新規バクテリオファージおよびこれを含む抗菌組成物
本発明は、新規バクテリオファージに関し、さらに詳しくは、家禽チフスを起こす家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)、およびひな白痢を起こすひな白痢菌(Salmonella pullorum)を特異的に死滅させることが可能なバクテリオファージに関する。また、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病の予防または治療用組成物に関する。さらに、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、家禽用飼料、飲用水、洗浄剤および消毒剤に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規バクテリオファージに係り、さらに詳しくは、家禽チフスを起こす家禽チフス菌（Salmonella gallinarum、ＳＧ）、およびひな白痢を起こすひな白痢菌（Salmonella pullorum、ＳＰ）を特異的に死滅させることが可能なバクテリオファージに関する。また、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病の予防または治療用組成物に関する。さらに、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、家禽用飼料、飲用水、洗浄剤および消毒剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ菌は、腸内菌とのグラム陰性の通性嫌気性細菌１属（条件無酸素菌である）で無芽胞性の桿菌であり、一般に周毛性鞭毛による運動性を有する。サルモネラ菌の遺伝子塩基構成成分をみれば、ＧＣ含有程度が５０〜５２％であって、大腸菌（Escherichia coli）および赤痢菌（Shigella）と類似である。サルモネラ菌属は、ヒトにだけでなく、各種家畜に感染して多様な疾病を起こす病原性微生物である。サルモネラ種としての腸炎菌（Salmonella enterica）は、血清学的区別による区分によってGallinarum、Pullorum、Typhimurium、Enteritidis、Typhi、Choleraesuis、derbyなどを含んだ多くの血清型（serovar）を有する（Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strokebine NA. Escherichia, Shigella, Salmonella. In Murry PR, Baron EJ, et al eds Manual of clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC American Society for Microbiology 1999;467-74 ; Ryan KJ. Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9）。これらのうち、家禽に特異的なGallinarumとPullorum、ヒトに特異的なTyphi、豚に特異的なSalmonella Choleraesuisとderby、および疾病を起こす対象動物が多様な人畜共通血清型の腸炎菌（Salmonella enterica）とネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）などが疾病を起こして農家および消費者に莫大な被害を与えることもある。
【０００３】
家禽におけるサルモネラ菌が起こす疾病の例として、家禽チフス（Fowl Typhoid、ＦＴ）がある。この家禽チフスは、家禽チフス菌（Salmonella gallinarum、以下「ＳＧ」という）を病原体とし、鳥および七面鳥などの鳥類に発生する急・慢性の伝染病であって、全ての日齢に現れる敗血症による高い斃死率が特徴である。最近、ヨーロッパ、南米、アフリカおよび東南アジアなどでは発生頻度が高いと報告されており、その被害が増加している。韓国では、１９９２年以来、主に家禽チフスの発生が褐色産卵鶏農場に対して全国的に拡散してきた（Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on avian diseases. Information publication by National Veterinary Research & Quarantine Service. March, 2001; Kim Ae-Ran et al., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347~353）。
【０００４】
ひな白痢（pullorum disease）もサルモネラ菌を原因とする疾病であって、ひな白痢菌（Salmonella Pullorum、以下「ＳＰ」という。）によって発病される。ひな白痢は、日齢または季節を問わずに発病するが、初生雛時期に最も感受性が高いことが特徴である。去る１世紀の間、韓国を含んだ全世界にわたって、母鶏から卵への経卵伝染による１〜２週齢未満の日齢ひなに発生して被害が深刻であった疾病であって、去る８０年代以後にその発生が非常に減少したが、近年９０年代中盤以後さらに増加する趨勢にある（Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on avian diseases. Information publication by National Veterinary Research & Quarantine Service. March, 2001; Kim Ae-Ran et al., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347~353）。
【０００５】
韓国では、１９９０年代以後、家禽チフトとひな白痢の発病が増加している趨勢にあり、濃家に大きい経済的損失を与えている。このため、２００４年から弱毒化ＳＧ生菌ワクチンをブロイラー（broiler）に使用して家禽チフスに対して予防しようとしたが（Kim Ae-Ran et al., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347~353）、ワクチンの効果に対する使用者の疑問が提起されており、産卵鶏(Layer)では経卵伝染のおそれで生菌ワクチンの使用が許可されていない。家禽チフスとは異なり、ひな白痢は現在商業化された予防策はない。よって、家禽チフトとひな白痢を予防することが可能な方法の模索が至急な実情である。
【０００６】
一方、バクテリオファージは、特定の細菌にのみ感染して細胞の成長を統制する細菌特異的ウイルスであって、細菌宿主なしでは自己増殖が不可能である。バクテリオファージは、一本鎖或いは二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが遺伝物質として核酸を構成しており、この核酸をタンパク質外皮で包んでいる単純な構造であって、二十面体の頭に尾がある形態、二十面体の頭に尾がない形態、およびフィラメント形態の３つの基本型構造に分けられる。バクテリオファージは、形態学的な構造と遺伝物質によって分類される。二本鎖ＤＮＡを遺伝物質として有し且つ二十面体の頭からなるバクテリオファージは、尾の模様によって収縮性尾形態のマイオウイルス（Myoviridae）、長い無収縮性尾形態のシフォビラーダ（Siphoviridae）、および短い無収縮性尾形態のポドウイルス（Podoviridae）に分類される。ＲＮＡまたはＤＮＡを遺伝物質として有し且つ二十面体の頭に尾がないバクテリオファージは、頭の形態、頭の構成成分、および外皮有無によって分類される。最後に、ＤＮＡを遺伝物質として有するフィラメント形態のバクテリオファージは、大きさ、模様、外皮およびフィラメント構成成分によって分類される（H.W.Ackermann. Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000; Arch Virol (2001) 146:843-857; Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application; CRC press）。
【０００７】
細菌を感染させるとき、バクテリオファージは細菌の表面にくっ付いて自分の遺伝物質を細胞内に注入した後、溶菌性（lytic）または溶原性（lysogenic）を示す。溶菌性の場合、バクテリオファージが細胞機構を用いて自分の構造物を作った後、新規バクテリオファージ粒子を放出させることにより、細胞を破壊または溶解する。溶原性の場合、自分の核酸を細菌宿主細胞の染色体に取り入れ、細菌を破壊することなく細胞と共に複製されるが、一定の条件になると溶菌性に転換される（Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application. CRC press）。
【０００８】
バクテリオファージの発見以後、これを感染疾病治療剤として用いるための研究が行われてきたが、広範囲な宿主範囲（broad target spectrum）を有する抗生剤の特性に比べて、宿主特異性（specific target spectrum）を有するバクテリオファージが競争から外されて関心を受けていない。ところが、抗生剤の誤・濫用により抗生剤耐性菌の問題が深刻になり、食品内の抗生剤残留による人体への悪影響に対するおそれが加えられている（Cislo, M et al. Bacteriophage treatment of suppurative skin infections. Arch Immunol.Ther.Exp. 1987.2:175-183; Kim sung-hun et al., Bacteriophage; New Alternative Antibiotics. biological research information center, BRIC）。特に、動物の成長促進のために飼料に添加する抗生剤（antimicrobial growth promoters、ＡＧＰ）が抗生剤耐性誘発の主要原因であることが明らかにされることにより、ＡＧＰの使用を禁止する政策が立案され、ヨーロッパ連合では２００６年から全てのＡＧＰの使用が禁止されており、韓国では２００９年に一部ＡＧＰの使用禁止が施行されており、向後２０１３〜２０１５年には全面禁止が予想されている。
【０００９】
このような流れに基づき、バクテリオファージの研究がさらに関心を集めている。バクテリオファージを用いて大腸菌Ｏ１５７：Ｈ菌を統制するための７種のバクテリオファージが２００２年に米国特許登録（米国登録特許第６，４８５，９０２号−Use of bacteriophages for control of Escherichia coli O157）された。また、Ｎｙｍｏｘ社では、多様な種の微生物を統制する２種のバクテリオファージに対して２００５年に米国特許登録（米国登録特許第６，９４２，８５８号）を受けた。バクテリオファージに関する研究が盛んに行われるにつれて、産業界ではバクテリオファージを用いた多様な商品を開発している。ヨーロッパのＥＢＩ ｆｏｏｄ ｓｙｓｔｅｍ社では、バクテリオファージを用いて、リステリア菌による食中毒を防止する食品添加剤製品Ｌｉｓｔｅｒｉｘ−Ｐ１００を開発して最初に米国ＦＤＡの承認を受けたとともに、同一概念のリステリア菌統制食品添加型バクテリオファージ製品ＬＭＰ−１０２を開発してＧＲＡＳ（Generally regarded as safe）の認証を受けた。また、２００７年には、ＯｍｎｉＬｙｔｉｃｓ社により、屠畜過程中に大腸菌Ｏ１５７が牛肉製品を汚染させることを防ぐための洗浄液として、バクテリオファージを用いた製品が開発され、ＵＳＤ’ｓ ＦＳＩＳ（USDA’s Food Safety and Inspection Service）から承認された。Clostridium sporogenes phage NCIMB 30008 and Clostridium tyrobutiricum phage NCIMB 30008は、それぞれ２００３年と２００５年にヨーロッパで飼料保存剤として登録され、飼料内の汚染したクロストリジウム菌の統制を目的とする製品として開発された。このような研究は、バクテリオファージが、抗生剤治療の難しい細菌、或いは畜産物などを汚染させる人畜共通伝染菌などを食品段階で統制することを可能にする研究が持続的に行われていることを示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、過去抗生剤のように広範囲な宿主範囲の問題点を解決するために、家畜の主要疾病を起こすサルモネラ病原菌に感染するバクテリオファージを自然源から新規分離し、これらの形態的、生化学的および遺伝的特性を確認した結果、前記バクテリオファージが、これらの益菌には影響を与えることなく家禽チフス菌（ＳＧ）およびひな白痢菌（ＳＰ）のみを選択的に死滅させることができるうえ、耐酸性、耐熱性および耐乾性にも優れることを確認することにより、家禽チフス菌およびひな白痢菌により誘発される疾患、特に家禽チフスおよびひな白痢の予防または治療目的で用いることが可能な組成物、および家禽チフス菌（ＳＧ）およびひな白痢菌（ＳＰ）を統制することができる多様な製品、すなわち家禽飼料添加剤、飲用水、畜舎消毒剤および肉加工洗浄剤にも適用可能であることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、家禽チフス菌およびひな白痢菌に対して特異的死滅能を有する新規バクテリオファージを提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病の予防または治療用組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家禽用飼料および飲用水を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む消毒剤および洗浄剤を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む組成物を用いて、家禽における家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病としての家禽チフスまたはひな白痢を予防および治療する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の新規バクテリオファージは、家禽チフス菌およびひな白痢菌に対して特異的死滅能を有し、耐酸性、耐熱性および耐乾性にも優れるという利点を持つため、家禽チフス菌およびひな白痢菌感染性疾病である家禽チフスまたはひな白痢の予防および治療用途として利用可能であるうえ、家禽チフス菌およびひな白痢菌の統制用途としても利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１はΦＣＪ１の電子顕微鏡写真である：形態学上、正二十面体の頭（isometric capside）および無収縮性の尾（long non-contractile tail）からなる形態型（morphotype）、シフォビラーダ科（siphoviridae）に属する。
【図２】図２は分離されたバクテリオファージΦＣＪ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である：バクテリオファージのタンパク質パターンを示すもので、約３８ｋＤａと４９ｋＤａの主タンパク質が観察され、その他にも８ｋＤａ、１７ｋＤａ、８０ｋＤａおよび１００ｋＤａのタンパク質が観察される（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｅｅ−ｂｌｕｅ ｐｌｕｓ ２ ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ−ｓｔａｎｄａｒｄをマーカーとして使用した）。
