抗ＨＥＲ３抗体及びその使用
本発明は、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体（抗ＨＥＲ３抗体）、それらの製造方法、該抗体を含有する薬学的組成物、及びそれらの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体（抗ＨＥＲ３抗体）、それらの製造方法、該抗体を含有する薬学的組成物、及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＨＥＲ３（ＥｒｂＢ-３、ＥＲＢＢ３、ｃ-ｅｒｂＢ-３、ｃ-ｅｒｂＢ３、レセプターチロシン-プロテインキナーゼ、配列番号：１７）は、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲとしても知られている）、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ４（Kraus, M.Hら, PNAS 86(1989) 9193-9197；Plowman, G.Dら, PNAS 87(1990) 4905-4909；Kraus, M.Hら, PNAS 90(1993) 2900-2904）もまた含むレセプターチロシンキナーゼの上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーをコードする。プロトタイプの上皮増殖因子レセプターと同様に、膜貫通レセプターＨＥＲ３は、細胞外リガンド結合ドメイン（ＥＣＤ）、ＥＣＤ内の二量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）、及びＣ-末端リン酸化ドメインからなる。この膜結合タンパク質は、細胞外ドメイン内にＨＥＲ３、ヘレグリン（ＨＲＧ）結合ドメインを有するが、活性なキナーゼドメインは持たない。よって、それはこのリガンドへの結合は可能であるが、タンパク質のリン酸化を介して細胞にシグナルを運ぶことはできない。しかしながら、それは、キナーゼ活性を有する他のＨＥＲファミリーのメンバーとは、ヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体化により、その細胞内ドメインのトランスリン酸化及びレセプター-媒介性シグナル伝達経路の活性化を生じる。ＨＥＲファミリーメンバー間の二量体形成は、ＨＥＲ３のシグナル伝達の可能性を拡大させ、シグナル多様化のためだけでなく、シグナル増幅のための手段である。例えば、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、ＨＥＲファミリーメンバーの中でも、ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴ経路を介した最も重要な分裂促進シグナルの一つを誘導する（Sliwkowski M.Xら, J. Biol. Chem. 269(1994)14661-14665；Alimandi Mら, Oncogene. 10(1995) 1813-1821；Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276(2001) 42153-4261；Singer, E., J. Biol. Chem. 276(2001) 44266-44274；Schaefer, K.L., Neoplasia 8(2006) 613-622）。
【０００３】
この遺伝子の増幅及び／又はそのタンパク質の過剰発現は、前立腺、膀胱及び乳腺の腫瘍を含む多くの癌で報告されている。異なったアイソフォームをコードする選択的転写スプライスバリアントが特徴付けられている。一アイソフォームは膜間領域を欠き、細胞の外に分泌される。この形態は、膜結合型の活性を調節するように作用する。付加的なスプライスバリアントも報告されているが、十分に特徴付けられてはいない。
【０００４】
国際公開第９７／３５８８５号はＨＥＲ３抗体に関連している。国際公開第２００３／０１３６０２号は、ＨＥＲ抗体を含むＨＥＲ活性のインヒビターに関連している。国際公開第２００７／０７７０２８号及び国際公開第２００８／１００６２４号も、ＨＥＲ３抗体に関連している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１Ｌ領域又は配列番号：７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体を含む。
【０００６】
本発明は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１０であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１１であることを特徴とする本発明の抗体；又はそのヒト化型をさらに含む。
【０００７】
本発明は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする抗体をさらに含む。
【０００８】
本発明は、配列番号：８の重鎖可変ドメインＶＨ；及び配列番号：９又は配列番号：１１の軽鎖可変ドメインＶＬを含む抗体をさらに含む。
【０００９】
本発明は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：７のＣＤＲ１Ｌ領域を含む抗体をさらに含む。
【００１０】
本発明は、配列番号：８の重鎖可変ドメインＶＨ；及び配列番号：１０の軽鎖可変ドメインＶＬを含む抗体をさらに含む。
【００１１】
本発明の他の態様は、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、配列番号：８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインＶＨ、及び配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含む抗体を提供する。
【００１２】
一実施態様では、本発明の抗体は、抗体がモノクローナルであることを特徴とする。
【００１３】
一実施態様では、本発明の抗体は、抗体がヒト化されていることを特徴とする。
【００１４】
一実施態様では、本発明の抗体は、抗体がＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする。
【００１５】
本発明は、本発明の抗体を含有することを特徴とする薬学的組成物をさらに含む。
【００１６】
本発明は、癌の治療のための本発明の抗体をさらに含む。
【００１７】
本発明は、癌の治療のための医薬の製造における本発明の抗体の使用をさらに含む。
【００１８】
本発明は、本発明の抗体を患者に投与することを特徴とする、癌に罹患している患者を治療する方法をさらに含む。
【００１９】
本発明の他の態様は、ここで提供される抗ＨＥＲ３抗体の重鎖と軽鎖をコードする核酸を提供する。一実施態様では、抗体は、配列番号：８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含む。
【００２０】
本発明は、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体の重鎖と軽鎖をコードする核酸をさらに含み、該抗体は、配列番号：８の可変ドメインＶＨ；及び配列番号：８、配列番号：１０、又は配列番号：１１の軽鎖可変ドメインＶＬ；又はそのヒト化型を含むことを特徴とする。
【００２１】
本発明は、原核生物又は真核生物の宿主細胞に、本発明の抗体を発現させるための本発明の核酸を含有することを特徴とする発現ベクターをさらに含む。
【００２２】
本発明は、本発明のベクターを含有する原核生物又は真核生物の宿主細胞をさらに含む。
【００２３】
本発明は、原核生物又は真核生物の宿主細胞において本発明の核酸を発現させ、該細胞又は細胞培養物の上清から上記抗体を回収することを特徴とする、本発明の組換え抗体を生産する方法をさらに含む。
【００２４】
驚くべきことに、本発明の抗体が、優れた薬物動態特性（例えば、長い半減期等）、ＨＥＲ３に対する高度な結合親和性、癌細胞の増殖に関連し、（例えば、ＨＥＲ３リン酸化及びＡＫＴリン酸化等の）ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達の強力な阻害、ＨＥＲ３発現癌細胞の強力な増殖阻害等の非常に貴重な特性を有することが見いだされた。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１Ｌ領域又は配列番号：７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体を含む。
【００２６】
本発明は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１０であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１１であることを特徴とする本発明の抗体；又はそのヒト化型をさらに含む。
【００２７】
本発明は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１０であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１１であることを特徴とする本発明の抗体をさらに含む。
【００２８】
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする。
【００２９】
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１１であることを特徴とする。
【００３０】
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする。
【００３１】
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１０であることを特徴とする。
【００３２】
一実施態様では、本発明の抗体はモノクローナルである。一実施態様では、本発明の抗体はヒト化又はヒトである。一実施態様では、本発明の抗体はＩｇＧ１、又はＩｇＧ４サブクラスである。一実施態様では、本発明の抗体はＩｇＧ１サブクラスのモノクローナルヒト化抗体である。一実施態様では、本発明の抗体は、Ａｓｎ２９７で糖鎖でグリコシル化されており、よって該糖鎖内のフコース量が６５％以下であることを特徴とする抗体である。
【００３３】
本発明は、それぞれＶＨ及びＶＬ又はＣＤＲを有するヒト化抗体Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３を含む。
一実施態様では、このような抗体は、例えば配列番号：１２−１６、好ましくは配列番号：１２−１３等の、ヒト由来の定常領域を含む。
【００３４】
「抗体」なる用語は、種々の形態の抗体構造を包含し、限定されるものではないが、全抗体及び抗体断片を含む。本発明の抗体は、好ましくはヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は本発明の特徴的特性が保持されている限り、さらに遺伝子改変された抗体である。
【００３５】
「抗体断片」は全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例には、ダイアボディ、単鎖抗体分子、及び多重特異性抗体で、抗体断片から形成されたものが含まれる。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。さらに、抗体断片は、ＶＨドメイン、すなわちＶＬドメインと共にアセンブリ可能である、又はＨＥＲ３に結合するＶＬドメイン、すなわち機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共にアセンブリ可能であるという特徴を有し、よって本発明の抗体の特徴を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００３６】
ここで使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を意味する。
【００３７】
「キメラ抗体」なる用語は、マウスからの可変領域、すなわち結合領域と、異なった供給源又は種から誘導された、通常は組換えＤＮＡ技術により調製される定常領域の少なくとも一部を含むモノクローナル抗体を意味する。マウス可変領域とヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。このようなラット／ヒトキメラ抗体は、ラット免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明に包含される「キメラ抗体」の他の形態は、クラス又はサブクラスが元々の抗体のものから修飾され又は変化させられたものである。このような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体を生産するための方法には、今は当該技術分野でよく知られている一般的な組換えＤＮＡ及び遺伝子形質移入技術が含まれる。例えば、Morrison, S.Lら, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81(1984) 6851-6855；米国特許第５２０２２３８号及び米国特許第５２０４２４４号を参照。
【００３８】
「ヒト化抗体」又は「抗体のヒト化型」なる用語は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が修飾されて、親免疫グロブリンのものと比較して、異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変された抗体を意味する。好ましい実施態様では、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲは、ヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトされて、「ヒト化抗体」が調製される。例えば、 Riechmann, Lら, Nature 332(1988) 323-327；及びNeuberger, M.Sら, Nature 314(1985) 268-270を参照。重鎖及び軽鎖の可変フレームワーク領域は、同一又は異なるヒト抗体配列から誘導されうる。ヒト抗体配列は天然に生じるヒト抗体の配列でありうる。ヒト重鎖及び軽鎖可変フレームワーク領域は、Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology(2000) - Appendix 1P A.1P.1-A.1P.37に列挙されており、ＩＭＧＴ、国際免疫遺伝学的情報システム(international ImMunoGeneTics information system)(登録商標)(http://imgt.cines.fr) 又はhttp://vbase.mrc-cpe.cam.ac.ukによってアクセス可能である。場合によっては、フレームワーク領域をさらなる変異により修飾することもできる。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体に対して上述した抗原を認識する配列を表すものに相当する。好ましくは、このようなヒト化型はヒト定常領域でキメラ化される（例えば、配列番号：１２−１６の配列を参照）。ここで使用される「ヒト化抗体」なる用語は、「クラススイッチング」により、すなわちＦｃ部の変化又は変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４、及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）により、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、本発明の特性を生じさせるために、定常領域が修飾されたこのような抗体をまた含む。
【００３９】
ここで使用される「ヒト抗体」なる用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。ヒト抗体は従来技術でよく知られている（van Dijk, M.A.及び van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001) 368-374）。またヒト抗体は、免疫化において、内在性免疫グロブリン生成の不在下において、ヒト抗体の選択、又は全レパートリーを生成可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)で生成可能である。このような生殖系列変異マウスへの、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動により、抗原曝露でヒト抗体が生成される（例えば、Jakobovits, Aら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993) 2551-2555；Jakobovits, Aら, Nature 362(1993) 255-258；Brueggemann, M.Dら, Year Immunol. 7(1993) 33-40）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにおいても生成可能である（Hoogenboom, H.R., 及び Winter, G., J. Mol. Biol. 227(1992) 381-388；Marks, J.Dら, J. Mol. Biol. 222(1991) 581-597）。また、Cole, Aら及びBoerner, Pらの技術は、ヒトモノクローナル抗体の生成に有用である（Cole, Aら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A.L., p. 77(1985)；及びBoerner, Pら, J. Immunol. 147(1991) 86-95）。本発明のヒト化抗体について上述したように、ここで使用される場合、「ヒト抗体」なる用語は、「クラススイッチ」により、すなわちＦｃ部の変化又は変異(例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４、及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異)により、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、本発明の特性を生じさせるために、定常領域が修飾されたこのような抗体を含む。
【００４０】
ここで使用される場合、「組換えヒト抗体」なる用語は、宿主細胞に形質移入された組換え発現ベクターを使用し、発現したヒト免疫グロブリン遺伝子又は抗体用のトランスジェニックである動物(例えばマウス)から、又はＮＳ０又はＣＨＯ細胞等の宿主細胞から単離された抗体等、組換え手段により調製、発現、生成又は単離された全てのヒト抗体を含むことを意図している。このような組換えヒト抗体は、再配列された形態で、可変及び定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、インビボ体細胞突然変異を受ける。よって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列から誘導され、関連しているので、 インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しないであろう配列である。
【００４１】
ここで使用される場合、「ヒトＨＥＲ３に結合」、「ヒトＨＥＲ３に特異的に結合」、又は「抗ＨＥＲ３抗体」は交換可能であり、２５℃で１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ-値、一実施態様では２５℃で１．０×１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ-値の結合親和性を有する、ヒトＨＥＲ３抗原に特異的に結合する抗体を称する。結合親和性は２５℃で標準的な結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴技術(BIAcore(登録商標), GE-Healthcare Uppsala, Sweden)を用いて測定される。結合親和性のＫＤ-値を測定するための方法は、実施例２ｂ)に記載されている。よって、ここで使用される場合、「ヒトＨＥＲ３に結合する抗体」とは、２５℃でＫＤ１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下(好ましくは、１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ-１．０×１０−１２ｍｏｌ／ｌ)の結合親和性を有する、ヒトＨＥＲ３抗原に特異的に結合する抗体を称する。
【００４２】
ヒトＨＥＲ３(ＥｒｂＢ-３、ＥＲＢＢ３、ｃ-ｅｒｂＢ−３、ｃ-ｅｒｂＢ３、レセプターチロシン-プロテインキナーゼｅｒｂＢ-３、配列番号：１７)は、ＨＥＲ１(ＥＧＦＲとしても知られている）、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ４も含む、レセプターチロシンキナーゼの上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)ファミリーのメンバーをコードする(Kraus, M.Hら, PNAS 86(1989), 9193-9197; Plowman, G.Dら, PNAS 87(1990), 4905-4909; Kraus, M.Hら, PNAS 90(1993), 2900-2904)。プロトタイプの上皮増殖因子レセプターと同様、膜貫通レセプターＨＥＲ３は、細胞外リガンド-結合ドメイン(ＥＣＤ）、ＥＣＤ内の二量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメイン(ＴＫＤ）、及びＣ-末端リン酸化ドメインからなる。この膜結合タンパク質は、ＨＥＲ３、細胞外ドメイン内のヘレグリン(ＨＲＧ)結合ドメインを有するが、活性キナーゼドメインは有さない。よって、このリガンドへの結合は可能であるが、タンパク質のリン酸化を介して、細胞にシグナルを伝達することはできない。しかしながら、キナーゼ活性を有する他のＨＥＲファミリーのメンバーとは、ヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体化により、その細胞内ドメインのトランスリン酸化及びレセプター媒介性シグナル伝達経路の活性化に至る。ＨＥＲファミリーメンバー間の二量体形成は、ＨＥＲ３のシグナル伝達の可能性を拡大させ、シグナル多様化のためだけでなく、シグナル増幅のための手段である。例えば、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、ＨＥＲファミリーメンバーの中でも、ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴ経路を介した、最も重要な分裂促進シグナルの一つを誘発する(Sliwkowski M.Xら, J. Biol. Chem. 269(1994)14661-14665; Alimandi Mら, Oncogene. 10(1995) 1813-1821; Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276(2001) 42153-4261; Singer, E., J. Biol. Chem. 276(2001) 44266-44274; Schaefer, K.L., Neoplasia 8(2006) 613-622)。
【００４３】
ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３は、ＨＥＲ３に対し、リガンドヘルグリン（ＨＲＧ）との競合的結合を示す。
【００４４】
この遺伝子の増幅及び／又はそのタンパク質の過剰発現は、前立腺、膀胱及び乳腺の腫瘍を含む、多くのがんで報告されている。種々のアイソフォームをコードする選択的転写スプライスバリアントが特徴付けられている。一アイソフォームは膜間領域を欠き、細胞の外に分泌される。この形態は、膜結合形態の活性を調節するように作用する。付加的なスプライスバリアントも報告されているが、十分に特徴付けられているわけではない。
【００４５】
「エピトープ」なる用語は、抗体に特異的に結合可能な任意のポリペプチド決定基を含む。ある種の実施態様では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニル等の、分子の化学的に活性な表面グルーピングを含み、ある実施態様においては、特異的な３次元構造的特性、又は特異的な電荷特性を有し得る。
【００４６】
ここで使用される場合、「本発明の抗体の可変ドメイン」(軽鎖の可変ドメイン(ＶＬ)、重鎖の可変ドメイン(ＶＨ))は、抗原への抗体の結合に直接関与している、軽鎖及び重鎖ドメイン対のそれぞれを示す。軽鎖及び重鎖の可変ドメインは同様の一般構造を有し、各ドメインは、その配列が広範囲に保存されており、３つの「高頻度可変領域」(又は相補性決定領域、ＣＤＲ)により結合している、４つのフレームワーク(ＦＲ)領域を含む。フレームワーク領域はβ-シート立体構造を採用し、ＣＤＲはβ-シート構造に結合するループを形成可能である。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域により３次元構造に保持され、他の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明の抗体の結合特異性／親和性において、特に重要な役割を担っており、よって本発明のさらなる目的を提供する。
【００４７】
ここで使用される場合、「抗体の抗原結合部分」なる用語は、抗原結合の原因となる、抗体のアミノ酸残基を称する。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。本発明の抗体の「抗原-結合部分」なる用語は、抗原に対する結合部位の親和性の様々な程度の原因である、６つの相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ(ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３)、及び３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ(ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。「ＣＤＲＨ１」なる用語は、カバットに従い算出される重鎖可変領域のＣＤＲ１領域を示す。ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、重鎖(Ｈ)又は軽鎖(Ｌ)からのそれぞれの領域を意味する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域(ＦＲ)の範囲は、それらの領域が、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)の配列における可変性に従い定められている、アミノ酸配列のコンパイルデータベースと比較することにより決定される。
【００４８】
