抗Ｅセレクチン抗体による認知症予防効果
【課題】虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害を予防するのに有用な組成物、予防方法などを提供すること
【解決手段】本発明は、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物を提供する。１つの実施形態において、本発明の組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与されることを特徴とする。本発明はまた、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物を提供する。１つの実施形態において、本発明の組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与されることを特徴とする。本発明はまた、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管性認知症、特に、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害の予防の技術に関する。本発明は、特に、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物を用いて、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害を予防することに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、認知症の患者数は１６０〜１８０万人、有病率は６５歳以上の８％程度といわれている。年齢別にみると、６０歳代で１％、７０歳代で５％、８０歳代で２０％の有病率である。急速な高齢化で２０３０年頃の患者数は３００万人を超えると予想されている。原因疾患はアルツハイマー病が最も多く、次いで脳血管障害が原因で発病する血管性認知症の患者が多い。血管性認知症の中で虚血性大脳性白質病変を特徴とする皮質下の血管性認知症の患者数は血管性認知症患者の半数以上を占めており、人口の高齢化に伴い増加傾向にあり、血管性認知症の予防・治療戦略上、最も重要な対象疾患となっている。
【０００３】
さらに、皮質下の血管性認知症の症状は緩徐進行性であり、血管性危険因子の管理、抗血小板などの治療を行っても進行の抑制が困難なため、その新規治療法の開発が急務である。
【０００４】
近年、血管性認知症モデル動物を用いて脳虚血処置後に薬物を投与し、その薬物が脳に与える影響が報告されている（非特許文献１〜３、６および７）。また、脳虚血処置の前に薬物を投与した場合の効果が報告されている（非特許文献４および５）。しかし、非特許文献１〜７の方法では、薬物を繰り返し投与する必要があり、薬効の持続性は低いものであった。非特許文献１〜７には、１回の静脈内投与により、ほぼ１００％に近い有効性が１か月間も持続するという効果は記載されていない。
【０００５】
非特許文献６には、閉塞後の薬物（シロスタゾール：ｃｉｌｏｓｔａｚｏｌ）投与が大脳低灌流により誘導された白質損傷および認知障害に対して保護効果を示したことが記載されている。しかし、非特許文献６では、神経線維脱落という白質損傷の程度自体の病理学的検討はされていない。また、非特許文献６では、シロスタゾールの投与により脳低灌流により誘導された障害の程度が軽減されることが報告されているだけであり、それらを完全に防ぐことはできていない。
【０００６】
非特許文献８には、一過性大脳虚血マウスにおいて、抗Ｅセレクチン抗体を投与すると神経系の欠損、死亡率、梗塞サイズ等が用量依存的に減少することが記載されている。非特許文献９には、一過性虚血ヒヒにおいて、ＥセレクチンおよびＰセレクチンに対する抗体を投与すると、プラセボと比べて皮質への多形核白血球浸潤の減少、梗塞サイズの減少、神経学的スコアの改善等が認められると記載されている。しかし、非特許文献８および９では、急性期の病変しか検討されていない。また、神経学的スコアによる急性期の運動麻痺が観察されているだけであり、慢性期に生じる記憶機能障害については何ら記載されていない。
【０００７】
特許文献１には、血管性認知症を処置、予防することが記載されている。特許文献２には、Ｅセレクチンにより脳卒中に関連した組織損傷を軽減することが記載されている。しかし、特許文献１および２には、抗Ｅセレクチン抗体を用いて虚血による大脳皮質損傷および記憶機能の低下を完全に予防することは記載されていない。また、１回の静脈内投与により、ほぼ１００％に近い有効性が１か月間も持続するという効果も記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／０２８１３３号パンフレット
【特許文献２】特表２００４−５０３４７１号（国際公開第２００１／８９５５７号パンフレット）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ １０（１９９９）１４６１−１４６５
【非特許文献２】Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９８０（２００３）１５６−１６０
【非特許文献３】Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９９２（２００３）５３−５９
【非特許文献４】Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ ７５（２００３）６３５−６４３
【非特許文献５】Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ Ａｎａｌｏｇｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ（２００３）
【非特許文献６】Ｓｔｒｏｋｅ ３７（２００６）１５３９−１５４５
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １５（２００８）１７４−１７８
【非特許文献８】Ｓｔｒｏｋｅ ３１（２０００）３０４７−３０５３
【非特許文献９】Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１（２００２）９０７−９１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害を予防するのに有用な組成物、予防方法などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究の結果、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物が、血管性認知症（特に、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害）において予想外に治療効果を上げることを見出し、本発明を完成させるに至ったものである。
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）
虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための組成物であって、該組成物は抗Ｅセレクチン抗体を含む、組成物。
（項目２）
前記組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物は、虚血が生じた約２時間後に投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目４）
前記大脳白質損傷が脳梁の神経線維脱落である、上記項目に記載の組成物。
（項目５）
前記大脳白質損傷が脳梁の神経線維脱落であり、前記組成物が、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目６）
前記組成物は、被験体に対して約０．１〜約５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目７）
前記組成物は、投与１日後の血清中抗体濃度が、約５０μｇ／ｍｌ〜約１３０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目８）
前記組成物は、投与１週間後の血清中抗体濃度が、約３０μｇ／ｍｌ〜約７０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目９）
前記組成物は、投与２週間後の血清中抗体濃度が、約２０μｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目１０）
前記組成物は、投与４週間後の血清中抗体濃度が、約４μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目１１）
前記組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で静脈投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目１２）
前記大脳白質損傷が脳梁の神経線維脱落であり、前記組成物は、虚血が生じた約２時間後に約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で静脈投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目１３）
虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防する方法であって、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目１４）
虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための医薬の製造における抗Ｅセレクチン抗体の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物が、それ自体で血管性認知症を効果的に治療できることが初めて見出された。このような組成物は、本発明によって初めて提供されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本実施例１において調製した抗Ｅセレクチン抗体が、白血球と血管内皮細胞との接着阻止効果を有することを示す。縦軸は、内皮細胞と接着したＴＨＰ−１細胞の数を示す。横軸上段の「−」はＴＮＦ−αを添加しなかったことを示し、「＋」はＴＮＦ−αを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加したことを示す。Ｙ軸下段の「−」は抗Ｅセレクチン抗体を添加しなかったことを示し、各数字は添加した抗Ｅセレクチン抗体の濃度（３、１０、３０μｇ／ウェル）を示す。シャープ（＃）はｐ＜０．０１ ｖｓ コントロール（ＴＮＦ−α（-）、抗Ｅセレクチン抗体（-））を示し、アスタリスク（＊）はｐ＜０．０１ ｖｓ （ＴＮＦ−α（＋）、抗Ｅセレクチン抗体（-））を示す。値は平均値±標準偏差である。
【図２】図２は、血清中の抗Ｅセレクチン阻止抗体濃度を示す。縦軸は血清中の抗Ｅセレクチン阻止抗体濃度（μｇ／ｍｌ）であり、横軸は抗体濃度を測定した時間を示す。１ｄ：投与１日後、１ｗ：投与１週間後、２ｗ：投与２週間後、４ｗ：投与４週間後。値は平均値±標準偏差である。
【図３】図３は、抗Ｅセレクチン阻止抗体または正常マウス免疫グロブリンを投与したラットにおける、記憶機能検査（物品認識検査）の結果である。縦軸はｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘである。ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘは横軸は記憶機能検査を行った時期を示す（Ａ：虚血手術前、Ｂ：術後２週間、Ｃ：術後４週間）。菱形：抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群、四角：正常マウス免疫グロブリン投与群、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１（統計処理は、ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ （ＡＮＯＶＡ）と、ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔとして Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法により行った）。値は平均値±標準偏差である。
【図４】図４は、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群および正常マウス免疫グロブリン投与群における脳梁の病理像を示す。図４Ａ：正常マウス免疫グロブリン投与群、図４Ｂ：抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群。
【図５】図５は、抗Ｅセレクチン阻止抗体または生理食塩水を投与したマウスにおける、記憶機能検査（物品認識検査）の結果である。縦軸は識別指数である。横軸の「Ａ」は、虚血手術前に記憶機能検査を行った結果を示し、横軸「Ｂ」は、虚血手術４週間後に記憶機能検査を行った結果を示す。白：偽手術（生理食塩水投与）群（ｎ＝４）、斜線：偽手術（抗Ｅセレクチン阻止抗体投与）群（ｎ＝３）、黒：虚血（生理食塩水投与）群（ｎ＝６）、格子：虚血（抗Ｅセレクチン阻止抗体投与）群（ｎ＝７）。＊：ｐ＜０．０５（統計処理は、＊：非等分散の2標本を対象とするt検定、＊＊：対をなすデータのt検定を行った）。値は平均値±標準偏差である。
【図６】図６は、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群および生理食塩水投与群における脳梁の神経線維の脱落を線維蜜度により評価した結果を示す。縦軸は相対的線維密度（ｐｉｘｅｌ）である。横軸の「Ａ」は、偽手術群の結果を示し、横軸「Ｂ」は、虚血群の結果を示す。白：生理食塩水投与群、グレー：抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群。各群４匹を検討した。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。（統計処理は、＊：非等分散の2標本を対象とするt検定、＊＊：対をなすデータのt検定を行った）。値は平均値±標準偏差である。
【図７】図７は、血管性認知症モデルにおける血管閉塞後の脳梁におけるＴＮＦ−α陽性の血管を検索した結果である。縦軸は、１切片あたりの脳梁内のＴＮＦ−α陽性血管の数である。横軸は検索した時期を示す。１ｄａｙ：手術１日後、３ｄａｙｓ：手術３日後、７ｄａｙｓ：手術７日後、１４ｄａｙｓ：手術１４日後、３０ｄａｙｓ：手術３０日後。「ｎ」は実験に用いたラット数。値は平均値±標準偏差である。
【図８】図８は、血管性認知症モデルの脳梁におけるＴＮＦ−αの発現を検討した結果を示す。Ａ：虚血手術１日後、Ｂ：虚血手術１４日後、Ｃ：虚血手術３０日後。バーは５０μｍを示す。
【図９】図９は、血管性認知症モデルにおける血管閉塞後の脳梁におけるＥセレクチン陽性の血管を検索した結果である。縦軸は、１切片あたりのＥセレクチン陽性血管の数である。横軸は検索した時期を示す。１ｄａｙ：手術１日後、３ｄａｙｓ：手術３日後、７ｄａｙｓ：手術７日後、１４ｄａｙｓ：手術１４日後、３０ｄａｙｓ：手術３０日後。「ｎ」は実験に用いたラット数。値は平均値±標準偏差である。
【図１０】図１０は、血管性認知症モデルの脳梁におけるＥセレクチンの発現を検討した結果を示す。Ａ：虚血手術１日後、Ｂ：虚血手術１４日後、Ｃ：虚血手術３０日後。バーは５０μｍを示す。
【図１１】図１１は、血管性認知症モデルにおける血管閉塞後の脳梁における活性化したミクログリアを検索した結果である。縦軸は、１切片あたりの活性化したミクログリアの数である。横軸は検索した時期を示す。１ｄａｙ：手術１日後、３ｄａｙｓ：手術３日後、７ｄａｙｓ：手術７日後、１４ｄａｙｓ：手術１４日後、３０ｄａｙｓ：手術３０日後。「ｎ」は実験に用いたラット数。値は平均値±標準偏差である。
【図１２】図１２は、血管性認知症モデルの脳梁における活性化したミクログリアを検討した結果を示す。Ａ：虚血手術１日後、Ｂ：虚血手術１４日後、Ｃ：虚血手術３０日後。バーは５０μｍを示す。
【図１３】図１３は、血管性認知症モデルにおける血管閉塞後の脳梁におけるＣＤ４＋ Ｔリンパ球浸潤を検索した結果である。縦軸は、１切片あたりの、浸潤したＣＤ４＋ Ｔリンパ球の数である。横軸は検索した時期を示す。１ｄａｙ：手術１日後、３ｄａｙｓ：手術３日後、７ｄａｙｓ：手術７日後、１４ｄａｙｓ：手術１４日後、３０ｄａｙｓ：手術３０日後。「ｎ」は実験に用いたラット数。値は平均値±標準偏差である。
【図１４】図１４は、血管性認知症モデルの脳梁におけるＣＤ８＋ リンパ球浸潤を検討した結果を示す。Ａ：虚血手術１日後、Ｃ：虚血手術１４日後、Ｄ：虚血手術３０日後。バーは５０μｍを示す。
【図１５】図１５は、血管性認知症モデルにおける血管閉塞後の脳梁におけるＣＤ８＋ リンパ球浸潤を検索した結果である。縦軸は、１切片あたりの、浸潤したＣＤ８＋ リンパ球の数である。横軸は検索した時期を示す。１ｄａｙ：手術１日後、３ｄａｙｓ：手術３日後、７ｄａｙｓ：手術７日後、１４ｄａｙｓ：手術１４日後、３０ｄａｙｓ：手術３０日後。「ｎ」は実験に用いたラット数。値は平均値±標準偏差である。
【図１６】図１６は、血管性認知症モデルの脳梁におけるＣＤ８＋ リンパ球浸潤を検討した結果を示す。Ａ：虚血手術１日後、Ｂ：虚血手術１４日後、Ｃ：虚血手術３０日後。バーは５０μｍを示す。
【図１７】図１７は、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群および正常マウス免疫グロブリン投与群における脳梁の繊維密度を示す棒グラフである（統計処理は、対をなさないデータのt検定を行った）。値は平均値±標準誤差である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１６】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を適宜説明する。
【００１７】
本明細書において「虚血」とは、当該分野において通常用いられるものと同様の意味で使用され、主に動脈の狭窄または中断による、血液供給の器質的障害により引き起こされる局所性貧血をいう。虚血としては、例えば、例示的に、脳虚血などが挙げられる。
【００１８】
本明細書において「脳虚血」とは、脳への血液供給が低下または遮断されることにより引き起こされる局所性貧血をいう。
【００１９】
本明細書において「虚血により誘導される」とは、虚血が直接的または間接的な原因となって何らかの事象が発生することをいう。
【００２０】
本明細書において「大脳白質損傷」とは、大脳白質が損なわれ傷つくことをいう。大脳白質損傷としては、例えば、脳梁の神経線維脱落、線条体の神経線維脱落、内包の神経線維脱落、前交連の神経線維脱落などが挙げられる。
【００２１】
虚血により誘導される大脳白質損傷を「予防」するとは、大脳白質損傷が発生する前に、何らかの手段により、その大脳白質損傷を生じさせないかまたは少なくとも遅延させること、あるいは虚血自体が生じたとしてもそれが原因の障害が生じないような状態にすることをいう。
【００２２】
また、本明細書において、血管性認知症を「治療」するとは、既に発症している病気の進行を食い止めるか、または完全または部分的に拘わらず、認知症の症状が改善することをいう。血管性認知症は長期間にわたる慢性疾患であることから、血管性認知症の患者に抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物を投与することによって、既に発症している病気の進行を食い止めることにも意義があるというべきである。
【００２３】
本明細書において「記憶機能」とは、過去に体験したこと、覚えたことなどを忘れずに心にとめておくための機能をいう。記憶機能は、例えば、物品認識検査、水迷路検査、Ｔ字型迷路検査、Ｙ字型迷路検査、放射状迷路検査などにより判定することができる。物品認識検査は、物品を認識する場合、以前から記憶している対象より、被験体が新しい対象により多くの興味を持つことを利用した記憶検査である。
【００２４】
虚血により誘導される記憶機能の低下を「予防」するとは、記憶機能の低下が発生する前に、何らかの手段により、その記憶機能の低下を生じさせないかまたは少なくとも遅延させること、あるいは虚血自体が生じたとしてもそれが原因の記憶機能の低下が生じないような状態にすることをいう。
【００２５】
本明細書において「抗Ｅセレクチン阻止抗体」とは、Ｅセレクチンによって惹起された特異的なアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子をいう。本明細書において「抗Ｅセレクチン阻止抗体」と「抗Ｅセレクチン抗体」とは交換可能に使用され得る。
【００２６】
本明細書において「被験体」とは、虚血により誘導される大脳白質損傷または記憶機能を低下の予防の対象とされる動物をいう。本発明が対象とする動物は、例えば、鳥類、哺乳動物などであってもよい。好ましくは、そのような動物は、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモットなどの小動物が用いられ得る。
【００２７】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【００２８】
（組成物）
１つの局面において、本発明は、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための組成物を提供する。本発明の組成物は抗Ｅセレクチン抗体を含み得る。
【００２９】
本発明の組成物は、長期にわたって虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害を完全に予防するという顕著な効果を発揮し、このような顕著な効果は本発明の組成物により初めて達成されたものである。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明の組成物に含まれる抗Ｅセレクチン抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２５１５として寄託されたハイブリドーマまたはその子孫により生産された抗体であり得るが、これらに限定されない。
【００３１】
上記のようなモノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法を用いて容易に産生可能であるが、この抗体は、例えば、以下のようにして産生することが可能である。
【００３２】
マウスＢａｌｂ／ｃ（雌性６週齢）に、プリスタン０．５ｍＬ／マウスを投与する。ハイブリドーマを、定法に従って、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ，ペニシリン（Ｐｃ）＋ストレプトマイシン（Ｓｔ）含有）培地で、５％ＣＯ２、３７℃で培養する。ＰＢＳに細胞を懸濁して、５×１０６細胞／マウスでマウスの腹腔内に投与する。約２週間後に腹水を採取する。採取した腹水を硫酸アンモニウム沈殿し、沈殿物をＰＢＳに溶解させ、ＰＢＳ緩衝液で透析を行う。得られた透析後の抗体含有溶液を、プロテインＧカラムに通す。カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、０．１Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ２．７）をカラムに通して、プロテインＧに結合したモノクローナル抗体を溶出し、得られた溶出液を１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ９．０）で中和する。その後、ＰＢＳ緩衝液で再び透析を行い、実質的に精製されたモノクローナル抗体を得る。このようにして得られたモノクローナル抗体の濃度は、当該分野で周知のタンパク質濃度測定法（例えば、Ｂｉｏ−ＲａｄのＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを使用する方法）により測定可能である。