【図３】図３は分離されたバクテリオファージΦＣＪ１のＰＦＧＥ結果である：ΦＣＪ１の全体ゲノムサイズは約６１ｋｂｐ程度である（Ｂｉｏ−ｒａｄ社の５ｋｂｐ ＤＮＡ ｓｉｚｅ ｓｔａｎｄａｒｄをサイズマーカーとして使用した）。
【図４】図４はΦＣＪ１のゲノムＤＮＡの各プライマーセットを用いたＰＣＲ結果を示すもので（Ａ；配列番号６と７のプライマーセットでＰＣＲ増幅、Ｂ；配列番号１０と１１のプライマーセットでＰＣＲ増幅、Ｃ；配列番号８と９のプライマーセットでＰＣＲ増幅、Ｄ；配列番号１２と１３のプライマーセットでＰＣＲ増幅）、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ ｌａｎｅは順次約６６０ｂｐ、１．３ｋｂｐ、６７０ｂｐ、および１．８ｋｂｐ程度のＰＣＲ産出物を持つ。
【図５】図５はバクテリオファージΦＣＪ１の一段増殖（one-step growth）実験結果である（Ａ；家禽チフス菌、Ｂ；ひな白痢菌）。バクテリオファージは家禽チフス菌とひな白痢菌において全て約１０２以上の放出量を有する。
【図６】図６はバクテリオファージΦＣＪ１の効率実験（efficiency test）（クリアリングアッセイ）結果である（Ａ；家禽チフス菌、Ｂ；ひな白痢菌）。他の範例；ＭＯＩ（multiply of infection：宿主細胞当りバクテリオファージが感染する数）。全て宿主細胞に対するバクテリオファージΦＣＪ１の感染比率が高いほど効率的に宿主細胞を溶菌させる。
【図７】図７はバクテリオファージΦＣＪ１の耐酸性実験結果である：ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．４、６．９、７．４、８．０および９．０における生存バクテリオファージの数を示す。対照群と比較して、ｐＨ２．５まではバクテリオファージΦＣＪ１の活性を失わないが、ｐＨ２．１では活性を完全に失う。
【図８】図８はバクテリオファージΦＣＪ１の耐熱性実験結果である：３７、４５、５３、６０、７０および８０℃で０、１０、３０、６０および１２０分毎に時間別に装置しておいたときの生存バクテリオファージ数を示す。７０℃で２時間まで露出されても活性を殆ど失わない。８０℃以上では１０分露出後に活性が減少するが、一定の比率活性を維持する。
【図９】図９はバクテリオファージΦＣＪ１の耐乾性実験結果である：スピードバキュームドライヤー（speed vacuum dryer、ＳＶＤ）を用いて６０℃で１２０分間乾燥処理したものである。乾燥の後、元来のタイターと相対的な安定性を比較したとき、活性が約１０２程度減少することが分かった。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一様態において、本発明は、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)特異的死滅能を有する新規バクテリオファージに関する。
【００１９】
本発明のバクテリオファージは、形態学上、正二十面体の頭(isometric capside)および無収縮性の尾(long non-contractile tail)を有する形態型(morphotype)シフォビラーダ科(siphoviridae)に属し、全体ゲノムサイズが６１ｋｂｐであり、３８ｋＤａおよび４９ｋＤａサイズのタンパク質を主要構造タンパク質として有することを特徴とする。
【００２０】
具体的に、本発明のバクテリオファージは、サルモネラ菌のうち、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)を選択的に感染させ、他の種は感染させない種特異性を有する。
【００２１】
本発明のバクテリオファージは、全体ゲノムサイズが６１ｋｂｐであり、配列番号１〜５に示される核酸分子を全体ゲノムの一部として含むことができる。
【００２２】
本発明において、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子における基本構成単位のヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体(analogue)を含む概念である。
【００２３】
また、本発明のバクテリオファージは、耐酸性および耐熱性の生化学的特徴を有するが、ｐＨ２．５〜ｐＨ９．０の広いｐＨ範囲で安定的に生存する耐酸性を有し、３７℃〜７０℃範囲の温度、すなわち高温でも安定的に生存することが可能な耐熱性を有する。また、高温乾燥（６０℃で１２０分）の後にも安定的に生存する耐乾性を有する。このような耐酸性、耐熱性および耐乾性は本発明のバクテリオファージを家禽のＳＧ、ＳＰ由来疾病の予防および治療用組成物、並びにバクテリオファージを有効成分として含む多様な製品に適用することにおいて、多様な温度およびｐＨ範囲の適用を可能にする。
【００２４】
本発明者は、屠鶏場近くの下水から試料を採取し、ＳＧおよびＳＰ特異的死滅能および前述した特徴を有する本発明のバクテリオファージを同定し、これをΦＣＪ１と命名し、２００８年１０月２４日に韓国微生物保存センターに寄託番号第ＫＣＣＭ１０９６９Ｐ号で寄託した。
【００２５】
本発明の具体的な実施例によれば、屠鶏場近くの下水から試料を採取し、試料から、宿主細胞ＳＰを溶菌するバクテリオファージを分離し、これらがＳＧおよびＳＰを特異的に溶菌させることができることを確認した。また、これらのバクテリオファージ（ΦＣＪ１）を電子顕微鏡によって形態学的に観察した結果、形態型(morphotype)シフォビラーダ科(siphoviridae)に属することを確認した（図１）。
【００２６】
また、ΦＣＪ１のタンパク質パターンを分析した結果、バクテリオファージの主要構造タンパク質として約３８ｋＤａと４９ｋＤａのタンパク質を含むことを確認した。
【００２７】
また、ΦＣＪ１の全体ゲノムサイズを分析した結果、約６１ｋｂｐのサイズを持つことを確認した。これらの遺伝的特性を分析した結果、配列番号１および配列番号５の核酸分子を全体ゲノムの一部として含むことを確認し、これらに基づいて他種間の類似性を比較した結果、現在まで知られているバクテリオファージとの類似性が非常に低いため、新規バクテリオファージであることを確認した。遺伝的特性をさらに具体的に分析した結果、ΦＣＪ１に特異的なプライマーセット(primer set)、すなわち配列番号６と７、配列番号１０と１１、および配列番号８と９、配列番号１２と１３、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９のプライマーセットでＰＣＲを行ったとき、特定サイズのＰＣＲ産出物である６６０ｂｐ、１．３ｋｂｐ、６７０ｂｐ、１．８ｋｂｐ、１ｋｂｐ、１ｋｐおよび１ｋｂｐ程度のＰＣＲ産出物が得られることを確認した。
【００２８】
また、ΦＣＪ１をＳＧおよびＳＰに感染させたとき、溶菌斑（ｐｈａｇｅ ｐｌａｑｕｅであって、ソフトアガ(soft agar)で一つのバクテリオファージによって宿主細胞が溶菌されて形成されるクリアゾーン(clear zone)）の大きさおよび濁度などが同一であり、これらを溶菌させることによりＳＧおよびＳＰの成長を抑制させることを確認した。
【００２９】
また、ΦＣＪ１の安定性を多様なｐｈ範囲および温度で調査した結果、ｐＨ２．５〜９．０および３７℃〜７０℃の広い範囲で安定的に生存するうえ、高温乾燥（６０℃で１２０分）の際にも安定性を維持することを確認した。これは、本発明のバクテリオファージΦＣＪ１を、ＳＧとＳＰを統制することができる多様な製品へ適用することが容易であることを意味する。
【００３０】
他の様態において、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)またはひな白痢菌(Salmonella pullorum)感染性疾病である家禽チフスまたはひな白痢の予防または治療用組成物に関する。
【００３１】
本発明のバクテリオファージは、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)を特異的に死滅させることが可能な抗菌活性を有するので、これらの菌により誘発される疾病を予防または治療するための目的で利用できる。具体的に好ましい一様態として、抗生剤を含むことができる。
【００３２】
本発明において、用語「予防」とは、組成物の投与により疾病を抑制させ或いは発病を遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、組成物の投与により前記疾病の症状が好転され或いは有利に変更される全ての行為を意味する。
【００３３】
本発明の前記組成物を適用することが可能な家禽チフス菌感染性疾病の例としては家禽チフスが好ましく、ひな白痢菌感染性疾病の例としてはひな白痢が好ましいが、これに限定されない。
【００３４】
本発明の前記組成物は、５×１０２〜５×１０１２ｐｆｕ／ｍｌのΦＣＪ１を含み、好ましくは１×１０６〜１×１０１０ｐｆｕ／ｍｌのΦＣＪ１を含む。
【００３５】
本発明の前記組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化されて食品、医薬品および飼料添加剤として提供できる。
【００３６】
本発明において、用語「薬学的に許容される担体」とは、生物体を刺激せず、投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬剤学的担体としては、滅菌および生体に適した、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分の少なくとも一つを混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤よび潤滑剤を付加的に添加して、例えば水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【００３７】
本発明の組成物を有効成分として含む経口投与剤形としては、例えば錠剤、トローチ剤、ローゼンジ(lozenge)、水溶性または油性懸濁液、調製粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップ、またはエリキシル剤に製剤化することができる。錠剤およびカプセルなどの剤形に製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤、第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチまたはサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油を含むことができ、カプセル剤形の場合、前述した物質以外にも、脂肪油などの液体担体をさらに含むことができる。
【００３８】
本発明の組成物を有効成分として含む非経口投与用剤形としては、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用形態、坐剤注入方式または呼吸器を介して吸入可能にするエアロゾル剤などのスプレイー用に製剤化することができる。注射用剤形に製剤化するためには、本発明の組成物を安定剤または緩衝剤と共に水で混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与用に製剤化することができる。エアロゾル剤などのスプレイー用に剤形化する場合、水分散された濃縮物または湿潤粉末が分散するように推進剤などが添加剤と共に配合できる。
【００３９】
本発明において、用語「抗生剤」とは、薬剤の形で動物に提供されて菌を死滅させることが可能な製剤を意味し、防腐剤、殺菌剤および抗菌剤を総称する。本発明のバクテリオファージは、既存の抗生剤に比べて家禽チフス菌およびひな白痢菌に対する特異性が非常に高いので、益菌は死滅させず、特定の病原菌のみを死滅させることができ、薬物耐性を誘導しないため、既存の抗生物質に比べて製品寿命が長い新規抗生剤として提供できる。
別の様態において、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家禽用飼料または飲用水に関する。
【００４０】
本発明の家畜用飼料は、バクテリオファージを飼料添加剤の形で別途製造して飼料に混合させ、或いは飼料製造の際に直接添加させて製造することができる。本発明の飼料内バクテリオファージは液状または乾燥状態である。乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥および凍結乾燥が使用できるが、これに限定されない。本発明のバクテリオファージは粉末形態で飼料重量の０．０５〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％の成分比で混合できる。
【００４１】
本発明におけるΦＣＪ１を含む飼料は、植物性としては穀物類、堅果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、澱粉類、粗びき粉類、穀物副産物類などがあり、動物性としてはタンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、油脂類、単細胞タンパク質、動物性プランクトン類、残りの飲食物などがあり、これに限定されない。
【００４２】
本発明におけるΦＣＪ１を含む飼料添加剤には、品質低下を防止するために添加する結合剤、乳化剤、保存剤などがあり、効用増大のために飼料に添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非タンパク窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤、オリゴー糖などがあり、その他にも、飼料混合剤などをさらに含むことができ、これに限定されない。
【００４３】
また、飲用水に混合して供給することにより、持続的に腸内の家禽チフス菌或いはひな白痢菌の数を減少させることができ、家禽チフス菌およびひな白痢菌清浄家畜の生産を模索することができる。
【００４４】
別の様態において、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む消毒剤及び洗浄剤に関する。
【００４５】
前記バクテリオファージを有効成分として含む消毒剤は、家禽チフス菌およびひな白痢菌除去のための撒布にも活用され、家禽の活動領域、家禽屠畜場、家禽斃死地域、その他の生産設備に使用でき、場所はこれに限定されない。
【００４６】
また、前記バクテリオファージを有効成分として含む洗浄剤は、生きている家禽の皮膚表面、毛および身体の各部位に付いており或いは感染可能な家禽チフス菌およびひな白痢菌の除去に使用できる。
【００４７】
別の様態において、本発明は、前記家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)またはひな白痢菌(Salmonella pullorum)感染性疾病の予防または治療用組成物を用いて、家禽における家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病である家禽チフスまたはひな白痢を予防または治療する方法に関する。
【００４８】
本発明の前記組成物は、薬学的製剤の形で動物に投与され、或いは家畜の飼料または飲用水に混合してこれを摂食させる方法によって投与されることが可能であり、好ましくは飼料添加剤の形で飼料に混合されて投与できる。
【００４９】
本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達することが可能な限りは、経口または非経口の多様な経路を介して投与でき、具体的に、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、経鼻、吸入などを介して通常の方式で投与できる。
【００５０】
