新規なラクトバチルス属微生物および乳酸菌製剤
【課題】消化管において良好な付着性と定着性を有し、下痢や疝痛（せんつう）の予防・治療効果を有するとともに、ストレス軽減効果などプロバイオティクス効果を有する新規なラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物を含有する乳酸菌製剤を提供する。
【解決手段】ストレス低減効果を有するラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株またはＳＴ１８株と同定されるラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物を含有する乳酸菌製剤である。
【解決手段】ストレス低減効果を有するラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株またはＳＴ１８株と同定されるラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物を含有する乳酸菌製剤である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス軽減効果を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する新規微生物およびその微生物を含有する乳酸菌製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
牛や豚、馬などの哺乳動物の飼育においては、消化器疾患がしばしば問題となり、例えば、馬の飼育における、疝痛（せんつう）や下痢症などの消化器疾患は、消化吸収に影響を及ぼし栄養障害につながるため、馬の発育を阻害する要因となる。特に仔馬はこのような消化器疾患を発症しやすく、生後６ヶ月までに約７０〜８０％の仔馬が何らかの下痢を発症することが報告されている。このような下痢や腸炎の原因となる病原微生物の報告はあるが、仔馬の場合は不顕性保菌馬も多いため、効果的な治療法がとれず下痢状態が長期間に及ぶ場合もある。したがって、腸内フローラの状態を改善し下痢症などの消化器疾患を予防・治療することが望まれていた。
【０００３】
一方、馬は家畜として人に飼育され、競走用、使役用、ホースセラピー用などの用途に使用されており、様々なストレスに曝される。例えば競走馬であれば、調教や輸送などにおいて多大なストレスを受け、輸送熱などの症状となって顕れることもある。したがって、日常飼育の中でのストレスを軽減することも望まれていた。
【０００４】
近年、馬に対して下痢の予防や治療、増体重の促進を目的として、乳酸菌を添加した飼料が使用されている。しかしながら、従来の乳酸菌では、馬の有用な腸内フローラの形成には有効に働かず下痢症などを十分に予防、治療することができないものであった。さらに、馬に対してストレス軽減効果を有する乳酸菌はこれまで知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明は、哺乳動物の消化管中に良好な付着性と定着性を有し、下痢症や疝痛などの消化器疾患を予防・治療することができ、さらにはストレス軽減効果などプロバイオティクス効果のあるラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物およびその微生物を含有する乳酸菌製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、馬の腸内に常在するラクトバチルス（Lactobacillus）属の分布や構成を調べ、それらの馬の消化管由来株の分離同定を行う過程で、優勢菌種として広く分布する２種類のラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物の未同定菌株を分離した。そしてその菌株を馬に投与することにより、馬の下痢や疝痛の発生を予防・治療することができ、さらに馬およびラットに対してストレス軽減効果を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物を含有することを特徴とする乳酸菌製剤である。
【０００８】
また本発明は、
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（イ）および（ロ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である乳酸菌製剤：
（イ）Ｇ＋Ｃ含量が３４．３±２．０ｍｏｌ％
（ロ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）
JCM1231T株およびラクトバチルス・アビアリウス・サブスピーシズ・アビアリ
ウス（L.aviarius subsp. aviarius）JCM 5666T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同
性が６０％未満
である。
【０００９】
さらに本発明は、
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号２に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ハ）および（ニ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である乳酸菌製剤：
（ハ）Ｇ＋Ｃ含量が３７．５±２．０ｍｏｌ％
（ニ）近縁菌種の基準株であるカテニバクテリウム・ミツオカイ（Catenibacterium
mitsuokai）JCM 0609 T株、ラクトバチルス・ヴィトゥリニス（L. vitulinus）
JCM 1121T株およびラクトバチルス・カテナフォルミス（L. catenaformis）
JCM 1143T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の乳酸菌は、消化管内での定着能が高く、馬などの哺乳動物に投与することにより有効に下痢症や疝痛などの消化器疾患を予防・治療できるとともに、ストレスを低減できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の２種の新規な微生物はいずれも、競走馬の糞便より分離されたものである。
健常なサラブレッドの排泄後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを糞便が凍結しない７℃以下の冷蔵で運搬した。運搬された糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部をＢＬ寒天培地またはＬＢＳ寒天培地（ともに栄研化学製）に塗抹し、スチール・ウール法で、３７℃で４８時間嫌気培養して形成されたコロニーから２種の新規なラクトバチルス属微生物を分離した。以下にこれら微生物の性質を示す。
【００１２】
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株の分類学的性質
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質および（ｄ）化学分類学的性質について以下に示す。
（ａ）形態的性質
（１）細菌の形：桿菌
（２）細菌の大きさ： １〜１．５×３〜５μｍ
（３）細菌の多形性：無
（４）運動性：無
（５）胞子：無
【００１３】
このラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株の顕微鏡写真を図１に示す。
【００１４】
（ｂ）培養的性質（生育状態）
（１）ＭＲＳ寒天培地での培養：
３７℃、４８時間培養により、直径０．５〜１．５ｍｍ程度の円形で扁平状に
隆起し、周縁および表面は円滑で、露滴状の構造であって、褐色で不透明、硬度
は脂状のコロニーを生じる。
（２）ＭＲＳ液体培地での培養：３７℃、１５時間培養によって懸濁する。
（Ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）カタラーゼ反応：陰性
（３）酸素に対する態度：通性嫌気性
（４）乳酸発酵：ホモ型
（５）グルコースから産生される乳酸の旋光性：Ｌ型
（６）グルコースからのガス発生：なし
（７）生育の範囲
温度 １５℃ なし
４５℃ あり
（８）耐塩性 ３％耐塩性
（９）糖類からの酸生成の有無
ＡＰＩ ５０ ＣＨ Ｓｙｓｔｅｍ （ＢｉｏＭｅｒｅｕｘ社製）を用いた。
（＋酸生成あり、＋／−酸生成わずかにあり、−酸生成なし）
グリセロール −
エリスリトール −
Ｄ−アラビノース −
Ｌ−アラビノース −
リボース −
Ｄ−キシロース −
Ｌ−キシロース −
アドニトール −
メチル−β−Ｄ−キシロピラノシド −
ガラクトース −
グルコース ＋
フラクトース ＋
マンノース ＋
ソルボース −
ラムノース −
ダルシトール −
イノシトール −
マンニトール ＋
ソルビトール −
メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド −
メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド −
Ｎ−アセチルグルコサミン ＋
アミグダリン ＋／−
アルブチン ＋
サリシン ＋
セロビオース ＋
マルトース ＋
ラクトース −
メリビオース −
シュクロース ＋
トレハロース −
イヌリン −
メレジトース −
ラフィノース ＋／−
デンプン −
グリコーゲン −
キシリトール −
ゲンチオビオース ＋
ツラノース −
Ｄ−リキソース −
Ｄ−タガトース −
Ｄ−フコース −
Ｌ−フコース −
Ｄ−アラビトール −
Ｌ−アラビトール −
グルコン酸 −
２−ケトグルコン酸 −
５−ケトグルコン酸 −
（１０）エスクリンの分解性：あり
【００１５】
（ｄ）化学分類学的性質
（１）Ｇ＋Ｃ含量
Mesbahらの方法（Mesbah, M., Premachandran, U.and Whitman, W. E. Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography. Int. J. Syst. Bacteriol., 39: 159-167,1989）によって測定した。
Ｇ＋Ｃ含量：３４．３±２．０ｍｏｌ％
（２）細胞壁のアミノ酸組成
アミノ酸組成：リジン、グルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸
ペプチドグリカンタイプ：Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｓｐ（Ａ４α）
（３）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列の相同性
（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定）
コロニーＰＣＲにより、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）により全１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を決定した。以下の２７Ｆ、７５Ｒ、５２０Ｆ、５２０Ｒ、９３０Ｆ、８００Ｒ、１１００Ｆ、１１００Ｒのプライマーを用いた。
【００１６】
＜１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’
【００１７】
決定したラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の塩基配列１に示す。
【００１８】
（相同性検索）
このラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。この結果、一般的に相同性が９７％未満であれば別種であるとされるが、最も近縁のL. salivarius JCM 1231 Tとの相同性は９６％であった。配列表の塩基配列１に対し相同性９７％以上であれば、本発明の微生物に含まれる。
【００１９】
なお、既存の最も近縁な株はLactobacillus salivarius JCM 1150（アクセッションナンバー：Ｍ５９０５４）であるが、L. salivariusには亜種の分類は不要とする説に基づき、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の最も近縁な基準株はL. salivarius JCM1231（アクセッションナンバー：ＡＦ０８９１０８）とした（Li, Y.,Raftis, E., Canchaya, C., Fitzgerald, G. F., van Sinderen, D. & O’Toole, P.W. (2006). Polyphasic analysis indicates that L. salivarius subsp. salivariusand L. salivarius subsp. salicinicus do not merit separate subspecies status. Int. J. Evol. Microbiol., 56, 2397-2403.）
【００２０】
（系統解析）
さらに解析ソフトＣＬＵＳＴＡＬ Ｗにより系統樹を作成した。図２は、既知のラクトバチルス属微生物とラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株との関係を示した系統樹の図である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値であり、また括弧内の記号はアクセッションナンバーを表す。
【００２１】
（４）近縁種とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、Ｅｚａｋｉらの蛍光検出によるマイクロプレート法（Int. J. Syst. Bacteriol., ３９，２２４−２２９、１９８９）により行った。２株の近縁菌種の基準株（L. salivarius JCM 1231 T、L. aviarius subsp. aviarius JCM 5666T）を、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株と比較するのに使用した。
【００２２】
（ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性）
L. salivarius JCM 1231 T：１４．２％
L. aviarius subsp. aviariusJCM 5666 T：７．９％
【００２３】
