新規な使用
炎症性疾患、特に、腸管炎症性疾患の予防または治療におけるガラクトオリゴ糖の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖、特に、炎症の予防または治療におけるガラクトオリゴ糖の使用、特に、腸管炎症の予防または治療における使用に関する。ガラクトオリゴ糖は、非可消化炭水化物であり、哺乳動物の胃腸の消化酵素に耐性があるが、特定の結腸細菌によって発酵する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腸管内菌叢は、病原性、良性および有益な微生物属を含む。前者が優勢であることにより、急性（例えば、胃腸炎）および慢性（例えば、炎症性腸疾患およびいくつかの腸がん）の双方であり得る腸管疾患が引き起こされ得る。
【０００３】
結腸内の１種または限定された種数の細菌の成長および／または活性を選択的に刺激することにより、宿主に有利に影響する非可消化食品成分と定義され、これにより宿主の健康が改善される、プレバイオティクスは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）等の数多くの炎症状態において、間接的な保護効果を有していることが示されている。あるＩＢＤ患者は、共生腸内細菌叢に対して適応免疫系が過反応性であることが知られている（Guarner F, Malagelada JR, Best Pract. Res. Clin. Gatroenterol., (2003); 17; 793-804を参照されたい）。それ故に、プレバイオティクスは、病気の再発防止に役立つ有益な腸内微生物叢を増強するために用いれらている（Sartor RD., Gastroenterology, (2004), 126, 1620-1633を参照のこと）。
【０００４】
プレバイオティクスに分類される化合物の１つのグループとして、ガラクトオリゴ糖が挙げられる。これらは、Ｇｌｃ β１−４［Ｇａｌ β１−６］ｎ、ここで、ｎ＝２〜５である、という形態の、ガラクトース含有オリゴ糖であり、β−ガラクトシダーゼ酵素の糖転移酵素活性を用いて、ラクトースシロップから産生される（Crittenden, (1999) Probiotics: A Critical Review, Tannock, G. (ed) Horizon Scientific Press, Wymondham, pp 141-156）。
【０００５】
欧州特許第１６４４４８２号には、ラクトースを新規なガラクトオリゴ糖混合物に転換するガラクトシダーゼ酵素活性を生じる、新規なビフィドバクテリウム・ビディフム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｄｉｆｕｍ）株が開示されている。このガラクトオリゴ糖混合物は、二糖：Ｇａｌ（β１‐３）Ｇｌｃ；Ｇａｌ（β１‐３）‐Ｇａｌ；Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ；Ｇａｌ（α１‐６）‐Ｇａｌ；三糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ；またはＧａｌ（β１‐３）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ；四糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃまたは五糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃを含み、プレバイオティクス性を有し、有益な細菌ビフィズス菌および乳酸菌の個体群を増加させることが示されている。このガラクトオリゴ糖混合物は、Ｂｉｍｕｎｏ（登録商標）の名称で市販されており、Ｃｌａｓａｄｏ社（英国、ミルトン・キーンズ）から入手可能である。
【０００６】
Vulevic, J et alは、Am. J Clin. Nutr., (2008), 88 : 1438-46において、健康な高齢者にガラクトオリゴ糖を投与することが、糞便の細菌叢組成物および免疫応答の双方において、いかに、好ましい効果をもたらしたかを記載している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＤＰ（重合度）３以上を有するガラクトオリゴ糖が、哺乳動物の腸管粘膜の炎症反応を直接調節し得ることを見出した。特に、このようなガラクトオリゴ糖は、炎症性物質の存在下、炎症促進性のケモカイン反応を減弱させる。従って、このようなガラクトオリゴ糖は、炎症性腸疾患、大腸炎、腸壊死性の大腸炎、偽膜性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、憩室炎、虚血等の腸管炎症状態の処置において有用であり得る。
【０００８】
本発明によれば、炎症の予防または治療、好ましくは、腸管炎症性疾患の予防または治療における使用のための、ＤＰが３以上のガラクトオリゴ糖が提供される。好ましくは、ガラクトオリゴ糖は３〜５のＤＰを有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｔ８４細胞内におけるＴＮＦ−α誘導ＩＬ−８分泌に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図２】（Ａ）および（Ｂ）は、ＮＣＭ−４６０細胞内におけるＴＮＦ−α誘導ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α分泌に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図３】（Ａ）および（Ｂ）は、ＴＮＦ−αで処理したＮＣＭ−４６０細胞内におけるＩＬ−８およびＭＩＰ−３α ｍＲＮＡの発現に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図４】（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、ＴＮＦ−αの核で処理したＮＣＭ−４６０細胞へのＮＦ−κＢ ｐ６５タンパク質の転座に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図５】ＮＣＭ−４６０細胞におけるＴＮＦ−α誘導ＩＬ−８分泌に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図６】ＮＣＭ−４６０細胞におけるＴＮＦ−α誘導ＩＬ−８分泌に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図７】（Ａ）および（Ｂ）は、ＤＳＳで処理したマウスにおけるＩＬ−６およびＭＩＰ−２分泌に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図８】（Ａ）および（Ｂ）は、ＩＬ−８およびＭＩＰ−３αの産生に対するガラクトオリゴ糖の種々の画分の効果をそれぞれ示す。
【図９】（Ａ）および（Ｂ）は、ＮＣＭ４６０細胞がＢｉｍｕｎｏならびにＤＰ３およびＤＰ＞３のその画分で処理されている場合、ＴＮＦ−α誘導ＩＬ ８およびＭＩＰ−３ αの産生に対する効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ガラクトオリゴ糖は、三糖の場合、Ｇａｌ‐Ｇａｌ‐Ｇｌｃ、四糖の場合、Ｇａｌ‐Ｇａｌ‐Ｇａｌ‐Ｇｌｃ、五糖の場合、Ｇａｌ‐Ｇａｌ‐Ｇｌａ‐Ｇａｌ‐Ｇｌｃという式を有し、ここで、Ｇａｌはガラクトース残基を示し、Ｇｌｃはグルコース残基を示す。ガラクトオリゴ糖の構造は、Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１‐３）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐ＧｌｃおよびＧａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃである。ガラクトオリゴ糖は、好ましくは、前述のガラクトオリゴ糖からなる群より選択される。
【００１１】
腸細胞は、単一の分極上皮層を形成し、宿主から腸腔環境を分離している。これらは、宿主の生体防御に貢献する。あらゆる炎症刺激に対する腸細胞の自然免疫反応は、主に、上皮のバリア機能を素早く再生することに関与する。上皮は、必要に応じて、損傷した粘膜に、好中球等の自然免疫細胞を補充するプロセスを開始する、炎症促進性サイトカインおよびケモカインを発現するように誘導される。例えば、ＩＬ−８等の炎症促進性ケモカインは、上皮細胞およびマクロファージによって、免疫応答の間、炎症を起こした粘膜に好中球およびＰＭＮ（多形核白血球）を補充するように、刺激され得る。マクロファージ炎症性タンパク質−３α（ＭＩＰ−３α）、またはＣＣＬ２０は、ケモカイン受容体ＣＣＲ６の活性化によってリンパ球および樹状細胞を活性化することにより、適応免疫系を誘発する別のケモカインである。ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α（ＣＣＬ２０）の誘導は、炎症誘発に対する反応の程度を示す。
【００１２】
種々の成人結腸細胞培養モデルの炎症反応に対するガラクトオリゴ糖の効果を研究した。生理的濃度において、ガラクトオリゴ糖は、腸管上皮細胞、即ちヒト腸細胞におけるＴＮＦ−α炎症刺激によって誘導される炎症促進性ケモカイン反応を減弱させることを予期せず見出した。
【００１３】
ガラクトオリゴ糖は、Ｂｉｍｕｎｏとして知られている市販のガラクトオリゴ糖混合物から、例えば、室温に保たれたＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムを用いて、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用いることによって、精製することで調製してもよい。水中にこの粉末を１０％ｗ／ｖで溶解し、脱イオン水で２ｍＬ／分の速度で溶出することにより、試料を調製してもよい。
【００１４】
これに代わって、Ｂｉｍｕｎｏ混合物の活性画分は、適切な酵素を用いて酵素糖転移によって調製してもよい。
【００１５】
ガラクトオリゴ糖は、粉末、シロップまたはソフトトローチの形態で提供してもよい。炎症性疾患、例えば、腸管炎症性疾患を患っている患者に、毎日、有効量の活性ガラクトオリゴ糖を１〜１０ｇ、好ましくは２〜５ｇ、最も好ましくは２．７５ｇ投与してもよい。これは、単一回投与、または、数時間を置いて、２回量投与とすることができる。ガラクトオリゴ糖粉末は、温かい飲み物に添加しても、食べ物に振り掛けてもよい。シロップは単独で消費することができ、これに代わり、飲料に混入、または、食べ物に塗ることができる。ソフトトローチは口の中で噛まれる。
【００１６】
炎症を予防するために、ガラクトオリゴ糖を個人に対して有効一日用量１〜１Ｏｇ、好ましくは２〜５ｇ、最も好ましくは２．７５ｇ投与してもよい。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、有効量のガラクトオリゴ糖を投与することを含む、腸管炎症等の炎症を処置または予防する方法が提供される。
【００１８】
以下の実施例および図面を参照し、本発明を更に説明する。
【実施例１】
【００１９】
サイトカイン分泌に対するガラクトオリゴ糖の効果