本発明の治療方法は、本発明の組成物を薬学的有効量で投与することを含む。適切な総１日使用量が正しい医学的判断範囲内において処置医によって決定できることは、当業者には自明である。特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共にまたは同時に使用される薬物などの多様な因子、および医薬分野によく知られている類似因子に応じて異ならせて適用することが好ましい。
【００５１】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。ところが、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５２】
〔発明の様態〕
〔実施例１：サルモネラ菌に感染するバクテリオファージの分離〕
（１−１．バクテリオファージのスクリーニングおよび単一バクテリオファージの分離）
屠鶏場および近くの下水終末処理場の試料５０ｍｌを遠心分離管に移して４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を０．４５μｍのフィルターを用いて濾過した。１５０μＬのＳＴ振とう培養液（ＯＤ６００＝２）と２ｍＬの１０×Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（以下「ＬＢ培地」という。トリプトン１０；酵母抽出液５ｇ；ＮａＣｌ１０ｇ；最終体積が１Ｌとなるように）に１８ｍＬの試料濾過液を混ぜた。これを３７℃で１８時間培養した後、培養液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上澄み液を０．２μｍのフィルターを用いて濾過した。ＬＢプレートに３ｍＬの０．７％寒天（ｗ／ｖ）、１５０μＬのＳＴ振とう培養液（ＯＤ６００＝２）を混ぜ注いで固めた後、その上に１０μＬの試料培養濾過液を滴下して３７℃で１８時間培養した（０．７％寒天を用いて固体培地上に付着するものをｔｏｐ−ａｇａｒとし、ｔｏｐ−ａｇａｒで成長する宿主細胞を用いてバクテリオファージが溶菌することを観察する方法をソフトアガオーバーレイ(soft agar overlay)方法と定義する）。
【００５３】
溶菌の起った試料培養濾過液を適当に希釈して１５０μＬのＳＰ振とう培養液（ＯＤ６００＝２）と混ぜた後、ソフトアガオーバーレイを行って単一溶菌斑を獲得した。一つの溶菌斑が一つのバクテリオファージからなっていると見なすから、単一バクテリオファージを純粋分離するために一つの溶菌斑を取って４００μＬのＳＭ溶液（ＮａＣｌ、５．８ｇ；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、２ｇ；１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＬ；Ｈ２Ｏ、最終体積が１Ｌとなるように）に入れて４時間室温に静置して単一バクテリオファージを純粋分離した。分離されたバクテリオファージを大量確保するために単一バクテリオファージ溶液の上澄み液１００μＬを取った後、１２ｍＬの０．７％寒天および５００μＬのＳＰ振とう培養液と混合して、直径１５０ｍｍのＬＢ培地でソフトアガオーバーレイを実施した。完全に溶菌の起ったプレートに１５ｍＬのＳＭ溶液を注いだ後、４時間室温で若干振とうしてトップアガ内のバクテリオファージを流出させた。バクテリオファージの流出したＳＭ溶液を回収した後、最終体積の１％となるようにクロロホルムを添加して１０分間よく混ぜた後、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ここで、得られた上澄み液を０．２μｍのフィルターで濾過して冷蔵保管した。
【００５４】
（１−２．バクテリオファージの大量培養）
選別されたバクテリオファージをＳＰを用いて大量培養した。ＳＰを振とう培養して１．５×１０１０ｃｆｕ(colony forming unit)となるように分注して４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、これを４ｍＬのＳＭ溶液に再浮遊させた。ここに７．５×１０７ｐｆｕ(plaque forming unit)のバクテリオファージを接種してＭＯＩ(multiplicity of infection)＝０．００５に作った後、３７℃で２０分間静置した。これを１５０ｍＬのＬＢ培地が入ったフラスコに接種した後、５時間３７℃で培養した。最終体積の１％となるようにクロロホルムを添加し、２０分間振とうした。ＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡをそれぞれ最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加し、３０分間３７℃で静置させた。最終濃度がそれぞれ１Ｍと１０％（ｗ／ｖ）になるようにＮａＣｌおよびＰＥＧ(polyethylene glycol)を入れた後、４℃で３時間追加静置させた。４℃、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄み液を除去した。５ｍＬのＳＭ溶液に沈殿物を再浮遊させた後、２０分間室温に静置させた。ここに４ｍＬのクロロホルムを添加した後、よく攪拌し、４℃、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み液を０．２μｍのフィルターで濾過して、グリセロール密度勾配法（密度：４０％、５％グリセロール）を用いた超遠心分離（３５，０００ｒｐｍ、１時間、４℃）によってΦＣＪ１を精製した。精製したΦＣＪ１は３００μＬのＳＭ溶液に再浮遊した後、タイターを測定した。
【００５５】
〔実施例２：ΦＣＪ１のサルモネラ菌感染有無の調査〕
選別されたバクテリオファージがＳＰ以外に他種のサルモネラ菌に対して溶菌活性を示すかを検査するために、他種のサルモネラ菌に交差感染を試みた。その結果、ΦＣＪ１はＳＴ(Salmonella enterica Serotype Typhimurium)、ＳＥ(Salmonella enterica Serotype Enteritis)、ＳＣ(Salmonella enterica Serotype Choleraesuis)、ＳＤ(Salmonella enterica Serotype Derby)、ＳＡ(Salmonella enterica subsp. Arizonae)、およびＳＢ(Salmonella enterica subsp. Bongori)には感染せず、ＳＧとＳＰに特異的に感染した（実施例１３参照）。その結果は表１のとおりである。ＳＧを宿主として用いて生産したΦＣＪ１は、ＳＰで生産されたものと同一の溶菌斑模様、形成された溶菌の透明性程度、タンパク質パターンおよびゲノムサイズを示した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
〔実施例３：ΦＣＪ１の形態観察〕
精製されたΦＣＪ１を０．０１％のゼラチン溶液に希釈した後、２．５％のグルタルアルデヒド溶液で固定した。これをｃａｒｂｏｎ−ｃｏａｔｅｄ ｍｉｃａ ｐｌａｔｅ（ｃａ．２．５×２．５ｍｍ）に滴下して１０分間適応させた後、滅菌蒸留水で洗浄した。カーボンフィルムを銅グリッド(copper grid)に挿入して４％の酢酸ウラニル(uranyl acetate)で３０〜６０秒間染色し、乾燥を行った後、透過電子顕微鏡（ＪＥＭ−１０１１トランスミッションエレクトロンマイクロスコープ(transmission electron microscope)、８０ｋＶ、倍率×１２０，０００〜×２００，２０００）で検鏡した。その結果、分離されたΦＣＪ１の形態は図１のとおりであり、形態学上、正二十面体の頭と無収縮性の尾からなる形態型シフォビラーダ科(siphoviridae)に属することが分かった。
【００５８】
〔実施例４：ΦＣＪ１のタンパク質パターン分析〕
１０１１ｐｆｕ／ｍＬタイターの精製されたΦＣＪ１溶液１５μＬと５Ｘ ＳＤＳ試料溶液３μＬを混ぜた後、５分間沸騰した。４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ゲルでΦＣＪ１の全体タンパク質を展開した。クマシーブルー染色溶液を用いてゲルを１時間常温で染色した。その結果、タンパク質パターンは、図２に示すように３８ｋＤａと４０ｋＤａの主要タンパク質が観察され、その他にも８ｋＤａ、１７ｋＤａ、８０ｋＤａおよび１００ｋＤａのタンパク質が観察されたことを示す。
【００５９】
〔実施例５：ΦＣＪ１の全体ゲノムＤＮＡサイズの分析〕
超遠心分離によって精製されたΦＣＪ１のゲノムＤＮＡを抽出した。具体的に精製されたΦＣＪ１培養液にＥＤＴＡ(ethylenediaminetetraacetic acid（ｐＨ８．０）)、プロテイナーゼＫ、およびＳＤＳ(sodium dodecyl sulfate)をそれぞれ最終濃度２０ｍＭ、５０μｇ／ｍＬ、および０．５％（ｗ／ｖ）となるように添加した後、５０℃で１時間静置した。同量のフェノール（ｐＨ８．０）を添加し、よく混ぜた後、室温で１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液を収得して同量のＰＣ（フェノール：クロロホルム＝１：１）を添加し、よく混ぜた後、室温で１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、上澄み液を収得して同量のクロロホルムをよく混ぜた後、室温で１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液を収得した後、３Ｍの酢酸ナトリウムを全体体積の１／１０で混ぜ、２倍量の冷たい９５％のエタノールを添加した後、−２０℃で１時間静置させた。しかる後に、０℃で１０分間１２０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を完全に除去し、しかる後に、底部のＤＮＡを５０μＬのＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））溶液に溶かした。抽出したＤＮＡを１０倍希釈してＯＤ２６０で吸光度を測定することにより濃度を測定した。全体ゲノムＤＮＡ１μｇを１％ＰＦＧＥ(pulse-field gel electrophoresis)アガロースゲルにロードした後、ＢＩＯＲＡＤ ＰＦＧＥシステムの７番プログラム(size range 25-100 kbp; switch time ramp 0.4-2.0 seconds, linear shape; forward voltage 180 V; reverse voltage 120 V)を用いて常温で２０時間展開した。ΦＣＪ１のゲノムＤＮＡのサイズは図３に示すように約６１ｋｂｐ程度であった。
【００６０】
〔実施例６：ΦＣＪ１の遺伝的特性分析〕
分離したΦＣＪ１の遺伝的特性を調べるために、ΦＣＪ１のゲノムＤＮＡ５μｇをＥｃｏＲＶとＳｃａＩ制限酵素で同時に処理した。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をＥｃｏＲＶ制限酵素で切断した後、ＣＩＰ(calf intestinal alkaline phosphatase)処理したものを使用した。ｇＤＮＡ切片とベクターの量が３：１となるように反応条件を合わせて混ぜた後、１６℃で５時間ライゲーションを行った。これを、大腸菌の一種であるＤＨ５α細胞に導入させた。このように形質転換された転換体をアンピシリンおよびＸ−ｇａｌ(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)含有のＬＢ平板培地にプレートし、通常の青白コロニー選別法によって２つのコロニーを選別した。選別されたコロニーをアンピシリン含有の培養培地で１６時間振とう培養した。ここで、プラスミド精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてプラスミドを抽出した。
【００６１】
前記プラスミドのクローニング有無をＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースのプライマーセットを用いてＰＣＲによって確認し、挿入断片のサイズが１ｋｂｐ以上となるものを選んでＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーセットを用いて塩基配列を分析した。こうして得た遺伝子塩基配列が配列番号１〜５に示されている。その解読塩基配列の類似性をＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｘプログラムを用いて分析した結果が下記表２に示されている。
【００６２】
表２に示すように、ΦＣＪ１は、配列番号１の解読塩基配列の前部は大腸菌バクテリオファージｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＴＬＳのＤｃｍと３６％の類似性を示し、後部はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ｐｈａｇｅ ＢｃｅｐＮａｚｇｕｌのＤＲ０５３０−ｌｉｋｅ ｐｒｉｍａｓｅと３１％の類似性を示した。配列番号１の解読塩基配列の場合には、逆方向にサルモネラファージＤｅｔ７のテールスパイクプロテイン(tail spike protein)と３４％の類似性を示した。このように解読塩基配列が公知のバクテリオファージのタンパク質と相同性が高くなかった。しかも、配列番号１〜５のＤＮＡ塩基配列をＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｎプログラムを用いて分析した結果、塩基配列の相同性を示さなかった。よって、ΦＣＪ１は新規バクテリオファージと判断された。
【００６３】
【表２】
【００６４】
〔実施例７：ΦＣＪ１特異的プライマー塩基配列の製作〕
ΦＣＪ１を同定するために、ΦＣＪ１特異的プライマーを、配列番号１に基づいて配列番号６と７、配列番号１０と１１のプライマーセットを製作し、配列番号２に基づいて配列番号８と９、配列番号１２と１３のプライマーセットを製作した。また、配列番号３、配列番号４および配列番号５に基づいてそれぞれ配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、および配列番号１８と１９のプライマーセットを製作してＰＣＲを行った。０．１μｇのバクテリオファージ全体ゲノムＤＮＡと０．５ｐｍｏｌのプライマーをｐｒｅ−ｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）に添加し、最終体積が２０μＬとなるように合わせた。これを変性(denaturation)；９４℃３０秒、アニーリング(annealing)；６０℃で３０秒、重合(polymeration)；７２℃で１分の条件で３０サイクルＰＣＲを行った。その結果、配列番号６と７、配列番号１０と１１をプライマーセットとして用いた場合、図４に示すようにそれぞれ約６６０ｂｐと１．３ｋｂｐ程度のＰＣＲ産物を得た。配列番号８と９、および配列番号１２と１３をプライマーセットとして用いた場合も、図４に示すようにそれぞれ６７０ｂｐと１．８ｋｂｐ程度のＰＣＲ産物を得た。また、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、および配列番号１８と１９をプライマーセットとして用いた場合、図示しなかったが、全て１ｋｂｐ程度のＰＣＲ産物を収得した。
【００６５】
〔実施例８：バクテリオファージの感染能力の確認〕
ΦＣＪ１の感染能力を確認するために、一段増殖(one-step growth)実験を行った。
【００６６】
