新規の種類のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としてのＺｎ２＋キレートモチーフ係留短鎖脂肪酸
【課題】ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤としての、Ｚｎ２＋キレートモチーフで係留された脂肪酸を提供すること。
【解決手段】化合物はインビトロおよびインビボテストにて良く効果を発揮した。本発明は、例えばバルプロエート、ブチレート、フェニルおよびフェニルブチレートなどの短鎖脂肪酸を含む脂肪酸の構造的な改変に基づく。本発明は一般に、脂肪酸を、芳香族ωアミノ酸リンカーを介してＺｎ２＋キレートモチーフ（ヒドロキサム酸、ο‐フェニレンジアミンが挙げられるが、これらに限定されない）と結合することを含む。
【解決手段】化合物はインビトロおよびインビボテストにて良く効果を発揮した。本発明は、例えばバルプロエート、ブチレート、フェニルおよびフェニルブチレートなどの短鎖脂肪酸を含む脂肪酸の構造的な改変に基づく。本発明は一般に、脂肪酸を、芳香族ωアミノ酸リンカーを介してＺｎ２＋キレートモチーフ（ヒドロキサム酸、ο‐フェニレンジアミンが挙げられるが、これらに限定されない）と結合することを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の説明）
本発明は、Ａｒｍｙ Ｇｒａｎｔ ＤＡＭＤ１７−０２−１−０１１７およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｒａｎｔ ＣＡ９４８２９によって支援された。政府は、本発明において一定の権利を有する。本願は、２００２年１２月２日に出願された米国仮特許出願６０／５２６，３４８号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に関係し、特にＺｎ２＋キレートモチーフを包含するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に関する。より詳細には、本発明は、短鎖脂肪酸を基本とする、Ｚｎ２＋キレートモチーフを包含するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
コアヒストンのアセチル化状態は、ＤＮＡのヌクレオソーム・パッケージングの調節を介して、遺伝子の転写調節において中枢的役割を果たしている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。低アセチル化状態では、ヌクレオソームは緊密に凝縮されており、その結果転写因子の標的ＤＮＡへの接触が制限されることに起因して、転写が抑制される。反対に、ヒストンがアセチル化されるとヌクレオソーム構造は緩み、クロマチンは転写許容状態となる。どちらも配列特異的転写活性因子との複合体として標的遺伝子へ動員される、ヒストンアセチル基転移酵素（ＨＡＴ）の活性とヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の活性との間の動力学的なバランスが、この翻訳後修飾のレベルを維持している。この後成的なマーキング（ｍａｒｋｉｎｇ）システムの調節異常が、多くの形態の癌の主要な病因である不適切な遺伝子発現を引き起こすことが示されている（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。さらに、多くの種類の腫瘍細胞でＨＤＡＣを阻害すると、少数の遺伝子の転写が再活性化されることによって、成長停止、分化および／またはアポトーシスが誘引されることを例証する多くの証拠がある（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。異種移植片モデルでもまた、これらインビトロでの知見が確認されており、これらのことはＨＤＡＣ機能の調節が、癌の予防的および／または治療的介入のための標的となることを示唆している。
【０００４】
現時点で、構造的に異なる種類のいくつかのＨＤＡＣ阻害剤が報告されており（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）、これとしては短鎖脂肪酸（例えば、ブチレート（ｂｕｔｙｒａｔｅ）、バルプロエート（ｖａｌｐｒｏａｔｅ）、フェニルアセテート（ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）およびフェニルブチレート（ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ））（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）、ベンズアミド誘導体類（例えばＭＳ−２７−２７５）（非特許文献１６；非特許文献１７）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）および類似体（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）、ハイブリッド極性化合物（例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ））（非特許文献２１；非特許文献２２）、環状テトラペプチド類（例えばアピシジン（ａｐｉｃｉｄｉｎ））（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）、並びにデプシペプチドＦＲ９０１２２８（非特許文献２６）が挙げられる。これらの薬剤の内、短鎖脂肪酸は、他の種類のＨＤＡＣ阻害剤のＩＣ５０がμＭまたはｎＭ単位ですらあることと比較して、ＩＣ５０がｍＭ単位である最も弱い阻害剤である。短鎖脂肪酸を癌治療に使用することが報告されているが、低い抗増殖活性、速い代謝、および非特異的様式での作用のため、その治療効果は限られている。
【０００５】
最近、細菌性のＨＤＡＣ相同体であるＨＤＬＰ（ヒストン脱アセチル化酵素様タンパク質）のＸ線結晶分析から、タンパク質−リガンド相互作用（それによりＴＳＡおよびＳＡＨＡが酵素阻害を媒介する）の特異な様式が示唆された（非特許文献２７）。ＨＤＡＣ触媒ドメインは、炭素数４から６の直鎖に相当する長さにわたる、細い管状ポケット構造から成ることが明白となっている。この酵素のポケット構造の底部近くにＺｎ２＋陽イオンが位置し、これが、２つのＨｉｓ−Ａｓｐ電荷伝達系と協同して脱アセチル化触媒を促進していると考えられている。
【０００６】
当該分野の他の研究を慎重に考察し、短鎖脂肪酸のＨＤＡＣ阻害効力が弱いのは、短鎖脂肪酸が、本発明者らが脱アセチル化触媒の中心的役割を果たしていると考えている、活性部位ポケット内のＺｎ２＋陽イオンに接近できないことに一部起因すると、本発明者らは理解した。この考察およびさらなる研究を基に、本発明者らは、芳香族リンカーを介してＺｎ２＋キレートモチーフに短鎖脂肪酸を係留（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）することによって、短鎖脂肪酸を構造的に改変した。本発明者らの発見および研究によって、本発明者らは、新しい種類のＺｎ２＋キレートモチーフに係留された短鎖脂肪酸を発明するに至った。これらのうちのいくつかはｎＭの単位でＨＤＡＣ活性並びに癌細胞増殖の阻害を示すものもあり、これは親化合物と比較して３桁の作用効力向上である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ，「Ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌａｓｅｓ ａｎｄ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ（１９９９）９：４０−４８
【非特許文献２】Ｇｒａｙ ａｎｄ Ｅｋｓｔｒｏｍ，「Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ．」Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ（２００１）２６２：７５−８３
【非特許文献３】Ｊｅｎｕｗｅｉｎ ａｎｄ Ａｌｌｉｓ，「Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｃｏｄｅ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）２９３：１０７４−１０８０
【非特許文献４】Ｗａｄｅ，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｂｙ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ．」Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ（２００１）１０：６９３−６９８
【非特許文献５】Ｃｒｅｓｓ ａｎｄ Ｓｅｔｏ，「Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ，ｔｒｅａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ，ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．」Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（２０００）１８４：１−１６
【非特許文献６】Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ： ｃａｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｒａｐｉｅｓ．」Ｎａｔｌ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ（２００１）１：１９４−２０２
【非特許文献７】Ｊｕｎｇ，「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ ａｓ ｎｅｗ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ．」Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（２００１）８ １５０５−１５１１
【非特許文献８】Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，「Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．」Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２００２）９：３−１６
【非特許文献９】Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，「Ｈｉｓｔｏｎｅ−ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｎｏｖｅｌ ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．」Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ（２００２）１：２８７−２９９
【非特許文献１０】Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ａｓ ａ ｔｈｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ．」Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ（２００１）１２：２９４−３００
【非特許文献１１】Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ」Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（２０００）９２：１２１０−１２１６
【非特許文献１２】Ｌｅａ ａｎｄ Ｔｕｌｓｙａｎ，「Ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｕｔｙｌａｔｅ ａｎｏｌｏｇｕｅｓ ｏｎ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ．」Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９５）１５：８７９：８８３
【非特許文献１３】Ｋｒｕｈ，「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｅ，ａ ｎｅｗ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔ，ｏｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８２）４２：６５−８２
【非特許文献１４】Ｎｅｗｍａｒｋ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，「Ｂｕｔｙｒａｔｅ ａｎｄ ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ ａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ：ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．」Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｕｐｐｌ（１９９５）２２：２４７−２５３
【非特許文献１５】Ｐｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｓ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ，ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ，ｍｏｏｄ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ，ａｎｄ ｔｅｒａｔｏｇｅｎ．」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００１）２７６：３６７３４−３６７４１
【非特許文献１６】Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｅｗ ｂｅｎｚａｍｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．」Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９９９）４２：３００１−３００３
【非特許文献１７】Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，ＭＳ−２７−２７５，ｗｉｔｈ ｍａｒｋｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ．」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９９）９６：４５９２−４５９７
【非特許文献１８】Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ．」Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）（１９７６）２９：１−６
【非特許文献１９】Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．「Ａｍｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ ａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．」Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９９９）４２：４６６９−４６７９
【非特許文献２０】Ｆｕｒｕｍａｉ ｅｔ ａｌ．「Ｐｏｔｅｎｔ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｂｕｉｌｔ ｆｒｏｍ ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ ａｎｄ ｃｙｃｌｉｃ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｒａｐｏｘｉｎ．」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００１）９８：８７−９２
【非特許文献２１】Ｒｉｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｐｏｌａｒ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ．」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９８）９５：３００３−３００７
【非特許文献２２】Ｒｅｍｉｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅｓ．」Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（２００２）４５：７５３−７５７
【非特許文献２３】Ｋｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｒａｐｏｘｉｎ，ａｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｃｙｃｌｉｃ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ，ｉｓ ａｎ ｉｎｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ．」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：２２４２９−２２４３５
【非特許文献２４】Ｓｈｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，「Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｃｈｌａｍｙｄｏｃｉｎ ａｎｄ ＨＣ−ｔｏｘｉｎ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ ｋｅｔｏｎｅ ａｎｄ ｄｉａｚｏｍｅｔｈｙｌ ｋｅｔｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｃｙｃｌｉｃ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅｓ．」Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９８７）３０：７１−７８
【非特許文献２５】Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，「Ａｐｉｃｉｄｉｎ，ａ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１ ａｎｄ ｇｅｌｓｏｌｉｎ．」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００）６０：６０６８−６０７４
【非特許文献２６】Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．「ＦＲ９０１２２８，ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．」Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ（１９９８）２４１：１２６−１３３
【非特許文献２７】Ｆｉｎｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ａ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ＴＳＡ ａｎｄ ＳＡＨＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）４０１：１８８−１９３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（本発明の要旨）
本発明者らは、短鎖脂肪酸のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤としての効力が弱いのは、脱アセチル化触媒に重要と考えられるＨＤＡＣ活性部位ポケット内の亜鉛陽イオンに短鎖脂肪酸が接近できないことに一部起因すると理解した。本発明は、例えばバルプロエート、ブチレート、フェニルアセテートおよびフェニルブチレートなどの短鎖脂肪酸を含む脂肪酸の構造的な改変に基づく。本発明は一般に、脂肪酸を、芳香族ωアミノ酸リンカーを介してＺｎ２＋キレートモチーフ（ヒドロキサム酸、ο‐フェニレンジアミンが挙げられるが、これらに限定されない）と結合することを含む。新しい種類のＺｎ２＋キレートモチーフ係留短鎖脂肪酸を含む本発明は、このストラテジーから導かれた。
【０００９】
本発明の化合物のＨＤＡＣ阻害における効力は、ＨＤＬＰリガンド複合体の結晶構造から提供されるフレームワークに基づいて、強力なＨＤＡＣ阻害剤が設計され得ることを示している。本発明は、短鎖脂肪酸、ωアミノ酸、ヒドロキサマト（ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｏ）などの亜鉛キレート剤の様々な組み合わせにより、化合物の大きなライブラリを創出することを可能にする係留ストラテジーに基づいている。
【００１０】
本発明は、以下の式：
【００１１】
【化６】
を有するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む。ここで：
Ｘは、ＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｙは、ｎが０〜２の（ＣＨ２）ｎであり；
Ｚは、ｍが０〜３である（ＣＨ２）ｍおよび（ＣＨ）２から選択され；
Ａは、ヒドロカルビル基であり；
Ｂは、ο‐アミノフェニル基またはヒドロキシ基であり；
Ｑは、ハロゲン、水素、またはメチル基である。
【００１２】
一実施例において、Ａは脂肪族を含み得、この脂肪族は分岐であり得る。Ａはまた、置換されていても置換されていなくてもよい芳香族も含む。この式において、Ｂはο‐アミノフェニル基またはヒドロキシ基である。いくつかの実施例において、Ｙはｎが０である（ＣＨ２）ｎであり得、Ａは芳香族基を含み、Ｂはヒドロキシで、かつＱは水素である。
【００１３】
いくつかの実施例では、ｍは０かつＸはＨである。これらの特徴を有する化合物としては以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００１４】
【化７】
【００１５】
【化８】
いくつかの実施例では、ＸはＨであり、かつＡは以下：
【００１６】
【化９】
から選択され、ここでＲは分岐または非分岐の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、脂肪族または芳香族を含む。
【００１７】
本発明は、本発明の阻害剤を含む組成物を包含し、この組成物はＲ立体異性体と比較してＳ立体異性体が富化されている。
【００１８】
本発明の具体的な阻害剤としては、Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；２−プロピル−ペンタン酸−｛４−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−メチル］−フェニル｝−アミド；２−プロピル−ペンタン酸（４−ヒドロキシカルバモイル−メチル−フェニル）−アミド；２−プロピル−ペンタン酸−｛４−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−エチル］−フェニル｝−アミド；２−プロピル−ペンタン酸［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−アミド；２−プロピル−ペンタン酸｛４−２−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−ビニル］−フェニル｝−アミド；２−プロピル−ペンタン酸−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−ビニル）−フェニル］−アミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（ブチリルアミノ−メチル）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（４−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；４−（ブチリルアミノ−メチル）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（４−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；４−ブチリルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（４−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−ブチルアミド；Ｎ−ヒドロキシ−３−（４−フェニルアセチルアミノ−フェニル）−プロピオンアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−４−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（３−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−３−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（３−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；４−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−メチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−クロロ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−ブロモ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−ｔｅｒｔ−ブチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−フェニル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロシキ−ベンズアミド；４−（４−メトキシル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−トリフルオロメチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−ニトロ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；ピリジン−２−カルボン酸（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニル）−アミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−メチル−２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；４−（２，２−ジメチル−４−フェニル‐ブチリルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［メチル−（４−フェニル−ブチリル）−アミノ］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−メトキシ−２−フェニル−アセチルアミノ）−ベンズアミド；４−ジフェニルアセチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（４−イソブチル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（５−フェニル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２，２−ジメチル−４−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（４−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−メチル−２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［２−（４−イソブチル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ベンズアミド；ならびにＮ−ヒドロキシ−４−［２−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイルーエチル）−フェニル］−２−（Ｓ）−フェニル−ブチリルアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイルーエチル）−フェニル］−２−（Ｒ）−フェニルブチルアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［３−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；およびＮ−ヒドロキシ−４−［３−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミドが含まれる。
【００１９】
本発明はまた、これらの阻害剤と１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤とを含む薬学的組成物を含む。さらになお、本発明は、動物（例えば、ヒト）内で腫瘍性細胞増殖を阻害する方法を含み、、これは治療的有効量の少なくとも１種の本発明の阻害剤を投与する工程を包含する。
【００２０】
本発明のさらなる特性および利点は、以下に続く説明にてその一部が記述される。その一部はこの説明から明白となるか、または本発明の実施によって習得され得る。本発明の特性および利点は、添付の特許請求の範囲において具体的に示される要素および組み合わせによって理解され、達成されることとなる。
【００２１】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はいずれも、例示であって説明にすぎず、特許請求の範囲のように本発明を制限するものではないことが、理解されるべきである。この明細に添付され、この明細の一部を構成する付属の図面は、本発明の実施形態を実証し、説明と一緒になって本発明の本質を説明するのに役立つものである。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
式
【化１】
を有する、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であって、ここで：
Ｘは、ＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｙは、ｎが０〜２である、（ＣＨ２）ｎから選択され；
Ｚは、ｍが０〜３である（ＣＨ２）ｍおよび（ＣＨ）２から選択され；
Ａは、ヒドロカルビル基であり；
Ｂは、ｏ−アミノフェニル基またはヒドロキシル基であり；そして
Ｑが、ハロゲン、水素、またはメチルである、阻害剤。
（項目２）
請求項１に記載の阻害剤であって、Ａが脂肪族基を含む、阻害剤。
（項目３）
請求項２に記載の阻害剤であって、前記脂肪族基が分枝である、阻害剤。
（項目４）
請求項１に記載の阻害剤であって、Ａが芳香族基を含む、阻害剤。
（項目５）
請求項４に記載の阻害剤であって、Ａが、置換した芳香族基を含む、阻害剤。
（項目６）
請求項１に記載の阻害剤であって、Ｂがｏ−アミノフェニルである、阻害剤。
（項目７）
請求項１に記載の阻害剤であって、Ｂがヒドロキシである、阻害剤。
（項目８）