【００３３】
他の実施形態において、本発明の組成物に含まれ得る抗Ｅセレクチン抗体としては、例えば、抗Ｅセレクチン抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ：ＢＢＡ２、ＢＢＡ１６、ＢＢＡ２６）、抗Ｅセレクチン抗体（ａｂｃａｍ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ：ａｂ８１６５）、抗Ｅセレクチン抗体（ＭＯＮＯＳＡＮ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ：ＭＯＮ６０１１）、抗Ｅセレクチン抗体（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ：ＢＭ２３０７）が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、Ｅセレクチンの持つ白血球と血管内皮細胞との接着等の炎症機構を阻止すれば、同様の効果が得られると考えられるからである。
【００３４】
虚血により誘導される記憶機能の低下は、例えば、物品認識検査、水迷路検査、Ｔ字型迷路検査、Ｙ字型迷路検査、放射状迷路検査などにより判定することができる。
【００３５】
物品認識検査は、物品を認識する場合、以前から記憶している対象より、被験体が新しい対象により多くの興味を持つことを利用した記憶検査である。ラットまたはマウスでは物品認識試験は、以下のように実施される。部屋の明かりを消し、ガラス水槽の床から７０ｃｍの高さに１００Ｗの蛍光灯を点ける。試験前日に１０分間、被験体を縦３０ｃｍ横４５ｃｍ高さ３０ｃｍのガラス水槽に入れ、環境に慣れさせる。試験当日は１時間間隔で２つの探索行動を行わせる。３種類の対象（プラスチック製の玩具各２個；それぞれ高さ６ｃｍの青色の円柱、赤色の立方体、緑色の三角錐）から任意に１種類（同じもの２個）の対象を選び、ガラス水槽の中に壁から５ｃｍ離した位置に置く。その中に被験体を１回目は６分間探索させる。１時間後、１個の対象を別の種類に変え、６分間探索させる。各対象の探索時間を計測し、以前に１度探索した対象を２度目に探索した時間の合計をＴＦとし、変更した後の対象の探索時間の合計をＴＮとする。探索の定義は被験体が髭や鼻で対象に触るか２ｃｍ以内に鼻を近づけた場合とする。ＴＮ−ＴＦ／ＴＮ＋ＴＦをｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘとし、記憶機能をこの指標を基に評価することができる。指標の数値が大きい程、１回目の探索対象を記憶していると考えられ、記憶機能が高いと考えられる。
【００３６】
他の実施形態において、本発明の組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与され得る。なぜなら、Ｅセレクチンが虚血により脳内の血管内皮細胞に誘導されている時間を通じて有効血中濃度が維持されると考えられるからである。好ましくは、本発明の組成物は、虚血が生じた約２時間後に投与され得る。
【００３７】
他の実施形態において、本発明の組成物により予防され得る大脳白質損傷は、例えば、脳梁の神経線維脱落、線条体の神経線維脱落などであり得る。この大脳白質損傷は、組織学的検索（例えば、Ｋｌｕｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ染色、エオシン−ヘマトキシリン染色など）、神経線維の構成成分に対する免疫染色（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔやｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎに対する抗体を用いた免疫染色）、神経線維に対する染色法（Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ染色および当該分野で周知のその改変法）により評価することができる。
【００３８】
他の実施形態において、本発明の組成物により予防され得る大脳白質損傷は、脳梁の神経線維脱落であり、この組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与され得る。
【００３９】
他の実施形態において、本発明の組成物は、被験体に対して約０．１〜約５ｍｇ／体重ｋｇの抗Ｅセレクチン抗体の量で投与され得る。本発明の組成物は、例えば、約０．１〜約５ｍｇ／体重、好ましくは約０．５〜約３ｍｇ／体重、より好ましくは約０．７５〜約２ｍｇ／体重、最も好ましくは約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重で投与され得るが、これらに限定されない。
【００４０】
他の実施形態において、本発明の組成物は、投与１日後の血清中抗体濃度が、約５０μｇ／ｍｌ〜約１３０μｇ／ｍｌとなるように投与され得るが、これらに限定されない。投与１日後の血中抗体濃度の上限は、約１３０μｇ／ｍｌ、またはそれより大きくてもよく、あるいは、約１２９μｇ／ｍｌ、約１２８μｇ／ｍｌ、約１２７μｇ／ｍｌ、約１２６μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１２０μｇ／ｍｌ、約１１５μｇ／ｍｌ、約１１０μｇ／ｍｌ、約１０５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１０５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約６５μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約５９μｇ／ｍｌ、約５８μｇ／ｍｌ、約５７μｇ／ｍｌ、約５６μｇ／ｍｌ、約５５μｇ／ｍｌ、約５４μｇ／ｍｌ、約５３μｇ／ｍｌ、約５２μｇ／ｍｌ、約５１μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌであり得る。投与１日後の血中抗体濃度の下限は、約５０μｇ／ｍｌ、またはそれより小さくてもよく、あるいは、約５１μｇ／ｍｌ、約５２μｇ／ｍｌ、約５３μｇ／ｍｌ、約５４μｇ／ｍｌ、約５５μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約６５μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約６５μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約８５μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約９５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１０５μｇ／ｍｌ、約１１０μｇ／ｍｌ、約１１５μｇ／ｍｌ、約１２０μｇ／ｍｌ、約１２１μｇ／ｍｌ、約１２２μｇ／ｍｌ、約１２３μｇ／ｍｌ、約１２４μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１２６μｇ／ｍｌ、約１２７μｇ／ｍｌ、約１２８μｇ／ｍｌ、約１２９μｇ／ｍｌ、約１３０μｇ／ｍｌであり得る。投与１日後の血中抗体濃度は、例えば、上記の上限および下限を結ぶ範囲にわたる、約５０μｇ／ｍｌ〜約１３０μｇ／ｍｌの範囲内に入る任意の数値範囲であり得る。
【００４１】
他の実施形態において、本発明の組成物は、投与１週間後の血清中抗体濃度が、約３０μｇ／ｍｌ〜約７０μｇ／ｍｌとなるように投与され得るが、これらに限定されない。投与１日後の血中抗体濃度の上限は、約７０μｇ／ｍｌ、またはそれより大きくてもよく、あるいは、約６９μｇ／ｍｌ、約６８μｇ／ｍｌ、約６７μｇ／ｍｌ、約６６μｇ／ｍｌ、約６５μｇ／ｍｌ、約６４μｇ／ｍｌ、約６３μｇ／ｍｌ、約６２μｇ／ｍｌ、約６１μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約５５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約５５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約４５μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約３９μｇ／ｍｌ、約３８μｇ／ｍｌ、約３７μｇ／ｍｌ、約３６μｇ／ｍｌ、約３５μｇ／ｍｌ、約３４μｇ／ｍｌ、約３３μｇ／ｍｌ、約３２μｇ／ｍｌ、約３１μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌであり得る。投与１週間後の血中抗体濃度の下限は、約３０μｇ／ｍｌ、またはそれより小さくてもよく、あるいは、約３１μｇ／ｍｌ、約３２μｇ／ｍｌ、約４３μｇ／ｍｌ、約３４μｇ／ｍｌ、約３５μｇ／ｍｌ、約３６μｇ／ｍｌ、約３７μｇ／ｍｌ、約３８μｇ／ｍｌ、約３９μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約４５μｇｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約５５μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約６１μｇ／ｍｌ、約６２μｇ／ｍｌ、約６３μｇ／ｍｌ、約６４μｇ／ｍｌ、約６５μｇ／ｍｌ、約６６μｇ／ｍｌ、約６７μｇｍｌ、約６８μｇ／ｍｌ、約６９μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌであり得る。投与１日後の血中抗体濃度は、例えば、上記の上限および下限を結ぶ範囲にわたる、約３０μｇ／ｍｌ〜約７０μｇ／ｍｌの範囲内に入る任意の数値範囲であり得る。
【００４２】
他の実施形態において、本発明の組成物は、投与２週間後の血清中抗体濃度が、約２０μｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌとなるように投与され得るが、これらに限定されない。投与１日後の血中抗体濃度の上限は、約４０μｇ／ｍｌ、またはそれより大きくてもよく、あるいは、約３９μｇ／ｍｌ、約３８μｇ／ｍｌ、約３７μｇ／ｍｌ、約３６μｇ／ｍｌ、約３５μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約２４μｇ／ｍｌ、約２３μｇ／ｍｌ、約２２μｇ／ｍｌ、約２１μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌであり得る。投与２週間後の血中抗体濃度の下限は、約２０μｇ／ｍｌ、またはそれより小さくてもよく、あるいは、約２１μｇ／ｍｌ、約２２μｇ／ｍｌ、約２３μｇ／ｍｌ、約２４μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約３５μｇ／ｍｌ、約３６μｇ／ｍｌ、約３７μｇ／ｍｌ、約３８μｇ／ｍｌ、約３９μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌであり得る。投与１日後の血中抗体濃度は、例えば、上記の上限および下限を結ぶ範囲にわたる、約２０μｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌの範囲内に入る任意の数値範囲であり得る。
【００４３】
他の実施形態において、本発明の組成物は、投与４週間後の血清中抗体濃度が、約４μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌとなるように投与され得るが、これらに限定されない。投与１日後の血中抗体濃度の上限は、約１０μｇ／ｍｌ、またはそれより大きくてもよく、あるいは、約９．９μｇ／ｍｌ、９．８μｇ／ｍｌ、約９．７μｇ／ｍｌ、約９．６μｇ／ｍｌ、約９．５μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約８．５μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約６．５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約５．５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約４．５μｇ／ｍｌ、約４．４μｇ／ｍｌ、約４．３μｇ／ｍｌ、約４．２μｇ／ｍｌ、約４．１μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌであり得る。投与２週間後の血中抗体濃度の下限は、約４μｇ／ｍｌ、またはそれより小さくてもよく、あるいは、約４．１μｇ／ｍｌ、約４．２μｇ／ｍｌ、約４．３μｇ／ｍｌ、約４．４μｇ／ｍｌ、約４．５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約５．５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約６．５μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約８．５μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約９．５μｇ／ｍｌ、約９．６μｇ／ｍｌ、約９．７μｇ／ｍｌ、約９．８μｇ／ｍｌ、約９．９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌであり得る。投与１日後の血中抗体濃度は、例えば、上記の上限および下限を結ぶ範囲にわたる
約４μｇ／ｍｌ〜約１０ｍμｇ／ｍｌの範囲内に入る任意の数値範囲であり得る。。
【００４４】
本発明の組成物の血清中抗体濃度を測定する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ブロット法などが挙げられるが、これらに限定されない。一般には、ＥＬＩＳＡ法が使用される。ＥＬＩＳＡ法は、例えば、以下のように実施され得る。定法に従って、プラスチックプレートのウェルに抗原物質を吸着させ、一次抗体として血清等の濃度未知の抗体を含む溶液を添加して、抗原抗体複合物を形成させる。ウェル中の抗原抗体複合物に、酵素を標識した既知の二次抗体を反応させた後、二次抗体に結合した酵素に特異的な基質をウェルに添加する。一定時間反応させた後、プレートリーダー等により吸光度を測定して、抗体濃度を評価する。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で投与され得る。好ましくは、本発明の組成物は、血管を介する投与法（例えば、静脈内投与、動脈内投与）により投与され得るが、これらに限定されない。
【００４６】
より好ましい実施形態において、本発明の組成物により予防され得る大脳白質損傷は、脳梁の神経線維脱落、線条体の神経線維脱落であり、本発明の組成物は、虚血が生じた約２時間後に約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で静脈内投与され得る。
【００４７】
本発明の組成物は、必要に応じて、適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、蛍光色素、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよび／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の組成物は、抗Ｅセレクチン抗体、および必要に応じて他の有効成分を、少なくとも１つの生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、ミセル、注射溶液、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的に使用される他の物質を補充することが可能である。
【００４８】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくは、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、好ましくは、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられる。
【００４９】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ約７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ約４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【００５０】
以下に本発明の組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品および水産薬組成物等についても公知の調製法により製造することができることに注意されたい。
【００５１】
本発明の組成物などは、薬学的に受容可能なキャリアと必要に応じて配合し、例えば、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸収剤、湿潤剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には、抗Ｅセレクチン抗体以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、皮膚投与など等が挙げられるがそれらに限定されない。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製について、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することは、当業者の技術範囲内である。
【００５２】
液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。
【００５３】
液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５４】
液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
【００５５】
液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５６】
液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５７】
液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５８】
液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５９】
液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６０】
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液または他の目的のための注射部位における溶媒と等張であることが好ましい。通常、これらは、細菌保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射などによって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。
【００６１】
さらに、本発明の組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
【００６２】
本発明において使用される物質、組成物等の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の方法を被験体に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。投与する量は、処置されるべき部位が必要とする量を見積もることによって確定することができる。
【００６３】
（予防方法）
別の局面において、本発明は、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防する方法を提供する。この方法は、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物を投与する工程を包含し得る。ここで抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物は、上述の（組成物）に記載される任意の形態が使用され得る。
【００６４】
（使用）
他の局面において、本発明は、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための医薬の製造における抗Ｅセレクチン抗体の使用を提供する。ここで抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物は、上述の（組成物）に記載される任意の形態が使用され得る。
【００６５】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００６６】
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、市販されているものを使用した。
【実施例】
【００６７】
（実施例１．ラットにおける抗Ｅセレクチン阻止抗体の予防効果）
（抗Ｅセレクチン抗体の調製）
抗Ｅ−セレクチン抗体は、抗Ｅ−セレクチン抗体産生ハイブリドーマ（ＣＬ−３）ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−２５１５から精製した。
【００６８】
マウスＢａｌｂ／ｃ（雌性６週齢）に、プリスタン０．５ｍＬ／マウスを投与した。ハイブリドーマをＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ，ペニシリン（Ｐｃ）＋ストレプトマイシン（Ｓｔ）含有）培地で、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ＰＢＳに細胞を懸濁して、５×１０６細胞／マウスでマウスの腹腔内に投与した。約２週間後に腹水を採取した。硫酸アンモニウム沈殿し、沈殿物をＰＢＳに溶解させ、ＰＢＳ緩衝液で透析を行った。プロテインＧカラム（ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ ｃｏｌｕｍｎ １ｍＬ）カラムに透析後の溶液を通した。カラムを洗浄後、プロテインＧに結合したモノクローナル抗体を、０．１Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ２．７）にて溶出し、溶出液を１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ９．０）で中和した。その後、ＰＢＳ緩衝液で透析を行って、定法により、透析後溶液に含まれる抗体濃度を測定した。
【００６９】
（抗体の接着阻止効果の確認）
