新規なプラスミド及びその利用
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来の配列番号７３に記載の塩基配列を有するプラスミド及び配列番号７４に記載の塩基配列を有するプラスミド又はそのＤＮＡ断片等から、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌内で複製可能なＤＮＡ領域を調製し、大腸菌由来のプラスミド又はそのＤＮＡ断片から、大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域を調製し、シャトルベクターを作製する。シャトルベクターにアミノケトン不斉還元酵素遺伝子を挿入してベクターを構築し、当該ベクターを含む形質転換体を作製し、アミノケトン不斉還元酵素及び光学活性アミノアルコールを製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ロドコッカス）属に属する微生物（以下、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌という）由来の新規なプラスミド及びその利用に関する。より具体的には、プラスミド及びその一部であるＤＮＡ断片（以下、単にＤＮＡ断片ともいう）、並びにそれらを利用するシャトルベクター、ベクター、形質転換体、アミノケトン不斉還元酵素の製造方法及び光学活性アミノアルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌は、ニトリル類の代謝に関与する酵素を生産することやアミノケトンを不斉的に還元する酵素を産生することが知られている。特に、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓは、きわめて高いアミノケトン不斉還元活性を有することが知られている。このような微生物及び酵素は、α−アミノケトンに作用して、光学活性β−アミノアルコールを高収率かつ高選択的に生産する（例えば、特許文献１及び５）。したがって、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌において、有用な酵素等の大量生産を目的とする宿主−ベクター系の開発が以前から期待されてきた。しかしながら、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌を宿主とするに適したベクターの開発は遅れているのが現状である。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌においてプラスミドが見出された微生物は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｈ１３−Ａ株（非特許文献１）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ４２７６株（特許文献２）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ４００１株（特許文献３）及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＩＦＯ１２３２０株（特許文献４）など数株にしかすぎない。
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０１／７３１００号パンフレット
【特許文献２】特開平４−１４８６８５号公報
【特許文献３】特開平４−３３０２８７号公報
【特許文献４】特開平９−２８３７９号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ０２／０７０７１４号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，６３８，１９８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のようにＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌から工業的に利用できる菌株を育種、改良（変異株）するための新しいベクターの開発が望まれている。特に、組換えＤＮＡ微生物及びその産物である食品や添加物の安全性の面からセルフクローニング系によることが望ましいとされている。本発明は、このような宿主−ベクター系におけるベクターとして利用できる新規なプラスミドを提供することを目的とする。
【０００５】
アミノケトン不斉還元活性を有するＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓにおいて、工業的に利用できる組換え微生物の創出が望まれている。特に、このような組換え微生物の創出に利用できる新規なプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片を提供することを本発明の第一の目的とする。
【０００６】
前記プラスミドが得られれば、他の微生物でも複製可能なシャトルベクターを構築することも容易となる。本発明は、このようなシャトルベクター構築に必要となるＤＮＡ複製に関する塩基配列情報（複製領域等）を提供することを第二の目的とする。
【０００７】
本発明は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌のいずれにおいても複製可能なシャトルベクターを提供することを第三の目的とする。
【０００８】
さらに、本発明は前記シャトルベクターのアミノケトン不斉還元酵素への適用を第四の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌株よりベクター作製のためのプラスミドを鋭意スクリーニングした結果、宿主−ベクター系におけるベクターとして利用可能な幾つかの新規なプラスミドを見出した。
【００１０】
また、本発明者らは、前記プラスミドに、薬剤耐性遺伝子、大腸菌内で複製可能な遺伝子領域などを導入することによって、シャトルベクターを作製できることを見出した。このように、上記課題を達成する塩基配列情報、プラスミド及びシャトルベクターを得て、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明によれば、以下の（１）〜（３９）に記載のＤＮＡ断片、ＤＮＡ、プラスミド、シャトルベクター、ベクター、形質転換体、アミノケトン不斉還元酵素の製造方法及び光学活性アミノアルコールの製造方法が提供される。
（１）配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（２）配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（３）配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（４）配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（５）配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、且つ配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（６）配列番号７６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（７）配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（８）配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含み、且つ配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載のプラスミド又はＤＮＡ断片を有し、制限酵素切断部位数がＢａｍＨＩ：２、ＥｃｏＲＩ：２、ＫｐｎＩ：１、ＰｖｕＩＩ：１、ＳａｃＩ：１及びＳｍａＩ：１であり、大きさが約５．４ｋｂｐであることを特徴とする環状プラスミド。
（１０）配列番号７３に記載の塩基配列を有するプラスミド。
（１１）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来であることを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかに記載のプラスミド又はＤＮＡ断片。
（１２）配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（１３）配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（１４）配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（１５）配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（１６）配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、且つ配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（１７）配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含み、且つ配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（１８）配列番号６７及び配列番号４７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（１９）配列番号６７及び配列番号４７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有する接合タンパク質領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（２０）配列番号７５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（２１）配列番号７５に記載の塩基配列を有する接合に関する領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（２２）（１２）〜（２１）のいずれかに記載のプラスミド又はＤＮＡ断片を有し、制限酵素切断部位数がＢａｍＨＩ：２、ＰｖｕＩＩ：４、ＳａｃＩ：３及びＳｍａＩ：４であり、大きさが約５．８ｋｂｐであることを特徴とする環状プラスミド。
（２３）配列番号７４に記載の塩基配列を有するプラスミド。
（２４）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来であることを特徴とする（１２）〜（２３）のいずれかに記載のプラスミド又はＤＮＡ断片。
（２５）配列番号７７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（２６）配列番号７７に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするＤＮＡ断片。
（２７）（１）〜（２６）のいずれかに記載のプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片と大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域とを含み、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌内で複製可能なシャトルベクター。
（２８）（２７）に記載のシャトルベクターを用いて作製することを特徴とするベクター。
（２９）（６）、（７）、（２５）又は（２６）のいずれかに記載のプラスミド又はＤＮＡ断片を含むことを特徴とするベクター。
（３０）アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入されていることを特徴とする（２８）又は（２９）に記載のベクター。
（３１）アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が、配列番号７８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号７８のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（３０）に記載のベクター。
（３２）アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が、配列番号７９に記載の塩基配列からなる核酸、又は配列番号７９と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（３０）に記載のベクター。
（３３）（２８）又は（２９）に記載のベクターを含む形質転換体。
（３４）（３０）〜（３２）のいずれかに記載のベクターを含む形質転換体。
（３５）（３４）に記載の形質転換体を該形質転換体が増殖可能な培地中で培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた該形質転換体からアミノケトン不斉還元酵素を精製する精製工程と
を含むアミノケトン不斉還元酵素の製造方法。
（３６）一般式（１）：
【化１】
（式中、Ｘは同一又は異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基及びスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；ｎは０〜３の整数を示し；Ｒ１は低級アルキル基を示し；Ｒ２，Ｒ３は同一又は異なっていてもよく、水素原子及び低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物に（３５）記載の製造方法で得られるアミノケトン不斉還元酵素を作用させて一般式（２）：
【化２】
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記定義と同一）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめる光学活性アミノアルコールの製造方法。
（３７）一般式（１）：
【化３】
（式中、Ｘは同一又は異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基及びスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；ｎは０〜３の整数を示し；Ｒ１は低級アルキル基を示し；Ｒ２，Ｒ３は同一又は異なっていてもよく、水素原子及び低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物に（３４）記載の形質転換体を作用させて一般式（２）：
【化４】
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記定義と同一）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめる光学活性アミノアルコールの製造方法。
（３８）（３７）に記載の光学活性アミノアルコールの製造方法において、
一般式（３）：
【化５】
（式中、Ａは構造式（Ｙ）又は（Ｚ）を表し、
【化６】
（ここで、Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環又はＲ８と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表す。）、
【化７】
（ここで、Ｒ５は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、若しくはＲ６又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ６は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環、Ｒ５又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ７は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）；
Ｒ８は水素原子、カルボキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ４と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格、Ｒ６と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環を表し；Ｒ９は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアシル基、Ｒ５又はＲ６と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ１０は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
で表される化合物、又はその製薬学的に許容される塩あるいは溶媒和物をさらに添加して光学活性アミノアルコールを生成させる光学活性アミノアルコールの製造方法。
（３９）配列番号８９〜配列番号１００に記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有する（２７）に記載のシャトルベクター。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のプラスミドは、従来知られていない新規なプラスミドであり、工業的に有用なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する宿主−ベクター系におけるベクターとして価値がある。特に、アミノケトンの不斉還元を工業的に行なえる組換え微生物の創出に有用である。このような微生物が貢献するアミノケトンの不斉還元としては、１−２−メチルアミノ−１−フェニル−１−プロパノンからｄ−（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドエフェドリンを製造する反応が挙げられる。
【００１３】
また、本発明のプラスミドは、単一のロドコッカス細胞に共存することから、複製機能を利用した単独での使用の他に、それぞれ和合性プラスミドとしても利用できる。すなわち、別のタンパク質（酵素等）遺伝子をそれぞれのプラスミドに挿入することにより、別のタンパク質を同時に同一細胞内で発現できるようになる。
【００１４】
さらに、本発明のシャトルベクターは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌）において、工業的に利用し得る組換え微生物の創出に有用である。
【００１５】
本発明のプラスミドから得られるＤＮＡ複製に関する塩基配列情報は、それに基づいて前記シャトルベクターの構築を可能とし、具体的にはベクターの構成要素であるＤＮＡ断片等を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、プラスミドｐＲＥＴ１１００の制限酵素切断地図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＲＥＴ１０００の制限酵素切断地図である。
【図３】図３は、シャトルベクターｐＲＥＴ１１０１の構築の概要を示す図である。
【図４】図４は、シャトルベクターｐＲＥＴ１１０２の構築の概要を示す図である。
【図５】図５は、シャトルベクターｐＲＥＴ１１０３の構築の概要を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を好適な実施の形態に従って説明する。
【００１８】
本発明の第１のプラスミドは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌から単離されるプラスミド又はその誘導体である。具体的には、例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＩＡＭ１４００，ＩＡＭ１５０３，ＪＣＭ２８９３及びＪＣＭ２８９４株等の菌株から単離することができ、その大きさが約５．４ｋｂｐであり、且つ表１に示す制限酵素に対する分解特性を有する環状プラスミドである。以下、それぞれの菌株から単離されるプラスミドをｐＲＥＴ１１００、ｐＲＥＴ１３００、ｐＲＥＴ１５００及びｐＲＥＴ１７００と称する。なお、供試菌株から本発明のプラスミドを調製するには、公知の方法（例えば、ボイル法、アルカリ溶解法、塩化セシウム密度勾配超遠心法：ラボマニュアル遺伝子工学、第３版、第１０章、５５−５９頁、丸善株式会社）を採用することができる。
【００１９】
【表１】
【００２０】
プラスミドｐＲＥＴ１１００の制限酵素地図を図１に示す。このプラスミドについて、公知の方法（例えば、蛍光式自動シークエンサー）によりシークエンスしたところ、その全塩基配列は、配列表の配列番号７３に示す５４４４ｂｐであることが分かった。
【００２１】
また、本発明の第２のプラスミドも、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌から単離されるプラスミド又はその誘導体である。具体的には、例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｎｉｉ ＪＣＭ３２０３株から単離することができ、その大きさが約５．８ｋｂｐであり、且つ表２に示す制限酵素に対する分解特性を有する環状プラスミドである。以下このプラスミドをｐＲＥＴ１０００と称する。
【００２２】
【表２】
【００２３】
プラスミドｐＲＥＴ１０００の制限酵素地図を図２に示す。このプラスミドについても、公知の方法によりシークエンスしたところ、配列表の配列番号７４に示す５８１３ｂｐの塩基配列を有することが分かった。
【００２４】
以上のように本発明のプラスミド類（天然型もしくは野生型）は、表１又は表２に示す制限酵素切断パターンによっても特定され得る環状プラスミドである。したがって、本発明は次の２種類の環状プラスミドを包含する。
（１）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来の環状プラスミドであって、その大きさが約５．４ｋｂｐであり、制限酵素切断部位数がＢａｍＨＩ：２、ＥｃｏＲＩ：２、ＫｐｎＩ：１、ＰｖｕＩＩ：１、ＳａｃＩ：１及びＳｍａＩ：１であることを特徴とする環状プラスミド。
（２）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来の環状プラスミドであって、その大きさが約５．８ｋｂｐであり、制限酵素切断部位数がＢａｍＨＩ：２、ＰｖｕＩＩ：４、ＳａｃＩ：３及びＳｍａＩ：４であることを特徴とする環状プラスミド。
【００２５】
プラスミドｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１０００の塩基配列（すなわち、配列番号７３及び配列番号７４）を解析した結果、ＤＮＡ複製やその他の機能を有するタンパク質をコードしている一群の塩基配列（オープンリーディングフレーム、以下ｏｒｆという）が存在することが推測される。
【００２６】
当該技術分野において、「ＤＮＡ複製」とは、ＤＮＡ自身が鋳型となって、すでにある２本鎖ＤＮＡ（親ＤＮＡ）と全く同じ２個の２本鎖ＤＮＡが形成されることを指す。その複製機構は、複製開始点（複製起点）からの開始、ＤＮＡ鎖の伸長、終結の３段階からなる。複製の際にはＤＮＡ２本鎖の一部がほどけ、それぞれの１本鎖に相補的な新しいＤＮＡ鎖が合成される。２本鎖をほどくのは、ＤＮＡへリカーゼとらせん不安定化蛋白（一本鎖ＤＮＡ結合蛋白ともいう）であり、ほどかれた部分は複製フォークと呼ばれる。複製フォークに向かって３’→５’方向の鋳型ＤＮＡをリーディング鎖、その逆で５’→３’方向をラギング鎖と呼ぶ。ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’に向かってＤＮＡ鎖を伸ばしてゆく。そのためリーディング鎖を鋳型にする場合、複製フォークの方向にＤＮＡが合成される。しかし、反対側のラギング鎖を鋳型にすると、複製フォークと逆方向にＤＮＡ鎖を伸ばさねばならない。そのためラギング鎖の複製は、岡崎フラグメントと呼ぶ２００塩基程度の断片ごとに行われる。約２００塩基ごとにＲＮＡプライマーがＤＮＡを鋳型にして、１０塩基のＲＮＡを５’→３’の方向に合成する。そのＲＮＡをプライマーにして、ラギング鎖を鋳型にＤＮＡポリメラーゼが５’→３’方向にＤＮＡ鎖を合成する。複製された２００塩基程度のＤＮＡ断片は、その後ＲＮＡが除去され１本鎖のＤＮＡに結合される。このような複製機構の中で、ＤＮＡへリカーゼ、らせん不安定化蛋白などの種々のタンパク質が協同して複製装置を形成している。関与している他のタンパク質として、ＤＮＡトポイソメラーゼ（ＤＮＡ複製の際のよじれを防ぐ）、複製開始蛋白や複製終了蛋白などが挙げられる。ＤＮＡ複製機構については、例えば、「細胞の分子生物学、第３版、中村桂子ら訳、２５１−２６２頁、教育社、１９９６年」に詳しく解説されている。
【００２７】
そこで、さらにプラスミドｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１０００の塩基配列を解析した結果、前記ＤＮＡ複製に関与するｏｒｆの近辺に、ＡＴリッチな相同性又は相似性のある繰返しを持った配列やＤＮＡの二次構造をもつと思われる配列、すなわちＤＮＡ複製領域（ＤＮＡの複製に関与するタンパク質が認識する塩基配列領域、又はＤＮＡの複製開始点が存在する領域）と推測される塩基配列が見出された。
【００２８】
以上、ＤＮＡ複製には、ＤＮＡ複製領域及びＤＮＡ複製に関与するタンパク質（以下、ＤＮＡ複製関連タンパク質という）をコードする領域が必須である。本発明に従えば、ｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１０００の両プラスミドについて、これらの領域の塩基配列に関する情報が取得できる。
【００２９】
まず、プラスミドｐＲＥＴ１１００において、ＤＮＡ複製領域としては、配列番号３５〜３７に記載の塩基配列が同定される。また、ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域としては、配列番号１〜３に記載の塩基配列（ｏｒｆ１）、配列番号４に記載の塩基配列（ｏｒｆ２）、配列番号５〜１６に記載の塩基配列（ｏｒｆ３）、配列番号１７〜２１に記載の塩基配列（ｏｒｆ４）、配列番号２２〜２６に記載の塩基配列（ｏｒｆ５）、配列番号２７又は２８に記載の塩基配列（ｏｒｆ６）、塩基配列２９又は３０に記載の塩基配列（ｏｒｆ７）、配列番号３１又は３２に記載の塩基配列（ｏｒｆ８）、配列番号３３又は３４に記載の塩基配列（ｏｒｆ９）が同定される。
【００３０】
ｐＲＥＴ１１００からＤＮＡ複製可能なプラスミドを作製するためには、この組換えプラスミドは、前記ＤＮＡ複製領域を少なくとも１つと前記ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域（ｏｒｆ）を少なくとも１つ備える必要がある。したがって、本発明のプラスミド（組換え型）は、このようなＤＮＡ複製領域を少なくとも１つとＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を少なくとも１つ含むことを特徴とする。ここで、ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域は、配列番号１、４、１４、１７及び２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有することが好ましい。
【００３１】
配列番号７６に記載の塩基配列の領域は複製に関係するタンパク質の発現に関与するプロモーターであることが示唆されており、本発明のプラスミドは、配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含んでいることが好ましい。
【００３２】
プラスミド作製に際しては、前述の塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ断片を適宜選択して、構築することができる。また、本発明は、該プラスミドの誘導体もしくは機能的な（ＤＮＡ複製）断片をも包含する。
【００３３】
次に、プラスミドｐＲＥＴ１０００において、ＤＮＡ複製領域としては、配列番号７０〜７２に記載の塩基配列が同定される。また、ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域としては、配列番号３８〜４１に記載の塩基配列（ｏｒｆ１０）、配列番号４２又は４３に記載の塩基配列（ｏｒｆ１１）、配列番号４４に記載の塩基配列（ｏｒｆ１２）、配列番号４５又は４６に記載の塩基配列（ｏｒｆ１３）、配列番号４８〜５０に記載の塩基配列（ｏｒｆ１４）、配列番号５１又は５２に記載の塩基配列（ｏｒｆ１５）、配列番号５３又は５４に記載の塩基配列（ｏｒｆ１６）、配列番号５５に記載の塩基配列（ｏｒｆ１７）、配列番号５６〜６０に記載の塩基配列（ｏｒｆ１８）、配列番号６１に記載の塩基配列（ｏｒｆ１９）、配列番号６２に記載の塩基配列（ｏｒｆ２０）、配列番号６３〜６９に記載の塩基配列（ｏｒｆ２１）が同定される。
【００３４】
ｐＲＥＴ１０００からＤＮＡ複製可能なプラスミドを作製するためには、この組換えプラスミドは、前記ＤＮＡ複製領域を少なくとも１つと前記ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域（ｏｒｆ）を少なくとも１つ備える必要がある。したがって、本発明のプラスミド（組換え型）は、このようなＤＮＡ複製領域を少なくとも１つとＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を少なくとも１つ含むことを特徴とする。ここで、ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域は、配列番号４０、４２、４４、４５、５３、５５、５６、６１、６２及び６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有することが好ましい。
【００３５】
配列番号６７及び４７に記載の塩基配列の領域は接合タンパク質（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）と相同性があり、接合に関与することが示唆されている。また、配列番号７５に記載の塩基配列の領域は接合タンパク質遺伝子の発現に関与することや発現タンパク質の認識部位であることが示唆されている。したがって、本発明のプラスミドは、配列番号６７及び４７に記載の塩基配列を有する接合タンパク質領域を含んでいることや配列番号７５に記載の塩基配列を有する接合に関する領域を含んでいることが好ましい。
【００３６】
プラスミド作製に際しては、前述の塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ断片を適宜選択して、構築することができる。また、本発明は、該プラスミドの誘導体もしくは機能的な（ＤＮＡ複製）断片をも包含する。
【００３７】
本発明のプラスミド又はＤＮＡ断片は、ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部において、それぞれの領域の機能が損なわれない限り、１若しくは複数個のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を含む塩基配列を有していてもよい。
【００３８】
また、本発明のシャトルベクターは、本発明のＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域のいずれかに記載のプラスミド又はＤＮＡ断片と大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域を含み、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌内で複製可能なものであればよく、例えば、配列番号８９〜配列番号１００の塩基配列を有するものが挙げられる。本発明のシャトルベクターは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌内で複製可能なものであれば、該塩基配列に、１若しくは複数個のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を含む塩基配列を有していてもよい。
【００３９】
前記「複数個」とは、領域の種類によっても異なるが、具体的には、２〜１１００個、好ましくは、２〜８００個、より好ましくは２〜３００個である。更に好ましくは、２〜１００個、更により好ましくは、２〜２０個、最も好ましくは２〜１０個である。
【００４０】
また、上記のような、ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部と実質的に同一の塩基配列を有するプラスミド又はＤＮＡ断片として具体的には、ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列が挙げられる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄の条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域の一部が３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗浄の条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００４１】
上記のような、ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部と実質的に同一の塩基配列を有するプラスミド又はＤＮＡ断片は、例えば、部位特異的変異法によって、特定の部位のヌクレオチドにおいて置換、欠失、又は挿入を含むように、ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部を改変することによって取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部を含むＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および同ＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００４２】
また、上記のようなヌクレオチドの置換、欠失又は挿入には、ロドコッカス属菌の菌株による違いなどの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【００４３】
本発明のシャトルベクターは、上記のプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片（Ａ）及び大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域（Ｂ）を含む。また、このシャトルベクターは、場合により薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域を含んでもよく、これは好ましい。当該技術分野において、一般的に「シャトルベクター」とは、二種の細胞のＤＮＡ複製機構を含み、望ましくはさらに選択マーカーとしての薬剤耐性遺伝子等を含む、その二種の細胞中で自律複製することができるベクターをいう。プラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片（Ａ）は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌中で複製可能なＤＮＡ領域である。大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域（Ｂ）は、大腸菌内で複製増殖可能なプラスミドであれば、プラスミド全体であってもよく、又はその一部であってもよい。前記大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域としては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９８等のプラスミドを用いることが可能である。