ＳＧ培養液（ＯＤ６００＝０．５）５０ｍＬを４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、新しいＬＢ培地２５ｍＬに再浮遊させた。ここに分離したバクテリオファージをＭＯＩ＝０．０００５で接種した後、５分間静置させた。反応液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を分離した後、これをさらに新しいＬＢ培地に再浮遊させた。その後、３７℃で培養し、１０分の間隔で２つずつ培養液を収集して１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上澄み液のみを取った。処理した実験培養液を段階希釈し、ソフトアガオーバーレイ方法で各段階の希釈液を１０μＬずつ滴下させた後、３７℃で１８時間培養して溶菌有無によってタイターを測定した。ΦＣＪ１はＳＧとＳＰに同時感染するバクテリオファージなので、このような実験をＳＰに対しても同様に行った。ＳＧとＳＰを宿主細胞として用いたとき、一段増殖結果をみれば、放出量(burst size)は１０２以上であることが分かった。詳細な結果は図５のとおりである。
【００６７】
〔実施例９：バクテリオファージの効能確認〕
ΦＣＪ１の液体培地上におけるＳＧに対する効能を調べるために多様な条件でクリアリングアッセイ(clearing assay)実験を行った。２５０ｍＬのフラスコに３５ｍＬのＬＢ培地を入れた後、分離されたバクテリオファージ単一溶菌斑：ＳＧの細胞数比率を１：１、１：１００、１：１００００の条件で接種した。接種の後、３７℃で２００ｒｐｍにて培養し、時間別にＯＤ６００の変化を測定した。その結果、ΦＣＪ１の溶菌によるＳＧとＳＰの成長抑制を観察することができた。実験結果は図６に示されている。
【００６８】
〔実施例１０：バクテリオファージのｐＨによる安定性の調査〕
ΦＣＪ１が鶏の胃内の低いｐＨで安定性を保有するかを確認するために、多様なｐＨ範囲（ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５．６．４、６．９、７．４、８．２および９．０）で安定性調査実験を行った。多様なｐＨ溶液（酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ２．１、ｐＨ４．０、ｐＨ５．５およびｐＨ６．４）、クエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ２．５、ｐＨ３．０およびｐＨ３．５）、リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ６．９およびｐＨ７．４）、およびトリス溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２およびｐＨ９．０）をそれぞれ２Ｍに製作した。１００μＬのｐＨ溶液と同量の１．０×１０１１ｐｆｕ／ｍｌタイターのバクテリオファージ溶液を混ぜて各ｐＨ溶液の濃度が１Ｍとなるようにした後、１時間常温で静置した。これらを段階希釈し、ソフトアガオーバーレイ方法を用いて各段階の希釈液を１０μＬずつ滴下した後、３７℃で１８時間培養して溶菌有無によってタイターを測定した。元来のΦＣＪ１のタイターと比較してｐＨ変化によるタイター変化によって相対的安定性を確認したが、実験結果、ｐＨ２．５までは活性を失わず非常に安定的であることが分かった。しかし、ｐＨ２．１では活性を失った。その結果を図７に示した。
【００６９】
〔実施例１１：バクテリオファージの温熱度による安定性の調査〕
バクテリオファージの製品剤形のうち、飼料添加剤として用いる場合、バクテリオファージの剤形過程で発生する熱に対する安全性を確認するための実験を行った。１．０×１０１１ｐｆｕ／ｍＬタイターのΦＣＪ１の溶液２００μＬを３７℃、４５℃、５３℃、６０℃、７０℃および８０℃の温度条件下でそれぞれ０分、１０分、３０分、６０分および１２０分静置させた。処理した実験培養液を段階希釈し、ソフトアガオーバーレイ方法を用いて各段階の希釈液を１０μＬずつ滴下した後、３７℃で１８時間培養して溶菌有無によってタイターを測定した。元来のΦＣＪ１のタイター、温度および露出時間の変化によるて相対的安定性を確認したが、７０℃で２時間まで露出されても活性を多く失わないことが分かった。しかし、８０℃以上では１０分間露出の後に活性が急激に減少するが、一定の比率活性を維持する。その結果を図８に示した。
【００７０】
〔実施例１２：バクテリオファージの乾燥に対する安定性の調査〕
バクテリオファージの製品剤形のうち、飼料添加剤として用いる場合、バクテリオファージの剤形過程で発生する乾燥条件に対する安全性を確認した。耐熱性確認実験によって導出した結果に基づき、６０℃１２０分の条件下における高温乾燥実験を行った。１．０×１０１１ｐｆｕ／ｍＬタイターのΦＣＪ１の溶液２００μＬをスピードバキューム（ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃｕｕｍ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ５３０１、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて乾燥させた。乾燥の後に得られたペレットを、初期溶液と同量のＳＭ溶液を入れて４℃で１日間完全に再浮遊させた。処理した実験培養液を段階希釈して、ソフトアガオーバーレイ方法で各段階の希釈液を１０μＬずつ滴下させた後、３７℃で１８時間培養して溶菌有無によってタイターを測定した。乾燥の後、元来のタイターと相対的な安定性を比較したとき、活性が約１０２程度減少することが分かった。その結果を図９に示した。
【００７１】
〔実施例１３：バクテリオファージの野生分離株ＳＧ／ＳＰに対する感染範囲の調査〕
ΦＣＪ１が、実験に使用されたＳＧ（ＳＧ ＲＫＳ４９９４）およびＳＰ（ＳＰＲＫＳ２４２）以外に、ソウル大学校獣医科大学鳥類疾病学室で分離した韓国の野生分離株ＳＧ、ＳＰそれぞれ１５株と５株に対して溶菌活性を持つか否かについて確認した。各菌株の振とう培養液（ＯＤ６００＝２）１５０μＬを混ぜてソフトアガオーバーレイ方法を行い、１０１０ｐｆｕ／ｍＬタイターのΦＣＪ１の溶液を１０μＬずつ滴下した後、３７℃で１８時間培養して溶菌斑形成有無を観察した。野生分離株ＳＧとＳＰに対して１００％溶菌率を示すことを確認することができた。その結果は下記表３のとおりである。
【００７２】
【表３】
【００７３】
〔実施例１４：バクテリオファージの毒性評価〕
家禽チフス予防用バクテリオファージとしてΦＣＪ１の産卵鶏における安全性、残留量および卵継代評価を実施して毒性評価を行った。産卵鶏実験はさらに３つのグループに分けて病原性試験、卵継代試験、並びに病変有無および盲腸糞の濃度調査を行った。
【００７４】
病原性試験は、産卵中の褐色産卵鶏１３羽をΦＣＪ１投与群に８羽、対照群に５羽割り当てて行った。投与群にはΦＣＪ１を飼料と混合して供給（飼料ｇ当り１０８ｐｆｕ以上）し、対照群にはファージを含有していない試料を供給し、産卵率および臨床症状有無をファージ投与時点から３週間観察した。その結果は表４に示すとおりであり、ΦＣＪ１投与群は約４２％、対照群は約５０％の産卵率を示した。また、ファージ投与後の臨床症状観察結果、およびΦＣＪ１投与後２４日間の観察結果によれば、呼吸器および消化器の異常症状は観察されておらず、活動性においても対照群との差異を示さないため、ΦＣＪ１投与による問題はないことを確認した。
【００７５】
卵継代試験は、ΦＣＪ１投与３日、６日、９日に集卵した卵１０個内外の表面を７０％エタノールで洗浄し破卵して卵黄と卵百を混合した後、混合液５ｍＬを４５ｍＬのＰＢＳで１０−１、１０−２、１０−３まで希釈した。各希釈液２５ｍＬにＳＮＵＳＧ１９７ １０６ｃｆｕを添加して３７℃で３時間培養した後、遠心分離で菌体分離した。５００μＬの上澄み液と１００μＬのＳＮＵＳＧ０１９７（１０９ｃｆｕ／ｍＬ）を混合してｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ａｇａｒ ｐｌａｔｅにトップアガオーバーレイ方法で塗抹し、３７℃で１８時間培養した後、溶菌斑(plaque)の数から卵１ｍＬ当たりファージの数を計算した。表５に示すように、３日、６日、９日に集卵した卵１７個におけるΦＣＪ１の有無を検査した結果、ΦＣＪ１が分離されなかった。
【００７６】
産卵鶏における最後の実験として、ΦＣＪ１投与時の病変有無および盲腸糞内のΦＣＪ１濃度を調査した。ΦＣＪ１投与３週後に試験鶏を安楽死させ、剖検して肝臓、脾臓、腎臓および卵胞の肉眼的病所有無を観察し、肝臓試料を綿棒で無菌的に採取してＭａｃ Ｃｏｎｋｅｙ寒天培地に塗抹した後、家禽チフス菌の有無も確認した。また、盲腸糞を採取し、投与したΦＣＪ１濃度を個体別に測定したが、これは、盲腸糞１ｇを９ｍＬのＰＢＳに浮遊させ、１５０００ｇで３０分間遠心分離した後、上澄み液１ｍＬをＰＢＳで１０−１〜１０−４まで希釈させた後、５００μＬの希釈液と１００μＬのＳＧＯ１９７（１０９ｃｆｕ／ｍＬ）を混合して１０×ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ寒天培地にトップアガオーバーレイ方法で塗抹した。これを３７℃で１８時間培養した後、形成された溶菌斑の数を数えて段階別希釈倍数を考慮して盲腸糞グラム当たりバクテリオファージ数を算出した。その結果、観察期間に特異的な臨床症状が観察されておらず、盲腸糞では盲腸糞ｇ当たり約３．７×１０４ｐｆｕのΦＣＪ１が測定された。これにより、飼料として供給したファージが胃を通過して腸にまで到達していることが分かった。
【００７７】
バクテリオファージの内部臓器分布調査は、１０羽の１１日齢ＳＰＦ雛を５羽ずつ２グループに分け、投与群にはΦＣＪ１飼料ｇ当りそれぞれ１０８ｐｆｕを添加した飼料を、対照群にはΦＣＪ１を添加していない飼料をそれぞれ３日間供給した後、犠牲させて肝臓、腎臓および盲腸糞を採取してΦＣＪ１の有無を確認した。採取した肝臓、腎臓および盲腸糞と同量のＰＢＳを添加して乳化させた後、肝臓は１ｍＬを採取し、腎臓と盲腸糞は全てを１．５ｍＬのチューブに入れて１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。１ｍＬの上澄み液をＰＢＳで１０−１〜１０−４まで希釈した後、５００μＬの希釈液と１００μＬのＳＧ０１９７（１０９ｃｆｕ／ｍＬ）を混合して１０×ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ寒天培地にトップアガオーバーレイ方法で塗抹した。これを３７℃で１８時間培養した後、形成された溶菌斑の数を数えて段階別希釈倍数を考慮し、盲腸糞ｇ当たりバクテリオファージ数を算出した。その結果は、表６に示すように、肝臓および腎臓ではΦＣＪ１が観察されておらず、盲腸糞でのみ観察された。
【００７８】
【表４】
【００７９】
【表５】
【００８０】
【表６】
【００８１】
〔実施例１５：バクテリオファージの効能評価〕
ΦＣＪ１のＳＧに対する予防および治療程度の可能性を確認するために、鶏で効能評価実験を行った。
【００８２】
２０羽の１日齢褐色産卵鶏を１０羽ずつ１０個の試験群（ΦＣＪ１投与群＋無投与攻撃群１つ）に割り当て、試験鶏に、ΦＣＪ１をｇ当り１０７ｐｆｕで混合した飼料およびｍＬ当り１０７ｐｆｕで混合した飲み水を１週間供給し、１週目に羽当たりＳＧ０１９７ １０６ｃｆｕと各ファージ１０７ｐｆｕ（ＭＯＩ＝１０）を５００μＬのＴＳＢに混合した後、氷上に放置してから１時間以内に口腔を介して接種した。２週間斃死率を観察し、生存した試験鶏を剖検して病変有無を確認し、細菌を分離した。その結果は表７のとおりである。ΦＣＪ１投与群は無投与群に比べて有意的に高い（Ｐ＜０．０５）防御率を示すことが分かった。
【００８３】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明のバクテリオファージは、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)に対して特異的死滅能を有するため、益菌を死滅させず、耐酸性、耐熱性および耐乾性にも優れるので、家禽チフス菌およびひな白痢菌感染性疾病、特に家禽チフスおよびひな白痢の予防または治療目的の治療剤、抗生剤、家畜用飼料などに広範囲に利用できる。
【受託番号】
【００８５】
ＫＣＣＭ１０９６９Ｐ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規バクテリオファージに係り、さらに詳しくは、家禽チフスを起こす家禽チフス菌（Salmonella gallinarum、ＳＧ）、およびひな白痢を起こすひな白痢菌（Salmonella pullorum、ＳＰ）を特異的に死滅させることが可能なバクテリオファージに関する。また、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病の予防または治療用組成物に関する。さらに、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、家禽用飼料、飲用水、洗浄剤および消毒剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
サルモネラ菌は、腸内菌とのグラム陰性の通性嫌気性細菌１属（条件無酸素菌である）で無芽胞性の桿菌であり、一般に周毛性鞭毛による運動性を有する。サルモネラ菌の遺伝子塩基構成成分をみれば、ＧＣ含有程度が５０〜５２％であって、大腸菌（Escherichia coli）および赤痢菌（Shigella）と類似である。サルモネラ菌属は、ヒトにだけでなく、各種家畜に感染して多様な疾病を起こす病原性微生物である。サルモネラ種としての腸炎菌（Salmonella enterica）は、血清学的区別による区分によってGallinarum、Pullorum、Typhimurium、Enteritidis、Typhi、Choleraesuis、derbyなどを含んだ多くの血清型（serovar）を有する（Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strokebine NA. Escherichia, Shigella, Salmonella. In Murry PR, Baron EJ, et al eds Manual of clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC American Society for Microbiology 1999;467-74 ; Ryan KJ. Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9）。これらのうち、家禽に特異的なGallinarumとPullorum、ヒトに特異的なTyphi、豚に特異的なSalmonella Choleraesuisとderby、および疾病を起こす対象動物が多様な人畜共通血清型の腸炎菌（Salmonella enterica）とネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）などが疾病を起こして農家および消費者に莫大な被害を与えることもある。
【０００３】
家禽におけるサルモネラ菌が起こす疾病の例として、家禽チフス（Fowl Typhoid、ＦＴ）がある。この家禽チフスは、家禽チフス菌（Salmonella gallinarum、以下「ＳＧ」という）を病原体とし、鳥および七面鳥などの鳥類に発生する急・慢性の伝染病であって、全ての日齢に現れる敗血症による高い斃死率が特徴である。最近、ヨーロッパ、南米、アフリカおよび東南アジアなどでは発生頻度が高いと報告されており、その被害が増加している。韓国では、１９９２年以来、主に家禽チフスの発生が褐色産卵鶏農場に対して全国的に拡散してきた（Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on avian diseases. Information publication by National Veterinary Research & Quarantine Service. March, 2001; Kim Ae-Ran et al., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347~353）。
【０００４】
