懸濁剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、キレート化剤、希釈剤、ゲル化剤、保存剤、滑剤など。
【００３０】
これに加えて、本発明のラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９は胆汁塩や胃酸に抵抗性があることも見出されており、それゆえ胃腸のプロバイオティック物として使用するのに適している。例えば、これら２種類の分離株及びそれらの継代培養した後世代は食品添加物として使用でき、それは既知の方法によれば食物成分の調製時に添加されるか、又はこのものを発酵プロセス中に加えるのが望ましくない場合、当該食品成分の発酵後に加えて、ヒト又は動物で摂取するのに適する食品中にいずれの食用成分とともに処方されるようにする。
【００３１】
本発明は同様に前述のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株又はそれらの後世代と食用成分を含む食品を提供する。
【００３２】
本発明に適している食用成分には、これに限られることはないが：液体ミルク製品、例えばミルク及び濃縮ミルク；発酵ミルク、例えばヨーグルト、酸乳、冷凍ヨーグルト及び乳酸菌発酵飲料；粉乳；アイスクリーム；クリームチーズ；乾燥チーズ；豆乳；発酵豆乳；植物−果実ジュース；果物ジュース；スポーツ飲料；菓子類；ゼリー；キャンディ；特殊調製粉乳；健康食品；飼料；健康補助食品などが含まれる。
【００３３】
これに加えて、本発明の食品は凍結乾燥又は噴霧乾燥した分離菌株粉末を含有する即席食品の形であっていてもよく、それは直接消費できる。関連する食品の調製については、例えばＵＳ ６，８７２，５６５ Ｂ２、ＵＳ ７，２４４，４２４ Ｂ２、ＵＳ ７，２７０，９９４ Ｂ２、ＵＳ ７，１７２，７７７ Ｂ２及びＵＳ ６，８７２，４１１ Ｂ１を参考にすることができる。
【００３４】
本発明の食品は更に少なくとも１種類のプロバイオティック微生物を含んでいても良い。本明細書で使用いるとき、用語“プロバイオティック微生物”及び“プロバイオティックス”は同じ意味で使用されており、生きている微生物の調製物を称する。これらの微生物は、ヒト又は動物に摂取された後でも胃腸管中で残存し生存することができ、予防的又は治療的効果を及ぼすことができる。
【００３５】
本発明で使用に適しているプロバイオティック微生物には、これだけに限らないがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、酵母及びそれらの組合せが含まれる。
【００３６】
好ましくは、当該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種は以下からなる群より選ばれる：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｕｃａｓｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｕｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ及びそれらの組合せ。
【００３７】
好ましくは、当該Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は以下からなる群より選ばれる：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ及びそれらの組合せ。
【００３８】
好ましくは、当該Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種は以下からなる群よりえらばれる：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉａｃｅｔｙｌｃａｔｉｓ及びそれらの組合せ。
【００３９】
好ましくは、当該酵母は以下からなる群より選ばれる：Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｅａｅそしてそれらの組合せ。
（実施例）
【実施例１】
【００４０】
実施例１．抗炎症性活性を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の予備的選出
【００４１】
材料及び方法：
Ａ．試験を行った菌株の出所及び調製
出願人は２００２年１月にＣｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（台中，台湾）にて多くの健康な成人の胃腸管から試料を採取した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの約４００の分離株を当該試料から選択した。関節炎リウマチの治療において可能性があるプロバイオティックスを探すために、出願人は抗炎症性活性に関してＩＬ−１０を選択標識として用いて分離した菌株を分析した。
【００４２】
Ｂａｃｔｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＭＲＳブロス培地（ＤＩＦＣＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０８８１）に試験菌株を植え、そののち３７℃で１２〜１８時間嫌気性培養した。得られた細菌培養物を４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、当該沈降物を３回１×リン酸緩衝食塩水中（ＰＢＳ）で洗浄して、そののち１×ＰＢＳに懸濁した。当該得られた細菌溶液の濃度を１×ＰＢＳを用いて１〜５×１０９細胞／ｍＬに調整し（細菌数はＯＤ６００を用いて計数した、ＯＤ６００＝１．００＝５．０×１０８細胞／ｍＬ）、こうして調整した細菌溶液を１０８、１０７、１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１細胞／ｍＬの試験溶液を得るための１０倍連続希釈用の原液として使用した。
【００４３】
Ｂ．マウス脾臓単球の調製：