本発明の「Ｆｃ部分」は、抗原に対する抗体の結合性には直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は当業者によく知られた用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定められる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのクラスに分けられ：これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けられる。重鎖定常領域に応じて、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性に基づき、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）、Ｃ１ｑ結合性及びＦｃレセプター結合性に直接関与している。「補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）」なる用語は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ領域への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始されるプロセスを示す。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位での、明確なタンパク質-タンパク質相互作用によって生じる。このような結合部位は従来技術で知られているであり、例えばBoackle, R.Jら, Nature 282(1979) 742-743, Lukas, T.Jら, J. Immunol. 127(1981) 2555-2560, Brunhouse, R., 及び Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16(1979) 907-917, Burton, D.Rら, Nature 288(1980) 338-344, Thommesen, J.Eら, Mol. Immunol. 37(2000) 995-1004, Idusogie, E.Eら, J. Immunol.164(2000) 4178-4184, Hezareh, Mら, J. Virology 75(2001) 12161-12168, Morgan, Aら, Immunology 86(1995) 319-324, 欧州特許第0 307 434号に記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９である(Kabat, E.AのＥＵ指標に従い番号付け、以下参照)。通常、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は補体活性、及びＣ１ｑ及びＣ３結合を示すが、ＩｇＧ４は補体系を活性化させず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。
【００４９】
一実施態様では、本発明の抗体は、ヒト由来から誘導されたＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域の全ての他の部分を含む。ここで使用される場合、「ヒト由来から誘導されたＦｃ部分」なる用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、例えばヒトＩｇＧ１サブクラスからのＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラスからの変異Ｆｃ部分(好ましくは、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａに変異を有する）、ヒトＩｇＧ４サブクラスからのＦｃ部分、又はヒトＩｇＧ４サブクラスからの変異Ｆｃ部分(好ましくは、Ｓ２２８Ｐに変異を有する）のいずれかである、Ｆｃ部分を示す。配列番号：１３(ヒトＩｇＧ１サブクラス）、配列番号：１４(変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラス)のヒト重鎖定常領域が好ましい。
【００５０】
一実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ３サブクラスのものである。一実施態様では、本発明の抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。
【００５１】
一実施態様では、本発明の抗体は、定常ドメインがヒト由来のものであることを特徴とする。このような定常ドメインは従来技術でよく知られており、例えばKabat, E.A.,(例えば、Johnson, G. 及び Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28(2000) 214-218を参照)に記載されている。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号：１３のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号：１２のカッパ-軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
この出願内で使用される「アミノ酸」なる用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、自然に生じるカルボキシα-アミノ酸の群を示す。
【００５３】
ここで使用される場合、「核酸」又は「核酸分子」なる用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図している。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、他の核酸と機能的関係に位置している場合は、「作用可能に結合」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているならば、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが常套的な手法に従って使用される。ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」なる表現は交換可能に使用され、全てのこのような意味には子孫が含まれる。よって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」なる用語には、初代の対照細胞、及び移動の回数に関係なくそこから得られた培養体も含まれる。また、全ての子孫は、計画的又は偶発的変異により、ＤＮＡ量において、厳密には同一でない可能性もあると理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされた場合、同じ機能又は生物活性を有する変異子孫も含まれる。
【００５４】
本発明の抗体は、好ましくは、定常鎖がヒト由来のものであることを特徴とする。このような定常鎖は従来技術ではよく知られており、例えばKabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載されている。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号：１２のカッパ-軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。例えば有用なヒト重鎖定常領域は配列番号：１３〜１６を含む。
【００５５】
本発明のさらなる実施態様は、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸である。
【００５６】
本発明の抗体には、さらに「保存配列修飾」(変異抗体)、ヌクレオチド、及び本発明の抗体の上述した特徴が影響を受けていない又は変化していないアミノ酸配列修飾を有するこのような抗体が含まれる。修飾は、当該技術で知られているの標準的技術、例えば部位指向性変異原性及びＰＣＲ媒介性変異原性により導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるものが含まれる。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術で定められている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷の極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ-分枝状側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。よって、ヒト抗ＨＥＲ３抗体において予知される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同様の側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができる。よって、「変異」抗ＨＥＲ３抗体は、ここでは親抗体の一又は複数の可変領域において、１０まで、好ましくは約２〜約５の付加、欠失及び／又は置換により、「親」抗ＨＥＲ３抗体アミノ酸配列とは、アミノ酸配列が異なっている分子を称する。アミノ酸置換は、Riechmann, Lら, Nature 332 (1988) 323-327 及び Queen, Cら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-1003により記載されているような、分子モデリングに基づく変異原性により実施することができる。
【００５７】
他の態様では、本発明の抗ＨＥＲ３抗体は、配列番号：８のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(ＶＨ)配列を含む。ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ３に結合する能力を保持している。ある実施態様においては、全体で１〜１０のアミノ酸が、配列番号：８にて、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様においては、置換、挿入又は欠失は、ＣＤＲの外側領域(すなわち、ＦＲ)で生じている。場合によっては、抗ＨＥＲ３抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号：８にＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは：(ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１Ｈ、(ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２Ｈ、及び(ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３Ｈから選択される、１、２又は３のＣＤＲを含む。
【００５８】
他の態様では、本発明の抗ＨＥＲ３抗体は、配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)配列を含む。ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲに結合する能力を保持している。ある実施態様においては、全体で１〜１０のアミノ酸が、配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１にて、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様においては、置換、挿入又は欠失は、ＣＤＲの外側領域(すなわち、ＦＲ)で生じている。場合によっては、抗ＨＥＲ３抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１にＶＬ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは：(ａ）配列番号：６又は配列番号：７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１Ｌ、(ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２Ｌ、及び(ｃ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３Ｌから選択される、１、２又は３のＣＤＲを含む。
【００５９】
他の態様においては、抗ＨＥＲ３抗体が提供され、ここで抗体は、上述にて提供した任意の実施態様のＶＨ、及び上述にて提供した任意の実施態様のＶＬを含む。一実施態様では、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含み；以下の特性（実施例３及び２に記載されるアッセイで測定）：
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＣＦ７細胞、ＦａＤｕ細胞、又はＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害し(一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１．０μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％(一実施態様では、少なくとも９０％)のＭＣＦ７細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％(一実施態様では、少なくとも９０％)のＦａＤｕ細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも６０％(一実施態様では、少なくとも７０％)のＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示す)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害し(一実施態様においては０．５０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、一実施態様においては０．３５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、抗ＨＥＲ３抗体が、Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害する)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を阻害し(一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を阻害する)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、５．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値、一実施態様においては３．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値で、ＨＥＲ３に結合する
の一又は複数を有する、それぞれ配列番号：８及び配列番号：１０にＶＨ及びＶＬ配列を含む。
【００６０】
他の態様では、本発明の抗ＨＥＲ３抗体は、配列番号：８のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(ＶＨ)配列を含み、配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)配列を含み、次の特性（実施例３及び２に記載されるアッセイで測定）：
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＣＦ７細胞、ＦａＤｕ細胞、又はＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害し(一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１．０μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％(一実施態様では、少なくとも９０％)のＭＣＦ７細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％(一実施態様では、少なくとも９０％)のＦａＤｕ細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも６０％(一実施態様では、少なくとも７０％)のＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示す)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害し(一実施態様においては０．５０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、一実施態様においては０．３５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、抗ＨＥＲ３抗体が、Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害する)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を阻害し(一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を阻害する)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、５．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値、一実施態様においては３．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値で、ＨＥＲ３に結合する
の一又は複数を有する。
【００６１】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＥＲ３に結合し、配列番号：８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインＶＨ、及び配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含む抗体である。
【００６２】
本発明の一実施態様は、軽鎖可変ドメインＶＬが、配列番号：９と少なくとも９５％の配列同一性を有する、このような抗体である。
【００６３】
本発明の一実施態様は、軽鎖可変ドメインＶＬが、配列番号：１０と少なくとも９５％の配列同一性を有する、このような抗体である。
【００６４】
本発明の一実施態様は、軽鎖可変ドメインＶＬが、配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する、このような抗体である。
【００６５】
本発明の一実施態様は、配列番号：８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインＶＨ、及び配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含み、ヒトＨＥＲ３に結合し；次の特性（実施例３及び２に記載のアッセイで測定）：
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＣＦ７細胞、ＦａＤｕ細胞、又はＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害し(一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１．０μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％(一実施態様では、少なくとも９０％)のＭＣＦ７細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％(一実施態様では、少なくとも９０％)のＦａＤｕ細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも６０％(一実施態様では、少なくとも７０％)のＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示す)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害し(一実施態様においては０．５０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、一実施態様においては０．３５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、抗ＨＥＲ３抗体が、Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害する)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を阻害し(一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を阻害する)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、５．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値、一実施態様においては３．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値で、ＨＥＲ３に結合する
の一又は複数を有する抗体である。
【００６６】
配列に関する同一性又は相同性は、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要ならば、配列を変化させ、間隙を導入した後、親配列と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとしてここでは定められる。抗体配列における、Ｎ末端、Ｃ末端、又は内部の伸長、欠失、又は挿入のいずれも、配列同一性又は相同性に影響を与えると解釈すべきではない。変異体は、ヒトＨＥＲ３の可変ドメインに結合する能力を保持しており、好ましくは親抗体よりも優れた特性を有する。例えば、変異体は処置中の副作用が低減する可能性がある。
【００６７】
例示的な「親」抗体は、抗体Ｍａｂ ２０５．１０．２のＣＤＲ領域を含み、好ましくは、変異体の調製に使用される。好ましくは、親抗体はヒトフレームワーク領域を有しており、存在するならば、ヒト抗体定常ドメインを有する。例えば、親抗体はヒト化又はヒト抗体であってよい。
【００６８】
「抗体依存性細胞傷害性性（ＡＤＣＣ）」なる用語は、エフェクター細胞の存在下、本発明の抗体によるヒト標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣは、エフェクター細胞の存在下、例えば新鮮に単離されたＰＢＭＣ又はバフィーコートからの精製エフェクター細胞、例えば単球又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は永続的に増殖するＮＫ細胞株の存在下で本発明の抗体でＨＥＲ３発現細胞の調製物を処理することにより好ましくは測定される。
【００６９】
モノクローナル抗体のＡＤＣＣのような細胞媒介性エフェクター機能は、Umana, Pら, Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180、及び米国特許第６６０２６８４号に記載されているような、それらのオリゴ糖成分を操作することにより高めることができる。最も一般的に使用される治療用抗体であるＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメインにおいて、Ａｓｎ２９７に保存されたＮ結合グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複合二分岐オリゴ糖はＣＨ２ドメイン間に埋没しており、ポリペプチド骨格を有する広範な接触部を形成し、それらの存在は、抗体が、抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)等のエフェクター機能を媒介するのに必須である(Lifely, M.Rら, Glycobiology 5(1995) 813-822; Jefferis, Rら, Immunol. Rev. 163(1998) 59-76; Wright, A. 及び Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15(1997) 26-32)。 Umana, Pら, Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180 及び国際公開第９９／５４３４２号には、チャイニーズ卵巣ＣＨＯ細胞において、β(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）、二分されたオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼが、抗体のインビトロＡＤＣＣ活性をかなり増加させることが示されている。Ａｓｎ２９７炭水化物の組成における変化又はその除去は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの結合にも影響を及ぼす（Umana, Pら, Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180；Davies, Jら, Biotechnol. Bioeng. 74(2001) 288-294；Mimura, Yら, J. Biol. Chem. 276(2001) 45539-45547；Radaev, Sら, J. Biol. Chem. 276(2001) 16478-16483；Shields, R.Lら, J. Biol. Chem. 276(2001) 6591-6604；Shields, R.Lら, J. Biol. Chem. 277(2002) 26733-26740；Simmons, L.Cら, J. Immunol. Methods 263(2002) 133-147)。
【００７０】
糖鎖操作を介してモノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能を高める方法は、例えば国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Umana, Pら, Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180、国際公開第９９／１５４３４２号、国際公開第２００５／０１８５７２号、国際公開第２００６／１１６２６０号、国際公開第２００６／１１４７００号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００５／０１１７３５号、国際公開第２００５／０２７９６６号、国際公開第１９９７／０２８２６７号、米国特許第２００６／０１３４７０９号、米国特許第２００５／００５４０４８号、米国特許第２００５／０１５２８９４号、国際公開第２００３／０３５８３５号、及び国際公開第２０００／０６１７３９号、又は例えばNiwa, Rら, J. Immunol. Methods 306(2005) 151-160; Shinkawa, Tら, J Biol Chem, 278(2003) 3466-3473；国際公開第０３／０５５９９３号、及び米国特許第２００５／０２４９７２２号において報告されている。
【００７１】
本発明の一実施態様では、本発明の抗体は、抗体が、（ＩｇＧ１又はＩＧ３サブクラスのＦｃ部分を含むならば）Ａｓｎ２９７で糖鎖にてグリコシル化されていることを意味するアフコシル化されており、よって該糖鎖内のフコースの量は８０％以下（カバットによる番号付け）、例えば８０％から１％である。他の実施態様では、前記糖鎖内のフコースの量は６５％以下であり、一実施態様においては５％〜６５％であり、一実施態様では、該糖鎖内のフコースの量は０％である。このような抗体は、以下「アフコシル化抗体」又は「非フコシル化」と称される。このようなアフコシル化抗体は高められたＡＤＣＣを示すが、他の抗体特性は実質的に影響を受けずに保持されている。