ヒト動脈由来血管内皮細胞（ＨＡＥＣ、Ｃａｍｂｒｅｘ，カタログ番号ＣＣ−２５３５）を６ウェル培養プレート中、ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２１０−ＴＡ−０１０）存在下で培養し（１．５ｘ１０５細胞／ウェル）、Ｅセレクチンを内皮細胞表面に誘導した。ＴＮＦ−α添加の１２時間後、各ウェルあたり３μｇ、１０μｇ、または３０μｇの抗Ｅセレクチン抗体を加えた。抗Ｅセレクチン抗体添加の１時間後、ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ（Ｄｏｊｉｎｄｏ，カタログ番号３４１−０７９０１、１μＭ）で蛍光標識した白血球系細胞のＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ，カタログ番号ＴＩＢ−２０２、１．０ｘ１０×５細胞）を加え、１．０ｄｙｎｅ／ｃｍ２のｓｈｅｅｒ ｓｔｒｅｓｓ下で１０分間培養した。蛍光顕微鏡にて内皮細胞と接着したＴＨＰ−１細胞の数を計測することで、抗体の接着阻止効果を評価した。１回あたり１０ウェルで実施し、１ウェルあたりの平均値を測定した。また、独立した実験を３回行った。
【００７０】
コントロールとして、ＴＮＦ−αおよび抗Ｅセレクチン抗体を添加しない群、ならびに、ＴＮＦ−αの存在下で抗Ｅセレクチン抗体を添加しない群を作製し、蛍光顕微鏡にて内皮細胞と接着したＴＨＰ−１細胞の数を計測した。１回あたり１０ウェルで実施し、１ウェルあたりの平均値を測定した。また、独立した実験を３回行った。
【００７１】
その結果、ＴＮＦ−αおよび抗Ｅセレクチン抗体を添加しなかった群では、内皮細胞とＴＨＰ−１細胞とはほとんど接着しなかった。ＴＮＦ−α存在下で抗Ｅセレクチン抗体を添加しなかった群では、内皮細胞に接着したＴＨＰ−１細胞は、約５．３±０．９であり、ＴＮＦ−α存在下で抗Ｅセレクチン抗体を３μｇ投与した群では、約２．５±０．６であり、ＴＮＦ−α存在下で抗Ｅセレクチン抗体を１０μｇ投与した群では、約２．４±０．３であり、ＴＮＦ−α存在下で抗Ｅセレクチン抗体を３０μｇ投与した群では、約１．５±０．３であった。この結果より、抗Ｅセレクチン抗体が濃度依存性に接着阻止効果を持つことが明らかとなった（図１）。
【００７２】
（ラット血管性認知症モデルの作製）
１０〜１２週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラットを日本チャールズ・リバー株式会社から購入し実験に使用した。両側総頚動脈を永久閉塞する血管性認知症モデル動物を８匹作製した。ラットの手術は小動物全身麻酔装置（新鋭工業株式会社製、ソフトランダー、承認番号１７浦安第４５８８号）により吸入麻酔薬のイソフルラン（アボットジャパン、製品名フォーレン、日本標準商品分類番号８７１１１４）を５％濃度で混和した酸素３０％、笑気７０％の混合ガスで麻酔を導入し、１．５％イソフルランを混和した酸素３０％、笑気７０％の混合ガスで麻酔を維持し実体顕微鏡（オリンパス社製、ＳＺＸ１２）を用いて行った。
【００７３】
具体的な手順は、以下のとおりである。頚部（腹側）を正中切開し両側総頚動脈を周りの組織から露出させた。外頚動脈と内頚動脈との分岐部直下の総頚動脈の遠位部を６号絹糸（株式会社夏目製作所製カタログ番号Ｃ−２３）にて２重に結紮した。
【００７４】
（抗Ｅセレクチン阻止抗体の投与）
本実施例にて作製したラット血管性認知症モデルのうち４匹に対し、０．５ミリグラム（1.5mg/kg）の抗Ｅセレクチン阻止抗体を閉塞２時間後に大腿静脈から投与した。
【００７５】
投与の１日後、１週間後、２週間後、４週間後に血液を採取し、血清中の抗Ｅセレクチン阻止抗体濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００７６】
（ＥＬＩＳＡ法）
ＥＬＩＳＡ法は以下の手順でおこなった。
【００７７】
４μｇ／ｍｌ の濃度で５５ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）に溶解したＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ（Ｒ＆Ｄ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｎ，ＡＤＰ１）を、９６穴のプラスチックプレート（ＮＵＮＣ，ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ ＰＬＡＴＥ Ｆ９６ ＭＡＸＩＳＯＲＰ）に１００μｌづつ添加し、４℃で１６時間インキュベーションした。液を捨て、ウェルを洗浄液（ＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。ブロッキングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０（ＴＢＳ），Ｔｈｅｒｍｏ３７５４３）を３００μｌずつ各ウェルに添加し、１時間インキュベーションした。液を捨て、ブロッキングバッファーで２００−４００倍希釈したマウス血清を１００μｌずつウェルに添加し、２時間室温でインキュベーションした。液を捨て、洗浄液で４回洗浄した。ブロッキングバッファーで１００００倍希釈した抗マウス−ＨＲＰ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，Ａ１０６ＰＵ）を１００μｌずつウェルに添加し、１時間室温でインキュベーションした。液を捨て、洗浄液で４回洗浄した。ＴＭＢ液（ＫＰＬ，ＴＭＢ １ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａsｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ，ＫＰＬ５３−００−０１）を１００μｌずつ添加し、遮光して３０分間室温でインキュベーションした。ＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＫＰＬ５０−８５−０４）を１００μｌずつ加え、３０分以内にプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｍｏｄｅｌ ５５０，ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）で吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
【００７８】
その結果、血清中の抗Ｅセレクチン阻止抗体濃度は、投与１日後では８９．６２±４１．５９７μｇ／ｍｌであり、１週間後では４７．２７±２０．４８４μｇ／ｍｌであり、２週間後では２８．２８±１１．５１５μｇ／ｍｌであり、４週間後では６．８４±３．２３９μｇ／ｍｌであった。血清中の抗Ｅセレクチン阻止抗体濃度は緩やかに減少し、半減期は１週間であった（図２）。
【００７９】
以上の結果をまとめると、本発明の組成物では、抗Ｅセレクチン阻止抗体の半減期は約１週間であり、２週間後でも約３０％の血中濃度が維持されていた。この点、従来の報告（非特許文献１〜７）には、このような長期にわたって虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害に対して予防効果を発揮するようなものはなく、このような顕著な効果は本発明の組成物により初めて達成されたものである。
【００８０】
（記憶機能検査（物品認識検査））
抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与したラット（４匹）に対し、虚血手術前、術後２週間、術後４週間に記憶機能検査（物品認識検査）を行った。物品認識試験はラットが物品を認識する場合、以前から記憶している対象より、新しい対象により興味を持つことを利用した記憶検査である（Ｓａｒｔｉ Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｂｅｈａｖ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ２００２）。
【００８１】
物品認識試験は、具体的には以下のとおり実施した。部屋の明かりを消し、ガラス水槽の床から７０ｃｍの高さに１００Ｗの蛍光灯を点けた。試験前日に１０分間、ラットを縦３０ｃｍ横４５ｃｍ高さ３０ｃｍのガラス水槽に入れ、環境に慣れさせた。試験当日は１時間間隔で２つの探索行動を行わせた。３種類の対象（プラスチック製の玩具各２個；それぞれ高さ６ｃｍの青色の円柱、赤色の立方体、緑色の三角錐）から任意に１種類（同じもの２個）の対象を選び、ガラス水槽の中に壁から５ｃｍ離した位置に置いた。その中にラットを１回目は６分間探索させた。１時間後、１個の対象を別の種類に変え、６分間探索させた。各対象の探索時間を計測し、以前に１度探索した対象を２度目に探索した時間の合計をＴＦとした。変更した後の対象の探索時間の合計をＴＮとした。探索の定義はラットが髭や鼻で対象に触るか２ｃｍ以内に鼻を近づけた場合とした。ＴＮ−ＴＦ／ＴＮ＋ＴＦをｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘとし、記憶機能をこの指標を基に評価した。指標の数値が大きい程、１回目の探索対象を記憶していると考えられ、記憶機能が高いと考えられる。
【００８２】
物品認識試験の結果、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群において、手術前では０．３３±０．１１７、術後２週間では０．３２８±０．１１５、術後４週間では０．３７１±０．１７８のｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘであった（図３、菱形）。ラット血管性認知症モデルでは、抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与すると、記憶機能の低下が予防された。
【００８３】
（組織学的検索）
記憶機能検査を行ったラットに対し、術後の４週間後に動物脳に灌流固定を行い、パラフィンブロックを作製した。具体的には、０．０１Ｍのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）１００ｍｌで灌流後、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ、１６２−１６０６５）を含む０．１Ｍのリン酸緩衝水（ｐＨ７．４）３００ｍｌで灌流した後、脳を取り出し、パラッフィンブロックを作製した。ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ、ＳＭ２０００Ｒ）で２μｍ厚の切片を作製し、Ｋｌｕｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ法を行って、ミエリンおよび神経細胞を染色した。具体的には、脱パラフィンしたスライドグラスを、９５％エタノール中で水和した。このスライドグラスを、ルクソールファーストブルー（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， ＳＯＬＵＶＥＮＴ ＢＬＵＥ ３８）中、６０℃で１２時間染色し、室温にもどした後、９５％エタノール中で余分な色素を落とし、蒸留水になじませた。その後、０．０５％炭酸リチウムに数秒浸け、７０％エタノールに２回浸ける操作を、皮質の部位の色素が除けるまで繰り返した。その後、スライドグラスを一度鏡検し、灰白質と白質との境界が明瞭になっていない場合、０．０５％炭酸リチウム浸漬および７０％エタノール浸漬（×２）の操作を繰り返した。その後、スライドを蒸留水の中に入れた。染色の直前にクレシールバイオレット液（武藤化学株式会社、カタログ番号４１０２）を、製造業者の推奨に従って調製した。スライドグラスを、３７℃でクレシールバイオレット液で２時間対比染色した。蒸留水で余分な色素を除いた後、スライドグラスを９５％エタノールで２回すすぎ、無水アルコールに２回浸けて、脱水し、キシレンに２回浸して透徹し封入した。ブレグマから後方０．４ｍｍの位置の脳梁を、顕微鏡（オリンパス社製ＢＸ５１）およびデジタルカメラ（オリンパス社製ＤＰ７１）を用いて、対物レンズ４０倍でカラー写真を撮影し、グレースケール、ＰＩＣＴファイルに変換し、ＮＩＨ ｉｍａｇｅソフトウエアーを用いて線維密度を解析することで、神経線維の脱落を評価した。
【００８４】
線維密度は撮影画像の総面積の中の線維の占める面積を百分率で示した。
【００８５】
抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与すると、脳梁の神経線維はほとんど脱落しなかった（図４Ｂ）。神経繊維の脱落は、有意に予防された（図１７）。
【００８６】
（比較例１）
本実施例にて作製したラット血管性認知症モデルのうち４匹に、上記（抗Ｅセレクチン阻止抗体の投与）と同様の方法により、０．５ミリグラムの正常マウス免疫グロブリン（株式会社免疫生物研究所、コード番号17314）を閉塞２時間後に大腿静脈から投与した。
【００８７】
（記憶機能検査（物品認識検査））
正常マウス免疫グロブリンを投与したラット（４匹）に対し、実施例１と同様の方法を用いて、虚血手術前、術後２週間、術後４週間に記憶機能検査（物品認識検査）を行った。
【００８８】
その結果、正常マウス免疫グロブリン投与群において、手術前では０．３１５±０．１２４、術後２週間では−０．１１±０．１７１、術後４週間では−０．０８±０．０１６のｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘであった（図３、四角）。正常マウス免疫グロブリンを投与したラットでは、記憶機能は低下した。
【００８９】
（組織学的検索）
記憶機能検査を行ったラットに対し、術後の４週間後に動物脳に灌流固定を行い、パラフィンブロックを作製した。実施例１と同様の方法を用いて、Ｋｌｕｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ染色を行い、顕微鏡（オリンパス社製ＢＸ５１）およびデジタルカメラ（オリンパス社製ＤＰ７１）を用いて、神経線維の脱落を評価した。
【００９０】
その結果、正常マウス免疫グロブリン投与群では、脳梁の神経線維の脱落が認められた（図４Ａ）。
【００９１】
（実施例１および比較例１のまとめ）
ラット血管性認知症モデルでは、記憶機能検査により、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群（図３、菱形）が、正常マウス免疫グロブリン投与群（図３、四角）に比べて、記憶機能の低下を有意に抑制することが確認された。
【００９２】
虚血による脳梁の神経線維脱落もまた、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群は、正常マウス免疫グロブリン投与群に比べて有意に抑制された。
【００９３】
以上から、虚血により誘発される記憶障害および神経線維脱落は、抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与することにより予防することが可能と考えられる。
【００９４】
（実施例２．マウスにおける抗Ｅセレクチン阻止抗体の効果）
本実施例では、実施例１と同様の方法により調製した抗Ｅセレクチン阻止抗体を用いた。
【００９５】
（マウス血管性認知症モデルの作製）
９−１０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを日本エスエルシー株式会社から購入し実験に使用した。右側総頚動脈を永久閉塞したマウス血管性認知症モデルを１３匹作製した。マウスの手術は、小動物全身麻酔装置（新鋭工業株式会社製、ソフトランダー、承認番号１７浦安第４５８８号）により吸入麻酔薬のイソフルラン（アボットジャパン、製品名フォーレン、日本標準商品分類番号８７１１１４）を５％濃度で混和した酸素３０％、笑気７０％の混合ガスでマウスに麻酔を導入し、次いで、１．５％イソフルランを混和した酸素３０％、笑気７０％の混合ガスで麻酔を維持し実体顕微鏡（オリンパス社製、ＳＺＸ１２）を用いて行った。手順は、以下のとおりである。
【００９６】
頚部（腹側）を正中切開し右側総頚動脈を周りの組織から露出させた。外頚動脈と内頚動脈との分岐部直下の総頚動脈の遠位部を６号絹糸（株式会社夏目製作所製カタログ番号Ｃ−２３）にて２重に結紮した。
【００９７】
（抗Ｅセレクチン阻止抗体の投与）
マウス血管性認知症モデル群のうち、７匹を抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群とした。残り６匹を生理食塩水投与群とした。この抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群には、０．８７ｍｇ／ｋｇの濃度で１００μｌの抗Ｅセレクチン抗体を、閉塞直前に大腿静脈から投与した。生理食塩水投与群には、１００μｌの生理食塩水を閉塞直前に大腿静脈から投与した。
【００９８】
（記憶機能検査（物品認識検査））
虚血手術前および虚血手術４週間後に、物品認識検査を行った。具体的には、四面に白紙を貼ったガラス水槽（縦３０ｃｍ横４５ｃｍ高さ３０ｃｍの床から７０ｃｍ）を用い照明をつけた部屋で行った。試験前日に１０分間、マウスをガラス水槽に入れ、環境に慣れさせた。試験当日は１時間間隔で２つの探索行動を行わせた。３種類の対象（プラスチック製の玩具各２個；それぞれ高さ６ｃｍの青色の円柱、赤色の立方体、緑色の三角錐）から任意に１種類（同じもの２個）の対象を選び、ガラス水槽の中に壁から５ｃｍ離した位置に置いた。その中にマウスを１回目は１０分間探索させた。１時間後、１個の対象を別の種類に変え、５分間探索させた。各対象の探索時間を計測し、以前に１度探索した対象を２度目に探索した時間の合計をＴＦとした。変更した後の対象の探索時間の合計をＴＮとした。探索の定義はマウスが髭や鼻で対象に触るか１ｃｍ以内に鼻を近づけた場合とした。ＴＮ−ＴＦ／ＴＮ＋ＴＦを識別指数とし、記憶機能をこの数値を基に評価した。識別指数の数値が大きい程、１回目の探索対象を記憶していると考えられ、記憶機能が高いと考えられる。虚血手術前の試験で識別指数が０．１に満たない個体はあらかじめ除外した。その結果を以下の表１に示す。
【００９９】
【表１】
【０１００】
（＋）：抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群、「ｎ」は実験に用いたマウス数。
【０１０１】
抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与すると、記憶機能はほとんど低下しなかった（図５）。
【０１０２】
（組織学的検索）
虚血手術から４週間後に動物脳に灌流固定を行い、パラフィンブロックを作製した。ミクロトームで１μｍ厚の切片を作製し、脱パラフィンしたスライドグラスを９５％エタノールでに５分浸してなじませてから、９５％エタノールに溶解したルクソールファーストブルー（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， ＳＯＬＵＶＥＮＴ ＢＬＵＥ ３８）中で６０℃で１６時間インキュベーションした。室温にもどした後、９５％エタノール中で余分な色素を落とし、蒸留水になじませた。その後、０．０５％炭酸リチウムに数秒浸け、７０％エタノールに２回浸ける操作を、皮質の部位の色素が除けるまで繰り返した。スライドグラスを９５％エタノールで２回すすぎ、１００％エタノールに５分間２回浸して脱水し、キシロールに１５分づつ２回浸して透徹し封入した。顕微鏡（オリンパス社製ＢＸ５１）、デジタルカメラ（オリンパス社製ＤＰ７１）で脳梁を撮影した。
【０１０３】
神経線維の脱落は脳梁の顕微鏡像をソフトウェアー、ＷｉｎＲｏｏｆ（三谷商事株式会社）で線維蜜度を測定することにより評価した。神経線維の脱落は、ブレグマから後方１．９ｍｍの位置のルクソールファーストブルー染色切片の顕微鏡像を、ソフトウェアー、ＷｉｎＲｏｏｆ（三谷商事株式会社）を用い、正中線を含む位置の脳梁の０．００５ｍｍ２を選択し、グレースケールに変換した後、濃度測定ツールを用いて相対的濃度を計測し線維蜜度を測定することにより評価した。各群４匹を検討した。その結果を、以下の表２に示す。
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
（＋）：抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群。
【０１０６】
（比較例２）
偽手術群７匹を作製した。偽手術群は総頚動脈を絹糸での閉塞を行わないこと以外は、実施例２の虚血群と同じ手順で手術を行った。
【０１０７】
（抗Ｅセレクチン阻止抗体の投与）
実施例２において作製したマウス血管性認知症モデル群のうち６匹を、コントロールとしての生理食塩水投与群とした。また、偽手術群の各動物を、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群（３匹）と生理食塩水投与群（４匹）とに分けた。
【０１０８】
抗Ｅセレクチン投与群には、０．８７ｍｇ／ｋｇの濃度で１００μｌの抗Ｅセレクチン抗体を、閉塞直前に大腿静脈から投与した。生理食塩水投与群には、１００μｌの生理食塩水を閉塞直前に大腿静脈から投与した。記憶機能検査の結果を以下の表３に示す。
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
（−）：生理食塩水投与群、（＋）：抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群、「ｎ」は実験に用いたマウス数。
【０１１１】
偽虚血群では、手術前後において記憶機能検査の結果に大きな差異はなかった。虚血手術後に生理食塩水を投与した群では、手術後に記憶機能が顕著に低下した（図５）。
【０１１２】
（組織学的検索）
実施例２と同様の方法を用いて、虚血手術から４週間後に動物脳に灌流固定を行い、パラフィンブロックを作製した。ミクロトームで１μｍ厚の切片を作製し、Ｌｕｘｏｌ−ｆａｓｔ ｂｌｕｅ染色を行い、顕微鏡（オリンパス社製ＢＸ５１）、デジタルカメラ（オリンパス社製ＤＰ７１）で脳梁を撮影した。結果を以下の表４に示す。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】
（実施例２および比較例２のまとめ）
抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与すると、記憶機能の低下が有意に抑制されることが確認された（図５）。
【０１１５】
（実施例２および比較例２のまとめ）
マウス血管性認知症モデルでは、記憶機能検査により、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群（図５、格子）が、生理食塩水投与群（図５、グレー）に比べて、記憶機能の低下を有意に抑制することが確認された。
【０１１６】
虚血による線条体の神経線維脱落もまた、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群は、生理食塩水投与群に比べて有意に抑制された（図６）。
【０１１７】
以上から、虚血により誘発される記憶障害および神経線維脱落は、抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与することにより、有意に予防することが可能と考えられる。
【０１１８】
（比較例３）
（血管性認知症モデルおよび偽手術モデルの作製）
血管性認知症モデル及び偽手術モデルを、以下の方法に従って作製する。血管認知症モデルを、実施例１と同様の方法により２４匹作製した。偽手術モデルの作製法は、以下に示すとおりである。
【０１１９】
偽手術群は総頚動脈を絹糸での閉塞を行わないこと以外は、実施例１の虚血群と同じ手順で手術を行う。
【０１２０】
（標本作製）