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＣＯ２を用いて屠殺し、当該脾臓を取り出して滅菌したガラス棒で擂り潰した。擂り潰した後、得た脾臓組織をＦｉｃｏｌｌ−ＰａｇｕｅＴＭ ＰＬＵＳ（１７−１４４１−０３、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により容量比１：１にて密度勾配遠心分離法（７２０ｇ×２０分、４℃未満）にかけた。そののち、赤血球を除去してそれによりマウス脾臓単球が得られるようにし、当該細胞の濃度を、１０％牛血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地を用いて４×１０６細胞／ｍＬに調整した。
【００４４】
Ｃ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株で刺激したマウス脾臓単球によるＩＬ−１０の評価：
９６穴培養プレートの各穴に、項目Ｂで調製した脾臓単球の４×１０６細胞／ｍＬの試料１００μＬを添加した。当該試料を実験群、標準対照群及び陽性対照群に分割した。当該実験群において、各穴に更に項目Ａで調製した試験細菌溶液の２０μＬを加えた。標準対照群では、各穴には更に１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地２０μＬを加えた。当該陽性対照群では、各穴に更にリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ｓｅｒｏｔｙｐｅ０５５：Ｂ５，Ｓｉｇｍａ）を加えた。培養器中で（３７℃、５％ＣＯ２）２４時間の間培養したのち、各穴の培養溶液を取り出して遠心分離した。
マウスＩＬ−１０ ＯｐｔＥＩＡＴＭセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５５５２５２）を用いた酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を行うために当該上澄み液１００μＬを取り出した。当該実験は各群について２回繰り返した。
【００４５】
ＩＬ−１０の濃度はＥＬＩＳＡで得たＯＤ４０５値を以下の方程式に代入して、ＥＬＩＳＡ単位（％）で表した：
ＥＬＩＳＡ単位（％）＝［（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）］×１００
この式で、Ａ＝Ｌａｃｔｏｂａｔｉｌｌｕｓ分離株のＯＤ４０５値
Ｂ＝陽性対照群のＯＤ４０５値；そして
Ｃ＝標準対照群のＯＤ４０５値。
【００４６】
結果
当該実験菌株全体のうち４６菌株は、マウス脾臓単球によるより多くのＩＬ−１０分泌を刺激した。当該実験結果は表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
表１の実験結果によれば、当該試験菌株の生育速度、細菌数、大量生産に関する実用性などのような要素を考慮して、出願人はＧＭＮＬ−１９、ＧＭＮＬ−７６、ＧＭＮＬ−７８、ＧＭＮＬ−８９、ＧＭＮＬ−９４、ＧＭＮＬ−１０１及びＧＭＮＬ−１６１を、ヒト末梢血液単球（ヒトＰＢＭＣｓ）のＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの分泌を刺激するこれらの菌株の能力を評価する更なる実験用に選択した。
【実施例２】
【００４９】
実施例２．ヒトＰＢＭＣｓによるＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの分泌を促すＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の能力の評価
【００５０】
材料と方法
Ａ．ヒトＰＢＭＣｓの調製
実験の目的に適するか検査したヒト白血球濃度（台湾献血センター）をＦｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＴＭ ＰＬＵＳ（１７−１４４１−０３、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により容量比１：１で４℃にて密度勾配遠心分離（７２０ｇ，２０分間）にかけた。そののち、当該赤血球を取り除いてそれによりヒトＰＢＭＣｓを得て、当該細胞濃度を１０％ＰＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地を用いて４×１０６細胞／ｍＬに調整した。
【００５１】
Ｂ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株により刺激されたヒトＰＢＭＣｓによるＩＬ−１０分泌の評価：
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株ＧＭＮＬ−１９、ＧＭＮＬ−７６、ＧＭＮＬ−７８、ＧＭＮＬ−８９、ＧＭＮＬ−９４、ＧＭＮＬ−１０１及びＧＭＮＬ−１６１のヒトＰＢＭＣｓによるＩＬ−１０の分泌を刺激する能力の評価は、実施例１の項目Ｃに関連して説明した操作手順に基本的に基づいている。１×１０８細胞／ｍＬの濃度を有する試験細菌溶液２０μＬを実験群として使用し、項目Ａで調製したヒトＰＢＭＣｓの試料の１００μＬ及びヒトＩＬ−１０ ＯｐｔＥＩＡＴＭセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５５５１５７）を用いた場合に差異が存在する。
【００５２】
Ｃ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株により刺激されたＰＢＭＣｓによるＩＦＮ−γの分泌の評価
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−１９、ＧＭＮＬ−７６、ＧＭＮＬ−７８、ＧＭＮＬ−８９、ＧＭＮＬ−９４、ＧＭＮＬ−１０１及びＧＭＮＬ−１６１のヒトＰＭＢＣｓによるＩＦＮ−γ分泌の刺激能力を以下の記述に従って分析した。
【００５３】
９６穴培養プレートの各穴にヒトＰＢＭＣｓの試料１００μＬを加えた。当該試料を実験群及び標準対照群に分割した。当該実験群では、実施例１の項目Ａで調製した試験細菌溶液（１×１０７細胞／ｍＬ）２０μＬを更に各穴に加えた。当該標準対照群では、１０％ＦＢＳを含んでいるＲＰＭＩ １６４０培地２０μＬを加えた。培養器（３７℃、５％ＣＯ２）にて２４時間の間培養したのち、各穴中の培養溶液を遠心分離した。ＢＤ ＯｐｔＥＩＡＴＭヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキットＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５５０６１２）を用いるＩＦＮ−γＥＬＩＳＡを実施するために、そこから上澄み液１００μＬを取り出した。