【００７２】
さらなる実施態様では、前記糖鎖内での、Ｎ-グリコシル化ノイラミン酸(ＮＧＮＡ)の量は１％以下であり、及び／又はＮ-末端アルファ-１,３-ガラクトースの量は１％以下である。糖鎖は、ＣＨＯ細胞で組換え的に発現した抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ-結合グリカンの特徴を好ましくは示す。
【００７３】
本発明の「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域のほぼ２９７位に位置するアミノ酸アスパラギンを意味する。抗体の小さな配列変化に基づき、Ａｓｎ２９７は、２９７位の上流又は下流のいくつかのアミノ酸（通常、±３のアミノ酸は超えない）、すなわち２９４から３００位の間に位置しうる。
【００７４】
「糖鎖がＣＨＯ細胞で組換え的に発現した抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ-結合グリカンの特徴を示す」なる用語は、本発明の全長親抗体のＡｓｎ２９７の糖鎖が、フコース残基を除き、未修飾のＣＨＯ細胞で発現した同様の抗体のもの、例えば国際公開第２００６／１０３１００号で報告されているものと同様の構造及び糖残基配列を有することを示す。
【００７５】
この出願で使用される「ＮＧＮＡ」なる用語は、糖残基Ｎ-グリコシル-ノイラミン酸を示す。
【００７６】
ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化は、コアフコシル化された二分岐複合オリゴ糖のグリコシル化が２つまでのＧａｌ残基で終結している場合、Ａｓｎ２９７で生じる。ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのヒト定常重鎖領域は、Kabat, E., Aら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991), 及びBrueggemann, Mら, J. Exp. Med. 166(1987) 1351-1361；Love, T.Wら, Methods Enzymol. 178(1989) 515-527に詳細に報告されている。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じて、Ｇ０、Ｇ１(α-１,６-又はα-１,３-）、又はＧ２グリカン残基と命名される(Raju, T.S., Bioprocess Int. 1(2003) 44-53)。抗体のＦｃ部分のＣＨＯ型グリコシル化は、例えば、Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14(1997) 201-207により記載されている。非糖修飾されたＣＨＯ宿主細胞で組換え的に発現している抗体は、通常、少なくとも８５％の量で、Ａｓｎ２９７でフコシル化されている。全長親抗体の修飾されたオリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体であってもよい。好ましくは、二分された、還元／非フコシル化オリゴ糖はハイブリッドである。他の実施態様では、二分された、還元／非フコシル化オリゴ糖は複合体である。
【００７７】
本発明によれば、「フコースの量」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（例えば、ＬＣ／ＭＳシステム）により測定され、平均値として算出する（例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号を参照）ことによる、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造体（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造体）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での、糖鎖内の糖の量を意味する。フコースの相対量は、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦにより、Ｎ-グリコシターゼＦで処理された試料（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ-及び高-マンノース構造体それぞれ）において同定された全ての糖構造体に対する、フコース含有構造体のパーセンテージである。
【００７８】
本発明の抗体は、好ましくは組換え手段により生成される。このような方法は従来技術において幅広く知られており、抗体ポリペプチドの後続する単離、通常は薬学的に許容可能な純度までの精製を伴い、原核生物及び真核生物細胞におけるタンパク質発現を含む。タンパク質発現について、軽鎖及び重鎖又はその断片をコードする核酸は、標準的な方法で発現ベクターに挿入される。発現は、適切な原核生物又は真核生物宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、又は大腸菌細胞において実施され、抗体は細胞から(上清から又は細胞溶解後に)回収される。抗体の組換え生成は従来技術でよく知られており、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, Sら, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の文献に記載されている。抗体は、全細胞中、細胞可溶化物中、又は部分的に精製された、又は実質的に純粋な形態で存在しうる。カラムクロマトグラフィー及び当該技術でよく知られている他のものを含む標準的な技術により、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を除去するために、精製が実施される（Ausubel, Fら編. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)）。ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.Mら, Cytotechnology 32 (2000) 109-123；Barnes, L.Mら, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Yら, Nucl. Acids. Res. 30(2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, Rら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837；Carter, Pら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；Norderhaug, Lら, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過性発現システム(ＨＥＫ２９３)は、Schlaeger, E.-J. 及び Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83、及びSchlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199に記載されている。モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等、従来からの免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、従来の手順を使用し、容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源として提供することができる。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に挿入され、ついで、宿主細胞、例えば免疫グロブリンタンパク質を生成しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞に形質移入され、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成が得られる。前記細胞株から得ることができる抗体は、本発明の好ましい実施態様である。アフコシル化された抗体は、好ましくは上述した糖鎖工学を介して調製される。
【００７９】
抗ＨＥＲ３抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体コード化ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入する、又はペプチド合成により調製される。しかしながら、このような修飾は、例えば上述したような非常に限られた範囲でしか実施することができない。例えば、修飾により、上述した抗体の特徴、例えばＩｇＧアイソタイプ及びエピトープ結合性を変化させることはできないが、組換え生成の収率、タンパク質安定性、又は精製の容易性を改善することはできる。また、抗ＨＥＲ３の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基は、一般的にセリンで置換され、分子の酸化安定性が改善され、異常な架橋が防止される。反対に、システイン結合(類)は抗体に付加されて、その安定性が改善される(特に、抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合)。抗体の他の種類のアミノ酸変異体では、抗体元来のグリコシル化パターンが変化している。「変化」とは、抗体に見出される一又は複数の炭水化物部分の除去、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合である。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物部分が付着することを称する。Ｘがプロリン以外のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。よって、ポリペプチドにこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的グリコシル化部位が生じる。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列を含有するように(Ｎ結合グリコシル化部位用)、アミノ酸配列を変化させることによって簡便に達成される。
【００８０】
抗ＨＥＲ３抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術で知られているの種々の方法で調製される。これらの方法には、限定されるものではないが、天然源（自然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、又はオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）変異原性、ＰＣＲ変異原性、ヒト化抗ＨＥＲ３抗体の前もって調製された変異体又は非変異型のカセット変異原性が含まれる。
【００８１】
抗体の他のタイプの共有結合的修飾は、米国特許第４６４０８３５号；同４４９６６８９号；同４３０１１４４号；同４６７０４１７号；同４７９１１９２号；同４１７９３３７号に説明された方式において、種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリアルキレンの一つに、抗体を結合させることを含む。
【００８２】
本発明の重鎖及び軽鎖可変ドメインは、発現ベクターコンストラクトが形成されるように、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３'非翻訳領域、ポリアデニル化、及び転写終結の配列が組合せられたものである。重鎖及び軽鎖発現コンストラクトは単一ベクターに組み込まれ、宿主細胞に同時形質移入、連続的形質移入、又は別々に形質移入され、ついでこれらが融合され、双方の鎖を発現する単一の宿主細胞が形成される。
【００８３】
本発明の一態様は、本発明の抗体を含有する薬学的組成物である。本発明の他の態様は、薬学的組成物を調製するための、本発明の抗体の使用にある。本発明のさらなる態様は、本発明の抗体を含有する薬学的組成物を調製するための方法にある。他の態様では、本発明は、本発明の抗体を含有し、薬学的担体と共に処方される組成物、例えば薬学的組成物を提供する。
【００８４】
さらに、本発明の抗ＨＥＲ３抗体は、癌の処置に特に有用であることがわかっている。
【００８５】
よって、本発明の一態様は、癌を処置するための前記薬学的組成物にある。
【００８６】
本発明の他の態様は、癌を処置するための本発明の抗体にある。
【００８７】
本発明の他の態様は、癌の治療のための医薬の製造のための、本発明の抗体の使用にある。
【００８８】
本発明の他の態様は、本発明の抗体を、このような処置を必要とする患者に投与することにより、癌に罹患している患者を治療する方法にある。
【００８９】
ここで使用される場合、「薬学的担体」には、任意及び全ての溶媒、分散用媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延化剤で、生理学的に融和性のあるものが含まれる。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、大脳内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適している。
【００９０】
本発明の組成物は、当該技術で知られているの種々の方法で投与することができる。当業者に理解されているように、投与の経路及び／又は方式は、所望する結果に応じて変えられるであろう。投与のある種の経路により、本発明の化合物を投与するため、化合物をコーティングする、又はその不活性化を防止するための物質と化合物とを当時投与する必要があるかもしれない。例えば、化合物は適切な担体、例えばリポソーム、又は希釈剤において、被験者に投与されてもよい。薬学的に許容可能な希釈剤には、生理食塩水又は水性緩衝液が含まれる。薬学的担体には、滅菌水溶液又は分散液、及び注射可能な滅菌溶液又は分散液を即時調製するための滅菌パウダーが含まれる。薬学的に活性な物質用のこのような媒体又は薬剤の使用は、当該技術で知られているである。
【００９１】
ここで使用される場合、「非経口投与」及び「非経口的に投与」なる語句は、経腸及び局所投与以外の投与方式、通常は注射による投与を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、包膜内、莢膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が含まれる。
【００９２】
ここで使用される場合、「癌」なる用語は、例えば、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、気管支肺胞上皮細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃腸癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、随芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、上述した任意の癌の抵抗性バージョン、又は上述した癌の一又は複数の組合せであってよい。好ましくは、このような癌は、乳癌、肺癌、頭部又は頸部の癌、又は膵臓癌、さらに好ましくは肺癌、頭部又は頸部の癌、又は膵臓癌である。このような癌は、好ましくはＨＥＲ３の発現又は過剰発現により、さらに好ましくはＨＥＲ３の過剰発現により、さらに特徴付けられる。
【００９３】
これらの組成物は、アジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤をさらに含有可能である。微生物存在の防止は、上掲の滅菌手段、及び種々の抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、スコルビン酸等により確実になる。また、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムを、組成物に含有せしめることもまた望ましい。注射可能な薬学的形態の長時間にわたる吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有せしめることによりもたらすことができる。
【００９４】
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和形態、及び／又は本発明の薬学的組成物で使用される本発明の化合物は、当業者に知られている一般的な方法により、薬学的に許容可能な剤形に処方される。
【００９５】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベルは、患者に対して毒性がなく、特定の患者、組成、及び投与方式に対して所望する治療的応答を達成するのに効果的な活性成分の量が得られるように変えうる。選択された投与レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置時間、他の薬剤、使用される特定の組成物と組合せて使用される化合物及び／又は物質、年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態、処置される患者の以前の病歴、及び医療でよく知られている要因を含む、種々の薬物動態学的要因に依存するであろう。
【００９６】
組成物は滅菌されていなければならず、組成物がシリンジにより送達可能である程度に、流動的でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは等張の緩衝生理食塩水である。
【００９７】
適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティング剤を使用することにより、又は分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、そして界面活性剤を使用することにより、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、多価アルコール類、例えばマンニトール又はソルビトール、及び塩化ナトリウムを、組成物に含有せしめることが好ましい。
【００９８】
次の実施例、配列表及び図面は、本発明の理解を補助するために提供されるものであり、発明の真の範囲は添付の請求の範囲に記載される。本発明の精神を逸脱しないで記載された手順に変更をなすことができることが理解される。
【００９９】
配列表の記載
配列番号：１ 重鎖ＣＤＲ３Ｈ、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：２ 重鎖ＣＤＲ２Ｈ、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：３ 重鎖ＣＤＲ１Ｈ、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：４ 軽鎖ＣＤＲ３Ｌ、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：５ 軽鎖ＣＤＲ２Ｌ、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：６ 軽鎖ＣＤＲ１Ｌ(変異体１）、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：７ 軽鎖ＣＤＲ１Ｌ(変異体２）、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：８ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：９ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｍａｂ ２０５．１０．１
配列番号：１０ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｍａｂ ２０５．１０．２
配列番号：１１ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｍａｂ ２０５．１０．３
配列番号：１２ ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号：１３ ＩｇＧ１から誘導されたヒト重鎖定常領域
配列番号：１４ Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａで変異したＩｇＧ１から誘導されたヒト重鎖定常領域
配列番号：１５ ＩｇＧ４から誘導されたヒト重鎖定常領域
配列番号：１６ Ｓ２２８Ｐで変異したＩｇＧ４から誘導されたヒト重鎖定常領域
配列番号：１７ ヒトＨＥＲ３
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ】図１Ａは、異なった濃度での、ＭＣＦ７細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、異なった濃度での、ＭＣＦ７細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、異なった濃度での、Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を示す。
【図２】図２は、Ｍａｂ ２０５(１０ｍｇ／ｋｇ ｑ７ｄｘ３、ｉ．ｐ．)を用いた処置による、異種移植片が移植されたＦａＤｕ ＳＣＣＨＮの腫瘍停滞を示す。
【図３】図３は、Ｍａｂ ２０５(１０ｍｇ／ｋｇ ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．)を用いた処置による、異種移植片が移植されたＭＡＸＦ４４９乳癌の腫瘍停滞を示す。
【図４】図４は、Ｍａｂ ２０５(２５ｍｇ／ｋｇ ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．)を用いた処置による、異種移植片が移植された７１７７ＮＳＣＬＣの腫瘍停滞を示す。
【実施例】
【０１０１】
実施例１
免疫化
ＮＭＲＩマウスを、ｈＨＥＲ３-ＥＣＤ（社内）で免疫化し、ｈｕ-ＨＥＲ３-ＥＣＤで追加免役した。免疫応答をＨＥＲ１／２／３-ＥＣＤ-ＥＬＩＳＡに対して血清試料を試験することによりモニタリングした。十分な力価の抗ＨＥＲ３免疫グロブリンと共にマウスからの脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３との融合により、後での不死化のために凍結させた。１回融合させ、ハイブリドーマ上清を、交差反応を示さないが、ＨＥＲ３-ＥＣＤに結合するＨＥＲ１／２／-ＥＣＤ-ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、抗ＨＥＲ３選択的ハイブリドーマを選択した。関連したハイブリドーマを、単細胞ＦＡＣＳ選別によりクローニングした。異なったハイブリドーマからの単細胞クローンをインビトロで培養し、特徴付けのために組織培養培地中に抗体を生成させた。抗体を、ＨＥＲ３リン酸化、ＡＫＴリン酸化、及びＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の腫瘍細胞増殖を阻害するそれらの能力を測定することにより、選択した（以下の実施例を参照）。得られた抗体から、一つをさらにヒト化させ、それらのそれぞれのＶＨ及びＶＬ又はＣＤＲを有する、次の抗体Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２及びＭａｂ ２０５．１０．３を得た。
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
一実施態様では、このような抗体を、ヒト由来の定常領域、例えば配列番号：１２−１３を使用して調製した。
【０１０５】
実施例２
結合アッセイ
ａ）ヒトＨＥＲ３ ＥＣＤに結合する抗原特異性ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）に融合した可溶性ヒトＨＥＲ３細胞外ドメインをストレプトアビジンプレートに捕捉させた。ＳＰＢ-ＣＤＣＰ１に対する抗体の最適な結合性を定めるために、MicroCoat, Bernried, Germany(ID-No.1734776-001)から供給された３８４ウェルのポリスチレンプレート（ＮＵＮＣ、ストレプトアビジンでコーティング）を、純粋で段階希釈されたＨＥＫ２９３上清（ＢＳＡ／ＩＭＤＭバッファー：１００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ画分Ｖ、 Roche 10735078001、Iscoveのダルベッコ改変培地に溶解）でコーティングした。マウスキメラ２０５抗体の較正曲線を使用し、マイクロタイタープレートのストレプトアビジン結合能力に関するＨＥＫ２９３上清の最適希釈係数を同定した。標準的なコーティングについて、ＳＢＰ-ＨＥＲ３含有ＨＥＫ２９３上清を希釈し（１：１５から１：４０）、２−８０Ｃで一晩インキュベートした（ウェル当たり２５μｌ）。残りの未結合ＳＢＰ-ＨＥＲ３を除去するために、マイクロタイタープレートを強く洗浄する必要がある。
【０１０６】
本発明の抗体を、未希釈か又は１２段階希釈を使用して試験した。ウェル当たり１２．５μｌの各サンプルを、室温で９０分インキュベートした。ＰＢＳ-Ｔ（ＰＢＳ中に０．１％のトゥイーン２０）、ヒト抗体用の、２５μｌのＨＲＰとカップリングしたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch, Code No: 109-036-098, 希釈率 1:10000）を添加し、１時間インキュベートした。強く洗浄した後、抗体の結合を、ＡＢＴＳ錠（Roche Diagnostics GmbH, Cat.No.: 1112422）で検出した。４０５ｎｍ／４９２ｎｍでの吸光度を標準的な光度計を使用して測定した。
【０１０７】
表は異なった抗体の相対的結合比を示している。
【０１０８】
ｂ）バイアコア分析によるヒトＨＥＲ３の細胞外ドメイン-(ＥＣＤ)断片に対する抗ＨＥＲ３抗体の結合の特徴付け
親和性測定のために、３０μｇ／ｍｌの抗Ｆｃγ抗体（ヤギ由来、Jackson Immuno Research）を、ＳＰＲ機器（Biacore T100）での標準的なアミンカップリング及びブロッキング化学により、ＣＭ-５センサーチップの表面にカップリングさせた。コンジュゲート後、２５℃、５μＬ／分の流量で抗ＨＥＲ３抗体を、続いて３０μＬ／分でヒトＨＥＲ３ ＥＣＤの希釈シリーズ（０ｎＭから１０００ｎＭ）を注入した。結合実験用の流通バッファーとして、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを使用した。ついで、１０ｍＭのグリシン-ＨＣｌ、ｐＨ２．０溶液の６０秒パルスで、チップを再生させた。
【０１０９】
熱力学的パラメーターの算出（ＫＤ、ＨＥＲ３に対する結合定数）を、ラングミュラー１：１結合モデルを使用して算出した。
【０１１０】
競合結合アッセイ（バイアコア）において、Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３は全て同じエピトープに対する結合性を示した。国際公開第２００７／０７７０２８号に記載されている抗ＨＥＲ３抗体Ｕ１-７、Ｕ-５３及びＵ１-５９、及び国際公開第２００８／１００６２４号に記載されているＡｂ＃６を、このようなアッセイで研究し、抗体Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３よりも種々のエピトープに結合することが明らかとなった。
