改良されたＲＮＡポリメラーゼ変異体
【課題】 主細胞を用いて生産される組換えＲＮＡポリメラーゼであって、野生型（天然型）ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列を変異することで宿主細胞での生産性が向上したＲＮＡポリメラーゼ、該ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を用いるＲＮＡポリメラーゼの製造法を提供すること。
【解決手段】 宿主細胞を用いて生産される組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼであって、野生型（天然型）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、４９０番目のメチオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたことで、宿主細胞での生産性が野生型の生産性と比較して向上した、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体により、前記課題を解決する。
【解決手段】 宿主細胞を用いて生産される組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼであって、野生型（天然型）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、４９０番目のメチオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたことで、宿主細胞での生産性が野生型の生産性と比較して向上した、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体により、前記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細胞を用いて生産される組換えＲＮＡポリメラーゼであって、野生型（天然型）ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列を変異することで宿主細胞での生産性が向上したＲＮＡポリメラーゼ、該ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を用いるＲＮＡポリメラーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の伸長反応を行なう酵素であるポリメラーゼは、基質となる核酸よってＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡポリメラーゼとに大別される。ＤＮＡポリメラーゼは、更にＤＮＡ複製やＤＮＡ修復において中心的な役割を担うＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼと逆転写やテロメア合成を行なうＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼの２つに分けられる。一方、ＲＮＡポリメラーゼは、ｍＲＮＡやｒＲＮＡなどを合成するＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡウイルスで重要な機能を果たすＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ、そして特定の鋳型を必要としないＲＮＡポリメラーゼの３つに分けられる。
【０００３】
ポリメラーゼは生命現象を理解する上で重要な研究対象であるだけでなく、産業上も重要な酵素であり、さまざま産業分野で応用されている。例えば、ＤＮＡを増幅する手法であるＰＣＲ法ではＴａｑポリメラーゼが、ＲＮＡを増幅する手法であるＴＲＣ法（特許文献１及び非特許文献１）ではＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが応用されている。
【０００４】
以上のような、既に産業分野で応用されているポリメラーゼには、機能を強化した変異型酵素が知られているものも多い。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでは、アミノ酸置換により認識するプロモーター配列を改変したもの（特許文献２）、高温での比活性及び熱安定性を高めたもの（特許文献３）、アミノ酸の欠失と置換により３’−デオキシリボヌクレオチドの取り込み能を増強したもの（特許文献４）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献２】米国特許第５３８５８３４号公報
【特許文献３】特表２００３−５２５６２７号公報
【特許文献４】特開２００３−０６１６８３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等の既に産業分野での応用が進んでいるポリメラーゼでは、機能を強化した種々の変異型酵素が知られている。しかしながら、かかる機能強化は活性を向上する、特異性を向上する、何らかの耐性を向上する、等といった機能強化ばかりであり、その生産性、即ち、宿主細胞での生産性（宿主細胞中での発現性）の向上等、当該酵素そのものをより大量に生産する、等という観点からの機能強化ではない。
【０００８】
そこで本発明は、宿主細胞を用いて生産される組換えＲＮＡポリメラーゼであって、野生型（天然型）ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列を変異することで宿主細胞での生産性が向上したＲＮＡポリメラーゼ、該ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を用いるＲＮＡポリメラーゼの製造法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究した結果、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸を遺伝子工学的手法によって変異（他のアミノ酸への置換）することで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの生産性を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち本発明は、宿主細胞を用いて生産される組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼであって、野生型（天然型）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、４９０番目のメチオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたことで、宿主細胞での生産性が野生型の生産性と比較して向上した、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体である。また本発明は、かかるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子である。また本発明は、かかるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞である。そして本発明は、かかるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を培養することからなる、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの生産方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列（配列番号６）のうち、４９０番目のメチオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたものである。置換する「他のアミノ酸残基」は特に制限されないが、バリン、ロイシン、イソロイシン又はファニルアラニンといった疎水性アミノ酸が好ましいアミノ酸残基として例示でき、また中でもバリンは、特に好ましくいアミノ酸残基として例示することができる。結果的にみれば、４９０番目のメチオニンに相当するアミノ酸残基を上記のように置換することによってＴ７ＲＮＡポリメラーゼの疎水性が増加し安定性が向上したと考えられる。
【００１２】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの立体構造は明らかになっている。４９０番目のメチオニンに相当するアミノ酸残基の置換は「生産性の向上」を達成する上で必須であるが、本発明では４９０番目の変異に加え、従来知られているＴ７ＲＮＡポリメラーゼの活性を向上するための変異等が重畳的に加えられていても良い。かかる変異としては、例えば、１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基、７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基及び６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基のいずれか一以上のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換を例示することができる。ここで、１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基をグルタミン酸等に置換する変異が加えられたＴ７ＲＮＡポリメラーゼでは、更に熱安定性および比活性の向上という効果を達成することが可能であり、７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基をロイシンおよびメチオニン等に置換する変異が加えられたＴ７ＲＮＡポリメラーゼでは、更に熱安定性および比活性の向上という効果を達成することが可能であり、６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基をアラニン等に置換する変異が加えられたＴ７ＲＮＡポリメラーゼでは、更に熱安定性の向上という効果を達成することが可能である。