【００５４】
これに加えて、ヒトＰＢＭＣｓの試料に、ＰＨＡ１０μｇ／ｍＬに対してＰｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｎ（ＰＨＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ２７６９）を４×１０６細胞／ｍＬの比で加え、４８時間培養した。遠心分離（７２０ｇ×２０分、４℃）後、上澄み液を取り出して−８０℃に設定した冷凍庫に保存した。当該ＰＨＡ処理上澄み液（１００ｍＬ）をＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡの分析を行うときの内部陽性対照として使用した。
【００５５】
コーティング緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４，０．７７ｍＭ ＮａＮ３，ｐＨ ９．０）で１０００倍希釈したマウス抗ヒトＩＦＮ−γ（ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５５１２２１）の１００μＬを９６穴培養プレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭ ９６ ＭｉｃｒｏＷｅｌｌＴＭ Ｐｌａｔｅｓ，ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４４２４０４）の各穴に加えた。当該培養プレートは室温(２５℃)にて１時間４０ｒｐｍで攪伴したのち、次いで４℃で一夜培養した。
【００５６】
そののち、当該培養プレートは室温に戻し、各穴の液体を除去した。各穴を洗浄用緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）を用いて２回（各３分間）洗浄し、次いでブロッキング緩衝液（３％の牛血清アルブミンを含有しているＰＢＳ）の２００ｍＬを各穴に添加した。当該培養プレートは室温で２時間放置し、次いで当該ブロッキング緩衝液を除去し、当該洗浄用緩衝液で２回洗浄した。
【００５７】
試験を行う試料の１００μＬを各穴に加え、一夜４℃で反応させた。その後、各穴の液体を除去し、各細胞を洗浄用緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有しているＰＢＳ）で２回洗浄した。続いて、希釈用緩衝液（１％のＢＳＡを含んでいるＰＢＳ）で２０００倍に希釈したビオチンマウス抗ヒトＩＦＮ−γ（ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ，Ｃａｔ，Ｎｏ．５５４５５０）の１００ｍＬを各穴に加え、室温で２時間反応させた。各穴中の液体を除去したのち、各穴は洗浄用緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含んでいるＰＢＳ）で２回洗浄した。そののち、希釈用緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で２０００倍に希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＰ，ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎＴＭ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５５４０６５）の１００ｍＬを室温で１時間反応させた。各穴の液体を除去した後、各穴を洗浄用緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、次いで新たに調製したｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）溶液を各穴に加えた。当該培養プレートは室温で暗所に置き、３０分間反応させた。そののち、ＥＬＩＳＡ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｏｄｅｌ ５５０）を用い、各穴について４０５ｎｍでの吸光度を測定した。この実験は各群について２回行った。
【００５８】
ＩＦＮ−γの濃度はＥＬＩＳＡで得たＯＤ４０５の値を以下の式に代入し、ＥＬＩＳＡ単位（％）で表した：
ＥＬＩＳＡ単位（％）＝［（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）］×１００
この式で、Ａ＝Ｌａｃｔｏｂａｔｉｌｌｕｓ分離株のＯＤ４０５値
Ｂ＝内部陽性対照群のＯＤ４０５値；そして
Ｃ＝標準対照群のＯＤ４０５値である。
【００５９】
結果：
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−１９、ＧＭＮＬ−７６、ＧＭＮＬ−７８、ＧＭＮＬ−８９、ＧＭＮＬ−９４、ＧＭＮＬ−１０１及びＧＭＮＬ−１６１で刺激されたヒトＰＢＭＣｓＩＬ−１０及びＩＮＦ−γ分泌の結果はそれぞれ表２及び表３に示した。
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【００６２】
表２から、全てのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の中で、ＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９がヒトＰＢＣｓによるＩＬ−１０分泌の最大量を刺激することが分かる。これはヒトＰＢＭＣｓによるＩＬ−１０の分泌を刺激するこれらのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の能力が最大であることを示している。
【００６３】