【００４４】
本発明のシャトルベクターが薬剤耐性遺伝子を含む場合、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが好適に用いられるが、宿主となるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌内で発現し、宿主細胞に薬剤耐性を与えることができ、両菌属間で、薬剤耐性能によりプラスミドの存在が確認できるものであれば、薬剤の種類に限定はない。また、そのような薬剤耐性遺伝子を複数個、使用してもよい。
【００４５】
シャトルベクターには、複数のクローニングサイト（マルチクローニングサイト）が含まれることが望ましく、このクローニングサイトと前記薬剤耐性遺伝子は、例えば、大腸菌プラスミドから誘導されうる。すなわち、上記で列挙した公知の大腸菌プラスミドを適当な制限酵素によって、切断して、クローニングサイトと薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域を作製し、他方のＤＮＡ断片（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌中で複製可能なＤＮＡ領域）とライゲーションする。
【００４６】
実例として、シャトルベクターの構築の概略を図３〜５に示す。シャトルベクターは、上記プラスミド及び大腸菌由来のプラスミドを適切な制限酵素で処理した後、両者をライゲーションすることにより構築することが可能である。このようにして、本発明者らは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌のプラスミドｐＲＥＴ１０００、ｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１２００と大腸菌のプラスミドｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９及びｐＨＳＧ３９８とを使用して１８種類のシャトルベクター（表５）を作製した。
【００４７】
本発明のシャトルベクターは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌又は大腸菌を宿主とすることができ、それらのいずれでも複製可能であり、工業的に利用できる。本発明のシャトルベクターによって形質転換されたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌又は大腸菌、さらにその他の微生物の形質転換体は、このように有用であり、これら形質転換体も本発明に包含される。
【００４８】
本発明のベクターは、本発明のシャトルベクターを用いて作製することを特徴とする。すなわち、本発明のシャトルベクターに導入したい標的ＤＮＡが挿入されているベクターである。導入したいＤＮＡ及び本発明のシャトルベクターを適切な制限酵素で処理した後、両者をライゲーションすることで、かかるベクターを作製することが可能である。このベクターを利用することで、所望のＤＮＡを導入した形質転換体を得ることができる。
【００４９】
挿入するＤＮＡとしては、例えば、アミノケトン不斉還元酵素遺伝子や補酵素再生系酵素遺伝子が挙げられる。アミノケトン不斉還元酵素遺伝子は、ＷＯ０２／０７０７１４に記載されているアミノケトン不斉還元酵素をコードする遺伝子であり、より具体的には、配列番号７８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株由来のアミノケトン不斉還元酵素）をコードするＤＮＡであり、特に、配列番号７９に記載の塩基配列からなるＤＮＡである。ＷＯ０２／０７０７１４に記載されている内容も全て本明細書に含まれる。
【００５０】
アミノケトン不斉還元酵素は、ＷＯ０２／０７０７１４に記載されている性質を有しておればよく、配列表の配列番号７８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、前記アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、アミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質も含まれる。ここで、アミノケトン不斉還元活性とは、前記一般式（１）で表されるα−アミノケトンを基質として前記一般式（２）で表される光学活性なアミノアルコールを生成する活性をいう。
【００５１】
このような欠失、挿入、置換、付加を施す方法としては特に制限はなく、公知の方法が使用できる。例えば、日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、ｐ１０５（広瀬進）、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ編，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５４，ｐ．３５０＆ｐ．３６７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ編，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００，ｐ．４５７＆ｐ．４６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｊ．Ａ．Ｗｅｌｌｓら，“Ｇｅｎｅ”，Ｖｏｌ．３４，ｐ．３１５（１９８５）；Ｔ．Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍら，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ”，Ｖｏｌ．１３，ｐ．３３０５（１９８５）；Ｊ．Ｔａｙｌｏｒら，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．”，Ｖｏｌ．１３，ｐ．８７６５（１９８５）；Ｒ．Ｗｕ編，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５５，ｐ．５６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ａ．Ｒ．Ｏｌｉｐｈａｎｔら，“Ｇｅｎｅ”，Ｖｏｌ．４４，ｐ．１７７（１９８６）に記載の方法が挙げられる。具体的には、例えば、合成オリゴヌクレオチド等を利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、Ｋｕｎｋｅｌ法、ｄＮＴＰ［αＳ］法（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）法、亜硫酸や亜硝酸等を用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
【００５２】
また、多くのタンパク質には糖鎖が付加されている場合があり、アミノ酸を１若しくは複数置換することにより糖鎖の付加を調節することができる。従って、配列表の配列番号７８に記載のアミノ酸配列において、前記糖鎖の調節されたタンパク質も上述のアミノケトン不斉還元活性を有する限りは、本発明のアミノケトン不斉還元酵素に包含される。
【００５３】
さらに本発明のアミノケトン不斉還元酵素は、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例えば、ペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ等の酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体に改変することができる。
【００５４】
また、遺伝子組換え法で製造する時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるいは生体外で天然のアミノケトン不斉還元酵素と実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。この場合、遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、こうした融合タンパク質はその融合部を利用してアフィニティークロマトグラフィー等で精製することも可能である。タンパク質の構造の修飾・改変等は、例えば日本生化学会編、「新生化学実験講座１、タンパク質ＶＩＩ、タンパク質工学」、東京化学同人（１９９３）を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができる。
【００５５】
さらに、本発明のアミノケトン不斉還元酵素は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであってもよい。本発明は、天然のアミノケトン不斉還元酵素に特有なアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個等）欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個等）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個等）のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体も包含する。天然のアミノケトン不斉還元酵素の特徴であるドメイン構造を有しているものも包含されてよい。また、同質のアミノケトン不斉還元酵素活性を有するものも挙げられる。
【００５６】
天然のアミノケトン不斉還元酵素の特徴であるドメイン構造が維持されていれば、上記のごとき変異体は、全て本発明のアミノケトン不斉還元酵素に包含される。また本発明の天然のアミノケトン不斉還元酵素と実質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さらに天然のアミノケトン不斉還元酵素と実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。こうした本発明のアミノケトン不斉還元酵素は、下記で説明するように分離・精製処理されることができる。一方では、こうして本発明は上記したポリペプチドをコードするＤＮＡ断片、そして天然の特性の全部あるいは一部を有するアミノケトン不斉還元酵素のポリペプチド、さらにその類縁体あるいは誘導体をコードするＤＮＡ断片も包含する。該アミノケトン不斉還元酵素のヌクレオチドは、修飾（例えば、付加、除去、置換等）されることもでき、そうした修飾されたものも包含されてよい。
【００５７】
本発明のアミノケトン不斉還元酵素遺伝子は、上記のアミノケトン不斉還元酵素をコードする核酸である。代表的には、配列表の配列番号７８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、特に配列番号７９に記載の塩基配列を有する核酸が挙げられるが、一つのアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）は複数存在するため配列番号７８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸は多数存在する。従って、このような核酸も本発明のアミノケトン不斉還元酵素遺伝子に包含される。ここで、「タンパク質をコードする」とは、ＤＮＡが２本鎖である場合には、相補２本鎖のいずれか一方がタンパク質をコードする塩基配列を有するものを含むことを意味するため、本発明の核酸には配列番号７８に記載のアミノ酸配列を直接コードする塩基配列からなる核酸若しくはその相補的な塩基配列からなる核酸も包含される。さらに、本発明にかかるアミノケトン不斉還元酵素遺伝子は、配列番号７９と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、前記定義と同一である。
【００５８】
補酵素再生系酵素遺伝子は、各種脱水素酵素、すなわちグルコース脱水素酵素、グルコース６リン酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、有機酸脱水素酵素及びアミノ酸脱水素酵素などが挙げられる。より具体的には、アセトアルデヒド脱水素酵素、エタノール脱水素酵素、プロパノール脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、酢酸脱水素酵素、酪酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素及びグルタミン酸脱水素酵素などが適宜利用される。
【００５９】
本発明の形質転換体は、上記ベクターを含むことを特徴とする。形質転換体は、宿主細胞に上記ベクターを導入することにより得られる。ベクターの導入方法は公知の方法、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などで行うことが可能である。
【００６０】
例えば、アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入されたベクターを含む本発明の形質転換体は、アミノケトン不斉還元活性を有しており、下記のアミノケトン不斉還元酵素の製造方法や光学活性アミノアルコールの製造方法に応用することが可能である。
【００６１】
本発明のアミノケトン不斉還元酵素の製造方法は、アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入されたベクターを含む形質転換体を該形質転換体が増殖可能な培地で培養する培養工程と、前記培養工程で得られた該形質転換体からアミノケトン不斉還元酵素を精製する精製工程と、を含むことを特徴とする。
【００６２】
前記培養の方法としては、使用する菌体が生育可能な条件であれば特に制限はなく公知の方法が使用でき、通常、炭素源、窒素源、その他養分を含む液体培地が使用される。培地の炭素源としては、上記菌体が利用可能であればいずれでも使用できる。具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン、デンプン、ソルビトール等の糖類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類およびその塩類、パラフィン等の炭化水素類、あるいはこれらの混合物等が使用できる。窒素源としては上記菌体が利用可能であればいずれでも使用できる。具体的には、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩；フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩；肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン等の無機または有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物等が使用できる。また、培地には、無機塩、微量金属塩、ビタミン類等の通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。また、必要に応じて、培地には、菌体の増殖を促進する物質、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質等を添加してもよい。
【００６３】
菌体の培養は、生育に適した条件下で行うことができる。具体的には培地のｐＨ３〜１０、好ましくは４〜９、温度０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で行うことができる。菌体の培養は、好気的または嫌気的条件下で行うことができる。培養時間は１０〜１５０時間が好ましいが、それぞれの菌体により適宜決められるべきである。
【００６４】
このようにして培養された菌体の培養液をろ過または遠心分離して、その菌体を水又は緩衝液でよく洗浄する。洗浄した菌体は適量の緩衝液に懸濁し、菌体を破砕する。破砕の方法としては特に制限はないが、例えば、乳鉢、ダイノミル、フレンチプレス、超音波破砕機等の機械的破砕法が挙げられる。得られた菌体の破砕液中より、固形物をろ過または遠心分離によって除去して得られた無細胞抽出液中のアミノケトン不斉還元酵素は酵素単離の常法によって採取される。
【００６５】
このような酵素単離の方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法等の塩析；セファデックス等によるゲルろ過法；ジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基等を持つ担体等を用いたイオン交換クロマトグラフィー法；ブチル基、オクチル基、フェニル基等疎水性基を持つ担体等を用いた疎水性クロマトグラフィー法；色素ゲルクロマトグラフィー法；電気泳動法；透析；限外ろ過法；アフィニティークロマトグラフィー法；高速液体クロマトグラフィー法等により精製することができる。
【００６６】
さらに、前記酵素を固定化酵素として用いることもできる。このような方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、酵素又は酵素産生細胞を固定化したものが挙げられ、共有結合法や吸着法といった担体結合法、架橋法、包括法等により固定化できる。また、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート等の縮合剤を必要に応じて使用してもよい。また、他の固定化法としては、例えば、モノマーを重合反応でゲル化させて行うモノマー法；通常のモノマーよりも大きな分子を重合させるプレポリマー法；ポリマーをゲル化させて行うポリマー法；ポリアクリルアミドを用いた固定化；アルギン酸、コラーゲン、ゼラチン、寒天、κ−カラギーナン等の天然高分子を用いた固定化；光硬化性樹脂、ウレタンポリマー等の合成高分子を用いた固定化が挙げられる。
【００６７】
このようにして精製された酵素は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等）によって単一バンドが確認されれば精製が十分に行われたものと判断される。
【００６８】
本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法は、一般式（１）：
【化８】
（式中、
Ｘは同一又は異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基及びスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；
ｎは０〜３の整数を示し；
Ｒ１は低級アルキル基を示し；
Ｒ２，Ｒ３は同一又は異なっていてもよく、水素原子及び低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；
＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物に本発明の製造方法で得られるアミノケトン不斉還元酵素を作用させて一般式（２）：
【化９】
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記定義と同一）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめることを特徴とする。
【００６９】
まず、本発明にかかる一般式（１）で表されるα−アミノケトンについて説明する。
【００７０】
置換基Ｘについて説明する。前記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子などが挙げられる。
【００７１】
また、低級アルキル基としては炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。これらは、直鎖状または分枝状のいずれの構造を取っていてもよい。また、置換基として、フッ素原子や塩素原子などのハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アミノ基またはアルコキシ基などを有していてもよい。
【００７２】
保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基の保護基としては、水で処理して除去可能なもの、酸または弱塩基で除去可能なもの、水素添加にて除去可能なもの、ルイス酸触媒およびチオ尿素などで除去可能なものなどが挙げられ、前記保護基には、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいシリル基、アルコキシアルキル基、置換基を有していてもよい低級アルキル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基およびトリチル基などが含まれる。
【００７３】
なお、前記アシル基には、アセチル基、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基およびｐ−ニトロベンゾイル基などが含まれる。また、置換基として、ヒドロキシル基、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基およびハロゲン原子などを有していてもよい。前記シリル基には、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基およびトリアリールシリル基などが含まれる。また、置換基として、アルキル基、アリール基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、ニトロ基およびハロゲン原子などの置換基を有していてもよい。前記アルコキシアルキル基には、メトキシメチル基および２−メトキシエトキシメチル基などが含まれる。前記低級アルキル基には炭素数１〜６のアルキル基が含まれ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。これらは直鎖状または分枝状のいずれの構造を取っていてもよい。また、置換基として、フッ素原子や塩素原子などのハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アミノ基およびアルコキシ基などを有していてもよい。
【００７４】
また、Ｘはニトロ基またはスルホニル基でもよく、具体的にはメチルスルホニル基などが挙げられる。
【００７５】
さらに、Ｘの数ｎは０〜３の整数であり、好ましくは０である。
【００７６】
また、前記一般式（１）中のＲ１は低級アルキル基を示す。このような低級アルキル基としては炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。これらは直鎖状または分枝状のいずれの構造を取ってもよい。
【００７７】
Ｒ２、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基を示す。前記低級アルキル基には炭素数１〜６のアルキル基が含まれ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。これらは直鎖状または分枝状のいずれの構造を取ってもよい。
【００７８】
また、前記α−アミノケトン化合物の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩などの無機酸の塩、または、酢酸、クエン酸などの有機酸の塩が挙げられる。
【００７９】
前記α−アミノケトンは、対応する１−フェニルケトン誘導体のα炭素をハロゲン化、例えば、ブロム化後、ブロム基などのハロゲンをアミンに置換することによって容易に合成できる（Ｇｅｒ．（Ｅａｓｔ），１１，３３２，Ｍａｒ．１２，１９５６）。
【００８０】
次に、本発明にかかる一般式（２）で表される光学活性アミノアルコールについて説明する。前記一般式（２）におけるＸ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記一般式（１）における定義と同一である。さらに所望の光学活性を有するβ−アミノアルコールとしては（１Ｓ，２Ｓ）アミノアルコールが挙げられる。（１Ｓ，２Ｓ）アミノアルコールの具体例として、ｄ−スレオ−２−メチルアミノ−１−フェニルプロパノール（ｄ−プソイドエフェドリン）、ｄ−スレオ−２−ジメチルアミノ−１−フェニルプロパノール（ｄ−メチルプソイドエフェドリン）、（１Ｓ，２Ｓ）−α−（１−アミノエチル）−ベンジルアルコール（ｄ−ノルプソイドエフェドリン）、（１Ｓ，２Ｓ）−１−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２−メチルアミノ−１−プロパノール、（１Ｓ，２Ｓ）−α−（１−アミノエチル）−２，５−ジメトキシ−ベンジルアルコール、（１Ｓ，２Ｓ）−１−（ｍ−ヒドロキシフェニル）−２−アミノ−１−プロパノール、（１Ｓ，２Ｓ）−１−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２−アミノ−１−プロパノール、（１Ｓ，２Ｓ）−１−フェニル−２−エチルアミノ−１−プロパノール、（１Ｓ，２Ｓ）−１−フェニル−２−アミノ−１−ブタノール、（１Ｓ，２Ｓ）−１−フェニル−２−メチルアミノ−１−ブタノールなどが挙げられる。
【００８１】
所望の光学活性を有する一般式（２）で表される光学活性アミノアルコールが生成する限り、アミノケトン不斉還元酵素を作用させる条件は特に限定されないが、当該酵素の至適ｐＨは８．１であり、至適温度は５５℃であることから、ｐＨ７〜９及び温度３０〜６５℃の条件で行うことが好ましい。
【００８２】
さらに、本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法は、一般式（１）：
【化１０】
で表されるα−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物に本発明の形質転換体を作用させて一般式（２）：
【化１１】
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめることを特徴とする。
【００８３】
前記反応を行う際の反応条件としては、例えば、液体培地で振盪培養した形質転換菌を集菌し、得られた菌体にアミノケトン水溶液（０．１〜１０％濃度）を加え、ｐＨを６〜８に調整しながら温度２０〜４０℃で数時間から１日反応させればよい。反応終了後、菌体を分離し、反応液中の生成物を単離することにより、光学活性アミノアルコールを得ることができる。ここで、形質転換菌の処理菌体（乾燥菌体や固定化菌体等）や形質転換菌から得られた酵素、又は、固定化酵素等も同様にして行うことが可能である。
【００８４】
また、本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法においては、一般式（３）：
【化１２】
（式中、
Ａは下記式（Ｙ）又は（Ｚ）を表し、
【化１３】
（ここで、Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環又はＲ８と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表す。）、
【化１４】
（ここで、Ｒ５は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、若しくはＲ６又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ６は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環、Ｒ５又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ７は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）；Ｒ８は水素原子、カルボキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ４と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格、Ｒ６と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環を表し；Ｒ９は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアシル基、Ｒ５又はＲ６と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し；Ｒ１０は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
で表される化合物、又はその製薬学的に許容される塩あるいは溶媒和物をさらに添加して反応を行うことにより、より効率的に光学活性アミノアルコールの製造を行うことが可能である。
【００８５】
前記一般式（３）において、炭素数１〜３のアルキル基としては、直鎖状、分枝状のいずれであってもよく、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基などが挙げられる。また、炭素数１〜６のアルキル基としては、直鎖状、分枝状のいずれであってもよく、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。炭素数５〜１０の炭化水素環としてはシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニルおよびシクロデカニルなどが挙げられる。
【００８６】
ヘテロ原子１〜３個を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格において、ヘテロ原子としては窒素原子、酸素原子、硫黄原子などが挙げられ、特に好ましくは窒素原子、酸素原子が挙げられ、５〜８員環のヘテロ環状骨格としてはピロリジン、ピペリジン、イミダゾリジン、ピペラジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオフェンおよびモルホリンなどが挙げられる。
【００８７】
また、炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基としてはメチルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、イソブチルオキシカルボニル基およびｔ−ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。アシル基としてはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ピバロイル基、ベンゾイル基およびバレリル基などが挙げられる。前記の炭素数１〜３または炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基またはアシル基が置換基を有する場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の数に限定されないが、置換基としては、例えばフッ素原子や塩素原子などのハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ基、ニトロ基およびアリール基などが挙げられる。さらに、製薬学的に許容される塩としては塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸の塩、酢酸、クエン酸などの有機酸の塩、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、アンモニアなどの無機塩基の塩およびトリエチルアミン、シクロヘキシルアミンなどの有機塩基の塩が挙げられる。
【００８８】
このような一般式（３）で表される化合物としては、例えば、１−アセチルアミノ−２−ヒドロキシプロパン、１−メチルアミノ−２−ヒドロキシプロパン、１−アミノ−２−オキソプロパン、１−アミノ−２−ヒドロキシシクロペンタン、１−アミノ−２，３−ジヒドロキシプロパン、Ｌ−トレオニン、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、１−アミノ−２−オキソシクロヘキサン、モルホリン、３−ヒドロキシピロリジン、３−ヒドロキシピペリジン、２−アミノメチル−テトラヒドロフラン、１−（２−ヒドロキシプロピル）アミノ−２−ヒドロキシプロパン、１−ｔ−ブチロキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシプロパン、２−アミノ−３−ヒドロキシブタン、ＤＬ−セリン、１−アミノ−２−ヒドロキシプロパン、１−アミノ−２−ヒドロキシブタン、１−アミノ−２−ヒドロキシシクロヘキサンが挙げられる。これらのうち、不斉炭素原子を有する化合物においては、特に記載がない限り、光学活性体であっても、ラセミ体であってもよい。
【００８９】
これら活性誘導剤を培地中に添加することにより、菌体の活性が誘導され、その後の光学活性なβ−アミノアルコールの生成は、無添加時に比べ効率よく進行する。活性誘導剤は各々単独で用いてもよく、または複数の誘導剤の混合物で用いてもよい。このような活性誘導剤の添加量は、培地に対し０．０１〜１０重量％が望ましい。
【００９０】
本発明にかかるβ−アミノアルコールの製造における反応方法としては、前記一般式（１）に示されるα−アミノケトン化合物またはその塩のエナンチオマー混合物に前記菌体又は菌体から得られた酵素が作用して、対応する一般式（２）で示される光学活性β−アミノアルコール化合物を生成する方法であれば特に限定されず、原料であるα−アミノケトンの水溶液に、緩衝液または水などで洗浄した菌体を混合することで反応を開始する。
【００９１】
また、反応条件は一般式（２）で示される光学活性β−アミノアルコール化合物の生成を損なわない範囲で選択できる。菌体量は、乾燥菌体として、ラセミアミノケトンに対して好ましくは１００分の１〜１０００倍、より好ましくは１０分の１〜１００倍である。また、基質であるラセミアミノケトンの濃度は好ましくは０．０１〜２０％、より好ましくは０．１〜１０％である。さらに、反応液のｐＨは好ましくは５〜９、より好ましくは６〜８であり、反応温度は好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃である。また、反応時間は５〜１５０時間が好ましいが、それぞれの菌体により適宜決められるべきである。
【００９２】
また、反応をより効率的に進行させるために、グルコースなどの糖類、酢酸などの有機酸、グリセロールなどのエネルギー物質を添加することができる。これらは、各々単独で用いてもよく、それらの混合物で用いてもよい。添加量は、基質に対して好ましくは１００分の１〜１０倍量である。また、補酵素等を添加することもできる。補酵素としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）などを単独または混合物で用いることができ、添加量はラセミアミノケトンに対して好ましくは１０００分の１〜５分の１倍量である。また、これら補酵素に加え、補酵素再生酵素、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼを添加することができ、添加量はラセミアミノケトンに対して好ましくは１０００分の１〜５分の１倍量である。また、補酵素再生酵素の基質、例えばグルコースを添加することもでき、添加量はラセミアミノケトンに対して好ましくは１００分の１〜１０倍量である。さらに、グルコースなどの糖類、酢酸などの有機酸、グリセロールなどのエネルギー物質、補酵素、補酵素再生酵素および補酵素再生酵素の基質をそれぞれ組み合せて用いてもよい。これらは、本来、菌体中に蓄積されているが、必要に応じてこれら物質を添加することにより、反応速度、収率等を上昇させることができる場合があり、適宜選択され得る。