ひな白痢（pullorum disease）もサルモネラ菌を原因とする疾病であって、ひな白痢菌（Salmonella Pullorum、以下「ＳＰ」という。）によって発病される。ひな白痢は、日齢または季節を問わずに発病するが、初生雛時期に最も感受性が高いことが特徴である。去る１世紀の間、韓国を含んだ全世界にわたって、母鶏から卵への経卵伝染による１〜２週齢未満の日齢ひなに発生して被害が深刻であった疾病であって、去る８０年代以後にその発生が非常に減少したが、近年９０年代中盤以後さらに増加する趨勢にある（Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on avian diseases. Information publication by National Veterinary Research & Quarantine Service. March, 2001; Kim Ae-Ran et al., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347~353）。
【０００５】
韓国では、１９９０年代以後、家禽チフトとひな白痢の発病が増加している趨勢にあり、濃家に大きい経済的損失を与えている。このため、２００４年から弱毒化ＳＧ生菌ワクチンをブロイラー（broiler）に使用して家禽チフスに対して予防しようとしたが（Kim Ae-Ran et al., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347~353）、ワクチンの効果に対する使用者の疑問が提起されており、産卵鶏(Layer)では経卵伝染のおそれで生菌ワクチンの使用が許可されていない。家禽チフスとは異なり、ひな白痢は現在商業化された予防策はない。よって、家禽チフトとひな白痢を予防することが可能な方法の模索が至急な実情である。
【０００６】
一方、バクテリオファージは、特定の細菌にのみ感染して細胞の成長を統制する細菌特異的ウイルスであって、細菌宿主なしでは自己増殖が不可能である。バクテリオファージは、一本鎖或いは二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡが遺伝物質として核酸を構成しており、この核酸をタンパク質外皮で包んでいる単純な構造であって、二十面体の頭に尾がある形態、二十面体の頭に尾がない形態、およびフィラメント形態の３つの基本型構造に分けられる。バクテリオファージは、形態学的な構造と遺伝物質によって分類される。二本鎖ＤＮＡを遺伝物質として有し且つ二十面体の頭からなるバクテリオファージは、尾の模様によって収縮性尾形態のマイオウイルス（Myoviridae）、長い無収縮性尾形態のシフォビラーダ（Siphoviridae）、および短い無収縮性尾形態のポドウイルス（Podoviridae）に分類される。ＲＮＡまたはＤＮＡを遺伝物質として有し且つ二十面体の頭に尾がないバクテリオファージは、頭の形態、頭の構成成分、および外皮有無によって分類される。最後に、ＤＮＡを遺伝物質として有するフィラメント形態のバクテリオファージは、大きさ、模様、外皮およびフィラメント構成成分によって分類される（H.W.Ackermann. Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000; Arch Virol (2001) 146:843-857; Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application; CRC press）。
【０００７】
細菌を感染させるとき、バクテリオファージは細菌の表面にくっ付いて自分の遺伝物質を細胞内に注入した後、溶菌性（lytic）または溶原性（lysogenic）を示す。溶菌性の場合、バクテリオファージが細胞機構を用いて自分の構造物を作った後、新規バクテリオファージ粒子を放出させることにより、細胞を破壊または溶解する。溶原性の場合、自分の核酸を細菌宿主細胞の染色体に取り入れ、細菌を破壊することなく細胞と共に複製されるが、一定の条件になると溶菌性に転換される（Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application. CRC press）。
【０００８】
バクテリオファージの発見以後、これを感染疾病治療剤として用いるための研究が行われてきたが、広範囲な宿主範囲（broad target spectrum）を有する抗生剤の特性に比べて、宿主特異性（specific target spectrum）を有するバクテリオファージが競争から外されて関心を受けていない。ところが、抗生剤の誤・濫用により抗生剤耐性菌の問題が深刻になり、食品内の抗生剤残留による人体への悪影響に対するおそれが加えられている（Cislo, M et al. Bacteriophage treatment of suppurative skin infections. Arch Immunol.Ther.Exp. 1987.2:175-183; Kim sung-hun et al., Bacteriophage; New Alternative Antibiotics. biological research information center, BRIC）。特に、動物の成長促進のために飼料に添加する抗生剤（antimicrobial growth promoters、ＡＧＰ）が抗生剤耐性誘発の主要原因であることが明らかにされることにより、ＡＧＰの使用を禁止する政策が立案され、ヨーロッパ連合では２００６年から全てのＡＧＰの使用が禁止されており、韓国では２００９年に一部ＡＧＰの使用禁止が施行されており、向後２０１３〜２０１５年には全面禁止が予想されている。
【０００９】
このような流れに基づき、バクテリオファージの研究がさらに関心を集めている。バクテリオファージを用いて大腸菌Ｏ１５７：Ｈ菌を統制するための７種のバクテリオファージが２００２年に米国特許登録（米国登録特許第６，４８５，９０２号−Use of bacteriophages for control of Escherichia coli O157）された。また、Ｎｙｍｏｘ社では、多様な種の微生物を統制する２種のバクテリオファージに対して２００５年に米国特許登録（米国登録特許第６，９４２，８５８号）を受けた。バクテリオファージに関する研究が盛んに行われるにつれて、産業界ではバクテリオファージを用いた多様な商品を開発している。ヨーロッパのＥＢＩ ｆｏｏｄ ｓｙｓｔｅｍ社では、バクテリオファージを用いて、リステリア菌による食中毒を防止する食品添加剤製品Ｌｉｓｔｅｒｉｘ−Ｐ１００を開発して最初に米国ＦＤＡの承認を受けたとともに、同一概念のリステリア菌統制食品添加型バクテリオファージ製品ＬＭＰ−１０２を開発してＧＲＡＳ（Generally regarded as safe）の認証を受けた。また、２００７年には、ＯｍｎｉＬｙｔｉｃｓ社により、屠畜過程中に大腸菌Ｏ１５７が牛肉製品を汚染させることを防ぐための洗浄液として、バクテリオファージを用いた製品が開発され、ＵＳＤ’ｓ ＦＳＩＳ（USDA’s Food Safety and Inspection Service）から承認された。Clostridium sporogenes phage NCIMB 30008 and Clostridium tyrobutiricum phage NCIMB 30008は、それぞれ２００３年と２００５年にヨーロッパで飼料保存剤として登録され、飼料内の汚染したクロストリジウム菌の統制を目的とする製品として開発された。このような研究は、バクテリオファージが、抗生剤治療の難しい細菌、或いは畜産物などを汚染させる人畜共通伝染菌などを食品段階で統制することを可能にする研究が持続的に行われていることを示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、過去抗生剤のように広範囲な宿主範囲の問題点を解決するために、家畜の主要疾病を起こすサルモネラ病原菌に感染するバクテリオファージを自然源から新規分離し、これらの形態的、生化学的および遺伝的特性を確認した結果、前記バクテリオファージが、これらの益菌には影響を与えることなく家禽チフス菌（ＳＧ）およびひな白痢菌（ＳＰ）のみを選択的に死滅させることができるうえ、耐酸性、耐熱性および耐乾性にも優れることを確認することにより、家禽チフス菌およびひな白痢菌により誘発される疾患、特に家禽チフスおよびひな白痢の予防または治療目的で用いることが可能な組成物、および家禽チフス菌（ＳＧ）およびひな白痢菌（ＳＰ）を統制することができる多様な製品、すなわち家禽飼料添加剤、飲用水、畜舎消毒剤および肉加工洗浄剤にも適用可能であることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、家禽チフス菌およびひな白痢菌に対して特異的死滅能を有する新規バクテリオファージを提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病の予防または治療用組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家禽用飼料および飲用水を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む消毒剤および洗浄剤を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、前記バクテリオファージを有効成分として含む組成物を用いて、家禽における家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病としての家禽チフスまたはひな白痢を予防および治療する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の新規バクテリオファージは、家禽チフス菌およびひな白痢菌に対して特異的死滅能を有し、耐酸性、耐熱性および耐乾性にも優れるという利点を持つため、家禽チフス菌およびひな白痢菌感染性疾病である家禽チフスまたはひな白痢の予防および治療用途として利用可能であるうえ、家禽チフス菌およびひな白痢菌の統制用途としても利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１はΦＣＪ１の電子顕微鏡写真である：形態学上、正二十面体の頭（isometric capside）および無収縮性の尾（long non-contractile tail）からなる形態型（morphotype）、シフォビラーダ科（siphoviridae）に属する。
【図２】図２は分離されたバクテリオファージΦＣＪ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果である：バクテリオファージのタンパク質パターンを示すもので、約３８ｋＤａと４９ｋＤａの主タンパク質が観察され、その他にも８ｋＤａ、１７ｋＤａ、８０ｋＤａおよび１００ｋＤａのタンパク質が観察される（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｅｅ−ｂｌｕｅ ｐｌｕｓ ２ ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ−ｓｔａｎｄａｒｄをマーカーとして使用した）。
【図３】図３は分離されたバクテリオファージΦＣＪ１のＰＦＧＥ結果である：ΦＣＪ１の全体ゲノムサイズは約６１ｋｂｐ程度である（Ｂｉｏ−ｒａｄ社の５ｋｂｐ ＤＮＡ ｓｉｚｅ ｓｔａｎｄａｒｄをサイズマーカーとして使用した）。
【図４】図４はΦＣＪ１のゲノムＤＮＡの各プライマーセットを用いたＰＣＲ結果を示すもので（Ａ；配列番号６と７のプライマーセットでＰＣＲ増幅、Ｂ；配列番号１０と１１のプライマーセットでＰＣＲ増幅、Ｃ；配列番号８と９のプライマーセットでＰＣＲ増幅、Ｄ；配列番号１２と１３のプライマーセットでＰＣＲ増幅）、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ ｌａｎｅは順次約６６０ｂｐ、１．３ｋｂｐ、６７０ｂｐ、および１．８ｋｂｐ程度のＰＣＲ産出物を持つ。
【図５】図５はバクテリオファージΦＣＪ１の一段増殖（one-step growth）実験結果である（Ａ；家禽チフス菌、Ｂ；ひな白痢菌）。バクテリオファージは家禽チフス菌とひな白痢菌において全て約１０２以上の放出量を有する。
【図６】図６はバクテリオファージΦＣＪ１の効率実験（efficiency test）（クリアリングアッセイ）結果である（Ａ；家禽チフス菌、Ｂ；ひな白痢菌）。他の範例；ＭＯＩ（multiply of infection：宿主細胞当りバクテリオファージが感染する数）。全て宿主細胞に対するバクテリオファージΦＣＪ１の感染比率が高いほど効率的に宿主細胞を溶菌させる。
【図７】図７はバクテリオファージΦＣＪ１の耐酸性実験結果である：ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．４、６．９、７．４、８．０および９．０における生存バクテリオファージの数を示す。対照群と比較して、ｐＨ２．５まではバクテリオファージΦＣＪ１の活性を失わないが、ｐＨ２．１では活性を完全に失う。
【図８】図８はバクテリオファージΦＣＪ１の耐熱性実験結果である：３７、４５、５３、６０、７０および８０℃で０、１０、３０、６０および１２０分毎に時間別に装置しておいたときの生存バクテリオファージ数を示す。７０℃で２時間まで露出されても活性を殆ど失わない。８０℃以上では１０分露出後に活性が減少するが、一定の比率活性を維持する。
【図９】図９はバクテリオファージΦＣＪ１の耐乾性実験結果である：スピードバキュームドライヤー（speed vacuum dryer、ＳＶＤ）を用いて６０℃で１２０分間乾燥処理したものである。乾燥の後、元来のタイターと相対的な安定性を比較したとき、活性が約１０２程度減少することが分かった。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一様態において、本発明は、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)特異的死滅能を有する新規バクテリオファージに関する。
【００１９】
本発明のバクテリオファージは、形態学上、正二十面体の頭(isometric capside)および無収縮性の尾(long non-contractile tail)を有する形態型(morphotype)シフォビラーダ科(siphoviridae)に属し、全体ゲノムサイズが６１ｋｂｐであり、３８ｋＤａおよび４９ｋＤａサイズのタンパク質を主要構造タンパク質として有することを特徴とする。
【００２０】
具体的に、本発明のバクテリオファージは、サルモネラ菌のうち、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)を選択的に感染させ、他の種は感染させない種特異性を有する。
【００２１】
本発明のバクテリオファージは、全体ゲノムサイズが６１ｋｂｐであり、配列番号１〜５に示される核酸分子を全体ゲノムの一部として含むことができる。
【００２２】
本発明において、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子における基本構成単位のヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体(analogue)を含む概念である。
【００２３】
また、本発明のバクテリオファージは、耐酸性および耐熱性の生化学的特徴を有するが、ｐＨ２．５〜ｐＨ９．０の広いｐＨ範囲で安定的に生存する耐酸性を有し、３７℃〜７０℃範囲の温度、すなわち高温でも安定的に生存することが可能な耐熱性を有する。また、高温乾燥（６０℃で１２０分）の後にも安定的に生存する耐乾性を有する。このような耐酸性、耐熱性および耐乾性は本発明のバクテリオファージを家禽のＳＧ、ＳＰ由来疾病の予防および治療用組成物、並びにバクテリオファージを有効成分として含む多様な製品に適用することにおいて、多様な温度およびｐＨ範囲の適用を可能にする。