一般的に６０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を持つ菌群を同一菌種とされる。しかしながら、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株は、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が２０％未満の低い相同性しか示さなかった。本願発明の微生物には、上記近縁菌種の基準株（L. salivarius JCM 1231 T、L. aviarius subsp. aviarius JCM 5666
T）とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満のものが含まれる。
【００２４】
以上の化学分類学的性質により、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株は、いままでに報告されていない新規な乳酸桿菌であると判断された。このラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株を平成１９年１月１９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、微生物寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３０１として寄託した。
【００２５】
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株の分類学的性質：
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質および（ｄ）化学分類学的性質について以下に示す。
（ａ）形態的性質
（１）細菌の形：桿菌
（２）細菌の大きさ： ０．７〜１×２〜１０μｍ
（３）運動性：無
（４）胞子：無
【００２６】
このラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株の顕微鏡写真を図３に示す。
【００２７】
（ｂ）培養的性質（生育状態）
（１）ＡＢＣＭブイヨン寒天培地での培養：
３７℃、２４時間培養により、直径１〜２．５ｍｍ程度のやや不規則な円形状
で扁平状に隆起し、周縁は波状、表面は円滑で、露滴状の構造であって、褐色で
透明、硬度は脂状のコロニーを生じる。
（２）ＡＢＣＭブイヨン液体培地での培養：
３７℃、１５〜２４時間培養によって懸濁する。
（Ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）カタラーゼ反応：陰性
（３）酸素に対する態度：嫌気性
（４）乳酸発酵：ヘテロ型
（５）グルコースから産生される乳酸の旋光性：Ｄ型
（６）グルコースからのガス発生：あり
（７）生育の範囲
温度 １５℃ なし
４５℃ あり
（８）耐塩性 ３％耐塩性
（９）糖類からの酸生成の有無
ＡＰＩ ５０ ＣＨ Ｓｙｓｔｅｍ （ＢｉｏＭｅｒｅｕｘ社製）を用いた。
（＋酸生成あり、＋／−酸生成わずかにあり、−酸生成なし）
Ｄ−アラビノース −
リボース −
Ｄ−キシロース −
ガラクトース ＋
グルコース ＋
フラクトース ＋
マンノース ＋
ラムノース −
マンニトール −
ソルビトール −
サリシン −
セロビオース ＋
ラクトース ＋
メリビオース ＋
トレハロース −
メレジトース −
ラフィノース −
デンプン ＋
グルコン酸 −
【００２８】
（ｄ）化学分類学的性質
（１）Ｇ＋Ｃ含量
Mesbahらの方法（Mesbah, M., U. Premachandran,and W. E. Whitman. Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography. Int. J. Syst. Bacteriol., 39: 159-167,1989）によって測定した。
Ｇ＋Ｃ含量：３４．３±２．０ｍｏｌ％
（２）細胞壁のアミノ酸組成
アミノ酸組成：アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン、メソジ
アミノピメリン酸
ペプチドグリカンタイプ：ｍｅｓｏ−ＤＡＰ ｄｉｒｅｃｔ（Ａ１γ）
【００２９】
（３）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性
（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定）
コロニーＰＣＲにより、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）により全１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を決定した。以下の２７Ｆ、７５Ｒ、５２０Ｆ、５２０Ｒ、９３０Ｆ、８００Ｒ、１１００Ｆ、１１００Ｒのプライマーを用いた。
【００３０】
＜１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’
【００３１】
決定したラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の塩基配列２に示す。
【００３２】
（相同性検索）
このラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。この結果、一般的に相同性が９７％未満であれば別種であるとされるが、最も近縁のL. catenaformis JCM 1143T（アクセッションナンバー：Ｍ２３７２９）との相同性は９３％であった。配列表の塩基配列２に対し相同性９７％以上であれば、本発明の微生物に含まれる。
【００３３】
（系統解析）
さらに解析ソフトＣＬＵＳＴＡＬ Ｗにより系統樹を作成した。図４は、既知のラクトバチルス属微生物とラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株との関係を示した系統樹の図である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値であり、括弧内の記号はアクセッションナンバーである。
【００３４】
（４）近縁種とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、Ｅｚａｋｉらの蛍光検出によるマイクロプレート法（Int. J. Syst. Bacteriol., ３９，２２４−２２９、１９８９）により行った。３株の近縁菌種の基準株（L. vitulinus JCM 1121T、L. catenaformis JCM 1143T、Catenibacterium mitsuokai JCM 0609T）を、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株と比較するのに使用した。
【００３５】
（ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性）
Catenibacterium mitsuokai JCM 0609 T：１５．６％
L.vitulinus JCM 1121T：１４．３％
L. catenaformis JCM 1143T：０．７％
【００３６】
このように、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株は、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が２０％未満の低い相同性しか示さなかった。本発明の微生物には、上記近縁菌種の基準株（Catenibacterium mitsuokai JCM 0609T、L. vitulinus JCM1121T、L. catenaformis JCM1143T）とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満のものが含まれる。
【００３７】
以上の化学分類学的性質により、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株は、いままでに報告されていない新規な乳酸桿菌であると判断された。このラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株を平成１９年１月１９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、微生物寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３００として寄託した。
【００３８】
上記２種の本発明の微生物を得るには、通常の培養方法に準じて培養を行えばよい。例えばラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株はＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で２４時間培養して得られる。一方、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株は、ＡＢＣＭブイヨン培地に接種し、３７℃で２４時間培養して得ることができる。
【００３９】
本発明の乳酸菌製剤は、上記のように培養した本発明の２種の新規乳酸菌の培養液をそのまま用いることもできるが、遠心分離等の手段を用いて集菌した菌体をスキムミルク等に分散して懸濁液として用いてもよい。さらに、培養液や懸濁液を凍結乾燥等により乾燥させた乾燥菌体として用いることもできる。
【００４０】
本発明の乳酸菌製剤の剤型としては特に限定はなく、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、ペレット、液剤等の任意の剤型とすることができ、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、シュクロース、スキムミルク等の賦形剤やその他フラクトオリゴ糖など各種のプレバイオティクス成分等の任意成分を配合することもできる。
【００４１】
かくして得られた本発明の新規乳酸菌を馬などの哺乳動物に投与することにより、乳酸菌が消化管に付着・定着し、下痢や疝痛等の消化器疾患を予防・治療することができ、さらにはストレスを軽減させることができる。新規乳酸菌の投与量は１頭当たり１日に１×１０６〜１×１０１１ｃｆｕ（コロニー形成単位）程度、特に１×１０７〜１×１０１０ｃｆｕ程度が好ましい。なお、本発明においてストレスの軽減とは、本発明製剤の投与前後で血清アルブミンのフリーのＳＨ基保有率が例えば、対照群３頭の平均から、試験群の平均が１．５倍以上増加することをいう。
【００４２】
本発明の乳酸菌製剤は、馬などの哺乳動物に直接経口投与してもよく、飼料や餌等に混ぜて投与してもよい。なお、本発明の乳酸菌製剤の投与対象である哺乳動物としては、馬、牛、豚、ヒツジ、山羊等が例示できる。
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
実 施 例 １
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株の培養：
ＭＲＳ液体培地（Ｏｘｏｉｄ社製）５Ｌをフラスコに入れ、ｐＨを６．８に調整しオートクレーブで、１２１℃、１５分間の滅菌を行った。このＭＲＳ液体培地に、予め、ＢＬ寒天培地（栄研化学社製）で４８時間培養したコロニーを釣菌し、ＭＲＳ液体培地で２４時間のプレ培養したラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株培養液を０．２容量％接種し、３７℃、２４時間静置培養した。この培養液を３０００×ｇで遠心分離し集菌して湿重量約６ｇ／５Ｌの菌体ペレットを得た。
【００４５】
実 施 例 ２
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株含有乳酸菌製剤の調製：
実施例１により得られた菌体ペレットを生理食塩水で洗浄した。その菌体ペレット６ｇ（湿重量）を滅菌１０％スキムミルク５４ｍｌに懸濁し、この懸濁液を凍結乾燥処理して凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末に５質量倍のスキムミルク粉末を加えて均一に混合して本発明の乳酸菌製剤を得た。この乳酸菌製剤は、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株を７．０×１０１０ｃｆｕ／ｇ含有するものであった。
【００４６】
試 験 例 １
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の消化管付着性試験１：
実施例１で得られた菌体ペレット６ｇ（湿重量）を、あらかじめ滅菌しておいた１０％スキムミルク溶液５０ｍｌに懸濁し−８５℃で急冷した。融解試験を行ったところ、３×１０９ｃｆｕ／ｍｌの生菌数が認められた。この懸濁液１ｍｌを１０ｍｌの滅菌１０％スキムミルク溶液に再懸濁して試料とした。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１１ｍｌを５日間連日、シリンジで経口投与した（試験区）。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、１１ｍｌの滅菌１０％スキムミルクを５日間連続で経口投与した。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
一般に定着性のない細菌の場合、投与した細菌は３日以内にすべてが排菌され、腸内フローラに影響を及ぼさないと考えられている。対照区では、ほとんど菌数の変化は見られなかったが、試験区では菌数が１オーダー増加していることから、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株が定着後に増殖しているものと考えられた。
【００４９】
試 験 例 ２
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の下痢症・疝痛予防効果：
試験例１において、それぞれの馬について試料投与開始から３０日間糞便の状態を観察し、各試験区について軟便が確認された延べ日数の合計を調べた。対照区では、延べ８日間の軟便が確認されたのに対し、試験区では、軟便は認められなかった。また、対照区では、延べ５日間の疝痛の徴候が確認されたのに対し、試験区では疝痛の徴候のある馬はみられなかった。したがって、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株が有する馬への下痢症・疝痛予防効果が認められた。
【００５０】
試 験 例 ３
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の消化管付着性試験２：