虚血手術から１日後、３日後、７日後、１４日後および３０日後に、上記で作製した血管認知症モデル動物を灌流固定し、脳を取り出して、凍結切片用の標本を作製した。具体的には、０．０１Ｍのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）１００ｍｌで灌流後、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ、１６２−１６０６５）を含む０．１Ｍのリン酸緩衝水（ｐＨ７．４）３００ｍｌで灌流した後、脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍのリン酸緩衝水（ｐＨ７．４）で１２時間後固定した。その後２０％蔗糖を含む０．１Ｍのリン酸緩衝水（ｐＨ７．４）に脳を入れ、凍結切片作製まで４℃で保存した。用いた動物数は、虚血手術から１日後４匹、３日後４匹、７日後５匹、１４日後６匹および３０日後５匹であった。なお、偽手術群は、手術直後に屠殺し、虚血手術群と同様の方法を用いて標本を作製する。
【０１２１】
（ＴＮＦ−αの発現）
血管性認知症モデルにおいて、ブレグマから後方２．３ｍｍの位置の脳梁におけるＴＮＦ−αの発現を検索した。具体的には、抗ＴＮＦ−α抗体として、ＹＡＮＡＩＨＡＲＡ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＩＮＣ、カタログ番号ＹＣ０３２を用いた。クリオスタット（Ｌｅｉｃａ、ＣＭ１８５０）で凍結切片を作製し、浮遊切片として染色した。手順は以下のとおりである。切片を、０．３％の過酸化水素（過酸化水素水（３０％）和光純薬工業株式会社カタログ番号０８１−０４２１５より調整）、１０％のメタノール（和光純薬工業株式会社カタログ番号１３７−０１８２３より調整）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に３０分浸漬した後、１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、５％の濃度の正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−２０００）を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号Ｔ９２８４−５００ＭＬ）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に６０分浸漬した。抗ＴＮＦ−α抗体を、５％の濃度の正常ウマ血清を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて８００倍に希釈し、標本をその溶液で４℃で１２時間浸漬した。その後１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、この切片を、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて７０倍に希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ−２００１）に、６０分間浸漬した。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で１５分間洗浄した後、ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１００）を用いて切片を１時間反応させた。その後、ＤＡＢ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＫ−４１００）で発色させた。
【０１２２】
その結果を以下の表５、図７および図８に示す。
【０１２３】
【表５】
【０１２４】
「ｎ」は実験に用いたラット数
虚血手術群では、虚血手術から１日後、１４日後および３０日後にＴＮＦ−αの発現が認められた（図８Ａ〜Ｃ）。
【０１２５】
参考文献（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２８：３４１−３５３，２００８）では、偽手術群（４匹）における１切片あたりの脳梁内ＴＮＦ−α陽性血管数は、１．００±０．０８２である（値は、平均値±標準偏差）。上記で作製した血管性認知症モデルは、偽手術群と比較すると、ＴＮＦ−α陽性血管数が増加している。
【０１２６】
（Ｅセレクチンの発現）
血管性認知症モデルにおいて、ブレグマから後方２．３ｍｍの位置の脳梁におけるＥセレクチンの発現を検索した。具体的には、抗Ｅ−セレクチン抗体として、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ９７７を用いた。クリオスタット（Ｌｅｉｃａ、ＣＭ１８５０）で凍結切片を作製し、浮遊切片として染色した。手順は以下のとおりである。切片を、０．３％の過酸化水素（過酸化水素水（３０％）和光純薬工業株式会社カタログ番号０８１−０４２１５より調整）、１０％のメタノール（和光純薬工業株式会社カタログ番号１３７−０１８２３より調整）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に３０分浸漬した後、１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、５％の濃度の正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−２０００）を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号Ｔ９２８４−５００ＭＬ）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に６０分浸漬した。さらに、５μｇ／ｍｌの濃度の抗Ｅ−セレクチン阻止抗体と５％の濃度の正常ウマ血清を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて４℃で１２時間浸漬した。その後１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、この切片を、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて２００倍に希釈したビオチン化抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ−９５００）に６０分間浸漬した。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で１５分間洗浄した後、ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１００）を用いて切片を１時間反応させた。その後、ＤＡＢ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＫ−４１００）で発色させた。その結果を以下の表６、図９および図１０に示す。
【０１２７】
【表６】
【０１２８】
「ｎ」は実験に用いたラット数。
【０１２９】
虚血手術群では、虚血手術から１日後、１４日後および３０日後にＥセレクチンの発現が認められた（それぞれ、図１０Ａ〜Ｃ）。
【０１３０】
参考文献（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２８：３４１−３５３，２００８）では、偽手術群（４匹）における１切片あたりの脳梁内Ｅセレクチン陽性血管数は極めて少数（平均で１未満）であった。上記で作製した血管性認知症モデルは、偽手術群と比較すると、Ｅセレクチン陽性血管数が増加している。
【０１３１】
（ミクログリアの活性化）
血管性認知症モデルにおいて、ブレグマから後方２．３ｍｍの位置の脳梁におけるミクログリアの活性化を検索した。具体的には、血管性認知症モデルおよび偽手術モデルにおいて、ブレグマから後方２．３ｍｍの位置の脳梁におけるＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩの発現を検索した。具体的には、抗ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗体としてＳｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ、カタログ番号 ＭＣＡ４６Ｒを用いた。クリオスタット（Ｌｅｉｃａ、ＣＭ１８５０）で凍結切片を作製し、浮遊切片として染色した。手順は以下のとおりである。切片を、０．３％の過酸化水素（過酸化水素水（３０％）和光純薬工業株式会社カタログ番号０８１−０４２１５より調整）、１０％のメタノール（和光純薬工業株式会社カタログ番号１３７−０１８２３より調整）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に３０分浸漬した後、１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、５％の濃度の正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−２０００）を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号Ｔ９２８４−５００ＭＬ）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に６０分浸漬した。抗ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗体を５％の濃度の正常ウマ血清を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて１００倍に希釈し、標本をその溶液で４℃で１２時間浸漬した。その後１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、この切片を、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて７０倍に希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ−２００１）に、６０分間浸漬した。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で１５分間洗浄した後、ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１００）を用いて切片を１時間反応させた。その後、ＤＡＢ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＫ−４１００）で発色させた。その結果を、以下の表７、図１１および図１２に示す。
【０１３２】
【表７】
【０１３３】
「ｎ」は実験に用いたラット数。
【０１３４】
虚血手術群では、虚血手術から３日後、１４日後および３０日後に活性化したミクログリアが認められた（図１２Ａ〜Ｃ）。
【０１３５】
参考文献（Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ ８７：４８４−４９２，１９９４）では、偽手術群（５匹）における１切片あたりの活性化ミクログリア数は極めて少数であった。上記で作製した血管性認知症モデルは、偽手術群と比較すると、活性化ミクログリア数が増加している。
【０１３６】
（ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ リンパ球の浸潤）
血管認知症モデルにおいて、ブレグマから後方２．３ｍｍの位置の脳梁におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ リンパ球の浸潤を観察した。具体的には、抗ＣＤ４抗体としてＳｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ、カタログ番号 ＭＣＡ５５Ｒ、および抗ＣＤ８抗体としてＳｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ、カタログ番号 ＭＣＡ４８Ｒ、を用いた。クリオスタット（Ｌｅｉｃａ、ＣＭ１８５０）で凍結切片を作製し、浮遊切片として染色した。手順は以下のとおりである。切片を、０．３％の過酸化水素（過酸化水素水（３０％）和光純薬工業株式会社カタログ番号０８１−０４２１５より調整）、１０％のメタノール（和光純薬工業株式会社カタログ番号１３７−０１８２３より調整）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に３０分浸漬した後、１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、５％の濃度の正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−２０００）を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号Ｔ９２８４−５００ＭＬ）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に６０分浸漬した。抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体を、５％の濃度の正常ウマ血清を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にてそれぞれ、４００倍および２００倍に希釈し、標本をその溶液で４℃で１２時間浸漬した。その後１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、この切片を、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて７０倍に希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ−２００１）に、６０分間浸漬した。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で１５分間洗浄した後、ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１００）を用いて切片を１時間反応させた。その後、ＤＡＢ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＫ−４１００）で発色させた。
【０１３７】
ＣＤ４＋ Ｔリンパ球浸潤の結果を以下の表８、図１３および図１４に示す。
【０１３８】
【表８】
【０１３９】
「ｎ」は実験に用いたラット数。
【０１４０】
虚血手術群では、虚血手術から１日後、１４日後および３０日後においてＣＤ４＋ Ｔリンパ球浸潤が認められた（図１４Ａ〜Ｃ）。
【０１４１】
参考文献（Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ ８７： ４８４−４９２，１９９４）では、偽手術群（５匹）における１切片あたりのＣＤ４＋ Ｔリンパ球の脳実質への浸潤は認めなかった。上記で作製した血管性認知症モデルは、偽手術群と比較すると、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球数が有意に増加している。
【０１４２】
ＣＤ８＋ リンパ球浸潤の結果を以下の表９、図１５および図１６に示す。
【０１４３】
【表９】
【０１４４】
「ｎ」は実験に用いたラット数。
【０１４５】
虚血手術群では、虚血手術から１日後、７日後および３０日後においてＣＤ８＋ リンパ球浸潤が認められた（図１６Ａ〜Ｃ）。
【０１４６】
参考文献（Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ ８７： ４８４−４９２，１９９４）では、偽手術群（５匹）における１切片あたりのＣＤ８＋ Ｔリンパ球の脳実質への浸潤は認めなかった。上記で作製した血管性認知症モデルは、偽手術群と比較すると、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球数が有意に増加している。
【０１４７】
（実施例３．ラットにおける抗Ｅセレクチン阻止抗体の治療効果）
（ラットにおける抗Ｅセレクチン阻止抗体の投与）
実施例１と同様に、ラット血管性認知症モデルを６匹作製した（閉塞した日を０日目とする）。閉塞２週間後に６匹全てに対して、実施例１に記載される物品認識検査（１回目）を行う。物品認識検査を行った直後に、ラットを２群に分け（３匹／群）、１つめの群をコントロール群として、生理食塩水のみを大腿静脈から投与する。２つめの群を実験群として、０．５ミリグラム（１．５ｍｇ／ｋｇ）の抗Ｅセレクチン阻止抗体を大腿静脈から投与する。
【０１４８】
投与の１日後、１週間後、２週間後、４週間後に血液を採取し、血清中の抗Ｅセレクチン阻止抗体濃度をＥＬＩＳＡ法で測定する。
【０１４９】
（ＥＬＩＳＡ法）
ＥＬＩＳＡ法を実施例１に記載される手順でおこなう。
【０１５０】
実施例１の実験では、抗Ｅセレクチン阻止抗体の半減期は約１週間であり、２週間後でも約３０％の血中濃度が維持されていたので、この点、血管性認知症を発症したラットにおいても、同様の血中濃度が検出されると考えられる。
【０１５１】
（記憶機能検査（物品認識検査））
上記で作製した生理食塩水を投与したコントロール群および抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与した実験群のラットに対して、ラット（３匹）に対し、１回目の物品認識検査から２週間目および４週間目に、２回目および３回目の記憶機能検査（物品認識検査）を行う。
【０１５２】
物品認識試験の結果、３回目の記憶機能検査におけるｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘは、２回目のｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘと比較してほとんど変化がないことが予想される。コントロール群は、３回目の記憶機能検査におけるｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘは、２回目のｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘと比較して、徐々に低下することが予想される。よって、ラット血管性認知症モデルでは、抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与すると、血管性認知症を発生した場合にも、記憶機能が低下の進行防止が認められる。
【０１５３】
（組織学的検索）
記憶機能検査を行ったラットに対し、術後の４週間後に動物脳に灌流固定を行い、パラフィンブロックを作製した。ミクロトームで２μｍ厚の切片を作製し、実施例１と同様に、Ｋｌｕｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ染色を行った。顕微鏡（オリンパス社製ＢＸ５１）およびデジタルカメラ（オリンパス社製ＤＰ７１）を用いて、対物レンズ４０倍でカラー写真を撮影し、グレースケール、ＰＩＣＴファイルに変換し、ＮＩＨ ｉｍａｇｅソフトウエアーを用いて線維密度を解析することで、神経線維の脱落を評価する。抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与した実験群では、脳梁の神経線維脱落はコントロール群と比較して有意に軽減される。
【０１５４】
（実施例４．ヒトにおける抗Ｅセレクチン阻止抗体の効果）
上記実施例の結果に鑑みると、ヒトにおいては血管性認知症の患者や血管性認知症を発症するリスクのある患者（動脈硬化のある患者、脳卒中の既往者、高血圧や糖尿病等の血管性危険因子を持つ軽度認知障害患者等）に対して、抗Ｅセレクチン阻止抗体を１か月に１回静脈注射または点滴（例えば、用量０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重）をする事で、既に血管性認知症の発症した患者に対しては血管性認知症の進行が予防でき、血管性認知症を発症するリスクのある患者に対しては、発症が予防できる。
【０１５５】
（実施例５．抗Ｅセレクチン抗体を含む製剤の調製）
例えば、ＡＴＣＣ番号 CRL-2515のハイブリドーマの遺伝子操作により、抗Ｅセレクチン阻止抗体のヒト化バージョンを作製する。このようにして得られたヒト化バージョンのモノクローナル抗体を、基本的には、実施例１に記載されるモノクローナル抗体の生成に従って商業規模で調製し、実質的に精製された抗体を凍結乾燥することによって、静脈注射用の抗体粉末を得る。１回使用の使い捨てバイアルに詰め、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で要時調製する。
【０１５６】
（実施例６．抗Ｅセレクチン抗体を含む製剤の投与）
血管性認知症の発症予防または進行予防のために、血管性認知症の患者や血管性認知症を発症するリスクのある患者は、１ヶ月に１回定期的に通院することで、認知能力の変化をチェックし、抗Ｅセレクチン阻止抗体（用量０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重）を静脈注射または点滴をする。
【０１５７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明の抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物は、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能を低下を抑える効果を有する。本発明の組成物は、虚血による障害が発生する前に投与することにより、その発生を完全に防ぐ予防薬として利用され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管性認知症、特に、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害の予防の技術に関する。本発明は、特に、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物を用いて、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害を予防することに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、認知症の患者数は１６０〜１８０万人、有病率は６５歳以上の８％程度といわれている。年齢別にみると、６０歳代で１％、７０歳代で５％、８０歳代で２０％の有病率である。急速な高齢化で２０３０年頃の患者数は３００万人を超えると予想されている。原因疾患はアルツハイマー病が最も多く、次いで脳血管障害が原因で発病する血管性認知症の患者が多い。血管性認知症の中で虚血性大脳性白質病変を特徴とする皮質下の血管性認知症の患者数は血管性認知症患者の半数以上を占めており、人口の高齢化に伴い増加傾向にあり、血管性認知症の予防・治療戦略上、最も重要な対象疾患となっている。
【０００３】
さらに、皮質下の血管性認知症の症状は緩徐進行性であり、血管性危険因子の管理、抗血小板などの治療を行っても進行の抑制が困難なため、その新規治療法の開発が急務である。
【０００４】
近年、血管性認知症モデル動物を用いて脳虚血処置後に薬物を投与し、その薬物が脳に与える影響が報告されている（非特許文献１〜３、６および７）。また、脳虚血処置の前に薬物を投与した場合の効果が報告されている（非特許文献４および５）。しかし、非特許文献１〜７の方法では、薬物を繰り返し投与する必要があり、薬効の持続性は低いものであった。非特許文献１〜７には、１回の静脈内投与により、ほぼ１００％に近い有効性が１か月間も持続するという効果は記載されていない。
【０００５】
非特許文献６には、閉塞後の薬物（シロスタゾール：ｃｉｌｏｓｔａｚｏｌ）投与が大脳低灌流により誘導された白質損傷および認知障害に対して保護効果を示したことが記載されている。しかし、非特許文献６では、神経線維脱落という白質損傷の程度自体の病理学的検討はされていない。また、非特許文献６では、シロスタゾールの投与により脳低灌流により誘導された障害の程度が軽減されることが報告されているだけであり、それらを完全に防ぐことはできていない。
【０００６】
