放射線傷害から皮膚を保護する方法
本発明は、電離放射線治療を受けている患者において、電離放射線の望ましくない副作用から皮膚および粘膜を保護する方法、およびそのための組成物に関する。特に、本出願は、Ｎｒｆ２誘導物質の局所使用を含む方法およびその組成物を開示する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
皮膚は、酸化的傷害、熱、寒さ、紫外線、怪我およびメカニカルストレス等を含む外的環境の変化に常に曝されている。最終分化したケラチノサイトからなる角質層は、水分の損失を防ぎ、感染性病原体（例えば、細菌、ウイルス）、小さな物体（例えば、粒子）、および幅広い種類の水溶性化学物質の侵入を防ぐ天然のバリアを構成している。
【０００２】
本発明は、放射線を含む外部からによる傷害から皮膚および粘膜を保護する方法に関する。
【発明の概要】
【０００３】
この目的のために、本発明は、電離放射線治療を受ける患者において皮膚および粘膜を保護する方法を提供するものであって、この方法は、治療上有効な量のＮｒｆ２誘導物質を含む組成物を電離放射線に曝される患者の身体の領域および周辺領域に局所投与することを含む。この処置を受ける患者は、短期または長期の電離放射線治療の影響を受けていてよい。本発明の一態様では、患者は、急性紅斑、皮膚刺激、炎症、浮腫、落屑、皮膚の壊死、口内のひりひりする痛みおよび潰瘍、疼痛、線維症、毛細血管拡張症、口腔乾燥症、眼球乾燥症、膣または直腸粘膜の乾燥および刺激、黒色腫、乳癌、胃癌、肺癌または甲状腺疾患に罹患していてよい。本発明のもう一つの態様では、この処置を受ける患者は症状がなくてもよい。
【０００４】
さらなる実施形態では、電離放射線治療を受ける患者において皮膚および粘膜を保護する方法は、電離放射線に曝される患者の身体の領域および周辺領域に治療上有効な量の第２相酵素誘導物質を含む組成物を局所投与することを含む。一実施形態では、第２相誘導物質は、イソチオシアネートである。好ましい実施形態では、第２相酵素誘導物質は、スルホラファンである。もう一つの好ましい実施形態では、第２相酵素誘導物質は、スルホラファン合成類似体である。スルホラファン類似体は、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノン、エキソ−２−アセチル−６−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−イソチオシアナト−６−メチルスルホニルノルボルナン、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノール、１−イソチオシアナト−４−ジメチルホスホニルブタン、エキソ−２−（１’−ヒドロキシエチル）−５−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−アセチル−５−イソチオシアナトノルボルナン、１−イソチオシアナト−５−メチルスルホニルペンタン、シス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートおよびトランス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートからなる群から選択され得る。
【０００５】
さらに別の実施形態では、Ｎｒｆ２誘導物質はグルコシノレートである。さらなる実施形態では、組成物は、電離放射線治療の前、間、または後に患者に投与される。
【０００６】
さらなる実施形態では、本発明は、皮膚への局所適用のための組成物を提供するものであって、この組成物は、治療上有効な量のＮｒｆ２誘導物質と、送達に適した媒体（ビヒクル）とを含む。Ｎｒｆ２誘導物質の局所送達に適したビヒクルとしては、ホホバ油および月見草油が挙げられる。
【０００７】
好ましくは、組成物中のＮｒｆ２誘導物質は、第２相酵素誘導物質である。より好ましくは、第２相誘導物質は、イソチオシアネートである。さらにより好ましくは、第２相酵素誘導物質は、スルホラファンまたはスルホラファン合成類似体である。スルホラファン類似体は、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノン、エキソ−２−アセチル−６−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−イソチオシアナト−６−メチルスルホニルノルボルナン、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノール、１−イソチオシアナト−４−ジメチルホスホニルブタン、エキソ−２−（１’−ヒドロキシエチル）−５−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−アセチル−５−イソチオシアナトノルボルナン、１−イソチオシアナト−５−メチルスルホニルペンタン、シス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートおよびトランス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートからなる群から選択され得る。
【０００８】
もう一つの実施形態では、Ｎｒｆ２誘導物質は、グルコシノレートである。好ましくは、局所投与のための組成物は、軟膏、クリーム、エマルション、ローション、ゲルまたは日焼け止め剤の形態である。
【０００９】
前述の発明の概要ならびに後述の図面の簡単な説明および発明を実施するための形態は、例示的なものであり、説明のためのものであって、特許請求の範囲に記載した本発明のさらなる説明を提供することを意図するものである。その他の目的、利点、および新規な特徴については、当業者であれば後述する記載から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＰＥネズミケラチノサイト（Ａ）およびヒトＨａＣａＴケラチノサイト（Ｂ）中のスルホラファン濃度に対して、キノンレダクターゼ（ＮＱＯ１）の誘導およびＧＳＨの上昇を示すグラフである。細胞（１穴当たり２０，０００個）を、９６穴プレートに蒔き、一連の濃度のスルホラファンに曝露した。細胞可溶化物中のＧＳＨおよびＮＱＯ１レベルをそれぞれ２４時間後および４８時間後に測定した。各々のデータポイントは、８つの異なる穴の測定値の平均を表す。標準偏差は、全てのデータポイントについて＜５％であった。
【図２】ＵＶＡ線によって生成する反応性酸素中間体に対して、ＰＥネズミケラチノサイト中のスルホラファンによりもたらされる保護を示すグラフである。細胞（１穴当たり５０，０００個）を、２４穴プレートに蒔き、５μＭスルホラファンで２４時間処理し、ＤＰＢＳで洗浄し、次いでＵＶＡに曝露した（１０Ｊ／ｃｍ２）。紫外線により生成された反応性酸素中間体を蛍光プローブ２’，７’−ジクロロジニトロフルオレセインにより定量し、蛍光強度を測定した（曝露細胞の非曝露細胞に対する比として表す）。
【図３】健康なヒトボランティアのヒト皮膚において１００ｎｍｏｌスルホラファンの単回局所投与によるキノンレダクターゼ（ＮＱＯ１）の誘導の経時的推移を示す図である。
【図４】２４時間間隔で５０ｎｍｏｌのスルホラファンを３回局所投与することによる、健康なヒトボランティアのヒト皮膚におけるＮＱＯ１の誘導を示す図である。
【図５】γ−インターフェロンまたはリポ多糖類で刺激したＲＡＷ２６４．７細胞における（Ａ）ＮＯ産生ならびにｉＮＯＳ ｍＲＮＡ（Ｂ）およびタンパク質（Ｃ）誘導への、スルホラファンにより引き起こされる阻害を示す図である。細胞を、様々な濃度のスルホラファンと、ＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはリポ多糖（ＬＰＳ；３ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで２４時間処理した。培地中のＮＯを亜硝酸塩としてＧｒｉｅｓｓ反応（Ａ）により測定し、ｉＮＯＳ誘導をノーザンブロッティング（Ｂ）およびウエスタンブロッティング（Ｃ）により検出した。
【図６】ハイリスクマウスにおいてＵＶＢ線により誘導される皮膚発癌のスルホラファンによる阻害を示す図である。
【図７】スルホラファンの経皮投与によるハイリスクマウスにおける全体的な腫瘍量の阻害を示すグラフである。腫瘍量は、リスクのある動物の数で除算した全ての腫瘍の全容積（ｍｍ３）として表される。平均値±ＳＥが示される。腫瘍容積を対数変換すると（処置時間を入れ子式変数として用いる濃度のＡＮＯＶＡ）、劇的かつ極めて有意な濃度（処置）効果があった（ｐ＜０．００２７）。
【図８】小型腫瘍（＜１ｃｍ３、白色棒）および大型腫瘍（＞１ｃｍ３、黒色棒）の多重度へのスルホラファンの影響を示すグラフである。保護具またはビヒクルでの処置後１１週間に、対照群での腫瘍発生率は１００％であり、実験を停止した。同じ日に全てのマウスを安楽死させ、腫瘍サイズを測定した。低用量の０．３μｍｏｌスルホラファン、高用量の１．０μｍｏｌスルホラファンを毎日、週５回、これらの動物の背側に投与した。
【図９】スルホラファンの食餌投与を受けているハイリスクマウスにおける腫瘍発生率（腫瘍をもつマウスの率）を示すグラフである。対照群は円として表され、低用量群は四角形として表され、高用量群は三角形として表される。低用量および高用量グルコラファニンを与えられている動物における腫瘍発生率は、対照群と比較して、それぞれ２５％および３５％減少した。
【図１０】スルホラファンの食餌投与を受けているハイリスクマウスにおける腫瘍多重度（１匹のマウス当たりの腫瘍の数）を示すグラフである。対照群は円として表され、低用量群は四角形として表され、高用量群は三角形として表される。腫瘍多重度は、対照群と比較して、それぞれ４７％および７２％減少した。
【図１１】スルホラファンの食餌投与を受けているハイリスクマウスにおいて、１匹のマウス当たりの腫瘍量（全腫瘍容積）を示すグラフである。対照群は円として表され、低用量群は四角形として表され、高用量群は三角形として表される。低用量および高用量グルコラファニン処置は両方ともに、対照群と比較して１匹のマウス当たりの全腫瘍容積の７０％阻害という結果となった。
【図１２】３１１ｎｍ紫外線の浮腫および炎症作用に対して、スルホラファンおよびスルホラファンに富むブロッコリースプラウト抽出物によりもたらされるマウス皮膚の保護を示す図である。ＳＫＨ−１無毛マウスの背側を、２４時間間隔で３用量の：（ｉ）５０μｌの８０％アセトン／２０％水（ｖｏｌ／ｖｏｌ）中０．５μｍｏｌのスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物を尾側部位に、および（ｉｉ）頭側部位に投与される溶媒、を用いて局所的に処置した。７００ｍＪ／ｃｍ２の３１１ｎｍＵＶ照射を最終用量から２４時間後に受けた動物を２４時間後に安楽死させ、それらの背側の皮膚を採取した。（Ａ）９μｍ厚の皮膚の新鮮凍結切片をパラホルムアルデヒドに固定して、Ｈ＆Ｅで染色した（スケールバー１００μｍ）。（Ｂ）マウスを一連の範囲の線量の紫外線で照射し、２４時間後に安楽死させた。（Ｃ）液体窒素凍結し、微粉砕した背側の皮膚から調製した全ホモジネートの上清画分においてＭＰＯ特異的活性を測定し、そのタンパク質レベルを抗ＭＰＯ抗体（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてウエスタンブロットにより検出した。タンパク質レベルの均一性を、並行ゲルのクーマシーブルー染色により確認した（データは示さず）。（ＤおよびＥ）ＭＰＯ特異的（Ｄ）およびＮＱＯ１特異的（Ｅ）活性を、溶媒（黒色棒）、スルホラファン（灰色棒）、およびブロッコリースプラウト抽出物（白色棒）で処置したマウス由来全皮膚ホモジネートの上清画分において測定し、非照射対照に対する各々の処置の比として表した。平均値±ＳＤが示される。８匹の動物を対照群に用い、４匹を各々の処置群に用いた。スルホラファンかまたはブロッコリースプラウト抽出物による処置は、ＵＶ照射に誘導されるＭＰＯ上昇（スルホラファン、Ｐ＝０．００５；ブロッコリースプラウト抽出物、Ｐ＝０．００１）、およびＵＶ照射により低下したＮＱＯ１レベルの回復（スルホラファン、Ｐ＝０．００３；ブロッコリースプラウト抽出物、Ｐ＝０．００００１）に対して同等の保護をもたらした。
【図１３】紅斑の強さが紫外線量に線形に依存することを示す図である。（Ａ）接着性のビニル鋳型（ａｄｈｅｓｉｖｅ ｖｉｎｙｌ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）を胸後部の傍脊柱部に置いた。開口部は直径２．０ｃｍであり、個々に閉鎖して一連の範囲の紫外線量をもたらすことができる。連日同じ位置に正確に鋳型を置くために、各鋳型の四隅にある小さな穴の位置に皮膚マーカーを用いて印を付ける。（Ｂ）紫外線量の関数としての紅斑の強さ。紅斑の値（ａ＊）を、１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２の３１１ｎｍ紫外線への曝露直前および曝露後２４時間の男性被験者の背側の直径２．０ｃｍの円で測定した。２対の隣接するスポットを各紫外線量に割り当てた。照射後のａ＊値の平均変化を（黒円）、重複した値の範囲を示すバーとともに示す。照射前の１６スポット全ての平均ａ＊値は、６．２２±１．９１（ＣＶ＝３０．７％）であった。紫外線量に関するａ＊値の増分の線形相関係数（ｒ２）は、０．９８６である。
【図１４】３１１ｎｍＵＶ照射により引き起こされる紅斑に対して、スルホラファンに富むブロッコリースプラウト抽出物によりもたらされるヒト皮膚の保護を示す図である。（Ａ）一連の範囲のスルホラファン用量を用いる男性ボランティアの局所処置による皮膚紅斑発生の阻害。直径２．０ｃｍ円形スポットに、１００、２００、４００、または６００ｎｍｏｌのスルホラファンを、２５μｌの８０％アセトン／２０％水中ブロッコリースプラウト抽出物として２４時間間隔で３日間与えた。対照スポットに、２５μｌの溶媒のみを与えた。ａ＊の比色計測定値は、５００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を用いる照射の４日前および照射の２４時間後に得た。照射前の溶媒処置部位の４日間の平均ａ＊値は、６．７０±１．１６であった。紅斑形成の阻害（％）は、［ａ＊（未処置）−ａ＊（処置）／ａ＊（未処置）］×１００から計算した。未処置の値（ゼロ線量）は、２５μｌの、４００ｎｍｏｌの加水分解されていないグルコラファニン（スルホラファンの不活性グルコシノレート前駆体）を含有する８０％アセトン／２０％水中ブロッコリースプラウト抽出物を与えた２つの領域の増分から計算した。（Ｂ）１００、２００、４００、または６００ｎｍｏｌの用量のスルホラファンを（ブロッコリースプラウト抽出物として）、あるいは溶媒のみを投与された個体（Ａと表す）の４対のスポットの写真。（Ｃ）スルホラファン含有ブロッコリースプラウト抽出物を用いる局所処置の、一連の範囲の線量の紫外線への紅斑応答への効果。１６窓の鋳型を用いて、水平に隣接するスポット対を、２５μｌの８０％アセトン／２０％水中２００ｎｍｏｌのスルホラファンかまたは溶媒のみのいずれかを用いて３日連続で２４時間間隔で処理し、２４時間後に１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を照射した。各スポットのａ＊値の増分を、ＵＶ照射前のそれらの４日間の平均に関して、紫外線量の関数としてプロットする。視覚的に決定される最小紅斑線量は６００ｍＪ／ｃｍ２であった。（Ｄ）５００、６００、または７００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を受けた、ブロッコリースプラウト抽出物で処置したスポットおよび溶媒で処置したスポットの対の写真。この被験者に関する完全なセットの減少率は、表１に示される（被験者２）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
電離放射線治療または放射線治療は、悪性腫瘍の治療によく使用される。電離放射線は、脳、乳、子宮頸部、喉頭、肺、膵臓、前立腺、皮膚、脊椎、胃、子宮の癌および軟部組織肉腫をはじめとするほとんどあらゆる種類の固形腫瘍において、癌細胞を死滅させ、腫瘍を収縮させるために用いることができる。また、放射線を用いて白血病およびリンパ腫を治療することもできる。放射線治療は、腫瘍もしくは症状の開放を局所管理するための治療法がない場合の対症療法として、または患者の寿命を伸ばすための治療上の処置として用いられ得る。全身照射は骨髄移植の前に行われる。一部の例では、放射線治療は、非悪性状態、例えば三叉神経痛、甲状腺眼疾患、翼状片およびケロイド瘢痕増殖または異所性骨化の予防の処置に用いられる。大きな腫瘍または進行した腫瘍の処置に対する反応性を増大させるために、温熱療法すなわち深部組織加熱が放射線と併用して用いられる場合が多い。
【００１２】
放射線治療は、そのＤＮＡを破壊し、シグナル伝達経路を変更し、かつアポトーシスを誘導することにより標的組織の細胞を破壊する。電離放射線は、比較的広い面積に放射線を与えることのできる、Ｘ線およびγ線を含む電磁線（光子）と、ごく短い距離だけ組織に透過することのできる微粒子線（粒子ビームとも呼ばれる）、例えば電子、陽子、および中性子などからなる。標的組織への放射線量は、癌の種類および位置を含む多数の要因に依存する。次に、放射線に対する細胞の応答は、数ある中でも放射線の種類および線量ならびに組織の感受性に依存する。理想としては、放射線は、正常細胞への影響は最小限に、腫瘍細胞の死滅を対象とするものでありたい。にもかかわらず、放射線治療の間の電離放射線は、癌組織だけでなく健常器官および組織にも影響を及ぼす。
【００１３】
放射線治療は、皮膚紅斑、刺激作用および炎症を含む短期副作用、ならびに中期および長期副作用、例えば浮腫、疼痛、線維症および拡張型表層血管（ｄｉｌａｔｅｄ ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ）（毛細血管拡張症）に関連する場合が多い。乳房切除術の後の胸壁の処置、頭頚部腫瘍および皮膚腫瘍のための放射線治療は、急性反応ならびに皮膚および粘膜への重度のダメージを引き起こす可能性がある。皮膚反応は、急性紅斑から落屑および壊死まで様々であり得る。同様に、口、咽頭、食道、気管、腸、膀胱および直腸内の粘膜はダメージを受ける可能性がある。口内のひりひりする痛みおよび潰瘍は電離放射線で治療を受けた後の患者に共通する症状である。放射線の急性効果は唾液または粘液を産生する付属腺で感じられるが、副作用には口腔乾燥症（口渇）、眼球乾燥症（ドライアイ）および膣粘膜の乾燥も含まれる。
【００１４】
長期合併症は、一般により高用量の放射線（３５グレイ以上）で起こる。数ヶ月または数年の経過中に発症し得る遅発性副作用には、結合組織の増加に起因する組織の瘢痕、続発性癌、例えば放射線領域に隣接する身体領域で発症する胸、胃、肺および黒色腫など、および甲状腺疾患が挙げられる。
【００１５】
身体の深部器官、例えば肝臓、肺、膵臓、卵巣、直腸、前立腺、胸および胃などの進行性腫瘍または大型腫瘍は、電離放射線に加えて温熱療法または加温を必要とする場合が多い。癌組織は通常深部組織を４３℃〜５０℃の範囲の温度に曝すことにより破壊され、皮膚の熱傷を引き起こす。
【００１６】
放射線治療の細胞毒性効果は、ＤＮＡのイオン化、ならびに、細胞、タンパク質およびＤＮＡに損傷を与え得る、スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素およびヒドロキシルラジカルを含む活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を引き起こす、電子のエネルギーレベルの増加に関連している。
【００１７】
宇宙旅行者も透過性電離放射線に曝露される。宇宙放射線には、陽子および高質量（Ｈ）、高原子番号（Ｚ）および高エネルギー（Ｅ）粒子（ＨＺＥ粒子）放射線が含まれる。宇宙放射線により引き起こされる損傷は、放射線曝露の時点で起こる。
【００１８】
本発明者らは、哺乳類において、特に放射線治療、温熱療法または宇宙放射線に曝露されたヒトにおいて、電離放射線に曝露された皮膚および粘膜の領域ならびに周辺領域へのＮｒｆ２誘導物質の局所適用が、皮膚および粘膜の機械的回復力を著しく向上させ、かつ、皮膚および粘膜損傷を防止または減少させることを見出した。特に、放射線治療の前、間または後に医薬上有効量のスルホラファンを局所投与すると、皮膚および粘膜への短期および長期損傷に対して効果的な保護が得られる。
【００１９】
本発明の目的において、用語「患者」は動物を意味する。本発明の好ましい態様では、患者は哺乳類である。本発明の最も好ましい態様では、哺乳類はヒトである。
【００２０】
皮膚または粘膜への損傷または皮膚もしくは粘膜の障害は、本文脈で用いられるように、当業者に明らかであるはずであり、放射線治療が損傷または障害の病因に関与している皮膚および粘膜のあらゆる異常を含むことが意図される。本発明を用いることのできる損傷または疾患の例としては、好ましくは、限定されるものではないが、急性紅斑、皮膚刺激、炎症、浮腫、落屑、皮膚の壊死、口内のひりひりする痛みおよび潰瘍、疼痛、線維症、毛細血管拡張症、口腔乾燥症、眼球乾燥症、膣粘膜の乾燥、乳癌、胃癌、肺癌、黒色腫および甲状腺疾患が挙げられる。
【００２１】
本発明により想定される治療は、既存の状態をもつ患者または皮膚もしくは粘膜疾患の素因のある患者に使用することができる。さらに、本発明の方法は、患者において放射線治療の症状を軽減するため、または、患者において予防処置として用いることができる。
【００２２】
本明細書において、「医薬上有効量」は、臨床的に有意な細胞応答を誘起するために有効な量を意味することが意図される。
【００２３】
転写因子ＮＦ−Ｅ２−関連因子２（Ｎｒｆ２）は、転写因子のＣＮＣ（Ｃａｐ−Ｎ−Ｃｏｌｌａｒ）ファミリーに属し、高度に保存された塩基性領域−ロイシンジッパー（ｂＺｉｐ）構造を有する。Ｎｒｆ２は、防御酵素をコードする第２相遺伝子として一般に公知の抗酸化剤および解毒遺伝子の構成的および誘導的発現の重要な役割を果たし、防御酵素には、薬剤代謝酵素、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＮＡＤＰ（Ｈ）：キノンオキシドレダクターゼおよびＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼなど、ならびに酸化および生体異物ストレスに応える抗酸化剤酵素、例えばヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）および−グルタミルシステインシンセターゼ（ＧＣＳ）などが含まれる（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｆａｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｆａｈｅｙ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，１９９９；Ｈｏｌｔｚｃｌａｗ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ，２００４）。これらの酵素は、抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）または求電子剤応答配列（ＥｐＲＥ）と呼ばれるプロモーターによって調節される。第２相遺伝子は、反応性酸素または窒素種（ＲＯＳまたはＲＮＳ）の除去、求電子剤の解毒および細胞内還元電位の維持を含む、細胞防御機構を担う（例えば、Ｈｏｌｔｚｃｌａｗ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ，２００４）。
【００２４】
Ｎｒｆ２は通常、Ｋｅａｐ１と呼ばれるアクチン結合性調節タンパク質によって細胞の細胞質中に隔離されている。細胞が酸化的または求電子性のストレスに曝されると、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２複合体は立体構造変化を受け、Ｎｒｆ２が複合体から遊離し、核内に放出される。活性のあるＮｒｆ２は小さなＭａｆタンパク質と二量体化し、ＡＲＥに結合し、第２相遺伝子転写を活性化させる（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ，２００４）。
【００２５】
第２相酵素の誘導は、発癌および変異誘発性から保護し、細胞の抗酸化性能を促進するという証拠が増えてきている（Ｆａｈｅｙ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，１９９９；Ｉｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これまで、９つのクラスの第２相酵素誘導物質が同定された：１）ジフェノール、フェニレンジアミンおよびキノン；２）Ｍｉｃｈａｅｌ受容体；３）イソチオシアネート；４）ヒドロペルオキシドおよび過酸化水素；５）１，２−ジチオール−３−チオン；６）ジメルカプタン；７）三価ヒ素剤；８）二価重金属；および９）カロテノイド、クルクミンおよび関連ポリエン（Ｆａｈｅｙ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，１９９９）。これらの第２相酵素誘導物質は、直接の抗酸化薬とは違って、酸化還元反応中に化学量的に消費されず、作用の持続時間が長く、直接的な抗酸化薬、例えばトコフェロールおよびＣｏＱなどの機能を補助し、強力な抗酸化薬であるグルタチオンの合成を促進するので、非常に効果的な抗酸化薬であると考えられる（Ｆａｈｅｙ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，１９９９）。
