新規な細胞増殖促進剤
細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞の増殖を促進する剤を提供する。本発明のタンパク質導入ドメインおよびＥＲａｓタンパク質を含んでいることを特徴とする融合タンパク質あるいは化学的結合体を用いることによって細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞の増殖を促進することができる。本発明の細胞増殖促進剤は、可逆的に調整をすることができるため、遺伝子導入法に比べてより臨床応用が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は細胞増殖促進剤に関するものである。具体的には、胚性幹細胞や体性幹細胞の細胞増殖促進剤を提供するものである。
【背景技術】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や体性幹細胞（組織幹細胞）などの幹細胞は神経疾患、糖尿病、白血病などに対する移植療法の資源として期待されている。ＥＳ細胞は受精卵（胚盤胞）の内部細胞塊に由来し、分化多能性を有することから特に価値が高い。マウスＥＳ細胞は白血病阻害因子（ＬＩＦ）により分化多能性を維持することができる。しかしヒトおよびサルのＥＳ細胞はＬＩＦ存在下でも、分化多能性を完全に維持しつつ増殖させることが難しい。一方体性幹細胞は受精卵を利用しないためＥＳ細胞のような倫理的問題が無いという長所を持つ。しかし体性幹細胞はＥＳ細胞よりも増殖が悪く、十分な細胞数を得ることが難しい。そのため、これらＥＳ細胞や体性幹細胞の増殖促進物質が望まれている。
本発明者は、ＥＳ細胞で特異的に発現する遺伝子群ＥＣＡＴ（ＥＳ ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を同定し、その機能を解析してきた（ＷＯ ０２／０９７０９０ Ａ１）。これまでに、ＥＣＡＴ４（Ｎａｎｏｇ）はホメオボックス転写因子であり、ＮａｎｏｇをＥＳ細胞で過剰に発現させるとＬＩＦ非依存的に分化多能性を維持できること（Ｃｅｌｌ，１１３，６３１−６４２（２００３））、およびＥＣＡＴ５（ＥＲａｓ）は恒常活性型のＲａｓ蛋白質であり、ＥＲａｓはＰＩ３キナーゼの活性化を介してＥＳ細胞の増殖を促進していること（Ｎａｔｕｒｅ，４２３，５４１−５４５（２００３））などが明らかとなっている。ＥＲａｓはＥＳ細胞だけでなくＮＩＨ３Ｔ３細胞やマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）に対しても強い増殖促進を示す。
【発明の開示】
本発明は、可逆的な細胞増殖促進剤、特に胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や体性幹細胞の可逆的な細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。
現在、多分化能を維持したままＥＳ細胞や体性幹細胞を大量生産することは極めて困難であり、未だ達成されていない。また遺伝子導入は、リポフェクション法やレトロウイルスベクター法などの公知の方法により達成できるが、（ｉ）高い導入効率を得ることが難しい、（ｉｉ）導入された遺伝子は染色体に取り込まれるが染色体のどこに組み込まれるか不明で不可逆的であるため癌化するリスクが高い、（ｉｉｉ）操作が煩雑なために多数の細胞を一度に処理しにくい、などの様々な課題がある。したがって臨床応用を考えると、細胞増殖に関与する遺伝子を遺伝子導入して細胞を増殖させることは現実的ではない。
そのため、本発明は遺伝子導入によらない臨床応用可能な細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。
本発明者は、上記の問題点を解決すべく鋭意検討し、ＥＲａｓ（ＥＣＡＴ５）タンパク質にＨＩＶ由来のＴＡＴペプチドを組み合わせた融合タンパク質を培地に添加することによって、該融合タンパク質が細胞に取り込まれて細胞増殖が促進されることを見出した。なお、培地から融合蛋白質を除去すると、細胞内に取り込まれた蛋白質が分解されるとともに反応は停止するため、本発明における細胞増殖促進作用は可逆的である。
これらの知見から、本発明者は、ＥＲａｓタンパク質を細胞に取り込ませることによって細胞増殖を可逆的に促進させることができ、特に、多分化能を保ったまま培養して増殖させるのが困難な胚性幹細胞や体性幹細胞を増殖させるのに有用であると考え、本発明を完成するに至った。
即ち本発明の要旨は、以下のとおりである。
〔１〕タンパク質導入ドメインおよびＥＲａｓタンパク質を含んでいることを特徴とする融合タンパク質、
〔２〕Ｒａｓタンパク質がヒト、サル、ウシまたはマウス由来のものである、上記〔１〕記載の融合タンパク質、
〔３〕タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ ＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Ａｎｔｏｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）、ＨＳＶ ＶＰ２２またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、上記〔１〕または〔２〕記載の融合タンパク質、
〔４〕タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ Ｒｅｖのフラグメント、ｆｌｏｃｋ ｈｏｕｓｅ ｖｉｒｕｓ Ｃｏａｔ（ＦＨＶ Ｃｏａｔ）のフラグメント、ｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ Ｇａｇ（ＢＭＶ Ｇａｇ）のフラグメント、ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ−ＩＩ ＲｅＸ（ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲｅＸ）のフラグメント、ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ Ｇａｇ（ＣＣＭＶ Ｇａｇ）のフラグメント、Ｐ２２Ｎのフラグメント、λＮのフラグメント、φ２１Ｎのフラグメント、酵母ＰＲＰ６のフラグメント、またはオリゴアルギニンからなるペプチドである、上記〔１〕または〔２〕記載の融合タンパク質、
〔５〕タンパク質導入ドメインが、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、上記〔１〕または〔２〕記載の融合タンパク質、
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸、
〔７〕上記〔６〕記載の核酸を含有する発現ベクター、
〔８〕上記〔７〕記載の発現ベクターを含有する細胞、
〔９〕上記〔８〕記載の細胞を、融合タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質の製造方法、
〔１０〕ビスフォスフォネート化合物、グルコース−６−リン酸、Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物またはアルギニンを有する分岐型ペプチドと、ＥＲａｓタンパク質との化学的結合体、
〔１１〕上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔１０〕記載の化学的結合体を有効成分として含有する細胞増殖促進剤、
〔１２〕Ｎａｎｏｇタンパク質をさらに含有する、上記〔１１〕記載の細胞増殖促進剤、〔１３〕細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、上記〔１１〕または〔１２〕記載の細胞増殖促進剤、
〔１４〕上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔１０〕記載の化学的結合体と細胞とを接触させる工程を含む、細胞増殖促進方法、
〔１５〕Ｎａｎｏｇタンパク質をさらに接触させる、上記〔１４〕記載の細胞増殖促進方法、
〔１６〕細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、上記〔１４〕または〔１５〕記載の細胞増殖促進方法、
〔１７〕ピノサイトーシスで上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔１０〕記載の化学的結合体を細胞内に取り込ませる工程を含む、上記〔１４〕〜〔１６〕いずれか記載の細胞増殖促進方法、
〔１８〕上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔１０〕の化学的結合体を含有する細胞。
【図面の簡単な説明】
図１は、融合タンパク質の例で、ＥＲａｓタンパク質のＮ末端にＨＩＶ由来のＴＡＴペプチドを融合させたものを示している。これらのタンパク質は大腸菌内やＣｅｌｌ Ｆｒｅｅ合成系で合成、精製することができる。
図２は、ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質による細胞増殖促進作用を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明において「融合タンパク質」とは、タンパク質導入ドメインとＥＲａｓタンパク質を含んでいる融合タンパク質であり、細胞に取り込まれることにより細胞増殖活性の亢進が認められるものであればよい。この融合タンパク質を細胞に取り込ませることにより、細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞などの培養の効率性と経済性の向上が期待できる。
融合タンパク質における２つのドメインの融合はいずれの可能な位置でもよく、タンパク質導入ドメインはＥＲａｓタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれに融合してもよいが、好ましくはＥＲａｓタンパク質のＮ末端に融合する。
タンパク質導入ドメインは、公知の方法で融合することができ、例えば、直接的な化学結合により、あるいはリンカー分子を介して、ＥＲａｓタンパク質に融合してもよい。かかる場合、リンカー分子は、２つのドメインを連結させることのできるいずれの２価の化学構造物であってもよい。本発明の好ましいリンカー分子は短いペプチド、例えば、１〜２０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基を有するものである。融合タンパク質は公知の遺伝子工学的な手法を用いて作製することもできる。
本明細書において「タンパク質」には、特定のアミノ酸配列（配列番号：２，４，６または８）で示されるタンパク質だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質と、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。
従って、本明細書において「ＥＲａｓタンパク質」は、特に言及しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号２，４，６または８）で示されるＥＲａｓタンパク質やその同族体、変異体、誘導体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するマウスＥＲａｓタンパク質、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するヒトＥＲａｓタンパク質、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するサルＥＲａｓタンパク質、配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するウシＥＲａｓタンパク質、およびラットホモログなどが包含される。ここで配列番号２に示すタンパク質は、マウス由来のＥＲａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号４に示すタンパク質は、ヒト由来のＥＲａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号６に示すタンパク質は、サル由来のＥＲａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号８に示すタンパク質は、ウシ由来のＥＲａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質である。
ＥＲａｓタンパク質には、配列番号２，４，６または８に示す各アミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記各アミノ酸配列において、１もしくは複数（通常数個）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つもとのアミノ酸配列のＥＲａｓタンパク質と実質的に同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
ここで実質的に同等の活性とは、該タンパク質を発現させた細胞の細胞増殖が促進される、あるいは該タンパク質を取り込ませた細胞の細胞増殖が促進されるという性質を示す。このようなＥＲａｓタンパク質の性質は、公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，４２３，５４１−５４５（２００３））などにより容易に測定することができる。
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数および変異部位は、その活性が保持される限り制限はない。活性を消失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ Ｓｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がＥＲａｓタンパク質の活性を保持している限り、特に制限されない。この置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、アミノ酸の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、両親媒性などにおいて置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、ＡｓｐおよびＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