腸管上皮細胞は、初期濃度５ｘ１０５細胞／ｍＬから、２４−ウェルプレートにおいてコンフルエンスにまで成長した。細胞が７０％のコンフルエンスに達したとき、細胞を以下のように４連で処理した：（ｉ）ネガティブコントロール、（ｉｉ）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）ポジティブコントロール、（ｉｉｉ）Ｂ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）、ならびに（ｉｖ）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＢ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）。人乳に見出されるオリゴ糖の生理的濃度である、濃度５ｇ／Ｌのオリゴ糖を用いた。１６時間後、上清を採取し、ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α分泌を後にＥＬＩＳＡで測定するため−２０℃で保存した。以下の実験では、ＴＮＦ−αをＩＬｌβまたはフラゲリンで置き換えた。
【００２０】
ＩＬ−８の定量
ＩＬ−８の濃度を上述のようにＥＬＩＳＡによって測定した（Claud EC, Savidge T, Walker WA 2003 Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatr Res 53:419-425）。簡潔に述べると、９６ウェル高付着プレート（９６−ｗｅｌｌ ｈｉｇｈ ｂｏｎｄ ｐｌａｔｅ）（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｌｏｎ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ミドルタウン、バージニア州、米国）のそれぞれのウェルを、１００μＬの３μｇ／ｍＬマウス抗ヒトＩＬ−８モノクローナル抗体で一晩コーティングし、２００μＬの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＬの試料を３７℃にて１時間インキュベートした。次に、これらのウェルを３回洗浄し、１００μＬの０．１μｇ／ｍＬビオチン−標識マウス抗ヒトＩＬ−８抗体で１時間インキュベートした。もう一度洗浄した後、それぞれのウェルを１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼでインキュベートし、再び洗浄した後、１００μＬのＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩および過酸化水素でインキュベートした。１００μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、吸光度は４９０ｎｍを示した。試料中のＩＬ−８濃度は、ＩＬ−８検量線から計算した。
【００２１】
ＭＩＰ−３αの定量
プレートを一晩、１００μＬの２．０μｇ／ｍＬマウス抗ヒトＭＩＰ−３αモノクローナル抗体でコーティングしたことを除いてＩＬ−８と同様に、ＥＬＩＳＡによりＭＩＰ−３α分泌の量を測定した。検出抗体であるビオチン−標識マウス抗ヒトＭＩＰ−３α抗体は、検出抗体として濃度５０ｎｇ／ｍＬ、容積１００μＬで用いた。試料中のＭＩＰ−３α濃度は、ＭＩＰ−３α検量線から計算した。
【００２２】
細胞生存率アッセイ
Ｂ−ＧＯＳ細胞毒性を、トリパンブルー色素排除試験法を用いて調べた。ＮＣＭ−４６０細胞は、初期濃度２ｘ１０５細胞／ｍＬからカバーガラス上で成長した。これらの細胞は、Ｂ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）またはコントロール培地で、３連で処理した。１６時間後、ＮＣＭ−４６０細胞は、トリパンブルー色素排除アッセイにより細胞生存率をアッセイした（Raimondi F, Crivaro V, Capasso L, Maiuri L, Santoro P, Tucci M, Barone MV, Pappacoda S, Paludetto R 2006 Unconjugated bilirubin modulates the intestinal epithelial barrier function in a human-derived in vitro model. Pediatr Res 60:30-33）。この濃度での細胞の生存率に対するＢ−ＧＯＳの有意な効果はなかった。
【００２３】
サイトカイン転写の誘導に対するＢ−ＧＯＳの効果
ＮＣＭ−４６０細胞は、初期濃度５ｘ１０５細胞／ｍＬから６−ウェルプレートにおいてコンフルエンスにまで成長した。これらの細胞が７０％のコンフルエンスに達したときに、４連で、以下のように処理した：（ｉ）ネガティブコントロール、（ｉｉ）ＴＮＦ−αまたはＩＬｌβまたはフラゲリン（１０ｎｇ／ｍＬ）ポジティブコントロール、ならびに（ｉｉｉ）ＴＮＦ−αまたはＩＬｌβまたはフラゲリン（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＢ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）。１８時間後、全細胞ＲＮＡをトリゾール−クロロホルム抽出によって単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲキットを用いて、ＩＬ−８、ＭＩＰ−３αおよびＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現をＭＪ Ｏｐｔｉｃｏｎ ２上で測定し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現に標準化した。
【００２４】
ＮＦ−κＢ転座に対するＢ−ＧＯＳの効果
ＮＣＭ−４６０細胞は、カバーガラス上で７０％のコンフルエンシーにまで成長し、１０分間または３０分間の２連で、以下のように処理した：（ｉ）ネガティブコントロール、（ｉｉ）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）ポジティブコントロール、ならびに（ｉｉｉ）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＢ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）。培地を除去し、細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定した。メタノールによる透過処理および１０％ヤギ血清含有０．２５％ＢＳＡ含有ＴＢＳによるブロッキングの後、これらの細胞をウサギ抗ヒトＮＦ−κＢ ｐ６５ポリクローナル抗体でプローブした。洗浄後、これらの細胞をＣｙＴＭ ３−共役ヤギ抗ウサギ抗体でインキュベートした。次に、カバーガラスを洗浄し、スライドガラスに載せ、顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００−Ｓ）で可視化した。
【００２５】
材料
ＴＮＦ−αサイトカイン、ＩＬｌβ、フラゲリン、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびｈｕｍａｎ ＣＣＬ２０−ＭＩＰ−３α ＥＬＩＳＡ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｋｉｔｓ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）から入手した。抗ヒトＩＬ−８およびマウス抗ヒトＩＬ−８抗体は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎ社（ウォバーン、マサチューセッツ州、米国）から入手した。Ｏ−フェニレンジアミン錠剤をＰｉｅｒｃｅ社（ロックフォード、イリノイ州、米国）から入手した。トリゾール、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔｓ、およびｑＲＴ−ＰＣＲに必要な他の試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールズバッド、ＣＡ、米国）から入手した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＣＭＲＬ培地、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＨＥＰＥＳ緩衝液は、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールズバッド、ＣＡ、米国）から入手した。ウシ胎仔血清は、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（ローレンスビル、ジョージア州、米国）から入手した。Ｍ３Ｄは、Ｉｎｃｅｌｌ社（サンアントニオ、テキサス州、米国）から入手した。ウサギ抗ヒトＮＦ−κＢ（ｐ６５）ポリクローナル抗体をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（ギブズタウン、ニュージャージー州、米国）から入手した。ＣｙＴＭ ３−共役Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ウサギＩｇＧをＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社（ウェストグローブ、ペンシルヴァニア州、米国）から入手した。免疫蛍光法のための他の全ての試薬はＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂ社（バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）から入手した。他のすべての試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）製の分析用または分子生物学的用途のものであった。
【００２６】
Ｂ−ガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳ
Ｂｉｍｕｎｏ（登録商標）は、Ｃｌａｓａｄｏ社、ミルトンケインズ、英国により供給された。
【００２７】
腸管上皮細胞株
２つの成人ヒト腸管上皮培養モデルをこれらの研究に用いた。Ｔ８４およびＮＣＭ−４６０細胞は、それぞれ、形質転換した結腸上皮細胞および形質転換していない結腸上皮細胞である。細胞は、Ｆａｌｃｏｎ社製細胞培養ディッシュにおいて、３７℃にて、水蒸気によって飽和した９５％０２および５％ＣＯ２雰囲気で培養した。Ｔ８４培地は、ＦＢＳ（５％）、ＨＥＰＥＳ緩衝液、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリンおよびストレプトマイシン（１２）で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２から成っていた。ＮＣＭ−４６０培地は、ＦＢＳ（１０％）、上述のペニシリンおよびストレプトマイシン（１３）で補充されたＭ３Ｄ培地から成る。
【００２８】
統計分析
サイトカインの誘導は、標準誤差（ＳＥ）を表すエラーバーと共に、ポジティブコントロールに標準化された。グループ間の比較を、両側スチューデントｔ検定を用いて行った。ｑＲＴ−ＰＣＲによって得られた遺伝子発現データは、ＳＥを有する平均値として表された。グループ間の比較を、対数変換後に、両側スチューデントｔ検定を用いて行った。ｐ値＜０．０５は統計的に有意と考え、アスタリスク（＊）で示し、ｐ値＜０．０１は２つのアスタリスク（＊＊）で示し、ｐ値＜０．００１は３つのアスタリスク（＊＊＊）で示した。
【００２９】
結果
Ｔ８４細胞におけるサイトカイン分泌に対するガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳの効果（図１）
Ｔ８４細胞におけるＴＮＦ−α−誘導ＩＬ−８分泌は１００％に標準化され、４つの独立した実験間の比較を可能とした。処理されていないＴ８４細胞の基礎的なＩＬ−８分泌は２０．５％であった。ＴＮＦ−α刺激をすると、ＩＬ−８分泌は有意に増加し、４．９倍（ｐ＜０．００１）となった。
【００３０】
