抗ＥＧＦＲ抗体
本発明は、ＥＧＦＲ特異的なモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。これらの抗体又はその抗原結合部分は、ＥＧＦＲに対する高い親和性を有し、ＥＧＦＲの活性化を阻害し、ＥＧＦＲにより媒介される癌の治療に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学の分野に関し、具体的には上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と反応するモノクローナル抗体の分野に関する。より詳細には、本発明は高い親和性を有するヒト化抗ＥＧＦＲ抗体、並びに様々な癌の治療、予防又は診断への当該抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、上皮、間充織及び神経組織において広く発現し、成長及び分化の際に不可欠な役割を果たす、細胞表面受容体のチロシンキナーゼファミリーに属するメンバーである。ＥＧＦＲ（別名ＨＥＲ１又はｃ−ｅｒｂＢ−１）は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインからなる１７０ｋＤａの膜貫通型の糖タンパク質である（非特許文献１）。ＥＧＦＲと結合し活性化させる哺乳類のリガンドとしては、ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、ヘパリン−結合性ＥＧＦ様成長因子、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピレグリン及びエピゲンが挙げられる（非特許文献２）。成長因子ＥＧＦ又はトランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）の上皮細胞増殖因子受容体に対する結合により、レセプタ二量体化、自己リン酸化及びチロシンキナーゼカスケードが誘導され、その結果、ＤＮＡ合成及び細胞分裂に至る。
【０００３】
ＥＧＦＲは多くの上皮腫瘍において異常に活性化し、例えば非小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸癌、頭部癌及び頸部癌、並びに前立腺ガンのそれらが挙げられる（非特許文献３）。ＥＧＦＲの異常な活性化はレセプタの過剰発現、遺伝子増幅、突然変異の誘発、受容体リガンドの過剰発現及び／又はＥＧＦＲ活性の調節不全をもたらしうる（非特許文献４）。異常に高いＥＧＦＲの活性化により幾つかの細胞内基質のリン酸化がなされ、それにより減数分裂シグナリング、及びその他の腫瘍誘発性の活性が生じる。すなわちＥＧＦＲは、受容体の異常な発現を潜在的に阻害若しくは減少させることができる抗癌治療ストラテジーにおける標的であるといえる。
【０００４】
ＥＧＦＲを標的とする抗癌剤には、モノクローナル抗体が包含される。キメラモノクローナル抗体Ｃ２２５（又はセツキシマブ）（ｍＡｂ２２５のネズミ可変領域及びヒトＩｇＧ１定常領域を含んでなる）は、現在米国及びヨーロッパのイリノテカン抵抗性大腸癌の治療に使用されている（非特許文献５）。更に、ＥＧＦＲに対するヒト抗体及びヒト化モノクローナル抗体に関して研究がなされている。完全にヒト抗体ＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ）は、Ｃ２２５のよりもＥＧＦＲに対する親和性が約８倍高い（非特許文献６）。ＥＧＦＲに対するヒト化抗体ＥＭＤ７２０００（マツズマブ）の親和性はＣ２２５のそれと類似しており（非特許文献７）、ＥＧＦＲに対するヒト化抗体ｈ−Ｒ３の親和性はＣ２２５のそれ未満である（非特許文献８）。１００ｍｇ／ｍ２以上のセツキシマブの投与による診療において、合併症が観察されている。例えば、紅潮、脂漏性皮膚炎及びざ瘡様発疹をもたらす皮膚毒性などである（非特許文献９）。
【非特許文献１】Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ａ−４３１ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０９，４１８−２５（１９８６）
【非特許文献２】Ｓｉｎｇｈ，Ａ．及びＨａｒｒｉｓ，Ｒ．，２００５，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ １７：１１８３−１１９３
【非特許文献３】Ａｄａｍｓ，Ｇ．及びＷｅｉｎｅｒ，Ｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１１４７−１１５７
【非特許文献４】Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．及びＡｒｔｅａｇａ，Ｃ．，２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：２４４５−２４５９
【非特許文献５】Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．及びＡｒｔｅａｇａ，Ｃ．，２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：２４４５−２４５９
【非特許文献６】Ｙａｎｇ，Ｘ−Ｄら、２００１，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍａｔ．，３８：１７−２３
【非特許文献７】Ｖａｎｈｏｅｆｅｒ，Ｕ．ら、２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２２：１７５−１８４
【非特許文献８】Ｃｒｏｍｂｅｔ，Ｔ．ら、２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２２：１６４６−１６５４
【非特許文献９】Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．及びＬａｎｇｅｒ，Ｃ．，２００２，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９：２７−３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＥＧＦＲと高い親和性で結合し、上皮腫瘍のＥＧＦＲの異常な活性化を阻害する抗ＥＧＦＲ抗体に対する治療的ニーズが存在する。高親和性の抗ＥＧＦＲ抗体により、低用量での投与が可能となり、副作用（例えば皮膚毒性）の危険性が減少する。更に、抗体の複数回投与により誘導されうる、抗体に対するいかなる免疫反応も減少させることができる抗ＥＧＦＲ抗体の提供に対するニーズが存在する。本発明はこれらのニーズを満たし、それに関連する多くの効果を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の抗体は、ＥＧＦＲの活性化を阻害する、ＥＧＦＲ特異的なヒト化モノクローナル抗体及びその抗原結合部分に関する。一実施形態では、本発明の抗体は、ＥＧＦＲと高い親和性で結合することを特徴とし、当該抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体は、約０．０１ｐＭ〜約１０ｐＭのＥＧＦＲとの結合親和性（Ｋｄ）を有する。好ましい実施形態では、本発明の抗体は１０ｐＭ以下のＫｄ（ＥＧＦＲに対する）を有し、好ましくは９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｐＭ以下のＫｄを有し、より好ましくは０．８、０．６、０．４、０．２、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２又は０．０１ｐＭ以下のＫｄを有する。
【０００７】
一実施形態では、ＥＧＦＲ特異的なモノクローナル抗体は、配列番号４３に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号４５に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号４６に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号３５に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２及び配列番号４７に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含んでなる。好ましくは当該抗体は、ＥＧＦＲの活性化を阻害することを更なる特徴とする。好ましくは当該抗体は、ＥＧＦＲとの１０ｐＭ以下の結合親和性（Ｋｄ）を有すること、好ましくは９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｐＭ以下のＫｄを有すること、より好ましくは０．８、０．６、０．４、０．２、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２又は０．０１ｐＭ以下のＫｄを有することを更なる特徴とする。好ましくは当該抗体は、ＥＧＦＲの活性化を阻害し、ＥＧＦＲとの１０ｐＭ以下の結合親和性を有すること、好ましくは９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｐＭ以下のＫｄを有すること、より好ましくは０．８、０．６、０．４、０．２、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２又は０．０１ｐＭ以下のＫｄを有することを更なる特徴とする。
【０００８】
本発明の一実施形態では、本発明のＥＧＦＲ特異的なモノクローナル抗体は、配列番号４９の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び配列番号６６の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含んでなる。他の実施形態では、ＥＧＦＲ特異的なモノクローナル抗体は、配列番号５１のＨＣＶＲ及び配列番号６８のＬＣＶＲ、配列番号５５のＨＣＶＲ及び配列番号７２のＬＣＶＲ、又は、配列番号５６のＨＣＶＲ及び配列番号７３のＬＣＶＲを含んでなる。
【０００９】
本発明の他の実施形態は、前記実施形態のうちのいずれかのモノクローナル抗体に関し、当該抗体は完全長抗体、実質的な完全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又は単鎖Ｆｖフラグメントである。好ましくは、当該抗体又はその抗原結合部分は、前記実施形態のうちのいずれかのヒト化抗体である。
【００１０】
本発明には、本願明細書に記載されている抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子、前記核酸分子を含むベクター（好ましくは発現ベクター）が包含される。本発明にはまた、本願明細書に記載されている抗体を発現するこれらのポリヌクレオチドを含んでなるベクターでトランスフェクションした宿主細胞が包含される。
【００１１】
本発明には、本願明細書に記載されている抗体を有効量で患者に投与することを含んでなる、ＥＧＦＲにより媒介される癌の治療方法が包含される。
【００１２】
最後に本発明には、患者におけるＥＧＦＲにより媒介される癌の治療用薬剤の製造への、本願明細書に記載されている抗体の使用が包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
定義
本発明では、「外皮成長因子受容体」又は「ＥＧＦＲ」とは、成熟した、チロシンキナーゼ細胞表面受容体のことを指す。「可溶性ＥＧＦＲ」又は「ｓＥＧＦＲ」という用語は、ＥＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインを含んでなるＥＧＦＲの一部のことを指す。より詳細には、ｓＥＧＦＲは成熟型ＥＧＦＲの１〜６１９番目のアミノ酸を含む（Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ａ−４３１ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０９，４１８−２５（１９８６））。
【００１４】
「ＥＧＦＲにより媒介される癌」という用語は、通常の対応する上皮組織より高いレベルでＥＧＦＲが異常に活性化している上皮腫瘍により特徴づけられる癌のことを指す。これらの高いＥＧＦＲ活性レベルにより、多くのタイプの癌において腫瘍成長が促進される。かかる癌としては、限定されないが、非小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸癌、東部及び頚部癌、並びに前立腺癌が挙げられる。ＥＧＦＲの異常な活性化は、受容体の過剰発現、遺伝子増幅、突然変異の増加、受容体リガンドの過剰発現及び／又はＥＧＦＲ活性の調節因子の損失に起因すると考えられる。
【００１５】
本明細書で用いられる用語「抗体」とは、ジスルフィド結合で相互に結合した、４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖）を含んでなる免疫グロブリン分子のことを指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨとして本願明細書に略記される）及び重鎖定常領域を含んでなる。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含んでなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ又はＶＬとして本願明細書に略記される）及び軽鎖定常領域を含んでなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）を含んでなる。ＶＨ及びＶＬ領域は更に、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される）と、点在する保存されたドメイン（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される）に分類される。３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列されている。各ドメインに対するアミノ酸の割当ては、公知の慣例によって行われる（例えばＫａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、又はＣｈｏｔｈｉａ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８，１９９７）に記載）。ＶＨのＣＤＲは、本明細書においてＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と称する。ＶＬのＣＤＲは、本明細書においてＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と称する。
【００１６】
軽鎖はκ及びλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ又はεに分類され、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥと定義される。軽鎖及び重鎖中では、可変領域及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域により結合し、重鎖については、約３つ以上のアミノ酸からなる「ｄ」領域を含む。
【００１７】
上記によれば、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。しかしながらかかる抗体は、それらが単一の細胞種のクローンに由来するという点でのみ、単クローン性といえる。しかしながらこのことは、それらを特定の起源に限定するものではない。かかる抗体は、通常抗体を生産しない細胞（例えばＣＨＯ、ＮＳ０又はＣＯＳ細胞）において容易に産生させることができる。更にかかる抗体は、他のタイプの細胞（特に哺乳類の及び植物細胞でさえも）においても産生させることができ、その場合には、かかる細胞に遺伝子的な操作を施して軽鎖及び重鎖ポリペプチドを発現させ、それらを集合させて抗体分子を形成させる。更に、かかる鎖は化学的に合成してもよい。なお、それらは所定の抗原決定要素に対して特異的であるため、「単クローン」の用語の主旨に適う抗体を構成することには変わりない。すなわち、本願明細書の用語「モノクローナル抗体」は、前記抗体の生産に使用する機構を単に指すというよりは、むしろ抗体分子の特性及び純度を意味するものと解すべきである。
【００１８】
本発明で使用する、抗体の「抗原結合部分」という用語は、可変領域の範囲内における、目的の抗原との結合に必要となる抗体分子の部分を意味する。抗原結合部分は、抗原と相互作用し、抗体に対して抗原との特異性及び親和性を付与するためのアミノ酸残基を含んでなる。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体中のフラグメントにより付与される。抗体の「抗原結合部分」の用語中に包含される結合フラグメントの例としては、
（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント）、
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合している２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント）、
（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント（ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる）、
（ｉｖ）Ｆｖフラグメント（抗体の１つのアームとしての、ＶＬ及びＶＨドメインからなる）、
（ｖ）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６、ＶＨドメインからなる）。
更に、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬ及びＶＨ）は、別々の遺伝子としてコードされているが、組換え方法を用いて、それらを合成リンカーを用いて結合させ、単一のタンパク質鎖として合成することも可能である。その場合、ＶＬ及びＶＨ領域が対を形成して一価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知、例えばＢｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６：及びＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照）。かかる単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」の用語に包含される。単鎖抗体の他の形態としては、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）などが挙げられる。ｄｉａｂｏｄｙとは、二価の、二重特異的な抗体のことを指し、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖として発現されるが、過度に短いリンカーを用いることにより、同じ鎖上において２つのドメイン間の対合が生じず、ゆえにそのドメインが他の鎖の補完的なドメインとの対合形成を余儀なくされ、２つの抗原結合部位が形成されることを特徴とする（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ら、（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照）。
【００１９】
「ヒト化抗体」の用語は、ヒト抗体生殖細胞系又は再構成された配列に由来して、ヒト以外の生物由来の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）とかかる配列を連結することによって作製されるアミノ酸配列の部分又は全部から構成される抗体を意味する。可変領域のフレームワーク領域は、完全なヒトフレームワーク領域、又は実質的なヒトフレームワーク領域で置換される。ヒトの治療用途に用いるヒト化抗体において、当該フレームワーク配列は好ましくは完全に、又は実質的にヒト由来（すなわち少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％がヒト由来）である。ヒト化抗体のＣＤＲｓは、ヒト以外の抗体のＣＤＲｓを基にして、所望の特性（例えば特異性、親和性及び力価）を得るために最適化してもよい。元のヒト以外のＣＤＲｓと比較して、最適化されたＣＤＲｓは、アミノ酸置換、付加及び／又は欠失を有してもよい。本願明細書に記載のように、ヒト化抗体に包含される抗体としては、完全長抗体に限られず、その抗原結合部（例えばフラグメント及び単鎖の形）も挙げられる。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「ヒト抗体」には、ヒトの抗体並びに、組換え手法を用いて調製、発現、作製又は単離されるそれらが包含される。組換え手法によって得られるヒト抗体としては、宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターから発現される抗体、組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子を用いたトランスジェニック動物（例えばマウス）から単離される抗体（例えばＴａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ら、（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含んでなる、他のあらゆる手段によって調製さる、発現され、作製され、又は単離される抗体が挙げられる。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異導入して、ＶＨのアミノ酸配列及び組換え抗体のＶＬドメインを、ヒト生殖細胞系のＶＨ及びＶＬ配列に由来しつつも、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるヒト抗体の生殖細胞系レパートリー中には存在し得ない配列としてもよい。