更に表３から、全てのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の中で、ＧＭＮＬ−７８はヒトＰＢＭＣｓによる最少量のＩＦＮ−γ分泌の刺激を行い、ＧＭＮＬ−８９とＧＭＮＬ−７６がそれに次いでいることが明らかである。これはヒトＰＢＭＣｓによるＩＦＮ−γ分泌を刺激させるＧＭＮＬ−７８の能力が最少で、ＧＭＮＬ−８９とＧＭＮＬ−７６の能力も同じように極めて低いことを示している。
【００６４】
炎症性サイトカイン（ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのような）は炎症を促進し、悪化した関節リウマチとなることが知られているが、その一方免疫調節性サイトカイン（ＩＬ−１０のような）は炎症性サイトカインの生成を阻害できることが知られている。そこで本出願人は：ヒト又は動物の単球が、より多くの免疫調節性サイトカイン及び、より少ない炎症性性サイトカインを分泌するように刺激できればヒト又は動物の関節リウマチの症状は改善できるであろうという仮説をたてた。更に、表２及び表３における結果によって、本出願人はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９は開発に関してより高い可能性を示したと考え、以下に記述した動物試験に使用した。
【実施例３】
【００６５】
実施例３．コラーゲン誘導関節炎のラットに対するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９の治療効果の評価
材料及び方法：
【００６６】
Ａ．動物：
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｔａｉｗａｎ）から購入した雄ＬＥＷ／ＳｓＮＮａｒｌラット（６週齢、体重２００〜２５０ｇ）を以下の実験で使用した。全ての動物は、温度２５±１℃で相対湿度６０±５％に保ち、明１２時間にした隔離された空調室で飼育した。当該動物は十分な水と飼料が摂食でき、試験環境で１週間馴化させた。動物の扱い及び当該実験プロトコルはＬａｂｏｒａｔｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｔａｉｗａｎの基準に適合していた。
【００６７】
Ｂ．試験菌株の調製：
Ｂａｃｔｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＭＲＳブロス培地（ＤＩＦＣＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０８８１）にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９をそれぞれ接種した。当該分離株は３７℃で増殖が飽和するまで嫌気的に培養した。３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離したあと、当該沈殿物を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）の２ｍＬと１ｍＬで２回それぞれ洗浄し、次いでそれにＰＢＳ１ｍＬを加えた。当該細菌溶液の濃度はＯＤ６００を用いて測定した。当該測定した濃度は約１．０×１０１０細胞／ｍＬであった。当該細菌溶液は次に使用するために−８０℃で保存した。
【００６８】
Ｃ．関節炎の誘導：
関節炎の誘導はＹ．Ｋａｍｅｙａｍａ等がＢｏｎｅ ３５（２００４）９４８〜９５６に記述した方法を少し修正した方法を用いて実施した。牛ＩＩ型コラーゲン（略してＣＩＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ１１８８）を０．０５Ｍ酢酸に溶解させ、２ｍｇ／ｍＬの濃度を有するＣＩＩ溶液とした。ＣＩＩ溶液１００μＬと完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）１００μＬからなるＣＩＩ乳化物を作成した。その後、当該ＣＩＩ乳化物の２００μＬをラットの尾に経皮的に注射した。当該ラットは最初の免疫付与後２１日目にブースター注射を行った。
【００６９】
Ｄ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株を用いた飼育：
ラットを無作為に３群の実験群（ＧＭＮＬ−７６、ＧＭＮＬ−８９及びプラセボ群）と対照群を含む４群（各群当たりｎ＝６）に分けた。当該対照群を除いて、本実施例の項目Ｃで説明した方法により他の全ての群のラットに関節炎誘発を行った。
【００７０】
ＧＭＮＬ−７６群及びＧＭＮＬ−８９群に対し、ブースター注射後７日目からの開始で、当該ラットを本実施例の項目Ｂで調製した細菌溶液（１．０×１０１０細胞／ｍＬ／日）で飼育した。プラセボ群及び対照群のラットは逆浸透（ＲＯ）水で飼育した。
【００７１】
８週連続で飼育したのち、遠心分離用に当該ラットの血液を眼窩瀉血で採取した。得られた血清はＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの濃度の測定に使用した。これに加えて、全てのラットは眼窩瀉血ののち、関節炎の以下の評価のために更に使用した。
【００７２】
Ｅ．ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの濃度の測定
ＩＬ−１０濃度の評価は、本実施例の項目Ｄで得たラット血清及びラットＩＬ−１０ ＯｐｔＥＩＡＴＭセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２６１１ＫＩ）を使用したのを除き、原則的に実施例１の項目Ｃで説明した操作手順に基づいていた。
【００７３】
ＩＦＮ−γ濃度の評価は、本実施例の項目Ｄで得たラット血清及びラットＩＦＮ−γ ＯｐｔＥＩＡＴＭセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用したのを除き、原則的に実施例２の項目Ｃで説明した操作手順に基づいていた。
【００７４】
ＴＮＦ−γ濃度の評価は、本実施例の項目Ｄで得たラット血清及びＢＤ ＯｐｔＥＩＡセットラットＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用したのを除き、原則的に実施例１の項目Ｃで説明した操作手順に基づいていた。
【００７５】