【００９３】
さらに、反応液が上記になるように特定の塩を加え、その条件下で反応させると、未反応のα−アミノケトン異性体のラセミ化が促進され、菌体又は菌体から得られた酵素の基質となる鏡像異性体への変換をより効率的に進行させることができる。これにより、原料から５０％以上の高収率で目的のアミノアルコールが得られる傾向にある。
【００９４】
未反応のα−アミノケトンのラセミ化を促進する塩としては、酢酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、リン酸塩、炭酸塩、パラニトロフェノール塩、亜硫酸塩およびホウ酸塩などの弱酸の塩であればよいが、好ましくはリン酸塩（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素アンモニウム）、炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニウム）、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム）などが使用される。また、これらの混合物も使用でき、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液として、最終濃度が０．０１〜１Ｍとなるよう添加することが望ましい。例えば、リン酸塩の場合、リン酸二水素ナトリウム及びリン酸一水素ナトリウムを、９対１から５対９５の割合で混合するとよい。
【００９５】
反応によって生成した光学活性α−アミノアルコールは、慣用の分離精製手段によって精製できる。例えば、反応液から直接または菌体を分離した後、膜分離、有機溶媒（例えばトルエン、クロロホルムなど）による抽出、カラムクロマトグラフィー、減圧濃縮、蒸留、晶析、再結晶などの通常の精製方法に供することにより、光学活性β−アミノアルコールを得ることができる。生成した光学活性β−アミノアルコールの光学純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定することができる。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明の技術範囲を限定するものではない。
【００９７】
（実施例１）プラスミドの分離精製
（１）方法
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌を５ｍＬのＧＰＹ培地（１％グルコース、０．５％バクトペプトン、０．３％イーストエキストラクト）に植菌し、２５℃で振盪培養した。対数増殖期に１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリン溶液を２５０μＬ添加し、２５℃で２時間振盪培養した。遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間）で集菌し、上清を取り除いた後、１ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で懸濁し、再度、遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間）で集菌し、上清を取り除いた。ＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した２５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液で懸濁し、３７℃で３０分間放置した。その後、１００μＬの３Ｍ食塩水と２５μＬの１０％ＳＤＳを加え、−２０℃で一晩放置した。遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間）した上清に５０μｇ／ｍＬ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ及び５０μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡをそれぞれ０．５μＬ加え、３７℃で１５分間放置した。その後、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液を添加し、遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間）を行った。上清に２．５倍量のエタノールを加え、遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間）し、５０μＬの滅菌水に沈殿を溶解した。プラスミドの確認は、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色した後、ＵＶ照射で行った。
【００９８】
（２）供試菌株及び結果
本実施例では、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属及びその類縁菌であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の各種入手可能な菌株から上記（１）の方法にしたがって、プラスミドの有無についてのスクリーニングを行った。
【００９９】
スクリーニングした菌株のうちプラスミドの保持を確認できたものを表３に示す。すなわち、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＩＡＭ１４００、ＩＡＭ１５０３、ＪＣＭ２８９３、ＪＣＭ２８９４及びＪＣＭ２８９５）さらに、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｎｉｉ（ＪＣＭ３２０３）において、それぞれ約５．４ｋｂｐ及び約５．８ｋｂｐのプラスミドを確認できた。これらのプラスミドを、表３に列挙された名称のように、ｐＲＥＴ１１００、ｐＲＥＴ１２００、ｐＲＥＴ１３００、ｐＲＥＴ１４００、ｐＲＥＴ１５００、ｐＲＥＴ１６００、ｐＲＥＴ１７００、ｐＲＥＴ１８００、ｐＲＥＴ０５００、ｐＲＥＴ１０００と命名した（表３）。
【０１００】
なお、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＩＡＭ１４００及びＩＡＭ１５０３は、東京大学分子細胞生物学研究所が発行した「ＩＡＭ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４」に記載されており、当該研究所から入手することができる。また、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＪＣＭ２８９３、ＪＣＭ２８９４及びＪＣＭ２８９５、並びにＲ．ｒｈｏｄｎｉｉ ＪＣＭ３２０３は、独立行政法人理化学研究所が発行した「ＪＣＭ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ，Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００２」に記載されており、当該研究所から入手することができる。
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
（実施例２）制限酵素サイトの特定
表３に示したプラスミドを分類するために各種制限酵素を用いて、制限酵素サイトを調べた。各プラスミドを実施例１に記載の方法で分離した後、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩ、ＳｐＨＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動することによりＤＮＡ断片を確認した。サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ（東洋紡）を使用した。サイズマーカーを基に、制限酵素で切断されるサイトの数とそのフラグメントの大きさを決定した。結果を表４にまとめた。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
上記解析の結果、表３のプラスミドは、ｐＲＥＴ１１００と同様の制限酵素サイトを保持するプラスミド類、ｐＲＥＴ１２００と同様の制限酵素サイトを保持するプラスミド類及びｐＲＥＴ１０００の３種類に分類された。
【０１０５】
（実施例３）プラスミドのシークエンス及び相同性検索
実施例２の結果から、プラスミドが３種類、すなわちｐＲＥＴ１０００、ｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１２００に分類されたので、それぞれのプラスミドのシークエンスを試みた。
【０１０６】
まず、塩基配列を決定するために、これらプラスミド類のクローニングを行った。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＩＡＭ１４００）については、プラスミド（ｐＲＥＴ１１００、ｐＲＥＴ１２００）を分離したあとＳｍａＩとＳａｃＩで消化した。０．８％アガロースゲルで電気泳動し、ＤＮＡ断片を確認したところ、約０．５ｋｂｐ、約１．７ｋｂｐ、約３．７ｋｂｐ、約４．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を確認できた。これらのＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてアガロースゲルから回収し、インサートＤＮＡとした。一方、ベクターＤＮＡとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）をＳｍａＩ単独で又はＳｍａＩ及びＳａｃＩで消化したものを用いた。インサートＤＮＡとベクターＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。得られた形質転換体をＧＦＸ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてスクリーニングし、各々のクローンを得た。
【０１０７】
一方、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｎｉｉ（ＪＣＭ３２０３）についてはプラスミド（ｐＲＥＴ１０００）を分離した後、ＢａｍＨＩで消化した。０．８％アガロースゲルで電気泳動したところ、約２．０ｋｂｐ、約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を確認できた。これらのＤＮＡ断片を上記のＫｉｔを用いてゲルから回収し、インサートＤＮＡとした。ベクターＤＮＡはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（−）をＢａｍＨＩで消化したものを用いた。
【０１０８】
プラスミドのインサートの塩基配列決定は、プライマーウォーキング法で行った。機器はＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３１０ＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、酵素はＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＡＢＩ製）を使用した。
【０１０９】
まず、Ｐ７（Ｍ１３ ｆｏｒｗａｒｄ、東洋紡）プライマー及びＰ８（Ｍ１３ ｒｅｖｅｒｓｅ、東洋紡）プライマーを用いてインサートの塩基配列の一部を解読した。次に解読した配列内にプライマーを設計（配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏを使用；日立ソフトウェア社）し、設計したプライマー（合成オリゴＤＮＡ）を用いてさらに塩基配列を解読した。この手順を、インサートの塩基配列が全て解読できるまで繰り返した。インサートの塩基配列解読が終了したあと、これらのインサートがどのように連結しているかを解析するために、各々のインサートの末端にベクター方向に反応が行われるようプライマーを設計し、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＩＡＭ１４００）から分離したプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行った（ＫＯＤ Ｐｌｕｓを使用）。そのＰＣＲ産物をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、ＰＣＲに使用したプライマーと同じプライマーを使用してシーケンスを行いインサートの整列を解析した。
【０１１０】
シークエンスの結果、ｐＲＥＴ１１００は５４４４ｂｐからなり、そのＧ＋Ｃ含量は５９％であることが分かった。決定された全塩基配列を配列表の配列番号７３に示す。ｐＲＥＴ１２００は、５４２１ｂｐからなり、Ｇ＋Ｃ含量は６２％であった。ｐＲＥＴ１０００は、５８１３ｂｐからなり、Ｇ＋Ｃ含量は６７％であった。決定された全塩基配列を配列表の配列番号７４に示す。
【０１１１】
これらの決定された塩基配列をＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏを用いて、相同性検索を行ったところ、ｐＲＥＴ１０００及びｐＲＥＴ１１００は新規のプラスミドであることが判明した。一方、ｐＲＥＴ１２００は、ｐＮ３０（Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＦ３１２２１０）と約９９．６％（ｐＲＥＴ１２００を基に計算）相同性があった。
【０１１２】
さらに、ｐＲＥＴ１０００及びｐＲＥＴ１１００について、決定された塩基配列を基にＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏを使用して、公知プラスミドとの比較を行った。その結果、両方のプラスミドについて、全ての制限酵素サイトが一致するプラスミドは検出されなかった。
【０１１３】
（実施例４）塩基配列の解析
ｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１０００の塩基配列を解析した結果を以下に示す。
【０１１４】
ｐＲＥＴ１１００には以下のｏｒｆが見出された：
配列番号７３に記載の塩基配列上、２０２番目、２３８番目又は３３７番目から４８０番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１（配列番号１、配列番号２又は配列番号３）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、４７７番目から７５８番目までの塩基配列からなるｏｒｆ２（配列番号４）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、８６２番目、１２９４番目、１４５０番目、１４６２番目、１４８６番目、１４８９番目、１５１３番目、１６３０番目、１６４５番目、１６８７番目、２２２４番目又は２２２７番目から２４０９番目までの塩基配列からなるｏｒｆ３（配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、１８７５番目、１７３４番目、１７０１番目、１６７４番目又は１５８１番目から１４４４番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ４（配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、２８２８番目、２７９２番目、２７４７番目、２５９４番目又は２５４０番目から２４０６番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ５（配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５又は配列番号２６）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、２９７１番目又は３０４９番目から３３０６番目までの塩基配列からなるｏｒｆ６（配列番号２７又は配列番号２８）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、３５７７番目又は３５７１番目から３０５３番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ７（配列番号２９又は配列番号３０）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、３３３９番目又は３６４８番目からそれぞれ３９０２番目までの塩基配列からなるｏｒｆ８（配列番号３１又は配列番号３２）；及び
配列番号７３に記載の塩基配列上、４３６６番目又は４４７７番目から５０３４番目までの塩基配列からなるｏｒｆ９（配列番号３３又は配列番号３４）。
【０１１５】
ｐＲＥＴ１０００には以下のｏｒｆが見出された：
配列番号７４に記載の塩基配列上、３３５０番目、３２５１番目、２９４５番目又は２８４９番目から２４１２番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ１０（配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０又は配列番号４１）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、２３６５番目又は２３３２番目から２１５９番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ１１（配列番号４２又は配列番号４３）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、３１９７番目から３５２６番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１２（配列番号４４）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、４０３５番目又は３９９６番目から３６７９番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ１３（配列番号４５又は配列番号４６）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、４６２１番目、４６５４番目又は４６６６番目から４８３０番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１４（配列番号４８、配列番号４９又は配列番号５０）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、５１６１番目又は５０６２番目から４７０９番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ１５（配列番号５１又は配列番号５２）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、２３３１番目又は２３３４番目から２６１８番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１６（配列番号５３又は配列番号５４）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、２９０７番目から３２４２番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１７（配列番号５５）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、１６５０番目、１６８９番目、１７１３番目、１８２７番目又は１８７５番目から２１６２番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１８（配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、１９０６番目から２１６９番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１９（配列番号６１）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、８１０番目から５５３番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ２０（配列番号６２）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、１１７番目、１４７番目、３０６番目、４５６番目、５１４４番目、５２７６番目又は５５３４番目から６５６番目までの塩基配列からなるｏｒｆ２１（配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８又は配列番号６９）。
【０１１６】
ｐＲＥＴ１１００におけるＤＮＡ複製領域は、配列番号３５に記載の塩基配列（２４１０番目から３２００番目）、配列番号３６に記載の塩基配列（１０００番目から１５００番目）又は配列番号３７に記載の塩基配列（５０００番目から５００番目）で示される領域である。ｐＲＥＴ１０００におけるＤＮＡ複製領域は、配列番号７０に記載の塩基配列（３３５５番目から３５０７番目）、配列番号７１に記載の塩基配列（４２９０番目から４３５０番目）又は配列番号７２に記載の塩基配列（３５７０番目から３８９４番目）で示される領域である。
【０１１７】
ｐＲＥＴ１０００（配列番号７４）の塩基配列上、５１４４番目から６５６番目の塩基配列（配列番号６７）の領域及び４３８１番目から４８３０番目の塩基配列（配列番号４７）の領域は、ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（接合タンパク質）と相同性があり、接合に関与することが示唆された。
【０１１８】
さらに、ｐＲＥＴ１０００（配列番号７４）の塩基配列上、４２６０番目から４３３９番目の塩基配列（配列番号７５）の領域ではＤＮＡの二次構造が推定され、上記ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の発現や発現したタンパク質の認識部位であることが示唆された。
【０１１９】
一方、ｐＲＥＴ１１００（配列番号７３）の塩基配列上、７６１番目から８６８番目の塩基配列（配列番号７６）の領域は、複製に関係するタンパク質の発現に関与するプロモーターであることが示唆された。
【０１２０】
（実施例５）シャトルベクターの構築
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌と大腸菌間のシャトルベクターを構築するために、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌のプラスミドｐＲＥＴ１０００、ｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１２００と大腸菌のプラスミドｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９及びｐＨＳＧ３９８を使用して以下の実験を行った。
【０１２１】
まず、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓのプラスミドからＤＮＡフラグメントを調製した。すなわち、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＩＡＭ１４００）からプラスミドｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１２００を取得した後、Ａｌｗ４４Ｉを用いてｐＲＥＴ１１００を３７℃で２時間消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて平滑末端化することにより、一方ｐＲＥＴ１２００はＢｓｐＬＵ１１Ｉを用いて４８℃で２時間消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈを用いて平滑末端化することにより、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓプラスミドのＤＮＡフラグメントを得た。各々のＤＮＡフラグメントをＴＥ溶液に溶解した。
【０１２２】
一方、ｐＲＥＴ１０００については、Ｒ．ｒｈｏｄｎｉｉ（ＪＣＭ３２０３）からプラスミドｐＲＥＴ１０００を取得した後、ＤｒｄＩを用いてｐＲＥＴ１０００を３７℃で２時間消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈを用いて平滑末端化することによりｐＲＥＴ１０００のＤＮＡを得、これをＴＥ溶液に溶解した。
【０１２３】
次にＥ．ｃｏｌｉプラスミドからＤＮＡフラグメントを調製した。すなわちｐＵＣ１８（アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）含有）はＳｍａＩを用いて３０℃で２時間消化することにより、ｐＨＳＧ２９９（カナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍｒ）含有）及びｐＨＳＧ３９８（クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍｒ）含有）はＨｉｎｃＩＩを用いて３７℃で２時間消化することにより、Ｅ．ｃｏｌｉのプラスミドのＤＮＡフラグメントを得、ＴＥに溶解した。
【０１２４】
上記のように調製したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌のプラスミドからのＤＮＡフラグメントをライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換して、３０μＬの０．１ＭＩＰＴＧ（イソプロピル−β−ガラクトシド）と４％のＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を塗布した、１００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン又は３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢ（１％トリプトファン、０．５％イーストエキストラクト、１％塩化ナトリウム；ｐＨ７．２）寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し１００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン又は３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢ液体培地で３０℃、６０時間振盪培養した。得られた培養液からＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製、商品添付資料の条件で精製）を用いてＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。得られたシャトルベクターを表５に、ｐＲＥＴ１１００を用いた各シャトルベクターの作製方法を図３〜５に示す。
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
ｐＲＥＴ１１００とｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９又はｐＨＳＧ３９８とで構成されるシャトルベクターを、それぞれ、ｐＲＥＴ１１０１（配列番号８９）、ｐＲＥＴ１１０２（配列番号９０）又はｐＲＥＴ１１０３（配列番号９１）と命名した。なお、ｐＲＥＴ１１０１はアンピシリン耐性、ｐＲＥＴ１１０２はカナマイシン耐性、ｐＲＥＴ１１０３は、クロラムフェニコール耐性を示すシャトルベクターである。また、ｐＲＥＴ１１０１〜１１０３のそれぞれの大腸菌遺伝子とｐＲＥＴ１１００の結合の仕方が反対（Ｒｖ）のシャトルベクターを、それぞれｐＲＥＴ１１０１Ｒｖ（配列番号９２）、ｐＲＥＴ１１０２Ｒｖ（配列番号９３）及びｐＲＥＴ１１０３Ｒｖ（配列番号９４）と命名した。
【０１２７】
同様に、ｐＲＥＴ１０００及びｐＲＥＴ１２００を用いて構築したシャトルベクターをそれぞれｐＲＥＴ１００１〜ｐＲＥＴ１００３（配列番号９５〜配列番号９７）及びｐＲＥＴ１００１Ｒｖ〜ｐＲＥＴ１００３Ｒｖ（配列番号９８〜配列番号１００）並びにｐＲＥＴ１２０１〜ｐＲＥＴ１２０３及びｐＲＥＴ１２０１Ｒｖ〜ｐＲＥＴ１２０３Ｒｖと命名した（表５）。
【０１２８】
（実施例６）Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓへの形質転換方法の検討
実施例５で得られたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌−Ｅ．ｃｏｌｉのシャトルベクターを用いて、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株（ＭＡＫ−３４；受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−７４５１、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）にて平成１３年２月１５日に受託）を形質転換した。遺伝子導入方法としてエレクトロポレーション法を検討した。
【０１２９】
まず、５ｍＬのＧＰＹ培地にＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株を植菌し、３０℃で３６時間振盪培養した。その培養液１ｍＬを１００ｍＬのＬＢ培地に植え継ぎ、３０℃で１０時間、２００ｒｐｍで培養した。培養した菌体を遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間、４℃）により回収し、回収した菌体を超純水で２回洗浄した。洗浄し終えた菌体を遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間、４℃）により回収し、２．４ｍＬの１０％グリセロール溶液に懸濁した。懸濁液を３００μＬずつ分注し、−８０℃で凍結してコンピテントセルとした。
【０１３０】
作製したコンピテントセル９０μＬとシャトルベクター（ｐＲＥＴ１００１、ｐＲＥＴ１００２、ｐＲＥＴ１００３、ｐＲＥＴ１１０１、ｐＲＥＴ１１０２、ｐＲＥＴ１１０３、ｐＲＥＴ１２０１、ｐＲＥＴ１２０２及びｐＲＥＴ１２０３）５μＬとを氷上で混合した。混合溶液を氷上で冷却した０．１ｃｍのキュベットに静かに流し込み、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）にセットした。２０ｋＶ／ｃｍ、４００Ω、２５μＦでパルスし、直ちに３００μＬのＬＢ培地を加え、２５℃で３時間放置した。
【０１３１】
その菌懸濁液の一部を、抗生物質を含むＬＢプレート（１００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン又は３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）にプレーティングした。その結果、カナマイシン耐性遺伝子を持つｐＲＥＴ１００２、ｐＲＥＴ１１０２及びｐＲＥＴ１２０２を用いた場合にコロニーが得られた。また、この得られたコロニーがプラスミドを保持しているかを確認するために、プラスミドを分離して確認したところ、すべてシャトルベクターを保持していた。
【０１３２】
以上から、エレクトロポレーションによってＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを形質転換できるということ、並びにｐＲＥＴ１００２、ｐＲＥＴ１１０２及びｐＲＥＴ１２０２がシャトルベクターとして機能していることが示唆された。
【０１３３】
（実施例７）アミノケトン不斉還元酵素遺伝子（ｍａｋ ｇｅｎｅ）の取得
表５に示したシャトルベクターにｍａｋ ｇｅｎｅを挿入するために、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株からｍａｋ ｇｅｎｅを単離した。
【０１３４】
最初に、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株のゲノムＤＮＡの取得を行った。５ｍＬのＧＰＹ培地にＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株を植菌し、３０℃で４８時間振盪培養した後、その培養液を１００ｍＬのＧＰＹ培地に植え継ぎ、３０℃で１０時間、２００ｒｐｍで培養した。Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｂｕｆｆｅｒ ｓｅｔ及びＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ５００／Ｇ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを取得した。
【０１３５】
次に、取得したゲノムＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いてＰＣＲを行った。プライマーはＭＡＫＦ１（５’−ＧＡＡＴＣＴＴＣＴＣＧＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣ−３’；配列番号８０）とＭＡＫＲ２（５’−ＣＴＧＡＣＴＣＣＧＴＡＧＴＧＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＣ−３’；配列番号８１）、アニール温度６８℃、伸長反応１分５０秒でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈澱した後、ＳｍａＩを用いて３０℃で２時間消化したｐＵＣ１８と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、３０μＬの０．１Ｍ ＩＰＴＧと４％のＸ−ｇａｌを塗布したＬＢ寒天培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有）にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３０℃、６０時間振盪培養した。得られた培養液からＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ精製した。得られたＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。得られたクローンをｐＭＡＫ−１と命名した。
【０１３６】
（実施例８）発現ベクターの構築−１
表５に示したシャトルベクターにプロモーター及びアミノケトン不斉還元酵素遺伝子（ｍａｋ ｇｅｎｅ）を挿入した。
【０１３７】
まず、ｍａｋ ｇｅｎｅの上流約４００ｂｐを含む発現ベクター（外来プロモーター無し）のプラスミドを構築した。
【０１３８】
ｐＭＡＫ−１を、ＳｍａＩを用いて３０℃で２時間消化し、さらにＰｓｔＩを用いて３７℃で２時間消化した。その溶液を０．８％アガロースゲルで電気泳動に供した。ＤＮＡサイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用した。電気泳動後、約１．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、それをインサートＤＮＡとして使用した。一方、ベクターはｐＲＥＴ１１０２をＨｉｎｃＩＩ及びＰｓｔＩを用いて３７℃で２時間消化したものを使用した。これらのＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションし、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。