ＥＲａｓタンパク質は、後述するＥＲａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって製造することができる。
本発明において「タンパク質導入ドメイン」とは、タンパク質を導入することができる、またはタンパク質導入を補助することのできるものであればよく、何ら限定されない。例えば、（ｉ）公知であるＨＩＶ ＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Ａｎｔｏｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）、ＨＳＶ ＶＰ２２またはこれらのうちいずれかのフラグメント、（ｉｉ）ＨＩＶ Ｒｅｖのフラグメント、ｆｌｏｃｋ ｈｏｕｓｅ ｖｉｒｕｓ Ｃｏａｔ（ＦＨＶ Ｃｏａｔ）のフラグメント、ｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ Ｇａｇ（ＢＭＶ Ｇａｇ）のフラグメント、ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ−ＩＩ ＲｅＸ（ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲｅＸ）のフラグメント、ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ Ｇａｇ（ＣＣＭＶ Ｇａｇ）のフラグメント、Ｐ２２Ｎのフラグメント、λＮのフラグメント、φ２１Ｎのフラグメントまたは酵母ＰＲＰ６のフラグメント、（ｉｉｉ）オリゴアルギニンを有するペプチド、（ｉｖ）ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＰＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはこれらのうちいずれかのフラグメント、などを挙げることができる。
前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのタンパク質導入ドメインを用いることによって、広範囲な細胞にＥＲａｓを細胞内に取り込ませることができる。また、目的細胞において特異的に発現するレセプターと結合する物質をタンパク質導入ドメインとして用いることによって組織あるいは細胞特異的な取り込みが可能となるため、前記（ｉｖ）のタンパク質導入ドメインを用いれば、対応するレセプターが発現した組織あるいは細胞特異的にＥＲａｓを細胞内に取り込ませることができる。
前記（ｉ）のタンパク質導入ドメインであるＨＩＶ ＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Ａｎｔｏｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）、ＨＳＶ ＶＰ２２には、ＨＩＶ由来のＴＡＴ（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｌｏｅｗｎｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ，５６（６），１１７９−８８（１９８８）、Ｆｒａｎｋｅｌ ａｎｄ Ｐａｂｏ，Ｃｅｌｌ，５５（６），１１８９−９３（１９８８））、ショウジョウバエ由来のアンテナペディア蛋白（Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７２（２５），１６０１０−７（１９９７））、ＨＳＶ由来のＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ，８８（２），２２３−３３（１９９７））のみならず、その機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体などが包含される。なお、変異体としては、変異のないタンパク質と少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。
更に前記（ｉ）のタンパク質導入ドメインは、ＨＩＶ ＴＡＴのフラグメント、アンテナペデイア・ホメオドメインのフラグメントまたはＨＳＶ ＶＰ２２のフラグメントであり、且つタンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものも包含する。該フラグメントの長さは、タンパク質導入またはタンパク質導入を補助する機能を有するのであればよく、何ら限定はされない。
ＨＩＶ ＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメインおよびＨＳＶ ＶＰ２２は、細胞膜を貫通する能力を有する蛋白トランスダクションドメイン（以下、「ＰＴＤ」という）が同定されているため、タンパク質導入ドメインであるＨＩＶ ＴＡＴのフラグメント、アンテナペデイア・ホメオドメインのフラグメントおよびＨＳＶ ＶＰ２２のフラグメントには、これらのＰＴＤからなるフラグメントも包含される。異種蛋白とＰＴＤを融合することにより、培養細胞中に導入することができることは公知であり、その作製方法も知られている（Ｆａｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１（２），６６４−８（１９９４）、Ｅｌｌｉｏｔｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ（１９９７），Ｐｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６，４４０−４４３（１９９８）およびＤｉｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６（１），１２−２１（１９９９）、特許番号第２７０２２８５号）。ＨＩＶ ＴＡＴのＰＴＤについては、ＨＩＶ ＴＡＴ蛋白由来の１１アミノ酸のＰＴＤに融合したβ−ガラクトシダーゼ蛋白が、生きたマウスのすべての組織に浸潤してすべての単一細胞に到達できることが報告されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５（５４３３），１５６９−７２（１９９９））。
ＨＩＶ ＴＡＴのフラグメントとしては、具体的には、前記の公知文献等に記載されているものを挙げることができるが、好ましくは特許番号第２７０２２８５号に記載のＨＩＶ ＴＡＴフラグメントであり、更に好ましくは配列番号１３で示される配列を含有するペプチドが挙げられる。配列番号１３で示される配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するＨＩＶ ＴＡＴ−（４８−６０）ペプチドが挙げられる。
アルギニンに富む塩基性ペプチドは細胞膜透過能を有しており、ＨＩＶ ＴＡＴのフラグメントは分子中央部を全てアルギニンに置換しても（配列番号１６）、該フラグメント（ペプチド）は細胞膜透過能を有することが知られているため（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，５８３６−５８４０（２００１））、ＨＩＶ ＴＡＴのフラグメント、アンテナペデイア・ホメオドメインのフラグメントおよびＨＳＶ ＶＰ２２のフラグメントは、複数個のアミノ酸がアルギニンに置換されていてもよく、置換後のフラグメントがタンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有していれば、本発明のタンパク質導入ドメインに含まれる。
前記（ｉｉ）のタンパク質導入ドメインであるＨＩＶ Ｒｅｖのフラグメント、ｆｌｏｃｋ ｈｏｕｓｅ ｖｉｒｕｓ Ｃｏａｔ（ＦＨＶ Ｃｏａｔ）のフラグメント、ｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ Ｇａｇ（ＢＭＶ Ｇａｇ）のフラグメント、ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ−ＩＩ ＲｅＸ（ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲｅＸ）のフラグメント、ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ Ｇａｇ（ＣＣＭＶ Ｇａｇ）のフラグメント、Ｐ２２ Ｎのフラグメント、λＮのフラグメント、φ２１Ｎのフラグメントおよび酵母ＰＲＰ６のフラグメントは、タンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものであればよく、何ら限定されない。これらのフラグメントは、細胞膜透過能を有することが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，５８３６−５８４０（２００１））。例えば、ＨＩＶ ＲｅｖのフラグメントとしてはＨＩＶ Ｒｅｖ−（３４−５０）ペプチド（配列番号１８）、ＦＨＶ ＣｏａｔのフラグメントとしてはＦＨＶ Ｃｏａｔ−（３５−４９）ペプチド（配列番号１９）、ＢＭＶ ＧａｇのフラグメントとしてはＢＭＶ Ｇａｇ−（７−２５）ペプチド（配列番号２０）、ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲｅＸのフラグメントとしてはＨＴＬＶ−ＩＩ Ｒｅｘ−（４−１６）ペプチド（配列番号２１）、ＣＣＭＶ ＧａｇのフラグメントとしてはＣＣＭＶ Ｇａｇ−（７−２５）ペプチド（配列番号２２）、Ｐ２２ ＮのフラグメントとしてはＰ２２ Ｎ−（１４−３０）ペプチド（配列番号２３）、λＮのフラグメントとしてはλＮ−（１−２２）ペプチド（配列番号２４）、φ２１Ｎのフラグメントとしてはφ２１Ｎ−（１２−２９）ペプチド（配列番号２５）、酵母ＰＲＰ６のフラグメントとしては酵母ＰＲＰ６−（１２９−１４４）ペプチド（配列番号２６）の全部または一部を有するフラグメントが挙げられる。また、これらのフラグメントの配列において複数個のアミノ酸がアルギニンに置換されてもよく、置換後のフラグメントがタンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有していれば、本発明のタンパク質導入ドメインに含まれる。
前記（ｉｉｉ）のタンパク質導入ドメインであるオリゴアルギニンからなるペプチドは、タンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有していればよく、何ら限定されない。オリゴアルギニンおよびオリゴアルギニンを有するペプチドが細胞膜透過能を有することは公知であるため（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，５８３６−５８４０（２００１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（４），２４３７−２７４３（２００２））、例えば、これらの文献に挙げられている細胞膜透過能を有するペプチドをタンパク質導入ドメインとして用いることができる。オリゴアルギニンを有するペプチドは、オリゴアルギニン（ｎ＝５〜９）を有するペプチドが好ましく、オリゴアルギニン（ｎ＝６〜８）を有するペプチドが更に好ましい。
前記（ｉｖ）のタンパク質導入ドメインである、「線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはこれらのうちいずれかのフラグメント」とは、公知のＦＧＦタンパク質、公知のＨＧＦタンパク質またはこれらのうちいずれかのフラグメントであり、対応するレセプター発現細胞にタンパク質を導入する機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものであればよく、何ら限定されない。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のフラグメントとの結合体が細胞内に取り込まれることは公知である（Ｒｏｊａｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，３７０−３７５（１９９８）、Ｌｉｎ，Ｙ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１４２５５−１４２５８（１９９５））。従って、これらの文献に報告されているＦＧＦフラグメントをタンパク質導入ドメインとして用いることができる。ＦＧＦのフラグメントとしては、例えば、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含有するフラグメントを挙げることができる。
本発明には、前記の本発明融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸も含まれる。
ここで「核酸」とは、「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」が含まれ、その長さによって特に制限されるものではない。「ＤＮＡ」とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。「ＲＮＡ」とは、１本鎖ＲＮＡのみならず、それに相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡ、さらにはそれらから構成される２本鎖ＲＮＡを包含する趣旨で用いられる。なお、核酸は機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができるため、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸は、前記ＥＲａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドとタンパク質導入ドメインをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。
タンパク質導入ドメインがＨＩＶ ＴＡＴフラグメントである場合は、本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸は、具体的には、例えば