こうして得たＯＤ４０５値は、その次にＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−αの異なる既知濃度に対するそれらのＯＤ４０５値をプロットして前もって作成した相関曲線に基づいてｐｇ／ｍＬで表した濃度に変換した。
【００７６】
Ｆ．関節炎の評価
ラットでの関節炎の評価は、Ｂｏｎｅ ３５（２００４）９４８〜９５６でＫａｍｅｙａｍａ等が説明した方法に基づいていた。具体的には、各ラットの４肢の関節における腫脹及び肥大のような変化を記録し、０〜４の尺度で各肢を評点化して定量した：０は関節炎徴候なし；１は１肢が腫脹；２は３肢より多くで腫脹；肢全体が腫脹；４は全ての関節が重度の腫脹及び湾曲で、通常の歩行が妨げられる。
【００７７】
Ｇ．統計的分析：
ＳＰＳＳ統計ソフトウェア（バージョン１０．０）を用いて統計分析を行った。当該試験をした動物の全数が３０未満なので、当該実験データは試料分布に関して、対照群、ＧＭＮＬ−７６群、ＧＭＮＬ−８９群及びプラセボ群の間の差異の評価はノンパラメトリック統計法（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試験としても知られている）を用いて分析した。当該実験データは平均±標準偏差（統計有意差、ｐ＜０．０５）で表した。
【００７８】
結果：
８連続週の間飼育したラット血清中のＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの濃度をそれぞれ表４及び図１から３にて示す。これに加えて、関節炎の評価の評点結果を表４にまとめている。
【００７９】
【表４】
１：全てのデータはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いて分析した。
２：各ラットに関する関節炎の程度の評点は４肢における関節に関する全評点を集計して計算した。
３：＊：プラセボ群と比較してｐ＜０．０５。
【００８０】
表４及び図１から３より、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９でそれぞれ飼育されたＧＭＮＬ−７６群及びＧＭＮＬ−８９群におけるラットに関して、それらの血清中のＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α濃度は当該プラセボ群と比較して著しく低く抑えられる一方、ＩＬ−１０の濃度は顕著に高まっていた。
【００８１】
それゆえ、当該出願人はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９は、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮ−γの分泌を低減させて炎症を緩和させる傍らＴＮＦ−α分泌を抑えることができ、それによりＭＭＰｓの分泌を低下させて関節組織の軟骨の更なる破壊を防止する。これに加えて、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９は免疫調節性サイトカインであるＩＬ−１０の分泌も増加させて炎症の状態を制御可能とする。それにより、関節炎で起こった関節破壊は取り返しがつかないが、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９で飼育することでラット血清中の炎症関連ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの低下がある一方、抗炎症関連したＩＬ−１０の増加がある。これはラットでの関節炎の疾患が緩和され、悪化しないことを示す。
【実施例４】
【００８２】
実施例４．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９の同定と特性化
【００８３】
上の実施例で選択したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９を同定するために、以下の予備試験、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析及びランダム増殖多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析を実施した。
【００８４】
材料及び方法：
Ａ．予備試験：
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９に対して行った予備試験の項目には：グラム染色、形態的観察、カタラーゼ試験、移動性、好気性及び嫌気性条件での増殖が含まれる。
【００８５】
Ｂ．１６Ｓ ｒＤＮＡ 配列分析：
滅菌条件下で、分離株ＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９のおのおのを１ｍＬのＢａｃｔｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳブロス培地（ＤＩＦＣＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０８８１）に植えつけ、３７℃で一夜培養した。その後、当該細菌溶液を１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、次いで上澄み液の除去を行った。残された沈澱のおのおのを２００μＬのｄｄＨ２Ｏに懸濁し、次いで１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して上澄み液を除去した。この工程はもう一度繰り返した。最後に遠心分離でこうして得た細胞沈殿物のおのおのをｄｄＨ２Ｏの２００μＬに懸濁した。
【００８６】
ゲノムＤＮＡを含んでいる細胞懸濁物について、以下のヌクレオチド配列を有し、Ｐ．Ｓ．Ｍ．Ｙｅｕｎｇ等（２００２）による文献（Ｊ．Ｄａｉｒｙ ｓｃｉ．，８５：１０３９〜１０５１）で報告された１６Ｓ ｒＤＮＡ配列用に設計されたプライマー対（ＰＡＦプライマー及び５３６Ｒプライマー）を用いて、表５で示した反応条件下で実施するポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）にかけた。
ＰＡＦプライマー
【００８７】
【化１】
５３６Ｒプライマー
【００８８】