【０１１１】
実施例３
ａ）ＭＣＦ７、ＦａＤｕ及びＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の阻害
アッセイを、次のプロトコルに従い、ＭＣＦ７及びＦａＤｕ細胞において実施した：１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において、ポリ-Ｄ-リジンでコーティングされた９６ウェルプレートに、５０００００細胞／ウェルで細胞を播種する。２４時間インキュベートする。吸引により培地を除去し、０．５％のＦＣＳを含有する５００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０と共に一晩インキュベートする。０．５％のＦＣＳを含有する５００μｌのＲＰＭＩ１６４０に抗体を添加する。１時間インキュベートする。１０分間、ＨＲＧ-１ｂ（最終濃度５００ｎｇ／ｍｌ）を添加する。細胞を溶解させるために培地を除去し、８０μｌの氷冷トリトン-Ｘ-１００細胞溶解バッファーを添加し、氷上で５分インキュベートする。１．５ｍｌの反応チューブに可溶化物を移した後、４℃で１５分、１４０００ｒｐｍで遠心分離し、新たな反応チューブに上清を移動する。ＳＤＳ充填バッファーに同量のタンパク質を含有する試料をＳＤＳ ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に対して半乾燥ウエスタンブロットを使用してブロットした。１×ＮＥＴ-バッファー＋０．２５％のゼラチンにより、１時間、膜をブロックし、ｐＨＥＲ３を、抗体αホスホ-ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３(Ｔｙｒ１２８９）（２１Ｄ３）、Cell Signaking #4791により、ＨＥＲ３を抗体αＥｒｂＢ３(Ｃ-１７)、Santa Cruz, #sc-285により、それぞれ検出した。洗浄及びＰＯＤカップリング二次抗体によるシグナルの検出後、バンドをデンソメーターでスキャンした。抗ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３、さらに国際公開第２００７／０７７０２８号に記載された抗ＨＥＲ３抗体Ｕ１-７、Ｕ-５３及びＵ１-５９、国際公開第２００８／１００６２４号に記載されたＡｂ＃６を調査した。ＭＣＦ７細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を以下と図１Ａに示す。
【０１１２】
【０１１３】
さらなる実験において、抗ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ ２０５．１０．２、さらに国際公開第９７／３５８８５号に記載された抗ＨＥＲ３-抗体８Ｂ８．２Ｄ９、国際公開第２００３／０１３６０２号に記載された１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２を調査した。ＭＣＦ７細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を、以下と図１Ｂに示す。
【０１１４】
【０１１５】
ＦａＤｕ細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を以下に示す。
【０１１６】
さらなる実験において、抗ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ ２０５．１０．２、さらに国際公開第９７／３５８８５号に記載された抗ＨＥＲ３-抗体８Ｂ８．２Ｄ９、国際公開第２００３／０１３６０２号に記載された１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２、及び１０５．５形態(Millipore, Cat.no. 05-47、国際公開第２００３／０１３６０２号においてはα-ＨＥＲＥＤＣと命名)を、Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において調査した。Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞におけるアッセイを、ＭＣＦ７及びＦａＤｕ細胞において上述のプロトコルに従い実施した。細胞数及び培地の体積を、１２ウェルプレートに適応させた。Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を、以下と図１Ｃに示す。
【０１１７】
【０１１８】
ｂ）ＡＫＴリン酸（ＥＬＩＳＡ）
アッセイを、次のプロトコルに従い、ＭＣＦ７細胞で実施した：１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において、ポリ-Ｄ-リジンでコーティングされた９６ウェルプレートに、３００００細胞／ウェルでＭＣＦ７細胞を播種し、２４時間インキュベートする。清浄なペーパータオルで軽くたたくことにより培地を除去し、２００μｌの無血清培地で注意深く洗浄し、０．５％のＦＣＳを含有する１００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０と共に一晩インキュベートする。上述したようにして培地を除去し；０．５％のＦＣＳを含有する１００μｌのＲＰＭＩ１６４０に抗体を添加し、１．５時間インキュベートする。１０分間、ＨＲＧ-１ｂ（最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）を添加する。上述したようにして培地を除去する。細胞を溶解させるために、１００μｌの氷冷細胞溶解バッファーを氷上に添加し、約５×ピペッティングすることにより懸濁させる。４℃で１０分、３０００ｒｐｍでプレートを遠心分離し、新たなポリプロピレンプレートに８０μｌの上清（又はアリコート）を移し、ＬＮ２においてショック凍結させる。アッセイまで−８０℃で保存する。
【０１１９】
ＡＫＴ１，２（ホスホ-Ｓｅｒ４７３）ＥＩＡキットアッセイデザイン＃９００-１６２：試料（１：１０に希釈）を、ＡＫＴのＮ末端に対して特異的なマウスＭＡＢでコーティングされたプレートに添加する。振揺させつつ、室温で１時間インキュベートする。５×洗浄し、振揺させつつ、室温で１時間、ビオチン化抗ホスホ-ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）と共にインキュベートする。５×洗浄し、振揺させつつ、室温で３０分、ストレプトアビジン-ＨＲＰコンジュゲートと共にインキュベートする。５×洗浄し、振揺させつつ、室温で３０分、ＴＭＢ基質と共にインキュベートする。停止させ、４５０ｎｍで読み取る。
【０１２０】
Ｍａｂ ２０５．１０．２は、０．０６μｇ／ｍｌのＡＫＴリン酸化阻害のＩＣ５０を示した。
【０１２１】
ＭＣＦ７細胞で記載したようにして実施したＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞におけるｐＡＫＴ ＥＬＩＳＡにおいて、Ｍａｂ ２０５．１０．２は０．２８μｇ／ｍｌのＡＫＴリン酸化阻害のＩＣ５０を示し、全ての他の分析抗体は、(＞)５０以上のＩＣ５０を示した。
【０１２２】
ｃ）腫瘍細胞増殖の阻害
ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞（ＶＩＩヒト乳癌細胞、ATCCカタログ番号HTB-25）を使用し、細胞増殖アッセイにおける、ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３の抗-腫瘍効果を評価した。ウェル当たり２００００細胞を、１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培養培地が入った滅菌９６ウェル組織培養プレートに播種し、１日３７℃±１℃、５％±１％のＣＯ２においてインキュベートした。細胞は、約１．５日の倍加時間、ゆっくりと増殖する細胞である。抗ＨＥＲ３抗体を一連の希釈をし、さらに６日間インキュベートした。ついで、細胞生存率を、アラマーブルー(登録商標)読み取りを使用して評価した。細胞生存率がコントロールの５０％以上に低減しているならば、ＩＣ５０値を、各抗体濃度について３回の平均を使用して算出し、最も高い濃度で細胞生存率の阻害度％が５０％以下であるならば、ＩＣ５０は算出できないものとし、ＩＣ５０[ｍｇ／ｍｌ]が最も高い濃度以上(＞)であることが示される。また、国際公開第２００７／０７７０２８号に記載された抗ＨＥＲ３抗体Ｕ１-５９、及び国際公開第２００８／１００６２４号に記載されたＡｂ＃６も調べた。
【０１２３】
さらなる実験において、国際公開第９７／３５８８５号に記載された抗ＨＥＲ３抗体８Ｂ８．２Ｄ９、及び国際公開第２００３／０１３６０２号に記載された１Ｂ４Ｃ３についても調べた。
【０１２４】
実施例５
１μｇ／ｍｌのｓｐｅｃＬｙｓｉｓ％によるＫＬＰ-腫瘍細胞におけるインビトロＡＤＣＣ
標的細胞ＫＰＬ４(ＡＤＣＣ）、乳癌、ＲＰＭＩ１６４０＋２ｍＭのＬ-アラニル-Ｌ-グルタミン＋１０％のＦＣＳ)で培養を、指数関数的増殖相において、トリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco # 25300-054)と共に収集した。洗浄工程、及び細胞数と生存率のチェック後、必要なアリコートを、カルセイン（Invitrogen #C3100MP；１バイアルを、５ｍｌの培地に、５ミオ細胞に対して５０μｌのＤＭＳＯに再懸濁させた）を用い、細胞インキュベーター内において、３７℃で３０分、ラベリングした。その後、ＡＩＭ-Ｖ培地で細胞を３回洗浄し、細胞数及び生存率をチェックし、細胞数を０．３Ｍｉｏ／ｍｌに調節した。
【０１２５】
その間に、エフェクター細胞としてのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、製造者のプロトコル（洗浄工程を４００ｇで１×、３５０ｇで２×、各１０分）に従い、密度勾配遠心分離（Histopaque-1077, Sigma # H8889）により調製した。細胞数及び生存率をチェックし、細胞数を１５Ｍｉｏ／ｍｌに調節した。
【０１２６】
１００μｌのカルセイン染色された標的細胞を、丸底９６ウェルプレートに配し、５０μｌに希釈し、アフコシル化抗体（Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、Ｍａｂ ２０５．１０．３、以下を参照）を添加し、５０μｌのエフェクター細胞を添加した。いくつかの実施態様では、標的細胞をRedimune(登録商標)NFリキッド(ZLB Behring)と、１０ｍｇ／ｍｌのRedimune濃度で混合した。
【０１２７】
抗体なしに標的とエフェクター細胞を同時培養することにより決定して自然な溶解がコントロールとなり、最大溶解が、標的細胞のみの１％のトリトン-Ｘ-１００溶解により決定される。プレートを、加湿された細胞インキュベーターにおいて３７℃で４時間インキュベートした。
【０１２８】
標的細胞の死滅を、製造者の使用説明書に従い、細胞傷害検出キット（LDH Detection Kit, Roche # 1 644 793）を使用し、ダメージを受けた細胞から放出されるＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）を測定することにより評価した。簡単に述べると、各ウェルからの１００μｌの上清を、透明な平底の９６ウェルプレートにおいて、キットからの１００μｌの基質と混合した。基質の色調反応のＶｍａｘ値を、少なくとも１０分、４９０ｎｍにてＥＬＩＳＡリーダーで測定した。特定の抗体媒介性死滅のパーセンテージを、次のようにして算出した：（(Ａ−ＳＲ)／(ＭＲ−ＳＲ)×１００、ここでＡは特定の抗体濃度におけるＶｍａｘの平均であり、ＳＲは自然放出のＶｍａｘの平均であり、ＭＲは最大放出のＶｍａｘの平均である。
【０１２９】
付加的な読み取りとして、インタクトな標的細胞のカルセイン保持を、ホウ酸塩バッファー（５ｍＭのホウ酸ナトリウム＋０．１％のトリトン）において、残存している標的細胞を溶解させ、蛍光プレートリーダーにおけるカルセイン蛍光を測定することによって評価した。Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、Ｍａｂ２０５．１０．３は、約４０−６０％の１μｇ／ｍｌの特定溶解によってＡＤＣＣ［ＫＰＬ-４］を示した。
【０１３０】
アフコシル化抗体（Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、Ｍａｂ ２０５．１０．３）を、２つは抗体発現用、１つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用（ＧｎＴ-ＩＩＩ発現ベクター）、及び１つはマンノシダーゼＩＩ発現用で、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞におけるその比率がそれぞれ４：４：１：１である４つのプラスミドを用いて同時形質移入することにより調製した。
【０１３１】
全長抗体の重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列を、ＭＰＳＶプロモーターのコントロールの存在下、また合成ポリＡ部位の上流で、哺乳動物発現ベクター（一つは軽鎖用、一つは重鎖用）内でサブクローンし、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を担持している。抗体を、リン酸カルシウム-形質移入アプローチを使用し、抗体の重鎖及び軽鎖発現ベクターを用い、ＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞又はＣＨＯ細胞を同時形質移入させることにより調製した。指数関数的に増殖するＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞を、リン酸カルシウム法により形質移入させた。糖鎖操作抗体を生産するために、細胞を、２つは抗体発現用、１つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用（ＧｎＴ-ＩＩＩ発現ベクター）、及び１つはマンノシダーゼＩＩ発現用で、それぞれ４：４：１：１の比率である４つのプラスミドを用いて同時形質移入した。細胞を、１０％のＦＣＳが補填されたＤＭＥＭ培養培地を使用し、Ｔフラスコにおいて粘着性のある単層培養体として増殖させ、それらが５０〜８０％のコンフルエントになった時に形質移入させた。Ｔ１５０フラスコでの形質移入のために、１５００００００の細胞を、ＦＣＳが補填された２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地（最終的に１０％のＶ／Ｖ）に形質移入する２４時間前に播種し、細胞を、５％のＣＯ２雰囲気にて一晩、３７℃のインキュベーターに配した。生産される全ての抗体について、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液を、１８８μｌの全プラスミドベクターＤＮＡ（２つは抗体発現用（１つは軽鎖、１つは重鎖）、１つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用（ＧｎＴ-ＩＩＩ発現ベクター）、及び１つはマンノシダーゼＩＩ発現用（ゴルジマンノシターゼＩＩ発現ベクター）で、それぞれ４：４：１：１の比率である４つのプラスミド）、最終容量が９３８μｌになるまで水と、また９３８μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液と混合することによって調製した。この溶液に、１８７６μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液、ｐＨ７．０５を添加し、すぐに１０秒混合し、室温で２０秒放置した。懸濁液を、２％のＦＣＳが補足された４６ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、存在する培地の代わりに、２つのＴ１５０フラスコ分けた。
【０１３２】
細胞を、３７℃、５％のＣＯ２にて、１７〜２０時間インキュベートし、ついで培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳで置き換えた。調製された培養培地を、２１０×ｇで１５分遠心分離することにより、形質移入の７日後に収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度が０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを添加し、４℃で保持した。
【０１３３】
分泌されたアフコシル化抗体を精製し、抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖を、例えばＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳにより（例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載したようにして）分析した。この分析のために、オリゴ糖を、ＰＶＤＦ膜に固定されたか、又は溶液中にある抗体を用い、ＰＮＧアーゼ消化することで抗体から酵素的に放出させた。放出されたオリゴ糖を含有する得られた消化溶液は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳ分析用に直接調製されるか、又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳ分析用にサンプルを調製する前に、ＥｎｄｏＨグリコシターゼでさらに消化させた。Ａｓｎ２９７での、糖鎖内のフコースの分析量は５０−２０％であった。
【０１３４】
実施例６
インビボ抗腫瘍効果
抗体Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、Ｍａｂ ２０５．１０．３のインビボ抗腫瘍効果は、ＳＣＩＤべージュ又はヌードマウスに移植された種々の腫瘍由来（例えば、肺癌、ＳＣＣＨＮ、乳癌及び膵臓癌）の細胞及び断片ベースのモデルにおいて検出可能であった。実施例として、データを、ＳＣＣＨＮ異種移植モデルＦａＤｕ（細胞株ベース）、乳癌モデルＭＡＸＦ４４９（断片ベース）、及びＮＳＣＬＣモデル７１７７（断片ベース）について示している。
【０１３５】
試験剤
アフコシル化されたＭａｂ ２０５．１０．２（図２、３、４においてはＭａｂ ２０５と命名）を、Roche, Penzberg, Germanyからの保存溶液として提供された。抗体バッファーはヒスチジンを含有していた。抗体溶液を、注射前に原液からバッファーで適切に希釈した。
【０１３６】
細胞株及び培養条件
ＦａＤｕヒトＨＮＳＣＣ細胞を、最初にＡＴＣＣから得た。腫瘍細胞株を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ-グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び０．１ｍＭのＮＥＡＡが補足されたＭＥＭイーグル培地において、水分飽和した５％ＣＯ２の雰囲気にて３７℃で常套的に培養した。培養継代を、３日毎に分けて、トリプシン／ＥＤＴＡ１ｘを用いて実施した。
【０１３７】
腫瘍断片
腫瘍断片を、最初に患者から取り出し、ヌードドナーマウスに皮下移植した。続いて、腫瘍断片をインビボで連続継代した。前臨床研究用に、小さな腫瘍断片をドナーマウスから得、さらなるヌードマウス（ＭＡＸＦ４４９、７１７７）に皮下的に配した。
【０１３８】
動物
メスのＳＣＩＤベージュ又はヌードマウスを、ブリーダーから購入し（例えば、Charles River, Sulzfeld, Germany）、関連するガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、毎日、１２時間は明所、１２時間は暗所のサイクルで、特異的病原体のいない条件下で保持した。実験的な研究プロトコルは再考されており、地方自治体により承認されている。到着後、動物を１週間、動物施設の検疫部に保持し、新規の環境及び観察用に慣らした。連続的な健康モニタリングを定期的基準において実施した。ダイエット食品(Provimi Kliba 3337)及び水(ｐＨ ２．５-３に酸性化)を自由裁量で提供した。
【０１３９】
モニタリング
動物を、臨床的兆候及び副作用の検出について、毎日管理した。実験を通してモニタリングのために動物の体重を記録した。
【０１４０】
動物の処置
動物のランダム化後、平均腫瘍サイズが約１００−１５０ｍｍ３である場合は、細胞又は断片の移植後、 動物の処置を開始した。抗体を、モデルに応じて、３−６週間、週に１度、１０又は２５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．ｑ７ｄで、単一薬剤として投与した。対応するビヒクルを同じ日に投与した。
【０１４１】
抗体の効果
Ａ）ＦａＤｕ ＨＮＳＣＣ異種移植
ＦａＤｕ ＨＮＳＣＣ異種移植を担持するマウスを、研究日１４から３５に抗体Ｍａｂ ２０５．１０．２で処置した。その結果、Ｍａｂ ２０５．１０．２抗体での処置により、ｓ．ｃ．ＦａＤｕ異種移植の腫瘍停止を伴う、有意な抗腫瘍有効性が示された。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は９８％と算出された。
Ｍａｂ ２０５(１０ｍｇ／ｋｇ ｑ７ｄｘ３、ｉ．ｐ．）を用いた処置により、異種移植が移植されたＦａＤｕ ＳＣＣＨＮの腫瘍停止に至った（図２を参照）。
【０１４２】
Ｂ）ＭＡＸＦ４４９乳癌異種移植
ＭＡＸＦ４４９乳癌異種移植を担持するマウスを、研究日６４から９１に抗体Ｍａｂ ２０５．１０．２で処置した。その結果、Ｍａｂ ２０５．１０．２抗体での処置により、ＭＡＸＦ４４９異種移植の腫瘍停止を伴う、有意な抗腫瘍有効性が示された。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は１００％超であった。
Ｍａｂ ２０５（１０ｍｇ／ｋｇ ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．）を用いた処置により、異種移植が移植されたＭＡＸＦ４４９乳癌の腫瘍停止に至った（図３を参照）。
【０１４３】
Ｃ）７１７７ＮＳＣＬＣ異種移植片
７１７７ＮＳＣＬＣ異種移植片を担持するマウスを、研究日２８から５６に抗体Ｍａｂ ２０５．１０．２で処置した。その結果、Ｍａｂ ２０５．１０．２抗体での処置により、７１７７ＮＳＣＬＣ異種移植片の腫瘍停止を伴う、有意な抗腫瘍有効性が示された。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は１００％超であった。
Ｍａｂ ２０５(２５ｍｇ／ｋｇ ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．）を用いた処置により、異種移植が移植された７１７７ＮＳＣＬＣの腫瘍停止に至った（図４を参照）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体（抗ＨＥＲ３抗体）、それらの製造方法、該抗体を含有する薬学的組成物、及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＨＥＲ３（ＥｒｂＢ-３、ＥＲＢＢ３、ｃ-ｅｒｂＢ-３、ｃ-ｅｒｂＢ３、レセプターチロシン-プロテインキナーゼ、配列番号：１７）は、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲとしても知られている）、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ４（Kraus, M.Hら, PNAS 86(1989) 9193-9197；Plowman, G.Dら, PNAS 87(1990) 4905-4909；Kraus, M.Hら, PNAS 90(1993) 2900-2904）もまた含むレセプターチロシンキナーゼの上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーをコードする。プロトタイプの上皮増殖因子レセプターと同様に、膜貫通レセプターＨＥＲ３は、細胞外リガンド結合ドメイン（ＥＣＤ）、ＥＣＤ内の二量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメイン（ＴＫＤ）、及びＣ-末端リン酸化ドメインからなる。この膜結合タンパク質は、細胞外ドメイン内にＨＥＲ３、ヘレグリン（ＨＲＧ）結合ドメインを有するが、活性なキナーゼドメインは持たない。よって、それはこのリガンドへの結合は可能であるが、タンパク質のリン酸化を介して細胞にシグナルを運ぶことはできない。しかしながら、それは、キナーゼ活性を有する他のＨＥＲファミリーのメンバーとは、ヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体化により、その細胞内ドメインのトランスリン酸化及びレセプター-媒介性シグナル伝達経路の活性化を生じる。ＨＥＲファミリーメンバー間の二量体形成は、ＨＥＲ３のシグナル伝達の可能性を拡大させ、シグナル多様化のためだけでなく、シグナル増幅のための手段である。例えば、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、ＨＥＲファミリーメンバーの中でも、ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴ経路を介した最も重要な分裂促進シグナルの一つを誘導する（Sliwkowski M.Xら, J. Biol. Chem. 269(1994)14661-14665；Alimandi Mら, Oncogene. 10(1995) 1813-1821；Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276(2001) 42153-4261；Singer, E., J. Biol. Chem. 276(2001) 44266-44274；Schaefer, K.L., Neoplasia 8(2006) 613-622）。
【０００３】
この遺伝子の増幅及び／又はそのタンパク質の過剰発現は、前立腺、膀胱及び乳腺の腫瘍を含む多くの癌で報告されている。異なったアイソフォームをコードする選択的転写スプライスバリアントが特徴付けられている。一アイソフォームは膜間領域を欠き、細胞の外に分泌される。この形態は、膜結合型の活性を調節するように作用する。付加的なスプライスバリアントも報告されているが、十分に特徴付けられてはいない。
【０００４】
国際公開第９７／３５８８５号はＨＥＲ３抗体に関連している。国際公開第２００３／０１３６０２号は、ＨＥＲ抗体を含むＨＥＲ活性のインヒビターに関連している。国際公開第２００７／０７７０２８号及び国際公開第２００８／１００６２４号も、ＨＥＲ３抗体に関連している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１Ｌ領域又は配列番号：７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体を含む。
【０００６】
本発明は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１０であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１１であることを特徴とする本発明の抗体；又はそのヒト化型をさらに含む。
【０００７】
本発明は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする抗体をさらに含む。