Ｂ−ＧＯＳの効果を測定するために、ガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）の存在下、ＴＮＦ−αによりまたはＴＮＦ−αなしにＴ８４細胞を刺激した。Ｂ−ＧＯＳ−処理したＴ８４細胞のＩＬ−８分泌は１６．４％であった。これは、処理されていないＴ８４細胞の基礎的レベルと有意に異なってはいなかった。ＴＮＦ−αによる刺激をすると、Ｂ−ＧＯＳは、ＩＬ−８分泌を有意に３８．５％（ｐ＜０．００１）減弱させた。
【００３１】
ＮＣＭ−４６０細胞におけるサイトカイン分泌に対するガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳの効果（図２、図５、図６）
ＮＣＭ−４６０細胞におけるＴＮＦ−α−誘導ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α分泌は１００％に標準化され、４つの独立した実験間の比較を可能とした。処理されていないＮＣＭ−４６０細胞の基礎的なＩＬ−８分泌およびＭＩＰ−３α分泌は、それぞれ１．７％および４．０％であった。ＴＮＦ−α刺激をすると、ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α分泌は有意に増加し、それぞれ５８．８倍（ｐ＜０．００１）（図２Ａ）および２５．０倍（ｐ＜０．００１）（図２Ｂ）となった。
【００３２】
Ｂ−ＧＯＳの効果を測定するために、ＮＣＭ−４６０細胞をガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）の存在下、ＴＮＦ−αによりまたはＴＮＦ−αなしに刺激した。Ｂ−ＧＯＳ処理したＮＣＭ−４６０細胞は、ＩＬ−８およびＭＩＰ−３αをそれぞれ１．１％および３．９％分泌した。これは、処理されていないＮＣＭ−４６０細胞の基礎的なレベルと有意に異なってはいなかった。ＴＮＦ−α刺激をすると、Ｂ−ＧＯＳは、ＩＬ−８分泌およびＭＩＰ−３α分泌を有意にそれぞれ４３．５％（ｐ＜０．００１）（図２Ａ）および５２．１％（ｐ＜０．０５）（図２Ｂ）減弱させた。同様に、ＴＮＦ−α刺激をする前に、ＮＣＭ−４６０細胞をＢ−ＧＯＳで予洗した場合、Ｂ−ＧＯＳが存在しない場合でもＩＬ８の分泌は有意に３２％（ｐ＜０．００１）減少した（図６）。このことは、Ｂ−ＧＯＳ混合物の構成物が、Ｔｏｌｌ様受容体（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＴＬＲ）等の上皮受容体と相互作用し、細胞の炎症刺激を予防することを示唆する。
【００３３】
同様に、フラゲリンで刺激すると、Ｂ−ＧＯＳは、有意にＩＬ−８分泌を２１．５％（ｐ＜０．０５）減弱させた（図５）。ＩＬ１βで刺激した場合、効果は観察できなかった。
【００３４】
Ｂ−ＧＯＳが細胞傷害性であるか否かを決定するために、ＮＣＭ−４６０細胞をＢ−ＧＯＳとともにまたはＢ−ＧＯＳなしに１６時間インキュベートした。Ｂ−ＧＯＳは、上記方法に記載のトリパンブルー色素排除アッセイによって測定されるＴ細胞の生存率に影響しなかった。
【００３５】
サイトカイン発現に対するガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳの効果（図３）
ＴＮＦ−α処理したＮＣＭ−４６０細胞の全ＲＮＡを単離し、ＩＬ−８、ＭＩＰ−３αおよびＭＣＰ−１ ｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした。ＴＮＦ−αで刺激すると、ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α ｍＲＮＡ発現は有意に増加し、それぞれ、１２．２倍（ｐ＜０．００１）（図３Ａ）および９９．４倍（ｐ＜０．００１）（図３Ｂ）となった。いずれの処理間においても、ＭＣＰ−Ｉ ｍＲＮＡ発現に変化は観察されなかった（ｐ＝０．１９）（データ図示せず）。Ｂ−ＧＯＳの効果を測定するために、ＮＣＭ−４６０細胞をＢ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）の存在下で、ＴＮＦ−αにより刺激した。ガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳは、ＴＮＦ−α−誘導ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α ｍＲＮＡ発現を、それぞれ、５．７倍（ｐ＜０．０５）（図３Ａ）および５８．９倍（ｐ＜０．０５）（図３Ｂ）で有意に減弱させた。ＭＣＰ−１ ｍＲＮＡ発現は、Ｂ−ＧＯＳにより減少したが、有意に達しなかった（ｐ＝０．０６）（データ示さず）。
【００３６】
ＮＦ−κＢ転座に対するガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳの効果（図４）
成人結腸ＮＣＭ−４６０細胞を、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）で処理し、ＮＦ−κＢ ｐ６５タンパク質の核転座をアッセイした。ビヒクルで処理したコントロール細胞において（図４Ａ）、ＮＦ−κＢ ｐ６５の染色は主に細胞質内であり、核にｐ６５タンパク質は存在しなかった。ＴＮＦ−αによる３０分間の刺激の後、明らかにＮＦ−κＢ ｐ６５は核内に移動した。
【００３７】
しかしながら、Ｂ−ＧＯＳの存在下では、ＴＮＦ−α−誘導ＮＦ−κＢ転座は、３０分で部分的に阻害された（図４Ｃ）。
【実施例２】
【００３８】
デキストラン硫酸ナトリウム誘導大腸炎マウスモデルにおけるＢ−ＧＯＳの効果のインビボ実験
【００３９】
材料方法
２つのグループ（それぞれｎ＝２４）の成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーハーバー、メーン州、米国）、従来法で飼育した（ＣＲ）マウスおよび細菌除去された（ＢＤ）マウスを用いて大腸炎を誘発させた。全ての動物を１２時間の明／暗周期内で飼育し、マウス固形飼料および水を自由に利用できるようにした。
【００４０】
６週齢において、従来法でコロニー形成したマウスは、未処理の水と共に従来の条件の下で飼育し（ＣＲグループ）、一方、ＢＤグループのマウスは、飲料水に抗生物質カクテルを付与して２週間与えた。カナマイシン（８ｍｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（０．７ｍｇ／ｍＬ）、コリスチン（３４，０００Ｕ／ｍＬ）、メトロニダゾール（４．３ｍｇ／ｍＬ）およびバンコマイシン（０．９ｍｇ／ｍＬ）で抗生物質カクテルは構成された。水中の抗生物質の濃度は、年齢群により消費された水の平均を基に計算した。
【００４１】
８週齢において、双方のグループ（ＣＲおよびＢＤ）の全てのマウスに、飲料水中に３．５％ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、オーロラ、オハイオ州、米国）を５日間与えることにより大腸炎を誘発させた。１０週齢において、それぞれのグループの半分のマウスに、Ｂｉｍｕｎｏ（５ｇ／ｌ）を７日間付与した。１０週の終りに、これらの動物を安楽死させ、分析のため腸を収集した。
【００４２】
サイトカイン測定
結腸組織ホモジネートにおいて、マウスＩＬ−６およびＭＩＰ−２サイトカインを、製造者による説明書に従ってＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州、米国）により分析した。簡潔に述べると、それぞれのグループの近接結腸を採取し、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを補充した１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳホモジナイジング緩衝液でホモジナイズした。ホモジナイズした溶液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を分注し、−７０℃で保存した。
【００４３】
結果
コントロールマウス（Ｂｉｍｕｎｏ非投与）と比較した、マウスの双方のグループ（ＣＲおよびＢＤ）においてＢｉｍｕｎｏがＤＳＳ大腸炎の損傷および炎症を減少させる能力を測定した。
【００４４】
従来のＤＳＳ処理マウスにおいて、ＩＬ−６およびＭＩＰ−２分泌が有意に誘導され、それぞれ２．２倍（ｐ＜０．０００１）および８．３倍（ｐ＜０．０００１）となった。Ｂｉｍｕｎｏは、ＩＬ−６およびＭＩＰ−２分泌を、それぞれ６．６倍（ｐ＜０．０００１）および５．５倍（ｐ＜０．０００１）有意に減弱させた。
【００４５】
ＢＤ ＤＳＳ処理マウスにおいて、ＩＬ−６およびＭＩＰ−２分泌が有意に誘導され、それぞれ６．２倍（ｐ＜０．０００１）および２７．２倍（ｐ＜０．０００５）であった。Ｂｉｍｕｎｏは、ＩＬ−６分泌を３．６倍（ｐ＜０．０００１）有意に減弱させた。ＭＩＰ−２分泌は１．３倍に減少したが、これは有意とは認められなかった（ｐ＝０．１２６）。
【００４６】
要約すると、従来のＤＳＳ処理マウスは未処理のグループと比較して大腸炎が進行した。Ｂｉｍｕｎｏ補充されＤＳＳ処理された従来のマウスは、有意に炎症のマーカー（ＩＬ−６およびＭＩＰ−２）を減少させ、大腸炎の症状を軽減させた。同様の効果が、細菌除去されたＤＳＳ処理マウスにおいても観察された。このことは、Ｂｉｍｕｎｏによる炎症の観察された減少は、細菌叢によって媒介されるのみではないことを示唆する。Ｂｉｍｕｎｏは、ＤＳＳ大腸炎において腸上皮に直接的な免疫調節効果を有する。
【実施例３】
【００４７】
炎症性サイトカインＴＮＦ−αの存在下でのＭＩＰ−３αおよびＩＬ−８サイトカインの産生に対するＢｉｍｕｎｏガラクトオリゴ糖混合物の画分の効果
【００４８】
材料および方法
Ｂｉｍｕｎｏ混合物からのＧＯＳ画分の採取
種々の画分のガラクトオリゴ糖（ラクトースを除いたＤＰ２、ＤＰ３およびＤＰ＞３）を分離および採取するために、室温に保ったＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラム（１００ｃｍｘ５ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、英国）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いた。全ての試料を、脱イオン水で２ｍＬ／分の割合で溶出し、１３２ＲＩ検出器（Ｇｉｌｓｏｎ社）によりモニタリングした。ＴＥＮＮＯＪＩ−ＫＵ（大阪、日本）により提供されるβ−ガラクトシダーゼＢＩＯＬＡＣＴＡ ＦＮＳにより、ラクトースをＤＰ２画分から除去した。１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液を緩衝液として、１ｍＭのＭｇＣＬ２を補因子として用い、加水分解を４０℃、ｐＨ６．４で行った。それぞれの画分の炭水化物量は、ＬａＣｈｒｏｍ ＲＩ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｌ−７４９０を備えたＲＣＭ−ＭＯＮＯＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ Ｒｅｚｅｘ ＨＰＬＣカラム ＭＥＲＣＫ社）上でのイオン排除およびイオン交換クロマトグラフィーによって分析した。オリゴ糖を、０．５ｍｌ／分、８４．４℃にて、脱イオン水で溶出した。
【００４９】
細胞培養
正常ヒト結腸粘膜上皮由来のＮＣＭ４６０細胞株は、ＩＮＣＥＬＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＬＬＣにより提供され、１０％［ｖ／ｖ］の胎児ウシ血清を補充したＭ３Ｂａｓｅ培地（ＩＮＣＥＬＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＬＬＣ）で、３７℃にて９５％空気、５％ＣＯ２の加湿された環境で維持した。