【００１３】
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする本発明の遺伝子は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号６）へ変異を導入することによって得ることができる。所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知であり、例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出といった公知の技術を適宜使用することができ、また例えば実施例において説明した手法を参照することもできる。なお、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、例えばＴ７ファージ（ＤＳＭ Ｎｏ．４６２３，ＡＴＣＣ １１３０３−Ｂ７、ＮＣＩＭＢ１０３８０等）から、そのゲノム情報から作製した適当なプライマー（かかるプライマーの設計は、いわゆる当業者にとって容易である）を用いてＰＣＲによって取得することができる。
【００１４】
本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、細胞（宿主細胞）を、本発明の遺伝子を含むベクターで形質転換し、当該細胞を培養することによって生産することができる。
【００１５】
本発明の遺伝子を含むベクターは特に限定されず、例えば自立複製型ベクターでも良いし、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターであっても良いが、本発明の遺伝子に対し、その転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結された発現ベクターが特に好ましい。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択すれば良い。大腸菌のための好適なプロモーターとしては、例えばｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ又はｔａｃプロモーター等を例示することができる。また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、プロモーター以外の有用な配列が付加されていても良い。例えば、生産された本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを宿主細胞の細胞外へ分泌させるためのシグナルペプチドをコードする遺伝子を付加したり、生産後の精製操作を簡便にする目的で末端にヒスチジンヘキサマーを含んだタグ配列を付加する遺伝子を付加することが例示できる。
【００１６】
なお、例えば宿主細胞として大腸菌を利用する場合、適当なプラスミドに目的の遺伝子を組み込んで本発明のベクターとすることが簡便である。かかるプラスミドとしては、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、ｐＣＤＦ−１ｂ（タカラバイオ製）といった発現用プラスミドが例示できる。
【００１７】
本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを生産するためには、宿主細胞として、酵母、動物細胞株、植物細胞、昆虫細胞等の各種培養細胞が使用できるが、ＪＭ１０９株やＨＢ１０１株といった、バクテリオファージの感染先で、かつ、取り扱いの簡便な大腸菌が好適な細胞（宿主）として例示できる。
【００１８】
ベクターによる宿主細胞の形質転換は、通常の方法に従えば良い。このようにして得られる形質転換体を、導入した本発明の遺伝子の発現を可能にする条件下、適切な栄養培地中で培養することで、本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを生産することができる。培養液からの変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの抽出は、通常のタンパク質の精製方法を適用して行うことができる。例えば、本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが細胞内に発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、適当な水系緩衝液に懸濁後、界面活性剤、リゾチーム処理、超音波破砕機等や市販のタンパク質抽出試薬などで抽出する。
【００１９】
得られた抽出液に含まれるＲＮＡポリメラーゼ量は、通常のタンパク質で用いられる分析法で測定することができる。例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドを用いた電気泳動法やイオン交換、疎水性相互作用、ゲルろ過などによる各種クロマトグラフィーを用いることができる。また少量のサンプルでも迅速に測定が可能なキャピラリーやマイクロチップなどを用いた電気泳動法も用いることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、宿主細胞を用いて生産される組換えＲＮＡポリメラーゼであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列を変異することで宿主細胞での生産性が向上したＲＮＡポリメラーゼである。後述する実施例で示したように、野生型のものと同等の活性等を有するものを、野生型と比較して約２倍の生産性で生産することができる（実施例４参照）。
【００２１】
この結果、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体では、野生型のものと同一のコストで、より大量に生産することができる。これにより、産業分野での適用が進むＴ７ＲＮＡポリメラーゼをより安価に提供して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが適用されている種々の試薬や試験等のコストを引き下げることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをクローニングしたプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌの制限酵素地図。
【図２】野生型及びＭ４９０Ｖ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼポリアクリルアミド電気泳動で経時的に分析した結果。レーン１は分子量マーカー、レーン２はＩＰＴＧ添加前（野生型）、レーン３はＩＰＴＧ添加１時間後（野生型）、レーン４はＩＰＴＧ添加２時間後（野生型）、レーン５はＩＰＴＧ添加３時間後（野生型）、レーン６は分子量マーカー、レーン７は分子量マーカー、レーン８はＩＰＴＧ添加前（Ｍ４９０Ｖ）、レーン９はＩＰＴＧ添加１時間後（Ｍ４９０Ｖ）、レーン１０はＩＰＴＧ添加２時間後（Ｍ４９０Ｖ）、レーン１１はＩＰＴＧ添加３時間後（Ｍ４９０Ｖ）、レーン１２は分子量マーカー、の結果をそれぞれ示す。
【図３】ＩＰＴＧ添加前の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの菌体抽出物を全自動チップ電気泳動システムで分析した結果。縦軸は蛍光強度（装置からの読み取り値）、横軸は時間（秒）をそれぞれ示す。
【図４】ＩＰＴＧ添加３時間後の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの菌体抽出物を全自動チップ電気泳動システムで分析した結果。縦軸は蛍光強度（装置からの読み取り値）、横軸は時間（秒）をそれぞれ示す。
【図５】ＩＰＴＧ添加前のＭ４９０Ｖ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの菌体抽出物を全自動チップ電気泳動システムで分析した結果。縦軸は蛍光強度（装置からの読み取り値）、横軸は時間（秒）をそれぞれ示す。
【図６】ＩＰＴＧ添加３時間後のＭ４９０Ｖ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの菌体抽出物を全自動チップ電気泳動システムで分析した結果。縦軸は蛍光強度（装置からの読み取り値）、横軸は時間（秒）をそれぞれ示す。
【図７】精製された野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを全自動チップ電気泳動システムで分析した結果。縦軸は蛍光強度（装置からの読み取り値）、横軸は時間（秒）をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