実施例２により得られた乳酸菌製剤を試料として用いた。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１．５ｇを飼葉０．５ｋｇの上に置いて投与する方法により５日間連続投与した（試験区）。完食を確認後、飼葉を自由摂取させた。試験例１とは別の個体を用いた。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、５日間、飼葉を自由摂取させた。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
この結果から、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の乾燥粉末を投与してもラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株が定着後に増殖しているものと考えられた。
【００５３】
試 験 例 ４
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の馬のストレス軽減効果：
哺乳動物のストレス度合いは、血清中のアルブミンにおけるフリーＳＨ基保有率を指標とした。馬のストレスが高くなるとアルブミン中のフリーＳＨ基が酸化されこの割合が低下すると考えられる。測定方法は、J.P. Fabsiakらの方法に準じた（J.P. Fabsiak, A. Sedelov and V. E. Kagon Quantificaion of Oxidative/Nitrosative Modification of CYS34 in Human serumAlbumin Using a Fluorescence-based SDS-PAGE assay Antioxidants & Redox signaling vol.4 No.5 p855-865 (2002)）。
【００５４】
すなわち、試験例１および３のラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株を含有する試料を投与したうちの３馬について、馬用乳酸菌製剤投与５日間の５日目、その５日間の投与終了の１日目、投与終了９日後、投与終了１５日後、投与終了２２日後及び投与終了３０日後の血液を採取しその血清を得た（ＫＢＬ１３株投与群）。それから得られた馬血清を１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.４）により１００倍に希釈したものをサンプルとした。次に、このサンプルの２５０μｌに２４０μＭのＴｈｉｏ−Ｇｌｏ１（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ製）を２５μｌ（終濃度２０μＭ）と、３６０ｍＭのＳＤＳ（終濃度３０ｍＭ）またはＰＢＳの２５μｌを加え、分注器で混合した。これとは別にスタンダードとしてＤＴＴで還元したＢＳＡの５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌを同様に用意した後、６０℃で４５分間反応させる。続いて室温にて１５分間インキュベートし、これを３５５ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの蛍光波長で蛍光強度を測定した。また、サンプルの６０μｌに（−）ＢＰＢの４×サンプルバッファー２０μｌを添加しＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調製した。
このサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。電気泳動後のゲルのバンドをトランスイルミネーター（フナコシ社製）で写真を撮り、強度を数値化した。続いてＣＢＢＲにて染色し写真撮影後、アルブミンとしてのタンパク量もＮＩＨ−Ｉｍａｇｅで求めた。この蛍光強度を、ｓｔａｎｄａｒｄ ＢＳＡの蛍光強度に換算した血清量／通常（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の蛋白定量から、血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を求めた。通常（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の蛋白量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）で求めた。対照として、試験例１および３において、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株を投与しなかった馬のうち３頭について同様に試験した（ＫＢＬ１３株無投与群）。結果を図５に示す。
【００５５】
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株投与群は、無投与群に比べて血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率が有意に高く、ストレスが軽減されている結果が得られた。１歳馬は、競走馬になるべくすでに調教が始まっており、実験に用いた馬はいずれもほぼ同じトレーニングを行っていたため、その調教がストレスになっているものと考えられる。また、そのストレス軽減効果は、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株投与を止めた４週間後でも持続していることが認められた。
【００５６】
実 施 例 ３
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株の培養：
ＡＢＣＭブイヨン培地（栄研化学社製）５Ｌをフラスコに入れ、ｐＨを７．２ に調整しオートクレーブで、１１５℃、１５分間の滅菌を行った。このＡＢＣＭブイヨン培地に、予め、ＢＬ寒天培地（栄研化学社製）で４８時間培養したコロニーを釣菌し、ＡＢＣＭブイヨン培地で２４時間のプレ培養したラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株培養液を０．２容量％接種し、３７℃、２４時間静置培養した。この培養液を３０００×ｇで遠心分離し集菌して湿重量約４ｇ／５Ｌの菌体ペレットを得た。
【００５７】
実 施 例 ４
ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株含有乳酸菌製剤の調製：
実施例３により得られた菌体ペレットを生理食塩水で洗浄した。その菌体ペレット
４ｇ（湿重量）を滅菌１０％スキムミルク４６ｍｌに懸濁し、凍結乾燥処理をして凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末に５質量倍のスキムミルク粉末を加えて均一に混合して本発明の乳酸菌製剤を得た。この乳酸菌製剤は、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株を４.５×１０１０ｃｆｕ／ｇ含有するものであった。
【００５８】
試 験 例 ５
ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の消化管付着性試験１：
実施例３で得られた菌体ペレット４ｇ（湿重量）を、あらかじめ滅菌しておいた１０％スキムミルク溶液４６ｍｌに懸濁し−８５℃で急冷した。融解試験を行ったところ、１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌの生菌数が認められた。この懸濁液１ｍｌを１０ｍｌの滅菌１０％スキムミルク溶液に再懸濁して試料とした。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１１ｍｌを５日間連日、シリンジで経口投与した（試験区）。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、１１ｍｌの滅菌１０％スキムミルクを５日間連続で経口投与した。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表３に示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
対照区では、ほとんど菌数の変化は見られなかったが、試験区では菌数が1オーダー増加していることから、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株が定着後に増殖しているものと考えられた。
【００６１】
試 験 例 ６
ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の下痢症・疝痛予防効果：
試験例５において、それぞれの馬について試料投与開始から３０日間糞便の状態を観察し、各試験区について軟便が確認された延べ日数を調べた。対照区では、延べ８日間の軟便が確認されたのに対し、試験区では、軟便は認められなかった。また、対照区では、延５日間の疝痛の徴候が確認されたのに対し、試験区では疝痛の徴候はみられなかった。したがって、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株が有する馬への下痢症・疝痛予防効果が認められた。
【００６２】
試 験 例 ７
ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の消化管付着性試験２：
実施例４により得られた乳酸菌製剤を試料として用いた。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１．５ｇを飼葉０．５ｋｇの上に置いて投与する方法により５日間連続投与した（試験区）。完食を確認後、飼葉を自由摂取させた。試験例６とは別の個体を用いた。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、５日間、飼葉を自由摂取させた。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表４に示す。
【００６３】
【表４】
【００６４】
この結果から、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の乾燥粉末を投与してもラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株が定着後に増殖しているものと考えられた。
【００６５】
試 験 例 ８
ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の馬のストレス軽減効果：
試験例５および７のラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株を含有する試料を投与したうちの３馬について、試験例４と同様にしてストレス軽減効果確認試験を行った。結果を図６に示す。
【００６６】
ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株投与群は、無投与群に比べて血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率が有意に高く、ストレスが軽減されている結果が得られた。また、そのストレス軽減効果は、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株投与を止めた４週間後でも持続していることが認められた。
【００６７】
試 験 例 ９
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株のラットに対する拘束ス トレス軽減効果：
ラットに拘束ストレスを負荷し、血中コルチコステロンの濃度を測定することによりストレス軽減効果を評価した。金属製の拘束装置を用い、ラットを８時間（午前０時〜午前８時）拘束した。拘束の前後で尾静脈からの採血を行いコルチコステロンの血中濃度を測定した。コルチコステロン量の測定は、ＡＣＴＩＶＥ Ｒａｔ Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＤＳＬ社、１０−８１１００）を用いてイムノアッセイ法で測定した。試験群には、１０の８乗レベルとなる量の実施例１および３で得られたラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株をそれぞれ５日間連続で経口投与した（ｎ＝６）。乳酸菌を与えない群をコントロールとした。５日目に拘束ストレスをかけ、前日の血中コルチコステロン濃度と拘束ストレス負荷後の血中コルチコステロン濃度を求めた。結果を図７に示す。
【００６８】
コントロール群および各乳酸菌投与群ともにストレス負荷をかける前は、１００ｎｇ／ｍｌ未満の範囲であった。コントロール群は、血中コルチコステロン量がストレス負荷後に有意に上昇しており、有効なストレス刺激が負荷されたことが確認された。ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株投与群はいずれもコントロール群に比べて、ストレス付加後の血中コルチコステロン濃度は低くなり、ストレス軽減効果が認められた。
【００６９】
試 験 例 １０
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株のラットに対する強
制水泳ストレス軽減効果：
直径２０ｃｍ、高さ５０ｃｍのプラスチック製の円筒に２７℃の水を４０ｃｍまで入れ、ラットを１５分間の強制水泳させ、強制水泳前後で尾静脈から採血し血中コルチコステロン量を測定した。試験群には、１０の８乗レベルとなる量の実施例１および３で得られたラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株をそれぞれ５日間連続で経口投与した（ｎ＝６）。乳酸菌を与えない群をコントロールとした。５日目に強制水泳させ、前日の血中コルチコステロン濃度と強制水泳ストレス負荷後の血中コルチコステロン濃度を求めた。結果を図８に示す。
【００７０】
コントロール群は、血中コルチコステロン量がストレス負荷後に有意に上昇しており、有効なストレス刺激が負荷されたことが確認された。ＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株投与群は、いずれもコントロール群に比べ、ストレス負荷後の血中コルチコステロン量が抑制され、ラットに対するストレス軽減効果があることがわかった。
【００７１】
試 験 例 １１
馬腸内フローラにおけるラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１
８株の分布（１）