【００２６】
利尿薬であるエタクリン酸（ＥＡ）、求電子性Ｍｉｃｈａｅｌ受容体であるオルチプラズ、およびイソチオシアネートであるスルホラファンは、免疫刺激マクロファージ由来の、炎症性疾患の病因に関与する炎症促進性タンパク質である、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）のリポ多糖（ＬＰＳ）に誘導される分泌を阻害することが示されている（Ｋｉｌｌｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。オルチプラズは、肝臓および膀胱において発癌物質解毒を促進することにより発癌を抑制する（Ｉｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。創傷皮膚を含む損傷組織および炎症組織の酸化ストレスに対するケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）の細胞保護作用は、皮膚の創傷修復の間のＮｒｆ２のＫＧＦ刺激に関連している（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【００２７】
主にアブラナ科の野菜に由来するイソチオシアネートは、第２相酵素の活性化による腫瘍の化学防御、発癌物質活性化第１相酵素の阻害およびアポトーシス誘導において、強力な抗酸化薬であり、効果的な薬剤である（Ｈｅｃｈｔ，１９９５；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，１９９４；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９４）。イソチオシアネートは、β−チオグルコシド−Ｎ−ヒドロキシ硫酸塩であり、捕食者による野菜の冷浸、食品調製または咀嚼により、結果として起こる酵素ミロシナーゼの活性化および放出とともに細胞の破壊が引き起こされる時に、植物においてグルコシノレートの加水分解から形成される。結果として得られるアグリコンは、非酵素的分子内転位を受けて、イソチオシアネート、ニトリルおよびエピチオニトリルを生じる。
【００２８】
スルホラファンは、スルホラファングルコシノレート（ＳＧＳ）としても公知のグルコシノレート・グルコラファニンのアグリコン分解産物である。スルホラファンの分子式は、Ｃ６Ｈ１１ＮＯＳ２であり、その分子量は１７７．２９ダルトンである。スルホラファンは、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネートおよび（−）−１−イソチオシアナト−４（Ｒ）−（メチルスルフィニル）ブタンとしても公知である。スルホラファンの構造式は、
【化１】
である。
【００２９】
スルホラファンは近年ブロッコリーにおいて同定され、単離されたネズミ肝細胞癌細胞において強力な第２相酵素誘導物質であることが示され（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、スプラーグドーリーラットにおいて乳房腫瘍の形成を阻止し（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、マウス皮膚腫瘍形成の促進を妨げ（Ｇｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞においてヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）発現を増加させる（Ｋｅｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００６）。スルホラファンはまた、ヒトケラチノサイトにおいて皮膚発癌のプロモーターであるアクチベータータンパク質−１（ＡＰ−１）の紫外（ＵＶ）光に誘導される活性化を阻害することも示され（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００４）、スルホラファン抽出物を局所適用すると、マウス皮膚表皮において第２相酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ１（ＮＱＯ１）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＡ１およびヘムオキシゲナーゼ１のレベルが増加するという証拠がある（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。さらに、スルホラファンは、強力な細胞傷害性薬剤であり、かつ強力な突然変異誘発物質および発癌物質である、硫黄マスタードからヒト上皮ケラチノサイトを保護し（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）、かつ、細胞増殖を阻害し、アポトーシスを活性化させ、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）活性を阻害し、かつ、ヒト乳癌細胞において乳癌増殖に関与する主要タンパク質である、エストロゲン受容体−α、上皮成長因子受容体およびヒト上皮成長因子受容体−２の発現を低下させる（Ｐｌｅｄｇｉｅ−Ｔｒａｃｙ ｅｔ ａｌ．，２００７）。さらに、スルホラファンは、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）をヒト胃異種移植片から根絶させることが示された（Ｈａｒｉｓｔｏｙ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００３０】
本発明は、上記のように、放射線治療、温熱療法または宇宙放射線により引き起こされる皮膚もしくは粘膜に対する損傷または皮膚もしくは粘膜の障害を予防または治療する方法として、転写因子ＮＦ−Ｅ２−関連因子２（Ｎｒｆ２）を誘導する方法に関する。
【００３１】
本発明の方法において使用される化合物は、上記のように、Ｎｒｆ２活性の誘導物質である。
【００３２】
イソチオシアネートは、イソチオシアネート（ＮＣＳ）部分を含有する化合物であり、当業者によって容易に同定できる。イソチオシアネートの例としては、限定されるものではないが、スルホラファンまたはその類似体が挙げられる。イソチオシアネート類似体の説明および調製は、米国再発行特許第３６，７８４号に記載され、参照によりその全文が本明細書に援用される。本発明で使用されるスルホラファン類似体としては、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノン、エキソ−２−アセチル−６−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−イソチオシアナト−６−メチルスルホニルノルボルナン、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノール、１−イソチオシアナト−４−ジメチルホスホニルブタン、エキソ−２−（１’−ヒドロキシエチル）−５−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−アセチル−５−イソチオシアナトノルボルナン、１−イソチオシアナト−５−メチルスルホニルペンタン、シス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートおよびトランス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートが挙げられる。
【００３３】
イソチオシアネートの前駆体であるグルコシノレートも、本発明により企図される。グルコシノレートは当分野で周知であり、その全内容が参照により本明細書に援用されるＦａｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５６：５−５１（２００１）に概説されている。
【００３４】
本発明により企図されるその他の化合物としては、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、オルチプラズ、エタクリン酸、およびそれらの類似体、ならびに、さらなるＭｉｃｈａｅｌ反応受容体、例えばトリテルペノイドまたは環状／非環状ビスベンジリデンアルカロン（ａｌｋａｌｏｎｅｓ）が挙げられる。
【００３５】
本発明の方法で使用される化合物は、哺乳類への局所投与に適した医薬上許容される賦形剤とともに医薬組成物に処方することができる。そのような賦形剤は当分野で周知である。局所投与には、肺、胃、膣、口および目の表面を含む皮膚または粘膜への投与が含まれる。
【００３６】
局所投与の投薬形態としては、限定されるものではないが、軟膏、クリーム、エマルション、ローション、ゲル、日焼け止め剤および表皮内部での浸透を助ける薬剤が挙げられる。好ましい実施形態では、組成物は局所軟膏の形態である。
【００３７】
当業者に公知の様々な添加剤を、本発明の局所製剤に含めてよい。添加剤の例としては、限定されるものではないが、可溶化剤、皮膚透過促進剤、防腐剤（例えば、抗酸化剤）、モイスチャライザー、ゲル化剤、緩衝剤、界面活性剤、乳化剤、皮膚軟化薬、増粘剤、安定剤、保湿剤、分散剤および製薬担体が挙げられる。
【００３８】
モイスチャライザーの例としては、ホホバ油および月見草油が挙げられる。
【００３９】
適した皮膚透過促進剤は当分野で周知であり、例えばメタノール、エタノールおよび２−プロパノールなどの低級アルカノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、デシルメチルスルホキシド（Ｃ１０ＭＳＯ）およびテトラデシルメチルスルホキシドなどのアルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、尿素、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド、Ｃ２−Ｃ６アルカンジオール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）およびテトラヒドロフルフリルアルコールが挙げられる。
【００４０】
可溶化剤の例としては、限定されるものではないが、例えばジエチレングリコールモノエチルエーテル（エトキシジグリコール、Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ（登録商標）として市販されている）およびジエチレングリコールモノエチルエーテルオレエート（Ｓｏｆｔｃｕｔｏｌ（登録商標）として市販されている）などの親水性エーテル、ポリオキシ３５ヒマシ油、ポリオキシ４０水素化ヒマシ油、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、特にＰＥＧ３００およびＰＥＧ４００などの低分子量ＰＥＧ、ＰＥＧ−８カプリル酸／カプリン酸グリセリド（Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）として市販されている）などのポリエチレングリコール誘導体、ＤＭＳＯなどのアルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、ＤＭＡ、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００４１】
適した製薬担体としては、無毒であって、組成物のその他の成分または皮膚とあまり有害な様式で相互作用しない、当分野で公知のあらゆる当該材料、例えば、あらゆる液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤、ポリマーなどが挙げられる。
【００４２】
感染の予防および／または治療は、抗生物質、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸、および同類のものなどを、本発明の組成物中に含めることによって達成することができる。
【００４３】
当業者であれば、本発明の方法で使用される組成物中の薬剤の有効量を経験的に決定することができることを理解する。ヒト患者に投与される場合、本発明の組成物の一日の全使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医により決定されることは当然理解される。任意の特定患者に関する具体的な治療有効量レベルは、多様な要因、すなわち、達成するべき応答の種類および程度、用いる具体的な組成物の活性、患者の年齢や体重、総合的な健康状態、性別および食事、治療の持続期間、本発明の方法と併用して又は同時に用いる薬剤、ならびに医学分野で周知の同様の要因によって決まる。
【００４４】
一般に、患者に局所投与される組成物中のＮｒｆ２誘導物質の量は、約１００ｎｍｏｌ〜約１μｍｏｌ／ｃｍ２であり、放射線治療または温熱療法の結果として生じる短期および長期の副作用を防ぐかまたは最小限にするために、組成物は患者の身体の関連部分の上の皮膚に直接適用される。
【００４５】
開示される製剤の見込まれる商業用途としては、例えば、（ｉ）保護／予防用途、（ｉｉ）化粧品用途および（ｉｉｉ）医学的用途が挙げられる。一実施形態では、油性（スルホラファン）または水性（グルコラファニンに加水分解剤を加えたもの）のいずれかの局所適用のための保護ローションおよびクリームが提供される。もう一つの実施形態では、スルホラファン含有組成物を日焼け止め剤と組み合わせることができる。
【００４６】
また、上記のＮｒｆ２誘導物質を含む組成物は、経口投与、粘膜投与、皮下投与、筋肉内投与および非経口投与を含む、様々なその他の経路で投与することができ、多様な担体または賦形剤を含んでよい。適した担体としては、限定されるものではないが、無毒の固体、半固体または液体増量剤、希釈剤、カプセル化剤または任意の種類の製剤助剤、例えばリポソームなどを挙げることができる。
【００４７】
非経口注射のための組成物は、医薬上許容される滅菌水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルションならびに使用直前に滅菌注射液または分散液へ再構成するための滅菌粉末を含んでよい。適した水性および非水性担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および同類のものなど）、カルボキシメチルセルロースおよびそれらの適した混合物、植物油（例えばオリーブ油など）、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用することにより、分散液の場合には所要の粒径を維持することにより、そして界面活性剤を使用することにより維持することができる。本発明の組成物は、アジュバント、例えば、限定されるものではないが、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などを含有してもよい。糖、塩化ナトリウム、および同類のものなどの等張剤を含むことも望ましい。注射用医薬品形態の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの封入によりもたらすことができる。
【００４８】
一部の例では、薬剤の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの吸収を遅らせることが望ましい。これは難水溶性の結晶性または非晶質物質の液体懸濁液を使用することにより達成することができる。その結果薬剤の吸収速度はその溶解速度に依存し、それは次に、結晶の大きさおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口投与された薬剤形態の遅延吸収は、薬剤を油性ビヒクルに溶解または懸濁することにより達成される。
【００４９】
注射用デポー形態は、薬剤のマイクロカプセルマトリックス（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌｅ ｍａｔｒｉｃｅｓ）をポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に形成することにより製造される。薬剤のポリマーに対する比および用いる特定のポリマーの性質によって、薬剤放出速度を制御することができる。その他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。また、デポー注射用製剤は、生体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬剤を捕捉することにより調製される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルタを通して濾過することによるか、または、使用直前に滅菌水またはその他の滅菌注射用媒体に溶解または分散させることのできる無菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより滅菌することができる。
【００５０】
経口投与のための固体投薬形態としては、限定されるものではないが、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉剤、および顆粒剤が挙げられる。このような固体投薬形態において、活性化合物は、クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムなどの医薬上許容される賦形剤もしくは担体、ならびに／または、ａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの増量剤またはエキステンダー、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアラビアガムなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの保湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤、ｆ）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、アセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイトクレーなどの吸収剤、およびｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの滑沢剤の少なくとも１つの物品と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合には、投薬形態は緩衝剤を含んでもよい。同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤ならびに高分子量ポリエチレングリコールおよび同類のものなどを用いて軟および硬ゼラチンカプセル中で増量剤として用いることもできる。
【００５１】
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体投薬形態は、コーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティングおよびその他のコーティングなど、製薬処方分野で周知の長期放出（ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）、持続放出、遅延放出および即時放出コーティングなどを用いて調製することができる。それらは所望により不透明剤を含有してよく、腸管の特定の部分において、有効成分だけを、または優先的に、所望により遅延様式で放出する組成物でもあり得る。使用できる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが含まれる。また、活性化合物は、適切な場合、１以上の上述の賦形剤とともにマイクロカプセル形態に含まれていてもよい。
【００５２】
経口投与のための液体投薬形態としては、限定されるものではないが、医薬上許容されるエマルション、溶液、懸濁液、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。活性化合物に加えて、液体投薬形態は、当分野で慣用される不活性希釈剤、例えば、水またはその他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などを含有してよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物には、補助剤、例えば湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤、甘味料、香味料、および香料が含まれてよい。懸濁液には、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、およびトラガカントガム、およびそれらの混合物のような沈殿防止剤が含有されてよい。
【００５３】
本発明に従う飲食用組成物（ｄｉｅｔａｒｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、スルホラファン、イソチオシアネート、グルコシノレートまたはそれらの類似体を含有するあらゆる摂取可能な調製物である。例えば、スルホラファン、イソチオシアネート、グルコシノレートまたはそれらの類似体は、食品に混合されてよい。この食品は、乾燥させ、調理し、茹で、凍結乾燥させ、または焼くことができる。本発明において企図される膨大な数の食品の中には、パン、茶、スープ、シリアル、サラダ、サンドウィッチ、スプラウト（ｓｐｒｏｕｔｓ）、野菜、動物飼料、丸剤、および錠剤がある。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
（ブロッコリースプラウトからのスルホラファンの調製）
農薬またはその他の種子処理化学物質で全く処理されていないことが認証されたブロッコリーの種子（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｉｔａｌｉｃａ，ｃｖ．ＤｅＣｉｃｃｏ）を発芽させ、Ｆａｈｅｙ ｅｔ ａｌ．（１２）に記載される通り処理した。手短に言えば、種子を微量のＡｌｃｏｎｏｘ（登録商標）洗浄剤を含有するＣｌｏｒｏｘ（登録商標）漂白剤の２５％水溶液で表面消毒し、水で徹底的にすすいだ。次に、これらの種子を傾斜した多孔プラスチックトレイに層状に広げ、濾過水を１時間に約６回３０秒間霧状に吹き付け、頭上蛍光ランプから照射した。３日後に、スプラウトを蒸気ジャケット付きやかん中の沸騰水に直接投じ、沸騰状態に戻して、約５分間攪拌することにより成長を止めた。この処理により、内在性のスプラウトミロシナーゼを不活性化し、グルコシノレートを抽出した。ＨＰＬＣ（２６）により測定すると、スルホラファン前駆体であるグルコラファニンが、初期抽出物中の支配的なグルコシノレートであった。次に、Ｆａｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７ およびＳｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００１（１２，２７）に記載されるように、ダイコンスプラウトミロシナーゼを、グルコシノレートのイソチオシアネートへの定量的変換のために加えた。次に、この調製物を凍結乾燥し、酢酸エチルに溶解させ、回転蒸発により蒸発乾固させ、少量の水に溶解させ、８０％アセトン：２０％水（ｖ／ｖ）中５０ｍＭスルホラファンの終濃度までアセトンを添加した。総イソチオシアネート含量を環化縮合反応（２８）により決定し（１２，２７）、ＨＰＬＣ（２６）によりグルコシノレートの完全な不在を確認し、ミロシナーゼ反応により開放されるイソチオシアネートの正確な比率をアセトニトリル勾配でのＨＰＬＣにより決定し、抽出物のグルコシノレートプロフィールに一致させた。スルホラファンはイソチオシアネート含量の９０％超を構成した。この調製物を８０％アセトン（ｖ／ｖ）に希釈して、「高用量」（１．０μｍｏｌ／１００μｌ）および「低用量」（０．３μｍｏｌ／１００ｍｌ）を作成した。Ｐｒｏｃｈａｓｋａ試験（２９，３０）中の生物検定法により、以前の実験（１１）に一致するＣＤ値（ＮＱＯ１の活性を二倍にするために必要な濃度）を得た。
【００５５】
（実施例２）
（ケラチノサイトのスルホラファンによる処理）
グルタチオンは主要かつ最も豊富な細胞の非タンパク質チオールであり、細胞防御の重要な部分を構成する：グルタチオンは損傷をもたらす可能性のある求電子剤と容易に反応し、フリーラジカルを捕捉して、過酸化物を還元することにより、反応性酸素中間体およびそれらの毒性代謝産物の解毒に関与する。ＧＳＨの細胞レベルを上昇させる能力は、酸化ストレスに対抗する上で非常に重要である。この目的のため、本発明者らは、ケラチノサイトの培養物においてＵＶＡにより引き起こされる酸化ストレスから保護する、スルホラファンに誘導される第２相応答の能力を調査した。ＵＶＡの遺伝子毒性は主に反応性酸素中間体の生成によるものであると考えられるため、本発明者らはＵＶＡをこの試験に選択した。
【００５６】
（細胞培養）
ＨａＣａＴヒトケラチノサイト（Ｇ．Ｔｉｍ Ｂｏｗｄｅｎ，Ａｒｉｚｏｎａ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｕｃｓｏｎより提供）を、５％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養し、ＰＥネズミケラチノサイト（Ｓｔｕａｒｔ Ｈ．Ｙｕｓｐａ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤより提供）を、８％ＦＢＳを含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で培養し、Ｃｈｅｌｅｘ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で処理してＣａ２＋を除去した。