請求項１に記載の阻害剤であって、ｎが０であり、Ａが芳香族基を含み、Ｂがヒドロキシであり、そしてＱが水素である、阻害剤。
（項目９）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；２−プロピル−ペンタン酸｛４−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−メチル］−フェニル｝−アミド；２−プロピル−ペンタン酸（４−ヒドロキシカルバモイル−メチル−フェニル）−アミド；２−プロピル−ペンタン酸｛４−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−エチル］−フェニル｝−アミド；２−プロピル−ペンタン酸［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−アミド；２−プロピル−ペンタン酸｛４−２−（２−アミノ−フェニルカルバモイル）−ビニル］−フェニル｝−アミド；および２−プロピル−ペンタン酸［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−ビニル）−フェニル］−アミドから選択される、阻害剤。
（項目１０）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（ブチリルアミノ−メチル）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（４−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；４−（ブチリルアミノ−メチル）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（４−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；４−ブチリルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（４−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；およびＮ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−ブチルアミドから選択される、阻害剤。
（項目１１）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、Ｎ−ヒドロキシ−３−（４−フェニルアセチルアミノ−フェニル）−プロピオンアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−４−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（３−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−３−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；およびＮ−ヒドロキシ−４−［（３−フェニルーブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミドから選択される、阻害剤。
（項目１２）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、４−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−メチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−クロロ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−ブロモ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−ｔｅｒｔ−ブチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−フェニル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−メトキシル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−トリフルオロメチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−ニトロ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミドおよびピリジン−２−カルボン酸（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニル）−アミドから選択される、阻害剤。
（項目１３）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−メチル−２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；４−（２，２−ジメチル−４−フェニル−ブチリルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［メチル−（４−フェニル−ブチリル）−アミノ］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−メトキシ−２−フェニルーアセチルアミノ）−ベンズアミド；４−ジフェニルアセチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（４−イソブチル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ベンズアミド；およびＮ−（２−アミノ−フェニル）−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミドから選択される、阻害剤。
（項目１４）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（５−フェニル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２，２−ジメチル−４−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（４−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−メチル−２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［２−（４−イソブチル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ベンズアミド；およびＮ−ヒドロキシ−４−［２−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミドから選択される、阻害剤。
（項目１５）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−（Ｓ）−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−（Ｒ）−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［３−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；およびＮ−ヒドロキシ−４−［３−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミドから選択される、阻害剤。
（項目１６）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、エステルまたは塩である、阻害剤。
（項目１７）
請求項１に記載の阻害剤と、少なくとも一つ薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、薬学的組成物。
（項目１８）
動物における腫瘍性細胞増殖を阻害する方法であって、治療上効果的な量の、請求項１に記載される少なくとも一つの阻害剤を投与する工程、を包含する、方法。
（項目１９）
請求項１８に記載の方法であって、前記動物がヒトである、方法。
（項目２０）
請求項８に記載の阻害剤であって、ｍ＝０であり、そしてＸ＝Ｈである、方法。
（項目２１）
請求項２０に記載の阻害剤であって、前記化合物が、
【化２】
である、阻害剤。
（項目２２）
請求項２０に記載の阻害剤であって、前記化合物が、
【化３】
である、阻害剤。
（項目２３）
請求項２０に記載の阻害剤であって、前記化合物が、
【化４】
である、阻害剤。
（項目２４）
請求項２１に記載の阻害剤を含む組成物であって、該組成物が、Ｒ−立体異性体と比べて、Ｓ−立体異性体が富化されている、組成物。
（項目２５）
請求項１に記載の阻害剤であって、Ｘ＝Ｈであり、そしてＡが、
【化５】
から選択され、Ｒが、分枝または非分枝の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、脂肪族基または芳香族基である、阻害剤。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、化合物１〜１０を生成するための、バルプロ酸と５つの芳香族ωアミノ酸および２つのＺｎ２＋キレート部分との様々な結合体を示す。
【図２】図２は、化合物１〜１０のＨＤＡＣ阻害効力を示す。インビトロＨＤＡＣアッセイは、本明細書中で記載されている市販の酵素アッセイキットを使用して行った。データは、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。
【図３】図３は、化合物１１〜２２の構造およびＨＤＡＣ阻害効力を示す。値は、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。
【図４】図４は、ＤＵ−１４５細胞におけるヒストンアセチル化およびｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１の発現に対する、ＨＴＰＢ、ＴＳＡおよびフェニルブチレートの影響を示す。１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ １６４０培地中で、ＤＵ−１４５細胞を、ＨＴＰＢ、ＴＳＡおよびフェニルブチレートに、示された濃度で２４時間曝露した。それぞれの溶解液からの等量のタンパク質を電気泳動し、それぞれの抗体を使用するウエスタンブロットによって試験した。内部参照タンパク質としてアクチンを使用した。
【図５】図５は、ＤＵ−１４５細胞に対するＨＴＰＢの増殖阻害効果を示す。（Ａ）細胞生存率に対するＨＴＰＢ用量依存的な影響の時間経過。ＤＵ−１４５細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地中の０〜２．５μＭのＨＴＰＢで、示された時間、処理した。ＭＴＴアッセイによって生細胞を試験した。データは平均値±Ｓ．Ｄ．である（ｎ＝６）。（Ｂ）２４時間曝露後のヌクレオソームＤＮＡの形成に対する、ＨＴＰＢ用量依存的な影響。ヌクレオソームの形成は、各アッセイについて２×１０３の細胞に相当する溶解物を用いたＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡによって、定量的に測定した。データは、２回の独立した定量の平均である。
【図６】図６は、本発明の化合物を合成するためのスキームの例を示す。
【図７−１】図７（フレーム１）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−２】図７（フレーム２）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−３】図７（フレーム３）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−４】図７（フレーム４）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−５】図７（フレーム５）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−６】図７（フレーム６）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−７】図７（フレーム７）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−８】図７（フレーム８）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−９】図７（フレーム９）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−１０】図７（フレーム１０）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−１１】図７（フレーム１１）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図８−１】図８（フレーム１）は、本発明に従って使用され得る亜鉛キレートモチーフの例を表示する。
【図８−２】図８（フレーム２）は、本発明に従って使用され得る亜鉛キレートモチーフの例を表示する。
【図９】図９は、化合物１９のリガンドドッキングの分子モデリング研究である。
【図１０】図１０は、化合物１９とその結合部位との相互作用の過程で起こると考えられるプロトン移動を図示する。
【図１１】図１１は、化合物４２のリガンドドッキングの分子モデリング研究である。
【図１２】図１２は、ＰＣ−３アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞における、ヒストンＨ−４過アセチル化およびｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１発現に対する、化合物４２、ＳＡＨＡ、およびＴＳＡの影響を示す。
【図１３】図１３は、ＰＣ−３細胞におけるＡｋｔの活性化状態に対する、化合物４２、ＳＡＨＡ、およびＴＳＡの影響を示す。
【図１４】図１４は、いくつかのリン酸化酵素に対する化合物４２の影響を示す。
【図１５】図１５は、定着したＰＣ−３異種移植片腫瘍の増殖に対する、経口投与した化合物４２の影響を示す。
【図１６】図１６は、胸腺欠損マウスにおける皮下ＰＣ−３異種移植片腫瘍の増殖に対する、化合物４２、化合物４４、およびＳＡＨＡの影響を示す。
【図１７】図１７は、化合物４２、ＳＡＨＡ、またはコントロールで処理した２つの代表的なＰＣ−３腫瘍ホモジネートの、ヒストンＨ３並びにアセチル化Ｈ３のウエスタンブロットを示す。
【図１８】図１８は、代表的な乳癌細胞株、肺癌細胞株および甲状腺癌細胞株に対する、化合物４２の用量依存的な抗増殖効果を示す。
【図１９】図１９は、初代ＣＬＬ細胞に対する、化合物４２の影響を示す。
【図２０】図２０は、化合物４２の化学合成スキームを図示する。
【図２１】図２１は、本発明に従う化合物に関する一般的な化学合成スキームを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の実施形態の説明）
一般に、短鎖脂肪酸は、アシル鎖の構造に係わらず、ｍＭ範囲でＨＤＡＣ阻害および抗増殖活性を示す（Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ９：３−１６（２００２）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １：２８７−２９９（２００２）；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １２：２９４−３００（２００１））。本発明はとりわけ、これらの脂肪酸が、酵素ポケット入口に位置する表面残基および／またはこの管状ポケット内の疎水性部分との非特異的な疎水性相互作用を介して、ＨＤＡＣ阻害を発揮するという発見に基づく。本発明者らは、疎水性スペーサーを介してＺｎ２＋キレート部分を係留することによって、これら短鎖脂肪酸のＨＤＡＣ阻害効力を増大させた。
【００２４】
ヒストン脱アセチル化酵素の酵素活性の測定は、公知の方法論を用いて達成され得る。例えば、Ｙｏｓｈｉｄａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７１７４−１７１７９（１９９０））は、トリコスタチンＡで処理した細胞においてアセチル化ヒストンを検出することによる、ヒストン脱アセチル化酵素の酵素活性の評価を記載している。同様に、Ｔａｕｎｔｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：４０８−４１１（１９９６））は、内在性ＨＤＡＣ−１および組換えＨＤＡＣ−１を使用してヒストン脱アセチル化酵素の酵素活性を測定する方法を記載している。Ｙｏｓｈｉｄａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７１７４−１７１７９，１９９０）およびＴａｕｎｔｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：４０８−４１１，１９９６）はいずれも、本明細書中に参考として援用される。
【００２５】
この開示を通じて、本発明に従う化合物に対する参照がなされる。この明細書および特許請求の範囲においてそのような化合物に対する参照は、その化合物のエステルおよび塩を包含する。従って、たとえ明確に列挙されていなくても、その化合物自体への参照によって、そのようなエステルおよび塩は企図および包含される。
【００２６】
本発明に従って使用され得る脂肪酸は、ヒドロカルビル部分およびカルボン酸部分を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ヒドロカルビル」は、「脂肪族」、「環式脂肪族」、および「芳香族」が含まれると理解される。このヒドロカルビル基には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、およびアルカリル基が含まれると理解される。さらに、「ヒドロカルビル」には、非置換ヒドロカルビル基と置換ヒドロカルビル基とのいずれもが含まれると理解され、後者は炭素および水素以外の付加置換基を有する炭化水素部分を指す。さらに、「カルボン酸」はこの化合物を指すために使用されるが、そのような酸の塩（例えば、カルボン酸塩など）も明確に企図される。さらに、本明細書中においてカルボン酸とカルボン酸塩は交換可能なものとして使用され得る。
【００２７】
脂肪酸には、特に、約３個〜約１４個の炭素の長さの非分枝脂肪酸の長さに匹敵する長さの分子鎖を有するものが含まれるが、これらに限定されない。従って、この分子鎖は、例えば約３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個の炭素の長さであり得る。この鎖は、最大で、例えば約１４個、１３個、１２個、１１個、９個、８個、７個、６個、５個または４個の炭素の長さであり得る。この脂肪酸は直鎖であっても分枝であってもよく、単結合、二重結合および／または三重結合を含み得る。脂肪酸の非限定的な例としては、バルプロエート、ブチレート、フェニルアセテートおよびフェニルブチレートが含まれる。
【００２８】
本発明に従って企図されるＺｎ２＋キレートモチーフとしては、ヒドロキサム酸およびο−フェニレンジアミンが挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、トリフルオロメチルケトン、α−ケトアミド、α−ケトチアゾール、２−ケト１−メチル−１Ｈ−イミダゾール、α−ケト１Ｈ−テトラゾール、α−ケト１Ｈ−イミダゾール、５−ケト１メチル−１Ｈ−イミダゾール、α−ケトオキサゾール、α−ケト４，５−シヒドロ−オキサゾール、α−ケトベンゾオキサゾール、α−ケトオキサゾール［４，５−ｂ］ピリジンおよびα−ケトピリジンが含まれる。これらのモチーフの構造は、図８に示される。
【００２９】
スペーサーは任意のヒドロカルビルスペーサーであり得るが、好ましくは芳香族成分を含む。芳香族リンカーは、以下の利点を有していると考えられている：１）上記結合体の構造硬性を増大させる、および２）ポケットの管様疎水領域とのファンデルワールス接触を増大させて結合親和力を向上させる。リンカーの例としては、芳香族ω‐アミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。
【００３０】
このリンカーは、炭素数４から８の直鎖（例えば炭素数４、５、６、７、あるいは８の直鎖）と同じ長さを示す。従って、その長さは炭素数４〜７または４〜６の直鎖と同じであり得る。その長さは、結合ポケットの疎水領域の深さに基づき得る。本発明のリンカーの例としては、４−（アミノメチル）安息香酸、４−アミノ安息香酸、（４−アミノフェニル）酢酸、３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸、および３−（４−アミノフェニル）−アクリル酸が挙げられるが、これらに限定されない。とりわけ、４−（アミノメチル）安息香酸は、ＭＳ−２７−２７５（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：４５９２−４５９７（１９９９））のリンカーとして使用されている。
【００３１】
以下の化合物が具体的に企図される：
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；
２−プロピル−ペンタン酸｛４−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−メチル］−フェニル｝−アミド；
２−プロピル−ペンタン酸（４−ヒドロキシカルバモイル−メチル−フェニル）−アミド；
２−プロピル−ペンタン酸｛４−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−エチル］−フェニル｝−アミド；
２−プロピル−ペンタン酸［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−アミド；
２−プロピル−ペンタン酸｛４−［２−（２−アミノ−フェニルカルバモイル）−ビニル］−フェニル｝−アミド；
２−プロピル−ペンタン酸［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−ビニル）−フェニル］−アミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（ブチリルアミノ−メチル）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（４−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；
４−（ブチリルアミノ−メチル）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［（４−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；
４−ブチリルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（４−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−ブチルアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−３−（４−フェニルアセチルアミノ−フェニル）−プロピオンアミド；
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−４−フェニル−ブチルアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（３−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−フェニル−ブチルアミド；
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−３−フェニル−ブチルアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［（３−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；
４−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−メチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−クロロ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−ブロモ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；］
４−（４−ｔｅｒｔ−ブチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−フェニル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−メトキシル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−トリフルオロメチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−ニトロ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
ピリジン−２−カルボン酸（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニル）−アミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−メチル−２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；
４−（２，２−ジメチル−４−フェニル−ブチリルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［メチル−（４−フェニル−ブチリル）−アミノ］−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−メトキシ−２−フェニル−アセチルアミノ）−ベンズアミド；
４−ジフェニルアセチルアミノ−Ｎ−ヒドロキキシ−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（４−イソブチル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（５−フェニル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２，２−ジメチル−４−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（４−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−メチル−２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［２−（４−イソブチル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−（Ｓ）−フェニル−ブチルアミド；
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−（Ｒ）−フェニル−ブチルアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［３−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；および
Ｎ−ヒドロキシ−４−［３−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド。
【００３２】
本発明の化合物は、ラセミ化合物あるいはラセミ混合物である場合がある。本明細書中で使用される場合、用語「ラセミ」は、本発明の化合物の（Ｒ）鏡像異性体と（Ｓ）鏡像異性体との混合物、あるいは立体異性体混合物を意味し、ここで鏡像異性体もしくは立体異性体はいずれも、実質的に他方から精製されていない。
【００３３】
本発明の（Ｒ）立体異性体または（Ｓ）立体異性体を記述するために本明細書中で使用される「富化」という語は、（Ｓ）立体異性体よりも（Ｒ）立体異性体の量が多いか、またはその逆の組成物を指す。例えば、この組成物は、化合物４２の全重量に対して、５０重量％、５５重量％、あるいは６０重量％以上の化合物４２の（Ｓ）立体異性体を含有し得る。一実施例において、富化された（Ｓ）化合物４２の量はより多いいものであり得、例えば、化合物４２の全重量に対し、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８１重量％、８２重量％、８３重量％、８４重量％、８５重量％、８６重量％、８７重量％、８８重量％、８９重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、９９重量％以上、もしくはこれらの任意の分数量（例えば９０．１重量％、９０．２重量％等）の（Ｓ）‐化合物４２であり得る。特定の実施例において、富化された（Ｓ）化合物４２の量は、化合物４２の全重量に対し、９９重量％、９９．１重量％、９９．２重量％、９９．３重量％、９９．４重量％、９９．５重量％、９９．６重量％、９９．７重量％、９９．８重量％、９９．９重量％よりも多いものであってもよいし、１００重量％であってもよい。これらの用語はまた、（Ｓ）化合物４２の薬学的に受容可能な任意の塩の量を定義する。これらは非限定的な例であり、本発明の他のラセミ化合物に対しても、同じ富化が達成され得る。
【００３４】
本発明の鏡像異性体富化した組成物を投与することにより、所望の治療効果が得られる。即ち、鏡像異性体富化した組成物は、低い合計濃度で治療効果をもたらし得るか、または所望されな鏡像異性体の存在に起因する副作用を軽減し得る。これらの利点は特に企図される。
【００３５】
本発明の方法にて用いられる任意の本発明の化合物は、経口的に、非経口的に（ＩＶ、ＩＭ、デポーＩＭＳ、ＳＱ、およびデポーＳＱ）、舌下に、経鼻的に（吸入）、髄腔内に、局所的に、あるいは直腸的に投与され得る。当業者に公知の投与形態は、本発明の方法において用いられる本発明の化合物の送達に適している。
【００３６】
治療的有効量の、本発明の方法において用いられる本発明の化合物を含有する組成物が提供される。この化合物は、錠剤、カプセル、あるいはエリキシル等経口投与に適切な薬学的調製物に、あるいは非経口投与のための滅菌溶液もしくは滅菌懸濁液に処方することができる。本明細書中に記載される化合物は、当該分野で周知の技術および手順を用いて薬学的組成物に処方することができる。
【００３７】
約０．１ｍｇから１０００ｍｇの、本発明の方法において用いられる本発明の化合物あるいは発明の化合物の混合物、あるいは生理学的に受容可能な塩もしくはエステルは、認可された製薬業務に必要な単位投与量形態内で、生理学的に許容できるビヒクル、キャリア、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、香味料等と混合される。これらの組成物あるいは調製物中の活性物質量は、記載した単位の適切な投与量が得られる量である。この組成物は単位投薬形態に処方され得、各投与形態物は、約１〜約５００ｍｇ、または約１０〜約１００ｍｇの活性成分を含有する。「単位用量形態」という語は、ヒト被験体および他の哺乳類のための単位投与物として適切な、物理的に別々の単位を指し、各単位物は、適切な賦形剤と共に、所望する治療効果が生じるよう計算された、前決定された量の活性物質を含有する。
【００３８】
組成物を調製するため、本発明の方法で用いられる１つ以上の発明の化合物は、適切な薬学的に受容可能なキャリアと混合される。この化合物を混合あるいは添加すると、溶液、懸濁液、乳液などが生じ得る。薬学的に適切なキャリアとして、リポソーム懸濁液もまた、使用され得る。これらは、当業者に周知の方法に従って調製され得る。得られる混合物の形態は、多数の因子に依存し、この因子としては、意図する投与様式および選択したキャリアまたはビヒクルにおけるこの化合物の溶解性が挙げられる。有効濃度は、処置される疾患、障害または状態の１つ以上の症状が軽減または改善されるのに十分であり、経験的に決定され得る。
【００３９】
本明細書中で提供される化合物の投与に適した薬学的キャリアまたは薬学的ビヒクルとしては、特定の投与様式に適する任意のキャリアが含まれる。さらに、活性物質もまた、所望の活性を損なわない他の活性物質と、または所望の活性を補う他の活性物質と、または他の活性を有する活性物質と、混合され得る。この化合物は、組成物内で唯一の薬学的活性成分として処方されてもよいし、他の活性成分と組み合わせられてもよい。