【０００８】
本発明は、配列番号：８の重鎖可変ドメインＶＨ；及び配列番号：９又は配列番号：１１の軽鎖可変ドメインＶＬを含む抗体をさらに含む。
【０００９】
本発明は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：７のＣＤＲ１Ｌ領域を含む抗体をさらに含む。
【００１０】
本発明は、配列番号：８の重鎖可変ドメインＶＨ；及び配列番号：１０の軽鎖可変ドメインＶＬを含む抗体をさらに含む。
【００１１】
本発明の他の態様は、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、配列番号：８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインＶＨ、及び配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含む抗体を提供する。
【００１２】
一実施態様では、本発明の抗体は、抗体がモノクローナルであることを特徴とする。
【００１３】
一実施態様では、本発明の抗体は、抗体がヒト化されていることを特徴とする。
【００１４】
一実施態様では、本発明の抗体は、抗体がＩｇＧ１又はＩｇＧ４サブクラスであることを特徴とする。
【００１５】
本発明は、本発明の抗体を含有することを特徴とする薬学的組成物をさらに含む。
【００１６】
本発明は、癌の治療のための本発明の抗体をさらに含む。
【００１７】
本発明は、癌の治療のための医薬の製造における本発明の抗体の使用をさらに含む。
【００１８】
本発明は、本発明の抗体を患者に投与することを特徴とする、癌に罹患している患者を治療する方法をさらに含む。
【００１９】
本発明の他の態様は、ここで提供される抗ＨＥＲ３抗体の重鎖と軽鎖をコードする核酸を提供する。一実施態様では、抗体は、配列番号：８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含む。
【００２０】
本発明は、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体の重鎖と軽鎖をコードする核酸をさらに含み、該抗体は、配列番号：８の可変ドメインＶＨ；及び配列番号：８、配列番号：１０、又は配列番号：１１の軽鎖可変ドメインＶＬ；又はそのヒト化型を含むことを特徴とする。
【００２１】
本発明は、原核生物又は真核生物の宿主細胞に、本発明の抗体を発現させるための本発明の核酸を含有することを特徴とする発現ベクターをさらに含む。
【００２２】
本発明は、本発明のベクターを含有する原核生物又は真核生物の宿主細胞をさらに含む。
【００２３】
本発明は、原核生物又は真核生物の宿主細胞において本発明の核酸を発現させ、該細胞又は細胞培養物の上清から上記抗体を回収することを特徴とする、本発明の組換え抗体を生産する方法をさらに含む。
【００２４】
驚くべきことに、本発明の抗体が、優れた薬物動態特性（例えば、長い半減期等）、ＨＥＲ３に対する高度な結合親和性、癌細胞の増殖に関連し、（例えば、ＨＥＲ３リン酸化及びＡＫＴリン酸化等の）ＨＥＲ３媒介性シグナル伝達の強力な阻害、ＨＥＲ３発現癌細胞の強力な増殖阻害等の非常に貴重な特性を有することが見いだされた。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１Ｌ領域又は配列番号：７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体を含む。
【００２６】
本発明は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１０であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１１であることを特徴とする本発明の抗体；又はそのヒト化型をさらに含む。
【００２７】
本発明は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１０であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１１であることを特徴とする本発明の抗体をさらに含む。
【００２８】
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする。
【００２９】
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１１であることを特徴とする。
【００３０】
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする。
【００３１】
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１０であることを特徴とする。
【００３２】
一実施態様では、本発明の抗体はモノクローナルである。一実施態様では、本発明の抗体はヒト化又はヒトである。一実施態様では、本発明の抗体はＩｇＧ１、又はＩｇＧ４サブクラスである。一実施態様では、本発明の抗体はＩｇＧ１サブクラスのモノクローナルヒト化抗体である。一実施態様では、本発明の抗体は、Ａｓｎ２９７で糖鎖でグリコシル化されており、よって該糖鎖内のフコース量が６５％以下であることを特徴とする抗体である。
【００３３】
本発明は、それぞれＶＨ及びＶＬ又はＣＤＲを有するヒト化抗体Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３を含む。
一実施態様では、このような抗体は、例えば配列番号：１２−１６、好ましくは配列番号：１２−１３等の、ヒト由来の定常領域を含む。
【００３４】
「抗体」なる用語は、種々の形態の抗体構造を包含し、限定されるものではないが、全抗体及び抗体断片を含む。本発明の抗体は、好ましくはヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は本発明の特徴的特性が保持されている限り、さらに遺伝子改変された抗体である。
【００３５】
「抗体断片」は全長抗体の一部、好ましくはその可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例には、ダイアボディ、単鎖抗体分子、及び多重特異性抗体で、抗体断片から形成されたものが含まれる。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96に記載されている。さらに、抗体断片は、ＶＨドメイン、すなわちＶＬドメインと共にアセンブリ可能である、又はＨＥＲ３に結合するＶＬドメイン、すなわち機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共にアセンブリ可能であるという特徴を有し、よって本発明の抗体の特徴を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００３６】
ここで使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物を意味する。
【００３７】
「キメラ抗体」なる用語は、マウスからの可変領域、すなわち結合領域と、異なった供給源又は種から誘導された、通常は組換えＤＮＡ技術により調製される定常領域の少なくとも一部を含むモノクローナル抗体を意味する。マウス可変領域とヒト定常領域を含むキメラ抗体が特に好ましい。このようなラット／ヒトキメラ抗体は、ラット免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメントと、ヒト免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。本発明に包含される「キメラ抗体」の他の形態は、クラス又はサブクラスが元々の抗体のものから修飾され又は変化させられたものである。このような「キメラ」抗体は、「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体を生産するための方法には、今は当該技術分野でよく知られている一般的な組換えＤＮＡ及び遺伝子形質移入技術が含まれる。例えば、Morrison, S.Lら, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81(1984) 6851-6855；米国特許第５２０２２３８号及び米国特許第５２０４２４４号を参照。
【００３８】
「ヒト化抗体」又は「抗体のヒト化型」なる用語は、フレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が修飾されて、親免疫グロブリンのものと比較して、異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変された抗体を意味する。好ましい実施態様では、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲは、ヒト抗体のフレームワーク領域にグラフトされて、「ヒト化抗体」が調製される。例えば、 Riechmann, Lら, Nature 332(1988) 323-327；及びNeuberger, M.Sら, Nature 314(1985) 268-270を参照。重鎖及び軽鎖の可変フレームワーク領域は、同一又は異なるヒト抗体配列から誘導されうる。ヒト抗体配列は天然に生じるヒト抗体の配列でありうる。ヒト重鎖及び軽鎖可変フレームワーク領域は、Lefranc, M.-P., Current Protocols in Immunology(2000) - Appendix 1P A.1P.1-A.1P.37に列挙されており、ＩＭＧＴ、国際免疫遺伝学的情報システム(international ImMunoGeneTics information system)(登録商標)(http://imgt.cines.fr) 又はhttp://vbase.mrc-cpe.cam.ac.ukによってアクセス可能である。場合によっては、フレームワーク領域をさらなる変異により修飾することもできる。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体に対して上述した抗原を認識する配列を表すものに相当する。好ましくは、このようなヒト化型はヒト定常領域でキメラ化される（例えば、配列番号：１２−１６の配列を参照）。ここで使用される「ヒト化抗体」なる用語は、「クラススイッチング」により、すなわちＦｃ部の変化又は変異（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４、及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異）により、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、本発明の特性を生じさせるために、定常領域が修飾されたこのような抗体をまた含む。
【００３９】
ここで使用される「ヒト抗体」なる用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から由来する可変及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。ヒト抗体は従来技術でよく知られている（van Dijk, M.A.及び van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001) 368-374）。またヒト抗体は、免疫化において、内在性免疫グロブリン生成の不在下において、ヒト抗体の選択、又は全レパートリーを生成可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)で生成可能である。このような生殖系列変異マウスへの、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動により、抗原曝露でヒト抗体が生成される（例えば、Jakobovits, Aら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993) 2551-2555；Jakobovits, Aら, Nature 362(1993) 255-258；Brueggemann, M.Dら, Year Immunol. 7(1993) 33-40）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにおいても生成可能である（Hoogenboom, H.R., 及び Winter, G., J. Mol. Biol. 227(1992) 381-388；Marks, J.Dら, J. Mol. Biol. 222(1991) 581-597）。また、Cole, Aら及びBoerner, Pらの技術は、ヒトモノクローナル抗体の生成に有用である（Cole, Aら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A.L., p. 77(1985)；及びBoerner, Pら, J. Immunol. 147(1991) 86-95）。本発明のヒト化抗体について上述したように、ここで使用される場合、「ヒト抗体」なる用語は、「クラススイッチ」により、すなわちＦｃ部の変化又は変異(例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４、及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４変異)により、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、本発明の特性を生じさせるために、定常領域が修飾されたこのような抗体を含む。
【００４０】
ここで使用される場合、「組換えヒト抗体」なる用語は、宿主細胞に形質移入された組換え発現ベクターを使用し、発現したヒト免疫グロブリン遺伝子又は抗体用のトランスジェニックである動物(例えばマウス)から、又はＮＳ０又はＣＨＯ細胞等の宿主細胞から単離された抗体等、組換え手段により調製、発現、生成又は単離された全てのヒト抗体を含むことを意図している。このような組換えヒト抗体は、再配列された形態で、可変及び定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、インビボ体細胞突然変異を受ける。よって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列から誘導され、関連しているので、 インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しないであろう配列である。
【００４１】
ここで使用される場合、「ヒトＨＥＲ３に結合」、「ヒトＨＥＲ３に特異的に結合」、又は「抗ＨＥＲ３抗体」は交換可能であり、２５℃で１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ-値、一実施態様では２５℃で１．０×１０−９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ-値の結合親和性を有する、ヒトＨＥＲ３抗原に特異的に結合する抗体を称する。結合親和性は２５℃で標準的な結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴技術(BIAcore(登録商標), GE-Healthcare Uppsala, Sweden)を用いて測定される。結合親和性のＫＤ-値を測定するための方法は、実施例２ｂ)に記載されている。よって、ここで使用される場合、「ヒトＨＥＲ３に結合する抗体」とは、２５℃でＫＤ１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ以下(好ましくは、１．０×１０−８ｍｏｌ／ｌ-１．０×１０−１２ｍｏｌ／ｌ)の結合親和性を有する、ヒトＨＥＲ３抗原に特異的に結合する抗体を称する。
【００４２】
ヒトＨＥＲ３(ＥｒｂＢ-３、ＥＲＢＢ３、ｃ-ｅｒｂＢ−３、ｃ-ｅｒｂＢ３、レセプターチロシン-プロテインキナーゼｅｒｂＢ-３、配列番号：１７)は、ＨＥＲ１(ＥＧＦＲとしても知られている）、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ４も含む、レセプターチロシンキナーゼの上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)ファミリーのメンバーをコードする(Kraus, M.Hら, PNAS 86(1989), 9193-9197; Plowman, G.Dら, PNAS 87(1990), 4905-4909; Kraus, M.Hら, PNAS 90(1993), 2900-2904)。プロトタイプの上皮増殖因子レセプターと同様、膜貫通レセプターＨＥＲ３は、細胞外リガンド-結合ドメイン(ＥＣＤ）、ＥＣＤ内の二量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内タンパク質チロシンキナーゼドメイン(ＴＫＤ）、及びＣ-末端リン酸化ドメインからなる。この膜結合タンパク質は、ＨＥＲ３、細胞外ドメイン内のヘレグリン(ＨＲＧ)結合ドメインを有するが、活性キナーゼドメインは有さない。よって、このリガンドへの結合は可能であるが、タンパク質のリン酸化を介して、細胞にシグナルを伝達することはできない。しかしながら、キナーゼ活性を有する他のＨＥＲファミリーのメンバーとは、ヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体化により、その細胞内ドメインのトランスリン酸化及びレセプター媒介性シグナル伝達経路の活性化に至る。ＨＥＲファミリーメンバー間の二量体形成は、ＨＥＲ３のシグナル伝達の可能性を拡大させ、シグナル多様化のためだけでなく、シグナル増幅のための手段である。例えば、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、ＨＥＲファミリーメンバーの中でも、ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴ経路を介した、最も重要な分裂促進シグナルの一つを誘発する(Sliwkowski M.Xら, J. Biol. Chem. 269(1994)14661-14665; Alimandi Mら, Oncogene. 10(1995) 1813-1821; Hellyer, N.J., J. Biol. Chem. 276(2001) 42153-4261; Singer, E., J. Biol. Chem. 276(2001) 44266-44274; Schaefer, K.L., Neoplasia 8(2006) 613-622)。
【００４３】
ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３は、ＨＥＲ３に対し、リガンドヘルグリン（ＨＲＧ）との競合的結合を示す。
【００４４】
この遺伝子の増幅及び／又はそのタンパク質の過剰発現は、前立腺、膀胱及び乳腺の腫瘍を含む、多くのがんで報告されている。種々のアイソフォームをコードする選択的転写スプライスバリアントが特徴付けられている。一アイソフォームは膜間領域を欠き、細胞の外に分泌される。この形態は、膜結合形態の活性を調節するように作用する。付加的なスプライスバリアントも報告されているが、十分に特徴付けられているわけではない。
【００４５】
「エピトープ」なる用語は、抗体に特異的に結合可能な任意のポリペプチド決定基を含む。ある種の実施態様では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニル等の、分子の化学的に活性な表面グルーピングを含み、ある実施態様においては、特異的な３次元構造的特性、又は特異的な電荷特性を有し得る。
【００４６】
ここで使用される場合、「本発明の抗体の可変ドメイン」(軽鎖の可変ドメイン(ＶＬ)、重鎖の可変ドメイン(ＶＨ))は、抗原への抗体の結合に直接関与している、軽鎖及び重鎖ドメイン対のそれぞれを示す。軽鎖及び重鎖の可変ドメインは同様の一般構造を有し、各ドメインは、その配列が広範囲に保存されており、３つの「高頻度可変領域」(又は相補性決定領域、ＣＤＲ)により結合している、４つのフレームワーク(ＦＲ)領域を含む。フレームワーク領域はβ-シート立体構造を採用し、ＣＤＲはβ-シート構造に結合するループを形成可能である。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域により３次元構造に保持され、他の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明の抗体の結合特異性／親和性において、特に重要な役割を担っており、よって本発明のさらなる目的を提供する。
【００４７】
ここで使用される場合、「抗体の抗原結合部分」なる用語は、抗原結合の原因となる、抗体のアミノ酸残基を称する。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。本発明の抗体の「抗原-結合部分」なる用語は、抗原に対する結合部位の親和性の様々な程度の原因である、６つの相補性決定領域(ＣＤＲ)を含む。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲ(ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３)、及び３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲ(ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。「ＣＤＲＨ１」なる用語は、カバットに従い算出される重鎖可変領域のＣＤＲ１領域を示す。ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、重鎖(Ｈ)又は軽鎖(Ｌ)からのそれぞれの領域を意味する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域(ＦＲ)の範囲は、それらの領域が、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)の配列における可変性に従い定められている、アミノ酸配列のコンパイルデータベースと比較することにより決定される。
【００４８】
本発明の「Ｆｃ部分」は、抗原に対する抗体の結合性には直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は当業者によく知られた用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定められる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのクラスに分けられ：これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けられる。重鎖定常領域に応じて、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体のＦｃ部分は、補体活性に基づき、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）、Ｃ１ｑ結合性及びＦｃレセプター結合性に直接関与している。「補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）」なる用語は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ領域への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始されるプロセスを示す。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位での、明確なタンパク質-タンパク質相互作用によって生じる。このような結合部位は従来技術で知られているであり、例えばBoackle, R.Jら, Nature 282(1979) 742-743, Lukas, T.Jら, J. Immunol. 127(1981) 2555-2560, Brunhouse, R., 及び Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16(1979) 907-917, Burton, D.Rら, Nature 288(1980) 338-344, Thommesen, J.Eら, Mol. Immunol. 37(2000) 995-1004, Idusogie, E.Eら, J. Immunol.164(2000) 4178-4184, Hezareh, Mら, J. Virology 75(2001) 12161-12168, Morgan, Aら, Immunology 86(1995) 319-324, 欧州特許第0 307 434号に記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９である(Kabat, E.AのＥＵ指標に従い番号付け、以下参照)。通常、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は補体活性、及びＣ１ｑ及びＣ３結合を示すが、ＩｇＧ４は補体系を活性化させず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。
【００４９】
一実施態様では、本発明の抗体は、ヒト由来から誘導されたＦｃ部分、好ましくはヒト定常領域の全ての他の部分を含む。ここで使用される場合、「ヒト由来から誘導されたＦｃ部分」なる用語は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒト抗体のＦｃ部分、例えばヒトＩｇＧ１サブクラスからのＦｃ部分、ヒトＩｇＧ１サブクラスからの変異Ｆｃ部分(好ましくは、Ｌ２３４Ａ＋Ｌ２３５Ａに変異を有する）、ヒトＩｇＧ４サブクラスからのＦｃ部分、又はヒトＩｇＧ４サブクラスからの変異Ｆｃ部分(好ましくは、Ｓ２２８Ｐに変異を有する）のいずれかである、Ｆｃ部分を示す。配列番号：１３(ヒトＩｇＧ１サブクラス）、配列番号：１４(変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラス)のヒト重鎖定常領域が好ましい。
【００５０】
一実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１サブクラス又はヒトＩｇＧ３サブクラスのものである。一実施態様では、本発明の抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。
【００５１】
一実施態様では、本発明の抗体は、定常ドメインがヒト由来のものであることを特徴とする。このような定常ドメインは従来技術でよく知られており、例えばKabat, E.A.,(例えば、Johnson, G. 及び Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28(2000) 214-218を参照)に記載されている。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号：１３のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号：１２のカッパ-軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
この出願内で使用される「アミノ酸」なる用語は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、自然に生じるカルボキシα-アミノ酸の群を示す。
【００５３】