【００２１】
本発明の抗体に関する「生物学的特性」又は「生物学的活性」の用語は本願明細書では交換可能に用いられ、例えばエピトープ／抗原親和性及び特異性、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＧＦＲの活性を中和若しくはアンタゴナイズする能力、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ安定性及び抗体の免疫原特異性などが挙げられるが、これらに限定されない。他の定義可能な抗体の生物学的特性としては、例えば、特異性、交差反応性（すなわち標的ペプチドのヒト以外の相同物、又は通常他のタンパク質又は組織との交差反応性）、及び哺乳動物細胞におけるタンパク質の高い発現レベルを維持する能力が挙げられる。上記の特性又は特徴は、当業者に公知の技術を使用して観察、測定又は評価することができる。ＥＬＩＳＡ、競争的ＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴分析、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ中和アッセイ、受容体結合アッセイ、及びヒト又はヒト以外の様々な給源からの組織切片を用いた免疫組織化学を必要に応じて用いてもよい。
【００２２】
本発明の抗体の活性に関して本明細書で用いられる「阻害する」の用語は、生物学的活性若しくは特異性、疾患若しくは症状の進行又は重症度を、実質的にアンタゴナイズする、抑止する、防止する、遅延させる、抑制する、崩壊させる、除去する、停止させる、減少させる又は逆転させる能力のことを指すが、これらに限定されない。当該阻害又は中和の程度は、好ましくは少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上である。
【００２３】
本明細書で用いられる抗体に関する「ＥＧＦＲ活性化を阻害する能力」とは、そのＥＧＦＲに対する結合が、ヒトＥＧＦＲの活性化の抑制、及びその受容体の活性化に応じて生じるヒトＥＧＦＲの生物学的活性の抑制につながる、抗体の能力のことを指すものとする。ＥＧＦＲ生物学的活性の１つ以上の指標の測定（細胞増殖アッセイを使用して測定される）、アポトーシスアッセイ、受容体結合アッセイ、受容体リン酸化アッセイ、又はマウス腫瘍モデル（実施例６から１０を参照）を行うことにより、抗体がＥＧＦＲ活性化を阻害する能力を評価できる。
【００２４】
本明細書で用いられる「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体のことを指す（例えば、ＥＧＦＲと結合する単離された抗体は、他の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＥＧＦＲと特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原（例えば他の種由来のＥＧＦＲ分子）との交差反応性を有することもありえる。更に、単離された抗体は、他の細胞内物質及び／又は化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「ｋｏｎ」は、正反応若しくは複合体形成反応に関する、結合若しくはｏｎ速度定数、又は特異的反応速度のことを指し、Ｍ−１秒−１の単位として表される。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「ｋｏｆｆ」は、抗原／抗体複合体からの抗体解離反応に関する、解離若しくはｏｆｆ速度定数、又は特異的反応速度のことを指し、秒−１の単位として表される。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「Ｋｄ」とは、ある特定の抗体−抗原相互作用の解離定数のことを指す。以下の式により算出される：
ｋｏｆｆ／ｋｏｎ＝Ｋｄ。
【００２８】
本発明の抗体は高親和性抗体であり、通常低いｋｏｆｆ値を示す。本願明細書における用語「高い親和性」とは、約１×１０−１１Ｍ〜約１×１０−１４Ｍの親和性又はＫｄのことを指すか、あるいは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．８、０．６、０．４、０．２、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２又は０．０１ｐＭ以下の親和性又はＫｄのことを指す。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「核酸分子」には、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子が包含される。当該核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖のＤＮＡである。
【００３０】
本明細書で用いられる用語「単離された核酸分子」とは、ヒトＥＧＦＲと結合する抗体又は抗体部分（例えばＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関して用いる場合は、当該抗体若しくは抗体部をコードするヌクレオチド配列がヒトＥＧＦＲ以外の抗原と結合する抗体若しくは抗体部をコードする他のヌクレオチド配列を含まず、当該他の配列が、ヒトゲノムＤＮＡの核酸中で側方に天然に存在しうる、核酸分子のことを指す。すなわち、例えば抗ヒトＥＧＦＲ抗体のＶＨ領域をコードする本発明の単離された核酸は、ヒトＥＧＦＲ以外の抗原と結合する他のＶＨ領域をコードする他のいかなる配列も含まない。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「ベクター」とは、連結された他の核酸を輸送できる核酸分子のことを指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、それは付加的なＤＮＡ部分をライゲーションさせることができる、環状の二重鎖ＤＮＡループのことを指す。他のタイプのベクターはウィルスベクターであり、付加的なＤＮＡ部分をウィルスゲノムにライゲーションさせることができる。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）とは、組換え発現ベクターが導入された細胞のことを指す。
【００３３】
抗体の特性
ヒト化抗体の利点として最初に挙げられることは、患者への反復投与によっても免疫反応が最小限であることである。ヒト化抗体においてヒト配列がより多く使用されるほど、免疫原性の危険性は低くなる。更に、注入されたヒト化抗体は通常、ヒト由来でないか部分的にヒト由来でない抗体を注入した場合より循環系における半減期が長い。
【００３４】
本願明細書に記載のように、ヒトフレームワーク可変領域及びその変異型が本発明で使用可能である。しかしながら、選択されるフレームワークに関係なく、免疫原性の危険性を低下させることが目的である場合、選択されるヒトフレームワークに対する変化の数は最小化するのが望ましい。
【００３５】
重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークの残基は、同じ若しくは異なるヒト抗体配列に由来してもよい。ヒト抗体配列は、天然のヒト抗体の配列である場合もあり、又は幾つかのヒト抗体の共通配列である場合もある。本発明のヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系軽鎖フレームワークを含むか、又はそれに由来してもよい。同様に、本発明のヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系重鎖フレームワーク含むか、又はそれに由来してもよい。ＣＤＲｓのフレームワーク前後関係は抗原に対するそれらの結合に影響を与えるため、別のフレームワークとの間の変化は抗原に対する結合親和性の若干又は顕著な損失をもたらしうる。本発明の好ましい実施形態では、軽鎖フレームワークはヒト生殖細胞系ＶＫ配列Ａ２６に由来する。好ましい実施形態では、重鎖ヒト生殖細胞系フレームワークはＶＨ２−２６及びＶＨ４−５９から選択される。異なる生殖細胞系配列の説明に関しては、国際公開第２００５／００５６０４号を参照のこと。
【００３６】
好ましい本発明のヒト化抗体のヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域又はＩｇＧ４定常領域（両方とも公知）を含む。
【００３７】
本発明には、ＥＧＦＲと結合して受容体のリガンドとの結合及びその後の活性化を阻害する抗体又はその抗原結合部分が包含される。すなわち、本願明細書に記載のＣＤＲｓ、並びに重鎖及び軽鎖可変領域を用いることにより、ＥＧＦＲとの結合にＣＤＲｓが関与しているタンパク質の結合親和性が維持された、完全長抗体及び機能性フラグメントが得られる。
【００３８】
抗体の結合親和性は、Ｓａｐｉｄｙｎｅ ＫＩＮＥＸＡアッセイ（実施例７を参照）を使用して測定した。キメラ抗体Ｃ２２５は約３８０ｐＭ（ピコモル濃度）のＫｄを有する。本発明のヒト化抗体は、約０．０１〜約１０ｐＭ、約０．１〜約１０ｐＭ、約０．１〜約１ｐＭ、約０．２〜約１０ｐＭ、約０．２〜約１ｐＭ、約０．６〜約１０ｐＭ、及び約０．６〜約１ｐＭのＫｄ価を示す。好ましくは、本発明のヒト化抗体は１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．８、０．６、０．４、０．２、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２又は０．０１ｐＭ以下のＫｄ価を示す。
【００３９】
本発明の抗体又はその抗原結合部分がＥＧＦＲの活性化を阻害することも好ましい。幾つかのアッセイを利用し、本発明のＥＧＦＲ活性化を阻害する抗体の能力を試験することができる（実施例６から１０を参照）。
【００４０】
配列
表１及び２は、１つ以上の重鎖及び軽鎖のＣＤＲｓを含む本発明の抗体において使用されるＣＤＲｓのアミノ酸配列（標準的なアミノ酸の１文字表記）を示す。表中に、個々の抗体クローン（Ｆａｂフラグメント）の前後関係におけるＣＤＲｓを示す。表１及び２において、対応するＣ２２５ ＣＤＲｓに関して導入したアミノ酸置換の部位（すなわちＣＤＲｓ中の異なるアミノ酸の部位）を太字及び下線で示す。表１及び２は重鎖及び軽鎖のＣＤＲｓを示す。これらのＣＤＲｓを、以下の通りにヒト生殖細胞系フレームワーク配列と連結した：
軽鎖ＣＤＲｓを、ＶＬ Ａ２６に由来するフレームワーク配列と連結した。表１のＨｕ ２−２６から２．１１．１０のＣＤＲｓは、ＶＨ ２−２６に由来する重鎖フレームワーク配列を有し、その一方で、表１のＨｕ ４−４９から４．２３のＣＤＲｓは、ＶＨ ４−５９に由来する重鎖フレームワーク配列を有する。フレームワークの前後関係におけるＣＤＲｓを示す典型的なＨＣＶＲｓ及びＬＣＶＲｓを以下の表３に示す。
【００４１】
表１：ＣＤＲ配列−重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）
【表１】
【００４２】
表２：ＣＤＲ配列−軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）
【表２】
【００４３】
表１及び２に列記するＦａｂの各々は、ＥＧＦＲと結合することが、捕捉フィルターリフトアッセイ（実施例３）及び捕捉ＥＬＩＳＡ（実施例４）の結果から示されている。捕捉ＥＬＩＳＡは更に、これらの各々のＦａｂが、キメラ抗体Ｃ２２５の場合よりもＥＧＦＲに対する高い親和性を有することを示す。
【００４４】
本発明に係る、ＣＤＲを含んでなる構造は通常、抗体の重鎖若しくは軽鎖の配列又はその実質部分であり、当該ＣＤＲは、天然のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲに対応する位置に存在する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ ｏｆ ＨＨＳ，１９９１）。各鎖（軽鎖及び重鎖）の３つのＣＤＲ領域は、隣接配列として、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の式で表されるフレームワーク領域中に存在する。重鎖又は軽鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、上記の順のＣＤＲｓを有する隣接配列として配列されたときに、完全なフレームワークを形成する。本発明の抗体のフレームワークドメインは好ましくはヒト由来であるか、ヒト化されているか、又は実質的にヒト由来である。
【００４５】
異なるＦａｂ（そのＣＤＲｓを表１及び２に列記する）で表される本発明の抗体は、少なくとも１つのＣＤＲの配列変化、及び５つまでのＣＤＲｓの配列変化により各々異なる。クローン間におけるＣＤＲｓの相違は、所定の位置のＣＤＲｓが互いに置換されていることを示すものであるが、但し、得られる置換された抗体はおそらくＥＧＦＲと結合し、その活性化を阻害する能力を保持している。本発明の一実施形態では、当該抗体は、配列番号１−１０及び４３からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＨ１、及び／又は配列番号１１−２３及び４４からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＨ２、及び／又は配列番号２５−２９及び４５からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＨ３を含んでなるＨＣＶＲを含んでなる。別の実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は配列番号３０−３４及び４６からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＬ１、及び／又は配列番号３５の配列を含むＣＤＲＬ２、及び／又は配列番号３６−４２及び４７からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＬ３を含んでなるＬＣＶＲを含んでなる。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１−１０及び４３からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＨ１、及び／又は配列番号１１−２３及び４４からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＨ２、及び／又は配列番号２５−２９及び４５の配列を含むＣＤＲＨ３を含んでなり、並びに、更に配列番号３０−３４及び４６からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＬ１、及び／又は配列番号３５の配列を含むＣＤＲＬ２、及び／又は配列番号３６−４２及び４７からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＬ３を含んでなるＬＣＶＲを含んでなる。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は表１に列挙するＣＤＲｓの１つの組合せのうちのＣＤＲｓを含む重鎖可変領域、表２に列挙するＣＤＲｓの１つの組合せのうちのＣＤＲｓを含む軽鎖可変領域を有する。好ましくは、これらのＨＣＶＲｓ及びＬＣＶＲｓは、表１及び２においてＣＤＲｓに関して記載しているフレームワークを含む。より好ましくは、抗体は具体的に、表１に列挙するＣＤＲｓの組合せのうちの１つのＣＤＲｓを含むＨＣＶＲと、表２に列挙するＣＤＲｓの対応する組合せのＣＤＲｓを含むＬＣＶＲを有し、例えば、配列番号１を有するＨＣＤＲ１、配列番号１１を有するＨＣＤＲ２、配列番号２５を有するＨＣＤＲ３、配列番号３０を有するＬＣＤＲ１、配列番号３５を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３７を有するＬＣＤＲ３を含んでなる抗体が好ましい。好ましくは、これらのＨＣＶＲｓ及びＬＣＶＲｓは、表１及び２に列挙するＣＤＲｓの特定の組合せとして記載するようなフレームワークを含む。
【００４７】
他の好ましい実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、表３に列挙するヒト化Ｆａｂから選択される１つのＨＣＶＲと、表３に列記するヒト化Ｆａｂから選択される１つのＬＣＶＲを有する。好ましくは、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは同じヒト化Ｆａｂに由来する。
【００４８】
表３では、本発明の抗体の好ましいＨＣＶＲｓ及びＬＣＶＲｓを示す。ＣＤＲ領域を太字で示す。またこれらのＨＣＶＲｓ及びＬＣＶＲｓ中に、本発明の抗体の好ましいフレームワーク領域も示す。表３の抗体２．３８から２．１１．３は、フレームワーク配列ＦＲＨ１（配列番号５７）、ＦＲＨ２（配列番号５８）ＦＲＨ３（配列番号５９）、及びＦＲＨ４（配列番号６０）を有し、それらはＶＨ２−２６ヒト生殖細胞系フレームワークに由来するものである。同様に、これは表１の抗体Ｈｕ２−２６から２．１１．１０における好ましいフレームワークである。表３の抗体４．１４から４．２１は、フレームワークＦＲＨ１（配列番号６１）、ＦＲＨ２（配列番号６２）、ＦＲＨ３（配列番号６３）及びＦＲＨ４（配列番号６４）を有し、それらはＶＨ４−５９ヒト生殖細胞系フレームワークに由来するものである。同様に、これは表１の抗体Ｈｕ４−５９から４．２３における好ましいフレームワークである。表３の抗体の全ては、ＶＫＡ２６ヒト生殖細胞系フレームワークに由来するフレームワークＦＲＬ１（配列番号７４）、ＦＲＬ２（配列番号７５）、ＦＲＬ３（配列番号７６）及びＦＲＬ４（配列番号７７）を有し、それらは表２の抗体Ｈｕ−２−２６から４．２３における好ましいフレームワークである。
【００４９】
表３：ヒト化重鎖可変領域（ＶＨ２−２６及びＶＨ４−５９鋳型）
【表３】
【００５０】
本願明細書に開示される本発明では、ＥＧＦＲ活性化を阻害する能力が強化された抗体は、本願明細書に開示されるように、単一のポリペプチド構造中に１つ以上の新規なＣＤＲ配列を組み合わせることによって作製できる。この方法により、１つの抗体中に幾つかの新規なアミノ酸配列（同じ若しくは異なるＣＤＲｓに由来）を組み合わせ、望ましい抗ＥＧＦＲ活性レベルを有する抗体を作製することが可能となる。かかる望ましいレベルは、好ましくは１ｐＭ以下のＫｄ価を示す抗体を作製することにより得られる。非限定的な例としては、表１及び２に示すような新規なＣＤＲ配列を用いて抗体を作製し、更に実施例６から１０で後述するアッセイ方法でＥＧＦＲ活性化の阻害能に関してスクリーニングすることが挙げられる。
【００５１】
本発明の抗体をある特定の徴候に対して用いる場合、抗体の有用性の基となる有益な特性の有無に関して解析することができる。一実施形態では、本発明の抗体は、キメラ抗体Ｃ２２５などの公知の抗体より高いＥＧＦＲに対する親和性（すなわち低いＫｄ値、例えばＢｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎｅｘａアッセイで測定する）を示す。上記の通り、Ｋｄはｋｏｎとｋｏｆｆ定数の比率として算出される。例えば、３．１×１０７（Ｍ−１ｓ−１）のｋｏｎと０．９×１０−４（ｓ−１）のｋｏｆｆを用いて２．９ｘ１０−１２ＭのＫｄとして算出される。すなわち、親和性はｋｏｎを増加させるか又はｋｏｆｆを減少させることにより増加させることができる。
【００５２】
抗ＥＧＦＲ抗体の親和性の改良は、ＥＧＦＲ活性化を阻害する抗体の能力の強化につながると考えられる。実施例６から１０で説明するように、ＥＧＦＲ活性化を阻害する能力の強化の程度は、いずれかのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイで解析できる。これらのアッセイ方法としては、限定されないが細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、受容体結合アッセイ、受容体リン酸化アッセイ又は腫瘍モデルマウスの使用が挙げられる。好ましくは、本発明の抗体は、いずれかのアッセイで測定されるＥＧＦＲ活性化阻害能が向上している。好ましくは、本発明の抗体は１０ｐＭ以下、好ましくは１ｐＭ以下、より好ましくは約０．２ｐＭ以下のＫｄを示し、ＥＧＦＲの活性化阻害能が強化されている。
【００５３】
抗体の発現
本発明の別の態様は、本発明の抗体及びそのフラグメントをコードする組み換えＤＮＡに関する。本発明の抗体又はそのフラグメントをコードする組み換えＤＮＡの配列は、遺伝暗号を使用する当業者であれば容易に決定できる。決定された配列を有する核酸は、公知の技術を使用して多種多様な宿主システムのうちの適切なものを用いて調製し、発現させることができる。
【００５４】
