抗２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸抗体とその応用
【課題】 ２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸に対して反応する抗体及びこれを産生するハイブリドーマ、並びに上記抗体を応用した検出方法及び検出キットを提供すること。
【解決手段】 タンパク質と２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸とを化学的に結合させてなる物質を抗原として哺乳動物を免疫することにより、２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸に対して反応する抗体を産生させること等。独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を提供すること等。
【解決手段】 タンパク質と２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸とを化学的に結合させてなる物質を抗原として哺乳動物を免疫することにより、２−Ｏ脱硫酸化アカラン硫酸に対して反応する抗体を産生させること等。独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を提供すること等。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸抗体とその応用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類中で使用する略号を以下に示す。
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＨＥＰ：ヘパリン
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＥＨＳ−ＨＳ：マウスのエンジェルブレス−ホーム−スワーン腫瘍組織（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ ｓａｒｃｏｍａ）由来のＨＳ
Ｂｉ−ＧＡＧ：ビオチン標識ＧＡＧ
Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体：ビオチン標識ＨＥＰ誘導体
ＧｌｃＮＳ：Ｎ−硫酸化グルコサミン
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＩｄｏＡ：イズロン酸
ＩｄｏＡ（２Ｓ）：２−Ｏ−硫酸化イズロン酸
ＮＡＨ：Ｎ−アセチルヘパロザン
ＡＣＨ：２−Ｏ−脱硫酸化ＡＳ
Ｂｉ−ＡＣＨ：ビオチン標識ＡＣＨ
ＲＡ−ＡＣＨ：還元アミノ化ＡＣＨ
ＰＤＰ−ＡＣＨ：２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＡＣＨ
ＳＨ−ＡＣＨ：チオプロピオニル化ＡＣＨ
ＡＳ：アカラン硫酸
ＮＨ2−ＨＥＰ：Ｎ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＡｃ−ＨＥＰ：Ｎ−アセチル化−ＨＥＰ
２ＤＳＨ；２−Ｏ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＨ2−６ＳＨ：（２−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化ＨＥＰ
６ＳＨ：（２−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
６ＤＳＨ：６−Ｏ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＡｃ−６ＤＳＨ：Ｎ−アセチル化６ＤＳＨ
ＮＳＨ：（２−Ｏ・６−Ｏ）−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＡｃ−ＮＳＨ；N-アセチル化ＮＳＨ
ＮＨ2−２ＳＨ：（６−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化ＨＥＰ
２ＳＨ：（６−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
ＮＨ2−ＣＤＳＨ：完全脱硫酸化ＨＥＰ
ＣＤＳＨ：完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
Ｃｈ；コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＣＳ−Ａ（Ｗ）；クジラ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ａ（Ｓ）；サメ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ｂ；コンドロイチン硫酸Ｂ
ＣＳ−Ｃ；コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳ−Ｄ；コンドロイチン硫酸Ｄ
ＣＳ−Ｅ；コンドロイチン硫酸Ｅ
ＫＳ：ケラタン硫酸
ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＫＬＨ：ヘモシアニン
ＰＤＰ−ＫＬＨ：２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＫＬＨ
ＴＭＢ：テトラメチルベンジジン
ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオン酸
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＬＩＳＡ法：酵素標識抗体測定法
ＡＳは、アフリカマイマイ(学名：Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ)から単離されたＧＡＧの一種として知られている（非特許文献１）。ＡＣＨは公知の方法に従って、ＡＳを化学的に脱硫酸化することによって調製される（非特許文献２）。ＡＳに反応する抗体としては、ＭＷ３Ｇ３が知られている（非特許文献３）。しかしながら、ＡＣＨに反応する抗体は知られていない。
【０００３】
【非特許文献１】ヨン Ｓ．キム（Yeong S. Kim）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、（米国）、１９９６年、第２７１巻、第２０号、ｐ．１１７５０−１１７５５
【非特許文献２】Ｍ．イシハラ（M. Ishihara）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、１９９７年、第１２１巻、第２号、ｐ．３４５−３４９
【非特許文献３】ジェディー Ｂ．テン ダン（Gerdy B. ten Dam）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、（米国）、２００４年、第２７９巻、ｐ．３８３４６−３８３５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＡＣＨに対して反応する抗体及びこれを産生するハイブリドーマ、並びに上記抗体を応用した検出方法及び検出キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を鑑み鋭意検討を重ねた結果、タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として用いることにより、ＡＣＨに対して反応する抗体を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
（１）ＡＣＨに対して反応する抗体（以下、「本発明抗体」という）。
（２）ＡＳに対して実質的に反応しない、上記（１）に記載の抗体。
（３）ＮＡＨに対して実質的に反応しない、上記（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）ブタ腸由来のＨＥＰに対して実質的に反応しない、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の抗体。
（５）ウシ腎臓由来のＨＳに対して実質的に反応しない、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の抗体。
（６）ＥＨＳ−ＨＳに対して実質的に反応しない、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の抗体。
（７）モノクローナル抗体である、上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の抗体。
（８）タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と、哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、上記（７）に記載の抗体。
（９）リンパ球及びミエローマ細胞がマウス由来である、上記（８）に記載の抗体。
（１０）免疫グロブリンクラスがＩｇＭである、上記（１）〜（９）のいずれか１つに記載の抗体。
（１１）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
（１２）タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質であって、ＡＣＨに対して反応する抗体を産生させ得る抗原性を有する物質（以下、「本発明抗原」という）。
（１３）タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマ（以下、「本発明ハイブリドーマ」という）。
（１４）リンパ球及びミエローマ細胞がマウス由来である、上記（１３）に記載のハイブリドーマ。
（１５）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマ。
（１６）上記（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するＡＣＨの検出方法（以下、「本発明ＡＣＨ検出方法」という）。
（１７）試料が、体液、細胞、組織、又は、細胞若しくは微生物の培養物から選択されるものに由来する、上記（１６）に記載の検出方法。
（１８）上記（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の抗体を少なくとも含む、試料中に存在するＡＣＨの検出キット（以下、「本発明ＡＣＨ検出キット」という）。
（１９）試料が、体液、細胞、組織、又は、細胞若しくは微生物の培養物から選択されるものに由来する、上記（１８）に記載の検出キット。
【発明の効果】
【０００６】
本発明抗体は、ＡＣＨに対して反応するため、ＡＣＨの検出に好適に用いることができる。また、本発明抗体は、ＡＣＨの特異的な検出にも応用することができる。また、本発明抗原及び本発明ハイブリドーマを用いることにより、本発明抗体を効率的に産生させることができる。また、本発明ＡＣＨ検出方法により、ＡＣＨを効率的に検出することができる。また、本発明ＡＣＨ検出キットを用いることにより、本発明ＡＣＨ検出方法によるＡＣＨの検出をより効率的且つ簡便に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
＜１＞本発明抗体
本発明抗体は、ＡＣＨに対して反応する抗体である。
【０００８】
ＡＣＨは、Ｎ−アセチルグルコサミンとイズロン酸とからなる二糖（−［ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＡｃ］−）の繰り返し構造を基本糖鎖構造として有する多糖である。ＡＣＨは、アフリカマイマイ(学名:Achatina fulica)を原料としてＡＳを調製し、このＡＳのイズロン酸残基の２位の硫酸基を、公知の方法に従って脱硫酸化することにより調製することができる。より具体的な調製方法としては、後述する実施例１を参照されたい。
【０００９】
上記において「反応」とは、免疫学的反応又は抗原抗体反応を意味し、この反応性は例えば、ＥＬＩＳＡ法、RIA法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法などによって調べることができる。例えば、一定濃度の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行ったときに、抗原の濃度の増加に比例して反応シグナルが増強される場合に、該抗体は該抗原に反応するということができる。ただし本明細書に記載する、抗原に対する本発明抗体の反応性は、特に断りのない場合、後述する実施例５に記載の方法（抗原濃度：0.1 μg/ウェル）により測定される、本発明抗体のＡＣＨに対する反応性を１００％とした場合における、相対的な反応性を意味する。
【００１０】
本発明抗体は、ＡＣＨに対して反応する抗体である限りにおいて特に限定されないが、なかでも、ＡＳに対して実質的に反応しない抗体は好ましく、また、ＮＡＨに対して実質的に反応しない抗体も好ましく、ブタ腸由来のＨＥＰに対して実質的に反応しない抗体も好ましく、ウシ腎臓由来のＨＳに対して実質的に反応しない抗体も好ましく、ＥＨＳ−ＨＳに対して実質的に反応しない抗体も好ましい。このような抗体のなかでも、ＡＣＨに対して反応し、且つＡＳ、ＮＡＨ、ブタ腸由来のＨＥＰ、ウシ腎臓由来のＨＳ及びＥＨＳ−ＨＳのいずれに対しても実質的に反応しない抗体はより好ましい。
【００１１】
また本発明抗体は、下記のＨＥＰ誘導体群から選択される１又は２以上のＨＥＰ誘導体に対して実質的に反応しないことが好ましい；
ＨＥＰ誘導体群；ＮＨ2−ＨＥＰ、ＮＡｃ−ＨＥＰ、６ＤＳＨ、ＮＡｃ−６ＤＳＨ、ＮＨ2−６ＳＨ、ＮＨ2−２ＳＨ、ＮＳＨ、ＮＨ2−ＣＤＳＨ。なかでも、上記のいずれのＨＥＰ誘導体に対しても実質的に反応しないことがより好ましい。
【００１２】
なお、本明細書において、「実質的に反応しない」とは、抗体と抗原との反応性が、後述する実施例５に記載の方法（抗原濃度：0.1 μg/ウェル）で測定を行った場合、反応シグナルを与えないか、極めて弱い反応シグナルしか与えない程度であることを意味するが、本明細書においては、例えば５％程度以下の反応性がある場合についても、反応シグナルを与えない程度であると解されるものとする。
【００１３】
また本発明抗体は、ＣＤＳＨに対して反応することが好ましい。
【００１４】
なお、上記の各種ＧＡＧ及び各種ＨＥＰ誘導体は、後述する実施例に記載の方法により、入手又は調製することができる。
【００１５】
本発明抗体のエピトープは特に限定されないが、イズロン酸ユニット（−［ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＡｃ］−）により構成されることが好ましい。
【００１６】
