抗菌性試験用標準試験片、その製造方法及び抗菌性試験方法
【課題】評価のバラツキを従来以上により正確に見定めることのできる抗菌効果評価用標準試験片を提供する。
【解決手段】この抗菌性試験用標準試験片は、基板３と、基板３の一定面積上に形成され、基板３の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層５と、第１結合層５上に単位面積当たりに一定量で配列され、各ステロールに特異的に結合したステロール結合性タンパク質からなる第２結合層７と、各ステロール結合性タンパク質７の分子毎に露出状態で保持された銀９とからなる。基板３は単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつ例えばシリコンウエハである。
【解決手段】この抗菌性試験用標準試験片は、基板３と、基板３の一定面積上に形成され、基板３の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層５と、第１結合層５上に単位面積当たりに一定量で配列され、各ステロールに特異的に結合したステロール結合性タンパク質からなる第２結合層７と、各ステロール結合性タンパク質７の分子毎に露出状態で保持された銀９とからなる。基板３は単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつ例えばシリコンウエハである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性試験用標準試験片、その製造方法及び抗菌性試験方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、特許文献１開示の抗菌性試験用標準試験片が知られている。この抗菌性試験用標準試験片は、基板と、この基板の一定面積上に形成され、基板の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層と、第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列され、各ステロールに特異的に結合したステロール結合性タンパク質からなる第２結合層と、各ステロール結合性タンパク質の分子毎に露出状態で保持された抗菌成分とからなる。
【０００３】
この抗菌性試験用標準試験片では、ステロールの単分子膜からなる第１結合層が基板の一定面積上に形成され、ステロール結合性タンパク質が第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列されている。そして、それらのステロール結合性タンパク質が一定量の抗菌成分を露出状態で保持する。このため、この抗菌性試験用標準試験片では、菌液が一定量の抗菌成分と接触することとなり、この状態で抗菌効果が評価されることとなる。このため、この抗菌性試験用標準試験片は、これ自体が評価のバラツキを生じることがなく、試験片以外による評価のバラツキをより正確に見定めることが可能になる。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１４７０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、評価のバラツキを従来以上により正確に見定めることのできる抗菌効果評価用標準試験片が求められている。
【０００６】
本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであって、評価のバラツキを従来以上により正確に見定めることのできる抗菌効果評価用標準試験片を提供することを解決すべき課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、上記課題解決のために鋭意研究を行ない、単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつ基板を採用することが課題解決のために有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明の抗菌性試験用標準試験片は、基板と、該基板の一定面積上に形成され、該基板の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層と、該第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列され、各該ステロールに特異的に結合したステロール結合性タンパク質からなる第２結合層と、各該ステロール結合性タンパク質の分子毎に露出状態で保持された抗菌成分とからなる抗菌性試験用標準試験片において、
前記基板は単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつものであることを特徴とする。
【０００９】
従来においても、基板は、その表面にコレステロール等のステロールの単分子膜からなる第１結合層が形成されるものであることから、疎水性の表面をもつものであることが好ましいことは明らかであった。このため、従来の抗菌性試験用標準試験片は、表面研磨加工済みのガラス、ポリエチレン、アクリル、ポリビニリデンジフルオライド（Polyvinylidene Difluoride（ＰＶＤＦ））膜、雲母等を基板とすることを意図していた。また、基板の表面が親水性である場合には、表面にシリコーン、フッ素等をコーティングして疎水性にすることとしていた。比較的表面の平滑性に優れた基板であれば足り、表面の平滑性についてはさほどの認識を有していなかったからである。そのため、従来の具体例としては、ＰＶＤＦからなる基板を採用していた。基板の両面にコレステロール、ステロール結合性タンパク質としての一定のコレラ菌溶血毒、抗菌成分としての銀を順に結合させ、抗菌性試験用標準試験片とした。そして、この抗菌性試験用標準試験片の表裏両面で抗菌活性評価と表面分析とを行ったところ、両面ともほぼ同一の抗菌活性があり、表面の元素にも違いが認められなかった。
【００１０】
しかしながら、ＰＶＤＦからなる基板の表面を光学顕微鏡で観察すると、一方の面が平滑であり、他方の面が凹凸を有していることが分かった。この基板を採用した抗菌性試験用標準試験片では、基板における凹凸を有する面側において、銀が１０ｎｍよりさらに深い位置に存在していることが考えられる。また、多孔質のＰＶＤＦからなる基板を採用した場合には、銀が孔内に存在していることも考えられる。これにより、ＰＶＤＦからなる基板を採用した抗菌性試験用標準試験片は、評価のバラツキの抑制に限界の懸念がある。
【００１１】
一方、単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつ基板を採用した場合、保持された銀等の抗菌成分が全て抗菌活性に寄与すると考えられる。平滑性は、単結晶に基づくものであることから、極めて高く、均一であり、かつ安定している。発明者らはこの基板を採用した抗菌性試験用標準試験片において、評価のバラツキの低減を確認した。
【００１２】
したがって、本発明の抗菌性試験用標準試験片によれば、自己以外による評価のバラツキを従来以上により正確に見定めることが可能になる。
【００１３】
本発明の抗菌性試験用標準試験片は本発明の製造方法によって製造することができる。本発明の抗菌性試験用標準試験片の製造方法は、単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつ基板を用意する基板用意工程と、該基板の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層を該基板の一定面積上に形成する第１結合層形成工程と、各該ステロールに特異的に結合するステロール結合性タンパク質を該第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列させる第２結合層形成工程と、各該ステロール結合性タンパク質の分子毎に抗菌成分を露出状態で保持する抗菌成分保持工程とからなることを特徴とする。
【００１４】
基板用意工程では、単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつ基板を用意する。基板としては、シリコンウエハ、石英、平滑な面に加工処理されたガラス等を採用することができる。シリコンウエハや石英からなる基板を採用すれば、量産性も確保することができる。
【００１５】
基板は、表面が親水性の基板本体と、この基板本体の表面に結合された疎水性の単分子膜からなるカップリング層とからなることができる。例えば、基板本体がシリコンウエハである場合、シリコンウエハの表面は酸化によって二酸化ケイ素を有しやすく、この二酸化ケイ素によって親水性となっている。基板本体が石英である場合も同様である。このため、基板本体が親水性の表面を有する場合には、その表面に疎水性の単分子膜からなるカップリング層を形成することが好ましい。カップリング層も単分子膜であることにより、評価のバラツキが低減される。発明者らは、基板本体がシリコンウエハであり、カップリング層がフェニルトリクロロシラン（ＰｈＴＣＳ；Ｃ6Ｈ5ＳｉＣｌ3（分子量２１１．５５））からなる場合に本発明の効果を確認した。