【００５７】
（キノンレダクターゼ（ＮＱＯ１）およびグルタチオンアッセイ）
細胞（１穴当たり２０，０００個）を９６穴プレートで２４時間増殖させ、その後、連続希釈のスルホラファンに２４時間（グルタチオン定量のため）かまたは４８時間（ＮＱＯ１定量のため）曝露し、最後に０．０８％ジギトニン中に溶解させた。アリコート（２５μｌ）をタンパク質分析のために使用した。ＮＱＯ１の活性をＰｒｏｃｈａｓｋａ試験（２９，３０）により測定した。細胞内グルタチオンレベルを測定するため、２５μｌの細胞溶解産物に２ｍＭ ＥＤＴＡ中５０μｌの氷冷メタリン酸（５０ｇ／リットル）を加えて細胞タンパク質を沈殿させた。４℃にて１０分後、プレートを１，５００ｇにて１５分間遠心し、結果として生じる上清画分５０μｌを平行プレートに移した。これらのウェルの各々に、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０μｌの２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５を添加し、総細胞グルタチオンをリサイクリングアッセイにおける速度測定により定量した（３１，３２）。
【００５８】
（細胞のＵＶ照射および反応性酸素中間体の定量）
ＰＥ細胞（１穴当たり５０，０００個）を２４穴プレートに播種し、４８時間増殖させた。次に、細胞を１μＭまたは５μＭスルホラファンに２４時間曝露した。実験の当日に、培地を除去した後、５００μｌの新鮮培地中１００μＭの２’，７’−ジクロロジニトロフルオレセインジアセテート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とともに３０分間細胞をインキュベートした。次に、蛍光プローブを含有する培地を除去し、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ＵＶＡ放射線（１０Ｊ／ｃｍ２）に曝露した。対照細胞は暗所で保持した。細胞をトリプシンで剥がし、２．０ｍｌのＤＰＢＳ中に懸濁し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ５０蛍光光度計において２ｍｌキュベット中４８５ｎｍで励起し、５２０ｎｍで細胞懸濁液中の蛍光強度を測定した。
【００５９】
ＨａＣａＴヒトケラチノサイトまたはＰＥネズミケラチノサイトをスルホラファンに曝露すると、ＮＱＯ１およびグルタチオンの細胞内レベルは用量依存的に上昇し（
1276669697046_0.ipdl?N0000=235&N0001=31&N0005=RgdyT4qQO2dFG3YNItIz&N0500=4JPA%20420539261%20%20%20%20%20%20%20&N0510=PPfA1vrTnRmHtWshKaY0&N0552=9&N0553=000011
Ａ、Ｂ）、以前の所見に一致する（Ｙｅ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，２００１）。特に顕著であったのが、細胞毒性の明白な証拠を伴わないＨａＣａＴ細胞におけるＮＱＯ１誘導の大きさであった（＞１０倍）。５μＭスルホラファンによる２４時間の処置により、蛍光プローブ２’，７’−ジクロロジニトロ−フルオレセインにより定量される、ＵＶ照射により生成される反応性酸素中間体の実質的な（５０％）低下が生じた（３５）（図２）。
【００６０】
（実施例３）
（マウスにおけるスルホラファンの局所適用のＮＱＯ１およびＧＳＨへの効果）
次に第２相応答をＳＫＨ−１無毛マウスにおいてインビボで評価した。雌ＳＫＨ−１無毛マウス（４週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手し、実験開始前に２週間、本発明者らの動物施設において馴化させた。動物を１２時間明／１２時間暗サイクル、３５％湿度に保持し、水とＡＩＮ７６Ａ固形試料食（Ｈａｒｌａｎ ＴｅｋＬａｄ，誘導物質を含まない）を自由に摂取させた。すべての動物実験は国立衛生研究所のガイドラインに従うものであり、ジョンズ・ホプキンス大学の実験動物委員会により承認された。
【００６１】
７週齢のＳＫＨ−１無毛マウス（群当たり５匹）を、１μｍｏｌのスルホラファンを含有する１００μｌの標準ミロシナーゼ加水分解ブロッコリースプラウト抽出物か、またはビヒクル（１００μｌの８０％アセトン：２０％水、ｖ／ｖ）のいずれかを用いてそれらの背側で局所的に処置した。動物を２４時間後に安楽死させ、背側の皮膚を長方形の鋳型（２．５×５ｃｍ）を用いて切開し、液体Ｎ２中で凍結させた。皮膚試料を液体Ｎ２中で粉砕し、１００ｍｇの結果として生じる粉末を、ＮＱＯ１酵素活性およびタンパク質含量の分析のために、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で緩衝した０．２５Ｍスクロースか、またはグルタチオンの分析のために、２ｍＭ ＥＤＴＡ中氷冷メタリン酸（５０ｇ／リットル）のいずれか１ｍｌ中でホモジナイズした。４℃にて１４，０００ｇで２０分間の遠心分離により、透明な上清画分を得、そのアリコートを、細胞培養実験に関して下に記載されるタンパク質含量、酵素活性および総グルタチオンレベルの測定に使用した。
【００６２】
これらの結果は、スルホラファンの局所投与が、対照と比較して処置動物のＮＱＯ１の約５０％の誘導（Ｐ＜０．００１）および総グルタチオンレベルの約１５％の上昇を生じさせることを示した。
【００６３】
（実施例４）
（ヒトにおけるスルホラファンの局所適用のＮＱＯ１およびＧＳＨへの効果）
健康なヒトボランティアを含むこの試験は、ジョンズ・ホプキンス大学の治験審査委員会により承認されたプロトコールに従って実施した。単回用量のブロッコリースプラウト抽出物の健康なヒトボランティアの皮膚への局所投与の安全性を調査した。抽出物を８０％アセトン：２０％水中で調製し、それらのスルホラファン含量を、イソチオシアネートおよびそれらのジチオカルバメート代謝産物の定量のために本発明者らの研究室で常套的に使用される方法である、環化縮合アッセイにより正確に決定した。各参加者の前腕内側の皮膚に円（直径１ｃｍ）を描き、次いでポジティブディスプレイスメントピペットを用いて抽出物を円の内側に適用した。投与された８つの漸増用量（０．３；５．３；１０．７；２１．４；４２．７；８５．４；１７０；および３４０ｎｍｏｌのスルホラファン）の各々に２名の被験者が参加した。各被験者は自身の対照となり、プラセボ「ビヒクルスポット」を投与された。これらの用量のいずれにおいても有害反応は観察されなかった。
【００６４】
効力試験も行った。エンドポイントは、単回用量のブロッコリースプラウト抽出物の適用後の２名の健康なヒトボランティアの３ｍｍの皮膚パンチ生検におけるキノンレダクターゼ（原型の第２相タンパク質）の酵素活性の測定であった。再び、各被験者は自身の対照となり、「ビヒクルスポット」を投与された。キノンレダクターゼ活性およびタンパク質含量の両方がこれらの試料において確実に検出された。キノンレダクターゼの比活性は、１００ｎｍｏｌのスルホラファンを含有する抽出物の適用後２４時間で約２倍に上昇した（図３）。特に、適用後７２時間で生検を行った場合でさえも活性はプラセボ処置部位の活性よりも高いままであったので誘導は長く続いた。
【００６５】
次に５０ｎｍｏｌのスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物の３回反復した（２４時間間隔での）局所適用の効果を調査した。これにより、２名の健康なヒトボランティアの適用部位の下の皮膚においてキノンレダクターゼ（ＮＱＯ１）比活性がさらに大いに上昇した（図４）。
【００６６】
（実施例５）
（スルホラファンの誘導型一酸化窒素合成酵素への効果）
本発明者らは最近、一連の合成トリテルペノイドに共通して、炎症応答（γ−インターフェロンによるｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２活性化）の阻害と第２相酵素の誘導との間に６桁を超える有効性に及ぶ線形相関を見出した（２０）。
【００６７】
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ（５×１０５細胞／穴）を、９６穴プレートに蒔き、スルホラファンおよび１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γまたは３ｎｇ／ｍｌのＬＰＳのいずれかとともに２４時間インキュベートした。ＮＯは、亜硝酸としてＧｒｉｅｓｓ反応により測定した（３３）。ＲＡＷ２６４．７細胞を様々な濃度のスルホラファンとともにγ−インターフェロンまたはリポ多糖と２４時間インキュベートすると、ＮＯ形成の用量依存的阻害が存在し、ＩＣ５０は両方のサイトカインについて０．３μＭであった（図５Ａ）。
【００６８】
この結果に一致して、ノーザンブロットおよびウエスタンブロット分析により、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡおよびタンパク質の合成も阻害されることが明らかとなった（図５Ｂ、Ｃ）。ＲＡＷ２６４．７マクロファージ（２×１０６細胞／穴）を、スルホラファンおよび１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γまたは３ｎｇ／ｍｌのＬＰＳのいずれかとともに一晩インキュベートした。ノーザンブロットのために、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で全ＲＮＡを単離し、既に記載されるようにブロッティング用に調製した（３３）。ｉＮＯＳおよびＧＡＰＤＨのためのプローブをランダムプライマーとともに［γ−３２Ｐ］ｄＣＴＰで放射性標識した。ウエスタンブロットのために、全細胞可溶化液をＳＤＳ／ＰＡＧＥに付し、膜に移し、ｉＮＯＳおよびβ−アクチン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でプローブした．
【００６９】
これらの知見は、スルホラファンへの曝露がγ−インターフェロンまたはリポ多糖のいずれかによるｉＮＯＳの誘導を抑制し、発癌の過程で役割を果たす炎症応答を減弱させることを示す。
【００７０】
（実施例６）
（スルホラファンの局所適用の紫外線に誘発される発癌への効果）
ＳＫＨ−１無毛マウスを比較的低用量のＵＶＢ照射（３０ｍＪ／ｃｍ２）に週に２回２０週間曝露した結果、その後さらなるＵＶ放射治療がない場合に皮膚腫瘍を発症する「ハイリスクマウス」となった（２４，２５）。この動物モデルは、子供の時に日光にひどく曝露されたが、成人の時には曝露が制限されたヒトに非常に関連性がある。加えて、それは照射スケジュールの完了後の、従って僅かに着色され得るスプラウト抽出物の保護製剤による「光フィルタ作用」の可能性を除く、可能性のある化学防護剤の評価を可能にする。従って、ＵＶＢで前処置したハイリスクマウスを、１日１回、週５日、１１週間、０．３μｍｏｌ（低用量）かまたは１μｍｏｌ（高用量）のスルホラファンを含有する１００μｌの標準ミロシナーゼ加水分解ブロッコリースプラウト抽出物で局所的に処置した。対照群にはビヒクル処置を行った。体重および直径１ｍｍよりも大きい腫瘍の形成を週に１回測定した。
【００７１】
ＵＶＢ照射は、ＵＶＢ（２８０〜３２０ｎｍ、総エネルギーの６５％）およびＵＶＡ（３２０〜３７５ｎｍ、総エネルギーの３５％）を放射するひとそろいのＵＶランプ（ＦＳ７２Ｔ１２−ＵＶＢ−ＨＯ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｗｉｎｓｂｕｒｇ，ＯＨ）により行った。ＵＶＢの放射線量をＵＶＢ Ｄａａｖｌｉｎ Ｆｌｅｘ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｄｏｓｉｍｅｔｅｒで定量し、さらにＩＬ−１４００ラジオメーター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ，Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ，ＭＡ）で較正した。
【００７２】
動物を２０週間火曜日と金曜日に３０ｍＪ／ｃｍ２／セッションの放射露光で照射した。１週間後、マウスを３つの群：各々の処置群に２９匹の動物、および対照群に３３匹の動物、に分けた。２つの処置群のマウスには、１μｍｏｌスルホラファン（高用量）かまたは０．３μｍｏｌのスルホラファン（低用量）を含有する１００μｌのブロッコリースプラウト抽出物の局所適用を行い、対照群のマウスには１００μｌのビヒクルを適用した。処置は週５日、１１週間反復し、その時点で対照群の全ての動物が少なくとも１つの腫瘍を有し、実験を終わらせた。腫瘍（直径１ｍｍより大きい病変と定義した）および体重を週に１回記録した。腫瘍容積は、直径１ｍｍより大きい各塊の高さ、長さおよび幅を測定することにより決定した。３回の測定値の平均を直径として用いて、容積を計算した（ｖ＝４πｒ３／３）。同日に全てのマウスを安楽死させ、腫瘍のサイズおよび多重度を測定した。背側の皮膚を、マウスの全処置部分を含むように長方形の鋳型（２．５×５ｃｍ）を用いて切開した。皮膚をボール紙にホチキスでとめ、写真撮影し、４℃の氷冷１０％リン酸緩衝ホルマリン中で２４時間固定した。
【００７３】
群間で平均体重および体重増加に差はなかった。実験開始時の体重（平均±ＳＤ）は、対照群について２２．３±１．９ｇ、低用量処置群について２２．２±１．９ｇ、および高用量処置群について２３．０±１．９ｇであった。実験終了時（３１週後）、それぞれの体重は、３２．１±９．７ｇ、３１．９±８．８ｇ、および３２．１±６．９ｇであった。１ｍｍより大きい初期病変は、保護具を用いる局所処置が開始して１週間後である照射の終了の２週間後に観察された。この時点で、対照、低用量処置、および高用量処置マウスの、それぞれ、３、６、および４匹のマウスがその最初の腫瘍を発現した。
【００７４】
高用量処置動物は、紫外線の発癌作用から実質的に保護された。従って、実験を終了した処置１１週後に、対照群の動物の１００％が腫瘍を発現したが、１μｍｏｌのスルホラファンを含有するスプラウト抽出物で毎日処置したマウスの４８％には腫瘍がなかった（図６Ａ）。注目すべきは、３匹の動物（対照の２匹と低用量処置群の１匹）は、直径２ｃｍに近い腫瘍を有していたので実験終了の１週間前に安楽死させたことである。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析と、それに続く層別ログランク検定、および生存関数が等しいことを求めるウィルコクソン検定の両方により、処置間で非常に有意な差異（Ｐ＜０．０００１）のあることが示された。１μｍｏｌ処置は、９５％信頼水準で、最後の３観察期間（９、１０、および１１週）の各々について、０．３μｍｏｌおよび対照処置の両方と異なっていた。０．３μｍｏｌと対照処置との間にはいずれの時点でも有意な差はなかった。
【００７５】
図６Ｂは、腫瘍数への処置の全体的な効果が極めて有意であったことを示す（ｐ＜０．００１）。１．０μｍｏｌ用量レベルの対照とのＡＮＯＶＡ比較により、極めて有意な全体的な効果（ｐ＜０．００１）が示されたが、差は９週間後にやっと有意となった（９、１０、および１１週目に行った観察に関して、それぞれｐ＜０．０７９４、ｐ＜０．０４６４およびｐ＜０．００８７）。平均値±ＳＥを示す。
【００７６】
腫瘍発生率および多重度の低下に加えて、腫瘍出現に有意な遅延があった。リスクのある対照動物の５０％が照射終了後６．５週に腫瘍を有していたのに対して、リスクのある高用量処置動物の５０％が腫瘍を発現するまで１０．５週かかった。注目すべきは、保護剤の発癌過程を遅延させる能力が、化学防御においてますます評価される概念になりつつあることである。同様に、腫瘍多重度は５８％低下した：マウスあたりの腫瘍の平均数は、処置群について２．４、対照群について５．７であった。
【００７７】
低用量処置とビヒクル処置群との間に腫瘍発生率および多重度の差はなかったが（図６Ａ、Ｂ）、マウス当たりの全体的な腫瘍量（ｍｍ３での容積として表される）は低用量処置群において処置９、１０、および１１週に、それぞれ８６％、６８％、および５６％実質的に小さかった（図７）。時間を伴う処置に関して一見したところ有効性が低下しているのは、大きな腫瘍（＞１ｃｍ３）が実験の最後の２週間で急速に増大したために生じると思われる。高用量処置群における全体的な腫瘍量は、処置９、１０、および１１週に、それぞれ９１％、８５％、および４６％さらに一層劇的に低下した。興味深いことに、この処置群のマウスの一部は、抽出物を適用していない頭部に腫瘍を有したが、保護抽出物を適用したその背部には腫瘍はなかった。
【００７８】
個々の腫瘍の組織学的特性決定は完了していないが、この動物モデルは一貫して、およそ８０％の小さな非悪性腫瘍（主に角化棘細胞腫および少数の乳頭腫）およびおよそ２０％の大きな悪性腫瘍（扁平上皮癌）を形成した（２４，２５）。本発明者らはすべての腫瘍をそれらの容積に従って２つのカテゴリー：「小型」（＜１ｃｍ３）（図８、白色棒）および「大型」（＞１ｃｍ３）（図８、黒色棒）に分類した。スプラウト抽出物による処置は実験群全体にわたって大型腫瘍の多重度を変化させず、対照群の全３３匹の動物の中では１７個、低用量処置群の全２９匹の動物の中では１９個、および高用量処置群の全２９匹の動物の中では１６個の大型腫瘍が存在した。対照的に、ブロッコリースプラウト抽出物は小型腫瘍の数に用量依存的阻害を生じた（対照、低用量処置、および高用量処置群中、それぞれ１７０個、１２３個、および５４個）。影響を受けなかった腫瘍は、直接ＵＶ照射誘導性ＤＮＡ光産物により引き起こされる突然変異蓄積細胞に由来するが、抽出物は主に酸化ストレス誘導性のＤＮＡ損傷の結果生じる発癌過程を阻害する可能性がある。大豆イソフラボン、ゲニステインはマウス皮膚において脂質過酸化産物、Ｈ２Ｏ２、および８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの生成を阻害したが、紫外線に応答して形成されるピリミジン二量体には影響を及ぼさなかったという同様の現象が報告されている（３６）。
【００７９】
（統計分析）
腫瘍発生率を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析と、それに続く層別ログランク検定、および生存関数が等しいことを求めるウィルコクソン検定の両方を用いて評価した。腫瘍多重度はＡＮＯＶＡにより評価し、比較は全ての処置に関して、および個々の対応のある処置に関して行った（ｔ検定）。腫瘍容積は、処置時間を入れ子式変数とするＡＮＯＶＡにより評価した。これらの計算はＳｔａｔａ７．０（Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ）を用いて実施した。その他の統計はＥｘｃｅｌを用いて計算した。
【００８０】
（実施例７）
（凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末の調製）
ブロッコリーの種子（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｉｔａｌｉｃａ，ｃｖ．ＤｅＣｉｃｃｏ）を用いて実施例１に記載されるように芽を成長させた。３日後に、芽を沸騰水に投じ、約３０分間沸騰させることにより成長を停止させた。この処理により内在性のスプラウトミロシナーゼを不活性化し、グルコシノレートを抽出した。スルホラファン前駆体であるグルコラファニンが、ＨＰＬＣ（２６）により測定して抽出物中の支配的なグルコシノレートであった。次に、この調製物を凍結乾燥して、約８．８重量％のグルコラファニンを含有するグルコシノレートに富む粉末を得た。この粉末をマウス飼料（粉末ＡＩＮ７６Ａ）と混合して、飼料３グラムあたり１０μｍｏｌ（低用量）または５０μｍｏｌ（高用量）のグルコラファニン等価物を得た。
【００８１】
（実施例８）
（スルホラファンの食餌投与の紫外線誘導性発癌への効果）
この試験では、ＵＶＢで前処理したハイリスクマウスに、実施例６に従って調製した凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末（無傷植物に見出されるスルホラファンのグルコシノレート前駆体であるグルコラファニン１０μｍｏｌ／日［低用量］および５０μｍｏｌ／日［高用量］に相当、マウスによる経口摂取でその約１０％がスルホラファンに変換される）を組み込んだ食餌を１３週間与えた。対照群の食餌は凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末を含有しなかった。体重および直径１ｍｍよりも大きい腫瘍の形成を週に１回測定した。
【００８２】
ＵＶＢ照射は、ＵＶＢ（２８０〜３２０ｎｍ、総エネルギーの６５％）およびＵＶＡ（３２０〜３７５ｎｍ、総エネルギーの３５％）を放射するひとそろいのＵＶランプ（ＦＳ７２Ｔ１２−ＵＶＢ−ＨＯ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｗｉｎｓｂｕｒｇ，ＯＨ）により行った。ＵＶＢの放射線量をＵＶＢ Ｄａａｖｌｉｎ Ｆｌｅｘ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｄｏｓｉｍｅｔｅｒで定量し、さらにＩＬ−１４００ラジオメーター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ，Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ，ＭＡ）で較正した。
【００８３】
動物を２０週間火曜日と金曜日に３０ｍＪ／ｃｍ２／セッションの放射露光で照射した。１週間後、マウスを３つの群：各々の処置群に３０匹の動物、および対照群に３０匹の動物、に分けた。２つの処置群のマウスには凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末を組み込んだ食餌を与えた。低用量処置群の食餌には、１０μｍｏｌ／日グルコラファニンに相当する凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末が含まれ、一方、高用量処置群の食餌には、５０μｍｏｌ／日グルコラファニンに相当する凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末が含まれた。対照群の食餌は凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末を含有しなかった。マウスにこの食餌を１３週間与えた。１３週後、対照マウスの９３％が腫瘍を有し、実験を終了した。
【００８４】
腫瘍容積は、直径１ｍｍより大きい各塊の高さ、長さおよび幅を測定することにより決定した。３回の測定値の平均を直径として用いて、容積を計算した（ｖ＝４πｒ３／３）。同日に全てのマウスを安楽死させ、腫瘍のサイズおよび多重度を測定した。背側の皮膚を、マウスの全処置部分を含むように長方形の鋳型（２．５×５ｃｍ）を用いて切開した。皮膚をボール紙にホチキスでとめ、写真撮影し、４℃の氷冷１０％リン酸緩衝ホルマリン中で２４時間固定した。
【００８５】
腫瘍発生率（腫瘍を有する動物のパーセント）は、低用量および高用量グルコラファニンを与えられている動物において、対照群のマウスと比較してそれぞれ２５％および３５％低下した。（図９）
【００８６】
さらに大きかったのが、腫瘍多重度（マウス当たりの腫瘍数）への処置の効果であって、低用量および高用量グルコラファニンを与えられている動物において、対照群のマウスと比較してそれぞれ４７％および７２％低下した。従って、対照群の動物がマウス当たり平均４．３個の腫瘍を有していたのに対し、マウス当たりの腫瘍数は低用量グルコラファニンについて２．３個、高用量グルコラファニンについて１．２個であった。（図１０）
【００８７】
腫瘍量も劇的に影響を受けた：低用量および高用量グルコラファニン処置の両方が、マウス当たりの全腫瘍容積の７０％阻害をもたらした。（図１１）
【００８８】
スルホラファンおよびその代謝産物の血漿レベルは非常に類似していた：低用量および高用量グルコラファニン処置について、それぞれ２．２μＭおよび２．５μＭであった。これは、グルコラファニンがスルホラファンに変換されること、および常習的な食餌治療の結果、動物の血液中のスルホラファンおよびその代謝産物が定常状態のレベルとなったことを示す。これらのレベルは生物学的効果を期待するのに十分である。
【００８９】
試験したほぼ全ての器官、すなわち、前胃、胃、膀胱、肝臓、および網膜において第２相酵素のレベルが誘導された（キノンレダクターゼ１について２〜２．５倍、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼについて１．２〜２．２倍）
【００９０】
（統計分析）
腫瘍発生率を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析と、それに続く層別ログランク検定、および生存関数が等しいことを求めるウィルコクソン検定の両方を用いて評価した。腫瘍多重度はＡＮＯＶＡにより評価し、比較は全ての処置に関して、および個々の対応のある処置に関して行った（ｔ検定）。腫瘍容積は、処置時間を入れ子式変数とするＡＮＯＶＡにより評価した。これらの計算はＳｔａｔａ７．０（Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ）を用いて実施した。その他の統計はＥｘｃｅｌを用いて計算した。
【００９１】
（実施例９）
（高用量紫外線誘導性発癌へのスルホラファンの局所適用の効果）