本発明抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることがより好ましい。また、モノクローナル抗体はそのフラグメントであってもよい。モノクローナル抗体のフラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）2化抗体、Ｆａｂ化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）及びミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）などが挙げられる。
【００１７】
本発明抗体がモノクローナル抗体である場合、本発明抗体は、例えば、タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と、哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマにより産生させることができる。
【００１８】
また本発明抗体がポリクローナル抗体である場合、本発明抗体は、例えば、タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物の血清から得ることができる。
【００１９】
タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質における「タンパク質」としては、例えばＢＳＡ及びＫＬＨが例示されるが、なかでもＫＬＨが好ましい。
【００２０】
また、上記においてタンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させる方法としては、化学的な結合の様式は特に限定されないが、共有結合が好ましく、ジスルフィド結合（以下、「−ＳＳ−」と表記することがある）がより好ましい。ジスルフィド結合により化学的に結合する方法としては、例えば以下の方法を採用することができる。すなわち、ＡＣＨを還元アミノ化し、これと５ｍＭ ＳＰＤＰを反応させて、２−ピリジルジチオプロピニル化ＡＣＨを得る。これをジチオスレイトール等の還元剤で還元し、チオール化ＡＣＨを得る。同様に、タンパク質とＳＰＤＰを反応させ、２−ピリジルジチオプロピニル化タンパク質を得る。次に、チオール化ＡＣＨ溶液と２−ピリジルジチオプロピニル化タンパク質溶液を混合することによって、ＡＣＨとタンパク質との間にジスルフィド結合を生成させ、ＡＣＨ−ＳＳ−タンパク質を得る。
【００２１】
また、上記のリンパ球及びミエローマ細胞の由来は、哺乳動物由来である限りにおいて特に限定されず、哺乳動物としては、例えばブタ、ウシ、マウス、ラット等が例示されるが、なかでもマウスが好ましい。
【００２２】
また、上記において免疫は、例えば上記方法により調製した抗原を哺乳動物に皮下注射することにより行うことができる。注射方法はこれに限らず、腹腔内注射、静脈注射でも良い。通常、免疫は数回に分けて行うが、免疫はアジュバントと共に投与することが好ましい。アジュバンとしては、ミョウバン、結核死菌、核酸、完全フロインドアジュバント、不完全フロイントアジュバント等、アジュバント効果が期待できるもので有れば良いが、特に、ＴｉｔｅｒＭＡＸ Ｇｏｌｄ（シグマ社製）が良い。
【００２３】
また、上記の細胞融合は、例えば、マウスを最終免疫した後に、当該マウスのリンパ節或は脾臓から得られるリンパ球と、ミエローマ細胞等の腫瘍細胞株の細胞（通常、マウスのBALB/c 由来のP3 -NS-1/1-Ag4-1、P3 -X63-Ag8-U1(P3 U1)、P3 -X63-Ag8-653、SP2/0-Ag14 等）を用いて、公知の方法により行うことができる。
【００２４】
また、上記のハイブリドーマは、例えば下記に例示する方法により選択と単クローン化を行うことにより得ることができる。すなわち、ハイブリドーマの増殖の盛んな細胞培養上清から種々の分析法（例えばＲＩＡ法、プラーク法、凝集反応法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法 等）でＡＣＨに対して反応する目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次に、得られたハイブリドーマについてクローニングを行う。クローニングの方法としてはＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ ）もしくは、一般によく用いられる限界希釈法等が挙げられる。例えば、限界希釈法では９６ウェルプレートの１ウェルあたり細胞が１個以下になるように行うことが好ましい。どの方法を用いてもクローニングは２回繰返し行うことが好ましく、単一クローンとすることが好ましい。
【００２５】
このようにして得られた単一クローンを、例えばin vitro で培養する方法、in vivo で培養（腹水化）する方法等により培養することにより、モノクロナール抗体を産生させることができる。また得られた培養液から、例えば塩析、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的一般的手法を適宜組み合わせることにより、上記抗体を分離、精製することができる。
【００２６】
本発明抗体の免疫グロブリンクラスは特に限定されないが、ＩｇＭであることが好ましい。
【００２７】
なお、上記の本発明抗体の一例としては、例えば独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
＜２＞本発明抗原
本発明抗原は、タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質であって、ＡＣＨに対して反応する抗体を産生させ得る抗原性を有する物質である。
【００２８】
上記の「タンパク質」、「ＡＣＨ」なる用語、及びタンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させる方法に関する説明については、上記＜１＞本発明抗体における説明を参照されたい。また、上記の「反応」は、上記＜１＞本発明抗体の場合と同様に、免疫学的反応又は抗原抗体反応を意味する。具体的な説明は上記＜１＞本発明抗体を参照されたい。
【００２９】
また、ＡＣＨに対して反応する抗体を産生させ得る抗原性を有するか否かは、例えば上記＜１＞本発明抗体に記載の方法によりタンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を用いて哺乳動物の免疫化を行い、免疫後の哺乳動物に由来する血清等の試料中に抗体が存在するか否かを、例えばＲＩＡ法、プラーク法、凝集反応法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法等の方法により確認することにより、判断することができる。
【００３０】
上記のＡＣＨに対して反応する抗体は、本発明抗体であることが好ましい。したがって本発明抗原は、本発明抗体を生産する目的で使用することができる。このような場合、例えば＜１＞本発明抗体に記載した免疫において用いる抗原として、本発明抗原を用いることができる。より具体的には、後述する実施例を参照されたい。
＜３＞本発明ハイブリドーマ
本発明ハイブリドーマは、タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマである。
【００３１】
上記の「タンパク質」、「ＡＣＨ」なる用語、及びタンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させる方法、「免疫」、「哺乳動物由来のリンパ球」、「哺乳動物由来のミエローマ細胞」、「細胞融合」、「ハイブリドーマ」に関する説明については、上記＜１＞本発明抗体における説明を参照されたい。
【００３２】
なお、上記のような本発明ハイブリドーマの一例としては、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマが挙げられる。
【００３３】
本発明ハイブリドーマは、本発明抗体（好ましくは、モノクローナル抗体である本発明抗体）を生産する目的で使用することができる。ここで本発明抗体は、例えば本発明ハイブリドーマを、in vitro で培養する方法、in vivo で培養（腹水化）する方法等により培養することにより産生させることができる。より具体的には、後述する実施例を参照されたい。
＜４＞本発明検出方法
以下、本発明検出方法について説明する。
【００３４】
本発明ＡＣＨ検出方法は、本発明抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するＡＣＨの検出方法である。
【００３５】
上記の「試料」とは、ＡＣＨを含むか、含む可能性を有する試料であれば特に限定されないが、試料の由来となるものとしては、例えば尿、血液、血漿、血清、関節液、髄等の体液、分泌物、動物細胞若しくは植物細胞等の細胞、組織、臓器、又は細胞若しくは微生物の培養物（例えば培養上清等を含む）等が例示される。上記において、試料の由来が動物細胞である場合、好ましい動物細胞の一例としてはプルキンエ細胞が例示される。また試料の由来が組織である場合、好ましい組織の一例としては小脳が例示される。また、上記「由来」とは、上記に例示したものに由来する精製物、抽出物、標本等であってもよく、そのもの自体であってもよいことを意味する。
【００３６】
本発明ＡＣＨ検出方法において、試料中に存在するＡＣＨの検出における具体的方法としては、例えば組織標本を試料として用いる場合は通常の免疫組織染色法などを用いることができ、例えば体液又は培養上清等を試料として用いる場合はＥＬＩＳＡ法、RIA法、サンドイッチ法、競合法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロッティング法などを用いることができる。
【００３７】
上記のサンドイッチ法においては、例えば本発明抗体をプレート等に例示される固相に固着させて１次抗体として用いても良く、また、本発明抗体を標識して２次抗体として用いても良い。
【００３８】
本発明ＡＣＨ検出方法によれば、本発明の抗体の反応の反応性を利用することにより、試料中に存在するＡＣＨを好適に検出することができる。さらに本発明ＡＣＨ検出方法は、＜１＞本発明抗体で述べた本発明抗体の各種抗原に対する特異的な反応性を利用することにより、ＡＣＨの特異的な検出に応用することができる。
【００３９】
本発明ＡＣＨ検出方法における検出は、定量的な検出であってもよく、定性的な検出であってもよい。定量的な検出である場合、試料中に存在するＡＣＨ濃度は、例えば予め既知濃度のＡＣＨ標準液を用いてＡＣＨ濃度と検出結果との関係について検量線を作成し、ＡＣＨ濃度が未知の試料についての検出結果と前記検量線とを照らし合わせることにより行うことができる。
【００４０】
また、本発明検出方法は、本発明抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在する本発明抗体が反応する物質の検出方法を提供する。
【００４１】
上記において、「試料」、検出における具体的方法、検出の種類等についての説明については、上記の本発明ＡＣＨ検出方法における説明を参照されたい。また、上記「反応」は、免疫学的反応又は抗原抗体反応を意味するが、より具体的な説明については＜１＞本発明抗体における説明を参照されたい。
＜５＞本発明検出キット
以下、本発明検出キットについて説明する。
【００４２】
本発明ＡＣＨ検出キットは、本発明抗体を少なくとも含む、試料中に存在するＡＣＨの検出キットである。本発明の検出キットによれば、本発明検出方法をより効率的に、且つ簡便に行うことができる。上記において、「本発明抗体を少なくとも含むキット」としては、例えば本発明抗体そのもの（例えば、溶液に溶解した本発明抗体等も含む）を構成成分として含むキット、本発明抗体を固着させた固相を構成成分として含むキット、酵素等により標識した本発明抗体を構成成分として含むキット等が例示される。また、上記の「試料」なる用語については、上記＜４＞本発明検出方法で説明した通りである。
【００４３】
また本発明ＡＣＨ検出キットの構成成分には、本発明抗体に加えて、例えば１次抗体、2次抗体、反応バッファー、洗浄液、反応基質、ＡＣＨ標準液などを含むものであってもよい。
【００４４】
また、本発明検出キットは、本発明抗体を少なくとも含む、試料中に存在する本発明抗体が反応する物質の検出キットを提供する。
【００４５】
上記において、「本発明抗体を少なくとも含むキット」に関する具体的説明は、上記本発明ＡＣＨ検出キットにおける説明を参照されたい。
【００４６】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
【実施例１】
【００４７】
(参考例１) ＡＳ及びＡＣＨの調製
ＡＳは、ヨン Ｓ．キム（Yeong S. Kim）らの方法（前記の非特許文献１に記載された方法）に従って、アフリカマイマイ（学名：Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ）から調製した。得られたＡＳを原料として、Ｍ．イシハラらの方法（前記の非特許文献２に記載された方法）に記載の方法に従ってＡＣＨを調製した。
(参考例２) ＰＤＰ−ＫＬＨの調製
ＫＬＨへの２−ピリジルジスルフィド構造の導入は、カールソン Ｊ．（Carlsson, Jan）らの方法（バイオケミカル・ジャーナル、１９７８年、第１７３巻、第３号、ｐ．７２３−７３７に記載の方法）に従って行った。
【００４８】
すなわち、0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.5)/0.1M NaClに、終濃度が2.5mg/mlになるようにKLH（シグマ社製） 60mgを溶解した。この溶液に、終濃度が0.238mMになるように5mM ＳＰＤＰ（シグマ社製））エタノール溶液を添加・混合し、30分間室温に保持した。過剰のＳＰＤＰを除去するために蒸留水に対して透析した後に、混合液を凍結乾燥し、ＰＤＰ−ＫＬＨ 59.4mgを得た。
(参考例３) ウロン酸を介したＡＣＨ−ＢＳＡコンジュゲートの調製
ＡＣＨ及びＢＳＡ(バイエル社製)を、それぞれ0.1M ＭＥＳ緩衝液（pH5.5）に、終濃度が10mg/mlになるように溶解し、ＡＣＨ溶液及びBSA溶液を得た。ＡＣＨ溶液 300 μlとBSA溶液 150 μlとを混合し、ＥＤＣ（PIERCE社製） 400 μｇを添加した後、撹拌しながら20時間室温に保持した。得られた反応後の溶液は、蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥し、ウロン酸を介したＡＣＨ−ＢＳＡコンジュゲート 3.5mgを得た。
(参考例４) Ｂｉ−ＧＡＧ及びＢｉ−ＨＥＰ誘導体の調製
ＡＳおよび、ＡＣＨは参考例１で調製したものを使用した。ブタ皮由来のＨＡ（以下、単に「ＨＡ」と記載する）、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ、ウシ腎臓由来のＨＳ（以下、単に「ＨＳ」と記載する）、及びウシ角膜由来のＫＳ（以下、単に「ＫＳ」と記載する））は、生化学工業株式会社製のものを使用した。ＮＡＨは特開2004-18840に記載の方法に従って、大腸菌K5の培養物から調製した。ブタ腸由来のＨＥＰ（以下、実施例において単に「ＨＥＰ」と記載する）は、サイエンティフィックプロテインラボラトリーズ社から購入した。また、ＥＨＳ−ＨＳは、特公平７−５３７５６号公報に記載の方法により調製した。