好ましくは、当該ＤＮＡを発現させる場合、当該ＤＮＡは、配列番号１、１１、２４、３０、３５、３６の軽鎖及び重鎖ＣＤＲｓを１つから５つ、及び配列番号２−１０、１２−２３、２５−２９、３１−３４、３７−４２の軽鎖及び重鎖ＣＤＲｓを１つ以上で、合計６つのＣＤＲｓ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３で、ＣＤＲＬ２が配列番号３５である）を含む抗体をコードする。更に好ましくは、当該ＤＮＡを発現させる場合、当該ＤＮＡは、これらのＣＤＲｓと、表３に示される配列にて図示するような、本発明の好ましい軽鎖及び重鎖フレームワークとの組み合わせを含む抗体をコードする。
【００５５】
本発明の抗体をコードするＤＮＡは通常、抗体をコードする配列に制御可能な状態で結合した発現制御ポリヌクレオチド配列（天然の異種プロモータードメインを含む）を更に含んでなる。好ましくは、発現制御配列は真核生物由来の宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションできるベクター中に存在する真核生物プロモーターシステムであるが、原核宿主の制御配列を使用してもよい。当該ベクターを適当な宿主細胞系に導入した後、宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現に適する条件下で増殖させ、必要に応じて、軽鎖、重鎖、軽／重鎖二量体又は完全抗体、フラグメント又は他の免疫グロブリン形態の回収及び精製を行う。
【００５６】
最終的に所望の抗体を発現できる本発明の核酸配列は、様々な公知技術を用いて、様々な異なるポリヌクレオチド（ゲノム又はｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチドなど）及び構成要素（例えばＶ、Ｊ、Ｄ及びＣドメイン）から作製できる。適当なゲノムと合成配列とを結合させることが一般的な製造方法ではあるが、ｃＤＮＡ配列を利用することも可能である。
【００５７】
ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、様々なヒト細胞から公知の方法に従い単離できるが、好ましくは不死化Ｂ細胞から単離する。ポリヌクレオチド配列の適切な給源細胞、及び免疫グロブリンの発現及び分泌のための宿主細胞は、従来技術において公知の多くの供給源から得られる。
【００５８】
本願明細書に記載のように、本願明細書に具体的に記載されている抗体以外にも、当業者に公知の様々な組み換えＤＮＡ技術を利用して、実質的に類似又は、同一の配列を有する他の修飾抗体を容易に設計し、製造することができる。例えば、フレームワーク領域は、幾つかのアミノ酸置換、末端及び中間部への挿入及び欠失などによって、一次構造レベルで天然の配列に変異導入することができる。更に、様々なヒトフレームワーク領域を単独もしくは組み合わせで用い、本発明のヒト化免疫グロブリンのベースとしてもよい。通常遺伝子の修飾は、様々な公知の技術（例えば部位特異的突然変異導入）によって容易に実施できる。
【００５９】
あるいは、抗体の一部の一次構造のみを含んでなるポリペプチドフラグメント（当該フラグメントは１つ以上の免疫グロブリン活性（例えば補体結合活性）を有する）を作製してもよい。これらのポリペプチドフラグメントは、公知の方法によって完全抗体のタンパク質分解によって調製してもよく、又は、部位特異的突然変異導入を使用してベクターの所望の場所で停止コドンを挿入することによって（例えばＣＨ１の後にＦａｂフラグメントを置くか、又はヒンジ領域の後にＦ（ａｂ’）２を置く）調製してもよい。単鎖抗体は、ＤＮＡリンカーを介してＶＬ及びＶＨと結合させることによって調製できる。
【００６０】
上記のように、ポリヌクレオチドは、当該配列が発現制御配列と制御可能な状態で連結される（すなわち確実に機能するように配置する）ことにより、宿主中で発現する。これらの発現ベクターは通常、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。発現ベクターは通常、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を容易にするために、選択マーカー（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン及びジヒドロ葉酸還元酵素）を有する。
【００６１】
大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドのクローニングに特に有用な原核宿主細胞である。また、他の使用できる微生物宿主としては、細菌（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び他の腸細菌（例えばサルモネラ属、セラチア属及び様々なシュードモナス種）が挙げられる。これらの原核宿主において発現ベクターを作製してもよく、それらは通常宿主細胞との適合性を有する発現制御配列（例えば複製開始点）を有する。更に、多くの公知のプロモーター、例えばラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、βラクタマーゼプロモーターシステム又はλファージプロモーターシステムを存在させてもよい。当該プロモーターは通常、任意のオペレーター配列と共に発現を制御し、またリボソーム結合部位配列などを有することにより転写及び翻訳を開始し完了させる。
【００６２】
他の微生物（例えば酵母）を発現に用いてもよい。例えばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを宿主とし、発現制御配列（３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素などのプロモーター）、複製開始点、終結配列などを必要に応じて有するベクターを用いてもよい。
【００６３】
哺乳類の培養細胞を用いて、本発明のポリペプチドを発現させ、調製してもよい。真核生物細胞が好ましいのは、完全な免疫グロブリンを分泌できる多くの適切な宿主細胞系が従来技術において開発されているからであり、そのような細胞としては、ＣＨＯ細胞系、様々なＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞、ヒト胚腎臓細胞系又はハイブリドーマが挙げられる。好ましい細胞系は、ＣＨＯ及び骨髄腫細胞系（例えばＳＰ２／０及びＮＳ０）である。
【００６４】
これらの細胞用の発現ベクターは、発現制御配列（例えば複製開始点、プロモーター、エンハンサー）及び必要なスプライシング部位（例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネータ配列）を含んでもよい。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。好ましいポリアデニル化部位としては、ＳＶ４０及びウシ成長ホルモンに由来する配列が挙げられる。
【００６５】
目的のポリヌクレオチド配列（例えば重鎖及び軽鎖をコードする配列、及び発現制御配列）を含んでなるベクターを用い、細胞宿主のタイプに適宜応じて、公知の方法によって宿主細胞を形質転換できる。例えば、塩化カルシウムによるトランスフェクションは原核細胞で通常利用されるが、その他の細胞宿主の場合はリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションを使用できる。
【００６６】
発現させた後、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換、親和性（例えばプロテインＡ）、逆相もしくは疎水性相互作用カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動などの標準的方法に従って抗体を精製することができる。少なくとも約９０〜９５％の純度の、実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、特に製薬用途の場合は９８〜９９％以上の純度が最も好ましい。必要に応じて部分的又は純粋に精製した後、本願明細書に記載のように、ポリペプチドを治療的又は予防的用途に使用できる。
【００６７】
抗体の治療への使用
本発明はまた、患者にＥＧＦＲと結合する有効量の抗体を投与することを含む、ＥＧＦＲにより媒介される癌に罹患するヒトの治療方法の提供に関する。本発明の抗体はＥＧＦＲに結合し、その活性化を阻害する。ＥＧＦＲにより媒介される癌としては、非小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸癌、頭部癌及び頚部癌、並びに前立腺ガンなど、様々なものが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６８】
本発明の抗体又はその抗原結合部は、本発明の抗体を薬理学的に許容できる希釈剤又は賦形剤の中に懸濁させた状態で含んでなる組成物の形態としてもよい。これらの医薬組成物は、自己免疫疾患（好ましくは多発性硬化症）の治療用の公知のいかなる手段によって投与してもよい。好ましい投与経路は非経口投与であり、本願明細書では静脈内、筋肉内、腹膜内、内部胸骨、皮下、及び関節内注射及び注入などの投与様式として定義する。投与量は、受容者の年齢、健康状態及び体重、並行して行っている治療の種類（もしあらば）、治療頻度、及び所望の効果の性質などに依存して変化する。
【００６９】
本発明に係る組成物には、癌の治療において所望の医学効果を提供するのに効果的な量の抗体又はその抗原結合部分を含有する全ての組成物が包含される。
【００７０】
投与用の医薬組成物は、選択された投与様式にとり適切な態様でされ、必要に応じて、例えば薬学的に許容できる賦形剤（バッファ、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤など）を使用してもよい。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、イーストン、ＰＡ、最新版）は当業者に一般に公知であり、製剤技術に関する解説が記載されている。
【００７１】
製剤中の抗ＥＧＦＲ抗体の濃度は最低約０．１％〜最高１５又は２０重量％であってもよく、溶液の体積、粘度、安定性に基づいて主に選択され、特に投与様式の選択によって適宜調節することができる。抗ＥＧＦＲ抗体の好ましい濃度は通常、１〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲である。好ましくは、１０〜約５０ｍｇ／ｍＬである。
【００７２】
製剤は、調製後にフィルター濾過して無菌状態にするか、又は微生物学的に許容できる態様にしてもよい。ｍ−クレゾールもしくはフェノール、又はその混合物などの防腐剤を添加し、微生物の増殖及び汚染を防止してもよい。
【００７３】
静脈内点滴用の典型的な組成物は、２５０ｍＬの液体（例えば無菌のリンガー溶液）で、１ｍＬあたり１〜１００ｍｇもしくはそれ以上の抗体濃度を有してもよい。本発明の治療薬は、凍結させるか又は凍結乾燥して保存することができ、また使用前に適切な無菌の担体中で再構成させることができる。凍結乾燥及び還元により、多少の抗体活性の損失（例えば従来の免疫グロブリンの場合、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体より大きな活性損失を有する傾向がある）が生じる場合もある。ゆえにそれらを補償するように投与量を調節する必要がある場合もある。
【００７４】
上記方法が例えばヒト化抗体などのタンパク質の投与にとり最も簡便及び最適であると考えられるが、適切に剤形を設計して調製することにより、経真皮投与及び経口投与などの他の投与方法により使用することもできると考えられる。更に、生分解可能フィルム及びマトリックス、又は浸透圧ミニポンプ、又はデキストランビーズ、アルギン酸又はコラーゲンを主成分とした輸送システムなどを使用して徐放性製剤を調製することも望ましい。
【００７５】
典型的な投与量レベルは、投与様式及び患者の症状を考慮しながら、標準的な臨床技術を使用して最適化することができる。投与量は通常、１０μｇ／ｋｇ／月〜１０ｍｇ／ｋｇ／月の範囲である。
【００７６】
別の態様は、癌の治療用薬剤としての、本発明の抗体又はその抗原結合部分の使用に関する。
【００７７】
更に他の態様では、容器、パッケージ、パッケージ材、ディスペンサなどの製品が包含される。
【００７８】
本発明を以下の実施例で例示するが、いかなる形であれ本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７９】
＜実施例１＞可溶性ＥＧＦＲ（ｓＥＧＦＲ）のクローニング及び発現
ヒトＥＧＦＲは、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域を含んでなる単一のポリペプチド鎖からなる。例えば結合アッセイで可溶性の抗原を使用する際、細胞外領域を以下の通りにクローニングし、発現させた。
【００８０】
ヒトＥＧＦＲの配列に基づいてプライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲによって前駆体タンパク質のＮ末端側の６４３のアミノ酸の単離に用いた。上流の「センス」プライマー（プライマー３０５３）によりクローニング用のＫｐｎＩ部位を添加し、コンセンサスコザック配列に適合するようにコザック配列及びシグナル配列の第１アミノ酸を改変し、真核生物における発現を向上させた。開始コドンを、下で示される各々の配列中に下線で示す。
プライマー３０５３：ＴＡＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＧＧＧ ＡＣＧ［配列番号７８］
天然配列：ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＧＧＧ ＡＣＧ［配列番号７９］。
下流の「アンチセンス」プライマー（プライマー３０５４）は、１６１９（成熟型タンパク質のアミノ酸付番に基づく）においてタンパク質合成を終結させ、
（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒリンカー［Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ、配列番号８０］
及び
（Ｈｉｓ）６タグ［配列番号８１］
を付与する。ＸｂａＩ部位を導入してクローニング用に用いた。
プライマー３０５４：ＡＴＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＡＣ ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＡＴ ＣＴＴ ＡＧＧ ＣＣＣ ＡＴＴ ＣＧＴ ＴＧＧ ＡＣＡ［配列番号８２］。融合するリンカー及び（Ｈｉｓ）６タグ［配列番号６］を有する成熟型ｓＥＧＦＲのアミノ酸配列を図２に示す。
【００８１】
Ｆａｓｔ−Ｔｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、ヒトＡ４３１上皮癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５５）からｍＲＮＡを単離した。プライマー３０５３及び３０５４を用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ １ステップＲＴ−ＰＣＲ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）により遺伝子の細胞外部分を増幅し、ベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。タグを付与した遺伝子部分をＤＮＡ塩基配列決定により確認し、ｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）発現ベクターのＸｂａＩ／ＫｐｎＩフラグメントとして挿入した。
【００８２】
プラスミドＤＮＡを線形にし、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にエレクトロポレーションした。ジェネテシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に対する耐性に基づきクローンを選抜した。約１００のコロニーに関して、ｍ２２５（Ａｂ−２）抗体（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ社）を用いたウエスタンブロッティングによる、可溶性ＥＧＦＲ（ｓＥＧＦＲ）の発現の検出を行った。適切な発現を示すクローンを増殖させ、限界希釈によりサブクローニングし、無血清媒体（ＣＨＯ ＳＦＩＩ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に順化させた。
【００８３】
可溶性の抗原を、フラスコ培養の最終時点の上澄みを濃度し、Ｎｉ−ＮＴＡセファロース（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）に結合させて半精製した。具体的には、最終時点の細胞上澄みを、遠心分離で細胞をペレット化して回収し、その上澄みを濾過していかなる細胞残渣も除去し、その後の精製処理において０〜４℃に維持した。Ａｍｉｃｏｎコンセントレータを使用して、３０，０００ＭＷＣＯ膜で、合計約１００ｍｌとなるまで上澄みを濃縮した濃縮物を一晩バッファＡ（：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのイミダゾール）で透析した。必要に応じてバッファを一度交換してもよい。透析の後、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを約８００μｌのバッファＡで２〜３回洗浄し、更に５０ｍｌのコニカルチューブで透析後の上澄みに添加し、低温室で２時間回転させた。５０ｍｌのコニカルチューブ内でビーズをスピンダウンし、上澄みを若干量チューブに残し、大部分の上澄みを他の容器に移した。この上澄みをボルテックスしてはビーズを再懸濁し、ビーズを適切な市販のカラム上へロードした。液体をスルーさせ、残りの上澄みをカラムに添加される。上澄みをカラム２〜３回再利用した。カラムを約１０ｍｌのバッファＡで洗浄した。カラムから、約３〜４ｍｌのバッファＡ（２００ｍＭのイミダゾールを含有）で溶出し、２５０μｌのフラクションを回収した。ブランクとして溶出バッファを使用して、フラクションのＯＤ２８０をプレートリーダーで測定した。最も濃縮されているフラクションをプールし、一晩ＰＢＳで透析した。プールした透析後のフラクションに１／１０量のグリセロールを添加して−７０℃で凍結させてもよく、又は透析後のフラクションをビオチン化してもよい（下記参照）。
【００８４】
ｓＥＧＦＲを５００ｍＭのイミダゾールで溶出し、上記の通りＰＢＳで透析した。ｓＥＧＦＲを含んでなる混合タンパク質フラクションを、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ２１３３５）を使用してビオチン化し、余分な試薬を除去するためにＰＢＳで透析した。ビオチン化ｓＥＧＦＲ（Ｂ−ｓＥＧＦＲ）のアリコートを、−８０℃で１０％グリセロールストックとして保存した。
【００８５】
＜実施例２＞バクテリアで発現させたＦａｂの単離
本発明に係るＦａｂは、以下の通り細菌ペリプラズムから単離できる。ＯＤ６００ｎｍで約０．９〜１．２に達するまで、２×ＹＴ培地中で、３７℃で２５０回転／分で振とうしてＸＬ−０細胞を増殖させた。次いでＩＰＴＧを１ｍＭ（１Ｍストックから）の最終濃度に添加した。分析クローンごとに、１５ｍｌの細胞液を無菌のコニカルチューブ内で培養した。高い力価のファージストック１０μｌを用いて細胞を感染させ、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を２５℃の条件に移し、振とうしながら一晩増殖させた。卓上臨床用遠心分離機で２５分間、〜２０００×ｇで細胞を沈殿させた。次に細胞をエッペンドルフチューブへ移し、１ｍｌの３０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液中にピペッティングにより再懸濁した。微量遠心分離機を用い、８０００回転／分で３分間サンプルを沈殿させた。上澄みを吸引除去した。ペレットを５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのショ糖中に再懸濁し、更にボルテックスし、３０分間の氷上に配置した。微量遠心分離機を用い、４℃、９０００回転数／分で１０分間処理し、細胞破片を沈殿させた。上澄みを単離し、４℃で保存した。
【００８６】
＜実施例３＞フィルタリフトによるＦａｂの同定
ビオチン化ｓＥＧＦＲと結合する、ファージにより発現されたＦａｂを、Ｆａｂフィルター又は捕捉リフトによって多様なＦａｂを含有する集団から検出した。ｃｔファージはＦａｂを発現し、それは例えば、ファージにより発現された多様なＦａｂの集団の中でもＢ−ｓＥＧＦＲと結合した。簡潔には、フィルターを捕捉試薬（ヤギ抗ヒトκ鎖抗体）でコーティングし、そのコーティングされたフィルターを、Ｆａｂを発現するファージによるファージプラークを有するプレートに配置した。フィルターをプラークと共にインキュベートし、更にフィルターをビオチン化ｓＥＧＦＲでインキュベートし、結合したビオチン化ｓＥＧＦＲを、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＡＰの結合、及び検出可能なアルカリホスファターゼ基質とのインキュベートにより検出した。
【００８７】