ＳＫＨ−１無毛マウスを単回高線量（７００〜１２００ｍＪ／ｃｍ２）の狭帯域３１１ｎｍ ＵＶＢ照射に曝露した。これらの高線量は、ヒトにおいて皮膚紅斑を判定するために用いるものに匹敵する。ＵＶランプを装備した痛風型キャビネットにおいてマウスに照射した。対照群にはビヒクル処置を行った。
【００９２】
照射によりマウスの表皮層は非常に厚くなり、２４時間以内に顕著な浮腫および炎症が示された（図１２Ａ左および中央）。これらの損傷作用は、ブロッコリースプラウト抽出物として供給される日用量１００ｎｍｏｌ／ｃｍ２のスルホラファンで３日間マウス皮膚を事前に処置することによって実質的に回避された（図１２Ａ右）。好中球のアズール顆粒に局在し、炎症強度の感受性マーカーである、皮膚ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性は、紫外線によって用量依存的に増加した（１，２００ｍＪ／ｃｍ２で＞２５倍）（図１２Ｂ）。合成スルホラファンでの前処置またはスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物での前処置は、スルホラファン処置マウスまたはブロッコリースプラウト抽出物処置マウスの皮膚ホモジネートにおいて、ＭＰＯタンパク質および酵素活性レベルの増加を抑制し、（図１２ＣおよびＤ）、原型の第２相酵素、ＮＱＯ１の比活性を増加させた（図１２Ｅ）。紫外線はこれらの誘導をわずかに抑制した（図１２Ｅ）。純粋なスルホラファンまたは同等量のスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物での局所処置は、ＮＱＯ１の誘導性増加および紫外線依存性のＭＰＯ活性の阻害に関して量的に同等な効果を示した。
【００９３】
この知見により、次の結論が強く支持される：（ｉ）ブロッコリースプラウト抽出物によりもたらされる、ＵＶ介在性の浮腫および炎症（ならびにおそらくＵＶ損傷のその他の状況）に対する第２相誘導物質活性および保護効果の両方は、完全にそのスルホラファン含量に起因する、そして（ｉｉ）スルホラファンの３１１ｎｍでの吸収は僅かであるが、ブロッコリースプラウト抽出物は水性植物抽出物であり、着色されているため、これらの効果は直接的な紫外線吸収から生じるものではない。
【００９４】
（ＵＶ紅斑の測定ならびに処置および放射線照射のための鋳型の設計）
これらの知見をマウスからヒトに置き換える際には、ヒト皮膚のＵＶ介在性損傷を評価するための高度に定量的であり再現性のある方法を開発することが必要であった。紅斑を非侵襲性バイオマーカーとして用いた。本発明者らは、皮膚の上に正確に位置づけることができ、標準３１１ｎｍ線量の紫外線および可能性のある保護具で処置したまさしく同じ区域（スポット）で赤色反射（ｒｅｄ ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）を反復測定することのできる、再利用可能な接着性のビニル鋳型を設計した。４対の直径２．０ｃｍの円窓のついた、２枚の１０×１７ｃｍの長方形の不透明ビニル鋳型を、連日正確にボランティアの背中の同じ傍脊柱部に正確に貼り付けた（図１３Ａ）。窓は取り外しの容易なビニルシェード（周囲は接着性であるが、窓を覆う部分は非接着性）で個別に塞ぐことができたので、段階的な紫外線量をスポットに送達することができた。狭帯域（３１１ｎｍを中心とする）を、統合ＵＶＢ線量計（ＢｒｙａｎＯＨ）を装備した、ＮＢ−ＵＶＢ／ＴＬ０１ランプを備えたＤａａｖｌｉｎ Ｆｕｌｌ Ｂｏｄｙ Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ Ｃａｂｉｎｅｔにおいて送達した。窓を用いて、全ての窓に同じ線量のＵＶを生成するか、または１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２の段階的な線量を選択した水平に隣接する窓の対に生成した。被験者は、皮膚フォトタイプ（ｐｈｏｔｏｔｙｐｅｓ）１（常にやけどし、決して日焼けしない）、２（常にやけど状態、時々日焼けする）または３（時々やけどし、常に日焼けする）であった。各スポットの紅斑を、標準条件下で、紅斑指数ａ＊を決定する比色計（モデルＣＲ−４００；Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ）を用いて、緑−赤軸に沿って色度について調節した、皮膚の赤色反射の強度の、キセノンアーク閃光の放出に対する、単位のない比率を定量した（Ｆａｒｒ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｙ，１９８４；Ｄｉｆｆｅｙ ａｎｄ Ｆａｒｒ，１９９１）。各測定セッションの前に比色計を白色および赤色タイルで較正した。皮膚タイプが１、２、または３で皮膚病変のない男性および女性ボランティア（２８〜５３歳）を登録した。ボランティアに、実験前の１週間および実験期間中に、マスタード、セイヨウワサビ、ワサビを含むアブラナ科の植物、および香味料を摂取することを控えるよう依頼した。ボランティアはさらに、毎日１３時に行われる実験に訪れる前に毎回コーヒーの摂取または運動を行わないように指示された。薬剤または栄養補助食品の摂取には制限はなかった。被験者は、測定を行う前に温度制御された部屋（２５℃±２℃）において２０分間腹臥で休息した。測定は、比色計の重量（約８０ｇ）下で皮膚を平衡化させた２０秒後に各スポットで開始した。各スポットで素早く連続して（約５秒間隔）１１の反復測定値を得た。最後の８つの値を用いて各スポットについての平均ａ＊値および変動係数（ＣＶ）を算出した。全ての測定値は単一の訓練を積んだオペレーターが読み取った。
【００９５】
測定手順の再現性を、連続５日間の（ＵＶ曝露前４日および２４時間後の）５名の被験者の１６スポット全ての平均ａ＊値を得ることにより検証した。これらの測定は以下の内容を証明した：（ｉ）ＵＶ照射の前の４日の間に同じ１６の一つ一つのスポットに行った最後の８回の反復比色計測定値のＣＶは３．７９であったが（ＳＥＭ＝０．１９％；ｎ＝３２０測定）、ＵＶ曝露２４時間後に同じ５名の被験者の１６のスポットの現在高いほうのａ＊値のＣＶは２．２６であった（ＳＥＭ＝０．２１％；ｎ＝８０）。従って、照射スポットの高いほうのａ＊値を反復測定することにより、より優れた精度で測定することができた（Ｐ＜０．０００１）；（ｉｉ）ＵＶ照射の前に４日間連続で測定した５名の個体の１６のスポットの初期平均ａ＊値は４．５２±１．８９であった（ｎ＝３２０）。しかし、個々のスポット間のａ＊値の変動性は相当に大きく、０．５９〜１０．１７に及んだ。スポット位置と測定日の両方が所定の個体に関する基礎的なａ＊値に有意に影響を及ぼしたとはいえ、スポット位置のみによるＣＶは１９．２％であり、一方一日ごとのＣＶは６．２％であった。従って、単一被験者の個々のスポット間でのａ＊値の差は、同じスポットでの経時的反復測定値間の変動よりもはるかに大きかった。この紅斑指数ａ＊測定値の分析により、任意の個体の各スポットは独立した観察単位と考える必要があるという結論が導かれた；（ｉｉｉ）紫外線に起因する紅斑の増加（Δａ＊）は、ＵＶ曝露前のａ＊の初期値（Ｐ＝０．００８）に反比例して変化した、これは明るい（ｌｉｇｈｔｅｒ）皮膚のほうが暗い（ｄａｒｋｅｒ）皮膚よりも紅斑に対する感受性が高いという見解に一致する；さらに（ｉｖ）紫外線誘導性の紅斑の変動（Δａ＊）は背部全体にわたって無秩序であった、これは垂直にまたは水平に隣接する対照スポットおよび処置スポットを選択することに統計的傾向がないことを示す。解剖学的考慮（例えば、デルマトームおよび脈管構造）に基づいて、水平に隣接するスポットを処置／対照対として選定した。
【００９６】
（紫外線量反応曲線）
ＵＶ介在性紅斑を評価するための定量的および再現性のあるシステムを確立したので、紫外線量と紅斑応答の関係を、タイプ２の皮膚の一人の５３歳男性で調査した。水平に対になった８つの窓を、１００ｍＪ／ｃｍ２の増分で１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線量に曝露し、ＵＶ照射の直前および２４時間後にａ＊測定を行った。この紫外線量の範囲は、皮膚科医が最小紅斑量を決定するために広く用いられている。ａ＊値の増分はこの範囲において紫外線量とともに直線的に上昇し（図１３Ｂ）、各スポットの初期ａ＊値が全く異なっている場合でさえ二重反復領域間に合理的な一致があった。したがって、紅斑の増加は、ＵＶ照射の後のＵＶ照射の前に対するａ＊値の比よりもむしろ、各々の個別のスポットのａ＊値の算術的な増分として表された。
【００９７】
（ヒト皮膚におけるＮＱＯ１の誘導のためのスルホラファンスケジューリングの最適化）
ヒト皮膚をＵＶ誘導性の紅斑から保護する本研究のためにスルホラファンの投薬スケジュールを最適化するため、３名のボランティアの腰の１．０ｃｍの円領域を１００ｎｍｏｌのスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物の５μｌアリコートで処理した。抽出物は２４時間間隔で１日目に、３日目に、２日目と３日目に、または１日目、２日目、および３日目に適用し、４日目に生検を採取した。３日連続の処置により最大のＮＱＯ１誘導が得られ、ＮＱＯ１特異的活性の平均上昇は２．１９倍であった（範囲は１．７６〜３．２４）。したがって、以下の実験では、ブロッコリースプラウト抽出物による処置をＵＶ照射の前に３日連続で２４時間間隔で行った。
【００９８】
（ＵＶ紅斑に対する保護のスルホラファン用量への依存）
スルホラファンの保護用量を最適化するため、１名の被験者（５３歳男性）に一連の範囲の用量のスルホラファン含有ブロッコリースプラウト抽出物（１００、２００、４００、または６００ｎｍｏｌのスルホラファンを含有）を用いて３日連続で毎日処置を行い、５００ｍＪ／ｃｍ２のＵＶを２４時間後に照射した。放射線の前（４日の平均；４．７２±０．８７１）から放射線の２４時間後までの紅斑ａ＊値の増分により、スルホラファン処置により用量依存的保護がもたらされることが示された（図３ＡおよびＢ）。紅斑の増加は、直径２．０ｃｍのスポット１つ当たりスルホラファン１００、２００、４００、または６００ｎｍｏｌの一日量で、それぞれ２６．３％、４４４％、５７．６％、および５７．５％阻害された。この用量の関数としてのスルホラファンによる保護の程度は、ヒト皮膚において既に証明されたＮＱＯ１誘導の用量依存性に合理的に一致する（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【００９９】
（ボランティアにおける、スルホラファンによるＵＶ誘導性紅斑に対する保護）
スルホラファン含有ブロッコリースプラウト抽出物での処置による紫外線量依存性紅斑への保護効果を調べるため、ビニル鋳型の直径２．０ｃｍの円の内側に抽出物を局所的に適用した。処置したスポットには２５μｌの８０％アセトン／２０％水中ブロッコリースプラウト抽出物を適用し、水平に対になったスポットは溶媒のみで処置した。ａ＊値の測定は５日連続で行った：ＵＶ曝露前の３日、曝露日のＵＶ照射の直前、および曝露後２４時間。各々の被験者を８つの線量の紫外線（１００ｍＪ／ｃｍ２の増分で１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２）で調べ、各紫外線量レベルの処置および対照スポットについてａ＊値を得た。ＵＶ照射の前に４日連続で得た各スポットのａ＊測定値を平均し、平均値をａ＊（ＵＶ照射前）値として用いた。パイロット実験により、ＵＶ照射後のａ＊値（Δａ＊）の増分［すなわちａ＊（ＵＶ照射後）−ａ＊（ＵＶ照射前）］は、個別のスポットの皮膚紅斑の変化の最も適切な測定値であることが示された。個々の被験者の所定の線量のＵＶに対する応答はＵＶ照射前のａ＊値と同様に有意に変動したので（Ｐ＜０．０００１）、スルホラファンの保護効果は処置による紅斑の減少割合（％）として表され、従って被験者および皮膚領域特異的な正規化の方法が得られた。
【０１００】
典型的な結果（図１４ＣおよびＤ）により、スルホラファン処置が、照射前に３日連続で２００ｎｍｏｌのスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物で処置したスポットにおいて、６００、７００、および８００ｍＪ／ｃｍ２線量の紫外線で紅斑の発現をそれぞれ８４．３％、４１．６％、および８９．４％阻害することが証明された。次に、スルホラファンの保護効果を６名のボランティアで調査し、ボランティアらに照射前に３日連続で２００ｎｍｏｌ（４名の被験者）または４００ｎｍｏｌ（２名の被験者）のいずれかのスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物を与え、一連の範囲の８つの線量の紫外線（１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２）に曝露した。１００および２００ｍＪ／ｃｍ２での応答は、これらの低い紫外線量でのａ＊の増分は一貫してその基礎となる日変動よりも低かったため、分析から排除した（表１）。紫外線量は紅斑の減少率に僅しか効果がなく（Ｐ＝０．０５）、紫外線量に対する紅斑の減少割合の動向分析により有意な関連のないことが示された（Ｐ＝０．０９）。この知見は、保護の程度が、その大きさに関係なく紅斑応答の比較的一定な割合であることを示唆する。したがって、スルホラファンはおそらく多因子性の紅斑応答の比較的一定な割合を保護する。本調査の検出力を高めるため、６回のＵＶ照射の６名の被験者全てに関するデータをプールした。しかし、紅斑が全く観察されない値を含む、値のこの制限がたとえなくても（ｎ＝３５；１つの観察結果は無効であった）、極めて有意な治療効果があり（Ｐ＜０．０００１）、この知見は視覚的に容易に明らかであった。プールしたデータにより、６名の被験者に関して６つの紫外線量全てにわたって（３００〜８００ｍＪ／ｃｍ２）３７．７％という保護の平均レベルが明らかになった（ＳＥＭ＝５．７；ｎ＝３５）。この保護は極めて有意であった［Ｐ＜０．０００１；９５％信頼区間（ＣＩ）＝２５〜５０％］。さらに、個体ベースで（すなわち表１中の横列にわたって）調べた場合、所定の被験者の全ての紫外線量にわたる平均保護は３７．７％であり（ＳＥＭ＝１１．２；ｎ＝６）、これも有意であった（Ｐ＝０．０２５；ＣＩ＝１１．８〜６４％）。視覚検査で確認されるａ＊測定により、大部分の観察においてスルホラファン処置がＵＶ誘導性の紅斑を阻害しても（３５スポットのうち２７が８．７％以上の保護を示した）、その応答は個々の被験者においても、被験者間でも相当変動するという根拠が得られた。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
６名の被験者（３名の男性および３名の女性）を同一条件下で５日間にわたって調査した。接着性のビニル鋳型の対を同じ傍脊柱位置に２４時間間隔で４日連続で適用し、各セッションの１６個の円（直径２．０ｃｍ）窓の各々で比色計を用いて紅斑指数（ａ＊）値を測定した。４日間に得た各々一式の測定値の最後の８つの値の平均値を平均し、これらの平均値をＵＶ照射前の各スポットのａ＊値と考えた（ＵＶ照射前）。最後の測定の直後に、被験者を一連の範囲の線量のＵＶ（３１１ｎｍ）に、８対の隣接するスポットが１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２を１００ｍＪ／ｃｍ２の増分で受けるように曝露した。ＵＶ照射の２４時間後、比色計によるａ＊測定を繰り返した（ＵＶ照射後）。３００〜８００ｍＪ／ｃｍ２−ＵＶＲについての結果のみを示す。最初の３日間、各対のスポットの一方を２５μｌの（８０％アセトン／２０％水中）２００〜４００ｎｍｏｌのスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物で処置し、もう一方は２５μｌの溶媒のみを与えた。紫外線誘導性の紅斑ａ＊への処置の効果は、ブロッコリースプラウト抽出物処置スポットおよび溶媒処置スポットについてのａ＊値（Δａ＊）、すなわち（ａ＊ＵＶ照射後−ａ＊ＵＶ照射前）の変化から導かれ、変化率は次のように表された：［（処置スポットのΔａ＊／対照スポットのΔａ＊）×１００］。Ｐ値は両側スチューデントｔ検定を用いて計算したものであり、個々の被験者の平均減少率（すなわち投与した全ての紫外線量に及ぶ）と非保護（すなわち紅斑の減少が０％）との間の比較を表す。ｔ検定の目的において、非保護（０％減少）に関連する標準偏差は、各個体について計算したものと同じと考えた。結果的に、６名の被験者全員についての平均減少率の有意性を決定する際、非保護値（０％）に関連する標準偏差は、個々の被験者応答のそれに等しいと考えた。
【０１０３】
（保護は紫外線の吸収に依存しない）
３種類の実験により、スルホラファンの紫外線傷害に対する保護効果が入射紫外線の吸収に媒介されないという説得力のある証拠が得られた。（ｉ）日焼け止め剤（スポット当たり約１０ｍｇのＮｅｕｔｒｏｇｅｎａ Ｕｌｔｒａｓｈｅｅｒ，Ｓｕｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ５５）を３日間ブロッコリースプラウト抽出物およびＵＶ照射（５００ｍＪ／ｃｍ２）と同じスケジュールで適用した結果、最後の適用の２４時間後にごく僅かな保護が得られた（３．５％；２つの観察平均）。ボランティアに個人の衛生を保つように勧めたので、ＵＶ吸収効果が２４時間以上持続できることは全くありそうにないと思われる。（ｉｉ）スポット当たり４００ｎｍｏｌの加水分解されていないグルコラファニン（スルホラファンの不活性グルコシノレート前駆体）を送達するブロッコリースプラウト抽出物調製物の適用はごく僅かな保護をもたらした（４．７％；２つの観察平均）。これらの製剤は、スルホラファン前駆体がミロシナーゼにより加水分解されていないことを除いてスルホラファン含有ブロッコリースプラウト抽出物と同一であった。（ｉｉｉ）処置終了後４８または７２時間のＵＶ照射の遅延を除いて、以前のプロトコールに従うブロッコリースプラウト抽出物による１名の被験者の３日間の処置の結果、実質的な継続的保護：４８時間で３２．１％保護および７２時間で１０．３％がもたらされた。これらの対照実験も幅広い種類の酵素の転写活性化に依存する保護戦略の特有の性質を明らかにした。従って、スルホラファンは短い組織半減期を有し（１〜２時間）、それにもかかわらずその効果は長命のタンパク質の合成に依存するので、それは処置後２〜３日でさえ全く明白である。この長続きする特性は、日焼け止め剤、メラトニン、没食子酸エピガロカテキンおよびカロテンなどのその他の局所皮膚保護具について実証されていない（Ｂａｌｉｇａ ａｎｄ Ｋａｔｉｙａｒ，２００６；Ｂａｎｇｈａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。さらに、マウス皮膚での実験は、ブロッコリースプラウト抽出物の紫外線保護効果が同等量の純粋なスルホラファンの効果に相当することを強く示唆する。スルホラファンはＵＶを最大でほぼ２４０ｎｍ吸収し、３１１ｎｍでほぼ透過性であるので、この化合物は、一部の他の局所保護剤とは対照的に３１１ｎｍの紫外線により分解または吸収される可能性が低い。
【０１０４】
略語：ＣＯＸ−２、シクロオキシゲナーゼ２；ＧＳＨ、グルタチオン；γ−ＩＦＮ、インターフェロンγ；ｉＮＯＳ、誘導型一酸化窒素合成酵素；ＬＰＳ、リポ多糖；ＮＱＯ１、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−キノンアクセプターオキシドレダクターゼ（キノンレダクターゼとも表される）。
【０１０５】
［参考文献］
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【表２Ｄ】
【表２Ｅ】
【表２Ｆ】
【表２Ｇ】
【表２Ｈ】
【背景技術】
【０００１】
皮膚は、酸化的傷害、熱、寒さ、紫外線、怪我およびメカニカルストレス等を含む外的環境の変化に常に曝されている。最終分化したケラチノサイトからなる角質層は、水分の損失を防ぎ、感染性病原体（例えば、細菌、ウイルス）、小さな物体（例えば、粒子）、および幅広い種類の水溶性化学物質の侵入を防ぐ天然のバリアを構成している。
【０００２】
本発明は、放射線を含む外部からによる傷害から皮膚および粘膜を保護する方法に関する。
【発明の概要】
【０００３】
この目的のために、本発明は、電離放射線治療を受ける患者において皮膚および粘膜を保護する方法を提供するものであって、この方法は、治療上有効な量のＮｒｆ２誘導物質を含む組成物を電離放射線に曝される患者の身体の領域および周辺領域に局所投与することを含む。この処置を受ける患者は、短期または長期の電離放射線治療の影響を受けていてよい。本発明の一態様では、患者は、急性紅斑、皮膚刺激、炎症、浮腫、落屑、皮膚の壊死、口内のひりひりする痛みおよび潰瘍、疼痛、線維症、毛細血管拡張症、口腔乾燥症、眼球乾燥症、膣または直腸粘膜の乾燥および刺激、黒色腫、乳癌、胃癌、肺癌または甲状腺疾患に罹患していてよい。本発明のもう一つの態様では、この処置を受ける患者は症状がなくてもよい。
【０００４】
さらなる実施形態では、電離放射線治療を受ける患者において皮膚および粘膜を保護する方法は、電離放射線に曝される患者の身体の領域および周辺領域に治療上有効な量の第２相酵素誘導物質を含む組成物を局所投与することを含む。一実施形態では、第２相誘導物質は、イソチオシアネートである。好ましい実施形態では、第２相酵素誘導物質は、スルホラファンである。もう一つの好ましい実施形態では、第２相酵素誘導物質は、スルホラファン合成類似体である。スルホラファン類似体は、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノン、エキソ−２−アセチル−６−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−イソチオシアナト−６−メチルスルホニルノルボルナン、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノール、１−イソチオシアナト−４−ジメチルホスホニルブタン、エキソ−２−（１’−ヒドロキシエチル）−５−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−アセチル−５−イソチオシアナトノルボルナン、１−イソチオシアナト−５−メチルスルホニルペンタン、シス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートおよびトランス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートからなる群から選択され得る。
【０００５】
さらに別の実施形態では、Ｎｒｆ２誘導物質はグルコシノレートである。さらなる実施形態では、組成物は、電離放射線治療の前、間、または後に患者に投与される。
【０００６】
さらなる実施形態では、本発明は、皮膚への局所適用のための組成物を提供するものであって、この組成物は、治療上有効な量のＮｒｆ２誘導物質と、送達に適した媒体（ビヒクル）とを含む。Ｎｒｆ２誘導物質の局所送達に適したビヒクルとしては、ホホバ油および月見草油が挙げられる。
【０００７】
好ましくは、組成物中のＮｒｆ２誘導物質は、第２相酵素誘導物質である。より好ましくは、第２相誘導物質は、イソチオシアネートである。さらにより好ましくは、第２相酵素誘導物質は、スルホラファンまたはスルホラファン合成類似体である。スルホラファン類似体は、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノン、エキソ−２−アセチル−６−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−イソチオシアナト−６−メチルスルホニルノルボルナン、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノール、１−イソチオシアナト−４−ジメチルホスホニルブタン、エキソ−２−（１’−ヒドロキシエチル）−５−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−アセチル−５−イソチオシアナトノルボルナン、１−イソチオシアナト−５−メチルスルホニルペンタン、シス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートおよびトランス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートからなる群から選択され得る。
【０００８】
もう一つの実施形態では、Ｎｒｆ２誘導物質は、グルコシノレートである。好ましくは、局所投与のための組成物は、軟膏、クリーム、エマルション、ローション、ゲルまたは日焼け止め剤の形態である。
【０００９】
前述の発明の概要ならびに後述の図面の簡単な説明および発明を実施するための形態は、例示的なものであり、説明のためのものであって、特許請求の範囲に記載した本発明のさらなる説明を提供することを意図するものである。その他の目的、利点、および新規な特徴については、当業者であれば後述する記載から明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＰＥネズミケラチノサイト（Ａ）およびヒトＨａＣａＴケラチノサイト（Ｂ）中のスルホラファン濃度に対して、キノンレダクターゼ（ＮＱＯ１）の誘導およびＧＳＨの上昇を示すグラフである。細胞（１穴当たり２０，０００個）を、９６穴プレートに蒔き、一連の濃度のスルホラファンに曝露した。細胞可溶化物中のＧＳＨおよびＮＱＯ１レベルをそれぞれ２４時間後および４８時間後に測定した。各々のデータポイントは、８つの異なる穴の測定値の平均を表す。標準偏差は、全てのデータポイントについて＜５％であった。