【００４９】
また、各種ＨＥＰ誘導体（ＮＨ２−ＨＥＰ、ＮＡｃ−ＨＥＰ、６ＤＳＨ、ＮＡｃ−６ＤＳＨ、ＮＨ２−６ＳＨ、６ＳＨ、ＮＨ２−２ＳＨ、２ＳＨ、ＮＳＨ、ＮＡｃ−ＮＳＨ、ＮＨ２−ＣＤＳＨ、ＣＤＳＨ）は、図１に示す方法で、各種脱硫酸化反応及び／又はＮ−アセチル化反応を、単独で、又は組み合わせて用いることにより調製した。図中、ＨＥＰの６−Ｏ、２−Ｏ、およびＮ−脱硫酸化はそれぞれ、高野ら、苅谷ら、Ａｙｏｔｔｅ，Ｌ．らの方法に従った（Ｔａｋａｎｏ，Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．１４，８８５（１９９５），Ｔａｋａｎｏ， Ｒ．ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｌｅｔｔ． ３， ７１（１９９８）， Ｋａｒｉｙａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２３， ２４０（１９９８）， Ａｙｏｔｔｅ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， １４５， ２６７（１９８６））。
【００５０】
また、Ｎ−アセチル化は、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ， Ｉ．らの方法に従った。（Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， ５， ４０７（１９６５））。
【００５１】
高野らの方法に従って６−Ｏ−脱硫酸化を実施すると、副反応として若干のＮ−脱硫酸化も起きるので、得られた６ＤＳＨとＮＳＨの一部はＮ−アセチル化を行い、ＮＡｃ−６ＤＳＨとＮＡｃ−ＮＳＨを調製した。
【００５２】
上記の各種ＧＡＧ及び各種ＨＥＰ誘導体、並びに参考例１で調製したＡＳ及びＡＣＨを、それぞれ終濃度が10mg/mlになるように0.1M ＭＥＳ緩衝液（pH5.5）に溶解し、各種ＧＡＧ溶液及び各種ＨＥＰ誘導体溶液を得た。これらの各種ＧＡＧ溶液及び各種ＨＥＰ誘導体溶液 各 1mlに対して、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業社製）で２０ｍＭに調製したビオチン-LC-ヒドラジド（PIERCE社製）を、それぞれ２５μlずつ添加した。続いて、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で１００ｍｇ／ｍｌに調製したＥＤＣ溶液を１２．５μl添加した。これをよく撹拌した後、室温（１５℃〜２５℃）で２０時間撹拌して反応させた。反応終了後の反応物を、透析膜としてCellu Sep H1（フナコシ社製、カットオフ；分子量１，０００以下）を、透析液としてダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（pH7.2〜7.5、カルシウムイオン等の2価イオン不含：以下、「ＰＢＳ（−）」という）をそれぞれ用いて透析に付し、遊離のビオチンを充分に除去し、各種Ｂｉ−ＧＡＧ及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体を得た。透析終了後、Ｂｉ−ＧＡＧ濃度又はＢｉ−ＨＥＰ誘導体をそれぞれ５ｍｇ／ｍｌ に調整し、凍結保存した。
(参考例５) ストレプトアビジン固相化マイクロプレートの作製
ストレプトアビジン（Vector社製）をＰＢＳ（−）で２０μｇ／ｍｌに希釈し、マキシソープ（登録商標） ９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェルに５０μｌずつ加えた。このプレートを18時間、４℃で保存することにより、ストレプトアビジンをプレート上に均一に固相化した後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。続いて、ブロッキング剤としてApplieDuo（登録商標、生化学工業株式会社製）を用い、以下の方法によりストレプトアビジンでコーティングされていない部分をブロッキングした。すなわち、防腐剤として０．０５％プロクリン３００（登録商標、SUPELCO社製）を含むリン酸緩衝液（pH7.2〜7.5：以下、「ＰＢ」という）を用いて、ApplieDuo（登録商標）の５倍希釈液（以下、「ブロッキング液」という）を調製し、これを各ウェルに２５０μｌずつ加え、室温で2時間静置した。静置後、ブロッキング液を充分に除去し、３７℃で２時間乾燥させることにより、所望するストレプトアビジン固相化マイクロプレートを得た。得られたプレートは乾燥剤とともにアルミラミネート袋に封入し、冷蔵保存した。
(参考例６) 各種ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートの作製
１） ＡＣＨ固相化マイクロプレートの作製
参考例３で調製したＡＣＨ-ＢＳＡコンジュゲート (50 ng)を、マキシソープ（登録商標） ９６ウェルマイクロプレートに添加し、18時間、4℃に保持した後、防腐剤として０．０５％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で4倍希釈したブロックエース(登録商標、大日本製薬社製)を用いてブロッキングした。１時間、室温で静置した後、所望のＡＣＨ固相化マイクロプレートを得た。このＡＣＨ固相化マイクロプレートは、後述する実施例３において血清中の抗体価の検証のために使用した。
２） 各種Ｂｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートの作製
上記参考例４に記載の各種Ｂｉ−ＧＡＧ及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体を、終濃度が1 μg/mlになるように、０．０５％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍希釈したApplieDuo（登録商標）溶液に溶解した（以下この溶液を、「各種Ｂｉ−ＧＡＧ溶液」及び「各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体溶液」という）。参考例５で作製したストレプトアビジン固相化マイクロプレートの各ウェルを、300 μlの０．０５％プロクリン300（登録商標）及び０．０５％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ（−）（以下、「洗浄緩衝液」と言う）で4回洗浄した。各種Ｂｉ−ＧＡＧ溶液及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体溶液をそれぞれ100 μlずつ各ウェルに分注し、室温で30分間静置したのち、各ウェルを洗浄緩衝液で4回洗浄することにより、所望の各種Ｂｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートを得た。これらのプレートは、後述する実施例３におけるクローニング、及び後述する実施例５における反応性試験において使用した。
【実施例２】
【００５３】
ＡＣＨ抗原の調製
【００５４】
１） ＲＡ−ＡＣＨの調製
実施例１の参考例１で調製したＡＣＨ ４．５ｍｇを、２Ｍ 塩化アンモニウム水溶液 １６０μｌに溶解した。この溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム１２ｍｇを添加し、７０℃で２日間、還元アミノ化反応を行った。反応後の溶液に、シアノ水素ホウ素ナトリウム ５ｍｇを添加し、さらに２日間、上記と同一の条件で反応を行った。反応後の溶液を氷浴中で冷却した後、酢酸 ３２μｌを添加して反応を完全に停止させた。２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法により、ＲＡ−ＡＣＨを回収した。得られた沈殿を、エタノール洗浄した後に凍結乾燥し、ＲＡ−ＡＣＨの凍結乾燥物 ２．１ｍｇを得た。
２） ＰＤＰ−ＡＣＨの調製
上記１）で調製したＲＡ−ＡＣＨ ２．１ｍｇを、０．１Ｍ食塩/０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５） １ｍｌに溶解した。この溶液に５ｍＭ ＳＰＤＰエタノール溶液 ８０μlを添加した後、室温にて一晩静置し、２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化反応（ＰＤＰ反応）を行った。過剰のＳＰＤＰを除くために蒸留水を用いて透析を行った後、凍結乾燥し、ＰＤＰ−ＡＣＨの凍結乾燥物 １．７ｍｇを得た。
３） ＳＨ−ＡＣＨの調製
上記２）で調製したＰＤＰ−ＡＣＨ 1.7ｍｇを、０．１Ｍ食塩/０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５） １６０μｌに溶解した。この溶液に、終濃度が２５ｍＭになるようにジチオスレイトールを添加し、６０分間室温にて還元反応を行った。２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法でＳＨ−ＡＣＨを回収した。得られた沈殿を、エタノール洗浄した後に凍結乾燥し、ＳＨ−ＡＣＨの凍結乾燥物 １．３ｍｇを得た。
４） ジスルフィド結合を介したＡＣＨ−ＫＬＨコンジュゲートの調製
上記３）で調製したＳＨ−ＡＣＨ １．３ｍｇ及び参考例２で調製したＰＤＰ−ＫＬＨ ０．６５ｍｇを、０．１Ｍ食塩/０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５） １ｍｌに溶解し、２時間室温にてコンジュゲーション反応を行った。反応中に生成されるピリジル−２−チオンを除くため、上記反応後の溶液を、蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥し、ＡＣＨ−ＫＬＨコンジュゲートの凍結乾燥物１．５ｍｇを得た。得られた凍結乾燥物は、後述する実施例３において、ＡＣＨ抗原として用いた。
【実施例３】
【００５５】
ＡＣＨに対して反応する抗体を生産するハイブリドーマ細胞株の樹立
【００５６】
１） マウスの免疫化
上記実施例２の４）で得られたＡＣＨ抗原 1 mgを少量の蒸留水に溶解し、これをTiterMAX Gold（登録商標、シグマ社製）2mlと混合し、抗原溶液を調製した。また、免疫する動物としては、4匹のBALB/Cマウス(6週齢のメス、日本チャールズリバー社製)を用いた。上記の抗原溶液 100μｌ/匹を、2週間毎に2又は3回皮下投与した。血清の抗体価が充分な値に達した時、最終免疫として、アジュバントを含まないＡＣＨ抗原溶液 100μｌ/匹を投与した。最終免疫から３日後、免疫したマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。
【００５７】
なお、上記において、血清中の抗体価の検証は、以下の方法により行った。すなわち、参考例６ １）で作製したＡＣＨ固相化マイクロプレート及びアルカリホスファターゼ標識抗−マウスＩｇＧ＋Ｍ＋Ａ抗体（以下、「ＡＬＰ−抗マウスＩｇ」という）を用い、ＥＬＩＳＡ法により血清中の抗体価を検証した。すなわち、ＰＢＳ（−）で1000倍希釈した血清 50 μlをＡＣＨ固相化マイクロプレートに分注し、３７℃で1時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳ（−）で４回洗浄し、10% ブロックエース（登録商標）/ＰＢＳ（−） で1000倍希釈したALP-抗マウスIg 溶液 50 μlを各ウェルに分注した。さらに、ＰＢＳ（−）で４回洗浄した後、基質溶液(ALPローゼ, シノテスト社製) 50μlを各ウェルに分注し、20分間、室温にて静置した。さらに、発色試薬(シノテスト社製) 50μlを添加し、660nmをバックグラウンド補正として495nmの吸光度を測定した。
２）ハイブリドーマの創製
１）で摘出した脾臓から得られた免疫感作されたリンパ球と、マウスミエローマP3U1細胞(シマ研究所製)とを、4対1ないし5対1の混合比で混合した後、50%のポリエチレングリコール1500(ロシュ社製)中で共遠心分離することによって細胞融合を実施した。なお、上記の細胞融合に用いるミエローマ細胞には、細胞融合の1週間前より、8-アザグアニンを含んだHAT培地で生育させたものを用いた。細胞融合後、HAT培地中で細胞を生育させた細胞を、以下のクローンの選抜に用いた。
３）クローンの選抜及び評価
３−１） クローニング
クローニングには限界希釈法を採用した。すなわち、細胞数がウェル当り１以下になるようにHAT培地で細胞を希釈し、これを９６ウェルマイクロプレートに播種した。これを常法に従って培養し、培養上清液を得た。培養上清液の抗体価の評価を、参考例６ ２）で作製したＢｉ−ＡＣＨ固相化マイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法により行い、クローンを選抜した。以上のクローンニングの工程は、少なくとも2回以上実行した。以上の結果として、１つのクローンを選抜し、取得した。
３−２） クローンの評価
上記３−１）で取得したクローンの活性が維持されていることを確認するため、当該クローンを２４ウェルプレートの培養スケールにて培養し、得られた培養上清液の抗体価の評価を、参考例６ ２）で作製したＢｉ−ＡＣＨ固相化マイクロプレート、及びＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体(以下、「ＨＲＰ抗マウスＩｇ」と記載する、ダコ社製)を用いたＥＬＩＳＡ法により行った。以下に詳細を示す。
[クローンの抗体価の評価]
予め洗浄緩衝液によって4回洗浄したＢｉ−ＡＣＨ固相化マイクロプレートに、培養上清液 100μlを分注し、室温にて1時間静置した。さらに洗浄緩衝液で4回洗浄した後に、反応緩衝液(0.05%プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍に希釈したApplieDuo（登録商標）溶液)で2000倍に希釈したＨＲＰ抗マウスＩｇ 100μlを、各ウェルに分注した。このプレートを室温にて1時間静置した後、洗浄緩衝液で4回洗浄し、ＴＭＢ溶液（HRP基質溶液、BIOFX社製） 100μlを各ウェルに加え、30分間、37℃で酵素反応を行った。反応終了後、発色試薬（BIOFX社製） 100μlを各ウェルに添加し、630nmをバックグラウンド補正として、450nmの吸光度を測定した。なお、反応緩衝液をネガティブブランクとして用いた。その結果、当該クローンが抗ＡＣＨ抗体を生産していることが確認された。樹立したハイブリドーマのクローン番号はACH55であったことから、このハイブリドーマによって産生される抗体を、ＡＣＨ５５抗体と名付けた。上記のハイブリドーマは、平成１８年３月１日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてFERM P-20828が付与された。常法に従って抗体の免疫グロブリンクラスを調べた結果、ＡＣＨ５５抗体の免疫グロブリンクラスはＩｇＭであることを確認した。