実施例１ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
【００２５】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニングは以下の方法に従い実施した。
（１）Ｔ７ファージゲノミックＤＮＡライブラリー（シグマ製）を鋳型プラスミドとして、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、以下の試薬組成及び反応条件にて、前半部分と後半部分に分けてＰＣＲ法を用い増幅した。なお、試薬組成のうち合成ＤＮＡプライマーは、前半部分の増幅にはプライマーＦＦ（配列番号１、３’末端側２０塩基は配列番号５の１から２０番目の塩基に相当）及びプライマーＦＲ（配列番号２、配列番号５の１８１３から１８３９番目の塩基の相補鎖に相当）を、後半部分の増幅にはプライマーＲＦ（配列番号３、配列番号５の１８２５から１８５３番目の塩基に相当）及びプライマーＲＲ（配列番号４、３’末端側２０塩基は配列番号５の２６３３から２６５２番目の塩基の相補鎖に相当）を、それぞれ用いた。
【００２６】
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
各２００ｐＭ 合成ＤＮＡプライマー
１００ｎｇ 鋳型プラスミド
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｅｘ
Ｔａｑ（商品名）、タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱
後、９４℃・１分、５８℃・３０秒、７２℃・１分の温度サイクルを２５回繰り返
した。
（２）ＰＣＲ反応後の液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（３）精製したＰＣＲ産物のうち、前半部分のＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＨＩ（ニューイングランドバイオラボ製）及びＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ製）で消化し、制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ製）及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（４）（３）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、１％ 寒天、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆとした。
（５）常法に従いｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆを調製後、後半部分のＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＦにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（６）（５）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、１％ 寒天、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌとした。図１にｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌの制限酵素地図を示す。なお、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子については実施例２に示す方法を用いて塩基配列を決定することにより、意図しない変異が導入されていないことを確認した。得られたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子配列を配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ８８１６９４の１から２６５２番目の塩基に相当）に、アミノ酸配列を配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿０４１９６０と同一の配列）に示す。
【００２７】
実施例２ 塩基配列確認方法
実施例１で作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを生産する組換え大腸菌を、３７℃のＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））で一晩培養後、定法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドに含まれるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列決定は以下の方法で行なった。
（１）ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、添付のバッファー２．０μＬ、プレミックス４．０μＬ、合成ＤＮＡプライマー３．２ｐｍｏｌ、鋳型プラスミド５００ｎｇを滅菌水にて２０μＬに調製し、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９６℃で１分加熱後、９６℃・１０秒、５０℃・５秒、６０℃・４分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）（１）で調製した塩基配列決定用サンプルをＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ 精製キット（商品名）Ｃｅｎｔｒｉ―Ｓｅｐスピンカラム（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、以下に示す方法で精製した。
（２−１）ＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ溶液２０μＬと及びＳＡＭ溶液９０μＬを加え、振とう器で３０分間激しく撹拌振とうさせる。
（２−２）１０００Ｇで２分間遠心分離する。
（３）（２）で調製した塩基配列決定用サンプルをＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ジェネティックアナライザ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で解析することで、塩基配列を決定した。塩基配列決定に使用した合成ＤＮＡプライマーは、（４）決定した塩基配列はＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．８．０（商品名）（ゼネティクス製）を使用して解析を行なった。
【００２８】
プライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号７）、プライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号８）、プライマーＴ７Ｆ０（配列番号９）、プライマーＴ７Ｆ１（配列番号１０、配列番号５の２５８から２８７番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ２（配列番号１１、配列番号５の７１１から７４０番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ３（配列番号１２、配列番号５の１１６３から１１９２番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ４（配列番号１３、配列番号５の１６１５から１６４４番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ５（配列番号１４、配列番号５の２０６６から２０９５番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ６（配列番号１５、配列番号５の２５２０から２５４９番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｒ０（配列番号１６）、プライマーＴ７Ｒ１（配列番号１７、配列番号５の２３９０から２４１９番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ２（配列番号１８、配列番号５の１９３２から１９６１番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ３（配列番号１９、配列番号５の１４７６から１５０４番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ４（配列番号２０、配列番号５の１０２５から１０５４番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ５（配列番号２１、配列番号５の５６１から５９０番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ６（配列番号２２、配列番号５の１１１から１４０番目の塩基の相補鎖に相当）を必要に応じて選択し使用した。
【００２９】