【図２】ＵＶＡ線によって生成する反応性酸素中間体に対して、ＰＥネズミケラチノサイト中のスルホラファンによりもたらされる保護を示すグラフである。細胞（１穴当たり５０，０００個）を、２４穴プレートに蒔き、５μＭスルホラファンで２４時間処理し、ＤＰＢＳで洗浄し、次いでＵＶＡに曝露した（１０Ｊ／ｃｍ２）。紫外線により生成された反応性酸素中間体を蛍光プローブ２’，７’−ジクロロジニトロフルオレセインにより定量し、蛍光強度を測定した（曝露細胞の非曝露細胞に対する比として表す）。
【図３】健康なヒトボランティアのヒト皮膚において１００ｎｍｏｌスルホラファンの単回局所投与によるキノンレダクターゼ（ＮＱＯ１）の誘導の経時的推移を示す図である。
【図４】２４時間間隔で５０ｎｍｏｌのスルホラファンを３回局所投与することによる、健康なヒトボランティアのヒト皮膚におけるＮＱＯ１の誘導を示す図である。
【図５】γ−インターフェロンまたはリポ多糖類で刺激したＲＡＷ２６４．７細胞における（Ａ）ＮＯ産生ならびにｉＮＯＳ ｍＲＮＡ（Ｂ）およびタンパク質（Ｃ）誘導への、スルホラファンにより引き起こされる阻害を示す図である。細胞を、様々な濃度のスルホラファンと、ＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはリポ多糖（ＬＰＳ；３ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで２４時間処理した。培地中のＮＯを亜硝酸塩としてＧｒｉｅｓｓ反応（Ａ）により測定し、ｉＮＯＳ誘導をノーザンブロッティング（Ｂ）およびウエスタンブロッティング（Ｃ）により検出した。
【図６】ハイリスクマウスにおいてＵＶＢ線により誘導される皮膚発癌のスルホラファンによる阻害を示す図である。
【図７】スルホラファンの経皮投与によるハイリスクマウスにおける全体的な腫瘍量の阻害を示すグラフである。腫瘍量は、リスクのある動物の数で除算した全ての腫瘍の全容積（ｍｍ３）として表される。平均値±ＳＥが示される。腫瘍容積を対数変換すると（処置時間を入れ子式変数として用いる濃度のＡＮＯＶＡ）、劇的かつ極めて有意な濃度（処置）効果があった（ｐ＜０．００２７）。
【図８】小型腫瘍（＜１ｃｍ３、白色棒）および大型腫瘍（＞１ｃｍ３、黒色棒）の多重度へのスルホラファンの影響を示すグラフである。保護具またはビヒクルでの処置後１１週間に、対照群での腫瘍発生率は１００％であり、実験を停止した。同じ日に全てのマウスを安楽死させ、腫瘍サイズを測定した。低用量の０．３μｍｏｌスルホラファン、高用量の１．０μｍｏｌスルホラファンを毎日、週５回、これらの動物の背側に投与した。
【図９】スルホラファンの食餌投与を受けているハイリスクマウスにおける腫瘍発生率（腫瘍をもつマウスの率）を示すグラフである。対照群は円として表され、低用量群は四角形として表され、高用量群は三角形として表される。低用量および高用量グルコラファニンを与えられている動物における腫瘍発生率は、対照群と比較して、それぞれ２５％および３５％減少した。
【図１０】スルホラファンの食餌投与を受けているハイリスクマウスにおける腫瘍多重度（１匹のマウス当たりの腫瘍の数）を示すグラフである。対照群は円として表され、低用量群は四角形として表され、高用量群は三角形として表される。腫瘍多重度は、対照群と比較して、それぞれ４７％および７２％減少した。
【図１１】スルホラファンの食餌投与を受けているハイリスクマウスにおいて、１匹のマウス当たりの腫瘍量（全腫瘍容積）を示すグラフである。対照群は円として表され、低用量群は四角形として表され、高用量群は三角形として表される。低用量および高用量グルコラファニン処置は両方ともに、対照群と比較して１匹のマウス当たりの全腫瘍容積の７０％阻害という結果となった。
【図１２】３１１ｎｍ紫外線の浮腫および炎症作用に対して、スルホラファンおよびスルホラファンに富むブロッコリースプラウト抽出物によりもたらされるマウス皮膚の保護を示す図である。ＳＫＨ−１無毛マウスの背側を、２４時間間隔で３用量の：（ｉ）５０μｌの８０％アセトン／２０％水（ｖｏｌ／ｖｏｌ）中０．５μｍｏｌのスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物を尾側部位に、および（ｉｉ）頭側部位に投与される溶媒、を用いて局所的に処置した。７００ｍＪ／ｃｍ２の３１１ｎｍＵＶ照射を最終用量から２４時間後に受けた動物を２４時間後に安楽死させ、それらの背側の皮膚を採取した。（Ａ）９μｍ厚の皮膚の新鮮凍結切片をパラホルムアルデヒドに固定して、Ｈ＆Ｅで染色した（スケールバー１００μｍ）。（Ｂ）マウスを一連の範囲の線量の紫外線で照射し、２４時間後に安楽死させた。（Ｃ）液体窒素凍結し、微粉砕した背側の皮膚から調製した全ホモジネートの上清画分においてＭＰＯ特異的活性を測定し、そのタンパク質レベルを抗ＭＰＯ抗体（Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてウエスタンブロットにより検出した。タンパク質レベルの均一性を、並行ゲルのクーマシーブルー染色により確認した（データは示さず）。（ＤおよびＥ）ＭＰＯ特異的（Ｄ）およびＮＱＯ１特異的（Ｅ）活性を、溶媒（黒色棒）、スルホラファン（灰色棒）、およびブロッコリースプラウト抽出物（白色棒）で処置したマウス由来全皮膚ホモジネートの上清画分において測定し、非照射対照に対する各々の処置の比として表した。平均値±ＳＤが示される。８匹の動物を対照群に用い、４匹を各々の処置群に用いた。スルホラファンかまたはブロッコリースプラウト抽出物による処置は、ＵＶ照射に誘導されるＭＰＯ上昇（スルホラファン、Ｐ＝０．００５；ブロッコリースプラウト抽出物、Ｐ＝０．００１）、およびＵＶ照射により低下したＮＱＯ１レベルの回復（スルホラファン、Ｐ＝０．００３；ブロッコリースプラウト抽出物、Ｐ＝０．００００１）に対して同等の保護をもたらした。
【図１３】紅斑の強さが紫外線量に線形に依存することを示す図である。（Ａ）接着性のビニル鋳型（ａｄｈｅｓｉｖｅ ｖｉｎｙｌ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）を胸後部の傍脊柱部に置いた。開口部は直径２．０ｃｍであり、個々に閉鎖して一連の範囲の紫外線量をもたらすことができる。連日同じ位置に正確に鋳型を置くために、各鋳型の四隅にある小さな穴の位置に皮膚マーカーを用いて印を付ける。（Ｂ）紫外線量の関数としての紅斑の強さ。紅斑の値（ａ＊）を、１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２の３１１ｎｍ紫外線への曝露直前および曝露後２４時間の男性被験者の背側の直径２．０ｃｍの円で測定した。２対の隣接するスポットを各紫外線量に割り当てた。照射後のａ＊値の平均変化を（黒円）、重複した値の範囲を示すバーとともに示す。照射前の１６スポット全ての平均ａ＊値は、６．２２±１．９１（ＣＶ＝３０．７％）であった。紫外線量に関するａ＊値の増分の線形相関係数（ｒ２）は、０．９８６である。
【図１４】３１１ｎｍＵＶ照射により引き起こされる紅斑に対して、スルホラファンに富むブロッコリースプラウト抽出物によりもたらされるヒト皮膚の保護を示す図である。（Ａ）一連の範囲のスルホラファン用量を用いる男性ボランティアの局所処置による皮膚紅斑発生の阻害。直径２．０ｃｍ円形スポットに、１００、２００、４００、または６００ｎｍｏｌのスルホラファンを、２５μｌの８０％アセトン／２０％水中ブロッコリースプラウト抽出物として２４時間間隔で３日間与えた。対照スポットに、２５μｌの溶媒のみを与えた。ａ＊の比色計測定値は、５００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を用いる照射の４日前および照射の２４時間後に得た。照射前の溶媒処置部位の４日間の平均ａ＊値は、６．７０±１．１６であった。紅斑形成の阻害（％）は、［ａ＊（未処置）−ａ＊（処置）／ａ＊（未処置）］×１００から計算した。未処置の値（ゼロ線量）は、２５μｌの、４００ｎｍｏｌの加水分解されていないグルコラファニン（スルホラファンの不活性グルコシノレート前駆体）を含有する８０％アセトン／２０％水中ブロッコリースプラウト抽出物を与えた２つの領域の増分から計算した。（Ｂ）１００、２００、４００、または６００ｎｍｏｌの用量のスルホラファンを（ブロッコリースプラウト抽出物として）、あるいは溶媒のみを投与された個体（Ａと表す）の４対のスポットの写真。（Ｃ）スルホラファン含有ブロッコリースプラウト抽出物を用いる局所処置の、一連の範囲の線量の紫外線への紅斑応答への効果。１６窓の鋳型を用いて、水平に隣接するスポット対を、２５μｌの８０％アセトン／２０％水中２００ｎｍｏｌのスルホラファンかまたは溶媒のみのいずれかを用いて３日連続で２４時間間隔で処理し、２４時間後に１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を照射した。各スポットのａ＊値の増分を、ＵＶ照射前のそれらの４日間の平均に関して、紫外線量の関数としてプロットする。視覚的に決定される最小紅斑線量は６００ｍＪ／ｃｍ２であった。（Ｄ）５００、６００、または７００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を受けた、ブロッコリースプラウト抽出物で処置したスポットおよび溶媒で処置したスポットの対の写真。この被験者に関する完全なセットの減少率は、表１に示される（被験者２）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
電離放射線治療または放射線治療は、悪性腫瘍の治療によく使用される。電離放射線は、脳、乳、子宮頸部、喉頭、肺、膵臓、前立腺、皮膚、脊椎、胃、子宮の癌および軟部組織肉腫をはじめとするほとんどあらゆる種類の固形腫瘍において、癌細胞を死滅させ、腫瘍を収縮させるために用いることができる。また、放射線を用いて白血病およびリンパ腫を治療することもできる。放射線治療は、腫瘍もしくは症状の開放を局所管理するための治療法がない場合の対症療法として、または患者の寿命を伸ばすための治療上の処置として用いられ得る。全身照射は骨髄移植の前に行われる。一部の例では、放射線治療は、非悪性状態、例えば三叉神経痛、甲状腺眼疾患、翼状片およびケロイド瘢痕増殖または異所性骨化の予防の処置に用いられる。大きな腫瘍または進行した腫瘍の処置に対する反応性を増大させるために、温熱療法すなわち深部組織加熱が放射線と併用して用いられる場合が多い。
【００１２】
放射線治療は、そのＤＮＡを破壊し、シグナル伝達経路を変更し、かつアポトーシスを誘導することにより標的組織の細胞を破壊する。電離放射線は、比較的広い面積に放射線を与えることのできる、Ｘ線およびγ線を含む電磁線（光子）と、ごく短い距離だけ組織に透過することのできる微粒子線（粒子ビームとも呼ばれる）、例えば電子、陽子、および中性子などからなる。標的組織への放射線量は、癌の種類および位置を含む多数の要因に依存する。次に、放射線に対する細胞の応答は、数ある中でも放射線の種類および線量ならびに組織の感受性に依存する。理想としては、放射線は、正常細胞への影響は最小限に、腫瘍細胞の死滅を対象とするものでありたい。にもかかわらず、放射線治療の間の電離放射線は、癌組織だけでなく健常器官および組織にも影響を及ぼす。
【００１３】
放射線治療は、皮膚紅斑、刺激作用および炎症を含む短期副作用、ならびに中期および長期副作用、例えば浮腫、疼痛、線維症および拡張型表層血管（ｄｉｌａｔｅｄ ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ）（毛細血管拡張症）に関連する場合が多い。乳房切除術の後の胸壁の処置、頭頚部腫瘍および皮膚腫瘍のための放射線治療は、急性反応ならびに皮膚および粘膜への重度のダメージを引き起こす可能性がある。皮膚反応は、急性紅斑から落屑および壊死まで様々であり得る。同様に、口、咽頭、食道、気管、腸、膀胱および直腸内の粘膜はダメージを受ける可能性がある。口内のひりひりする痛みおよび潰瘍は電離放射線で治療を受けた後の患者に共通する症状である。放射線の急性効果は唾液または粘液を産生する付属腺で感じられるが、副作用には口腔乾燥症（口渇）、眼球乾燥症（ドライアイ）および膣粘膜の乾燥も含まれる。
【００１４】
長期合併症は、一般により高用量の放射線（３５グレイ以上）で起こる。数ヶ月または数年の経過中に発症し得る遅発性副作用には、結合組織の増加に起因する組織の瘢痕、続発性癌、例えば放射線領域に隣接する身体領域で発症する胸、胃、肺および黒色腫など、および甲状腺疾患が挙げられる。
【００１５】
身体の深部器官、例えば肝臓、肺、膵臓、卵巣、直腸、前立腺、胸および胃などの進行性腫瘍または大型腫瘍は、電離放射線に加えて温熱療法または加温を必要とする場合が多い。癌組織は通常深部組織を４３℃〜５０℃の範囲の温度に曝すことにより破壊され、皮膚の熱傷を引き起こす。
【００１６】
放射線治療の細胞毒性効果は、ＤＮＡのイオン化、ならびに、細胞、タンパク質およびＤＮＡに損傷を与え得る、スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素およびヒドロキシルラジカルを含む活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を引き起こす、電子のエネルギーレベルの増加に関連している。
【００１７】
宇宙旅行者も透過性電離放射線に曝露される。宇宙放射線には、陽子および高質量（Ｈ）、高原子番号（Ｚ）および高エネルギー（Ｅ）粒子（ＨＺＥ粒子）放射線が含まれる。宇宙放射線により引き起こされる損傷は、放射線曝露の時点で起こる。
【００１８】
本発明者らは、哺乳類において、特に放射線治療、温熱療法または宇宙放射線に曝露されたヒトにおいて、電離放射線に曝露された皮膚および粘膜の領域ならびに周辺領域へのＮｒｆ２誘導物質の局所適用が、皮膚および粘膜の機械的回復力を著しく向上させ、かつ、皮膚および粘膜損傷を防止または減少させることを見出した。特に、放射線治療の前、間または後に医薬上有効量のスルホラファンを局所投与すると、皮膚および粘膜への短期および長期損傷に対して効果的な保護が得られる。
【００１９】
本発明の目的において、用語「患者」は動物を意味する。本発明の好ましい態様では、患者は哺乳類である。本発明の最も好ましい態様では、哺乳類はヒトである。
【００２０】
皮膚または粘膜への損傷または皮膚もしくは粘膜の障害は、本文脈で用いられるように、当業者に明らかであるはずであり、放射線治療が損傷または障害の病因に関与している皮膚および粘膜のあらゆる異常を含むことが意図される。本発明を用いることのできる損傷または疾患の例としては、好ましくは、限定されるものではないが、急性紅斑、皮膚刺激、炎症、浮腫、落屑、皮膚の壊死、口内のひりひりする痛みおよび潰瘍、疼痛、線維症、毛細血管拡張症、口腔乾燥症、眼球乾燥症、膣粘膜の乾燥、乳癌、胃癌、肺癌、黒色腫および甲状腺疾患が挙げられる。
【００２１】
本発明により想定される治療は、既存の状態をもつ患者または皮膚もしくは粘膜疾患の素因のある患者に使用することができる。さらに、本発明の方法は、患者において放射線治療の症状を軽減するため、または、患者において予防処置として用いることができる。
【００２２】
本明細書において、「医薬上有効量」は、臨床的に有意な細胞応答を誘起するために有効な量を意味することが意図される。
【００２３】
転写因子ＮＦ−Ｅ２−関連因子２（Ｎｒｆ２）は、転写因子のＣＮＣ（Ｃａｐ−Ｎ−Ｃｏｌｌａｒ）ファミリーに属し、高度に保存された塩基性領域−ロイシンジッパー（ｂＺｉｐ）構造を有する。Ｎｒｆ２は、防御酵素をコードする第２相遺伝子として一般に公知の抗酸化剤および解毒遺伝子の構成的および誘導的発現の重要な役割を果たし、防御酵素には、薬剤代謝酵素、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＮＡＤＰ（Ｈ）：キノンオキシドレダクターゼおよびＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼなど、ならびに酸化および生体異物ストレスに応える抗酸化剤酵素、例えばヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）および−グルタミルシステインシンセターゼ（ＧＣＳ）などが含まれる（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｆａｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｆａｈｅｙ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，１９９９；Ｈｏｌｔｚｃｌａｗ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ，２００４）。これらの酵素は、抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）または求電子剤応答配列（ＥｐＲＥ）と呼ばれるプロモーターによって調節される。第２相遺伝子は、反応性酸素または窒素種（ＲＯＳまたはＲＮＳ）の除去、求電子剤の解毒および細胞内還元電位の維持を含む、細胞防御機構を担う（例えば、Ｈｏｌｔｚｃｌａｗ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ，２００４）。
【００２４】
Ｎｒｆ２は通常、Ｋｅａｐ１と呼ばれるアクチン結合性調節タンパク質によって細胞の細胞質中に隔離されている。細胞が酸化的または求電子性のストレスに曝されると、Ｋｅａｐ１−Ｎｒｆ２複合体は立体構造変化を受け、Ｎｒｆ２が複合体から遊離し、核内に放出される。活性のあるＮｒｆ２は小さなＭａｆタンパク質と二量体化し、ＡＲＥに結合し、第２相遺伝子転写を活性化させる（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ，２００４）。
【００２５】
第２相酵素の誘導は、発癌および変異誘発性から保護し、細胞の抗酸化性能を促進するという証拠が増えてきている（Ｆａｈｅｙ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，１９９９；Ｉｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。これまで、９つのクラスの第２相酵素誘導物質が同定された：１）ジフェノール、フェニレンジアミンおよびキノン；２）Ｍｉｃｈａｅｌ受容体；３）イソチオシアネート；４）ヒドロペルオキシドおよび過酸化水素；５）１，２−ジチオール−３−チオン；６）ジメルカプタン；７）三価ヒ素剤；８）二価重金属；および９）カロテノイド、クルクミンおよび関連ポリエン（Ｆａｈｅｙ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，１９９９）。これらの第２相酵素誘導物質は、直接の抗酸化薬とは違って、酸化還元反応中に化学量的に消費されず、作用の持続時間が長く、直接的な抗酸化薬、例えばトコフェロールおよびＣｏＱなどの機能を補助し、強力な抗酸化薬であるグルタチオンの合成を促進するので、非常に効果的な抗酸化薬であると考えられる（Ｆａｈｅｙ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，１９９９）。
【００２６】
利尿薬であるエタクリン酸（ＥＡ）、求電子性Ｍｉｃｈａｅｌ受容体であるオルチプラズ、およびイソチオシアネートであるスルホラファンは、免疫刺激マクロファージ由来の、炎症性疾患の病因に関与する炎症促進性タンパク質である、高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）のリポ多糖（ＬＰＳ）に誘導される分泌を阻害することが示されている（Ｋｉｌｌｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。オルチプラズは、肝臓および膀胱において発癌物質解毒を促進することにより発癌を抑制する（Ｉｉｄａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。創傷皮膚を含む損傷組織および炎症組織の酸化ストレスに対するケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）の細胞保護作用は、皮膚の創傷修復の間のＮｒｆ２のＫＧＦ刺激に関連している（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【００２７】
主にアブラナ科の野菜に由来するイソチオシアネートは、第２相酵素の活性化による腫瘍の化学防御、発癌物質活性化第１相酵素の阻害およびアポトーシス誘導において、強力な抗酸化薬であり、効果的な薬剤である（Ｈｅｃｈｔ，１９９５；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ，１９９４；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，１９９４）。イソチオシアネートは、β−チオグルコシド−Ｎ−ヒドロキシ硫酸塩であり、捕食者による野菜の冷浸、食品調製または咀嚼により、結果として起こる酵素ミロシナーゼの活性化および放出とともに細胞の破壊が引き起こされる時に、植物においてグルコシノレートの加水分解から形成される。結果として得られるアグリコンは、非酵素的分子内転位を受けて、イソチオシアネート、ニトリルおよびエピチオニトリルを生じる。
【００２８】
スルホラファンは、スルホラファングルコシノレート（ＳＧＳ）としても公知のグルコシノレート・グルコラファニンのアグリコン分解産物である。スルホラファンの分子式は、Ｃ６Ｈ１１ＮＯＳ２であり、その分子量は１７７．２９ダルトンである。スルホラファンは、４−メチルスルフィニルブチルイソチオシアネートおよび（−）−１−イソチオシアナト−４（Ｒ）−（メチルスルフィニル）ブタンとしても公知である。スルホラファンの構造式は、
【化１】
である。
【００２９】
スルホラファンは近年ブロッコリーにおいて同定され、単離されたネズミ肝細胞癌細胞において強力な第２相酵素誘導物質であることが示され（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、スプラーグドーリーラットにおいて乳房腫瘍の形成を阻止し（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、マウス皮膚腫瘍形成の促進を妨げ（Ｇｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００６）、ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞においてヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）発現を増加させる（Ｋｅｕｍ ｅｔ ａｌ．，２００６）。スルホラファンはまた、ヒトケラチノサイトにおいて皮膚発癌のプロモーターであるアクチベータータンパク質−１（ＡＰ−１）の紫外（ＵＶ）光に誘導される活性化を阻害することも示され（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００４）、スルホラファン抽出物を局所適用すると、マウス皮膚表皮において第２相酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ１（ＮＱＯ１）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＡ１およびヘムオキシゲナーゼ１のレベルが増加するという証拠がある（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。さらに、スルホラファンは、強力な細胞傷害性薬剤であり、かつ強力な突然変異誘発物質および発癌物質である、硫黄マスタードからヒト上皮ケラチノサイトを保護し（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）、かつ、細胞増殖を阻害し、アポトーシスを活性化させ、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）活性を阻害し、かつ、ヒト乳癌細胞において乳癌増殖に関与する主要タンパク質である、エストロゲン受容体−α、上皮成長因子受容体およびヒト上皮成長因子受容体−２の発現を低下させる（Ｐｌｅｄｇｉｅ−Ｔｒａｃｙ ｅｔ ａｌ．，２００７）。さらに、スルホラファンは、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）をヒト胃異種移植片から根絶させることが示された（Ｈａｒｉｓｔｏｙ ｅｔ ａｌ．，２００３）。
【００３０】
本発明は、上記のように、放射線治療、温熱療法または宇宙放射線により引き起こされる皮膚もしくは粘膜に対する損傷または皮膚もしくは粘膜の障害を予防または治療する方法として、転写因子ＮＦ−Ｅ２−関連因子２（Ｎｒｆ２）を誘導する方法に関する。
【００３１】
本発明の方法において使用される化合物は、上記のように、Ｎｒｆ２活性の誘導物質である。
【００３２】