国内各地の生産牧場および厩舎における０（当歳）〜３３歳までの様々な年齢の牡７頭、牝９頭の糞便を採取し、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法によりラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株を保有しているか調べた。その結果、ＫＢＬ１３株は１６頭中１６頭、ＳＴ１８株は１６頭中１４頭から検出されたことから、本発明の２種のラクトバチルス属微生物はいずれも、生産牧場や厩舎には関係なく、健常な馬の腸内フローラに普遍的に存在している微生物であると考えられる。したがって、本発明のラクトバチルス属微生物は馬に投与しても安全性の高いものである。
【００７２】
試 験 例 １２
馬腸内フローラにおけるラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１
８株の分布（２）
下記表５に示した健常なサラブレッド１２頭（Ａ〜Ｌ）の新鮮な糞便について、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＰＣＲ−ＤＧＧＥ）法により、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株の分布を調べた。これらのサラブレッドは、糞便の採取１ヶ月以内に、生菌剤は使用していない。Walterら（Walter, J., Hertel, C., Tannock, G.W., Lis, C. M., Munro, K. & Hammes, W. P. (2001). Detection of Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella species in human feces by using group-specific PCR primers and denaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol 67, 2578-2585)の文献に基づくＰＣＲ条件と、大腸菌の１６ＳｒＲＮＡ配列のＮｏ．３４１−５３４領域で３４０ｂｐを増幅させる下記のプライマーＬａｃ１とＬａｃ２ＧＣを用いた。
【００７３】
＜ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｃ１＞
５′−ＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡ−３′
＜ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｃ２ＧＣ＞
５′−ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＧＣＡＣ
ＣＧＧＧＧＧＡＴＴＹＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＡＴＧ−３′
【００７４】
【表５】
【００７５】
ＤＧＧＥ泳動には、ＤＣｏｄｅシステム装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、各種糞便からラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株の検出を試みた。ＫＢＬ１３株の検出は次のようにして行った。変性剤（尿素とホルムアミド）で３５％から５０％の濃度勾配をつけた８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリアクリルアミドゲルを用いた。Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液に浸して、６０Ｖで１４時間、泳動した。泳動後のゲルは、１０ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液２５μｌを添加した２５０ｍｌＴＡＥ緩衝液で染色した。ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株のバンドの特定は、純粋培養したラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の移動度、およびそのバンドを切り出しての１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列決定によって、９８％以上の相同性のあるものをラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株とした。１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列決定は上記と同様の方法により行った。結果を図９に示す。
【００７６】
一方、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の検出は次のようにして行った。変性剤（尿素とホルムアミド）で３７．５％から５２．５％の濃度勾配をつけた８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリアクリルアミドゲルを用いた。Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液に浸して、６０Ｖで１４時間、泳動した。泳動後のゲルは、１０ ｍｇ／ｍｌ 臭化エチジウム溶液２５μｌを添加した２５０ｍｌＴＡＥ緩衝液で染色した。ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株のバンドの特定は、純粋培養したラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の移動度、およびそのバンドを切り出しての１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列決定によって、９８％以上の相同性のあるものをラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株とした。１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列決定も上記と同様の方法により行った。結果を図１０に示す。
【００７７】
図９に示すとおり、１２頭のすべてのサラブレッドからラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株が検出された。また図１０に示すとおり、１２頭中９頭のサラブレットからラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株が検出された。この結果から、これらの菌種は、健常なサラブレッドの消化管内に広く分布し、またバンドの濃さの強弱は菌数を反映していることから、ラクトバチルス属の中で優勢に生育していることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明のラクトバチルス属微生物は、消化管に対して良好な付着性および定着性を示し、下痢や疝痛など消化器疾患の予防・治療効果を有し、さらにストレス軽減効果などプロバイオティクス効果をも有するものである。
【００７９】
したがって、本発明のラクトバチルス属微生物は、馬などの哺乳動物に投与する乳酸菌製剤として有利に利用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株の光学顕微鏡写真である。
【図２】既知のラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物とラクトバチルスＫＬＢ１３株との関係を示した系統樹である。
【図３】ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株の光学顕微鏡写真である。
【図４】既知のラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物とラクトバチルスＳＴ１８株との関係を示した系統樹である。
【図５】試験例４において、ラクトバチルスＫＢＬ１３株投与群と無投与群との血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を示す図である。
【図６】試験例８において、ラクトバチルスＳＴ１８株投与群と無投与群との血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を示す図である。
【図７】試験例９における、拘束ストレス負荷前後の血中コルチコステロン濃度を示す図である。
【図８】試験例１０における、強制水泳ストレス負荷前後の血中コルチコステロン濃度を示す図である。
【図９】試験例１２における、ラクトバチルスＫＢＬ１３株のＰＣＲ−ＤＧＧＥ電気泳動図である。
【図１０】試験例１２における、ラクトバチルスＳＴ１８株のＰＣＲ−ＤＧＧＥ電気泳動図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス軽減効果を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する新規微生物およびその微生物を含有する乳酸菌製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
牛や豚、馬などの哺乳動物の飼育においては、消化器疾患がしばしば問題となり、例えば、馬の飼育における、疝痛（せんつう）や下痢症などの消化器疾患は、消化吸収に影響を及ぼし栄養障害につながるため、馬の発育を阻害する要因となる。特に仔馬はこのような消化器疾患を発症しやすく、生後６ヶ月までに約７０〜８０％の仔馬が何らかの下痢を発症することが報告されている。このような下痢や腸炎の原因となる病原微生物の報告はあるが、仔馬の場合は不顕性保菌馬も多いため、効果的な治療法がとれず下痢状態が長期間に及ぶ場合もある。したがって、腸内フローラの状態を改善し下痢症などの消化器疾患を予防・治療することが望まれていた。
【０００３】
一方、馬は家畜として人に飼育され、競走用、使役用、ホースセラピー用などの用途に使用されており、様々なストレスに曝される。例えば競走馬であれば、調教や輸送などにおいて多大なストレスを受け、輸送熱などの症状となって顕れることもある。したがって、日常飼育の中でのストレスを軽減することも望まれていた。
【０００４】
近年、馬に対して下痢の予防や治療、増体重の促進を目的として、乳酸菌を添加した飼料が使用されている。しかしながら、従来の乳酸菌では、馬の有用な腸内フローラの形成には有効に働かず下痢症などを十分に予防、治療することができないものであった。さらに、馬に対してストレス軽減効果を有する乳酸菌はこれまで知られていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明は、哺乳動物の消化管中に良好な付着性と定着性を有し、下痢症や疝痛などの消化器疾患を予防・治療することができ、さらにはストレス軽減効果などプロバイオティクス効果のあるラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物およびその微生物を含有する乳酸菌製剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、馬の腸内に常在するラクトバチルス（Lactobacillus）属の分布や構成を調べ、それらの馬の消化管由来株の分離同定を行う過程で、優勢菌種として広く分布する２種類のラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物の未同定菌株を分離した。そしてその菌株を馬に投与することにより、馬の下痢や疝痛の発生を予防・治療することができ、さらに馬およびラットに対してストレス軽減効果を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物を含有することを特徴とする乳酸菌製剤である。
【０００８】
また本発明は、
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（イ）および（ロ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である乳酸菌製剤：
（イ）Ｇ＋Ｃ含量が３４．３±２．０ｍｏｌ％
（ロ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）
JCM1231T株およびラクトバチルス・アビアリウス・サブスピーシズ・アビアリ
ウス（L.aviarius subsp. aviarius）JCM 5666T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同
性が６０％未満
である。
【０００９】
さらに本発明は、
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号２に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ハ）および（ニ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である乳酸菌製剤：
（ハ）Ｇ＋Ｃ含量が３７．５±２．０ｍｏｌ％
（ニ）近縁菌種の基準株であるカテニバクテリウム・ミツオカイ（Catenibacterium
mitsuokai）JCM 0609 T株、ラクトバチルス・ヴィトゥリニス（L. vitulinus）
JCM 1121T株およびラクトバチルス・カテナフォルミス（L. catenaformis）
JCM 1143T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の乳酸菌は、消化管内での定着能が高く、馬などの哺乳動物に投与することにより有効に下痢症や疝痛などの消化器疾患を予防・治療できるとともに、ストレスを低減できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の２種の新規な微生物はいずれも、競走馬の糞便より分離されたものである。
健常なサラブレッドの排泄後すぐの新鮮な糞便を、嫌気パック（アネロガスパック：三菱ガス化学製）に入れ、これを糞便が凍結しない７℃以下の冷蔵で運搬した。運搬された糞便を嫌気的な段階希釈法（光岡知足、「腸内菌の世界」、第２版、５３−６５、叢文社、１９８４）で段階希釈し、これの一部をＢＬ寒天培地またはＬＢＳ寒天培地（ともに栄研化学製）に塗抹し、スチール・ウール法で、３７℃で４８時間嫌気培養して形成されたコロニーから２種の新規なラクトバチルス属微生物を分離した。以下にこれら微生物の性質を示す。
【００１２】
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株の分類学的性質
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質および（ｄ）化学分類学的性質について以下に示す。