【００２４】
本発明者は、屠鶏場近くの下水から試料を採取し、ＳＧおよびＳＰ特異的死滅能および前述した特徴を有する本発明のバクテリオファージを同定し、これをΦＣＪ１と命名し、２００８年１０月２４日に韓国微生物保存センターに寄託番号第ＫＣＣＭ１０９６９Ｐ号で寄託した。
【００２５】
本発明の具体的な実施例によれば、屠鶏場近くの下水から試料を採取し、試料から、宿主細胞ＳＰを溶菌するバクテリオファージを分離し、これらがＳＧおよびＳＰを特異的に溶菌させることができることを確認した。また、これらのバクテリオファージ（ΦＣＪ１）を電子顕微鏡によって形態学的に観察した結果、形態型(morphotype)シフォビラーダ科(siphoviridae)に属することを確認した（図１）。
【００２６】
また、ΦＣＪ１のタンパク質パターンを分析した結果、バクテリオファージの主要構造タンパク質として約３８ｋＤａと４９ｋＤａのタンパク質を含むことを確認した。
【００２７】
また、ΦＣＪ１の全体ゲノムサイズを分析した結果、約６１ｋｂｐのサイズを持つことを確認した。これらの遺伝的特性を分析した結果、配列番号１および配列番号５の核酸分子を全体ゲノムの一部として含むことを確認し、これらに基づいて他種間の類似性を比較した結果、現在まで知られているバクテリオファージとの類似性が非常に低いため、新規バクテリオファージであることを確認した。遺伝的特性をさらに具体的に分析した結果、ΦＣＪ１に特異的なプライマーセット(primer set)、すなわち配列番号６と７、配列番号１０と１１、および配列番号８と９、配列番号１２と１３、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、配列番号１８と１９のプライマーセットでＰＣＲを行ったとき、特定サイズのＰＣＲ産出物である６６０ｂｐ、１．３ｋｂｐ、６７０ｂｐ、１．８ｋｂｐ、１ｋｂｐ、１ｋｐおよび１ｋｂｐ程度のＰＣＲ産出物が得られることを確認した。
【００２８】
また、ΦＣＪ１をＳＧおよびＳＰに感染させたとき、溶菌斑（ｐｈａｇｅ ｐｌａｑｕｅであって、ソフトアガ(soft agar)で一つのバクテリオファージによって宿主細胞が溶菌されて形成されるクリアゾーン(clear zone)）の大きさおよび濁度などが同一であり、これらを溶菌させることによりＳＧおよびＳＰの成長を抑制させることを確認した。
【００２９】
また、ΦＣＪ１の安定性を多様なｐｈ範囲および温度で調査した結果、ｐＨ２．５〜９．０および３７℃〜７０℃の広い範囲で安定的に生存するうえ、高温乾燥（６０℃で１２０分）の際にも安定性を維持することを確認した。これは、本発明のバクテリオファージΦＣＪ１を、ＳＧとＳＰを統制することができる多様な製品へ適用することが容易であることを意味する。
【００３０】
他の様態において、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)またはひな白痢菌(Salmonella pullorum)感染性疾病である家禽チフスまたはひな白痢の予防または治療用組成物に関する。
【００３１】
本発明のバクテリオファージは、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)を特異的に死滅させることが可能な抗菌活性を有するので、これらの菌により誘発される疾病を予防または治療するための目的で利用できる。具体的に好ましい一様態として、抗生剤を含むことができる。
【００３２】
本発明において、用語「予防」とは、組成物の投与により疾病を抑制させ或いは発病を遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、組成物の投与により前記疾病の症状が好転され或いは有利に変更される全ての行為を意味する。
【００３３】
本発明の前記組成物を適用することが可能な家禽チフス菌感染性疾病の例としては家禽チフスが好ましく、ひな白痢菌感染性疾病の例としてはひな白痢が好ましいが、これに限定されない。
【００３４】
本発明の前記組成物は、５×１０２〜５×１０１２ｐｆｕ／ｍｌのΦＣＪ１を含み、好ましくは１×１０６〜１×１０１０ｐｆｕ／ｍｌのΦＣＪ１を含む。
【００３５】
本発明の前記組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化されて食品、医薬品および飼料添加剤として提供できる。
【００３６】
本発明において、用語「薬学的に許容される担体」とは、生物体を刺激せず、投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬剤学的担体としては、滅菌および生体に適した、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分の少なくとも一つを混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤よび潤滑剤を付加的に添加して、例えば水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【００３７】
本発明の組成物を有効成分として含む経口投与剤形としては、例えば錠剤、トローチ剤、ローゼンジ(lozenge)、水溶性または油性懸濁液、調製粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップ、またはエリキシル剤に製剤化することができる。錠剤およびカプセルなどの剤形に製剤化するために、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンなどの結合剤、第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチまたはサツマイモ澱粉などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油を含むことができ、カプセル剤形の場合、前述した物質以外にも、脂肪油などの液体担体をさらに含むことができる。
【００３８】
本発明の組成物を有効成分として含む非経口投与用剤形としては、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射などの注射用形態、坐剤注入方式または呼吸器を介して吸入可能にするエアロゾル剤などのスプレイー用に製剤化することができる。注射用剤形に製剤化するためには、本発明の組成物を安定剤または緩衝剤と共に水で混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与用に製剤化することができる。エアロゾル剤などのスプレイー用に剤形化する場合、水分散された濃縮物または湿潤粉末が分散するように推進剤などが添加剤と共に配合できる。
【００３９】
本発明において、用語「抗生剤」とは、薬剤の形で動物に提供されて菌を死滅させることが可能な製剤を意味し、防腐剤、殺菌剤および抗菌剤を総称する。本発明のバクテリオファージは、既存の抗生剤に比べて家禽チフス菌およびひな白痢菌に対する特異性が非常に高いので、益菌は死滅させず、特定の病原菌のみを死滅させることができ、薬物耐性を誘導しないため、既存の抗生物質に比べて製品寿命が長い新規抗生剤として提供できる。
別の様態において、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家禽用飼料または飲用水に関する。
【００４０】
本発明の家畜用飼料は、バクテリオファージを飼料添加剤の形で別途製造して飼料に混合させ、或いは飼料製造の際に直接添加させて製造することができる。本発明の飼料内バクテリオファージは液状または乾燥状態である。乾燥方法は、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥および凍結乾燥が使用できるが、これに限定されない。本発明のバクテリオファージは粉末形態で飼料重量の０．０５〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％の成分比で混合できる。
【００４１】
本発明におけるΦＣＪ１を含む飼料は、植物性としては穀物類、堅果類、食品加工副産物類、藻類、繊維質類、製薬副産物類、油脂類、澱粉類、粗びき粉類、穀物副産物類などがあり、動物性としてはタンパク質類、無機物類、油脂類、鉱物性類、油脂類、単細胞タンパク質、動物性プランクトン類、残りの飲食物などがあり、これに限定されない。
【００４２】
本発明におけるΦＣＪ１を含む飼料添加剤には、品質低下を防止するために添加する結合剤、乳化剤、保存剤などがあり、効用増大のために飼料に添加するアミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非タンパク窒素化合物、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤、オリゴー糖などがあり、その他にも、飼料混合剤などをさらに含むことができ、これに限定されない。
【００４３】
また、飲用水に混合して供給することにより、持続的に腸内の家禽チフス菌或いはひな白痢菌の数を減少させることができ、家禽チフス菌およびひな白痢菌清浄家畜の生産を模索することができる。
【００４４】
別の様態において、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む消毒剤及び洗浄剤に関する。
【００４５】
前記バクテリオファージを有効成分として含む消毒剤は、家禽チフス菌およびひな白痢菌除去のための撒布にも活用され、家禽の活動領域、家禽屠畜場、家禽斃死地域、その他の生産設備に使用でき、場所はこれに限定されない。
【００４６】
また、前記バクテリオファージを有効成分として含む洗浄剤は、生きている家禽の皮膚表面、毛および身体の各部位に付いており或いは感染可能な家禽チフス菌およびひな白痢菌の除去に使用できる。
【００４７】
別の様態において、本発明は、前記家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)またはひな白痢菌(Salmonella pullorum)感染性疾病の予防または治療用組成物を用いて、家禽における家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病である家禽チフスまたはひな白痢を予防または治療する方法に関する。
【００４８】
本発明の前記組成物は、薬学的製剤の形で動物に投与され、或いは家畜の飼料または飲用水に混合してこれを摂食させる方法によって投与されることが可能であり、好ましくは飼料添加剤の形で飼料に混合されて投与できる。
【００４９】
本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達することが可能な限りは、経口または非経口の多様な経路を介して投与でき、具体的に、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、経鼻、吸入などを介して通常の方式で投与できる。
【００５０】
本発明の治療方法は、本発明の組成物を薬学的有効量で投与することを含む。適切な総１日使用量が正しい医学的判断範囲内において処置医によって決定できることは、当業者には自明である。特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共にまたは同時に使用される薬物などの多様な因子、および医薬分野によく知られている類似因子に応じて異ならせて適用することが好ましい。
【００５１】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。ところが、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５２】
〔発明の様態〕
〔実施例１：サルモネラ菌に感染するバクテリオファージの分離〕
（１−１．バクテリオファージのスクリーニングおよび単一バクテリオファージの分離）
屠鶏場および近くの下水終末処理場の試料５０ｍｌを遠心分離管に移して４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を０．４５μｍのフィルターを用いて濾過した。１５０μＬのＳＴ振とう培養液（ＯＤ６００＝２）と２ｍＬの１０×Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（以下「ＬＢ培地」という。トリプトン１０；酵母抽出液５ｇ；ＮａＣｌ１０ｇ；最終体積が１Ｌとなるように）に１８ｍＬの試料濾過液を混ぜた。これを３７℃で１８時間培養した後、培養液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上澄み液を０．２μｍのフィルターを用いて濾過した。ＬＢプレートに３ｍＬの０．７％寒天（ｗ／ｖ）、１５０μＬのＳＴ振とう培養液（ＯＤ６００＝２）を混ぜ注いで固めた後、その上に１０μＬの試料培養濾過液を滴下して３７℃で１８時間培養した（０．７％寒天を用いて固体培地上に付着するものをｔｏｐ−ａｇａｒとし、ｔｏｐ−ａｇａｒで成長する宿主細胞を用いてバクテリオファージが溶菌することを観察する方法をソフトアガオーバーレイ(soft agar overlay)方法と定義する）。
【００５３】
溶菌の起った試料培養濾過液を適当に希釈して１５０μＬのＳＰ振とう培養液（ＯＤ６００＝２）と混ぜた後、ソフトアガオーバーレイを行って単一溶菌斑を獲得した。一つの溶菌斑が一つのバクテリオファージからなっていると見なすから、単一バクテリオファージを純粋分離するために一つの溶菌斑を取って４００μＬのＳＭ溶液（ＮａＣｌ、５．８ｇ；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、２ｇ；１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＬ；Ｈ２Ｏ、最終体積が１Ｌとなるように）に入れて４時間室温に静置して単一バクテリオファージを純粋分離した。分離されたバクテリオファージを大量確保するために単一バクテリオファージ溶液の上澄み液１００μＬを取った後、１２ｍＬの０．７％寒天および５００μＬのＳＰ振とう培養液と混合して、直径１５０ｍｍのＬＢ培地でソフトアガオーバーレイを実施した。完全に溶菌の起ったプレートに１５ｍＬのＳＭ溶液を注いだ後、４時間室温で若干振とうしてトップアガ内のバクテリオファージを流出させた。バクテリオファージの流出したＳＭ溶液を回収した後、最終体積の１％となるようにクロロホルムを添加して１０分間よく混ぜた後、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ここで、得られた上澄み液を０．２μｍのフィルターで濾過して冷蔵保管した。
【００５４】
（１−２．バクテリオファージの大量培養）
選別されたバクテリオファージをＳＰを用いて大量培養した。ＳＰを振とう培養して１．５×１０１０ｃｆｕ(colony forming unit)となるように分注して４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、これを４ｍＬのＳＭ溶液に再浮遊させた。ここに７．５×１０７ｐｆｕ(plaque forming unit)のバクテリオファージを接種してＭＯＩ(multiplicity of infection)＝０．００５に作った後、３７℃で２０分間静置した。これを１５０ｍＬのＬＢ培地が入ったフラスコに接種した後、５時間３７℃で培養した。最終体積の１％となるようにクロロホルムを添加し、２０分間振とうした。ＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡをそれぞれ最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加し、３０分間３７℃で静置させた。最終濃度がそれぞれ１Ｍと１０％（ｗ／ｖ）になるようにＮａＣｌおよびＰＥＧ(polyethylene glycol)を入れた後、４℃で３時間追加静置させた。４℃、１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄み液を除去した。５ｍＬのＳＭ溶液に沈殿物を再浮遊させた後、２０分間室温に静置させた。ここに４ｍＬのクロロホルムを添加した後、よく攪拌し、４℃、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み液を０．２μｍのフィルターで濾過して、グリセロール密度勾配法（密度：４０％、５％グリセロール）を用いた超遠心分離（３５，０００ｒｐｍ、１時間、４℃）によってΦＣＪ１を精製した。精製したΦＣＪ１は３００μＬのＳＭ溶液に再浮遊した後、タイターを測定した。