【００１６】
第１結合層形成工程では、基板の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層を基板の一定面積上に形成する。ステロールとしては、コレステロール（colesterol）、ジオスゲニン（diosgenin）、カンペステロール（campesterol）、エルゴステロール（ergosterol）等を採用することができる。これらのステロールにより第１結合層を形成する場合、ステロールをクロロフォルム等の揮発性の高い溶剤に溶解してステロール液とした後、上記疎水性の基板上にステロール液を塗布することができる。
【００１７】
第２結合層形成工程では、各ステロールに特異的に結合するステロール結合性タンパク質を第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列させる。ステロール結合性タンパク質としては、コレラ菌溶血毒等を採用することができる。コレラ菌溶血毒は、細胞毒性があるだけでなく、病原性細菌であるコレラ菌から精製しなければならない。そこで、遺伝子工学的手法を用いてステロール結合活性を有する毒性のないコレラ菌溶血毒を大腸菌を用いて大量に産生させることが必要である。
【００１８】
第１結合層上にステロール結合性タンパク質からなる第２結合層を単位面積当たりに一定量で配列する場合、ステロール結合性タンパク質をリン酸緩衝液あるいはトリス緩衝液に分散させた溶液を調製し、この溶液を第１結合層をもつ基板に薄く塗布することにより、ステロール結合性タンパク質を第１結合層のステロール分子に特異的に結合させ、薄層又は一層のタンパク質の膜を形成させることができる。こうして得られる第２結合層は、アミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基又は特異的な結合能を有する化学物質を表面に位置させていることとなる。
【００１９】
抗菌成分保持工程では、各ステロール結合性タンパク質の分子毎に抗菌成分を露出状態で保持する。この抗菌成分としては、タンパク質と結合性の高い銀、銅等の無機系抗菌剤の他、アルコール系、フェノール系、アルデヒド系、カルボン酸系、エステル系、エーテル系、ニトリル系、過酸化物・エポキシ系、ハロゲン系、ピリジン・キノリン系、トリアジン系、イソチアゾロン系、イミダゾール系、チアゾール系、アニリド系、ビグアナイド系、ジスルフィド系、チオカーバメート系、ペプチドタンパク系、界面活性剤系及び有機金属系等の有機系抗菌剤、有機−無機系ハイブリッド型抗菌剤を採用することができる。
【００２０】
抗菌成分保持工程は、銀等の抗菌成分からなる電極等の電気分解によって第２結合層形成工程後の試験片に抗菌成分を保持することも可能であるが、第２結合層形成工程後の試験片を抗菌成分のイオンを含む水溶液に浸漬することによって行うことが好ましい。作業が簡易でありながら、評価のバラツキを生じ難いからである。発明者らは、抗菌成分のイオンとして、銀イオンを含む水溶液を用いてこの効果を確認した。抗菌成分のイオンとしては、銅イオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン等を採用することが可能である。銀イオンを含む水溶液としては、硝酸銀水溶液、塩化銀水溶液等を採用することができる。
【００２１】
本発明の抗菌性試験方法は本発明の抗菌性試験用標準試験片を用いて行うことを特徴とする。この場合、本発明の抗菌性試験用標準試験自体が評価のバラツキを生じることが従来以上にないため、測定の不確かさが従来よりもさらに明確になり、抗菌効果を正確かつ高い再現性の下で評価することが可能である
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を具体化した実施例を図面を参照しつつ説明する。
（実施例）
【００２３】
（１）基板用意工程
図１に示すように、５（ｃｍ）×５（ｃｍ）×０．０５（ｃｍ）の基板本体１を用意した。この基板本体１はシリコンウエハからなる。シリコンウエハは、図２に示すように、金属ケイ素の単結晶からなる本体１ａと、本体１ａの表面に酸化によって形成された二酸化ケイ素からなる酸化層１ｂとからなる。このため、この基板本体１は表面が親水性である。
【００２４】
ＰｈＴＣＳ溶液を用意し、基板本体１をこのＰｈＴＣＳ溶液に２時間浸漬した。この後、浸漬後の基板本体１をエタノールで洗浄し、さらにトルエンで洗浄し、シリカゲル入りのデシケータ中で乾燥した。図２に示すように、得られた基板３は、基板本体１と、基板本体１の表面に結合されたＰｈＴＣＳの単分子膜からなるカップリング層２とからなる。カップリング層２は、ＰｈＴＣＳの疎水鎖が基板１の逆側に整列している。
【００２５】
（２）第１結合層形成工程
コレステロールを溶剤としてのクロロフォルムに１００〜５００（ｎｍｏｌ／μｌ）の濃度になるように溶解し、ステロール液を作製した。そして、図３に示すように、２０°Ｃの水上にステロール液を落とし、ブレード４、４によりステロール液中のコレステロールを２０Ｎの力で集め、コレステロールの疎水鎖が上を向いた単分子膜を形成した。この水中に基板３を浸漬し、徐々に基板３を引き上げることにより、基板３の表面に単分子膜からなる第１結合層５を形成した。こうして、図４に示す第１基板６とした。この第１基板６をシリカゲル入りのデシケータ中で乾燥した。得られた第１基板６は、基板３と、基板３の表面全体に形成され、基板３の表面に結合したコレステロールの単分子膜からなる第１結合層５とからなる。第１結合層５は、コレステロールの疎水鎖が基板３側に整列している。
【００２６】
（３）第２結合層形成工程
ステロール結合性タンパク質として、コレラ菌溶血毒（ＶＣＨ、分子の質量；６５ｋＤａ）を用いる。遺伝子工学的手法を用いてスチロール結合活性を有する毒性のないＶＣＨ（６５ｋＤａの成熟型コレラ菌溶血毒のアミノ末端側にｐｒｏ領域が結合した分子量７９ｋＤａのｐｒｏ−ＶＣＨ）を大腸菌によって大量に産生させた。
【００２７】
そして、各第１基板６を１０ｍｌのリン酸緩衝液に浸漬し、０．４ｍｇ／ｍｌのステロール結合性タンパク質溶液を９８７．５ｍｌを添加した。この状態で室温下、１時間静かに攪拌した後、１０ｍｌのリン酸緩衝液水溶液及び超純水で振動させながら洗浄した。リン酸緩衝液水溶液による洗浄は、１回３分を２回続けて行った。超純水による洗浄は、１回３分を１回行った。
【００２８】
これにより、図５に示すように、第１基板６の表面の第１結合層２に対し、およそ１０ｎｍ（詳細は不明）の長さのステロール結合性タンパク質を垂直に結合させ、ステロールの濃度に依存したステロール結合性タンパク質の定量的且つ３次元的に均一な配列からなる第２結合層７を第１基板６上に施すことができた。こうして得られる第２結合層７は、アミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基又は特異的な結合能を有する化学物質を表面に位置させていることとなる。こうして、第２基板８とした。得られた第２基板８は、基板３と、基板３の表面全体に形成され、基板３の表面に結合したコレステロールの単分子膜からなる第１結合層５と、第１結合層５上に単位面積当たりに一定量で配列され、各コレステロールに特異的に結合したステロール結合性タンパク質からなる第２結合層７とからなる。
【００２９】
（４）抗菌成分保持工程
濃度１００μＭ又は１０００μＭの硝酸銀水溶液を用意した。各硝酸銀水溶液のｐＨは、約７、約６である。２５°Ｃ、１０ｍｌの各硝酸銀水溶液に第２基板８を浸漬した。攪拌しながら一夜放置し、滅菌した超純水で十分に洗浄した。３０分間真空乾燥した後、デシケータ中で一夜放置した。これにより、第２結合層７の各タンパク質毎にイオン状態の銀９を露出状態で保持した。こうして、実施例の各抗菌性試験用標準試験片を得た。
【００３０】
得られた抗菌性試験用標準試験片により抗菌性試験を行えば、菌液が一定量の銀９と接触することとなり、この状態で抗菌効果が評価されることとなる。このため、抗菌性試験用標準試験自体が評価のバラツキを生じることが従来よりもなくなる。
【００３１】
したがって、これらの抗菌性試験用標準試験片によれば、自己以外による評価のバラツキを従来以上により正確に見定めることが可能になる。このため、抗菌性試験においても、測定の不確かさが従来よりもさらに明確になり、抗菌効果を正確かつ高い再現性の下で評価することが可能である。
【００３２】
（試験１）
硝酸銀水溶液で処理した試験片について、抗菌性の評価を行った。評価は、ＪＩＳ Ｚ ２８０１：２０００に準拠した。大腸菌を各試験片に２４時間接触させた後、コロニー法によって菌数を算出した。供試菌としては大腸菌ＮＢＲＣ３９７２株を用いた。
【００３３】
まず、（ｉ）未処理のシリコンウエハ（基板本体１と同種。試験品１の試験片とする。）、（ｉｉ）ＰｈＴＣＳの単分子膜からなるカップリング層２と、コレステロールの単分子膜からなる第１結合層５とを形成したシリコンウエハ（第１基板６と同様。試験品３の試験片とする。）、（ｉｉｉ）カップリング層２と、第１結合層５と、ステロール結合性タンパク質からなる第２結合層７とを形成したシリコンウエハ（第２基板８と同様。試験品４の試験片とする。）の３種類を使用した。