（ａ）形態的性質
（１）細菌の形：桿菌
（２）細菌の大きさ： １〜１．５×３〜５μｍ
（３）細菌の多形性：無
（４）運動性：無
（５）胞子：無
【００１３】
このラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株の顕微鏡写真を図１に示す。
【００１４】
（ｂ）培養的性質（生育状態）
（１）ＭＲＳ寒天培地での培養：
３７℃、４８時間培養により、直径０．５〜１．５ｍｍ程度の円形で扁平状に
隆起し、周縁および表面は円滑で、露滴状の構造であって、褐色で不透明、硬度
は脂状のコロニーを生じる。
（２）ＭＲＳ液体培地での培養：３７℃、１５時間培養によって懸濁する。
（Ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）カタラーゼ反応：陰性
（３）酸素に対する態度：通性嫌気性
（４）乳酸発酵：ホモ型
（５）グルコースから産生される乳酸の旋光性：Ｌ型
（６）グルコースからのガス発生：なし
（７）生育の範囲
温度 １５℃ なし
４５℃ あり
（８）耐塩性 ３％耐塩性
（９）糖類からの酸生成の有無
ＡＰＩ ５０ ＣＨ Ｓｙｓｔｅｍ （ＢｉｏＭｅｒｅｕｘ社製）を用いた。
（＋酸生成あり、＋／−酸生成わずかにあり、−酸生成なし）
グリセロール −
エリスリトール −
Ｄ−アラビノース −
Ｌ−アラビノース −
リボース −
Ｄ−キシロース −
Ｌ−キシロース −
アドニトール −
メチル−β−Ｄ−キシロピラノシド −
ガラクトース −
グルコース ＋
フラクトース ＋
マンノース ＋
ソルボース −
ラムノース −
ダルシトール −
イノシトール −
マンニトール ＋
ソルビトール −
メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド −
メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド −
Ｎ−アセチルグルコサミン ＋
アミグダリン ＋／−
アルブチン ＋
サリシン ＋
セロビオース ＋
マルトース ＋
ラクトース −
メリビオース −
シュクロース ＋
トレハロース −
イヌリン −
メレジトース −
ラフィノース ＋／−
デンプン −
グリコーゲン −
キシリトール −
ゲンチオビオース ＋
ツラノース −
Ｄ−リキソース −
Ｄ−タガトース −
Ｄ−フコース −
Ｌ−フコース −
Ｄ−アラビトール −
Ｌ−アラビトール −
グルコン酸 −
２−ケトグルコン酸 −
５−ケトグルコン酸 −
（１０）エスクリンの分解性：あり
【００１５】
（ｄ）化学分類学的性質
（１）Ｇ＋Ｃ含量
Mesbahらの方法（Mesbah, M., Premachandran, U.and Whitman, W. E. Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography. Int. J. Syst. Bacteriol., 39: 159-167,1989）によって測定した。
Ｇ＋Ｃ含量：３４．３±２．０ｍｏｌ％
（２）細胞壁のアミノ酸組成
アミノ酸組成：リジン、グルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸
ペプチドグリカンタイプ：Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｓｐ（Ａ４α）
（３）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列の相同性
（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定）
コロニーＰＣＲにより、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）により全１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を決定した。以下の２７Ｆ、７５Ｒ、５２０Ｆ、５２０Ｒ、９３０Ｆ、８００Ｒ、１１００Ｆ、１１００Ｒのプライマーを用いた。
【００１６】
＜１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’
【００１７】
決定したラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の塩基配列１に示す。
【００１８】
（相同性検索）
このラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。この結果、一般的に相同性が９７％未満であれば別種であるとされるが、最も近縁のL. salivarius JCM 1231 Tとの相同性は９６％であった。配列表の塩基配列１に対し相同性９７％以上であれば、本発明の微生物に含まれる。
【００１９】
なお、既存の最も近縁な株はLactobacillus salivarius JCM 1150（アクセッションナンバー：Ｍ５９０５４）であるが、L. salivariusには亜種の分類は不要とする説に基づき、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の最も近縁な基準株はL. salivarius JCM1231（アクセッションナンバー：ＡＦ０８９１０８）とした（Li, Y.,Raftis, E., Canchaya, C., Fitzgerald, G. F., van Sinderen, D. & O’Toole, P.W. (2006). Polyphasic analysis indicates that L. salivarius subsp. salivariusand L. salivarius subsp. salicinicus do not merit separate subspecies status. Int. J. Evol. Microbiol., 56, 2397-2403.）
【００２０】
（系統解析）
さらに解析ソフトＣＬＵＳＴＡＬ Ｗにより系統樹を作成した。図２は、既知のラクトバチルス属微生物とラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株との関係を示した系統樹の図である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値であり、また括弧内の記号はアクセッションナンバーを表す。
【００２１】
（４）近縁種とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、Ｅｚａｋｉらの蛍光検出によるマイクロプレート法（Int. J. Syst. Bacteriol., ３９，２２４−２２９、１９８９）により行った。２株の近縁菌種の基準株（L. salivarius JCM 1231 T、L. aviarius subsp. aviarius JCM 5666T）を、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株と比較するのに使用した。
【００２２】
（ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性）
L. salivarius JCM 1231 T：１４．２％
L. aviarius subsp. aviariusJCM 5666 T：７．９％
【００２３】
一般的に６０％以上のＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を持つ菌群を同一菌種とされる。しかしながら、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株は、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が２０％未満の低い相同性しか示さなかった。本願発明の微生物には、上記近縁菌種の基準株（L. salivarius JCM 1231 T、L. aviarius subsp. aviarius JCM 5666
T）とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満のものが含まれる。
【００２４】
以上の化学分類学的性質により、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株は、いままでに報告されていない新規な乳酸桿菌であると判断された。このラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株を平成１９年１月１９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、微生物寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３０１として寄託した。
【００２５】
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株の分類学的性質：
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株の（ａ）形態的性質、（ｂ）培養的性質、（ｃ）生理学的性質および（ｄ）化学分類学的性質について以下に示す。
（ａ）形態的性質
（１）細菌の形：桿菌
（２）細菌の大きさ： ０．７〜１×２〜１０μｍ
（３）運動性：無
（４）胞子：無
【００２６】
このラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株の顕微鏡写真を図３に示す。
【００２７】
（ｂ）培養的性質（生育状態）
（１）ＡＢＣＭブイヨン寒天培地での培養：
３７℃、２４時間培養により、直径１〜２．５ｍｍ程度のやや不規則な円形状
で扁平状に隆起し、周縁は波状、表面は円滑で、露滴状の構造であって、褐色で
透明、硬度は脂状のコロニーを生じる。
（２）ＡＢＣＭブイヨン液体培地での培養：
３７℃、１５〜２４時間培養によって懸濁する。
（Ｃ）生理学的性質
（１）グラム染色性：陽性
（２）カタラーゼ反応：陰性
（３）酸素に対する態度：嫌気性
（４）乳酸発酵：ヘテロ型
（５）グルコースから産生される乳酸の旋光性：Ｄ型
（６）グルコースからのガス発生：あり
（７）生育の範囲
温度 １５℃ なし
４５℃ あり
（８）耐塩性 ３％耐塩性
（９）糖類からの酸生成の有無
ＡＰＩ ５０ ＣＨ Ｓｙｓｔｅｍ （ＢｉｏＭｅｒｅｕｘ社製）を用いた。
（＋酸生成あり、＋／−酸生成わずかにあり、−酸生成なし）
Ｄ−アラビノース −
リボース −
Ｄ−キシロース −
ガラクトース ＋
グルコース ＋
フラクトース ＋
マンノース ＋
ラムノース −
マンニトール −
ソルビトール −
サリシン −
セロビオース ＋
ラクトース ＋
メリビオース ＋
トレハロース −
メレジトース −
ラフィノース −
デンプン ＋
グルコン酸 −
【００２８】
（ｄ）化学分類学的性質
（１）Ｇ＋Ｃ含量
Mesbahらの方法（Mesbah, M., U. Premachandran,and W. E. Whitman. Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography. Int. J. Syst. Bacteriol., 39: 159-167,1989）によって測定した。
Ｇ＋Ｃ含量：３４．３±２．０ｍｏｌ％
（２）細胞壁のアミノ酸組成
アミノ酸組成：アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン、メソジ
アミノピメリン酸
ペプチドグリカンタイプ：ｍｅｓｏ−ＤＡＰ ｄｉｒｅｃｔ（Ａ１γ）
【００２９】
（３）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性
（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定）
コロニーＰＣＲにより、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を増幅し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）により全１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列を決定した。以下の２７Ｆ、７５Ｒ、５２０Ｆ、５２０Ｒ、９３０Ｆ、８００Ｒ、１１００Ｆ、１１００Ｒのプライマーを用いた。
【００３０】
＜１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子増幅用および塩基配列決定用ＰＣＲプライマー＞
２７Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
７５Ｒ：５’−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣ
ＧＡＣＴＴ−３’
５２０Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧ−３’
５２０Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’
９３０Ｆ：５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧ−３’
８００Ｒ：５’−ＣＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴ−３’
１１００Ｆ：５’−ＣＡＧＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ−３’
１１００Ｒ：５’−ＡＧＧＧＴＴＧＣＧＣＴＣＧＴＴＧ−３’
【００３１】
決定したラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の塩基配列２に示す。
【００３２】
（相同性検索）
このラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。この結果、一般的に相同性が９７％未満であれば別種であるとされるが、最も近縁のL. catenaformis JCM 1143T（アクセッションナンバー：Ｍ２３７２９）との相同性は９３％であった。配列表の塩基配列２に対し相同性９７％以上であれば、本発明の微生物に含まれる。
【００３３】
（系統解析）
さらに解析ソフトＣＬＵＳＴＡＬ Ｗにより系統樹を作成した。図４は、既知のラクトバチルス属微生物とラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株との関係を示した系統樹の図である。図中の分岐点に示された数値は、ブートストラップ信頼値であり、括弧内の記号はアクセッションナンバーである。