【実施例４】
【００５８】
抗ＡＣＨモノクローナル抗体の調製
【００５９】
１） 抗ＡＣＨモノクローナル抗体の生産
目的の抗ＡＣＨモノクローナル抗体を生産する方法としては、マウス腹水法を採用した。すなわち、上記実施例３ ３）で樹立したハイブリドーマ(クローン番号；ACH55) 5×106個を、予めプリスタン（2,6,10,14-Tetrametylpentadecane：東京化成工業）処理した３匹のBALB/Cマウス(15週齢の雌)の腹腔に注入した。注射後10〜20日の間に、マウスの腹水を数回に分けて採取し、合計約10mlの腹水を得た。
２） 抗ＡＣＨモノクローナル抗体の精製
上記１）で得た腹水を、吸着バッファ2(0.5M K2SO4を含む20mM リン酸緩衝液(pH 7.5))に対して一晩透析した。透析内液をメンブランフィルタ(孔径:0.45 μm)によって濾過し、得られた濾過液を、予め吸着バッファ1（20 mMリン酸緩衝液(pH 7.0)）で平衡化したHiTrap IgY Purification HPカラム(5ml、アマシャム・バイオサイエンス社製)にアプライした後、吸着バッファ1でカラムを洗浄した。通過させた洗浄液の280nmの吸収がほぼ0になった時、20 mMリン酸緩衝液(pH 7.5)をカラムに通過させ、ＡＣＨ５５抗体を溶出した。溶出したＡＣＨ５５抗体をNH4SO4(50%の飽和)を用いて塩析することによって回収した。得られた沈澱物をＰＢＳ（−）に対して透析し、精製ＡＣＨ５５抗体 2.2mgを含む透析内液を得た。
【実施例５】
【００６０】
反応性試験
【００６１】
１） ＡＣＨ５５抗体の各種ＧＡＧに対する反応性
１）―１ 方法
Ｂｉ−ＧＡＧの固相化量の異なるマイクロプレートを作製するために、Ｂｉ−ＧＡＧ溶液中のＢｉ−ＧＡＧの終濃度を、0.001, 0.004, 0.012, 0.037, 0.111, 0.333, 1.000 μg/mlと変化させた溶液を用いて、参考例６ ２）と同様の方法でＢｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレートを作製した後、それぞれ洗浄緩衝液で4回洗浄した。その後各ウェルに、添加剤としてApplieDuo（登録商標。最終希釈率２０倍、生化学工業株式会社製）、防腐剤として０．０５％プロクリン３００を含むＰＢＳ（−）（以下、「反応液Ａ」という）を用いて0.06 μg/mlに調製したＡＣＨ５５抗体からなる各試験溶液を１００μｌずつ加え、これを常温で６０分間静置し、抗原抗体反応させた。反応終了後、各ウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄し、二次抗体溶液として、反応液Ａで２０００倍希釈したＨＲＰ抗マウスＩｇ（ダコ社製）溶液を１００μｌずつ加え、これを常温で６０分間静置して抗原抗体反応させた。反応終了後、このプレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ溶液（BIOFX社製）を１００μｌずつ 加え、常温で３０分間反応させて発色させた。続いて、プレートに反応停止液（BIOFX社製）を１００μｌずつ 加えて反応を停止させた後、ＴＭＢ分解によって増加する波長４５０nmの吸光度（対照波長６３０nm）をウェルリーダーＳＫ−６０３（登録商標、生化学工業株式会社販売）で測定した。なお、抗体の反応性は、上記の各濃度のＢｉ−ＧＡＧを用いて作製したＢｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレートを用いて上記測定を行った場合の吸光度から、Ｂｉ−ＧＡＧ溶液の代わりにＢｉ−ＧＡＧを含まない０．０５％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍希釈したApplieDuo（登録商標）溶液を用いることの他、参考例６ ２）と同様の方法により作製したコントロール測定用マイクロプレートを用いて上記の測定方法に準じて測定を行った場合の吸光度（ブランク値）を減算した吸光度差（以下、単に「吸光度差」と記載する）によって評価した。
１）−２ 結果
Ｂｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレートのＧＡＧとして、ＮＡＨ、ＡＳ、ＡＣＨ、ＨＳ、ＨＥＰ及びＥＨＳ−ＨＳを用いた場合の結果を、図２に示す。
【００６２】
ＡＣＨ５５抗体は、ＡＣＨに対しては、Ｂｉ−ＡＣＨ濃度を0.01μg/ mL（0.001 μg/ウェル）とした場合においても強く反応（吸光度差=約1.0）した一方で、ＡＳ、ＨＥＰ、ＨＳ、ＮＡＨ、及びＥＨＳ−ＨＳに対しては、Ｂｉ−ＧＡＧ濃度を1.0 μg/ mL（0.1 μg/ウェル）にまで上げた場合においても反応しなかった（図２）。
【００６３】
また、ＡＣＨ５５抗体は上述したＨＥＰの場合と同様に、ＨＡ、各種ＣＳ（ＣＳ−Ａ（Ｗ）， ＣＳ−Ａ（Ｓ）， ＣＳ−Ｂ， ＣＳ−Ｃ， ＣＳ−Ｄ， ＣＳ−Ｅ）、及びＫＳに対しても反応しなかった。
２） ＡＣＨ５５抗体の各種ＨＥＰ誘導体に対する反応性
Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートを用い、各種ＨＥＰ誘導体に対する反応性を評価した。ＨＥＰ誘導体としては、ＮＨ2−ＨＥＰ、ＮＡｃ−ＨＥＰ、６ＤＳＨ、ＮＡｃ−６ＤＳＨ、ＮＨ2−６ＳＨ、６ＳＨ、ＮＨ2−２ＳＨ、２ＳＨ、ＮＳＨ、ＮＡｃ−ＮＳＨ、ＮＨ2−ＣＤＳＨ及びＣＤＳＨを用いた。測定は、上記１）−１に記載の方法に準じて行ったが、この試験においては、固相化に用いるＢｉ−ＨＥＰ誘導体を含む溶液の濃度を1μg/mlに固定した（0.1 μg/ウェル）。結果を図３に示す。
【００６４】
ＡＣＨ５５抗体は、ＣＤＳＨに対しては強く反応し、また、２ＳＨ、６ＳＨとＮＡｃ−ＮＳＨに対しては、極弱く反応した（図３）。
【００６５】
ＡＣＨ５５抗体が強く反応したＡＣＨは、イズロン酸ユニット（−［ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＡｃ］−）を主な構成二糖としていることから、ＡＣＨ５５抗体のエピトープは、イズロン酸ユニットから構成されていると考えられる。また、当該抗体が反応しなかったＮＡＨは、グルクロン酸ユニット（−［ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ］−）からなるＡＣＨのウロン酸Ｃ５−エピマーであることから、特にイズロン酸残基がＡＣＨ５５抗体の抗原認識において必須であることが示唆された。さらに、ＡＳ（イズロン酸残基の２位−水酸基が硫酸化されている）に対して反応性が見られないことから、イズロン酸の硫酸化（ＩｄｏＡ（２Ｓ））は、ＡＣＨ５５抗体の抗原に対する反応性を阻害することが示唆された。
【００６６】
ＣＤＳＨはグルクロン酸ユニット及びイズロン酸ユニットにより構成される多糖であり、イズロン酸ユニットの存在比は60%以上と高い。したがって、ＣＤＳＨが当該抗体と反応した結果に矛盾は無い。また、この反応性はＮ−アセチルグルコサミン残基のＮ−脱アセチル化（ＮＨ２−ＣＤＳＨ）、及びＮ−硫酸化（ＮＳＨ）によって消失したので、グルコサミン残基のアミノ基がアセチル化されていることも、ＡＣＨ５５抗体の抗原の認識において重要であることが示唆された。
【００６７】
ＡＳと反応しない抗体が２ＳＨ、６ＳＨやＮＡｃ−ＮＳＨと弱く反応した理由は、ＨＥＰがＮ−脱硫酸化、２−Ｏ脱硫酸化及び６−Ｏ脱硫酸化等、複数の修飾を経る過程で、イズロン酸ユニットがＨＥＰ誘導体中に顕在化したためと推察した。
【実施例６】
【００６８】
組織染色
【００６９】
ラット小脳凍結切片を用いて免疫組織染色における染色性を検討した。
【００７０】
ＳＤラット（日本チャールスリバー社、８週齢、雄）をジエチルエーテル（和光純薬工業社製）で麻酔し、腹部大動脈より放血、屠殺後、小脳を摘出した。摘出した小脳をＯＣＴコンパウンド（三共マイルス社製）に包埋し、アセトン・ドライアイスで凍結させ、クリオスタット（ライカ社販売）にて厚さ6μmの切片を作製した。
【００７１】
作製した切片を２時間常温にて風乾後、冷アセトン（４℃）で固定を行い、さらに常温で１時間風乾した。この後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄し、０．１％アジ化ナトリウム（和光純薬工業社製）−０．３％過酸化水素水（和光純薬工業社製）を含む蒸留水中に常温で１０分間浸漬し、内因性のペルオキシダーゼ活性を除去した後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄し、０．１％ＢＳＡ及び０．１％カゼイン（和光純薬工業社製）を含むＰＢＳ（−）でブロッキングを常温で６０分間行った。
【００７２】
０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄後、アビジン−ビオチンブロッキングキット（ＶＥＣＴＯＲ社製）にて内因性のビオチンのブロッキングを行った。
【００７３】
この後０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．１％ＢＳＡ及び０．１％カゼインを含むＰＢＳ（−）で１μg/mLに希釈したＡＣＨ５５抗体を４℃で一晩反応させた。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄後、１０％ラット血清を含むビオチン標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（ＪＡＣＫＳＯＮ社製）を０．１％ＢＳＡ及び０．１％カゼインを含むＰＢＳ（−）で５００倍に希釈し、常温で３０分間反応させた。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ニチレイ社製）を常温にて３０分間反応させた。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄後、ＤＡＢ発色キット（Ｚｙｍｅｄ社製）にて茶色の発色反応を行った。
【００７４】
発色後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）に浸漬し反応を停止させ、常水にて５分間洗浄した。この後、対比染色を行うためヘマトキシリン（ＤＡＫＯ社製）にて核染色（青色）を行った。常水にて５分間洗浄後、常法に従い脱水、透徹操作を行い封入した。
【００７５】
得られた染色像を図４に示す。プルキンエ細胞に陽性反応が観察された（矢印）。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明抗体は、ＡＣＨの検出に好適に用いることができることから極めて有用である。また、本発明抗原及び本発明ハイブリドーマは、本発明抗体の効率的な生産のために用いることができることから極めて有用である。また、本発明ＡＣＨ検出方法によれば、ＡＣＨを好適に検出することができることから極めて有用である。また、本発明検出キットは、これを用いることにより、本発明検出方法をより効率的且つ簡便に行うことを可能にすることから極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】各種ＨＥＰ誘導体の製造方法の流れを示す図である。
【図２】ＡＣＨ５５抗体の各種ＧＡＧに対する反応性を示す図である。横軸のＢｉ−ＧＡＧ（μg/ml）は、Ｂｉ−ＧＡＧ固相化プレートの作製において用いたＢｉ−ＧＡＧ溶液におけるＢｉ−ＧＡＧの終濃度を示す。
【図３】ＡＣＨ５５抗体の各種ＨＥＰ誘導体等に対する反応性を示す図である。
【図４】ＡＣＨ５５抗体を用いたラット小脳の組織染色の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸抗体とその応用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類中で使用する略号を以下に示す。
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＨＥＰ：ヘパリン
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＥＨＳ−ＨＳ：マウスのエンジェルブレス−ホーム−スワーン腫瘍組織（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ ｓａｒｃｏｍａ）由来のＨＳ
Ｂｉ−ＧＡＧ：ビオチン標識ＧＡＧ
Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体：ビオチン標識ＨＥＰ誘導体
ＧｌｃＮＳ：Ｎ−硫酸化グルコサミン
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＩｄｏＡ：イズロン酸
ＩｄｏＡ（２Ｓ）：２−Ｏ−硫酸化イズロン酸
ＮＡＨ：Ｎ−アセチルヘパロザン
ＡＣＨ：２−Ｏ−脱硫酸化ＡＳ
Ｂｉ−ＡＣＨ：ビオチン標識ＡＣＨ
ＲＡ−ＡＣＨ：還元アミノ化ＡＣＨ
ＰＤＰ−ＡＣＨ：２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＡＣＨ
ＳＨ−ＡＣＨ：チオプロピオニル化ＡＣＨ
ＡＳ：アカラン硫酸
ＮＨ2−ＨＥＰ：Ｎ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＡｃ−ＨＥＰ：Ｎ−アセチル化−ＨＥＰ
２ＤＳＨ；２−Ｏ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＨ2−６ＳＨ：（２−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化ＨＥＰ
６ＳＨ：（２−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
６ＤＳＨ：６−Ｏ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＡｃ−６ＤＳＨ：Ｎ−アセチル化６ＤＳＨ
ＮＳＨ：（２−Ｏ・６−Ｏ）−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＡｃ−ＮＳＨ；N-アセチル化ＮＳＨ
ＮＨ2−２ＳＨ：（６−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化ＨＥＰ
２ＳＨ：（６−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
ＮＨ2−ＣＤＳＨ：完全脱硫酸化ＨＥＰ
ＣＤＳＨ：完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