非特許文献８には、一過性大脳虚血マウスにおいて、抗Ｅセレクチン抗体を投与すると神経系の欠損、死亡率、梗塞サイズ等が用量依存的に減少することが記載されている。非特許文献９には、一過性虚血ヒヒにおいて、ＥセレクチンおよびＰセレクチンに対する抗体を投与すると、プラセボと比べて皮質への多形核白血球浸潤の減少、梗塞サイズの減少、神経学的スコアの改善等が認められると記載されている。しかし、非特許文献８および９では、急性期の病変しか検討されていない。また、神経学的スコアによる急性期の運動麻痺が観察されているだけであり、慢性期に生じる記憶機能障害については何ら記載されていない。
【０００７】
特許文献１には、血管性認知症を処置、予防することが記載されている。特許文献２には、Ｅセレクチンにより脳卒中に関連した組織損傷を軽減することが記載されている。しかし、特許文献１および２には、抗Ｅセレクチン抗体を用いて虚血による大脳皮質損傷および記憶機能の低下を完全に予防することは記載されていない。また、１回の静脈内投与により、ほぼ１００％に近い有効性が１か月間も持続するという効果も記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００７／０２８１３３号パンフレット
【特許文献２】特表２００４−５０３４７１号（国際公開第２００１／８９５５７号パンフレット）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ １０（１９９９）１４６１−１４６５
【非特許文献２】Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９８０（２００３）１５６−１６０
【非特許文献３】Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９９２（２００３）５３−５９
【非特許文献４】Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒ ７５（２００３）６３５−６４３
【非特許文献５】Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ Ａｎａｌｏｇｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ（２００３）
【非特許文献６】Ｓｔｒｏｋｅ ３７（２００６）１５３９−１５４５
【非特許文献７】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １５（２００８）１７４−１７８
【非特許文献８】Ｓｔｒｏｋｅ ３１（２０００）３０４７−３０５３
【非特許文献９】Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１（２００２）９０７−９１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害を予防するのに有用な組成物、予防方法などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究の結果、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物が、血管性認知症（特に、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害）において予想外に治療効果を上げることを見出し、本発明を完成させるに至ったものである。
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）
虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための組成物であって、該組成物は抗Ｅセレクチン抗体を含む、組成物。
（項目２）
前記組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物は、虚血が生じた約２時間後に投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目４）
前記大脳白質損傷が脳梁の神経線維脱落である、上記項目に記載の組成物。
（項目５）
前記大脳白質損傷が脳梁の神経線維脱落であり、前記組成物が、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目６）
前記組成物は、被験体に対して約０．１〜約５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目７）
前記組成物は、投与１日後の血清中抗体濃度が、約５０μｇ／ｍｌ〜約１３０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目８）
前記組成物は、投与１週間後の血清中抗体濃度が、約３０μｇ／ｍｌ〜約７０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目９）
前記組成物は、投与２週間後の血清中抗体濃度が、約２０μｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目１０）
前記組成物は、投与４週間後の血清中抗体濃度が、約４μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目１１）
前記組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で静脈投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目１２）
前記大脳白質損傷が脳梁の神経線維脱落であり、前記組成物は、虚血が生じた約２時間後に約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で静脈投与されることを特徴とする、上記項目に記載の組成物。
（項目１３）
虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防する方法であって、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目１４）
虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための医薬の製造における抗Ｅセレクチン抗体の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物が、それ自体で血管性認知症を効果的に治療できることが初めて見出された。このような組成物は、本発明によって初めて提供されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本実施例１において調製した抗Ｅセレクチン抗体が、白血球と血管内皮細胞との接着阻止効果を有することを示す。縦軸は、内皮細胞と接着したＴＨＰ−１細胞の数を示す。横軸上段の「−」はＴＮＦ−αを添加しなかったことを示し、「＋」はＴＮＦ−αを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加したことを示す。Ｙ軸下段の「−」は抗Ｅセレクチン抗体を添加しなかったことを示し、各数字は添加した抗Ｅセレクチン抗体の濃度（３、１０、３０μｇ／ウェル）を示す。シャープ（＃）はｐ＜０．０１ ｖｓ コントロール（ＴＮＦ−α（-）、抗Ｅセレクチン抗体（-））を示し、アスタリスク（＊）はｐ＜０．０１ ｖｓ （ＴＮＦ−α（＋）、抗Ｅセレクチン抗体（-））を示す。値は平均値±標準偏差である。
【図２】図２は、血清中の抗Ｅセレクチン阻止抗体濃度を示す。縦軸は血清中の抗Ｅセレクチン阻止抗体濃度（μｇ／ｍｌ）であり、横軸は抗体濃度を測定した時間を示す。１ｄ：投与１日後、１ｗ：投与１週間後、２ｗ：投与２週間後、４ｗ：投与４週間後。値は平均値±標準偏差である。
【図３】図３は、抗Ｅセレクチン阻止抗体または正常マウス免疫グロブリンを投与したラットにおける、記憶機能検査（物品認識検査）の結果である。縦軸はｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘである。ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘは横軸は記憶機能検査を行った時期を示す（Ａ：虚血手術前、Ｂ：術後２週間、Ｃ：術後４週間）。菱形：抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群、四角：正常マウス免疫グロブリン投与群、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１（統計処理は、ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ （ＡＮＯＶＡ）と、ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔとして Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法により行った）。値は平均値±標準偏差である。
【図４】図４は、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群および正常マウス免疫グロブリン投与群における脳梁の病理像を示す。図４Ａ：正常マウス免疫グロブリン投与群、図４Ｂ：抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群。
【図５】図５は、抗Ｅセレクチン阻止抗体または生理食塩水を投与したマウスにおける、記憶機能検査（物品認識検査）の結果である。縦軸は識別指数である。横軸の「Ａ」は、虚血手術前に記憶機能検査を行った結果を示し、横軸「Ｂ」は、虚血手術４週間後に記憶機能検査を行った結果を示す。白：偽手術（生理食塩水投与）群（ｎ＝４）、斜線：偽手術（抗Ｅセレクチン阻止抗体投与）群（ｎ＝３）、黒：虚血（生理食塩水投与）群（ｎ＝６）、格子：虚血（抗Ｅセレクチン阻止抗体投与）群（ｎ＝７）。＊：ｐ＜０．０５（統計処理は、＊：非等分散の2標本を対象とするt検定、＊＊：対をなすデータのt検定を行った）。値は平均値±標準偏差である。
【図６】図６は、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群および生理食塩水投与群における脳梁の神経線維の脱落を線維蜜度により評価した結果を示す。縦軸は相対的線維密度（ｐｉｘｅｌ）である。横軸の「Ａ」は、偽手術群の結果を示し、横軸「Ｂ」は、虚血群の結果を示す。白：生理食塩水投与群、グレー：抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群。各群４匹を検討した。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。（統計処理は、＊：非等分散の2標本を対象とするt検定、＊＊：対をなすデータのt検定を行った）。値は平均値±標準偏差である。
【図７】図７は、血管性認知症モデルにおける血管閉塞後の脳梁におけるＴＮＦ−α陽性の血管を検索した結果である。縦軸は、１切片あたりの脳梁内のＴＮＦ−α陽性血管の数である。横軸は検索した時期を示す。１ｄａｙ：手術１日後、３ｄａｙｓ：手術３日後、７ｄａｙｓ：手術７日後、１４ｄａｙｓ：手術１４日後、３０ｄａｙｓ：手術３０日後。「ｎ」は実験に用いたラット数。値は平均値±標準偏差である。
【図８】図８は、血管性認知症モデルの脳梁におけるＴＮＦ−αの発現を検討した結果を示す。Ａ：虚血手術１日後、Ｂ：虚血手術１４日後、Ｃ：虚血手術３０日後。バーは５０μｍを示す。
【図９】図９は、血管性認知症モデルにおける血管閉塞後の脳梁におけるＥセレクチン陽性の血管を検索した結果である。縦軸は、１切片あたりのＥセレクチン陽性血管の数である。横軸は検索した時期を示す。１ｄａｙ：手術１日後、３ｄａｙｓ：手術３日後、７ｄａｙｓ：手術７日後、１４ｄａｙｓ：手術１４日後、３０ｄａｙｓ：手術３０日後。「ｎ」は実験に用いたラット数。値は平均値±標準偏差である。
【図１０】図１０は、血管性認知症モデルの脳梁におけるＥセレクチンの発現を検討した結果を示す。Ａ：虚血手術１日後、Ｂ：虚血手術１４日後、Ｃ：虚血手術３０日後。バーは５０μｍを示す。
【図１１】図１１は、血管性認知症モデルにおける血管閉塞後の脳梁における活性化したミクログリアを検索した結果である。縦軸は、１切片あたりの活性化したミクログリアの数である。横軸は検索した時期を示す。１ｄａｙ：手術１日後、３ｄａｙｓ：手術３日後、７ｄａｙｓ：手術７日後、１４ｄａｙｓ：手術１４日後、３０ｄａｙｓ：手術３０日後。「ｎ」は実験に用いたラット数。値は平均値±標準偏差である。
【図１２】図１２は、血管性認知症モデルの脳梁における活性化したミクログリアを検討した結果を示す。Ａ：虚血手術１日後、Ｂ：虚血手術１４日後、Ｃ：虚血手術３０日後。バーは５０μｍを示す。
【図１３】図１３は、血管性認知症モデルにおける血管閉塞後の脳梁におけるＣＤ４＋ Ｔリンパ球浸潤を検索した結果である。縦軸は、１切片あたりの、浸潤したＣＤ４＋ Ｔリンパ球の数である。横軸は検索した時期を示す。１ｄａｙ：手術１日後、３ｄａｙｓ：手術３日後、７ｄａｙｓ：手術７日後、１４ｄａｙｓ：手術１４日後、３０ｄａｙｓ：手術３０日後。「ｎ」は実験に用いたラット数。値は平均値±標準偏差である。
【図１４】図１４は、血管性認知症モデルの脳梁におけるＣＤ８＋ リンパ球浸潤を検討した結果を示す。Ａ：虚血手術１日後、Ｃ：虚血手術１４日後、Ｄ：虚血手術３０日後。バーは５０μｍを示す。
【図１５】図１５は、血管性認知症モデルにおける血管閉塞後の脳梁におけるＣＤ８＋ リンパ球浸潤を検索した結果である。縦軸は、１切片あたりの、浸潤したＣＤ８＋ リンパ球の数である。横軸は検索した時期を示す。１ｄａｙ：手術１日後、３ｄａｙｓ：手術３日後、７ｄａｙｓ：手術７日後、１４ｄａｙｓ：手術１４日後、３０ｄａｙｓ：手術３０日後。「ｎ」は実験に用いたラット数。値は平均値±標準偏差である。
【図１６】図１６は、血管性認知症モデルの脳梁におけるＣＤ８＋ リンパ球浸潤を検討した結果を示す。Ａ：虚血手術１日後、Ｂ：虚血手術１４日後、Ｃ：虚血手術３０日後。バーは５０μｍを示す。
【図１７】図１７は、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群および正常マウス免疫グロブリン投与群における脳梁の繊維密度を示す棒グラフである（統計処理は、対をなさないデータのt検定を行った）。値は平均値±標準誤差である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１６】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を適宜説明する。
【００１７】
本明細書において「虚血」とは、当該分野において通常用いられるものと同様の意味で使用され、主に動脈の狭窄または中断による、血液供給の器質的障害により引き起こされる局所性貧血をいう。虚血としては、例えば、例示的に、脳虚血などが挙げられる。
【００１８】
本明細書において「脳虚血」とは、脳への血液供給が低下または遮断されることにより引き起こされる局所性貧血をいう。
【００１９】
本明細書において「虚血により誘導される」とは、虚血が直接的または間接的な原因となって何らかの事象が発生することをいう。
【００２０】
本明細書において「大脳白質損傷」とは、大脳白質が損なわれ傷つくことをいう。大脳白質損傷としては、例えば、脳梁の神経線維脱落、線条体の神経線維脱落、内包の神経線維脱落、前交連の神経線維脱落などが挙げられる。
【００２１】
虚血により誘導される大脳白質損傷を「予防」するとは、大脳白質損傷が発生する前に、何らかの手段により、その大脳白質損傷を生じさせないかまたは少なくとも遅延させること、あるいは虚血自体が生じたとしてもそれが原因の障害が生じないような状態にすることをいう。
【００２２】
また、本明細書において、血管性認知症を「治療」するとは、既に発症している病気の進行を食い止めるか、または完全または部分的に拘わらず、認知症の症状が改善することをいう。血管性認知症は長期間にわたる慢性疾患であることから、血管性認知症の患者に抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物を投与することによって、既に発症している病気の進行を食い止めることにも意義があるというべきである。
【００２３】
本明細書において「記憶機能」とは、過去に体験したこと、覚えたことなどを忘れずに心にとめておくための機能をいう。記憶機能は、例えば、物品認識検査、水迷路検査、Ｔ字型迷路検査、Ｙ字型迷路検査、放射状迷路検査などにより判定することができる。物品認識検査は、物品を認識する場合、以前から記憶している対象より、被験体が新しい対象により多くの興味を持つことを利用した記憶検査である。
【００２４】
虚血により誘導される記憶機能の低下を「予防」するとは、記憶機能の低下が発生する前に、何らかの手段により、その記憶機能の低下を生じさせないかまたは少なくとも遅延させること、あるいは虚血自体が生じたとしてもそれが原因の記憶機能の低下が生じないような状態にすることをいう。
【００２５】
本明細書において「抗Ｅセレクチン阻止抗体」とは、Ｅセレクチンによって惹起された特異的なアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子をいう。本明細書において「抗Ｅセレクチン阻止抗体」と「抗Ｅセレクチン抗体」とは交換可能に使用され得る。
【００２６】
本明細書において「被験体」とは、虚血により誘導される大脳白質損傷または記憶機能を低下の予防の対象とされる動物をいう。本発明が対象とする動物は、例えば、鳥類、哺乳動物などであってもよい。好ましくは、そのような動物は、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモットなどの小動物が用いられ得る。
【００２７】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【００２８】
（組成物）
１つの局面において、本発明は、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための組成物を提供する。本発明の組成物は抗Ｅセレクチン抗体を含み得る。
【００２９】
本発明の組成物は、長期にわたって虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害を完全に予防するという顕著な効果を発揮し、このような顕著な効果は本発明の組成物により初めて達成されたものである。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明の組成物に含まれる抗Ｅセレクチン抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２５１５として寄託されたハイブリドーマまたはその子孫により生産された抗体であり得るが、これらに限定されない。
【００３１】
上記のようなモノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法を用いて容易に産生可能であるが、この抗体は、例えば、以下のようにして産生することが可能である。
【００３２】
マウスＢａｌｂ／ｃ（雌性６週齢）に、プリスタン０．５ｍＬ／マウスを投与する。ハイブリドーマを、定法に従って、ＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ，ペニシリン（Ｐｃ）＋ストレプトマイシン（Ｓｔ）含有）培地で、５％ＣＯ２、３７℃で培養する。ＰＢＳに細胞を懸濁して、５×１０６細胞／マウスでマウスの腹腔内に投与する。約２週間後に腹水を採取する。採取した腹水を硫酸アンモニウム沈殿し、沈殿物をＰＢＳに溶解させ、ＰＢＳ緩衝液で透析を行う。得られた透析後の抗体含有溶液を、プロテインＧカラムに通す。カラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、０．１Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ２．７）をカラムに通して、プロテインＧに結合したモノクローナル抗体を溶出し、得られた溶出液を１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ９．０）で中和する。その後、ＰＢＳ緩衝液で再び透析を行い、実質的に精製されたモノクローナル抗体を得る。このようにして得られたモノクローナル抗体の濃度は、当該分野で周知のタンパク質濃度測定法（例えば、Ｂｉｏ−ＲａｄのＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを使用する方法）により測定可能である。
【００３３】
他の実施形態において、本発明の組成物に含まれ得る抗Ｅセレクチン抗体としては、例えば、抗Ｅセレクチン抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ：ＢＢＡ２、ＢＢＡ１６、ＢＢＡ２６）、抗Ｅセレクチン抗体（ａｂｃａｍ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ：ａｂ８１６５）、抗Ｅセレクチン抗体（ＭＯＮＯＳＡＮ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ：ＭＯＮ６０１１）、抗Ｅセレクチン抗体（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ：ＢＭ２３０７）が挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、Ｅセレクチンの持つ白血球と血管内皮細胞との接着等の炎症機構を阻止すれば、同様の効果が得られると考えられるからである。
【００３４】
虚血により誘導される記憶機能の低下は、例えば、物品認識検査、水迷路検査、Ｔ字型迷路検査、Ｙ字型迷路検査、放射状迷路検査などにより判定することができる。
【００３５】
物品認識検査は、物品を認識する場合、以前から記憶している対象より、被験体が新しい対象により多くの興味を持つことを利用した記憶検査である。ラットまたはマウスでは物品認識試験は、以下のように実施される。部屋の明かりを消し、ガラス水槽の床から７０ｃｍの高さに１００Ｗの蛍光灯を点ける。試験前日に１０分間、被験体を縦３０ｃｍ横４５ｃｍ高さ３０ｃｍのガラス水槽に入れ、環境に慣れさせる。試験当日は１時間間隔で２つの探索行動を行わせる。３種類の対象（プラスチック製の玩具各２個；それぞれ高さ６ｃｍの青色の円柱、赤色の立方体、緑色の三角錐）から任意に１種類（同じもの２個）の対象を選び、ガラス水槽の中に壁から５ｃｍ離した位置に置く。その中に被験体を１回目は６分間探索させる。１時間後、１個の対象を別の種類に変え、６分間探索させる。各対象の探索時間を計測し、以前に１度探索した対象を２度目に探索した時間の合計をＴＦとし、変更した後の対象の探索時間の合計をＴＮとする。探索の定義は被験体が髭や鼻で対象に触るか２ｃｍ以内に鼻を近づけた場合とする。ＴＮ−ＴＦ／ＴＮ＋ＴＦをｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘとし、記憶機能をこの指標を基に評価することができる。指標の数値が大きい程、１回目の探索対象を記憶していると考えられ、記憶機能が高いと考えられる。
【００３６】
他の実施形態において、本発明の組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与され得る。なぜなら、Ｅセレクチンが虚血により脳内の血管内皮細胞に誘導されている時間を通じて有効血中濃度が維持されると考えられるからである。好ましくは、本発明の組成物は、虚血が生じた約２時間後に投与され得る。
【００３７】