具体的には、ニトロセルロース（ＢＡ８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｌ）フィルターを、室温で２時間、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトκ抗体（２０６０−０１、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）５ｍＬに浸漬することによってコーティングした。フィルターを１５分間水に浸漬した。フィルターを３回ＰＢＳで洗浄した。フィルターを１時間、ＰＢＳ（１％ＢＳＡ含有）でブロッキングした。フィルターを３回ＰＢＳで洗浄した。フィルターを１０分間空気乾燥した。フィルターを慎重にファージプレート上に配置し、２２℃で一晩インキュベートした。フィルターを慎重に剥離し、短時間ＰＢＳで洗浄した。３％の粉ミルク、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中にビオチン化抗原を１／１０００希釈した溶液を調製し、室温で１時間フィルターをインキュベートした。フィルターをＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有）で３回真空洗浄した。ＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有）中にＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＡＰを１／１０００希釈した溶液を調製し、室温で３０分間フィルターをインキュベートした。フィルターをＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有）で３回真空洗浄した。１０ｍｌのＡＰ基質（ニトロブルーテトラゾリウム、５−ブロモ−４−クロロ−インドリルリンホスフェート、Ｐｉｅｒｃｅ社製、ロックフォード、ＩＬ）中でフィルターを発色させた。プラークを、青色の強度に基づいて選抜した。
【００８８】
＜実施例４＞Ｆａｂ結合ｓＥＧＦＲの捕捉ＥＬＩＳＡアッセイ
捕捉ＥＬＩＳＡを用いて以下の通りにアッセイし、ｓＥＧＦＲと結合するＦａｂを検出した。Ｃｏｓｔａｒ社製のＵ字底プレートを、１０μｇ／ｍＬでヤギ抗ヒトκ抗体（２０６０−０１ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ＡＬ）を含む炭酸塩バッファ（０．０１５Ｍ炭酸ナトリウム、０．０３５Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５））で、５０μＬ／ウェルで４℃で一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄した。ウェルをＲＴで１時間、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の１％ＢＳＡ溶液で、５０μＬ／ウェルでブロッキングした。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。ペリプラズムから調製したＦａｂ（実施例２を参照、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５μｇ／ｍＬに希釈）を１：５の希釈系列により、５０μＬ／ウェルで添加した（２サンプル調製）。プレートをＲＴで２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。５０μＬ／ウェルでビオチン化ｓＥＧＦＲ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１／１０００希釈）を添加、プレートをＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。５０μＬ／ウェルのＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼ（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ ＡＰ、Ｐｉｅｒｃｅ社製，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１／１０００希釈）をＲＴで添加し、３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。１５０μＬ／ウェルでｐＮＰＰ基質（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、発色するまで３７℃でインキュベートした。プレートをＯＤ４０５で測定した。
【００８９】
ＦａｂのｓＥＧＦＲへの結合を捕捉アッセイで解析した結果を図１に示す。
【００９０】
＜実施例５＞Ａ４３１癌細胞可溶化物に対するＦａｂ結合アッセイ
ＥＧＦＲに対するＦａｂ結合を、以下の通りＡ４３１癌細胞可溶化物を用いてアッセイすることもできる。Ａ−４３１細胞可溶化物を、“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｃｔｉｖｅ ＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｙａｒｄｅｎら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，３１５−３１９”に記載のとおり調製した。すなわち、コンフルエントなＡ−４３１細胞の単分子層を、ＰＢＳで２回、更にＨＮＥＧ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０％のグリセロール）で１回洗浄した。細胞をＨＮＥＧの２０ｍＬ中に掻き取り、１０分間６００×ｇで遠心分離した。１０７個の細胞を１ｍＬの可溶化バッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１，５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５μｇ／ｍＬのロイペプチン、１％のアプロチニン）中に懸濁し、更にガラスガラスホモジナイザでホモジナイズした。３０分間４０，０００×ｇで遠心分離し、不溶性物質を除去した。透明な上澄みを回収し、−８０℃で凍結させた。
【００９１】
Ｃｏｓｔａｒ社製のＵ字底プレートを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１％トリトンＸ−１００溶液で１／２０希釈した細胞可溶化物で５０μＬ／ウェルでコーティングし、フード中で一晩乾燥させた。プレートを、ＰＢＳ（０．５％のＢＳＡ含有）で、１００μＬ／ウェルで添加してブロッキングし、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ）で３回洗浄した。５０μｌ／ウェルでＦａｂを添加し、ＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ）を用いて１〜５μｇ／ｍｌで１／５希釈系列を作製し、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。ヤギ抗ヒトκ−ＡＰ（２０６０−０１，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１／２０００希釈液を、１００μＬ／ウェルで添加した。プレートをＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。１５０μＬ／ウェルでｐＮＰＰ基質（Ｎ−９３８９，Ｓｉｇｍａ社製，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）［Ｓｏｕｒｃｅ／Ｃａｔ．＃］（１タブレット／３ｍＬの水）を添加し、３７℃で最高１時間インキュベートした。プレートをＯＤ４０５で測定した。
【００９２】
＜実施例６＞抗ＥＧＦＲ抗体による細胞増殖の抑制
Ａ４３１表皮癌細胞による細胞増殖アッセイを行い、抗ＥＧＦＲ Ｆａｂの相対的な力価を測定した。先行技術文献に従いアッセイを行い（Ｓａｔｏら、“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”，（１９８３），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１，５１１−５２９）、それにより抗ＥＧＦ受容体抗体に応答したＡ４３１細胞の細胞増殖の低下が示された。細胞増殖アッセイは、以下の通りである。Ａ４３１細胞を、ＤＭＥＭ（１０％のＦＢＳ含有）において培養した。第１日目に細胞を、２０分間ＰＢＳ中に置き、表面コーティングの５分前にトリプシン処理した。ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ３８４を使用して、Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ ＴＣ処理した細胞培養プレート上に、ウェル当たり１５，０００の細胞の細胞密度で細胞を３８４ウェルフォーマットでプレーティングした。最終的な溶媒体積を５０μｌとした。細胞培養プレートをａｉｒｐｏｒｅテープ（Ｑｉａｇｅｎ社製、バレンシア、ＣＡ）で被覆した。朝までかけて細胞を付着させた。第２日目に細胞培養培地を除去し、フェノールレッドフリーなＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ無し）［「コントロールウェル」］、又は２．５μｇ／ｍｌの予想濃度でＦａｂペリプラズム調製物（実施例２を参照）を含むＤＭＥＭ培地［「処理ウェル」］（２サンプル調製）を各５０μｌ用いて培地交換した。２つのコントロールウェルを、各処理セルに隣接させて調製し、合計１９２のコントロールウェルとした。第３日目に、培地を除去し、ＭＴＳ細胞増殖試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マディソン、ＷＩ、１ｍｌ／１０ｍｌ培地）を含有するフェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地で培地交換した。１５及び３０分後における４９０ｎｍの吸光度を記録した。処理ウェルにおける全ての２サンプルの平均値を、全てのコントロールウェルの平均値で除算した。
【００９３】
Ｆａｂを用いたアッセイの代表的な結果を図２に示す。同様に、完全長抗体によるアッセイの代表的な結果を図３に示す。Ｆａｂ又は抗体の非存在下で細胞をインキュベートした場合（＝１００％）のシグナルに対する、得られたシグナルのパーセンテージを図２及び３各々に示す。但しシグナル強度のパーセンテージが、完全に実際の細胞数と必ずしも相関するわけではない点に留意する必要がある。
【００９４】
＜実施例７＞結合親和性
本発明の完全長のモノクローナル抗体の結合親和性の測定を、Ｓａｐｉｄｙｎｅ ＫＩＮＥＸＡアッセイを使用して行った。ＮＨＳで活性化した高流速セファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を、抗原（ビーズ１ｍｌ当たり５０μｇの抗ＥＧＦＲ抗体）でプレコートし、１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ含有）でブロッキングした。次に本発明の抗体２ｐＭ、４ｐＭ、４０ｐＭを、バッファ（ＰＢＳ、０．００５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０及び１ｍｇ／ｍｌのオバルブミン）中で、様々な濃度のｓＥＧＦＲ（例えば２．４ｐＭ〜１０ｎＭ、連続希釈）と、室温で１０時間インキュベートした。平衡時に存在するフリーの抗体を測定するため、各サンプルを、ｓＥＧＦＲコーティングしたビーズ中を通過させた。次にランニングバッファ中のバッファ蛍光（Ｃｙ５）標識したヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（１：４０００希釈溶液）をビーズ中に通し、ビーズに結合した抗体の量を測定した。測定された蛍光シグナルは平衡時のフリーの抗体濃度と比例していた。ｓＥＧＦＲの各濃度測定を２度実施した。多数曲線、１部位均一結合モデル（ＫＩＮＥＸＡソフトウェア）を使用して、競争曲線の非線形回帰から平衡解離定数（ＫＤ）を得た。
【００９５】
ｓＥＧＦＲ結合のための結合速度定数（ｋｏｎ）も、Ｓａｐｉｄｙｎｅ ＫＩＮＥＸＡアッセイを使用して得た。上記と同じ条件を使用して、２ｐＭ抗体と２０ｐＭのｓＥＧＦＲを混合した。幾つかの時点で、上記の条件を用いて、平衡結合時のフリーの抗体濃度を解析し、更に得られた時間との相関関係を、ＫＩＮＥＸＡソフトウェアを結合速度（ｋｏｎ）を用いて解析した。計算式ｋｏｆｆ＝Ｋｄ×ｋｏｎを使用して、解離速度定数（ｋｏｆｆ）を算出した。完全長のモノクローナル抗体の親和性を上記のアッセイにより測定し、得られた結果を以下の表４に示す。
【００９６】
表４：抗体親和性（ＫｉｎＥｘＡ３０００ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製）による測定）
【表４】
【００９７】
＜実施例８＞ＥＧＦＲのリン酸化
【００９８】
ＥＧＦＲのリン酸化を阻害する本発明の抗体の能力を、以下の通りにアッセイした。Ａ４３１細胞を６ウェルプレートの〜７０％コンフルエンスまで増殖させ、ＤＭＥＭ培地（０．５％ＦＢＳ）を用いた血清飢餓の状態で一晩培養した。次に細胞を、１００ｎＭ ＥＧＦ（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）の存在下で希釈した抗体と１時間インキュベートした。細胞を冷却ＰＢＳ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％のＩＧＥＰＧＡＬ ＣＡ−６３０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのバナジウム酸ナトリウム（ＮａＶＯ４）、１ｍＭのＮａＦ、１／２タブレットのプロテアーゼカクテル（／１０ｍＬ））で洗浄し、０．５ｍＬの溶解緩衝液を用いて溶解させた。１０，０００回転数／分で３０分間超遠心分離を行い、不溶性物質を除去した。細胞可溶化物をタンパク質濃度に合わせて調製し、各抽出液を等量用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。リン酸化されたＥＧＦＲをウエスタンブロットに供し、抗リン酸化ＥＧＦＲ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）で発色させて解析した。
【００９９】
モノクローナル抗体Ｃ２２５、ＶＨ４．１５及びＶＨ４．２１の存在下におけるＥＧＦＲのリン酸化の結果を図４に示す。図５に示すように、リン酸化の抑制は、モノクローナル抗体Ｃ２２４及びＶＨ４．１５の結果との比較による、細胞ベースのアッセイにおける細胞の抗体力価と相関していた。
【０１００】
＜実施例９＞抗ＥＧＦＲ抗体によるアポトーシスの誘導
ＥＧＦＲ活性化を阻害する抗ＥＧＦＲ抗体の能力を、以下の通りＡ４３１細胞のアポトーシス誘導によりアッセイした。２４ウェルプレート中に２００００細胞／ウェルでＡ４３１細胞を添加し、１．０μｇ／ｍＬの抗体を用いて０、３、７、２４又は４８時間インキュベートした。アポトーシスは、ＤＮＡフラグメント用のＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）で測定した。非特異抗体によるベースのアポトーシスを平均値から減算した。
【０１０１】
完全長モノクローナル抗体Ｃ２２５、ＡＢＸ−ＥＧＦ及びＶＨ４．１５を用いた抗ＥＧＦＲによるＡ４３１細胞のアポトーシス誘導の結果を図６に示す。
【０１０２】
＜実施例１０＞抗ＥＧＦＲ抗体によるモデルマウスのＡ４３１腫瘍の治療
抗ＥＧＦＲ抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおけるＥＧＦＲの活性化を阻害する能力を、Ａ４３１腫瘍細胞株を保持するモデルマウスに対する複数種の抗体の投与によりアッセイした。この腫瘍モデルマウスアッセイを、以下の通り実施した。第０日目に、培養したＡ４３１細胞を調製し、細胞数を計測し、５×１０７細胞濃度で再懸濁させた。７週齢のオスのＣＢ１７−ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ社製）の左の横腹（ＥＣ）に、１０７細胞（すなわち２００μｌ）で皮下注射した。腫瘍が〜３００ｍｍ３（通常約２１日後）となった後、動物に対して毎週二回（火曜／金曜）腹膜内に約２５０〜３００μｌの０．５ｍｇ抗体／マウスで注射し、一方コントロール動物群では２５０μｌの生理食塩水を投与した。合計５回の抗体注入を実施した。腫瘍体積を、抗体の最初の投与から３週間の間、週３回測定した。
【０１０３】
モデルマウスにおけるＡ４３１腫瘍の抗ＥＧＦＲ抗体による処理の結果を図７に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】Ｆａｂ２．６９、４．１５、４．２１、キメラ抗体Ｃ２２５及びヒト抗体ＡＧＸ−ＥＧＦを用いて捕捉ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】Ｆａｂ４．１４、４．１５、４．２１、４．４及びキメラ抗体Ｃ２２５を用いたＡ４３１細胞の増殖アッセイの結果を示す。
【図３】完全長抗体４．１５、げっ歯類抗体２２５及びキメラ抗体Ｃ２２５を用いたＡ４３１細胞の増殖阻害を示す。
【図４】抗体４．１５、４．２１又はキメラ抗体Ｃ２２５とプレインキュベートしたＡ４３１細胞において検出された、リン酸化ＥＧＦＲ（ｐ−Ｔｙｒ ＥＧＦＲ）の量を示す。
【図５】抗体４．１５及びキメラ抗体Ｃ２２５によるＡ４３１細胞増殖の抑制が、ＥＧＦＲリン酸化の阻害と相関することを示す。
【図６】完全長抗体４．１５、キメラ抗体Ｃ２２５及びヒト抗体ＡＢＸ−ＥＧＦを用いた、抗体によるＡ４３１細胞のアポトーシス誘導アッセイの結果を示す。
【図７】完全長抗体２．６９、４．１５、４．２１及びキメラ抗体Ｃ２２５を用いた、モデルマウスにおけるＡ４３１腫瘍の抑制を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学の分野に関し、具体的には上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）と反応するモノクローナル抗体の分野に関する。より詳細には、本発明は高い親和性を有するヒト化抗ＥＧＦＲ抗体、並びに様々な癌の治療、予防又は診断への当該抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、上皮、間充織及び神経組織において広く発現し、成長及び分化の際に不可欠な役割を果たす、細胞表面受容体のチロシンキナーゼファミリーに属するメンバーである。ＥＧＦＲ（別名ＨＥＲ１又はｃ−ｅｒｂＢ−１）は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通領域、及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインからなる１７０ｋＤａの膜貫通型の糖タンパク質である（非特許文献１）。ＥＧＦＲと結合し活性化させる哺乳類のリガンドとしては、ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、ヘパリン−結合性ＥＧＦ様成長因子、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピレグリン及びエピゲンが挙げられる（非特許文献２）。成長因子ＥＧＦ又はトランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）の上皮細胞増殖因子受容体に対する結合により、レセプタ二量体化、自己リン酸化及びチロシンキナーゼカスケードが誘導され、その結果、ＤＮＡ合成及び細胞分裂に至る。
【０００３】
ＥＧＦＲは多くの上皮腫瘍において異常に活性化し、例えば非小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸癌、頭部癌及び頸部癌、並びに前立腺ガンのそれらが挙げられる（非特許文献３）。ＥＧＦＲの異常な活性化はレセプタの過剰発現、遺伝子増幅、突然変異の誘発、受容体リガンドの過剰発現及び／又はＥＧＦＲ活性の調節不全をもたらしうる（非特許文献４）。異常に高いＥＧＦＲの活性化により幾つかの細胞内基質のリン酸化がなされ、それにより減数分裂シグナリング、及びその他の腫瘍誘発性の活性が生じる。すなわちＥＧＦＲは、受容体の異常な発現を潜在的に阻害若しくは減少させることができる抗癌治療ストラテジーにおける標的であるといえる。
【０００４】
ＥＧＦＲを標的とする抗癌剤には、モノクローナル抗体が包含される。キメラモノクローナル抗体Ｃ２２５（又はセツキシマブ）（ｍＡｂ２２５のネズミ可変領域及びヒトＩｇＧ１定常領域を含んでなる）は、現在米国及びヨーロッパのイリノテカン抵抗性大腸癌の治療に使用されている（非特許文献５）。更に、ＥＧＦＲに対するヒト抗体及びヒト化モノクローナル抗体に関して研究がなされている。完全にヒト抗体ＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ）は、Ｃ２２５のよりもＥＧＦＲに対する親和性が約８倍高い（非特許文献６）。ＥＧＦＲに対するヒト化抗体ＥＭＤ７２０００（マツズマブ）の親和性はＣ２２５のそれと類似しており（非特許文献７）、ＥＧＦＲに対するヒト化抗体ｈ−Ｒ３の親和性はＣ２２５のそれ未満である（非特許文献８）。１００ｍｇ／ｍ２以上のセツキシマブの投与による診療において、合併症が観察されている。例えば、紅潮、脂漏性皮膚炎及びざ瘡様発疹をもたらす皮膚毒性などである（非特許文献９）。
【非特許文献１】Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ａ−４３１ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０９，４１８−２５（１９８６）