【００３４】
各試験品１、３、４の試験片に実施例と同様の抗菌成分保持工程を行った。基板本体１と同種である試験品１の試験片に抗菌成分保持工程を行った試験片を試験品１ａの試験片とした。第１基板６と同種である試験品３の試験片に抗菌成分保持工程を行った試験片を試験品３ａの試験片とした。第２基板８と同種である試験品４の試験片に抗菌成分保持工程を行った試験片を試験品４ａの試験片とした。
【００３５】
図６に示すように、１μＭ又は１０μＭの硝酸銀水溶液で処理した試験品１ａ、３ａ、４ａの試験片は、硝酸銀非存在下で作製しただけである試験品１、３、４の試験片とほぼ同数の大腸菌が２４時間培養後の表面から回収された。また、カップリング層２、第１結合層５及び第２結合層７が結合しただけの試験品４の試験片は、菌数がほとんど同じであり、抗菌活性が認められなかった。
【００３６】
しかし、１００μＭの硝酸銀水溶液で処理した試験品１ａ、３ａ、４ａの試験片は、抗菌活性値が６．２９という強い活性を示した。また、１０００μＭの硝酸銀水溶液で処理した試験品１ａ、３ａ、４ａの試験片においては、６．４７の抗菌活性値が示された。
【００３７】
（試験２）
塩化銀の飽和水溶液で処理した試験片について、抗菌性の評価を行った。評価は試験１と同様である。
【００３８】
難溶性である塩化銀の水に対する溶解度は、２０°Ｃで１．５５ｐｐｍである。モル数にして１０．８μＭであるので、１０μＭの硝酸銀水溶液を用いて作製した試験片で抗菌活性がなかったことから考えると、塩化銀の飽和水溶液で処理した試験片が抗菌活性を示すことは期待できない。しかしながら、塩化銀の飽和水溶液はｐＨが中性付近にあり、ステロール結合性タンパク質の構造や活性に及ぼす影響が少ないと考えられたので、塩化銀の飽和水溶液を使用することとした。
【００３９】
２ｇの塩化銀粉末を２００ｍｌの逆浸透水へ入れ、２２°Ｃで２４時間攪拌したものを塩化銀の飽和水溶液として使用した。試験１と同様、試験品１、３、４の各試験片をこの飽和水溶液に２５°Ｃで２４時間浸漬し、試験品１ａ、３ａ、４ａの各試験片を作製した。また、各試験片に吸着した銀が洗浄によってどの程度失われるのかを調べるため、洗浄を１回（弱く洗浄）又は３回（強く洗浄）行った試験片も作製した。
【００４０】
飽和水溶液で処理した試験片の抗菌活性の結果を図７に示した。試験１と同様、試験品１ａの試験片は抗菌活性が認められなかった。しかしながら、カップリング層２及び第１結合層５が結合した試験品３ａの試験片は、洗浄が弱いと、３．８６の抗菌活性値が認められた。これを強く洗浄すると、０．８９という低い抗菌活性値が示された。
【００４１】
一方、カップリング層、第１結合層５及び第２結合層７が結合した試験品４ａの試験片は、洗浄の強弱にかかわらず、抗菌活性値がそれぞれ１．２１と１．２８を示した。このため、銀９のイオンは第１結合層５のコレステロールの単分子膜に吸着しやすい性質があることが示唆された。また、第２結合層７を第１結合層５のコレステロールに結合させることによって、銀９のイオンのコレステロールへの吸着を低減できることが分かった。
【００４２】
（試験３）
シリコンウエハからなる基板本体１上に形成した成分がその基板本体１と結合しているかどうかを確認するため、接触角の測定を行った。試験１、２と同様、カップリング層２を形成したシリコンウエハを試験品２の試験片とし、カップリング層２及び第１結合層５とを形成したシリコンウエハを試験品３の試験片とし、カップリング層２、第１結合層５及び第２結合層７を形成したシリコンウエハを試験品４の試験片とした。また、試験品４の試験片に実施例と同様の抗菌成分保持工程を行ったものを試験品４ａの試験片とした。結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
表１に示されるように、基板本体１にカップリング層２を自己組織化させた試験品２の試験片は、ＰｈＴＣＳが疎水的性質をもつため、接触角が大きくなった。この試験品２の試験片にコレステロールの単分子膜からなる第１結合層５を形成した試験品３の試験片でも、接触角は試験品２の試験片と同程度の値を示した。
【００４５】
第２結合層７を積層した試験品４の試験片は、接触角が小さくなった。これはステロール結合性タンパク質がコレステロールの上に結合し、最表面が親水性になったためであると考えられた。
【００４６】
さらに、銀イオン溶液で処理した試験品４ａの試験片は、ステロール結合性タンパク質よりも、接触角がわずかに大きくなった。これは、試験片の表面全体が銀で覆われたことによるものか、あるいは銀の結合によってタンパク質の高次構造が変化したことによるものであると考えられる。
【００４７】
（試験４）
シリコンウエハを基板本体１とした試験品２、３、４、４ａの試験片について、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により表面構造を観察した。試験品２の試験片についての結果を図８及び図９に示し、試験品３の試験片についての結果を図１０及び図１１に示し、試験品４の試験片についての結果を図１２及び図１３に示す。また、試験品４ａの試験片についての結果を図１４に示す。
【００４８】
試験品４ａの試験片については、図１５に示すように、表面に対して垂直方向に林立している無数のひも状の構造体を画像として捉えることができた。シリコンウエハだけからなる基板本体１、シリコンウエハにカップリング層２と第１結合層５とが結合した試験品３の試験片ではこの構造体が観察されなかった。このため、ひも状の構造体は、第２結合層７である可能性が非常に高いと考えられる。この画像表面をＮＩＨイメージで三次元解析すると、図１５に示すように、ひも状の構造体が基板表面に対して垂直に林立していることが確認できた。
【００４９】
（試験５）
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて試験品１、２、３、４、４ａの試験品の表面構造を観察した。
【００５０】
試験品１〜３までの試験片の表面構造がフラットであるのに対し、試験品４及び試験品４ａは粒子構造が観察された。この粒子は、ＳＥＭ像で観察されたひも状の構造体と第２結合層７であると推測された。
【００５１】
表面粗さＲａは、試験品１の試験品で０．１００±０．００９ｎｍ、試験品２の試験品で０．１４０±０．００４ｎｍ、試験品３の試験品で０．１４９±０．０１９ｎｍ、試験品４の試験品で０．１４９±０．０１９ｎｍ、試験品４ａの試験品で０．３２６±０．０１９ｎｍであり、試験品１〜４までほぼ同じ数値を示した。試験品１の試験品のＲａ値が最も小さく、凹凸が少ないことを示している。また、第２結合層７が結合しているにもかかわらず、Ｒａ値に変化がみられないのは、第２結合層７が同じ方向を向いてほぼ同じ高さで密に集合していることを示唆している。しかしながら、電気分解で生じさせた銀イオン水溶液で試験品４の試験片を処理すると、表面の構造が変化し、Ｒａ値の増大がみられた。これは、銀イオンによって、第２結合層７の構造に影響を与えていると考えられる。また、ＮＩＨイメージを用いた三次元構造解析の結果において、カップリング層２及び第１結合層５を積層した試験片の表面の方がさらに第２結合層７を結合している試験片よりもフラットであることが示された。
【００５２】
（試験６）
シンクロトロン放射Ｘ線（SPring-8、BL39XU）を用い、試験品４ａの試験片について、銀−Ｋ吸収端の蛍光ＸＡＦＳスペクトルを測定した。ＸＡＦＳは、ＸＡＮＥＳ（X-ray absorption near edge structure：X線吸収端近傍構造）と、ＥＸＡＦＳ（Extended X-ray absorption fine structure：広域X線吸収微細構造）とにＸ線エネルギーによって分けることができる。ＸＡＮＥＳは、吸収端近傍に現れる微細構造のことであり、Ｘ線吸収による別準位への（原子内部）電子遷移によって制限される構造である。この分析によって電子状態（価数、近接原子種、化学種の組成等）に関する情報が得られる。一方、ＥＸＡＦＳは、吸収端から数十ｅＶ以上の振動構造のことを指し、Ｘ線吸収により飛び出した光電子の干渉によって現れる。この分析によって、目的原子の周りの局所構造（原子間距離、配位数、モデル構造等）に関する情報が得られる。
【００５３】
ＸＡＦＳの測定条件は以下のとおりである。
照射X線スリット幅：０．０４ｍｍ（Ｈ）×０．２ｍｍ（Ｗ）
入射角：０．１ｍｒａｄ（＝０．００５７°、全反射条件）
検出器：１６素子ＳＳＤ蛍光X線法（薄膜試料、水溶液試料）、透過法（銀箔）
吸収端：銀−Ｋ吸収端
銀薄膜としては、１ｍＭ硝酸銀水溶液を用いた。
【００５４】
カップリング層２及び第１結合層５を積層した試験品３の試験片を電気分解による銀イオン水溶液に浸漬し、作製した試験品３ａの試験片のＸＡＦＳを分析した。図１６は、銀イオン水溶液の濃度を変えて作製した３種類の試験片について、表面のＸＡＦＳ分析によって得られた吸光度のプロットである。
【００５５】