【００４０】
この化合物が不十分な溶解性を示す場合、可溶化のための方法が使用され得る。そのような方法は公知であり、これとしてはジメチルスルホキシド（ＤＮＳＯ）のような共溶媒の使用、ＴＷＥＥＮのような界面活性剤の使用、および炭酸水素ナトリウム水溶液への溶解が含まれるが、これらに限定されない。有効な薬学的組成物の処方において、塩またはプロドラッグのような、この化合物の誘導体もまた使用され得る。
【００４１】
化合物の濃度は、化合物投与の対象である障害の少なくとも１つの症状を軽減または改善する投与量の送達に有効なものである。代表的には、この組成物は、単回用量投与のために処方される。
【００４２】
本発明の方法において用いられる本発明の化合物は、徐放性処方物またはコーティングのような、体内からの急速な排出に対して化合物を保護するキャリアと一緒に、調製され得る。そのようなキャリアとしては、マイクロカプセル化された送達系などの徐放性処方物が挙げられるが、これに限定されない。この活性化合物は、治療を受ける患者に有害な副作用を与えずに、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で、薬学的に受容可能なキャリア中に含有され得る。治療的に有効な濃度は、処置される疾患に対するインビトロモデル系およびインビボモデル系において、公知の化合物を試験することによって、経験的に決定され得る。
【００４３】
本発明の化合物および組成物は、複数回投与容器あるいは１回投与容器内に収められ得る。この封入された化合物および組成物は、例えば、使用のために組み立てられ得る成分部分を含有するキットにおいて、提供され得る。例えば、凍結乾燥形態の発明の化合物と適切な稀釈剤とが、使用前に混合するために別々の成分部分として提供され得る。キットは、本発明の化合物と、共投与のための第二の治療剤とを包含し得る。本発明の化合物および第二の治療剤は、別々の成分部分として提供され得る。キットは複数の容器を備え得、各容器は、本発明の方法において用いられる本発明の化合物の１単位用量以上を含む。この容器は所望の投与様式に適合され得、これとしては、経口投与のための錠剤、ゲルカプセル、徐放性カプセルなど；非経口投与のためのデポー製品、充填済み注射器、アンプル、バイアルなど；局所投与のためのパッチ、医療用パッド、クリームなど、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
薬物組成物中の本発明の活性化合物の濃度は、その活性化合物の吸収性、不活性化性および排出速度、投与スケジュール、投与量、ならびに当業者に公知の他の要因に依存する。
【００４５】
この活性成分は、一度に投与されてもよいし、時間間隔ごとに投与される、より小さないくつかの投与量に分割されてもよい。正確な用量および処置期間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコルを用いて、あるいはインビボもしくはインビトロの試験データから外挿することによって、経験的に決定され得る。また、濃度および投与値は、緩和されるべき状態の重篤度によって変動し得ることに、注意するべきである。任意の特定の患者に関して、特定の投薬レジメンは、その患者の必要性および、この組成物を投与するかまたは組成物の投与を監督する者である専門家による判断に従って、時間経過と共に調整するべきであること、そして、この明細で記載される濃度の範囲は例示というだけであって、特許請求される組成物の範囲または実施の制限を意図したものでないことが、さらに理解されるべきである。
【００４６】
経口投与が所望される場合、胃の酸性環境から化合物を保護する組成で、この化合物は提供され得る。例えば、この組成物は、胃の中でその保全性を維持し、そして腸内でこの活性化合物を放出する腸溶コーティング内に処方され得る。この組成物はまた、制酸薬あるいは他の同様の成分と組み合わせて処方され得る。
【００４７】
経口組成物は、一般に、不活性の希釈剤あるいは食用のキャリアが含み、そして圧縮されて錠剤となるか、またはゼラチンカプセル内に封入され得る。経口治療投与の目的のために、その活性化合物を賦形剤と混合し、錠剤、カプセル、あるいはトローチの形態にて使用され得る。この組成物の一部として、薬学的に適合性の結合剤および補助物質が含有され得る。
【００４８】
この錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、任意の以下の成分あるいは同様の性質の化合物を含有し得る：結合剤（例えば、トラガカントゴム、アカシアゴム、トウモロコシ澱粉またはゼラチンが挙げられるが、これらに限定されない）；賦形剤（例えば、ミクロクリスタリンセルロース、澱粉、あるいは乳糖）；崩壊剤（例えば、アルギン酸およびトウモロコシ澱粉が挙げられるが、これらに限定されない）；潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）（例えば、ステアリン酸マグネシウムが挙げられるが、これに限定されない）；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、二酸化ケイ素コロイドが挙げられるが、これに限定されない）；甘味料（例えば、ショ糖またはサッカリン）；香味料（例えば、ペパーミント、サルチル酸メチルまたはフルーツ香料）。
【００４９】
投与単位形態がカプセルである場合、これは上記の種類の物質に加えて脂肪油などの液体キャリアを含有し得る。さらに、投与単位形態は、例えば糖衣あるいは他の腸溶剤のような、この投与単位形態の物理的形態を改変する様々な他の物質を含有し得る。この化合物はまた、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤、チューイングガムなどの成分として投与され得る。シロップは、この活性成分に加えて、甘味料、およびある種の保存料としてショ糖、色素および着色剤、ならびに香味料を含有し得る。
【００５０】
この活性物質はまた、所望の作用を損なわない他の活性物質と、あるいは所望の作用を補う物質と、混合され得る。本発明の化合物は、例えば抗がん剤、ホルモン、ステロイド、またはレチノイドと併用して使用され得る。抗がん剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン剤、抗生剤、コルヒチン、ビンカアルカロイド、Ｌ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、ニトロソウレア類、あるいはイミダゾールカルボキサミドのような多数の化学治療剤のうちの１つであり得る。適切な薬剤としては、チューブリンの脱分極を促進する薬剤が挙げられる。例としては、コルヒチンならびにビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチンおよびビンクリスチン）が挙げられる。
【００５１】
経口、皮内、皮下、あるいは局所投与に使用する溶液または懸濁液は、以下の任意の成分を含有し得る：滅菌希釈剤（注射用水、生理食塩水、固定油、例えばゴマ油、ココナッツ油、ピーナッツ油、綿果油などのような天然植物油、あるいはオレイン酸エチルなどの合成脂質性ビヒクル、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールおよびメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸および重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝液（例えば、酢酸、クエン酸、およびリン酸）；浸透圧を調整するための薬剤（例えば、塩化ナトリウムおよびデキストロース）。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、あるいはガラス、プラスチック、もしくは他の適切な物質からできた複数回投与用バイアル内に、封入することができる。必要に応じて、緩衝液、保存剤、抗酸化剤などが組み入れられ得る。
【００５２】
静脈経由で投与する場合、適切なキャリアとしては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤および溶解剤を含有する溶液（例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびこれらの混合物）が挙げられるが、これらに限定されない。組織標的リポソームを含むリポソーム懸濁液もまた、薬学的に受容可能なキャリアであり得る。これらは、当該分野で公知な方法に従って調製され得る。
【００５３】
本発明の化合物は、時間放出処方あるいはコーティングのような、体外への急速な排出から化合物を保護するキャリアと共に調製され得る。そのようなキャリアとしては、インプラントおよびマイクロカプセル送達系、ならびに生分解性生体適合ポリマー（例えば、コラーゲン、エチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸など）のような徐放性組成物が挙げられるが、これらに限定されない。そのような組成物を調製するための方法は、当業者に公知である。
【００５４】
本発明の方法において用いられる化合物は、経腸的にあるいは非経口的に投与され得る。経口的に投与される場合、本発明の方法で用いられる化合物は、当業者に周知の、経口投与のための通常の投薬形態で投与され得る。これらの投薬形態としては、錠剤並びにカプセルの通常の固形単位用量形態、ならびに溶液、懸濁液、およびエリキシルなどの液体投与形態が挙げられる。固形投与形態を使用する場合、その形態は徐放性型であり得、その結果、本発明の方法で用いられる化合物は１日１、２回の投与のみが必要とされる。
【００５５】
経口投与形態は、１日１回、２回、３回、または４回患者に投与され得る。本発明の方法で用いられる本発明の化合物は、１日３回以下、もしくは１日１回あるいは２回のみ投与され得る。つまり、本発明の方法で用いられる本発明の化合物は、経口投与形態にて投与される。どのような経口投与形態を用いる場合でも、本発明の方法で用いられる化合物を胃の酸性環境から保護するように、これらは設計され得る。腸溶性コーティング錠剤が、当業者に周知である。さらに、酸性である胃から保護するよう一つ一つがコーティングされた小球体が充填されたカプセルもまた、当業者に周知である。
【００５６】
本発明の方法で用いられる本発明の化合物はまた、ナノ結晶分散処方物にて、有利に送達され得る。そのような処方物の調製は、例えば米国特許第５，１４５，６８４号に記載されており、その全内容が、参考として援用される。ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤のナノ結晶分散物およびその使用法は、米国特許第６，０４５，８２９号に記載されており、その全内容が、参考として援用される。ナノ結晶処方物は、代表的には薬物化合物の生物学的有用性を増大させる。
【００５７】
本発明の化合物および方法は、動物において腫瘍性細胞の増殖を抑制するために使用され得る。この方法は、体内に１つ以上の腫瘍性細胞を有する動物に、治療的有効量の１種以上の本発明の化合物を、上記のような組成物にて投与する工程を包含する。この動物は哺乳類（家畜を含む）であり得る。この動物はヒトであり得る。
【００５８】
用語「腫瘍性細胞」は、異常な細胞増殖を示す細胞を指すために使用される。腫瘍性細胞の異常な増殖には、細胞増殖の増大が含まれる。例えば、腫瘍性細胞は、過増殖性細胞、またはインビトロにて増殖の接触抑制の欠如を示す細胞、インビボで転移することのできない良性腫瘍細胞、インビボで転移することができかつ除去の試み後に再発し得る癌細胞であり得る。用語「腫瘍形成」は、腫瘍性増殖の発症へと導く細胞増殖の誘導を示すために使用される。
【００５９】
用語「治療的有効量」および「治療的有効期間」は、腫瘍性細胞増殖の軽減に有効な投与量で腫瘍性細胞増殖の軽減に有効な期間に渡る処置を示すために使用される。上記のように、そのような投与は、非経口的、経口的、舌下的、経皮的、局所的、経鼻的、あるいは直腸内的であり得る。全身投与する場合、本発明の化合物の血中濃度が約０．１μＭ〜約１００ｍＭを達成するのに十分な投与量で、その治療的組成物は投与され得る。局所的な投与については、これよりもはるかに少量が有効であり得、またはるかに高い濃度が許容される場合がある。当業者は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の有効濃度の低下をもたらすそのような治療効果は、本発明に従って処置される組織、器官、あるいは特定の動物もしくは患者によって著しく変動し得ることを認識する。また、患者がある投与量で開始しても、その患者の状態が変化するため、投与量は経時的に変化し得ることもまた、理解される。
【００６０】
本発明は、動物の細胞増殖性疾患あるいは状態を治療するための組成物並びに方法を提供し、この方法は、そのような処置を必要とする動物に治療的有効量の、本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を投与する工程を包含する。記述したように、この動物は哺乳動物（家畜を含む）であり得る。この動物はヒトであり得る。
【００６１】
用語「細胞増殖性疾患または細胞増殖性状態」は、異常な細胞増殖（好ましくは、異常に増大した細胞増殖）によって特徴づけられる任意の状態を指すことが意味される。そのような細胞増殖性疾患または状態の例としては、癌、再狭窄および乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施例において、本発明は、動物内の腫瘍性細胞増殖を阻害するための方法を提供し、この方法は、体内に１つ以上の腫瘍性細胞を有する動物に、治療的有効量の本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を投与する工程を包含する。本発明に従って治療することのできる癌としては、前立腺癌、肺癌、急性白血病、多発性硬化症、膀胱癌腫、腎臓癌腫、乳癌腫、結腸直腸癌腫、神経芽腫、あるいは黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明の化合物のいくつかは、原生動物由来のヒストン脱アセチル化酵素に対する阻害活性を有する。従って、本発明はまた、原生動物性疾患または原生動物性感染を処置もしくは予防するための方法を提供し、この方法は、そのような処置を必要とする動物に、治療的有効量の本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を投与する工程を包含する。ここでも、動物は哺乳動物であり得、そしてヒトであり得る。いくつかの実施形態において、このヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、哺乳動物ヒストン脱アセチル化酵素、特にヒトヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を阻害するよりも高い程度で、原生動物ヒストン脱アセチル化酵素を阻害する。
【００６３】
本発明はさらに、真菌性疾患または真菌性感染を処置するための方法を提供し、この方法は、そのような処置を必要とする動物に治療的有効量の本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を投与する工程を包含する。この動物は、ヒトを含む哺乳動物であり得る。本発明のこの実施形態に従って使用されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、哺乳類ヒストン脱アセチル化酵素、特にヒトヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を阻害するよりも高い程度で、真菌のヒストン脱アセチル化酵素を阻害し得る。
【００６４】
当業者である投与を行う医療従事者に周知なように、正確な投与量および投与の頻度が、本発明の方法で用いられる投与される特定の化合物、処置される患者の具体的な状態、処置される状態の重篤度、特定の患者の年齢、体重、全身の身体状態、およびその患者が受けている可能性のある他の医薬に依存することは、当業者には明白であるはずである。
【実施例】
【００６５】
（実験）
化学試薬および有機溶媒は、他に記載のない限り、Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ ＮＭＲ）は、Ｂｒｕｋｅｒ ２５０ ＭＨｚで測定した。化学シフト（δ）は、ＴＭＳピークに対する１００万分の１（ｐｐｍ）で記載する。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析は、３−Ｔｅｓｌａ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＦＴＭＳ−２０００ フーリエ変換質量分析器で実行した。元素分析値は、計算値の±０．４％以内であった。
【００６６】
シリカゲル（２３０−４００メッシュ）を用いて、フラッシュカラムクロマトグラフィーを行った。ωアミノ酸メチルエステルを、メタノール／ＴＭＳＣｌを使用して市販の酸から調製し、（２−アミノ−フェニル）カルバミン酸ベンジルエステルを、標準的な手順に従ってο−フェニレンジアミンおよびギ酸ベンジルクロリドから合成した。ウサギ抗アセチルヒストンＨ３ポリクローナル抗体およびウサギ抗アセチルヒストンＨ４ポリクローナル抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，
ＮＹ）から購入し、ウサギ抗ｐ２１抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。マウス抗アクチンモノクローナル抗体は、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）製であった。ＨＲＰ結合対化ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧは、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。
【００６７】
化合物１〜８および１１〜２２は、以下に記載する方法（図６、スキーム１Ａ）に従って合成し、化合物９および１０は、３−［４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−フェニル］−アクリル酸から、それぞれ方法ｆおよび方法ｇ（図６、スキーム１Ｂ）によって調製した。これらは表題化合物の下に別々に記載している。
【００６８】
方法ａ 塩酸［１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）カップリング］
個々の短鎖脂肪酸の無水ＴＨＦ（５〜１０ ｍｍｏｌ／ｍＬ）溶液に、Ｎ２下で、様々なωアミノ酸メチルエステル（１当量）を加え、続いてＥＤＣ（１．３当量）を加えた。一晩撹拌した後、減圧下でＴＨＦを除去し、残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解した。この混合物を、水（５０ｍＬ）で２回、さらに飽和食塩水（５０ｍＬ）で続けて洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮した。生じた残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【００６９】
方法ｂ（エステル開裂）
方法ａから得られたエステルを２Ｍ ＫＯＨ／ＭｅＯＨ溶液に溶解した。この混合物を８０℃で１時間撹拌して０℃まで冷却した。さらに２Ｎ ＨＣｌでｐＨ ３まで酸性化し、真空下で濃縮して、酢酸エチル（１００ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５０ｍＬ）を加えた。この有機相を分離して、それぞれ５０ｍＬの水および飽和食塩水で続けて洗浄した。さらにＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【００７０】
方法ｃ ［ｂｉｓ（２−オキソ−３−オキザゾリジニル）ホスホルジアミド（ＢＯＰ−Ｃｌ）カップリング］
方法ｂから得られる酸の無水ＴＨＦ（５〜１０ｍｍｏｌ／ｍＬ）溶液に、Ｎ２下で、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１当量）を加えた。この混合物を室温で１０分間撹拌し、ＢＯＰ−Ｃｌ（１．１当量）、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミン塩酸（１当量）、およびＴＥＡ（３当量）を加えた。室温で一晩撹拌した後、この溶液を真空下で濃縮し、酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え、次に３％ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）を加えた。この有機相を分離して、それぞれ５０ｍＬの水および飽和食塩水で続けて洗浄した。さらにＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【００７１】
方法ｄ（ＥＤＣカップリング）
方法ｂから得られる個々の酸の無水ＴＨＦ（５〜１０ｍｍｏｌ／ｍＬ）溶液に、Ｎ２下で、（２−アミノフェニル）カルバミン酸ベンジルエステル（１当量）を加え、次にＥＤＣ（１．３当量）を加えた。一晩撹拌した後、この混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチル（１００ｍＬ）を加えた。有機相を水（５０ｍＬ）で２回、次に飽和食塩水（５０ｍＬ）で続けて洗浄し、さらにＮａ２ＳＯ４上で乾燥して濃縮した。得られた残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【００７２】
方法ｅ（水素化分解）
方法ｃまたは方法ｄから得られたＮ−ベンジルオキシもしくはＮ−Ｃｂｚ誘導体を、メタノール／ＴＨＦ（５〜１０ｍｍｏｌ／ｍＬ）１：１溶液に溶解し、木炭上１０％パラジウム（１０％ ｗ／ｗ）を加えた。この混合物を大気圧下で２時間、水素で処理し、ろ過した。溶媒をエバポレートし、残渣を酢酸エチルで再結晶化した。
【００７３】
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド（１）
【００７４】
【化１０−１】
【００７５】
【化１０−２】
Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド（２）
【００７６】
【化１０−３】
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド（３）
【００７７】
【化１０−４】
Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド（４）
【００７８】
【化１０−５】
２−プロピル−ペンタン酸｛４−［（２−アミノ−フェニルカルバモイル）−メチル］−フェニル｝−アミド（５）
【００７９】
【化１０−６】
２−プロピル−ペンタン酸（４−ヒドロキシフェニルカルバモイルメチル−フェニル）−アミド（６）
【００８０】
【化１０−７】
【００８１】
【化１０−８】
２−プロピル−ペンタン酸｛４−［２−（２−アミノ−フェニルカルバモイル）−エチル］−フェニル｝−アミド（７）
【００８２】
【化１０−９】
２−プロピル−ペンタン酸［４−（２−ヒドロキシフェニルカルバモイル）−エチル）−フェニル］−アミド（８）
【００８３】
【化１０−１０】
３−［４−（２−プロピル−ペンタノイル）−フェニル］−アクリル酸
化合物９および１０の前駆体であるこの化合物は、２−プロピル−ペンタン酸（０．７８ｍＬ、４．９ｍｍｏｌ）および３−（４−アミノ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル（０．８６ｇ、４．９ｍｍｏｌ）から、前述の方法ａおよび方法ｂに従って合成した。全収量、１．０５ｇ（２工程で７０％）；
【００８４】
【化１０−１１】
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−３−［４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−フェニル］−アクリルアミド（９）
３−［４−（２−プロピル−ペンタノイル）−フェニル］−アクリル酸（２００ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液に、Ｎ２下で、ベンゼン−１，２−ジアミン（４５０ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）を、次にＥＤＣ（１８０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を加えた。一晩撹拌した後、この混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、水（３０ｍＬ）で２回、そして飽和食塩水（３０ｍＬ）で続けて洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮した。この粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン、１：１）によって精製し、白色の固体として化合物９（２００ｍｇ、収量７６％）を得た。
【００８５】
【化１０−１２】
Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−フェニル］−アクリルアミド（１０）
３−［４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−フェニル］−アクリル酸（１００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、窒素下で、ＥＤＣ（７９ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）（６２ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１時間撹拌し、塩酸ヒドロキシルアミン（２７．４ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（５４μＬ）を加え、さらに１２時間撹拌し、真空下で濃縮した。さらに、酢酸エチル（４０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１５ｍＬ）を加えた。有機相を分離し、それぞれ２０ｍＬの水および飽和食塩水で続けて洗浄した。この有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮した。この粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー［酢酸エチル−ＭｅＯＨ（９：１）］によって精製し、白色固体の化合物１０（４５ｍｇ、収量４０％）を得た。
【００８６】
【化１０−１３】
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（ブチリルアミノ−メチル）−ベンズアミド（１１）
【００８７】
【化１０−１４】
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド（１２）
【００８８】
【化１０−１５】
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（４−フェニルブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド（１３）
【００８９】
【化１０−１６】
４−（ブチリルアミノ−メチル）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド（１４）
【００９０】
【化１０−１７】
Ｎ−ヒドロキシ−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド（１５）
【００９１】
【化１０−１８】
【００９２】
【化１０−１９】
Ｎ−ヒドロキシ−４−［（４−フェニルブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド（１６）
【００９３】
【化１０−２０】
４−ブチリルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド（１７）
【００９４】
【化１０−２１】
Ｎ−ヒドロキシ−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミド（１８）
【００９５】
【化１０−２２】
Ｎ−ヒドロキシ−４−（４−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド（１９）
【００９６】
【化１０−２３】
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−ブチルアミド（２０）
【００９７】
【化１０−２４】
【００９８】
【化１０−２５】
Ｎ−ヒドロキシ−３−（４−フェニルアセチルアミノ−フェニル）−プロピオンアミド（２１）
【００９９】
【化１０−２６】
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−４−フェニル−ブチルアミド（２２）
【０１００】
【化１０−２７】
さらに別の化合物２３〜６７を含む、全ての化合物の一覧を図６に示す。
【０１０１】
（インビトロＨＤＡＣアッセイ）
ヒストン脱アセチル化酵素アッセイキット（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）を使用して、製造者による使用説明書にわずかな改変を加えてこれに従い、ＨＤＡＣ活性を測定した。このアッセイは、ヒストン脱アセチル化酵素活性に富むＤＵ−１４５核抽出物が、ストレプトアビジンアガロースビーズに結合させたビオチン化［３Ｈ］−アセチルヒストンＨ４ペプチドの脱アセチル化を媒介する能力に基づく。上清への遊離した［３Ｈ］−アセテートの放出を測定し、ＨＤＡＣ活性を計算した。ナトリウムブチレート（０．２５〜１ｍＭ）を陽性コントロールとして使用した。
【０１０２】
（細胞生存率アッセイ）
各ウェル当たり４，０００個のＤＵ−１４５細胞を播種した９６ウェルの平底プレートにて、細胞生存率に対するＨＴＰＢの影響を、ＭＴＴ｛［３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−臭化テトラゾリウム］｝アッセイによって分析した。細胞を、５％ＣＯ２下３７℃で、記載した時間、１０％ ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地に記載した濃度にて溶解したＨＴＰＢに曝露した。この培地を取り除いて、ＲＰＭＩ−１６４０培地に溶解した０．５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ １５０μｌに置き換え、細胞を、３７℃で２時間、ＣＯ２インキュベーターにてインキュベートした。ウェルから上清を除去し、還元されたＭＴＴ色素を２００μｌ／ウェルのＤＭＳＯで可溶化した。プレートリーダーで、５７０ｎｍにて吸光度を測定した。各処理は６ウェルずつ繰り返した。
【０１０３】
（酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるアポトーシスの検出）
Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の使用説明書に従って使用して、アポトーシスの誘導を評価した。この試験は、アポトーシス性細胞死誘導後の、モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソーム形態の細胞質性ヒストン結合ＤＮＡフラグメントの定量的測定に基づいている。簡潔に述べると、実験の２４時間前に１×１０６のＤＵ−１４５細胞をＴ−７５フラスコ内で培養した。細胞を、１０％ ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地に、記載した濃度のＨＴＰＢで処理した。浮遊細胞および吸着細胞の双方を回収し、２×１０３個の細胞に相当する細胞溶解物をＥＬＩＳＡに使用した。
【０１０４】
（ウェエスタンブロット分析）