（ａ）配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１３記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
（ｂ）配列番号：４記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１３記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
（ｃ）配列番号：６記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１３記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
（ｄ）配列番号：８記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１３記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
（ｅ）配列番号：１記載の塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｆ）配列番号：３記載の塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｇ）配列番号：５記載の塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｈ）配列番号：７記載の塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｉ）配列番号：１記載の塩基配列の第１７８番目のヌクレオチドから第８５８番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｊ）配列番号：３記載の塩基配列の第２５２番目のヌクレオチドから第９５０番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｋ）配列番号：５記載の塩基配列の第１番目のヌクレオチドから第６９９番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｌ）配列番号：７記載の塩基配列の第１１６番目のヌクレオチドから第８１７番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｍ）配列番号：１０記載のアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｎ）配列番号：１４記載のアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｏ）配列番号：９記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｐ）配列番号：９記載の塩基配列からなる核酸、
またはこれら（ａ）〜（ｐ）の核酸と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸が挙げられる。
これら配列番号：１，３，５または７に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、本明細書の配列表の配列番号：１，３，５または７に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダイゼーションのプローブあるいはＰＣＲのプライマーに用いて、例えばＥＳ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローニングすることができる。該クローニングは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
また前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸とは、具体的には、
（ｑ）前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
（ｒ）前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸との配列同一性を示す塩基配列を含有する核酸、
（ｓ）前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸によりコードされるタンパク質において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸、
などが挙げられる。
ここで前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸とは、例えば前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含有する核酸が挙げられる。具体的には、前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の部分配列などが挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３３３ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、３３３ｍＭ ＮａＣｌを示す）、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドを含む溶液中で４２℃にてハイブリダイズさせる条件、または６×ＳＳＣを含む（５０％ホルムアミドは含まない）溶液中で６５℃にてハイブリダイズさせる条件などが挙げられる。またハイブリダイゼーション後の洗浄の条件としては、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄するような条件が挙げられる。
前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸との配列同一性を示す塩基配列を含有する核酸とは、例えば前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を示す塩基配列を含有する核酸が挙げられる。具体的には、前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の部分配列などが挙げられる。このような配列同一性を有する核酸は、前述のハイブリダイゼーション反応やＰＣＲ反応により、または後述する核酸の改変（欠失、付加、置換）反応により作製することができる。
前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸によりコードされるタンパク質において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存在するアレル変異対等のタンパク質をコードする核酸を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明の核酸によりコードされるタンパク質の活性（細胞増殖促進活性）が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個欠失、置換及び／又は付加されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ Ｓｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ａｓｐ及びＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
この改変タンパク質をコードする核酸は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に記載の種々の方法、例えば部位特異的変異誘発やＰＣＲ法等によって製造することができる。また市販のキットを用いて、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法に従って製造することもできる。
以上のような、前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸と実質的に同一の塩基配列を含有する本発明の核酸は、当該核酸によりコードされるタンパク質が、細胞内への導入が可能であり、導入された後は配列番号：２，４，６または８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質であることが好ましい。ここで実質的に同質の活性とは、本発明の核酸によりコードされるタンパク質を発現させた細胞は細胞増殖が促進されるという性質、あるいは当該タンパク質を取り込んだ細胞の細胞増殖が促進するという性質を指す。当該活性およびその測定については、公知の方法にて実施することができる。
本発明の核酸が２本鎖の場合、前記本発明の核酸を発現ベクターに挿入することにより、本発明のタンパク質を発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＣＥＰ４、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、２９３−ＥＢＮＡ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のタンパク質を製造することができる。得られたタンパク質は、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のタンパク質を、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
なお、実施例に示すように、これらの融合タンパク質は、試験管内で合成、精製することもできる。
本発明の「化学的結合体」とは、ＥＲａｓタンパク質を、ビスフォスフォネート化合物、グルコース−６−リン酸、Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物（たとえばＢＣＲＰインヒビター）またはアルギニンを有する分岐型ペプチドと化学的に結合して得られる結合体のことである。
「ビスフォスフォネート化合物」とは、例えば、エチドロネート、アレンドロネート、リセドロネート、インカドロネート、パミドロネート等の公知の化合物を挙げることができる。ビスフォスフォネート化合物は骨芽細胞に選択的に取り込まれるため、この公知の性質を利用したビスフォスフォネート化合物との結合体が報告されている（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．，５９，１６８−１７３（１９９６）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，４，１３７５−１３８０（１９９５））。そのため、ＥＲａｓタンパク質にビスフォスフォネート化合物を化学的に結合させた化学的結合体は骨芽細胞に将来分化していく間質系幹細胞特異的に取り込まれる。
「グルコース−６−リン酸」は公知の物質であり、ＥＲａｓタンパク質とグルコース−６−リン酸を化学的に結合させた化学的結合体は肝細胞および膵細胞に将来分化していく前駆細胞特異的に取り込まれる。
「Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物」とは、例えばＢＣＲＰインヒビターを挙げることができる。具体的には、例えば、ＢＣＲＰインヒビターであるＧＦ１２０９１８などを挙げることができる。Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物とＮａｎｏｇタンパク質と化学的に結合させることにより、化学的結合体はＳＰ細胞と呼ばれる各種体性幹細胞特異的に取り込まれる。
「アルギニンを有する分岐型ペプチド」とは、例えば、文献Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１，７９２５−７９３０，（２００２）に記載されているような細胞膜透過能をもつ８個程度のアルギニンを有する分岐型ペプチドのことであり、具体的には、該文献の（Ｒ２）４ペプチドや（ＲＧ３Ｒ）４ペプチドなどが挙げられる。
ＥＲａｓタンパク質は前記のように作製することができる。精製されたＥＲａｓタンパク質と上記物質の化学的結合体は公知の方法に従って化学的に結合させて作製することができる。例えば、アミノ基を持つリンカーをつけることで酸アミド結合など公知の方法に従って化学的に結合させることによって作製することができる。
本発明の「細胞増殖促進剤」とは、上記の本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のうち少なくとも１つを含有する剤のことであり、細胞に取り込まれることによって該細胞の増殖を促進する。
ここで細胞は、特に限定されないが、哺乳動物細胞を挙げることができる。哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、ウシ、ラットやマウス等の哺乳動物の組織・臓器細胞またはこれら由来の細胞であって、個体の細胞、個体から取り出した初代細胞、または培養細胞のいずれでもよい。好ましくは、市販の培養細胞（ＡＴＣＣ社など）、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞を挙げることができ、より好ましくはヒト胚性幹細胞やヒト体性幹細胞である。
また、マウスＥＳ細胞にＮａｎｏｇタンパク質を強制発現させるとＬＩＦなしでも万能性を維持したまま継代することができるため（Ｃｅｌｌ，１１３，６３１−６４２（２００３））、本発明の細胞増殖促進剤は本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体だけでなく、Ｎａｎｏｇ（ＥＣＡＴ４）タンパク質も含有されていてもよい。
本発明の「Ｎａｎｏｇタンパク質」とは、Ｎａｎｏｇタンパク質のみに限定されず、本発明の融合タンパク質や化学的結合体と同様に、細胞内に取り込まれやすくした態様のものも包含される。本発明のＮａｎｏｇタンパク質は、そのアミノ酸配列および塩基配列が公知であるため（ＷＯ ０２／０９７０９０ Ａ１）、前記のＥＲａｓタンパク質、融合タンパク質、あるいは化学的結合体と同様の方法にて作製することができる。
本発明の細胞増殖促進剤を作用させるには、当該剤を直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、ヒトからある種の細胞を採取し、体外で該細胞に添加してその細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法、および培養細胞に添加するｉｎ ｖｉｔｒｏ法がある。