【非特許文献２】Ｓｉｎｇｈ，Ａ．及びＨａｒｒｉｓ，Ｒ．，２００５，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ １７：１１８３−１１９３
【非特許文献３】Ａｄａｍｓ，Ｇ．及びＷｅｉｎｅｒ，Ｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１１４７−１１５７
【非特許文献４】Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．及びＡｒｔｅａｇａ，Ｃ．，２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：２４４５−２４５９
【非特許文献５】Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．及びＡｒｔｅａｇａ，Ｃ．，２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：２４４５−２４５９
【非特許文献６】Ｙａｎｇ，Ｘ−Ｄら、２００１，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍａｔ．，３８：１７−２３
【非特許文献７】Ｖａｎｈｏｅｆｅｒ，Ｕ．ら、２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２２：１７５−１８４
【非特許文献８】Ｃｒｏｍｂｅｔ，Ｔ．ら、２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２２：１６４６−１６５４
【非特許文献９】Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．及びＬａｎｇｅｒ，Ｃ．，２００２，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９：２７−３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＥＧＦＲと高い親和性で結合し、上皮腫瘍のＥＧＦＲの異常な活性化を阻害する抗ＥＧＦＲ抗体に対する治療的ニーズが存在する。高親和性の抗ＥＧＦＲ抗体により、低用量での投与が可能となり、副作用（例えば皮膚毒性）の危険性が減少する。更に、抗体の複数回投与により誘導されうる、抗体に対するいかなる免疫反応も減少させることができる抗ＥＧＦＲ抗体の提供に対するニーズが存在する。本発明はこれらのニーズを満たし、それに関連する多くの効果を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の抗体は、ＥＧＦＲの活性化を阻害する、ＥＧＦＲ特異的なヒト化モノクローナル抗体及びその抗原結合部分に関する。一実施形態では、本発明の抗体は、ＥＧＦＲと高い親和性で結合することを特徴とし、当該抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体は、約０．０１ｐＭ〜約１０ｐＭのＥＧＦＲとの結合親和性（Ｋｄ）を有する。好ましい実施形態では、本発明の抗体は１０ｐＭ以下のＫｄ（ＥＧＦＲに対する）を有し、好ましくは９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｐＭ以下のＫｄを有し、より好ましくは０．８、０．６、０．４、０．２、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２又は０．０１ｐＭ以下のＫｄを有する。
【０００７】
一実施形態では、ＥＧＦＲ特異的なモノクローナル抗体は、配列番号４３に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号４５に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号４６に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号３５に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２及び配列番号４７に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含んでなる。好ましくは当該抗体は、ＥＧＦＲの活性化を阻害することを更なる特徴とする。好ましくは当該抗体は、ＥＧＦＲとの１０ｐＭ以下の結合親和性（Ｋｄ）を有すること、好ましくは９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｐＭ以下のＫｄを有すること、より好ましくは０．８、０．６、０．４、０．２、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２又は０．０１ｐＭ以下のＫｄを有することを更なる特徴とする。好ましくは当該抗体は、ＥＧＦＲの活性化を阻害し、ＥＧＦＲとの１０ｐＭ以下の結合親和性を有すること、好ましくは９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｐＭ以下のＫｄを有すること、より好ましくは０．８、０．６、０．４、０．２、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２又は０．０１ｐＭ以下のＫｄを有することを更なる特徴とする。
【０００８】
本発明の一実施形態では、本発明のＥＧＦＲ特異的なモノクローナル抗体は、配列番号４９の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び配列番号６６の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含んでなる。他の実施形態では、ＥＧＦＲ特異的なモノクローナル抗体は、配列番号５１のＨＣＶＲ及び配列番号６８のＬＣＶＲ、配列番号５５のＨＣＶＲ及び配列番号７２のＬＣＶＲ、又は、配列番号５６のＨＣＶＲ及び配列番号７３のＬＣＶＲを含んでなる。
【０００９】
本発明の他の実施形態は、前記実施形態のうちのいずれかのモノクローナル抗体に関し、当該抗体は完全長抗体、実質的な完全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又は単鎖Ｆｖフラグメントである。好ましくは、当該抗体又はその抗原結合部分は、前記実施形態のうちのいずれかのヒト化抗体である。
【００１０】
本発明には、本願明細書に記載されている抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸分子、前記核酸分子を含むベクター（好ましくは発現ベクター）が包含される。本発明にはまた、本願明細書に記載されている抗体を発現するこれらのポリヌクレオチドを含んでなるベクターでトランスフェクションした宿主細胞が包含される。
【００１１】
本発明には、本願明細書に記載されている抗体を有効量で患者に投与することを含んでなる、ＥＧＦＲにより媒介される癌の治療方法が包含される。
【００１２】
最後に本発明には、患者におけるＥＧＦＲにより媒介される癌の治療用薬剤の製造への、本願明細書に記載されている抗体の使用が包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
定義
本発明では、「外皮成長因子受容体」又は「ＥＧＦＲ」とは、成熟した、チロシンキナーゼ細胞表面受容体のことを指す。「可溶性ＥＧＦＲ」又は「ｓＥＧＦＲ」という用語は、ＥＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインを含んでなるＥＧＦＲの一部のことを指す。より詳細には、ｓＥＧＦＲは成熟型ＥＧＦＲの１〜６１９番目のアミノ酸を含む（Ｕｌｌｒｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ａ−４３１ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３０９，４１８−２５（１９８６））。
【００１４】
「ＥＧＦＲにより媒介される癌」という用語は、通常の対応する上皮組織より高いレベルでＥＧＦＲが異常に活性化している上皮腫瘍により特徴づけられる癌のことを指す。これらの高いＥＧＦＲ活性レベルにより、多くのタイプの癌において腫瘍成長が促進される。かかる癌としては、限定されないが、非小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸癌、東部及び頚部癌、並びに前立腺癌が挙げられる。ＥＧＦＲの異常な活性化は、受容体の過剰発現、遺伝子増幅、突然変異の増加、受容体リガンドの過剰発現及び／又はＥＧＦＲ活性の調節因子の損失に起因すると考えられる。
【００１５】
本明細書で用いられる用語「抗体」とは、ジスルフィド結合で相互に結合した、４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖）を含んでなる免疫グロブリン分子のことを指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨとして本願明細書に略記される）及び重鎖定常領域を含んでなる。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含んでなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ又はＶＬとして本願明細書に略記される）及び軽鎖定常領域を含んでなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）を含んでなる。ＶＨ及びＶＬ領域は更に、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される）と、点在する保存されたドメイン（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される）に分類される。３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列されている。各ドメインに対するアミノ酸の割当ては、公知の慣例によって行われる（例えばＫａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、又はＣｈｏｔｈｉａ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８，１９９７）に記載）。ＶＨのＣＤＲは、本明細書においてＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と称する。ＶＬのＣＤＲは、本明細書においてＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と称する。
【００１６】
軽鎖はκ及びλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ又はεに分類され、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥと定義される。軽鎖及び重鎖中では、可変領域及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域により結合し、重鎖については、約３つ以上のアミノ酸からなる「ｄ」領域を含む。
【００１７】
上記によれば、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。しかしながらかかる抗体は、それらが単一の細胞種のクローンに由来するという点でのみ、単クローン性といえる。しかしながらこのことは、それらを特定の起源に限定するものではない。かかる抗体は、通常抗体を生産しない細胞（例えばＣＨＯ、ＮＳ０又はＣＯＳ細胞）において容易に産生させることができる。更にかかる抗体は、他のタイプの細胞（特に哺乳類の及び植物細胞でさえも）においても産生させることができ、その場合には、かかる細胞に遺伝子的な操作を施して軽鎖及び重鎖ポリペプチドを発現させ、それらを集合させて抗体分子を形成させる。更に、かかる鎖は化学的に合成してもよい。なお、それらは所定の抗原決定要素に対して特異的であるため、「単クローン」の用語の主旨に適う抗体を構成することには変わりない。すなわち、本願明細書の用語「モノクローナル抗体」は、前記抗体の生産に使用する機構を単に指すというよりは、むしろ抗体分子の特性及び純度を意味するものと解すべきである。
【００１８】
本発明で使用する、抗体の「抗原結合部分」という用語は、可変領域の範囲内における、目的の抗原との結合に必要となる抗体分子の部分を意味する。抗原結合部分は、抗原と相互作用し、抗体に対して抗原との特異性及び親和性を付与するためのアミノ酸残基を含んでなる。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体中のフラグメントにより付与される。抗体の「抗原結合部分」の用語中に包含される結合フラグメントの例としては、
（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント）、
（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合している２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント）、
（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント（ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる）、
（ｉｖ）Ｆｖフラグメント（抗体の１つのアームとしての、ＶＬ及びＶＨドメインからなる）、
（ｖ）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６、ＶＨドメインからなる）。
更に、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬ及びＶＨ）は、別々の遺伝子としてコードされているが、組換え方法を用いて、それらを合成リンカーを用いて結合させ、単一のタンパク質鎖として合成することも可能である。その場合、ＶＬ及びＶＨ領域が対を形成して一価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知、例えばＢｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６：及びＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照）。かかる単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」の用語に包含される。単鎖抗体の他の形態としては、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）などが挙げられる。ｄｉａｂｏｄｙとは、二価の、二重特異的な抗体のことを指し、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖として発現されるが、過度に短いリンカーを用いることにより、同じ鎖上において２つのドメイン間の対合が生じず、ゆえにそのドメインが他の鎖の補完的なドメインとの対合形成を余儀なくされ、２つの抗原結合部位が形成されることを特徴とする（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ら、（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３を参照）。
【００１９】
「ヒト化抗体」の用語は、ヒト抗体生殖細胞系又は再構成された配列に由来して、ヒト以外の生物由来の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）とかかる配列を連結することによって作製されるアミノ酸配列の部分又は全部から構成される抗体を意味する。可変領域のフレームワーク領域は、完全なヒトフレームワーク領域、又は実質的なヒトフレームワーク領域で置換される。ヒトの治療用途に用いるヒト化抗体において、当該フレームワーク配列は好ましくは完全に、又は実質的にヒト由来（すなわち少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％がヒト由来）である。ヒト化抗体のＣＤＲｓは、ヒト以外の抗体のＣＤＲｓを基にして、所望の特性（例えば特異性、親和性及び力価）を得るために最適化してもよい。元のヒト以外のＣＤＲｓと比較して、最適化されたＣＤＲｓは、アミノ酸置換、付加及び／又は欠失を有してもよい。本願明細書に記載のように、ヒト化抗体に包含される抗体としては、完全長抗体に限られず、その抗原結合部（例えばフラグメント及び単鎖の形）も挙げられる。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「ヒト抗体」には、ヒトの抗体並びに、組換え手法を用いて調製、発現、作製又は単離されるそれらが包含される。組換え手法によって得られるヒト抗体としては、宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターから発現される抗体、組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子を用いたトランスジェニック動物（例えばマウス）から単離される抗体（例えばＴａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ら、（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５を参照）、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含んでなる、他のあらゆる手段によって調製さる、発現され、作製され、又は単離される抗体が挙げられる。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異導入して、ＶＨのアミノ酸配列及び組換え抗体のＶＬドメインを、ヒト生殖細胞系のＶＨ及びＶＬ配列に由来しつつも、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるヒト抗体の生殖細胞系レパートリー中には存在し得ない配列としてもよい。
【００２１】
本発明の抗体に関する「生物学的特性」又は「生物学的活性」の用語は本願明細書では交換可能に用いられ、例えばエピトープ／抗原親和性及び特異性、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでＥＧＦＲの活性を中和若しくはアンタゴナイズする能力、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ安定性及び抗体の免疫原特異性などが挙げられるが、これらに限定されない。他の定義可能な抗体の生物学的特性としては、例えば、特異性、交差反応性（すなわち標的ペプチドのヒト以外の相同物、又は通常他のタンパク質又は組織との交差反応性）、及び哺乳動物細胞におけるタンパク質の高い発現レベルを維持する能力が挙げられる。上記の特性又は特徴は、当業者に公知の技術を使用して観察、測定又は評価することができる。ＥＬＩＳＡ、競争的ＥＬＩＳＡ、表面プラスモン共鳴分析、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ中和アッセイ、受容体結合アッセイ、及びヒト又はヒト以外の様々な給源からの組織切片を用いた免疫組織化学を必要に応じて用いてもよい。
【００２２】
本発明の抗体の活性に関して本明細書で用いられる「阻害する」の用語は、生物学的活性若しくは特異性、疾患若しくは症状の進行又は重症度を、実質的にアンタゴナイズする、抑止する、防止する、遅延させる、抑制する、崩壊させる、除去する、停止させる、減少させる又は逆転させる能力のことを指すが、これらに限定されない。当該阻害又は中和の程度は、好ましくは少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上である。
【００２３】
本明細書で用いられる抗体に関する「ＥＧＦＲ活性化を阻害する能力」とは、そのＥＧＦＲに対する結合が、ヒトＥＧＦＲの活性化の抑制、及びその受容体の活性化に応じて生じるヒトＥＧＦＲの生物学的活性の抑制につながる、抗体の能力のことを指すものとする。ＥＧＦＲ生物学的活性の１つ以上の指標の測定（細胞増殖アッセイを使用して測定される）、アポトーシスアッセイ、受容体結合アッセイ、受容体リン酸化アッセイ、又はマウス腫瘍モデル（実施例６から１０を参照）を行うことにより、抗体がＥＧＦＲ活性化を阻害する能力を評価できる。
【００２４】
本明細書で用いられる「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体のことを指す（例えば、ＥＧＦＲと結合する単離された抗体は、他の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＥＧＦＲと特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原（例えば他の種由来のＥＧＦＲ分子）との交差反応性を有することもありえる。更に、単離された抗体は、他の細胞内物質及び／又は化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「ｋｏｎ」は、正反応若しくは複合体形成反応に関する、結合若しくはｏｎ速度定数、又は特異的反応速度のことを指し、Ｍ−１秒−１の単位として表される。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「ｋｏｆｆ」は、抗原／抗体複合体からの抗体解離反応に関する、解離若しくはｏｆｆ速度定数、又は特異的反応速度のことを指し、秒−１の単位として表される。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「Ｋｄ」とは、ある特定の抗体−抗原相互作用の解離定数のことを指す。以下の式により算出される：