他の実施形態において、本発明の組成物により予防され得る大脳白質損傷は、例えば、脳梁の神経線維脱落、線条体の神経線維脱落などであり得る。この大脳白質損傷は、組織学的検索（例えば、Ｋｌｕｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ染色、エオシン−ヘマトキシリン染色など）、神経線維の構成成分に対する免疫染色（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔやｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎに対する抗体を用いた免疫染色）、神経線維に対する染色法（Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ染色および当該分野で周知のその改変法）により評価することができる。
【００３８】
他の実施形態において、本発明の組成物により予防され得る大脳白質損傷は、脳梁の神経線維脱落であり、この組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与され得る。
【００３９】
他の実施形態において、本発明の組成物は、被験体に対して約０．１〜約５ｍｇ／体重ｋｇの抗Ｅセレクチン抗体の量で投与され得る。本発明の組成物は、例えば、約０．１〜約５ｍｇ／体重、好ましくは約０．５〜約３ｍｇ／体重、より好ましくは約０．７５〜約２ｍｇ／体重、最も好ましくは約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重で投与され得るが、これらに限定されない。
【００４０】
他の実施形態において、本発明の組成物は、投与１日後の血清中抗体濃度が、約５０μｇ／ｍｌ〜約１３０μｇ／ｍｌとなるように投与され得るが、これらに限定されない。投与１日後の血中抗体濃度の上限は、約１３０μｇ／ｍｌ、またはそれより大きくてもよく、あるいは、約１２９μｇ／ｍｌ、約１２８μｇ／ｍｌ、約１２７μｇ／ｍｌ、約１２６μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１２０μｇ／ｍｌ、約１１５μｇ／ｍｌ、約１１０μｇ／ｍｌ、約１０５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１０５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約６５μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約５９μｇ／ｍｌ、約５８μｇ／ｍｌ、約５７μｇ／ｍｌ、約５６μｇ／ｍｌ、約５５μｇ／ｍｌ、約５４μｇ／ｍｌ、約５３μｇ／ｍｌ、約５２μｇ／ｍｌ、約５１μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌであり得る。投与１日後の血中抗体濃度の下限は、約５０μｇ／ｍｌ、またはそれより小さくてもよく、あるいは、約５１μｇ／ｍｌ、約５２μｇ／ｍｌ、約５３μｇ／ｍｌ、約５４μｇ／ｍｌ、約５５μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約６５μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約６５μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約８５μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約９５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１０５μｇ／ｍｌ、約１１０μｇ／ｍｌ、約１１５μｇ／ｍｌ、約１２０μｇ／ｍｌ、約１２１μｇ／ｍｌ、約１２２μｇ／ｍｌ、約１２３μｇ／ｍｌ、約１２４μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１２６μｇ／ｍｌ、約１２７μｇ／ｍｌ、約１２８μｇ／ｍｌ、約１２９μｇ／ｍｌ、約１３０μｇ／ｍｌであり得る。投与１日後の血中抗体濃度は、例えば、上記の上限および下限を結ぶ範囲にわたる、約５０μｇ／ｍｌ〜約１３０μｇ／ｍｌの範囲内に入る任意の数値範囲であり得る。
【００４１】
他の実施形態において、本発明の組成物は、投与１週間後の血清中抗体濃度が、約３０μｇ／ｍｌ〜約７０μｇ／ｍｌとなるように投与され得るが、これらに限定されない。投与１日後の血中抗体濃度の上限は、約７０μｇ／ｍｌ、またはそれより大きくてもよく、あるいは、約６９μｇ／ｍｌ、約６８μｇ／ｍｌ、約６７μｇ／ｍｌ、約６６μｇ／ｍｌ、約６５μｇ／ｍｌ、約６４μｇ／ｍｌ、約６３μｇ／ｍｌ、約６２μｇ／ｍｌ、約６１μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約５５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約５５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約４５μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約３９μｇ／ｍｌ、約３８μｇ／ｍｌ、約３７μｇ／ｍｌ、約３６μｇ／ｍｌ、約３５μｇ／ｍｌ、約３４μｇ／ｍｌ、約３３μｇ／ｍｌ、約３２μｇ／ｍｌ、約３１μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌであり得る。投与１週間後の血中抗体濃度の下限は、約３０μｇ／ｍｌ、またはそれより小さくてもよく、あるいは、約３１μｇ／ｍｌ、約３２μｇ／ｍｌ、約４３μｇ／ｍｌ、約３４μｇ／ｍｌ、約３５μｇ／ｍｌ、約３６μｇ／ｍｌ、約３７μｇ／ｍｌ、約３８μｇ／ｍｌ、約３９μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約４５μｇｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約５５μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約６１μｇ／ｍｌ、約６２μｇ／ｍｌ、約６３μｇ／ｍｌ、約６４μｇ／ｍｌ、約６５μｇ／ｍｌ、約６６μｇ／ｍｌ、約６７μｇｍｌ、約６８μｇ／ｍｌ、約６９μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌであり得る。投与１日後の血中抗体濃度は、例えば、上記の上限および下限を結ぶ範囲にわたる、約３０μｇ／ｍｌ〜約７０μｇ／ｍｌの範囲内に入る任意の数値範囲であり得る。
【００４２】
他の実施形態において、本発明の組成物は、投与２週間後の血清中抗体濃度が、約２０μｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌとなるように投与され得るが、これらに限定されない。投与１日後の血中抗体濃度の上限は、約４０μｇ／ｍｌ、またはそれより大きくてもよく、あるいは、約３９μｇ／ｍｌ、約３８μｇ／ｍｌ、約３７μｇ／ｍｌ、約３６μｇ／ｍｌ、約３５μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約２４μｇ／ｍｌ、約２３μｇ／ｍｌ、約２２μｇ／ｍｌ、約２１μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌであり得る。投与２週間後の血中抗体濃度の下限は、約２０μｇ／ｍｌ、またはそれより小さくてもよく、あるいは、約２１μｇ／ｍｌ、約２２μｇ／ｍｌ、約２３μｇ／ｍｌ、約２４μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約３５μｇ／ｍｌ、約３６μｇ／ｍｌ、約３７μｇ／ｍｌ、約３８μｇ／ｍｌ、約３９μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌであり得る。投与１日後の血中抗体濃度は、例えば、上記の上限および下限を結ぶ範囲にわたる、約２０μｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌの範囲内に入る任意の数値範囲であり得る。
【００４３】
他の実施形態において、本発明の組成物は、投与４週間後の血清中抗体濃度が、約４μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌとなるように投与され得るが、これらに限定されない。投与１日後の血中抗体濃度の上限は、約１０μｇ／ｍｌ、またはそれより大きくてもよく、あるいは、約９．９μｇ／ｍｌ、９．８μｇ／ｍｌ、約９．７μｇ／ｍｌ、約９．６μｇ／ｍｌ、約９．５μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約８．５μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約６．５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約５．５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約４．５μｇ／ｍｌ、約４．４μｇ／ｍｌ、約４．３μｇ／ｍｌ、約４．２μｇ／ｍｌ、約４．１μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌであり得る。投与２週間後の血中抗体濃度の下限は、約４μｇ／ｍｌ、またはそれより小さくてもよく、あるいは、約４．１μｇ／ｍｌ、約４．２μｇ／ｍｌ、約４．３μｇ／ｍｌ、約４．４μｇ／ｍｌ、約４．５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約５．５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約６．５μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約８．５μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約９．５μｇ／ｍｌ、約９．６μｇ／ｍｌ、約９．７μｇ／ｍｌ、約９．８μｇ／ｍｌ、約９．９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌであり得る。投与１日後の血中抗体濃度は、例えば、上記の上限および下限を結ぶ範囲にわたる
約４μｇ／ｍｌ〜約１０ｍμｇ／ｍｌの範囲内に入る任意の数値範囲であり得る。。
【００４４】
本発明の組成物の血清中抗体濃度を測定する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ブロット法などが挙げられるが、これらに限定されない。一般には、ＥＬＩＳＡ法が使用される。ＥＬＩＳＡ法は、例えば、以下のように実施され得る。定法に従って、プラスチックプレートのウェルに抗原物質を吸着させ、一次抗体として血清等の濃度未知の抗体を含む溶液を添加して、抗原抗体複合物を形成させる。ウェル中の抗原抗体複合物に、酵素を標識した既知の二次抗体を反応させた後、二次抗体に結合した酵素に特異的な基質をウェルに添加する。一定時間反応させた後、プレートリーダー等により吸光度を測定して、抗体濃度を評価する。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で投与され得る。好ましくは、本発明の組成物は、血管を介する投与法（例えば、静脈内投与、動脈内投与）により投与され得るが、これらに限定されない。
【００４６】
より好ましい実施形態において、本発明の組成物により予防され得る大脳白質損傷は、脳梁の神経線維脱落、線条体の神経線維脱落であり、本発明の組成物は、虚血が生じた約２時間後に約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で静脈内投与され得る。
【００４７】
本発明の組成物は、必要に応じて、適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、蛍光色素、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよび／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の組成物は、抗Ｅセレクチン抗体、および必要に応じて他の有効成分を、少なくとも１つの生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、ミセル、注射溶液、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的に使用される他の物質を補充することが可能である。
【００４８】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくは、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、好ましくは、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられる。
【００４９】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ約７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ約４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【００５０】
以下に本発明の組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品および水産薬組成物等についても公知の調製法により製造することができることに注意されたい。
【００５１】
本発明の組成物などは、薬学的に受容可能なキャリアと必要に応じて配合し、例えば、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸収剤、湿潤剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には、抗Ｅセレクチン抗体以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、皮膚投与など等が挙げられるがそれらに限定されない。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製について、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することは、当業者の技術範囲内である。
【００５２】
液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。
【００５３】
液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５４】
液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
【００５５】
液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５６】
液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５７】
液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５８】
液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５９】
液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６０】
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液または他の目的のための注射部位における溶媒と等張であることが好ましい。通常、これらは、細菌保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射などによって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。
【００６１】
さらに、本発明の組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
【００６２】
本発明において使用される物質、組成物等の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の方法を被験体に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。投与する量は、処置されるべき部位が必要とする量を見積もることによって確定することができる。
【００６３】
（予防方法）
別の局面において、本発明は、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防する方法を提供する。この方法は、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物を投与する工程を包含し得る。ここで抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物は、上述の（組成物）に記載される任意の形態が使用され得る。
【００６４】
（使用）
他の局面において、本発明は、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための医薬の製造における抗Ｅセレクチン抗体の使用を提供する。ここで抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物は、上述の（組成物）に記載される任意の形態が使用され得る。
【００６５】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００６６】
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、市販されているものを使用した。
【実施例】
【００６７】
（実施例１．ラットにおける抗Ｅセレクチン阻止抗体の予防効果）
（抗Ｅセレクチン抗体の調製）
抗Ｅ−セレクチン抗体は、抗Ｅ−セレクチン抗体産生ハイブリドーマ（ＣＬ−３）ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−２５１５から精製した。
【００６８】
マウスＢａｌｂ／ｃ（雌性６週齢）に、プリスタン０．５ｍＬ／マウスを投与した。ハイブリドーマをＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ，ペニシリン（Ｐｃ）＋ストレプトマイシン（Ｓｔ）含有）培地で、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。ＰＢＳに細胞を懸濁して、５×１０６細胞／マウスでマウスの腹腔内に投与した。約２週間後に腹水を採取した。硫酸アンモニウム沈殿し、沈殿物をＰＢＳに溶解させ、ＰＢＳ緩衝液で透析を行った。プロテインＧカラム（ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＧ ｃｏｌｕｍｎ １ｍＬ）カラムに透析後の溶液を通した。カラムを洗浄後、プロテインＧに結合したモノクローナル抗体を、０．１Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ２．７）にて溶出し、溶出液を１Ｍ Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ９．０）で中和した。その後、ＰＢＳ緩衝液で透析を行って、定法により、透析後溶液に含まれる抗体濃度を測定した。
【００６９】
（抗体の接着阻止効果の確認）
ヒト動脈由来血管内皮細胞（ＨＡＥＣ、Ｃａｍｂｒｅｘ，カタログ番号ＣＣ−２５３５）を６ウェル培養プレート中、ＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２１０−ＴＡ−０１０）存在下で培養し（１．５ｘ１０５細胞／ウェル）、Ｅセレクチンを内皮細胞表面に誘導した。ＴＮＦ−α添加の１２時間後、各ウェルあたり３μｇ、１０μｇ、または３０μｇの抗Ｅセレクチン抗体を加えた。抗Ｅセレクチン抗体添加の１時間後、ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ（Ｄｏｊｉｎｄｏ，カタログ番号３４１−０７９０１、１μＭ）で蛍光標識した白血球系細胞のＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ，カタログ番号ＴＩＢ−２０２、１．０ｘ１０×５細胞）を加え、１．０ｄｙｎｅ／ｃｍ２のｓｈｅｅｒ ｓｔｒｅｓｓ下で１０分間培養した。蛍光顕微鏡にて内皮細胞と接着したＴＨＰ−１細胞の数を計測することで、抗体の接着阻止効果を評価した。１回あたり１０ウェルで実施し、１ウェルあたりの平均値を測定した。また、独立した実験を３回行った。
【００７０】
コントロールとして、ＴＮＦ−αおよび抗Ｅセレクチン抗体を添加しない群、ならびに、ＴＮＦ−αの存在下で抗Ｅセレクチン抗体を添加しない群を作製し、蛍光顕微鏡にて内皮細胞と接着したＴＨＰ−１細胞の数を計測した。１回あたり１０ウェルで実施し、１ウェルあたりの平均値を測定した。また、独立した実験を３回行った。
【００７１】
その結果、ＴＮＦ−αおよび抗Ｅセレクチン抗体を添加しなかった群では、内皮細胞とＴＨＰ−１細胞とはほとんど接着しなかった。ＴＮＦ−α存在下で抗Ｅセレクチン抗体を添加しなかった群では、内皮細胞に接着したＴＨＰ−１細胞は、約５．３±０．９であり、ＴＮＦ−α存在下で抗Ｅセレクチン抗体を３μｇ投与した群では、約２．５±０．６であり、ＴＮＦ−α存在下で抗Ｅセレクチン抗体を１０μｇ投与した群では、約２．４±０．３であり、ＴＮＦ−α存在下で抗Ｅセレクチン抗体を３０μｇ投与した群では、約１．５±０．３であった。この結果より、抗Ｅセレクチン抗体が濃度依存性に接着阻止効果を持つことが明らかとなった（図１）。
【００７２】
（ラット血管性認知症モデルの作製）
１０〜１２週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラットを日本チャールズ・リバー株式会社から購入し実験に使用した。両側総頚動脈を永久閉塞する血管性認知症モデル動物を８匹作製した。ラットの手術は小動物全身麻酔装置（新鋭工業株式会社製、ソフトランダー、承認番号１７浦安第４５８８号）により吸入麻酔薬のイソフルラン（アボットジャパン、製品名フォーレン、日本標準商品分類番号８７１１１４）を５％濃度で混和した酸素３０％、笑気７０％の混合ガスで麻酔を導入し、１．５％イソフルランを混和した酸素３０％、笑気７０％の混合ガスで麻酔を維持し実体顕微鏡（オリンパス社製、ＳＺＸ１２）を用いて行った。
【００７３】
具体的な手順は、以下のとおりである。頚部（腹側）を正中切開し両側総頚動脈を周りの組織から露出させた。外頚動脈と内頚動脈との分岐部直下の総頚動脈の遠位部を６号絹糸（株式会社夏目製作所製カタログ番号Ｃ−２３）にて２重に結紮した。
【００７４】
（抗Ｅセレクチン阻止抗体の投与）
本実施例にて作製したラット血管性認知症モデルのうち４匹に対し、０．５ミリグラム（1.5mg/kg）の抗Ｅセレクチン阻止抗体を閉塞２時間後に大腿静脈から投与した。
【００７５】
投与の１日後、１週間後、２週間後、４週間後に血液を採取し、血清中の抗Ｅセレクチン阻止抗体濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００７６】
（ＥＬＩＳＡ法）
ＥＬＩＳＡ法は以下の手順でおこなった。
【００７７】