投与方法としては、ｅｘ ｖｉｖｏ法またはｉｎ ｖｉｔｒｏ法であれば、細胞を培養している培養液中に添加、あるいは細胞に直接添加すればよい。添加量は、細胞の種類、細胞数等により適宜調整することができるが、細胞毒性が認められず細胞増殖促進活性が認められればよい。製剤中の本発明の融合タンパク質または結合体の添加量は通常培地に０．０００１μＭ〜１０００μＭ、好ましくは０．０００１μＭ〜１０μＭ、より好ましくは０．０００１μＭ〜１μＭであり、これを１〜数日に１回添加するのが好ましい。
また、ｉｎ ｖｉｖｏ法の投与方法としては、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明の融合タンパク質または結合体の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重などにより適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを１〜数日に１回投与するのが好ましい。
細胞増殖促進剤の有効成分である本発明の融合タンパク質あるいは結合体は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）、慣用の添加剤などと混合して試薬あるいは医薬組成物として調製することができ、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または培地等を含むものであってもよい。当該医薬組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などに調整することができる。
本発明の「細胞増殖促進方法」とは、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のいずれかを細胞に接触させることにより、細胞増殖を促進する方法である。具体的には、例えば、本発明の細胞増殖促進剤を細胞培養培地中に添加して細胞に接触させ、細胞に取り込ませることによって細胞増殖を促進する方法のことである。
本発明の細胞増殖促進方法は、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のいずれかを細胞と接触させた後に、細胞のピノサイトーシス（飲作用）により取り込まれ、細胞の増殖が促進される方法であってもよい。細胞のピノサイトーシスを利用した取り込み（導入）は、例えば、市販のキットであるＩｎｆｌｕｘ（登録商標）Ｐｉｎｏｃｙｔｉｃ Ｃｅｌｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）を用いることによって実施することができる。
本発明の細胞増殖促進方法は、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体だけでなく、さらに前記Ｎａｎｏｇタンパク質を接触させる工程を加えることもできる。
細胞は、特に限定されないが、哺乳動物細胞を挙げることができる。哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、ウシ、ラットやマウス等の哺乳動物の組織・臓器細胞またはこれら由来の細胞であって、個体の細胞、個体から取り出した初代細胞、または培養細胞のいずれでもよい。好ましくは、市販の培養細胞（ＡＴＣＣ社など）、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞を挙げることができ、より好ましくはヒト胚性幹細胞やヒト体性幹細胞である。
前記の細胞増殖促進剤あるいは細胞増殖促進方法により、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体を含有する細胞を作製することができる。
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
［実施例１］
（１）ＴＡＴ−ＥＲａｓ発現ベクターの構築
オリゴＤＮＡのＴＡＴ−Ｓ（配列番号１１）とＴＡＴ−ＡＳ（配列番号１２）を９４度で１分間変性の後、徐々に室温に戻し２本鎖ＤＮＡを作製した。これをｐＣＤＮＡ３．１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にライゲーションした（ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ）。このｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にＧａｔｅｗａｙ ｒｆＢ Ｃａｓｅｔｔｅを挿入してｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＧＷを作製した。ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＧＷとｐＥｎｔｅｒ−ｍＥＲａｓでＬＲ組み換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を行い、ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＥＲａｓ（図１）を作製した。ＴＡＴ−ＥＲａｓのＤＮＡ配列は配列番号９に、アミノ酸配列は配列番号１０で示されている。
（２）ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質の合成と精製
融合タンパク質の合成と精製は、ＰｕｒｅＧｅｎｅシステムを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて行った。
（３）ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質による細胞増殖促進
マウス１２．５日胚よりマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を単離した。ＭＥＦは１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ中で培養した。ここにＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質を加えると増殖が有意に促進された（図２）。一方、ＥＲａｓのＣ末端のＣＡＡＸモチーフを欠失し膜局在できなくしたＴＡＴ−ＥＲａｓ−ΔＣを加えても細胞増殖促進は認められなかった。
［実施例２］
（１）ＴＡＴ−ＥＲａｓ発現ベクターの構築
オリゴＤＮＡのＴＡＴ−Ｓ（配列番号１１）とＴＡＴ−ＡＳ（配列番号１２）を９４度で１分間変性の後、徐々に室温に戻し２本鎖ＤＮＡを作製する。これをｐＣＤＮＡ３．１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にライゲーションする（ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ）。このｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にＧａｔｅｗａｙ ｒｆＢ Ｃａｓｅｔｔｅを挿入してｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＧＷを作製する。ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＧＷとｐＥｎｔｅｒ−ｍＥＲａｓでＬＲ組み換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を行い、実施例１と同様に、ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＥＲａｓを作製する。ＴＡＴ−ＥＲａｓのＥＲａｓは、マウスＥＲａｓではなくヒトＥＲａｓを用いるため、作製されるＴＡＴ−ＥＲａｓのアミノ酸配列は配列番号１４に示されている。
（２）ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質の合成と精製
融合タンパク質の合成と精製は、実施例１と同様に、ＰｕｒｅＧｅｎｅシステムを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて行う。
（３）ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質による細胞増殖促進
ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）およびヒト体性幹細胞を常法により培養する。細胞に、実施例１または実施例２で作製したＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質を加えることにより、いずれの細胞についても細胞増殖が有意に促進されることが観察される。
【産業上の利用可能性】
本発明により、細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞の増殖を促進することができる融合タンパク質、または化学的結合体を提供することができる。本発明の細胞増殖促進剤は、多能性を維持させたまま増殖させることが困難な胚性幹細胞や体性幹細胞にも用いることができる。また本発明の細胞増殖促進剤は、多数の細胞を一度に簡便に処理することができるだけでなく、可逆的に調整をすることができるため、遺伝子導入法に比べてより臨床応用が可能である。
【配列表フリーテキスト】
配列番号：１１に記載の塩基配列はＴＡＴ−Ｓである。
配列番号：１２に記載の塩基配列はＴＡＴ−ＡＳである。
配列番号：１３に記載のアミノ酸配列はＨＩＶ ＴＡＴペプチドである。
配列番号：１５に記載のアミノ酸配列はＦＧＦフラグメントである。
配列番号：１６に記載のアミノ酸配列は置換後のＨＩＶ ＴＡＴペプチドである。
配列番号：１７に記載のアミノ酸配列はＨＩＶ ＴＡＴペプチドである。
配列番号：１８に記載のアミノ酸配列はＨＩＶ Ｒｅｖ−（３４−５０）ペプチドである。
配列番号：１９に記載のアミノ酸配列はＦＨＶ Ｃｏａｔ−（３５−４９）ペプチドである。
配列番号：２０に記載のアミノ酸配列はＢＭＶ Ｇａｇ−（７−２５）ペプチドである。
配列番号：２１に記載のアミノ酸配列はＨＴＬＶ−ＩＩ Ｒｅｘ−（４−１６）ペプチドである。
配列番号：２２に記載のアミノ酸配列はＣＣＭＶ Ｇａｇ−（７−２５）ペプチドである。
配列番号：２３に記載のアミノ酸配列はＰ２２ Ｎ−（１４−３０）ペプチドである。
配列番号：２４に記載のアミノ酸配列はλＮ−（１−２２）ペプチドである。
配列番号：２５に記載のアミノ酸配列はφ２１Ｎ−（１２−２９）ペプチドである。
配列番号：２６に記載のアミノ酸配列は酵母ＰＲＰ６−（１２９−１４４）ペプチドである。
【図１】
【図２】
【技術分野】
本発明は細胞増殖促進剤に関するものである。具体的には、胚性幹細胞や体性幹細胞の細胞増殖促進剤を提供するものである。
【背景技術】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や体性幹細胞（組織幹細胞）などの幹細胞は神経疾患、糖尿病、白血病などに対する移植療法の資源として期待されている。ＥＳ細胞は受精卵（胚盤胞）の内部細胞塊に由来し、分化多能性を有することから特に価値が高い。マウスＥＳ細胞は白血病阻害因子（ＬＩＦ）により分化多能性を維持することができる。しかしヒトおよびサルのＥＳ細胞はＬＩＦ存在下でも、分化多能性を完全に維持しつつ増殖させることが難しい。一方体性幹細胞は受精卵を利用しないためＥＳ細胞のような倫理的問題が無いという長所を持つ。しかし体性幹細胞はＥＳ細胞よりも増殖が悪く、十分な細胞数を得ることが難しい。そのため、これらＥＳ細胞や体性幹細胞の増殖促進物質が望まれている。
本発明者は、ＥＳ細胞で特異的に発現する遺伝子群ＥＣＡＴ（ＥＳ ｃｅｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を同定し、その機能を解析してきた（ＷＯ ０２／０９７０９０ Ａ１）。これまでに、ＥＣＡＴ４（Ｎａｎｏｇ）はホメオボックス転写因子であり、ＮａｎｏｇをＥＳ細胞で過剰に発現させるとＬＩＦ非依存的に分化多能性を維持できること（Ｃｅｌｌ，１１３，６３１−６４２（２００３））、およびＥＣＡＴ５（ＥＲａｓ）は恒常活性型のＲａｓ蛋白質であり、ＥＲａｓはＰＩ３キナーゼの活性化を介してＥＳ細胞の増殖を促進していること（Ｎａｔｕｒｅ，４２３，５４１−５４５（２００３））などが明らかとなっている。ＥＲａｓはＥＳ細胞だけでなくＮＩＨ３Ｔ３細胞やマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）に対しても強い増殖促進を示す。
【発明の開示】
本発明は、可逆的な細胞増殖促進剤、特に胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や体性幹細胞の可逆的な細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。
現在、多分化能を維持したままＥＳ細胞や体性幹細胞を大量生産することは極めて困難であり、未だ達成されていない。また遺伝子導入は、リポフェクション法やレトロウイルスベクター法などの公知の方法により達成できるが、（ｉ）高い導入効率を得ることが難しい、（ｉｉ）導入された遺伝子は染色体に取り込まれるが染色体のどこに組み込まれるか不明で不可逆的であるため癌化するリスクが高い、（ｉｉｉ）操作が煩雑なために多数の細胞を一度に処理しにくい、などの様々な課題がある。したがって臨床応用を考えると、細胞増殖に関与する遺伝子を遺伝子導入して細胞を増殖させることは現実的ではない。
そのため、本発明は遺伝子導入によらない臨床応用可能な細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。
本発明者は、上記の問題点を解決すべく鋭意検討し、ＥＲａｓ（ＥＣＡＴ５）タンパク質にＨＩＶ由来のＴＡＴペプチドを組み合わせた融合タンパク質を培地に添加することによって、該融合タンパク質が細胞に取り込まれて細胞増殖が促進されることを見出した。なお、培地から融合蛋白質を除去すると、細胞内に取り込まれた蛋白質が分解されるとともに反応は停止するため、本発明における細胞増殖促進作用は可逆的である。