Ｃｈ；コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＣＳ−Ａ（Ｗ）；クジラ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ａ（Ｓ）；サメ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ｂ；コンドロイチン硫酸Ｂ
ＣＳ−Ｃ；コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳ−Ｄ；コンドロイチン硫酸Ｄ
ＣＳ−Ｅ；コンドロイチン硫酸Ｅ
ＫＳ：ケラタン硫酸
ＨＲＰ：ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＫＬＨ：ヘモシアニン
ＰＤＰ−ＫＬＨ：２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＫＬＨ
ＴＭＢ：テトラメチルベンジジン
ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル−３−［２−ピリジルジチオ］プロピオン酸
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＬＩＳＡ法：酵素標識抗体測定法
ＡＳは、アフリカマイマイ(学名：Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ)から単離されたＧＡＧの一種として知られている（非特許文献１）。ＡＣＨは公知の方法に従って、ＡＳを化学的に脱硫酸化することによって調製される（非特許文献２）。ＡＳに反応する抗体としては、ＭＷ３Ｇ３が知られている（非特許文献３）。しかしながら、ＡＣＨに反応する抗体は知られていない。
【０００３】
【非特許文献１】ヨン Ｓ．キム（Yeong S. Kim）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、（米国）、１９９６年、第２７１巻、第２０号、ｐ．１１７５０−１１７５５
【非特許文献２】Ｍ．イシハラ（M. Ishihara）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー、１９９７年、第１２１巻、第２号、ｐ．３４５−３４９
【非特許文献３】ジェディー Ｂ．テン ダン（Gerdy B. ten Dam）ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、（米国）、２００４年、第２７９巻、ｐ．３８３４６−３８３５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＡＣＨに対して反応する抗体及びこれを産生するハイブリドーマ、並びに上記抗体を応用した検出方法及び検出キットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を鑑み鋭意検討を重ねた結果、タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として用いることにより、ＡＣＨに対して反応する抗体を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。
（１）ＡＣＨに対して反応する抗体（以下、「本発明抗体」という）。
（２）ＡＳに対して実質的に反応しない、上記（１）に記載の抗体。
（３）ＮＡＨに対して実質的に反応しない、上記（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）ブタ腸由来のＨＥＰに対して実質的に反応しない、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の抗体。
（５）ウシ腎臓由来のＨＳに対して実質的に反応しない、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の抗体。
（６）ＥＨＳ−ＨＳに対して実質的に反応しない、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の抗体。
（７）モノクローナル抗体である、上記（１）〜（６）のいずれか１つに記載の抗体。
（８）タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と、哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、上記（７）に記載の抗体。
（９）リンパ球及びミエローマ細胞がマウス由来である、上記（８）に記載の抗体。
（１０）免疫グロブリンクラスがＩｇＭである、上記（１）〜（９）のいずれか１つに記載の抗体。
（１１）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
（１２）タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質であって、ＡＣＨに対して反応する抗体を産生させ得る抗原性を有する物質（以下、「本発明抗原」という）。
（１３）タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマ（以下、「本発明ハイブリドーマ」という）。
（１４）リンパ球及びミエローマ細胞がマウス由来である、上記（１３）に記載のハイブリドーマ。
（１５）独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマ。
（１６）上記（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するＡＣＨの検出方法（以下、「本発明ＡＣＨ検出方法」という）。
（１７）試料が、体液、細胞、組織、又は、細胞若しくは微生物の培養物から選択されるものに由来する、上記（１６）に記載の検出方法。
（１８）上記（１）〜（１１）のいずれか１つに記載の抗体を少なくとも含む、試料中に存在するＡＣＨの検出キット（以下、「本発明ＡＣＨ検出キット」という）。
（１９）試料が、体液、細胞、組織、又は、細胞若しくは微生物の培養物から選択されるものに由来する、上記（１８）に記載の検出キット。
【発明の効果】
【０００６】
本発明抗体は、ＡＣＨに対して反応するため、ＡＣＨの検出に好適に用いることができる。また、本発明抗体は、ＡＣＨの特異的な検出にも応用することができる。また、本発明抗原及び本発明ハイブリドーマを用いることにより、本発明抗体を効率的に産生させることができる。また、本発明ＡＣＨ検出方法により、ＡＣＨを効率的に検出することができる。また、本発明ＡＣＨ検出キットを用いることにより、本発明ＡＣＨ検出方法によるＡＣＨの検出をより効率的且つ簡便に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
＜１＞本発明抗体
本発明抗体は、ＡＣＨに対して反応する抗体である。
【０００８】
ＡＣＨは、Ｎ−アセチルグルコサミンとイズロン酸とからなる二糖（−［ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＡｃ］−）の繰り返し構造を基本糖鎖構造として有する多糖である。ＡＣＨは、アフリカマイマイ(学名:Achatina fulica)を原料としてＡＳを調製し、このＡＳのイズロン酸残基の２位の硫酸基を、公知の方法に従って脱硫酸化することにより調製することができる。より具体的な調製方法としては、後述する実施例１を参照されたい。
【０００９】
上記において「反応」とは、免疫学的反応又は抗原抗体反応を意味し、この反応性は例えば、ＥＬＩＳＡ法、RIA法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法などによって調べることができる。例えば、一定濃度の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法を行ったときに、抗原の濃度の増加に比例して反応シグナルが増強される場合に、該抗体は該抗原に反応するということができる。ただし本明細書に記載する、抗原に対する本発明抗体の反応性は、特に断りのない場合、後述する実施例５に記載の方法（抗原濃度：0.1 μg/ウェル）により測定される、本発明抗体のＡＣＨに対する反応性を１００％とした場合における、相対的な反応性を意味する。
【００１０】
本発明抗体は、ＡＣＨに対して反応する抗体である限りにおいて特に限定されないが、なかでも、ＡＳに対して実質的に反応しない抗体は好ましく、また、ＮＡＨに対して実質的に反応しない抗体も好ましく、ブタ腸由来のＨＥＰに対して実質的に反応しない抗体も好ましく、ウシ腎臓由来のＨＳに対して実質的に反応しない抗体も好ましく、ＥＨＳ−ＨＳに対して実質的に反応しない抗体も好ましい。このような抗体のなかでも、ＡＣＨに対して反応し、且つＡＳ、ＮＡＨ、ブタ腸由来のＨＥＰ、ウシ腎臓由来のＨＳ及びＥＨＳ−ＨＳのいずれに対しても実質的に反応しない抗体はより好ましい。
【００１１】
また本発明抗体は、下記のＨＥＰ誘導体群から選択される１又は２以上のＨＥＰ誘導体に対して実質的に反応しないことが好ましい；
ＨＥＰ誘導体群；ＮＨ2−ＨＥＰ、ＮＡｃ−ＨＥＰ、６ＤＳＨ、ＮＡｃ−６ＤＳＨ、ＮＨ2−６ＳＨ、ＮＨ2−２ＳＨ、ＮＳＨ、ＮＨ2−ＣＤＳＨ。なかでも、上記のいずれのＨＥＰ誘導体に対しても実質的に反応しないことがより好ましい。
【００１２】
なお、本明細書において、「実質的に反応しない」とは、抗体と抗原との反応性が、後述する実施例５に記載の方法（抗原濃度：0.1 μg/ウェル）で測定を行った場合、反応シグナルを与えないか、極めて弱い反応シグナルしか与えない程度であることを意味するが、本明細書においては、例えば５％程度以下の反応性がある場合についても、反応シグナルを与えない程度であると解されるものとする。
【００１３】
また本発明抗体は、ＣＤＳＨに対して反応することが好ましい。
【００１４】
なお、上記の各種ＧＡＧ及び各種ＨＥＰ誘導体は、後述する実施例に記載の方法により、入手又は調製することができる。
【００１５】
本発明抗体のエピトープは特に限定されないが、イズロン酸ユニット（−［ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＡｃ］−）により構成されることが好ましい。
【００１６】
本発明抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることがより好ましい。また、モノクローナル抗体はそのフラグメントであってもよい。モノクローナル抗体のフラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）2化抗体、Ｆａｂ化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）及びミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）などが挙げられる。
【００１７】
本発明抗体がモノクローナル抗体である場合、本発明抗体は、例えば、タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と、哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマにより産生させることができる。
【００１８】
また本発明抗体がポリクローナル抗体である場合、本発明抗体は、例えば、タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物の血清から得ることができる。
【００１９】
タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質における「タンパク質」としては、例えばＢＳＡ及びＫＬＨが例示されるが、なかでもＫＬＨが好ましい。
【００２０】
また、上記においてタンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させる方法としては、化学的な結合の様式は特に限定されないが、共有結合が好ましく、ジスルフィド結合（以下、「−ＳＳ−」と表記することがある）がより好ましい。ジスルフィド結合により化学的に結合する方法としては、例えば以下の方法を採用することができる。すなわち、ＡＣＨを還元アミノ化し、これと５ｍＭ ＳＰＤＰを反応させて、２−ピリジルジチオプロピニル化ＡＣＨを得る。これをジチオスレイトール等の還元剤で還元し、チオール化ＡＣＨを得る。同様に、タンパク質とＳＰＤＰを反応させ、２−ピリジルジチオプロピニル化タンパク質を得る。次に、チオール化ＡＣＨ溶液と２−ピリジルジチオプロピニル化タンパク質溶液を混合することによって、ＡＣＨとタンパク質との間にジスルフィド結合を生成させ、ＡＣＨ−ＳＳ−タンパク質を得る。
【００２１】
また、上記のリンパ球及びミエローマ細胞の由来は、哺乳動物由来である限りにおいて特に限定されず、哺乳動物としては、例えばブタ、ウシ、マウス、ラット等が例示されるが、なかでもマウスが好ましい。
【００２２】
また、上記において免疫は、例えば上記方法により調製した抗原を哺乳動物に皮下注射することにより行うことができる。注射方法はこれに限らず、腹腔内注射、静脈注射でも良い。通常、免疫は数回に分けて行うが、免疫はアジュバントと共に投与することが好ましい。アジュバンとしては、ミョウバン、結核死菌、核酸、完全フロインドアジュバント、不完全フロイントアジュバント等、アジュバント効果が期待できるもので有れば良いが、特に、ＴｉｔｅｒＭＡＸ Ｇｏｌｄ（シグマ社製）が良い。
【００２３】
また、上記の細胞融合は、例えば、マウスを最終免疫した後に、当該マウスのリンパ節或は脾臓から得られるリンパ球と、ミエローマ細胞等の腫瘍細胞株の細胞（通常、マウスのBALB/c 由来のP3 -NS-1/1-Ag4-1、P3 -X63-Ag8-U1(P3 U1)、P3 -X63-Ag8-653、SP2/0-Ag14 等）を用いて、公知の方法により行うことができる。
【００２４】
また、上記のハイブリドーマは、例えば下記に例示する方法により選択と単クローン化を行うことにより得ることができる。すなわち、ハイブリドーマの増殖の盛んな細胞培養上清から種々の分析法（例えばＲＩＡ法、プラーク法、凝集反応法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法 等）でＡＣＨに対して反応する目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次に、得られたハイブリドーマについてクローニングを行う。クローニングの方法としてはＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ ）もしくは、一般によく用いられる限界希釈法等が挙げられる。例えば、限界希釈法では９６ウェルプレートの１ウェルあたり細胞が１個以下になるように行うことが好ましい。どの方法を用いてもクローニングは２回繰返し行うことが好ましく、単一クローンとすることが好ましい。