イソチオシアネートは、イソチオシアネート（ＮＣＳ）部分を含有する化合物であり、当業者によって容易に同定できる。イソチオシアネートの例としては、限定されるものではないが、スルホラファンまたはその類似体が挙げられる。イソチオシアネート類似体の説明および調製は、米国再発行特許第３６，７８４号に記載され、参照によりその全文が本明細書に援用される。本発明で使用されるスルホラファン類似体としては、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノン、エキソ−２−アセチル−６−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−イソチオシアナト−６−メチルスルホニルノルボルナン、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノール、１−イソチオシアナト−４−ジメチルホスホニルブタン、エキソ−２−（１’−ヒドロキシエチル）−５−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−アセチル−５−イソチオシアナトノルボルナン、１−イソチオシアナト−５−メチルスルホニルペンタン、シス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートおよびトランス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートが挙げられる。
【００３３】
イソチオシアネートの前駆体であるグルコシノレートも、本発明により企図される。グルコシノレートは当分野で周知であり、その全内容が参照により本明細書に援用されるＦａｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５６：５−５１（２００１）に概説されている。
【００３４】
本発明により企図されるその他の化合物としては、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、オルチプラズ、エタクリン酸、およびそれらの類似体、ならびに、さらなるＭｉｃｈａｅｌ反応受容体、例えばトリテルペノイドまたは環状／非環状ビスベンジリデンアルカロン（ａｌｋａｌｏｎｅｓ）が挙げられる。
【００３５】
本発明の方法で使用される化合物は、哺乳類への局所投与に適した医薬上許容される賦形剤とともに医薬組成物に処方することができる。そのような賦形剤は当分野で周知である。局所投与には、肺、胃、膣、口および目の表面を含む皮膚または粘膜への投与が含まれる。
【００３６】
局所投与の投薬形態としては、限定されるものではないが、軟膏、クリーム、エマルション、ローション、ゲル、日焼け止め剤および表皮内部での浸透を助ける薬剤が挙げられる。好ましい実施形態では、組成物は局所軟膏の形態である。
【００３７】
当業者に公知の様々な添加剤を、本発明の局所製剤に含めてよい。添加剤の例としては、限定されるものではないが、可溶化剤、皮膚透過促進剤、防腐剤（例えば、抗酸化剤）、モイスチャライザー、ゲル化剤、緩衝剤、界面活性剤、乳化剤、皮膚軟化薬、増粘剤、安定剤、保湿剤、分散剤および製薬担体が挙げられる。
【００３８】
モイスチャライザーの例としては、ホホバ油および月見草油が挙げられる。
【００３９】
適した皮膚透過促進剤は当分野で周知であり、例えばメタノール、エタノールおよび２−プロパノールなどの低級アルカノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、デシルメチルスルホキシド（Ｃ１０ＭＳＯ）およびテトラデシルメチルスルホキシドなどのアルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、尿素、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルアミド、Ｃ２−Ｃ６アルカンジオール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）およびテトラヒドロフルフリルアルコールが挙げられる。
【００４０】
可溶化剤の例としては、限定されるものではないが、例えばジエチレングリコールモノエチルエーテル（エトキシジグリコール、Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ（登録商標）として市販されている）およびジエチレングリコールモノエチルエーテルオレエート（Ｓｏｆｔｃｕｔｏｌ（登録商標）として市販されている）などの親水性エーテル、ポリオキシ３５ヒマシ油、ポリオキシ４０水素化ヒマシ油、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、特にＰＥＧ３００およびＰＥＧ４００などの低分子量ＰＥＧ、ＰＥＧ−８カプリル酸／カプリン酸グリセリド（Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）として市販されている）などのポリエチレングリコール誘導体、ＤＭＳＯなどのアルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、ＤＭＡ、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００４１】
適した製薬担体としては、無毒であって、組成物のその他の成分または皮膚とあまり有害な様式で相互作用しない、当分野で公知のあらゆる当該材料、例えば、あらゆる液体、ゲル、溶媒、液体希釈剤、可溶化剤、ポリマーなどが挙げられる。
【００４２】
感染の予防および／または治療は、抗生物質、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸、および同類のものなどを、本発明の組成物中に含めることによって達成することができる。
【００４３】
当業者であれば、本発明の方法で使用される組成物中の薬剤の有効量を経験的に決定することができることを理解する。ヒト患者に投与される場合、本発明の組成物の一日の全使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医により決定されることは当然理解される。任意の特定患者に関する具体的な治療有効量レベルは、多様な要因、すなわち、達成するべき応答の種類および程度、用いる具体的な組成物の活性、患者の年齢や体重、総合的な健康状態、性別および食事、治療の持続期間、本発明の方法と併用して又は同時に用いる薬剤、ならびに医学分野で周知の同様の要因によって決まる。
【００４４】
一般に、患者に局所投与される組成物中のＮｒｆ２誘導物質の量は、約１００ｎｍｏｌ〜約１μｍｏｌ／ｃｍ２であり、放射線治療または温熱療法の結果として生じる短期および長期の副作用を防ぐかまたは最小限にするために、組成物は患者の身体の関連部分の上の皮膚に直接適用される。
【００４５】
開示される製剤の見込まれる商業用途としては、例えば、（ｉ）保護／予防用途、（ｉｉ）化粧品用途および（ｉｉｉ）医学的用途が挙げられる。一実施形態では、油性（スルホラファン）または水性（グルコラファニンに加水分解剤を加えたもの）のいずれかの局所適用のための保護ローションおよびクリームが提供される。もう一つの実施形態では、スルホラファン含有組成物を日焼け止め剤と組み合わせることができる。
【００４６】
また、上記のＮｒｆ２誘導物質を含む組成物は、経口投与、粘膜投与、皮下投与、筋肉内投与および非経口投与を含む、様々なその他の経路で投与することができ、多様な担体または賦形剤を含んでよい。適した担体としては、限定されるものではないが、無毒の固体、半固体または液体増量剤、希釈剤、カプセル化剤または任意の種類の製剤助剤、例えばリポソームなどを挙げることができる。
【００４７】
非経口注射のための組成物は、医薬上許容される滅菌水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液またはエマルションならびに使用直前に滅菌注射液または分散液へ再構成するための滅菌粉末を含んでよい。適した水性および非水性担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および同類のものなど）、カルボキシメチルセルロースおよびそれらの適した混合物、植物油（例えばオリーブ油など）、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用することにより、分散液の場合には所要の粒径を維持することにより、そして界面活性剤を使用することにより維持することができる。本発明の組成物は、アジュバント、例えば、限定されるものではないが、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などを含有してもよい。糖、塩化ナトリウム、および同類のものなどの等張剤を含むことも望ましい。注射用医薬品形態の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの封入によりもたらすことができる。
【００４８】
一部の例では、薬剤の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの吸収を遅らせることが望ましい。これは難水溶性の結晶性または非晶質物質の液体懸濁液を使用することにより達成することができる。その結果薬剤の吸収速度はその溶解速度に依存し、それは次に、結晶の大きさおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口投与された薬剤形態の遅延吸収は、薬剤を油性ビヒクルに溶解または懸濁することにより達成される。
【００４９】
注射用デポー形態は、薬剤のマイクロカプセルマトリックス（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌｅ ｍａｔｒｉｃｅｓ）をポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に形成することにより製造される。薬剤のポリマーに対する比および用いる特定のポリマーの性質によって、薬剤放出速度を制御することができる。その他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。また、デポー注射用製剤は、生体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬剤を捕捉することにより調製される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルタを通して濾過することによるか、または、使用直前に滅菌水またはその他の滅菌注射用媒体に溶解または分散させることのできる無菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより滅菌することができる。
【００５０】
経口投与のための固体投薬形態としては、限定されるものではないが、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉剤、および顆粒剤が挙げられる。このような固体投薬形態において、活性化合物は、クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムなどの医薬上許容される賦形剤もしくは担体、ならびに／または、ａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸などの増量剤またはエキステンダー、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアラビアガムなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの保湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィンなどの溶解遅延剤、ｆ）第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、ｇ）例えば、アセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイトクレーなどの吸収剤、およびｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの滑沢剤の少なくとも１つの物品と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合には、投薬形態は緩衝剤を含んでもよい。同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤ならびに高分子量ポリエチレングリコールおよび同類のものなどを用いて軟および硬ゼラチンカプセル中で増量剤として用いることもできる。
【００５１】
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体投薬形態は、コーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティングおよびその他のコーティングなど、製薬処方分野で周知の長期放出（ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）、持続放出、遅延放出および即時放出コーティングなどを用いて調製することができる。それらは所望により不透明剤を含有してよく、腸管の特定の部分において、有効成分だけを、または優先的に、所望により遅延様式で放出する組成物でもあり得る。使用できる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが含まれる。また、活性化合物は、適切な場合、１以上の上述の賦形剤とともにマイクロカプセル形態に含まれていてもよい。
【００５２】
経口投与のための液体投薬形態としては、限定されるものではないが、医薬上許容されるエマルション、溶液、懸濁液、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。活性化合物に加えて、液体投薬形態は、当分野で慣用される不活性希釈剤、例えば、水またはその他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などを含有してよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物には、補助剤、例えば湿潤剤、乳化剤および沈殿防止剤、甘味料、香味料、および香料が含まれてよい。懸濁液には、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、およびトラガカントガム、およびそれらの混合物のような沈殿防止剤が含有されてよい。
【００５３】
本発明に従う飲食用組成物（ｄｉｅｔａｒｙ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、スルホラファン、イソチオシアネート、グルコシノレートまたはそれらの類似体を含有するあらゆる摂取可能な調製物である。例えば、スルホラファン、イソチオシアネート、グルコシノレートまたはそれらの類似体は、食品に混合されてよい。この食品は、乾燥させ、調理し、茹で、凍結乾燥させ、または焼くことができる。本発明において企図される膨大な数の食品の中には、パン、茶、スープ、シリアル、サラダ、サンドウィッチ、スプラウト（ｓｐｒｏｕｔｓ）、野菜、動物飼料、丸剤、および錠剤がある。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
（ブロッコリースプラウトからのスルホラファンの調製）
農薬またはその他の種子処理化学物質で全く処理されていないことが認証されたブロッコリーの種子（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｉｔａｌｉｃａ，ｃｖ．ＤｅＣｉｃｃｏ）を発芽させ、Ｆａｈｅｙ ｅｔ ａｌ．（１２）に記載される通り処理した。手短に言えば、種子を微量のＡｌｃｏｎｏｘ（登録商標）洗浄剤を含有するＣｌｏｒｏｘ（登録商標）漂白剤の２５％水溶液で表面消毒し、水で徹底的にすすいだ。次に、これらの種子を傾斜した多孔プラスチックトレイに層状に広げ、濾過水を１時間に約６回３０秒間霧状に吹き付け、頭上蛍光ランプから照射した。３日後に、スプラウトを蒸気ジャケット付きやかん中の沸騰水に直接投じ、沸騰状態に戻して、約５分間攪拌することにより成長を止めた。この処理により、内在性のスプラウトミロシナーゼを不活性化し、グルコシノレートを抽出した。ＨＰＬＣ（２６）により測定すると、スルホラファン前駆体であるグルコラファニンが、初期抽出物中の支配的なグルコシノレートであった。次に、Ｆａｈｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７ およびＳｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００１（１２，２７）に記載されるように、ダイコンスプラウトミロシナーゼを、グルコシノレートのイソチオシアネートへの定量的変換のために加えた。次に、この調製物を凍結乾燥し、酢酸エチルに溶解させ、回転蒸発により蒸発乾固させ、少量の水に溶解させ、８０％アセトン：２０％水（ｖ／ｖ）中５０ｍＭスルホラファンの終濃度までアセトンを添加した。総イソチオシアネート含量を環化縮合反応（２８）により決定し（１２，２７）、ＨＰＬＣ（２６）によりグルコシノレートの完全な不在を確認し、ミロシナーゼ反応により開放されるイソチオシアネートの正確な比率をアセトニトリル勾配でのＨＰＬＣにより決定し、抽出物のグルコシノレートプロフィールに一致させた。スルホラファンはイソチオシアネート含量の９０％超を構成した。この調製物を８０％アセトン（ｖ／ｖ）に希釈して、「高用量」（１．０μｍｏｌ／１００μｌ）および「低用量」（０．３μｍｏｌ／１００ｍｌ）を作成した。Ｐｒｏｃｈａｓｋａ試験（２９，３０）中の生物検定法により、以前の実験（１１）に一致するＣＤ値（ＮＱＯ１の活性を二倍にするために必要な濃度）を得た。
【００５５】
（実施例２）
（ケラチノサイトのスルホラファンによる処理）
グルタチオンは主要かつ最も豊富な細胞の非タンパク質チオールであり、細胞防御の重要な部分を構成する：グルタチオンは損傷をもたらす可能性のある求電子剤と容易に反応し、フリーラジカルを捕捉して、過酸化物を還元することにより、反応性酸素中間体およびそれらの毒性代謝産物の解毒に関与する。ＧＳＨの細胞レベルを上昇させる能力は、酸化ストレスに対抗する上で非常に重要である。この目的のため、本発明者らは、ケラチノサイトの培養物においてＵＶＡにより引き起こされる酸化ストレスから保護する、スルホラファンに誘導される第２相応答の能力を調査した。ＵＶＡの遺伝子毒性は主に反応性酸素中間体の生成によるものであると考えられるため、本発明者らはＵＶＡをこの試験に選択した。
【００５６】
（細胞培養）
ＨａＣａＴヒトケラチノサイト（Ｇ．Ｔｉｍ Ｂｏｗｄｅｎ，Ａｒｉｚｏｎａ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｕｃｓｏｎより提供）を、５％ＦＢＳを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養し、ＰＥネズミケラチノサイト（Ｓｔｕａｒｔ Ｈ．Ｙｕｓｐａ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤより提供）を、８％ＦＢＳを含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）で培養し、Ｃｈｅｌｅｘ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で処理してＣａ２＋を除去した。
【００５７】
（キノンレダクターゼ（ＮＱＯ１）およびグルタチオンアッセイ）
細胞（１穴当たり２０，０００個）を９６穴プレートで２４時間増殖させ、その後、連続希釈のスルホラファンに２４時間（グルタチオン定量のため）かまたは４８時間（ＮＱＯ１定量のため）曝露し、最後に０．０８％ジギトニン中に溶解させた。アリコート（２５μｌ）をタンパク質分析のために使用した。ＮＱＯ１の活性をＰｒｏｃｈａｓｋａ試験（２９，３０）により測定した。細胞内グルタチオンレベルを測定するため、２５μｌの細胞溶解産物に２ｍＭ ＥＤＴＡ中５０μｌの氷冷メタリン酸（５０ｇ／リットル）を加えて細胞タンパク質を沈殿させた。４℃にて１０分後、プレートを１，５００ｇにて１５分間遠心し、結果として生じる上清画分５０μｌを平行プレートに移した。これらのウェルの各々に、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０μｌの２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５を添加し、総細胞グルタチオンをリサイクリングアッセイにおける速度測定により定量した（３１，３２）。
【００５８】
（細胞のＵＶ照射および反応性酸素中間体の定量）
ＰＥ細胞（１穴当たり５０，０００個）を２４穴プレートに播種し、４８時間増殖させた。次に、細胞を１μＭまたは５μＭスルホラファンに２４時間曝露した。実験の当日に、培地を除去した後、５００μｌの新鮮培地中１００μＭの２’，７’−ジクロロジニトロフルオレセインジアセテート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とともに３０分間細胞をインキュベートした。次に、蛍光プローブを含有する培地を除去し、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ＵＶＡ放射線（１０Ｊ／ｃｍ２）に曝露した。対照細胞は暗所で保持した。細胞をトリプシンで剥がし、２．０ｍｌのＤＰＢＳ中に懸濁し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ５０蛍光光度計において２ｍｌキュベット中４８５ｎｍで励起し、５２０ｎｍで細胞懸濁液中の蛍光強度を測定した。
【００５９】
ＨａＣａＴヒトケラチノサイトまたはＰＥネズミケラチノサイトをスルホラファンに曝露すると、ＮＱＯ１およびグルタチオンの細胞内レベルは用量依存的に上昇し（
1276669697046_0.ipdl?N0000=235&N0001=31&N0005=RgdyT4qQO2dFG3YNItIz&N0500=4JPA%20420539261%20%20%20%20%20%20%20&N0510=PPfA1vrTnRmHtWshKaY0&N0552=9&N0553=000011
Ａ、Ｂ）、以前の所見に一致する（Ｙｅ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，２００１）。特に顕著であったのが、細胞毒性の明白な証拠を伴わないＨａＣａＴ細胞におけるＮＱＯ１誘導の大きさであった（＞１０倍）。５μＭスルホラファンによる２４時間の処置により、蛍光プローブ２’，７’−ジクロロジニトロ−フルオレセインにより定量される、ＵＶ照射により生成される反応性酸素中間体の実質的な（５０％）低下が生じた（３５）（図２）。
【００６０】
（実施例３）
（マウスにおけるスルホラファンの局所適用のＮＱＯ１およびＧＳＨへの効果）
次に第２相応答をＳＫＨ−１無毛マウスにおいてインビボで評価した。雌ＳＫＨ−１無毛マウス（４週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手し、実験開始前に２週間、本発明者らの動物施設において馴化させた。動物を１２時間明／１２時間暗サイクル、３５％湿度に保持し、水とＡＩＮ７６Ａ固形試料食（Ｈａｒｌａｎ ＴｅｋＬａｄ，誘導物質を含まない）を自由に摂取させた。すべての動物実験は国立衛生研究所のガイドラインに従うものであり、ジョンズ・ホプキンス大学の実験動物委員会により承認された。
【００６１】
７週齢のＳＫＨ−１無毛マウス（群当たり５匹）を、１μｍｏｌのスルホラファンを含有する１００μｌの標準ミロシナーゼ加水分解ブロッコリースプラウト抽出物か、またはビヒクル（１００μｌの８０％アセトン：２０％水、ｖ／ｖ）のいずれかを用いてそれらの背側で局所的に処置した。動物を２４時間後に安楽死させ、背側の皮膚を長方形の鋳型（２．５×５ｃｍ）を用いて切開し、液体Ｎ２中で凍結させた。皮膚試料を液体Ｎ２中で粉砕し、１００ｍｇの結果として生じる粉末を、ＮＱＯ１酵素活性およびタンパク質含量の分析のために、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で緩衝した０．２５Ｍスクロースか、またはグルタチオンの分析のために、２ｍＭ ＥＤＴＡ中氷冷メタリン酸（５０ｇ／リットル）のいずれか１ｍｌ中でホモジナイズした。４℃にて１４，０００ｇで２０分間の遠心分離により、透明な上清画分を得、そのアリコートを、細胞培養実験に関して下に記載されるタンパク質含量、酵素活性および総グルタチオンレベルの測定に使用した。
【００６２】
これらの結果は、スルホラファンの局所投与が、対照と比較して処置動物のＮＱＯ１の約５０％の誘導（Ｐ＜０．００１）および総グルタチオンレベルの約１５％の上昇を生じさせることを示した。
【００６３】
（実施例４）
（ヒトにおけるスルホラファンの局所適用のＮＱＯ１およびＧＳＨへの効果）
健康なヒトボランティアを含むこの試験は、ジョンズ・ホプキンス大学の治験審査委員会により承認されたプロトコールに従って実施した。単回用量のブロッコリースプラウト抽出物の健康なヒトボランティアの皮膚への局所投与の安全性を調査した。抽出物を８０％アセトン：２０％水中で調製し、それらのスルホラファン含量を、イソチオシアネートおよびそれらのジチオカルバメート代謝産物の定量のために本発明者らの研究室で常套的に使用される方法である、環化縮合アッセイにより正確に決定した。各参加者の前腕内側の皮膚に円（直径１ｃｍ）を描き、次いでポジティブディスプレイスメントピペットを用いて抽出物を円の内側に適用した。投与された８つの漸増用量（０．３；５．３；１０．７；２１．４；４２．７；８５．４；１７０；および３４０ｎｍｏｌのスルホラファン）の各々に２名の被験者が参加した。各被験者は自身の対照となり、プラセボ「ビヒクルスポット」を投与された。これらの用量のいずれにおいても有害反応は観察されなかった。
【００６４】