ｋｏｆｆ／ｋｏｎ＝Ｋｄ。
【００２８】
本発明の抗体は高親和性抗体であり、通常低いｋｏｆｆ値を示す。本願明細書における用語「高い親和性」とは、約１×１０−１１Ｍ〜約１×１０−１４Ｍの親和性又はＫｄのことを指すか、あるいは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．８、０．６、０．４、０．２、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２又は０．０１ｐＭ以下の親和性又はＫｄのことを指す。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「核酸分子」には、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子が包含される。当該核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖のＤＮＡである。
【００３０】
本明細書で用いられる用語「単離された核酸分子」とは、ヒトＥＧＦＲと結合する抗体又は抗体部分（例えばＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関して用いる場合は、当該抗体若しくは抗体部をコードするヌクレオチド配列がヒトＥＧＦＲ以外の抗原と結合する抗体若しくは抗体部をコードする他のヌクレオチド配列を含まず、当該他の配列が、ヒトゲノムＤＮＡの核酸中で側方に天然に存在しうる、核酸分子のことを指す。すなわち、例えば抗ヒトＥＧＦＲ抗体のＶＨ領域をコードする本発明の単離された核酸は、ヒトＥＧＦＲ以外の抗原と結合する他のＶＨ領域をコードする他のいかなる配列も含まない。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「ベクター」とは、連結された他の核酸を輸送できる核酸分子のことを指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、それは付加的なＤＮＡ部分をライゲーションさせることができる、環状の二重鎖ＤＮＡループのことを指す。他のタイプのベクターはウィルスベクターであり、付加的なＤＮＡ部分をウィルスゲノムにライゲーションさせることができる。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）とは、組換え発現ベクターが導入された細胞のことを指す。
【００３３】
抗体の特性
ヒト化抗体の利点として最初に挙げられることは、患者への反復投与によっても免疫反応が最小限であることである。ヒト化抗体においてヒト配列がより多く使用されるほど、免疫原性の危険性は低くなる。更に、注入されたヒト化抗体は通常、ヒト由来でないか部分的にヒト由来でない抗体を注入した場合より循環系における半減期が長い。
【００３４】
本願明細書に記載のように、ヒトフレームワーク可変領域及びその変異型が本発明で使用可能である。しかしながら、選択されるフレームワークに関係なく、免疫原性の危険性を低下させることが目的である場合、選択されるヒトフレームワークに対する変化の数は最小化するのが望ましい。
【００３５】
重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークの残基は、同じ若しくは異なるヒト抗体配列に由来してもよい。ヒト抗体配列は、天然のヒト抗体の配列である場合もあり、又は幾つかのヒト抗体の共通配列である場合もある。本発明のヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系軽鎖フレームワークを含むか、又はそれに由来してもよい。同様に、本発明のヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系重鎖フレームワーク含むか、又はそれに由来してもよい。ＣＤＲｓのフレームワーク前後関係は抗原に対するそれらの結合に影響を与えるため、別のフレームワークとの間の変化は抗原に対する結合親和性の若干又は顕著な損失をもたらしうる。本発明の好ましい実施形態では、軽鎖フレームワークはヒト生殖細胞系ＶＫ配列Ａ２６に由来する。好ましい実施形態では、重鎖ヒト生殖細胞系フレームワークはＶＨ２−２６及びＶＨ４−５９から選択される。異なる生殖細胞系配列の説明に関しては、国際公開第２００５／００５６０４号を参照のこと。
【００３６】
好ましい本発明のヒト化抗体のヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域又はＩｇＧ４定常領域（両方とも公知）を含む。
【００３７】
本発明には、ＥＧＦＲと結合して受容体のリガンドとの結合及びその後の活性化を阻害する抗体又はその抗原結合部分が包含される。すなわち、本願明細書に記載のＣＤＲｓ、並びに重鎖及び軽鎖可変領域を用いることにより、ＥＧＦＲとの結合にＣＤＲｓが関与しているタンパク質の結合親和性が維持された、完全長抗体及び機能性フラグメントが得られる。
【００３８】
抗体の結合親和性は、Ｓａｐｉｄｙｎｅ ＫＩＮＥＸＡアッセイ（実施例７を参照）を使用して測定した。キメラ抗体Ｃ２２５は約３８０ｐＭ（ピコモル濃度）のＫｄを有する。本発明のヒト化抗体は、約０．０１〜約１０ｐＭ、約０．１〜約１０ｐＭ、約０．１〜約１ｐＭ、約０．２〜約１０ｐＭ、約０．２〜約１ｐＭ、約０．６〜約１０ｐＭ、及び約０．６〜約１ｐＭのＫｄ価を示す。好ましくは、本発明のヒト化抗体は１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．８、０．６、０．４、０．２、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２又は０．０１ｐＭ以下のＫｄ価を示す。
【００３９】
本発明の抗体又はその抗原結合部分がＥＧＦＲの活性化を阻害することも好ましい。幾つかのアッセイを利用し、本発明のＥＧＦＲ活性化を阻害する抗体の能力を試験することができる（実施例６から１０を参照）。
【００４０】
配列
表１及び２は、１つ以上の重鎖及び軽鎖のＣＤＲｓを含む本発明の抗体において使用されるＣＤＲｓのアミノ酸配列（標準的なアミノ酸の１文字表記）を示す。表中に、個々の抗体クローン（Ｆａｂフラグメント）の前後関係におけるＣＤＲｓを示す。表１及び２において、対応するＣ２２５ ＣＤＲｓに関して導入したアミノ酸置換の部位（すなわちＣＤＲｓ中の異なるアミノ酸の部位）を太字及び下線で示す。表１及び２は重鎖及び軽鎖のＣＤＲｓを示す。これらのＣＤＲｓを、以下の通りにヒト生殖細胞系フレームワーク配列と連結した：
軽鎖ＣＤＲｓを、ＶＬ Ａ２６に由来するフレームワーク配列と連結した。表１のＨｕ ２−２６から２．１１．１０のＣＤＲｓは、ＶＨ ２−２６に由来する重鎖フレームワーク配列を有し、その一方で、表１のＨｕ ４−４９から４．２３のＣＤＲｓは、ＶＨ ４−５９に由来する重鎖フレームワーク配列を有する。フレームワークの前後関係におけるＣＤＲｓを示す典型的なＨＣＶＲｓ及びＬＣＶＲｓを以下の表３に示す。
【００４１】
表１：ＣＤＲ配列−重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）
【表１】
【００４２】
表２：ＣＤＲ配列−軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）
【表２】
【００４３】
表１及び２に列記するＦａｂの各々は、ＥＧＦＲと結合することが、捕捉フィルターリフトアッセイ（実施例３）及び捕捉ＥＬＩＳＡ（実施例４）の結果から示されている。捕捉ＥＬＩＳＡは更に、これらの各々のＦａｂが、キメラ抗体Ｃ２２５の場合よりもＥＧＦＲに対する高い親和性を有することを示す。
【００４４】
本発明に係る、ＣＤＲを含んでなる構造は通常、抗体の重鎖若しくは軽鎖の配列又はその実質部分であり、当該ＣＤＲは、天然のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲに対応する位置に存在する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ ｏｆ ＨＨＳ，１９９１）。各鎖（軽鎖及び重鎖）の３つのＣＤＲ領域は、隣接配列として、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の式で表されるフレームワーク領域中に存在する。重鎖又は軽鎖のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、上記の順のＣＤＲｓを有する隣接配列として配列されたときに、完全なフレームワークを形成する。本発明の抗体のフレームワークドメインは好ましくはヒト由来であるか、ヒト化されているか、又は実質的にヒト由来である。
【００４５】
異なるＦａｂ（そのＣＤＲｓを表１及び２に列記する）で表される本発明の抗体は、少なくとも１つのＣＤＲの配列変化、及び５つまでのＣＤＲｓの配列変化により各々異なる。クローン間におけるＣＤＲｓの相違は、所定の位置のＣＤＲｓが互いに置換されていることを示すものであるが、但し、得られる置換された抗体はおそらくＥＧＦＲと結合し、その活性化を阻害する能力を保持している。本発明の一実施形態では、当該抗体は、配列番号１−１０及び４３からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＨ１、及び／又は配列番号１１−２３及び４４からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＨ２、及び／又は配列番号２５−２９及び４５からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＨ３を含んでなるＨＣＶＲを含んでなる。別の実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は配列番号３０−３４及び４６からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＬ１、及び／又は配列番号３５の配列を含むＣＤＲＬ２、及び／又は配列番号３６−４２及び４７からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＬ３を含んでなるＬＣＶＲを含んでなる。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１−１０及び４３からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＨ１、及び／又は配列番号１１−２３及び４４からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＨ２、及び／又は配列番号２５−２９及び４５の配列を含むＣＤＲＨ３を含んでなり、並びに、更に配列番号３０−３４及び４６からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＬ１、及び／又は配列番号３５の配列を含むＣＤＲＬ２、及び／又は配列番号３６−４２及び４７からなる群から選択される配列を含むＣＤＲＬ３を含んでなるＬＣＶＲを含んでなる。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は表１に列挙するＣＤＲｓの１つの組合せのうちのＣＤＲｓを含む重鎖可変領域、表２に列挙するＣＤＲｓの１つの組合せのうちのＣＤＲｓを含む軽鎖可変領域を有する。好ましくは、これらのＨＣＶＲｓ及びＬＣＶＲｓは、表１及び２においてＣＤＲｓに関して記載しているフレームワークを含む。より好ましくは、抗体は具体的に、表１に列挙するＣＤＲｓの組合せのうちの１つのＣＤＲｓを含むＨＣＶＲと、表２に列挙するＣＤＲｓの対応する組合せのＣＤＲｓを含むＬＣＶＲを有し、例えば、配列番号１を有するＨＣＤＲ１、配列番号１１を有するＨＣＤＲ２、配列番号２５を有するＨＣＤＲ３、配列番号３０を有するＬＣＤＲ１、配列番号３５を有するＬＣＤＲ２及び配列番号３７を有するＬＣＤＲ３を含んでなる抗体が好ましい。好ましくは、これらのＨＣＶＲｓ及びＬＣＶＲｓは、表１及び２に列挙するＣＤＲｓの特定の組合せとして記載するようなフレームワークを含む。
【００４７】
他の好ましい実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体は、表３に列挙するヒト化Ｆａｂから選択される１つのＨＣＶＲと、表３に列記するヒト化Ｆａｂから選択される１つのＬＣＶＲを有する。好ましくは、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは同じヒト化Ｆａｂに由来する。
【００４８】
表３では、本発明の抗体の好ましいＨＣＶＲｓ及びＬＣＶＲｓを示す。ＣＤＲ領域を太字で示す。またこれらのＨＣＶＲｓ及びＬＣＶＲｓ中に、本発明の抗体の好ましいフレームワーク領域も示す。表３の抗体２．３８から２．１１．３は、フレームワーク配列ＦＲＨ１（配列番号５７）、ＦＲＨ２（配列番号５８）ＦＲＨ３（配列番号５９）、及びＦＲＨ４（配列番号６０）を有し、それらはＶＨ２−２６ヒト生殖細胞系フレームワークに由来するものである。同様に、これは表１の抗体Ｈｕ２−２６から２．１１．１０における好ましいフレームワークである。表３の抗体４．１４から４．２１は、フレームワークＦＲＨ１（配列番号６１）、ＦＲＨ２（配列番号６２）、ＦＲＨ３（配列番号６３）及びＦＲＨ４（配列番号６４）を有し、それらはＶＨ４−５９ヒト生殖細胞系フレームワークに由来するものである。同様に、これは表１の抗体Ｈｕ４−５９から４．２３における好ましいフレームワークである。表３の抗体の全ては、ＶＫＡ２６ヒト生殖細胞系フレームワークに由来するフレームワークＦＲＬ１（配列番号７４）、ＦＲＬ２（配列番号７５）、ＦＲＬ３（配列番号７６）及びＦＲＬ４（配列番号７７）を有し、それらは表２の抗体Ｈｕ−２−２６から４．２３における好ましいフレームワークである。
【００４９】
表３：ヒト化重鎖可変領域（ＶＨ２−２６及びＶＨ４−５９鋳型）
【表３】
【００５０】
本願明細書に開示される本発明では、ＥＧＦＲ活性化を阻害する能力が強化された抗体は、本願明細書に開示されるように、単一のポリペプチド構造中に１つ以上の新規なＣＤＲ配列を組み合わせることによって作製できる。この方法により、１つの抗体中に幾つかの新規なアミノ酸配列（同じ若しくは異なるＣＤＲｓに由来）を組み合わせ、望ましい抗ＥＧＦＲ活性レベルを有する抗体を作製することが可能となる。かかる望ましいレベルは、好ましくは１ｐＭ以下のＫｄ価を示す抗体を作製することにより得られる。非限定的な例としては、表１及び２に示すような新規なＣＤＲ配列を用いて抗体を作製し、更に実施例６から１０で後述するアッセイ方法でＥＧＦＲ活性化の阻害能に関してスクリーニングすることが挙げられる。
【００５１】
本発明の抗体をある特定の徴候に対して用いる場合、抗体の有用性の基となる有益な特性の有無に関して解析することができる。一実施形態では、本発明の抗体は、キメラ抗体Ｃ２２５などの公知の抗体より高いＥＧＦＲに対する親和性（すなわち低いＫｄ値、例えばＢｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎｅｘａアッセイで測定する）を示す。上記の通り、Ｋｄはｋｏｎとｋｏｆｆ定数の比率として算出される。例えば、３．１×１０７（Ｍ−１ｓ−１）のｋｏｎと０．９×１０−４（ｓ−１）のｋｏｆｆを用いて２．９ｘ１０−１２ＭのＫｄとして算出される。すなわち、親和性はｋｏｎを増加させるか又はｋｏｆｆを減少させることにより増加させることができる。
【００５２】
抗ＥＧＦＲ抗体の親和性の改良は、ＥＧＦＲ活性化を阻害する抗体の能力の強化につながると考えられる。実施例６から１０で説明するように、ＥＧＦＲ活性化を阻害する能力の強化の程度は、いずれかのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイで解析できる。これらのアッセイ方法としては、限定されないが細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、受容体結合アッセイ、受容体リン酸化アッセイ又は腫瘍モデルマウスの使用が挙げられる。好ましくは、本発明の抗体は、いずれかのアッセイで測定されるＥＧＦＲ活性化阻害能が向上している。好ましくは、本発明の抗体は１０ｐＭ以下、好ましくは１ｐＭ以下、より好ましくは約０．２ｐＭ以下のＫｄを示し、ＥＧＦＲの活性化阻害能が強化されている。
【００５３】
抗体の発現
本発明の別の態様は、本発明の抗体及びそのフラグメントをコードする組み換えＤＮＡに関する。本発明の抗体又はそのフラグメントをコードする組み換えＤＮＡの配列は、遺伝暗号を使用する当業者であれば容易に決定できる。決定された配列を有する核酸は、公知の技術を使用して多種多様な宿主システムのうちの適切なものを用いて調製し、発現させることができる。
【００５４】
好ましくは、当該ＤＮＡを発現させる場合、当該ＤＮＡは、配列番号１、１１、２４、３０、３５、３６の軽鎖及び重鎖ＣＤＲｓを１つから５つ、及び配列番号２−１０、１２−２３、２５−２９、３１−３４、３７−４２の軽鎖及び重鎖ＣＤＲｓを１つ以上で、合計６つのＣＤＲｓ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３で、ＣＤＲＬ２が配列番号３５である）を含む抗体をコードする。更に好ましくは、当該ＤＮＡを発現させる場合、当該ＤＮＡは、これらのＣＤＲｓと、表３に示される配列にて図示するような、本発明の好ましい軽鎖及び重鎖フレームワークとの組み合わせを含む抗体をコードする。
【００５５】
本発明の抗体をコードするＤＮＡは通常、抗体をコードする配列に制御可能な状態で結合した発現制御ポリヌクレオチド配列（天然の異種プロモータードメインを含む）を更に含んでなる。好ましくは、発現制御配列は真核生物由来の宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションできるベクター中に存在する真核生物プロモーターシステムであるが、原核宿主の制御配列を使用してもよい。当該ベクターを適当な宿主細胞系に導入した後、宿主細胞を、ヌクレオチド配列の発現に適する条件下で増殖させ、必要に応じて、軽鎖、重鎖、軽／重鎖二量体又は完全抗体、フラグメント又は他の免疫グロブリン形態の回収及び精製を行う。
【００５６】
最終的に所望の抗体を発現できる本発明の核酸配列は、様々な公知技術を用いて、様々な異なるポリヌクレオチド（ゲノム又はｃＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチドなど）及び構成要素（例えばＶ、Ｊ、Ｄ及びＣドメイン）から作製できる。適当なゲノムと合成配列とを結合させることが一般的な製造方法ではあるが、ｃＤＮＡ配列を利用することも可能である。
【００５７】
ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、様々なヒト細胞から公知の方法に従い単離できるが、好ましくは不死化Ｂ細胞から単離する。ポリヌクレオチド配列の適切な給源細胞、及び免疫グロブリンの発現及び分泌のための宿主細胞は、従来技術において公知の多くの供給源から得られる。
【００５８】
本願明細書に記載のように、本願明細書に具体的に記載されている抗体以外にも、当業者に公知の様々な組み換えＤＮＡ技術を利用して、実質的に類似又は、同一の配列を有する他の修飾抗体を容易に設計し、製造することができる。例えば、フレームワーク領域は、幾つかのアミノ酸置換、末端及び中間部への挿入及び欠失などによって、一次構造レベルで天然の配列に変異導入することができる。更に、様々なヒトフレームワーク領域を単独もしくは組み合わせで用い、本発明のヒト化免疫グロブリンのベースとしてもよい。通常遺伝子の修飾は、様々な公知の技術（例えば部位特異的突然変異導入）によって容易に実施できる。
【００５９】
あるいは、抗体の一部の一次構造のみを含んでなるポリペプチドフラグメント（当該フラグメントは１つ以上の免疫グロブリン活性（例えば補体結合活性）を有する）を作製してもよい。これらのポリペプチドフラグメントは、公知の方法によって完全抗体のタンパク質分解によって調製してもよく、又は、部位特異的突然変異導入を使用してベクターの所望の場所で停止コドンを挿入することによって（例えばＣＨ１の後にＦａｂフラグメントを置くか、又はヒンジ領域の後にＦ（ａｂ’）２を置く）調製してもよい。単鎖抗体は、ＤＮＡリンカーを介してＶＬ及びＶＨと結合させることによって調製できる。
【００６０】
上記のように、ポリヌクレオチドは、当該配列が発現制御配列と制御可能な状態で連結される（すなわち確実に機能するように配置する）ことにより、宿主中で発現する。これらの発現ベクターは通常、エピソームとして、又は宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。発現ベクターは通常、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を容易にするために、選択マーカー（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン及びジヒドロ葉酸還元酵素）を有する。
【００６１】