ここで使用される場合、「核酸」又は「核酸分子」なる用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図している。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、他の核酸と機能的関係に位置している場合は、「作用可能に結合」している。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているならば、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが常套的な手法に従って使用される。ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」なる表現は交換可能に使用され、全てのこのような意味には子孫が含まれる。よって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」なる用語には、初代の対照細胞、及び移動の回数に関係なくそこから得られた培養体も含まれる。また、全ての子孫は、計画的又は偶発的変異により、ＤＮＡ量において、厳密には同一でない可能性もあると理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされた場合、同じ機能又は生物活性を有する変異子孫も含まれる。
【００５４】
本発明の抗体は、好ましくは、定常鎖がヒト由来のものであることを特徴とする。このような定常鎖は従来技術ではよく知られており、例えばKabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載されている。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号：１２のカッパ-軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。例えば有用なヒト重鎖定常領域は配列番号：１３〜１６を含む。
【００５５】
本発明のさらなる実施態様は、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸である。
【００５６】
本発明の抗体には、さらに「保存配列修飾」(変異抗体)、ヌクレオチド、及び本発明の抗体の上述した特徴が影響を受けていない又は変化していないアミノ酸配列修飾を有するこのような抗体が含まれる。修飾は、当該技術で知られているの標準的技術、例えば部位指向性変異原性及びＰＣＲ媒介性変異原性により導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるものが含まれる。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術で定められている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷の極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ-分枝状側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。よって、ヒト抗ＨＥＲ３抗体において予知される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同様の側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができる。よって、「変異」抗ＨＥＲ３抗体は、ここでは親抗体の一又は複数の可変領域において、１０まで、好ましくは約２〜約５の付加、欠失及び／又は置換により、「親」抗ＨＥＲ３抗体アミノ酸配列とは、アミノ酸配列が異なっている分子を称する。アミノ酸置換は、Riechmann, Lら, Nature 332 (1988) 323-327 及び Queen, Cら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-1003により記載されているような、分子モデリングに基づく変異原性により実施することができる。
【００５７】
他の態様では、本発明の抗ＨＥＲ３抗体は、配列番号：８のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(ＶＨ)配列を含む。ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲ３に結合する能力を保持している。ある実施態様においては、全体で１〜１０のアミノ酸が、配列番号：８にて、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様においては、置換、挿入又は欠失は、ＣＤＲの外側領域(すなわち、ＦＲ)で生じている。場合によっては、抗ＨＥＲ３抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号：８にＶＨ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＨは：(ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１Ｈ、(ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２Ｈ、及び(ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３Ｈから選択される、１、２又は３のＣＤＲを含む。
【００５８】
他の態様では、本発明の抗ＨＥＲ３抗体は、配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)配列を含む。ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列に対して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ＨＥＲ３抗体は、ＨＥＲに結合する能力を保持している。ある実施態様においては、全体で１〜１０のアミノ酸が、配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１にて、置換、挿入及び／又は欠失している。ある実施態様においては、置換、挿入又は欠失は、ＣＤＲの外側領域(すなわち、ＦＲ)で生じている。場合によっては、抗ＨＥＲ３抗体は、その配列の翻訳後修飾を含む、配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１にＶＬ配列を含む。特定の実施態様では、ＶＬは：(ａ）配列番号：６又は配列番号：７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１Ｌ、(ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２Ｌ、及び(ｃ）配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３Ｌから選択される、１、２又は３のＣＤＲを含む。
【００５９】
他の態様においては、抗ＨＥＲ３抗体が提供され、ここで抗体は、上述にて提供した任意の実施態様のＶＨ、及び上述にて提供した任意の実施態様のＶＬを含む。一実施態様では、抗体は、その配列の翻訳後修飾を含み；以下の特性（実施例３及び２に記載されるアッセイで測定）：
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＣＦ７細胞、ＦａＤｕ細胞、又はＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害し(一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１．０μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％(一実施態様では、少なくとも９０％)のＭＣＦ７細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％(一実施態様では、少なくとも９０％)のＦａＤｕ細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも６０％(一実施態様では、少なくとも７０％)のＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示す)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害し(一実施態様においては０．５０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、一実施態様においては０．３５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、抗ＨＥＲ３抗体が、Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害する)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を阻害し(一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を阻害する)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、５．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値、一実施態様においては３．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値で、ＨＥＲ３に結合する
の一又は複数を有する、それぞれ配列番号：８及び配列番号：１０にＶＨ及びＶＬ配列を含む。
【００６０】
他の態様では、本発明の抗ＨＥＲ３抗体は、配列番号：８のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(ＶＨ)配列を含み、配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)配列を含み、次の特性（実施例３及び２に記載されるアッセイで測定）：
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＣＦ７細胞、ＦａＤｕ細胞、又はＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害し(一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１．０μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％(一実施態様では、少なくとも９０％)のＭＣＦ７細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％(一実施態様では、少なくとも９０％)のＦａＤｕ細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも６０％(一実施態様では、少なくとも７０％)のＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示す)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害し(一実施態様においては０．５０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、一実施態様においては０．３５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、抗ＨＥＲ３抗体が、Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害する)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を阻害し(一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を阻害する)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、５．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値、一実施態様においては３．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値で、ＨＥＲ３に結合する
の一又は複数を有する。
【００６１】
本発明の一実施態様は、ヒトＨＥＲ３に結合し、配列番号：８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインＶＨ、及び配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含む抗体である。
【００６２】
本発明の一実施態様は、軽鎖可変ドメインＶＬが、配列番号：９と少なくとも９５％の配列同一性を有する、このような抗体である。
【００６３】
本発明の一実施態様は、軽鎖可変ドメインＶＬが、配列番号：１０と少なくとも９５％の配列同一性を有する、このような抗体である。
【００６４】
本発明の一実施態様は、軽鎖可変ドメインＶＬが、配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する、このような抗体である。
【００６５】
本発明の一実施態様は、配列番号：８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインＶＨ、及び配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含み、ヒトＨＥＲ３に結合し；次の特性（実施例３及び２に記載のアッセイで測定）：
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＣＦ７細胞、ＦａＤｕ細胞、又はＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害し(一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１．０μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％(一実施態様では、少なくとも９０％)のＭＣＦ７細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも８０％(一実施態様では、少なくとも９０％)のＦａＤｕ細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示し；一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、０．１μｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも６０％(一実施態様では、少なくとも７０％)のＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞にてＨＥＲ３のリン酸化阻害を示す)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害し(一実施態様においては０．５０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、一実施態様においては０．３５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、抗ＨＥＲ３抗体が、Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において、ＡＫＴのリン酸化を阻害する)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、腫瘍細胞、例えばＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を阻害し(一実施態様では、抗ＨＥＲ３抗体が、１０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０値で、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を阻害する)
− 抗ＨＥＲ３抗体が、５．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値、一実施態様においては３．０×１０−９Ｍ未満のＫＤ値で、ＨＥＲ３に結合する
の一又は複数を有する抗体である。
【００６６】
配列に関する同一性又は相同性は、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要ならば、配列を変化させ、間隙を導入した後、親配列と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとしてここでは定められる。抗体配列における、Ｎ末端、Ｃ末端、又は内部の伸長、欠失、又は挿入のいずれも、配列同一性又は相同性に影響を与えると解釈すべきではない。変異体は、ヒトＨＥＲ３の可変ドメインに結合する能力を保持しており、好ましくは親抗体よりも優れた特性を有する。例えば、変異体は処置中の副作用が低減する可能性がある。
【００６７】
例示的な「親」抗体は、抗体Ｍａｂ ２０５．１０．２のＣＤＲ領域を含み、好ましくは、変異体の調製に使用される。好ましくは、親抗体はヒトフレームワーク領域を有しており、存在するならば、ヒト抗体定常ドメインを有する。例えば、親抗体はヒト化又はヒト抗体であってよい。
【００６８】
「抗体依存性細胞傷害性性（ＡＤＣＣ）」なる用語は、エフェクター細胞の存在下、本発明の抗体によるヒト標的細胞の溶解を意味する。ＡＤＣＣは、エフェクター細胞の存在下、例えば新鮮に単離されたＰＢＭＣ又はバフィーコートからの精製エフェクター細胞、例えば単球又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は永続的に増殖するＮＫ細胞株の存在下で本発明の抗体でＨＥＲ３発現細胞の調製物を処理することにより好ましくは測定される。
【００６９】
モノクローナル抗体のＡＤＣＣのような細胞媒介性エフェクター機能は、Umana, Pら, Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180、及び米国特許第６６０２６８４号に記載されているような、それらのオリゴ糖成分を操作することにより高めることができる。最も一般的に使用される治療用抗体であるＩｇＧ１型抗体は、各ＣＨ２ドメインにおいて、Ａｓｎ２９７に保存されたＮ結合グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複合二分岐オリゴ糖はＣＨ２ドメイン間に埋没しており、ポリペプチド骨格を有する広範な接触部を形成し、それらの存在は、抗体が、抗体依存性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)等のエフェクター機能を媒介するのに必須である(Lifely, M.Rら, Glycobiology 5(1995) 813-822; Jefferis, Rら, Immunol. Rev. 163(1998) 59-76; Wright, A. 及び Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15(1997) 26-32)。 Umana, Pら, Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180 及び国際公開第９９／５４３４２号には、チャイニーズ卵巣ＣＨＯ細胞において、β(１,４)-Ｎ-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）、二分されたオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼが、抗体のインビトロＡＤＣＣ活性をかなり増加させることが示されている。Ａｓｎ２９７炭水化物の組成における変化又はその除去は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの結合にも影響を及ぼす（Umana, Pら, Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180；Davies, Jら, Biotechnol. Bioeng. 74(2001) 288-294；Mimura, Yら, J. Biol. Chem. 276(2001) 45539-45547；Radaev, Sら, J. Biol. Chem. 276(2001) 16478-16483；Shields, R.Lら, J. Biol. Chem. 276(2001) 6591-6604；Shields, R.Lら, J. Biol. Chem. 277(2002) 26733-26740；Simmons, L.Cら, J. Immunol. Methods 263(2002) 133-147)。
【００７０】
糖鎖操作を介してモノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能を高める方法は、例えば国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Umana, Pら, Nature Biotechnol. 17(1999) 176-180、国際公開第９９／１５４３４２号、国際公開第２００５／０１８５７２号、国際公開第２００６／１１６２６０号、国際公開第２００６／１１４７００号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００５／０１１７３５号、国際公開第２００５／０２７９６６号、国際公開第１９９７／０２８２６７号、米国特許第２００６／０１３４７０９号、米国特許第２００５／００５４０４８号、米国特許第２００５／０１５２８９４号、国際公開第２００３／０３５８３５号、及び国際公開第２０００／０６１７３９号、又は例えばNiwa, Rら, J. Immunol. Methods 306(2005) 151-160; Shinkawa, Tら, J Biol Chem, 278(2003) 3466-3473；国際公開第０３／０５５９９３号、及び米国特許第２００５／０２４９７２２号において報告されている。
【００７１】
本発明の一実施態様では、本発明の抗体は、抗体が、（ＩｇＧ１又はＩＧ３サブクラスのＦｃ部分を含むならば）Ａｓｎ２９７で糖鎖にてグリコシル化されていることを意味するアフコシル化されており、よって該糖鎖内のフコースの量は８０％以下（カバットによる番号付け）、例えば８０％から１％である。他の実施態様では、前記糖鎖内のフコースの量は６５％以下であり、一実施態様においては５％〜６５％であり、一実施態様では、該糖鎖内のフコースの量は０％である。このような抗体は、以下「アフコシル化抗体」又は「非フコシル化」と称される。このようなアフコシル化抗体は高められたＡＤＣＣを示すが、他の抗体特性は実質的に影響を受けずに保持されている。
【００７２】
さらなる実施態様では、前記糖鎖内での、Ｎ-グリコシル化ノイラミン酸(ＮＧＮＡ)の量は１％以下であり、及び／又はＮ-末端アルファ-１,３-ガラクトースの量は１％以下である。糖鎖は、ＣＨＯ細胞で組換え的に発現した抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ-結合グリカンの特徴を好ましくは示す。
【００７３】
本発明の「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域のほぼ２９７位に位置するアミノ酸アスパラギンを意味する。抗体の小さな配列変化に基づき、Ａｓｎ２９７は、２９７位の上流又は下流のいくつかのアミノ酸（通常、±３のアミノ酸は超えない）、すなわち２９４から３００位の間に位置しうる。
【００７４】
「糖鎖がＣＨＯ細胞で組換え的に発現した抗体のＡｓｎ２９７に結合したＮ-結合グリカンの特徴を示す」なる用語は、本発明の全長親抗体のＡｓｎ２９７の糖鎖が、フコース残基を除き、未修飾のＣＨＯ細胞で発現した同様の抗体のもの、例えば国際公開第２００６／１０３１００号で報告されているものと同様の構造及び糖残基配列を有することを示す。
【００７５】
この出願で使用される「ＮＧＮＡ」なる用語は、糖残基Ｎ-グリコシル-ノイラミン酸を示す。
【００７６】
ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化は、コアフコシル化された二分岐複合オリゴ糖のグリコシル化が２つまでのＧａｌ残基で終結している場合、Ａｓｎ２９７で生じる。ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのヒト定常重鎖領域は、Kabat, E., Aら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991), 及びBrueggemann, Mら, J. Exp. Med. 166(1987) 1351-1361；Love, T.Wら, Methods Enzymol. 178(1989) 515-527に詳細に報告されている。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じて、Ｇ０、Ｇ１(α-１,６-又はα-１,３-）、又はＧ２グリカン残基と命名される(Raju, T.S., Bioprocess Int. 1(2003) 44-53)。抗体のＦｃ部分のＣＨＯ型グリコシル化は、例えば、Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14(1997) 201-207により記載されている。非糖修飾されたＣＨＯ宿主細胞で組換え的に発現している抗体は、通常、少なくとも８５％の量で、Ａｓｎ２９７でフコシル化されている。全長親抗体の修飾されたオリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体であってもよい。好ましくは、二分された、還元／非フコシル化オリゴ糖はハイブリッドである。他の実施態様では、二分された、還元／非フコシル化オリゴ糖は複合体である。
【００７７】
本発明によれば、「フコースの量」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（例えば、ＬＣ／ＭＳシステム）により測定され、平均値として算出する（例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号を参照）ことによる、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造体（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造体）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での、糖鎖内の糖の量を意味する。フコースの相対量は、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦにより、Ｎ-グリコシターゼＦで処理された試料（例えば、複合体、ハイブリッド、及びオリゴ-及び高-マンノース構造体それぞれ）において同定された全ての糖構造体に対する、フコース含有構造体のパーセンテージである。
【００７８】