実施例３ Ｍ４９０Ｖ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの作製
実施例１で作製したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌプラスミド（図１）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子より、以下の手順で、アミノ酸配列４９０番目のメチオニンがバリンに変異したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体（Ｍ４９０Ｖ変異体）を作製した。
（１）ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌプラスミド（図１）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、ＰＣＲ反応を行なった。なお、合成プライマーはプライマーＭ４９０ＶＦ（配列番号２３）とプライマーＦＲ（配列番号２）の組み合わせ、及びプライマーＦＦ（配列番号１）とプライマーＭ４９０ＶＲ（配列番号２４）の組み合わせを用いた。
【００３０】
（試薬組成）（総反応液量：５０μＬ）
各１００ｐＭ 合成ＤＮＡプライマー
５０ｎｇ 鋳型プラスミド
０．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ
ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９６℃で３０秒加
熱後、９６℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・３分の温度サイクルを３０回繰
り返した。
（２）反応液を１％アガロース電気泳動で分離後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（３）（２）で得られた、２種類の精製ＰＣＲ産物を鋳型として、さらにＰＣＲ反応を行ない、Ｍ４９０Ｖ変異体遺伝子を作製した。なお、ＰＣＲ反応における試薬組成、反応条件、及び精製操作は、合成ＤＮＡプライマーとしてプライマーＦＦ（配列番号１）及びプライマーＦＲ（配列番号２）の組み合わせを使用した他は（１）から（２）と同じ条件である。
（４）（３）で得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ製）及びＢｓｐＨＩ（ニューイングランドバイオラボ製）で消化後、制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ製）で消化したｐＴｒｃ９９Ａベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）に、Ｔ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（５）（４）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、１％ 寒天、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆ−Ｍ４９０Ｖとした。
（６）常法に従いｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆ−Ｍ４９０Ｖを調製後、実施例１で調製した制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子後半部分の精製ＰＣＲ産物を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆ−Ｍ４９０ＶにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（７）（６）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、１％ 寒天、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをＭ４９０Ｖ変異体とした。なおＭ４９０Ｖ変異については、実施例２に示す塩基配列決定方法を用いることにより、変異の導入を確認した。その遺伝子配列を配列番号２５に、アミノ酸配列を配列番号２６に示す。
【００３１】
実施例４ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの生産量確認
野生型及びＭ４９０Ｖ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの培養は以下の手順で行なった。
（１）ＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））３ｍＬに実施例１及び３で得た野生型及びＭ４９０Ｖ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを産生する組換え大腸菌を植菌し、１８ｍＬ試験管にて３７℃で一晩振とう培養した。
（２）２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％ バクトトリプトン、１％ バクト酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））１００ｍＬに（１）の前培養液１．０ｍＬを植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付き三角フラスコにて、３７℃、１５０回転／分（タイテック製、ロータリー式）で培養した。
（３）（２）の培養約３から４時間後（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍの値としておよそ２．０から３．０程度）に５００ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）１００μＬを添加し、温度を３０℃に下げて更に３時間振とう培養した。
（４）ＩＰＴＧを添加した後は1時間おきに培養液を適量サンプリングし、そのうちの９００μＬを１４０００回転／分で５分間遠心分離にて菌体を回収し、回収した菌体は−３０で保存した。
（５）回収した菌体に核酸分解酵素Ｂｅｎｚｏｎａｅ（商品名、ノバジェン製）を含むタンパク質抽出液ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商品名、ノバジェン製）を１８０μＬ加え、よく懸濁させたのち、室温にて１時間処理した。
（６）得られた抽出液を４℃にて１２０００回転／分で１０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清の一部をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で分析し、タンパク質の生産量を経時的に解析した。ＩＰＴＧの添加により野生型及びＭ４９０Ｖ変異型とも顕著にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを生産が確認された。９８ＫＤａ付近のＴ７ＲＮＡポリメラーゼに相当するバンドの濃さから、Ｍ４９０Ｖ変異型は野生型よりも多く生産し、Ｍ４９０Ｖの変異によりＴ７ＲＮＡポリメラーゼの生産量が増加することがわかる（図２）。
（７）また全自動チップ電気泳動システム、エクスペリオン（商品名、バイオラッド製）による定量解析を行なった。ＩＰＴＧ添加３時間後のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの含量は、野生型の９．１％からＭ４９０Ｖ変異型は１６．５％に増加し、Ｍ４９０Ｖの変異により生産効率も向上していることがわかる（図４、図６、表１）。
【００３２】
以上の実施例で使用した各配列については、配列表のほか、表２にも示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細胞を用いて生産される組換えＲＮＡポリメラーゼであって、野生型（天然型）ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列を変異することで宿主細胞での生産性が向上したＲＮＡポリメラーゼ、該ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を用いるＲＮＡポリメラーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の伸長反応を行なう酵素であるポリメラーゼは、基質となる核酸よってＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡポリメラーゼとに大別される。ＤＮＡポリメラーゼは、更にＤＮＡ複製やＤＮＡ修復において中心的な役割を担うＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼと逆転写やテロメア合成を行なうＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼの２つに分けられる。一方、ＲＮＡポリメラーゼは、ｍＲＮＡやｒＲＮＡなどを合成するＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼと、ＲＮＡウイルスで重要な機能を果たすＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ、そして特定の鋳型を必要としないＲＮＡポリメラーゼの３つに分けられる。
