新規ポリペプチド
【課題】本発明は、ＰＨＡ−活性化リンパ球、内皮細胞、または樹状細胞(ＤＣ)から単離されたポリペプチド(タンパク質)をコードするポリヌクレオチドを提供することを課題とする。本発明は、また、このようなポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド(タンパク質)の作用を阻害または活性化することを課題とする。
【解決手段】単離ＤＩＮＯ遺伝子およびポリペプチド；このようなポリペプチド／タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法におけるそれらの使用；ならびにこのようなポリペプチド／タンパク質のアンタゴニストまたはアゴニストおよび医薬としてのその使用の提供により解決される。
【解決手段】単離ＤＩＮＯ遺伝子およびポリペプチド；このようなポリペプチド／タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法におけるそれらの使用；ならびにこのようなポリペプチド／タンパク質のアンタゴニストまたはアゴニストおよび医薬としてのその使用の提供により解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＨＡ−活性化リンパ球、内皮細胞、または樹状細胞(ＤＣ)から単離されたポリペプチド(タンパク質)をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は、また、このようなポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド(タンパク質)の作用を阻害または活性化することに関する。
【背景技術】
【０００２】
内皮細胞(ＥＣ)は、大小の血管の内部表面を構成し、そして基底組織(underlying tissue)への免疫系細胞の遊出を仲介する。刺激されていないＥＣは、遮られていない血流を保証する抗凝血性表面を表す。ＴＮＦα、ＩＬ−１またはリポポリサッカライド(ＬＰＳ)のような炎症メディエーターで刺激すると、ＥＣは細胞接着分子(例えば、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１を含む。)、サイトカイン(ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８)、凝固系の構成成分(組織因子、ＰＡＩ−１)およびその他(ｉＮＯＳ)を含むさまざまな分子を発現する。これらの発現された分子は、ケモタキシス、免疫細胞の接着および遊出、ならびにいくつかの他の機能を仲介する(de Martin et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20 [2000] e83-e88.)。したがって、免疫応答は、例えば炎症、動脈硬化症、再狭窄、再灌流障害、炎症性腸疾患、乾癬およびアトピー性皮膚炎を含むさまざまな疾患の共通の基本メカニズムである。
【０００３】
上記の発現分子の大部分は、転写因子ＮＦ−ｋＢを含む誘導可能かつ一過性の方法で上方調節される。薬理学的または遺伝学的インヒビターによるＮＦ−ｋＢの阻害が、炎症およびＥＣ活性化の他の観点をブロックすることが示された(Wrighton et al. J. Exp. Med. 183 [1996] 1013-1022; Oitzinger et al. Blood 97 [2001] 1611-1617)。したがって、ＮＦ−ｋＢのインヒビターは、広い治療可能性を有する。
【０００４】
ＮＦ−ｋＢの活性化をもたらす調節工程の現在の理解は、次のものを含む：刺激後、ＮＦ−ｋＢ(例えば、ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマー)は、阻害サブユニットＩｋＢａ、−ｂまたは−ｅを含む不活性細胞質複合体から放出される。ＩｋＢサブユニットは、ＮＦ−ｋＢと結合した場合に、ＮＦ−ｋＢ核局在性シグナルをマスクし、したがってその核転座を妨げる。ＮＦ−ｋＢの遊離は、ＩｋＢａ中の２つのセリン残基Ｓｅｒ３２およびＳｅｒ３６のＩｋＢリン酸化により開始され、続いて、ＩｋＢｂ中の対応する部位が、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体のｂ−ＴｒＣＰ様構成成分(Ｓｋｐ１／Ｃｕｌ１／ＲＯＣ１／Ｆ−ｂｏｘタンパク質ＦＷＤ１)により認識され、ユビキチン化され、そして２６Ｓプロテアソームを介して分解される。
【０００５】
当分野における主要な飛躍的進歩は、ＩｋＢａを特異的にリン酸化する２つのキナーゼ(ＩＫＫ１／ＩＫＫａおよびＩＫＫ２／ＩＫＫｂ)の同定である。これらのキナーゼは、それらのロイシンジッパードメインを通じてホモ−およびヘテロダイマーを形成し、そして第３のタンパク質(ＮＥＭＯ／ＩＫＫｇ)に結合する。ＩＫＫ１、ＩＫＫ２およびＮＥＭＯからなる、このＩｋＢキナーゼ複合体(ＩＫＣ)は、シグナロソームと呼ばれる分子量の大きい(５００〜７００ｋＤ)複合体内に含まれ、これはＰＫＡの触媒サブユニット(ｃｓＰＫＡ)およびホスホ−チロシン含有タンパク質のような他のタンパク質を含み得る。ノックアウトマウスを用いる遺伝的証拠により、炎症のシグナル伝達におけるＩＫＫ２の顕著な役割が明らかにされたが、ＩＫＫ１は分化のプロセスに関与するようである。
【０００６】
ＩＫＫに加えて、ｐｐ９０ｒｓｋおよびＤＮＡ−ＰＫは、ＩｋＢを直接リン酸化および活性化できることが示された。さらに、２つの新規のＩＫＫが記載され、１つはマクロファージ(ＩＫＫ−ｉ)においてｍＲＮＡレベルでＬＰＳにより誘導可能なものであり、そして１つ(ＴＢＫ１)はＴＲＡＦ２およびＴＡＮＫと複合体を形成し、したがって、ＮＦ−ｋＢ活性化をもたらすＴＮＦａのための代替的シグナル伝達経路を表すものである。いくつかのグループにより、正または負のいずれかでＩＫＫ活性に影響するモジュレーターが記載され(例えば、ＴＡＫ１；Hofer-Warbinek et al. J. Biol. Chem. 275 [2000] 22064-22068)、これは、さらなる重要なレベルのＮＦ−ｋＢ活性の調節を示している。
【０００７】
さまざまな細胞型において、ＩＫＣの複数の上流アクチベーター(multiple upstream activator)が記載されている。これらには、ＭＡＰ３Ｋ型キナーゼＮＩＫ(ＮＦ−ｋＢ誘導キナーゼ)およびＭＥＫＫ１(ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ１)、ＴＧＦｂ誘導可能キナーゼＴＡＫ１ならびにＡｋｔおよびＰＫＣアイソフォームゼータおよびシータを含み、これは不均質性ならびに異なる細胞型および刺激に関してＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路の一定の程度の特異性の両方を反映している。これらの上流アクチベーターは、刺激、例えばＴＮＦ−Ｒに関してＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＤＤ、ならびにＩＬ−１ＲおよびＴｏｌｌファミリーレセプターに関してＴＲＡＦ６によりレセプターへ補充されたレセプター特異的細胞質性シグナル伝達複合体の異なる構成成分に結合する。したがって、ＩＫＫ２は、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達において中心的に重要であるように見える。
【０００８】
今回、単離ＰＨＡ−活性化リンパ球のｃＤＮＡライブラリーから、例えば配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有し、かつ、配列番号２で示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも８０％の同一性の配列を有するポリペプチドをコードする、ＩＫＫ２−５５遺伝子が単離され得ることが示された。
【０００９】
内皮細胞(ＥＣ)は、脈管構造に局在化している。それらは接合部複合体によりつながっており、そして内皮を形成し、これは血管系全体を裏打ちしている。それらは、循環(circulation)と特定の器官との間の物質の流動を制御し、そして炎症応答の主要な部位である。さらに、それらは、体自体の免疫防御システムの循環細胞と特定の臓器の改変細胞との間の相互作用が起こる部位である。血流と体のさまざまな組織との間での物質、ペプチドおよび免疫細胞の交換は、ＥＣバリアーにより制御される。このＥＣバリアーの選択性は、それぞれの器官の完全性を維持するために不可欠ないくつかのいわゆる「血液−組織」バリアーの形成に非常に重要である。
【００１０】
さまざまな病理学的刺激に応答して、ＥＣはそれらの構成的機能を調整し得、内皮機能障害(endothelial dysfunction)と呼ばれる、それらの機能的状態のいくつかのタイプの可逆的変化がもたらされる。ＥＣは、適切な血流の維持に必須の多数の生理学的シグナルに対して釣合いの取れた方法で応答しなければならず、これはすべての組織に酸素および栄養を供給し、そして微生物、ウイルスおよび寄生生物感染と戦う。さらに、ＥＣは、また、新しい血管、癌の進行、およびアテローム性動脈硬化症の進行の増殖および後退の誘導により損傷修復に関与する(例えば、Cines et al. Blood 91 [1998] 3527-3561参照)。
【００１１】
キャピラリーＥＣは、特異的モノクローナル抗体を用いる免疫磁気ビーズにより、または、磁気ビーズを被覆しているＵｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓレクチン タイプ１により、ヒト組織から単離され得る(例えば、Manconi et al. Meth. Cell Science [2000] 22 89-99参照)。ＥＣのｃＤＮＡライブラリーを作成し得、そしてＥＣの遺伝子発現パターンが、オリゴヌクレオチドフィンガープリント、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションまたはＲＮＡプロファイリングのようなさまざまなハイブリダイゼーション技術により、および慣用的方法の配列決定により、得られ得る。
【００１２】
今回、単離ＥＣのｃＤＮＡライブラリーから、例えば配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有し、かつ、配列番号４で示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するＤＩＮＯポリペプチドをコードする、ＤＩＮＯ遺伝子が単離され得ることも見出された。
【００１３】