本発明の抗体は、好ましくは組換え手段により生成される。このような方法は従来技術において幅広く知られており、抗体ポリペプチドの後続する単離、通常は薬学的に許容可能な純度までの精製を伴い、原核生物及び真核生物細胞におけるタンパク質発現を含む。タンパク質発現について、軽鎖及び重鎖又はその断片をコードする核酸は、標準的な方法で発現ベクターに挿入される。発現は、適切な原核生物又は真核生物宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母、又は大腸菌細胞において実施され、抗体は細胞から(上清から又は細胞溶解後に)回収される。抗体の組換え生成は従来技術でよく知られており、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, Sら, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の文献に記載されている。抗体は、全細胞中、細胞可溶化物中、又は部分的に精製された、又は実質的に純粋な形態で存在しうる。カラムクロマトグラフィー及び当該技術でよく知られている他のものを含む標準的な技術により、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を除去するために、精製が実施される（Ausubel, Fら編. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)）。ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.Mら, Cytotechnology 32 (2000) 109-123；Barnes, L.Mら, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Yら, Nucl. Acids. Res. 30(2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, Rら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837；Carter, Pら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；Norderhaug, Lら, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過性発現システム(ＨＥＫ２９３)は、Schlaeger, E.-J. 及び Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83、及びSchlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199に記載されている。モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等、従来からの免疫グロブリン精製手順により、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、従来の手順を使用し、容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡの供給源として提供することができる。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に挿入され、ついで、宿主細胞、例えば免疫グロブリンタンパク質を生成しないＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞に形質移入され、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成が得られる。前記細胞株から得ることができる抗体は、本発明の好ましい実施態様である。アフコシル化された抗体は、好ましくは上述した糖鎖工学を介して調製される。
【００７９】
抗ＨＥＲ３抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体コード化ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入する、又はペプチド合成により調製される。しかしながら、このような修飾は、例えば上述したような非常に限られた範囲でしか実施することができない。例えば、修飾により、上述した抗体の特徴、例えばＩｇＧアイソタイプ及びエピトープ結合性を変化させることはできないが、組換え生成の収率、タンパク質安定性、又は精製の容易性を改善することはできる。また、抗ＨＥＲ３の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基は、一般的にセリンで置換され、分子の酸化安定性が改善され、異常な架橋が防止される。反対に、システイン結合(類)は抗体に付加されて、その安定性が改善される(特に、抗体がＦｖ断片等の抗体断片である場合)。抗体の他の種類のアミノ酸変異体では、抗体元来のグリコシル化パターンが変化している。「変化」とは、抗体に見出される一又は複数の炭水化物部分の除去、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。抗体のグリコシル化は典型的にはＮ結合である。Ｎ結合は、アスパラギン残基の側鎖に炭水化物部分が付着することを称する。Ｘがプロリン以外のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。よって、ポリペプチドにこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的グリコシル化部位が生じる。抗体へのグリコシル化部位の付加は、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列を含有するように(Ｎ結合グリコシル化部位用)、アミノ酸配列を変化させることによって簡便に達成される。
【００８０】
抗ＨＥＲ３抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術で知られているの種々の方法で調製される。これらの方法には、限定されるものではないが、天然源（自然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、又はオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）変異原性、ＰＣＲ変異原性、ヒト化抗ＨＥＲ３抗体の前もって調製された変異体又は非変異型のカセット変異原性が含まれる。
【００８１】
抗体の他のタイプの共有結合的修飾は、米国特許第４６４０８３５号；同４４９６６８９号；同４３０１１４４号；同４６７０４１７号；同４７９１１９２号；同４１７９３３７号に説明された方式において、種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリアルキレンの一つに、抗体を結合させることを含む。
【００８２】
本発明の重鎖及び軽鎖可変ドメインは、発現ベクターコンストラクトが形成されるように、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３'非翻訳領域、ポリアデニル化、及び転写終結の配列が組合せられたものである。重鎖及び軽鎖発現コンストラクトは単一ベクターに組み込まれ、宿主細胞に同時形質移入、連続的形質移入、又は別々に形質移入され、ついでこれらが融合され、双方の鎖を発現する単一の宿主細胞が形成される。
【００８３】
本発明の一態様は、本発明の抗体を含有する薬学的組成物である。本発明の他の態様は、薬学的組成物を調製するための、本発明の抗体の使用にある。本発明のさらなる態様は、本発明の抗体を含有する薬学的組成物を調製するための方法にある。他の態様では、本発明は、本発明の抗体を含有し、薬学的担体と共に処方される組成物、例えば薬学的組成物を提供する。
【００８４】
さらに、本発明の抗ＨＥＲ３抗体は、癌の処置に特に有用であることがわかっている。
【００８５】
よって、本発明の一態様は、癌を処置するための前記薬学的組成物にある。
【００８６】
本発明の他の態様は、癌を処置するための本発明の抗体にある。
【００８７】
本発明の他の態様は、癌の治療のための医薬の製造のための、本発明の抗体の使用にある。
【００８８】
本発明の他の態様は、本発明の抗体を、このような処置を必要とする患者に投与することにより、癌に罹患している患者を治療する方法にある。
【００８９】
ここで使用される場合、「薬学的担体」には、任意及び全ての溶媒、分散用媒体、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延化剤で、生理学的に融和性のあるものが含まれる。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、大脳内、皮下、非経口、脊髄、又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適している。
【００９０】
本発明の組成物は、当該技術で知られているの種々の方法で投与することができる。当業者に理解されているように、投与の経路及び／又は方式は、所望する結果に応じて変えられるであろう。投与のある種の経路により、本発明の化合物を投与するため、化合物をコーティングする、又はその不活性化を防止するための物質と化合物とを当時投与する必要があるかもしれない。例えば、化合物は適切な担体、例えばリポソーム、又は希釈剤において、被験者に投与されてもよい。薬学的に許容可能な希釈剤には、生理食塩水又は水性緩衝液が含まれる。薬学的担体には、滅菌水溶液又は分散液、及び注射可能な滅菌溶液又は分散液を即時調製するための滅菌パウダーが含まれる。薬学的に活性な物質用のこのような媒体又は薬剤の使用は、当該技術で知られているである。
【００９１】
ここで使用される場合、「非経口投与」及び「非経口的に投与」なる語句は、経腸及び局所投与以外の投与方式、通常は注射による投与を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、包膜内、莢膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が含まれる。
【００９２】
ここで使用される場合、「癌」なる用語は、例えば、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、気管支肺胞上皮細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃腸癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、随芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、上述した任意の癌の抵抗性バージョン、又は上述した癌の一又は複数の組合せであってよい。好ましくは、このような癌は、乳癌、肺癌、頭部又は頸部の癌、又は膵臓癌、さらに好ましくは肺癌、頭部又は頸部の癌、又は膵臓癌である。このような癌は、好ましくはＨＥＲ３の発現又は過剰発現により、さらに好ましくはＨＥＲ３の過剰発現により、さらに特徴付けられる。
【００９３】
これらの組成物は、アジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤をさらに含有可能である。微生物存在の防止は、上掲の滅菌手段、及び種々の抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、スコルビン酸等により確実になる。また、等張剤、例えば糖類、塩化ナトリウムを、組成物に含有せしめることもまた望ましい。注射可能な薬学的形態の長時間にわたる吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有せしめることによりもたらすことができる。
【００９４】
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和形態、及び／又は本発明の薬学的組成物で使用される本発明の化合物は、当業者に知られている一般的な方法により、薬学的に許容可能な剤形に処方される。
【００９５】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベルは、患者に対して毒性がなく、特定の患者、組成、及び投与方式に対して所望する治療的応答を達成するのに効果的な活性成分の量が得られるように変えうる。選択された投与レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置時間、他の薬剤、使用される特定の組成物と組合せて使用される化合物及び／又は物質、年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態、処置される患者の以前の病歴、及び医療でよく知られている要因を含む、種々の薬物動態学的要因に依存するであろう。
【００９６】
組成物は滅菌されていなければならず、組成物がシリンジにより送達可能である程度に、流動的でなければならない。水に加えて、担体は、好ましくは等張の緩衝生理食塩水である。
【００９７】
適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティング剤を使用することにより、又は分散液の場合は必要な粒径を維持することにより、そして界面活性剤を使用することにより、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、多価アルコール類、例えばマンニトール又はソルビトール、及び塩化ナトリウムを、組成物に含有せしめることが好ましい。
【００９８】
次の実施例、配列表及び図面は、本発明の理解を補助するために提供されるものであり、発明の真の範囲は添付の請求の範囲に記載される。本発明の精神を逸脱しないで記載された手順に変更をなすことができることが理解される。
【００９９】
配列表の記載
配列番号：１ 重鎖ＣＤＲ３Ｈ、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：２ 重鎖ＣＤＲ２Ｈ、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：３ 重鎖ＣＤＲ１Ｈ、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：４ 軽鎖ＣＤＲ３Ｌ、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：５ 軽鎖ＣＤＲ２Ｌ、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：６ 軽鎖ＣＤＲ１Ｌ(変異体１）、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：７ 軽鎖ＣＤＲ１Ｌ(変異体２）、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：８ 重鎖可変ドメインＶＨ、Ｍａｂ ２０５．１０
配列番号：９ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｍａｂ ２０５．１０．１
配列番号：１０ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｍａｂ ２０５．１０．２
配列番号：１１ 軽鎖可変ドメインＶＬ、Ｍａｂ ２０５．１０．３
配列番号：１２ ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号：１３ ＩｇＧ１から誘導されたヒト重鎖定常領域
配列番号：１４ Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａで変異したＩｇＧ１から誘導されたヒト重鎖定常領域
配列番号：１５ ＩｇＧ４から誘導されたヒト重鎖定常領域
配列番号：１６ Ｓ２２８Ｐで変異したＩｇＧ４から誘導されたヒト重鎖定常領域
配列番号：１７ ヒトＨＥＲ３
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１Ａ】図１Ａは、異なった濃度での、ＭＣＦ７細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、異なった濃度での、ＭＣＦ７細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、異なった濃度での、Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を示す。
【図２】図２は、Ｍａｂ ２０５(１０ｍｇ／ｋｇ ｑ７ｄｘ３、ｉ．ｐ．)を用いた処置による、異種移植片が移植されたＦａＤｕ ＳＣＣＨＮの腫瘍停滞を示す。
【図３】図３は、Ｍａｂ ２０５(１０ｍｇ／ｋｇ ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．)を用いた処置による、異種移植片が移植されたＭＡＸＦ４４９乳癌の腫瘍停滞を示す。
【図４】図４は、Ｍａｂ ２０５(２５ｍｇ／ｋｇ ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．)を用いた処置による、異種移植片が移植された７１７７ＮＳＣＬＣの腫瘍停滞を示す。
【実施例】
【０１０１】
実施例１
免疫化
ＮＭＲＩマウスを、ｈＨＥＲ３-ＥＣＤ（社内）で免疫化し、ｈｕ-ＨＥＲ３-ＥＣＤで追加免役した。免疫応答をＨＥＲ１／２／３-ＥＣＤ-ＥＬＩＳＡに対して血清試料を試験することによりモニタリングした。十分な力価の抗ＨＥＲ３免疫グロブリンと共にマウスからの脾臓細胞を、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３との融合により、後での不死化のために凍結させた。１回融合させ、ハイブリドーマ上清を、交差反応を示さないが、ＨＥＲ３-ＥＣＤに結合するＨＥＲ１／２／-ＥＣＤ-ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、抗ＨＥＲ３選択的ハイブリドーマを選択した。関連したハイブリドーマを、単細胞ＦＡＣＳ選別によりクローニングした。異なったハイブリドーマからの単細胞クローンをインビトロで培養し、特徴付けのために組織培養培地中に抗体を生成させた。抗体を、ＨＥＲ３リン酸化、ＡＫＴリン酸化、及びＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の腫瘍細胞増殖を阻害するそれらの能力を測定することにより、選択した（以下の実施例を参照）。得られた抗体から、一つをさらにヒト化させ、それらのそれぞれのＶＨ及びＶＬ又はＣＤＲを有する、次の抗体Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２及びＭａｂ ２０５．１０．３を得た。
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
一実施態様では、このような抗体を、ヒト由来の定常領域、例えば配列番号：１２−１３を使用して調製した。
【０１０５】
実施例２
結合アッセイ
ａ）ヒトＨＥＲ３ ＥＣＤに結合する抗原特異性ＥＬＩＳＡ
ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）に融合した可溶性ヒトＨＥＲ３細胞外ドメインをストレプトアビジンプレートに捕捉させた。ＳＰＢ-ＣＤＣＰ１に対する抗体の最適な結合性を定めるために、MicroCoat, Bernried, Germany(ID-No.1734776-001)から供給された３８４ウェルのポリスチレンプレート（ＮＵＮＣ、ストレプトアビジンでコーティング）を、純粋で段階希釈されたＨＥＫ２９３上清（ＢＳＡ／ＩＭＤＭバッファー：１００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ画分Ｖ、 Roche 10735078001、Iscoveのダルベッコ改変培地に溶解）でコーティングした。マウスキメラ２０５抗体の較正曲線を使用し、マイクロタイタープレートのストレプトアビジン結合能力に関するＨＥＫ２９３上清の最適希釈係数を同定した。標準的なコーティングについて、ＳＢＰ-ＨＥＲ３含有ＨＥＫ２９３上清を希釈し（１：１５から１：４０）、２−８０Ｃで一晩インキュベートした（ウェル当たり２５μｌ）。残りの未結合ＳＢＰ-ＨＥＲ３を除去するために、マイクロタイタープレートを強く洗浄する必要がある。
【０１０６】
本発明の抗体を、未希釈か又は１２段階希釈を使用して試験した。ウェル当たり１２．５μｌの各サンプルを、室温で９０分インキュベートした。ＰＢＳ-Ｔ（ＰＢＳ中に０．１％のトゥイーン２０）、ヒト抗体用の、２５μｌのＨＲＰとカップリングしたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch, Code No: 109-036-098, 希釈率 1:10000）を添加し、１時間インキュベートした。強く洗浄した後、抗体の結合を、ＡＢＴＳ錠（Roche Diagnostics GmbH, Cat.No.: 1112422）で検出した。４０５ｎｍ／４９２ｎｍでの吸光度を標準的な光度計を使用して測定した。
【０１０７】
表は異なった抗体の相対的結合比を示している。
【０１０８】
ｂ）バイアコア分析によるヒトＨＥＲ３の細胞外ドメイン-(ＥＣＤ)断片に対する抗ＨＥＲ３抗体の結合の特徴付け
親和性測定のために、３０μｇ／ｍｌの抗Ｆｃγ抗体（ヤギ由来、Jackson Immuno Research）を、ＳＰＲ機器（Biacore T100）での標準的なアミンカップリング及びブロッキング化学により、ＣＭ-５センサーチップの表面にカップリングさせた。コンジュゲート後、２５℃、５μＬ／分の流量で抗ＨＥＲ３抗体を、続いて３０μＬ／分でヒトＨＥＲ３ ＥＣＤの希釈シリーズ（０ｎＭから１０００ｎＭ）を注入した。結合実験用の流通バッファーとして、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡを使用した。ついで、１０ｍＭのグリシン-ＨＣｌ、ｐＨ２．０溶液の６０秒パルスで、チップを再生させた。
【０１０９】
熱力学的パラメーターの算出（ＫＤ、ＨＥＲ３に対する結合定数）を、ラングミュラー１：１結合モデルを使用して算出した。
【０１１０】
競合結合アッセイ（バイアコア）において、Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３は全て同じエピトープに対する結合性を示した。国際公開第２００７／０７７０２８号に記載されている抗ＨＥＲ３抗体Ｕ１-７、Ｕ-５３及びＵ１-５９、及び国際公開第２００８／１００６２４号に記載されているＡｂ＃６を、このようなアッセイで研究し、抗体Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３よりも種々のエピトープに結合することが明らかとなった。
【０１１１】
実施例３
ａ）ＭＣＦ７、ＦａＤｕ及びＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞におけるＨＥＲ３リン酸化の阻害
アッセイを、次のプロトコルに従い、ＭＣＦ７及びＦａＤｕ細胞において実施した：１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において、ポリ-Ｄ-リジンでコーティングされた９６ウェルプレートに、５０００００細胞／ウェルで細胞を播種する。２４時間インキュベートする。吸引により培地を除去し、０．５％のＦＣＳを含有する５００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０と共に一晩インキュベートする。０．５％のＦＣＳを含有する５００μｌのＲＰＭＩ１６４０に抗体を添加する。１時間インキュベートする。１０分間、ＨＲＧ-１ｂ（最終濃度５００ｎｇ／ｍｌ）を添加する。細胞を溶解させるために培地を除去し、８０μｌの氷冷トリトン-Ｘ-１００細胞溶解バッファーを添加し、氷上で５分インキュベートする。１．５ｍｌの反応チューブに可溶化物を移した後、４℃で１５分、１４０００ｒｐｍで遠心分離し、新たな反応チューブに上清を移動する。ＳＤＳ充填バッファーに同量のタンパク質を含有する試料をＳＤＳ ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に対して半乾燥ウエスタンブロットを使用してブロットした。１×ＮＥＴ-バッファー＋０．２５％のゼラチンにより、１時間、膜をブロックし、ｐＨＥＲ３を、抗体αホスホ-ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３(Ｔｙｒ１２８９）（２１Ｄ３）、Cell Signaking #4791により、ＨＥＲ３を抗体αＥｒｂＢ３(Ｃ-１７)、Santa Cruz, #sc-285により、それぞれ検出した。洗浄及びＰＯＤカップリング二次抗体によるシグナルの検出後、バンドをデンソメーターでスキャンした。抗ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３、さらに国際公開第２００７／０７７０２８号に記載された抗ＨＥＲ３抗体Ｕ１-７、Ｕ-５３及びＵ１-５９、国際公開第２００８／１００６２４号に記載されたＡｂ＃６を調査した。ＭＣＦ７細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を以下と図１Ａに示す。
【０１１２】
【０１１３】
さらなる実験において、抗ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ ２０５．１０．２、さらに国際公開第９７／３５８８５号に記載された抗ＨＥＲ３-抗体８Ｂ８．２Ｄ９、国際公開第２００３／０１３６０２号に記載された１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２を調査した。ＭＣＦ７細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を、以下と図１Ｂに示す。
【０１１４】
【０１１５】
ＦａＤｕ細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を以下に示す。
【０１１６】
さらなる実験において、抗ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ ２０５．１０．２、さらに国際公開第９７／３５８８５号に記載された抗ＨＥＲ３-抗体８Ｂ８．２Ｄ９、国際公開第２００３／０１３６０２号に記載された１Ｂ４Ｃ３及び２Ｄ１Ｄ１２、及び１０５．５形態(Millipore, Cat.no. 05-47、国際公開第２００３／０１３６０２号においてはα-ＨＥＲＥＤＣと命名)を、Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞において調査した。Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞におけるアッセイを、ＭＣＦ７及びＦａＤｕ細胞において上述のプロトコルに従い実施した。細胞数及び培地の体積を、１２ウェルプレートに適応させた。Ｍｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞におけるレセプターリン酸化に対する抗ＨＥＲ３抗体の阻害パーセント（％）を、以下と図１Ｃに示す。
【０１１７】
【０１１８】
ｂ）ＡＫＴリン酸（ＥＬＩＳＡ）
アッセイを、次のプロトコルに従い、ＭＣＦ７細胞で実施した：１０％のＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地において、ポリ-Ｄ-リジンでコーティングされた９６ウェルプレートに、３００００細胞／ウェルでＭＣＦ７細胞を播種し、２４時間インキュベートする。清浄なペーパータオルで軽くたたくことにより培地を除去し、２００μｌの無血清培地で注意深く洗浄し、０．５％のＦＣＳを含有する１００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０と共に一晩インキュベートする。上述したようにして培地を除去し；０．５％のＦＣＳを含有する１００μｌのＲＰＭＩ１６４０に抗体を添加し、１．５時間インキュベートする。１０分間、ＨＲＧ-１ｂ（最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）を添加する。上述したようにして培地を除去する。細胞を溶解させるために、１００μｌの氷冷細胞溶解バッファーを氷上に添加し、約５×ピペッティングすることにより懸濁させる。４℃で１０分、３０００ｒｐｍでプレートを遠心分離し、新たなポリプロピレンプレートに８０μｌの上清（又はアリコート）を移し、ＬＮ２においてショック凍結させる。アッセイまで−８０℃で保存する。