銀イオン水溶液の濃度が増加すると、吸光度のジャンプ量が増大することが分かった。このジャンプ量は試験片の表面の銀存在量に比例すると考えられるので、銀イオン水溶液由来の銀が試験片の表面へ結合していることが推測できた。
【００５６】
さらに、ＸＡＮＥＳの規格化強度プロットを行った。結果を図１７に示す。銀が結合した試験片と銀薄膜とのスペクトルは同じ形であったが、硝酸銀水溶液の波形は異なっていた。この結果はバイオ基板上に結合している銀が金属の状態で存在していることを示唆している。
【００５７】
また、ＸＡＮＥＳのスペクトルをフーリエ変換した。結果を図１８に示す。銀薄膜のスペクトルの２．８Åの位置に現れているピークは、銀−銀間距離、そして硝酸銀水溶液のスペクトルの１．９Åのピークは、銀と水和水の酸素との距離をそれぞれ反映していると考えられた。
【００５８】
５．１１ｍｇ／ｍＬと０．５１ｍｇ／ｍＬとの銀イオン水溶液に浸漬した試験片のスペクトルは、銀−銀間距離に相当する位置にピークが現れているので、銀イオンが還元され、Ａｇ0として基板上に存在していると考えられる。一方、０．０５ｍｇ／ｍＬの銀イオン水溶液に浸漬した試験片のスペクトルは、Ａｇ0とＡｇ+とが試験片上に存在することを示唆している。
【００５９】
このため、試験片上に存在する銀は試験片を浸漬する銀イオン水溶液の濃度に依存し、Ａｇ+又はＡｇ0に変化することが推測できた。
【００６０】
また、塩化銀飽和水溶液を用いた試験片についても、ＸＡＦＳ分析を行い、銀、Ｋ−edge ＸＡＮＥＳスペクトルをフーリエ変換した。結果を図１９に示す。塩化銀飽和水溶液を用いると、銀が結合した試験片を洗浄する強弱（回数）にかかわらず、試験片上にはＡｇ0とＡｇ+とが共存して存在することが推測された。
【００６１】
（まとめ）
かつてＰＶＤＦ膜を支持台とした作製した試験片に一定の抗菌性が認められたが、ＰＶＤＦ膜は、多孔性であり、かつ表面がフラットでないため、表面の微細構造や積層成分の解析ができなかった。このため、新たにシリコンウエハを用いた試験片の検討を行った。シリコンウエハにＰｈＴＣＳの自己組織化単分子膜、コレステロール単分子膜、ＶＣＨ及び銀を積層した試験片を作製し、抗菌活性を評価したところ、６．３の抗菌活性値が認められた。
【００６２】
塩化銀飽和水溶液を用いた試験片の抗菌活性値は０．９から３．９の範囲にあったが、これに比べて硝酸銀水溶液を用いて作製した試験片は６．３という非常に高い抗菌活性値を示した。硝酸銀水溶液の濃度を減らすことによって抗菌活性値が下がるかどうかを最優先課題として検討していく予定である。もし抗菌活性値を下げることができれば、試験片の抗菌活性値は任意にコントロールできる可能性が高いと考えられる。
【００６３】
シリコンウエハ上に積層した成分が結合しているかどうかを定性的に確認するために接触角測定を行った。ＰｈＴＣＳを自己組織化させた試験片は、ＰｈＴＣＳの疎水的性質のために接触角が大きくなっていたが、コレステロール単分子膜を吸着させても接触角に大きな変化はなかった。さらにＶＣＨを結合させると、表面が親水性になり、試験片の接触角が小さくなった。銀イオン溶液で処理し、水で十分洗浄した試験片は、ＶＣＨよりも接触角がわずかに大きくなった。これらの結果は、試験片上にＰｈＴＣＳ、コレステロール、ＶＣＨ及び銀が順に結合していくことを示唆している。
【００６４】
ＰｈＴＣＳ、コレステロール、ＶＣＨ及び銀イオン溶液の順に結合させた試験片の表面の微細構造をＡＦＭとＳＥＭを用いて観察すると、試験片に対して垂直方向に柱状の構造体が多数林立していた。柱状の構造体はコレステロールが結合した試験片にのみ観察されたので、ＶＣＨはコレステロールを介して結合していると考えられた。
【００６５】
極微量の元素分析が可能なシンクロトロン放射Ｘ線を用いて分析した。試験片の表面のＸＡＦＳ（Ｘ線吸収微細構造）スペクトルに明瞭な銀イオンの吸収が現れたので、試験片上に銀が存在することが明らかとなった。ＥＸＡＦＳ領域の振動構造解析によって、銀は主にＡｇ0及びＡｇ+として、試験片上に吸着されていることが示唆された。銀の吸着量と価数とは、試験片の作製条件に依存して変化した。また、銀イオン水溶液の濃度が低い方が吸着量は減少したが、一価の銀の割合が増加する傾向にあった。
【００６６】
以上において、本発明を実施例及び試験１〜６に即して説明したが、本発明は上記実施例等に制限されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して適用できることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は抗菌性試験に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例に係り、基板本体の斜視図である。
【図２】実施例に係り、基板本体の断面及びカップリング層の化学式を示す模式断面図である。
【図３】実施例に係り、基板にカップリング層を形成する工程を示す斜視図である。
【図４】実施例に係り、基板本体の断面並びにカップリング層及び第１結合層の化学式を示す模式断面図である。
【図５】実施例に係り、基板本体の断面、カップリング層及び第１結合層の化学式並びに第２結合層及び銀を示す模式断面図である。
【図６】試験１に係り、硝酸銀水溶液の濃度と生菌数との関係を示すグラフである。
【図７】試験２に係り、洗浄の強度の差と生菌数との関係を示すグラフである。
【図８】試験４に係り、試験品２の試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図９】試験４に係り、試験品２の試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図１０】試験４に係り、試験品３の試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図１１】試験４に係り、試験品３の試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図１２】試験４に係り、試験品４の試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図１３】試験４に係り、試験品４の試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図１４】試験４に係り、試験品４ａの試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図１５】試験４に係り、試験品４ａの試験片の表面を三次元解析したイメージ図である。
【図１６】試験６に係り、銀イオン水溶液の濃度を変えて作製した３種類の試験片についての吸光度を示すグラフである。
【図１７】試験６に係り、ＸＡＮＥＳの規格化強度を示すグラフである。
【図１８】試験６に係り、ＸＡＮＥＳのスペクトルをフーリエ変換した結果を示すグラフである。
【図１９】試験６に係り、ＸＡＦＳ分析後のＸＡＮＥＳのスペクトルをフーリエ変換した結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００６９】
３…基板
１…基板本体
１ａ…本体
１ｂ…酸化層
２…カップリング層
５…第１結合層
７…第２結合層
９…抗菌成分
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性試験用標準試験片、その製造方法及び抗菌性試験方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、特許文献１開示の抗菌性試験用標準試験片が知られている。この抗菌性試験用標準試験片は、基板と、この基板の一定面積上に形成され、基板の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層と、第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列され、各ステロールに特異的に結合したステロール結合性タンパク質からなる第２結合層と、各ステロール結合性タンパク質の分子毎に露出状態で保持された抗菌成分とからなる。
【０００３】
この抗菌性試験用標準試験片では、ステロールの単分子膜からなる第１結合層が基板の一定面積上に形成され、ステロール結合性タンパク質が第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列されている。そして、それらのステロール結合性タンパク質が一定量の抗菌成分を露出状態で保持する。このため、この抗菌性試験用標準試験片では、菌液が一定量の抗菌成分と接触することとなり、この状態で抗菌効果が評価されることとなる。このため、この抗菌性試験用標準試験片は、これ自体が評価のバラツキを生じることがなく、試験片以外による評価のバラツキをより正確に見定めることが可能になる。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−１４７０９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、評価のバラツキを従来以上により正確に見定めることのできる抗菌効果評価用標準試験片が求められている。