４μｇ／ｍｌ の濃度で５５ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）に溶解したＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ（Ｒ＆Ｄ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｎ，ＡＤＰ１）を、９６穴のプラスチックプレート（ＮＵＮＣ，ＮＵＮＣ−ＩＭＭＵＮＯ ＰＬＡＴＥ Ｆ９６ ＭＡＸＩＳＯＲＰ）に１００μｌづつ添加し、４℃で１６時間インキュベーションした。液を捨て、ウェルを洗浄液（ＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎ）で４回洗浄した。ブロッキングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０（ＴＢＳ），Ｔｈｅｒｍｏ３７５４３）を３００μｌずつ各ウェルに添加し、１時間インキュベーションした。液を捨て、ブロッキングバッファーで２００−４００倍希釈したマウス血清を１００μｌずつウェルに添加し、２時間室温でインキュベーションした。液を捨て、洗浄液で４回洗浄した。ブロッキングバッファーで１００００倍希釈した抗マウス−ＨＲＰ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，Ａ１０６ＰＵ）を１００μｌずつウェルに添加し、１時間室温でインキュベーションした。液を捨て、洗浄液で４回洗浄した。ＴＭＢ液（ＫＰＬ，ＴＭＢ １ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａsｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ，ＫＰＬ５３−００−０１）を１００μｌずつ添加し、遮光して３０分間室温でインキュベーションした。ＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＫＰＬ５０−８５−０４）を１００μｌずつ加え、３０分以内にプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｍｏｄｅｌ ５５０，ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）で吸光度（ＯＤ４５０）を測定した。
【００７８】
その結果、血清中の抗Ｅセレクチン阻止抗体濃度は、投与１日後では８９．６２±４１．５９７μｇ／ｍｌであり、１週間後では４７．２７±２０．４８４μｇ／ｍｌであり、２週間後では２８．２８±１１．５１５μｇ／ｍｌであり、４週間後では６．８４±３．２３９μｇ／ｍｌであった。血清中の抗Ｅセレクチン阻止抗体濃度は緩やかに減少し、半減期は１週間であった（図２）。
【００７９】
以上の結果をまとめると、本発明の組成物では、抗Ｅセレクチン阻止抗体の半減期は約１週間であり、２週間後でも約３０％の血中濃度が維持されていた。この点、従来の報告（非特許文献１〜７）には、このような長期にわたって虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶障害に対して予防効果を発揮するようなものはなく、このような顕著な効果は本発明の組成物により初めて達成されたものである。
【００８０】
（記憶機能検査（物品認識検査））
抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与したラット（４匹）に対し、虚血手術前、術後２週間、術後４週間に記憶機能検査（物品認識検査）を行った。物品認識試験はラットが物品を認識する場合、以前から記憶している対象より、新しい対象により興味を持つことを利用した記憶検査である（Ｓａｒｔｉ Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｂｅｈａｖ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ２００２）。
【００８１】
物品認識試験は、具体的には以下のとおり実施した。部屋の明かりを消し、ガラス水槽の床から７０ｃｍの高さに１００Ｗの蛍光灯を点けた。試験前日に１０分間、ラットを縦３０ｃｍ横４５ｃｍ高さ３０ｃｍのガラス水槽に入れ、環境に慣れさせた。試験当日は１時間間隔で２つの探索行動を行わせた。３種類の対象（プラスチック製の玩具各２個；それぞれ高さ６ｃｍの青色の円柱、赤色の立方体、緑色の三角錐）から任意に１種類（同じもの２個）の対象を選び、ガラス水槽の中に壁から５ｃｍ離した位置に置いた。その中にラットを１回目は６分間探索させた。１時間後、１個の対象を別の種類に変え、６分間探索させた。各対象の探索時間を計測し、以前に１度探索した対象を２度目に探索した時間の合計をＴＦとした。変更した後の対象の探索時間の合計をＴＮとした。探索の定義はラットが髭や鼻で対象に触るか２ｃｍ以内に鼻を近づけた場合とした。ＴＮ−ＴＦ／ＴＮ＋ＴＦをｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘとし、記憶機能をこの指標を基に評価した。指標の数値が大きい程、１回目の探索対象を記憶していると考えられ、記憶機能が高いと考えられる。
【００８２】
物品認識試験の結果、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群において、手術前では０．３３±０．１１７、術後２週間では０．３２８±０．１１５、術後４週間では０．３７１±０．１７８のｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘであった（図３、菱形）。ラット血管性認知症モデルでは、抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与すると、記憶機能の低下が予防された。
【００８３】
（組織学的検索）
記憶機能検査を行ったラットに対し、術後の４週間後に動物脳に灌流固定を行い、パラフィンブロックを作製した。具体的には、０．０１Ｍのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）１００ｍｌで灌流後、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ、１６２−１６０６５）を含む０．１Ｍのリン酸緩衝水（ｐＨ７．４）３００ｍｌで灌流した後、脳を取り出し、パラッフィンブロックを作製した。ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ、ＳＭ２０００Ｒ）で２μｍ厚の切片を作製し、Ｋｌｕｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ法を行って、ミエリンおよび神経細胞を染色した。具体的には、脱パラフィンしたスライドグラスを、９５％エタノール中で水和した。このスライドグラスを、ルクソールファーストブルー（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， ＳＯＬＵＶＥＮＴ ＢＬＵＥ ３８）中、６０℃で１２時間染色し、室温にもどした後、９５％エタノール中で余分な色素を落とし、蒸留水になじませた。その後、０．０５％炭酸リチウムに数秒浸け、７０％エタノールに２回浸ける操作を、皮質の部位の色素が除けるまで繰り返した。その後、スライドグラスを一度鏡検し、灰白質と白質との境界が明瞭になっていない場合、０．０５％炭酸リチウム浸漬および７０％エタノール浸漬（×２）の操作を繰り返した。その後、スライドを蒸留水の中に入れた。染色の直前にクレシールバイオレット液（武藤化学株式会社、カタログ番号４１０２）を、製造業者の推奨に従って調製した。スライドグラスを、３７℃でクレシールバイオレット液で２時間対比染色した。蒸留水で余分な色素を除いた後、スライドグラスを９５％エタノールで２回すすぎ、無水アルコールに２回浸けて、脱水し、キシレンに２回浸して透徹し封入した。ブレグマから後方０．４ｍｍの位置の脳梁を、顕微鏡（オリンパス社製ＢＸ５１）およびデジタルカメラ（オリンパス社製ＤＰ７１）を用いて、対物レンズ４０倍でカラー写真を撮影し、グレースケール、ＰＩＣＴファイルに変換し、ＮＩＨ ｉｍａｇｅソフトウエアーを用いて線維密度を解析することで、神経線維の脱落を評価した。
【００８４】
線維密度は撮影画像の総面積の中の線維の占める面積を百分率で示した。
【００８５】
抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与すると、脳梁の神経線維はほとんど脱落しなかった（図４Ｂ）。神経繊維の脱落は、有意に予防された（図１７）。
【００８６】
（比較例１）
本実施例にて作製したラット血管性認知症モデルのうち４匹に、上記（抗Ｅセレクチン阻止抗体の投与）と同様の方法により、０．５ミリグラムの正常マウス免疫グロブリン（株式会社免疫生物研究所、コード番号17314）を閉塞２時間後に大腿静脈から投与した。
【００８７】
（記憶機能検査（物品認識検査））
正常マウス免疫グロブリンを投与したラット（４匹）に対し、実施例１と同様の方法を用いて、虚血手術前、術後２週間、術後４週間に記憶機能検査（物品認識検査）を行った。
【００８８】
その結果、正常マウス免疫グロブリン投与群において、手術前では０．３１５±０．１２４、術後２週間では−０．１１±０．１７１、術後４週間では−０．０８±０．０１６のｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘであった（図３、四角）。正常マウス免疫グロブリンを投与したラットでは、記憶機能は低下した。
【００８９】
（組織学的検索）
記憶機能検査を行ったラットに対し、術後の４週間後に動物脳に灌流固定を行い、パラフィンブロックを作製した。実施例１と同様の方法を用いて、Ｋｌｕｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ染色を行い、顕微鏡（オリンパス社製ＢＸ５１）およびデジタルカメラ（オリンパス社製ＤＰ７１）を用いて、神経線維の脱落を評価した。
【００９０】
その結果、正常マウス免疫グロブリン投与群では、脳梁の神経線維の脱落が認められた（図４Ａ）。
【００９１】
（実施例１および比較例１のまとめ）
ラット血管性認知症モデルでは、記憶機能検査により、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群（図３、菱形）が、正常マウス免疫グロブリン投与群（図３、四角）に比べて、記憶機能の低下を有意に抑制することが確認された。
【００９２】
虚血による脳梁の神経線維脱落もまた、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群は、正常マウス免疫グロブリン投与群に比べて有意に抑制された。
【００９３】
以上から、虚血により誘発される記憶障害および神経線維脱落は、抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与することにより予防することが可能と考えられる。
【００９４】
（実施例２．マウスにおける抗Ｅセレクチン阻止抗体の効果）
本実施例では、実施例１と同様の方法により調製した抗Ｅセレクチン阻止抗体を用いた。
【００９５】
（マウス血管性認知症モデルの作製）
９−１０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを日本エスエルシー株式会社から購入し実験に使用した。右側総頚動脈を永久閉塞したマウス血管性認知症モデルを１３匹作製した。マウスの手術は、小動物全身麻酔装置（新鋭工業株式会社製、ソフトランダー、承認番号１７浦安第４５８８号）により吸入麻酔薬のイソフルラン（アボットジャパン、製品名フォーレン、日本標準商品分類番号８７１１１４）を５％濃度で混和した酸素３０％、笑気７０％の混合ガスでマウスに麻酔を導入し、次いで、１．５％イソフルランを混和した酸素３０％、笑気７０％の混合ガスで麻酔を維持し実体顕微鏡（オリンパス社製、ＳＺＸ１２）を用いて行った。手順は、以下のとおりである。
【００９６】
頚部（腹側）を正中切開し右側総頚動脈を周りの組織から露出させた。外頚動脈と内頚動脈との分岐部直下の総頚動脈の遠位部を６号絹糸（株式会社夏目製作所製カタログ番号Ｃ−２３）にて２重に結紮した。
【００９７】
（抗Ｅセレクチン阻止抗体の投与）
マウス血管性認知症モデル群のうち、７匹を抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群とした。残り６匹を生理食塩水投与群とした。この抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群には、０．８７ｍｇ／ｋｇの濃度で１００μｌの抗Ｅセレクチン抗体を、閉塞直前に大腿静脈から投与した。生理食塩水投与群には、１００μｌの生理食塩水を閉塞直前に大腿静脈から投与した。
【００９８】
（記憶機能検査（物品認識検査））
虚血手術前および虚血手術４週間後に、物品認識検査を行った。具体的には、四面に白紙を貼ったガラス水槽（縦３０ｃｍ横４５ｃｍ高さ３０ｃｍの床から７０ｃｍ）を用い照明をつけた部屋で行った。試験前日に１０分間、マウスをガラス水槽に入れ、環境に慣れさせた。試験当日は１時間間隔で２つの探索行動を行わせた。３種類の対象（プラスチック製の玩具各２個；それぞれ高さ６ｃｍの青色の円柱、赤色の立方体、緑色の三角錐）から任意に１種類（同じもの２個）の対象を選び、ガラス水槽の中に壁から５ｃｍ離した位置に置いた。その中にマウスを１回目は１０分間探索させた。１時間後、１個の対象を別の種類に変え、５分間探索させた。各対象の探索時間を計測し、以前に１度探索した対象を２度目に探索した時間の合計をＴＦとした。変更した後の対象の探索時間の合計をＴＮとした。探索の定義はマウスが髭や鼻で対象に触るか１ｃｍ以内に鼻を近づけた場合とした。ＴＮ−ＴＦ／ＴＮ＋ＴＦを識別指数とし、記憶機能をこの数値を基に評価した。識別指数の数値が大きい程、１回目の探索対象を記憶していると考えられ、記憶機能が高いと考えられる。虚血手術前の試験で識別指数が０．１に満たない個体はあらかじめ除外した。その結果を以下の表１に示す。
【００９９】
【表１】
【０１００】
（＋）：抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群、「ｎ」は実験に用いたマウス数。
【０１０１】
抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与すると、記憶機能はほとんど低下しなかった（図５）。
【０１０２】
（組織学的検索）
虚血手術から４週間後に動物脳に灌流固定を行い、パラフィンブロックを作製した。ミクロトームで１μｍ厚の切片を作製し、脱パラフィンしたスライドグラスを９５％エタノールでに５分浸してなじませてから、９５％エタノールに溶解したルクソールファーストブルー（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．， ＳＯＬＵＶＥＮＴ ＢＬＵＥ ３８）中で６０℃で１６時間インキュベーションした。室温にもどした後、９５％エタノール中で余分な色素を落とし、蒸留水になじませた。その後、０．０５％炭酸リチウムに数秒浸け、７０％エタノールに２回浸ける操作を、皮質の部位の色素が除けるまで繰り返した。スライドグラスを９５％エタノールで２回すすぎ、１００％エタノールに５分間２回浸して脱水し、キシロールに１５分づつ２回浸して透徹し封入した。顕微鏡（オリンパス社製ＢＸ５１）、デジタルカメラ（オリンパス社製ＤＰ７１）で脳梁を撮影した。
【０１０３】
神経線維の脱落は脳梁の顕微鏡像をソフトウェアー、ＷｉｎＲｏｏｆ（三谷商事株式会社）で線維蜜度を測定することにより評価した。神経線維の脱落は、ブレグマから後方１．９ｍｍの位置のルクソールファーストブルー染色切片の顕微鏡像を、ソフトウェアー、ＷｉｎＲｏｏｆ（三谷商事株式会社）を用い、正中線を含む位置の脳梁の０．００５ｍｍ２を選択し、グレースケールに変換した後、濃度測定ツールを用いて相対的濃度を計測し線維蜜度を測定することにより評価した。各群４匹を検討した。その結果を、以下の表２に示す。
【０１０４】
【表２】
【０１０５】
（＋）：抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群。
【０１０６】
（比較例２）
偽手術群７匹を作製した。偽手術群は総頚動脈を絹糸での閉塞を行わないこと以外は、実施例２の虚血群と同じ手順で手術を行った。
【０１０７】
（抗Ｅセレクチン阻止抗体の投与）
実施例２において作製したマウス血管性認知症モデル群のうち６匹を、コントロールとしての生理食塩水投与群とした。また、偽手術群の各動物を、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群（３匹）と生理食塩水投与群（４匹）とに分けた。
【０１０８】
抗Ｅセレクチン投与群には、０．８７ｍｇ／ｋｇの濃度で１００μｌの抗Ｅセレクチン抗体を、閉塞直前に大腿静脈から投与した。生理食塩水投与群には、１００μｌの生理食塩水を閉塞直前に大腿静脈から投与した。記憶機能検査の結果を以下の表３に示す。
【０１０９】
【表３】
【０１１０】
（−）：生理食塩水投与群、（＋）：抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群、「ｎ」は実験に用いたマウス数。
【０１１１】
偽虚血群では、手術前後において記憶機能検査の結果に大きな差異はなかった。虚血手術後に生理食塩水を投与した群では、手術後に記憶機能が顕著に低下した（図５）。
【０１１２】
（組織学的検索）
実施例２と同様の方法を用いて、虚血手術から４週間後に動物脳に灌流固定を行い、パラフィンブロックを作製した。ミクロトームで１μｍ厚の切片を作製し、Ｌｕｘｏｌ−ｆａｓｔ ｂｌｕｅ染色を行い、顕微鏡（オリンパス社製ＢＸ５１）、デジタルカメラ（オリンパス社製ＤＰ７１）で脳梁を撮影した。結果を以下の表４に示す。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】
（実施例２および比較例２のまとめ）
抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与すると、記憶機能の低下が有意に抑制されることが確認された（図５）。
【０１１５】
（実施例２および比較例２のまとめ）
マウス血管性認知症モデルでは、記憶機能検査により、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群（図５、格子）が、生理食塩水投与群（図５、グレー）に比べて、記憶機能の低下を有意に抑制することが確認された。
【０１１６】
虚血による線条体の神経線維脱落もまた、抗Ｅセレクチン阻止抗体投与群は、生理食塩水投与群に比べて有意に抑制された（図６）。
【０１１７】
以上から、虚血により誘発される記憶障害および神経線維脱落は、抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与することにより、有意に予防することが可能と考えられる。
【０１１８】
（比較例３）
（血管性認知症モデルおよび偽手術モデルの作製）
血管性認知症モデル及び偽手術モデルを、以下の方法に従って作製する。血管認知症モデルを、実施例１と同様の方法により２４匹作製した。偽手術モデルの作製法は、以下に示すとおりである。
【０１１９】
偽手術群は総頚動脈を絹糸での閉塞を行わないこと以外は、実施例１の虚血群と同じ手順で手術を行う。
【０１２０】
（標本作製）
虚血手術から１日後、３日後、７日後、１４日後および３０日後に、上記で作製した血管認知症モデル動物を灌流固定し、脳を取り出して、凍結切片用の標本を作製した。具体的には、０．０１Ｍのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）１００ｍｌで灌流後、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ、１６２−１６０６５）を含む０．１Ｍのリン酸緩衝水（ｐＨ７．４）３００ｍｌで灌流した後、脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍのリン酸緩衝水（ｐＨ７．４）で１２時間後固定した。その後２０％蔗糖を含む０．１Ｍのリン酸緩衝水（ｐＨ７．４）に脳を入れ、凍結切片作製まで４℃で保存した。用いた動物数は、虚血手術から１日後４匹、３日後４匹、７日後５匹、１４日後６匹および３０日後５匹であった。なお、偽手術群は、手術直後に屠殺し、虚血手術群と同様の方法を用いて標本を作製する。
【０１２１】
（ＴＮＦ−αの発現）
血管性認知症モデルにおいて、ブレグマから後方２．３ｍｍの位置の脳梁におけるＴＮＦ−αの発現を検索した。具体的には、抗ＴＮＦ−α抗体として、ＹＡＮＡＩＨＡＲＡ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＩＮＣ、カタログ番号ＹＣ０３２を用いた。クリオスタット（Ｌｅｉｃａ、ＣＭ１８５０）で凍結切片を作製し、浮遊切片として染色した。手順は以下のとおりである。切片を、０．３％の過酸化水素（過酸化水素水（３０％）和光純薬工業株式会社カタログ番号０８１−０４２１５より調整）、１０％のメタノール（和光純薬工業株式会社カタログ番号１３７−０１８２３より調整）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に３０分浸漬した後、１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、５％の濃度の正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−２０００）を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号Ｔ９２８４−５００ＭＬ）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に６０分浸漬した。抗ＴＮＦ−α抗体を、５％の濃度の正常ウマ血清を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて８００倍に希釈し、標本をその溶液で４℃で１２時間浸漬した。その後１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、この切片を、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて７０倍に希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ−２００１）に、６０分間浸漬した。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で１５分間洗浄した後、ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１００）を用いて切片を１時間反応させた。その後、ＤＡＢ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＫ−４１００）で発色させた。
【０１２２】
その結果を以下の表５、図７および図８に示す。
【０１２３】
【表５】
【０１２４】
「ｎ」は実験に用いたラット数
虚血手術群では、虚血手術から１日後、１４日後および３０日後にＴＮＦ−αの発現が認められた（図８Ａ〜Ｃ）。
【０１２５】
参考文献（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２８：３４１−３５３，２００８）では、偽手術群（４匹）における１切片あたりの脳梁内ＴＮＦ−α陽性血管数は、１．００±０．０８２である（値は、平均値±標準偏差）。上記で作製した血管性認知症モデルは、偽手術群と比較すると、ＴＮＦ−α陽性血管数が増加している。
【０１２６】
（Ｅセレクチンの発現）