【化２】
【００８９】
【表５】
【００９０】
ＰＣＲの終了後、得られたＰＣＲ生成物を１．８％アガロースゲルの電気泳動にかけることで、約５００ｂｐのＰＣＲ増幅生成物が得られたかどうかを確認して、そして当該確認したＰＣＲ生成物を取り出してアガロースゲルから精製した。当該精製ＰＣＲ生成物についての配列をＧｅｎｏｍｉｃｓ ＢｉｏＳｃｉ ＆ Ｔｅｃｈ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔａｉｗａｎにより決定を行い、決定した配列の比較をしてＮＣＢＩのウエブサイトにおけるソフトウエアのヌクレオチド−ヌクレオチドＢＬＡＳＴを用いて分析した。
【００９１】
Ｃ．ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９の種を１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を用いて分析及び確認を行った後、本実施例の項目Ｂで得たＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９のゲノムＤＮＡｓを鋳型として使用して、以下のヌクレオチド配列を有していてＭ．ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ等（２００１）がＡｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：２０１１〜２０２０で報告した１０−ｍｅｒのプライマーＬａｃ Ｐ２を表６で示した反応条件下でＰＣＲを実施するために選んだ。
Ｌａｃ Ｐ２プライマー
【００９２】
【化３】
【００９３】
【表６】
【００９４】
ＰＣＲを終了後、当該増幅した生成物を１．８％アガロースゲルにおける電気泳動にかけて、次ぎに染色、紫外線下での観察及び写真撮影を行った。
【００９５】
本実験において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの７菌株を同様にＢＣＲＣ ｏｆ ｔｈｅ ＦＩＲＤＩ、Ｔａｉｗａｎから購入して比較及び分析目的についての対照として供した。当該７菌株には：
１．ラクトバチルス サケイ亜種ｓａｋｅｉ，ＢＣＲＣ １２９３３（ＡＴＣＣ ３１０６３に相当；酢漬けキャベツから単離）；
２．ラクトバチルス サケイ亜種ｃａｒｎｏｓｕｓ，ＢＣＲＣ １７５００（ＬＭＧ １７３０２に相当；生ソーセージから単離）；
３．ラクトバチルス ロイテリ，ＢＣＲＣ １４６２５（ＡＴＣＣ ２３２７２及びＤＳＭ ２００１６に相当；ヒト糞便から単離）；
４．ラクトバチルス ロイテリ，ＢＣＲＣ １６０９０（ＤＳＭ ２００１５に相当；堆肥から単離）；
５．ラクトバチルス ロイテリ，ＢＣＲＣ １６０９１（ＤＳＭ ２００５３に相当；ヒト糞便から単離）；
６．ラクトバチルス ロイテリ，ＢＣＲＣ １７４７６（ＪＣＭ １０８１に相当；ニワトリの腸から単離）；及び
７．ラクトバチルス ロイテリ，ＢＣＲＣ １７４７８（ＪＣＭ ２７６２に相当；発酵糖蜜から単離）。
【００９６】
結果：
１．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株ＧＭＮＬ−７６の同定と特性化：
（ｉ）当該予備試験の結果によると、本分離株はグラム陽性、非運動性、カタラーゼ陰性及びオキシダーゼ陰性であり、好気性及び嫌気性で成長する。
【００９７】
（ｉｉ）本単離株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の分析結果を図４に示す。ＮＣＢＩのウエブサイトにおける遺伝子データベースと比較することで、本分離株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：４）はラクトバチルス サケイのものと最も類似していることが判明した；そして
【００９８】
（ｉｉｉ）図５にＲＡＰＤ分析結果を示す。示されたように本分離株のＰＣＲ生成物の遺伝子指紋プロファイルはラクトバチルス サケイの他の２つの既知菌株、ＢＣＲＣ １２９３３及びＢＣＲＣ １７５００のものとは異なる。
【００９９】
上記同定結果の観点では、本発明によるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株ＧＭＮＬ−７６はラクトバチルス サケイの新たな分離株と考えられる。
【０１００】
２．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−８９の同定と特性化
（ｉ）予備試験の結果によれば、本分離株はグラム陽性、非運動性、カタラーゼ陰性及びオキシダーゼ陰性であり、好気性及び嫌気性で成長する；
【０１０１】
（ｉｉ）本単離株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の分析結果を図６に示す。ＮＣＢＩのウエブサイトにおける遺伝子データベースとの比較してみると、本分離株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ．：５）はラクトバチルス ロイテリのものと最も類似していることが判明した；そして
【０１０２】
（ｉｉｉ）図７にＲＡＰＤ分析結果を示す。示したように本分離株のＰＣＲ生成物の遺伝子指紋プロファイルはラクトバチルス ロイテリの他の５つの既知菌株、ＢＣＲＣ１４６２５、ＢＣＲＣ １６０９０、ＢＣＲＣ １６０９１、ＢＣＲＣ １７４７６及びＢＣＲＣ １７４７８のものとは異なる。
【０１０３】
上記同定結果を考慮すると、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株はラクトバチルス ロイテリの新規分離株であると考えられる。
【０１０４】
ラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６及びラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９はそれぞれＢｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＣＲＣ）ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＦＩＲＤＩ）（３３１ Ｓｈｉｈ−Ｐｉｎ Ｒｏａｄ，Ｈｓｉｎｃｈｕ ｃｉｔｙ ３００，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ）に２００７年６月１４日及び２００６年１１月１４日にそれぞれ受託番号ＢＣＲＣ ９１０３５５及びＢＣＲＣ ９１０３４０で寄託した。これらの分離株は同様にｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）（Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ，４３００７２，Ｐｅｏｐｌｅ'ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ）に２００７年１１月１９日のブタペスト条約に従って受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３及びＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４でそれぞれ寄託した。
【実施例５】
【０１０５】
実施例５．ラット脾臓単球によるＩＬ−１０分泌を刺激におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株ＧＭＮＬ−７６とＧＭＮＬ−８９及び既知菌株の能力の評価
【０１０６】
単球を刺激してより多くのＩＬ−１０を分泌させる能力はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９に特有な生物活性であることを示すために、これらの分離株と既知の７種の菌株（即ち、ＦＩＲＤＩから購入したラクトバチルス サケイ ＢＩＲＣ １２９３３とＢＣＲＣ １７５００及びラクトバチルス ロイテリ ＢＣＲＣ １４６２５，ＢＣＲＣ １６０９０，ＢＣＲＣ１６０９１，ＢＣＲＣ １７４７６とＢＣＲＣ １７４７８）を以下の実験で比較した。
【０１０７】
材料及び方法：
ＩＬ−１０の濃度の評価は実施例１の項目Ｃで説明した操作手順に基本的に基づいていて、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株であるＧＭＮＬ−７６とＧＭＮＬ−８９及び７種類の既知菌株を、当該実験を実施するのに使用した。こうして得たＯＤ４０５値は、次に標準ＩＬ−１０の異なる既知濃度に対するそれらのＯＤ４０５値をプロットして前もって作成した相関曲線に基づきｐｇ／ｍＬで表す濃度に変換した。各菌株に対する実験は２回繰り返し、実験データは平均±標準偏差で表した。
【０１０８】
結果：
以下の表７はＧＭＮＬ−７６、ＧＭＮＬ−８９及び７種類の既知菌株で刺激されたラット脾臓単球によるＩＬ−１０の分泌結果を示す。
【０１０９】
【表７】
【０１１０】
表７から、試験をした菌株全部のうち本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株ＧＭＮＬ−８９及び既知菌株ＢＣＲＣ １７４７６がラット副腎単球を刺激してＩＬ−１０を分泌させる最高の能力を有しており、ＧＭＮＬ−７６がそれに次いでいることが明らかである。表７で示した実験結果は本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株ＧＭＮＬ−８９及びＧＭＮＬ−７６は同じ種に属する他の既知種とは異なることも示している。
【実施例６】
【０１１１】
実施例６．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９についての酸耐性試験及び胆汁塩酸耐性試験
【０１１２】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９が摂取された後、ヒト消化管の厳しい環境を生き残る能力を試験するために、ヒト消化管における消化プロセスを想定した実験を実施した。
【０１１３】
材料：
１．ＭＲＳブロス（ｐＨ＝３）
ＭＲＳ粉末（ＢＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２８８１３０）５５ｇをＲＯ水１Ｌに溶解して十分撹拌し、次いで１Ｍ ＨＣｌにてｐＨ値を３に調整して、１２１℃で１５分滅菌をした。得られたブロスは冷却したあと、次なる使用まで保存した。
【０１１４】
２．雄牛胆汁０．２％（ｗ／ｖ）を含んでいるＷＲＳブロス培地：
５５ｇのＭＲＳ粉末を１ＬのＲＯ水に溶解して十分に混合することでＭＲＳブロス培地を得た後、１２１℃で１５分間滅菌を行った。当該ＭＲＳブロス培地の温度が約４５℃まで下がったときに、２ｇの雄牛胆汁粉末（Ｓｉｇｍａ）を加えて十分混合すると０．２％（ｗ／ｖ）の雄牛胆汁を含んだＭＲＳブロス培地が得られ、それは次いで０．５μｍの孔を有する紙を用いてろ過した。
【０１１５】
３．ＭＲＳ寒天プレート：
５５ｇのＭＲＳ粉末を１ＬのＲＯ水中に溶解した。ＭＲＳ粉末が完全に溶解した後に１５ｇのアガロース粉末を加えた。こうして形成した混合物は次に１Ｌ血清フラスコに注ぎ、１２１℃で１５分間の滅菌を行った。当該混合物の温度が４５℃まで低下したとき、約１５〜２０ｍＬの混合物を滅菌操作条件下で各ペトリ皿に加えた。得られた混合物を冷却して次の使用のために凝固させた。
【０１１６】
方法：
Ａ．酸耐性試験：
ＭＲＳブロス培地（ｐＨ＝３）の２７ｍＬに実施例１の項目Ａで得た試験細菌溶液３ｍＬを植え付けて、それとともに混合し、次いで３７℃で３時間培養した。そののち、当該培養液の１ｍＬを取り出して滅菌水にて連続的希釈を行い、その後にスプレッドプレート法（１０−９〜１０−１）を行った。そののち、生存する細菌数を計数した。
【０１１７】
Ｂ．胆汁塩耐性試験：
酸耐性試験の終了後、当該培養液の残り２９ｍＬを４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。当該上澄み液を除去し、滅菌水３０ｍＬを加えて細菌を懸濁させた。それに引き続き、４，０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離を行い、上澄み液を除去することで酸性ＭＲＳブロス培地を取除いた。次に、雄牛胆汁０．２％を含有するＭＲＳブロス培地３０ｍＬを用いて当該細菌を分散させ、次いでこうして作成した培養液を３７℃で３時間培養した。そののち、当該培養液１ｍＬを取り出し、滅菌水を用いて連続希釈して、そしてスプレッドプレート法（１０−９〜１０−１）を行った。生存細菌数を計数した。