【００５５】
〔実施例２：ΦＣＪ１のサルモネラ菌感染有無の調査〕
選別されたバクテリオファージがＳＰ以外に他種のサルモネラ菌に対して溶菌活性を示すかを検査するために、他種のサルモネラ菌に交差感染を試みた。その結果、ΦＣＪ１はＳＴ(Salmonella enterica Serotype Typhimurium)、ＳＥ(Salmonella enterica Serotype Enteritis)、ＳＣ(Salmonella enterica Serotype Choleraesuis)、ＳＤ(Salmonella enterica Serotype Derby)、ＳＡ(Salmonella enterica subsp. Arizonae)、およびＳＢ(Salmonella enterica subsp. Bongori)には感染せず、ＳＧとＳＰに特異的に感染した（実施例１３参照）。その結果は表１のとおりである。ＳＧを宿主として用いて生産したΦＣＪ１は、ＳＰで生産されたものと同一の溶菌斑模様、形成された溶菌の透明性程度、タンパク質パターンおよびゲノムサイズを示した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
〔実施例３：ΦＣＪ１の形態観察〕
精製されたΦＣＪ１を０．０１％のゼラチン溶液に希釈した後、２．５％のグルタルアルデヒド溶液で固定した。これをｃａｒｂｏｎ−ｃｏａｔｅｄ ｍｉｃａ ｐｌａｔｅ（ｃａ．２．５×２．５ｍｍ）に滴下して１０分間適応させた後、滅菌蒸留水で洗浄した。カーボンフィルムを銅グリッド(copper grid)に挿入して４％の酢酸ウラニル(uranyl acetate)で３０〜６０秒間染色し、乾燥を行った後、透過電子顕微鏡（ＪＥＭ−１０１１トランスミッションエレクトロンマイクロスコープ(transmission electron microscope)、８０ｋＶ、倍率×１２０，０００〜×２００，２０００）で検鏡した。その結果、分離されたΦＣＪ１の形態は図１のとおりであり、形態学上、正二十面体の頭と無収縮性の尾からなる形態型シフォビラーダ科(siphoviridae)に属することが分かった。
【００５８】
〔実施例４：ΦＣＪ１のタンパク質パターン分析〕
１０１１ｐｆｕ／ｍＬタイターの精製されたΦＣＪ１溶液１５μＬと５Ｘ ＳＤＳ試料溶液３μＬを混ぜた後、５分間沸騰した。４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ゲルでΦＣＪ１の全体タンパク質を展開した。クマシーブルー染色溶液を用いてゲルを１時間常温で染色した。その結果、タンパク質パターンは、図２に示すように３８ｋＤａと４０ｋＤａの主要タンパク質が観察され、その他にも８ｋＤａ、１７ｋＤａ、８０ｋＤａおよび１００ｋＤａのタンパク質が観察されたことを示す。
【００５９】
〔実施例５：ΦＣＪ１の全体ゲノムＤＮＡサイズの分析〕
超遠心分離によって精製されたΦＣＪ１のゲノムＤＮＡを抽出した。具体的に精製されたΦＣＪ１培養液にＥＤＴＡ(ethylenediaminetetraacetic acid（ｐＨ８．０）)、プロテイナーゼＫ、およびＳＤＳ(sodium dodecyl sulfate)をそれぞれ最終濃度２０ｍＭ、５０μｇ／ｍＬ、および０．５％（ｗ／ｖ）となるように添加した後、５０℃で１時間静置した。同量のフェノール（ｐＨ８．０）を添加し、よく混ぜた後、室温で１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液を収得して同量のＰＣ（フェノール：クロロホルム＝１：１）を添加し、よく混ぜた後、室温で１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、上澄み液を収得して同量のクロロホルムをよく混ぜた後、室温で１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液を収得した後、３Ｍの酢酸ナトリウムを全体体積の１／１０で混ぜ、２倍量の冷たい９５％のエタノールを添加した後、−２０℃で１時間静置させた。しかる後に、０℃で１０分間１２０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を完全に除去し、しかる後に、底部のＤＮＡを５０μＬのＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））溶液に溶かした。抽出したＤＮＡを１０倍希釈してＯＤ２６０で吸光度を測定することにより濃度を測定した。全体ゲノムＤＮＡ１μｇを１％ＰＦＧＥ(pulse-field gel electrophoresis)アガロースゲルにロードした後、ＢＩＯＲＡＤ ＰＦＧＥシステムの７番プログラム(size range 25-100 kbp; switch time ramp 0.4-2.0 seconds, linear shape; forward voltage 180 V; reverse voltage 120 V)を用いて常温で２０時間展開した。ΦＣＪ１のゲノムＤＮＡのサイズは図３に示すように約６１ｋｂｐ程度であった。
【００６０】
〔実施例６：ΦＣＪ１の遺伝的特性分析〕
分離したΦＣＪ１の遺伝的特性を調べるために、ΦＣＪ１のゲノムＤＮＡ５μｇをＥｃｏＲＶとＳｃａＩ制限酵素で同時に処理した。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をＥｃｏＲＶ制限酵素で切断した後、ＣＩＰ(calf intestinal alkaline phosphatase)処理したものを使用した。ｇＤＮＡ切片とベクターの量が３：１となるように反応条件を合わせて混ぜた後、１６℃で５時間ライゲーションを行った。これを、大腸菌の一種であるＤＨ５α細胞に導入させた。このように形質転換された転換体をアンピシリンおよびＸ−ｇａｌ(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)含有のＬＢ平板培地にプレートし、通常の青白コロニー選別法によって２つのコロニーを選別した。選別されたコロニーをアンピシリン含有の培養培地で１６時間振とう培養した。ここで、プラスミド精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてプラスミドを抽出した。
【００６１】
前記プラスミドのクローニング有無をＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースのプライマーセットを用いてＰＣＲによって確認し、挿入断片のサイズが１ｋｂｐ以上となるものを選んでＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーセットを用いて塩基配列を分析した。こうして得た遺伝子塩基配列が配列番号１〜５に示されている。その解読塩基配列の類似性をＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｘプログラムを用いて分析した結果が下記表２に示されている。
【００６２】
表２に示すように、ΦＣＪ１は、配列番号１の解読塩基配列の前部は大腸菌バクテリオファージｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＴＬＳのＤｃｍと３６％の類似性を示し、後部はＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ｐｈａｇｅ ＢｃｅｐＮａｚｇｕｌのＤＲ０５３０−ｌｉｋｅ ｐｒｉｍａｓｅと３１％の類似性を示した。配列番号１の解読塩基配列の場合には、逆方向にサルモネラファージＤｅｔ７のテールスパイクプロテイン(tail spike protein)と３４％の類似性を示した。このように解読塩基配列が公知のバクテリオファージのタンパク質と相同性が高くなかった。しかも、配列番号１〜５のＤＮＡ塩基配列をＮＣＢＩ ｂｌａｓｔｎプログラムを用いて分析した結果、塩基配列の相同性を示さなかった。よって、ΦＣＪ１は新規バクテリオファージと判断された。
【００６３】
【表２】
【００６４】
〔実施例７：ΦＣＪ１特異的プライマー塩基配列の製作〕
ΦＣＪ１を同定するために、ΦＣＪ１特異的プライマーを、配列番号１に基づいて配列番号６と７、配列番号１０と１１のプライマーセットを製作し、配列番号２に基づいて配列番号８と９、配列番号１２と１３のプライマーセットを製作した。また、配列番号３、配列番号４および配列番号５に基づいてそれぞれ配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、および配列番号１８と１９のプライマーセットを製作してＰＣＲを行った。０．１μｇのバクテリオファージ全体ゲノムＤＮＡと０．５ｐｍｏｌのプライマーをｐｒｅ−ｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）に添加し、最終体積が２０μＬとなるように合わせた。これを変性(denaturation)；９４℃３０秒、アニーリング(annealing)；６０℃で３０秒、重合(polymeration)；７２℃で１分の条件で３０サイクルＰＣＲを行った。その結果、配列番号６と７、配列番号１０と１１をプライマーセットとして用いた場合、図４に示すようにそれぞれ約６６０ｂｐと１．３ｋｂｐ程度のＰＣＲ産物を得た。配列番号８と９、および配列番号１２と１３をプライマーセットとして用いた場合も、図４に示すようにそれぞれ６７０ｂｐと１．８ｋｂｐ程度のＰＣＲ産物を得た。また、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、および配列番号１８と１９をプライマーセットとして用いた場合、図示しなかったが、全て１ｋｂｐ程度のＰＣＲ産物を収得した。
【００６５】
〔実施例８：バクテリオファージの感染能力の確認〕
ΦＣＪ１の感染能力を確認するために、一段増殖(one-step growth)実験を行った。
【００６６】
ＳＧ培養液（ＯＤ６００＝０．５）５０ｍＬを４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、新しいＬＢ培地２５ｍＬに再浮遊させた。ここに分離したバクテリオファージをＭＯＩ＝０．０００５で接種した後、５分間静置させた。反応液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体を分離した後、これをさらに新しいＬＢ培地に再浮遊させた。その後、３７℃で培養し、１０分の間隔で２つずつ培養液を収集して１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上澄み液のみを取った。処理した実験培養液を段階希釈し、ソフトアガオーバーレイ方法で各段階の希釈液を１０μＬずつ滴下させた後、３７℃で１８時間培養して溶菌有無によってタイターを測定した。ΦＣＪ１はＳＧとＳＰに同時感染するバクテリオファージなので、このような実験をＳＰに対しても同様に行った。ＳＧとＳＰを宿主細胞として用いたとき、一段増殖結果をみれば、放出量(burst size)は１０２以上であることが分かった。詳細な結果は図５のとおりである。
【００６７】
〔実施例９：バクテリオファージの効能確認〕
ΦＣＪ１の液体培地上におけるＳＧに対する効能を調べるために多様な条件でクリアリングアッセイ(clearing assay)実験を行った。２５０ｍＬのフラスコに３５ｍＬのＬＢ培地を入れた後、分離されたバクテリオファージ単一溶菌斑：ＳＧの細胞数比率を１：１、１：１００、１：１００００の条件で接種した。接種の後、３７℃で２００ｒｐｍにて培養し、時間別にＯＤ６００の変化を測定した。その結果、ΦＣＪ１の溶菌によるＳＧとＳＰの成長抑制を観察することができた。実験結果は図６に示されている。
【００６８】
〔実施例１０：バクテリオファージのｐＨによる安定性の調査〕
ΦＣＪ１が鶏の胃内の低いｐＨで安定性を保有するかを確認するために、多様なｐＨ範囲（ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５．６．４、６．９、７．４、８．２および９．０）で安定性調査実験を行った。多様なｐＨ溶液（酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ２．１、ｐＨ４．０、ｐＨ５．５およびｐＨ６．４）、クエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ２．５、ｐＨ３．０およびｐＨ３．５）、リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ６．９およびｐＨ７．４）、およびトリス溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２およびｐＨ９．０）をそれぞれ２Ｍに製作した。１００μＬのｐＨ溶液と同量の１．０×１０１１ｐｆｕ／ｍｌタイターのバクテリオファージ溶液を混ぜて各ｐＨ溶液の濃度が１Ｍとなるようにした後、１時間常温で静置した。これらを段階希釈し、ソフトアガオーバーレイ方法を用いて各段階の希釈液を１０μＬずつ滴下した後、３７℃で１８時間培養して溶菌有無によってタイターを測定した。元来のΦＣＪ１のタイターと比較してｐＨ変化によるタイター変化によって相対的安定性を確認したが、実験結果、ｐＨ２．５までは活性を失わず非常に安定的であることが分かった。しかし、ｐＨ２．１では活性を失った。その結果を図７に示した。
【００６９】
〔実施例１１：バクテリオファージの温熱度による安定性の調査〕
バクテリオファージの製品剤形のうち、飼料添加剤として用いる場合、バクテリオファージの剤形過程で発生する熱に対する安全性を確認するための実験を行った。１．０×１０１１ｐｆｕ／ｍＬタイターのΦＣＪ１の溶液２００μＬを３７℃、４５℃、５３℃、６０℃、７０℃および８０℃の温度条件下でそれぞれ０分、１０分、３０分、６０分および１２０分静置させた。処理した実験培養液を段階希釈し、ソフトアガオーバーレイ方法を用いて各段階の希釈液を１０μＬずつ滴下した後、３７℃で１８時間培養して溶菌有無によってタイターを測定した。元来のΦＣＪ１のタイター、温度および露出時間の変化によるて相対的安定性を確認したが、７０℃で２時間まで露出されても活性を多く失わないことが分かった。しかし、８０℃以上では１０分間露出の後に活性が急激に減少するが、一定の比率活性を維持する。その結果を図８に示した。
【００７０】
〔実施例１２：バクテリオファージの乾燥に対する安定性の調査〕
バクテリオファージの製品剤形のうち、飼料添加剤として用いる場合、バクテリオファージの剤形過程で発生する乾燥条件に対する安全性を確認した。耐熱性確認実験によって導出した結果に基づき、６０℃１２０分の条件下における高温乾燥実験を行った。１．０×１０１１ｐｆｕ／ｍＬタイターのΦＣＪ１の溶液２００μＬをスピードバキューム（ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃｕｕｍ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ５３０１、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて乾燥させた。乾燥の後に得られたペレットを、初期溶液と同量のＳＭ溶液を入れて４℃で１日間完全に再浮遊させた。処理した実験培養液を段階希釈して、ソフトアガオーバーレイ方法で各段階の希釈液を１０μＬずつ滴下させた後、３７℃で１８時間培養して溶菌有無によってタイターを測定した。乾燥の後、元来のタイターと相対的な安定性を比較したとき、活性が約１０２程度減少することが分かった。その結果を図９に示した。