樹状細胞(ＤＣ)は、初期の免疫応答および免疫寛容の誘発に中心的な役割を果たす専門的な抗原提示白血球である。未分化の状態において、ＤＣは、侵入病原体の抗原を捕捉するために作られた体のさまざまな組織に存在し得る。抗原の捕捉後、ＤＣは抗原提示細胞へと成熟し、そしてリンパ器官へと移動してＴ細胞を活性化する(Banchereau, M. and R.M. Steinman Nature 329 [1998] 245-252)。例えば、皮膚に存在するランゲルハンス細胞(ＬＣ)は、皮膚において産生されたかまたは皮膚へと浸透し得るさまざまな抗原を提示することが示された。接触過敏症において、反応性ハプテンの局所投与はＬＣを活性化し、表皮の外に出て流入領域リンパ節(draining lymph node)の中へと移動し得、この部位でＬＣは、選択されたＴ細胞に対して抗原を提示し得る。ＬＣとＴ細胞との接触中、ＬＣは、Ｔ細胞に、増殖およびエフェクター細胞への分化を誘導するシグナルを提供し得る。
【００１４】
Ｔ細胞のタイプおよび相互作用する分子の種類に依存して、関与する細胞障害性、調節性およびヘルパーＴ細胞が形成され得る。ＤＣは、また、すべての種類のアポトーシス細胞を貪食し、したがって、自己抗原に対する寛容の維持において重大な役割を果たし得ることが示された(Steinman R.M. and K. Inaba J. Leukoc. Biol. 66 [1999] 205-208)。ＤＣが、免疫応答の主要な調節物質として、原因的または結果的役割を果たす疾患は、ＤＣ特異的な医薬的または医原性診療に関して、例えば慢性炎症性疾患、自己免疫疾患または移植拒絶において、ならびに接触過敏症またはアトピー性皮膚炎のような炎症性皮膚疾患を含む疾患、および有意な病理学的成分がＡＩＤＳおよび癌におけるように免疫抑制性である疾患または症候群において、標的化され得る。
【００１５】
ＤＣは、ネガティブセレクションにより、すなわち、特異的ｍＡＢ被覆マグネチックビーズ上で捕捉することまたは常法にしたがってパニングすることによる単球(ＣＤ１４＋)、Ｔ細胞(ＣＤ３＋)、Ｂ細胞(ＣＤ１９＋)およびＮＫ細胞(ＣＤ１６＋)からの単離により、末梢血から単離され得る。ＤＣのｃＤＮＡライブラリーを作成し得、そしてＤＣの遺伝子発現のパターンは、オリゴヌクレオチドフィンガープリント、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションまたはＲＮＡプロファイリングのようなさまざまなハイブリダイゼーション技術により、および慣用的方法にしたがう配列決定により、得られ得る。
【００１６】
ＤＣの膜貫通レセプターは重要である。何故なら、１つには、それらはＤＣによる抗原提示をもたらす寄生生物およびアポトーシス細胞の取り込みに関与するからである。他方には、これらのレセプターは、可溶性リガンド、ならびにＴ細胞および他の免疫細胞上の表面結合性リガンドと相互作用する。これらの相互作用は、ＤＣの機能ならびにＴ細胞のような相互作用性細胞の機能の調節に関与する。細胞の分化状態および相互作用性リガンドに依存する、これらの調節事象としては、ＤＣ、Ｔ細胞および他の免疫細胞の活性化および阻害が挙げられる。
【００１７】
ＩＩ型膜貫通配向性および細胞外部分にＣ型レクチン様ドメインを有するレセプターが、さまざまな造血細胞上に頻繁に発現されることが見出され、そしていくつかのものは初期の免疫応答において重要な役割を果たすことが示された(Weis W.I., Taylor M.E. and Drickamer K. Immunol. Rev. 163 [1998] 19-34)。造血系の細胞において広く発現されるＣＤ６９およびＡＩＣＬ(Santis A.G. et al. Eur. J. Immunol. 24 [1994] 1692-7; Hamann et al., Immunogenetics 45 [1997] 295-300)のようなタンパク質は別として、いくつかのものは、細胞型発現、例えば近年集中的に研究されているレクチン様ＮＫ細胞レセプターにおいてさらに制限されている。
【００１８】
げっ歯類のＮＫ細胞において最初に検出されたレクチン様ＮＫＲ−Ｐ１およびＬｙ４９遺伝子(Yokoyama W.M. et al. J. Immunol. 147 [1991] 3229-3236)、ならびにヒトＮＫ細胞から最初に記載されたＣＤ９４およびＮＫＧ２遺伝子(Chang C. et al. Eur. J. Immunol 25 [1995] 2433-2437; Houchins J. P. et al. J. Exp. Med. 173 [1991] 1017-1020; Hofer E. et al. Immunol. Today 13 [1992] 429-430)は、マウス第６染色体(Brown M.G. et al. Genomics 42 [1997] 16-25)、ラット第４染色体およびヒト１２ｐ１２．３−ｐ１３．２染色体(Sobanov Y. et al. Immunogenetics 49 [1999] 99-105)の合成領域に現れる。したがって、これらの領域は、ＮＫ遺伝子複合体と呼ばれる。自然の免疫細胞の機能のために重要ないくつかの遺伝子を含む染色体領域(chromosomal area)の概念と矛盾することなく、ウイルス感染への抵抗を仲介するかまたは同種異系リンパ球の溶解を仲介する遺伝子座が、げっ歯類においてこの領域にマッピングされた。
【００１９】
今日において、レクチン様ＮＫレセプターが適切なＭＨＣクラスＩの発現をモニターするのに重要な役割を有することが十分に確立されている(Lopez-Botet M. et al. Semin. Immunol. 12 [2000] 109-119; Hoglund P. Immunol. Rev. 155 [1997] 11-28)。ヒトＮＫ細胞において、ＣＤ９４鎖は、異なるＮＫＧ２アイソフォームとヘテロダイマー性レセプターを形成し、これは非古典的ＭＨＣクラスＩｂ分子ＨＬＡ−Ｅと結合できる。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは阻害性レセプターとして機能し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＣレセプターはＮＫ細胞を活性化できる。ＨＬＡ−Ｅは、他のクラスＩａ分子のリーダー配列からペプチドを提示し、そして適当なペプチドが負荷された場合に表面上に輸送されるのみである。
【００２０】
したがって、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡレセプターによるＨＬＡ−Ｅの認識は、ＭＨＣクラスＩ分子の適切な生合成をモニターするための罹病性の高い機構であり、これは多くのウイルスにより下方調節され得る(Alcami A. and U.H. Koszinowski Immunol. Today 21 [2000] 447-55)。この文脈におけるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターを活性化する機能は、まだ理解されていない。他のＮＫＧ２分子とわずかしか関連がない活性化ＮＫＧ２Ｄレセプターはヘテロダイマーを形成し、そしてクラスＩ様分子ＭＩＣＡを認識し、これはストレス、例えばウイルス感染により、およびいくつかの腫瘍細胞上で上方調節される(Bauer S. et al., Science 285 [1999] 727-729)。マウスにおける対応するＣＤ９４およびＮＫＧ２レセプターは、同様の機能を有すると思われる。
【００２１】
ヒトＮＫレセプター遺伝子のゲノム構造および転写(Glienke J. et al. Immunogenetics 48 [1998] 163-173)ならびにそれらのタンパク質産物の機能(Duchler M. et al. Eur. J. Immunol. 25 [1995] 2923-31)は、従来から研究されてきた。ＮＫＧ２およびＣＤ９４レセプター遺伝子に対する進化および機能に関連する遺伝子を発見する試みにおいて、これらの研究は、約１Ｍｂの両側のこれらの遺伝子に隣接するＮＫ遺伝子複合体の領域を包含するように拡張されてきた。Ｌｙ４９Ｌ偽遺伝子以外に、動原体側でさらなるヒトＬｙ４９遺伝子を検出することはできなかったが(Bull C. et al. Genes and Immunity 1 [2000] 280-287)、今回、ＣＤ９４の４つの関連性レクチン様テロメア性遺伝子の新規クラスターが見出された。このクラスターは、ＬＯＸ−１(Sawamura T. et al. Nature 386 [1997] 73-77)、新規ヒトレクチン様レセプター(ＬＬＲ−Ｊ２４)遺伝子および最近報告されたＣｌｅｃ−１およびＣｌｅｃ−２遺伝子(Colonna M., Samaridis J., Angman L. Eur. J. Immunol. 30 [2000] 697-704)を含む。それらの染色体上の局在性、発現パターンおよびＮＫレセプター遺伝子に対する相同性は、ＤＣ、単球および内皮細胞における重要な固有の免疫機能を示唆している。
【００２２】
ＤＣは、リンパ性および非リンパ性器官における抗原提示細胞集団である(Hart D.N. Blood 90 [1997] 3245-87)。それらは、抗原特異的なＴ細胞の増殖の開始において重要な役割を果たす。未成熟なＤＣは末梢非リンパ性器官に現れ、ここで、それらの主要な機能は、外来性抗原および病原体に関して周囲組織を濾過することである。これらの未成熟ＤＣは抗原取り込みおよびプロセシングにおいて高度に分化し、そして非リンパ性組織に長期間滞在する。抗原取り込み後、これらのＤＣは、リンパ節または脾臓のような二次リンパ器官のＴ細胞に富む領域に移動することができる。これは、ＤＣ成熟(DC maturation)として知られる表現型および機能的変化と深く関連している。このプロセスにおいて、ＤＣは、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子ならびにＣＤ８０およびＣＤ８６のようなＴ細胞共刺激性分子を上方調節する。
【００２３】
成熟ＤＣは、ヘルパーＴ細胞および細胞障害性Ｔ細胞の強力な刺激物質である。ＤＣの分化を先導し、次に、リンパ球の分化をプログラムする分子シグナルを理解することは、ワクチン接種戦略(vaccination strategy)に関してより効果的な免疫応答の操作を可能にするため、または損傷を受けている免疫応答をスイッチオフにすることを可能にするために極めて重要である。ＤＣにおけるＬＬＲ−Ｊ２４の特異的発現および成熟プロセス中のその下方調節についての現在の知見に基づいて、このレセプターがＤＣ成熟またはＴ細胞刺激の間に役割を果たすと考えられる。
【００２４】
ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子は、今回、見出され、単離され、そして単球由来および臍帯血前駆細胞由来ＤＣ(ＭｏＤＣおよびＣＢＤＣ)において選択的に発現された。ヌクレオチド配列番号５で示されるＬＬＲ−Ｊ２４−１遺伝子およびヌクレオチド配列番号７で示されるそのスプライスバリアントＬＬＲ−Ｊ２４−２は、ＮＫＧ２およびＣＤ９４ ＮＫレセプター鎖に関係するが同一ではなく(Houchins J.P. et al., J. Exp. Med. 173 [1991] 1017-1020; Chang C. et al., Eur. J. Immunol. 25 [1995] 2433-7; GenBank受託番号: NKG2A [X54867], NKG2C [X54869], NKG2E [L14542], NKG2H [AF078550], NKG2D [54780])、ｏｘＬＤＬレセプターＬＯＸ−１(Sawamura T. et al. Nature 386 [1997] 73-77; GenBank受託番号 AF035776)および２つの他のレセプター遺伝子がＤＣ、ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２において選択的に発現することが最近見出された(Colonna M. et al. Eur. J. Immunol. 30 [2000] 697-704; GenBank受託番号 CLEC-1 [AF200949], CLEC-2 [AF124841])。
【００２５】
ヒト第１２染色体上のいわゆるＮＫレセプター遺伝子複合体の他のメンバーに対して、幾分さらに離れた関係のものが存在する(Sobanov Y. et al. Immunogenetics 49 [1999] 99-105)。ＬＬＲ−Ｊ２４−１遺伝子は、配列番号５で示されるヌクレオチド配列およびヌクレオチド３５７〜３５８の間に挿入されたｓｔａｌｋペプチドをコードしている追加的エキソンからなるスプライスバリアントＬＬＲ−Ｊ２４−２として単離ＤＣ中に現れ得る。したがって、配列番号５で示されるスプライスバリアントは、スプライスアウトされたヌクレオチド３５８〜４９５を欠くこと以外は、配列番号７と同じである。
【００２６】
ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子は、細胞外部分にＣ型レクチン様ドメイン(ＣＴＬＤ)を有するＩＩ型膜貫通レセプターのサブファミリーの新規メンバーをコードする(Weis W.I. et al. Immunol Rev. 163 [1998] 19-34)。その最も近い類縁体は、マウスＤＥＣＴＩＮ−１(５９％同一性、Ariizumi et al. J. Biol. Chem. 275 [2000] 20157-20167, 受託番号 AF262985)、ヒトＬＯＸ−１(ＣＴＬＤにおいて４４％相同性、Sawamura T. Nature 386 [1997] 73-77; 受託番号 AF035776)、ＣＬＥＣ−１(ＣＴＬＤにおいて３７％相同性、Colonna M. et al. Eur. J. Immunol. 30 [2000] 697-704, 受託番号 AF200949)、ＣＬＥＣ−２(ＣＴＬＤにおいて３７％相同性、Colonna M. et al. Eur. J. Immunol. 30 [2000] 697-704, 受託番号 AF124841)、ＮＫＧ２−Ｄ(ＣＴＬＤにおいて３３％相同性、Houchins J.P. et al. J. Exp. Med. 173 [1991] 1017-1020, 受託番号 X54870)、ＮＫＧ２−Ａ(ＣＴＬＤにおいて３０％相同性、受託番号 X54867)、ＮＧＫ２−Ｃ(ＣＴＬＤにおいて３０％相同性、受託番号 X54869)およびＣＤ９４レセプター(ＣＴＬＤにおいて３１％相同性、Chang C. et al. Eur. J. Immunol. 25 [1995] 2433-7)鎖である。
【００２７】
ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子は、ＮＫレセプター遺伝子複合体中の第１２染色体上に位置し、これはまた、上記のホモログおよび幾分さらに離れた関係の追加的遺伝子を含む。配列番号５で示されるＬＬＲ−Ｊ２４−１遺伝子および配列番号７は、典型的なＣＴＬＤおよびその細胞質側末端におけるＩＴＡＭ様配列をコードする。ＣＴＬＤの配列は、該スーパーファミリーの他のメンバーのすべてのＣＴＬＤと明らかに相同であり、細胞質側末端は他のファミリーのメンバーとあまり関係がないかまたは全く関係がないが、マウスのＤＥＣＴＩＮ−１配列とは明らかに相同性がある。配列番号７で示されるＬＬＲ−Ｊ２４−２遺伝子は、配列番号５と同一であるが、ｓｔａｌｋペプチドをコードする追加的エキソンを含む。ｓｔａｌｋペプチドを有する対応するタンパク質は、配列番号８において示される。ｓｔａｌｋエキソンヌクレオチド配列は、配列番号９で表され、そして対応するｓｔａｌｋペプチドは配列番号１０で表される。
【００２８】
これまでに、ｓｔａｌｋペプチドは細胞表面上のレセプターの発現に必要であり、ｓｔａｌｋのないレセプターは細胞内で発現することが見出された。ＣＴＬＤは、Ｔ細胞のような他の免疫細胞上の表面ペプチド構造に結合する。これは、Ｔ細胞活性化に調節性、例えば共刺激性シグナルを提供し得る。ＤＣ成熟の間、該レセプターは下方調節される。これは、また、Ｔ細胞活性化に対する阻害シグナルを軽減し得る。レセプターの細胞質側ドメインは、リガンドへのＣＴＬＤの結合によりＤＣ成熟を制御する。ＣＴＬＤは、例えば、寄生生物、ｏｘＬＤＬおよびアポトーシス細胞膜の膜構造のようなリポタンパク質構造に結合する。これらの構造を含む細胞および化合物は内在化されて、効率のよい抗原提示をもたらす。ＤＣの貪食作用が減少した場合、レセプターはＤＣ成熟の間、下方調節される。レセプターの細胞質側ドメインは、リガンドへのＣＴＬＤの結合により、ＤＣ成熟の内在化および活性化を仲介する。
【００２９】
ｓｔａｌｋペプチドのないレセプターの細胞内部分は、異常型細胞内構造および寄生生物のモニターに関与し、したがって、配列番号１０で示されるｓｔａｌｋペプチドを含む部分とは別の機能を有する。
【発明の開示】
【００３０】
したがって、本発明は、単離された、
・配列番号２で示されるＩＫＫ２−５５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＩＫＫ２−５５遺伝子；
・配列番号４で示されるＤＩＮＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＩＮＯ遺伝子；または
・配列番号１０で示されるＬＬＲ−Ｊ２４−ｓｔａｌｋペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＬＬＲ−Ｊ２４−ｓｔａｌｋヌクレオチド
を提供する。
【００３１】
さらに、本発明は、単離された、
・配列番号２で示されるＩＫＫ２−５５ポリペプチドをコードする、例えば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含んでなるＩＫＫ２−５５遺伝子；
・配列番号４で示されるＤＩＮＯポリペプチドをコードする、例えば、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含んでなるＤＩＮＯ遺伝子；または
・配列番号１０で示されるｓｔａｌｋペプチドをコードする、例えば、配列番号９で示されるヌクレオチド配列を含んでなるＬＬＲ−Ｊ２４−ｓｔａｌｋヌクレオチド
を提供する。
【００３２】
さらに、本発明は、単離された、
・配列番号２で示されるＩＫＫ２−５５ポリペプチド；
・配列番号４で示されるＤＩＮＯポリペプチド；または
・配列番号１０で示されるＬＬＲ−Ｊ２４−ｓｔａｌｋペプチド
を提供する。
【００３３】
ＩＫＫ２−５５遺伝子、ＤＩＮＯ遺伝子、ＬＬＲ−Ｊ２４−ｓｔａｌｋ遺伝子、膜貫通タンパク質ＬＬＲ−Ｊ２４をコードする単離ポリヌクレオチドおよびＬＬＲ−Ｊ２４の細胞外ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドを、本明細書において、「本発明の遺伝子(複数も可)」と称する。
【００３４】
ＩＫＫ２−５５ポリペプチド、ＤＩＮＯポリペプチド、ＬＬＲ−Ｊ２４−ｓｔａｌｋペプチド、ＬＬＲ−Ｊ２４の細胞外ドメインである単離ポリペプチドおよび膜貫通タンパク質ＬＬＲ−Ｊ２４である単離ポリペプチドを、本明細書において、「本発明のポリペプチド(複数も可)」と称する。
【００３５】
本発明のポリペプチドには、配列番号２、配列番号４および配列番号１０のアミノ酸配列のポリペプチドが含まれ、そして、それぞれ、配列番号２、配列番号４または配列番号１０の対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、および対応する本発明のポリペプチドと同一の生物学的活性、を有するアミノ酸配列が含まれる。本発明のポリペプチドには、対応する本発明の遺伝子によりコードされたポリペプチドが含まれ、これには；例えば、遺伝コードの重複性(縮重)の結果として、また、対応する本発明のポリペプチドをコードする配列；あるいは、例えば、対立遺伝子変異体(allelic variant)および／または本発明の遺伝子の相補物を含む、本発明の遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、「成熟」ポリペプチド、例えばタンパク質の形態であってもよく、または、より大きいポリペプチド、例えばタンパク質、例えば融合タンパク質の部分であってもよい；例えば、分泌性またはリーダー配列、プロ配列、精製において役立つ配列、例えばマルチプルヒスチジン残基(multiple histidine residue)、または本発明のポリペプチドへの組換え産生中の安定性のための追加的配列を含むことは、有利であり得る。
【００３７】
本発明のポリペプチドは、また、本発明のポリペプチドのポリペプチドフラグメントも含む。このようなポリペプチドフラグメントは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と一部が完全に同一であるが、全体は同じでないアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。このようなポリペプチドフラグメントは「独立(free-standing)」であってもよく、またはこのようなポリペプチドフラグメントが、最も好ましくは単一連続領域(single continuous region)として、部分または領域を形成するより大きいポリペプチドの部分であってもよい。好ましくは、このようなポリペプチドフラグメントは、対応する本発明のポリペプチドの生物学的活性を保持する。
【００３８】
本発明の定義されたポリペプチド(フラグメント)配列の変異体も、また、本発明の一部を形成する。好適な変異体は、保存的アミノ酸の置換により指示物から変化したもの、例えば、同様の特徴の別のものと残基を置換したものである。典型的には、このような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間；ＳｅｒおよびＴｈｒの間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの間；ＡｓｎおよびＧｌｎの間；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの間；または、芳香族残基ＰｈｅおよびＴｈｒの間である。任意の組合せで、数個、５〜１０、１〜５、または１もしくは２のアミノ酸が、置換、欠失または追加された変異体が特に好ましい。