これらの知見から、本発明者は、ＥＲａｓタンパク質を細胞に取り込ませることによって細胞増殖を可逆的に促進させることができ、特に、多分化能を保ったまま培養して増殖させるのが困難な胚性幹細胞や体性幹細胞を増殖させるのに有用であると考え、本発明を完成するに至った。
即ち本発明の要旨は、以下のとおりである。
〔１〕タンパク質導入ドメインおよびＥＲａｓタンパク質を含んでいることを特徴とする融合タンパク質、
〔２〕Ｒａｓタンパク質がヒト、サル、ウシまたはマウス由来のものである、上記〔１〕記載の融合タンパク質、
〔３〕タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ ＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Ａｎｔｏｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）、ＨＳＶ ＶＰ２２またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、上記〔１〕または〔２〕記載の融合タンパク質、
〔４〕タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ Ｒｅｖのフラグメント、ｆｌｏｃｋ ｈｏｕｓｅ ｖｉｒｕｓ Ｃｏａｔ（ＦＨＶ Ｃｏａｔ）のフラグメント、ｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ Ｇａｇ（ＢＭＶ Ｇａｇ）のフラグメント、ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ−ＩＩ ＲｅＸ（ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲｅＸ）のフラグメント、ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ Ｇａｇ（ＣＣＭＶ Ｇａｇ）のフラグメント、Ｐ２２Ｎのフラグメント、λＮのフラグメント、φ２１Ｎのフラグメント、酵母ＰＲＰ６のフラグメント、またはオリゴアルギニンからなるペプチドである、上記〔１〕または〔２〕記載の融合タンパク質、
〔５〕タンパク質導入ドメインが、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、上記〔１〕または〔２〕記載の融合タンパク質、
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸、
〔７〕上記〔６〕記載の核酸を含有する発現ベクター、
〔８〕上記〔７〕記載の発現ベクターを含有する細胞、
〔９〕上記〔８〕記載の細胞を、融合タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質の製造方法、
〔１０〕ビスフォスフォネート化合物、グルコース−６−リン酸、Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物またはアルギニンを有する分岐型ペプチドと、ＥＲａｓタンパク質との化学的結合体、
〔１１〕上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔１０〕記載の化学的結合体を有効成分として含有する細胞増殖促進剤、
〔１２〕Ｎａｎｏｇタンパク質をさらに含有する、上記〔１１〕記載の細胞増殖促進剤、〔１３〕細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、上記〔１１〕または〔１２〕記載の細胞増殖促進剤、
〔１４〕上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔１０〕記載の化学的結合体と細胞とを接触させる工程を含む、細胞増殖促進方法、
〔１５〕Ｎａｎｏｇタンパク質をさらに接触させる、上記〔１４〕記載の細胞増殖促進方法、
〔１６〕細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、上記〔１４〕または〔１５〕記載の細胞増殖促進方法、
〔１７〕ピノサイトーシスで上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔１０〕記載の化学的結合体を細胞内に取り込ませる工程を含む、上記〔１４〕〜〔１６〕いずれか記載の細胞増殖促進方法、
〔１８〕上記〔１〕〜〔５〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔１０〕の化学的結合体を含有する細胞。
【図面の簡単な説明】
図１は、融合タンパク質の例で、ＥＲａｓタンパク質のＮ末端にＨＩＶ由来のＴＡＴペプチドを融合させたものを示している。これらのタンパク質は大腸菌内やＣｅｌｌ Ｆｒｅｅ合成系で合成、精製することができる。
図２は、ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質による細胞増殖促進作用を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明において「融合タンパク質」とは、タンパク質導入ドメインとＥＲａｓタンパク質を含んでいる融合タンパク質であり、細胞に取り込まれることにより細胞増殖活性の亢進が認められるものであればよい。この融合タンパク質を細胞に取り込ませることにより、細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞などの培養の効率性と経済性の向上が期待できる。
融合タンパク質における２つのドメインの融合はいずれの可能な位置でもよく、タンパク質導入ドメインはＥＲａｓタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれに融合してもよいが、好ましくはＥＲａｓタンパク質のＮ末端に融合する。
タンパク質導入ドメインは、公知の方法で融合することができ、例えば、直接的な化学結合により、あるいはリンカー分子を介して、ＥＲａｓタンパク質に融合してもよい。かかる場合、リンカー分子は、２つのドメインを連結させることのできるいずれの２価の化学構造物であってもよい。本発明の好ましいリンカー分子は短いペプチド、例えば、１〜２０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基を有するものである。融合タンパク質は公知の遺伝子工学的な手法を用いて作製することもできる。
本明細書において「タンパク質」には、特定のアミノ酸配列（配列番号：２，４，６または８）で示されるタンパク質だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質と、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。
従って、本明細書において「ＥＲａｓタンパク質」は、特に言及しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号２，４，６または８）で示されるＥＲａｓタンパク質やその同族体、変異体、誘導体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するマウスＥＲａｓタンパク質、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を有するヒトＥＲａｓタンパク質、配列番号：６に記載のアミノ酸配列を有するサルＥＲａｓタンパク質、配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有するウシＥＲａｓタンパク質、およびラットホモログなどが包含される。ここで配列番号２に示すタンパク質は、マウス由来のＥＲａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号４に示すタンパク質は、ヒト由来のＥＲａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号６に示すタンパク質は、サル由来のＥＲａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号８に示すタンパク質は、ウシ由来のＥＲａｓ遺伝子によってコードされるタンパク質である。
ＥＲａｓタンパク質には、配列番号２，４，６または８に示す各アミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記各アミノ酸配列において、１もしくは複数（通常数個）のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つもとのアミノ酸配列のＥＲａｓタンパク質と実質的に同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
ここで実質的に同等の活性とは、該タンパク質を発現させた細胞の細胞増殖が促進される、あるいは該タンパク質を取り込ませた細胞の細胞増殖が促進されるという性質を示す。このようなＥＲａｓタンパク質の性質は、公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，４２３，５４１−５４５（２００３））などにより容易に測定することができる。
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数および変異部位は、その活性が保持される限り制限はない。活性を消失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ Ｓｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がＥＲａｓタンパク質の活性を保持している限り、特に制限されない。この置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、アミノ酸の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、両親媒性などにおいて置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、ＡｓｐおよびＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
ＥＲａｓタンパク質は、後述するＥＲａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって製造することができる。
本発明において「タンパク質導入ドメイン」とは、タンパク質を導入することができる、またはタンパク質導入を補助することのできるものであればよく、何ら限定されない。例えば、（ｉ）公知であるＨＩＶ ＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Ａｎｔｏｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）、ＨＳＶ ＶＰ２２またはこれらのうちいずれかのフラグメント、（ｉｉ）ＨＩＶ Ｒｅｖのフラグメント、ｆｌｏｃｋ ｈｏｕｓｅ ｖｉｒｕｓ Ｃｏａｔ（ＦＨＶ Ｃｏａｔ）のフラグメント、ｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ Ｇａｇ（ＢＭＶ Ｇａｇ）のフラグメント、ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ−ＩＩ ＲｅＸ（ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲｅＸ）のフラグメント、ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ Ｇａｇ（ＣＣＭＶ Ｇａｇ）のフラグメント、Ｐ２２Ｎのフラグメント、λＮのフラグメント、φ２１Ｎのフラグメントまたは酵母ＰＲＰ６のフラグメント、（ｉｉｉ）オリゴアルギニンを有するペプチド、（ｉｖ）ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ＣＰＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはこれらのうちいずれかのフラグメント、などを挙げることができる。
前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかのタンパク質導入ドメインを用いることによって、広範囲な細胞にＥＲａｓを細胞内に取り込ませることができる。また、目的細胞において特異的に発現するレセプターと結合する物質をタンパク質導入ドメインとして用いることによって組織あるいは細胞特異的な取り込みが可能となるため、前記（ｉｖ）のタンパク質導入ドメインを用いれば、対応するレセプターが発現した組織あるいは細胞特異的にＥＲａｓを細胞内に取り込ませることができる。
前記（ｉ）のタンパク質導入ドメインであるＨＩＶ ＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Ａｎｔｏｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）、ＨＳＶ ＶＰ２２には、ＨＩＶ由来のＴＡＴ（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｌｏｅｗｎｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ，５６（６），１１７９−８８（１９８８）、Ｆｒａｎｋｅｌ ａｎｄ Ｐａｂｏ，Ｃｅｌｌ，５５（６），１１８９−９３（１９８８））、ショウジョウバエ由来のアンテナペディア蛋白（Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７２（２５），１６０１０−７（１９９７））、ＨＳＶ由来のＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ，８８（２），２２３−３３（１９９７））のみならず、その機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体などが包含される。なお、変異体としては、変異のないタンパク質と少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。