【００２５】
このようにして得られた単一クローンを、例えばin vitro で培養する方法、in vivo で培養（腹水化）する方法等により培養することにより、モノクロナール抗体を産生させることができる。また得られた培養液から、例えば塩析、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的一般的手法を適宜組み合わせることにより、上記抗体を分離、精製することができる。
【００２６】
本発明抗体の免疫グロブリンクラスは特に限定されないが、ＩｇＭであることが好ましい。
【００２７】
なお、上記の本発明抗体の一例としては、例えば独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
＜２＞本発明抗原
本発明抗原は、タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質であって、ＡＣＨに対して反応する抗体を産生させ得る抗原性を有する物質である。
【００２８】
上記の「タンパク質」、「ＡＣＨ」なる用語、及びタンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させる方法に関する説明については、上記＜１＞本発明抗体における説明を参照されたい。また、上記の「反応」は、上記＜１＞本発明抗体の場合と同様に、免疫学的反応又は抗原抗体反応を意味する。具体的な説明は上記＜１＞本発明抗体を参照されたい。
【００２９】
また、ＡＣＨに対して反応する抗体を産生させ得る抗原性を有するか否かは、例えば上記＜１＞本発明抗体に記載の方法によりタンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を用いて哺乳動物の免疫化を行い、免疫後の哺乳動物に由来する血清等の試料中に抗体が存在するか否かを、例えばＲＩＡ法、プラーク法、凝集反応法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法等の方法により確認することにより、判断することができる。
【００３０】
上記のＡＣＨに対して反応する抗体は、本発明抗体であることが好ましい。したがって本発明抗原は、本発明抗体を生産する目的で使用することができる。このような場合、例えば＜１＞本発明抗体に記載した免疫において用いる抗原として、本発明抗原を用いることができる。より具体的には、後述する実施例を参照されたい。
＜３＞本発明ハイブリドーマ
本発明ハイブリドーマは、タンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマである。
【００３１】
上記の「タンパク質」、「ＡＣＨ」なる用語、及びタンパク質とＡＣＨとを化学的に結合させる方法、「免疫」、「哺乳動物由来のリンパ球」、「哺乳動物由来のミエローマ細胞」、「細胞融合」、「ハイブリドーマ」に関する説明については、上記＜１＞本発明抗体における説明を参照されたい。
【００３２】
なお、上記のような本発明ハイブリドーマの一例としては、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマが挙げられる。
【００３３】
本発明ハイブリドーマは、本発明抗体（好ましくは、モノクローナル抗体である本発明抗体）を生産する目的で使用することができる。ここで本発明抗体は、例えば本発明ハイブリドーマを、in vitro で培養する方法、in vivo で培養（腹水化）する方法等により培養することにより産生させることができる。より具体的には、後述する実施例を参照されたい。
＜４＞本発明検出方法
以下、本発明検出方法について説明する。
【００３４】
本発明ＡＣＨ検出方法は、本発明抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在するＡＣＨの検出方法である。
【００３５】
上記の「試料」とは、ＡＣＨを含むか、含む可能性を有する試料であれば特に限定されないが、試料の由来となるものとしては、例えば尿、血液、血漿、血清、関節液、髄等の体液、分泌物、動物細胞若しくは植物細胞等の細胞、組織、臓器、又は細胞若しくは微生物の培養物（例えば培養上清等を含む）等が例示される。上記において、試料の由来が動物細胞である場合、好ましい動物細胞の一例としてはプルキンエ細胞が例示される。また試料の由来が組織である場合、好ましい組織の一例としては小脳が例示される。また、上記「由来」とは、上記に例示したものに由来する精製物、抽出物、標本等であってもよく、そのもの自体であってもよいことを意味する。
【００３６】
本発明ＡＣＨ検出方法において、試料中に存在するＡＣＨの検出における具体的方法としては、例えば組織標本を試料として用いる場合は通常の免疫組織染色法などを用いることができ、例えば体液又は培養上清等を試料として用いる場合はＥＬＩＳＡ法、RIA法、サンドイッチ法、競合法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロッティング法などを用いることができる。
【００３７】
上記のサンドイッチ法においては、例えば本発明抗体をプレート等に例示される固相に固着させて１次抗体として用いても良く、また、本発明抗体を標識して２次抗体として用いても良い。
【００３８】
本発明ＡＣＨ検出方法によれば、本発明の抗体の反応の反応性を利用することにより、試料中に存在するＡＣＨを好適に検出することができる。さらに本発明ＡＣＨ検出方法は、＜１＞本発明抗体で述べた本発明抗体の各種抗原に対する特異的な反応性を利用することにより、ＡＣＨの特異的な検出に応用することができる。
【００３９】
本発明ＡＣＨ検出方法における検出は、定量的な検出であってもよく、定性的な検出であってもよい。定量的な検出である場合、試料中に存在するＡＣＨ濃度は、例えば予め既知濃度のＡＣＨ標準液を用いてＡＣＨ濃度と検出結果との関係について検量線を作成し、ＡＣＨ濃度が未知の試料についての検出結果と前記検量線とを照らし合わせることにより行うことができる。
【００４０】
また、本発明検出方法は、本発明抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在する本発明抗体が反応する物質の検出方法を提供する。
【００４１】
上記において、「試料」、検出における具体的方法、検出の種類等についての説明については、上記の本発明ＡＣＨ検出方法における説明を参照されたい。また、上記「反応」は、免疫学的反応又は抗原抗体反応を意味するが、より具体的な説明については＜１＞本発明抗体における説明を参照されたい。
＜５＞本発明検出キット
以下、本発明検出キットについて説明する。
【００４２】
本発明ＡＣＨ検出キットは、本発明抗体を少なくとも含む、試料中に存在するＡＣＨの検出キットである。本発明の検出キットによれば、本発明検出方法をより効率的に、且つ簡便に行うことができる。上記において、「本発明抗体を少なくとも含むキット」としては、例えば本発明抗体そのもの（例えば、溶液に溶解した本発明抗体等も含む）を構成成分として含むキット、本発明抗体を固着させた固相を構成成分として含むキット、酵素等により標識した本発明抗体を構成成分として含むキット等が例示される。また、上記の「試料」なる用語については、上記＜４＞本発明検出方法で説明した通りである。
【００４３】
また本発明ＡＣＨ検出キットの構成成分には、本発明抗体に加えて、例えば１次抗体、2次抗体、反応バッファー、洗浄液、反応基質、ＡＣＨ標準液などを含むものであってもよい。
【００４４】
また、本発明検出キットは、本発明抗体を少なくとも含む、試料中に存在する本発明抗体が反応する物質の検出キットを提供する。
【００４５】
上記において、「本発明抗体を少なくとも含むキット」に関する具体的説明は、上記本発明ＡＣＨ検出キットにおける説明を参照されたい。
【００４６】
以下、本発明を実施例により具体的に詳説する。
【実施例１】
【００４７】
(参考例１) ＡＳ及びＡＣＨの調製
ＡＳは、ヨン Ｓ．キム（Yeong S. Kim）らの方法（前記の非特許文献１に記載された方法）に従って、アフリカマイマイ（学名：Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ）から調製した。得られたＡＳを原料として、Ｍ．イシハラらの方法（前記の非特許文献２に記載された方法）に記載の方法に従ってＡＣＨを調製した。
(参考例２) ＰＤＰ−ＫＬＨの調製
ＫＬＨへの２−ピリジルジスルフィド構造の導入は、カールソン Ｊ．（Carlsson, Jan）らの方法（バイオケミカル・ジャーナル、１９７８年、第１７３巻、第３号、ｐ．７２３−７３７に記載の方法）に従って行った。
【００４８】
すなわち、0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.5)/0.1M NaClに、終濃度が2.5mg/mlになるようにKLH（シグマ社製） 60mgを溶解した。この溶液に、終濃度が0.238mMになるように5mM ＳＰＤＰ（シグマ社製））エタノール溶液を添加・混合し、30分間室温に保持した。過剰のＳＰＤＰを除去するために蒸留水に対して透析した後に、混合液を凍結乾燥し、ＰＤＰ−ＫＬＨ 59.4mgを得た。
(参考例３) ウロン酸を介したＡＣＨ−ＢＳＡコンジュゲートの調製
ＡＣＨ及びＢＳＡ(バイエル社製)を、それぞれ0.1M ＭＥＳ緩衝液（pH5.5）に、終濃度が10mg/mlになるように溶解し、ＡＣＨ溶液及びBSA溶液を得た。ＡＣＨ溶液 300 μlとBSA溶液 150 μlとを混合し、ＥＤＣ（PIERCE社製） 400 μｇを添加した後、撹拌しながら20時間室温に保持した。得られた反応後の溶液は、蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥し、ウロン酸を介したＡＣＨ−ＢＳＡコンジュゲート 3.5mgを得た。
(参考例４) Ｂｉ−ＧＡＧ及びＢｉ−ＨＥＰ誘導体の調製
ＡＳおよび、ＡＣＨは参考例１で調製したものを使用した。ブタ皮由来のＨＡ（以下、単に「ＨＡ」と記載する）、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ、ウシ腎臓由来のＨＳ（以下、単に「ＨＳ」と記載する）、及びウシ角膜由来のＫＳ（以下、単に「ＫＳ」と記載する））は、生化学工業株式会社製のものを使用した。ＮＡＨは特開2004-18840に記載の方法に従って、大腸菌K5の培養物から調製した。ブタ腸由来のＨＥＰ（以下、実施例において単に「ＨＥＰ」と記載する）は、サイエンティフィックプロテインラボラトリーズ社から購入した。また、ＥＨＳ−ＨＳは、特公平７−５３７５６号公報に記載の方法により調製した。
【００４９】
また、各種ＨＥＰ誘導体（ＮＨ２−ＨＥＰ、ＮＡｃ−ＨＥＰ、６ＤＳＨ、ＮＡｃ−６ＤＳＨ、ＮＨ２−６ＳＨ、６ＳＨ、ＮＨ２−２ＳＨ、２ＳＨ、ＮＳＨ、ＮＡｃ−ＮＳＨ、ＮＨ２−ＣＤＳＨ、ＣＤＳＨ）は、図１に示す方法で、各種脱硫酸化反応及び／又はＮ−アセチル化反応を、単独で、又は組み合わせて用いることにより調製した。図中、ＨＥＰの６−Ｏ、２−Ｏ、およびＮ−脱硫酸化はそれぞれ、高野ら、苅谷ら、Ａｙｏｔｔｅ，Ｌ．らの方法に従った（Ｔａｋａｎｏ，Ｒ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．１４，８８５（１９９５），Ｔａｋａｎｏ， Ｒ．ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｌｅｔｔ． ３， ７１（１９９８）， Ｋａｒｉｙａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２３， ２４０（１９９８）， Ａｙｏｔｔｅ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， １４５， ２６７（１９８６））。
【００５０】
また、Ｎ−アセチル化は、Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ， Ｉ．らの方法に従った。（Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ， Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ．， ５， ４０７（１９６５））。
【００５１】
高野らの方法に従って６−Ｏ−脱硫酸化を実施すると、副反応として若干のＮ−脱硫酸化も起きるので、得られた６ＤＳＨとＮＳＨの一部はＮ−アセチル化を行い、ＮＡｃ−６ＤＳＨとＮＡｃ−ＮＳＨを調製した。
【００５２】
上記の各種ＧＡＧ及び各種ＨＥＰ誘導体、並びに参考例１で調製したＡＳ及びＡＣＨを、それぞれ終濃度が10mg/mlになるように0.1M ＭＥＳ緩衝液（pH5.5）に溶解し、各種ＧＡＧ溶液及び各種ＨＥＰ誘導体溶液を得た。これらの各種ＧＡＧ溶液及び各種ＨＥＰ誘導体溶液 各 1mlに対して、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業社製）で２０ｍＭに調製したビオチン-LC-ヒドラジド（PIERCE社製）を、それぞれ２５μlずつ添加した。続いて、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で１００ｍｇ／ｍｌに調製したＥＤＣ溶液を１２．５μl添加した。これをよく撹拌した後、室温（１５℃〜２５℃）で２０時間撹拌して反応させた。反応終了後の反応物を、透析膜としてCellu Sep H1（フナコシ社製、カットオフ；分子量１，０００以下）を、透析液としてダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水（pH7.2〜7.5、カルシウムイオン等の2価イオン不含：以下、「ＰＢＳ（−）」という）をそれぞれ用いて透析に付し、遊離のビオチンを充分に除去し、各種Ｂｉ−ＧＡＧ及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体を得た。透析終了後、Ｂｉ−ＧＡＧ濃度又はＢｉ−ＨＥＰ誘導体をそれぞれ５ｍｇ／ｍｌ に調整し、凍結保存した。
(参考例５) ストレプトアビジン固相化マイクロプレートの作製
ストレプトアビジン（Vector社製）をＰＢＳ（−）で２０μｇ／ｍｌに希釈し、マキシソープ（登録商標） ９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェルに５０μｌずつ加えた。このプレートを18時間、４℃で保存することにより、ストレプトアビジンをプレート上に均一に固相化した後、ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。続いて、ブロッキング剤としてApplieDuo（登録商標、生化学工業株式会社製）を用い、以下の方法によりストレプトアビジンでコーティングされていない部分をブロッキングした。すなわち、防腐剤として０．０５％プロクリン３００（登録商標、SUPELCO社製）を含むリン酸緩衝液（pH7.2〜7.5：以下、「ＰＢ」という）を用いて、ApplieDuo（登録商標）の５倍希釈液（以下、「ブロッキング液」という）を調製し、これを各ウェルに２５０μｌずつ加え、室温で2時間静置した。静置後、ブロッキング液を充分に除去し、３７℃で２時間乾燥させることにより、所望するストレプトアビジン固相化マイクロプレートを得た。得られたプレートは乾燥剤とともにアルミラミネート袋に封入し、冷蔵保存した。