【０１３９】
出現したコロニーを１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で３０℃、６０時間振盪培養した。得られた培養液からＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ精製した。得られたＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１４０】
スクリーニングは、得られたＤＮＡを制限酵素処理していないもの及びＰｓｔＩを用いて３７℃２時間消化したものを０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、得られたＤＮＡのサイズから目的のプラスミドを得た。その際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ、ｐＲＥＴ１１０２及びＰｓｔＩを用いて３７℃２時間消化したｐＲＥＴ１１０２を用いた。このようにして得たプラスミドをｐＲＥＴ１１０４と命名した。
【０１４１】
（実施例９）発現ベクターの構築−２
発現ベクターの改良、遺伝子改変、形質転換効率向上及び菌体内における複製などにおいてベクターの縮小は有効であるため、シャトルベクターの縮小を行った。
【０１４２】
まず、シャトルベクターｐＲＥＴ１１０２の縮小を行った。ｐＲＥＴ１１０２をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｃＩＩで２時間消化したあと０．８％アガロース電気泳動に供し、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて回収し、ｐＲＥＴ１１０２のＤＮＡ断片を調製した。この際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用した。
【０１４３】
一方、大腸菌で複製するＤＮＡ断片は、ｐＨＳＧ２９９をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｃＩＩで２時間消化したあと０．８％アガロース電気泳動に供し、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて回収することにより調製した。
【０１４４】
これらのＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションし、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、３０μＬの０．１Ｍ ＩＰＴＧと４％のＸ−ｇａｌを塗布した１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で４８時間放置した。
【０１４５】
出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で３０℃４８時間振盪培養した。得られた培養液からＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてＤＮＡを精製した。このようにして得たｐＲＥＴ１１０２の縮小シャトルベクターをｐＲＥＴ１１２３（約５．３ｋｂｐ）と命名した。
【０１４６】
次に、シャトルベクターｐＲＥＴ１２０２の縮小を行った。ロドコッカス属菌由来のＤＮＡ断片は、ｐＲＥＴ１２０２をＥｃｏＲＩで２時間消化し、さらにＤｒａＩＩＩで２時間消化した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈを用いて平滑末端化し、０．８％アガロース電気泳動に供した後約３．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて回収することにより調製した。この際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用した。このＤＮＡ断片をｐＨＳＧ２９９のＨｉｎｃＩＩサイトへ挿入した。ライゲーション後、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、３０μＬの０．１Ｍ ＩＰＴＧと４％のＸ−ｇａｌを塗布した１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で７２時間放置した。出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地中、３０℃で７２時間振盪培養した。得られた培養液からＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ精製した。スクリーニングにより得られたプラスミドをＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ又はＥｃｏＲＩで２時間消化したところ、すべてのクローンがロドコッカス属菌由来の領域のうち、ＥｃｏＲＩサイト側が約５００ｂｐ削られていた。このプラスミドをｐＲＥＴ１２０４（約５．９ｋｂｐ）と命名した。なお、ロドコッカス属菌複製領域が削れていないクローンについては取得できなかった。
【０１４７】
同様に、シャトルベクターｐＲＥＴ１００２の縮小をおこない、ｐＲＥＴ１００６（約４．９ｋｂｐ）を得た。
【０１４８】
これら３種類の縮小プラスミド、ｐＲＥＴ１００６、ｐＲＥＴ１１２３及びｐＲＥＴ１２０４でＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを形質転換し、実施例６記載の方法でシャトルベクターの保持の有無を確認したところ、シャトルベクターを保持していることを確認した。このことから、３種類の縮小プラスミド、ｐＲＥＴ１００６、ｐＲＥＴ１１２３及びｐＲＥＴ１２０４はＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓにおいて複製することが示唆された。
【０１４９】
（実施例１０）発現ベクターの構築−３
実施例９で構築したシャトルベクターへｍａｋ ｇｅｎｅを挿入し発現ベクターを構築した。
【０１５０】
プロモーターを１段階でクローニングするために実施例９で構築したｐＲＥＴ１１２３のＰｓｔＩサイトを欠損させた。ｐＲＥＴ１１２３をＰｓｔＩで２時間消化した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈを用いて平滑末端化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。その溶液をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｈｉｇｈを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレートで３０℃、３６時間培養した。形成されたコロニーを１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で２４時間培養した後、ＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ精製し、ｐＲＥＴ１１３２とした。
【０１５１】
なお、取得したｐＲＥＴ１１３２に関し、ＰｓｔＩで１時間消化した後、０．８％アガロース電気泳動に供し、ｐＲＥＴ１１３２がＰｓｔＩで切断されないことを確認した。このときコントロールとして、ＰｓｔＩ処理していないｐＲＥＴ１１２３及びｐＲＥＴ１１３２と、ＰｓｔＩ処理したｐＲＥＴ１１２３とを使用した。
【０１５２】
（実施例１１）発現ベクターの構築−４
前述のシャトルベクターにプロモーター及びｍａｋ ｇｅｎｅを挿入したクローンを構築した。
【０１５３】
プロモーターを挿入するためにｍａｋ ｇｅｎｅ上流にＰｓｔＩサイトを持つクローンを構築した。アミノケトン不斉還元酵素のＣ末端にＨｉｓ−Ｔａｇが付加したクローンを得るために、以下の操作を行った。実施例７で得られたｐＭＡＫ−１を鋳型として、ＭＡＫＰｓｔＦ（５’−ＧＡＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＴＣＣ−３’；配列番号８２）及びＭＡＫＨｉｓＢｇｌＩＩＲ（５’−ＣＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＣＣＧＡＧＣＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧ−３’；配列番号８３）をプライマーとし、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いてアニール温度６８℃、伸長反応１分５０秒でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩを用いて３７℃で２時間消化したＰＣＲ断片（インサート）と、ｐＱＥ７０（ＳｐＨＩを用いて３７℃で２時間消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈを用いて平滑末端化し、そしてＢｇｌＩＩを用いて３７℃で２時間消化した）とをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションし、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。出現したコロニーを１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３０℃６０時間振盪培養した。培養液からＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ精製した。得られたＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１５４】
スクリーニングは、得られたＤＮＡを制限酵素処理していないもの及びＰｓｔＩ及びＢｇｌＩＩを用いて３７℃２時間消化したものを０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、得られたＤＮＡのサイズから目的のプラスミドを得た。このようにして得られたプラスミドをｐＭＡＫ−２と命名した。サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ、ｐＱＥ７０及びＢｇｌＩＩを用いて３７℃２時間消化したｐＱＥ７０を用いた。
【０１５５】
このうち、ｐＭＡＫ−２のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩサイトにｐＲＥＴ１２００のＲｅｐＡプロモーター（ｐＲＥＴ１２０４のうち、ロドコッカス属菌由来ＤＮＡ断片にコードされているｒｅｐＡの向きが、ｐＨＳＧ２９９にコードされているカナマイシン耐性遺伝子と同じ向きのクローンを鋳型とし、Ｐ１２００ｒｅｐ−Ｐｓｔ５１９５（５’−ＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧ−３’；配列番号８４）とＰ７（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’；配列番号８５）をプライマーとし、アニーリング温度６０℃、伸長反応１分間でＰＣＲ増幅した後、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを用いて３７℃で２時間消化したもの）を挿入したクローンを構築した（ｐＭＡＫ−１９と命名した）。
【０１５６】
次に、ｐＭＡＫ−１９を鋳型とし、ｐＱＥ７０Ｆ１（５’−ＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣ−３’；配列番号８６）及びｐＱＥ７０Ｒ１１３５Ｂｍ（５’−ＧＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＡＣＧＣＧＣＧＡＧＧＣＡＧ−３’；配列番号８７）をプライマーとし、ＰＣＲ酵素にＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を使用してアニーリング温度６０℃伸長反応３分間でＰＣＲを行った。その反応液からＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＰＣＲ産物を精製し、精製したＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで２時間消化した後、０．８％アガロース電気泳動に供し、ＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。そのＤＮＡ断片をインサートとした。
【０１５７】
一方、発現シャトルベクターに用いるベクターは、ｐＲＥＴ１１３２をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで２時間消化したＤＮＡ断片を０．８％アガロース電気泳動に供し、ＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製したＤＮＡ断片を用いた。これらインサートとベクターを混合しＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションした後、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｈｉｇｈを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレートにプレーティングした。得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養した後、ＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを回収し、０．８％アガロース電気泳動を行うことによりスクリーニングを行った。サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ及びｐＲＥＴ１１３２を用いた。こうして得た発現ベクターをｐＲＥＴ１１３３と命名した。
【０１５８】
また、ｐＭＡＫ−１９をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、２時間消化した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈを用いて平滑末端化し、０．８％アガロース電気泳動に供し、約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。この断片をｐＲＥＴ１１０２のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入したクローンをｐＲＥＴ１１１４と命名した。
【０１５９】
さらに、ｐＲＥＴ１１３３のプロモーターの改良を行った。ｐＲＥＴ１１３３にコードされているＭＡＫ遺伝子を発現させるプロモーターは、ｐＲＥＴ１２００のｒｅｐＡ遺伝子のプロモーターで約８００ｂｐの長さであるが、このプロモーターを約２００ｂｐ欠損させたプラスミドを構築した。そのクローニングに使用したプロモーターの調製はＰＣＲで行った。プラスミドｐＲＥＴ１２００を鋳型とし、プライマーにＰ１２０４ｒｅｐ−Ｅｃ２９５８（５’−ＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣＧＣＡＣＡＣＣＧＣＡＣ−３’；配列番号８８）及びＰ１２００ｒｅｐ−Ｐｓｔ５１９５（５’−ＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧ−３’；配列番号８４）を使用し、ＰＣＲ酵素にＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いて、アニーリング温度６０℃、伸長反応５０秒間でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで２時間消化した後、１．６％アガロース電気泳動に供し、ＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。そのＤＮＡ断片をインサートとした。このＤＮＡ断片に含まれるプロモーター領域の塩基配列を、配列番号７７に示した。
【０１６０】
一方、ベクターについては、ｐＲＥＴ１１３３を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで２時間消化した後、０．８％アガロース電気泳動に供し、約７．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用した。
【０１６１】
このようにして得たインサートとベクターをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションし、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｈｉｇｈを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレートにプレーティングした。得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養した後、ＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを回収し、０．８％アガロース電気泳動を行うことによりスクリーニングした。サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ及びｐＲＥＴ１１３３を用いた。
【０１６２】
更に、得られたＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで２時間消化した後、１．６％アガロース電気泳動を行い、約６００ｂｐのインサートに相当するＤＮＡ断片を確認した。サイズマーカーは１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒを使用した。このようにして得た発現ベクターをｐＲＥＴ１１３８と命名した。
【０１６３】
（実施例１２）組換えＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓの形質転換及び活性測定
前述の発現ベクターｐＲＥＴ１１０２、ｐＲＥＴ１１０４、ｐＲＥＴ１１１４及びｐＲＥＴ１１３８を用いてＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株及びＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＪＣＭ２８９５（独立行政法人 理化学研究所より分譲）を形質転換し、活性測定を行った。ＭＡＫ−３４株から精製されるアミノケトン不斉還元酵素は、国際公開ＷＯ０２／０７０７１４に記載のように、１−２−メチルアミノ−１−フェニル−１−プロパノンに作用し、ｄ−（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドエフェドリンを生成する能力を持っている。その他、１−２−ジメチルアミノプロピオフェノン、１−アミノ−２−ブタノン等にも作用し、それぞれ対応したβ−アミノアルコールの生成が確認されている。
【０１６４】
活性測定は、菌量Ｏ．Ｄ．＝５、２％グルコース及び０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）になるように反応液を調製し、その反応中に基質として３％の（１Ｓ，２Ｓ）−２−（Ｎ−エチルアミノ）−１−フェニル−１−プロパノール（ＥＡＭ）を含有するようにした。ＥＡＭは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．５０，ｐｐ．２２８７−２２９２，１９２８にその合成方法が記載されている。反応液を３０℃で１６時間振盪反応した。反応生成物のβ−アミノアルコールである（１Ｓ，２Ｓ）−２−（Ｎ−エチルアミノ）−１−フェニル−１−プロパノール（ＥＰＥ）の確認はＨＰＬＣで行った。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ ＰＨ−３ ３．０×７５ｍｍ、溶離液は７％アセトニトリル水溶液及び０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、検出はＵＶ（２２０ｎｍ）で行った。
【０１６５】
このようにして活性測定した結果を表６に示した。外来プロモーター領域を持たないｐＲＥＴ１１０４を導入した組換え体は、対照であるｍａｋ ｇｅｎｅを持たないｐＲＥＴ１１０２を導入した組換え体とほぼ同じ活性を示し、組換え酵素の発現は認められなかった。
【０１６６】
ＭＡＫ−３４株にｐＲＥＴ１１１４を導入した場合、ｐＲＥＴ１１０４に比べて高い比活性が認められた。このことはベクターに挿入したｐＲＥＴ１２００のｒｅｐＡプロモーター領域が、プロモーターとして機能していることが示された。
【０１６７】
ｐＲＥＴ１１３８を導入した場合、組換えＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株の比活性は３７．７μｇ／ｈ・ｍＬ／Ｏ．Ｄ．であり、組換えＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＪＣＭ２８９５株の比活性は３４．９μｇ／ｈ・ｍＬ／Ｏ．Ｄ．であり、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ株における酵素の発現が確認された。
【０１６８】
【表６】
【０１６９】
（実施例１３）酵素の精製
実施例１２で得られた組換え菌体を１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地１００ｍＬで３０℃、４日間培養し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離して集菌し、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔキット（キアゲン社製）によりＨｉｓ−ｔａｇが付加されたタンパク質を精製した。具体的には、超音波処理により菌を破砕し、遠心分離によりその上清液を得、ニッケルキレートカラムによりタンパク質を精製した。得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量約２８０００のタンパク質バンドが認められた。この分子量は、国際公開ＷＯ０２／０７０７１４に記載のアミノケトン不斉還元酵素の分子量とほぼ同じであり、アミノケトン不斉還元酵素が組換えロドコッカス菌において産生されたことが示された。
【０１７０】
（実施例１４）酵素によるβ−アミノアルコールの製造
実施例１３で得られた精製酵素（０．５μｇ／ｍＬ）、５ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５ｍＭ ＥＡＭを含む反応液０．５ｍＬを３７℃で１６時間反応させた。基質及び生成物（ＥＰＥ）の分析はＨＰＬＣで行った。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ ＰＨ−３ ３．０×７５ｍｍ、溶離液は７％アセトニトリル水溶液及び０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、検出はＵＶ（２２０ｎｍ）で行った。その結果、ＥＰＥが生成したことを確認した。
【０１７１】
同様に、精製酵素又は実施例１３に記載の培養で得られた組換え体の破砕酵素粗抽出液を１−２−ジメチルアミノプロピオフェノン、１−アミノ−２−ブタノン等に作用させ、対応するβ−アミノアルコールを製造できることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
以上説明したように、本発明のプラスミド及びシャトルベクターは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌（特に、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ又はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｎｉｉ）由来のものであり、これらを利用して同菌を組換えにより改変し、より効率的にアミノケトン不斉還元酵素を産生する菌株を作製することができる。また、アミノケトン不斉還元酵素を含む有用酵素を形質転換体に大量生産させることもできるようになる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ（ロドコッカス）属に属する微生物（以下、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌という）由来の新規なプラスミド及びその利用に関する。より具体的には、プラスミド及びその一部であるＤＮＡ断片（以下、単にＤＮＡ断片ともいう）、並びにそれらを利用するシャトルベクター、ベクター、形質転換体、アミノケトン不斉還元酵素の製造方法及び光学活性アミノアルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌は、ニトリル類の代謝に関与する酵素を生産することやアミノケトンを不斉的に還元する酵素を産生することが知られている。特に、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓは、きわめて高いアミノケトン不斉還元活性を有することが知られている。このような微生物及び酵素は、α−アミノケトンに作用して、光学活性β−アミノアルコールを高収率かつ高選択的に生産する（例えば、特許文献１及び５）。したがって、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌において、有用な酵素等の大量生産を目的とする宿主−ベクター系の開発が以前から期待されてきた。しかしながら、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌を宿主とするに適したベクターの開発は遅れているのが現状である。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌においてプラスミドが見出された微生物は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｈ１３−Ａ株（非特許文献１）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ４２７６株（特許文献２）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ４００１株（特許文献３）及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＩＦＯ１２３２０株（特許文献４）など数株にしかすぎない。
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０１／７３１００号パンフレット
【特許文献２】特開平４−１４８６８５号公報
【特許文献３】特開平４−３３０２８７号公報
【特許文献４】特開平９−２８３７９号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ０２／０７０７１４号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，６３８，１９８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のようにＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌から工業的に利用できる菌株を育種、改良（変異株）するための新しいベクターの開発が望まれている。特に、組換えＤＮＡ微生物及びその産物である食品や添加物の安全性の面からセルフクローニング系によることが望ましいとされている。本発明は、このような宿主−ベクター系におけるベクターとして利用できる新規なプラスミドを提供することを目的とする。
【０００５】
アミノケトン不斉還元活性を有するＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓにおいて、工業的に利用できる組換え微生物の創出が望まれている。特に、このような組換え微生物の創出に利用できる新規なプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片を提供することを本発明の第一の目的とする。
【０００６】
前記プラスミドが得られれば、他の微生物でも複製可能なシャトルベクターを構築することも容易となる。本発明は、このようなシャトルベクター構築に必要となるＤＮＡ複製に関する塩基配列情報（複製領域等）を提供することを第二の目的とする。
【０００７】
本発明は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌のいずれにおいても複製可能なシャトルベクターを提供することを第三の目的とする。
【０００８】
さらに、本発明は前記シャトルベクターのアミノケトン不斉還元酵素への適用を第四の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌株よりベクター作製のためのプラスミドを鋭意スクリーニングした結果、宿主−ベクター系におけるベクターとして利用可能な幾つかの新規なプラスミドを見出した。
【００１０】
また、本発明者らは、前記プラスミドに、薬剤耐性遺伝子、大腸菌内で複製可能な遺伝子領域などを導入することによって、シャトルベクターを作製できることを見出した。このように、上記課題を達成する塩基配列情報、プラスミド及びシャトルベクターを得て、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明によれば、以下の（１）〜（３９）に記載のＤＮＡ断片、ＤＮＡ、プラスミド、シャトルベクター、ベクター、形質転換体、アミノケトン不斉還元酵素の製造方法及び光学活性アミノアルコールの製造方法が提供される。
（１）配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（２）配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（３）配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（４）配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（５）配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、且つ配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（６）配列番号７６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（７）配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（８）配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含み、且つ配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載のプラスミド又はＤＮＡ断片を有し、制限酵素切断部位数がＢａｍＨＩ：２、ＥｃｏＲＩ：２、ＫｐｎＩ：１、ＰｖｕＩＩ：１、ＳａｃＩ：１及びＳｍａＩ：１であり、大きさが約５．４ｋｂｐであることを特徴とする環状プラスミド。
（１０）配列番号７３に記載の塩基配列を有するプラスミド。
（１１）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来であることを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかに記載のプラスミド又はＤＮＡ断片。
（１２）配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（１３）配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（１４）配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（１５）配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（１６）配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、且つ配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（１７）配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含み、且つ配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（１８）配列番号６７及び配列番号４７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（１９）配列番号６７及び配列番号４７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有する接合タンパク質領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（２０）配列番号７５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（２１）配列番号７５に記載の塩基配列を有する接合に関する領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
（２２）（１２）〜（２１）のいずれかに記載のプラスミド又はＤＮＡ断片を有し、制限酵素切断部位数がＢａｍＨＩ：２、ＰｖｕＩＩ：４、ＳａｃＩ：３及びＳｍａＩ：４であり、大きさが約５．８ｋｂｐであることを特徴とする環状プラスミド。
（２３）配列番号７４に記載の塩基配列を有するプラスミド。
（２４）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来であることを特徴とする（１２）〜（２３）のいずれかに記載のプラスミド又はＤＮＡ断片。
（２５）配列番号７７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
（２６）配列番号７７に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするＤＮＡ断片。
（２７）（１）〜（２６）のいずれかに記載のプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片と大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域とを含み、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌内で複製可能なシャトルベクター。
（２８）（２７）に記載のシャトルベクターを用いて作製することを特徴とするベクター。
（２９）（６）、（７）、（２５）又は（２６）のいずれかに記載のプラスミド又はＤＮＡ断片を含むことを特徴とするベクター。
（３０）アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入されていることを特徴とする（２８）又は（２９）に記載のベクター。
（３１）アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が、配列番号７８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号７８のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（３０）に記載のベクター。