【００３９】
本発明のポリペプチド、またはそのフラグメントは、本発明の
・単離天然型ポリペプチド
・組換えにより製造されたポリペプチド
・合成的に製造されたポリペプチドおよび
・このようなポリペプチドの組合せ、
ならびにそれらのフラグメントを含む。
【００４０】
したがって、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントは、適当に、例えば慣用的方法で製造され得る。本明細書において特記しない限り、「単離(isolated)」は、「共存物質から分離された」、例えば天然の状態から「ヒトの手により改変された」という意味を含む。
【００４１】
本発明の遺伝子には、それぞれ、配列番号１、配列番号３および配列番号９で示される対応するヌクレオチド配列、およびそれらの対立遺伝子変異体、およびその相補物、ならびにそれらのスプライスバリアントが含まれ；例えばストリンジェント条件下で、例えば本発明の遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれ、例えば本発明の遺伝子の個々のヌクレオチド配列は、例えば遺伝コードの重複性(縮重)の結果として、本発明の遺伝子の配列と異なるが、本発明の対応するポリペプチドをコードするか、または、それぞれ、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくと８０％の同一性を有するアミノ酸配列の本発明のポリペプチドをコードし、そして本発明のポリペプチドと同じ生物学的活性を有する配列を含む。「ストリンジェント条件」は、本発明の遺伝子のヌクレオチド配列と、それとハイブリダイズする対応するポリヌクレオチド配列との間に、少なくとも８０％、例えば９０％、例えば９５％、９７％または９９％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起きることを含む。
【００４２】
本発明の遺伝子は、対応するポリペプチド、もしくは本発明の対応するポリペプチドの部分(フラグメント)をコードするか、または本発明の対応するコードされたポリペプチドと、例えば該対応するアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも８０％の同一性；例えば８０％〜１００％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９７％、例えば９９％または１００％の同一性；を有するアミノ酸配列のポリペプチドまたはポリペプチドの部分をコードし；該同一性は
【数１】
〔式中、ｎａはアミノ酸変更の数であり、ｘａは当該対応するアミノ酸配列中のアミノ酸の総数であり、そしてｙは１００で除した同一性パーセントである。〕
により計算され；例えば、該遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされたポリペプチド、または対応する遺伝子からの転写物の代替的スプライシングにより作成された対応するアミノ酸配列のアイソフォームを含む。「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度であり、そして、慣用的技術により、例えば市販のコンピュータープログラムを用いて、計算され得る。
【００４３】
本明細書において特記しない限り、「ポリペプチド」は、ペプチド結合により互いに結合した２またはそれ以上のアミノ酸を含んでなる任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書において特記しない限り、「ポリヌクレオチド」は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含み、これは、修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡであるか、あるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであり得、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ；ならびにＲＮＡハイブリッド分子を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４４】
本発明の対応するポリペプチドをコードする本発明の遺伝子は、例えば、ＤＣのｍＲＮＡを用いる逆転写ＰＣＲにより、例えば、発現配列タグ(ＥＳＴ)解析を用いて、ＰＨＡ−活性化リンパ球もしくは内皮細胞、またはＤＣ中のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーから、標準的クローニングおよびスクリーニング法を用いて得られ得る(Adams M.D. et al. Science 252 [1991] 1651-1656; Adams M.D. et al. Nature 355 [1992] 632-634; Adams M.D. et al. Nature 377 Suppl.3 [1995] 174)。本発明の遺伝子は、天然の供給源、例えばゲノム性ＤＮＡライブラリーから得られ得るか、または慣用的方法にしたがって合成され得る。
【００４５】
本発明の遺伝子は、本発明の対応するポリペプチド(フラグメント)の組換えによる製造に有用であり、そして、このような組換えによる製造に用いられる場合、遺伝子配列はそれ自身で成熟ポリペプチド(フラグメント)のためのコード配列；あるいは他のコード配列、例えば、リーダーまたは分泌性配列、プレ−もしくはプロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合タンパク質の部分をコードする配列を有するリーディングフレーム中の成熟ポリペプチド(フラグメント)についてのコード配列、を含み得る。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得る。該マーカー配列は、適当な慣用的マーカー配列、例えばｐＱＥベクター(Qiagen, Inc.)において提供されそしてGentz et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 86 [1989] 821-824において記載されたようなＦＬＡＧ−ｔａｇ(Sigma)またはヘキサ−ヒスチジンペプチド、あるいはＨＡタグであり得る。本発明の任意の遺伝子は、また、非コード５'および３'配列、例えば転写され、翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位ならびにｍＲＮＡを安定化する配列を含み得る。
【００４６】
本発明の遺伝子のヌクレオチド配列と同一であるかまたは十分に同一であるヌクレオチド配列、例えばそのフラグメントまたはそのスプライスバリアントを含むものは、本発明の対応するポリヌクレオチド(フラグメント)をコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノム性クローンを単離するために；そして、例えば、本発明の遺伝子と高い配列相同性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム性クローン(ヒト以外の種からのホモログおよびオーソログをコードする遺伝子を含む)を単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノム性ＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
【００４７】
ハイブリダイゼーションは、例えば、慣用的方法にしたがって行われ得る。典型的には、ある遺伝子配列に類似する配列は、本発明の遺伝子(フラグメント)の配列と８０％同一、好ましくは９０％同一、さらに好ましくは９５％同一である。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド、たとえば少なくとも３０ヌクレオチド、例えば少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約３０〜約５０ヌクレオチド；または全体のｃＤＮＡ配列のコード領域に相当するｃＤＮＡ配列もしくはその任意の部分を含み得る。ヒト以外の種からのホモログまたはオーソログを含む本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得るために、適当なハイブリダイゼーション技術、例えば、適当なライブラリーを、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、対応するポリヌクレオチド配列またはそのスプライスバリアントもしくはそのフラグメントの配列を有する標識プローブでスクリーニングする工程、および該ポリヌクレオチド配列を含有する完全長ｃＤＮＡおよびゲノム性クローンを単離する工程を含んでなる技術が使用され得る。
【００４８】
例えばストリンジェントの、ハイブリダイゼーション技術は、周知である。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、例えば上で定義された通りであるか、代わりに、適当な溶液、例えばホルムアミド、ＳＳＣ、リン酸ナトリウム、Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ溶液、デキストランおよびサケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液、例えば５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭ リン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性、切断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中にて、４０℃付近で一夜インキュベーションし、続いて０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルターを洗浄するという条件である。
【００４９】
さらなる観点において、本発明は、本発明の遺伝子、例えば、ポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。
【００５０】
このようなベクターは、適当に、例えば慣用的方法で製造され得る。適当なベクターは、慣用的方法にしたがって提供され得る。本発明の遺伝子を含んでなるベクターは、例えば宿主細胞において、例えば適合性宿主細胞(compatible host cell)において本発明の遺伝子によりコードされたポリペプチドを組換え的に製造することができる発現系を得るために有用であり得る。本発明のポリペプチドの組換え的製造のために、宿主細胞を、例えば本発明の遺伝子、またはその部分を含んでなるベクターの使用により、例えば遺伝子操作をして、本発明のポリペプチド(フラグメント)を発現させるために、宿主細胞中に発現系を組み込み得る。細胞を使用しない翻訳系は、また、例えば慣用的方法で、例えば本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いて、本発明の遺伝子を製造するために使用され得る。