【０００３】
ポリメラーゼは生命現象を理解する上で重要な研究対象であるだけでなく、産業上も重要な酵素であり、さまざま産業分野で応用されている。例えば、ＤＮＡを増幅する手法であるＰＣＲ法ではＴａｑポリメラーゼが、ＲＮＡを増幅する手法であるＴＲＣ法（特許文献１及び非特許文献１）ではＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが応用されている。
【０００４】
以上のような、既に産業分野で応用されているポリメラーゼには、機能を強化した変異型酵素が知られているものも多い。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼでは、アミノ酸置換により認識するプロモーター配列を改変したもの（特許文献２）、高温での比活性及び熱安定性を高めたもの（特許文献３）、アミノ酸の欠失と置換により３’−デオキシリボヌクレオチドの取り込み能を増強したもの（特許文献４）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−０１４４００号公報
【特許文献２】米国特許第５３８５８３４号公報
【特許文献３】特表２００３−５２５６２７号公報
【特許文献４】特開２００３−０６１６８３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等の既に産業分野での応用が進んでいるポリメラーゼでは、機能を強化した種々の変異型酵素が知られている。しかしながら、かかる機能強化は活性を向上する、特異性を向上する、何らかの耐性を向上する、等といった機能強化ばかりであり、その生産性、即ち、宿主細胞での生産性（宿主細胞中での発現性）の向上等、当該酵素そのものをより大量に生産する、等という観点からの機能強化ではない。
【０００８】
そこで本発明は、宿主細胞を用いて生産される組換えＲＮＡポリメラーゼであって、野生型（天然型）ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列を変異することで宿主細胞での生産性が向上したＲＮＡポリメラーゼ、該ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を用いるＲＮＡポリメラーゼの製造法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究した結果、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸を遺伝子工学的手法によって変異（他のアミノ酸への置換）することで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの生産性を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち本発明は、宿主細胞を用いて生産される組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼであって、野生型（天然型）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、４９０番目のメチオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたことで、宿主細胞での生産性が野生型の生産性と比較して向上した、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体である。また本発明は、かかるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子である。また本発明は、かかるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞である。そして本発明は、かかるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を培養することからなる、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの生産方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列（配列番号６）のうち、４９０番目のメチオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたものである。置換する「他のアミノ酸残基」は特に制限されないが、バリン、ロイシン、イソロイシン又はファニルアラニンといった疎水性アミノ酸が好ましいアミノ酸残基として例示でき、また中でもバリンは、特に好ましくいアミノ酸残基として例示することができる。結果的にみれば、４９０番目のメチオニンに相当するアミノ酸残基を上記のように置換することによってＴ７ＲＮＡポリメラーゼの疎水性が増加し安定性が向上したと考えられる。
【００１２】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの立体構造は明らかになっている。４９０番目のメチオニンに相当するアミノ酸残基の置換は「生産性の向上」を達成する上で必須であるが、本発明では４９０番目の変異に加え、従来知られているＴ７ＲＮＡポリメラーゼの活性を向上するための変異等が重畳的に加えられていても良い。かかる変異としては、例えば、１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基、７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基及び６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基のいずれか一以上のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換を例示することができる。ここで、１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基をグルタミン酸等に置換する変異が加えられたＴ７ＲＮＡポリメラーゼでは、更に熱安定性および比活性の向上という効果を達成することが可能であり、７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基をロイシンおよびメチオニン等に置換する変異が加えられたＴ７ＲＮＡポリメラーゼでは、更に熱安定性および比活性の向上という効果を達成することが可能であり、６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基をアラニン等に置換する変異が加えられたＴ７ＲＮＡポリメラーゼでは、更に熱安定性の向上という効果を達成することが可能である。
【００１３】
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする本発明の遺伝子は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号６）へ変異を導入することによって得ることができる。所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知であり、例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出といった公知の技術を適宜使用することができ、また例えば実施例において説明した手法を参照することもできる。なお、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、例えばＴ７ファージ（ＤＳＭ Ｎｏ．４６２３，ＡＴＣＣ １１３０３−Ｂ７、ＮＣＩＭＢ１０３８０等）から、そのゲノム情報から作製した適当なプライマー（かかるプライマーの設計は、いわゆる当業者にとって容易である）を用いてＰＣＲによって取得することができる。
【００１４】
本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、細胞（宿主細胞）を、本発明の遺伝子を含むベクターで形質転換し、当該細胞を培養することによって生産することができる。
【００１５】
本発明の遺伝子を含むベクターは特に限定されず、例えば自立複製型ベクターでも良いし、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターであっても良いが、本発明の遺伝子に対し、その転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結された発現ベクターが特に好ましい。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択すれば良い。大腸菌のための好適なプロモーターとしては、例えばｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ又はｔａｃプロモーター等を例示することができる。また、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は、プロモーター以外の有用な配列が付加されていても良い。例えば、生産された本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを宿主細胞の細胞外へ分泌させるためのシグナルペプチドをコードする遺伝子を付加したり、生産後の精製操作を簡便にする目的で末端にヒスチジンヘキサマーを含んだタグ配列を付加する遺伝子を付加することが例示できる。