【０００６】
本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであって、評価のバラツキを従来以上により正確に見定めることのできる抗菌効果評価用標準試験片を提供することを解決すべき課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、上記課題解決のために鋭意研究を行ない、単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつ基板を採用することが課題解決のために有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明の抗菌性試験用標準試験片は、基板と、該基板の一定面積上に形成され、該基板の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層と、該第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列され、各該ステロールに特異的に結合したステロール結合性タンパク質からなる第２結合層と、各該ステロール結合性タンパク質の分子毎に露出状態で保持された抗菌成分とからなる抗菌性試験用標準試験片において、
前記基板は単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつものであることを特徴とする。
【０００９】
従来においても、基板は、その表面にコレステロール等のステロールの単分子膜からなる第１結合層が形成されるものであることから、疎水性の表面をもつものであることが好ましいことは明らかであった。このため、従来の抗菌性試験用標準試験片は、表面研磨加工済みのガラス、ポリエチレン、アクリル、ポリビニリデンジフルオライド（Polyvinylidene Difluoride（ＰＶＤＦ））膜、雲母等を基板とすることを意図していた。また、基板の表面が親水性である場合には、表面にシリコーン、フッ素等をコーティングして疎水性にすることとしていた。比較的表面の平滑性に優れた基板であれば足り、表面の平滑性についてはさほどの認識を有していなかったからである。そのため、従来の具体例としては、ＰＶＤＦからなる基板を採用していた。基板の両面にコレステロール、ステロール結合性タンパク質としての一定のコレラ菌溶血毒、抗菌成分としての銀を順に結合させ、抗菌性試験用標準試験片とした。そして、この抗菌性試験用標準試験片の表裏両面で抗菌活性評価と表面分析とを行ったところ、両面ともほぼ同一の抗菌活性があり、表面の元素にも違いが認められなかった。
【００１０】
しかしながら、ＰＶＤＦからなる基板の表面を光学顕微鏡で観察すると、一方の面が平滑であり、他方の面が凹凸を有していることが分かった。この基板を採用した抗菌性試験用標準試験片では、基板における凹凸を有する面側において、銀が１０ｎｍよりさらに深い位置に存在していることが考えられる。また、多孔質のＰＶＤＦからなる基板を採用した場合には、銀が孔内に存在していることも考えられる。これにより、ＰＶＤＦからなる基板を採用した抗菌性試験用標準試験片は、評価のバラツキの抑制に限界の懸念がある。
【００１１】
一方、単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつ基板を採用した場合、保持された銀等の抗菌成分が全て抗菌活性に寄与すると考えられる。平滑性は、単結晶に基づくものであることから、極めて高く、均一であり、かつ安定している。発明者らはこの基板を採用した抗菌性試験用標準試験片において、評価のバラツキの低減を確認した。
【００１２】
したがって、本発明の抗菌性試験用標準試験片によれば、自己以外による評価のバラツキを従来以上により正確に見定めることが可能になる。
【００１３】
本発明の抗菌性試験用標準試験片は本発明の製造方法によって製造することができる。本発明の抗菌性試験用標準試験片の製造方法は、単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつ基板を用意する基板用意工程と、該基板の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層を該基板の一定面積上に形成する第１結合層形成工程と、各該ステロールに特異的に結合するステロール結合性タンパク質を該第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列させる第２結合層形成工程と、各該ステロール結合性タンパク質の分子毎に抗菌成分を露出状態で保持する抗菌成分保持工程とからなることを特徴とする。
【００１４】
基板用意工程では、単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつ基板を用意する。基板としては、シリコンウエハ、石英、平滑な面に加工処理されたガラス等を採用することができる。シリコンウエハや石英からなる基板を採用すれば、量産性も確保することができる。
【００１５】
基板は、表面が親水性の基板本体と、この基板本体の表面に結合された疎水性の単分子膜からなるカップリング層とからなることができる。例えば、基板本体がシリコンウエハである場合、シリコンウエハの表面は酸化によって二酸化ケイ素を有しやすく、この二酸化ケイ素によって親水性となっている。基板本体が石英である場合も同様である。このため、基板本体が親水性の表面を有する場合には、その表面に疎水性の単分子膜からなるカップリング層を形成することが好ましい。カップリング層も単分子膜であることにより、評価のバラツキが低減される。発明者らは、基板本体がシリコンウエハであり、カップリング層がフェニルトリクロロシラン（ＰｈＴＣＳ；Ｃ6Ｈ5ＳｉＣｌ3（分子量２１１．５５））からなる場合に本発明の効果を確認した。
【００１６】
第１結合層形成工程では、基板の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層を基板の一定面積上に形成する。ステロールとしては、コレステロール（colesterol）、ジオスゲニン（diosgenin）、カンペステロール（campesterol）、エルゴステロール（ergosterol）等を採用することができる。これらのステロールにより第１結合層を形成する場合、ステロールをクロロフォルム等の揮発性の高い溶剤に溶解してステロール液とした後、上記疎水性の基板上にステロール液を塗布することができる。
【００１７】
第２結合層形成工程では、各ステロールに特異的に結合するステロール結合性タンパク質を第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列させる。ステロール結合性タンパク質としては、コレラ菌溶血毒等を採用することができる。コレラ菌溶血毒は、細胞毒性があるだけでなく、病原性細菌であるコレラ菌から精製しなければならない。そこで、遺伝子工学的手法を用いてステロール結合活性を有する毒性のないコレラ菌溶血毒を大腸菌を用いて大量に産生させることが必要である。
【００１８】
第１結合層上にステロール結合性タンパク質からなる第２結合層を単位面積当たりに一定量で配列する場合、ステロール結合性タンパク質をリン酸緩衝液あるいはトリス緩衝液に分散させた溶液を調製し、この溶液を第１結合層をもつ基板に薄く塗布することにより、ステロール結合性タンパク質を第１結合層のステロール分子に特異的に結合させ、薄層又は一層のタンパク質の膜を形成させることができる。こうして得られる第２結合層は、アミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基又は特異的な結合能を有する化学物質を表面に位置させていることとなる。
【００１９】
抗菌成分保持工程では、各ステロール結合性タンパク質の分子毎に抗菌成分を露出状態で保持する。この抗菌成分としては、タンパク質と結合性の高い銀、銅等の無機系抗菌剤の他、アルコール系、フェノール系、アルデヒド系、カルボン酸系、エステル系、エーテル系、ニトリル系、過酸化物・エポキシ系、ハロゲン系、ピリジン・キノリン系、トリアジン系、イソチアゾロン系、イミダゾール系、チアゾール系、アニリド系、ビグアナイド系、ジスルフィド系、チオカーバメート系、ペプチドタンパク系、界面活性剤系及び有機金属系等の有機系抗菌剤、有機−無機系ハイブリッド型抗菌剤を採用することができる。
【００２０】
抗菌成分保持工程は、銀等の抗菌成分からなる電極等の電気分解によって第２結合層形成工程後の試験片に抗菌成分を保持することも可能であるが、第２結合層形成工程後の試験片を抗菌成分のイオンを含む水溶液に浸漬することによって行うことが好ましい。作業が簡易でありながら、評価のバラツキを生じ難いからである。発明者らは、抗菌成分のイオンとして、銀イオンを含む水溶液を用いてこの効果を確認した。抗菌成分のイオンとしては、銅イオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン等を採用することが可能である。銀イオンを含む水溶液としては、硝酸銀水溶液、塩化銀水溶液等を採用することができる。