１０％ ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、記載した濃度のＨＴＰＢで２４時間処理したＤＵ−１４５細胞（１×１０６個）を回収し、超音波処理した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、この溶解物のタンパク質濃度を測定した；各溶解物由来の等量のタンパク質を１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに溶解し、次いで半乾式トランスファーセルにてイモビロン−ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上へ移した。０．１％のＴＷＥＥＮ２０含有トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）（ＴＢＳＴ）で、このトランスブロットした膜を２回洗浄した。５％ノンファットミルク含有ＴＢＳＴで４０分間ブロッキングした後、この膜をＴＢＳＴ−１％ノンファットミルクに溶解した一次抗体（１：１０００希釈）と共に４℃で一晩インキュベートした。一次抗体で処理した後、この膜を計１５分間、ＴＢＳＴで３回洗浄し、続いてヤギ抗ウサギ、もしくは抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（１：３０００稀釈）を室温で１時間処理し、さらにＴＢＳＴで３回、計１時間洗浄した。この免疫ブロットを高感度化学発光によって可視化した。
【０１０５】
（結果）
第一のシリーズの化合物に関して、本発明者らは、スキーム１（Ａ、化合物１〜８；Ｂ、化合物９および１０）にて記載した手順に従って、Ｚｎ２＋係留結合体（図１）を合成する先導化合物としてバルプロ酸を用いた。化合物１〜８に関して、ＥＤＣ活性化を介して、バルプロ酸を４つの異なるωアミノ酸メチルエステルスペーサーと結合させた。得られたエステルを、アルカリ加水分解により酸に分解した。代表的なペプチドカップリング条件（ＢＯＰＣｌまたはＥＤＣ）の下で、得られた酸を、Ｂｎ保護ヒドロキシアミンおよびＣｂｚ保護ο‐フェニレンジアミンで処理し、水素化分解後に、それぞれアニリドおよびヒドロキサム酸を形成した（スキーム１Ａ）。化合物９および１０は、３−［４−（２−プロピル−ペンタノイル）−フェニル］−アクリル酸を、それぞれο‐フェニレンジアミンおよびヒドロキシルアミンと、代表的なＥＤＣカップリング条件下で直接カップリングさせることによって合成した（スキーム１Ｂ）。
【０１０６】
（Ｚｎ２＋キレートモチーフ係留バルプロエート誘導）
バルプロ酸を５種類の芳香族リンカーと、続いて２つのＺｎ２＋結合モチーフと様々に結合体化することによって、化合物１〜１０を得た。これらの係留結合体は、様々な程度のＨＤＡＣ阻害効力を示し（図２）、そのＩＣ５０値は５μＭ（化合物８）から８０μＭ（化合物５）の範囲にわたった。この抑効力は、親分子（ＩＣ５０、０．４ｍＭ）の８倍から５倍改善された。これらの結合体のうちのいずれかからバルプロイル部分もしくはＺｎ２＋キレートモチーフを除去すると、ＨＤＡＣ阻害活性は完全に失われ（データは示していない）、このことはタンパク質‐リガンド相互作用において、アシル基およびＺｎ２＋キレートモチーフが重要であることを示している。
【０１０７】
試験した１０個の係留結合体の中で、化合物１、２、４および８は最適な誘導体（ＩＣ５０、５〜８μＭ）であり、３、９、および１０がこれに次ぐ（ＩＣ５０、１０〜２０μＭ）。相対的に、ヒドロキサマト（化合物２、４、６、８および１０）は、一般に、対応するフェニレンジアミン（化合物１、３、５、７および９）よりも作用効力が強かった。さらに、芳香族リンカーは、ＨＤＡＣ阻害活性に対して微小な影響を示した。試験した５つの芳香族ωアミノ酸の中で、（４−アミノフェニル）アセテートは、ＨＤＡＣ阻害効力が最も弱い結合体（５および６）となったが、４−（アミノメチル）ベンゾエートは最適であるようであった。さらなる構造的改変については、化合物１、２、４および８が、全てＩＣ５０＜１０μＭを示したので、これらを先導化合物として使用した。
【０１０８】
（構造的改変）
バルプロイル基を除去すると、この結合体の阻害活性が完全に失われるという発見によって、活性部位ポケットと相互作用する際のアシル部分の重要性が強調された。従って、本発明者らは、化合物１、２、４および８のバルプロイル基を、ブチリル基、フェニルアセチル基またはフェニルブチリル基に置換して、ＨＤＡＣ阻害に対する立体電子効果を増大させた（図３）。これら全ての誘導体は、バルプロイル対応物と比較して、向上したＨＤＡＣ阻害作用効力を示した。試験した様々なアシル官能基の中で、同一のスペーサーおよびＺｎ２＋キレートモチーフと結合させた場合、相対的効力は、フェニルブチリル基＞フェニルアセチル基＞ブチリル基＞バルプロイル基の順であった。
【０１０９】
これらの１２個の誘導体の中で、化合物１９は特に注目すべきものであった。このヒドロキサマト係留フェニルブチレート（ＨＴＰＢ）（すなわち、化合物１９）は、４４ｎＭというＩＣ５０を示し、これはフェニルブチレートに対して強度４倍の向上である。この化合物を使用して、ＤＵ−１４５前立腺癌細胞におけるＨＤＡＣ活性に対する影響を調べた。
【０１１０】
（ＤＵ−１４５前立腺癌細胞におけるヒストンアセチル化およびｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１発現に対するＨＴＰＢの影響）
ヒストンの過アセチル化（ｈｙｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）およびサイクリン依存性リン酸化酵素阻害因子であるｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１の発現増加は、細胞内ＨＤＡＣ阻害に関する二つの特性である（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １：１９４−２０２（２００１））。従って、本発明者らは、ヒストンアセチル化およびｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１発現の状態の特性を明らかにすることによって、ＤＵ−１４５前立腺癌細胞におけるＨＤＡＣ活性に対するＨＴＰＢの影響を、ＴＳＡおよびフェニルブチレートと比較して試験した。
【０１１１】
ＤＵ−１４５細胞を、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ １６４０培地中で２４時間、０．５、１、２．５μＭのＨＴＰＢ、０．２５および０．５μＭのＴＳＡ、または１、２．５、および５ｍＭのフェニルブチレートに曝露した。細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、これらの薬剤の処理によってアセチル化ヒストンＨ３およびＨ４、ならびにｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１のレベルが上昇したことを示している（図４）。これらのバイオマーカーに対する１μＭ ＨＴＰＢの影響は、０．２５μＭ ＴＳＡ、もしくは２．５ｍＭフェニルブチレートの影響に近かった。ＤＵ−１４５細胞は、少量だが有意な量の内在性ｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１を示し、そのレベルは、０．５μＭという低濃度のＨＴＰＢへ曝露した後に、実質的に増加した。まとめると、これらのデータによって、ＨＴＰＢはＤＵ−１４５細胞にてＨＤＡＣ活性を標的としていることを確認した。
【０１１２】
（ＤＵ−１４５細胞の生存率に対するＨＴＰＢの影響）
１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ １６４０培地中のＤＵ−１４５細胞において、癌細胞生存率に対するＨＴＰＢの影響を調べた。これらの細胞は、ＨＴＰＢに対して高度の感受性を示し、増殖阻害におけるＩＣ５０は、約０．５μＭと１μＭの間であった（図５Ａ）。ＤＮＡフラグメント化によって証明されたように、ＨＴＰＢは用量依存的様式でＤＵ−１４５細胞のアポトーシスに対する感受性を増加させた（図５Ｂ）。示したように、薬物の濃度が１μＭを超えたときに、２４時間にて広範囲のアポトーシスが発生し、これは少なくとも部分的には、この細胞毒性効果がＨＤＡＣ阻害によってアポトーシスが誘導されたことに起因することを示している。試験した他の細胞株としては、ＡＮ３ＣＡ子宮内膜癌細胞、ならびにＳＷ−４８およびＨＣＴ−１５結腸直腸癌細胞が挙げられる。これらの癌細胞もまた、同程度の効力でＨＴＰＢの細胞毒性効果に対して感受性であった（データは示さず）。
【０１１３】
（考察）
本明細書中で、本発明者らは、新しい種類のＨＤＡＣ阻害剤の開発を示し、この阻害剤において、短鎖脂肪酸が疎水性結合を介してＺｎ２＋キレートモチーフに係留された。ＴＳＡおよびＳＡＨＡによるＨＤＡＣ阻害の独特な様式により提供された作用モデルについて、これらの化合物を開発する際の本発明者らのストラテジーが立てられた（Ｆｉｎｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０１：１８８−１９３（１９９９））。本発明者らの新しい係留ストラテジーからＨＴＰＢ（すなわち化合物１９）の発見が導かれ、これはＳＡＨＡについて報告された濃度（Ｒｉｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：３００３−３００７（１９９８））に一致する準μＭ濃度で、ＨＤＡＣ阻害活性および抗増殖活性を示す。
【０１１４】
本発明者らは、いくつかの癌細胞株において、ＨＴＰＢがＨＤＡＣ活性を標的とする２つの系列の証拠を得た。具体的には、ＤＵ−１４５前立腺癌細胞を、０．５μＭもの低濃度でＨＴＰＢ処理すると、用量依存的な様式でヒストンＨ３並びにＨ４の過アセチル化が引き起こされた。同様に、ＨＴＰＢに応答して、ｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１発現が実質的に上方制御された。対照的に、ヒストンアセチル化およびｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１発現に対する同様の細胞内効果を達成するのに、親分子であるフェニルブチレートは、少なくとも２．５ｍＭを必要とした。
【０１１５】
ＨＴＰＢは、構造的に既存のＨＤＡＣ阻害剤と区別され、その多くは、キャップ基が極性平面構造から構成されている。例えば、ＴＳＡ、ＳＡＨＡおよびＭＳ−２７５のキャップ基は、それぞれジメチルアミノフェニル基、フェニルアミノ基およびピリジン−３−イル−メトキシカルボニル基を含有する。従って、活性部位ポケットは、キャップ基に異なる立体電子特性を与える高度な柔軟性を示すと、本発明者らはさらに結論づけた。本発明者らのデータは、結合体の活性部位ポケットへの結合促進において、フェニルブチリル基およびフェニルアセチル基は脂肪族アシル部分より効果的であったことを示している。この矛盾は、部分的に、電子密度の違いおよび／または分岐した側鎖による立体化学的障害に起因すると推測される。芳香族リンカーに関しては、４−アミノ安息香酸が、フェニルブチリル基とヒドロキサマトとを係留するのに最適であるようであり、その長さはポケットの両端に接触するのに十分なものであった。
【０１１６】
（第二世代ＨＤＡＣ阻害剤の設計および合成−化合物１９の構造に基づく最適化）
化合物１９（ＨＴＰＢ）は、構造的に既存のＨＤＡＣ阻害剤とは区別され、多くは例えばＴＳＡ、ジメチルアミノフェニル；ＳＡＨＡ、フェニルアミノ；およびＭＳ−２７−２７５、ピリジン−３−イル−メトキシカルボニルのような、極性の平面構造から成るキャップ基を有する。この知見は、ＨＤＡＣ活性部位ポケットがキャップ基に異なる立体電子特性を与える、高度な柔軟性を示していることを示唆する。
【０１１７】
リガンド結合を予測するため、本発明者らは、化合物１９（図９、赤字）およびＴＳＡ（図９、黄字）の、ＨＤＬＰ活性部位ポケットへの分子ドッキングを行い、その後個々のリガンドの認識様式を比較するためにエネルギーを最小化した。図９に示したように、双方のリガンドともポケットへの結合は類似した配置をとっている。化合物１９の芳香族リンカーである４−アミノ安息香酸は、フェニルブチリル基とヒドロキサマトを係留するのに最適な長さを提供し、これによって双方の官能基はポケットの両端に接触することを可能にする。ヒドロキサム酸基［Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＯＨ］によって、化合物１９のＨＤＡＣ阻害効力はフェニルブチレートの４桁の大きさの増加に寄与するようである。
【０１１８】
図９のモデリングデータは、リガンド結合におけるヒドロキサマトの役割に２要素があることを示唆している。１つは、Ｚｎ２＋陽イオンをキレートする。２つ目は、ヒドロキサマトは、Ｈｉｓ１３１−Ａｓｐ１７３電荷リレー系の助けと共に、ＮＨ−ＯＨからＨｉｓ−１３１のＮτへのプロトン移動を促進する（図１０）。（ＴＳＡのリガンド結合研究については、Ｖａｎｏｍｍｅｓｌａｅｇｈｅ，Ｋ．，Ｖａｎ Ａｌｓｅｎｏｙ，Ｃ．，Ｄｅ Ｐｒｏｆｔ，Ｆ．，Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｔｏｕｒｗｅ，Ｄ．，ａｎｄ Ｇｅｅｒｌｉｎｇｓ，Ｐ．Ａｂ ｉｎｉｔｉｏ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ
ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ（ＴＳＡ） ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＤＬＰ）．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ，１：２９５１−２９５７，２００３を参照する。）
結論として、ヒドロキサマトＨＤＡＣ阻害剤である、ＴＳＡあるいは化合物１９のいずれかの結合によってＡｓｐからヒドロキサマトへの負電荷の転移が生じ、その結果、負荷電ヒドロキサマトとＺｎ２＋の正電荷およびイミダゾール環との間に塩架橋が形成される（図１０、中央パネル）。機構的に、この塩架橋は、ヒドロキサマトベースのリガンドと活性部位ポケットとの結合に寄与する主要な力となっており、フェニルブチレートから化合物１９への転換に伴う、ＨＤＡＣ阻害効力の１０４倍の増加に必要とされる微分自由エネルギー変化（ΔΔＧ‡＝５．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の根底となっている（ＩＣ５０、０．４ｍＭに対し４４ｎＭ）。
【０１１９】
結合親和力におけるこの塩架橋の役割は、化合物１９のヒドロキサマト部分をフェニレンジアミン基に置換した（化合物５５）ときにＨＤＡＣ阻害効果が１０倍低下する（すなわち、ＩＣ５０、０．０４４μＭに対して０．４μＭ）ことによって、さらに強調される。ヒドロキサマトとは対照的に、フェニレンジアミン基の活性部位への結合には、Ｈｉｓ１３１のＮτへのプロトン転移が関係しない。代わりに、Ｈｉｓ１３１との荷電‐荷電相互作用を形成することなく、電子に富むジアミンのみがＺｎ２＋陽イオンをキレートする。その結果、フェニレンジアミンベース（例えば、化合物５５）のリガンドとの結合親和性は、対応するヒドロキサマトと比較して著しく低下する。
【０１２０】
この分子ドッキングはまた、化合物１９の次なる改変のための有用な指針を提供した。図９に示したように、ＴＳＡおよび化合物１９のキャップ基は、Ｔｙｒ９１、Ｇｌｕ９２、Ｇｌｙ１４０、およびＰｈｅ１４１に囲まれた溝近くに位置する。本来この溝は、様々な程度のかさ高さを有するキャップ基を適合させる柔軟性を提供し、ＨＤＡＣ阻害効力を増大させるのに活用され得る。
【０１２１】
従って、本発明者らは、化合物１９のフェニルブチリル部分を、様々なα分岐芳香族脂肪族アシル基に置換した。その原理は、２つであった。第１に、フェニルブチリル基と化合物１９内のリンカーとの間のアミド結合が、タンパク質分解性消化に感受性であり得る。アシル基の嵩高さが増加することによって、アミド結合がより立体的に妨げられたものに変わることにより、代謝安定性が増大し得る。第２に、アシル基の大きさが増したことで、前記溝との疎水結合が増大し、これによって結合親和力が増し得る。
【０１２２】
このストラテジーから、化合物１９（すなわち、ＨＴＰＢ）よりも大きな作用効力を有する、多数のＨＤＡＣ阻害剤が導かれた。いくつかの代表的な誘導体の構造およびＩＣ５０を表１にまとめる。
【０１２３】
表１ 代表的なフェニルブチレートベースのＨＤＡＣ阻害剤
【０１２４】
【表１】
合成した８０を超える誘導体の中で、化合物４２がＴＳＡに匹敵するＩＣ５０を持つ最適な薬剤である。分子モデリング解析によって、化合物４２は、活性部位ポケット内側でＴＳＡの原子配置と並立する配置をとっていることが示されている（図１１を参照のこと）。さらに、イソプロピル部分が溝の内側にあり、隣接する疎水性残基と相互作用し得る。それゆえ、さらなるインビトロおよびインビボでの特徴付けのために、化合物４２を選択した。
【０１２５】
（化合物４２およびＴＳＡは、抗増殖効果を後成的かつ細胞レベルで媒介する−新規の細胞標的の同定）
ＰＣ−３アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞にて、ｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１発現およびヒストンＨ４過アセチル化に対する影響についての試験に、化合物４２、ＳＡＨＡ、およびＴＳＡを供した。図１２は、これらのバイオマーカーの誘導における化合物４２の効力がＴＳＡに匹敵し、ＳＡＨＡよりも約５倍高いことを示している。
【０１２６】
ＰＣ−３細胞（ＰＴＥＮ−／−）におけるＡｋｔ活性化状態に対するこれらの薬剤の影響もまた、試験した。Ａｋｔは、アンドロゲン非依存性およびこれらの細胞の化学治療耐性に寄与する機能性ＰＴＥＮが存在しないため、ＰＣ−３細胞にて構造的に活性化されている。ＰＣ−３細胞にて、化合物４２とＴＳＡのいずれもが、１μＭもの低濃度で著しいＡｋｔ脱リン酸化を引き起こしたことに注目すべきである（図１３）。対照的に、リン酸化Ａｋｔに対するＳＡＨＡの影響は認められなかった。これはＳＡＨＡと化合物４２／ＴＳＡとの間には、作用様式に僅かな差異があることを示唆している。
【０１２７】
ＰＣ−３細胞におけるリン酸化Ａｋｔに対する化合物４２の影響は、多くがＰＴＥＮ変異を示すホルモン不応性前立腺癌細胞におけるこのＨＤＡＣ阻害剤の臨床投与の点から注目に値する。しかし、この脱リン酸化効果はリン酸化酵素特異的なものである。試験した他の一連のシグナル伝達リン酸化酵素の中で、ＦＡＫ（局所接着リン酸化酵素）およびＥＲＫ類のリン酸化レベルは投与量依存的に減少したが、ｐ３８あるいはＪＮＫのリン酸化レベルは影響を受けないままであった（図１４）。
【０１２８】
本発明者らは、ＨＤＡＣアイソザイムと複合体を形成してその核への局在化を促進するプロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）により、この脱リン酸化が仲介されると仮説を立てる。本発明者らは、ＰＣ−３細胞を化合物４２あるいはＴＳＡで処理すると核内でＨＤＡＣ−ＰＰ１複合体の分解が起こり、ＰＰ１の細胞質内への再局在を誘導して標的リン酸化酵素の脱リン酸化を媒介することを提唱する。あるいは、この効果は熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）−９０のアセチル化に起因し、その結果Ａｋｔへの結合性が減少してその後Ａｋｔが分解されるとも考えられる（Ｆｕｉｎｏ，Ｌ．，Ｂａｌｉ，Ｐ．，Ｗｉｔｔｍａｎｎ，Ｓ．，Ｄｏｎａｐａｔｙ，Ｓ．，Ｇｕｏ，Ｆ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｇ．，Ａｔａｄｊａ，Ｐ．，ａｎｄ Ｂｈａｌｌａ，Ｋ．Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＬＡＱ８２４ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｈｅｒ−２ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ，ｔａｘｏｔｅｒｅ，ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ，ａｎｄ ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ Ｂ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，２：９７１−９８４，２００３）。
【０１２９】
（前立腺癌に対する化合物４２の抗腫瘍効果のインビボでの特徴付け）
定着したＰＣ−３異種移植片腫瘍の増殖に対する経口投与した化合物４２（１日当たり５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）の影響を、腹腔内注射したＳＡＨＡ（１日当たり５０ｇ／ｋｇ）と比較して調べた。さらに本発明者らは、化合物４２のＨＤＡＣ阻害効力に匹敵する阻害効力を持つという点から、化合物４４（１日当たり５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）も取り入れた（ＩＣ５０、３２ｎＭに対し２５ｎＭ）。化合物４２と４４の双方とも、用量依存的に、１０％ＦＢＳ含有培地にてＰＣ−３細胞の増殖をインビボで抑制するのに有効であり、ＩＣ５０値はそれぞれ０．６μＭと０．８μＭであった（図１５、７２時間処理）。
【０１３０】
図１６は、上記のようにＨＤＡＣ阻害剤を処理した胸腺欠損マウスにおける皮下ＰＣ−３異種移植片腫瘍の増殖を表す（パネルＡ、平均腫瘍容積±ＳＤとして表したデータ；パネルＢ、ビヒクル、化合物４４並びに化合物４２で処理したグループの代表的なマウスの写真）。示しているように、化合物４２と４４のいずれも、いずれかの投与量で、経口経路を介して、定着したＰＣ−３腫瘍の増殖を抑制するのに有効であった。１日当たり５０ｍｇ／ｋｇで経口的に投与した化合物４２のインビボでの効力は、同じ量を腹腔内投与したＳＡＨＡの効力に匹敵し、腫瘍の増殖を、ビヒクルで処理したコントロールグループと比較して、それぞれ７０．４％並びに６９．０％減少させた。１日当たり１００ｍｇ／ｋｇで、化合物４２はＰＣ−３腫瘍の増殖をほぼ完全に抑制し（９１．７％の減少）、体重の継続測定並びに病理的検査によって確認したように明白な副作用もみられなかった。
【０１３１】
本研究の結論として、Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ
ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（オハイオ州立大獣医学部）の、専門医師会認定の獣医病理学者による、各処理群の１匹のマウスの完全病理検査を実施した。この検査は、これは臨床病理学（血液学、血清化学）ならびに完全剖検（２７種類以上の組織および器官の肉眼および顕微鏡検査）を包含した。剖検で観察された肉眼的病理学的異常は、ＳＡＨＡ処理マウス、およびＤＭＳＯ処理コントロールマウスの腹膜内の小さな接着に限られており、これは毎日腹腔内注射を行った副作用のようである。血液パラメーターは、好中球の増加を除いて正常範囲内であり、これはビヒクル処理コントロールマウス群、ならびにＳＡＨＡおよび化合物４４（５０ｍｇ／ｋｇ）処理群の双方のマウスのみに観察された。血清化学値は、ビヒクル処理マウスでは脱水症状に一致する値となったが、他の全てのマウスでは正常範囲内であった。
【０１３２】
生物学的応答とインビトロで同定された提唱される作用機構とを相関させるため、経口投与した化合物４２および腹腔内投与したＳＡＨＡが、ＰＣ−３異種移植片腫瘍内のヒストンＨ−３のアセチル化を調節する作用を、免疫ブロットによって分析した。図１７は、ビヒクル、１日当たり５０もしくは１００ｍｇ／ｋｇの経口化合物４２、あるいは１日当たり５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内ＳＡＨＡで２８日間処理した腫瘍保有マウス由来の、２つの代表的なＰＣ−３腫瘍のホモジネート内のヒストンＨ３とアセチル化Ｈ３のウエスタンブロットを、様々な容量で表す。薬剤処理グループにおいて、インビボＨＤＡＣ阻害の特性である、ヒストンＨ３のアセチル化レベルの著しい増加が認められた。
【０１３３】
インビボ実験にて、等量の血清を含まない培地とマトリゲル基底膜マトリックスとに懸濁したＰＣ−３細胞を、５〜７週齢のオスＮＣｒ胸腺欠損ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の脇腹に皮下注射した（０．５×１０６ 細胞／０．１ｍｌ／マウス）。腫瘍容積が１７０〜２００ｍｍ３に達したときに、強制経口投与によって化合物４２もしくは４４を（１日当たり５０および１００ｍｇ／ｋｇ）、あるいは腹腔内注射によってＳＡＨＡ（１日当たり５０ｍｇ／ｋｇ）を毎日処理することを開始した（各グループにつきＮ＝６）。コントロールグループには、経口あるいは腹腔内経由でビヒクルのみ（それぞれ０．１％メチルセルロース／０．０５％ＴＷＥＥＮ８０水溶液、およびＤＭＳＯ）を与えた。処理は、コントロール群の平均腫瘍容積が約１，５００ｍｍ３に達するまで継続した。ノギスを使用して腫瘍を毎週測定し、標準公式：（幅）２×（長さ）×０．５２を用いて腫瘍の容積を算出した。体重を毎週測定し、実験期間中一定であった。
【０１３４】
乳癌細胞株、肺癌細胞株、および甲状腺癌細胞株における、化合物４２のインビトロ抗増殖効果。ＮＣＩ開発途上治療プログラム（ＤＰＴ）による６０細胞株スクリーニングによると、化合物４２は、６０細胞株全てに対し、平均ＧＩ５０（細胞増殖の５０％抑制）値が０．２μＭという強力なインビトロ抗増殖活性を示した。さらに、本発明者らは、甲状腺癌細胞株において化合物４２を試験した。代表的な乳癌細胞株、肺癌細胞株、および甲状腺癌細胞株における化合物４２の用量依存的抗増殖効果を、図１８に示す。
【０１３５】
（慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）における化合物４２のインビトロおよびインビボ抗増殖効果）
ＨＤＡＣ抑制能並びに細胞毒性促進能について、化合物４２を初代ＣＬＬ細胞にて試験した。図１９に示したように、ＨＤＡＣが抑制される１μＭ以上の濃度で、著しい細胞毒性が認められた（Ｎ＝６）。さらに、ＴＬＣ−１遺伝子移入マウスモデルを使用したインビボ予備試験によって、経口胃管注入によって１００ｍｇ／ｋｇの化合物４２を４週間、５日投与／２日非投与し、生存率が向上する傾向と顕著な毒性がないことが示された。
【０１３６】
（立体選択性）
驚くべきことに、化合物４２のＨＤＡＣ阻害活性が立体選択的であることを発見した。Ｓ異性体は、Ｒ異性体対応物よりも強力である（ＩＣ５０、１５ｎＭに対し８０ｎＭ）。
【０１３７】
まとめると、分子モデリングとコンビナトリアル化学技術とを組み合わせることにより、短鎖脂肪酸を骨格として使用して新たな種類の強力なＨＤＡＣ阻害剤を開発した。最適な薬剤である化合物４２（ＮＳＣ−Ｄ−７３１４３８）は、２５ｎＭのＩＣ５０でＨＤＡＣ活性を阻害し、これは親化合物フェニルブチレートの１０，０００倍以上の増大である。化合物４２は、これが臨床へ持ち込まれる有望な候補にする理由となるいくつかの独特の特性を示している。第一に、化合物４２は、後生的機構および細胞性機構の両方を介して、インビトロで抗増殖効果を媒介する。この特性はＴＳＡと同様であるが、ＳＡＨＡにはないものである。第二に、これは、ＭＳ−２７５およびＳＡＨＡよりも優れたインビトロおよび／またはインビボでの効力を有しながら経口的に生物学的利用可能である。第三に、１日当たり５０あるいは１００ｍｇ／ｋｇの投与量で２８日間の過程を終えても、腫瘍保有マウスにて明らかな毒性を示さない。このことは、長期投与および他の標的治療との組み合わせのための機会を与える。最後に、化合物４２は単純な構造を有し、大規模な合成に適する。
【０１３８】
（化合物４２の生成）
本発明者らは、数グラム単位で多数回、化合物４２を合成した。基本的に、４段階合成を経て調製し、全体の収量は５２％であった（図２０）。出発物質は全て容易に入手できるものであり、この合成は実験室の設定にて数百グラム単位のスケールアップが容易である。その手順を以下に記載する。中間生成物および最終産物は、クロマトグラフィーによる分離を用いなくとも９９％以上の純度で、結晶化によって反応混合物から単離され得る。全体として、合成および精製の手順は単純明快であり、この化合物の大規模生産に関して特別な問題点は無い。
【０１３９】
Ｎ−（４−アセチル−フェニル−３−メチル−２−フェニル−ブチルアミド（１））。（α−イソプロピル）−フェニル酢酸（４ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）を、塩化チオニル（３０ｍｌ）に溶解し、５０℃で１時間加熱した。溶媒を除去した後、残渣をＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解し、ｐ−アミノ安息香酸メチルエステル（３．４ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（３．５ｍｌ、２５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍｌ）溶液を、室温で撹拌しながら加えた。４時間後、真空下でＴＨＦを除去して酢酸エチル（２００ｍｌ）に溶解し、水（１００ｍｌ）と食塩水（１００ｍｌ）で続けて洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４上で有機相を乾燥し、真空下で濃縮して化合物１を得た（５．６ｇ；収量８５％）。その後精製することなく、この粗生成物を次の工程に使用した。
【０１４０】
４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）安息香酸（２）。化合物１（５．６ｇ；２０ｍｍｏｌ）を、ＫＯＨ（２１ｇ）を含有するメタノール（１５０ｍｌ）に溶解した。この混合物を２時間還流して０℃に冷却し、１２Ｎ ＨＣｌ（１２Ｎ）を滴下して生成物を沈殿させた。真空下で溶媒を除去し、冷水（１２０ｍｌ）を加えた。ろ過によって沈殿物を回収し、水で洗浄して乾燥し、化合物２を得た（５ｇ；収量８４％）
Ｎ−ベンジルオキシ−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド（３）。Ｎ２下で、２（５ｇ；１６．８ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１２０ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン（ＴＥＡ、２．５ｍｌ；１６．８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で１０分間撹拌し、ｂｉｓ（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）塩化ホスホルジアミド（ＢＯＰ−Ｃｌ）（４．７ｇ；１８．７ｍｍｏｌ）、塩酸Ｏ−ベンジルヒドロキシアミン（２．７ｇ；１７ｍｍｏｌ）、およびＴＥＡ（７．５ｍｌ）を加えた。室温で一晩撹拌後、この溶液を真空下で濃縮し、酢酸エチル（２００ｍｌ）、次いで３％ＮａＨＣＯ３（８０ｍｌ）を加えた。有機相を分離して、それぞれ１００ｍｌの水および飽和食塩水で続けて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して真空下で濃縮した。この残渣（６．１ｇ、収量９０％）をその後精製することなく、直接水素化分解に使用した。
【０１４１】
Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド（４）。化合物３（６．１ｇ；１５．２ｍｍｏｌ）をメタノール／ＴＨＦの１：１溶液（１２０ｍｌ）に混合し、木炭上の１０％パラジウム（０．６ｇ、１０％ ｗ／ｗ）を加えた。この混合物を大気圧下で２時間、水素で処理し、ろ過した。溶媒をエバポレートし、残渣を酢酸エチルで再結晶化した。収量は４．２ｇであった（収量９０％）。
【０１４２】
本発明に従うＨＤＡＣ阻害剤の代替的な合成スキームを、図２１に図示する。
【０１４３】
本発明の他の実施形態は、この明細の考察並びにこの明細にて開示されている発明の実践から、当業者には明白であろう。この明細および実施例は、以下の請求項によって示される本発明の真の範囲および本質を伴う例示にすぎないものであるとみなされることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の説明）