【００１６】
なお、例えば宿主細胞として大腸菌を利用する場合、適当なプラスミドに目的の遺伝子を組み込んで本発明のベクターとすることが簡便である。かかるプラスミドとしては、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、ｐＣＤＦ−１ｂ（タカラバイオ製）といった発現用プラスミドが例示できる。
【００１７】
本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを生産するためには、宿主細胞として、酵母、動物細胞株、植物細胞、昆虫細胞等の各種培養細胞が使用できるが、ＪＭ１０９株やＨＢ１０１株といった、バクテリオファージの感染先で、かつ、取り扱いの簡便な大腸菌が好適な細胞（宿主）として例示できる。
【００１８】
ベクターによる宿主細胞の形質転換は、通常の方法に従えば良い。このようにして得られる形質転換体を、導入した本発明の遺伝子の発現を可能にする条件下、適切な栄養培地中で培養することで、本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを生産することができる。培養液からの変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの抽出は、通常のタンパク質の精製方法を適用して行うことができる。例えば、本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが細胞内に発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、適当な水系緩衝液に懸濁後、界面活性剤、リゾチーム処理、超音波破砕機等や市販のタンパク質抽出試薬などで抽出する。
【００１９】
得られた抽出液に含まれるＲＮＡポリメラーゼ量は、通常のタンパク質で用いられる分析法で測定することができる。例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドを用いた電気泳動法やイオン交換、疎水性相互作用、ゲルろ過などによる各種クロマトグラフィーを用いることができる。また少量のサンプルでも迅速に測定が可能なキャピラリーやマイクロチップなどを用いた電気泳動法も用いることができる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、宿主細胞を用いて生産される組換えＲＮＡポリメラーゼであって、野生型ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列を変異することで宿主細胞での生産性が向上したＲＮＡポリメラーゼである。後述する実施例で示したように、野生型のものと同等の活性等を有するものを、野生型と比較して約２倍の生産性で生産することができる（実施例４参照）。
【００２１】
この結果、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体では、野生型のものと同一のコストで、より大量に生産することができる。これにより、産業分野での適用が進むＴ７ＲＮＡポリメラーゼをより安価に提供して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが適用されている種々の試薬や試験等のコストを引き下げることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをクローニングしたプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌの制限酵素地図。
【図２】野生型及びＭ４９０Ｖ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼポリアクリルアミド電気泳動で経時的に分析した結果。レーン１は分子量マーカー、レーン２はＩＰＴＧ添加前（野生型）、レーン３はＩＰＴＧ添加１時間後（野生型）、レーン４はＩＰＴＧ添加２時間後（野生型）、レーン５はＩＰＴＧ添加３時間後（野生型）、レーン６は分子量マーカー、レーン７は分子量マーカー、レーン８はＩＰＴＧ添加前（Ｍ４９０Ｖ）、レーン９はＩＰＴＧ添加１時間後（Ｍ４９０Ｖ）、レーン１０はＩＰＴＧ添加２時間後（Ｍ４９０Ｖ）、レーン１１はＩＰＴＧ添加３時間後（Ｍ４９０Ｖ）、レーン１２は分子量マーカー、の結果をそれぞれ示す。
【図３】ＩＰＴＧ添加前の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの菌体抽出物を全自動チップ電気泳動システムで分析した結果。縦軸は蛍光強度（装置からの読み取り値）、横軸は時間（秒）をそれぞれ示す。
【図４】ＩＰＴＧ添加３時間後の野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの菌体抽出物を全自動チップ電気泳動システムで分析した結果。縦軸は蛍光強度（装置からの読み取り値）、横軸は時間（秒）をそれぞれ示す。
【図５】ＩＰＴＧ添加前のＭ４９０Ｖ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの菌体抽出物を全自動チップ電気泳動システムで分析した結果。縦軸は蛍光強度（装置からの読み取り値）、横軸は時間（秒）をそれぞれ示す。
【図６】ＩＰＴＧ添加３時間後のＭ４９０Ｖ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの菌体抽出物を全自動チップ電気泳動システムで分析した結果。縦軸は蛍光強度（装置からの読み取り値）、横軸は時間（秒）をそれぞれ示す。
【図７】精製された野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを全自動チップ電気泳動システムで分析した結果。縦軸は蛍光強度（装置からの読み取り値）、横軸は時間（秒）をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
実施例１ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
【００２５】
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニングは以下の方法に従い実施した。
（１）Ｔ７ファージゲノミックＤＮＡライブラリー（シグマ製）を鋳型プラスミドとして、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、以下の試薬組成及び反応条件にて、前半部分と後半部分に分けてＰＣＲ法を用い増幅した。なお、試薬組成のうち合成ＤＮＡプライマーは、前半部分の増幅にはプライマーＦＦ（配列番号１、３’末端側２０塩基は配列番号５の１から２０番目の塩基に相当）及びプライマーＦＲ（配列番号２、配列番号５の１８１３から１８３９番目の塩基の相補鎖に相当）を、後半部分の増幅にはプライマーＲＦ（配列番号３、配列番号５の１８２５から１８５３番目の塩基に相当）及びプライマーＲＲ（配列番号４、３’末端側２０塩基は配列番号５の２６３３から２６５２番目の塩基の相補鎖に相当）を、それぞれ用いた。
【００２６】
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
各２００ｐＭ 合成ＤＮＡプライマー
１００ｎｇ 鋳型プラスミド
０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ Ｅｘ
Ｔａｑ（商品名）、タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱
後、９４℃・１分、５８℃・３０秒、７２℃・１分の温度サイクルを２５回繰り返
した。
（２）ＰＣＲ反応後の液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（３）精製したＰＣＲ産物のうち、前半部分のＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＨＩ（ニューイングランドバイオラボ製）及びＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ製）で消化し、制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ製）及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（４）（３）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、１％ 寒天、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆとした。