（３２）アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が、配列番号７９に記載の塩基配列からなる核酸、又は配列番号７９と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする（３０）に記載のベクター。
（３３）（２８）又は（２９）に記載のベクターを含む形質転換体。
（３４）（３０）〜（３２）のいずれかに記載のベクターを含む形質転換体。
（３５）（３４）に記載の形質転換体を該形質転換体が増殖可能な培地中で培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた該形質転換体からアミノケトン不斉還元酵素を精製する精製工程と
を含むアミノケトン不斉還元酵素の製造方法。
（３６）一般式（１）：
【化１】
（式中、Ｘは同一又は異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基及びスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；ｎは０〜３の整数を示し；Ｒ１は低級アルキル基を示し；Ｒ２，Ｒ３は同一又は異なっていてもよく、水素原子及び低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物に（３５）記載の製造方法で得られるアミノケトン不斉還元酵素を作用させて一般式（２）：
【化２】
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記定義と同一）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめる光学活性アミノアルコールの製造方法。
（３７）一般式（１）：
【化３】
（式中、Ｘは同一又は異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基及びスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；ｎは０〜３の整数を示し；Ｒ１は低級アルキル基を示し；Ｒ２，Ｒ３は同一又は異なっていてもよく、水素原子及び低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物に（３４）記載の形質転換体を作用させて一般式（２）：
【化４】
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記定義と同一）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめる光学活性アミノアルコールの製造方法。
（３８）（３７）に記載の光学活性アミノアルコールの製造方法において、
一般式（３）：
【化５】
（式中、Ａは構造式（Ｙ）又は（Ｚ）を表し、
【化６】
（ここで、Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環又はＲ８と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表す。）、
【化７】
（ここで、Ｒ５は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、若しくはＲ６又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ６は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環、Ｒ５又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ７は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）；
Ｒ８は水素原子、カルボキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ４と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格、Ｒ６と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環を表し；Ｒ９は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアシル基、Ｒ５又はＲ６と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ１０は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
で表される化合物、又はその製薬学的に許容される塩あるいは溶媒和物をさらに添加して光学活性アミノアルコールを生成させる光学活性アミノアルコールの製造方法。
（３９）配列番号８９〜配列番号１００に記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有する（２７）に記載のシャトルベクター。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のプラスミドは、従来知られていない新規なプラスミドであり、工業的に有用なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する宿主−ベクター系におけるベクターとして価値がある。特に、アミノケトンの不斉還元を工業的に行なえる組換え微生物の創出に有用である。このような微生物が貢献するアミノケトンの不斉還元としては、１−２−メチルアミノ−１−フェニル−１−プロパノンからｄ−（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドエフェドリンを製造する反応が挙げられる。
【００１３】
また、本発明のプラスミドは、単一のロドコッカス細胞に共存することから、複製機能を利用した単独での使用の他に、それぞれ和合性プラスミドとしても利用できる。すなわち、別のタンパク質（酵素等）遺伝子をそれぞれのプラスミドに挿入することにより、別のタンパク質を同時に同一細胞内で発現できるようになる。
【００１４】
さらに、本発明のシャトルベクターは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属菌）において、工業的に利用し得る組換え微生物の創出に有用である。
【００１５】
本発明のプラスミドから得られるＤＮＡ複製に関する塩基配列情報は、それに基づいて前記シャトルベクターの構築を可能とし、具体的にはベクターの構成要素であるＤＮＡ断片等を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、プラスミドｐＲＥＴ１１００の制限酵素切断地図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＲＥＴ１０００の制限酵素切断地図である。
【図３】図３は、シャトルベクターｐＲＥＴ１１０１の構築の概要を示す図である。
【図４】図４は、シャトルベクターｐＲＥＴ１１０２の構築の概要を示す図である。
【図５】図５は、シャトルベクターｐＲＥＴ１１０３の構築の概要を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を好適な実施の形態に従って説明する。
【００１８】
本発明の第１のプラスミドは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌から単離されるプラスミド又はその誘導体である。具体的には、例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＩＡＭ１４００，ＩＡＭ１５０３，ＪＣＭ２８９３及びＪＣＭ２８９４株等の菌株から単離することができ、その大きさが約５．４ｋｂｐであり、且つ表１に示す制限酵素に対する分解特性を有する環状プラスミドである。以下、それぞれの菌株から単離されるプラスミドをｐＲＥＴ１１００、ｐＲＥＴ１３００、ｐＲＥＴ１５００及びｐＲＥＴ１７００と称する。なお、供試菌株から本発明のプラスミドを調製するには、公知の方法（例えば、ボイル法、アルカリ溶解法、塩化セシウム密度勾配超遠心法：ラボマニュアル遺伝子工学、第３版、第１０章、５５−５９頁、丸善株式会社）を採用することができる。
【００１９】
【表１】
【００２０】
プラスミドｐＲＥＴ１１００の制限酵素地図を図１に示す。このプラスミドについて、公知の方法（例えば、蛍光式自動シークエンサー）によりシークエンスしたところ、その全塩基配列は、配列表の配列番号７３に示す５４４４ｂｐであることが分かった。
【００２１】
また、本発明の第２のプラスミドも、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌から単離されるプラスミド又はその誘導体である。具体的には、例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｎｉｉ ＪＣＭ３２０３株から単離することができ、その大きさが約５．８ｋｂｐであり、且つ表２に示す制限酵素に対する分解特性を有する環状プラスミドである。以下このプラスミドをｐＲＥＴ１０００と称する。
【００２２】
【表２】
【００２３】
プラスミドｐＲＥＴ１０００の制限酵素地図を図２に示す。このプラスミドについても、公知の方法によりシークエンスしたところ、配列表の配列番号７４に示す５８１３ｂｐの塩基配列を有することが分かった。
【００２４】
以上のように本発明のプラスミド類（天然型もしくは野生型）は、表１又は表２に示す制限酵素切断パターンによっても特定され得る環状プラスミドである。したがって、本発明は次の２種類の環状プラスミドを包含する。
（１）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来の環状プラスミドであって、その大きさが約５．４ｋｂｐであり、制限酵素切断部位数がＢａｍＨＩ：２、ＥｃｏＲＩ：２、ＫｐｎＩ：１、ＰｖｕＩＩ：１、ＳａｃＩ：１及びＳｍａＩ：１であることを特徴とする環状プラスミド。
（２）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来の環状プラスミドであって、その大きさが約５．８ｋｂｐであり、制限酵素切断部位数がＢａｍＨＩ：２、ＰｖｕＩＩ：４、ＳａｃＩ：３及びＳｍａＩ：４であることを特徴とする環状プラスミド。
【００２５】
プラスミドｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１０００の塩基配列（すなわち、配列番号７３及び配列番号７４）を解析した結果、ＤＮＡ複製やその他の機能を有するタンパク質をコードしている一群の塩基配列（オープンリーディングフレーム、以下ｏｒｆという）が存在することが推測される。
【００２６】
当該技術分野において、「ＤＮＡ複製」とは、ＤＮＡ自身が鋳型となって、すでにある２本鎖ＤＮＡ（親ＤＮＡ）と全く同じ２個の２本鎖ＤＮＡが形成されることを指す。その複製機構は、複製開始点（複製起点）からの開始、ＤＮＡ鎖の伸長、終結の３段階からなる。複製の際にはＤＮＡ２本鎖の一部がほどけ、それぞれの１本鎖に相補的な新しいＤＮＡ鎖が合成される。２本鎖をほどくのは、ＤＮＡへリカーゼとらせん不安定化蛋白（一本鎖ＤＮＡ結合蛋白ともいう）であり、ほどかれた部分は複製フォークと呼ばれる。複製フォークに向かって３’→５’方向の鋳型ＤＮＡをリーディング鎖、その逆で５’→３’方向をラギング鎖と呼ぶ。ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’に向かってＤＮＡ鎖を伸ばしてゆく。そのためリーディング鎖を鋳型にする場合、複製フォークの方向にＤＮＡが合成される。しかし、反対側のラギング鎖を鋳型にすると、複製フォークと逆方向にＤＮＡ鎖を伸ばさねばならない。そのためラギング鎖の複製は、岡崎フラグメントと呼ぶ２００塩基程度の断片ごとに行われる。約２００塩基ごとにＲＮＡプライマーがＤＮＡを鋳型にして、１０塩基のＲＮＡを５’→３’の方向に合成する。そのＲＮＡをプライマーにして、ラギング鎖を鋳型にＤＮＡポリメラーゼが５’→３’方向にＤＮＡ鎖を合成する。複製された２００塩基程度のＤＮＡ断片は、その後ＲＮＡが除去され１本鎖のＤＮＡに結合される。このような複製機構の中で、ＤＮＡへリカーゼ、らせん不安定化蛋白などの種々のタンパク質が協同して複製装置を形成している。関与している他のタンパク質として、ＤＮＡトポイソメラーゼ（ＤＮＡ複製の際のよじれを防ぐ）、複製開始蛋白や複製終了蛋白などが挙げられる。ＤＮＡ複製機構については、例えば、「細胞の分子生物学、第３版、中村桂子ら訳、２５１−２６２頁、教育社、１９９６年」に詳しく解説されている。
【００２７】
そこで、さらにプラスミドｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１０００の塩基配列を解析した結果、前記ＤＮＡ複製に関与するｏｒｆの近辺に、ＡＴリッチな相同性又は相似性のある繰返しを持った配列やＤＮＡの二次構造をもつと思われる配列、すなわちＤＮＡ複製領域（ＤＮＡの複製に関与するタンパク質が認識する塩基配列領域、又はＤＮＡの複製開始点が存在する領域）と推測される塩基配列が見出された。
【００２８】
以上、ＤＮＡ複製には、ＤＮＡ複製領域及びＤＮＡ複製に関与するタンパク質（以下、ＤＮＡ複製関連タンパク質という）をコードする領域が必須である。本発明に従えば、ｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１０００の両プラスミドについて、これらの領域の塩基配列に関する情報が取得できる。
【００２９】
まず、プラスミドｐＲＥＴ１１００において、ＤＮＡ複製領域としては、配列番号３５〜３７に記載の塩基配列が同定される。また、ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域としては、配列番号１〜３に記載の塩基配列（ｏｒｆ１）、配列番号４に記載の塩基配列（ｏｒｆ２）、配列番号５〜１６に記載の塩基配列（ｏｒｆ３）、配列番号１７〜２１に記載の塩基配列（ｏｒｆ４）、配列番号２２〜２６に記載の塩基配列（ｏｒｆ５）、配列番号２７又は２８に記載の塩基配列（ｏｒｆ６）、塩基配列２９又は３０に記載の塩基配列（ｏｒｆ７）、配列番号３１又は３２に記載の塩基配列（ｏｒｆ８）、配列番号３３又は３４に記載の塩基配列（ｏｒｆ９）が同定される。
【００３０】
ｐＲＥＴ１１００からＤＮＡ複製可能なプラスミドを作製するためには、この組換えプラスミドは、前記ＤＮＡ複製領域を少なくとも１つと前記ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域（ｏｒｆ）を少なくとも１つ備える必要がある。したがって、本発明のプラスミド（組換え型）は、このようなＤＮＡ複製領域を少なくとも１つとＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を少なくとも１つ含むことを特徴とする。ここで、ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域は、配列番号１、４、１４、１７及び２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有することが好ましい。
【００３１】
配列番号７６に記載の塩基配列の領域は複製に関係するタンパク質の発現に関与するプロモーターであることが示唆されており、本発明のプラスミドは、配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含んでいることが好ましい。
【００３２】
プラスミド作製に際しては、前述の塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ断片を適宜選択して、構築することができる。また、本発明は、該プラスミドの誘導体もしくは機能的な（ＤＮＡ複製）断片をも包含する。
【００３３】
次に、プラスミドｐＲＥＴ１０００において、ＤＮＡ複製領域としては、配列番号７０〜７２に記載の塩基配列が同定される。また、ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域としては、配列番号３８〜４１に記載の塩基配列（ｏｒｆ１０）、配列番号４２又は４３に記載の塩基配列（ｏｒｆ１１）、配列番号４４に記載の塩基配列（ｏｒｆ１２）、配列番号４５又は４６に記載の塩基配列（ｏｒｆ１３）、配列番号４８〜５０に記載の塩基配列（ｏｒｆ１４）、配列番号５１又は５２に記載の塩基配列（ｏｒｆ１５）、配列番号５３又は５４に記載の塩基配列（ｏｒｆ１６）、配列番号５５に記載の塩基配列（ｏｒｆ１７）、配列番号５６〜６０に記載の塩基配列（ｏｒｆ１８）、配列番号６１に記載の塩基配列（ｏｒｆ１９）、配列番号６２に記載の塩基配列（ｏｒｆ２０）、配列番号６３〜６９に記載の塩基配列（ｏｒｆ２１）が同定される。
【００３４】
ｐＲＥＴ１０００からＤＮＡ複製可能なプラスミドを作製するためには、この組換えプラスミドは、前記ＤＮＡ複製領域を少なくとも１つと前記ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域（ｏｒｆ）を少なくとも１つ備える必要がある。したがって、本発明のプラスミド（組換え型）は、このようなＤＮＡ複製領域を少なくとも１つとＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を少なくとも１つ含むことを特徴とする。ここで、ＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域は、配列番号４０、４２、４４、４５、５３、５５、５６、６１、６２及び６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有することが好ましい。
【００３５】
配列番号６７及び４７に記載の塩基配列の領域は接合タンパク質（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）と相同性があり、接合に関与することが示唆されている。また、配列番号７５に記載の塩基配列の領域は接合タンパク質遺伝子の発現に関与することや発現タンパク質の認識部位であることが示唆されている。したがって、本発明のプラスミドは、配列番号６７及び４７に記載の塩基配列を有する接合タンパク質領域を含んでいることや配列番号７５に記載の塩基配列を有する接合に関する領域を含んでいることが好ましい。
【００３６】
プラスミド作製に際しては、前述の塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ断片を適宜選択して、構築することができる。また、本発明は、該プラスミドの誘導体もしくは機能的な（ＤＮＡ複製）断片をも包含する。
【００３７】
本発明のプラスミド又はＤＮＡ断片は、ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部において、それぞれの領域の機能が損なわれない限り、１若しくは複数個のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を含む塩基配列を有していてもよい。
【００３８】
また、本発明のシャトルベクターは、本発明のＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域のいずれかに記載のプラスミド又はＤＮＡ断片と大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域を含み、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌内で複製可能なものであればよく、例えば、配列番号８９〜配列番号１００の塩基配列を有するものが挙げられる。本発明のシャトルベクターは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌内で複製可能なものであれば、該塩基配列に、１若しくは複数個のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を含む塩基配列を有していてもよい。
【００３９】
前記「複数個」とは、領域の種類によっても異なるが、具体的には、２〜１１００個、好ましくは、２〜８００個、より好ましくは２〜３００個である。更に好ましくは、２〜１００個、更により好ましくは、２〜２０個、最も好ましくは２〜１０個である。
【００４０】
また、上記のような、ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部と実質的に同一の塩基配列を有するプラスミド又はＤＮＡ断片として具体的には、ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列が挙げられる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄の条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域の一部が３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗浄の条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００４１】
上記のような、ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部と実質的に同一の塩基配列を有するプラスミド又はＤＮＡ断片は、例えば、部位特異的変異法によって、特定の部位のヌクレオチドにおいて置換、欠失、又は挿入を含むように、ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部を改変することによって取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ＤＮＡ複製領域、ＤＮＡ複製関連タンパク質コード領域、プロモーター領域、接合タンパク質領域、接合に関する領域又はそれらの一部を含むＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および同ＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００４２】
また、上記のようなヌクレオチドの置換、欠失又は挿入には、ロドコッカス属菌の菌株による違いなどの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【００４３】
本発明のシャトルベクターは、上記のプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片（Ａ）及び大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域（Ｂ）を含む。また、このシャトルベクターは、場合により薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域を含んでもよく、これは好ましい。当該技術分野において、一般的に「シャトルベクター」とは、二種の細胞のＤＮＡ複製機構を含み、望ましくはさらに選択マーカーとしての薬剤耐性遺伝子等を含む、その二種の細胞中で自律複製することができるベクターをいう。プラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片（Ａ）は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌中で複製可能なＤＮＡ領域である。大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域（Ｂ）は、大腸菌内で複製増殖可能なプラスミドであれば、プラスミド全体であってもよく、又はその一部であってもよい。前記大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域としては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９８等のプラスミドを用いることが可能である。
【００４４】
本発明のシャトルベクターが薬剤耐性遺伝子を含む場合、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが好適に用いられるが、宿主となるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌内で発現し、宿主細胞に薬剤耐性を与えることができ、両菌属間で、薬剤耐性能によりプラスミドの存在が確認できるものであれば、薬剤の種類に限定はない。また、そのような薬剤耐性遺伝子を複数個、使用してもよい。
【００４５】
シャトルベクターには、複数のクローニングサイト（マルチクローニングサイト）が含まれることが望ましく、このクローニングサイトと前記薬剤耐性遺伝子は、例えば、大腸菌プラスミドから誘導されうる。すなわち、上記で列挙した公知の大腸菌プラスミドを適当な制限酵素によって、切断して、クローニングサイトと薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域を作製し、他方のＤＮＡ断片（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌中で複製可能なＤＮＡ領域）とライゲーションする。
【００４６】
実例として、シャトルベクターの構築の概略を図３〜５に示す。シャトルベクターは、上記プラスミド及び大腸菌由来のプラスミドを適切な制限酵素で処理した後、両者をライゲーションすることにより構築することが可能である。このようにして、本発明者らは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌のプラスミドｐＲＥＴ１０００、ｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１２００と大腸菌のプラスミドｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９及びｐＨＳＧ３９８とを使用して１８種類のシャトルベクター（表５）を作製した。
【００４７】
本発明のシャトルベクターは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌又は大腸菌を宿主とすることができ、それらのいずれでも複製可能であり、工業的に利用できる。本発明のシャトルベクターによって形質転換されたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌又は大腸菌、さらにその他の微生物の形質転換体は、このように有用であり、これら形質転換体も本発明に包含される。
【００４８】
本発明のベクターは、本発明のシャトルベクターを用いて作製することを特徴とする。すなわち、本発明のシャトルベクターに導入したい標的ＤＮＡが挿入されているベクターである。導入したいＤＮＡ及び本発明のシャトルベクターを適切な制限酵素で処理した後、両者をライゲーションすることで、かかるベクターを作製することが可能である。このベクターを利用することで、所望のＤＮＡを導入した形質転換体を得ることができる。
【００４９】
挿入するＤＮＡとしては、例えば、アミノケトン不斉還元酵素遺伝子や補酵素再生系酵素遺伝子が挙げられる。アミノケトン不斉還元酵素遺伝子は、ＷＯ０２／０７０７１４に記載されているアミノケトン不斉還元酵素をコードする遺伝子であり、より具体的には、配列番号７８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株由来のアミノケトン不斉還元酵素）をコードするＤＮＡであり、特に、配列番号７９に記載の塩基配列からなるＤＮＡである。ＷＯ０２／０７０７１４に記載されている内容も全て本明細書に含まれる。
【００５０】
アミノケトン不斉還元酵素は、ＷＯ０２／０７０７１４に記載されている性質を有しておればよく、配列表の配列番号７８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、及び、前記アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、アミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質も含まれる。ここで、アミノケトン不斉還元活性とは、前記一般式（１）で表されるα−アミノケトンを基質として前記一般式（２）で表される光学活性なアミノアルコールを生成する活性をいう。
【００５１】
このような欠失、挿入、置換、付加を施す方法としては特に制限はなく、公知の方法が使用できる。例えば、日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、ｐ１０５（広瀬進）、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ編，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５４，ｐ．３５０＆ｐ．３６７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｒ．Ｗｕ，Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ編，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００，ｐ．４５７＆ｐ．４６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｊ．Ａ．Ｗｅｌｌｓら，“Ｇｅｎｅ”，Ｖｏｌ．３４，ｐ．３１５（１９８５）；Ｔ．Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍら，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ”，Ｖｏｌ．１３，ｐ．３３０５（１９８５）；Ｊ．Ｔａｙｌｏｒら，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．”，Ｖｏｌ．１３，ｐ．８７６５（１９８５）；Ｒ．Ｗｕ編，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５５，ｐ．５６８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ａ．Ｒ．Ｏｌｉｐｈａｎｔら，“Ｇｅｎｅ”，Ｖｏｌ．４４，ｐ．１７７（１９８６）に記載の方法が挙げられる。具体的には、例えば、合成オリゴヌクレオチド等を利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法）、Ｋｕｎｋｅｌ法、ｄＮＴＰ［αＳ］法（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）法、亜硫酸や亜硝酸等を用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
【００５２】
また、多くのタンパク質には糖鎖が付加されている場合があり、アミノ酸を１若しくは複数置換することにより糖鎖の付加を調節することができる。従って、配列表の配列番号７８に記載のアミノ酸配列において、前記糖鎖の調節されたタンパク質も上述のアミノケトン不斉還元活性を有する限りは、本発明のアミノケトン不斉還元酵素に包含される。
【００５３】
さらに本発明のアミノケトン不斉還元酵素は、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例えば、ペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ等の酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体に改変することができる。
【００５４】
また、遺伝子組換え法で製造する時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるいは生体外で天然のアミノケトン不斉還元酵素と実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。この場合、遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、こうした融合タンパク質はその融合部を利用してアフィニティークロマトグラフィー等で精製することも可能である。タンパク質の構造の修飾・改変等は、例えば日本生化学会編、「新生化学実験講座１、タンパク質ＶＩＩ、タンパク質工学」、東京化学同人（１９９３）を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができる。
【００５５】
さらに、本発明のアミノケトン不斉還元酵素は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然のものと異なるものであってもよい。本発明は、天然のアミノケトン不斉還元酵素に特有なアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個等）欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸残基の１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個等）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個等）のアミノ酸残基が付加されている付加類縁体も包含する。天然のアミノケトン不斉還元酵素の特徴であるドメイン構造を有しているものも包含されてよい。また、同質のアミノケトン不斉還元酵素活性を有するものも挙げられる。
【００５６】
天然のアミノケトン不斉還元酵素の特徴であるドメイン構造が維持されていれば、上記のごとき変異体は、全て本発明のアミノケトン不斉還元酵素に包含される。また本発明の天然のアミノケトン不斉還元酵素と実質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さらに天然のアミノケトン不斉還元酵素と実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。こうした本発明のアミノケトン不斉還元酵素は、下記で説明するように分離・精製処理されることができる。一方では、こうして本発明は上記したポリペプチドをコードするＤＮＡ断片、そして天然の特性の全部あるいは一部を有するアミノケトン不斉還元酵素のポリペプチド、さらにその類縁体あるいは誘導体をコードするＤＮＡ断片も包含する。該アミノケトン不斉還元酵素のヌクレオチドは、修飾（例えば、付加、除去、置換等）されることもでき、そうした修飾されたものも包含されてよい。
【００５７】
本発明のアミノケトン不斉還元酵素遺伝子は、上記のアミノケトン不斉還元酵素をコードする核酸である。代表的には、配列表の配列番号７８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、特に配列番号７９に記載の塩基配列を有する核酸が挙げられるが、一つのアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）は複数存在するため配列番号７８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸は多数存在する。従って、このような核酸も本発明のアミノケトン不斉還元酵素遺伝子に包含される。ここで、「タンパク質をコードする」とは、ＤＮＡが２本鎖である場合には、相補２本鎖のいずれか一方がタンパク質をコードする塩基配列を有するものを含むことを意味するため、本発明の核酸には配列番号７８に記載のアミノ酸配列を直接コードする塩基配列からなる核酸若しくはその相補的な塩基配列からなる核酸も包含される。さらに、本発明にかかるアミノケトン不斉還元酵素遺伝子は、配列番号７９と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、前記定義と同一である。