効力試験も行った。エンドポイントは、単回用量のブロッコリースプラウト抽出物の適用後の２名の健康なヒトボランティアの３ｍｍの皮膚パンチ生検におけるキノンレダクターゼ（原型の第２相タンパク質）の酵素活性の測定であった。再び、各被験者は自身の対照となり、「ビヒクルスポット」を投与された。キノンレダクターゼ活性およびタンパク質含量の両方がこれらの試料において確実に検出された。キノンレダクターゼの比活性は、１００ｎｍｏｌのスルホラファンを含有する抽出物の適用後２４時間で約２倍に上昇した（図３）。特に、適用後７２時間で生検を行った場合でさえも活性はプラセボ処置部位の活性よりも高いままであったので誘導は長く続いた。
【００６５】
次に５０ｎｍｏｌのスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物の３回反復した（２４時間間隔での）局所適用の効果を調査した。これにより、２名の健康なヒトボランティアの適用部位の下の皮膚においてキノンレダクターゼ（ＮＱＯ１）比活性がさらに大いに上昇した（図４）。
【００６６】
（実施例５）
（スルホラファンの誘導型一酸化窒素合成酵素への効果）
本発明者らは最近、一連の合成トリテルペノイドに共通して、炎症応答（γ−インターフェロンによるｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２活性化）の阻害と第２相酵素の誘導との間に６桁を超える有効性に及ぶ線形相関を見出した（２０）。
【００６７】
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ（５×１０５細胞／穴）を、９６穴プレートに蒔き、スルホラファンおよび１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γまたは３ｎｇ／ｍｌのＬＰＳのいずれかとともに２４時間インキュベートした。ＮＯは、亜硝酸としてＧｒｉｅｓｓ反応により測定した（３３）。ＲＡＷ２６４．７細胞を様々な濃度のスルホラファンとともにγ−インターフェロンまたはリポ多糖と２４時間インキュベートすると、ＮＯ形成の用量依存的阻害が存在し、ＩＣ５０は両方のサイトカインについて０．３μＭであった（図５Ａ）。
【００６８】
この結果に一致して、ノーザンブロットおよびウエスタンブロット分析により、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡおよびタンパク質の合成も阻害されることが明らかとなった（図５Ｂ、Ｃ）。ＲＡＷ２６４．７マクロファージ（２×１０６細胞／穴）を、スルホラファンおよび１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γまたは３ｎｇ／ｍｌのＬＰＳのいずれかとともに一晩インキュベートした。ノーザンブロットのために、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で全ＲＮＡを単離し、既に記載されるようにブロッティング用に調製した（３３）。ｉＮＯＳおよびＧＡＰＤＨのためのプローブをランダムプライマーとともに［γ−３２Ｐ］ｄＣＴＰで放射性標識した。ウエスタンブロットのために、全細胞可溶化液をＳＤＳ／ＰＡＧＥに付し、膜に移し、ｉＮＯＳおよびβ−アクチン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でプローブした．
【００６９】
これらの知見は、スルホラファンへの曝露がγ−インターフェロンまたはリポ多糖のいずれかによるｉＮＯＳの誘導を抑制し、発癌の過程で役割を果たす炎症応答を減弱させることを示す。
【００７０】
（実施例６）
（スルホラファンの局所適用の紫外線に誘発される発癌への効果）
ＳＫＨ−１無毛マウスを比較的低用量のＵＶＢ照射（３０ｍＪ／ｃｍ２）に週に２回２０週間曝露した結果、その後さらなるＵＶ放射治療がない場合に皮膚腫瘍を発症する「ハイリスクマウス」となった（２４，２５）。この動物モデルは、子供の時に日光にひどく曝露されたが、成人の時には曝露が制限されたヒトに非常に関連性がある。加えて、それは照射スケジュールの完了後の、従って僅かに着色され得るスプラウト抽出物の保護製剤による「光フィルタ作用」の可能性を除く、可能性のある化学防護剤の評価を可能にする。従って、ＵＶＢで前処置したハイリスクマウスを、１日１回、週５日、１１週間、０．３μｍｏｌ（低用量）かまたは１μｍｏｌ（高用量）のスルホラファンを含有する１００μｌの標準ミロシナーゼ加水分解ブロッコリースプラウト抽出物で局所的に処置した。対照群にはビヒクル処置を行った。体重および直径１ｍｍよりも大きい腫瘍の形成を週に１回測定した。
【００７１】
ＵＶＢ照射は、ＵＶＢ（２８０〜３２０ｎｍ、総エネルギーの６５％）およびＵＶＡ（３２０〜３７５ｎｍ、総エネルギーの３５％）を放射するひとそろいのＵＶランプ（ＦＳ７２Ｔ１２−ＵＶＢ−ＨＯ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｗｉｎｓｂｕｒｇ，ＯＨ）により行った。ＵＶＢの放射線量をＵＶＢ Ｄａａｖｌｉｎ Ｆｌｅｘ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｄｏｓｉｍｅｔｅｒで定量し、さらにＩＬ−１４００ラジオメーター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ，Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ，ＭＡ）で較正した。
【００７２】
動物を２０週間火曜日と金曜日に３０ｍＪ／ｃｍ２／セッションの放射露光で照射した。１週間後、マウスを３つの群：各々の処置群に２９匹の動物、および対照群に３３匹の動物、に分けた。２つの処置群のマウスには、１μｍｏｌスルホラファン（高用量）かまたは０．３μｍｏｌのスルホラファン（低用量）を含有する１００μｌのブロッコリースプラウト抽出物の局所適用を行い、対照群のマウスには１００μｌのビヒクルを適用した。処置は週５日、１１週間反復し、その時点で対照群の全ての動物が少なくとも１つの腫瘍を有し、実験を終わらせた。腫瘍（直径１ｍｍより大きい病変と定義した）および体重を週に１回記録した。腫瘍容積は、直径１ｍｍより大きい各塊の高さ、長さおよび幅を測定することにより決定した。３回の測定値の平均を直径として用いて、容積を計算した（ｖ＝４πｒ３／３）。同日に全てのマウスを安楽死させ、腫瘍のサイズおよび多重度を測定した。背側の皮膚を、マウスの全処置部分を含むように長方形の鋳型（２．５×５ｃｍ）を用いて切開した。皮膚をボール紙にホチキスでとめ、写真撮影し、４℃の氷冷１０％リン酸緩衝ホルマリン中で２４時間固定した。
【００７３】
群間で平均体重および体重増加に差はなかった。実験開始時の体重（平均±ＳＤ）は、対照群について２２．３±１．９ｇ、低用量処置群について２２．２±１．９ｇ、および高用量処置群について２３．０±１．９ｇであった。実験終了時（３１週後）、それぞれの体重は、３２．１±９．７ｇ、３１．９±８．８ｇ、および３２．１±６．９ｇであった。１ｍｍより大きい初期病変は、保護具を用いる局所処置が開始して１週間後である照射の終了の２週間後に観察された。この時点で、対照、低用量処置、および高用量処置マウスの、それぞれ、３、６、および４匹のマウスがその最初の腫瘍を発現した。
【００７４】
高用量処置動物は、紫外線の発癌作用から実質的に保護された。従って、実験を終了した処置１１週後に、対照群の動物の１００％が腫瘍を発現したが、１μｍｏｌのスルホラファンを含有するスプラウト抽出物で毎日処置したマウスの４８％には腫瘍がなかった（図６Ａ）。注目すべきは、３匹の動物（対照の２匹と低用量処置群の１匹）は、直径２ｃｍに近い腫瘍を有していたので実験終了の１週間前に安楽死させたことである。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析と、それに続く層別ログランク検定、および生存関数が等しいことを求めるウィルコクソン検定の両方により、処置間で非常に有意な差異（Ｐ＜０．０００１）のあることが示された。１μｍｏｌ処置は、９５％信頼水準で、最後の３観察期間（９、１０、および１１週）の各々について、０．３μｍｏｌおよび対照処置の両方と異なっていた。０．３μｍｏｌと対照処置との間にはいずれの時点でも有意な差はなかった。
【００７５】
図６Ｂは、腫瘍数への処置の全体的な効果が極めて有意であったことを示す（ｐ＜０．００１）。１．０μｍｏｌ用量レベルの対照とのＡＮＯＶＡ比較により、極めて有意な全体的な効果（ｐ＜０．００１）が示されたが、差は９週間後にやっと有意となった（９、１０、および１１週目に行った観察に関して、それぞれｐ＜０．０７９４、ｐ＜０．０４６４およびｐ＜０．００８７）。平均値±ＳＥを示す。
【００７６】
腫瘍発生率および多重度の低下に加えて、腫瘍出現に有意な遅延があった。リスクのある対照動物の５０％が照射終了後６．５週に腫瘍を有していたのに対して、リスクのある高用量処置動物の５０％が腫瘍を発現するまで１０．５週かかった。注目すべきは、保護剤の発癌過程を遅延させる能力が、化学防御においてますます評価される概念になりつつあることである。同様に、腫瘍多重度は５８％低下した：マウスあたりの腫瘍の平均数は、処置群について２．４、対照群について５．７であった。
【００７７】
低用量処置とビヒクル処置群との間に腫瘍発生率および多重度の差はなかったが（図６Ａ、Ｂ）、マウス当たりの全体的な腫瘍量（ｍｍ３での容積として表される）は低用量処置群において処置９、１０、および１１週に、それぞれ８６％、６８％、および５６％実質的に小さかった（図７）。時間を伴う処置に関して一見したところ有効性が低下しているのは、大きな腫瘍（＞１ｃｍ３）が実験の最後の２週間で急速に増大したために生じると思われる。高用量処置群における全体的な腫瘍量は、処置９、１０、および１１週に、それぞれ９１％、８５％、および４６％さらに一層劇的に低下した。興味深いことに、この処置群のマウスの一部は、抽出物を適用していない頭部に腫瘍を有したが、保護抽出物を適用したその背部には腫瘍はなかった。
【００７８】
個々の腫瘍の組織学的特性決定は完了していないが、この動物モデルは一貫して、およそ８０％の小さな非悪性腫瘍（主に角化棘細胞腫および少数の乳頭腫）およびおよそ２０％の大きな悪性腫瘍（扁平上皮癌）を形成した（２４，２５）。本発明者らはすべての腫瘍をそれらの容積に従って２つのカテゴリー：「小型」（＜１ｃｍ３）（図８、白色棒）および「大型」（＞１ｃｍ３）（図８、黒色棒）に分類した。スプラウト抽出物による処置は実験群全体にわたって大型腫瘍の多重度を変化させず、対照群の全３３匹の動物の中では１７個、低用量処置群の全２９匹の動物の中では１９個、および高用量処置群の全２９匹の動物の中では１６個の大型腫瘍が存在した。対照的に、ブロッコリースプラウト抽出物は小型腫瘍の数に用量依存的阻害を生じた（対照、低用量処置、および高用量処置群中、それぞれ１７０個、１２３個、および５４個）。影響を受けなかった腫瘍は、直接ＵＶ照射誘導性ＤＮＡ光産物により引き起こされる突然変異蓄積細胞に由来するが、抽出物は主に酸化ストレス誘導性のＤＮＡ損傷の結果生じる発癌過程を阻害する可能性がある。大豆イソフラボン、ゲニステインはマウス皮膚において脂質過酸化産物、Ｈ２Ｏ２、および８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシンの生成を阻害したが、紫外線に応答して形成されるピリミジン二量体には影響を及ぼさなかったという同様の現象が報告されている（３６）。
【００７９】
（統計分析）
腫瘍発生率を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析と、それに続く層別ログランク検定、および生存関数が等しいことを求めるウィルコクソン検定の両方を用いて評価した。腫瘍多重度はＡＮＯＶＡにより評価し、比較は全ての処置に関して、および個々の対応のある処置に関して行った（ｔ検定）。腫瘍容積は、処置時間を入れ子式変数とするＡＮＯＶＡにより評価した。これらの計算はＳｔａｔａ７．０（Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ）を用いて実施した。その他の統計はＥｘｃｅｌを用いて計算した。
【００８０】
（実施例７）
（凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末の調製）
ブロッコリーの種子（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｉｔａｌｉｃａ，ｃｖ．ＤｅＣｉｃｃｏ）を用いて実施例１に記載されるように芽を成長させた。３日後に、芽を沸騰水に投じ、約３０分間沸騰させることにより成長を停止させた。この処理により内在性のスプラウトミロシナーゼを不活性化し、グルコシノレートを抽出した。スルホラファン前駆体であるグルコラファニンが、ＨＰＬＣ（２６）により測定して抽出物中の支配的なグルコシノレートであった。次に、この調製物を凍結乾燥して、約８．８重量％のグルコラファニンを含有するグルコシノレートに富む粉末を得た。この粉末をマウス飼料（粉末ＡＩＮ７６Ａ）と混合して、飼料３グラムあたり１０μｍｏｌ（低用量）または５０μｍｏｌ（高用量）のグルコラファニン等価物を得た。
【００８１】
（実施例８）
（スルホラファンの食餌投与の紫外線誘導性発癌への効果）
この試験では、ＵＶＢで前処理したハイリスクマウスに、実施例６に従って調製した凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末（無傷植物に見出されるスルホラファンのグルコシノレート前駆体であるグルコラファニン１０μｍｏｌ／日［低用量］および５０μｍｏｌ／日［高用量］に相当、マウスによる経口摂取でその約１０％がスルホラファンに変換される）を組み込んだ食餌を１３週間与えた。対照群の食餌は凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末を含有しなかった。体重および直径１ｍｍよりも大きい腫瘍の形成を週に１回測定した。
【００８２】
ＵＶＢ照射は、ＵＶＢ（２８０〜３２０ｎｍ、総エネルギーの６５％）およびＵＶＡ（３２０〜３７５ｎｍ、総エネルギーの３５％）を放射するひとそろいのＵＶランプ（ＦＳ７２Ｔ１２−ＵＶＢ−ＨＯ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｗｉｎｓｂｕｒｇ，ＯＨ）により行った。ＵＶＢの放射線量をＵＶＢ Ｄａａｖｌｉｎ Ｆｌｅｘ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｄｏｓｉｍｅｔｅｒで定量し、さらにＩＬ−１４００ラジオメーター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ，Ｎｅｗｂｕｒｙｐｏｒｔ，ＭＡ）で較正した。
【００８３】
動物を２０週間火曜日と金曜日に３０ｍＪ／ｃｍ２／セッションの放射露光で照射した。１週間後、マウスを３つの群：各々の処置群に３０匹の動物、および対照群に３０匹の動物、に分けた。２つの処置群のマウスには凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末を組み込んだ食餌を与えた。低用量処置群の食餌には、１０μｍｏｌ／日グルコラファニンに相当する凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末が含まれ、一方、高用量処置群の食餌には、５０μｍｏｌ／日グルコラファニンに相当する凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末が含まれた。対照群の食餌は凍結乾燥ブロッコリースプラウト抽出物粉末を含有しなかった。マウスにこの食餌を１３週間与えた。１３週後、対照マウスの９３％が腫瘍を有し、実験を終了した。
【００８４】
腫瘍容積は、直径１ｍｍより大きい各塊の高さ、長さおよび幅を測定することにより決定した。３回の測定値の平均を直径として用いて、容積を計算した（ｖ＝４πｒ３／３）。同日に全てのマウスを安楽死させ、腫瘍のサイズおよび多重度を測定した。背側の皮膚を、マウスの全処置部分を含むように長方形の鋳型（２．５×５ｃｍ）を用いて切開した。皮膚をボール紙にホチキスでとめ、写真撮影し、４℃の氷冷１０％リン酸緩衝ホルマリン中で２４時間固定した。
【００８５】
腫瘍発生率（腫瘍を有する動物のパーセント）は、低用量および高用量グルコラファニンを与えられている動物において、対照群のマウスと比較してそれぞれ２５％および３５％低下した。（図９）
【００８６】
さらに大きかったのが、腫瘍多重度（マウス当たりの腫瘍数）への処置の効果であって、低用量および高用量グルコラファニンを与えられている動物において、対照群のマウスと比較してそれぞれ４７％および７２％低下した。従って、対照群の動物がマウス当たり平均４．３個の腫瘍を有していたのに対し、マウス当たりの腫瘍数は低用量グルコラファニンについて２．３個、高用量グルコラファニンについて１．２個であった。（図１０）
【００８７】
腫瘍量も劇的に影響を受けた：低用量および高用量グルコラファニン処置の両方が、マウス当たりの全腫瘍容積の７０％阻害をもたらした。（図１１）
【００８８】
スルホラファンおよびその代謝産物の血漿レベルは非常に類似していた：低用量および高用量グルコラファニン処置について、それぞれ２．２μＭおよび２．５μＭであった。これは、グルコラファニンがスルホラファンに変換されること、および常習的な食餌治療の結果、動物の血液中のスルホラファンおよびその代謝産物が定常状態のレベルとなったことを示す。これらのレベルは生物学的効果を期待するのに十分である。
【００８９】
試験したほぼ全ての器官、すなわち、前胃、胃、膀胱、肝臓、および網膜において第２相酵素のレベルが誘導された（キノンレダクターゼ１について２〜２．５倍、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼについて１．２〜２．２倍）
【００９０】
（統計分析）
腫瘍発生率を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析と、それに続く層別ログランク検定、および生存関数が等しいことを求めるウィルコクソン検定の両方を用いて評価した。腫瘍多重度はＡＮＯＶＡにより評価し、比較は全ての処置に関して、および個々の対応のある処置に関して行った（ｔ検定）。腫瘍容積は、処置時間を入れ子式変数とするＡＮＯＶＡにより評価した。これらの計算はＳｔａｔａ７．０（Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＴＸ）を用いて実施した。その他の統計はＥｘｃｅｌを用いて計算した。
【００９１】
（実施例９）
（高用量紫外線誘導性発癌へのスルホラファンの局所適用の効果）
ＳＫＨ−１無毛マウスを単回高線量（７００〜１２００ｍＪ／ｃｍ２）の狭帯域３１１ｎｍ ＵＶＢ照射に曝露した。これらの高線量は、ヒトにおいて皮膚紅斑を判定するために用いるものに匹敵する。ＵＶランプを装備した痛風型キャビネットにおいてマウスに照射した。対照群にはビヒクル処置を行った。
【００９２】
照射によりマウスの表皮層は非常に厚くなり、２４時間以内に顕著な浮腫および炎症が示された（図１２Ａ左および中央）。これらの損傷作用は、ブロッコリースプラウト抽出物として供給される日用量１００ｎｍｏｌ／ｃｍ２のスルホラファンで３日間マウス皮膚を事前に処置することによって実質的に回避された（図１２Ａ右）。好中球のアズール顆粒に局在し、炎症強度の感受性マーカーである、皮膚ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性は、紫外線によって用量依存的に増加した（１，２００ｍＪ／ｃｍ２で＞２５倍）（図１２Ｂ）。合成スルホラファンでの前処置またはスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物での前処置は、スルホラファン処置マウスまたはブロッコリースプラウト抽出物処置マウスの皮膚ホモジネートにおいて、ＭＰＯタンパク質および酵素活性レベルの増加を抑制し、（図１２ＣおよびＤ）、原型の第２相酵素、ＮＱＯ１の比活性を増加させた（図１２Ｅ）。紫外線はこれらの誘導をわずかに抑制した（図１２Ｅ）。純粋なスルホラファンまたは同等量のスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物での局所処置は、ＮＱＯ１の誘導性増加および紫外線依存性のＭＰＯ活性の阻害に関して量的に同等な効果を示した。
【００９３】
この知見により、次の結論が強く支持される：（ｉ）ブロッコリースプラウト抽出物によりもたらされる、ＵＶ介在性の浮腫および炎症（ならびにおそらくＵＶ損傷のその他の状況）に対する第２相誘導物質活性および保護効果の両方は、完全にそのスルホラファン含量に起因する、そして（ｉｉ）スルホラファンの３１１ｎｍでの吸収は僅かであるが、ブロッコリースプラウト抽出物は水性植物抽出物であり、着色されているため、これらの効果は直接的な紫外線吸収から生じるものではない。
【００９４】
（ＵＶ紅斑の測定ならびに処置および放射線照射のための鋳型の設計）
これらの知見をマウスからヒトに置き換える際には、ヒト皮膚のＵＶ介在性損傷を評価するための高度に定量的であり再現性のある方法を開発することが必要であった。紅斑を非侵襲性バイオマーカーとして用いた。本発明者らは、皮膚の上に正確に位置づけることができ、標準３１１ｎｍ線量の紫外線および可能性のある保護具で処置したまさしく同じ区域（スポット）で赤色反射（ｒｅｄ ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）を反復測定することのできる、再利用可能な接着性のビニル鋳型を設計した。４対の直径２．０ｃｍの円窓のついた、２枚の１０×１７ｃｍの長方形の不透明ビニル鋳型を、連日正確にボランティアの背中の同じ傍脊柱部に正確に貼り付けた（図１３Ａ）。窓は取り外しの容易なビニルシェード（周囲は接着性であるが、窓を覆う部分は非接着性）で個別に塞ぐことができたので、段階的な紫外線量をスポットに送達することができた。狭帯域（３１１ｎｍを中心とする）を、統合ＵＶＢ線量計（ＢｒｙａｎＯＨ）を装備した、ＮＢ−ＵＶＢ／ＴＬ０１ランプを備えたＤａａｖｌｉｎ Ｆｕｌｌ Ｂｏｄｙ Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ Ｃａｂｉｎｅｔにおいて送達した。窓を用いて、全ての窓に同じ線量のＵＶを生成するか、または１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２の段階的な線量を選択した水平に隣接する窓の対に生成した。被験者は、皮膚フォトタイプ（ｐｈｏｔｏｔｙｐｅｓ）１（常にやけどし、決して日焼けしない）、２（常にやけど状態、時々日焼けする）または３（時々やけどし、常に日焼けする）であった。各スポットの紅斑を、標準条件下で、紅斑指数ａ＊を決定する比色計（モデルＣＲ−４００；Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ）を用いて、緑−赤軸に沿って色度について調節した、皮膚の赤色反射の強度の、キセノンアーク閃光の放出に対する、単位のない比率を定量した（Ｆａｒｒ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｙ，１９８４；Ｄｉｆｆｅｙ ａｎｄ Ｆａｒｒ，１９９１）。各測定セッションの前に比色計を白色および赤色タイルで較正した。皮膚タイプが１、２、または３で皮膚病変のない男性および女性ボランティア（２８〜５３歳）を登録した。ボランティアに、実験前の１週間および実験期間中に、マスタード、セイヨウワサビ、ワサビを含むアブラナ科の植物、および香味料を摂取することを控えるよう依頼した。ボランティアはさらに、毎日１３時に行われる実験に訪れる前に毎回コーヒーの摂取または運動を行わないように指示された。薬剤または栄養補助食品の摂取には制限はなかった。被験者は、測定を行う前に温度制御された部屋（２５℃±２℃）において２０分間腹臥で休息した。測定は、比色計の重量（約８０ｇ）下で皮膚を平衡化させた２０秒後に各スポットで開始した。各スポットで素早く連続して（約５秒間隔）１１の反復測定値を得た。最後の８つの値を用いて各スポットについての平均ａ＊値および変動係数（ＣＶ）を算出した。全ての測定値は単一の訓練を積んだオペレーターが読み取った。
【００９５】
測定手順の再現性を、連続５日間の（ＵＶ曝露前４日および２４時間後の）５名の被験者の１６スポット全ての平均ａ＊値を得ることにより検証した。これらの測定は以下の内容を証明した：（ｉ）ＵＶ照射の前の４日の間に同じ１６の一つ一つのスポットに行った最後の８回の反復比色計測定値のＣＶは３．７９であったが（ＳＥＭ＝０．１９％；ｎ＝３２０測定）、ＵＶ曝露２４時間後に同じ５名の被験者の１６のスポットの現在高いほうのａ＊値のＣＶは２．２６であった（ＳＥＭ＝０．２１％；ｎ＝８０）。従って、照射スポットの高いほうのａ＊値を反復測定することにより、より優れた精度で測定することができた（Ｐ＜０．０００１）；（ｉｉ）ＵＶ照射の前に４日間連続で測定した５名の個体の１６のスポットの初期平均ａ＊値は４．５２±１．８９であった（ｎ＝３２０）。しかし、個々のスポット間のａ＊値の変動性は相当に大きく、０．５９〜１０．１７に及んだ。スポット位置と測定日の両方が所定の個体に関する基礎的なａ＊値に有意に影響を及ぼしたとはいえ、スポット位置のみによるＣＶは１９．２％であり、一方一日ごとのＣＶは６．２％であった。従って、単一被験者の個々のスポット間でのａ＊値の差は、同じスポットでの経時的反復測定値間の変動よりもはるかに大きかった。この紅斑指数ａ＊測定値の分析により、任意の個体の各スポットは独立した観察単位と考える必要があるという結論が導かれた；（ｉｉｉ）紫外線に起因する紅斑の増加（Δａ＊）は、ＵＶ曝露前のａ＊の初期値（Ｐ＝０．００８）に反比例して変化した、これは明るい（ｌｉｇｈｔｅｒ）皮膚のほうが暗い（ｄａｒｋｅｒ）皮膚よりも紅斑に対する感受性が高いという見解に一致する；さらに（ｉｖ）紫外線誘導性の紅斑の変動（Δａ＊）は背部全体にわたって無秩序であった、これは垂直にまたは水平に隣接する対照スポットおよび処置スポットを選択することに統計的傾向がないことを示す。解剖学的考慮（例えば、デルマトームおよび脈管構造）に基づいて、水平に隣接するスポットを処置／対照対として選定した。