大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドのクローニングに特に有用な原核宿主細胞である。また、他の使用できる微生物宿主としては、細菌（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び他の腸細菌（例えばサルモネラ属、セラチア属及び様々なシュードモナス種）が挙げられる。これらの原核宿主において発現ベクターを作製してもよく、それらは通常宿主細胞との適合性を有する発現制御配列（例えば複製開始点）を有する。更に、多くの公知のプロモーター、例えばラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、βラクタマーゼプロモーターシステム又はλファージプロモーターシステムを存在させてもよい。当該プロモーターは通常、任意のオペレーター配列と共に発現を制御し、またリボソーム結合部位配列などを有することにより転写及び翻訳を開始し完了させる。
【００６２】
他の微生物（例えば酵母）を発現に用いてもよい。例えばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを宿主とし、発現制御配列（３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の解糖酵素などのプロモーター）、複製開始点、終結配列などを必要に応じて有するベクターを用いてもよい。
【００６３】
哺乳類の培養細胞を用いて、本発明のポリペプチドを発現させ、調製してもよい。真核生物細胞が好ましいのは、完全な免疫グロブリンを分泌できる多くの適切な宿主細胞系が従来技術において開発されているからであり、そのような細胞としては、ＣＨＯ細胞系、様々なＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞、ヒト胚腎臓細胞系又はハイブリドーマが挙げられる。好ましい細胞系は、ＣＨＯ及び骨髄腫細胞系（例えばＳＰ２／０及びＮＳ０）である。
【００６４】
これらの細胞用の発現ベクターは、発現制御配列（例えば複製開始点、プロモーター、エンハンサー）及び必要なスプライシング部位（例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネータ配列）を含んでもよい。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。好ましいポリアデニル化部位としては、ＳＶ４０及びウシ成長ホルモンに由来する配列が挙げられる。
【００６５】
目的のポリヌクレオチド配列（例えば重鎖及び軽鎖をコードする配列、及び発現制御配列）を含んでなるベクターを用い、細胞宿主のタイプに適宜応じて、公知の方法によって宿主細胞を形質転換できる。例えば、塩化カルシウムによるトランスフェクションは原核細胞で通常利用されるが、その他の細胞宿主の場合はリン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションを使用できる。
【００６６】
発現させた後、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換、親和性（例えばプロテインＡ）、逆相もしくは疎水性相互作用カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動などの標準的方法に従って抗体を精製することができる。少なくとも約９０〜９５％の純度の、実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、特に製薬用途の場合は９８〜９９％以上の純度が最も好ましい。必要に応じて部分的又は純粋に精製した後、本願明細書に記載のように、ポリペプチドを治療的又は予防的用途に使用できる。
【００６７】
抗体の治療への使用
本発明はまた、患者にＥＧＦＲと結合する有効量の抗体を投与することを含む、ＥＧＦＲにより媒介される癌に罹患するヒトの治療方法の提供に関する。本発明の抗体はＥＧＦＲに結合し、その活性化を阻害する。ＥＧＦＲにより媒介される癌としては、非小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸癌、頭部癌及び頚部癌、並びに前立腺ガンなど、様々なものが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６８】
本発明の抗体又はその抗原結合部は、本発明の抗体を薬理学的に許容できる希釈剤又は賦形剤の中に懸濁させた状態で含んでなる組成物の形態としてもよい。これらの医薬組成物は、自己免疫疾患（好ましくは多発性硬化症）の治療用の公知のいかなる手段によって投与してもよい。好ましい投与経路は非経口投与であり、本願明細書では静脈内、筋肉内、腹膜内、内部胸骨、皮下、及び関節内注射及び注入などの投与様式として定義する。投与量は、受容者の年齢、健康状態及び体重、並行して行っている治療の種類（もしあらば）、治療頻度、及び所望の効果の性質などに依存して変化する。
【００６９】
本発明に係る組成物には、癌の治療において所望の医学効果を提供するのに効果的な量の抗体又はその抗原結合部分を含有する全ての組成物が包含される。
【００７０】
投与用の医薬組成物は、選択された投与様式にとり適切な態様でされ、必要に応じて、例えば薬学的に許容できる賦形剤（バッファ、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤など）を使用してもよい。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、イーストン、ＰＡ、最新版）は当業者に一般に公知であり、製剤技術に関する解説が記載されている。
【００７１】
製剤中の抗ＥＧＦＲ抗体の濃度は最低約０．１％〜最高１５又は２０重量％であってもよく、溶液の体積、粘度、安定性に基づいて主に選択され、特に投与様式の選択によって適宜調節することができる。抗ＥＧＦＲ抗体の好ましい濃度は通常、１〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲である。好ましくは、１０〜約５０ｍｇ／ｍＬである。
【００７２】
製剤は、調製後にフィルター濾過して無菌状態にするか、又は微生物学的に許容できる態様にしてもよい。ｍ−クレゾールもしくはフェノール、又はその混合物などの防腐剤を添加し、微生物の増殖及び汚染を防止してもよい。
【００７３】
静脈内点滴用の典型的な組成物は、２５０ｍＬの液体（例えば無菌のリンガー溶液）で、１ｍＬあたり１〜１００ｍｇもしくはそれ以上の抗体濃度を有してもよい。本発明の治療薬は、凍結させるか又は凍結乾燥して保存することができ、また使用前に適切な無菌の担体中で再構成させることができる。凍結乾燥及び還元により、多少の抗体活性の損失（例えば従来の免疫グロブリンの場合、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体より大きな活性損失を有する傾向がある）が生じる場合もある。ゆえにそれらを補償するように投与量を調節する必要がある場合もある。
【００７４】
上記方法が例えばヒト化抗体などのタンパク質の投与にとり最も簡便及び最適であると考えられるが、適切に剤形を設計して調製することにより、経真皮投与及び経口投与などの他の投与方法により使用することもできると考えられる。更に、生分解可能フィルム及びマトリックス、又は浸透圧ミニポンプ、又はデキストランビーズ、アルギン酸又はコラーゲンを主成分とした輸送システムなどを使用して徐放性製剤を調製することも望ましい。
【００７５】
典型的な投与量レベルは、投与様式及び患者の症状を考慮しながら、標準的な臨床技術を使用して最適化することができる。投与量は通常、１０μｇ／ｋｇ／月〜１０ｍｇ／ｋｇ／月の範囲である。
【００７６】
別の態様は、癌の治療用薬剤としての、本発明の抗体又はその抗原結合部分の使用に関する。
【００７７】
更に他の態様では、容器、パッケージ、パッケージ材、ディスペンサなどの製品が包含される。
【００７８】
本発明を以下の実施例で例示するが、いかなる形であれ本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７９】
＜実施例１＞可溶性ＥＧＦＲ（ｓＥＧＦＲ）のクローニング及び発現
ヒトＥＧＦＲは、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞内領域を含んでなる単一のポリペプチド鎖からなる。例えば結合アッセイで可溶性の抗原を使用する際、細胞外領域を以下の通りにクローニングし、発現させた。
【００８０】
ヒトＥＧＦＲの配列に基づいてプライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲによって前駆体タンパク質のＮ末端側の６４３のアミノ酸の単離に用いた。上流の「センス」プライマー（プライマー３０５３）によりクローニング用のＫｐｎＩ部位を添加し、コンセンサスコザック配列に適合するようにコザック配列及びシグナル配列の第１アミノ酸を改変し、真核生物における発現を向上させた。開始コドンを、下で示される各々の配列中に下線で示す。
プライマー３０５３：ＴＡＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＧＧＧ ＡＣＧ［配列番号７８］
天然配列：ＧＣＴ ＣＴＴ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＣＧＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＧＧＧ ＡＣＧ［配列番号７９］。
下流の「アンチセンス」プライマー（プライマー３０５４）は、１６１９（成熟型タンパク質のアミノ酸付番に基づく）においてタンパク質合成を終結させ、
（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒリンカー［Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ、配列番号８０］
及び
（Ｈｉｓ）６タグ［配列番号８１］
を付与する。ＸｂａＩ部位を導入してクローニング用に用いた。
プライマー３０５４：ＡＴＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＡＣ ＴＣＡ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＧＡＴ ＣＴＴ ＡＧＧ ＣＣＣ ＡＴＴ ＣＧＴ ＴＧＧ ＡＣＡ［配列番号８２］。融合するリンカー及び（Ｈｉｓ）６タグ［配列番号６］を有する成熟型ｓＥＧＦＲのアミノ酸配列を図２に示す。
【００８１】
Ｆａｓｔ−Ｔｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、ヒトＡ４３１上皮癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５５５）からｍＲＮＡを単離した。プライマー３０５３及び３０５４を用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ １ステップＲＴ−ＰＣＲ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）により遺伝子の細胞外部分を増幅し、ベクターｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。タグを付与した遺伝子部分をＤＮＡ塩基配列決定により確認し、ｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）発現ベクターのＸｂａＩ／ＫｐｎＩフラグメントとして挿入した。
【００８２】
プラスミドＤＮＡを線形にし、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にエレクトロポレーションした。ジェネテシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に対する耐性に基づきクローンを選抜した。約１００のコロニーに関して、ｍ２２５（Ａｂ−２）抗体（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ社）を用いたウエスタンブロッティングによる、可溶性ＥＧＦＲ（ｓＥＧＦＲ）の発現の検出を行った。適切な発現を示すクローンを増殖させ、限界希釈によりサブクローニングし、無血清媒体（ＣＨＯ ＳＦＩＩ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に順化させた。
【００８３】
可溶性の抗原を、フラスコ培養の最終時点の上澄みを濃度し、Ｎｉ−ＮＴＡセファロース（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、ＣＡ）に結合させて半精製した。具体的には、最終時点の細胞上澄みを、遠心分離で細胞をペレット化して回収し、その上澄みを濾過していかなる細胞残渣も除去し、その後の精製処理において０〜４℃に維持した。Ａｍｉｃｏｎコンセントレータを使用して、３０，０００ＭＷＣＯ膜で、合計約１００ｍｌとなるまで上澄みを濃縮した濃縮物を一晩バッファＡ（：５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、３００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのイミダゾール）で透析した。必要に応じてバッファを一度交換してもよい。透析の後、Ｎｉ−ＮＴＡビーズを約８００μｌのバッファＡで２〜３回洗浄し、更に５０ｍｌのコニカルチューブで透析後の上澄みに添加し、低温室で２時間回転させた。５０ｍｌのコニカルチューブ内でビーズをスピンダウンし、上澄みを若干量チューブに残し、大部分の上澄みを他の容器に移した。この上澄みをボルテックスしてはビーズを再懸濁し、ビーズを適切な市販のカラム上へロードした。液体をスルーさせ、残りの上澄みをカラムに添加される。上澄みをカラム２〜３回再利用した。カラムを約１０ｍｌのバッファＡで洗浄した。カラムから、約３〜４ｍｌのバッファＡ（２００ｍＭのイミダゾールを含有）で溶出し、２５０μｌのフラクションを回収した。ブランクとして溶出バッファを使用して、フラクションのＯＤ２８０をプレートリーダーで測定した。最も濃縮されているフラクションをプールし、一晩ＰＢＳで透析した。プールした透析後のフラクションに１／１０量のグリセロールを添加して−７０℃で凍結させてもよく、又は透析後のフラクションをビオチン化してもよい（下記参照）。
【００８４】
ｓＥＧＦＲを５００ｍＭのイミダゾールで溶出し、上記の通りＰＢＳで透析した。ｓＥＧＦＲを含んでなる混合タンパク質フラクションを、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ２１３３５）を使用してビオチン化し、余分な試薬を除去するためにＰＢＳで透析した。ビオチン化ｓＥＧＦＲ（Ｂ−ｓＥＧＦＲ）のアリコートを、−８０℃で１０％グリセロールストックとして保存した。
【００８５】
＜実施例２＞バクテリアで発現させたＦａｂの単離
本発明に係るＦａｂは、以下の通り細菌ペリプラズムから単離できる。ＯＤ６００ｎｍで約０．９〜１．２に達するまで、２×ＹＴ培地中で、３７℃で２５０回転／分で振とうしてＸＬ−０細胞を増殖させた。次いでＩＰＴＧを１ｍＭ（１Ｍストックから）の最終濃度に添加した。分析クローンごとに、１５ｍｌの細胞液を無菌のコニカルチューブ内で培養した。高い力価のファージストック１０μｌを用いて細胞を感染させ、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を２５℃の条件に移し、振とうしながら一晩増殖させた。卓上臨床用遠心分離機で２５分間、〜２０００×ｇで細胞を沈殿させた。次に細胞をエッペンドルフチューブへ移し、１ｍｌの３０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液中にピペッティングにより再懸濁した。微量遠心分離機を用い、８０００回転／分で３分間サンプルを沈殿させた。上澄みを吸引除去した。ペレットを５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのショ糖中に再懸濁し、更にボルテックスし、３０分間の氷上に配置した。微量遠心分離機を用い、４℃、９０００回転数／分で１０分間処理し、細胞破片を沈殿させた。上澄みを単離し、４℃で保存した。
【００８６】
＜実施例３＞フィルタリフトによるＦａｂの同定
ビオチン化ｓＥＧＦＲと結合する、ファージにより発現されたＦａｂを、Ｆａｂフィルター又は捕捉リフトによって多様なＦａｂを含有する集団から検出した。ｃｔファージはＦａｂを発現し、それは例えば、ファージにより発現された多様なＦａｂの集団の中でもＢ−ｓＥＧＦＲと結合した。簡潔には、フィルターを捕捉試薬（ヤギ抗ヒトκ鎖抗体）でコーティングし、そのコーティングされたフィルターを、Ｆａｂを発現するファージによるファージプラークを有するプレートに配置した。フィルターをプラークと共にインキュベートし、更にフィルターをビオチン化ｓＥＧＦＲでインキュベートし、結合したビオチン化ｓＥＧＦＲを、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＡＰの結合、及び検出可能なアルカリホスファターゼ基質とのインキュベートにより検出した。
【００８７】
具体的には、ニトロセルロース（ＢＡ８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｌ）フィルターを、室温で２時間、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトκ抗体（２０６０−０１、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）５ｍＬに浸漬することによってコーティングした。フィルターを１５分間水に浸漬した。フィルターを３回ＰＢＳで洗浄した。フィルターを１時間、ＰＢＳ（１％ＢＳＡ含有）でブロッキングした。フィルターを３回ＰＢＳで洗浄した。フィルターを１０分間空気乾燥した。フィルターを慎重にファージプレート上に配置し、２２℃で一晩インキュベートした。フィルターを慎重に剥離し、短時間ＰＢＳで洗浄した。３％の粉ミルク、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中にビオチン化抗原を１／１０００希釈した溶液を調製し、室温で１時間フィルターをインキュベートした。フィルターをＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有）で３回真空洗浄した。ＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有）中にＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−ＡＰを１／１０００希釈した溶液を調製し、室温で３０分間フィルターをインキュベートした。フィルターをＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有）で３回真空洗浄した。１０ｍｌのＡＰ基質（ニトロブルーテトラゾリウム、５−ブロモ−４−クロロ−インドリルリンホスフェート、Ｐｉｅｒｃｅ社製、ロックフォード、ＩＬ）中でフィルターを発色させた。プラークを、青色の強度に基づいて選抜した。
【００８８】
＜実施例４＞Ｆａｂ結合ｓＥＧＦＲの捕捉ＥＬＩＳＡアッセイ
捕捉ＥＬＩＳＡを用いて以下の通りにアッセイし、ｓＥＧＦＲと結合するＦａｂを検出した。Ｃｏｓｔａｒ社製のＵ字底プレートを、１０μｇ／ｍＬでヤギ抗ヒトκ抗体（２０６０−０１ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ＡＬ）を含む炭酸塩バッファ（０．０１５Ｍ炭酸ナトリウム、０．０３５Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５））で、５０μＬ／ウェルで４℃で一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で３回洗浄した。ウェルをＲＴで１時間、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の１％ＢＳＡ溶液で、５０μＬ／ウェルでブロッキングした。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。ペリプラズムから調製したＦａｂ（実施例２を参照、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５μｇ／ｍＬに希釈）を１：５の希釈系列により、５０μＬ／ウェルで添加した（２サンプル調製）。プレートをＲＴで２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。５０μＬ／ウェルでビオチン化ｓＥＧＦＲ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１／１０００希釈）を添加、プレートをＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。５０μＬ／ウェルのＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼ（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ ＡＰ、Ｐｉｅｒｃｅ社製，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１／１０００希釈）をＲＴで添加し、３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。１５０μＬ／ウェルでｐＮＰＰ基質（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、発色するまで３７℃でインキュベートした。プレートをＯＤ４０５で測定した。