更に前記（ｉ）のタンパク質導入ドメインは、ＨＩＶ ＴＡＴのフラグメント、アンテナペデイア・ホメオドメインのフラグメントまたはＨＳＶ ＶＰ２２のフラグメントであり、且つタンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものも包含する。該フラグメントの長さは、タンパク質導入またはタンパク質導入を補助する機能を有するのであればよく、何ら限定はされない。
ＨＩＶ ＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメインおよびＨＳＶ ＶＰ２２は、細胞膜を貫通する能力を有する蛋白トランスダクションドメイン（以下、「ＰＴＤ」という）が同定されているため、タンパク質導入ドメインであるＨＩＶ ＴＡＴのフラグメント、アンテナペデイア・ホメオドメインのフラグメントおよびＨＳＶ ＶＰ２２のフラグメントには、これらのＰＴＤからなるフラグメントも包含される。異種蛋白とＰＴＤを融合することにより、培養細胞中に導入することができることは公知であり、その作製方法も知られている（Ｆａｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１（２），６６４−８（１９９４）、Ｅｌｌｉｏｔｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ（１９９７），Ｐｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６，４４０−４４３（１９９８）およびＤｉｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６（１），１２−２１（１９９９）、特許番号第２７０２２８５号）。ＨＩＶ ＴＡＴのＰＴＤについては、ＨＩＶ ＴＡＴ蛋白由来の１１アミノ酸のＰＴＤに融合したβ−ガラクトシダーゼ蛋白が、生きたマウスのすべての組織に浸潤してすべての単一細胞に到達できることが報告されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５（５４３３），１５６９−７２（１９９９））。
ＨＩＶ ＴＡＴのフラグメントとしては、具体的には、前記の公知文献等に記載されているものを挙げることができるが、好ましくは特許番号第２７０２２８５号に記載のＨＩＶ ＴＡＴフラグメントであり、更に好ましくは配列番号１３で示される配列を含有するペプチドが挙げられる。配列番号１３で示される配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するＨＩＶ ＴＡＴ−（４８−６０）ペプチドが挙げられる。
アルギニンに富む塩基性ペプチドは細胞膜透過能を有しており、ＨＩＶ ＴＡＴのフラグメントは分子中央部を全てアルギニンに置換しても（配列番号１６）、該フラグメント（ペプチド）は細胞膜透過能を有することが知られているため（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，５８３６−５８４０（２００１））、ＨＩＶ ＴＡＴのフラグメント、アンテナペデイア・ホメオドメインのフラグメントおよびＨＳＶ ＶＰ２２のフラグメントは、複数個のアミノ酸がアルギニンに置換されていてもよく、置換後のフラグメントがタンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有していれば、本発明のタンパク質導入ドメインに含まれる。
前記（ｉｉ）のタンパク質導入ドメインであるＨＩＶ Ｒｅｖのフラグメント、ｆｌｏｃｋ ｈｏｕｓｅ ｖｉｒｕｓ Ｃｏａｔ（ＦＨＶ Ｃｏａｔ）のフラグメント、ｂｒｏｍｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ Ｇａｇ（ＢＭＶ Ｇａｇ）のフラグメント、ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ−ＩＩ ＲｅＸ（ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲｅＸ）のフラグメント、ｃｏｗｐｅａ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ Ｇａｇ（ＣＣＭＶ Ｇａｇ）のフラグメント、Ｐ２２ Ｎのフラグメント、λＮのフラグメント、φ２１Ｎのフラグメントおよび酵母ＰＲＰ６のフラグメントは、タンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものであればよく、何ら限定されない。これらのフラグメントは、細胞膜透過能を有することが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，５８３６−５８４０（２００１））。例えば、ＨＩＶ ＲｅｖのフラグメントとしてはＨＩＶ Ｒｅｖ−（３４−５０）ペプチド（配列番号１８）、ＦＨＶ ＣｏａｔのフラグメントとしてはＦＨＶ Ｃｏａｔ−（３５−４９）ペプチド（配列番号１９）、ＢＭＶ ＧａｇのフラグメントとしてはＢＭＶ Ｇａｇ−（７−２５）ペプチド（配列番号２０）、ＨＴＬＶ−ＩＩ ＲｅＸのフラグメントとしてはＨＴＬＶ−ＩＩ Ｒｅｘ−（４−１６）ペプチド（配列番号２１）、ＣＣＭＶ ＧａｇのフラグメントとしてはＣＣＭＶ Ｇａｇ−（７−２５）ペプチド（配列番号２２）、Ｐ２２ ＮのフラグメントとしてはＰ２２ Ｎ−（１４−３０）ペプチド（配列番号２３）、λＮのフラグメントとしてはλＮ−（１−２２）ペプチド（配列番号２４）、φ２１Ｎのフラグメントとしてはφ２１Ｎ−（１２−２９）ペプチド（配列番号２５）、酵母ＰＲＰ６のフラグメントとしては酵母ＰＲＰ６−（１２９−１４４）ペプチド（配列番号２６）の全部または一部を有するフラグメントが挙げられる。また、これらのフラグメントの配列において複数個のアミノ酸がアルギニンに置換されてもよく、置換後のフラグメントがタンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有していれば、本発明のタンパク質導入ドメインに含まれる。
前記（ｉｉｉ）のタンパク質導入ドメインであるオリゴアルギニンからなるペプチドは、タンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有していればよく、何ら限定されない。オリゴアルギニンおよびオリゴアルギニンを有するペプチドが細胞膜透過能を有することは公知であるため（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，５８３６−５８４０（２００１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（４），２４３７−２７４３（２００２））、例えば、これらの文献に挙げられている細胞膜透過能を有するペプチドをタンパク質導入ドメインとして用いることができる。オリゴアルギニンを有するペプチドは、オリゴアルギニン（ｎ＝５〜９）を有するペプチドが好ましく、オリゴアルギニン（ｎ＝６〜８）を有するペプチドが更に好ましい。
前記（ｉｖ）のタンパク質導入ドメインである、「線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはこれらのうちいずれかのフラグメント」とは、公知のＦＧＦタンパク質、公知のＨＧＦタンパク質またはこれらのうちいずれかのフラグメントであり、対応するレセプター発現細胞にタンパク質を導入する機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものであればよく、何ら限定されない。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のフラグメントとの結合体が細胞内に取り込まれることは公知である（Ｒｏｊａｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，３７０−３７５（１９９８）、Ｌｉｎ，Ｙ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１４２５５−１４２５８（１９９５））。従って、これらの文献に報告されているＦＧＦフラグメントをタンパク質導入ドメインとして用いることができる。ＦＧＦのフラグメントとしては、例えば、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含有するフラグメントを挙げることができる。
本発明には、前記の本発明融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸も含まれる。
ここで「核酸」とは、「ＲＮＡ」または「ＤＮＡ」が含まれ、その長さによって特に制限されるものではない。「ＤＮＡ」とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。「ＲＮＡ」とは、１本鎖ＲＮＡのみならず、それに相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡ、さらにはそれらから構成される２本鎖ＲＮＡを包含する趣旨で用いられる。なお、核酸は機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができるため、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれ、上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸は、前記ＥＲａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドとタンパク質導入ドメインをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。
タンパク質導入ドメインがＨＩＶ ＴＡＴフラグメントである場合は、本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸は、具体的には、例えば
（ａ）配列番号：２記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１３記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
（ｂ）配列番号：４記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１３記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
（ｃ）配列番号：６記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１３記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
（ｄ）配列番号：８記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号：１３記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、
（ｅ）配列番号：１記載の塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｆ）配列番号：３記載の塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｇ）配列番号：５記載の塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｈ）配列番号：７記載の塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｉ）配列番号：１記載の塩基配列の第１７８番目のヌクレオチドから第８５８番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｊ）配列番号：３記載の塩基配列の第２５２番目のヌクレオチドから第９５０番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｋ）配列番号：５記載の塩基配列の第１番目のヌクレオチドから第６９９番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｌ）配列番号：７記載の塩基配列の第１１６番目のヌクレオチドから第８１７番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号：１１または１２記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｍ）配列番号：１０記載のアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｎ）配列番号：１４記載のアミノ酸配列をコードする核酸、
（ｏ）配列番号：９記載の塩基配列を含有する核酸、
（ｐ）配列番号：９記載の塩基配列からなる核酸、
またはこれら（ａ）〜（ｐ）の核酸と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸が挙げられる。
これら配列番号：１，３，５または７に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、本明細書の配列表の配列番号：１，３，５または７に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダイゼーションのプローブあるいはＰＣＲのプライマーに用いて、例えばＥＳ細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることなどによりクローニングすることができる。該クローニングは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
また前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸とは、具体的には、
（ｑ）前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
（ｒ）前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸との配列同一性を示す塩基配列を含有する核酸、
（ｓ）前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸によりコードされるタンパク質において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸、