【００５１】
さらなる観点において、本発明は、例えば自然環境から単離された、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含んでなる発現系、例えば単離前の本発明の遺伝子を含んでなる発現系を提供し、当該発現系またはその部分が適合性宿主細胞中に存在する場合に、当該発現系またはその部分は本発明のポリペプチドを製造することができる。
【００５２】
さらなる観点において、本発明は、
・本発明の発現系を含んでなる単離宿主細胞；
・培養物中での本発明のポリペプチドの製造に十分な条件下で、本発明の発現系を含んでなる単離宿主細胞を培養すること、および培養物から本発明のポリペプチドを回収することを含んでなる本発明のポリペプチドの製造方法；
・適当な培養条件下で、宿主細胞が本発明のポリペプチドを製造するように、宿主細胞を本発明の発現系で形質転換またはトランスフェクトすることを含んでなる、本発明のポリペプチドを製造する組換え宿主細胞の製造方法；ならびに
・適当な培養条件下で、宿主細胞が本発明のポリペプチドを製造するように、宿主細胞を本発明の発現系で形質転換またはトランスフェクトすることにより製造された組換え宿主細胞、
を提供する。
【００５３】
組換え体製造に関して、宿主細胞は、本発明の遺伝子についての発現系またはその部分を組み込むために遺伝子操作され得る。
【００５４】
宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、適当に、例えば慣用的方法にしたがって、例えば、Davis et al. BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986); Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)にしたがって、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質介在性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、衝撃導入(ballistic introduction)もしくは感染、またはタンパク質形質導入にしたがって、行われ得る。適当な宿主細胞は、容易に見出され得る。適切な宿主細胞の例として、例えば連鎖球菌(streptococci)、ブドウ球菌(staphylococci)、大腸菌(E.coli)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、枯草菌(Bacillus subtilis)のような細菌類の細胞；酵母細胞(yeast cell)およびコウジカビ属の細胞(Aspergillus cell)のような真菌の細胞；Drosophila S2 および Spodoptera Sf9 細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、ＣＣＬ３９、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ ２９３、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような単離された動物細胞；および植物細胞が挙げられる。
【００５５】
適切な発現系は、例えば、染色体系、エピソーム系、およびウィルス由来系、例えばバクテリアプラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、イーストエピソーム、挿入エレメント、イースト染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウィルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、フォールポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどを由来とするベクター、ならびにそれらの組合せ由来のベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝エレメント由来のベクター、例えばコスミドやファージミドを含む。発現系は、発現を規定しそして発生させる制御領域を含む。一般的に、維持するか、増殖するか、または宿主細胞内でポリペプチドを生産するためのポリヌクレオチドを発現するのに適した、任意の系またはベクターが使用され得る。適当なヌクレオチド配列は、適当に、例えば慣用的方法にしたがって、例えば Sambrook et al., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL (supra) にしたがって、発現系に挿入され得る。
【００５６】
小胞体の内腔への、細胞膜周辺腔への、または細胞外環境への、翻訳されたタンパク質の分泌のために、適当な分泌シグナルが、所望のポリペプチドに組み込まれてもよい。これらは、異種性のシグナルであり得る。
【００５７】
本発明のポリペプチドをスクリーニングアッセイに使用するために発現させるのであれば、一般的に、ポリペプチドは細胞表面で作られ得る。この場合において、細胞は、スクリーニングアッセイに使用する前に採取され得る。代わって、ポリペプチドは細胞内で作られてもよい。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、組換え細胞培地から、適当に、例えば洗剤抽出(detergent extraction)、超遠心、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー、例えば高速液体クロマトグラフィーなどを含む、慣用的方法にしたがって、回収され、そして精製され得る。本発明のポリペプチドが、単離および／または精製の間に変性した場合は、活性なコンホメーションの再生、例えば変性した本発明のポリペプチドのリフォールディングが、適当な方法、例えば慣用的方法にしたがって行われ得る。
【００５９】
本発明のポリペプチドが細胞内で産生される場合、該細胞を、ポリペプチドの回収前に、例えば溶解し得る。
【００６０】
本発明の遺伝子(フラグメント)、または本発明のポリペプチド(フラグメント)は、動物およびヒトの疾患に対して、処置の発見と診断のための、検査試薬および検査物質として使用され得る。
【００６１】
転写因子ＮＦ−ｋＢは、免疫性および炎症性遺伝子の発現の調節において重要な調節的役割を果たす。ＮＦ−ｋＢの活性化をもたらすシグナル伝達経路の中心的構成成分の１つは、ＩＫＫ２である。ＩＫＫ２と相互作用するタンパク質は、ＩＫＫ２活性に対する調節機能を有し得る。ＩＫＫ２−５５は、酵母ツーハイブリッドスクリーンおよび共免疫沈降においてＩＫＫ２と相互作用することが見出された。それは、ＮＦ−ｋＢ活性ならびに一定のプロモーターの活性を調節することが見出された。したがって、ＩＫＫ２−５５ならびにその薬理学的アゴニストまたはアンタゴニストは、例えば炎症、動脈硬化症、再狭窄、再灌流障害、炎症性腸疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーおよび癌を含む多様な免疫または炎症関連疾患を処置するために使用され得る。
【００６２】
本発明のＤＩＮＯ遺伝子は、約３５０のアミノ酸のＣ末端ＨＥＣＴドメインおよびＮ末端にさまざまな数のＲＣＣ１リピートを典型的に含むＨＥＲＣタンパク質ファミリーに属することが見出された。ＨＥＣＴドメインタンパク質は、ユビキチンを、Ｅ２結合酵素から、プロテアソームによる分解が運命付けられた特異的基質に、移動させるＥ３ユビキチンリガーゼのサブファミリーを構成する。ＨＥＲＣファミリーのメンバーのための基質は、細胞サイクルの制御(サイクリンＥ、ｐ２１およびｐ５３)、癌(Ｅ６−ＡＰ)およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーのＢＭＰシグナル伝達の調節に関与することが示された(Mitsui et al. BBRC 266 [1999] 115-122; Cruz et al. FEBS letters 488 [2001] 74-80; Scheffner et al. Cell 75 [1993] 495-505; Zhu et al. Nature 400 [1999] 687-693)。
【００６３】
酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、ＤＩＮＯはＴＳＧ１０１遺伝子と相互作用できることが見出された。ＴＳＧ１０１は、ＴＳＧ１０１／ＭＤＭ２調節ループを形成することによりＭＤＭ２分解およびＭＤＭ２／ｐ５３フィードバック制御を調節する(Li et al. PNAS 98 [2000] 1619-1624)。さらに、レポーター遺伝子アッセイを用いて、ＤＩＮＯの発現はｐ５３転写活性を増大させることが見出された。ＤＩＮＯは、ＴＳＧ１０１とＭＤＭ２／ｐ５３ループとの間の機能的相互作用に深く関与し、したがって、細胞増殖、アポトーシスおよび炎症性応答のメディエーターであると考えられる。
【００６４】
ＤＩＮＯは、５つのＲＣＣ１リピートをＮ末端に有し、そして３つの完全および半分のリピートを有するＣｅｐ１と異なる。ＲＣＣ１は、低分子量ＧＴＰａｓｅ Ｒａｎのグアニンヌクレオチド交換因子(ＧＥＦ)である(Bischoff and Ponstingl Nature 354 [1991] 80-82)。ＤＩＮＯは、低分子量ＧＴＰａｓｅを同定するために今のところＧＥＦ活性を発揮すると考えられ得、したがって、細胞増殖、細胞骨格形態および細胞内輸送の調節に関与し得る。
【００６５】
ＤＩＮＯは、Ｈｅｒｃ３およびＣｅｐ１を含むクラスターとして染色体４．２１−２３上に位置し得る。
【００６６】
ＬＬＲ−Ｊ２４−１および−２遺伝子は、細胞外部分にＣＴＬＤを有するＩＩ型膜貫通レセプターのスーパーファミリーに属することが見出された(Weis W.I. et al. Immunol. Rev. 163 [1998] 19-34)。これらのレセプターの遺伝子の重要な部分は、ヒト第１２染色体上のＮＫレセプター複合体中に位置する(Sobanov, Y. et al. Immunogenetics 49 [1999] 99-105)。レセプターのＣＴＬＤは、典型的には、３つのエキソンによりコードされる。ＣＴＬＤは、進化の過程で、Ｃ型糖認識ドメイン(carbohydrate recognition domain)から発達した。これはレクチン折りたたみ結合Ｃａ＋＋を含み、そして肝アシアロ糖タンパク質レセプターのような糖リガンドを有していた。
【００６７】
ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子の結合ドメインは、ＣＴＬＤの修飾された特徴を有し、例えばそれはＣａ＋＋と独立して折りたたむことができ、そして非糖性リガンドと結合することができる。他のＣＴＬＤファミリーの遺伝子とＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子との関係を確立するために、ＣＴＬＤの予想アミノ酸配列を比較した。得られたデータにより、ＬＬＲ−Ｊ２４が、ＬＯＸ−１、ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２とともに、ＮＫＣのより近い関係のレクチン様レセプターのサブファミリーを形成することが示される。ＬＬＲ−Ｊ２４との最も高い相同性は、ＬＯＸ−１において見られ(４４％)、ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２は幾分さらに離れた関係である(３７％)。ＮＫＧ２およびＣＤ９４タンパク質からなるＣＴＬＤ ＮＫレセプターのサブファミリーは、その次に近い関係のタンパク質である(ＮＫＧ２−Ｅに関して２８％およびＮＫＧ２−Ｄに関して３３％)。ＡＩＣＬ／ＬＬＴ−１／ＣＤ６９グループならびにＫＬＲＦ１、ＭＡＦＡおよびＮＫＲ−Ｐ１レセプターは、さらに幾分、より離れており、そしてマルチプルアラインメントにおいて別々の枝に示される。
【００６８】
ＬＯＸ−１は、血管内皮細胞およびマクロファージにより発現されることが見出された。それは、ＴＮＦ−α、リポポリサッカライドおよびｏｘＬＤＬのような炎症性の刺激により、in vivo で動力学的に調節されるが、高血圧においてはＴＧＦ−β、アンギオテンシンＩＩおよび流体せん断力(fluid shear stress)によっても調節される。重要なことに、ＬＯＸ−１は、泡沫細胞形成および内皮機能障害に寄与すると信じられているアテローム性動脈硬化症の病変において上方調節されいることが見出された。ｏｘＬＤＬおよび陰イオン性リン脂質ならびに加齢赤血球細胞およびアポトーシス細胞を結びつけることが記載された(Sawamura T. et al. Nature 386 [1997] 73-77)。加齢またはアポトーシス細胞における最初の事象の１つは、細胞膜の外側のホスファチジルセリンの曝露であり、これはＬＯＸ−１により認識されそして結合する。したがって、ＬＯＸ−１は、血流からそれらの細胞を除去することに関与すると提案されている。ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターのような他のレクチン様レセプターのリガンド結合により開始されたシグナル伝達事象とは対照的に、ＬＯＸ−１に結合した分子および細胞フラグメントは、エンドサイトーシスにより内面化される。
【００６９】
ＬＯＸ−１と同様に、ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子は、ｏｘＬＤＬのような酸化されたリポタンパク質、寄生生物の表面構造およびアポトーシス細胞のフラグメントと結合すると考えられ得る。
【００７０】
他の２つの密接に関係した遺伝子は、ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２と呼ばれ、対応するｃＤＮＡは、近年、ＥＳＴデータベースにおいて同定され、そして記載された(Colonna M. et al. Eur. J. Immunol. 30. [2000] 697-704)。ＣＬＥＣ−１ ｍＲＮＡはＤＣにおいて選択的に発現されることが示され、そして、胎盤、肺および胸腺においても見出される。ＣＬＥＣ−２ ｍＲＮＡも、ＤＣにおいて検出されるが、さらに、造血系においてさらに広範な発現を示した。さらに、ＣＬＥＣ−２ ｍＲＮＡレベルは、肝臓においてとりわけ高い。ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２のリガンドは、まだ、同定されていない。
【００７１】
その次に近い関係の遺伝子は、ＮＫＧ２ ＮＫレセプターの遺伝子である。今日においては、レクチン様ＮＫレセプターは、ミッシング−セルフ(missing-self)仮説にしたがって適切なＭＨＣクラスＩ発現をモニターするのに重要な役割を有することが十分に確立されている(Hoglund P. et al. Immunol. Rev. 155 [1997] 11-28)。ヒトＮＫ細胞において、ＣＤ９４鎖は異なるＮＫＧ２アイソフォームとヘテロダイマー性レセプターを形成し、これは非古典的ＭＨＣクラスＩｂ分子ＨＬＡ−Ｅと結合することができる(Lopez-Botet M. et al. Semin. Immunol. 12 [2000] 109-119)。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、阻害性レセプターとして機能し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターは、ＮＫ細胞を活性化することができる。ＨＬＡ−Ｅは、優勢的に、他のクラスＩ分子のリーダー配列からペプチドを提示し、そして、適当なペプチドとともに負荷された場合に、表面上に輸送されるのみである。したがって、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡレセプターによるＨＬＡ−Ｅの認識は、ＭＨＣクラスＩ分子の生合成をモニターするための感度の高いメカニズムであり、これは多くのウイルスにより下方調節され得る。この文脈における活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターの機能は、まだ十分には理解されていない。
【００７２】
他のＮＫＧ２分子と少し離れた関係の、活性化ＮＫＧ２Ｄレセプターは、ホモダイマーを形成し、そしてクラスＩ様分子ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢを認識し、これはストレス、例えばウイルス感染により、およびいくつかの腫瘍細胞において、上方調節される(Bauer S. et al. Science 285 [1999] 727-729)。さらなるリガンドは、いわゆるＵＬ１６結合タンパク質であり、これはＣＭＶコードＵＬ１６タンパク質と結合し、そしてまた、腫瘍細胞において上方調節される。したがって、ＮＫＧ２−Ｄは、ウイルスに感染しそして形質転換した細胞の、ＮＫ介在性殺傷に直接関連する活性化レセプターである。ＮＫＧ２タンパク質の中で、ＬＬＲ−Ｊ２４がＮＫＧ２−Ｄに最も近く関係していることに注目すべきである。マウスにおける対応するＣＤ９４およびＮＫＧ２タンパク質は、比較可能な機能を有するように見える。さらに、マウスにおいて、Ｌｙ４９レセプターの１４を超えるアイソフォームが、さまざまなＭＨＣクラスＩ分子の発現のモニターに関係している。
【００７３】
ＮＫＧ２レセプターと同様に、ＬＬＲ−Ｊ２４は一定のＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体に、またはウイルス感染および腫瘍細胞で上方調節されたクラスＩ関連分子に、結合できると考えられている。
【００７４】
ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子の配列は、最初に単離されたヒトｃＤＮＡからｓｔａｌｋエキソンが失われていることを除いて、最近記載されたネズミＤＥＣＴＩＮ−１ ｃＤＮＡと高い相同性を示す。これは、約５〜１０％の転写物の細分画(subfraction)において正しくスプライシングされることが見出されると測定され得(図９および１０)、マウスおよびヒトＤＥＣＴＩＮ−１の対応する予想完全長タンパク質配列を比較した。両配列は、５９％の同一性(相同性６９％)を示す。高い相同性が、細胞質、およびｓｔａｌｋドメインを含む細胞外ドメインにおいて保存されている。細胞質ドメインのＮ末端の近くに、ＩＴＡＭ様配列が、ヒトならびにネズミのそれにおいて存在する。
【００７５】
この配列は、ＣＤ３−γ鎖またはＤＡＰ１２分子において見出された古典的ＩＴＡＭモチーフとは少し異なる(Lanier L.L. et al. Nature 391 [1998] 703-707)。該モチーフにおける最初のチロシン(残基３)は、ロイシン(残基７)の４アミノ酸前に位置するが、この距離は、古典的Ｙｘ２Ｌｘ６〜８Ｙｘ２Ｌモチーフにおける３アミノ酸の位置である。該モチーフの次の残基は正しく配置されている。両タンパク質は、さらに、Ｎ−グリコシル化のためのコンセンサス部位を示す。ヒトおよびネズミのレクチン様ドメインは、非糖リガンドを提示するＣａ＋＋結合に関与すると記載された残基のほとんどを欠いている。膜貫通ドメインは、荷電アミノ酸を示さず、これはＤＡＰ分子のようなＩＴＡＭ含有アダプターとの会合が起きていないことを示している。
【００７６】
一次ヒトＤＣ、単球、ＴおよびＢリンパ球ならびに内皮細胞におけるＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの発現も、また、調べられた。得られたデータにより、ヒトＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡは、単球由来ＤＣ(ＭｏＤＣ)においておよびＣＤ３４＋造血前駆細胞由来のＤＣ(ＨＰＤＣ)において、大量にそして選択的に発現している。少量のＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡが一次単球中に存在するが、さまざな刺激で処理されたまたは処理されていない、一次ＴおよびＢリンパ球ならびに内皮細胞は、検出可能なＬＬＲ−Ｊ２４転写物を発現しない。いくつかのさらなる細胞株、すなわちＪｕｒｋａｔ、ＲＰＭＩ８８６６、ＮＫＬおよびＮＫ９２を含むノーザンブロットにおいて、発現は見られない。ＤＣにおけるＲＮＡのサイズは、ノーザンブロットから３．０〜３．５ｋｂと見積もられ、これは、停止コドンから１．６〜１．９ｋｂ下流の領域の遺伝子において検出された第１のまたはいくつかの連続的ポリアデニル化シグナルの使用を仮定して期待される転写物のサイズに相当する。
【００７７】
ＤＣの活性化および最終的成熟は、それらの移動および機能を調節する遺伝子の改変された発現と関連する。したがって、炎症メディエーター、ＣＤ４０−リガンドまたはザイモサンＡによるＤＣの活性化がＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの発現レベルに変化をもたらすかどうかについて試験された。図８において示された通り、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αと組み合せたＭｏＤＣの１８〜２４時間の処理は、再生可能な、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの３〜５倍の減少をもたらした。代わって、ＨＰＤＣは、酵母粒子のファゴサイトーシスを刺激するザイモサンＡの非存在または存在下で、ＣＤ４０レセプターに特異的なｍＡｂにより活性化された。これらの結果に基づいて、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの下方調節が、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのような成熟の強力な誘発剤またはファゴサイトーシス刺激と組み合せたＣＤ４０ライゲーションで処理した培養物において特異的に表わされる。ＭＤＣケモカイン(ＣＣＬ２２)は、ＤＣにおいて成熟後に強力に誘導されることが知られているので、同じノーザンブロットを、ＭｏＤＣまたはＨＰＤＣの活性化の成功を確認するために、ＭＤＣのための特異的プローブとハイブリダイズさせた。図８において見られるように、ＭＤＣの強力な誘導は、両方のタイプのＤＣにおけるＬＬＲ−Ｊ２４転写物の下方調節と平行する。