血管性認知症モデルにおいて、ブレグマから後方２．３ｍｍの位置の脳梁におけるＥセレクチンの発現を検索した。具体的には、抗Ｅ−セレクチン抗体として、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＡＦ９７７を用いた。クリオスタット（Ｌｅｉｃａ、ＣＭ１８５０）で凍結切片を作製し、浮遊切片として染色した。手順は以下のとおりである。切片を、０．３％の過酸化水素（過酸化水素水（３０％）和光純薬工業株式会社カタログ番号０８１−０４２１５より調整）、１０％のメタノール（和光純薬工業株式会社カタログ番号１３７−０１８２３より調整）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に３０分浸漬した後、１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、５％の濃度の正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−２０００）を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号Ｔ９２８４−５００ＭＬ）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に６０分浸漬した。さらに、５μｇ／ｍｌの濃度の抗Ｅ−セレクチン阻止抗体と５％の濃度の正常ウマ血清を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて４℃で１２時間浸漬した。その後１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、この切片を、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて２００倍に希釈したビオチン化抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ−９５００）に６０分間浸漬した。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で１５分間洗浄した後、ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１００）を用いて切片を１時間反応させた。その後、ＤＡＢ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＫ−４１００）で発色させた。その結果を以下の表６、図９および図１０に示す。
【０１２７】
【表６】
【０１２８】
「ｎ」は実験に用いたラット数。
【０１２９】
虚血手術群では、虚血手術から１日後、１４日後および３０日後にＥセレクチンの発現が認められた（それぞれ、図１０Ａ〜Ｃ）。
【０１３０】
参考文献（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２８：３４１−３５３，２００８）では、偽手術群（４匹）における１切片あたりの脳梁内Ｅセレクチン陽性血管数は極めて少数（平均で１未満）であった。上記で作製した血管性認知症モデルは、偽手術群と比較すると、Ｅセレクチン陽性血管数が増加している。
【０１３１】
（ミクログリアの活性化）
血管性認知症モデルにおいて、ブレグマから後方２．３ｍｍの位置の脳梁におけるミクログリアの活性化を検索した。具体的には、血管性認知症モデルおよび偽手術モデルにおいて、ブレグマから後方２．３ｍｍの位置の脳梁におけるＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩの発現を検索した。具体的には、抗ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗体としてＳｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ、カタログ番号 ＭＣＡ４６Ｒを用いた。クリオスタット（Ｌｅｉｃａ、ＣＭ１８５０）で凍結切片を作製し、浮遊切片として染色した。手順は以下のとおりである。切片を、０．３％の過酸化水素（過酸化水素水（３０％）和光純薬工業株式会社カタログ番号０８１−０４２１５より調整）、１０％のメタノール（和光純薬工業株式会社カタログ番号１３７−０１８２３より調整）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に３０分浸漬した後、１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、５％の濃度の正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−２０００）を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号Ｔ９２８４−５００ＭＬ）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に６０分浸漬した。抗ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗体を５％の濃度の正常ウマ血清を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて１００倍に希釈し、標本をその溶液で４℃で１２時間浸漬した。その後１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、この切片を、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて７０倍に希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ−２００１）に、６０分間浸漬した。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で１５分間洗浄した後、ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１００）を用いて切片を１時間反応させた。その後、ＤＡＢ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＫ−４１００）で発色させた。その結果を、以下の表７、図１１および図１２に示す。
【０１３２】
【表７】
【０１３３】
「ｎ」は実験に用いたラット数。
【０１３４】
虚血手術群では、虚血手術から３日後、１４日後および３０日後に活性化したミクログリアが認められた（図１２Ａ〜Ｃ）。
【０１３５】
参考文献（Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ ８７：４８４−４９２，１９９４）では、偽手術群（５匹）における１切片あたりの活性化ミクログリア数は極めて少数であった。上記で作製した血管性認知症モデルは、偽手術群と比較すると、活性化ミクログリア数が増加している。
【０１３６】
（ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ リンパ球の浸潤）
血管認知症モデルにおいて、ブレグマから後方２．３ｍｍの位置の脳梁におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ リンパ球の浸潤を観察した。具体的には、抗ＣＤ４抗体としてＳｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ、カタログ番号 ＭＣＡ５５Ｒ、および抗ＣＤ８抗体としてＳｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ、カタログ番号 ＭＣＡ４８Ｒ、を用いた。クリオスタット（Ｌｅｉｃａ、ＣＭ１８５０）で凍結切片を作製し、浮遊切片として染色した。手順は以下のとおりである。切片を、０．３％の過酸化水素（過酸化水素水（３０％）和光純薬工業株式会社カタログ番号０８１−０４２１５より調整）、１０％のメタノール（和光純薬工業株式会社カタログ番号１３７−０１８２３より調整）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に３０分浸漬した後、１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で洗浄した。その後、５％の濃度の正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−２０００）を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号Ｔ９２８４−５００ＭＬ）を含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）に６０分浸漬した。抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体を、５％の濃度の正常ウマ血清を入れた０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にてそれぞれ、４００倍および２００倍に希釈し、標本をその溶液で４℃で１２時間浸漬した。その後１５分間、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄した。次いで、この切片を、０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）にて７０倍に希釈したビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ−２００１）に、６０分間浸漬した。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含むリン酸緩衝食塩水で１５分間洗浄した後、ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＰＫ−６１００）を用いて切片を１時間反応させた。その後、ＤＡＢ ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＳＫ−４１００）で発色させた。
【０１３７】
ＣＤ４＋ Ｔリンパ球浸潤の結果を以下の表８、図１３および図１４に示す。
【０１３８】
【表８】
【０１３９】
「ｎ」は実験に用いたラット数。
【０１４０】
虚血手術群では、虚血手術から１日後、１４日後および３０日後においてＣＤ４＋ Ｔリンパ球浸潤が認められた（図１４Ａ〜Ｃ）。
【０１４１】
参考文献（Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ ８７： ４８４−４９２，１９９４）では、偽手術群（５匹）における１切片あたりのＣＤ４＋ Ｔリンパ球の脳実質への浸潤は認めなかった。上記で作製した血管性認知症モデルは、偽手術群と比較すると、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球数が有意に増加している。
【０１４２】
ＣＤ８＋ リンパ球浸潤の結果を以下の表９、図１５および図１６に示す。
【０１４３】
【表９】
【０１４４】
「ｎ」は実験に用いたラット数。
【０１４５】
虚血手術群では、虚血手術から１日後、７日後および３０日後においてＣＤ８＋ リンパ球浸潤が認められた（図１６Ａ〜Ｃ）。
【０１４６】
参考文献（Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ ８７： ４８４−４９２，１９９４）では、偽手術群（５匹）における１切片あたりのＣＤ８＋ Ｔリンパ球の脳実質への浸潤は認めなかった。上記で作製した血管性認知症モデルは、偽手術群と比較すると、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球数が有意に増加している。
【０１４７】
（実施例３．ラットにおける抗Ｅセレクチン阻止抗体の治療効果）
（ラットにおける抗Ｅセレクチン阻止抗体の投与）
実施例１と同様に、ラット血管性認知症モデルを６匹作製した（閉塞した日を０日目とする）。閉塞２週間後に６匹全てに対して、実施例１に記載される物品認識検査（１回目）を行う。物品認識検査を行った直後に、ラットを２群に分け（３匹／群）、１つめの群をコントロール群として、生理食塩水のみを大腿静脈から投与する。２つめの群を実験群として、０．５ミリグラム（１．５ｍｇ／ｋｇ）の抗Ｅセレクチン阻止抗体を大腿静脈から投与する。
【０１４８】
投与の１日後、１週間後、２週間後、４週間後に血液を採取し、血清中の抗Ｅセレクチン阻止抗体濃度をＥＬＩＳＡ法で測定する。
【０１４９】
（ＥＬＩＳＡ法）
ＥＬＩＳＡ法を実施例１に記載される手順でおこなう。
【０１５０】
実施例１の実験では、抗Ｅセレクチン阻止抗体の半減期は約１週間であり、２週間後でも約３０％の血中濃度が維持されていたので、この点、血管性認知症を発症したラットにおいても、同様の血中濃度が検出されると考えられる。
【０１５１】
（記憶機能検査（物品認識検査））
上記で作製した生理食塩水を投与したコントロール群および抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与した実験群のラットに対して、ラット（３匹）に対し、１回目の物品認識検査から２週間目および４週間目に、２回目および３回目の記憶機能検査（物品認識検査）を行う。
【０１５２】
物品認識試験の結果、３回目の記憶機能検査におけるｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘは、２回目のｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘと比較してほとんど変化がないことが予想される。コントロール群は、３回目の記憶機能検査におけるｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘは、２回目のｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘと比較して、徐々に低下することが予想される。よって、ラット血管性認知症モデルでは、抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与すると、血管性認知症を発生した場合にも、記憶機能が低下の進行防止が認められる。
【０１５３】
（組織学的検索）
記憶機能検査を行ったラットに対し、術後の４週間後に動物脳に灌流固定を行い、パラフィンブロックを作製した。ミクロトームで２μｍ厚の切片を作製し、実施例１と同様に、Ｋｌｕｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ染色を行った。顕微鏡（オリンパス社製ＢＸ５１）およびデジタルカメラ（オリンパス社製ＤＰ７１）を用いて、対物レンズ４０倍でカラー写真を撮影し、グレースケール、ＰＩＣＴファイルに変換し、ＮＩＨ ｉｍａｇｅソフトウエアーを用いて線維密度を解析することで、神経線維の脱落を評価する。抗Ｅセレクチン阻止抗体を投与した実験群では、脳梁の神経線維脱落はコントロール群と比較して有意に軽減される。
【０１５４】
（実施例４．ヒトにおける抗Ｅセレクチン阻止抗体の効果）
上記実施例の結果に鑑みると、ヒトにおいては血管性認知症の患者や血管性認知症を発症するリスクのある患者（動脈硬化のある患者、脳卒中の既往者、高血圧や糖尿病等の血管性危険因子を持つ軽度認知障害患者等）に対して、抗Ｅセレクチン阻止抗体を１か月に１回静脈注射または点滴（例えば、用量０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重）をする事で、既に血管性認知症の発症した患者に対しては血管性認知症の進行が予防でき、血管性認知症を発症するリスクのある患者に対しては、発症が予防できる。
【０１５５】
（実施例５．抗Ｅセレクチン抗体を含む製剤の調製）
例えば、ＡＴＣＣ番号 CRL-2515のハイブリドーマの遺伝子操作により、抗Ｅセレクチン阻止抗体のヒト化バージョンを作製する。このようにして得られたヒト化バージョンのモノクローナル抗体を、基本的には、実施例１に記載されるモノクローナル抗体の生成に従って商業規模で調製し、実質的に精製された抗体を凍結乾燥することによって、静脈注射用の抗体粉末を得る。１回使用の使い捨てバイアルに詰め、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で要時調製する。
【０１５６】
（実施例６．抗Ｅセレクチン抗体を含む製剤の投与）
血管性認知症の発症予防または進行予防のために、血管性認知症の患者や血管性認知症を発症するリスクのある患者は、１ヶ月に１回定期的に通院することで、認知能力の変化をチェックし、抗Ｅセレクチン阻止抗体（用量０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重）を静脈注射または点滴をする。
【０１５７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明の抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物は、虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能を低下を抑える効果を有する。本発明の組成物は、虚血による障害が発生する前に投与することにより、その発生を完全に防ぐ予防薬として利用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための組成物であって、該組成物は抗Ｅセレクチン抗体を含む、組成物。
【請求項２】
前記組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、虚血が生じた約２時間後に投与されることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記大脳白質損傷が脳梁の神経線維脱落である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記大脳白質損傷が脳梁の神経線維脱落であり、前記組成物が、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、被験体に対して約０．１〜約５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、投与１日後の血清中抗体濃度が、約５０μｇ／ｍｌ〜約１３０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、投与１週間後の血清中抗体濃度が、約３０μｇ／ｍｌ〜約７０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、投与２週間後の血清中抗体濃度が、約２０μｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、投与４週間後の血清中抗体濃度が、約４μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で静脈投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記大脳白質損傷が脳梁の神経線維脱落であり、前記組成物は、虚血が生じた約２時間後に約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で静脈投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防する方法であって、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための医薬の製造における抗Ｅセレクチン抗体の使用。
【請求項１】
虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための組成物であって、該組成物は抗Ｅセレクチン抗体を含む、組成物。
【請求項２】
前記組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物は、虚血が生じた約２時間後に投与されることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記大脳白質損傷が脳梁の神経線維脱落である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記大脳白質損傷が脳梁の神経線維脱落であり、前記組成物が、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、被験体に対して約０．１〜約５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、投与１日後の血清中抗体濃度が、約５０μｇ／ｍｌ〜約１３０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、投与１週間後の血清中抗体濃度が、約３０μｇ／ｍｌ〜約７０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、投与２週間後の血清中抗体濃度が、約２０μｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、投与４週間後の血清中抗体濃度が、約４μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌとなるように投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、虚血が生じる前、虚血の間または虚血が生じた後、約２時間以内に約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で静脈投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記大脳白質損傷が脳梁の神経線維脱落であり、前記組成物は、虚血が生じた約２時間後に約０．８７〜約１．５ｍｇ／体重の抗Ｅセレクチン抗体の量で静脈投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防する方法であって、抗Ｅセレクチン抗体を含む組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１４】
虚血により誘導される大脳白質損傷および記憶機能の低下を予防するための医薬の製造における抗Ｅセレクチン抗体の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１１】
【図１３】
【図１５】
【図１７】
【図４】
【図８】
【図１０】
【図１２】
【図１４】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１１】
【図１３】
【図１５】
【図１７】
【図４】
【図８】
【図１０】
【図１２】
【図１４】
【図１６】
【公開番号】特開２０１０−１８４８８４（Ｐ２０１０−１８４８８４Ａ）
【公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９１７９（Ｐ２００９−２９１７９）
【出願日】平成２１年２月１０日（２００９．２．１０）
【出願人】（３９００１６３７７）片山化学工業株式会社 (9)
【出願人】（５０１３０４３１９）国立長寿医療センター総長 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１０日（２００９．２．１０）
【出願人】（３９００１６３７７）片山化学工業株式会社 (9)
【出願人】（５０１３０４３１９）国立長寿医療センター総長 (9)
【Ｆターム（参考）】
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