【０１１８】
結果：
模擬ヒト代謝プロセスを行った後のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９の増殖を以下の表８に示す。
【０１１９】
【表８】
【０１２０】
表８から明らかなように、本発明の２種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株をＭＲＳブロス培地（ｐＨ＝３）で３時間培養した後におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６についての生存細菌計数は処理後で１．８３×１０５ ＣＦＵ／ｍＬである。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−８９に関しては、生存細菌細胞計数は６．８３×１０８ ＣＦＵ／ｍＬである。当該２種類のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株を０．２％の雄牛胆十を含有するＭＲＳブロス培地で３時間追加の培養をした後の生存細菌細胞計数は低下せず、当該Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は０．２％の雄牛胆汁を含有するＭＲＳブロス培地中で優れた生存率を有していたことを示す。当該結果はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ＧＭＮＬ−７６及びＧＭＮＬ−８９はヒト消化管がもたらす環境圧に打ち勝つことができ、摂取後は腸に到達できて住みつけることを示す。
【０１２１】
本明細書で引用した全ての特許及び参照文献はそれらの全容につき明細書にて参考に取り込んである。不一致の場合、定義を含めて本記述が優先するであろう。
【０１２２】
本発明は上記具体的実施形態に準拠して説明したが、多くの修正及び変更が本発明の範囲と精神から逸脱せずにできることは明らかである。そこで本発明は添付請求項で示したもののみに制限されることを意図している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）以下から選ばれる寄託菌株、
（ａ）食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）に受託番号ＢＣＲＣ ９１０３５５で、中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３で寄託したラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６、及び
（ｂ）食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）に受託番号ＢＣＲＣ ９１０３４０で、中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４で寄託したラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９；又は
（ｉｉ）当該寄託菌株（ｉ）の継代培養した後世代、
であることを特徴とする、分離したラクトバチルス菌株。
【請求項２】
請求項１の分離したラクトバチルス菌株を特徴とする、抗炎症性活性を有する医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物が経口投薬形態に製造されることを特徴とする、請求項２の医薬組成物。
【請求項４】
食用材料及び請求項１の分離されたラクトバチルス菌株を特徴とする、食品生産物。
【請求項１】
（ｉ）以下から選ばれる寄託菌株、
（ａ）食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）に受託番号ＢＣＲＣ ９１０３５５で、中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５３で寄託したラクトバチルス サケイ ＧＭＮＬ−７６、及び
（ｂ）食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）の生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）に受託番号ＢＣＲＣ ９１０３４０で、中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）に受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０７１５４で寄託したラクトバチルス ロイテリ ＧＭＮＬ−８９；又は
（ｉｉ）当該寄託菌株（ｉ）の継代培養した後世代、
であることを特徴とする、分離したラクトバチルス菌株。
【請求項２】
請求項１の分離したラクトバチルス菌株を特徴とする、抗炎症性活性を有する医薬組成物。
【請求項３】
前記医薬組成物が経口投薬形態に製造されることを特徴とする、請求項２の医薬組成物。
【請求項４】
食用材料及び請求項１の分離されたラクトバチルス菌株を特徴とする、食品生産物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−２６９９０６（Ｐ２００９−２６９９０６Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−３３１８０９（Ｐ２００８−３３１８０９）
【出願日】平成２０年１２月２６日（２００８．１２．２６）
【出願人】（５０９００２２５７）景岳生物科技股▲分▼有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３１８０９（Ｐ２００８−３３１８０９）
【出願日】平成２０年１２月２６日（２００８．１２．２６）
【出願人】（５０９００２２５７）景岳生物科技股▲分▼有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
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