【００５０】
ＮＣＭ４６０培養によるサイトカイン産生の測定
濃度５ｘ１０５細胞／ｍＬのＮＣＭ４６０細胞を、２４−ウェルプレートに蒔き、３７℃にて９５％空気および５％ＣＯ２中でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、７０％のコンフルエンスに対応して、細胞を、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）（組換えヒトＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ―Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社）、ガラクトオリゴ糖画分（０．１３８ｇ／ｍｌのＤＰ２；０．０４９ｇ／ｍｌのＤＰ３；０．０４１ｇ／ｍｌのＤＰ＞３）、ならびにＴＮＦ−αとそれぞれの画分との混合物により、３連で処理した。コントロールは培地で成長した細胞から成っていた。次に、細胞を３７℃にて９５％空気、５％ＣＯ２中で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を採取し、２００μｌに分注して冷凍し、試験前に４００ｘｇで５分間遠心した。サイトカイン（ＭＩＰ−３αおよびＩＬ−８）の濃度を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州、米国）により提供されるＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥキットを用いてＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。
【００５１】
結果および考察
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて採取した３つの異なる画分は、以下の量のガラクトオリゴ糖を有していた：
ａ）ＤＰ２画分は、９０％のガラクト二糖を含み、残りの１０％は、単糖（１％）、ラクトース（６％）、三糖（２％）およびペンタオリゴ糖（ｐｅｎｔａｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）（１％）から構成され；
ｂ）ＤＰ３画分は、９７％のガラクト三糖および３％のＤＰ４オリゴ糖を含み；
ｃ）ＤＰ＞３画分は、９６％のＤＰ４およびＤＰ５を有するガラクトオリゴ糖と、４％のＤＰ３を有するガラクトオリゴ糖とを含んでいた。
【００５２】
ＩＬ−８およびＭＩＰ−３αの産生に対するこれら画分の効果は、それぞれ、図８（Ａ）および（Ｂ）に示す。
【００５３】
双方の実験について、ＤＰ３およびＤＰ＞３画分は、サイトカインの分泌を減少させた：
ａ）ＴＮＦ−α単独の場合と比べ、ＤＰ３は、ＩＬ−８の産生を３４％、ＭＩＰ−３αの産生を２５％減少させた；
ｂ）ＤＰ＞３の画分について、ＩＬ−８およびＭＩＰ−３αの減少は、それぞれ、３５％および５１％であった。
【００５４】
ＤＰ２画分の結果は明らかでなかった。ＩＬ−８分泌の減少は４９％であったが、この画分はＭＩＰ−３α産生に対していかなる効果も有さなかった。
【実施例４】
【００５５】
Ｂｉｍｕｎｏと比較した、炎症性サイトカインＴＮＦ−αの存在下でのＩＬ−８およびＭＩＰ−３αサイトカインの産生に対するＢｉｍｕｎｏガラクトオリゴ糖混合物の画分の効果
【００５６】
材料および方法
ＧＯＳ画分は、実施例３に記載のＢｉｍｕｎｏから調製した。
【００５７】
細胞培養
ＮＣＭ４６０細胞系統の細胞培養は、実施例３と同じ源から得られ、同様に維持された。
【００５８】
ＮＣＭ４６０培養によるサイトカイン産生の測定
濃度５ｘ１０５細胞／ｍＬのＮＣＭ４６０細胞を、２４−ウェルプレートに蒔き、３７℃にて９５％空気および５％ＣＯ２中でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、７０％のコンフルエンスに対応して、細胞を、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）（組換えヒトＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ―Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、並びにＴＮＦ−αとＢｉｍｕｎｏ（０．ｌｇ／ｍｌ）との混合物、ＴＮＦ−αとＢｉｍｕｎｏのＤＰ＝３画分（０．１ｇ／ｍｌ）との混合物、またはＴＮＦ−αとＢｉｍｕｎｏのＤＰ＞３画分（０．１ｇ／ｍｌ）との混合物で、３連で処理した。コントロールは培地で成長した細胞から成っていた。次に、細胞を３７℃にて９５％空気、５％ＣＯ２中で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を採取し、２００μｌに分注して冷凍し、試験前に４００ｘｇで５分間遠心した。サイトカイン（ＭＩＰ−３およびＩＬ−８）の濃度を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社により提供されるＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥキットを用いてＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。
【００５９】
結果
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて採取された２つの異なる画分は、
以下の量のガラクトオリゴ糖を有していた：
ａ）ＤＰ３を含む画分、
ｂ）ＤＰ＞３を含む画分。
【００６０】
ＩＬ−８およびＭＩＰ−３αの産生に対するガラクトオリゴ糖画分およびＢｉｍｕｎｏの効果を、それぞれ、図９（Ａ）および（Ｂ）に示す。図９（Ａ）および（Ｂ）から、Ｂｉｍｕｎｏと比較すると、ＤＰ３画分がＩＬ−８の産生を３５％以上減少させたことがわかる。ＭＩＰ−３αの産生の減少は、Ｂｉｍｕｎｏと比較すると、ＤＰ３画分を用いて３７％大きくなる。
【００６１】
ＤＰ＞３画分により、Ｂｉｍｕｎｏと比較したＩＬ−８の産生の減少が４０％大きくなり、ＭＩＰ−３ αの産生の減少は５５％大きくなる。
【００６２】
結論
ＤＰ３およびＤＰ＞３の画分が、全ガラクトオリゴ糖混合物（Ｂｉｍｕｎｏ）と等しい量で存在する場合、炎症に対する保護効果は有意に高い。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴ糖、特に、炎症の予防または治療におけるガラクトオリゴ糖の使用、特に、腸管炎症の予防または治療における使用に関する。ガラクトオリゴ糖は、非可消化炭水化物であり、哺乳動物の胃腸の消化酵素に耐性があるが、特定の結腸細菌によって発酵する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腸管内菌叢は、病原性、良性および有益な微生物属を含む。前者が優勢であることにより、急性（例えば、胃腸炎）および慢性（例えば、炎症性腸疾患およびいくつかの腸がん）の双方であり得る腸管疾患が引き起こされ得る。
【０００３】
結腸内の１種または限定された種数の細菌の成長および／または活性を選択的に刺激することにより、宿主に有利に影響する非可消化食品成分と定義され、これにより宿主の健康が改善される、プレバイオティクスは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）等の数多くの炎症状態において、間接的な保護効果を有していることが示されている。あるＩＢＤ患者は、共生腸内細菌叢に対して適応免疫系が過反応性であることが知られている（Guarner F, Malagelada JR, Best Pract. Res. Clin. Gatroenterol., (2003); 17; 793-804を参照されたい）。それ故に、プレバイオティクスは、病気の再発防止に役立つ有益な腸内微生物叢を増強するために用いれらている（Sartor RD., Gastroenterology, (2004), 126, 1620-1633を参照のこと）。
【０００４】
プレバイオティクスに分類される化合物の１つのグループとして、ガラクトオリゴ糖が挙げられる。これらは、Ｇｌｃ β１−４［Ｇａｌ β１−６］ｎ、ここで、ｎ＝２〜５である、という形態の、ガラクトース含有オリゴ糖であり、β−ガラクトシダーゼ酵素の糖転移酵素活性を用いて、ラクトースシロップから産生される（Crittenden, (1999) Probiotics: A Critical Review, Tannock, G. (ed) Horizon Scientific Press, Wymondham, pp 141-156）。
【０００５】
欧州特許第１６４４４８２号には、ラクトースを新規なガラクトオリゴ糖混合物に転換するガラクトシダーゼ酵素活性を生じる、新規なビフィドバクテリウム・ビディフム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｄｉｆｕｍ）株が開示されている。このガラクトオリゴ糖混合物は、二糖：Ｇａｌ（β１‐３）Ｇｌｃ；Ｇａｌ（β１‐３）‐Ｇａｌ；Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ；Ｇａｌ（α１‐６）‐Ｇａｌ；三糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ；またはＧａｌ（β１‐３）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ；四糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃまたは五糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃを含み、プレバイオティクス性を有し、有益な細菌ビフィズス菌および乳酸菌の個体群を増加させることが示されている。このガラクトオリゴ糖混合物は、Ｂｉｍｕｎｏ（登録商標）の名称で市販されており、Ｃｌａｓａｄｏ社（英国、ミルトン・キーンズ）から入手可能である。
【０００６】
Vulevic, J et alは、Am. J Clin. Nutr., (2008), 88 : 1438-46において、健康な高齢者にガラクトオリゴ糖を投与することが、糞便の細菌叢組成物および免疫応答の双方において、いかに、好ましい効果をもたらしたかを記載している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＤＰ（重合度）３以上を有するガラクトオリゴ糖が、哺乳動物の腸管粘膜の炎症反応を直接調節し得ることを見出した。特に、このようなガラクトオリゴ糖は、炎症性物質の存在下、炎症促進性のケモカイン反応を減弱させる。従って、このようなガラクトオリゴ糖は、炎症性腸疾患、大腸炎、腸壊死性の大腸炎、偽膜性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、憩室炎、虚血等の腸管炎症状態の処置において有用であり得る。
【０００８】