本発明は、Ａｒｍｙ Ｇｒａｎｔ ＤＡＭＤ１７−０２−１−０１１７およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｒａｎｔ ＣＡ９４８２９によって支援された。政府は、本発明において一定の権利を有する。本願は、２００２年１２月２日に出願された米国仮特許出願６０／５２６，３４８号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に関係し、特にＺｎ２＋キレートモチーフを包含するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に関する。より詳細には、本発明は、短鎖脂肪酸を基本とする、Ｚｎ２＋キレートモチーフを包含するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
コアヒストンのアセチル化状態は、ＤＮＡのヌクレオソーム・パッケージングの調節を介して、遺伝子の転写調節において中枢的役割を果たしている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。低アセチル化状態では、ヌクレオソームは緊密に凝縮されており、その結果転写因子の標的ＤＮＡへの接触が制限されることに起因して、転写が抑制される。反対に、ヒストンがアセチル化されるとヌクレオソーム構造は緩み、クロマチンは転写許容状態となる。どちらも配列特異的転写活性因子との複合体として標的遺伝子へ動員される、ヒストンアセチル基転移酵素（ＨＡＴ）の活性とヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の活性との間の動力学的なバランスが、この翻訳後修飾のレベルを維持している。この後成的なマーキング（ｍａｒｋｉｎｇ）システムの調節異常が、多くの形態の癌の主要な病因である不適切な遺伝子発現を引き起こすことが示されている（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。さらに、多くの種類の腫瘍細胞でＨＤＡＣを阻害すると、少数の遺伝子の転写が再活性化されることによって、成長停止、分化および／またはアポトーシスが誘引されることを例証する多くの証拠がある（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。異種移植片モデルでもまた、これらインビトロでの知見が確認されており、これらのことはＨＤＡＣ機能の調節が、癌の予防的および／または治療的介入のための標的となることを示唆している。
【０００４】
現時点で、構造的に異なる種類のいくつかのＨＤＡＣ阻害剤が報告されており（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）、これとしては短鎖脂肪酸（例えば、ブチレート（ｂｕｔｙｒａｔｅ）、バルプロエート（ｖａｌｐｒｏａｔｅ）、フェニルアセテート（ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）およびフェニルブチレート（ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ））（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）、ベンズアミド誘導体類（例えばＭＳ−２７−２７５）（非特許文献１６；非特許文献１７）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）および類似体（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）、ハイブリッド極性化合物（例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ））（非特許文献２１；非特許文献２２）、環状テトラペプチド類（例えばアピシジン（ａｐｉｃｉｄｉｎ））（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）、並びにデプシペプチドＦＲ９０１２２８（非特許文献２６）が挙げられる。これらの薬剤の内、短鎖脂肪酸は、他の種類のＨＤＡＣ阻害剤のＩＣ５０がμＭまたはｎＭ単位ですらあることと比較して、ＩＣ５０がｍＭ単位である最も弱い阻害剤である。短鎖脂肪酸を癌治療に使用することが報告されているが、低い抗増殖活性、速い代謝、および非特異的様式での作用のため、その治療効果は限られている。
【０００５】
最近、細菌性のＨＤＡＣ相同体であるＨＤＬＰ（ヒストン脱アセチル化酵素様タンパク質）のＸ線結晶分析から、タンパク質−リガンド相互作用（それによりＴＳＡおよびＳＡＨＡが酵素阻害を媒介する）の特異な様式が示唆された（非特許文献２７）。ＨＤＡＣ触媒ドメインは、炭素数４から６の直鎖に相当する長さにわたる、細い管状ポケット構造から成ることが明白となっている。この酵素のポケット構造の底部近くにＺｎ２＋陽イオンが位置し、これが、２つのＨｉｓ−Ａｓｐ電荷伝達系と協同して脱アセチル化触媒を促進していると考えられている。
【０００６】
当該分野の他の研究を慎重に考察し、短鎖脂肪酸のＨＤＡＣ阻害効力が弱いのは、短鎖脂肪酸が、本発明者らが脱アセチル化触媒の中心的役割を果たしていると考えている、活性部位ポケット内のＺｎ２＋陽イオンに接近できないことに一部起因すると、本発明者らは理解した。この考察およびさらなる研究を基に、本発明者らは、芳香族リンカーを介してＺｎ２＋キレートモチーフに短鎖脂肪酸を係留（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）することによって、短鎖脂肪酸を構造的に改変した。本発明者らの発見および研究によって、本発明者らは、新しい種類のＺｎ２＋キレートモチーフに係留された短鎖脂肪酸を発明するに至った。これらのうちのいくつかはｎＭの単位でＨＤＡＣ活性並びに癌細胞増殖の阻害を示すものもあり、これは親化合物と比較して３桁の作用効力向上である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ，「Ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌａｓｅｓ ａｎｄ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．」Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ（１９９９）９：４０−４８
【非特許文献２】Ｇｒａｙ ａｎｄ Ｅｋｓｔｒｏｍ，「Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ．」Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ（２００１）２６２：７５−８３
【非特許文献３】Ｊｅｎｕｗｅｉｎ ａｎｄ Ａｌｌｉｓ，「Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｃｏｄｅ．」Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）２９３：１０７４−１０８０
【非特許文献４】Ｗａｄｅ，「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｂｙ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ．」Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ（２００１）１０：６９３−６９８
【非特許文献５】Ｃｒｅｓｓ ａｎｄ Ｓｅｔｏ，「Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ，ｔｒｅａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ，ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．」Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（２０００）１８４：１−１６
【非特許文献６】Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ： ｃａｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｒａｐｉｅｓ．」Ｎａｔｌ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ（２００１）１：１９４−２０２
【非特許文献７】Ｊｕｎｇ，「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ ａｓ ｎｅｗ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ．」Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（２００１）８ １５０５−１５１１
【非特許文献８】Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，「Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｅｎｚｙｍｅｓ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．」Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２００２）９：３−１６
【非特許文献９】Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，「Ｈｉｓｔｏｎｅ−ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｎｏｖｅｌ ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．」Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ（２００２）１：２８７−２９９
【非特許文献１０】Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ａｓ ａ ｔｈｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ．」Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ（２００１）１２：２９４−３００
【非特許文献１１】Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｒ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌｓ」Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ（２０００）９２：１２１０−１２１６
【非特許文献１２】Ｌｅａ ａｎｄ Ｔｕｌｓｙａｎ，「Ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｕｔｙｌａｔｅ ａｎｏｌｏｇｕｅｓ ｏｎ ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ．」Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（１９９５）１５：８７９：８８３
【非特許文献１３】Ｋｒｕｈ，「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒａｔｅ，ａ ｎｅｗ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔ，ｏｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８２）４２：６５−８２
【非特許文献１４】Ｎｅｗｍａｒｋ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，「Ｂｕｔｙｒａｔｅ ａｎｄ ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ ａｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ：ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．」Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｕｐｐｌ（１９９５）２２：２４７−２５３
【非特許文献１５】Ｐｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｓ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｖａｌｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ，ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ，ｍｏｏｄ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ，ａｎｄ ｔｅｒａｔｏｇｅｎ．」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２００１）２７６：３６７３４−３６７４１
【非特許文献１６】Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｅｗ ｂｅｎｚａｍｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．」Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９９９）４２：３００１−３００３
【非特許文献１７】Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，ＭＳ−２７−２７５，ｗｉｔｈ ｍａｒｋｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ．」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９９）９６：４５９２−４５９７
【非特許文献１８】Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｎｅｗ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ．」Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）（１９７６）２９：１−６
【非特許文献１９】Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．「Ａｍｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ ａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．」Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９９９）４２：４６６９−４６７９
【非特許文献２０】Ｆｕｒｕｍａｉ ｅｔ ａｌ．「Ｐｏｔｅｎｔ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｂｕｉｌｔ ｆｒｏｍ ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ ａｎｄ ｃｙｃｌｉｃ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｒａｐｏｘｉｎ．」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００１）９８：８７−９２
【非特許文献２１】Ｒｉｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｐｏｌａｒ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ．」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９８）９５：３００３−３００７
【非特許文献２２】Ｒｅｍｉｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅｓ．」Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（２００２）４５：７５３−７５７
【非特許文献２３】Ｋｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｒａｐｏｘｉｎ，ａｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｃｙｃｌｉｃ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ，ｉｓ ａｎ ｉｎｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ．」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：２２４２９−２２４３５
【非特許文献２４】Ｓｈｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，「Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｃｈｌａｍｙｄｏｃｉｎ ａｎｄ ＨＣ−ｔｏｘｉｎ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ ｋｅｔｏｎｅ ａｎｄ ｄｉａｚｏｍｅｔｈｙｌ ｋｅｔｏｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｃｙｃｌｉｃ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅｓ．」Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ（１９８７）３０：７１−７８
【非特許文献２５】Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，「Ａｐｉｃｉｄｉｎ，ａ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１ ａｎｄ ｇｅｌｓｏｌｉｎ．」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ（２０００）６０：６０６８−６０７４
【非特許文献２６】Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．「ＦＲ９０１２２８，ａ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．」Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ（１９９８）２４１：１２６−１３３
【非特許文献２７】Ｆｉｎｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ａ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ ＴＳＡ ａｎｄ ＳＡＨＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）４０１：１８８−１９３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（本発明の要旨）
本発明者らは、短鎖脂肪酸のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤としての効力が弱いのは、脱アセチル化触媒に重要と考えられるＨＤＡＣ活性部位ポケット内の亜鉛陽イオンに短鎖脂肪酸が接近できないことに一部起因すると理解した。本発明は、例えばバルプロエート、ブチレート、フェニルアセテートおよびフェニルブチレートなどの短鎖脂肪酸を含む脂肪酸の構造的な改変に基づく。本発明は一般に、脂肪酸を、芳香族ωアミノ酸リンカーを介してＺｎ２＋キレートモチーフ（ヒドロキサム酸、ο‐フェニレンジアミンが挙げられるが、これらに限定されない）と結合することを含む。新しい種類のＺｎ２＋キレートモチーフ係留短鎖脂肪酸を含む本発明は、このストラテジーから導かれた。
【０００９】
本発明の化合物のＨＤＡＣ阻害における効力は、ＨＤＬＰリガンド複合体の結晶構造から提供されるフレームワークに基づいて、強力なＨＤＡＣ阻害剤が設計され得ることを示している。本発明は、短鎖脂肪酸、ωアミノ酸、ヒドロキサマト（ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｏ）などの亜鉛キレート剤の様々な組み合わせにより、化合物の大きなライブラリを創出することを可能にする係留ストラテジーに基づいている。
【００１０】
本発明は、以下の式：
【００１１】
【化６】
を有するヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む。ここで：
Ｘは、ＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｙは、ｎが０〜２の（ＣＨ２）ｎであり；
Ｚは、ｍが０〜３である（ＣＨ２）ｍおよび（ＣＨ）２から選択され；
Ａは、ヒドロカルビル基であり；
Ｂは、ο‐アミノフェニル基またはヒドロキシ基であり；
Ｑは、ハロゲン、水素、またはメチル基である。
【００１２】
一実施例において、Ａは脂肪族を含み得、この脂肪族は分岐であり得る。Ａはまた、置換されていても置換されていなくてもよい芳香族も含む。この式において、Ｂはο‐アミノフェニル基またはヒドロキシ基である。いくつかの実施例において、Ｙはｎが０である（ＣＨ２）ｎであり得、Ａは芳香族基を含み、Ｂはヒドロキシで、かつＱは水素である。
【００１３】
いくつかの実施例では、ｍは０かつＸはＨである。これらの特徴を有する化合物としては以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００１４】
【化７】
【００１５】
【化８】
いくつかの実施例では、ＸはＨであり、かつＡは以下：
【００１６】
【化９】
から選択され、ここでＲは分岐または非分岐の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、脂肪族または芳香族を含む。
【００１７】
本発明は、本発明の阻害剤を含む組成物を包含し、この組成物はＲ立体異性体と比較してＳ立体異性体が富化されている。
【００１８】
本発明の具体的な阻害剤としては、Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；２−プロピル−ペンタン酸−｛４−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−メチル］−フェニル｝−アミド；２−プロピル−ペンタン酸（４−ヒドロキシカルバモイル−メチル−フェニル）−アミド；２−プロピル−ペンタン酸−｛４−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−エチル］−フェニル｝−アミド；２−プロピル−ペンタン酸［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−アミド；２−プロピル−ペンタン酸｛４−２−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−ビニル］−フェニル｝−アミド；２−プロピル−ペンタン酸−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−ビニル）−フェニル］−アミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（ブチリルアミノ−メチル）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（４−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；４−（ブチリルアミノ−メチル）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（４−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；４−ブチリルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（４−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−ブチルアミド；Ｎ−ヒドロキシ−３−（４−フェニルアセチルアミノ−フェニル）−プロピオンアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−４−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（３−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−３−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（３−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；４−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−メチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−クロロ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−ブロモ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−ｔｅｒｔ−ブチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−フェニル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロシキ−ベンズアミド；４−（４−メトキシル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−トリフルオロメチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−ニトロ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；ピリジン−２−カルボン酸（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニル）−アミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−メチル−２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；４−（２，２−ジメチル−４−フェニル‐ブチリルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［メチル−（４−フェニル−ブチリル）−アミノ］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−メトキシ−２−フェニル−アセチルアミノ）−ベンズアミド；４−ジフェニルアセチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（４−イソブチル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（５−フェニル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２，２−ジメチル−４−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（４−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−メチル−２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［２−（４−イソブチル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ベンズアミド；ならびにＮ−ヒドロキシ−４−［２−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイルーエチル）−フェニル］−２−（Ｓ）−フェニル−ブチリルアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイルーエチル）−フェニル］−２−（Ｒ）−フェニルブチルアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［３−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；およびＮ−ヒドロキシ−４−［３−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミドが含まれる。
【００１９】
本発明はまた、これらの阻害剤と１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤とを含む薬学的組成物を含む。さらになお、本発明は、動物（例えば、ヒト）内で腫瘍性細胞増殖を阻害する方法を含み、、これは治療的有効量の少なくとも１種の本発明の阻害剤を投与する工程を包含する。
【００２０】
本発明のさらなる特性および利点は、以下に続く説明にてその一部が記述される。その一部はこの説明から明白となるか、または本発明の実施によって習得され得る。本発明の特性および利点は、添付の特許請求の範囲において具体的に示される要素および組み合わせによって理解され、達成されることとなる。
【００２１】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はいずれも、例示であって説明にすぎず、特許請求の範囲のように本発明を制限するものではないことが、理解されるべきである。この明細に添付され、この明細の一部を構成する付属の図面は、本発明の実施形態を実証し、説明と一緒になって本発明の本質を説明するのに役立つものである。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
式
【化１】
を有する、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であって、ここで：
Ｘは、ＨおよびＣＨ３から選択され；
Ｙは、ｎが０〜２である、（ＣＨ２）ｎから選択され；
Ｚは、ｍが０〜３である（ＣＨ２）ｍおよび（ＣＨ）２から選択され；
Ａは、ヒドロカルビル基であり；
Ｂは、ｏ−アミノフェニル基またはヒドロキシル基であり；そして
Ｑが、ハロゲン、水素、またはメチルである、阻害剤。
（項目２）
請求項１に記載の阻害剤であって、Ａが脂肪族基を含む、阻害剤。
（項目３）
請求項２に記載の阻害剤であって、前記脂肪族基が分枝である、阻害剤。
（項目４）
請求項１に記載の阻害剤であって、Ａが芳香族基を含む、阻害剤。
（項目５）
請求項４に記載の阻害剤であって、Ａが、置換した芳香族基を含む、阻害剤。
（項目６）
請求項１に記載の阻害剤であって、Ｂがｏ−アミノフェニルである、阻害剤。
（項目７）
請求項１に記載の阻害剤であって、Ｂがヒドロキシである、阻害剤。
（項目８）
請求項１に記載の阻害剤であって、ｎが０であり、Ａが芳香族基を含み、Ｂがヒドロキシであり、そしてＱが水素である、阻害剤。
（項目９）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；２−プロピル−ペンタン酸｛４−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−メチル］−フェニル｝−アミド；２−プロピル−ペンタン酸（４−ヒドロキシカルバモイル−メチル−フェニル）−アミド；２−プロピル−ペンタン酸｛４−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−エチル］−フェニル｝−アミド；２−プロピル−ペンタン酸［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−アミド；２−プロピル−ペンタン酸｛４−２−（２−アミノ−フェニルカルバモイル）−ビニル］−フェニル｝−アミド；および２−プロピル−ペンタン酸［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−ビニル）−フェニル］−アミドから選択される、阻害剤。