【００８９】
ＦａｂのｓＥＧＦＲへの結合を捕捉アッセイで解析した結果を図１に示す。
【００９０】
＜実施例５＞Ａ４３１癌細胞可溶化物に対するＦａｂ結合アッセイ
ＥＧＦＲに対するＦａｂ結合を、以下の通りＡ４３１癌細胞可溶化物を用いてアッセイすることもできる。Ａ−４３１細胞可溶化物を、“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｃｔｉｖｅ ＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｙａｒｄｅｎら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，３１５−３１９”に記載のとおり調製した。すなわち、コンフルエントなＡ−４３１細胞の単分子層を、ＰＢＳで２回、更にＨＮＥＧ（２０ｍＭのＨｅｐｅｓバッファ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０％のグリセロール）で１回洗浄した。細胞をＨＮＥＧの２０ｍＬ中に掻き取り、１０分間６００×ｇで遠心分離した。１０７個の細胞を１ｍＬの可溶化バッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１，５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５μｇ／ｍＬのロイペプチン、１％のアプロチニン）中に懸濁し、更にガラスガラスホモジナイザでホモジナイズした。３０分間４０，０００×ｇで遠心分離し、不溶性物質を除去した。透明な上澄みを回収し、−８０℃で凍結させた。
【００９１】
Ｃｏｓｔａｒ社製のＵ字底プレートを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１％トリトンＸ−１００溶液で１／２０希釈した細胞可溶化物で５０μＬ／ウェルでコーティングし、フード中で一晩乾燥させた。プレートを、ＰＢＳ（０．５％のＢＳＡ含有）で、１００μＬ／ウェルで添加してブロッキングし、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ）で３回洗浄した。５０μｌ／ウェルでＦａｂを添加し、ＰＢＳ（０．０５％のＴｗｅｅｎ）を用いて１〜５μｇ／ｍｌで１／５希釈系列を作製し、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。ヤギ抗ヒトκ−ＡＰ（２０６０−０１，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１／２０００希釈液を、１００μＬ／ウェルで添加した。プレートをＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。１５０μＬ／ウェルでｐＮＰＰ基質（Ｎ−９３８９，Ｓｉｇｍａ社製，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）［Ｓｏｕｒｃｅ／Ｃａｔ．＃］（１タブレット／３ｍＬの水）を添加し、３７℃で最高１時間インキュベートした。プレートをＯＤ４０５で測定した。
【００９２】
＜実施例６＞抗ＥＧＦＲ抗体による細胞増殖の抑制
Ａ４３１表皮癌細胞による細胞増殖アッセイを行い、抗ＥＧＦＲ Ｆａｂの相対的な力価を測定した。先行技術文献に従いアッセイを行い（Ｓａｔｏら、“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”，（１９８３），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１，５１１−５２９）、それにより抗ＥＧＦ受容体抗体に応答したＡ４３１細胞の細胞増殖の低下が示された。細胞増殖アッセイは、以下の通りである。Ａ４３１細胞を、ＤＭＥＭ（１０％のＦＢＳ含有）において培養した。第１日目に細胞を、２０分間ＰＢＳ中に置き、表面コーティングの５分前にトリプシン処理した。ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ３８４を使用して、Ｇｒｅｉｎｅｒ３８４ ＴＣ処理した細胞培養プレート上に、ウェル当たり１５，０００の細胞の細胞密度で細胞を３８４ウェルフォーマットでプレーティングした。最終的な溶媒体積を５０μｌとした。細胞培養プレートをａｉｒｐｏｒｅテープ（Ｑｉａｇｅｎ社製、バレンシア、ＣＡ）で被覆した。朝までかけて細胞を付着させた。第２日目に細胞培養培地を除去し、フェノールレッドフリーなＤＭＥＭ培地（ＦＢＳ無し）［「コントロールウェル」］、又は２．５μｇ／ｍｌの予想濃度でＦａｂペリプラズム調製物（実施例２を参照）を含むＤＭＥＭ培地［「処理ウェル」］（２サンプル調製）を各５０μｌ用いて培地交換した。２つのコントロールウェルを、各処理セルに隣接させて調製し、合計１９２のコントロールウェルとした。第３日目に、培地を除去し、ＭＴＳ細胞増殖試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マディソン、ＷＩ、１ｍｌ／１０ｍｌ培地）を含有するフェノールレッドフリーのＤＭＥＭ培地で培地交換した。１５及び３０分後における４９０ｎｍの吸光度を記録した。処理ウェルにおける全ての２サンプルの平均値を、全てのコントロールウェルの平均値で除算した。
【００９３】
Ｆａｂを用いたアッセイの代表的な結果を図２に示す。同様に、完全長抗体によるアッセイの代表的な結果を図３に示す。Ｆａｂ又は抗体の非存在下で細胞をインキュベートした場合（＝１００％）のシグナルに対する、得られたシグナルのパーセンテージを図２及び３各々に示す。但しシグナル強度のパーセンテージが、完全に実際の細胞数と必ずしも相関するわけではない点に留意する必要がある。
【００９４】
＜実施例７＞結合親和性
本発明の完全長のモノクローナル抗体の結合親和性の測定を、Ｓａｐｉｄｙｎｅ ＫＩＮＥＸＡアッセイを使用して行った。ＮＨＳで活性化した高流速セファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を、抗原（ビーズ１ｍｌ当たり５０μｇの抗ＥＧＦＲ抗体）でプレコートし、１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ含有）でブロッキングした。次に本発明の抗体２ｐＭ、４ｐＭ、４０ｐＭを、バッファ（ＰＢＳ、０．００５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０及び１ｍｇ／ｍｌのオバルブミン）中で、様々な濃度のｓＥＧＦＲ（例えば２．４ｐＭ〜１０ｎＭ、連続希釈）と、室温で１０時間インキュベートした。平衡時に存在するフリーの抗体を測定するため、各サンプルを、ｓＥＧＦＲコーティングしたビーズ中を通過させた。次にランニングバッファ中のバッファ蛍光（Ｃｙ５）標識したヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（１：４０００希釈溶液）をビーズ中に通し、ビーズに結合した抗体の量を測定した。測定された蛍光シグナルは平衡時のフリーの抗体濃度と比例していた。ｓＥＧＦＲの各濃度測定を２度実施した。多数曲線、１部位均一結合モデル（ＫＩＮＥＸＡソフトウェア）を使用して、競争曲線の非線形回帰から平衡解離定数（ＫＤ）を得た。
【００９５】
ｓＥＧＦＲ結合のための結合速度定数（ｋｏｎ）も、Ｓａｐｉｄｙｎｅ ＫＩＮＥＸＡアッセイを使用して得た。上記と同じ条件を使用して、２ｐＭ抗体と２０ｐＭのｓＥＧＦＲを混合した。幾つかの時点で、上記の条件を用いて、平衡結合時のフリーの抗体濃度を解析し、更に得られた時間との相関関係を、ＫＩＮＥＸＡソフトウェアを結合速度（ｋｏｎ）を用いて解析した。計算式ｋｏｆｆ＝Ｋｄ×ｋｏｎを使用して、解離速度定数（ｋｏｆｆ）を算出した。完全長のモノクローナル抗体の親和性を上記のアッセイにより測定し、得られた結果を以下の表４に示す。
【００９６】
表４：抗体親和性（ＫｉｎＥｘＡ３０００ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ社製）による測定）
【表４】
【００９７】
＜実施例８＞ＥＧＦＲのリン酸化
【００９８】
ＥＧＦＲのリン酸化を阻害する本発明の抗体の能力を、以下の通りにアッセイした。Ａ４３１細胞を６ウェルプレートの〜７０％コンフルエンスまで増殖させ、ＤＭＥＭ培地（０．５％ＦＢＳ）を用いた血清飢餓の状態で一晩培養した。次に細胞を、１００ｎＭ ＥＧＦ（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）の存在下で希釈した抗体と１時間インキュベートした。細胞を冷却ＰＢＳ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％のＩＧＥＰＧＡＬ ＣＡ−６３０、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのバナジウム酸ナトリウム（ＮａＶＯ４）、１ｍＭのＮａＦ、１／２タブレットのプロテアーゼカクテル（／１０ｍＬ））で洗浄し、０．５ｍＬの溶解緩衝液を用いて溶解させた。１０，０００回転数／分で３０分間超遠心分離を行い、不溶性物質を除去した。細胞可溶化物をタンパク質濃度に合わせて調製し、各抽出液を等量用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。リン酸化されたＥＧＦＲをウエスタンブロットに供し、抗リン酸化ＥＧＦＲ抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）で発色させて解析した。
【００９９】
モノクローナル抗体Ｃ２２５、ＶＨ４．１５及びＶＨ４．２１の存在下におけるＥＧＦＲのリン酸化の結果を図４に示す。図５に示すように、リン酸化の抑制は、モノクローナル抗体Ｃ２２４及びＶＨ４．１５の結果との比較による、細胞ベースのアッセイにおける細胞の抗体力価と相関していた。
【０１００】
＜実施例９＞抗ＥＧＦＲ抗体によるアポトーシスの誘導
ＥＧＦＲ活性化を阻害する抗ＥＧＦＲ抗体の能力を、以下の通りＡ４３１細胞のアポトーシス誘導によりアッセイした。２４ウェルプレート中に２００００細胞／ウェルでＡ４３１細胞を添加し、１．０μｇ／ｍＬの抗体を用いて０、３、７、２４又は４８時間インキュベートした。アポトーシスは、ＤＮＡフラグメント用のＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ社製）で測定した。非特異抗体によるベースのアポトーシスを平均値から減算した。
【０１０１】
完全長モノクローナル抗体Ｃ２２５、ＡＢＸ−ＥＧＦ及びＶＨ４．１５を用いた抗ＥＧＦＲによるＡ４３１細胞のアポトーシス誘導の結果を図６に示す。
【０１０２】
＜実施例１０＞抗ＥＧＦＲ抗体によるモデルマウスのＡ４３１腫瘍の治療
抗ＥＧＦＲ抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおけるＥＧＦＲの活性化を阻害する能力を、Ａ４３１腫瘍細胞株を保持するモデルマウスに対する複数種の抗体の投与によりアッセイした。この腫瘍モデルマウスアッセイを、以下の通り実施した。第０日目に、培養したＡ４３１細胞を調製し、細胞数を計測し、５×１０７細胞濃度で再懸濁させた。７週齢のオスのＣＢ１７−ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ社製）の左の横腹（ＥＣ）に、１０７細胞（すなわち２００μｌ）で皮下注射した。腫瘍が〜３００ｍｍ３（通常約２１日後）となった後、動物に対して毎週二回（火曜／金曜）腹膜内に約２５０〜３００μｌの０．５ｍｇ抗体／マウスで注射し、一方コントロール動物群では２５０μｌの生理食塩水を投与した。合計５回の抗体注入を実施した。腫瘍体積を、抗体の最初の投与から３週間の間、週３回測定した。
【０１０３】
モデルマウスにおけるＡ４３１腫瘍の抗ＥＧＦＲ抗体による処理の結果を図７に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】Ｆａｂ２．６９、４．１５、４．２１、キメラ抗体Ｃ２２５及びヒト抗体ＡＧＸ−ＥＧＦを用いて捕捉ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】Ｆａｂ４．１４、４．１５、４．２１、４．４及びキメラ抗体Ｃ２２５を用いたＡ４３１細胞の増殖アッセイの結果を示す。
【図３】完全長抗体４．１５、げっ歯類抗体２２５及びキメラ抗体Ｃ２２５を用いたＡ４３１細胞の増殖阻害を示す。
【図４】抗体４．１５、４．２１又はキメラ抗体Ｃ２２５とプレインキュベートしたＡ４３１細胞において検出された、リン酸化ＥＧＦＲ（ｐ−Ｔｙｒ ＥＧＦＲ）の量を示す。
【図５】抗体４．１５及びキメラ抗体Ｃ２２５によるＡ４３１細胞増殖の抑制が、ＥＧＦＲリン酸化の阻害と相関することを示す。
【図６】完全長抗体４．１５、キメラ抗体Ｃ２２５及びヒト抗体ＡＢＸ−ＥＧＦを用いた、抗体によるＡ４３１細胞のアポトーシス誘導アッセイの結果を示す。
【図７】完全長抗体２．６９、４．１５、４．２１及びキメラ抗体Ｃ２２５を用いた、モデルマウスにおけるＡ４３１腫瘍の抑制を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．０１ｐＭ〜１０ｐＭのＫｄ値でＥＧＦＲと結合する、ＥＧＦＲ特異的なモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
１０ｐＭ以下のＫｄ値でＥＧＦＲと結合する、ＥＧＦＲ特異的なモノクローナル抗体又はその抗原結合部部分。
【請求項３】
該抗体が更にＥＧＦＲの活性化を阻害する、請求項１又は２記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
該抗体が
配列番号４３に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号４４に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、
配列番号４５に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
配列番号４６に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号３５に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２及び
配列番号４７に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含んでなる、請求項１から３のいずれか１項記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項５】
ＥＧＦＲ特異的な抗体又はその抗原結合部分であって、該抗体が、
ａ）配列番号４９及び配列番号６６、
ｂ）配列番号５１及び配列番号６８、
ｃ）配列番号５５及び配列番号７２及び
ｄ）配列番号５６及び配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含んでなる、該抗体又はその抗原結合部分。
【請求項６】
該抗体が完全長抗体、実質的に完全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又は単鎖Ｆｖフラグメントである、請求項１から５のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
該抗体がヒト化抗体である、請求項１から６のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸。
【請求項９】
請求項８記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターで安定にトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１から７のいずれか１項記載の抗体及び薬学的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
患者におけるＥＧＦＲにより媒介される癌の治療方法であって、請求項１から７のいずれか１項記載の抗体を該患者に有効量で投与することを含んでなる方法。
【請求項１４】
薬剤として用いられる、請求項１から７のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１５】
患者におけるＥＧＦＲにより媒介される癌の治療用薬剤の製造への、請求項１から７のいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項１】
０．０１ｐＭ〜１０ｐＭのＫｄ値でＥＧＦＲと結合する、ＥＧＦＲ特異的なモノクローナル抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２】
１０ｐＭ以下のＫｄ値でＥＧＦＲと結合する、ＥＧＦＲ特異的なモノクローナル抗体又はその抗原結合部部分。
【請求項３】
該抗体が更にＥＧＦＲの活性化を阻害する、請求項１又は２記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
該抗体が
配列番号４３に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号４４に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、
配列番号４５に示すアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、
配列番号４６に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号３５に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２及び
配列番号４７に示すアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含んでなる、請求項１から３のいずれか１項記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項５】
ＥＧＦＲ特異的な抗体又はその抗原結合部分であって、該抗体が、
ａ）配列番号４９及び配列番号６６、
ｂ）配列番号５１及び配列番号６８、
ｃ）配列番号５５及び配列番号７２及び
ｄ）配列番号５６及び配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含んでなる、該抗体又はその抗原結合部分。
【請求項６】
該抗体が完全長抗体、実質的に完全長抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又は単鎖Ｆｖフラグメントである、請求項１から５のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
該抗体がヒト化抗体である、請求項１から６のいずれか１項記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでなる単離された核酸。
【請求項９】
請求項８記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターで安定にトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１から７のいずれか１項記載の抗体及び薬学的に許容できる担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１３】
患者におけるＥＧＦＲにより媒介される癌の治療方法であって、請求項１から７のいずれか１項記載の抗体を該患者に有効量で投与することを含んでなる方法。
【請求項１４】
薬剤として用いられる、請求項１から７のいずれか１項記載の抗体。
【請求項１５】
患者におけるＥＧＦＲにより媒介される癌の治療用薬剤の製造への、請求項１から７のいずれか１項記載の抗体の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５１５８７８（Ｐ２００９−５１５８７８Ａ）
【公表日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４０１２１（Ｐ２００８−５４０１２１）
【出願日】平成１８年１１月６日（２００６．１１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３３１１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５８８２３
【国際公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月６日（２００６．１１．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３３１１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５８８２３
【国際公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
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