本発明によれば、炎症の予防または治療、好ましくは、腸管炎症性疾患の予防または治療における使用のための、ＤＰが３以上のガラクトオリゴ糖が提供される。好ましくは、ガラクトオリゴ糖は３〜５のＤＰを有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｔ８４細胞内におけるＴＮＦ−α誘導ＩＬ−８分泌に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図２】（Ａ）および（Ｂ）は、ＮＣＭ−４６０細胞内におけるＴＮＦ−α誘導ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α分泌に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図３】（Ａ）および（Ｂ）は、ＴＮＦ−αで処理したＮＣＭ−４６０細胞内におけるＩＬ−８およびＭＩＰ−３α ｍＲＮＡの発現に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図４】（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、ＴＮＦ−αの核で処理したＮＣＭ−４６０細胞へのＮＦ−κＢ ｐ６５タンパク質の転座に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図５】ＮＣＭ−４６０細胞におけるＴＮＦ−α誘導ＩＬ−８分泌に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図６】ＮＣＭ−４６０細胞におけるＴＮＦ−α誘導ＩＬ−８分泌に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図７】（Ａ）および（Ｂ）は、ＤＳＳで処理したマウスにおけるＩＬ−６およびＭＩＰ−２分泌に対するＢ−ＧＯＳの効果を示す。
【図８】（Ａ）および（Ｂ）は、ＩＬ−８およびＭＩＰ−３αの産生に対するガラクトオリゴ糖の種々の画分の効果をそれぞれ示す。
【図９】（Ａ）および（Ｂ）は、ＮＣＭ４６０細胞がＢｉｍｕｎｏならびにＤＰ３およびＤＰ＞３のその画分で処理されている場合、ＴＮＦ−α誘導ＩＬ ８およびＭＩＰ−３ αの産生に対する効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ガラクトオリゴ糖は、三糖の場合、Ｇａｌ‐Ｇａｌ‐Ｇｌｃ、四糖の場合、Ｇａｌ‐Ｇａｌ‐Ｇａｌ‐Ｇｌｃ、五糖の場合、Ｇａｌ‐Ｇａｌ‐Ｇｌａ‐Ｇａｌ‐Ｇｌｃという式を有し、ここで、Ｇａｌはガラクトース残基を示し、Ｇｌｃはグルコース残基を示す。ガラクトオリゴ糖の構造は、Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１‐３）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐ＧｌｃおよびＧａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃである。ガラクトオリゴ糖は、好ましくは、前述のガラクトオリゴ糖からなる群より選択される。
【００１１】
腸細胞は、単一の分極上皮層を形成し、宿主から腸腔環境を分離している。これらは、宿主の生体防御に貢献する。あらゆる炎症刺激に対する腸細胞の自然免疫反応は、主に、上皮のバリア機能を素早く再生することに関与する。上皮は、必要に応じて、損傷した粘膜に、好中球等の自然免疫細胞を補充するプロセスを開始する、炎症促進性サイトカインおよびケモカインを発現するように誘導される。例えば、ＩＬ−８等の炎症促進性ケモカインは、上皮細胞およびマクロファージによって、免疫応答の間、炎症を起こした粘膜に好中球およびＰＭＮ（多形核白血球）を補充するように、刺激され得る。マクロファージ炎症性タンパク質−３α（ＭＩＰ−３α）、またはＣＣＬ２０は、ケモカイン受容体ＣＣＲ６の活性化によってリンパ球および樹状細胞を活性化することにより、適応免疫系を誘発する別のケモカインである。ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α（ＣＣＬ２０）の誘導は、炎症誘発に対する反応の程度を示す。
【００１２】
種々の成人結腸細胞培養モデルの炎症反応に対するガラクトオリゴ糖の効果を研究した。生理的濃度において、ガラクトオリゴ糖は、腸管上皮細胞、即ちヒト腸細胞におけるＴＮＦ−α炎症刺激によって誘導される炎症促進性ケモカイン反応を減弱させることを予期せず見出した。
【００１３】
ガラクトオリゴ糖は、Ｂｉｍｕｎｏとして知られている市販のガラクトオリゴ糖混合物から、例えば、室温に保たれたＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムを用いて、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用いることによって、精製することで調製してもよい。水中にこの粉末を１０％ｗ／ｖで溶解し、脱イオン水で２ｍＬ／分の速度で溶出することにより、試料を調製してもよい。
【００１４】
これに代わって、Ｂｉｍｕｎｏ混合物の活性画分は、適切な酵素を用いて酵素糖転移によって調製してもよい。
【００１５】
ガラクトオリゴ糖は、粉末、シロップまたはソフトトローチの形態で提供してもよい。炎症性疾患、例えば、腸管炎症性疾患を患っている患者に、毎日、有効量の活性ガラクトオリゴ糖を１〜１０ｇ、好ましくは２〜５ｇ、最も好ましくは２．７５ｇ投与してもよい。これは、単一回投与、または、数時間を置いて、２回量投与とすることができる。ガラクトオリゴ糖粉末は、温かい飲み物に添加しても、食べ物に振り掛けてもよい。シロップは単独で消費することができ、これに代わり、飲料に混入、または、食べ物に塗ることができる。ソフトトローチは口の中で噛まれる。
【００１６】
炎症を予防するために、ガラクトオリゴ糖を個人に対して有効一日用量１〜１Ｏｇ、好ましくは２〜５ｇ、最も好ましくは２．７５ｇ投与してもよい。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、有効量のガラクトオリゴ糖を投与することを含む、腸管炎症等の炎症を処置または予防する方法が提供される。
【００１８】
以下の実施例および図面を参照し、本発明を更に説明する。
【実施例１】
【００１９】
サイトカイン分泌に対するガラクトオリゴ糖の効果
腸管上皮細胞は、初期濃度５ｘ１０５細胞／ｍＬから、２４−ウェルプレートにおいてコンフルエンスにまで成長した。細胞が７０％のコンフルエンスに達したとき、細胞を以下のように４連で処理した：（ｉ）ネガティブコントロール、（ｉｉ）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）ポジティブコントロール、（ｉｉｉ）Ｂ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）、ならびに（ｉｖ）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＢ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）。人乳に見出されるオリゴ糖の生理的濃度である、濃度５ｇ／Ｌのオリゴ糖を用いた。１６時間後、上清を採取し、ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α分泌を後にＥＬＩＳＡで測定するため−２０℃で保存した。以下の実験では、ＴＮＦ−αをＩＬｌβまたはフラゲリンで置き換えた。
【００２０】
ＩＬ−８の定量
ＩＬ−８の濃度を上述のようにＥＬＩＳＡによって測定した（Claud EC, Savidge T, Walker WA 2003 Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatr Res 53:419-425）。簡潔に述べると、９６ウェル高付着プレート（９６−ｗｅｌｌ ｈｉｇｈ ｂｏｎｄ ｐｌａｔｅ）（Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｌｏｎ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ミドルタウン、バージニア州、米国）のそれぞれのウェルを、１００μＬの３μｇ／ｍＬマウス抗ヒトＩＬ−８モノクローナル抗体で一晩コーティングし、２００μＬの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＬの試料を３７℃にて１時間インキュベートした。次に、これらのウェルを３回洗浄し、１００μＬの０．１μｇ／ｍＬビオチン−標識マウス抗ヒトＩＬ−８抗体で１時間インキュベートした。もう一度洗浄した後、それぞれのウェルを１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼでインキュベートし、再び洗浄した後、１００μＬのＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩および過酸化水素でインキュベートした。１００μＬの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、吸光度は４９０ｎｍを示した。試料中のＩＬ−８濃度は、ＩＬ−８検量線から計算した。
【００２１】
ＭＩＰ−３αの定量
プレートを一晩、１００μＬの２．０μｇ／ｍＬマウス抗ヒトＭＩＰ−３αモノクローナル抗体でコーティングしたことを除いてＩＬ−８と同様に、ＥＬＩＳＡによりＭＩＰ−３α分泌の量を測定した。検出抗体であるビオチン−標識マウス抗ヒトＭＩＰ−３α抗体は、検出抗体として濃度５０ｎｇ／ｍＬ、容積１００μＬで用いた。試料中のＭＩＰ−３α濃度は、ＭＩＰ−３α検量線から計算した。
【００２２】
細胞生存率アッセイ
Ｂ−ＧＯＳ細胞毒性を、トリパンブルー色素排除試験法を用いて調べた。ＮＣＭ−４６０細胞は、初期濃度２ｘ１０５細胞／ｍＬからカバーガラス上で成長した。これらの細胞は、Ｂ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）またはコントロール培地で、３連で処理した。１６時間後、ＮＣＭ−４６０細胞は、トリパンブルー色素排除アッセイにより細胞生存率をアッセイした（Raimondi F, Crivaro V, Capasso L, Maiuri L, Santoro P, Tucci M, Barone MV, Pappacoda S, Paludetto R 2006 Unconjugated bilirubin modulates the intestinal epithelial barrier function in a human-derived in vitro model. Pediatr Res 60:30-33）。この濃度での細胞の生存率に対するＢ−ＧＯＳの有意な効果はなかった。
【００２３】
サイトカイン転写の誘導に対するＢ−ＧＯＳの効果
ＮＣＭ−４６０細胞は、初期濃度５ｘ１０５細胞／ｍＬから６−ウェルプレートにおいてコンフルエンスにまで成長した。これらの細胞が７０％のコンフルエンスに達したときに、４連で、以下のように処理した：（ｉ）ネガティブコントロール、（ｉｉ）ＴＮＦ−αまたはＩＬｌβまたはフラゲリン（１０ｎｇ／ｍＬ）ポジティブコントロール、ならびに（ｉｉｉ）ＴＮＦ−αまたはＩＬｌβまたはフラゲリン（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＢ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）。１８時間後、全細胞ＲＮＡをトリゾール−クロロホルム抽出によって単離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲキットを用いて、ＩＬ−８、ＭＩＰ−３αおよびＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現をＭＪ Ｏｐｔｉｃｏｎ ２上で測定し、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現に標準化した。
【００２４】
ＮＦ−κＢ転座に対するＢ−ＧＯＳの効果