(参考例６) 各種ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートの作製
１） ＡＣＨ固相化マイクロプレートの作製
参考例３で調製したＡＣＨ-ＢＳＡコンジュゲート (50 ng)を、マキシソープ（登録商標） ９６ウェルマイクロプレートに添加し、18時間、4℃に保持した後、防腐剤として０．０５％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で4倍希釈したブロックエース(登録商標、大日本製薬社製)を用いてブロッキングした。１時間、室温で静置した後、所望のＡＣＨ固相化マイクロプレートを得た。このＡＣＨ固相化マイクロプレートは、後述する実施例３において血清中の抗体価の検証のために使用した。
２） 各種Ｂｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートの作製
上記参考例４に記載の各種Ｂｉ−ＧＡＧ及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体を、終濃度が1 μg/mlになるように、０．０５％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍希釈したApplieDuo（登録商標）溶液に溶解した（以下この溶液を、「各種Ｂｉ−ＧＡＧ溶液」及び「各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体溶液」という）。参考例５で作製したストレプトアビジン固相化マイクロプレートの各ウェルを、300 μlの０．０５％プロクリン300（登録商標）及び０．０５％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレートを含むＰＢＳ（−）（以下、「洗浄緩衝液」と言う）で4回洗浄した。各種Ｂｉ−ＧＡＧ溶液及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体溶液をそれぞれ100 μlずつ各ウェルに分注し、室温で30分間静置したのち、各ウェルを洗浄緩衝液で4回洗浄することにより、所望の各種Ｂｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレート及び各種Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートを得た。これらのプレートは、後述する実施例３におけるクローニング、及び後述する実施例５における反応性試験において使用した。
【実施例２】
【００５３】
ＡＣＨ抗原の調製
【００５４】
１） ＲＡ−ＡＣＨの調製
実施例１の参考例１で調製したＡＣＨ ４．５ｍｇを、２Ｍ 塩化アンモニウム水溶液 １６０μｌに溶解した。この溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム１２ｍｇを添加し、７０℃で２日間、還元アミノ化反応を行った。反応後の溶液に、シアノ水素ホウ素ナトリウム ５ｍｇを添加し、さらに２日間、上記と同一の条件で反応を行った。反応後の溶液を氷浴中で冷却した後、酢酸 ３２μｌを添加して反応を完全に停止させた。２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法により、ＲＡ−ＡＣＨを回収した。得られた沈殿を、エタノール洗浄した後に凍結乾燥し、ＲＡ−ＡＣＨの凍結乾燥物 ２．１ｍｇを得た。
２） ＰＤＰ−ＡＣＨの調製
上記１）で調製したＲＡ−ＡＣＨ ２．１ｍｇを、０．１Ｍ食塩/０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５） １ｍｌに溶解した。この溶液に５ｍＭ ＳＰＤＰエタノール溶液 ８０μlを添加した後、室温にて一晩静置し、２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化反応（ＰＤＰ反応）を行った。過剰のＳＰＤＰを除くために蒸留水を用いて透析を行った後、凍結乾燥し、ＰＤＰ−ＡＣＨの凍結乾燥物 １．７ｍｇを得た。
３） ＳＨ−ＡＣＨの調製
上記２）で調製したＰＤＰ−ＡＣＨ 1.7ｍｇを、０．１Ｍ食塩/０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５） １６０μｌに溶解した。この溶液に、終濃度が２５ｍＭになるようにジチオスレイトールを添加し、６０分間室温にて還元反応を行った。２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法でＳＨ−ＡＣＨを回収した。得られた沈殿を、エタノール洗浄した後に凍結乾燥し、ＳＨ−ＡＣＨの凍結乾燥物 １．３ｍｇを得た。
４） ジスルフィド結合を介したＡＣＨ−ＫＬＨコンジュゲートの調製
上記３）で調製したＳＨ−ＡＣＨ １．３ｍｇ及び参考例２で調製したＰＤＰ−ＫＬＨ ０．６５ｍｇを、０．１Ｍ食塩/０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５） １ｍｌに溶解し、２時間室温にてコンジュゲーション反応を行った。反応中に生成されるピリジル−２−チオンを除くため、上記反応後の溶液を、蒸留水に対して一晩透析した後、凍結乾燥し、ＡＣＨ−ＫＬＨコンジュゲートの凍結乾燥物１．５ｍｇを得た。得られた凍結乾燥物は、後述する実施例３において、ＡＣＨ抗原として用いた。
【実施例３】
【００５５】
ＡＣＨに対して反応する抗体を生産するハイブリドーマ細胞株の樹立
【００５６】
１） マウスの免疫化
上記実施例２の４）で得られたＡＣＨ抗原 1 mgを少量の蒸留水に溶解し、これをTiterMAX Gold（登録商標、シグマ社製）2mlと混合し、抗原溶液を調製した。また、免疫する動物としては、4匹のBALB/Cマウス(6週齢のメス、日本チャールズリバー社製)を用いた。上記の抗原溶液 100μｌ/匹を、2週間毎に2又は3回皮下投与した。血清の抗体価が充分な値に達した時、最終免疫として、アジュバントを含まないＡＣＨ抗原溶液 100μｌ/匹を投与した。最終免疫から３日後、免疫したマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。
【００５７】
なお、上記において、血清中の抗体価の検証は、以下の方法により行った。すなわち、参考例６ １）で作製したＡＣＨ固相化マイクロプレート及びアルカリホスファターゼ標識抗−マウスＩｇＧ＋Ｍ＋Ａ抗体（以下、「ＡＬＰ−抗マウスＩｇ」という）を用い、ＥＬＩＳＡ法により血清中の抗体価を検証した。すなわち、ＰＢＳ（−）で1000倍希釈した血清 50 μlをＡＣＨ固相化マイクロプレートに分注し、３７℃で1時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳ（−）で４回洗浄し、10% ブロックエース（登録商標）/ＰＢＳ（−） で1000倍希釈したALP-抗マウスIg 溶液 50 μlを各ウェルに分注した。さらに、ＰＢＳ（−）で４回洗浄した後、基質溶液(ALPローゼ, シノテスト社製) 50μlを各ウェルに分注し、20分間、室温にて静置した。さらに、発色試薬(シノテスト社製) 50μlを添加し、660nmをバックグラウンド補正として495nmの吸光度を測定した。
２）ハイブリドーマの創製
１）で摘出した脾臓から得られた免疫感作されたリンパ球と、マウスミエローマP3U1細胞(シマ研究所製)とを、4対1ないし5対1の混合比で混合した後、50%のポリエチレングリコール1500(ロシュ社製)中で共遠心分離することによって細胞融合を実施した。なお、上記の細胞融合に用いるミエローマ細胞には、細胞融合の1週間前より、8-アザグアニンを含んだHAT培地で生育させたものを用いた。細胞融合後、HAT培地中で細胞を生育させた細胞を、以下のクローンの選抜に用いた。
３）クローンの選抜及び評価
３−１） クローニング
クローニングには限界希釈法を採用した。すなわち、細胞数がウェル当り１以下になるようにHAT培地で細胞を希釈し、これを９６ウェルマイクロプレートに播種した。これを常法に従って培養し、培養上清液を得た。培養上清液の抗体価の評価を、参考例６ ２）で作製したＢｉ−ＡＣＨ固相化マイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法により行い、クローンを選抜した。以上のクローンニングの工程は、少なくとも2回以上実行した。以上の結果として、１つのクローンを選抜し、取得した。
３−２） クローンの評価
上記３−１）で取得したクローンの活性が維持されていることを確認するため、当該クローンを２４ウェルプレートの培養スケールにて培養し、得られた培養上清液の抗体価の評価を、参考例６ ２）で作製したＢｉ−ＡＣＨ固相化マイクロプレート、及びＨＲＰ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体(以下、「ＨＲＰ抗マウスＩｇ」と記載する、ダコ社製)を用いたＥＬＩＳＡ法により行った。以下に詳細を示す。
[クローンの抗体価の評価]
予め洗浄緩衝液によって4回洗浄したＢｉ−ＡＣＨ固相化マイクロプレートに、培養上清液 100μlを分注し、室温にて1時間静置した。さらに洗浄緩衝液で4回洗浄した後に、反応緩衝液(0.05%プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍に希釈したApplieDuo（登録商標）溶液)で2000倍に希釈したＨＲＰ抗マウスＩｇ 100μlを、各ウェルに分注した。このプレートを室温にて1時間静置した後、洗浄緩衝液で4回洗浄し、ＴＭＢ溶液（HRP基質溶液、BIOFX社製） 100μlを各ウェルに加え、30分間、37℃で酵素反応を行った。反応終了後、発色試薬（BIOFX社製） 100μlを各ウェルに添加し、630nmをバックグラウンド補正として、450nmの吸光度を測定した。なお、反応緩衝液をネガティブブランクとして用いた。その結果、当該クローンが抗ＡＣＨ抗体を生産していることが確認された。樹立したハイブリドーマのクローン番号はACH55であったことから、このハイブリドーマによって産生される抗体を、ＡＣＨ５５抗体と名付けた。上記のハイブリドーマは、平成１８年３月１日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてFERM P-20828が付与された。常法に従って抗体の免疫グロブリンクラスを調べた結果、ＡＣＨ５５抗体の免疫グロブリンクラスはＩｇＭであることを確認した。
【実施例４】
【００５８】
抗ＡＣＨモノクローナル抗体の調製
【００５９】
１） 抗ＡＣＨモノクローナル抗体の生産
目的の抗ＡＣＨモノクローナル抗体を生産する方法としては、マウス腹水法を採用した。すなわち、上記実施例３ ３）で樹立したハイブリドーマ(クローン番号；ACH55) 5×106個を、予めプリスタン（2,6,10,14-Tetrametylpentadecane：東京化成工業）処理した３匹のBALB/Cマウス(15週齢の雌)の腹腔に注入した。注射後10〜20日の間に、マウスの腹水を数回に分けて採取し、合計約10mlの腹水を得た。
２） 抗ＡＣＨモノクローナル抗体の精製
上記１）で得た腹水を、吸着バッファ2(0.5M K2SO4を含む20mM リン酸緩衝液(pH 7.5))に対して一晩透析した。透析内液をメンブランフィルタ(孔径:0.45 μm)によって濾過し、得られた濾過液を、予め吸着バッファ1（20 mMリン酸緩衝液(pH 7.0)）で平衡化したHiTrap IgY Purification HPカラム(5ml、アマシャム・バイオサイエンス社製)にアプライした後、吸着バッファ1でカラムを洗浄した。通過させた洗浄液の280nmの吸収がほぼ0になった時、20 mMリン酸緩衝液(pH 7.5)をカラムに通過させ、ＡＣＨ５５抗体を溶出した。溶出したＡＣＨ５５抗体をNH4SO4(50%の飽和)を用いて塩析することによって回収した。得られた沈澱物をＰＢＳ（−）に対して透析し、精製ＡＣＨ５５抗体 2.2mgを含む透析内液を得た。
【実施例５】
【００６０】
反応性試験
【００６１】
１） ＡＣＨ５５抗体の各種ＧＡＧに対する反応性
１）―１ 方法
Ｂｉ−ＧＡＧの固相化量の異なるマイクロプレートを作製するために、Ｂｉ−ＧＡＧ溶液中のＢｉ−ＧＡＧの終濃度を、0.001, 0.004, 0.012, 0.037, 0.111, 0.333, 1.000 μg/mlと変化させた溶液を用いて、参考例６ ２）と同様の方法でＢｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレートを作製した後、それぞれ洗浄緩衝液で4回洗浄した。その後各ウェルに、添加剤としてApplieDuo（登録商標。最終希釈率２０倍、生化学工業株式会社製）、防腐剤として０．０５％プロクリン３００を含むＰＢＳ（−）（以下、「反応液Ａ」という）を用いて0.06 μg/mlに調製したＡＣＨ５５抗体からなる各試験溶液を１００μｌずつ加え、これを常温で６０分間静置し、抗原抗体反応させた。反応終了後、各ウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄し、二次抗体溶液として、反応液Ａで２０００倍希釈したＨＲＰ抗マウスＩｇ（ダコ社製）溶液を１００μｌずつ加え、これを常温で６０分間静置して抗原抗体反応させた。反応終了後、このプレートを洗浄緩衝液で４回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ溶液（BIOFX社製）を１００μｌずつ 加え、常温で３０分間反応させて発色させた。続いて、プレートに反応停止液（BIOFX社製）を１００μｌずつ 加えて反応を停止させた後、ＴＭＢ分解によって増加する波長４５０nmの吸光度（対照波長６３０nm）をウェルリーダーＳＫ−６０３（登録商標、生化学工業株式会社販売）で測定した。なお、抗体の反応性は、上記の各濃度のＢｉ−ＧＡＧを用いて作製したＢｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレートを用いて上記測定を行った場合の吸光度から、Ｂｉ−ＧＡＧ溶液の代わりにＢｉ−ＧＡＧを含まない０．０５％プロクリン300（登録商標）を含むＰＢＳ（−）で20倍希釈したApplieDuo（登録商標）溶液を用いることの他、参考例６ ２）と同様の方法により作製したコントロール測定用マイクロプレートを用いて上記の測定方法に準じて測定を行った場合の吸光度（ブランク値）を減算した吸光度差（以下、単に「吸光度差」と記載する）によって評価した。
１）−２ 結果