【００９６】
（紫外線量反応曲線）
ＵＶ介在性紅斑を評価するための定量的および再現性のあるシステムを確立したので、紫外線量と紅斑応答の関係を、タイプ２の皮膚の一人の５３歳男性で調査した。水平に対になった８つの窓を、１００ｍＪ／ｃｍ２の増分で１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２の紫外線量に曝露し、ＵＶ照射の直前および２４時間後にａ＊測定を行った。この紫外線量の範囲は、皮膚科医が最小紅斑量を決定するために広く用いられている。ａ＊値の増分はこの範囲において紫外線量とともに直線的に上昇し（図１３Ｂ）、各スポットの初期ａ＊値が全く異なっている場合でさえ二重反復領域間に合理的な一致があった。したがって、紅斑の増加は、ＵＶ照射の後のＵＶ照射の前に対するａ＊値の比よりもむしろ、各々の個別のスポットのａ＊値の算術的な増分として表された。
【００９７】
（ヒト皮膚におけるＮＱＯ１の誘導のためのスルホラファンスケジューリングの最適化）
ヒト皮膚をＵＶ誘導性の紅斑から保護する本研究のためにスルホラファンの投薬スケジュールを最適化するため、３名のボランティアの腰の１．０ｃｍの円領域を１００ｎｍｏｌのスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物の５μｌアリコートで処理した。抽出物は２４時間間隔で１日目に、３日目に、２日目と３日目に、または１日目、２日目、および３日目に適用し、４日目に生検を採取した。３日連続の処置により最大のＮＱＯ１誘導が得られ、ＮＱＯ１特異的活性の平均上昇は２．１９倍であった（範囲は１．７６〜３．２４）。したがって、以下の実験では、ブロッコリースプラウト抽出物による処置をＵＶ照射の前に３日連続で２４時間間隔で行った。
【００９８】
（ＵＶ紅斑に対する保護のスルホラファン用量への依存）
スルホラファンの保護用量を最適化するため、１名の被験者（５３歳男性）に一連の範囲の用量のスルホラファン含有ブロッコリースプラウト抽出物（１００、２００、４００、または６００ｎｍｏｌのスルホラファンを含有）を用いて３日連続で毎日処置を行い、５００ｍＪ／ｃｍ２のＵＶを２４時間後に照射した。放射線の前（４日の平均；４．７２±０．８７１）から放射線の２４時間後までの紅斑ａ＊値の増分により、スルホラファン処置により用量依存的保護がもたらされることが示された（図３ＡおよびＢ）。紅斑の増加は、直径２．０ｃｍのスポット１つ当たりスルホラファン１００、２００、４００、または６００ｎｍｏｌの一日量で、それぞれ２６．３％、４４４％、５７．６％、および５７．５％阻害された。この用量の関数としてのスルホラファンによる保護の程度は、ヒト皮膚において既に証明されたＮＱＯ１誘導の用量依存性に合理的に一致する（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【００９９】
（ボランティアにおける、スルホラファンによるＵＶ誘導性紅斑に対する保護）
スルホラファン含有ブロッコリースプラウト抽出物での処置による紫外線量依存性紅斑への保護効果を調べるため、ビニル鋳型の直径２．０ｃｍの円の内側に抽出物を局所的に適用した。処置したスポットには２５μｌの８０％アセトン／２０％水中ブロッコリースプラウト抽出物を適用し、水平に対になったスポットは溶媒のみで処置した。ａ＊値の測定は５日連続で行った：ＵＶ曝露前の３日、曝露日のＵＶ照射の直前、および曝露後２４時間。各々の被験者を８つの線量の紫外線（１００ｍＪ／ｃｍ２の増分で１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２）で調べ、各紫外線量レベルの処置および対照スポットについてａ＊値を得た。ＵＶ照射の前に４日連続で得た各スポットのａ＊測定値を平均し、平均値をａ＊（ＵＶ照射前）値として用いた。パイロット実験により、ＵＶ照射後のａ＊値（Δａ＊）の増分［すなわちａ＊（ＵＶ照射後）−ａ＊（ＵＶ照射前）］は、個別のスポットの皮膚紅斑の変化の最も適切な測定値であることが示された。個々の被験者の所定の線量のＵＶに対する応答はＵＶ照射前のａ＊値と同様に有意に変動したので（Ｐ＜０．０００１）、スルホラファンの保護効果は処置による紅斑の減少割合（％）として表され、従って被験者および皮膚領域特異的な正規化の方法が得られた。
【０１００】
典型的な結果（図１４ＣおよびＤ）により、スルホラファン処置が、照射前に３日連続で２００ｎｍｏｌのスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物で処置したスポットにおいて、６００、７００、および８００ｍＪ／ｃｍ２線量の紫外線で紅斑の発現をそれぞれ８４．３％、４１．６％、および８９．４％阻害することが証明された。次に、スルホラファンの保護効果を６名のボランティアで調査し、ボランティアらに照射前に３日連続で２００ｎｍｏｌ（４名の被験者）または４００ｎｍｏｌ（２名の被験者）のいずれかのスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物を与え、一連の範囲の８つの線量の紫外線（１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２）に曝露した。１００および２００ｍＪ／ｃｍ２での応答は、これらの低い紫外線量でのａ＊の増分は一貫してその基礎となる日変動よりも低かったため、分析から排除した（表１）。紫外線量は紅斑の減少率に僅しか効果がなく（Ｐ＝０．０５）、紫外線量に対する紅斑の減少割合の動向分析により有意な関連のないことが示された（Ｐ＝０．０９）。この知見は、保護の程度が、その大きさに関係なく紅斑応答の比較的一定な割合であることを示唆する。したがって、スルホラファンはおそらく多因子性の紅斑応答の比較的一定な割合を保護する。本調査の検出力を高めるため、６回のＵＶ照射の６名の被験者全てに関するデータをプールした。しかし、紅斑が全く観察されない値を含む、値のこの制限がたとえなくても（ｎ＝３５；１つの観察結果は無効であった）、極めて有意な治療効果があり（Ｐ＜０．０００１）、この知見は視覚的に容易に明らかであった。プールしたデータにより、６名の被験者に関して６つの紫外線量全てにわたって（３００〜８００ｍＪ／ｃｍ２）３７．７％という保護の平均レベルが明らかになった（ＳＥＭ＝５．７；ｎ＝３５）。この保護は極めて有意であった［Ｐ＜０．０００１；９５％信頼区間（ＣＩ）＝２５〜５０％］。さらに、個体ベースで（すなわち表１中の横列にわたって）調べた場合、所定の被験者の全ての紫外線量にわたる平均保護は３７．７％であり（ＳＥＭ＝１１．２；ｎ＝６）、これも有意であった（Ｐ＝０．０２５；ＣＩ＝１１．８〜６４％）。視覚検査で確認されるａ＊測定により、大部分の観察においてスルホラファン処置がＵＶ誘導性の紅斑を阻害しても（３５スポットのうち２７が８．７％以上の保護を示した）、その応答は個々の被験者においても、被験者間でも相当変動するという根拠が得られた。
【０１０１】
【表１】
【０１０２】
６名の被験者（３名の男性および３名の女性）を同一条件下で５日間にわたって調査した。接着性のビニル鋳型の対を同じ傍脊柱位置に２４時間間隔で４日連続で適用し、各セッションの１６個の円（直径２．０ｃｍ）窓の各々で比色計を用いて紅斑指数（ａ＊）値を測定した。４日間に得た各々一式の測定値の最後の８つの値の平均値を平均し、これらの平均値をＵＶ照射前の各スポットのａ＊値と考えた（ＵＶ照射前）。最後の測定の直後に、被験者を一連の範囲の線量のＵＶ（３１１ｎｍ）に、８対の隣接するスポットが１００〜８００ｍＪ／ｃｍ２を１００ｍＪ／ｃｍ２の増分で受けるように曝露した。ＵＶ照射の２４時間後、比色計によるａ＊測定を繰り返した（ＵＶ照射後）。３００〜８００ｍＪ／ｃｍ２−ＵＶＲについての結果のみを示す。最初の３日間、各対のスポットの一方を２５μｌの（８０％アセトン／２０％水中）２００〜４００ｎｍｏｌのスルホラファンを含有するブロッコリースプラウト抽出物で処置し、もう一方は２５μｌの溶媒のみを与えた。紫外線誘導性の紅斑ａ＊への処置の効果は、ブロッコリースプラウト抽出物処置スポットおよび溶媒処置スポットについてのａ＊値（Δａ＊）、すなわち（ａ＊ＵＶ照射後−ａ＊ＵＶ照射前）の変化から導かれ、変化率は次のように表された：［（処置スポットのΔａ＊／対照スポットのΔａ＊）×１００］。Ｐ値は両側スチューデントｔ検定を用いて計算したものであり、個々の被験者の平均減少率（すなわち投与した全ての紫外線量に及ぶ）と非保護（すなわち紅斑の減少が０％）との間の比較を表す。ｔ検定の目的において、非保護（０％減少）に関連する標準偏差は、各個体について計算したものと同じと考えた。結果的に、６名の被験者全員についての平均減少率の有意性を決定する際、非保護値（０％）に関連する標準偏差は、個々の被験者応答のそれに等しいと考えた。
【０１０３】
（保護は紫外線の吸収に依存しない）
３種類の実験により、スルホラファンの紫外線傷害に対する保護効果が入射紫外線の吸収に媒介されないという説得力のある証拠が得られた。（ｉ）日焼け止め剤（スポット当たり約１０ｍｇのＮｅｕｔｒｏｇｅｎａ Ｕｌｔｒａｓｈｅｅｒ，Ｓｕｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ５５）を３日間ブロッコリースプラウト抽出物およびＵＶ照射（５００ｍＪ／ｃｍ２）と同じスケジュールで適用した結果、最後の適用の２４時間後にごく僅かな保護が得られた（３．５％；２つの観察平均）。ボランティアに個人の衛生を保つように勧めたので、ＵＶ吸収効果が２４時間以上持続できることは全くありそうにないと思われる。（ｉｉ）スポット当たり４００ｎｍｏｌの加水分解されていないグルコラファニン（スルホラファンの不活性グルコシノレート前駆体）を送達するブロッコリースプラウト抽出物調製物の適用はごく僅かな保護をもたらした（４．７％；２つの観察平均）。これらの製剤は、スルホラファン前駆体がミロシナーゼにより加水分解されていないことを除いてスルホラファン含有ブロッコリースプラウト抽出物と同一であった。（ｉｉｉ）処置終了後４８または７２時間のＵＶ照射の遅延を除いて、以前のプロトコールに従うブロッコリースプラウト抽出物による１名の被験者の３日間の処置の結果、実質的な継続的保護：４８時間で３２．１％保護および７２時間で１０．３％がもたらされた。これらの対照実験も幅広い種類の酵素の転写活性化に依存する保護戦略の特有の性質を明らかにした。従って、スルホラファンは短い組織半減期を有し（１〜２時間）、それにもかかわらずその効果は長命のタンパク質の合成に依存するので、それは処置後２〜３日でさえ全く明白である。この長続きする特性は、日焼け止め剤、メラトニン、没食子酸エピガロカテキンおよびカロテンなどのその他の局所皮膚保護具について実証されていない（Ｂａｌｉｇａ ａｎｄ Ｋａｔｉｙａｒ，２００６；Ｂａｎｇｈａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。さらに、マウス皮膚での実験は、ブロッコリースプラウト抽出物の紫外線保護効果が同等量の純粋なスルホラファンの効果に相当することを強く示唆する。スルホラファンはＵＶを最大でほぼ２４０ｎｍ吸収し、３１１ｎｍでほぼ透過性であるので、この化合物は、一部の他の局所保護剤とは対照的に３１１ｎｍの紫外線により分解または吸収される可能性が低い。
【０１０４】
略語：ＣＯＸ−２、シクロオキシゲナーゼ２；ＧＳＨ、グルタチオン；γ−ＩＦＮ、インターフェロンγ；ｉＮＯＳ、誘導型一酸化窒素合成酵素；ＬＰＳ、リポ多糖；ＮＱＯ１、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−キノンアクセプターオキシドレダクターゼ（キノンレダクターゼとも表される）。
【０１０５】
［参考文献］
【表２Ａ】
【表２Ｂ】
【表２Ｃ】
【表２Ｄ】
【表２Ｅ】
【表２Ｆ】
【表２Ｇ】
【表２Ｈ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電離放射線治療を受けている患者の皮膚および粘膜を電離放射線の望ましくない副作用から保護する方法であって、前記患者の電離放射線が曝露される領域およびその周辺領域に、治療上有効な量のＮｒｆ２誘導物質を含む組成物を局所投与することを含む方法。
【請求項２】
前記望ましくない副作用が、急性紅斑、皮膚刺激、炎症、浮腫、落屑、皮膚の壊死、ひりひりする痛み、口内潰瘍、疼痛、線維症、毛細血管拡張症、口腔乾燥症、眼球乾燥症、膣粘膜の乾燥、黒色腫、乳癌、胃癌、肺癌および甲状腺疾患からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｎｒｆ２誘導物質が第２相酵素誘導物質である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２相酵素誘導物質がイソチオシアネートである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２相酵素誘導物質がスルホラファンまたはスルホラファン合成類似体である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記スルホラファン合成類似体が、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノン、エキソ−２−アセチル−６−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−イソチオシアナト−６−メチルスルホニルノルボルナン、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノール、１−イソチオシアナト−４−ジメチルホスホニルブタン、エキソ−２−（１’−ヒドロキシエチル）−５−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−アセチル−５−イソチオシアナトノルボルナン、１−イソチオシアナト−５−メチルスルホニルペンタン、シス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートおよびトランス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートからなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２相酵素誘導物質がグルコシノレートである請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、電離放射線治療の前、間または後に前記患者に投与される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記患者に局所投与される前記組成物中のＮｒｆ２誘導物質の量が、約１００ｎｍｏｌ／ｃｍ２〜約１μｍｏｌ／ｃｍ２である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｎｒｆ２誘導物質を含む組成物が、軟膏、クリーム、エマルション、ローション、ゲルおよび日焼け止め剤からなる群から選択される局所用製剤である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者が哺乳類である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類がヒトである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
皮膚への局所適用のための組成物であって、治療上有効な量のＮｒｆ２誘導物質と、ホホバ油および月見草油からなる群から選択される媒体とを含む組成物。
【請求項１４】
軟膏、クリーム、エマルション、ローション、ゲルまたは日焼け止め剤の形態である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｎｒｆ２誘導物質が第２相酵素誘導物質である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第２相酵素誘導物質がイソチオシアネートである請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第２相酵素誘導物質がスルホラファンまたはスルホラファン合成類似体である請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記スルホラファン合成類似体が、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノン、エキソ−２−アセチル−６−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−イソチオシアナト−６−メチルスルホニルノルボルナン、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノール、１−イソチオシアナト−４−ジメチルホスホニルブタン、エキソ−２−（１’−ヒドロキシエチル）−５−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−アセチル−５−イソチオシアナトノルボルナン、１−イソチオシアナト−５−メチルスルホニルペンタン、シス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートおよびトランス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートからなる群から選択される請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｎｒｆ２誘導物質がグルコシノレートである請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
前記Ｎｒｆ２誘導物質の量が約１００ｎｍｏｌ／ｃｍ２〜約１μｍｏｌ／ｃｍ２である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１】
電離放射線治療を受けている患者の皮膚および粘膜を電離放射線の望ましくない副作用から保護する方法であって、前記患者の電離放射線が曝露される領域およびその周辺領域に、治療上有効な量のＮｒｆ２誘導物質を含む組成物を局所投与することを含む方法。
【請求項２】
前記望ましくない副作用が、急性紅斑、皮膚刺激、炎症、浮腫、落屑、皮膚の壊死、ひりひりする痛み、口内潰瘍、疼痛、線維症、毛細血管拡張症、口腔乾燥症、眼球乾燥症、膣粘膜の乾燥、黒色腫、乳癌、胃癌、肺癌および甲状腺疾患からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｎｒｆ２誘導物質が第２相酵素誘導物質である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第２相酵素誘導物質がイソチオシアネートである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２相酵素誘導物質がスルホラファンまたはスルホラファン合成類似体である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記スルホラファン合成類似体が、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノン、エキソ−２−アセチル−６−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−イソチオシアナト−６−メチルスルホニルノルボルナン、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノール、１−イソチオシアナト−４−ジメチルホスホニルブタン、エキソ−２−（１’−ヒドロキシエチル）−５−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−アセチル−５−イソチオシアナトノルボルナン、１−イソチオシアナト−５−メチルスルホニルペンタン、シス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートおよびトランス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートからなる群から選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第２相酵素誘導物質がグルコシノレートである請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、電離放射線治療の前、間または後に前記患者に投与される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記患者に局所投与される前記組成物中のＮｒｆ２誘導物質の量が、約１００ｎｍｏｌ／ｃｍ２〜約１μｍｏｌ／ｃｍ２である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｎｒｆ２誘導物質を含む組成物が、軟膏、クリーム、エマルション、ローション、ゲルおよび日焼け止め剤からなる群から選択される局所用製剤である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者が哺乳類である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類がヒトである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
皮膚への局所適用のための組成物であって、治療上有効な量のＮｒｆ２誘導物質と、ホホバ油および月見草油からなる群から選択される媒体とを含む組成物。
【請求項１４】
軟膏、クリーム、エマルション、ローション、ゲルまたは日焼け止め剤の形態である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｎｒｆ２誘導物質が第２相酵素誘導物質である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第２相酵素誘導物質がイソチオシアネートである請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記第２相酵素誘導物質がスルホラファンまたはスルホラファン合成類似体である請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記スルホラファン合成類似体が、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノン、エキソ−２−アセチル−６−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−イソチオシアナト−６−メチルスルホニルノルボルナン、６−イソチオシアナト−２−ヘキサノール、１−イソチオシアナト−４−ジメチルホスホニルブタン、エキソ−２−（１’−ヒドロキシエチル）−５−イソチオシアナトノルボルナン、エキソ−２−アセチル−５−イソチオシアナトノルボルナン、１−イソチオシアナト−５−メチルスルホニルペンタン、シス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートおよびトランス−３−（メチルスルホニル）シクロヘキシルメチルイソチオシアネートからなる群から選択される請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｎｒｆ２誘導物質がグルコシノレートである請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
前記Ｎｒｆ２誘導物質の量が約１００ｎｍｏｌ／ｃｍ２〜約１μｍｏｌ／ｃｍ２である請求項１３に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１１−５００６８０（Ｐ２０１１−５００６８０Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２９９４３（Ｐ２０１０−５２９９４３）
【出願日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１７９２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５１７３９
【国際公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【出願人】（５０７３５７７３７）ジョンズ・ホプキンス・ユニヴァーシティ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１７９２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５１７３９
【国際公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【出願人】（５０７３５７７３７）ジョンズ・ホプキンス・ユニヴァーシティ (2)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]