【００２１】
本発明の抗菌性試験方法は本発明の抗菌性試験用標準試験片を用いて行うことを特徴とする。この場合、本発明の抗菌性試験用標準試験自体が評価のバラツキを生じることが従来以上にないため、測定の不確かさが従来よりもさらに明確になり、抗菌効果を正確かつ高い再現性の下で評価することが可能である
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を具体化した実施例を図面を参照しつつ説明する。
（実施例）
【００２３】
（１）基板用意工程
図１に示すように、５（ｃｍ）×５（ｃｍ）×０．０５（ｃｍ）の基板本体１を用意した。この基板本体１はシリコンウエハからなる。シリコンウエハは、図２に示すように、金属ケイ素の単結晶からなる本体１ａと、本体１ａの表面に酸化によって形成された二酸化ケイ素からなる酸化層１ｂとからなる。このため、この基板本体１は表面が親水性である。
【００２４】
ＰｈＴＣＳ溶液を用意し、基板本体１をこのＰｈＴＣＳ溶液に２時間浸漬した。この後、浸漬後の基板本体１をエタノールで洗浄し、さらにトルエンで洗浄し、シリカゲル入りのデシケータ中で乾燥した。図２に示すように、得られた基板３は、基板本体１と、基板本体１の表面に結合されたＰｈＴＣＳの単分子膜からなるカップリング層２とからなる。カップリング層２は、ＰｈＴＣＳの疎水鎖が基板１の逆側に整列している。
【００２５】
（２）第１結合層形成工程
コレステロールを溶剤としてのクロロフォルムに１００〜５００（ｎｍｏｌ／μｌ）の濃度になるように溶解し、ステロール液を作製した。そして、図３に示すように、２０°Ｃの水上にステロール液を落とし、ブレード４、４によりステロール液中のコレステロールを２０Ｎの力で集め、コレステロールの疎水鎖が上を向いた単分子膜を形成した。この水中に基板３を浸漬し、徐々に基板３を引き上げることにより、基板３の表面に単分子膜からなる第１結合層５を形成した。こうして、図４に示す第１基板６とした。この第１基板６をシリカゲル入りのデシケータ中で乾燥した。得られた第１基板６は、基板３と、基板３の表面全体に形成され、基板３の表面に結合したコレステロールの単分子膜からなる第１結合層５とからなる。第１結合層５は、コレステロールの疎水鎖が基板３側に整列している。
【００２６】
（３）第２結合層形成工程
ステロール結合性タンパク質として、コレラ菌溶血毒（ＶＣＨ、分子の質量；６５ｋＤａ）を用いる。遺伝子工学的手法を用いてスチロール結合活性を有する毒性のないＶＣＨ（６５ｋＤａの成熟型コレラ菌溶血毒のアミノ末端側にｐｒｏ領域が結合した分子量７９ｋＤａのｐｒｏ−ＶＣＨ）を大腸菌によって大量に産生させた。
【００２７】
そして、各第１基板６を１０ｍｌのリン酸緩衝液に浸漬し、０．４ｍｇ／ｍｌのステロール結合性タンパク質溶液を９８７．５ｍｌを添加した。この状態で室温下、１時間静かに攪拌した後、１０ｍｌのリン酸緩衝液水溶液及び超純水で振動させながら洗浄した。リン酸緩衝液水溶液による洗浄は、１回３分を２回続けて行った。超純水による洗浄は、１回３分を１回行った。
【００２８】
これにより、図５に示すように、第１基板６の表面の第１結合層２に対し、およそ１０ｎｍ（詳細は不明）の長さのステロール結合性タンパク質を垂直に結合させ、ステロールの濃度に依存したステロール結合性タンパク質の定量的且つ３次元的に均一な配列からなる第２結合層７を第１基板６上に施すことができた。こうして得られる第２結合層７は、アミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基又は特異的な結合能を有する化学物質を表面に位置させていることとなる。こうして、第２基板８とした。得られた第２基板８は、基板３と、基板３の表面全体に形成され、基板３の表面に結合したコレステロールの単分子膜からなる第１結合層５と、第１結合層５上に単位面積当たりに一定量で配列され、各コレステロールに特異的に結合したステロール結合性タンパク質からなる第２結合層７とからなる。
【００２９】
（４）抗菌成分保持工程
濃度１００μＭ又は１０００μＭの硝酸銀水溶液を用意した。各硝酸銀水溶液のｐＨは、約７、約６である。２５°Ｃ、１０ｍｌの各硝酸銀水溶液に第２基板８を浸漬した。攪拌しながら一夜放置し、滅菌した超純水で十分に洗浄した。３０分間真空乾燥した後、デシケータ中で一夜放置した。これにより、第２結合層７の各タンパク質毎にイオン状態の銀９を露出状態で保持した。こうして、実施例の各抗菌性試験用標準試験片を得た。
【００３０】
得られた抗菌性試験用標準試験片により抗菌性試験を行えば、菌液が一定量の銀９と接触することとなり、この状態で抗菌効果が評価されることとなる。このため、抗菌性試験用標準試験自体が評価のバラツキを生じることが従来よりもなくなる。
【００３１】
したがって、これらの抗菌性試験用標準試験片によれば、自己以外による評価のバラツキを従来以上により正確に見定めることが可能になる。このため、抗菌性試験においても、測定の不確かさが従来よりもさらに明確になり、抗菌効果を正確かつ高い再現性の下で評価することが可能である。
【００３２】
（試験１）
硝酸銀水溶液で処理した試験片について、抗菌性の評価を行った。評価は、ＪＩＳ Ｚ ２８０１：２０００に準拠した。大腸菌を各試験片に２４時間接触させた後、コロニー法によって菌数を算出した。供試菌としては大腸菌ＮＢＲＣ３９７２株を用いた。
【００３３】
まず、（ｉ）未処理のシリコンウエハ（基板本体１と同種。試験品１の試験片とする。）、（ｉｉ）ＰｈＴＣＳの単分子膜からなるカップリング層２と、コレステロールの単分子膜からなる第１結合層５とを形成したシリコンウエハ（第１基板６と同様。試験品３の試験片とする。）、（ｉｉｉ）カップリング層２と、第１結合層５と、ステロール結合性タンパク質からなる第２結合層７とを形成したシリコンウエハ（第２基板８と同様。試験品４の試験片とする。）の３種類を使用した。
【００３４】
各試験品１、３、４の試験片に実施例と同様の抗菌成分保持工程を行った。基板本体１と同種である試験品１の試験片に抗菌成分保持工程を行った試験片を試験品１ａの試験片とした。第１基板６と同種である試験品３の試験片に抗菌成分保持工程を行った試験片を試験品３ａの試験片とした。第２基板８と同種である試験品４の試験片に抗菌成分保持工程を行った試験片を試験品４ａの試験片とした。
【００３５】
図６に示すように、１μＭ又は１０μＭの硝酸銀水溶液で処理した試験品１ａ、３ａ、４ａの試験片は、硝酸銀非存在下で作製しただけである試験品１、３、４の試験片とほぼ同数の大腸菌が２４時間培養後の表面から回収された。また、カップリング層２、第１結合層５及び第２結合層７が結合しただけの試験品４の試験片は、菌数がほとんど同じであり、抗菌活性が認められなかった。
【００３６】
しかし、１００μＭの硝酸銀水溶液で処理した試験品１ａ、３ａ、４ａの試験片は、抗菌活性値が６．２９という強い活性を示した。また、１０００μＭの硝酸銀水溶液で処理した試験品１ａ、３ａ、４ａの試験片においては、６．４７の抗菌活性値が示された。
【００３７】
（試験２）
塩化銀の飽和水溶液で処理した試験片について、抗菌性の評価を行った。評価は試験１と同様である。
【００３８】
難溶性である塩化銀の水に対する溶解度は、２０°Ｃで１．５５ｐｐｍである。モル数にして１０．８μＭであるので、１０μＭの硝酸銀水溶液を用いて作製した試験片で抗菌活性がなかったことから考えると、塩化銀の飽和水溶液で処理した試験片が抗菌活性を示すことは期待できない。しかしながら、塩化銀の飽和水溶液はｐＨが中性付近にあり、ステロール結合性タンパク質の構造や活性に及ぼす影響が少ないと考えられたので、塩化銀の飽和水溶液を使用することとした。
【００３９】
２ｇの塩化銀粉末を２００ｍｌの逆浸透水へ入れ、２２°Ｃで２４時間攪拌したものを塩化銀の飽和水溶液として使用した。試験１と同様、試験品１、３、４の各試験片をこの飽和水溶液に２５°Ｃで２４時間浸漬し、試験品１ａ、３ａ、４ａの各試験片を作製した。また、各試験片に吸着した銀が洗浄によってどの程度失われるのかを調べるため、洗浄を１回（弱く洗浄）又は３回（強く洗浄）行った試験片も作製した。
【００４０】
飽和水溶液で処理した試験片の抗菌活性の結果を図７に示した。試験１と同様、試験品１ａの試験片は抗菌活性が認められなかった。しかしながら、カップリング層２及び第１結合層５が結合した試験品３ａの試験片は、洗浄が弱いと、３．８６の抗菌活性値が認められた。これを強く洗浄すると、０．８９という低い抗菌活性値が示された。
【００４１】
一方、カップリング層、第１結合層５及び第２結合層７が結合した試験品４ａの試験片は、洗浄の強弱にかかわらず、抗菌活性値がそれぞれ１．２１と１．２８を示した。このため、銀９のイオンは第１結合層５のコレステロールの単分子膜に吸着しやすい性質があることが示唆された。また、第２結合層７を第１結合層５のコレステロールに結合させることによって、銀９のイオンのコレステロールへの吸着を低減できることが分かった。
【００４２】
（試験３）