【００５８】
補酵素再生系酵素遺伝子は、各種脱水素酵素、すなわちグルコース脱水素酵素、グルコース６リン酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、有機酸脱水素酵素及びアミノ酸脱水素酵素などが挙げられる。より具体的には、アセトアルデヒド脱水素酵素、エタノール脱水素酵素、プロパノール脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、酢酸脱水素酵素、酪酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素及びグルタミン酸脱水素酵素などが適宜利用される。
【００５９】
本発明の形質転換体は、上記ベクターを含むことを特徴とする。形質転換体は、宿主細胞に上記ベクターを導入することにより得られる。ベクターの導入方法は公知の方法、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などで行うことが可能である。
【００６０】
例えば、アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入されたベクターを含む本発明の形質転換体は、アミノケトン不斉還元活性を有しており、下記のアミノケトン不斉還元酵素の製造方法や光学活性アミノアルコールの製造方法に応用することが可能である。
【００６１】
本発明のアミノケトン不斉還元酵素の製造方法は、アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入されたベクターを含む形質転換体を該形質転換体が増殖可能な培地で培養する培養工程と、前記培養工程で得られた該形質転換体からアミノケトン不斉還元酵素を精製する精製工程と、を含むことを特徴とする。
【００６２】
前記培養の方法としては、使用する菌体が生育可能な条件であれば特に制限はなく公知の方法が使用でき、通常、炭素源、窒素源、その他養分を含む液体培地が使用される。培地の炭素源としては、上記菌体が利用可能であればいずれでも使用できる。具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン、デンプン、ソルビトール等の糖類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類およびその塩類、パラフィン等の炭化水素類、あるいはこれらの混合物等が使用できる。窒素源としては上記菌体が利用可能であればいずれでも使用できる。具体的には、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩；フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩；硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩；肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン等の無機または有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物等が使用できる。また、培地には、無機塩、微量金属塩、ビタミン類等の通常の培養に用いられる栄養源を適宜添加してもよい。また、必要に応じて、培地には、菌体の増殖を促進する物質、培地のｐＨ保持に有効な緩衝物質等を添加してもよい。
【００６３】
菌体の培養は、生育に適した条件下で行うことができる。具体的には培地のｐＨ３〜１０、好ましくは４〜９、温度０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で行うことができる。菌体の培養は、好気的または嫌気的条件下で行うことができる。培養時間は１０〜１５０時間が好ましいが、それぞれの菌体により適宜決められるべきである。
【００６４】
このようにして培養された菌体の培養液をろ過または遠心分離して、その菌体を水又は緩衝液でよく洗浄する。洗浄した菌体は適量の緩衝液に懸濁し、菌体を破砕する。破砕の方法としては特に制限はないが、例えば、乳鉢、ダイノミル、フレンチプレス、超音波破砕機等の機械的破砕法が挙げられる。得られた菌体の破砕液中より、固形物をろ過または遠心分離によって除去して得られた無細胞抽出液中のアミノケトン不斉還元酵素は酵素単離の常法によって採取される。
【００６５】
このような酵素単離の方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、例えば、硫酸アンモニウム沈殿法等の塩析；セファデックス等によるゲルろ過法；ジエチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基等を持つ担体等を用いたイオン交換クロマトグラフィー法；ブチル基、オクチル基、フェニル基等疎水性基を持つ担体等を用いた疎水性クロマトグラフィー法；色素ゲルクロマトグラフィー法；電気泳動法；透析；限外ろ過法；アフィニティークロマトグラフィー法；高速液体クロマトグラフィー法等により精製することができる。
【００６６】
さらに、前記酵素を固定化酵素として用いることもできる。このような方法としては特に制限はなく、公知の方法を用いることができるが、酵素又は酵素産生細胞を固定化したものが挙げられ、共有結合法や吸着法といった担体結合法、架橋法、包括法等により固定化できる。また、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート等の縮合剤を必要に応じて使用してもよい。また、他の固定化法としては、例えば、モノマーを重合反応でゲル化させて行うモノマー法；通常のモノマーよりも大きな分子を重合させるプレポリマー法；ポリマーをゲル化させて行うポリマー法；ポリアクリルアミドを用いた固定化；アルギン酸、コラーゲン、ゼラチン、寒天、κ−カラギーナン等の天然高分子を用いた固定化；光硬化性樹脂、ウレタンポリマー等の合成高分子を用いた固定化が挙げられる。
【００６７】
このようにして精製された酵素は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等）によって単一バンドが確認されれば精製が十分に行われたものと判断される。
【００６８】
本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法は、一般式（１）：
【化８】
（式中、
Ｘは同一又は異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基及びスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；
ｎは０〜３の整数を示し；
Ｒ１は低級アルキル基を示し；
Ｒ２，Ｒ３は同一又は異なっていてもよく、水素原子及び低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；
＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物に本発明の製造方法で得られるアミノケトン不斉還元酵素を作用させて一般式（２）：
【化９】
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記定義と同一）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめることを特徴とする。
【００６９】
まず、本発明にかかる一般式（１）で表されるα−アミノケトンについて説明する。
【００７０】
置換基Ｘについて説明する。前記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子などが挙げられる。
【００７１】
また、低級アルキル基としては炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。これらは、直鎖状または分枝状のいずれの構造を取っていてもよい。また、置換基として、フッ素原子や塩素原子などのハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アミノ基またはアルコキシ基などを有していてもよい。
【００７２】
保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基の保護基としては、水で処理して除去可能なもの、酸または弱塩基で除去可能なもの、水素添加にて除去可能なもの、ルイス酸触媒およびチオ尿素などで除去可能なものなどが挙げられ、前記保護基には、置換基を有していてもよいアシル基、置換基を有していてもよいシリル基、アルコキシアルキル基、置換基を有していてもよい低級アルキル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基およびトリチル基などが含まれる。
【００７３】
なお、前記アシル基には、アセチル基、クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基およびｐ−ニトロベンゾイル基などが含まれる。また、置換基として、ヒドロキシル基、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基およびハロゲン原子などを有していてもよい。前記シリル基には、トリメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基およびトリアリールシリル基などが含まれる。また、置換基として、アルキル基、アリール基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、ニトロ基およびハロゲン原子などの置換基を有していてもよい。前記アルコキシアルキル基には、メトキシメチル基および２−メトキシエトキシメチル基などが含まれる。前記低級アルキル基には炭素数１〜６のアルキル基が含まれ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。これらは直鎖状または分枝状のいずれの構造を取っていてもよい。また、置換基として、フッ素原子や塩素原子などのハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基、アミノ基およびアルコキシ基などを有していてもよい。
【００７４】
また、Ｘはニトロ基またはスルホニル基でもよく、具体的にはメチルスルホニル基などが挙げられる。
【００７５】
さらに、Ｘの数ｎは０〜３の整数であり、好ましくは０である。
【００７６】
また、前記一般式（１）中のＲ１は低級アルキル基を示す。このような低級アルキル基としては炭素数１〜６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。これらは直鎖状または分枝状のいずれの構造を取ってもよい。
【００７７】
Ｒ２、Ｒ３は水素原子または低級アルキル基を示す。前記低級アルキル基には炭素数１〜６のアルキル基が含まれ、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。これらは直鎖状または分枝状のいずれの構造を取ってもよい。
【００７８】
また、前記α−アミノケトン化合物の塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩などの無機酸の塩、または、酢酸、クエン酸などの有機酸の塩が挙げられる。
【００７９】
前記α−アミノケトンは、対応する１−フェニルケトン誘導体のα炭素をハロゲン化、例えば、ブロム化後、ブロム基などのハロゲンをアミンに置換することによって容易に合成できる（Ｇｅｒ．（Ｅａｓｔ），１１，３３２，Ｍａｒ．１２，１９５６）。
【００８０】
次に、本発明にかかる一般式（２）で表される光学活性アミノアルコールについて説明する。前記一般式（２）におけるＸ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記一般式（１）における定義と同一である。さらに所望の光学活性を有するβ−アミノアルコールとしては（１Ｓ，２Ｓ）アミノアルコールが挙げられる。（１Ｓ，２Ｓ）アミノアルコールの具体例として、ｄ−スレオ−２−メチルアミノ−１−フェニルプロパノール（ｄ−プソイドエフェドリン）、ｄ−スレオ−２−ジメチルアミノ−１−フェニルプロパノール（ｄ−メチルプソイドエフェドリン）、（１Ｓ，２Ｓ）−α−（１−アミノエチル）−ベンジルアルコール（ｄ−ノルプソイドエフェドリン）、（１Ｓ，２Ｓ）−１−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２−メチルアミノ−１−プロパノール、（１Ｓ，２Ｓ）−α−（１−アミノエチル）−２，５−ジメトキシ−ベンジルアルコール、（１Ｓ，２Ｓ）−１−（ｍ−ヒドロキシフェニル）−２−アミノ−１−プロパノール、（１Ｓ，２Ｓ）−１−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２−アミノ−１−プロパノール、（１Ｓ，２Ｓ）−１−フェニル−２−エチルアミノ−１−プロパノール、（１Ｓ，２Ｓ）−１−フェニル−２−アミノ−１−ブタノール、（１Ｓ，２Ｓ）−１−フェニル−２−メチルアミノ−１−ブタノールなどが挙げられる。
【００８１】
所望の光学活性を有する一般式（２）で表される光学活性アミノアルコールが生成する限り、アミノケトン不斉還元酵素を作用させる条件は特に限定されないが、当該酵素の至適ｐＨは８．１であり、至適温度は５５℃であることから、ｐＨ７〜９及び温度３０〜６５℃の条件で行うことが好ましい。
【００８２】
さらに、本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法は、一般式（１）：
【化１０】
で表されるα−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物に本発明の形質転換体を作用させて一般式（２）：
【化１１】
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめることを特徴とする。
【００８３】
前記反応を行う際の反応条件としては、例えば、液体培地で振盪培養した形質転換菌を集菌し、得られた菌体にアミノケトン水溶液（０．１〜１０％濃度）を加え、ｐＨを６〜８に調整しながら温度２０〜４０℃で数時間から１日反応させればよい。反応終了後、菌体を分離し、反応液中の生成物を単離することにより、光学活性アミノアルコールを得ることができる。ここで、形質転換菌の処理菌体（乾燥菌体や固定化菌体等）や形質転換菌から得られた酵素、又は、固定化酵素等も同様にして行うことが可能である。
【００８４】
また、本発明の光学活性アミノアルコールの製造方法においては、一般式（３）：
【化１２】
（式中、
Ａは下記式（Ｙ）又は（Ｚ）を表し、
【化１３】
（ここで、Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環又はＲ８と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表す。）、
【化１４】
（ここで、Ｒ５は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、若しくはＲ６又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ６は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環、Ｒ５又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ７は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）；Ｒ８は水素原子、カルボキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ４と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格、Ｒ６と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環を表し；Ｒ９は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアシル基、Ｒ５又はＲ６と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し；Ｒ１０は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
で表される化合物、又はその製薬学的に許容される塩あるいは溶媒和物をさらに添加して反応を行うことにより、より効率的に光学活性アミノアルコールの製造を行うことが可能である。
【００８５】
前記一般式（３）において、炭素数１〜３のアルキル基としては、直鎖状、分枝状のいずれであってもよく、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基などが挙げられる。また、炭素数１〜６のアルキル基としては、直鎖状、分枝状のいずれであってもよく、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基およびヘキシル基などが挙げられる。炭素数５〜１０の炭化水素環としてはシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニルおよびシクロデカニルなどが挙げられる。
【００８６】
ヘテロ原子１〜３個を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格において、ヘテロ原子としては窒素原子、酸素原子、硫黄原子などが挙げられ、特に好ましくは窒素原子、酸素原子が挙げられ、５〜８員環のヘテロ環状骨格としてはピロリジン、ピペリジン、イミダゾリジン、ピペラジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオフェンおよびモルホリンなどが挙げられる。
【００８７】
また、炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基としてはメチルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、イソプロピルオキシカルボニル基、イソブチルオキシカルボニル基およびｔ−ブチルオキシカルボニル基などが挙げられる。アシル基としてはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ピバロイル基、ベンゾイル基およびバレリル基などが挙げられる。前記の炭素数１〜３または炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基またはアシル基が置換基を有する場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の数に限定されないが、置換基としては、例えばフッ素原子や塩素原子などのハロゲン原子、ヒドロキシル基、アルキル基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ基、ニトロ基およびアリール基などが挙げられる。さらに、製薬学的に許容される塩としては塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸の塩、酢酸、クエン酸などの有機酸の塩、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、アンモニアなどの無機塩基の塩およびトリエチルアミン、シクロヘキシルアミンなどの有機塩基の塩が挙げられる。
【００８８】
このような一般式（３）で表される化合物としては、例えば、１−アセチルアミノ−２−ヒドロキシプロパン、１−メチルアミノ−２−ヒドロキシプロパン、１−アミノ−２−オキソプロパン、１−アミノ−２−ヒドロキシシクロペンタン、１−アミノ−２，３−ジヒドロキシプロパン、Ｌ−トレオニン、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、１−アミノ−２−オキソシクロヘキサン、モルホリン、３−ヒドロキシピロリジン、３−ヒドロキシピペリジン、２−アミノメチル−テトラヒドロフラン、１−（２−ヒドロキシプロピル）アミノ−２−ヒドロキシプロパン、１−ｔ−ブチロキシカルボニルアミノ−２−ヒドロキシプロパン、２−アミノ−３−ヒドロキシブタン、ＤＬ−セリン、１−アミノ−２−ヒドロキシプロパン、１−アミノ−２−ヒドロキシブタン、１−アミノ−２−ヒドロキシシクロヘキサンが挙げられる。これらのうち、不斉炭素原子を有する化合物においては、特に記載がない限り、光学活性体であっても、ラセミ体であってもよい。
【００８９】
これら活性誘導剤を培地中に添加することにより、菌体の活性が誘導され、その後の光学活性なβ−アミノアルコールの生成は、無添加時に比べ効率よく進行する。活性誘導剤は各々単独で用いてもよく、または複数の誘導剤の混合物で用いてもよい。このような活性誘導剤の添加量は、培地に対し０．０１〜１０重量％が望ましい。
【００９０】
本発明にかかるβ−アミノアルコールの製造における反応方法としては、前記一般式（１）に示されるα−アミノケトン化合物またはその塩のエナンチオマー混合物に前記菌体又は菌体から得られた酵素が作用して、対応する一般式（２）で示される光学活性β−アミノアルコール化合物を生成する方法であれば特に限定されず、原料であるα−アミノケトンの水溶液に、緩衝液または水などで洗浄した菌体を混合することで反応を開始する。
【００９１】
また、反応条件は一般式（２）で示される光学活性β−アミノアルコール化合物の生成を損なわない範囲で選択できる。菌体量は、乾燥菌体として、ラセミアミノケトンに対して好ましくは１００分の１〜１０００倍、より好ましくは１０分の１〜１００倍である。また、基質であるラセミアミノケトンの濃度は好ましくは０．０１〜２０％、より好ましくは０．１〜１０％である。さらに、反応液のｐＨは好ましくは５〜９、より好ましくは６〜８であり、反応温度は好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃である。また、反応時間は５〜１５０時間が好ましいが、それぞれの菌体により適宜決められるべきである。
【００９２】
また、反応をより効率的に進行させるために、グルコースなどの糖類、酢酸などの有機酸、グリセロールなどのエネルギー物質を添加することができる。これらは、各々単独で用いてもよく、それらの混合物で用いてもよい。添加量は、基質に対して好ましくは１００分の１〜１０倍量である。また、補酵素等を添加することもできる。補酵素としては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）などを単独または混合物で用いることができ、添加量はラセミアミノケトンに対して好ましくは１０００分の１〜５分の１倍量である。また、これら補酵素に加え、補酵素再生酵素、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼを添加することができ、添加量はラセミアミノケトンに対して好ましくは１０００分の１〜５分の１倍量である。また、補酵素再生酵素の基質、例えばグルコースを添加することもでき、添加量はラセミアミノケトンに対して好ましくは１００分の１〜１０倍量である。さらに、グルコースなどの糖類、酢酸などの有機酸、グリセロールなどのエネルギー物質、補酵素、補酵素再生酵素および補酵素再生酵素の基質をそれぞれ組み合せて用いてもよい。これらは、本来、菌体中に蓄積されているが、必要に応じてこれら物質を添加することにより、反応速度、収率等を上昇させることができる場合があり、適宜選択され得る。
【００９３】
さらに、反応液が上記になるように特定の塩を加え、その条件下で反応させると、未反応のα−アミノケトン異性体のラセミ化が促進され、菌体又は菌体から得られた酵素の基質となる鏡像異性体への変換をより効率的に進行させることができる。これにより、原料から５０％以上の高収率で目的のアミノアルコールが得られる傾向にある。
【００９４】
未反応のα−アミノケトンのラセミ化を促進する塩としては、酢酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、リン酸塩、炭酸塩、パラニトロフェノール塩、亜硫酸塩およびホウ酸塩などの弱酸の塩であればよいが、好ましくはリン酸塩（例えば、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素アンモニウム）、炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニウム）、クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸アンモニウム）などが使用される。また、これらの混合物も使用でき、ｐＨ６．０〜８．０の緩衝液として、最終濃度が０．０１〜１Ｍとなるよう添加することが望ましい。例えば、リン酸塩の場合、リン酸二水素ナトリウム及びリン酸一水素ナトリウムを、９対１から５対９５の割合で混合するとよい。
【００９５】
反応によって生成した光学活性α−アミノアルコールは、慣用の分離精製手段によって精製できる。例えば、反応液から直接または菌体を分離した後、膜分離、有機溶媒（例えばトルエン、クロロホルムなど）による抽出、カラムクロマトグラフィー、減圧濃縮、蒸留、晶析、再結晶などの通常の精製方法に供することにより、光学活性β−アミノアルコールを得ることができる。生成した光学活性β−アミノアルコールの光学純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定することができる。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明の技術範囲を限定するものではない。
【００９７】
（実施例１）プラスミドの分離精製
（１）方法
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌を５ｍＬのＧＰＹ培地（１％グルコース、０．５％バクトペプトン、０．３％イーストエキストラクト）に植菌し、２５℃で振盪培養した。対数増殖期に１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリン溶液を２５０μＬ添加し、２５℃で２時間振盪培養した。遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間）で集菌し、上清を取り除いた後、１ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で懸濁し、再度、遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間）で集菌し、上清を取り除いた。ＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した２５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬリゾチーム溶液で懸濁し、３７℃で３０分間放置した。その後、１００μＬの３Ｍ食塩水と２５μＬの１０％ＳＤＳを加え、−２０℃で一晩放置した。遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間）した上清に５０μｇ／ｍＬ ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ及び５０μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡをそれぞれ０．５μＬ加え、３７℃で１５分間放置した。その後、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液を添加し、遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間）を行った。上清に２．５倍量のエタノールを加え、遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間）し、５０μＬの滅菌水に沈殿を溶解した。プラスミドの確認は、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色した後、ＵＶ照射で行った。
【００９８】
（２）供試菌株及び結果
本実施例では、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属及びその類縁菌であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の各種入手可能な菌株から上記（１）の方法にしたがって、プラスミドの有無についてのスクリーニングを行った。
【００９９】
スクリーニングした菌株のうちプラスミドの保持を確認できたものを表３に示す。すなわち、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＩＡＭ１４００、ＩＡＭ１５０３、ＪＣＭ２８９３、ＪＣＭ２８９４及びＪＣＭ２８９５）さらに、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｎｉｉ（ＪＣＭ３２０３）において、それぞれ約５．４ｋｂｐ及び約５．８ｋｂｐのプラスミドを確認できた。これらのプラスミドを、表３に列挙された名称のように、ｐＲＥＴ１１００、ｐＲＥＴ１２００、ｐＲＥＴ１３００、ｐＲＥＴ１４００、ｐＲＥＴ１５００、ｐＲＥＴ１６００、ｐＲＥＴ１７００、ｐＲＥＴ１８００、ｐＲＥＴ０５００、ｐＲＥＴ１０００と命名した（表３）。
【０１００】
なお、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＩＡＭ１４００及びＩＡＭ１５０３は、東京大学分子細胞生物学研究所が発行した「ＩＡＭ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４」に記載されており、当該研究所から入手することができる。また、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＪＣＭ２８９３、ＪＣＭ２８９４及びＪＣＭ２８９５、並びにＲ．ｒｈｏｄｎｉｉ ＪＣＭ３２０３は、独立行政法人理化学研究所が発行した「ＪＣＭ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｔｒａｉｎｓ，Ｅｉｇｈｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００２」に記載されており、当該研究所から入手することができる。
【０１０１】
【表３】
【０１０２】
（実施例２）制限酵素サイトの特定
表３に示したプラスミドを分類するために各種制限酵素を用いて、制限酵素サイトを調べた。各プラスミドを実施例１に記載の方法で分離した後、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩ、ＳｐＨＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動することによりＤＮＡ断片を確認した。サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ（東洋紡）を使用した。サイズマーカーを基に、制限酵素で切断されるサイトの数とそのフラグメントの大きさを決定した。結果を表４にまとめた。
【０１０３】
【表４】
【０１０４】
上記解析の結果、表３のプラスミドは、ｐＲＥＴ１１００と同様の制限酵素サイトを保持するプラスミド類、ｐＲＥＴ１２００と同様の制限酵素サイトを保持するプラスミド類及びｐＲＥＴ１０００の３種類に分類された。
【０１０５】
（実施例３）プラスミドのシークエンス及び相同性検索
実施例２の結果から、プラスミドが３種類、すなわちｐＲＥＴ１０００、ｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１２００に分類されたので、それぞれのプラスミドのシークエンスを試みた。
【０１０６】
まず、塩基配列を決定するために、これらプラスミド類のクローニングを行った。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＩＡＭ１４００）については、プラスミド（ｐＲＥＴ１１００、ｐＲＥＴ１２００）を分離したあとＳｍａＩとＳａｃＩで消化した。０．８％アガロースゲルで電気泳動し、ＤＮＡ断片を確認したところ、約０．５ｋｂｐ、約１．７ｋｂｐ、約３．７ｋｂｐ、約４．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を確認できた。これらのＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてアガロースゲルから回収し、インサートＤＮＡとした。一方、ベクターＤＮＡとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）をＳｍａＩ単独で又はＳｍａＩ及びＳａｃＩで消化したものを用いた。インサートＤＮＡとベクターＤＮＡをＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。得られた形質転換体をＧＦＸ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてスクリーニングし、各々のクローンを得た。
【０１０７】
一方、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｎｉｉ（ＪＣＭ３２０３）についてはプラスミド（ｐＲＥＴ１０００）を分離した後、ＢａｍＨＩで消化した。０．８％アガロースゲルで電気泳動したところ、約２．０ｋｂｐ、約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を確認できた。これらのＤＮＡ断片を上記のＫｉｔを用いてゲルから回収し、インサートＤＮＡとした。ベクターＤＮＡはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（−）をＢａｍＨＩで消化したものを用いた。
【０１０８】
プラスミドのインサートの塩基配列決定は、プライマーウォーキング法で行った。機器はＡＢＩ ＰＲＩＳＭＴＭ ３１０ＮＴ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、酵素はＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＡＢＩ製）を使用した。
【０１０９】
まず、Ｐ７（Ｍ１３ ｆｏｒｗａｒｄ、東洋紡）プライマー及びＰ８（Ｍ１３ ｒｅｖｅｒｓｅ、東洋紡）プライマーを用いてインサートの塩基配列の一部を解読した。次に解読した配列内にプライマーを設計（配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏを使用；日立ソフトウェア社）し、設計したプライマー（合成オリゴＤＮＡ）を用いてさらに塩基配列を解読した。この手順を、インサートの塩基配列が全て解読できるまで繰り返した。インサートの塩基配列解読が終了したあと、これらのインサートがどのように連結しているかを解析するために、各々のインサートの末端にベクター方向に反応が行われるようプライマーを設計し、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＩＡＭ１４００）から分離したプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行った（ＫＯＤ Ｐｌｕｓを使用）。そのＰＣＲ産物をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、ＰＣＲに使用したプライマーと同じプライマーを使用してシーケンスを行いインサートの整列を解析した。