（項目１０）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（ブチリルアミノ−メチル）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（４−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；４−（ブチリルアミノ−メチル）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（４−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；４−ブチリルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（４−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；およびＮ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−ブチルアミドから選択される、阻害剤。
（項目１１）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、Ｎ−ヒドロキシ−３−（４−フェニルアセチルアミノ−フェニル）−プロピオンアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−４−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（３−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−３−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；およびＮ−ヒドロキシ−４−［（３−フェニルーブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミドから選択される、阻害剤。
（項目１２）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、４−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−メチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−クロロ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−ブロモ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−ｔｅｒｔ−ブチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−フェニル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−メトキシル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−トリフルオロメチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；４−（４−ニトロ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミドおよびピリジン−２−カルボン酸（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニル）−アミドから選択される、阻害剤。
（項目１３）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−メチル−２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；４−（２，２−ジメチル−４−フェニル−ブチリルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［メチル−（４−フェニル−ブチリル）−アミノ］−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−メトキシ−２−フェニルーアセチルアミノ）−ベンズアミド；４−ジフェニルアセチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（４−イソブチル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ベンズアミド；およびＮ−（２−アミノ−フェニル）−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミドから選択される、阻害剤。
（項目１４）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（５−フェニル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２，２−ジメチル−４−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（４−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−メチル−２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［２−（４−イソブチル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ベンズアミド；およびＮ−ヒドロキシ−４−［２−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミドから選択される、阻害剤。
（項目１５）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−（Ｓ）−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−（Ｒ）−フェニル−ブチルアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；Ｎ−ヒドロキシ−４−［３−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；およびＮ−ヒドロキシ−４−［３−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミドから選択される、阻害剤。
（項目１６）
請求項１に記載の阻害剤であって、該阻害剤が、エステルまたは塩である、阻害剤。
（項目１７）
請求項１に記載の阻害剤と、少なくとも一つ薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、薬学的組成物。
（項目１８）
動物における腫瘍性細胞増殖を阻害する方法であって、治療上効果的な量の、請求項１に記載される少なくとも一つの阻害剤を投与する工程、を包含する、方法。
（項目１９）
請求項１８に記載の方法であって、前記動物がヒトである、方法。
（項目２０）
請求項８に記載の阻害剤であって、ｍ＝０であり、そしてＸ＝Ｈである、方法。
（項目２１）
請求項２０に記載の阻害剤であって、前記化合物が、
【化２】
である、阻害剤。
（項目２２）
請求項２０に記載の阻害剤であって、前記化合物が、
【化３】
である、阻害剤。
（項目２３）
請求項２０に記載の阻害剤であって、前記化合物が、
【化４】
である、阻害剤。
（項目２４）
請求項２１に記載の阻害剤を含む組成物であって、該組成物が、Ｒ−立体異性体と比べて、Ｓ−立体異性体が富化されている、組成物。
（項目２５）
請求項１に記載の阻害剤であって、Ｘ＝Ｈであり、そしてＡが、
【化５】
から選択され、Ｒが、分枝または非分枝の、置換または非置換の、飽和または不飽和の、脂肪族基または芳香族基である、阻害剤。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、化合物１〜１０を生成するための、バルプロ酸と５つの芳香族ωアミノ酸および２つのＺｎ２＋キレート部分との様々な結合体を示す。
【図２】図２は、化合物１〜１０のＨＤＡＣ阻害効力を示す。インビトロＨＤＡＣアッセイは、本明細書中で記載されている市販の酵素アッセイキットを使用して行った。データは、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。
【図３】図３は、化合物１１〜２２の構造およびＨＤＡＣ阻害効力を示す。値は、平均値±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）である。
【図４】図４は、ＤＵ−１４５細胞におけるヒストンアセチル化およびｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１の発現に対する、ＨＴＰＢ、ＴＳＡおよびフェニルブチレートの影響を示す。１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ １６４０培地中で、ＤＵ−１４５細胞を、ＨＴＰＢ、ＴＳＡおよびフェニルブチレートに、示された濃度で２４時間曝露した。それぞれの溶解液からの等量のタンパク質を電気泳動し、それぞれの抗体を使用するウエスタンブロットによって試験した。内部参照タンパク質としてアクチンを使用した。
【図５】図５は、ＤＵ−１４５細胞に対するＨＴＰＢの増殖阻害効果を示す。（Ａ）細胞生存率に対するＨＴＰＢ用量依存的な影響の時間経過。ＤＵ−１４５細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地中の０〜２．５μＭのＨＴＰＢで、示された時間、処理した。ＭＴＴアッセイによって生細胞を試験した。データは平均値±Ｓ．Ｄ．である（ｎ＝６）。（Ｂ）２４時間曝露後のヌクレオソームＤＮＡの形成に対する、ＨＴＰＢ用量依存的な影響。ヌクレオソームの形成は、各アッセイについて２×１０３の細胞に相当する溶解物を用いたＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡによって、定量的に測定した。データは、２回の独立した定量の平均である。
【図６】図６は、本発明の化合物を合成するためのスキームの例を示す。
【図７−１】図７（フレーム１）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−２】図７（フレーム２）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−３】図７（フレーム３）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−４】図７（フレーム４）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−５】図７（フレーム５）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−６】図７（フレーム６）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−７】図７（フレーム７）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−８】図７（フレーム８）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−９】図７（フレーム９）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−１０】図７（フレーム１０）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図７−１１】図７（フレーム１１）は、本発明に従う種々の化合物の例を表示する。
【図８−１】図８（フレーム１）は、本発明に従って使用され得る亜鉛キレートモチーフの例を表示する。
【図８−２】図８（フレーム２）は、本発明に従って使用され得る亜鉛キレートモチーフの例を表示する。
【図９】図９は、化合物１９のリガンドドッキングの分子モデリング研究である。
【図１０】図１０は、化合物１９とその結合部位との相互作用の過程で起こると考えられるプロトン移動を図示する。
【図１１】図１１は、化合物４２のリガンドドッキングの分子モデリング研究である。
【図１２】図１２は、ＰＣ−３アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞における、ヒストンＨ−４過アセチル化およびｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１発現に対する、化合物４２、ＳＡＨＡ、およびＴＳＡの影響を示す。
【図１３】図１３は、ＰＣ−３細胞におけるＡｋｔの活性化状態に対する、化合物４２、ＳＡＨＡ、およびＴＳＡの影響を示す。
【図１４】図１４は、いくつかのリン酸化酵素に対する化合物４２の影響を示す。
【図１５】図１５は、定着したＰＣ−３異種移植片腫瘍の増殖に対する、経口投与した化合物４２の影響を示す。
【図１６】図１６は、胸腺欠損マウスにおける皮下ＰＣ−３異種移植片腫瘍の増殖に対する、化合物４２、化合物４４、およびＳＡＨＡの影響を示す。
【図１７】図１７は、化合物４２、ＳＡＨＡ、またはコントロールで処理した２つの代表的なＰＣ−３腫瘍ホモジネートの、ヒストンＨ３並びにアセチル化Ｈ３のウエスタンブロットを示す。
【図１８】図１８は、代表的な乳癌細胞株、肺癌細胞株および甲状腺癌細胞株に対する、化合物４２の用量依存的な抗増殖効果を示す。
【図１９】図１９は、初代ＣＬＬ細胞に対する、化合物４２の影響を示す。
【図２０】図２０は、化合物４２の化学合成スキームを図示する。
【図２１】図２１は、本発明に従う化合物に関する一般的な化学合成スキームを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
（発明の実施形態の説明）
一般に、短鎖脂肪酸は、アシル鎖の構造に係わらず、ｍＭ範囲でＨＤＡＣ阻害および抗増殖活性を示す（Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ９：３−１６（２００２）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １：２８７−２９９（２００２）；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １２：２９４−３００（２００１））。本発明はとりわけ、これらの脂肪酸が、酵素ポケット入口に位置する表面残基および／またはこの管状ポケット内の疎水性部分との非特異的な疎水性相互作用を介して、ＨＤＡＣ阻害を発揮するという発見に基づく。本発明者らは、疎水性スペーサーを介してＺｎ２＋キレート部分を係留することによって、これら短鎖脂肪酸のＨＤＡＣ阻害効力を増大させた。
【００２４】
ヒストン脱アセチル化酵素の酵素活性の測定は、公知の方法論を用いて達成され得る。例えば、Ｙｏｓｈｉｄａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７１７４−１７１７９（１９９０））は、トリコスタチンＡで処理した細胞においてアセチル化ヒストンを検出することによる、ヒストン脱アセチル化酵素の酵素活性の評価を記載している。同様に、Ｔａｕｎｔｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：４０８−４１１（１９９６））は、内在性ＨＤＡＣ−１および組換えＨＤＡＣ−１を使用してヒストン脱アセチル化酵素の酵素活性を測定する方法を記載している。Ｙｏｓｈｉｄａら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１７１７４−１７１７９，１９９０）およびＴａｕｎｔｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：４０８−４１１，１９９６）はいずれも、本明細書中に参考として援用される。
【００２５】
この開示を通じて、本発明に従う化合物に対する参照がなされる。この明細書および特許請求の範囲においてそのような化合物に対する参照は、その化合物のエステルおよび塩を包含する。従って、たとえ明確に列挙されていなくても、その化合物自体への参照によって、そのようなエステルおよび塩は企図および包含される。
【００２６】
本発明に従って使用され得る脂肪酸は、ヒドロカルビル部分およびカルボン酸部分を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ヒドロカルビル」は、「脂肪族」、「環式脂肪族」、および「芳香族」が含まれると理解される。このヒドロカルビル基には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、およびアルカリル基が含まれると理解される。さらに、「ヒドロカルビル」には、非置換ヒドロカルビル基と置換ヒドロカルビル基とのいずれもが含まれると理解され、後者は炭素および水素以外の付加置換基を有する炭化水素部分を指す。さらに、「カルボン酸」はこの化合物を指すために使用されるが、そのような酸の塩（例えば、カルボン酸塩など）も明確に企図される。さらに、本明細書中においてカルボン酸とカルボン酸塩は交換可能なものとして使用され得る。
【００２７】
脂肪酸には、特に、約３個〜約１４個の炭素の長さの非分枝脂肪酸の長さに匹敵する長さの分子鎖を有するものが含まれるが、これらに限定されない。従って、この分子鎖は、例えば約３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個の炭素の長さであり得る。この鎖は、最大で、例えば約１４個、１３個、１２個、１１個、９個、８個、７個、６個、５個または４個の炭素の長さであり得る。この脂肪酸は直鎖であっても分枝であってもよく、単結合、二重結合および／または三重結合を含み得る。脂肪酸の非限定的な例としては、バルプロエート、ブチレート、フェニルアセテートおよびフェニルブチレートが含まれる。
【００２８】
本発明に従って企図されるＺｎ２＋キレートモチーフとしては、ヒドロキサム酸およびο−フェニレンジアミンが挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、トリフルオロメチルケトン、α−ケトアミド、α−ケトチアゾール、２−ケト１−メチル−１Ｈ−イミダゾール、α−ケト１Ｈ−テトラゾール、α−ケト１Ｈ−イミダゾール、５−ケト１メチル−１Ｈ−イミダゾール、α−ケトオキサゾール、α−ケト４，５−シヒドロ−オキサゾール、α−ケトベンゾオキサゾール、α−ケトオキサゾール［４，５−ｂ］ピリジンおよびα−ケトピリジンが含まれる。これらのモチーフの構造は、図８に示される。
【００２９】
スペーサーは任意のヒドロカルビルスペーサーであり得るが、好ましくは芳香族成分を含む。芳香族リンカーは、以下の利点を有していると考えられている：１）上記結合体の構造硬性を増大させる、および２）ポケットの管様疎水領域とのファンデルワールス接触を増大させて結合親和力を向上させる。リンカーの例としては、芳香族ω‐アミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。
【００３０】
このリンカーは、炭素数４から８の直鎖（例えば炭素数４、５、６、７、あるいは８の直鎖）と同じ長さを示す。従って、その長さは炭素数４〜７または４〜６の直鎖と同じであり得る。その長さは、結合ポケットの疎水領域の深さに基づき得る。本発明のリンカーの例としては、４−（アミノメチル）安息香酸、４−アミノ安息香酸、（４−アミノフェニル）酢酸、３−（４−アミノフェニル）プロピオン酸、および３−（４−アミノフェニル）−アクリル酸が挙げられるが、これらに限定されない。とりわけ、４−（アミノメチル）安息香酸は、ＭＳ−２７−２７５（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：４５９２−４５９７（１９９９））のリンカーとして使用されている。
【００３１】
以下の化合物が具体的に企図される：
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；
２−プロピル−ペンタン酸｛４−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−メチル］−フェニル｝−アミド；
２−プロピル−ペンタン酸（４−ヒドロキシカルバモイル−メチル−フェニル）−アミド；
２−プロピル−ペンタン酸｛４−［２−アミノ−フェニルカルバモイル）−エチル］−フェニル｝−アミド；
２−プロピル−ペンタン酸［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−アミド；
２−プロピル−ペンタン酸｛４−［２−（２−アミノ−フェニルカルバモイル）−ビニル］−フェニル｝−アミド；
２−プロピル−ペンタン酸［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−ビニル）−フェニル］−アミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（ブチリルアミノ−メチル）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（４−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；
４−（ブチリルアミノ−メチル）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［（４−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；
４−ブチリルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（４−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−ブチルアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−３−（４−フェニルアセチルアミノ−フェニル）−プロピオンアミド；
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−４−フェニル−ブチルアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（３−フェニル−ブチリルアミノ−メチル］−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−フェニル−ブチルアミド；
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−３−フェニル−ブチルアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［（３−フェニル−ブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド；
４−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−メチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−クロロ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−ブロモ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；］
４−（４−ｔｅｒｔ−ブチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−フェニル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−メトキシル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−トリフルオロメチル）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
４−（４−ニトロ）−ベンゾイルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
ピリジン−２−カルボン酸（４−ヒドロキシカルバモイル−フェニル）−アミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−メチル−２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；
４−（２，２−ジメチル−４−フェニル−ブチリルアミノ）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［メチル−（４−フェニル−ブチリル）−アミノ］−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−メトキシ−２−フェニル−アセチルアミノ）−ベンズアミド；
４−ジフェニルアセチルアミノ−Ｎ−ヒドロキキシ−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（４−イソブチル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（５−フェニル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２，２−ジメチル−４−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（４−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−メチル−２−フェニル−プロピオニルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［２−（４−イソブチル−フェニル）−プロピオニルアミノ］−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［２−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−（Ｓ）−フェニル−ブチルアミド；
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−２−（Ｒ）−フェニル−ブチルアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−４−［３−（Ｓ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド；および
Ｎ−ヒドロキシ−４−［３−（Ｒ）−フェニルブチリルアミノ］−ベンズアミド。
【００３２】
本発明の化合物は、ラセミ化合物あるいはラセミ混合物である場合がある。本明細書中で使用される場合、用語「ラセミ」は、本発明の化合物の（Ｒ）鏡像異性体と（Ｓ）鏡像異性体との混合物、あるいは立体異性体混合物を意味し、ここで鏡像異性体もしくは立体異性体はいずれも、実質的に他方から精製されていない。
【００３３】
本発明の（Ｒ）立体異性体または（Ｓ）立体異性体を記述するために本明細書中で使用される「富化」という語は、（Ｓ）立体異性体よりも（Ｒ）立体異性体の量が多いか、またはその逆の組成物を指す。例えば、この組成物は、化合物４２の全重量に対して、５０重量％、５５重量％、あるいは６０重量％以上の化合物４２の（Ｓ）立体異性体を含有し得る。一実施例において、富化された（Ｓ）化合物４２の量はより多いいものであり得、例えば、化合物４２の全重量に対し、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８１重量％、８２重量％、８３重量％、８４重量％、８５重量％、８６重量％、８７重量％、８８重量％、８９重量％、９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、９９重量％以上、もしくはこれらの任意の分数量（例えば９０．１重量％、９０．２重量％等）の（Ｓ）‐化合物４２であり得る。特定の実施例において、富化された（Ｓ）化合物４２の量は、化合物４２の全重量に対し、９９重量％、９９．１重量％、９９．２重量％、９９．３重量％、９９．４重量％、９９．５重量％、９９．６重量％、９９．７重量％、９９．８重量％、９９．９重量％よりも多いものであってもよいし、１００重量％であってもよい。これらの用語はまた、（Ｓ）化合物４２の薬学的に受容可能な任意の塩の量を定義する。これらは非限定的な例であり、本発明の他のラセミ化合物に対しても、同じ富化が達成され得る。
【００３４】
本発明の鏡像異性体富化した組成物を投与することにより、所望の治療効果が得られる。即ち、鏡像異性体富化した組成物は、低い合計濃度で治療効果をもたらし得るか、または所望されな鏡像異性体の存在に起因する副作用を軽減し得る。これらの利点は特に企図される。
【００３５】
本発明の方法にて用いられる任意の本発明の化合物は、経口的に、非経口的に（ＩＶ、ＩＭ、デポーＩＭＳ、ＳＱ、およびデポーＳＱ）、舌下に、経鼻的に（吸入）、髄腔内に、局所的に、あるいは直腸的に投与され得る。当業者に公知の投与形態は、本発明の方法において用いられる本発明の化合物の送達に適している。
【００３６】
治療的有効量の、本発明の方法において用いられる本発明の化合物を含有する組成物が提供される。この化合物は、錠剤、カプセル、あるいはエリキシル等経口投与に適切な薬学的調製物に、あるいは非経口投与のための滅菌溶液もしくは滅菌懸濁液に処方することができる。本明細書中に記載される化合物は、当該分野で周知の技術および手順を用いて薬学的組成物に処方することができる。
【００３７】
約０．１ｍｇから１０００ｍｇの、本発明の方法において用いられる本発明の化合物あるいは発明の化合物の混合物、あるいは生理学的に受容可能な塩もしくはエステルは、認可された製薬業務に必要な単位投与量形態内で、生理学的に許容できるビヒクル、キャリア、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、香味料等と混合される。これらの組成物あるいは調製物中の活性物質量は、記載した単位の適切な投与量が得られる量である。この組成物は単位投薬形態に処方され得、各投与形態物は、約１〜約５００ｍｇ、または約１０〜約１００ｍｇの活性成分を含有する。「単位用量形態」という語は、ヒト被験体および他の哺乳類のための単位投与物として適切な、物理的に別々の単位を指し、各単位物は、適切な賦形剤と共に、所望する治療効果が生じるよう計算された、前決定された量の活性物質を含有する。
【００３８】
組成物を調製するため、本発明の方法で用いられる１つ以上の発明の化合物は、適切な薬学的に受容可能なキャリアと混合される。この化合物を混合あるいは添加すると、溶液、懸濁液、乳液などが生じ得る。薬学的に適切なキャリアとして、リポソーム懸濁液もまた、使用され得る。これらは、当業者に周知の方法に従って調製され得る。得られる混合物の形態は、多数の因子に依存し、この因子としては、意図する投与様式および選択したキャリアまたはビヒクルにおけるこの化合物の溶解性が挙げられる。有効濃度は、処置される疾患、障害または状態の１つ以上の症状が軽減または改善されるのに十分であり、経験的に決定され得る。
【００３９】
本明細書中で提供される化合物の投与に適した薬学的キャリアまたは薬学的ビヒクルとしては、特定の投与様式に適する任意のキャリアが含まれる。さらに、活性物質もまた、所望の活性を損なわない他の活性物質と、または所望の活性を補う他の活性物質と、または他の活性を有する活性物質と、混合され得る。この化合物は、組成物内で唯一の薬学的活性成分として処方されてもよいし、他の活性成分と組み合わせられてもよい。
【００４０】
この化合物が不十分な溶解性を示す場合、可溶化のための方法が使用され得る。そのような方法は公知であり、これとしてはジメチルスルホキシド（ＤＮＳＯ）のような共溶媒の使用、ＴＷＥＥＮのような界面活性剤の使用、および炭酸水素ナトリウム水溶液への溶解が含まれるが、これらに限定されない。有効な薬学的組成物の処方において、塩またはプロドラッグのような、この化合物の誘導体もまた使用され得る。
【００４１】
化合物の濃度は、化合物投与の対象である障害の少なくとも１つの症状を軽減または改善する投与量の送達に有効なものである。代表的には、この組成物は、単回用量投与のために処方される。
【００４２】
本発明の方法において用いられる本発明の化合物は、徐放性処方物またはコーティングのような、体内からの急速な排出に対して化合物を保護するキャリアと一緒に、調製され得る。そのようなキャリアとしては、マイクロカプセル化された送達系などの徐放性処方物が挙げられるが、これに限定されない。この活性化合物は、治療を受ける患者に有害な副作用を与えずに、治療的に有用な効果を発揮するのに十分な量で、薬学的に受容可能なキャリア中に含有され得る。治療的に有効な濃度は、処置される疾患に対するインビトロモデル系およびインビボモデル系において、公知の化合物を試験することによって、経験的に決定され得る。