【００７８】
ＬＬＲ−Ｊ２４−１は、ｓｔａｌｋエキソン領域を欠いているので、ＤＣからのＬＬＲ−Ｊ２４転写物中のｓｔａｌｋエキソンの存在が調べられた。ノーザンブロット解析では、１４１塩基のみ異なることが予想された転写物を区別することができなかった。したがって、第２および第４のエキソンの間のフラグメントを増幅するためのプライマー対を用いて、逆転写ＰＣＲを行った。５０５ｂｐおよび３６７ｂｐの２つの生成物を得、これらは、それぞれ、ｓｔａｌｋエキソンを有するおよび有さない予想フラグメントのサイズに対応する(図９および１０)。該生成物の約５〜１０％がｓｔａｌｋエキソンを含むサイズであると見積もられる。
【００７９】
この上側のバンドをゲルから削り取り、サブクローニングし、２つの得られたクローンを配列決定した。両クローンは、ゲノム配列から予想された通り、正しくスプライシングされたｓｔａｌｋエキソンを表した。プライマー対で得られたＰＣＲフラグメントをさらに解析し、これは、それぞれ、５'−非翻訳領域からｓｔａｌｋエキソンまで、およびｓｔａｌｋエキソンから第６エキソンまでのｍＲＮＡのフラグメントを増幅する。両方の場合において、得られた主生成物は、正しくスプライシングされたエキソンについて予想されたサイズに対応した。これらのデータにより、ＬＬＲ−Ｊ２４転写物がｓｔａｌｋエキソンを含み、そして他のエキソンの位置でも正しくスプライシングされることが示される。
【００８０】
ＩＩ型レクチン様レセプターは、通常、ダイマーを形成し、そしてホモダイマーまたは２つの異なるレセプター鎖を組み合せたヘテロダイマーのいずれかを形成することが示されている。一定の場合において、異種性レクチン様レセプター鎖とのダイマー形成は、表面発現に必要であることが示されている。このことは、例えば、ＮＫＧ２／ＣＤ９４レセプターについて当てはまる(Carretero M. et al. Eur J Immunol. 27 [1997] 563-567)。したがって、それぞれの発現構築物で一過性にトランスフェクトした後に、２９３細胞およびＨＵＶＥＣにおけるＦＬＡＧタグ化組換えＬＬＲ−Ｊ２４の表面発現を評価した。表面発現を評価するために、抗−ＦＬＡＧ抗体での非浸透細胞の染色を、染色手順の前にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を浸透させた細胞のサンプルと平行化するために比較した。ＬＬＲ−Ｊ２４について、ｓｔａｌｋエキソンを有するおよび有さない構築物が使用された。
【００８１】
完全長ＬＬＲ−Ｊ２４は、非浸透細胞の強い染色により示されるように、ＨＵＶＥＣの細胞表面に効率的に蓄積した(図６Ａ)。対照的に、ｓｔａｌｋを有さない検出可能なレベルのＬＬＲ−Ｊ２４アイソフォームは、非浸透細胞上で観察されなかったが、浸透細胞の有意な細胞内染色が得られた。より高い倍率での浸透細胞の、より精密な解析により、完全長ＬＬＲ−Ｊ２４−２発現構築物でトランスフェクトされた細胞が核周辺細胞構成成分ならびに全細胞に及んで観察可能な表面発現の強い染色を示すことが明らかにされた(図６Ｂ)。ｓｔａｌｋのないＬＬＲ−Ｊ２４−１は、細胞質全体に均質に分配されることが観察されるが、表面上では観察されない。同様の結果が、２９３細胞に関して得られた(データ示さず)。
【００８２】
さらなる観点において、本発明は、
・膜貫通タンパク質ＬＬＲ−Ｊ２４をコードする単離ポリヌクレオチド；
・ＬＬＲ−Ｊ２４の細胞外ドメインをコードする単離ポリヌクレオチド；
・ＬＬＲ−Ｊ２４の細胞外ドメインである単離ポリペプチド；および
・膜貫通タンパク質ＬＬＲ−Ｊ２４である単離ポリペプチド
を提供する。
【００８３】
本発明は、また、診断試薬としての、本発明の遺伝子の使用を提供する。
機能障害と関係する、本発明の遺伝子の変異形の検出は、例えば、加え得る、または対応する遺伝子もしくはその変異体、および／または本発明のポリペプチドの、過少発現、過剰発現、または改変された発現に起因する疾患の診断または疾患の罹病性(susceptability)を定義し得る、例えば診断アッセイにおける、診断ツールを提供する。対応する遺伝子において変異を有する個体は、慣用的方法にしたがって、ＤＮＡレベルで検出され得る。
【００８４】
診断のための核酸は、対象の細胞、例えば、血液、尿、唾液、細胞診の組織、または検死の試料から得られ得る。ゲノムＤＮＡは、検出に直接的に使用されるか、または分析の前にＰＣＲもしくは他の増幅技術を用いることによって、酵素的に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同様に分析において使用され得る。欠失と挿入は、通常の遺伝子型と比べて、増幅された生成物のサイズの変化によって検出され得る。点変異(point mutation)は、本発明の標識遺伝子ヌクレオチド配列に、増幅したＤＮＡをハイブリダイズさせることによって同定され得る。
【００８５】
完全に一致した配列は、ＲＮａｓｅ消化によって、または融点の違いによって、一致しない二重鎖と区別され得る。ＤＮＡ配列の違いは、また、変性試薬での、または変性試薬なしでの、ゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動での移動度の変化によって、または例えば Myers et al. Science 230 (1985) 1242 にしたがって、直接ＤＮＡ配列決定によって検出され得る。特異的な位置での配列の変化は、また、ヌクレアーゼ保護アッセイにより、例えばＲＮａｓｅおよびＳ１保護法、または化学的切断方法、例えば、Cotton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1985) 4397-4401 にしたがって、明らかにされ得る。本発明の遺伝子ヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含んでなるオリゴヌクレオチド・プローブのアレイは、例えば遺伝子の変異などの効果的なスクリーニングを実施するために構成され得る。アレイ技術方法は、例えば M. Chee et al. Science 274 (1996) 610-613 にしたがって、遺伝子発現、遺伝子結合、および遺伝子可変性を含む、分子遺伝子学における様々な問題を扱うために使用され得る。
【００８６】
本発明のＩＫＫ２−５５遺伝子の場合において、診断アッセイは、本発明の遺伝子における変異の検出を通して、疾患、例えば、炎症、動脈硬化症、再狭窄、再灌流障害、炎症性腸疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーおよび癌を含む、例えば免疫性または炎症性疾患の罹病性を診断または測定する方法を提供する。
【００８７】
本発明のＤＩＮＯ遺伝子の場合において、診断的アッセイは、例えば炎症性疾患、例えば急性または慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、癌、アテローム性動脈硬化症および再狭窄を含む疾患の罹病性を診断または測定する方法を提供する。
【００８８】
本発明のＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子の場合において、診断的アッセイは、例えば慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、接触過敏症およびアトピー性皮膚炎のような炎症性皮膚疾患、またはウイルス誘導性免疫抑制、例えばＡＩＤＳを含む不釣合いの、増加したまたは減少したＤＣ機能に関連する疾患の罹病性、例えばあらゆる形態のウイルス、細菌、寄生生物感染疾患および癌の罹病性を診断または測定する方法を提供する。
【００８９】
疾患は、例えば慣用的方法にしたがって、例えば、対象由来の試料から、異常に減少したまたは増加したレベルの本発明の遺伝子またはポリペプチドまたは遺伝子ｍＲＮＡを測定することを含んでなる方法により、診断され得る。減少したまたは増加した発現は、ＲＮＡレベルで、例えばポリヌクレオチドの定量のための慣用的方法にしたがって、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護法、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法にしたがって、測定され得る。宿主由来の試料において、タンパク質、例えば本発明のポリペプチドのレベルを測定するために使用され得るアッセイ技術は、例えば常法としての慣用的方法にしたがって行われ得る。このようなアッセイ技術としては、例えばラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ(competitive-binding assay)、ウエスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【００９０】
したがって、さらなる観点において、本発明は、疾患または疾患の罹病性、例えば上記のもの、のための診断用キットであって；主な構成要素として、
ａ)本発明の遺伝子(例えば、その対立遺伝子変異体、またはそのフラグメント、またはスプライスバリアントを含む)；
ｂ)(ａ)のヌクレオチド配列に相補的な配列；
ｃ)本発明のポリペプチド(例えば、それと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチドを含み、例えば、本発明のポリペプチドのフラグメントもしくは変異体、または本発明の当該ポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチドのフラグメントまたは変異体を含む)；あるいは、
ｄ)本発明のポリペプチドに対する抗体；
を含んでなるキットを提供し、
例えば、いずれの該キット(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、または(ｄ)も、例えば試験されるべき試料の適当な環境、例えば試験されるべき試料中のａ)、ｂ)、ｃ)もしくはｄ)のいずれかの効果を測定するのに適当な方法、を含む本質的構成要素を含み得る。
【００９１】