【００３４】
（４）近縁種とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、Ｅｚａｋｉらの蛍光検出によるマイクロプレート法（Int. J. Syst. Bacteriol., ３９，２２４−２２９、１９８９）により行った。３株の近縁菌種の基準株（L. vitulinus JCM 1121T、L. catenaformis JCM 1143T、Catenibacterium mitsuokai JCM 0609T）を、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株と比較するのに使用した。
【００３５】
（ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性）
Catenibacterium mitsuokai JCM 0609 T：１５．６％
L.vitulinus JCM 1121T：１４．３％
L. catenaformis JCM 1143T：０．７％
【００３６】
このように、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株は、上記近縁菌種の基準株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が２０％未満の低い相同性しか示さなかった。本発明の微生物には、上記近縁菌種の基準株（Catenibacterium mitsuokai JCM 0609T、L. vitulinus JCM1121T、L. catenaformis JCM1143T）とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満のものが含まれる。
【００３７】
以上の化学分類学的性質により、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株は、いままでに報告されていない新規な乳酸桿菌であると判断された。このラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株を平成１９年１月１９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに、微生物寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３００として寄託した。
【００３８】
上記２種の本発明の微生物を得るには、通常の培養方法に準じて培養を行えばよい。例えばラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株はＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で２４時間培養して得られる。一方、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株は、ＡＢＣＭブイヨン培地に接種し、３７℃で２４時間培養して得ることができる。
【００３９】
本発明の乳酸菌製剤は、上記のように培養した本発明の２種の新規乳酸菌の培養液をそのまま用いることもできるが、遠心分離等の手段を用いて集菌した菌体をスキムミルク等に分散して懸濁液として用いてもよい。さらに、培養液や懸濁液を凍結乾燥等により乾燥させた乾燥菌体として用いることもできる。
【００４０】
本発明の乳酸菌製剤の剤型としては特に限定はなく、錠剤、粉剤、粒剤、カプセル、ペレット、液剤等の任意の剤型とすることができ、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、シュクロース、スキムミルク等の賦形剤やその他フラクトオリゴ糖など各種のプレバイオティクス成分等の任意成分を配合することもできる。
【００４１】
かくして得られた本発明の新規乳酸菌を馬などの哺乳動物に投与することにより、乳酸菌が消化管に付着・定着し、下痢や疝痛等の消化器疾患を予防・治療することができ、さらにはストレスを軽減させることができる。新規乳酸菌の投与量は１頭当たり１日に１×１０６〜１×１０１１ｃｆｕ（コロニー形成単位）程度、特に１×１０７〜１×１０１０ｃｆｕ程度が好ましい。なお、本発明においてストレスの軽減とは、本発明製剤の投与前後で血清アルブミンのフリーのＳＨ基保有率が例えば、対照群３頭の平均から、試験群の平均が１．５倍以上増加することをいう。
【００４２】
本発明の乳酸菌製剤は、馬などの哺乳動物に直接経口投与してもよく、飼料や餌等に混ぜて投与してもよい。なお、本発明の乳酸菌製剤の投与対象である哺乳動物としては、馬、牛、豚、ヒツジ、山羊等が例示できる。
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
実 施 例 １
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株の培養：
ＭＲＳ液体培地（Ｏｘｏｉｄ社製）５Ｌをフラスコに入れ、ｐＨを６．８に調整しオートクレーブで、１２１℃、１５分間の滅菌を行った。このＭＲＳ液体培地に、予め、ＢＬ寒天培地（栄研化学社製）で４８時間培養したコロニーを釣菌し、ＭＲＳ液体培地で２４時間のプレ培養したラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株培養液を０．２容量％接種し、３７℃、２４時間静置培養した。この培養液を３０００×ｇで遠心分離し集菌して湿重量約６ｇ／５Ｌの菌体ペレットを得た。
【００４５】
実 施 例 ２
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株含有乳酸菌製剤の調製：
実施例１により得られた菌体ペレットを生理食塩水で洗浄した。その菌体ペレット６ｇ（湿重量）を滅菌１０％スキムミルク５４ｍｌに懸濁し、この懸濁液を凍結乾燥処理して凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末に５質量倍のスキムミルク粉末を加えて均一に混合して本発明の乳酸菌製剤を得た。この乳酸菌製剤は、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株を７．０×１０１０ｃｆｕ／ｇ含有するものであった。
【００４６】
試 験 例 １
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の消化管付着性試験１：
実施例１で得られた菌体ペレット６ｇ（湿重量）を、あらかじめ滅菌しておいた１０％スキムミルク溶液５０ｍｌに懸濁し−８５℃で急冷した。融解試験を行ったところ、３×１０９ｃｆｕ／ｍｌの生菌数が認められた。この懸濁液１ｍｌを１０ｍｌの滅菌１０％スキムミルク溶液に再懸濁して試料とした。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１１ｍｌを５日間連日、シリンジで経口投与した（試験区）。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、１１ｍｌの滅菌１０％スキムミルクを５日間連続で経口投与した。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】
一般に定着性のない細菌の場合、投与した細菌は３日以内にすべてが排菌され、腸内フローラに影響を及ぼさないと考えられている。対照区では、ほとんど菌数の変化は見られなかったが、試験区では菌数が１オーダー増加していることから、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株が定着後に増殖しているものと考えられた。
【００４９】
試 験 例 ２
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の下痢症・疝痛予防効果：
試験例１において、それぞれの馬について試料投与開始から３０日間糞便の状態を観察し、各試験区について軟便が確認された延べ日数の合計を調べた。対照区では、延べ８日間の軟便が確認されたのに対し、試験区では、軟便は認められなかった。また、対照区では、延べ５日間の疝痛の徴候が確認されたのに対し、試験区では疝痛の徴候のある馬はみられなかった。したがって、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株が有する馬への下痢症・疝痛予防効果が認められた。
【００５０】
試 験 例 ３
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の消化管付着性試験２：
実施例２により得られた乳酸菌製剤を試料として用いた。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１．５ｇを飼葉０．５ｋｇの上に置いて投与する方法により５日間連続投与した（試験区）。完食を確認後、飼葉を自由摂取させた。試験例１とは別の個体を用いた。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、５日間、飼葉を自由摂取させた。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】
この結果から、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の乾燥粉末を投与してもラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株が定着後に増殖しているものと考えられた。
【００５３】
試 験 例 ４
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の馬のストレス軽減効果：
哺乳動物のストレス度合いは、血清中のアルブミンにおけるフリーＳＨ基保有率を指標とした。馬のストレスが高くなるとアルブミン中のフリーＳＨ基が酸化されこの割合が低下すると考えられる。測定方法は、J.P. Fabsiakらの方法に準じた（J.P. Fabsiak, A. Sedelov and V. E. Kagon Quantificaion of Oxidative/Nitrosative Modification of CYS34 in Human serumAlbumin Using a Fluorescence-based SDS-PAGE assay Antioxidants & Redox signaling vol.4 No.5 p855-865 (2002)）。
【００５４】
すなわち、試験例１および３のラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株を含有する試料を投与したうちの３馬について、馬用乳酸菌製剤投与５日間の５日目、その５日間の投与終了の１日目、投与終了９日後、投与終了１５日後、投与終了２２日後及び投与終了３０日後の血液を採取しその血清を得た（ＫＢＬ１３株投与群）。それから得られた馬血清を１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.４）により１００倍に希釈したものをサンプルとした。次に、このサンプルの２５０μｌに２４０μＭのＴｈｉｏ−Ｇｌｏ１（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ製）を２５μｌ（終濃度２０μＭ）と、３６０ｍＭのＳＤＳ（終濃度３０ｍＭ）またはＰＢＳの２５μｌを加え、分注器で混合した。これとは別にスタンダードとしてＤＴＴで還元したＢＳＡの５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌを同様に用意した後、６０℃で４５分間反応させる。続いて室温にて１５分間インキュベートし、これを３５５ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの蛍光波長で蛍光強度を測定した。また、サンプルの６０μｌに（−）ＢＰＢの４×サンプルバッファー２０μｌを添加しＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調製した。
このサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。電気泳動後のゲルのバンドをトランスイルミネーター（フナコシ社製）で写真を撮り、強度を数値化した。続いてＣＢＢＲにて染色し写真撮影後、アルブミンとしてのタンパク量もＮＩＨ−Ｉｍａｇｅで求めた。この蛍光強度を、ｓｔａｎｄａｒｄ ＢＳＡの蛍光強度に換算した血清量／通常（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の蛋白定量から、血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を求めた。通常（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の蛋白量は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）で求めた。対照として、試験例１および３において、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株を投与しなかった馬のうち３頭について同様に試験した（ＫＢＬ１３株無投与群）。結果を図５に示す。
【００５５】
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株投与群は、無投与群に比べて血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率が有意に高く、ストレスが軽減されている結果が得られた。１歳馬は、競走馬になるべくすでに調教が始まっており、実験に用いた馬はいずれもほぼ同じトレーニングを行っていたため、その調教がストレスになっているものと考えられる。また、そのストレス軽減効果は、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株投与を止めた４週間後でも持続していることが認められた。
【００５６】
実 施 例 ３
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株の培養：
ＡＢＣＭブイヨン培地（栄研化学社製）５Ｌをフラスコに入れ、ｐＨを７．２ に調整しオートクレーブで、１１５℃、１５分間の滅菌を行った。このＡＢＣＭブイヨン培地に、予め、ＢＬ寒天培地（栄研化学社製）で４８時間培養したコロニーを釣菌し、ＡＢＣＭブイヨン培地で２４時間のプレ培養したラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株培養液を０．２容量％接種し、３７℃、２４時間静置培養した。この培養液を３０００×ｇで遠心分離し集菌して湿重量約４ｇ／５Ｌの菌体ペレットを得た。