【０１１０】
シークエンスの結果、ｐＲＥＴ１１００は５４４４ｂｐからなり、そのＧ＋Ｃ含量は５９％であることが分かった。決定された全塩基配列を配列表の配列番号７３に示す。ｐＲＥＴ１２００は、５４２１ｂｐからなり、Ｇ＋Ｃ含量は６２％であった。ｐＲＥＴ１０００は、５８１３ｂｐからなり、Ｇ＋Ｃ含量は６７％であった。決定された全塩基配列を配列表の配列番号７４に示す。
【０１１１】
これらの決定された塩基配列をＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏを用いて、相同性検索を行ったところ、ｐＲＥＴ１０００及びｐＲＥＴ１１００は新規のプラスミドであることが判明した。一方、ｐＲＥＴ１２００は、ｐＮ３０（Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＦ３１２２１０）と約９９．６％（ｐＲＥＴ１２００を基に計算）相同性があった。
【０１１２】
さらに、ｐＲＥＴ１０００及びｐＲＥＴ１１００について、決定された塩基配列を基にＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏを使用して、公知プラスミドとの比較を行った。その結果、両方のプラスミドについて、全ての制限酵素サイトが一致するプラスミドは検出されなかった。
【０１１３】
（実施例４）塩基配列の解析
ｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１０００の塩基配列を解析した結果を以下に示す。
【０１１４】
ｐＲＥＴ１１００には以下のｏｒｆが見出された：
配列番号７３に記載の塩基配列上、２０２番目、２３８番目又は３３７番目から４８０番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１（配列番号１、配列番号２又は配列番号３）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、４７７番目から７５８番目までの塩基配列からなるｏｒｆ２（配列番号４）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、８６２番目、１２９４番目、１４５０番目、１４６２番目、１４８６番目、１４８９番目、１５１３番目、１６３０番目、１６４５番目、１６８７番目、２２２４番目又は２２２７番目から２４０９番目までの塩基配列からなるｏｒｆ３（配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、１８７５番目、１７３４番目、１７０１番目、１６７４番目又は１５８１番目から１４４４番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ４（配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、２８２８番目、２７９２番目、２７４７番目、２５９４番目又は２５４０番目から２４０６番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ５（配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５又は配列番号２６）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、２９７１番目又は３０４９番目から３３０６番目までの塩基配列からなるｏｒｆ６（配列番号２７又は配列番号２８）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、３５７７番目又は３５７１番目から３０５３番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ７（配列番号２９又は配列番号３０）；
配列番号７３に記載の塩基配列上、３３３９番目又は３６４８番目からそれぞれ３９０２番目までの塩基配列からなるｏｒｆ８（配列番号３１又は配列番号３２）；及び
配列番号７３に記載の塩基配列上、４３６６番目又は４４７７番目から５０３４番目までの塩基配列からなるｏｒｆ９（配列番号３３又は配列番号３４）。
【０１１５】
ｐＲＥＴ１０００には以下のｏｒｆが見出された：
配列番号７４に記載の塩基配列上、３３５０番目、３２５１番目、２９４５番目又は２８４９番目から２４１２番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ１０（配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０又は配列番号４１）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、２３６５番目又は２３３２番目から２１５９番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ１１（配列番号４２又は配列番号４３）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、３１９７番目から３５２６番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１２（配列番号４４）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、４０３５番目又は３９９６番目から３６７９番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ１３（配列番号４５又は配列番号４６）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、４６２１番目、４６５４番目又は４６６６番目から４８３０番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１４（配列番号４８、配列番号４９又は配列番号５０）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、５１６１番目又は５０６２番目から４７０９番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ１５（配列番号５１又は配列番号５２）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、２３３１番目又は２３３４番目から２６１８番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１６（配列番号５３又は配列番号５４）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、２９０７番目から３２４２番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１７（配列番号５５）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、１６５０番目、１６８９番目、１７１３番目、１８２７番目又は１８７５番目から２１６２番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１８（配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、１９０６番目から２１６９番目までの塩基配列からなるｏｒｆ１９（配列番号６１）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、８１０番目から５５３番目までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるｏｒｆ２０（配列番号６２）；
配列番号７４に記載の塩基配列上、１１７番目、１４７番目、３０６番目、４５６番目、５１４４番目、５２７６番目又は５５３４番目から６５６番目までの塩基配列からなるｏｒｆ２１（配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８又は配列番号６９）。
【０１１６】
ｐＲＥＴ１１００におけるＤＮＡ複製領域は、配列番号３５に記載の塩基配列（２４１０番目から３２００番目）、配列番号３６に記載の塩基配列（１０００番目から１５００番目）又は配列番号３７に記載の塩基配列（５０００番目から５００番目）で示される領域である。ｐＲＥＴ１０００におけるＤＮＡ複製領域は、配列番号７０に記載の塩基配列（３３５５番目から３５０７番目）、配列番号７１に記載の塩基配列（４２９０番目から４３５０番目）又は配列番号７２に記載の塩基配列（３５７０番目から３８９４番目）で示される領域である。
【０１１７】
ｐＲＥＴ１０００（配列番号７４）の塩基配列上、５１４４番目から６５６番目の塩基配列（配列番号６７）の領域及び４３８１番目から４８３０番目の塩基配列（配列番号４７）の領域は、ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（接合タンパク質）と相同性があり、接合に関与することが示唆された。
【０１１８】
さらに、ｐＲＥＴ１０００（配列番号７４）の塩基配列上、４２６０番目から４３３９番目の塩基配列（配列番号７５）の領域ではＤＮＡの二次構造が推定され、上記ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の発現や発現したタンパク質の認識部位であることが示唆された。
【０１１９】
一方、ｐＲＥＴ１１００（配列番号７３）の塩基配列上、７６１番目から８６８番目の塩基配列（配列番号７６）の領域は、複製に関係するタンパク質の発現に関与するプロモーターであることが示唆された。
【０１２０】
（実施例５）シャトルベクターの構築
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌と大腸菌間のシャトルベクターを構築するために、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌のプラスミドｐＲＥＴ１０００、ｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１２００と大腸菌のプラスミドｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９及びｐＨＳＧ３９８を使用して以下の実験を行った。
【０１２１】
まず、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓのプラスミドからＤＮＡフラグメントを調製した。すなわち、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＩＡＭ１４００）からプラスミドｐＲＥＴ１１００及びｐＲＥＴ１２００を取得した後、Ａｌｗ４４Ｉを用いてｐＲＥＴ１１００を３７℃で２時間消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて平滑末端化することにより、一方ｐＲＥＴ１２００はＢｓｐＬＵ１１Ｉを用いて４８℃で２時間消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈを用いて平滑末端化することにより、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓプラスミドのＤＮＡフラグメントを得た。各々のＤＮＡフラグメントをＴＥ溶液に溶解した。
【０１２２】
一方、ｐＲＥＴ１０００については、Ｒ．ｒｈｏｄｎｉｉ（ＪＣＭ３２０３）からプラスミドｐＲＥＴ１０００を取得した後、ＤｒｄＩを用いてｐＲＥＴ１０００を３７℃で２時間消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈを用いて平滑末端化することによりｐＲＥＴ１０００のＤＮＡを得、これをＴＥ溶液に溶解した。
【０１２３】
次にＥ．ｃｏｌｉプラスミドからＤＮＡフラグメントを調製した。すなわちｐＵＣ１８（アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）含有）はＳｍａＩを用いて３０℃で２時間消化することにより、ｐＨＳＧ２９９（カナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍｒ）含有）及びｐＨＳＧ３９８（クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍｒ）含有）はＨｉｎｃＩＩを用いて３７℃で２時間消化することにより、Ｅ．ｃｏｌｉのプラスミドのＤＮＡフラグメントを得、ＴＥに溶解した。
【０１２４】
上記のように調製したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌のプラスミドからのＤＮＡフラグメントをライゲーションした後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換して、３０μＬの０．１ＭＩＰＴＧ（イソプロピル−β−ガラクトシド）と４％のＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を塗布した、１００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン又は３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢ（１％トリプトファン、０．５％イーストエキストラクト、１％塩化ナトリウム；ｐＨ７．２）寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し１００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン又は３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢ液体培地で３０℃、６０時間振盪培養した。得られた培養液からＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製、商品添付資料の条件で精製）を用いてＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。得られたシャトルベクターを表５に、ｐＲＥＴ１１００を用いた各シャトルベクターの作製方法を図３〜５に示す。
【０１２５】
【表５】
【０１２６】
ｐＲＥＴ１１００とｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９又はｐＨＳＧ３９８とで構成されるシャトルベクターを、それぞれ、ｐＲＥＴ１１０１（配列番号８９）、ｐＲＥＴ１１０２（配列番号９０）又はｐＲＥＴ１１０３（配列番号９１）と命名した。なお、ｐＲＥＴ１１０１はアンピシリン耐性、ｐＲＥＴ１１０２はカナマイシン耐性、ｐＲＥＴ１１０３は、クロラムフェニコール耐性を示すシャトルベクターである。また、ｐＲＥＴ１１０１〜１１０３のそれぞれの大腸菌遺伝子とｐＲＥＴ１１００の結合の仕方が反対（Ｒｖ）のシャトルベクターを、それぞれｐＲＥＴ１１０１Ｒｖ（配列番号９２）、ｐＲＥＴ１１０２Ｒｖ（配列番号９３）及びｐＲＥＴ１１０３Ｒｖ（配列番号９４）と命名した。
【０１２７】
同様に、ｐＲＥＴ１０００及びｐＲＥＴ１２００を用いて構築したシャトルベクターをそれぞれｐＲＥＴ１００１〜ｐＲＥＴ１００３（配列番号９５〜配列番号９７）及びｐＲＥＴ１００１Ｒｖ〜ｐＲＥＴ１００３Ｒｖ（配列番号９８〜配列番号１００）並びにｐＲＥＴ１２０１〜ｐＲＥＴ１２０３及びｐＲＥＴ１２０１Ｒｖ〜ｐＲＥＴ１２０３Ｒｖと命名した（表５）。
【０１２８】
（実施例６）Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓへの形質転換方法の検討
実施例５で得られたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌−Ｅ．ｃｏｌｉのシャトルベクターを用いて、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株（ＭＡＫ−３４；受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−７４５１、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）にて平成１３年２月１５日に受託）を形質転換した。遺伝子導入方法としてエレクトロポレーション法を検討した。
【０１２９】
まず、５ｍＬのＧＰＹ培地にＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株を植菌し、３０℃で３６時間振盪培養した。その培養液１ｍＬを１００ｍＬのＬＢ培地に植え継ぎ、３０℃で１０時間、２００ｒｐｍで培養した。培養した菌体を遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間、４℃）により回収し、回収した菌体を超純水で２回洗浄した。洗浄し終えた菌体を遠心分離（１２ｋｒｐｍ、５分間、４℃）により回収し、２．４ｍＬの１０％グリセロール溶液に懸濁した。懸濁液を３００μＬずつ分注し、−８０℃で凍結してコンピテントセルとした。
【０１３０】
作製したコンピテントセル９０μＬとシャトルベクター（ｐＲＥＴ１００１、ｐＲＥＴ１００２、ｐＲＥＴ１００３、ｐＲＥＴ１１０１、ｐＲＥＴ１１０２、ｐＲＥＴ１１０３、ｐＲＥＴ１２０１、ｐＲＥＴ１２０２及びｐＲＥＴ１２０３）５μＬとを氷上で混合した。混合溶液を氷上で冷却した０．１ｃｍのキュベットに静かに流し込み、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）にセットした。２０ｋＶ／ｃｍ、４００Ω、２５μＦでパルスし、直ちに３００μＬのＬＢ培地を加え、２５℃で３時間放置した。
【０１３１】
その菌懸濁液の一部を、抗生物質を含むＬＢプレート（１００μｇ／ｍＬのカナマイシン、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン又は３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）にプレーティングした。その結果、カナマイシン耐性遺伝子を持つｐＲＥＴ１００２、ｐＲＥＴ１１０２及びｐＲＥＴ１２０２を用いた場合にコロニーが得られた。また、この得られたコロニーがプラスミドを保持しているかを確認するために、プラスミドを分離して確認したところ、すべてシャトルベクターを保持していた。
【０１３２】
以上から、エレクトロポレーションによってＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを形質転換できるということ、並びにｐＲＥＴ１００２、ｐＲＥＴ１１０２及びｐＲＥＴ１２０２がシャトルベクターとして機能していることが示唆された。
【０１３３】
（実施例７）アミノケトン不斉還元酵素遺伝子（ｍａｋ ｇｅｎｅ）の取得
表５に示したシャトルベクターにｍａｋ ｇｅｎｅを挿入するために、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株からｍａｋ ｇｅｎｅを単離した。
【０１３４】
最初に、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株のゲノムＤＮＡの取得を行った。５ｍＬのＧＰＹ培地にＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株を植菌し、３０℃で４８時間振盪培養した後、その培養液を１００ｍＬのＧＰＹ培地に植え継ぎ、３０℃で１０時間、２００ｒｐｍで培養した。Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｂｕｆｆｅｒ ｓｅｔ及びＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ５００／Ｇ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを取得した。
【０１３５】
次に、取得したゲノムＤＮＡを鋳型としてＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いてＰＣＲを行った。プライマーはＭＡＫＦ１（５’−ＧＡＡＴＣＴＴＣＴＣＧＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡＧＧＴＣ−３’；配列番号８０）とＭＡＫＲ２（５’−ＣＴＧＡＣＴＣＣＧＴＡＧＴＧＴＴＣＴＧＣＣＡＧＴＴＣ−３’；配列番号８１）、アニール温度６８℃、伸長反応１分５０秒でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルム処理及びエタノール沈澱した後、ＳｍａＩを用いて３０℃で２時間消化したｐＵＣ１８と混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、３０μＬの０．１Ｍ ＩＰＴＧと４％のＸ−ｇａｌを塗布したＬＢ寒天培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有）にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３０℃、６０時間振盪培養した。得られた培養液からＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ精製した。得られたＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。得られたクローンをｐＭＡＫ−１と命名した。
【０１３６】
（実施例８）発現ベクターの構築−１
表５に示したシャトルベクターにプロモーター及びアミノケトン不斉還元酵素遺伝子（ｍａｋ ｇｅｎｅ）を挿入した。
【０１３７】
まず、ｍａｋ ｇｅｎｅの上流約４００ｂｐを含む発現ベクター（外来プロモーター無し）のプラスミドを構築した。
【０１３８】
ｐＭＡＫ−１を、ＳｍａＩを用いて３０℃で２時間消化し、さらにＰｓｔＩを用いて３７℃で２時間消化した。その溶液を０．８％アガロースゲルで電気泳動に供した。ＤＮＡサイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用した。電気泳動後、約１．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントをＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、それをインサートＤＮＡとして使用した。一方、ベクターはｐＲＥＴ１１０２をＨｉｎｃＩＩ及びＰｓｔＩを用いて３７℃で２時間消化したものを使用した。これらのＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションし、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。
【０１３９】
出現したコロニーを１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で３０℃、６０時間振盪培養した。得られた培養液からＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ精製した。得られたＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１４０】
スクリーニングは、得られたＤＮＡを制限酵素処理していないもの及びＰｓｔＩを用いて３７℃２時間消化したものを０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、得られたＤＮＡのサイズから目的のプラスミドを得た。その際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ、ｐＲＥＴ１１０２及びＰｓｔＩを用いて３７℃２時間消化したｐＲＥＴ１１０２を用いた。このようにして得たプラスミドをｐＲＥＴ１１０４と命名した。
【０１４１】
（実施例９）発現ベクターの構築−２
発現ベクターの改良、遺伝子改変、形質転換効率向上及び菌体内における複製などにおいてベクターの縮小は有効であるため、シャトルベクターの縮小を行った。
【０１４２】
まず、シャトルベクターｐＲＥＴ１１０２の縮小を行った。ｐＲＥＴ１１０２をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｃＩＩで２時間消化したあと０．８％アガロース電気泳動に供し、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて回収し、ｐＲＥＴ１１０２のＤＮＡ断片を調製した。この際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用した。
【０１４３】
一方、大腸菌で複製するＤＮＡ断片は、ｐＨＳＧ２９９をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｃＩＩで２時間消化したあと０．８％アガロース電気泳動に供し、約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて回収することにより調製した。
【０１４４】
これらのＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションし、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、３０μＬの０．１Ｍ ＩＰＴＧと４％のＸ−ｇａｌを塗布した１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で４８時間放置した。
【０１４５】
出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で３０℃４８時間振盪培養した。得られた培養液からＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてＤＮＡを精製した。このようにして得たｐＲＥＴ１１０２の縮小シャトルベクターをｐＲＥＴ１１２３（約５．３ｋｂｐ）と命名した。
【０１４６】
次に、シャトルベクターｐＲＥＴ１２０２の縮小を行った。ロドコッカス属菌由来のＤＮＡ断片は、ｐＲＥＴ１２０２をＥｃｏＲＩで２時間消化し、さらにＤｒａＩＩＩで２時間消化した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈを用いて平滑末端化し、０．８％アガロース電気泳動に供した後約３．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて回収することにより調製した。この際、サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用した。このＤＮＡ断片をｐＨＳＧ２９９のＨｉｎｃＩＩサイトへ挿入した。ライゲーション後、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、３０μＬの０．１Ｍ ＩＰＴＧと４％のＸ−ｇａｌを塗布した１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で７２時間放置した。出現したコロニーのうち白色のコロニーを選択し、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地中、３０℃で７２時間振盪培養した。得られた培養液からＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ精製した。スクリーニングにより得られたプラスミドをＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ又はＥｃｏＲＩで２時間消化したところ、すべてのクローンがロドコッカス属菌由来の領域のうち、ＥｃｏＲＩサイト側が約５００ｂｐ削られていた。このプラスミドをｐＲＥＴ１２０４（約５．９ｋｂｐ）と命名した。なお、ロドコッカス属菌複製領域が削れていないクローンについては取得できなかった。
【０１４７】
同様に、シャトルベクターｐＲＥＴ１００２の縮小をおこない、ｐＲＥＴ１００６（約４．９ｋｂｐ）を得た。
【０１４８】
これら３種類の縮小プラスミド、ｐＲＥＴ１００６、ｐＲＥＴ１１２３及びｐＲＥＴ１２０４でＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを形質転換し、実施例６記載の方法でシャトルベクターの保持の有無を確認したところ、シャトルベクターを保持していることを確認した。このことから、３種類の縮小プラスミド、ｐＲＥＴ１００６、ｐＲＥＴ１１２３及びｐＲＥＴ１２０４はＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓにおいて複製することが示唆された。
【０１４９】
（実施例１０）発現ベクターの構築−３
実施例９で構築したシャトルベクターへｍａｋ ｇｅｎｅを挿入し発現ベクターを構築した。
【０１５０】
プロモーターを１段階でクローニングするために実施例９で構築したｐＲＥＴ１１２３のＰｓｔＩサイトを欠損させた。ｐＲＥＴ１１２３をＰｓｔＩで２時間消化した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈを用いて平滑末端化し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションした。その溶液をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｈｉｇｈを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレートで３０℃、３６時間培養した。形成されたコロニーを１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で２４時間培養した後、ＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ精製し、ｐＲＥＴ１１３２とした。
【０１５１】
なお、取得したｐＲＥＴ１１３２に関し、ＰｓｔＩで１時間消化した後、０．８％アガロース電気泳動に供し、ｐＲＥＴ１１３２がＰｓｔＩで切断されないことを確認した。このときコントロールとして、ＰｓｔＩ処理していないｐＲＥＴ１１２３及びｐＲＥＴ１１３２と、ＰｓｔＩ処理したｐＲＥＴ１１２３とを使用した。
【０１５２】
（実施例１１）発現ベクターの構築−４
前述のシャトルベクターにプロモーター及びｍａｋ ｇｅｎｅを挿入したクローンを構築した。
【０１５３】
プロモーターを挿入するためにｍａｋ ｇｅｎｅ上流にＰｓｔＩサイトを持つクローンを構築した。アミノケトン不斉還元酵素のＣ末端にＨｉｓ−Ｔａｇが付加したクローンを得るために、以下の操作を行った。実施例７で得られたｐＭＡＫ−１を鋳型として、ＭＡＫＰｓｔＦ（５’−ＧＡＣＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＡＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＧＴＣＣ−３’；配列番号８２）及びＭＡＫＨｉｓＢｇｌＩＩＲ（５’−ＣＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＣＣＧＡＧＣＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧ−３’；配列番号８３）をプライマーとし、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いてアニール温度６８℃、伸長反応１分５０秒でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩを用いて３７℃で２時間消化したＰＣＲ断片（インサート）と、ｐＱＥ７０（ＳｐＨＩを用いて３７℃で２時間消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈを用いて平滑末端化し、そしてＢｇｌＩＩを用いて３７℃で２時間消化した）とをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションし、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃で６０時間放置した。出現したコロニーを１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ液体培地で３０℃６０時間振盪培養した。培養液からＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてＤＮＡ精製した。得られたＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【０１５４】
スクリーニングは、得られたＤＮＡを制限酵素処理していないもの及びＰｓｔＩ及びＢｇｌＩＩを用いて３７℃２時間消化したものを０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、得られたＤＮＡのサイズから目的のプラスミドを得た。このようにして得られたプラスミドをｐＭＡＫ−２と命名した。サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ、ｐＱＥ７０及びＢｇｌＩＩを用いて３７℃２時間消化したｐＱＥ７０を用いた。
【０１５５】
このうち、ｐＭＡＫ−２のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩサイトにｐＲＥＴ１２００のＲｅｐＡプロモーター（ｐＲＥＴ１２０４のうち、ロドコッカス属菌由来ＤＮＡ断片にコードされているｒｅｐＡの向きが、ｐＨＳＧ２９９にコードされているカナマイシン耐性遺伝子と同じ向きのクローンを鋳型とし、Ｐ１２００ｒｅｐ−Ｐｓｔ５１９５（５’−ＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧ−３’；配列番号８４）とＰ７（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’；配列番号８５）をプライマーとし、アニーリング温度６０℃、伸長反応１分間でＰＣＲ増幅した後、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩを用いて３７℃で２時間消化したもの）を挿入したクローンを構築した（ｐＭＡＫ−１９と命名した）。
【０１５６】
次に、ｐＭＡＫ−１９を鋳型とし、ｐＱＥ７０Ｆ１（５’−ＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣ−３’；配列番号８６）及びｐＱＥ７０Ｒ１１３５Ｂｍ（５’−ＧＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＡＣＧＣＧＣＧＡＧＧＣＡＧ−３’；配列番号８７）をプライマーとし、ＰＣＲ酵素にＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を使用してアニーリング温度６０℃伸長反応３分間でＰＣＲを行った。その反応液からＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＰＣＲ産物を精製し、精製したＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで２時間消化した後、０．８％アガロース電気泳動に供し、ＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。そのＤＮＡ断片をインサートとした。
【０１５７】