シリコンウエハからなる基板本体１上に形成した成分がその基板本体１と結合しているかどうかを確認するため、接触角の測定を行った。試験１、２と同様、カップリング層２を形成したシリコンウエハを試験品２の試験片とし、カップリング層２及び第１結合層５とを形成したシリコンウエハを試験品３の試験片とし、カップリング層２、第１結合層５及び第２結合層７を形成したシリコンウエハを試験品４の試験片とした。また、試験品４の試験片に実施例と同様の抗菌成分保持工程を行ったものを試験品４ａの試験片とした。結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
表１に示されるように、基板本体１にカップリング層２を自己組織化させた試験品２の試験片は、ＰｈＴＣＳが疎水的性質をもつため、接触角が大きくなった。この試験品２の試験片にコレステロールの単分子膜からなる第１結合層５を形成した試験品３の試験片でも、接触角は試験品２の試験片と同程度の値を示した。
【００４５】
第２結合層７を積層した試験品４の試験片は、接触角が小さくなった。これはステロール結合性タンパク質がコレステロールの上に結合し、最表面が親水性になったためであると考えられた。
【００４６】
さらに、銀イオン溶液で処理した試験品４ａの試験片は、ステロール結合性タンパク質よりも、接触角がわずかに大きくなった。これは、試験片の表面全体が銀で覆われたことによるものか、あるいは銀の結合によってタンパク質の高次構造が変化したことによるものであると考えられる。
【００４７】
（試験４）
シリコンウエハを基板本体１とした試験品２、３、４、４ａの試験片について、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により表面構造を観察した。試験品２の試験片についての結果を図８及び図９に示し、試験品３の試験片についての結果を図１０及び図１１に示し、試験品４の試験片についての結果を図１２及び図１３に示す。また、試験品４ａの試験片についての結果を図１４に示す。
【００４８】
試験品４ａの試験片については、図１５に示すように、表面に対して垂直方向に林立している無数のひも状の構造体を画像として捉えることができた。シリコンウエハだけからなる基板本体１、シリコンウエハにカップリング層２と第１結合層５とが結合した試験品３の試験片ではこの構造体が観察されなかった。このため、ひも状の構造体は、第２結合層７である可能性が非常に高いと考えられる。この画像表面をＮＩＨイメージで三次元解析すると、図１５に示すように、ひも状の構造体が基板表面に対して垂直に林立していることが確認できた。
【００４９】
（試験５）
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を用いて試験品１、２、３、４、４ａの試験品の表面構造を観察した。
【００５０】
試験品１〜３までの試験片の表面構造がフラットであるのに対し、試験品４及び試験品４ａは粒子構造が観察された。この粒子は、ＳＥＭ像で観察されたひも状の構造体と第２結合層７であると推測された。
【００５１】
表面粗さＲａは、試験品１の試験品で０．１００±０．００９ｎｍ、試験品２の試験品で０．１４０±０．００４ｎｍ、試験品３の試験品で０．１４９±０．０１９ｎｍ、試験品４の試験品で０．１４９±０．０１９ｎｍ、試験品４ａの試験品で０．３２６±０．０１９ｎｍであり、試験品１〜４までほぼ同じ数値を示した。試験品１の試験品のＲａ値が最も小さく、凹凸が少ないことを示している。また、第２結合層７が結合しているにもかかわらず、Ｒａ値に変化がみられないのは、第２結合層７が同じ方向を向いてほぼ同じ高さで密に集合していることを示唆している。しかしながら、電気分解で生じさせた銀イオン水溶液で試験品４の試験片を処理すると、表面の構造が変化し、Ｒａ値の増大がみられた。これは、銀イオンによって、第２結合層７の構造に影響を与えていると考えられる。また、ＮＩＨイメージを用いた三次元構造解析の結果において、カップリング層２及び第１結合層５を積層した試験片の表面の方がさらに第２結合層７を結合している試験片よりもフラットであることが示された。
【００５２】
（試験６）
シンクロトロン放射Ｘ線（SPring-8、BL39XU）を用い、試験品４ａの試験片について、銀−Ｋ吸収端の蛍光ＸＡＦＳスペクトルを測定した。ＸＡＦＳは、ＸＡＮＥＳ（X-ray absorption near edge structure：X線吸収端近傍構造）と、ＥＸＡＦＳ（Extended X-ray absorption fine structure：広域X線吸収微細構造）とにＸ線エネルギーによって分けることができる。ＸＡＮＥＳは、吸収端近傍に現れる微細構造のことであり、Ｘ線吸収による別準位への（原子内部）電子遷移によって制限される構造である。この分析によって電子状態（価数、近接原子種、化学種の組成等）に関する情報が得られる。一方、ＥＸＡＦＳは、吸収端から数十ｅＶ以上の振動構造のことを指し、Ｘ線吸収により飛び出した光電子の干渉によって現れる。この分析によって、目的原子の周りの局所構造（原子間距離、配位数、モデル構造等）に関する情報が得られる。
【００５３】
ＸＡＦＳの測定条件は以下のとおりである。
照射X線スリット幅：０．０４ｍｍ（Ｈ）×０．２ｍｍ（Ｗ）
入射角：０．１ｍｒａｄ（＝０．００５７°、全反射条件）
検出器：１６素子ＳＳＤ蛍光X線法（薄膜試料、水溶液試料）、透過法（銀箔）
吸収端：銀−Ｋ吸収端
銀薄膜としては、１ｍＭ硝酸銀水溶液を用いた。
【００５４】
カップリング層２及び第１結合層５を積層した試験品３の試験片を電気分解による銀イオン水溶液に浸漬し、作製した試験品３ａの試験片のＸＡＦＳを分析した。図１６は、銀イオン水溶液の濃度を変えて作製した３種類の試験片について、表面のＸＡＦＳ分析によって得られた吸光度のプロットである。
【００５５】
銀イオン水溶液の濃度が増加すると、吸光度のジャンプ量が増大することが分かった。このジャンプ量は試験片の表面の銀存在量に比例すると考えられるので、銀イオン水溶液由来の銀が試験片の表面へ結合していることが推測できた。
【００５６】
さらに、ＸＡＮＥＳの規格化強度プロットを行った。結果を図１７に示す。銀が結合した試験片と銀薄膜とのスペクトルは同じ形であったが、硝酸銀水溶液の波形は異なっていた。この結果はバイオ基板上に結合している銀が金属の状態で存在していることを示唆している。
【００５７】
また、ＸＡＮＥＳのスペクトルをフーリエ変換した。結果を図１８に示す。銀薄膜のスペクトルの２．８Åの位置に現れているピークは、銀−銀間距離、そして硝酸銀水溶液のスペクトルの１．９Åのピークは、銀と水和水の酸素との距離をそれぞれ反映していると考えられた。
【００５８】
５．１１ｍｇ／ｍＬと０．５１ｍｇ／ｍＬとの銀イオン水溶液に浸漬した試験片のスペクトルは、銀−銀間距離に相当する位置にピークが現れているので、銀イオンが還元され、Ａｇ0として基板上に存在していると考えられる。一方、０．０５ｍｇ／ｍＬの銀イオン水溶液に浸漬した試験片のスペクトルは、Ａｇ0とＡｇ+とが試験片上に存在することを示唆している。
【００５９】
このため、試験片上に存在する銀は試験片を浸漬する銀イオン水溶液の濃度に依存し、Ａｇ+又はＡｇ0に変化することが推測できた。
【００６０】
また、塩化銀飽和水溶液を用いた試験片についても、ＸＡＦＳ分析を行い、銀、Ｋ−edge ＸＡＮＥＳスペクトルをフーリエ変換した。結果を図１９に示す。塩化銀飽和水溶液を用いると、銀が結合した試験片を洗浄する強弱（回数）にかかわらず、試験片上にはＡｇ0とＡｇ+とが共存して存在することが推測された。
【００６１】
（まとめ）
かつてＰＶＤＦ膜を支持台とした作製した試験片に一定の抗菌性が認められたが、ＰＶＤＦ膜は、多孔性であり、かつ表面がフラットでないため、表面の微細構造や積層成分の解析ができなかった。このため、新たにシリコンウエハを用いた試験片の検討を行った。シリコンウエハにＰｈＴＣＳの自己組織化単分子膜、コレステロール単分子膜、ＶＣＨ及び銀を積層した試験片を作製し、抗菌活性を評価したところ、６．３の抗菌活性値が認められた。
【００６２】
塩化銀飽和水溶液を用いた試験片の抗菌活性値は０．９から３．９の範囲にあったが、これに比べて硝酸銀水溶液を用いて作製した試験片は６．３という非常に高い抗菌活性値を示した。硝酸銀水溶液の濃度を減らすことによって抗菌活性値が下がるかどうかを最優先課題として検討していく予定である。もし抗菌活性値を下げることができれば、試験片の抗菌活性値は任意にコントロールできる可能性が高いと考えられる。
【００６３】
シリコンウエハ上に積層した成分が結合しているかどうかを定性的に確認するために接触角測定を行った。ＰｈＴＣＳを自己組織化させた試験片は、ＰｈＴＣＳの疎水的性質のために接触角が大きくなっていたが、コレステロール単分子膜を吸着させても接触角に大きな変化はなかった。さらにＶＣＨを結合させると、表面が親水性になり、試験片の接触角が小さくなった。銀イオン溶液で処理し、水で十分洗浄した試験片は、ＶＣＨよりも接触角がわずかに大きくなった。これらの結果は、試験片上にＰｈＴＣＳ、コレステロール、ＶＣＨ及び銀が順に結合していくことを示唆している。
【００６４】