【００４３】
本発明の化合物および組成物は、複数回投与容器あるいは１回投与容器内に収められ得る。この封入された化合物および組成物は、例えば、使用のために組み立てられ得る成分部分を含有するキットにおいて、提供され得る。例えば、凍結乾燥形態の発明の化合物と適切な稀釈剤とが、使用前に混合するために別々の成分部分として提供され得る。キットは、本発明の化合物と、共投与のための第二の治療剤とを包含し得る。本発明の化合物および第二の治療剤は、別々の成分部分として提供され得る。キットは複数の容器を備え得、各容器は、本発明の方法において用いられる本発明の化合物の１単位用量以上を含む。この容器は所望の投与様式に適合され得、これとしては、経口投与のための錠剤、ゲルカプセル、徐放性カプセルなど；非経口投与のためのデポー製品、充填済み注射器、アンプル、バイアルなど；局所投与のためのパッチ、医療用パッド、クリームなど、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
薬物組成物中の本発明の活性化合物の濃度は、その活性化合物の吸収性、不活性化性および排出速度、投与スケジュール、投与量、ならびに当業者に公知の他の要因に依存する。
【００４５】
この活性成分は、一度に投与されてもよいし、時間間隔ごとに投与される、より小さないくつかの投与量に分割されてもよい。正確な用量および処置期間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコルを用いて、あるいはインビボもしくはインビトロの試験データから外挿することによって、経験的に決定され得る。また、濃度および投与値は、緩和されるべき状態の重篤度によって変動し得ることに、注意するべきである。任意の特定の患者に関して、特定の投薬レジメンは、その患者の必要性および、この組成物を投与するかまたは組成物の投与を監督する者である専門家による判断に従って、時間経過と共に調整するべきであること、そして、この明細で記載される濃度の範囲は例示というだけであって、特許請求される組成物の範囲または実施の制限を意図したものでないことが、さらに理解されるべきである。
【００４６】
経口投与が所望される場合、胃の酸性環境から化合物を保護する組成で、この化合物は提供され得る。例えば、この組成物は、胃の中でその保全性を維持し、そして腸内でこの活性化合物を放出する腸溶コーティング内に処方され得る。この組成物はまた、制酸薬あるいは他の同様の成分と組み合わせて処方され得る。
【００４７】
経口組成物は、一般に、不活性の希釈剤あるいは食用のキャリアが含み、そして圧縮されて錠剤となるか、またはゼラチンカプセル内に封入され得る。経口治療投与の目的のために、その活性化合物を賦形剤と混合し、錠剤、カプセル、あるいはトローチの形態にて使用され得る。この組成物の一部として、薬学的に適合性の結合剤および補助物質が含有され得る。
【００４８】
この錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、任意の以下の成分あるいは同様の性質の化合物を含有し得る：結合剤（例えば、トラガカントゴム、アカシアゴム、トウモロコシ澱粉またはゼラチンが挙げられるが、これらに限定されない）；賦形剤（例えば、ミクロクリスタリンセルロース、澱粉、あるいは乳糖）；崩壊剤（例えば、アルギン酸およびトウモロコシ澱粉が挙げられるが、これらに限定されない）；潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）（例えば、ステアリン酸マグネシウムが挙げられるが、これに限定されない）；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、二酸化ケイ素コロイドが挙げられるが、これに限定されない）；甘味料（例えば、ショ糖またはサッカリン）；香味料（例えば、ペパーミント、サルチル酸メチルまたはフルーツ香料）。
【００４９】
投与単位形態がカプセルである場合、これは上記の種類の物質に加えて脂肪油などの液体キャリアを含有し得る。さらに、投与単位形態は、例えば糖衣あるいは他の腸溶剤のような、この投与単位形態の物理的形態を改変する様々な他の物質を含有し得る。この化合物はまた、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤、チューイングガムなどの成分として投与され得る。シロップは、この活性成分に加えて、甘味料、およびある種の保存料としてショ糖、色素および着色剤、ならびに香味料を含有し得る。
【００５０】
この活性物質はまた、所望の作用を損なわない他の活性物質と、あるいは所望の作用を補う物質と、混合され得る。本発明の化合物は、例えば抗がん剤、ホルモン、ステロイド、またはレチノイドと併用して使用され得る。抗がん剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン剤、抗生剤、コルヒチン、ビンカアルカロイド、Ｌ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、ミトタン、ニトロソウレア類、あるいはイミダゾールカルボキサミドのような多数の化学治療剤のうちの１つであり得る。適切な薬剤としては、チューブリンの脱分極を促進する薬剤が挙げられる。例としては、コルヒチンならびにビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチンおよびビンクリスチン）が挙げられる。
【００５１】
経口、皮内、皮下、あるいは局所投与に使用する溶液または懸濁液は、以下の任意の成分を含有し得る：滅菌希釈剤（注射用水、生理食塩水、固定油、例えばゴマ油、ココナッツ油、ピーナッツ油、綿果油などのような天然植物油、あるいはオレイン酸エチルなどの合成脂質性ビヒクル、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールおよびメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸および重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））；緩衝液（例えば、酢酸、クエン酸、およびリン酸）；浸透圧を調整するための薬剤（例えば、塩化ナトリウムおよびデキストロース）。非経口調製物は、アンプル、使い捨て注射器、あるいはガラス、プラスチック、もしくは他の適切な物質からできた複数回投与用バイアル内に、封入することができる。必要に応じて、緩衝液、保存剤、抗酸化剤などが組み入れられ得る。
【００５２】
静脈経由で投与する場合、適切なキャリアとしては、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤および溶解剤を含有する溶液（例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびこれらの混合物）が挙げられるが、これらに限定されない。組織標的リポソームを含むリポソーム懸濁液もまた、薬学的に受容可能なキャリアであり得る。これらは、当該分野で公知な方法に従って調製され得る。
【００５３】
本発明の化合物は、時間放出処方あるいはコーティングのような、体外への急速な排出から化合物を保護するキャリアと共に調製され得る。そのようなキャリアとしては、インプラントおよびマイクロカプセル送達系、ならびに生分解性生体適合ポリマー（例えば、コラーゲン、エチレンビニル酢酸、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸など）のような徐放性組成物が挙げられるが、これらに限定されない。そのような組成物を調製するための方法は、当業者に公知である。
【００５４】
本発明の方法において用いられる化合物は、経腸的にあるいは非経口的に投与され得る。経口的に投与される場合、本発明の方法で用いられる化合物は、当業者に周知の、経口投与のための通常の投薬形態で投与され得る。これらの投薬形態としては、錠剤並びにカプセルの通常の固形単位用量形態、ならびに溶液、懸濁液、およびエリキシルなどの液体投与形態が挙げられる。固形投与形態を使用する場合、その形態は徐放性型であり得、その結果、本発明の方法で用いられる化合物は１日１、２回の投与のみが必要とされる。
【００５５】
経口投与形態は、１日１回、２回、３回、または４回患者に投与され得る。本発明の方法で用いられる本発明の化合物は、１日３回以下、もしくは１日１回あるいは２回のみ投与され得る。つまり、本発明の方法で用いられる本発明の化合物は、経口投与形態にて投与される。どのような経口投与形態を用いる場合でも、本発明の方法で用いられる化合物を胃の酸性環境から保護するように、これらは設計され得る。腸溶性コーティング錠剤が、当業者に周知である。さらに、酸性である胃から保護するよう一つ一つがコーティングされた小球体が充填されたカプセルもまた、当業者に周知である。
【００５６】
本発明の方法で用いられる本発明の化合物はまた、ナノ結晶分散処方物にて、有利に送達され得る。そのような処方物の調製は、例えば米国特許第５，１４５，６８４号に記載されており、その全内容が、参考として援用される。ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤のナノ結晶分散物およびその使用法は、米国特許第６，０４５，８２９号に記載されており、その全内容が、参考として援用される。ナノ結晶処方物は、代表的には薬物化合物の生物学的有用性を増大させる。
【００５７】
本発明の化合物および方法は、動物において腫瘍性細胞の増殖を抑制するために使用され得る。この方法は、体内に１つ以上の腫瘍性細胞を有する動物に、治療的有効量の１種以上の本発明の化合物を、上記のような組成物にて投与する工程を包含する。この動物は哺乳類（家畜を含む）であり得る。この動物はヒトであり得る。
【００５８】
用語「腫瘍性細胞」は、異常な細胞増殖を示す細胞を指すために使用される。腫瘍性細胞の異常な増殖には、細胞増殖の増大が含まれる。例えば、腫瘍性細胞は、過増殖性細胞、またはインビトロにて増殖の接触抑制の欠如を示す細胞、インビボで転移することのできない良性腫瘍細胞、インビボで転移することができかつ除去の試み後に再発し得る癌細胞であり得る。用語「腫瘍形成」は、腫瘍性増殖の発症へと導く細胞増殖の誘導を示すために使用される。
【００５９】
用語「治療的有効量」および「治療的有効期間」は、腫瘍性細胞増殖の軽減に有効な投与量で腫瘍性細胞増殖の軽減に有効な期間に渡る処置を示すために使用される。上記のように、そのような投与は、非経口的、経口的、舌下的、経皮的、局所的、経鼻的、あるいは直腸内的であり得る。全身投与する場合、本発明の化合物の血中濃度が約０．１μＭ〜約１００ｍＭを達成するのに十分な投与量で、その治療的組成物は投与され得る。局所的な投与については、これよりもはるかに少量が有効であり得、またはるかに高い濃度が許容される場合がある。当業者は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の有効濃度の低下をもたらすそのような治療効果は、本発明に従って処置される組織、器官、あるいは特定の動物もしくは患者によって著しく変動し得ることを認識する。また、患者がある投与量で開始しても、その患者の状態が変化するため、投与量は経時的に変化し得ることもまた、理解される。
【００６０】
本発明は、動物の細胞増殖性疾患あるいは状態を治療するための組成物並びに方法を提供し、この方法は、そのような処置を必要とする動物に治療的有効量の、本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を投与する工程を包含する。記述したように、この動物は哺乳動物（家畜を含む）であり得る。この動物はヒトであり得る。
【００６１】
用語「細胞増殖性疾患または細胞増殖性状態」は、異常な細胞増殖（好ましくは、異常に増大した細胞増殖）によって特徴づけられる任意の状態を指すことが意味される。そのような細胞増殖性疾患または状態の例としては、癌、再狭窄および乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施例において、本発明は、動物内の腫瘍性細胞増殖を阻害するための方法を提供し、この方法は、体内に１つ以上の腫瘍性細胞を有する動物に、治療的有効量の本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を投与する工程を包含する。本発明に従って治療することのできる癌としては、前立腺癌、肺癌、急性白血病、多発性硬化症、膀胱癌腫、腎臓癌腫、乳癌腫、結腸直腸癌腫、神経芽腫、あるいは黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明の化合物のいくつかは、原生動物由来のヒストン脱アセチル化酵素に対する阻害活性を有する。従って、本発明はまた、原生動物性疾患または原生動物性感染を処置もしくは予防するための方法を提供し、この方法は、そのような処置を必要とする動物に、治療的有効量の本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を投与する工程を包含する。ここでも、動物は哺乳動物であり得、そしてヒトであり得る。いくつかの実施形態において、このヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、哺乳動物ヒストン脱アセチル化酵素、特にヒトヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を阻害するよりも高い程度で、原生動物ヒストン脱アセチル化酵素を阻害する。
【００６３】
本発明はさらに、真菌性疾患または真菌性感染を処置するための方法を提供し、この方法は、そのような処置を必要とする動物に治療的有効量の本発明のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を投与する工程を包含する。この動物は、ヒトを含む哺乳動物であり得る。本発明のこの実施形態に従って使用されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、哺乳類ヒストン脱アセチル化酵素、特にヒトヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を阻害するよりも高い程度で、真菌のヒストン脱アセチル化酵素を阻害し得る。
【００６４】
当業者である投与を行う医療従事者に周知なように、正確な投与量および投与の頻度が、本発明の方法で用いられる投与される特定の化合物、処置される患者の具体的な状態、処置される状態の重篤度、特定の患者の年齢、体重、全身の身体状態、およびその患者が受けている可能性のある他の医薬に依存することは、当業者には明白であるはずである。
【実施例】
【００６５】
（実験）
化学試薬および有機溶媒は、他に記載のない限り、Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ ＮＭＲ）は、Ｂｒｕｋｅｒ ２５０ ＭＨｚで測定した。化学シフト（δ）は、ＴＭＳピークに対する１００万分の１（ｐｐｍ）で記載する。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析は、３−Ｔｅｓｌａ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＦＴＭＳ−２０００ フーリエ変換質量分析器で実行した。元素分析値は、計算値の±０．４％以内であった。
【００６６】
シリカゲル（２３０−４００メッシュ）を用いて、フラッシュカラムクロマトグラフィーを行った。ωアミノ酸メチルエステルを、メタノール／ＴＭＳＣｌを使用して市販の酸から調製し、（２−アミノ−フェニル）カルバミン酸ベンジルエステルを、標準的な手順に従ってο−フェニレンジアミンおよびギ酸ベンジルクロリドから合成した。ウサギ抗アセチルヒストンＨ３ポリクローナル抗体およびウサギ抗アセチルヒストンＨ４ポリクローナル抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，
ＮＹ）から購入し、ウサギ抗ｐ２１抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。マウス抗アクチンモノクローナル抗体は、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）製であった。ＨＲＰ結合対化ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびＨＲＰ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧは、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。
【００６７】
化合物１〜８および１１〜２２は、以下に記載する方法（図６、スキーム１Ａ）に従って合成し、化合物９および１０は、３−［４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−フェニル］−アクリル酸から、それぞれ方法ｆおよび方法ｇ（図６、スキーム１Ｂ）によって調製した。これらは表題化合物の下に別々に記載している。
【００６８】
方法ａ 塩酸［１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）カップリング］
個々の短鎖脂肪酸の無水ＴＨＦ（５〜１０ ｍｍｏｌ／ｍＬ）溶液に、Ｎ２下で、様々なωアミノ酸メチルエステル（１当量）を加え、続いてＥＤＣ（１．３当量）を加えた。一晩撹拌した後、減圧下でＴＨＦを除去し、残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解した。この混合物を、水（５０ｍＬ）で２回、さらに飽和食塩水（５０ｍＬ）で続けて洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮した。生じた残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【００６９】
方法ｂ（エステル開裂）
方法ａから得られたエステルを２Ｍ ＫＯＨ／ＭｅＯＨ溶液に溶解した。この混合物を８０℃で１時間撹拌して０℃まで冷却した。さらに２Ｎ ＨＣｌでｐＨ ３まで酸性化し、真空下で濃縮して、酢酸エチル（１００ｍＬ）およびＨ２Ｏ（５０ｍＬ）を加えた。この有機相を分離して、それぞれ５０ｍＬの水および飽和食塩水で続けて洗浄した。さらにＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【００７０】
方法ｃ ［ｂｉｓ（２−オキソ−３−オキザゾリジニル）ホスホルジアミド（ＢＯＰ−Ｃｌ）カップリング］
方法ｂから得られる酸の無水ＴＨＦ（５〜１０ｍｍｏｌ／ｍＬ）溶液に、Ｎ２下で、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１当量）を加えた。この混合物を室温で１０分間撹拌し、ＢＯＰ−Ｃｌ（１．１当量）、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミン塩酸（１当量）、およびＴＥＡ（３当量）を加えた。室温で一晩撹拌した後、この溶液を真空下で濃縮し、酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え、次に３％ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）を加えた。この有機相を分離して、それぞれ５０ｍＬの水および飽和食塩水で続けて洗浄した。さらにＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【００７１】
方法ｄ（ＥＤＣカップリング）
方法ｂから得られる個々の酸の無水ＴＨＦ（５〜１０ｍｍｏｌ／ｍＬ）溶液に、Ｎ２下で、（２−アミノフェニル）カルバミン酸ベンジルエステル（１当量）を加え、次にＥＤＣ（１．３当量）を加えた。一晩撹拌した後、この混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチル（１００ｍＬ）を加えた。有機相を水（５０ｍＬ）で２回、次に飽和食塩水（５０ｍＬ）で続けて洗浄し、さらにＮａ２ＳＯ４上で乾燥して濃縮した。得られた残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。
【００７２】
方法ｅ（水素化分解）
方法ｃまたは方法ｄから得られたＮ−ベンジルオキシもしくはＮ−Ｃｂｚ誘導体を、メタノール／ＴＨＦ（５〜１０ｍｍｏｌ／ｍＬ）１：１溶液に溶解し、木炭上１０％パラジウム（１０％ ｗ／ｗ）を加えた。この混合物を大気圧下で２時間、水素で処理し、ろ過した。溶媒をエバポレートし、残渣を酢酸エチルで再結晶化した。
【００７３】
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド（１）
【００７４】
【化１０−１】
【００７５】
【化１０−２】
Ｎ−ヒドロキシ−４−［（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−メチル］−ベンズアミド（２）
【００７６】
【化１０−３】
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド（３）
【００７７】
【化１０−４】
Ｎ−ヒドロキシ−４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−ベンズアミド（４）
【００７８】
【化１０−５】
２−プロピル−ペンタン酸｛４−［（２−アミノ−フェニルカルバモイル）−メチル］−フェニル｝−アミド（５）
【００７９】
【化１０−６】
２−プロピル−ペンタン酸（４−ヒドロキシフェニルカルバモイルメチル−フェニル）−アミド（６）
【００８０】
【化１０−７】
【００８１】
【化１０−８】
２−プロピル−ペンタン酸｛４−［２−（２−アミノ−フェニルカルバモイル）−エチル］−フェニル｝−アミド（７）
【００８２】
【化１０−９】
２−プロピル−ペンタン酸［４−（２−ヒドロキシフェニルカルバモイル）−エチル）−フェニル］−アミド（８）
【００８３】
【化１０−１０】
３−［４−（２−プロピル−ペンタノイル）−フェニル］−アクリル酸
化合物９および１０の前駆体であるこの化合物は、２−プロピル−ペンタン酸（０．７８ｍＬ、４．９ｍｍｏｌ）および３−（４−アミノ−フェニル）−アクリル酸メチルエステル（０．８６ｇ、４．９ｍｍｏｌ）から、前述の方法ａおよび方法ｂに従って合成した。全収量、１．０５ｇ（２工程で７０％）；
【００８４】
【化１０−１１】
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−３−［４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−フェニル］−アクリルアミド（９）
３−［４−（２−プロピル−ペンタノイル）−フェニル］−アクリル酸（２００ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液に、Ｎ２下で、ベンゼン−１，２−ジアミン（４５０ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）を、次にＥＤＣ（１８０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を加えた。一晩撹拌した後、この混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加え、水（３０ｍＬ）で２回、そして飽和食塩水（３０ｍＬ）で続けて洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮した。この粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン、１：１）によって精製し、白色の固体として化合物９（２００ｍｇ、収量７６％）を得た。
【００８５】
【化１０−１２】
Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−フェニル］−アクリルアミド（１０）
３−［４−（２−プロピル−ペンタノイルアミノ）−フェニル］−アクリル酸（１００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、窒素下で、ＥＤＣ（７９ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）およびヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢＴ）（６２ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を１時間撹拌し、塩酸ヒドロキシルアミン（２７．４ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（５４μＬ）を加え、さらに１２時間撹拌し、真空下で濃縮した。さらに、酢酸エチル（４０ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１５ｍＬ）を加えた。有機相を分離し、それぞれ２０ｍＬの水および飽和食塩水で続けて洗浄した。この有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、真空下で濃縮した。この粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー［酢酸エチル−ＭｅＯＨ（９：１）］によって精製し、白色固体の化合物１０（４５ｍｇ、収量４０％）を得た。
【００８６】
【化１０−１３】
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（ブチリルアミノ−メチル）−ベンズアミド（１１）
【００８７】
【化１０−１４】
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド（１２）
【００８８】
【化１０−１５】
Ｎ−（２−アミノ−フェニル）−４−［（４−フェニルブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド（１３）
【００８９】
【化１０−１６】
４−（ブチリルアミノ−メチル）−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド（１４）
【００９０】
【化１０−１７】
Ｎ−ヒドロキシ−４−（フェニルアセチルアミノ−メチル）−ベンズアミド（１５）
【００９１】
【化１０−１８】
【００９２】
【化１０−１９】
Ｎ−ヒドロキシ−４−［（４−フェニルブチリルアミノ）−メチル］−ベンズアミド（１６）
【００９３】
【化１０−２０】
４−ブチリルアミノ−Ｎ−ヒドロキシ−ベンズアミド（１７）
【００９４】
【化１０−２１】
Ｎ−ヒドロキシ−４−フェニルアセチルアミノ−ベンズアミド（１８）
【００９５】
【化１０−２２】
Ｎ−ヒドロキシ−４−（４−フェニルブチリルアミノ）−ベンズアミド（１９）
【００９６】
【化１０−２３】
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−ブチルアミド（２０）
【００９７】
【化１０−２４】
【００９８】
【化１０−２５】
Ｎ−ヒドロキシ−３−（４−フェニルアセチルアミノ−フェニル）−プロピオンアミド（２１）
【００９９】
【化１０−２６】
Ｎ−［４−（２−ヒドロキシカルバモイル−エチル）−フェニル］−４−フェニル−ブチルアミド（２２）
【０１００】
【化１０−２７】
さらに別の化合物２３〜６７を含む、全ての化合物の一覧を図６に示す。
【０１０１】
（インビトロＨＤＡＣアッセイ）
ヒストン脱アセチル化酵素アッセイキット（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）を使用して、製造者による使用説明書にわずかな改変を加えてこれに従い、ＨＤＡＣ活性を測定した。このアッセイは、ヒストン脱アセチル化酵素活性に富むＤＵ−１４５核抽出物が、ストレプトアビジンアガロースビーズに結合させたビオチン化［３Ｈ］−アセチルヒストンＨ４ペプチドの脱アセチル化を媒介する能力に基づく。上清への遊離した［３Ｈ］−アセテートの放出を測定し、ＨＤＡＣ活性を計算した。ナトリウムブチレート（０．２５〜１ｍＭ）を陽性コントロールとして使用した。
【０１０２】
（細胞生存率アッセイ）
各ウェル当たり４，０００個のＤＵ−１４５細胞を播種した９６ウェルの平底プレートにて、細胞生存率に対するＨＴＰＢの影響を、ＭＴＴ｛［３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−臭化テトラゾリウム］｝アッセイによって分析した。細胞を、５％ＣＯ２下３７℃で、記載した時間、１０％ ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地に記載した濃度にて溶解したＨＴＰＢに曝露した。この培地を取り除いて、ＲＰＭＩ−１６４０培地に溶解した０．５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴ １５０μｌに置き換え、細胞を、３７℃で２時間、ＣＯ２インキュベーターにてインキュベートした。ウェルから上清を除去し、還元されたＭＴＴ色素を２００μｌ／ウェルのＤＭＳＯで可溶化した。プレートリーダーで、５７０ｎｍにて吸光度を測定した。各処理は６ウェルずつ繰り返した。
【０１０３】
（酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるアポトーシスの検出）
Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造者の使用説明書に従って使用して、アポトーシスの誘導を評価した。この試験は、アポトーシス性細胞死誘導後の、モノヌクレオソームおよびオリゴヌクレオソーム形態の細胞質性ヒストン結合ＤＮＡフラグメントの定量的測定に基づいている。簡潔に述べると、実験の２４時間前に１×１０６のＤＵ−１４５細胞をＴ−７５フラスコ内で培養した。細胞を、１０％ ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地に、記載した濃度のＨＴＰＢで処理した。浮遊細胞および吸着細胞の双方を回収し、２×１０３個の細胞に相当する細胞溶解物をＥＬＩＳＡに使用した。
【０１０４】
（ウェエスタンブロット分析）
１０％ ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、記載した濃度のＨＴＰＢで２４時間処理したＤＵ−１４５細胞（１×１０６個）を回収し、超音波処理した。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、この溶解物のタンパク質濃度を測定した；各溶解物由来の等量のタンパク質を１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに溶解し、次いで半乾式トランスファーセルにてイモビロン−ニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上へ移した。０．１％のＴＷＥＥＮ２０含有トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）（ＴＢＳＴ）で、このトランスブロットした膜を２回洗浄した。５％ノンファットミルク含有ＴＢＳＴで４０分間ブロッキングした後、この膜をＴＢＳＴ−１％ノンファットミルクに溶解した一次抗体（１：１０００希釈）と共に４℃で一晩インキュベートした。一次抗体で処理した後、この膜を計１５分間、ＴＢＳＴで３回洗浄し、続いてヤギ抗ウサギ、もしくは抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（１：３０００稀釈）を室温で１時間処理し、さらにＴＢＳＴで３回、計１時間洗浄した。この免疫ブロットを高感度化学発光によって可視化した。
【０１０５】
（結果）
第一のシリーズの化合物に関して、本発明者らは、スキーム１（Ａ、化合物１〜８；Ｂ、化合物９および１０）にて記載した手順に従って、Ｚｎ２＋係留結合体（図１）を合成する先導化合物としてバルプロ酸を用いた。化合物１〜８に関して、ＥＤＣ活性化を介して、バルプロ酸を４つの異なるωアミノ酸メチルエステルスペーサーと結合させた。得られたエステルを、アルカリ加水分解により酸に分解した。代表的なペプチドカップリング条件（ＢＯＰＣｌまたはＥＤＣ）の下で、得られた酸を、Ｂｎ保護ヒドロキシアミンおよびＣｂｚ保護ο‐フェニレンジアミンで処理し、水素化分解後に、それぞれアニリドおよびヒドロキサム酸を形成した（スキーム１Ａ）。化合物９および１０は、３−［４−（２−プロピル−ペンタノイル）−フェニル］−アクリル酸を、それぞれο‐フェニレンジアミンおよびヒドロキシルアミンと、代表的なＥＤＣカップリング条件下で直接カップリングさせることによって合成した（スキーム１Ｂ）。