などが挙げられる。
ここで前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸とは、例えば前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有する塩基配列を含有する核酸が挙げられる。具体的には、前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の部分配列などが挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
「ストリンジェントな条件」とは、例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは、３３３ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、３３３ｍＭ ＮａＣｌを示す）、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドを含む溶液中で４２℃にてハイブリダイズさせる条件、または６×ＳＳＣを含む（５０％ホルムアミドは含まない）溶液中で６５℃にてハイブリダイズさせる条件などが挙げられる。またハイブリダイゼーション後の洗浄の条件としては、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄するような条件が挙げられる。
前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸との配列同一性を示す塩基配列を含有する核酸とは、例えば前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の塩基配列と約４０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を示す塩基配列を含有する核酸が挙げられる。具体的には、前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸の部分配列などが挙げられる。このような配列同一性を有する核酸は、前述のハイブリダイゼーション反応やＰＣＲ反応により、または後述する核酸の改変（欠失、付加、置換）反応により作製することができる。
前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸によりコードされるタンパク質において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存在するアレル変異対等のタンパク質をコードする核酸を意味する。
ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明の核酸によりコードされるタンパク質の活性（細胞増殖促進活性）が保持される限り制限はない。このように活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個欠失、置換及び／又は付加されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ Ｓｔａｒ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ａｓｐ及びＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
この改変タンパク質をコードする核酸は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に記載の種々の方法、例えば部位特異的変異誘発やＰＣＲ法等によって製造することができる。また市販のキットを用いて、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法に従って製造することもできる。
以上のような、前記（ａ）〜（ｐ）のいずれかの核酸と実質的に同一の塩基配列を含有する本発明の核酸は、当該核酸によりコードされるタンパク質が、細胞内への導入が可能であり、導入された後は配列番号：２，４，６または８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質であることが好ましい。ここで実質的に同質の活性とは、本発明の核酸によりコードされるタンパク質を発現させた細胞は細胞増殖が促進されるという性質、あるいは当該タンパク質を取り込んだ細胞の細胞増殖が促進するという性質を指す。当該活性およびその測定については、公知の方法にて実施することができる。
本発明の核酸が２本鎖の場合、前記本発明の核酸を発現ベクターに挿入することにより、本発明のタンパク質を発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＣＥＰ４、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、２９３−ＥＢＮＡ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のタンパク質を製造することができる。得られたタンパク質は、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のタンパク質を、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
なお、実施例に示すように、これらの融合タンパク質は、試験管内で合成、精製することもできる。
本発明の「化学的結合体」とは、ＥＲａｓタンパク質を、ビスフォスフォネート化合物、グルコース−６−リン酸、Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物（たとえばＢＣＲＰインヒビター）またはアルギニンを有する分岐型ペプチドと化学的に結合して得られる結合体のことである。
「ビスフォスフォネート化合物」とは、例えば、エチドロネート、アレンドロネート、リセドロネート、インカドロネート、パミドロネート等の公知の化合物を挙げることができる。ビスフォスフォネート化合物は骨芽細胞に選択的に取り込まれるため、この公知の性質を利用したビスフォスフォネート化合物との結合体が報告されている（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．，５９，１６８−１７３（１９９６）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，４，１３７５−１３８０（１９９５））。そのため、ＥＲａｓタンパク質にビスフォスフォネート化合物を化学的に結合させた化学的結合体は骨芽細胞に将来分化していく間質系幹細胞特異的に取り込まれる。
「グルコース−６−リン酸」は公知の物質であり、ＥＲａｓタンパク質とグルコース−６−リン酸を化学的に結合させた化学的結合体は肝細胞および膵細胞に将来分化していく前駆細胞特異的に取り込まれる。
「Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物」とは、例えばＢＣＲＰインヒビターを挙げることができる。具体的には、例えば、ＢＣＲＰインヒビターであるＧＦ１２０９１８などを挙げることができる。Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物とＮａｎｏｇタンパク質と化学的に結合させることにより、化学的結合体はＳＰ細胞と呼ばれる各種体性幹細胞特異的に取り込まれる。
「アルギニンを有する分岐型ペプチド」とは、例えば、文献Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１，７９２５−７９３０，（２００２）に記載されているような細胞膜透過能をもつ８個程度のアルギニンを有する分岐型ペプチドのことであり、具体的には、該文献の（Ｒ２）４ペプチドや（ＲＧ３Ｒ）４ペプチドなどが挙げられる。
ＥＲａｓタンパク質は前記のように作製することができる。精製されたＥＲａｓタンパク質と上記物質の化学的結合体は公知の方法に従って化学的に結合させて作製することができる。例えば、アミノ基を持つリンカーをつけることで酸アミド結合など公知の方法に従って化学的に結合させることによって作製することができる。
本発明の「細胞増殖促進剤」とは、上記の本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のうち少なくとも１つを含有する剤のことであり、細胞に取り込まれることによって該細胞の増殖を促進する。
ここで細胞は、特に限定されないが、哺乳動物細胞を挙げることができる。哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、ウシ、ラットやマウス等の哺乳動物の組織・臓器細胞またはこれら由来の細胞であって、個体の細胞、個体から取り出した初代細胞、または培養細胞のいずれでもよい。好ましくは、市販の培養細胞（ＡＴＣＣ社など）、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞を挙げることができ、より好ましくはヒト胚性幹細胞やヒト体性幹細胞である。
また、マウスＥＳ細胞にＮａｎｏｇタンパク質を強制発現させるとＬＩＦなしでも万能性を維持したまま継代することができるため（Ｃｅｌｌ，１１３，６３１−６４２（２００３））、本発明の細胞増殖促進剤は本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体だけでなく、Ｎａｎｏｇ（ＥＣＡＴ４）タンパク質も含有されていてもよい。
本発明の「Ｎａｎｏｇタンパク質」とは、Ｎａｎｏｇタンパク質のみに限定されず、本発明の融合タンパク質や化学的結合体と同様に、細胞内に取り込まれやすくした態様のものも包含される。本発明のＮａｎｏｇタンパク質は、そのアミノ酸配列および塩基配列が公知であるため（ＷＯ ０２／０９７０９０ Ａ１）、前記のＥＲａｓタンパク質、融合タンパク質、あるいは化学的結合体と同様の方法にて作製することができる。
本発明の細胞増殖促進剤を作用させるには、当該剤を直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、ヒトからある種の細胞を採取し、体外で該細胞に添加してその細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法、および培養細胞に添加するｉｎ ｖｉｔｒｏ法がある。
投与方法としては、ｅｘ ｖｉｖｏ法またはｉｎ ｖｉｔｒｏ法であれば、細胞を培養している培養液中に添加、あるいは細胞に直接添加すればよい。添加量は、細胞の種類、細胞数等により適宜調整することができるが、細胞毒性が認められず細胞増殖促進活性が認められればよい。製剤中の本発明の融合タンパク質または結合体の添加量は通常培地に０．０００１μＭ〜１０００μＭ、好ましくは０．０００１μＭ〜１０μＭ、より好ましくは０．０００１μＭ〜１μＭであり、これを１〜数日に１回添加するのが好ましい。
また、ｉｎ ｖｉｖｏ法の投与方法としては、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明の融合タンパク質または結合体の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重などにより適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇであり、これを１〜数日に１回投与するのが好ましい。
細胞増殖促進剤の有効成分である本発明の融合タンパク質あるいは結合体は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）、慣用の添加剤などと混合して試薬あるいは医薬組成物として調製することができ、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または培地等を含むものであってもよい。当該医薬組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などに調整することができる。
本発明の「細胞増殖促進方法」とは、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のいずれかを細胞に接触させることにより、細胞増殖を促進する方法である。具体的には、例えば、本発明の細胞増殖促進剤を細胞培養培地中に添加して細胞に接触させ、細胞に取り込ませることによって細胞増殖を促進する方法のことである。
本発明の細胞増殖促進方法は、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のいずれかを細胞と接触させた後に、細胞のピノサイトーシス（飲作用）により取り込まれ、細胞の増殖が促進される方法であってもよい。細胞のピノサイトーシスを利用した取り込み（導入）は、例えば、市販のキットであるＩｎｆｌｕｘ（登録商標）Ｐｉｎｏｃｙｔｉｃ Ｃｅｌｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）を用いることによって実施することができる。
本発明の細胞増殖促進方法は、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体だけでなく、さらに前記Ｎａｎｏｇタンパク質を接触させる工程を加えることもできる。
細胞は、特に限定されないが、哺乳動物細胞を挙げることができる。哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、ウシ、ラットやマウス等の哺乳動物の組織・臓器細胞またはこれら由来の細胞であって、個体の細胞、個体から取り出した初代細胞、または培養細胞のいずれでもよい。好ましくは、市販の培養細胞（ＡＴＣＣ社など）、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞を挙げることができ、より好ましくはヒト胚性幹細胞やヒト体性幹細胞である。
前記の細胞増殖促進剤あるいは細胞増殖促進方法により、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体を含有する細胞を作製することができる。
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
［実施例１］
（１）ＴＡＴ−ＥＲａｓ発現ベクターの構築