ＰｈＴＣＳ、コレステロール、ＶＣＨ及び銀イオン溶液の順に結合させた試験片の表面の微細構造をＡＦＭとＳＥＭを用いて観察すると、試験片に対して垂直方向に柱状の構造体が多数林立していた。柱状の構造体はコレステロールが結合した試験片にのみ観察されたので、ＶＣＨはコレステロールを介して結合していると考えられた。
【００６５】
極微量の元素分析が可能なシンクロトロン放射Ｘ線を用いて分析した。試験片の表面のＸＡＦＳ（Ｘ線吸収微細構造）スペクトルに明瞭な銀イオンの吸収が現れたので、試験片上に銀が存在することが明らかとなった。ＥＸＡＦＳ領域の振動構造解析によって、銀は主にＡｇ0及びＡｇ+として、試験片上に吸着されていることが示唆された。銀の吸着量と価数とは、試験片の作製条件に依存して変化した。また、銀イオン水溶液の濃度が低い方が吸着量は減少したが、一価の銀の割合が増加する傾向にあった。
【００６６】
以上において、本発明を実施例及び試験１〜６に即して説明したが、本発明は上記実施例等に制限されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して適用できることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は抗菌性試験に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例に係り、基板本体の斜視図である。
【図２】実施例に係り、基板本体の断面及びカップリング層の化学式を示す模式断面図である。
【図３】実施例に係り、基板にカップリング層を形成する工程を示す斜視図である。
【図４】実施例に係り、基板本体の断面並びにカップリング層及び第１結合層の化学式を示す模式断面図である。
【図５】実施例に係り、基板本体の断面、カップリング層及び第１結合層の化学式並びに第２結合層及び銀を示す模式断面図である。
【図６】試験１に係り、硝酸銀水溶液の濃度と生菌数との関係を示すグラフである。
【図７】試験２に係り、洗浄の強度の差と生菌数との関係を示すグラフである。
【図８】試験４に係り、試験品２の試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図９】試験４に係り、試験品２の試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図１０】試験４に係り、試験品３の試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図１１】試験４に係り、試験品３の試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図１２】試験４に係り、試験品４の試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図１３】試験４に係り、試験品４の試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図１４】試験４に係り、試験品４ａの試験片の表面を示すＡＦＭの写真である。
【図１５】試験４に係り、試験品４ａの試験片の表面を三次元解析したイメージ図である。
【図１６】試験６に係り、銀イオン水溶液の濃度を変えて作製した３種類の試験片についての吸光度を示すグラフである。
【図１７】試験６に係り、ＸＡＮＥＳの規格化強度を示すグラフである。
【図１８】試験６に係り、ＸＡＮＥＳのスペクトルをフーリエ変換した結果を示すグラフである。
【図１９】試験６に係り、ＸＡＦＳ分析後のＸＡＮＥＳのスペクトルをフーリエ変換した結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００６９】
３…基板
１…基板本体
１ａ…本体
１ｂ…酸化層
２…カップリング層
５…第１結合層
７…第２結合層
９…抗菌成分
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、該基板の一定面積上に形成され、該基板の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層と、該第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列され、各該ステロールに特異的に結合したステロール結合性タンパク質からなる第２結合層と、各該ステロール結合性タンパク質の分子毎に露出状態で保持された抗菌成分とからなる抗菌性試験用標準試験片において、
前記基板は単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつものであることを特徴とする抗菌性試験用標準試験片。
【請求項２】
前記基板は、表面が親水性の基板本体と、該基板本体の表面に結合された疎水性の単分子膜からなるカップリング層とからなる請求項１記載の抗菌性試験用標準試験片。
【請求項３】
前記基板本体はシリコンウエハであり、前記カップリング層はフェニルトリクロロシランからなる請求項２記載の抗菌性試験用標準試験片。
【請求項４】
単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつ基板を用意する基板用意工程と、
該基板の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層を該基板の一定面積上に形成する第１結合層形成工程と、
各該ステロールに特異的に結合するステロール結合性タンパク質を該第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列させる第２結合層形成工程と、
各該ステロール結合性タンパク質の分子毎に抗菌成分を露出状態で保持する抗菌成分保持工程とからなることを特徴とする抗菌性試験用標準試験片の製造方法。
【請求項５】
前記抗菌成分保持工程は、前記第２結合層形成工程後の試験片を前記抗菌成分のイオンを含む水溶液に浸漬することによって行う請求項４記載の抗菌性試験用標準試験片の製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至３のいずれか１項記載の抗菌性試験用標準試験片を用いて行うことを特徴とする抗菌性試験方法。
【請求項１】
基板と、該基板の一定面積上に形成され、該基板の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層と、該第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列され、各該ステロールに特異的に結合したステロール結合性タンパク質からなる第２結合層と、各該ステロール結合性タンパク質の分子毎に露出状態で保持された抗菌成分とからなる抗菌性試験用標準試験片において、
前記基板は単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつものであることを特徴とする抗菌性試験用標準試験片。
【請求項２】
前記基板は、表面が親水性の基板本体と、該基板本体の表面に結合された疎水性の単分子膜からなるカップリング層とからなる請求項１記載の抗菌性試験用標準試験片。
【請求項３】
前記基板本体はシリコンウエハであり、前記カップリング層はフェニルトリクロロシランからなる請求項２記載の抗菌性試験用標準試験片。
【請求項４】
単結晶によって平滑にされた疎水性の表面をもつ基板を用意する基板用意工程と、
該基板の表面に結合したステロールの単分子膜からなる第１結合層を該基板の一定面積上に形成する第１結合層形成工程と、
各該ステロールに特異的に結合するステロール結合性タンパク質を該第１結合層上に単位面積当たりに一定量で配列させる第２結合層形成工程と、
各該ステロール結合性タンパク質の分子毎に抗菌成分を露出状態で保持する抗菌成分保持工程とからなることを特徴とする抗菌性試験用標準試験片の製造方法。
【請求項５】
前記抗菌成分保持工程は、前記第２結合層形成工程後の試験片を前記抗菌成分のイオンを含む水溶液に浸漬することによって行う請求項４記載の抗菌性試験用標準試験片の製造方法。
【請求項６】
請求項１乃至３のいずれか１項記載の抗菌性試験用標準試験片を用いて行うことを特徴とする抗菌性試験方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００７−３１２６８８（Ｐ２００７−３１２６８８Ａ）
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１４６２３９（Ｐ２００６−１４６２３９）
【出願日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（００００００４７９）株式会社ＩＮＡＸ (1,429)
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月２６日（２００６．５．２６）
【出願人】（００００００４７９）株式会社ＩＮＡＸ (1,429)
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]