一方、発現シャトルベクターに用いるベクターは、ｐＲＥＴ１１３２をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで２時間消化したＤＮＡ断片を０．８％アガロース電気泳動に供し、ＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製したＤＮＡ断片を用いた。これらインサートとベクターを混合しＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションした後、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｈｉｇｈを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレートにプレーティングした。得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養した後、ＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを回収し、０．８％アガロース電気泳動を行うことによりスクリーニングを行った。サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ及びｐＲＥＴ１１３２を用いた。こうして得た発現ベクターをｐＲＥＴ１１３３と命名した。
【０１５８】
また、ｐＭＡＫ−１９をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで３７℃、２時間消化した後、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈを用いて平滑末端化し、０．８％アガロース電気泳動に供し、約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。この断片をｐＲＥＴ１１０２のＨｉｎｃＩＩサイトに挿入したクローンをｐＲＥＴ１１１４と命名した。
【０１５９】
さらに、ｐＲＥＴ１１３３のプロモーターの改良を行った。ｐＲＥＴ１１３３にコードされているＭＡＫ遺伝子を発現させるプロモーターは、ｐＲＥＴ１２００のｒｅｐＡ遺伝子のプロモーターで約８００ｂｐの長さであるが、このプロモーターを約２００ｂｐ欠損させたプラスミドを構築した。そのクローニングに使用したプロモーターの調製はＰＣＲで行った。プラスミドｐＲＥＴ１２００を鋳型とし、プライマーにＰ１２０４ｒｅｐ−Ｅｃ２９５８（５’−ＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣＧＣＡＣＡＣＣＧＣＡＣ−３’；配列番号８８）及びＰ１２００ｒｅｐ−Ｐｓｔ５１９５（５’−ＡＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＣＡＴＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧ−３’；配列番号８４）を使用し、ＰＣＲ酵素にＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いて、アニーリング温度６０℃、伸長反応５０秒間でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで２時間消化した後、１．６％アガロース電気泳動に供し、ＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。そのＤＮＡ断片をインサートとした。このＤＮＡ断片に含まれるプロモーター領域の塩基配列を、配列番号７７に示した。
【０１６０】
一方、ベクターについては、ｐＲＥＴ１１３３を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで２時間消化した後、０．８％アガロース電気泳動に供し、約７．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＧＦＸＴＭ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔを使用した。
【０１６１】
このようにして得たインサートとベクターをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いてライゲーションし、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｈｉｇｈを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレートにプレーティングした。得られたコロニーを１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養した後、ＧＦＸＴＭ Ｍｉｃｒｏ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてプラスミドＤＮＡを回収し、０．８％アガロース電気泳動を行うことによりスクリーニングした。サイズマーカーはＬｏａｄｉｎｇ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒ λ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔ及びｐＲＥＴ１１３３を用いた。
【０１６２】
更に、得られたＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで２時間消化した後、１．６％アガロース電気泳動を行い、約６００ｂｐのインサートに相当するＤＮＡ断片を確認した。サイズマーカーは１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒを使用した。このようにして得た発現ベクターをｐＲＥＴ１１３８と命名した。
【０１６３】
（実施例１２）組換えＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓの形質転換及び活性測定
前述の発現ベクターｐＲＥＴ１１０２、ｐＲＥＴ１１０４、ｐＲＥＴ１１１４及びｐＲＥＴ１１３８を用いてＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株及びＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＪＣＭ２８９５（独立行政法人 理化学研究所より分譲）を形質転換し、活性測定を行った。ＭＡＫ−３４株から精製されるアミノケトン不斉還元酵素は、国際公開ＷＯ０２／０７０７１４に記載のように、１−２−メチルアミノ−１−フェニル−１−プロパノンに作用し、ｄ−（１Ｓ，２Ｓ）−プソイドエフェドリンを生成する能力を持っている。その他、１−２−ジメチルアミノプロピオフェノン、１−アミノ−２−ブタノン等にも作用し、それぞれ対応したβ−アミノアルコールの生成が確認されている。
【０１６４】
活性測定は、菌量Ｏ．Ｄ．＝５、２％グルコース及び０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）になるように反応液を調製し、その反応中に基質として３％の（１Ｓ，２Ｓ）−２−（Ｎ−エチルアミノ）−１−フェニル−１−プロパノール（ＥＡＭ）を含有するようにした。ＥＡＭは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．５０，ｐｐ．２２８７−２２９２，１９２８にその合成方法が記載されている。反応液を３０℃で１６時間振盪反応した。反応生成物のβ−アミノアルコールである（１Ｓ，２Ｓ）−２−（Ｎ−エチルアミノ）−１−フェニル−１−プロパノール（ＥＰＥ）の確認はＨＰＬＣで行った。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ ＰＨ−３ ３．０×７５ｍｍ、溶離液は７％アセトニトリル水溶液及び０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、検出はＵＶ（２２０ｎｍ）で行った。
【０１６５】
このようにして活性測定した結果を表６に示した。外来プロモーター領域を持たないｐＲＥＴ１１０４を導入した組換え体は、対照であるｍａｋ ｇｅｎｅを持たないｐＲＥＴ１１０２を導入した組換え体とほぼ同じ活性を示し、組換え酵素の発現は認められなかった。
【０１６６】
ＭＡＫ−３４株にｐＲＥＴ１１１４を導入した場合、ｐＲＥＴ１１０４に比べて高い比活性が認められた。このことはベクターに挿入したｐＲＥＴ１２００のｒｅｐＡプロモーター領域が、プロモーターとして機能していることが示された。
【０１６７】
ｐＲＥＴ１１３８を導入した場合、組換えＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＭＡＫ−３４株の比活性は３７．７μｇ／ｈ・ｍＬ／Ｏ．Ｄ．であり、組換えＲ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ ＪＣＭ２８９５株の比活性は３４．９μｇ／ｈ・ｍＬ／Ｏ．Ｄ．であり、Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ株における酵素の発現が確認された。
【０１６８】
【表６】
【０１６９】
（実施例１３）酵素の精製
実施例１２で得られた組換え菌体を１００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地１００ｍＬで３０℃、４日間培養し、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離して集菌し、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔキット（キアゲン社製）によりＨｉｓ−ｔａｇが付加されたタンパク質を精製した。具体的には、超音波処理により菌を破砕し、遠心分離によりその上清液を得、ニッケルキレートカラムによりタンパク質を精製した。得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、分子量約２８０００のタンパク質バンドが認められた。この分子量は、国際公開ＷＯ０２／０７０７１４に記載のアミノケトン不斉還元酵素の分子量とほぼ同じであり、アミノケトン不斉還元酵素が組換えロドコッカス菌において産生されたことが示された。
【０１７０】
（実施例１４）酵素によるβ−アミノアルコールの製造
実施例１３で得られた精製酵素（０．５μｇ／ｍＬ）、５ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５ｍＭ ＥＡＭを含む反応液０．５ｍＬを３７℃で１６時間反応させた。基質及び生成物（ＥＰＥ）の分析はＨＰＬＣで行った。カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ ＰＨ−３ ３．０×７５ｍｍ、溶離液は７％アセトニトリル水溶液及び０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）、検出はＵＶ（２２０ｎｍ）で行った。その結果、ＥＰＥが生成したことを確認した。
【０１７１】
同様に、精製酵素又は実施例１３に記載の培養で得られた組換え体の破砕酵素粗抽出液を１−２−ジメチルアミノプロピオフェノン、１−アミノ−２−ブタノン等に作用させ、対応するβ−アミノアルコールを製造できることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
以上説明したように、本発明のプラスミド及びシャトルベクターは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌（特に、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ又はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｎｉｉ）由来のものであり、これらを利用して同菌を組換えにより改変し、より効率的にアミノケトン不斉還元酵素を産生する菌株を作製することができる。また、アミノケトン不斉還元酵素を含む有用酵素を形質転換体に大量生産させることもできるようになる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項２】
配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項３】
配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項４】
配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項５】
配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、且つ配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項６】
配列番号７６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項７】
配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項８】
配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含み、且つ配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のプラスミド又はＤＮＡ断片を有し、制限酵素切断部位数がＢａｍＨＩ：２、ＥｃｏＲＩ：２、ＫｐｎＩ：１、ＰｖｕＩＩ：１、ＳａｃＩ：１及びＳｍａＩ：１であり、大きさが約５．４ｋｂｐであることを特徴とする環状プラスミド。
【請求項１０】
配列番号７３に記載の塩基配列を有するプラスミド。
【請求項１１】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプラスミド又はＤＮＡ断片。
【請求項１２】
配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項１３】
配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項１４】
配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項１５】
配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項１６】
配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、且つ配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項１７】
配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含み、且つ配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項１８】
配列番号６７及び配列番号４７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項１９】
配列番号６７及び配列番号４７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有する接合タンパク質領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項２０】
配列番号７５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項２１】
配列番号７５に記載の塩基配列を有する接合に関する領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項２２】
請求項１２〜２１のいずれか１項に記載のプラスミド又はＤＮＡ断片を有し、制限酵素切断部位数がＢａｍＨＩ：２、ＰｖｕＩＩ：４、ＳａｃＩ：３及びＳｍａＩ：４であり、大きさが約５．８ｋｂｐであることを特徴とする環状プラスミド。
【請求項２３】
配列番号７４に記載の塩基配列を有するプラスミド。
【請求項２４】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来であることを特徴とする請求項１２〜２３のいずれか１項に記載のプラスミド又はＤＮＡ断片。
【請求項２５】
配列番号７７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項２６】
配列番号７７に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片と大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域とを含み、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌内で複製可能なシャトルベクター。
【請求項２８】
請求項２７記載のシャトルベクターを用いて作製することを特徴とするベクター。
【請求項２９】
請求項６、７、２５又は２６のいずれか１項に記載のプラスミド又はＤＮＡ断片を含むことを特徴とするベクター。
【請求項３０】
アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入されていることを特徴とする請求項２８又は２９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３１】
アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が、配列番号７８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号７８のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項３０記載のベクター。
【請求項３２】
アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が、配列番号７９に記載の塩基配列からなる核酸、又は配列番号７９と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項３０記載のベクター。
【請求項３３】
請求項２８又は２９に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項３４】
請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項３５】
請求項３４記載の形質転換体を該形質転換体が増殖可能な培地中で培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた該形質転換体からアミノケトン不斉還元酵素を精製する精製工程と
を含むアミノケトン不斉還元酵素の製造方法。
【請求項３６】
一般式（１）：
【化１】
（式中、
Ｘは同一又は異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基及びスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；
ｎは０〜３の整数を示し；
Ｒ１は低級アルキル基を示し；
Ｒ２，Ｒ３は同一又は異なっていてもよく、水素原子及び低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；
＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物に請求項３５記載の製造方法で得られるアミノケトン不斉還元酵素を作用させて一般式（２）：
【化２】
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記定義と同一）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめる光学活性アミノアルコールの製造方法。
【請求項３７】
一般式（１）：
【化３】
（式中、
Ｘは同一又は異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基及びスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；
ｎは０〜３の整数を示し；
Ｒ１は低級アルキル基を示し；
Ｒ２，Ｒ３は同一又は異なっていてもよく、水素原子及び低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；
＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物に請求項３４記載の形質転換体を作用させて一般式（２）：
【化４】
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記定義と同一）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめる光学活性アミノアルコールの製造方法。
【請求項３８】
請求項３７記載の光学活性アミノアルコールの製造方法において、
一般式（３）：
【化５】
（式中、
Ａは下記式（Ｙ）又は（Ｚ）を表し、
【化６】
（ここで、Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環又はＲ８と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表す。）、
【化７】
（ここで、Ｒ５は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、若しくはＲ６又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ６は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環、Ｒ５又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ７は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）；
Ｒ８は水素原子、カルボキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ４と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格、Ｒ６と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環を表し；
Ｒ９は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアシル基、Ｒ５又はＲ６と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し；
Ｒ１０は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
で表される化合物、又はその製薬学的に許容される塩あるいは溶媒和物をさらに添加して光学活性アミノアルコールを生成させる光学活性アミノアルコールの製造方法。
【請求項１】
配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項２】
配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項３】
配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項４】
配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項５】
配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、且つ配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項６】
配列番号７６に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項７】
配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項８】
配列番号１、配列番号４、配列番号１４、配列番号１７及び配列番号２２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含み、且つ配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のプラスミド又はＤＮＡ断片を有し、制限酵素切断部位数がＢａｍＨＩ：２、ＥｃｏＲＩ：２、ＫｐｎＩ：１、ＰｖｕＩＩ：１、ＳａｃＩ：１及びＳｍａＩ：１であり、大きさが約５．４ｋｂｐであることを特徴とする環状プラスミド。
【請求項１０】
配列番号７３に記載の塩基配列を有するプラスミド。
【請求項１１】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプラスミド又はＤＮＡ断片。
【請求項１２】
配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項１３】
配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項１４】
配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項１５】
配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項１６】
配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、且つ配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項１７】
配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６２及び配列番号６９に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製関連タンパク質のコード領域を含み、配列番号７０、配列番号７１及び配列番号７２に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ複製領域を含み、且つ配列番号７６に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項１８】
配列番号６７及び配列番号４７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項１９】
配列番号６７及び配列番号４７に記載の塩基配列からなる群より選ばれる少なくとも１つの塩基配列を有する接合タンパク質領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項２０】
配列番号７５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項２１】
配列番号７５に記載の塩基配列を有する接合に関する領域を含むことを特徴とするプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片。
【請求項２２】
請求項１２〜２１のいずれか１項に記載のプラスミド又はＤＮＡ断片を有し、制限酵素切断部位数がＢａｍＨＩ：２、ＰｖｕＩＩ：４、ＳａｃＩ：３及びＳｍａＩ：４であり、大きさが約５．８ｋｂｐであることを特徴とする環状プラスミド。
【請求項２３】
配列番号７４に記載の塩基配列を有するプラスミド。
【請求項２４】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌由来であることを特徴とする請求項１２〜２３のいずれか１項に記載のプラスミド又はＤＮＡ断片。
【請求項２５】
配列番号７７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片。
【請求項２６】
配列番号７７に記載の塩基配列を有するプロモーター領域を含むことを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のプラスミド又はその一部であるＤＮＡ断片と大腸菌内で複製可能なＤＮＡ領域とを含み、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属菌及び大腸菌内で複製可能なシャトルベクター。
【請求項２８】
請求項２７記載のシャトルベクターを用いて作製することを特徴とするベクター。
【請求項２９】
請求項６、７、２５又は２６のいずれか１項に記載のプラスミド又はＤＮＡ断片を含むことを特徴とするベクター。
【請求項３０】
アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が挿入されていることを特徴とする請求項２８又は２９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３１】
アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が、配列番号７８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号７８のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項３０記載のベクター。
【請求項３２】
アミノケトン不斉還元酵素遺伝子が、配列番号７９に記載の塩基配列からなる核酸、又は配列番号７９と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアミノケトン不斉還元活性を有するタンパク質をコードする核酸であることを特徴とする請求項３０記載のベクター。
【請求項３３】
請求項２８又は２９に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項３４】
請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項３５】
請求項３４記載の形質転換体を該形質転換体が増殖可能な培地中で培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた該形質転換体からアミノケトン不斉還元酵素を精製する精製工程と
を含むアミノケトン不斉還元酵素の製造方法。
【請求項３６】
一般式（１）：
【化１】
（式中、
Ｘは同一又は異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基及びスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；
ｎは０〜３の整数を示し；
Ｒ１は低級アルキル基を示し；
Ｒ２，Ｒ３は同一又は異なっていてもよく、水素原子及び低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；
＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物に請求項３５記載の製造方法で得られるアミノケトン不斉還元酵素を作用させて一般式（２）：
【化２】
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記定義と同一）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめる光学活性アミノアルコールの製造方法。
【請求項３７】
一般式（１）：
【化３】
（式中、
Ｘは同一又は異なっていてもよく、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基及びスルホニル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；
ｎは０〜３の整数を示し；
Ｒ１は低級アルキル基を示し；
Ｒ２，Ｒ３は同一又は異なっていてもよく、水素原子及び低級アルキル基からなる群より選ばれる少なくとも一種を示し；
＊は不斉炭素を示す）
で表されるα−アミノケトン化合物又はその塩のエナンチオマー混合物に請求項３４記載の形質転換体を作用させて一般式（２）：
【化４】
（式中、Ｘ、ｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及び＊は前記定義と同一）
で表される光学活性アミノアルコール化合物であって、所望の光学活性を有する該化合物を生成せしめる光学活性アミノアルコールの製造方法。
【請求項３８】
請求項３７記載の光学活性アミノアルコールの製造方法において、
一般式（３）：
【化５】
（式中、
Ａは下記式（Ｙ）又は（Ｚ）を表し、
【化６】
（ここで、Ｒ４は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環又はＲ８と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表す。）、
【化７】
（ここで、Ｒ５は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基、若しくはＲ６又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ６は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ８と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環、Ｒ５又はＲ９と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し、Ｒ７は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）；
Ｒ８は水素原子、カルボキシル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、Ｒ４と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格、Ｒ６と結合してなる炭素数５〜１０の炭化水素環を表し；
Ｒ９は水素原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキルオキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアシル基、Ｒ５又はＲ６と結合してなる１〜３個のヘテロ原子を含む５〜８員環のヘテロ環状骨格を表し；
Ｒ１０は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基を表す。）
で表される化合物、又はその製薬学的に許容される塩あるいは溶媒和物をさらに添加して光学活性アミノアルコールを生成させる光学活性アミノアルコールの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４２７３９
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５１７１（Ｐ２００５−５１５１７１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６１０４
【国際出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【出願人】（３９００１０２０５）第一ファインケミカル株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６１０４
【国際出願日】平成１６年１０月２９日（２００４．１０．２９）
【出願人】（３９００１０２０５）第一ファインケミカル株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
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