Ｂｉ−ＧＡＧ固相化マイクロプレートのＧＡＧとして、ＮＡＨ、ＡＳ、ＡＣＨ、ＨＳ、ＨＥＰ及びＥＨＳ−ＨＳを用いた場合の結果を、図２に示す。
【００６２】
ＡＣＨ５５抗体は、ＡＣＨに対しては、Ｂｉ−ＡＣＨ濃度を0.01μg/ mL（0.001 μg/ウェル）とした場合においても強く反応（吸光度差=約1.0）した一方で、ＡＳ、ＨＥＰ、ＨＳ、ＮＡＨ、及びＥＨＳ−ＨＳに対しては、Ｂｉ−ＧＡＧ濃度を1.0 μg/ mL（0.1 μg/ウェル）にまで上げた場合においても反応しなかった（図２）。
【００６３】
また、ＡＣＨ５５抗体は上述したＨＥＰの場合と同様に、ＨＡ、各種ＣＳ（ＣＳ−Ａ（Ｗ）， ＣＳ−Ａ（Ｓ）， ＣＳ−Ｂ， ＣＳ−Ｃ， ＣＳ−Ｄ， ＣＳ−Ｅ）、及びＫＳに対しても反応しなかった。
２） ＡＣＨ５５抗体の各種ＨＥＰ誘導体に対する反応性
Ｂｉ−ＨＥＰ誘導体固相化マイクロプレートを用い、各種ＨＥＰ誘導体に対する反応性を評価した。ＨＥＰ誘導体としては、ＮＨ2−ＨＥＰ、ＮＡｃ−ＨＥＰ、６ＤＳＨ、ＮＡｃ−６ＤＳＨ、ＮＨ2−６ＳＨ、６ＳＨ、ＮＨ2−２ＳＨ、２ＳＨ、ＮＳＨ、ＮＡｃ−ＮＳＨ、ＮＨ2−ＣＤＳＨ及びＣＤＳＨを用いた。測定は、上記１）−１に記載の方法に準じて行ったが、この試験においては、固相化に用いるＢｉ−ＨＥＰ誘導体を含む溶液の濃度を1μg/mlに固定した（0.1 μg/ウェル）。結果を図３に示す。
【００６４】
ＡＣＨ５５抗体は、ＣＤＳＨに対しては強く反応し、また、２ＳＨ、６ＳＨとＮＡｃ−ＮＳＨに対しては、極弱く反応した（図３）。
【００６５】
ＡＣＨ５５抗体が強く反応したＡＣＨは、イズロン酸ユニット（−［ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＡｃ］−）を主な構成二糖としていることから、ＡＣＨ５５抗体のエピトープは、イズロン酸ユニットから構成されていると考えられる。また、当該抗体が反応しなかったＮＡＨは、グルクロン酸ユニット（−［ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ］−）からなるＡＣＨのウロン酸Ｃ５−エピマーであることから、特にイズロン酸残基がＡＣＨ５５抗体の抗原認識において必須であることが示唆された。さらに、ＡＳ（イズロン酸残基の２位−水酸基が硫酸化されている）に対して反応性が見られないことから、イズロン酸の硫酸化（ＩｄｏＡ（２Ｓ））は、ＡＣＨ５５抗体の抗原に対する反応性を阻害することが示唆された。
【００６６】
ＣＤＳＨはグルクロン酸ユニット及びイズロン酸ユニットにより構成される多糖であり、イズロン酸ユニットの存在比は60%以上と高い。したがって、ＣＤＳＨが当該抗体と反応した結果に矛盾は無い。また、この反応性はＮ−アセチルグルコサミン残基のＮ−脱アセチル化（ＮＨ２−ＣＤＳＨ）、及びＮ−硫酸化（ＮＳＨ）によって消失したので、グルコサミン残基のアミノ基がアセチル化されていることも、ＡＣＨ５５抗体の抗原の認識において重要であることが示唆された。
【００６７】
ＡＳと反応しない抗体が２ＳＨ、６ＳＨやＮＡｃ−ＮＳＨと弱く反応した理由は、ＨＥＰがＮ−脱硫酸化、２−Ｏ脱硫酸化及び６−Ｏ脱硫酸化等、複数の修飾を経る過程で、イズロン酸ユニットがＨＥＰ誘導体中に顕在化したためと推察した。
【実施例６】
【００６８】
組織染色
【００６９】
ラット小脳凍結切片を用いて免疫組織染色における染色性を検討した。
【００７０】
ＳＤラット（日本チャールスリバー社、８週齢、雄）をジエチルエーテル（和光純薬工業社製）で麻酔し、腹部大動脈より放血、屠殺後、小脳を摘出した。摘出した小脳をＯＣＴコンパウンド（三共マイルス社製）に包埋し、アセトン・ドライアイスで凍結させ、クリオスタット（ライカ社販売）にて厚さ6μmの切片を作製した。
【００７１】
作製した切片を２時間常温にて風乾後、冷アセトン（４℃）で固定を行い、さらに常温で１時間風乾した。この後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄し、０．１％アジ化ナトリウム（和光純薬工業社製）−０．３％過酸化水素水（和光純薬工業社製）を含む蒸留水中に常温で１０分間浸漬し、内因性のペルオキシダーゼ活性を除去した後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄し、０．１％ＢＳＡ及び０．１％カゼイン（和光純薬工業社製）を含むＰＢＳ（−）でブロッキングを常温で６０分間行った。
【００７２】
０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄後、アビジン−ビオチンブロッキングキット（ＶＥＣＴＯＲ社製）にて内因性のビオチンのブロッキングを行った。
【００７３】
この後０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．１％ＢＳＡ及び０．１％カゼインを含むＰＢＳ（−）で１μg/mLに希釈したＡＣＨ５５抗体を４℃で一晩反応させた。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄後、１０％ラット血清を含むビオチン標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（ＪＡＣＫＳＯＮ社製）を０．１％ＢＳＡ及び０．１％カゼインを含むＰＢＳ（−）で５００倍に希釈し、常温で３０分間反応させた。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ニチレイ社製）を常温にて３０分間反応させた。０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で洗浄後、ＤＡＢ発色キット（Ｚｙｍｅｄ社製）にて茶色の発色反応を行った。
【００７４】
発色後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）に浸漬し反応を停止させ、常水にて５分間洗浄した。この後、対比染色を行うためヘマトキシリン（ＤＡＫＯ社製）にて核染色（青色）を行った。常水にて５分間洗浄後、常法に従い脱水、透徹操作を行い封入した。
【００７５】
得られた染色像を図４に示す。プルキンエ細胞に陽性反応が観察された（矢印）。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明抗体は、ＡＣＨの検出に好適に用いることができることから極めて有用である。また、本発明抗原及び本発明ハイブリドーマは、本発明抗体の効率的な生産のために用いることができることから極めて有用である。また、本発明ＡＣＨ検出方法によれば、ＡＣＨを好適に検出することができることから極めて有用である。また、本発明検出キットは、これを用いることにより、本発明検出方法をより効率的且つ簡便に行うことを可能にすることから極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】各種ＨＥＰ誘導体の製造方法の流れを示す図である。
【図２】ＡＣＨ５５抗体の各種ＧＡＧに対する反応性を示す図である。横軸のＢｉ−ＧＡＧ（μg/ml）は、Ｂｉ−ＧＡＧ固相化プレートの作製において用いたＢｉ−ＧＡＧ溶液におけるＢｉ−ＧＡＧの終濃度を示す。
【図３】ＡＣＨ５５抗体の各種ＨＥＰ誘導体等に対する反応性を示す図である。
【図４】ＡＣＨ５５抗体を用いたラット小脳の組織染色の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸に対して反応する抗体。
【請求項２】
アカラン硫酸に対して実質的に反応しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｎ−アセチルヘパロザンに対して実質的に反応しない、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
ブタ腸由来のヘパリンに対して実質的に反応しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
ウシ腎臓由来のヘパラン硫酸に対して実質的に反応しない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
マウスのエンジェルブレス-ホーム-スワーン腫瘍組織由来のヘパラン硫酸に対して実質的に反応しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
タンパク質と２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸とを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と、哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
リンパ球及びミエローマ細胞がマウス由来である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
免疫グロブリンクラスがＩｇＭである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項１２】
タンパク質と２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸とを化学的に結合させてなる物質であって、２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸に対して反応する抗体を産生させ得る抗原性を有する物質。
【請求項１３】
タンパク質と２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸とを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマ。
【請求項１４】
リンパ球及びミエローマ細胞がマウス由来である、請求項１３に記載のハイブリドーマ。
【請求項１５】
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマ。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在する２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸の検出方法。
【請求項１７】
試料が、体液、細胞、組織、又は、細胞若しくは微生物の培養物から選択されるものに由来する、請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を少なくとも含む、試料中に存在する２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸の検出キット。
【請求項１９】
試料が、体液、細胞、組織、又は、細胞若しくは微生物の培養物から選択されるものに由来する、請求項１８に記載の検出キット。
【請求項１】
２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸に対して反応する抗体。
【請求項２】
アカラン硫酸に対して実質的に反応しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｎ−アセチルヘパロザンに対して実質的に反応しない、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
ブタ腸由来のヘパリンに対して実質的に反応しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
ウシ腎臓由来のヘパラン硫酸に対して実質的に反応しない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
マウスのエンジェルブレス-ホーム-スワーン腫瘍組織由来のヘパラン硫酸に対して実質的に反応しない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
タンパク質と２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸とを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と、哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
リンパ球及びミエローマ細胞がマウス由来である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
免疫グロブリンクラスがＩｇＭである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項１２】
タンパク質と２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸とを化学的に結合させてなる物質であって、２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸に対して反応する抗体を産生させ得る抗原性を有する物質。
【請求項１３】
タンパク質と２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸とを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されるハイブリドーマ。
【請求項１４】
リンパ球及びミエローマ細胞がマウス由来である、請求項１３に記載のハイブリドーマ。
【請求項１５】
独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM P-20828であるハイブリドーマ。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を試料に接触させる工程を少なくとも含むことを特徴とする、当該試料中に存在する２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸の検出方法。
【請求項１７】
試料が、体液、細胞、組織、又は、細胞若しくは微生物の培養物から選択されるものに由来する、請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体を少なくとも含む、試料中に存在する２−Ｏ−脱硫酸化アカラン硫酸の検出キット。
【請求項１９】
試料が、体液、細胞、組織、又は、細胞若しくは微生物の培養物から選択されるものに由来する、請求項１８に記載の検出キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−２９７３３６（Ｐ２００７−２９７３３６Ａ）
【公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２７０４６（Ｐ２００６−１２７０４６）
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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