ＮＣＭ−４６０細胞は、カバーガラス上で７０％のコンフルエンシーにまで成長し、１０分間または３０分間の２連で、以下のように処理した：（ｉ）ネガティブコントロール、（ｉｉ）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）ポジティブコントロール、ならびに（ｉｉｉ）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＢ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）。培地を除去し、細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定した。メタノールによる透過処理および１０％ヤギ血清含有０．２５％ＢＳＡ含有ＴＢＳによるブロッキングの後、これらの細胞をウサギ抗ヒトＮＦ−κＢ ｐ６５ポリクローナル抗体でプローブした。洗浄後、これらの細胞をＣｙＴＭ ３−共役ヤギ抗ウサギ抗体でインキュベートした。次に、カバーガラスを洗浄し、スライドガラスに載せ、顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００−Ｓ）で可視化した。
【００２５】
材料
ＴＮＦ−αサイトカイン、ＩＬｌβ、フラゲリン、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびｈｕｍａｎ ＣＣＬ２０−ＭＩＰ−３α ＥＬＩＳＡ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｋｉｔｓ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、ミネソタ州、米国）から入手した。抗ヒトＩＬ−８およびマウス抗ヒトＩＬ−８抗体は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎ社（ウォバーン、マサチューセッツ州、米国）から入手した。Ｏ−フェニレンジアミン錠剤をＰｉｅｒｃｅ社（ロックフォード、イリノイ州、米国）から入手した。トリゾール、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ｑＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔｓ、およびｑＲＴ−ＰＣＲに必要な他の試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールズバッド、ＣＡ、米国）から入手した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＣＭＲＬ培地、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＨＥＰＥＳ緩衝液は、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カールズバッド、ＣＡ、米国）から入手した。ウシ胎仔血清は、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社（ローレンスビル、ジョージア州、米国）から入手した。Ｍ３Ｄは、Ｉｎｃｅｌｌ社（サンアントニオ、テキサス州、米国）から入手した。ウサギ抗ヒトＮＦ−κＢ（ｐ６５）ポリクローナル抗体をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（ギブズタウン、ニュージャージー州、米国）から入手した。ＣｙＴＭ ３−共役Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ウサギＩｇＧをＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社（ウェストグローブ、ペンシルヴァニア州、米国）から入手した。免疫蛍光法のための他の全ての試薬はＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂ社（バーリンゲーム、カリフォルニア州、米国）から入手した。他のすべての試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）製の分析用または分子生物学的用途のものであった。
【００２６】
Ｂ−ガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳ
Ｂｉｍｕｎｏ（登録商標）は、Ｃｌａｓａｄｏ社、ミルトンケインズ、英国により供給された。
【００２７】
腸管上皮細胞株
２つの成人ヒト腸管上皮培養モデルをこれらの研究に用いた。Ｔ８４およびＮＣＭ−４６０細胞は、それぞれ、形質転換した結腸上皮細胞および形質転換していない結腸上皮細胞である。細胞は、Ｆａｌｃｏｎ社製細胞培養ディッシュにおいて、３７℃にて、水蒸気によって飽和した９５％０２および５％ＣＯ２雰囲気で培養した。Ｔ８４培地は、ＦＢＳ（５％）、ＨＥＰＥＳ緩衝液、グルタミン、非必須アミノ酸、ペニシリンおよびストレプトマイシン（１２）で補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２から成っていた。ＮＣＭ−４６０培地は、ＦＢＳ（１０％）、上述のペニシリンおよびストレプトマイシン（１３）で補充されたＭ３Ｄ培地から成る。
【００２８】
統計分析
サイトカインの誘導は、標準誤差（ＳＥ）を表すエラーバーと共に、ポジティブコントロールに標準化された。グループ間の比較を、両側スチューデントｔ検定を用いて行った。ｑＲＴ−ＰＣＲによって得られた遺伝子発現データは、ＳＥを有する平均値として表された。グループ間の比較を、対数変換後に、両側スチューデントｔ検定を用いて行った。ｐ値＜０．０５は統計的に有意と考え、アスタリスク（＊）で示し、ｐ値＜０．０１は２つのアスタリスク（＊＊）で示し、ｐ値＜０．００１は３つのアスタリスク（＊＊＊）で示した。
【００２９】
結果
Ｔ８４細胞におけるサイトカイン分泌に対するガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳの効果（図１）
Ｔ８４細胞におけるＴＮＦ−α−誘導ＩＬ−８分泌は１００％に標準化され、４つの独立した実験間の比較を可能とした。処理されていないＴ８４細胞の基礎的なＩＬ−８分泌は２０．５％であった。ＴＮＦ−α刺激をすると、ＩＬ−８分泌は有意に増加し、４．９倍（ｐ＜０．００１）となった。
【００３０】
Ｂ−ＧＯＳの効果を測定するために、ガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）の存在下、ＴＮＦ−αによりまたはＴＮＦ−αなしにＴ８４細胞を刺激した。Ｂ−ＧＯＳ−処理したＴ８４細胞のＩＬ−８分泌は１６．４％であった。これは、処理されていないＴ８４細胞の基礎的レベルと有意に異なってはいなかった。ＴＮＦ−αによる刺激をすると、Ｂ−ＧＯＳは、ＩＬ−８分泌を有意に３８．５％（ｐ＜０．００１）減弱させた。
【００３１】
ＮＣＭ−４６０細胞におけるサイトカイン分泌に対するガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳの効果（図２、図５、図６）
ＮＣＭ−４６０細胞におけるＴＮＦ−α−誘導ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α分泌は１００％に標準化され、４つの独立した実験間の比較を可能とした。処理されていないＮＣＭ−４６０細胞の基礎的なＩＬ−８分泌およびＭＩＰ−３α分泌は、それぞれ１．７％および４．０％であった。ＴＮＦ−α刺激をすると、ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α分泌は有意に増加し、それぞれ５８．８倍（ｐ＜０．００１）（図２Ａ）および２５．０倍（ｐ＜０．００１）（図２Ｂ）となった。
【００３２】
Ｂ−ＧＯＳの効果を測定するために、ＮＣＭ−４６０細胞をガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）の存在下、ＴＮＦ−αによりまたはＴＮＦ−αなしに刺激した。Ｂ−ＧＯＳ処理したＮＣＭ−４６０細胞は、ＩＬ−８およびＭＩＰ−３αをそれぞれ１．１％および３．９％分泌した。これは、処理されていないＮＣＭ−４６０細胞の基礎的なレベルと有意に異なってはいなかった。ＴＮＦ−α刺激をすると、Ｂ−ＧＯＳは、ＩＬ−８分泌およびＭＩＰ−３α分泌を有意にそれぞれ４３．５％（ｐ＜０．００１）（図２Ａ）および５２．１％（ｐ＜０．０５）（図２Ｂ）減弱させた。同様に、ＴＮＦ−α刺激をする前に、ＮＣＭ−４６０細胞をＢ−ＧＯＳで予洗した場合、Ｂ−ＧＯＳが存在しない場合でもＩＬ８の分泌は有意に３２％（ｐ＜０．００１）減少した（図６）。このことは、Ｂ−ＧＯＳ混合物の構成物が、Ｔｏｌｌ様受容体（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＴＬＲ）等の上皮受容体と相互作用し、細胞の炎症刺激を予防することを示唆する。
【００３３】
同様に、フラゲリンで刺激すると、Ｂ−ＧＯＳは、有意にＩＬ−８分泌を２１．５％（ｐ＜０．０５）減弱させた（図５）。ＩＬ１βで刺激した場合、効果は観察できなかった。
【００３４】
Ｂ−ＧＯＳが細胞傷害性であるか否かを決定するために、ＮＣＭ−４６０細胞をＢ−ＧＯＳとともにまたはＢ−ＧＯＳなしに１６時間インキュベートした。Ｂ−ＧＯＳは、上記方法に記載のトリパンブルー色素排除アッセイによって測定されるＴ細胞の生存率に影響しなかった。
【００３５】
サイトカイン発現に対するガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳの効果（図３）
ＴＮＦ−α処理したＮＣＭ−４６０細胞の全ＲＮＡを単離し、ＩＬ−８、ＭＩＰ−３αおよびＭＣＰ−１ ｍＲＮＡ発現をｑＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした。ＴＮＦ−αで刺激すると、ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α ｍＲＮＡ発現は有意に増加し、それぞれ、１２．２倍（ｐ＜０．００１）（図３Ａ）および９９．４倍（ｐ＜０．００１）（図３Ｂ）となった。いずれの処理間においても、ＭＣＰ−Ｉ ｍＲＮＡ発現に変化は観察されなかった（ｐ＝０．１９）（データ図示せず）。Ｂ−ＧＯＳの効果を測定するために、ＮＣＭ−４６０細胞をＢ−ＧＯＳ（５ｇ／Ｌ）の存在下で、ＴＮＦ−αにより刺激した。ガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳは、ＴＮＦ−α−誘導ＩＬ−８およびＭＩＰ−３α ｍＲＮＡ発現を、それぞれ、５．７倍（ｐ＜０．０５）（図３Ａ）および５８．９倍（ｐ＜０．０５）（図３Ｂ）で有意に減弱させた。ＭＣＰ−１ ｍＲＮＡ発現は、Ｂ−ＧＯＳにより減少したが、有意に達しなかった（ｐ＝０．０６）（データ示さず）。
【００３６】
ＮＦ−κＢ転座に対するガラクトオリゴ糖Ｂ−ＧＯＳの効果（図４）
成人結腸ＮＣＭ−４６０細胞を、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）で処理し、ＮＦ−κＢ ｐ６５タンパク質の核転座をアッセイした。ビヒクルで処理したコントロール細胞において（図４Ａ）、ＮＦ−κＢ ｐ６５の染色は主に細胞質内であり、核にｐ６５タンパク質は存在しなかった。ＴＮＦ−αによる３０分間の刺激の後、明らかにＮＦ−κＢ ｐ６５は核内に移動した。
【００３７】
しかしながら、Ｂ−ＧＯＳの存在下では、ＴＮＦ−α−誘導ＮＦ−κＢ転座は、３０分で部分的に阻害された（図４Ｃ）。
【実施例２】
【００３８】
デキストラン硫酸ナトリウム誘導大腸炎マウスモデルにおけるＢ−ＧＯＳの効果のインビボ実験
【００３９】
材料方法
２つのグループ（それぞれｎ＝２４）の成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーハーバー、メーン州、米国）、従来法で飼育した（ＣＲ）マウスおよび細菌除去された（ＢＤ）マウスを用いて大腸炎を誘発させた。全ての動物を１２時間の明／暗周期内で飼育し、マウス固形飼料および水を自由に利用できるようにした。