（５）常法に従いｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆを調製後、後半部分のＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＦにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（６）（５）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、１％ 寒天、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌとした。図１にｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌの制限酵素地図を示す。なお、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子については実施例２に示す方法を用いて塩基配列を決定することにより、意図しない変異が導入されていないことを確認した。得られたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子配列を配列番号５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＦＪ８８１６９４の１から２６５２番目の塩基に相当）に、アミノ酸配列を配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＮＰ＿０４１９６０と同一の配列）に示す。
【００２７】
実施例２ 塩基配列確認方法
実施例１で作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを生産する組換え大腸菌を、３７℃のＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））で一晩培養後、定法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドに含まれるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列決定は以下の方法で行なった。
（１）ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、添付のバッファー２．０μＬ、プレミックス４．０μＬ、合成ＤＮＡプライマー３．２ｐｍｏｌ、鋳型プラスミド５００ｎｇを滅菌水にて２０μＬに調製し、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９６℃で１分加熱後、９６℃・１０秒、５０℃・５秒、６０℃・４分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）（１）で調製した塩基配列決定用サンプルをＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ 精製キット（商品名）Ｃｅｎｔｒｉ―Ｓｅｐスピンカラム（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、以下に示す方法で精製した。
（２−１）ＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ溶液２０μＬと及びＳＡＭ溶液９０μＬを加え、振とう器で３０分間激しく撹拌振とうさせる。
（２−２）１０００Ｇで２分間遠心分離する。
（３）（２）で調製した塩基配列決定用サンプルをＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ジェネティックアナライザ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で解析することで、塩基配列を決定した。塩基配列決定に使用した合成ＤＮＡプライマーは、（４）決定した塩基配列はＧＥＮＥＴＹＸ ｖｅｒ．８．０（商品名）（ゼネティクス製）を使用して解析を行なった。
【００２８】
プライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号７）、プライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号８）、プライマーＴ７Ｆ０（配列番号９）、プライマーＴ７Ｆ１（配列番号１０、配列番号５の２５８から２８７番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ２（配列番号１１、配列番号５の７１１から７４０番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ３（配列番号１２、配列番号５の１１６３から１１９２番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ４（配列番号１３、配列番号５の１６１５から１６４４番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ５（配列番号１４、配列番号５の２０６６から２０９５番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｆ６（配列番号１５、配列番号５の２５２０から２５４９番目の塩基に相当）、プライマーＴ７Ｒ０（配列番号１６）、プライマーＴ７Ｒ１（配列番号１７、配列番号５の２３９０から２４１９番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ２（配列番号１８、配列番号５の１９３２から１９６１番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ３（配列番号１９、配列番号５の１４７６から１５０４番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ４（配列番号２０、配列番号５の１０２５から１０５４番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ５（配列番号２１、配列番号５の５６１から５９０番目の塩基の相補鎖に相当）、プライマーＴ７Ｒ６（配列番号２２、配列番号５の１１１から１４０番目の塩基の相補鎖に相当）を必要に応じて選択し使用した。
【００２９】
実施例３ Ｍ４９０Ｖ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの作製
実施例１で作製したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌプラスミド（図１）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子より、以下の手順で、アミノ酸配列４９０番目のメチオニンがバリンに変異したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体（Ｍ４９０Ｖ変異体）を作製した。
（１）ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌプラスミド（図１）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、ＰＣＲ反応を行なった。なお、合成プライマーはプライマーＭ４９０ＶＦ（配列番号２３）とプライマーＦＲ（配列番号２）の組み合わせ、及びプライマーＦＦ（配列番号１）とプライマーＭ４９０ＶＲ（配列番号２４）の組み合わせを用いた。
【００３０】
（試薬組成）（総反応液量：５０μＬ）
各１００ｐＭ 合成ＤＮＡプライマー
５０ｎｇ 鋳型プラスミド
０．１ｍＭ ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ
ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９６℃で３０秒加
熱後、９６℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・３分の温度サイクルを３０回繰
り返した。
（２）反応液を１％アガロース電気泳動で分離後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（３）（２）で得られた、２種類の精製ＰＣＲ産物を鋳型として、さらにＰＣＲ反応を行ない、Ｍ４９０Ｖ変異体遺伝子を作製した。なお、ＰＣＲ反応における試薬組成、反応条件、及び精製操作は、合成ＤＮＡプライマーとしてプライマーＦＦ（配列番号１）及びプライマーＦＲ（配列番号２）の組み合わせを使用した他は（１）から（２）と同じ条件である。
（４）（３）で得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ製）及びＢｓｐＨＩ（ニューイングランドバイオラボ製）で消化後、制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ製）で消化したｐＴｒｃ９９Ａベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）に、Ｔ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（５）（４）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、１％ 寒天、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆ−Ｍ４９０Ｖとした。