【００５７】
実 施 例 ４
ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株含有乳酸菌製剤の調製：
実施例３により得られた菌体ペレットを生理食塩水で洗浄した。その菌体ペレット
４ｇ（湿重量）を滅菌１０％スキムミルク４６ｍｌに懸濁し、凍結乾燥処理をして凍結乾燥粉末を得た。この凍結乾燥粉末に５質量倍のスキムミルク粉末を加えて均一に混合して本発明の乳酸菌製剤を得た。この乳酸菌製剤は、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株を４.５×１０１０ｃｆｕ／ｇ含有するものであった。
【００５８】
試 験 例 ５
ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の消化管付着性試験１：
実施例３で得られた菌体ペレット４ｇ（湿重量）を、あらかじめ滅菌しておいた１０％スキムミルク溶液４６ｍｌに懸濁し−８５℃で急冷した。融解試験を行ったところ、１×１０１０ｃｆｕ／ｍｌの生菌数が認められた。この懸濁液１ｍｌを１０ｍｌの滅菌１０％スキムミルク溶液に再懸濁して試料とした。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１１ｍｌを５日間連日、シリンジで経口投与した（試験区）。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、１１ｍｌの滅菌１０％スキムミルクを５日間連続で経口投与した。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表３に示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
対照区では、ほとんど菌数の変化は見られなかったが、試験区では菌数が1オーダー増加していることから、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株が定着後に増殖しているものと考えられた。
【００６１】
試 験 例 ６
ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の下痢症・疝痛予防効果：
試験例５において、それぞれの馬について試料投与開始から３０日間糞便の状態を観察し、各試験区について軟便が確認された延べ日数を調べた。対照区では、延べ８日間の軟便が確認されたのに対し、試験区では、軟便は認められなかった。また、対照区では、延５日間の疝痛の徴候が確認されたのに対し、試験区では疝痛の徴候はみられなかった。したがって、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株が有する馬への下痢症・疝痛予防効果が認められた。
【００６２】
試 験 例 ７
ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の消化管付着性試験２：
実施例４により得られた乳酸菌製剤を試料として用いた。２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、この試料１．５ｇを飼葉０．５ｋｇの上に置いて投与する方法により５日間連続投与した（試験区）。完食を確認後、飼葉を自由摂取させた。試験例６とは別の個体を用いた。対照区には、２頭の１歳牝馬および１頭の１歳牡馬に対し、５日間、飼葉を自由摂取させた。投与前と最終投与日から１０日後にそれぞれの馬の糞便中におけるラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の菌数測定を行った。菌数は各試験区の平均値とした。その結果を表４に示す。
【００６３】
【表４】
【００６４】
この結果から、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の乾燥粉末を投与してもラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株が定着後に増殖しているものと考えられた。
【００６５】
試 験 例 ８
ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の馬のストレス軽減効果：
試験例５および７のラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株を含有する試料を投与したうちの３馬について、試験例４と同様にしてストレス軽減効果確認試験を行った。結果を図６に示す。
【００６６】
ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株投与群は、無投与群に比べて血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率が有意に高く、ストレスが軽減されている結果が得られた。また、そのストレス軽減効果は、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株投与を止めた４週間後でも持続していることが認められた。
【００６７】
試 験 例 ９
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株のラットに対する拘束ス トレス軽減効果：
ラットに拘束ストレスを負荷し、血中コルチコステロンの濃度を測定することによりストレス軽減効果を評価した。金属製の拘束装置を用い、ラットを８時間（午前０時〜午前８時）拘束した。拘束の前後で尾静脈からの採血を行いコルチコステロンの血中濃度を測定した。コルチコステロン量の測定は、ＡＣＴＩＶＥ Ｒａｔ Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＤＳＬ社、１０−８１１００）を用いてイムノアッセイ法で測定した。試験群には、１０の８乗レベルとなる量の実施例１および３で得られたラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株をそれぞれ５日間連続で経口投与した（ｎ＝６）。乳酸菌を与えない群をコントロールとした。５日目に拘束ストレスをかけ、前日の血中コルチコステロン濃度と拘束ストレス負荷後の血中コルチコステロン濃度を求めた。結果を図７に示す。
【００６８】
コントロール群および各乳酸菌投与群ともにストレス負荷をかける前は、１００ｎｇ／ｍｌ未満の範囲であった。コントロール群は、血中コルチコステロン量がストレス負荷後に有意に上昇しており、有効なストレス刺激が負荷されたことが確認された。ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株投与群はいずれもコントロール群に比べて、ストレス付加後の血中コルチコステロン濃度は低くなり、ストレス軽減効果が認められた。
【００６９】
試 験 例 １０
ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株のラットに対する強
制水泳ストレス軽減効果：
直径２０ｃｍ、高さ５０ｃｍのプラスチック製の円筒に２７℃の水を４０ｃｍまで入れ、ラットを１５分間の強制水泳させ、強制水泳前後で尾静脈から採血し血中コルチコステロン量を測定した。試験群には、１０の８乗レベルとなる量の実施例１および３で得られたラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株をそれぞれ５日間連続で経口投与した（ｎ＝６）。乳酸菌を与えない群をコントロールとした。５日目に強制水泳させ、前日の血中コルチコステロン濃度と強制水泳ストレス負荷後の血中コルチコステロン濃度を求めた。結果を図８に示す。
【００７０】
コントロール群は、血中コルチコステロン量がストレス負荷後に有意に上昇しており、有効なストレス刺激が負荷されたことが確認された。ＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株投与群は、いずれもコントロール群に比べ、ストレス負荷後の血中コルチコステロン量が抑制され、ラットに対するストレス軽減効果があることがわかった。
【００７１】
試 験 例 １１
馬腸内フローラにおけるラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１
８株の分布（１）
国内各地の生産牧場および厩舎における０（当歳）〜３３歳までの様々な年齢の牡７頭、牝９頭の糞便を採取し、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法によりラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株を保有しているか調べた。その結果、ＫＢＬ１３株は１６頭中１６頭、ＳＴ１８株は１６頭中１４頭から検出されたことから、本発明の２種のラクトバチルス属微生物はいずれも、生産牧場や厩舎には関係なく、健常な馬の腸内フローラに普遍的に存在している微生物であると考えられる。したがって、本発明のラクトバチルス属微生物は馬に投与しても安全性の高いものである。
【００７２】
試 験 例 １２
馬腸内フローラにおけるラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１
８株の分布（２）
下記表５に示した健常なサラブレッド１２頭（Ａ〜Ｌ）の新鮮な糞便について、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＰＣＲ−ＤＧＧＥ）法により、ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株の分布を調べた。これらのサラブレッドは、糞便の採取１ヶ月以内に、生菌剤は使用していない。Walterら（Walter, J., Hertel, C., Tannock, G.W., Lis, C. M., Munro, K. & Hammes, W. P. (2001). Detection of Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella species in human feces by using group-specific PCR primers and denaturing gradient gel electrophoresis. Appl Environ Microbiol 67, 2578-2585)の文献に基づくＰＣＲ条件と、大腸菌の１６ＳｒＲＮＡ配列のＮｏ．３４１−５３４領域で３４０ｂｐを増幅させる下記のプライマーＬａｃ１とＬａｃ２ＧＣを用いた。
【００７３】
＜ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｃ１＞
５′−ＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡ−３′
＜ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｃ２ＧＣ＞
５′−ＣＧＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＧＧＣＡＣ
ＣＧＧＧＧＧＡＴＴＹＣＡＣＣＧＣＴＡＣＡＣＡＴＧ−３′
【００７４】
【表５】
【００７５】
ＤＧＧＥ泳動には、ＤＣｏｄｅシステム装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、各種糞便からラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株およびＳＴ１８株の検出を試みた。ＫＢＬ１３株の検出は次のようにして行った。変性剤（尿素とホルムアミド）で３５％から５０％の濃度勾配をつけた８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリアクリルアミドゲルを用いた。Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液に浸して、６０Ｖで１４時間、泳動した。泳動後のゲルは、１０ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液２５μｌを添加した２５０ｍｌＴＡＥ緩衝液で染色した。ラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株のバンドの特定は、純粋培養したラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株の移動度、およびそのバンドを切り出しての１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列決定によって、９８％以上の相同性のあるものをラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株とした。１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列決定は上記と同様の方法により行った。結果を図９に示す。
【００７６】
一方、ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の検出は次のようにして行った。変性剤（尿素とホルムアミド）で３７．５％から５２．５％の濃度勾配をつけた８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリアクリルアミドゲルを用いた。Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液に浸して、６０Ｖで１４時間、泳動した。泳動後のゲルは、１０ ｍｇ／ｍｌ 臭化エチジウム溶液２５μｌを添加した２５０ｍｌＴＡＥ緩衝液で染色した。ラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株のバンドの特定は、純粋培養したラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株の移動度、およびそのバンドを切り出しての１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列決定によって、９８％以上の相同性のあるものをラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株とした。１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列決定も上記と同様の方法により行った。結果を図１０に示す。
【００７７】