【００４０】
６週齢において、従来法でコロニー形成したマウスは、未処理の水と共に従来の条件の下で飼育し（ＣＲグループ）、一方、ＢＤグループのマウスは、飲料水に抗生物質カクテルを付与して２週間与えた。カナマイシン（８ｍｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（０．７ｍｇ／ｍＬ）、コリスチン（３４，０００Ｕ／ｍＬ）、メトロニダゾール（４．３ｍｇ／ｍＬ）およびバンコマイシン（０．９ｍｇ／ｍＬ）で抗生物質カクテルは構成された。水中の抗生物質の濃度は、年齢群により消費された水の平均を基に計算した。
【００４１】
８週齢において、双方のグループ（ＣＲおよびＢＤ）の全てのマウスに、飲料水中に３．５％ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、オーロラ、オハイオ州、米国）を５日間与えることにより大腸炎を誘発させた。１０週齢において、それぞれのグループの半分のマウスに、Ｂｉｍｕｎｏ（５ｇ／ｌ）を７日間付与した。１０週の終りに、これらの動物を安楽死させ、分析のため腸を収集した。
【００４２】
サイトカイン測定
結腸組織ホモジネートにおいて、マウスＩＬ−６およびＭＩＰ−２サイトカインを、製造者による説明書に従ってＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州、米国）により分析した。簡潔に述べると、それぞれのグループの近接結腸を採取し、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを補充した１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳホモジナイジング緩衝液でホモジナイズした。ホモジナイズした溶液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を分注し、−７０℃で保存した。
【００４３】
結果
コントロールマウス（Ｂｉｍｕｎｏ非投与）と比較した、マウスの双方のグループ（ＣＲおよびＢＤ）においてＢｉｍｕｎｏがＤＳＳ大腸炎の損傷および炎症を減少させる能力を測定した。
【００４４】
従来のＤＳＳ処理マウスにおいて、ＩＬ−６およびＭＩＰ−２分泌が有意に誘導され、それぞれ２．２倍（ｐ＜０．０００１）および８．３倍（ｐ＜０．０００１）となった。Ｂｉｍｕｎｏは、ＩＬ−６およびＭＩＰ−２分泌を、それぞれ６．６倍（ｐ＜０．０００１）および５．５倍（ｐ＜０．０００１）有意に減弱させた。
【００４５】
ＢＤ ＤＳＳ処理マウスにおいて、ＩＬ−６およびＭＩＰ−２分泌が有意に誘導され、それぞれ６．２倍（ｐ＜０．０００１）および２７．２倍（ｐ＜０．０００５）であった。Ｂｉｍｕｎｏは、ＩＬ−６分泌を３．６倍（ｐ＜０．０００１）有意に減弱させた。ＭＩＰ−２分泌は１．３倍に減少したが、これは有意とは認められなかった（ｐ＝０．１２６）。
【００４６】
要約すると、従来のＤＳＳ処理マウスは未処理のグループと比較して大腸炎が進行した。Ｂｉｍｕｎｏ補充されＤＳＳ処理された従来のマウスは、有意に炎症のマーカー（ＩＬ−６およびＭＩＰ−２）を減少させ、大腸炎の症状を軽減させた。同様の効果が、細菌除去されたＤＳＳ処理マウスにおいても観察された。このことは、Ｂｉｍｕｎｏによる炎症の観察された減少は、細菌叢によって媒介されるのみではないことを示唆する。Ｂｉｍｕｎｏは、ＤＳＳ大腸炎において腸上皮に直接的な免疫調節効果を有する。
【実施例３】
【００４７】
炎症性サイトカインＴＮＦ−αの存在下でのＭＩＰ−３αおよびＩＬ−８サイトカインの産生に対するＢｉｍｕｎｏガラクトオリゴ糖混合物の画分の効果
【００４８】
材料および方法
Ｂｉｍｕｎｏ混合物からのＧＯＳ画分の採取
種々の画分のガラクトオリゴ糖（ラクトースを除いたＤＰ２、ＤＰ３およびＤＰ＞３）を分離および採取するために、室温に保ったＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラム（１００ｃｍｘ５ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、英国）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを用いた。全ての試料を、脱イオン水で２ｍＬ／分の割合で溶出し、１３２ＲＩ検出器（Ｇｉｌｓｏｎ社）によりモニタリングした。ＴＥＮＮＯＪＩ−ＫＵ（大阪、日本）により提供されるβ−ガラクトシダーゼＢＩＯＬＡＣＴＡ ＦＮＳにより、ラクトースをＤＰ２画分から除去した。１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液を緩衝液として、１ｍＭのＭｇＣＬ２を補因子として用い、加水分解を４０℃、ｐＨ６．４で行った。それぞれの画分の炭水化物量は、ＬａＣｈｒｏｍ ＲＩ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｌ−７４９０を備えたＲＣＭ−ＭＯＮＯＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ Ｒｅｚｅｘ ＨＰＬＣカラム ＭＥＲＣＫ社）上でのイオン排除およびイオン交換クロマトグラフィーによって分析した。オリゴ糖を、０．５ｍｌ／分、８４．４℃にて、脱イオン水で溶出した。
【００４９】
細胞培養
正常ヒト結腸粘膜上皮由来のＮＣＭ４６０細胞株は、ＩＮＣＥＬＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＬＬＣにより提供され、１０％［ｖ／ｖ］の胎児ウシ血清を補充したＭ３Ｂａｓｅ培地（ＩＮＣＥＬＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＬＬＣ）で、３７℃にて９５％空気、５％ＣＯ２の加湿された環境で維持した。
【００５０】
ＮＣＭ４６０培養によるサイトカイン産生の測定
濃度５ｘ１０５細胞／ｍＬのＮＣＭ４６０細胞を、２４−ウェルプレートに蒔き、３７℃にて９５％空気および５％ＣＯ２中でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、７０％のコンフルエンスに対応して、細胞を、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）（組換えヒトＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ―Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社）、ガラクトオリゴ糖画分（０．１３８ｇ／ｍｌのＤＰ２；０．０４９ｇ／ｍｌのＤＰ３；０．０４１ｇ／ｍｌのＤＰ＞３）、ならびにＴＮＦ−αとそれぞれの画分との混合物により、３連で処理した。コントロールは培地で成長した細胞から成っていた。次に、細胞を３７℃にて９５％空気、５％ＣＯ２中で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を採取し、２００μｌに分注して冷凍し、試験前に４００ｘｇで５分間遠心した。サイトカイン（ＭＩＰ−３αおよびＩＬ−８）の濃度を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州、米国）により提供されるＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥキットを用いてＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。
【００５１】
結果および考察
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて採取した３つの異なる画分は、以下の量のガラクトオリゴ糖を有していた：
ａ）ＤＰ２画分は、９０％のガラクト二糖を含み、残りの１０％は、単糖（１％）、ラクトース（６％）、三糖（２％）およびペンタオリゴ糖（ｐｅｎｔａｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）（１％）から構成され；
ｂ）ＤＰ３画分は、９７％のガラクト三糖および３％のＤＰ４オリゴ糖を含み；
ｃ）ＤＰ＞３画分は、９６％のＤＰ４およびＤＰ５を有するガラクトオリゴ糖と、４％のＤＰ３を有するガラクトオリゴ糖とを含んでいた。
【００５２】
ＩＬ−８およびＭＩＰ−３αの産生に対するこれら画分の効果は、それぞれ、図８（Ａ）および（Ｂ）に示す。
【００５３】
双方の実験について、ＤＰ３およびＤＰ＞３画分は、サイトカインの分泌を減少させた：
ａ）ＴＮＦ−α単独の場合と比べ、ＤＰ３は、ＩＬ−８の産生を３４％、ＭＩＰ−３αの産生を２５％減少させた；
ｂ）ＤＰ＞３の画分について、ＩＬ−８およびＭＩＰ−３αの減少は、それぞれ、３５％および５１％であった。
【００５４】
ＤＰ２画分の結果は明らかでなかった。ＩＬ−８分泌の減少は４９％であったが、この画分はＭＩＰ−３α産生に対していかなる効果も有さなかった。
【実施例４】
【００５５】
Ｂｉｍｕｎｏと比較した、炎症性サイトカインＴＮＦ−αの存在下でのＩＬ−８およびＭＩＰ−３αサイトカインの産生に対するＢｉｍｕｎｏガラクトオリゴ糖混合物の画分の効果
【００５６】
材料および方法
ＧＯＳ画分は、実施例３に記載のＢｉｍｕｎｏから調製した。
【００５７】
細胞培養
ＮＣＭ４６０細胞系統の細胞培養は、実施例３と同じ源から得られ、同様に維持された。
【００５８】
ＮＣＭ４６０培養によるサイトカイン産生の測定
濃度５ｘ１０５細胞／ｍＬのＮＣＭ４６０細胞を、２４−ウェルプレートに蒔き、３７℃にて９５％空気および５％ＣＯ２中でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後、７０％のコンフルエンスに対応して、細胞を、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）（組換えヒトＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ―Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、並びにＴＮＦ−αとＢｉｍｕｎｏ（０．ｌｇ／ｍｌ）との混合物、ＴＮＦ−αとＢｉｍｕｎｏのＤＰ＝３画分（０．１ｇ／ｍｌ）との混合物、またはＴＮＦ−αとＢｉｍｕｎｏのＤＰ＞３画分（０．１ｇ／ｍｌ）との混合物で、３連で処理した。コントロールは培地で成長した細胞から成っていた。次に、細胞を３７℃にて９５％空気、５％ＣＯ２中で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を採取し、２００μｌに分注して冷凍し、試験前に４００ｘｇで５分間遠心した。サイトカイン（ＭＩＰ−３およびＩＬ−８）の濃度を、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社により提供されるＱＵＡＮＴＩＫＩＮＥキットを用いてＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。
【００５９】
結果
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて採取された２つの異なる画分は、
以下の量のガラクトオリゴ糖を有していた：
ａ）ＤＰ３を含む画分、
ｂ）ＤＰ＞３を含む画分。
【００６０】
ＩＬ−８およびＭＩＰ−３αの産生に対するガラクトオリゴ糖画分およびＢｉｍｕｎｏの効果を、それぞれ、図９（Ａ）および（Ｂ）に示す。図９（Ａ）および（Ｂ）から、Ｂｉｍｕｎｏと比較すると、ＤＰ３画分がＩＬ−８の産生を３５％以上減少させたことがわかる。ＭＩＰ−３αの産生の減少は、Ｂｉｍｕｎｏと比較すると、ＤＰ３画分を用いて３７％大きくなる。