（６）常法に従いｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆ−Ｍ４９０Ｖを調製後、実施例１で調製した制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子後半部分の精製ＰＣＲ産物を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆ−Ｍ４９０ＶにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（７）（６）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、１％ 寒天、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをＭ４９０Ｖ変異体とした。なおＭ４９０Ｖ変異については、実施例２に示す塩基配列決定方法を用いることにより、変異の導入を確認した。その遺伝子配列を配列番号２５に、アミノ酸配列を配列番号２６に示す。
【００３１】
実施例４ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの生産量確認
野生型及びＭ４９０Ｖ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの培養は以下の手順で行なった。
（１）ＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％ ポリペプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））３ｍＬに実施例１及び３で得た野生型及びＭ４９０Ｖ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを産生する組換え大腸菌を植菌し、１８ｍＬ試験管にて３７℃で一晩振とう培養した。
（２）２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％ バクトトリプトン、１％ バクト酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％ グルコース、５０μｇ／ｍＬ カルベニシリン（ｐＨ７．４））１００ｍＬに（１）の前培養液１．０ｍＬを植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付き三角フラスコにて、３７℃、１５０回転／分（タイテック製、ロータリー式）で培養した。
（３）（２）の培養約３から４時間後（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍの値としておよそ２．０から３．０程度）に５００ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）１００μＬを添加し、温度を３０℃に下げて更に３時間振とう培養した。
（４）ＩＰＴＧを添加した後は1時間おきに培養液を適量サンプリングし、そのうちの９００μＬを１４０００回転／分で５分間遠心分離にて菌体を回収し、回収した菌体は−３０で保存した。
（５）回収した菌体に核酸分解酵素Ｂｅｎｚｏｎａｅ（商品名、ノバジェン製）を含むタンパク質抽出液ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商品名、ノバジェン製）を１８０μＬ加え、よく懸濁させたのち、室温にて１時間処理した。
（６）得られた抽出液を４℃にて１２０００回転／分で１０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清の一部をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で分析し、タンパク質の生産量を経時的に解析した。ＩＰＴＧの添加により野生型及びＭ４９０Ｖ変異型とも顕著にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを生産が確認された。９８ＫＤａ付近のＴ７ＲＮＡポリメラーゼに相当するバンドの濃さから、Ｍ４９０Ｖ変異型は野生型よりも多く生産し、Ｍ４９０Ｖの変異によりＴ７ＲＮＡポリメラーゼの生産量が増加することがわかる（図２）。
（７）また全自動チップ電気泳動システム、エクスペリオン（商品名、バイオラッド製）による定量解析を行なった。ＩＰＴＧ添加３時間後のＴ７ＲＮＡポリメラーゼの含量は、野生型の９．１％からＭ４９０Ｖ変異型は１６．５％に増加し、Ｍ４９０Ｖの変異により生産効率も向上していることがわかる（図４、図６、表１）。
【００３２】
以上の実施例で使用した各配列については、配列表のほか、表２にも示す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞を用いて生産される組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼであって、野生型（天然型）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、４９０番目のメチオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたことで、宿主細胞での生産性が野生型の生産性と比較して向上した、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項２】
前記他のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸残基である、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項３】
前記疎水性アミノ酸残基がバリンである、請求項３に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項４】
１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基、７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基及び６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基のいずれか一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、請求項１から３のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞。
【請求項７】
請求項１から３のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を培養することからなる、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの生産方法。
【請求項１】
宿主細胞を用いて生産される組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼであって、野生型（天然型）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、４９０番目のメチオニンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたことで、宿主細胞での生産性が野生型の生産性と比較して向上した、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項２】
前記他のアミノ酸残基が疎水性アミノ酸残基である、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項３】
前記疎水性アミノ酸残基がバリンである、請求項３に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項４】
１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基、７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基及び６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基のいずれか一つ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、請求項１から３のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項１から３のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞。
【請求項７】
請求項１から３のいずれかに記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞を培養することからなる、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの生産方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−７５４１８（Ｐ２０１２−７５４１８Ａ）
【公開日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２６０３９（Ｐ２０１０−２２６０３９）
【出願日】平成２２年１０月５日（２０１０．１０．５）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月５日（２０１０．１０．５）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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