図９に示すとおり、１２頭のすべてのサラブレッドからラクトバチルス・エスピーＫＢＬ１３株が検出された。また図１０に示すとおり、１２頭中９頭のサラブレットからラクトバチルス・エスピーＳＴ１８株が検出された。この結果から、これらの菌種は、健常なサラブレッドの消化管内に広く分布し、またバンドの濃さの強弱は菌数を反映していることから、ラクトバチルス属の中で優勢に生育していることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明のラクトバチルス属微生物は、消化管に対して良好な付着性および定着性を示し、下痢や疝痛など消化器疾患の予防・治療効果を有し、さらにストレス軽減効果などプロバイオティクス効果をも有するものである。
【００７９】
したがって、本発明のラクトバチルス属微生物は、馬などの哺乳動物に投与する乳酸菌製剤として有利に利用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株の光学顕微鏡写真である。
【図２】既知のラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物とラクトバチルスＫＬＢ１３株との関係を示した系統樹である。
【図３】ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株の光学顕微鏡写真である。
【図４】既知のラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物とラクトバチルスＳＴ１８株との関係を示した系統樹である。
【図５】試験例４において、ラクトバチルスＫＢＬ１３株投与群と無投与群との血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を示す図である。
【図６】試験例８において、ラクトバチルスＳＴ１８株投与群と無投与群との血清アルブミン中のフリーＳＨ基保有率を示す図である。
【図７】試験例９における、拘束ストレス負荷前後の血中コルチコステロン濃度を示す図である。
【図８】試験例１０における、強制水泳ストレス負荷前後の血中コルチコステロン濃度を示す図である。
【図９】試験例１２における、ラクトバチルスＫＢＬ１３株のＰＣＲ−ＤＧＧＥ電気泳動図である。
【図１０】試験例１２における、ラクトバチルスＳＴ１８株のＰＣＲ−ＤＧＧＥ電気泳動図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物を含有することを特徴とする乳酸菌製剤。
【請求項２】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（イ）および（ロ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である請求項１記載の乳酸菌製剤：
（イ）Ｇ＋Ｃ含量が３４．３±２．０ｍｏｌ％
（ロ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）
JCM 1231T株およびラクトバチルス・アビアリウス・サブスピーシズ・アビア
リウス（L.aviarius subsp. aviarius）JCM 5666T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同
性が６０％未満
【請求項３】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株（寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３０１）である請求項第１項または第２項記載の乳酸菌製剤。
【請求項４】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号２に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ハ）および（ニ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である請求項第１項記載の乳酸菌製剤：
（ハ）Ｇ＋Ｃ含量が３７．５±２．０ｍｏｌ％
（ニ）近縁菌種の基準株であるカテニバクテリウム・ミツオカイ（Catenibacterium
mitsuokai）JCM 0609 T株、ラクトバチルス・ヴィトゥリニス（L. vitulinus）
JCM 1121T株およびラクトバチルス・カテナフォルミス（L. catenaformis）
JCM 1143T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
【請求項５】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株（寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３００）である請求項第１項または第４項記載の乳酸菌製剤。
【請求項６】
哺乳動物用である請求項１ないし５の何れかの項に記載の乳酸菌製剤。
【請求項７】
哺乳動物が馬である請求項６記載の乳酸菌製剤。
【請求項８】
配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ホ）および（ヘ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物：
（ホ）Ｇ＋Ｃ含量が３４．３±２．０ｍｏｌ％
（ヘ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）
JCM1231T株およびラクトバチルス・アビアリウス・サブスピーシズ・アビアリ
ウス（L.aviarius subsp. aviarius）JCM 5666T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同
性が６０％未満
【請求項９】
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株（寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３０１）である請求項第８項記載の微生物。
【請求項１０】
配列表の配列番号２に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ト）および（チ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物：
（ト）Ｇ＋Ｃ含量が３７．５±２．０ｍｏｌ％
（チ）近縁菌種の基準株であるカテニバクテリウム・ミツオカイ（Catenibacterium
mitsuokai）JCM 0609 T株、ラクトバチルス・ヴィトゥリニス（L. vitulinus）
JCM 1121T株およびラクトバチルス・カテナフォルミス（L. catenaformis）
JCM 1143T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
【請求項１１】
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株（寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３００）である請求項第１０項記載の微生物。
【請求項１２】
請求項８ないし１１の何れかの項記載の微生物を有効成分として含有することを特徴とする哺乳動物の下痢および／または疝痛の予防・治療用乳酸菌製剤。
【請求項１３】
哺乳動物が馬である請求項１１記載の下痢および／または疝痛の予防・治療用乳酸菌製剤。
【請求項１４】
請求項８ないし１１のいずれかの項記載の微生物を有効成分として含有することを特徴とする哺乳動物の抗ストレス用乳酸菌製剤。
【請求項１５】
哺乳動物が馬である請求項１３記載の抗ストレス用乳酸菌製剤。
【請求項１６】
非ヒト哺乳動物に請求項６ないし９の何れかの項記載の微生物を含有する乳酸菌製剤を投与することを特徴とする非ヒト哺乳動物のストレス低減方法。
【請求項１７】
非ヒト哺乳動物が馬である請求項１６記載のストレス低減方法。
【請求項１】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物を含有することを特徴とする乳酸菌製剤。
【請求項２】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（イ）および（ロ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である請求項１記載の乳酸菌製剤：
（イ）Ｇ＋Ｃ含量が３４．３±２．０ｍｏｌ％
（ロ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）
JCM 1231T株およびラクトバチルス・アビアリウス・サブスピーシズ・アビア
リウス（L.aviarius subsp. aviarius）JCM 5666T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同
性が６０％未満
【請求項３】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株（寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３０１）である請求項第１項または第２項記載の乳酸菌製剤。
【請求項４】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、配列表の配列番号２に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ハ）および（ニ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物である請求項第１項記載の乳酸菌製剤：
（ハ）Ｇ＋Ｃ含量が３７．５±２．０ｍｏｌ％
（ニ）近縁菌種の基準株であるカテニバクテリウム・ミツオカイ（Catenibacterium
mitsuokai）JCM 0609 T株、ラクトバチルス・ヴィトゥリニス（L. vitulinus）
JCM 1121T株およびラクトバチルス・カテナフォルミス（L. catenaformis）
JCM 1143T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
【請求項５】
ストレス軽減作用を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物が、ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株（寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３００）である請求項第１項または第４項記載の乳酸菌製剤。
【請求項６】
哺乳動物用である請求項１ないし５の何れかの項に記載の乳酸菌製剤。
【請求項７】
哺乳動物が馬である請求項６記載の乳酸菌製剤。
【請求項８】
配列表の配列番号１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ホ）および（ヘ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物：
（ホ）Ｇ＋Ｃ含量が３４．３±２．０ｍｏｌ％
（ヘ）近縁菌種の基準株であるラクトバチルス・サリバリウス（L. salivarius）
JCM1231T株およびラクトバチルス・アビアリウス・サブスピーシズ・アビアリ
ウス（L.aviarius subsp. aviarius）JCM 5666T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同
性が６０％未満
【請求項９】
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＫＢＬ１３株（寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３０１）である請求項第８項記載の微生物。
【請求項１０】
配列表の配列番号２に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を相同性９７％以上で含み、かつ以下の（ト）および（チ）の化学分類学的性質を有するラクトバチルス（Lactobacillus）属微生物：
（ト）Ｇ＋Ｃ含量が３７．５±２．０ｍｏｌ％
（チ）近縁菌種の基準株であるカテニバクテリウム・ミツオカイ（Catenibacterium
mitsuokai）JCM 0609 T株、ラクトバチルス・ヴィトゥリニス（L. vitulinus）
JCM 1121T株およびラクトバチルス・カテナフォルミス（L. catenaformis）
JCM 1143T株とのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性が６０％未満
【請求項１１】
ラクトバチルス・エスピー（Lactobacillus sp.）ＳＴ１８株（寄託番号 ＮＩＴＥ Ｐ−３００）である請求項第１０項記載の微生物。
【請求項１２】
請求項８ないし１１の何れかの項記載の微生物を有効成分として含有することを特徴とする哺乳動物の下痢および／または疝痛の予防・治療用乳酸菌製剤。
【請求項１３】
哺乳動物が馬である請求項１１記載の下痢および／または疝痛の予防・治療用乳酸菌製剤。
【請求項１４】
請求項８ないし１１のいずれかの項記載の微生物を有効成分として含有することを特徴とする哺乳動物の抗ストレス用乳酸菌製剤。
【請求項１５】
哺乳動物が馬である請求項１３記載の抗ストレス用乳酸菌製剤。
【請求項１６】
非ヒト哺乳動物に請求項６ないし９の何れかの項記載の微生物を含有する乳酸菌製剤を投与することを特徴とする非ヒト哺乳動物のストレス低減方法。
【請求項１７】
非ヒト哺乳動物が馬である請求項１６記載のストレス低減方法。
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２１２１４０（Ｐ２００８−２１２１４０Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２６９７５８（Ｐ２００７−２６９７５８）
【出願日】平成１９年１０月１７日（２００７．１０．１７）
【出願人】（５０７０４５８８９）クロスフィールドバイオ株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１７日（２００７．１０．１７）
【出願人】（５０７０４５８８９）クロスフィールドバイオ株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
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