オリゴＤＮＡのＴＡＴ−Ｓ（配列番号１１）とＴＡＴ−ＡＳ（配列番号１２）を９４度で１分間変性の後、徐々に室温に戻し２本鎖ＤＮＡを作製した。これをｐＣＤＮＡ３．１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にライゲーションした（ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ）。このｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にＧａｔｅｗａｙ ｒｆＢ Ｃａｓｅｔｔｅを挿入してｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＧＷを作製した。ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＧＷとｐＥｎｔｅｒ−ｍＥＲａｓでＬＲ組み換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を行い、ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＥＲａｓ（図１）を作製した。ＴＡＴ−ＥＲａｓのＤＮＡ配列は配列番号９に、アミノ酸配列は配列番号１０で示されている。
（２）ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質の合成と精製
融合タンパク質の合成と精製は、ＰｕｒｅＧｅｎｅシステムを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて行った。
（３）ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質による細胞増殖促進
マウス１２．５日胚よりマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を単離した。ＭＥＦは１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ中で培養した。ここにＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質を加えると増殖が有意に促進された（図２）。一方、ＥＲａｓのＣ末端のＣＡＡＸモチーフを欠失し膜局在できなくしたＴＡＴ−ＥＲａｓ−ΔＣを加えても細胞増殖促進は認められなかった。
［実施例２］
（１）ＴＡＴ−ＥＲａｓ発現ベクターの構築
オリゴＤＮＡのＴＡＴ−Ｓ（配列番号１１）とＴＡＴ−ＡＳ（配列番号１２）を９４度で１分間変性の後、徐々に室温に戻し２本鎖ＤＮＡを作製する。これをｐＣＤＮＡ３．１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にライゲーションする（ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ）。このｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ部位にＧａｔｅｗａｙ ｒｆＢ Ｃａｓｅｔｔｅを挿入してｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＧＷを作製する。ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＧＷとｐＥｎｔｅｒ−ｍＥＲａｓでＬＲ組み換え反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を行い、実施例１と同様に、ｐＣＤＮＡ３．１−ＴＡＴ−ＥＲａｓを作製する。ＴＡＴ−ＥＲａｓのＥＲａｓは、マウスＥＲａｓではなくヒトＥＲａｓを用いるため、作製されるＴＡＴ−ＥＲａｓのアミノ酸配列は配列番号１４に示されている。
（２）ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質の合成と精製
融合タンパク質の合成と精製は、実施例１と同様に、ＰｕｒｅＧｅｎｅシステムを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて行う。
（３）ＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質による細胞増殖促進
ヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）およびヒト体性幹細胞を常法により培養する。細胞に、実施例１または実施例２で作製したＴＡＴ−ＥＲａｓタンパク質を加えることにより、いずれの細胞についても細胞増殖が有意に促進されることが観察される。
【産業上の利用可能性】
本発明により、細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞の増殖を促進することができる融合タンパク質、または化学的結合体を提供することができる。本発明の細胞増殖促進剤は、多能性を維持させたまま増殖させることが困難な胚性幹細胞や体性幹細胞にも用いることができる。また本発明の細胞増殖促進剤は、多数の細胞を一度に簡便に処理することができるだけでなく、可逆的に調整をすることができるため、遺伝子導入法に比べてより臨床応用が可能である。
【配列表フリーテキスト】
配列番号：１１に記載の塩基配列はＴＡＴ−Ｓである。
配列番号：１２に記載の塩基配列はＴＡＴ−ＡＳである。
配列番号：１３に記載のアミノ酸配列はＨＩＶ ＴＡＴペプチドである。
配列番号：１５に記載のアミノ酸配列はＦＧＦフラグメントである。
配列番号：１６に記載のアミノ酸配列は置換後のＨＩＶ ＴＡＴペプチドである。
配列番号：１７に記載のアミノ酸配列はＨＩＶ ＴＡＴペプチドである。
配列番号：１８に記載のアミノ酸配列はＨＩＶ Ｒｅｖ−（３４−５０）ペプチドである。
配列番号：１９に記載のアミノ酸配列はＦＨＶ Ｃｏａｔ−（３５−４９）ペプチドである。
配列番号：２０に記載のアミノ酸配列はＢＭＶ Ｇａｇ−（７−２５）ペプチドである。
配列番号：２１に記載のアミノ酸配列はＨＴＬＶ−ＩＩ Ｒｅｘ−（４−１６）ペプチドである。
配列番号：２２に記載のアミノ酸配列はＣＣＭＶ Ｇａｇ−（７−２５）ペプチドである。
配列番号：２３に記載のアミノ酸配列はＰ２２ Ｎ−（１４−３０）ペプチドである。
配列番号：２４に記載のアミノ酸配列はλＮ−（１−２２）ペプチドである。
配列番号：２５に記載のアミノ酸配列はφ２１Ｎ−（１２−２９）ペプチドである。
配列番号：２６に記載のアミノ酸配列は酵母ＰＲＰ６−（１２９−１４４）ペプチドである。
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質導入ドメインおよびＥＲａｓタンパク質を含んでいることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
ＥＲａｓタンパク質がヒト、サル、ウシまたはマウス由来のものである、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ ＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Ａｎｔｏｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）、ＨＳＶ ＶＰ２２またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、請求項１または２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ Ｒｅｖのフラグメント、ＦＨＶ Ｃｏａｔのフラグメント、ＢＭＶ Ｇａｇのフラグメント、ＨＴＬＶ−ＩＩ Ｒｅｘのフラグメント、またはオリゴアルギニンからなるペプチドである、請求項１または２記載の融合タンパク質。
【請求項５】
タンパク質導入ドメインが、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、請求項１または２記載の融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸。
【請求項７】
請求項６記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターを含有する細胞。
【請求項９】
請求項８記載の細胞を、融合タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、請求項１〜５いずれか記載の融合タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
ビスフォスフォネート化合物、グルコース−６−リン酸、Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物またはアルギニンを有する分岐型ペプチドと、ＥＲａｓタンパク質との化学的結合体。
【請求項１１】
請求項１〜５いずれか記載の融合タンパク質または請求項１０記載の化学的結合体を有効成分として含有する細胞増殖促進剤。
【請求項１２】
Ｎａｎｏｇタンパク質をさらに含有する、請求項１１記載の細胞増殖促進剤。
【請求項１３】
細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、請求項１１または１２記載の細胞増殖促進剤。
【請求項１４】
請求項１〜５いずれか記載の融合タンパク質または請求項１０記載の化学的結合体と細胞とを接触させる工程を含む、細胞増殖促進方法。
【請求項１５】
Ｎａｎｏｇタンパク質をさらに接触させる、請求項１４記載の細胞増殖促進方法。
【請求項１６】
細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、請求項１４または１５記載の細胞増殖促進方法。
【請求項１７】
請求項１〜５いずれか記載の融合タンパク質または請求項１０記載の化学的結合体を含有する細胞。
【請求項１】
タンパク質導入ドメインおよびＥＲａｓタンパク質を含んでいることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
ＥＲａｓタンパク質がヒト、サル、ウシまたはマウス由来のものである、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ ＴＡＴ、アンテナペデイア・ホメオドメイン（Ａｎｔｏｎｎａｐｅｄｉａ ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）、ＨＳＶ ＶＰ２２またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、請求項１または２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
タンパク質導入ドメインが、ＨＩＶ Ｒｅｖのフラグメント、ＦＨＶ Ｃｏａｔのフラグメント、ＢＭＶ Ｇａｇのフラグメント、ＨＴＬＶ−ＩＩ Ｒｅｘのフラグメント、またはオリゴアルギニンからなるペプチドである、請求項１または２記載の融合タンパク質。
【請求項５】
タンパク質導入ドメインが、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、請求項１または２記載の融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸。
【請求項７】
請求項６記載の核酸を含有する発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターを含有する細胞。
【請求項９】
請求項８記載の細胞を、融合タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、請求項１〜５いずれか記載の融合タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
ビスフォスフォネート化合物、グルコース−６−リン酸、Ｐ糖タンパク質に結合活性を持つ化合物またはアルギニンを有する分岐型ペプチドと、ＥＲａｓタンパク質との化学的結合体。
【請求項１１】
請求項１〜５いずれか記載の融合タンパク質または請求項１０記載の化学的結合体を有効成分として含有する細胞増殖促進剤。
【請求項１２】
Ｎａｎｏｇタンパク質をさらに含有する、請求項１１記載の細胞増殖促進剤。
【請求項１３】
細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、請求項１１または１２記載の細胞増殖促進剤。
【請求項１４】
請求項１〜５いずれか記載の融合タンパク質または請求項１０記載の化学的結合体と細胞とを接触させる工程を含む、細胞増殖促進方法。
【請求項１５】
Ｎａｎｏｇタンパク質をさらに接触させる、請求項１４記載の細胞増殖促進方法。
【請求項１６】
細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、請求項１４または１５記載の細胞増殖促進方法。
【請求項１７】
請求項１〜５いずれか記載の融合タンパク質または請求項１０記載の化学的結合体を含有する細胞。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３５５６２
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【発行日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４６２７（Ｐ２００５−５１４６２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５００９
【国際出願日】平成１６年１０月５日（２００４．１０．５）
【出願人】（５０１２１９３１２）
【出願人】（０００００２９１２）大日本住友製薬株式会社 (332)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【発行日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５００９
【国際出願日】平成１６年１０月５日（２００４．１０．５）
【出願人】（５０１２１９３１２）
【出願人】（０００００２９１２）大日本住友製薬株式会社 (332)
【Ｆターム（参考）】
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