【０１０６】
（Ｚｎ２＋キレートモチーフ係留バルプロエート誘導）
バルプロ酸を５種類の芳香族リンカーと、続いて２つのＺｎ２＋結合モチーフと様々に結合体化することによって、化合物１〜１０を得た。これらの係留結合体は、様々な程度のＨＤＡＣ阻害効力を示し（図２）、そのＩＣ５０値は５μＭ（化合物８）から８０μＭ（化合物５）の範囲にわたった。この抑効力は、親分子（ＩＣ５０、０．４ｍＭ）の８倍から５倍改善された。これらの結合体のうちのいずれかからバルプロイル部分もしくはＺｎ２＋キレートモチーフを除去すると、ＨＤＡＣ阻害活性は完全に失われ（データは示していない）、このことはタンパク質‐リガンド相互作用において、アシル基およびＺｎ２＋キレートモチーフが重要であることを示している。
【０１０７】
試験した１０個の係留結合体の中で、化合物１、２、４および８は最適な誘導体（ＩＣ５０、５〜８μＭ）であり、３、９、および１０がこれに次ぐ（ＩＣ５０、１０〜２０μＭ）。相対的に、ヒドロキサマト（化合物２、４、６、８および１０）は、一般に、対応するフェニレンジアミン（化合物１、３、５、７および９）よりも作用効力が強かった。さらに、芳香族リンカーは、ＨＤＡＣ阻害活性に対して微小な影響を示した。試験した５つの芳香族ωアミノ酸の中で、（４−アミノフェニル）アセテートは、ＨＤＡＣ阻害効力が最も弱い結合体（５および６）となったが、４−（アミノメチル）ベンゾエートは最適であるようであった。さらなる構造的改変については、化合物１、２、４および８が、全てＩＣ５０＜１０μＭを示したので、これらを先導化合物として使用した。
【０１０８】
（構造的改変）
バルプロイル基を除去すると、この結合体の阻害活性が完全に失われるという発見によって、活性部位ポケットと相互作用する際のアシル部分の重要性が強調された。従って、本発明者らは、化合物１、２、４および８のバルプロイル基を、ブチリル基、フェニルアセチル基またはフェニルブチリル基に置換して、ＨＤＡＣ阻害に対する立体電子効果を増大させた（図３）。これら全ての誘導体は、バルプロイル対応物と比較して、向上したＨＤＡＣ阻害作用効力を示した。試験した様々なアシル官能基の中で、同一のスペーサーおよびＺｎ２＋キレートモチーフと結合させた場合、相対的効力は、フェニルブチリル基＞フェニルアセチル基＞ブチリル基＞バルプロイル基の順であった。
【０１０９】
これらの１２個の誘導体の中で、化合物１９は特に注目すべきものであった。このヒドロキサマト係留フェニルブチレート（ＨＴＰＢ）（すなわち、化合物１９）は、４４ｎＭというＩＣ５０を示し、これはフェニルブチレートに対して強度４倍の向上である。この化合物を使用して、ＤＵ−１４５前立腺癌細胞におけるＨＤＡＣ活性に対する影響を調べた。
【０１１０】
（ＤＵ−１４５前立腺癌細胞におけるヒストンアセチル化およびｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１発現に対するＨＴＰＢの影響）
ヒストンの過アセチル化（ｈｙｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）およびサイクリン依存性リン酸化酵素阻害因子であるｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１の発現増加は、細胞内ＨＤＡＣ阻害に関する二つの特性である（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １：１９４−２０２（２００１））。従って、本発明者らは、ヒストンアセチル化およびｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１発現の状態の特性を明らかにすることによって、ＤＵ−１４５前立腺癌細胞におけるＨＤＡＣ活性に対するＨＴＰＢの影響を、ＴＳＡおよびフェニルブチレートと比較して試験した。
【０１１１】
ＤＵ−１４５細胞を、１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ １６４０培地中で２４時間、０．５、１、２．５μＭのＨＴＰＢ、０．２５および０．５μＭのＴＳＡ、または１、２．５、および５ｍＭのフェニルブチレートに曝露した。細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、これらの薬剤の処理によってアセチル化ヒストンＨ３およびＨ４、ならびにｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１のレベルが上昇したことを示している（図４）。これらのバイオマーカーに対する１μＭ ＨＴＰＢの影響は、０．２５μＭ ＴＳＡ、もしくは２．５ｍＭフェニルブチレートの影響に近かった。ＤＵ−１４５細胞は、少量だが有意な量の内在性ｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１を示し、そのレベルは、０．５μＭという低濃度のＨＴＰＢへ曝露した後に、実質的に増加した。まとめると、これらのデータによって、ＨＴＰＢはＤＵ−１４５細胞にてＨＤＡＣ活性を標的としていることを確認した。
【０１１２】
（ＤＵ−１４５細胞の生存率に対するＨＴＰＢの影響）
１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ １６４０培地中のＤＵ−１４５細胞において、癌細胞生存率に対するＨＴＰＢの影響を調べた。これらの細胞は、ＨＴＰＢに対して高度の感受性を示し、増殖阻害におけるＩＣ５０は、約０．５μＭと１μＭの間であった（図５Ａ）。ＤＮＡフラグメント化によって証明されたように、ＨＴＰＢは用量依存的様式でＤＵ−１４５細胞のアポトーシスに対する感受性を増加させた（図５Ｂ）。示したように、薬物の濃度が１μＭを超えたときに、２４時間にて広範囲のアポトーシスが発生し、これは少なくとも部分的には、この細胞毒性効果がＨＤＡＣ阻害によってアポトーシスが誘導されたことに起因することを示している。試験した他の細胞株としては、ＡＮ３ＣＡ子宮内膜癌細胞、ならびにＳＷ−４８およびＨＣＴ−１５結腸直腸癌細胞が挙げられる。これらの癌細胞もまた、同程度の効力でＨＴＰＢの細胞毒性効果に対して感受性であった（データは示さず）。
【０１１３】
（考察）
本明細書中で、本発明者らは、新しい種類のＨＤＡＣ阻害剤の開発を示し、この阻害剤において、短鎖脂肪酸が疎水性結合を介してＺｎ２＋キレートモチーフに係留された。ＴＳＡおよびＳＡＨＡによるＨＤＡＣ阻害の独特な様式により提供された作用モデルについて、これらの化合物を開発する際の本発明者らのストラテジーが立てられた（Ｆｉｎｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０１：１８８−１９３（１９９９））。本発明者らの新しい係留ストラテジーからＨＴＰＢ（すなわち化合物１９）の発見が導かれ、これはＳＡＨＡについて報告された濃度（Ｒｉｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：３００３−３００７（１９９８））に一致する準μＭ濃度で、ＨＤＡＣ阻害活性および抗増殖活性を示す。
【０１１４】
本発明者らは、いくつかの癌細胞株において、ＨＴＰＢがＨＤＡＣ活性を標的とする２つの系列の証拠を得た。具体的には、ＤＵ−１４５前立腺癌細胞を、０．５μＭもの低濃度でＨＴＰＢ処理すると、用量依存的な様式でヒストンＨ３並びにＨ４の過アセチル化が引き起こされた。同様に、ＨＴＰＢに応答して、ｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１発現が実質的に上方制御された。対照的に、ヒストンアセチル化およびｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１発現に対する同様の細胞内効果を達成するのに、親分子であるフェニルブチレートは、少なくとも２．５ｍＭを必要とした。
【０１１５】
ＨＴＰＢは、構造的に既存のＨＤＡＣ阻害剤と区別され、その多くは、キャップ基が極性平面構造から構成されている。例えば、ＴＳＡ、ＳＡＨＡおよびＭＳ−２７５のキャップ基は、それぞれジメチルアミノフェニル基、フェニルアミノ基およびピリジン−３−イル−メトキシカルボニル基を含有する。従って、活性部位ポケットは、キャップ基に異なる立体電子特性を与える高度な柔軟性を示すと、本発明者らはさらに結論づけた。本発明者らのデータは、結合体の活性部位ポケットへの結合促進において、フェニルブチリル基およびフェニルアセチル基は脂肪族アシル部分より効果的であったことを示している。この矛盾は、部分的に、電子密度の違いおよび／または分岐した側鎖による立体化学的障害に起因すると推測される。芳香族リンカーに関しては、４−アミノ安息香酸が、フェニルブチリル基とヒドロキサマトとを係留するのに最適であるようであり、その長さはポケットの両端に接触するのに十分なものであった。
【０１１６】
（第二世代ＨＤＡＣ阻害剤の設計および合成−化合物１９の構造に基づく最適化）
化合物１９（ＨＴＰＢ）は、構造的に既存のＨＤＡＣ阻害剤とは区別され、多くは例えばＴＳＡ、ジメチルアミノフェニル；ＳＡＨＡ、フェニルアミノ；およびＭＳ−２７−２７５、ピリジン−３−イル−メトキシカルボニルのような、極性の平面構造から成るキャップ基を有する。この知見は、ＨＤＡＣ活性部位ポケットがキャップ基に異なる立体電子特性を与える、高度な柔軟性を示していることを示唆する。
【０１１７】
リガンド結合を予測するため、本発明者らは、化合物１９（図９、赤字）およびＴＳＡ（図９、黄字）の、ＨＤＬＰ活性部位ポケットへの分子ドッキングを行い、その後個々のリガンドの認識様式を比較するためにエネルギーを最小化した。図９に示したように、双方のリガンドともポケットへの結合は類似した配置をとっている。化合物１９の芳香族リンカーである４−アミノ安息香酸は、フェニルブチリル基とヒドロキサマトを係留するのに最適な長さを提供し、これによって双方の官能基はポケットの両端に接触することを可能にする。ヒドロキサム酸基［Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＯＨ］によって、化合物１９のＨＤＡＣ阻害効力はフェニルブチレートの４桁の大きさの増加に寄与するようである。
【０１１８】
図９のモデリングデータは、リガンド結合におけるヒドロキサマトの役割に２要素があることを示唆している。１つは、Ｚｎ２＋陽イオンをキレートする。２つ目は、ヒドロキサマトは、Ｈｉｓ１３１−Ａｓｐ１７３電荷リレー系の助けと共に、ＮＨ−ＯＨからＨｉｓ−１３１のＮτへのプロトン移動を促進する（図１０）。（ＴＳＡのリガンド結合研究については、Ｖａｎｏｍｍｅｓｌａｅｇｈｅ，Ｋ．，Ｖａｎ Ａｌｓｅｎｏｙ，Ｃ．，Ｄｅ Ｐｒｏｆｔ，Ｆ．，Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｔｏｕｒｗｅ，Ｄ．，ａｎｄ Ｇｅｅｒｌｉｎｇｓ，Ｐ．Ａｂ ｉｎｉｔｉｏ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ
ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ（ＴＳＡ） ｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＤＬＰ）．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ，１：２９５１−２９５７，２００３を参照する。）
結論として、ヒドロキサマトＨＤＡＣ阻害剤である、ＴＳＡあるいは化合物１９のいずれかの結合によってＡｓｐからヒドロキサマトへの負電荷の転移が生じ、その結果、負荷電ヒドロキサマトとＺｎ２＋の正電荷およびイミダゾール環との間に塩架橋が形成される（図１０、中央パネル）。機構的に、この塩架橋は、ヒドロキサマトベースのリガンドと活性部位ポケットとの結合に寄与する主要な力となっており、フェニルブチレートから化合物１９への転換に伴う、ＨＤＡＣ阻害効力の１０４倍の増加に必要とされる微分自由エネルギー変化（ΔΔＧ‡＝５．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の根底となっている（ＩＣ５０、０．４ｍＭに対し４４ｎＭ）。
【０１１９】
結合親和力におけるこの塩架橋の役割は、化合物１９のヒドロキサマト部分をフェニレンジアミン基に置換した（化合物５５）ときにＨＤＡＣ阻害効果が１０倍低下する（すなわち、ＩＣ５０、０．０４４μＭに対して０．４μＭ）ことによって、さらに強調される。ヒドロキサマトとは対照的に、フェニレンジアミン基の活性部位への結合には、Ｈｉｓ１３１のＮτへのプロトン転移が関係しない。代わりに、Ｈｉｓ１３１との荷電‐荷電相互作用を形成することなく、電子に富むジアミンのみがＺｎ２＋陽イオンをキレートする。その結果、フェニレンジアミンベース（例えば、化合物５５）のリガンドとの結合親和性は、対応するヒドロキサマトと比較して著しく低下する。
【０１２０】
この分子ドッキングはまた、化合物１９の次なる改変のための有用な指針を提供した。図９に示したように、ＴＳＡおよび化合物１９のキャップ基は、Ｔｙｒ９１、Ｇｌｕ９２、Ｇｌｙ１４０、およびＰｈｅ１４１に囲まれた溝近くに位置する。本来この溝は、様々な程度のかさ高さを有するキャップ基を適合させる柔軟性を提供し、ＨＤＡＣ阻害効力を増大させるのに活用され得る。
【０１２１】
従って、本発明者らは、化合物１９のフェニルブチリル部分を、様々なα分岐芳香族脂肪族アシル基に置換した。その原理は、２つであった。第１に、フェニルブチリル基と化合物１９内のリンカーとの間のアミド結合が、タンパク質分解性消化に感受性であり得る。アシル基の嵩高さが増加することによって、アミド結合がより立体的に妨げられたものに変わることにより、代謝安定性が増大し得る。第２に、アシル基の大きさが増したことで、前記溝との疎水結合が増大し、これによって結合親和力が増し得る。
【０１２２】
このストラテジーから、化合物１９（すなわち、ＨＴＰＢ）よりも大きな作用効力を有する、多数のＨＤＡＣ阻害剤が導かれた。いくつかの代表的な誘導体の構造およびＩＣ５０を表１にまとめる。
【０１２３】
表１ 代表的なフェニルブチレートベースのＨＤＡＣ阻害剤
【０１２４】
【表１】
合成した８０を超える誘導体の中で、化合物４２がＴＳＡに匹敵するＩＣ５０を持つ最適な薬剤である。分子モデリング解析によって、化合物４２は、活性部位ポケット内側でＴＳＡの原子配置と並立する配置をとっていることが示されている（図１１を参照のこと）。さらに、イソプロピル部分が溝の内側にあり、隣接する疎水性残基と相互作用し得る。それゆえ、さらなるインビトロおよびインビボでの特徴付けのために、化合物４２を選択した。
【０１２５】
（化合物４２およびＴＳＡは、抗増殖効果を後成的かつ細胞レベルで媒介する−新規の細胞標的の同定）
ＰＣ−３アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞にて、ｐ２１ＷＡＦ／ＣＩＰ１発現およびヒストンＨ４過アセチル化に対する影響についての試験に、化合物４２、ＳＡＨＡ、およびＴＳＡを供した。図１２は、これらのバイオマーカーの誘導における化合物４２の効力がＴＳＡに匹敵し、ＳＡＨＡよりも約５倍高いことを示している。
【０１２６】
ＰＣ−３細胞（ＰＴＥＮ−／−）におけるＡｋｔ活性化状態に対するこれらの薬剤の影響もまた、試験した。Ａｋｔは、アンドロゲン非依存性およびこれらの細胞の化学治療耐性に寄与する機能性ＰＴＥＮが存在しないため、ＰＣ−３細胞にて構造的に活性化されている。ＰＣ−３細胞にて、化合物４２とＴＳＡのいずれもが、１μＭもの低濃度で著しいＡｋｔ脱リン酸化を引き起こしたことに注目すべきである（図１３）。対照的に、リン酸化Ａｋｔに対するＳＡＨＡの影響は認められなかった。これはＳＡＨＡと化合物４２／ＴＳＡとの間には、作用様式に僅かな差異があることを示唆している。
【０１２７】
ＰＣ−３細胞におけるリン酸化Ａｋｔに対する化合物４２の影響は、多くがＰＴＥＮ変異を示すホルモン不応性前立腺癌細胞におけるこのＨＤＡＣ阻害剤の臨床投与の点から注目に値する。しかし、この脱リン酸化効果はリン酸化酵素特異的なものである。試験した他の一連のシグナル伝達リン酸化酵素の中で、ＦＡＫ（局所接着リン酸化酵素）およびＥＲＫ類のリン酸化レベルは投与量依存的に減少したが、ｐ３８あるいはＪＮＫのリン酸化レベルは影響を受けないままであった（図１４）。
【０１２８】
本発明者らは、ＨＤＡＣアイソザイムと複合体を形成してその核への局在化を促進するプロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）により、この脱リン酸化が仲介されると仮説を立てる。本発明者らは、ＰＣ−３細胞を化合物４２あるいはＴＳＡで処理すると核内でＨＤＡＣ−ＰＰ１複合体の分解が起こり、ＰＰ１の細胞質内への再局在を誘導して標的リン酸化酵素の脱リン酸化を媒介することを提唱する。あるいは、この効果は熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）−９０のアセチル化に起因し、その結果Ａｋｔへの結合性が減少してその後Ａｋｔが分解されるとも考えられる（Ｆｕｉｎｏ，Ｌ．，Ｂａｌｉ，Ｐ．，Ｗｉｔｔｍａｎｎ，Ｓ．，Ｄｏｎａｐａｔｙ，Ｓ．，Ｇｕｏ，Ｆ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｇ．，Ａｔａｄｊａ，Ｐ．，ａｎｄ Ｂｈａｌｌａ，Ｋ．Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＬＡＱ８２４ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｈｅｒ−２ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ，ｔａｘｏｔｅｒｅ，ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ，ａｎｄ ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ Ｂ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，２：９７１−９８４，２００３）。
【０１２９】
（前立腺癌に対する化合物４２の抗腫瘍効果のインビボでの特徴付け）
定着したＰＣ−３異種移植片腫瘍の増殖に対する経口投与した化合物４２（１日当たり５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）の影響を、腹腔内注射したＳＡＨＡ（１日当たり５０ｇ／ｋｇ）と比較して調べた。さらに本発明者らは、化合物４２のＨＤＡＣ阻害効力に匹敵する阻害効力を持つという点から、化合物４４（１日当たり５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ）も取り入れた（ＩＣ５０、３２ｎＭに対し２５ｎＭ）。化合物４２と４４の双方とも、用量依存的に、１０％ＦＢＳ含有培地にてＰＣ−３細胞の増殖をインビボで抑制するのに有効であり、ＩＣ５０値はそれぞれ０．６μＭと０．８μＭであった（図１５、７２時間処理）。
【０１３０】
図１６は、上記のようにＨＤＡＣ阻害剤を処理した胸腺欠損マウスにおける皮下ＰＣ−３異種移植片腫瘍の増殖を表す（パネルＡ、平均腫瘍容積±ＳＤとして表したデータ；パネルＢ、ビヒクル、化合物４４並びに化合物４２で処理したグループの代表的なマウスの写真）。示しているように、化合物４２と４４のいずれも、いずれかの投与量で、経口経路を介して、定着したＰＣ−３腫瘍の増殖を抑制するのに有効であった。１日当たり５０ｍｇ／ｋｇで経口的に投与した化合物４２のインビボでの効力は、同じ量を腹腔内投与したＳＡＨＡの効力に匹敵し、腫瘍の増殖を、ビヒクルで処理したコントロールグループと比較して、それぞれ７０．４％並びに６９．０％減少させた。１日当たり１００ｍｇ／ｋｇで、化合物４２はＰＣ−３腫瘍の増殖をほぼ完全に抑制し（９１．７％の減少）、体重の継続測定並びに病理的検査によって確認したように明白な副作用もみられなかった。
【０１３１】
本研究の結論として、Ｏｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ
ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（オハイオ州立大獣医学部）の、専門医師会認定の獣医病理学者による、各処理群の１匹のマウスの完全病理検査を実施した。この検査は、これは臨床病理学（血液学、血清化学）ならびに完全剖検（２７種類以上の組織および器官の肉眼および顕微鏡検査）を包含した。剖検で観察された肉眼的病理学的異常は、ＳＡＨＡ処理マウス、およびＤＭＳＯ処理コントロールマウスの腹膜内の小さな接着に限られており、これは毎日腹腔内注射を行った副作用のようである。血液パラメーターは、好中球の増加を除いて正常範囲内であり、これはビヒクル処理コントロールマウス群、ならびにＳＡＨＡおよび化合物４４（５０ｍｇ／ｋｇ）処理群の双方のマウスのみに観察された。血清化学値は、ビヒクル処理マウスでは脱水症状に一致する値となったが、他の全てのマウスでは正常範囲内であった。
【０１３２】
生物学的応答とインビトロで同定された提唱される作用機構とを相関させるため、経口投与した化合物４２および腹腔内投与したＳＡＨＡが、ＰＣ−３異種移植片腫瘍内のヒストンＨ−３のアセチル化を調節する作用を、免疫ブロットによって分析した。図１７は、ビヒクル、１日当たり５０もしくは１００ｍｇ／ｋｇの経口化合物４２、あるいは１日当たり５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内ＳＡＨＡで２８日間処理した腫瘍保有マウス由来の、２つの代表的なＰＣ−３腫瘍のホモジネート内のヒストンＨ３とアセチル化Ｈ３のウエスタンブロットを、様々な容量で表す。薬剤処理グループにおいて、インビボＨＤＡＣ阻害の特性である、ヒストンＨ３のアセチル化レベルの著しい増加が認められた。
【０１３３】
インビボ実験にて、等量の血清を含まない培地とマトリゲル基底膜マトリックスとに懸濁したＰＣ−３細胞を、５〜７週齢のオスＮＣｒ胸腺欠損ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）の脇腹に皮下注射した（０．５×１０６ 細胞／０．１ｍｌ／マウス）。腫瘍容積が１７０〜２００ｍｍ３に達したときに、強制経口投与によって化合物４２もしくは４４を（１日当たり５０および１００ｍｇ／ｋｇ）、あるいは腹腔内注射によってＳＡＨＡ（１日当たり５０ｍｇ／ｋｇ）を毎日処理することを開始した（各グループにつきＮ＝６）。コントロールグループには、経口あるいは腹腔内経由でビヒクルのみ（それぞれ０．１％メチルセルロース／０．０５％ＴＷＥＥＮ８０水溶液、およびＤＭＳＯ）を与えた。処理は、コントロール群の平均腫瘍容積が約１，５００ｍｍ３に達するまで継続した。ノギスを使用して腫瘍を毎週測定し、標準公式：（幅）２×（長さ）×０．５２を用いて腫瘍の容積を算出した。体重を毎週測定し、実験期間中一定であった。
【０１３４】
乳癌細胞株、肺癌細胞株、および甲状腺癌細胞株における、化合物４２のインビトロ抗増殖効果。ＮＣＩ開発途上治療プログラム（ＤＰＴ）による６０細胞株スクリーニングによると、化合物４２は、６０細胞株全てに対し、平均ＧＩ５０（細胞増殖の５０％抑制）値が０．２μＭという強力なインビトロ抗増殖活性を示した。さらに、本発明者らは、甲状腺癌細胞株において化合物４２を試験した。代表的な乳癌細胞株、肺癌細胞株、および甲状腺癌細胞株における化合物４２の用量依存的抗増殖効果を、図１８に示す。
【０１３５】
（慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）における化合物４２のインビトロおよびインビボ抗増殖効果）
ＨＤＡＣ抑制能並びに細胞毒性促進能について、化合物４２を初代ＣＬＬ細胞にて試験した。図１９に示したように、ＨＤＡＣが抑制される１μＭ以上の濃度で、著しい細胞毒性が認められた（Ｎ＝６）。さらに、ＴＬＣ−１遺伝子移入マウスモデルを使用したインビボ予備試験によって、経口胃管注入によって１００ｍｇ／ｋｇの化合物４２を４週間、５日投与／２日非投与し、生存率が向上する傾向と顕著な毒性がないことが示された。
【０１３６】
（立体選択性）
驚くべきことに、化合物４２のＨＤＡＣ阻害活性が立体選択的であることを発見した。Ｓ異性体は、Ｒ異性体対応物よりも強力である（ＩＣ５０、１５ｎＭに対し８０ｎＭ）。
【０１３７】
まとめると、分子モデリングとコンビナトリアル化学技術とを組み合わせることにより、短鎖脂肪酸を骨格として使用して新たな種類の強力なＨＤＡＣ阻害剤を開発した。最適な薬剤である化合物４２（ＮＳＣ−Ｄ−７３１４３８）は、２５ｎＭのＩＣ５０でＨＤＡＣ活性を阻害し、これは親化合物フェニルブチレートの１０，０００倍以上の増大である。化合物４２は、これが臨床へ持ち込まれる有望な候補にする理由となるいくつかの独特の特性を示している。第一に、化合物４２は、後生的機構および細胞性機構の両方を介して、インビトロで抗増殖効果を媒介する。この特性はＴＳＡと同様であるが、ＳＡＨＡにはないものである。第二に、これは、ＭＳ−２７５およびＳＡＨＡよりも優れたインビトロおよび／またはインビボでの効力を有しながら経口的に生物学的利用可能である。第三に、１日当たり５０あるいは１００ｍｇ／ｋｇの投与量で２８日間の過程を終えても、腫瘍保有マウスにて明らかな毒性を示さない。このことは、長期投与および他の標的治療との組み合わせのための機会を与える。最後に、化合物４２は単純な構造を有し、大規模な合成に適する。
【０１３８】
（化合物４２の生成）
本発明者らは、数グラム単位で多数回、化合物４２を合成した。基本的に、４段階合成を経て調製し、全体の収量は５２％であった（図２０）。出発物質は全て容易に入手できるものであり、この合成は実験室の設定にて数百グラム単位のスケールアップが容易である。その手順を以下に記載する。中間生成物および最終産物は、クロマトグラフィーによる分離を用いなくとも９９％以上の純度で、結晶化によって反応混合物から単離され得る。全体として、合成および精製の手順は単純明快であり、この化合物の大規模生産に関して特別な問題点は無い。
【０１３９】
Ｎ−（４−アセチル−フェニル−３−メチル−２−フェニル−ブチルアミド（１））。（α−イソプロピル）−フェニル酢酸（４ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）を、塩化チオニル（３０ｍｌ）に溶解し、５０℃で１時間加熱した。溶媒を除去した後、残渣をＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解し、ｐ−アミノ安息香酸メチルエステル（３．４ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（３．５ｍｌ、２５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍｌ）溶液を、室温で撹拌しながら加えた。４時間後、真空下でＴＨＦを除去して酢酸エチル（２００ｍｌ）に溶解し、水（１００ｍｌ）と食塩水（１００ｍｌ）で続けて洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４上で有機相を乾燥し、真空下で濃縮して化合物１を得た（５．６ｇ；収量８５％）。その後精製することなく、この粗生成物を次の工程に使用した。
【０１４０】
４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）安息香酸（２）。化合物１（５．６ｇ；２０ｍｍｏｌ）を、ＫＯＨ（２１ｇ）を含有するメタノール（１５０ｍｌ）に溶解した。この混合物を２時間還流して０℃に冷却し、１２Ｎ ＨＣｌ（１２Ｎ）を滴下して生成物を沈殿させた。真空下で溶媒を除去し、冷水（１２０ｍｌ）を加えた。ろ過によって沈殿物を回収し、水で洗浄して乾燥し、化合物２を得た（５ｇ；収量８４％）
Ｎ−ベンジルオキシ−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド（３）。Ｎ２下で、２（５ｇ；１６．８ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１２０ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン（ＴＥＡ、２．５ｍｌ；１６．８ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で１０分間撹拌し、ｂｉｓ（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）塩化ホスホルジアミド（ＢＯＰ−Ｃｌ）（４．７ｇ；１８．７ｍｍｏｌ）、塩酸Ｏ−ベンジルヒドロキシアミン（２．７ｇ；１７ｍｍｏｌ）、およびＴＥＡ（７．５ｍｌ）を加えた。室温で一晩撹拌後、この溶液を真空下で濃縮し、酢酸エチル（２００ｍｌ）、次いで３％ＮａＨＣＯ３（８０ｍｌ）を加えた。有機相を分離して、それぞれ１００ｍｌの水および飽和食塩水で続けて洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥して真空下で濃縮した。この残渣（６．１ｇ、収量９０％）をその後精製することなく、直接水素化分解に使用した。
【０１４１】
Ｎ−ヒドロキシ−４−（３−メチル−２−フェニル−ブチリルアミノ）−ベンズアミド（４）。化合物３（６．１ｇ；１５．２ｍｍｏｌ）をメタノール／ＴＨＦの１：１溶液（１２０ｍｌ）に混合し、木炭上の１０％パラジウム（０．６ｇ、１０％ ｗ／ｗ）を加えた。この混合物を大気圧下で２時間、水素で処理し、ろ過した。溶媒をエバポレートし、残渣を酢酸エチルで再結晶化した。収量は４．２ｇであった（収量９０％）。
【０１４２】
本発明に従うＨＤＡＣ阻害剤の代替的な合成スキームを、図２１に図示する。
【０１４３】
本発明の他の実施形態は、この明細の考察並びにこの明細にて開示されている発明の実践から、当業者には明白であろう。この明細および実施例は、以下の請求項によって示される本発明の真の範囲および本質を伴う例示にすぎないものであるとみなされることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
【図７−５】
【図７−６】
【図７−７】
【図７−８】
【図７−９】
【図７−１０】
【図７−１１】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
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【図７−１】
【図７−２】
【図７−３】
【図７−４】
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【図７−６】
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【図８−１】
【図８−２】
【図９】
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【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２０１１−１９０２８３（Ｐ２０１１−１９０２８３Ａ）
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１４４９９３（Ｐ２０１１−１４４９９３）
【出願日】平成２３年６月２９日（２０１１．６．２９）
【分割の表示】特願２００６−５４２７０４（Ｐ２００６−５４２７０４）の分割
【原出願日】平成１６年１２月１日（２００４．１２．１）
【出願人】（５０４３２５２８７）ザ オハイオ ステート ユニバーシティー リサーチ ファウンデーション (24)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２９日（２０１１．９．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４４９９３（Ｐ２０１１−１４４９９３）
【出願日】平成２３年６月２９日（２０１１．６．２９）
【分割の表示】特願２００６−５４２７０４（Ｐ２００６−５４２７０４）の分割
【原出願日】平成１６年１２月１日（２００４．１２．１）
【出願人】（５０４３２５２８７）ザ オハイオ ステート ユニバーシティー リサーチ ファウンデーション (24)
【Ｆターム（参考）】
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