【００７１】
〔実施例１３：バクテリオファージの野生分離株ＳＧ／ＳＰに対する感染範囲の調査〕
ΦＣＪ１が、実験に使用されたＳＧ（ＳＧ ＲＫＳ４９９４）およびＳＰ（ＳＰＲＫＳ２４２）以外に、ソウル大学校獣医科大学鳥類疾病学室で分離した韓国の野生分離株ＳＧ、ＳＰそれぞれ１５株と５株に対して溶菌活性を持つか否かについて確認した。各菌株の振とう培養液（ＯＤ６００＝２）１５０μＬを混ぜてソフトアガオーバーレイ方法を行い、１０１０ｐｆｕ／ｍＬタイターのΦＣＪ１の溶液を１０μＬずつ滴下した後、３７℃で１８時間培養して溶菌斑形成有無を観察した。野生分離株ＳＧとＳＰに対して１００％溶菌率を示すことを確認することができた。その結果は下記表３のとおりである。
【００７２】
【表３】
【００７３】
〔実施例１４：バクテリオファージの毒性評価〕
家禽チフス予防用バクテリオファージとしてΦＣＪ１の産卵鶏における安全性、残留量および卵継代評価を実施して毒性評価を行った。産卵鶏実験はさらに３つのグループに分けて病原性試験、卵継代試験、並びに病変有無および盲腸糞の濃度調査を行った。
【００７４】
病原性試験は、産卵中の褐色産卵鶏１３羽をΦＣＪ１投与群に８羽、対照群に５羽割り当てて行った。投与群にはΦＣＪ１を飼料と混合して供給（飼料ｇ当り１０８ｐｆｕ以上）し、対照群にはファージを含有していない試料を供給し、産卵率および臨床症状有無をファージ投与時点から３週間観察した。その結果は表４に示すとおりであり、ΦＣＪ１投与群は約４２％、対照群は約５０％の産卵率を示した。また、ファージ投与後の臨床症状観察結果、およびΦＣＪ１投与後２４日間の観察結果によれば、呼吸器および消化器の異常症状は観察されておらず、活動性においても対照群との差異を示さないため、ΦＣＪ１投与による問題はないことを確認した。
【００７５】
卵継代試験は、ΦＣＪ１投与３日、６日、９日に集卵した卵１０個内外の表面を７０％エタノールで洗浄し破卵して卵黄と卵百を混合した後、混合液５ｍＬを４５ｍＬのＰＢＳで１０−１、１０−２、１０−３まで希釈した。各希釈液２５ｍＬにＳＮＵＳＧ１９７ １０６ｃｆｕを添加して３７℃で３時間培養した後、遠心分離で菌体分離した。５００μＬの上澄み液と１００μＬのＳＮＵＳＧ０１９７（１０９ｃｆｕ／ｍＬ）を混合してｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ａｇａｒ ｐｌａｔｅにトップアガオーバーレイ方法で塗抹し、３７℃で１８時間培養した後、溶菌斑(plaque)の数から卵１ｍＬ当たりファージの数を計算した。表５に示すように、３日、６日、９日に集卵した卵１７個におけるΦＣＪ１の有無を検査した結果、ΦＣＪ１が分離されなかった。
【００７６】
産卵鶏における最後の実験として、ΦＣＪ１投与時の病変有無および盲腸糞内のΦＣＪ１濃度を調査した。ΦＣＪ１投与３週後に試験鶏を安楽死させ、剖検して肝臓、脾臓、腎臓および卵胞の肉眼的病所有無を観察し、肝臓試料を綿棒で無菌的に採取してＭａｃ Ｃｏｎｋｅｙ寒天培地に塗抹した後、家禽チフス菌の有無も確認した。また、盲腸糞を採取し、投与したΦＣＪ１濃度を個体別に測定したが、これは、盲腸糞１ｇを９ｍＬのＰＢＳに浮遊させ、１５０００ｇで３０分間遠心分離した後、上澄み液１ｍＬをＰＢＳで１０−１〜１０−４まで希釈させた後、５００μＬの希釈液と１００μＬのＳＧＯ１９７（１０９ｃｆｕ／ｍＬ）を混合して１０×ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ寒天培地にトップアガオーバーレイ方法で塗抹した。これを３７℃で１８時間培養した後、形成された溶菌斑の数を数えて段階別希釈倍数を考慮して盲腸糞グラム当たりバクテリオファージ数を算出した。その結果、観察期間に特異的な臨床症状が観察されておらず、盲腸糞では盲腸糞ｇ当たり約３．７×１０４ｐｆｕのΦＣＪ１が測定された。これにより、飼料として供給したファージが胃を通過して腸にまで到達していることが分かった。
【００７７】
バクテリオファージの内部臓器分布調査は、１０羽の１１日齢ＳＰＦ雛を５羽ずつ２グループに分け、投与群にはΦＣＪ１飼料ｇ当りそれぞれ１０８ｐｆｕを添加した飼料を、対照群にはΦＣＪ１を添加していない飼料をそれぞれ３日間供給した後、犠牲させて肝臓、腎臓および盲腸糞を採取してΦＣＪ１の有無を確認した。採取した肝臓、腎臓および盲腸糞と同量のＰＢＳを添加して乳化させた後、肝臓は１ｍＬを採取し、腎臓と盲腸糞は全てを１．５ｍＬのチューブに入れて１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。１ｍＬの上澄み液をＰＢＳで１０−１〜１０−４まで希釈した後、５００μＬの希釈液と１００μＬのＳＧ０１９７（１０９ｃｆｕ／ｍＬ）を混合して１０×ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ寒天培地にトップアガオーバーレイ方法で塗抹した。これを３７℃で１８時間培養した後、形成された溶菌斑の数を数えて段階別希釈倍数を考慮し、盲腸糞ｇ当たりバクテリオファージ数を算出した。その結果は、表６に示すように、肝臓および腎臓ではΦＣＪ１が観察されておらず、盲腸糞でのみ観察された。
【００７８】
【表４】
【００７９】
【表５】
【００８０】
【表６】
【００８１】
〔実施例１５：バクテリオファージの効能評価〕
ΦＣＪ１のＳＧに対する予防および治療程度の可能性を確認するために、鶏で効能評価実験を行った。
【００８２】
２０羽の１日齢褐色産卵鶏を１０羽ずつ１０個の試験群（ΦＣＪ１投与群＋無投与攻撃群１つ）に割り当て、試験鶏に、ΦＣＪ１をｇ当り１０７ｐｆｕで混合した飼料およびｍＬ当り１０７ｐｆｕで混合した飲み水を１週間供給し、１週目に羽当たりＳＧ０１９７ １０６ｃｆｕと各ファージ１０７ｐｆｕ（ＭＯＩ＝１０）を５００μＬのＴＳＢに混合した後、氷上に放置してから１時間以内に口腔を介して接種した。２週間斃死率を観察し、生存した試験鶏を剖検して病変有無を確認し、細菌を分離した。その結果は表７のとおりである。ΦＣＪ１投与群は無投与群に比べて有意的に高い（Ｐ＜０．０５）防御率を示すことが分かった。
【００８３】
【表７】
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明のバクテリオファージは、家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)に対して特異的死滅能を有するため、益菌を死滅させず、耐酸性、耐熱性および耐乾性にも優れるので、家禽チフス菌およびひな白痢菌感染性疾病、特に家禽チフスおよびひな白痢の予防または治療目的の治療剤、抗生剤、家畜用飼料などに広範囲に利用できる。
【受託番号】
【００８５】
ＫＣＣＭ１０９６９Ｐ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)に特異的死滅能を有し、形態学上、正二十面体の頭(isometric capside)および無収縮性の尾(long non-contractile tail)を有する形態型(morphotype)Ｂ１、シフォビラーダ科(siphoviridae)に属し、全体ゲノムサイズが６１ｋｂｐであり、３８ｋＤａおよび４９ｋＤａサイズのタンパク質を主要構造タンパク質として有することを特徴とする、バクテリオファージ。
【請求項２】
前記バクテリオファージは、形態学的に図１に示された形態型を有することを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項３】
前記バクテリオファージは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５よりなる群から選ばれた一つまたはそれ以上の核酸分子を全体ゲノムの一部として含むことを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項４】
前記バクテリオファージは、配列番号６と７、配列番号８と９、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、および配列番号１８と１９よりなる群から選ばれた一つまたはそれ以上のプライマーセットでＰＣＲを行った場合、それぞれ約６６０ｂｐ、６７０ｂｐ、１．３ｋｂｐ、１．８ｋｂｐ、１ｋｂｐ、１ｋｂｐ、および１ｋｂｐのＰＣＲ産出物を有することを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項５】
前記バクテリオファージは、ｐＨ２．５〜ｐＨ９．０の範囲で耐酸性を有し、３７℃〜７０℃の範囲で耐熱性を有し、６０℃で１２０分間乾燥させたときに耐乾性を有することを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項６】
前記バクテリオファージは寄託番号第ＫＣＣＭ１０９６９Ｐ号であることを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項７】
請求項１のバクテリオファージを有効成分として含む家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)またはひな白痢菌(Salmonella pullorum)感染性疾病の予防または治療用組成物。
【請求項８】
前記家禽チフス菌感染性疾病は家禽チフスであり、前記ひな白痢菌感染性疾病はひな白痢であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
抗生剤として使用されることを特徴とする、請求項７に記載の予防または治療用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項のバクテリオファージを有効成分として含む家畜用飼料または飲用水。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項のバクテリオファージを有効成分として含む消毒剤または洗浄剤。
【請求項１２】
請求項１のバクテリオファージまたは請求項７の組成物を用いて、ヒトを除いた動物の家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病を治療する方法。
【請求項１】
家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)およびひな白痢菌(Salmonella pullorum)に特異的死滅能を有し、形態学上、正二十面体の頭(isometric capside)および無収縮性の尾(long non-contractile tail)を有する形態型(morphotype)Ｂ１、シフォビラーダ科(siphoviridae)に属し、全体ゲノムサイズが６１ｋｂｐであり、３８ｋＤａおよび４９ｋＤａサイズのタンパク質を主要構造タンパク質として有することを特徴とする、バクテリオファージ。
【請求項２】
前記バクテリオファージは、形態学的に図１に示された形態型を有することを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項３】
前記バクテリオファージは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５よりなる群から選ばれた一つまたはそれ以上の核酸分子を全体ゲノムの一部として含むことを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項４】
前記バクテリオファージは、配列番号６と７、配列番号８と９、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３、配列番号１４と１５、配列番号１６と１７、および配列番号１８と１９よりなる群から選ばれた一つまたはそれ以上のプライマーセットでＰＣＲを行った場合、それぞれ約６６０ｂｐ、６７０ｂｐ、１．３ｋｂｐ、１．８ｋｂｐ、１ｋｂｐ、１ｋｂｐ、および１ｋｂｐのＰＣＲ産出物を有することを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項５】
前記バクテリオファージは、ｐＨ２．５〜ｐＨ９．０の範囲で耐酸性を有し、３７℃〜７０℃の範囲で耐熱性を有し、６０℃で１２０分間乾燥させたときに耐乾性を有することを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項６】
前記バクテリオファージは寄託番号第ＫＣＣＭ１０９６９Ｐ号であることを特徴とする、請求項１に記載のバクテリオファージ。
【請求項７】
請求項１のバクテリオファージを有効成分として含む家禽チフス菌(Salmonella gallinarum)またはひな白痢菌(Salmonella pullorum)感染性疾病の予防または治療用組成物。
【請求項８】
前記家禽チフス菌感染性疾病は家禽チフスであり、前記ひな白痢菌感染性疾病はひな白痢であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
抗生剤として使用されることを特徴とする、請求項７に記載の予防または治療用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項のバクテリオファージを有効成分として含む家畜用飼料または飲用水。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項のバクテリオファージを有効成分として含む消毒剤または洗浄剤。
【請求項１２】
請求項１のバクテリオファージまたは請求項７の組成物を用いて、ヒトを除いた動物の家禽チフス菌またはひな白痢菌感染性疾病を治療する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５（Ａ）】
【図５（Ｂ）】
【図６（Ａ）】
【図６（Ｂ）】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５（Ａ）】
【図５（Ｂ）】
【図６（Ａ）】
【図６（Ｂ）】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１１−５０９６５３（Ｐ２０１１−５０９６５３Ａ）
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４１４０８（Ｐ２０１０−５４１４０８）
【出願日】平成２１年８月１７日（２００９．８．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００４５８２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６４７７２
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５０８０６４７２４）シージェイ チェイルジェダン コーポレイション (32)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月１７日（２００９．８．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００４５８２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６４７７２
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５０８０６４７２４）シージェイ チェイルジェダン コーポレイション (32)
【Ｆターム（参考）】
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