【００６１】
ＤＰ＞３画分により、Ｂｉｍｕｎｏと比較したＩＬ−８の産生の減少が４０％大きくなり、ＭＩＰ−３ αの産生の減少は５５％大きくなる。
【００６２】
結論
ＤＰ３およびＤＰ＞３の画分が、全ガラクトオリゴ糖混合物（Ｂｉｍｕｎｏ）と等しい量で存在する場合、炎症に対する保護効果は有意に高い。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性疾患の予防または治療における使用のための、３以上の重合度を有するガラクトオリゴ糖。
【請求項２】
三糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１‐３）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、四糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃおよび五糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃからなる群より選択される、請求項１に記載の使用のためのガラクトオリゴ糖。
【請求項３】
腸管炎症性疾患の予防または治療における使用のための、請求項１または請求項２に記載のガラクトオリゴ糖。
【請求項４】
大腸炎、腸壊死性の大腸炎、偽膜性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、憩室炎、虚血または炎症性腸疾患の予防または治療における使用のための、請求項１〜請求項３のいずれか1項に記載のガラクトオリゴ糖。
【請求項５】
粉末、シロップまたはソフトトローチの形態で提供する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のガラクトオリゴ糖。
【請求項６】
１ｇ〜１０ｇのガラクトオリゴ糖、好ましくは２ｇ〜５ｇのガラクトオリゴ糖、最も好ましくは２．７５ｇのガラクトオリゴ糖を、炎症性疾患の治療のために毎日用いる、請求項５に記載のガラクトオリゴ糖。
【請求項７】
１ｇ〜１０ｇのガラクトオリゴ糖、好ましくは２ｇ〜５ｇのガラクトオリゴ糖、最も好ましくは２．７５ｇのガラクトオリゴ糖を、炎症性疾患の予防のために毎日用いる、請求項５に記載のガラクトオリゴ糖。
【請求項８】
炎症性疾患の予防または処置における、３以上の重合度を有するガラクトオリゴ糖の使用。
【請求項９】
ガラクトオリゴ糖は、三糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１‐３）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、四糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃおよび五糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃからなる群より選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
３以上の重合度を有するガラクトオリゴ糖を、哺乳動物に経口的に有効量投与することを含む、炎症性疾患の治療および／または予防のための方法。
【請求項１１】
ガラクトオリゴ糖は、三糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１‐３）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、四糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃおよび五糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
炎症性疾患は、腸管炎症性疾患である、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
炎症性疾患は、大腸炎、腸壊死性の大腸炎、偽膜性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、憩室炎、虚血または炎症性腸疾患である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物はヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ガラクトオリゴ糖を、粉末、シロップとしてまたはソフトトローチの形態で投与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
炎症性疾患を治療するための活性ガラクトオリゴ糖の有効一日用量は、１ｇ〜１０ｇ、好ましくは２ｇ〜５ｇ、最も好ましくは２．７５ｇである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
炎症性疾患を予防するための活性ガラクトオリゴ糖の有効一日用量は、１ｇ〜１０ｇ、好ましくは２ｇ〜５ｇ、最も好ましくは２．７５ｇである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１】
炎症性疾患の予防または治療における使用のための、３以上の重合度を有するガラクトオリゴ糖。
【請求項２】
三糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１‐３）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、四糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃおよび五糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃからなる群より選択される、請求項１に記載の使用のためのガラクトオリゴ糖。
【請求項３】
腸管炎症性疾患の予防または治療における使用のための、請求項１または請求項２に記載のガラクトオリゴ糖。
【請求項４】
大腸炎、腸壊死性の大腸炎、偽膜性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、憩室炎、虚血または炎症性腸疾患の予防または治療における使用のための、請求項１〜請求項３のいずれか1項に記載のガラクトオリゴ糖。
【請求項５】
粉末、シロップまたはソフトトローチの形態で提供する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のガラクトオリゴ糖。
【請求項６】
１ｇ〜１０ｇのガラクトオリゴ糖、好ましくは２ｇ〜５ｇのガラクトオリゴ糖、最も好ましくは２．７５ｇのガラクトオリゴ糖を、炎症性疾患の治療のために毎日用いる、請求項５に記載のガラクトオリゴ糖。
【請求項７】
１ｇ〜１０ｇのガラクトオリゴ糖、好ましくは２ｇ〜５ｇのガラクトオリゴ糖、最も好ましくは２．７５ｇのガラクトオリゴ糖を、炎症性疾患の予防のために毎日用いる、請求項５に記載のガラクトオリゴ糖。
【請求項８】
炎症性疾患の予防または処置における、３以上の重合度を有するガラクトオリゴ糖の使用。
【請求項９】
ガラクトオリゴ糖は、三糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１‐３）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、四糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃおよび五糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃからなる群より選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
３以上の重合度を有するガラクトオリゴ糖を、哺乳動物に経口的に有効量投与することを含む、炎症性疾患の治療および／または予防のための方法。
【請求項１１】
ガラクトオリゴ糖は、三糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１‐３）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃ、四糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃおよび五糖：Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐６）‐Ｇａｌ（β１‐４）‐Ｇｌｃからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
炎症性疾患は、腸管炎症性疾患である、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
炎症性疾患は、大腸炎、腸壊死性の大腸炎、偽膜性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、憩室炎、虚血または炎症性腸疾患である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物はヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
ガラクトオリゴ糖を、粉末、シロップとしてまたはソフトトローチの形態で投与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
炎症性疾患を治療するための活性ガラクトオリゴ糖の有効一日用量は、１ｇ〜１０ｇ、好ましくは２ｇ〜５ｇ、最も好ましくは２．７５ｇである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
炎症性疾患を予防するための活性ガラクトオリゴ糖の有効一日用量は、１ｇ〜１０ｇ、好ましくは２ｇ〜５ｇ、最も好ましくは２．７５ｇである、請求項１０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図４】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図４】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１２−５２４７７０（Ｐ２０１２−５２４７７０Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０６５８１（Ｐ２０１２−５０６５８１）
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５０６５９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２２３４４
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５０８１８７０４５）クラサド インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２３日（２０１０．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５０６５９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２２３４４
【国際公開日】平成２２年１０月２８日（２０１０．１０．２８）
【出願人】（５０８１８７０４５）クラサド インコーポレイテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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