【０１１９】
ＡＫＴ１，２（ホスホ-Ｓｅｒ４７３）ＥＩＡキットアッセイデザイン＃９００-１６２：試料（１：１０に希釈）を、ＡＫＴのＮ末端に対して特異的なマウスＭＡＢでコーティングされたプレートに添加する。振揺させつつ、室温で１時間インキュベートする。５×洗浄し、振揺させつつ、室温で１時間、ビオチン化抗ホスホ-ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）と共にインキュベートする。５×洗浄し、振揺させつつ、室温で３０分、ストレプトアビジン-ＨＲＰコンジュゲートと共にインキュベートする。５×洗浄し、振揺させつつ、室温で３０分、ＴＭＢ基質と共にインキュベートする。停止させ、４５０ｎｍで読み取る。
【０１２０】
Ｍａｂ ２０５．１０．２は、０．０６μｇ／ｍｌのＡＫＴリン酸化阻害のＩＣ５０を示した。
【０１２１】
ＭＣＦ７細胞で記載したようにして実施したＭｅｌ-Ｊｕｓｏ細胞におけるｐＡＫＴ ＥＬＩＳＡにおいて、Ｍａｂ ２０５．１０．２は０．２８μｇ／ｍｌのＡＫＴリン酸化阻害のＩＣ５０を示し、全ての他の分析抗体は、(＞)５０以上のＩＣ５０を示した。
【０１２２】
ｃ）腫瘍細胞増殖の阻害
ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞（ＶＩＩヒト乳癌細胞、ATCCカタログ番号HTB-25）を使用し、細胞増殖アッセイにおける、ＨＥＲ３抗体Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、及びＭａｂ ２０５．１０．３の抗-腫瘍効果を評価した。ウェル当たり２００００細胞を、１０％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培養培地が入った滅菌９６ウェル組織培養プレートに播種し、１日３７℃±１℃、５％±１％のＣＯ２においてインキュベートした。細胞は、約１．５日の倍加時間、ゆっくりと増殖する細胞である。抗ＨＥＲ３抗体を一連の希釈をし、さらに６日間インキュベートした。ついで、細胞生存率を、アラマーブルー(登録商標)読み取りを使用して評価した。細胞生存率がコントロールの５０％以上に低減しているならば、ＩＣ５０値を、各抗体濃度について３回の平均を使用して算出し、最も高い濃度で細胞生存率の阻害度％が５０％以下であるならば、ＩＣ５０は算出できないものとし、ＩＣ５０[ｍｇ／ｍｌ]が最も高い濃度以上(＞)であることが示される。また、国際公開第２００７／０７７０２８号に記載された抗ＨＥＲ３抗体Ｕ１-５９、及び国際公開第２００８／１００６２４号に記載されたＡｂ＃６も調べた。
【０１２３】
さらなる実験において、国際公開第９７／３５８８５号に記載された抗ＨＥＲ３抗体８Ｂ８．２Ｄ９、及び国際公開第２００３／０１３６０２号に記載された１Ｂ４Ｃ３についても調べた。
【０１２４】
実施例５
１μｇ／ｍｌのｓｐｅｃＬｙｓｉｓ％によるＫＬＰ-腫瘍細胞におけるインビトロＡＤＣＣ
標的細胞ＫＰＬ４(ＡＤＣＣ）、乳癌、ＲＰＭＩ１６４０＋２ｍＭのＬ-アラニル-Ｌ-グルタミン＋１０％のＦＣＳ)で培養を、指数関数的増殖相において、トリプシン／ＥＤＴＡ(Gibco # 25300-054)と共に収集した。洗浄工程、及び細胞数と生存率のチェック後、必要なアリコートを、カルセイン（Invitrogen #C3100MP；１バイアルを、５ｍｌの培地に、５ミオ細胞に対して５０μｌのＤＭＳＯに再懸濁させた）を用い、細胞インキュベーター内において、３７℃で３０分、ラベリングした。その後、ＡＩＭ-Ｖ培地で細胞を３回洗浄し、細胞数及び生存率をチェックし、細胞数を０．３Ｍｉｏ／ｍｌに調節した。
【０１２５】
その間に、エフェクター細胞としてのＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、製造者のプロトコル（洗浄工程を４００ｇで１×、３５０ｇで２×、各１０分）に従い、密度勾配遠心分離（Histopaque-1077, Sigma # H8889）により調製した。細胞数及び生存率をチェックし、細胞数を１５Ｍｉｏ／ｍｌに調節した。
【０１２６】
１００μｌのカルセイン染色された標的細胞を、丸底９６ウェルプレートに配し、５０μｌに希釈し、アフコシル化抗体（Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、Ｍａｂ ２０５．１０．３、以下を参照）を添加し、５０μｌのエフェクター細胞を添加した。いくつかの実施態様では、標的細胞をRedimune(登録商標)NFリキッド(ZLB Behring)と、１０ｍｇ／ｍｌのRedimune濃度で混合した。
【０１２７】
抗体なしに標的とエフェクター細胞を同時培養することにより決定して自然な溶解がコントロールとなり、最大溶解が、標的細胞のみの１％のトリトン-Ｘ-１００溶解により決定される。プレートを、加湿された細胞インキュベーターにおいて３７℃で４時間インキュベートした。
【０１２８】
標的細胞の死滅を、製造者の使用説明書に従い、細胞傷害検出キット（LDH Detection Kit, Roche # 1 644 793）を使用し、ダメージを受けた細胞から放出されるＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）を測定することにより評価した。簡単に述べると、各ウェルからの１００μｌの上清を、透明な平底の９６ウェルプレートにおいて、キットからの１００μｌの基質と混合した。基質の色調反応のＶｍａｘ値を、少なくとも１０分、４９０ｎｍにてＥＬＩＳＡリーダーで測定した。特定の抗体媒介性死滅のパーセンテージを、次のようにして算出した：（(Ａ−ＳＲ)／(ＭＲ−ＳＲ)×１００、ここでＡは特定の抗体濃度におけるＶｍａｘの平均であり、ＳＲは自然放出のＶｍａｘの平均であり、ＭＲは最大放出のＶｍａｘの平均である。
【０１２９】
付加的な読み取りとして、インタクトな標的細胞のカルセイン保持を、ホウ酸塩バッファー（５ｍＭのホウ酸ナトリウム＋０．１％のトリトン）において、残存している標的細胞を溶解させ、蛍光プレートリーダーにおけるカルセイン蛍光を測定することによって評価した。Ｍａｂ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、Ｍａｂ２０５．１０．３は、約４０−６０％の１μｇ／ｍｌの特定溶解によってＡＤＣＣ［ＫＰＬ-４］を示した。
【０１３０】
アフコシル化抗体（Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、Ｍａｂ ２０５．１０．３）を、２つは抗体発現用、１つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用（ＧｎＴ-ＩＩＩ発現ベクター）、及び１つはマンノシダーゼＩＩ発現用で、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞におけるその比率がそれぞれ４：４：１：１である４つのプラスミドを用いて同時形質移入することにより調製した。
【０１３１】
全長抗体の重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列を、ＭＰＳＶプロモーターのコントロールの存在下、また合成ポリＡ部位の上流で、哺乳動物発現ベクター（一つは軽鎖用、一つは重鎖用）内でサブクローンし、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を担持している。抗体を、リン酸カルシウム-形質移入アプローチを使用し、抗体の重鎖及び軽鎖発現ベクターを用い、ＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞又はＣＨＯ細胞を同時形質移入させることにより調製した。指数関数的に増殖するＨＥＫ２９３-ＥＢＮＡ細胞を、リン酸カルシウム法により形質移入させた。糖鎖操作抗体を生産するために、細胞を、２つは抗体発現用、１つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用（ＧｎＴ-ＩＩＩ発現ベクター）、及び１つはマンノシダーゼＩＩ発現用で、それぞれ４：４：１：１の比率である４つのプラスミドを用いて同時形質移入した。細胞を、１０％のＦＣＳが補填されたＤＭＥＭ培養培地を使用し、Ｔフラスコにおいて粘着性のある単層培養体として増殖させ、それらが５０〜８０％のコンフルエントになった時に形質移入させた。Ｔ１５０フラスコでの形質移入のために、１５００００００の細胞を、ＦＣＳが補填された２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地（最終的に１０％のＶ／Ｖ）に形質移入する２４時間前に播種し、細胞を、５％のＣＯ２雰囲気にて一晩、３７℃のインキュベーターに配した。生産される全ての抗体について、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液を、１８８μｌの全プラスミドベクターＤＮＡ（２つは抗体発現用（１つは軽鎖、１つは重鎖）、１つは融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現用（ＧｎＴ-ＩＩＩ発現ベクター）、及び１つはマンノシダーゼＩＩ発現用（ゴルジマンノシターゼＩＩ発現ベクター）で、それぞれ４：４：１：１の比率である４つのプラスミド）、最終容量が９３８μｌになるまで水と、また９３８μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液と混合することによって調製した。この溶液に、１８７６μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液、ｐＨ７．０５を添加し、すぐに１０秒混合し、室温で２０秒放置した。懸濁液を、２％のＦＣＳが補足された４６ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、存在する培地の代わりに、２つのＴ１５０フラスコ分けた。
【０１３２】
細胞を、３７℃、５％のＣＯ２にて、１７〜２０時間インキュベートし、ついで培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳで置き換えた。調製された培養培地を、２１０×ｇで１５分遠心分離することにより、形質移入の７日後に収集し、溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度が０．０１％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを添加し、４℃で保持した。
【０１３３】
分泌されたアフコシル化抗体を精製し、抗体のＦｃ領域に結合したオリゴ糖を、例えばＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳにより（例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載したようにして）分析した。この分析のために、オリゴ糖を、ＰＶＤＦ膜に固定されたか、又は溶液中にある抗体を用い、ＰＮＧアーゼ消化することで抗体から酵素的に放出させた。放出されたオリゴ糖を含有する得られた消化溶液は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳ分析用に直接調製されるか、又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ-ＭＳ分析用にサンプルを調製する前に、ＥｎｄｏＨグリコシターゼでさらに消化させた。Ａｓｎ２９７での、糖鎖内のフコースの分析量は５０−２０％であった。
【０１３４】
実施例６
インビボ抗腫瘍効果
抗体Ｍａｂ ２０５．１０．１、Ｍａｂ ２０５．１０．２、Ｍａｂ ２０５．１０．３のインビボ抗腫瘍効果は、ＳＣＩＤべージュ又はヌードマウスに移植された種々の腫瘍由来（例えば、肺癌、ＳＣＣＨＮ、乳癌及び膵臓癌）の細胞及び断片ベースのモデルにおいて検出可能であった。実施例として、データを、ＳＣＣＨＮ異種移植モデルＦａＤｕ（細胞株ベース）、乳癌モデルＭＡＸＦ４４９（断片ベース）、及びＮＳＣＬＣモデル７１７７（断片ベース）について示している。
【０１３５】
試験剤
アフコシル化されたＭａｂ ２０５．１０．２（図２、３、４においてはＭａｂ ２０５と命名）を、Roche, Penzberg, Germanyからの保存溶液として提供された。抗体バッファーはヒスチジンを含有していた。抗体溶液を、注射前に原液からバッファーで適切に希釈した。
【０１３６】
細胞株及び培養条件
ＦａＤｕヒトＨＮＳＣＣ細胞を、最初にＡＴＣＣから得た。腫瘍細胞株を、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬ-グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び０．１ｍＭのＮＥＡＡが補足されたＭＥＭイーグル培地において、水分飽和した５％ＣＯ２の雰囲気にて３７℃で常套的に培養した。培養継代を、３日毎に分けて、トリプシン／ＥＤＴＡ１ｘを用いて実施した。
【０１３７】
腫瘍断片
腫瘍断片を、最初に患者から取り出し、ヌードドナーマウスに皮下移植した。続いて、腫瘍断片をインビボで連続継代した。前臨床研究用に、小さな腫瘍断片をドナーマウスから得、さらなるヌードマウス（ＭＡＸＦ４４９、７１７７）に皮下的に配した。
【０１３８】
動物
メスのＳＣＩＤベージュ又はヌードマウスを、ブリーダーから購入し（例えば、Charles River, Sulzfeld, Germany）、関連するガイドライン(GV-Solas; Felasa; TierschG)に従い、毎日、１２時間は明所、１２時間は暗所のサイクルで、特異的病原体のいない条件下で保持した。実験的な研究プロトコルは再考されており、地方自治体により承認されている。到着後、動物を１週間、動物施設の検疫部に保持し、新規の環境及び観察用に慣らした。連続的な健康モニタリングを定期的基準において実施した。ダイエット食品(Provimi Kliba 3337)及び水(ｐＨ ２．５-３に酸性化)を自由裁量で提供した。
【０１３９】
モニタリング
動物を、臨床的兆候及び副作用の検出について、毎日管理した。実験を通してモニタリングのために動物の体重を記録した。
【０１４０】
動物の処置
動物のランダム化後、平均腫瘍サイズが約１００−１５０ｍｍ３である場合は、細胞又は断片の移植後、 動物の処置を開始した。抗体を、モデルに応じて、３−６週間、週に１度、１０又は２５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．ｑ７ｄで、単一薬剤として投与した。対応するビヒクルを同じ日に投与した。
【０１４１】
抗体の効果
Ａ）ＦａＤｕ ＨＮＳＣＣ異種移植
ＦａＤｕ ＨＮＳＣＣ異種移植を担持するマウスを、研究日１４から３５に抗体Ｍａｂ ２０５．１０．２で処置した。その結果、Ｍａｂ ２０５．１０．２抗体での処置により、ｓ．ｃ．ＦａＤｕ異種移植の腫瘍停止を伴う、有意な抗腫瘍有効性が示された。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は９８％と算出された。
Ｍａｂ ２０５(１０ｍｇ／ｋｇ ｑ７ｄｘ３、ｉ．ｐ．）を用いた処置により、異種移植が移植されたＦａＤｕ ＳＣＣＨＮの腫瘍停止に至った（図２を参照）。
【０１４２】
Ｂ）ＭＡＸＦ４４９乳癌異種移植
ＭＡＸＦ４４９乳癌異種移植を担持するマウスを、研究日６４から９１に抗体Ｍａｂ ２０５．１０．２で処置した。その結果、Ｍａｂ ２０５．１０．２抗体での処置により、ＭＡＸＦ４４９異種移植の腫瘍停止を伴う、有意な抗腫瘍有効性が示された。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は１００％超であった。
Ｍａｂ ２０５（１０ｍｇ／ｋｇ ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．）を用いた処置により、異種移植が移植されたＭＡＸＦ４４９乳癌の腫瘍停止に至った（図３を参照）。
【０１４３】
Ｃ）７１７７ＮＳＣＬＣ異種移植片
７１７７ＮＳＣＬＣ異種移植片を担持するマウスを、研究日２８から５６に抗体Ｍａｂ ２０５．１０．２で処置した。その結果、Ｍａｂ ２０５．１０．２抗体での処置により、７１７７ＮＳＣＬＣ異種移植片の腫瘍停止を伴う、有意な抗腫瘍有効性が示された。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は１００％超であった。
Ｍａｂ ２０５(２５ｍｇ／ｋｇ ｑ７ｄ、ｉ．ｐ．）を用いた処置により、異種移植が移植された７１７７ＮＳＣＬＣの腫瘍停止に至った（図４を参照）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１Ｌ領域又は配列番号：７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体。
【請求項２】
重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１０であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１１であることを特徴とし、又はそのヒト化型である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：９であり、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１１であることを特徴とする、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１０であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、配列番号：８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含む抗体。
【請求項８】
軽鎖可変ドメインＶＬが、配列番号：９と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
軽鎖可変ドメインＶＬが、配列番号：１０と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
軽鎖可変ドメインＶＬが、配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体がモノクローナルであることを特徴とする、請求項１から１０に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体がヒト化されていることを特徴とする、請求項１から１１に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体がＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする、請求項１から１２に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、Ａｓｎ２９７で糖鎖でグリコシル化されており、よって該糖鎖内のフコース量が６５％以下であることを特徴とする、請求項１から１３に記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１から１４に記載の抗体を含有することを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１６】
癌の治療のための請求項１から１４に記載の抗体。
【請求項１７】
癌の治療のための医薬の製造における請求項１から１４に記載の抗体の使用。
【請求項１８】
癌に罹患している患者を、治療を必要とする該患者に、請求項１から１４に記載の抗体を投与することにより治療する方法。
【請求項１９】
ヒトＨＥＲ３に結合する抗体の重鎖と軽鎖をコードする核酸において、該抗体が請求項２に記載の可変ドメインを含むことを特徴とする核酸。
【請求項２０】
原核生物又は真核生物の宿主細胞に、請求項１から９に記載の抗体を発現させるための請求項１９に記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターを含有する原核生物又は真核生物の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１から１４に記載の組換え抗体の生産方法であって、原核生物又は真核生物宿主細胞中において請求項１９に記載の核酸を発現させ、該細胞又は細胞培養物の上清から該抗体を回収することを特徴とする方法。
【請求項１】
重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１Ｌ領域又は配列番号：７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、ヒトＨＥＲ３に結合する抗体。
【請求項２】
重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：９であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１０であるか、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１１であることを特徴とし、又はそのヒト化型である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：６のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：９であり、又は軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１１であることを特徴とする、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
重鎖可変ドメインが、配列番号：１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号：２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号：３のＣＤＲ１Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、配列番号：４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号：５のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号：７のＣＤＲ１Ｌ領域を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
重鎖可変ドメインＶＨが配列番号：８であり；軽鎖可変ドメインＶＬが配列番号：１０であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ヒトＨＥＲ３に結合する抗体であって、配列番号：８と少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインＶＨと、配列番号：９、配列番号：１０、又は配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含む抗体。
【請求項８】
軽鎖可変ドメインＶＬが、配列番号：９と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
軽鎖可変ドメインＶＬが、配列番号：１０と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
軽鎖可変ドメインＶＬが、配列番号：１１と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体がモノクローナルであることを特徴とする、請求項１から１０に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体がヒト化されていることを特徴とする、請求項１から１１に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体がＩｇＧ１サブクラスのものであることを特徴とする、請求項１から１２に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、Ａｓｎ２９７で糖鎖でグリコシル化されており、よって該糖鎖内のフコース量が６５％以下であることを特徴とする、請求項１から１３に記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１から１４に記載の抗体を含有することを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１６】
癌の治療のための請求項１から１４に記載の抗体。
【請求項１７】
癌の治療のための医薬の製造における請求項１から１４に記載の抗体の使用。
【請求項１８】
癌に罹患している患者を、治療を必要とする該患者に、請求項１から１４に記載の抗体を投与することにより治療する方法。
【請求項１９】
ヒトＨＥＲ３に結合する抗体の重鎖と軽鎖をコードする核酸において、該抗体が請求項２に記載の可変ドメインを含むことを特徴とする核酸。
【請求項２０】
原核生物又は真核生物の宿主細胞に、請求項１から９に記載の抗体を発現させるための請求項１９に記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載のベクターを含有する原核生物又は真核生物の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１から１４に記載の組換え抗体の生産方法であって、原核生物又は真核生物宿主細胞中において請求項１９に記載の核酸を発現させ、該細胞又は細胞培養物の上清から該抗体を回収することを特徴とする方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１３−５１４７９３（Ｐ２０１３−５１４７９３Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４５２５５（Ｐ２０１２−５４５２５５）
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０７００６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７６６８３
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５１２０３６３８４）ロシュ グリクアート アーゲー (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１７日（２０１０．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０７００６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７６６８３
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５１２０３６３８４）ロシュ グリクアート アーゲー (8)
【Ｆターム（参考）】
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