本発明の遺伝子は、また、染色体同定に有用である。配列は、特異的に標的化され、そして個々のヒト染色体上の特定の場所でハイブリダイズし得る。染色体に対する本発明の関連配列のマッピングは、それらの配列を、遺伝子関連疾患と相関させる重要な第１段階である。配列は、一旦正確な染色体の位置にマップされれば、染色体上の配列の天然の位置を、遺伝子マップデータに相関し得る。相当するデータは、例えば V. McKusick Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを通じてオンラインで利用可能である)に開示されている。同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係は、連鎖解析(物理的に隣接した遺伝子の同時受継)によって同定され得る。影響がある個体と影響がない個体の間の、ｃＤＮＡもしくはゲノム配列における相違もまた、測定され得る。変異が、幾つかのまたは全ての影響がある個体において観察されるが、普通の個体において全く観察されなければ、該変異は疾患を引き起こす原因である可能性がある。
【００９２】
したがって、例えばＩＫＫ２−５５は、長い形態のＡＰＡＦ１(アポトーシス性プロテアーゼ活性化因子１)に非常に近接して、染色体１２ｑ２３．１に位置し、そして本発明のＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子は、ＮＫレセプター遺伝子複合体の第１２染色体の短腕での染色体同定に使用され；ウイルス性疾患および関節炎の罹病性が、げっ歯類において同様の合成領域にマッピングされた。
【００９３】
本発明のポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはこのような本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントを発現している細胞は、また、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を作成するための免疫原として使用され得る。「免疫特異的(immunospecific)」なる用語は、抗体が、他の関係のあるまたは関係のないポリペプチドとの親和性よりも、本発明のポリペプチドに関して実質的により大きい親和性を有することを意味する。
【００９４】
本発明のポリペプチドに対して作成された抗体は、例えば、このようなポリペプチド、またはエピトープ−担持フラグメント−アナログまたは細胞を、動物、好ましくは非ヒトに、通常の手順を用いて投与することにより得られ得る。モノクローナル抗体の調製のために、例えば連続継代細胞系培養(continuous cell line culture)により製造された、抗体を提供する適当な技術、例えばハイブリドーマ技術(Kohler, G. and C. Milstein Nature 256 [1975] 495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al. Immunology Today 4 [1983] 72)およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. [1985] 77-96)が使用され得る。
【００９５】
また、一本鎖抗体を製造するための技術(例えば、米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を製造するために適用され得る。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生物が、ヒト化抗体を発現させるために使用され得る。上記の抗体は、例えば、本発明のポリペプチドを発現しているクローンの単離または同定において、あるいは、アフィニティークロマトグラフィーによる本発明のポリペプチド(フラグメント)の精製のために、使用され得る。
【００９６】
本発明のポリペプチドに対する抗体は、また、疾患の処置において、例えば、ＤＩＮＯ遺伝子に対する抗体の場合には、炎症性疾患、例えば急性または慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、癌、アテローム性動脈硬化症および再狭窄のような疾患において；あるいはＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子に対する抗体の場合には、例えば接触過敏症、アトピー性皮膚炎のような炎症性皮膚疾患を含む、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶において、またはウイルス誘導性免疫抑制、例えばＡＩＤＳ、例えばウイルス、細菌、寄生生物感染疾患および癌に対するあらゆる形態での罹病性において、有用であり得る。
【００９７】
さらなる観点において、本発明は、本発明のポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明の抗体としては、ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドおよびウイルス、細菌または真核性寄生生物あるいは癌細胞に結合する二重特異性抗体(bispecific antibody)が挙げられる。
さらなる観点において、本発明は、ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドおよびウイルス、細菌または真核性寄生生物に結合する二重特異性抗体を提供する。
【００９８】
さらなる観点において、本発明は、ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドおよび癌細胞に結合する二重特異性抗体を提供する。
二重特異性抗体の代わりに、ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドおよびウイルス、細菌または真核性寄生生物あるいは癌細胞に結合する能力を有する別の二重特異性試薬も使用され得る。
【００９９】
さらなる観点において、本発明は、抗体でなく、かつ、ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドおよびウイルス、細菌または真核性寄生生物あるいは癌細胞に結合する能力を有する、二重特異性試薬を提供する。
【０１００】
さらなる観点において、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、ベクターを介して本発明のポリペプチドを送達すること、該動物を疾患から保護するための抗体を産生する免疫応答を誘導するために、in vivo で対応する本発明の遺伝子の発現を指示することを含んでなる方法；ならびに、
いっそうさらなる観点において、哺乳動物の宿主に導入された場合に、その哺乳動物において本発明のポリペプチドに対する免疫応答を誘導する免疫／ワクチン製剤(組成物)であって、本発明のポリペプチドまたは本発明の遺伝子を含んでなる組成物；
を提供する。
【０１０１】
さらなる観点において、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、哺乳動物に、それぞれ、疾患、例えば上記の疾患から該動物を保護するための抗体および／またはＴ細胞免疫応答を産生するのに適当な、本発明のＤＩＮＯポリペプチドもしくはそのフラグメント、または本発明のＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドもしくはそのフラグメントを接種することを含んでなる方法を提供し、ここで、本発明のＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドは、好ましくは配列番号６または配列番号８で示されるもの、さらに好ましくは配列番号８で示されるものである。
【０１０２】
ワクチン製剤は、さらに、適当な担体を含み得る。本発明のポリペプチドは、胃において分解され得るので、好ましくは非経腸的に(皮下、筋肉内、静脈内、皮内などの注射を含む)投与され得る。非経腸投与に適した免疫／ワクチン製剤としては、例えば、レシピエントの血液と等張な製剤を与える抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および溶質を含み得る水性および非水性の滅菌注射用溶液；ならびに懸濁化剤または増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。該製剤は、単回投与または複数回投与容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提供され得、そして、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥条件で保存され得る。ワクチン製剤は、また、その製剤の免疫原性を増大させるアジュバントシステム、例えば水中油(oil-in-water)システムおよび他の適当なシステムを含み得る。投与量は、ワクチンの特定の活性に依存し、そして通常の実験により容易に決定され得る。
【０１０３】
本発明のポリペプチドは、多くの生物学的機能、例えば多くの病的状態の基礎をなす機能に関与し得る。したがって、例えば生物学的に適合して、例えば転写的に、活性化し、そして／または本発明のポリペプチドの活性を刺激するか、あるいは一方において本発明の遺伝子の発現を刺激し(アゴニスト)、そして他方において本発明のポリペプチドの機能または本発明の遺伝子の発現を阻害できる(アンタゴニスト)、化合物および薬物を発見することが望ましい。したがって、本発明のポリペプチドまたはその機能ミメティクス(functional mimetics)、例えば、Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2) Chapter 5 (1991)に記載のものは、例えば細胞、細胞の入っていない製剤、化学ライブラリー、および天然物の混合物において、例えばスクリーニングアッセイにおいて、本発明のレセプターポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの結合を評価するために使用され得る。
【０１０４】
本発明のＩＫＫ２−５５ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば免疫または炎症関連疾患を含む疾患、例えば炎症、動脈硬化症、再狭窄、再灌流障害、炎症性腸疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーおよび癌の処置において使用され得る。
【０１０５】
本発明のＤＩＮＯポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば炎症性疾患、急性または慢性、自己免疫疾患、移植拒絶、癌、アテローム性動脈硬化症および再狭窄の処置において使用され得る。
【０１０６】
本発明のＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶を含む疾患、例えば炎症性皮膚疾患、例えば接触過敏症、アトピー性皮膚炎、またはウイルス誘導性免疫抑制、例えばＡＩＤＳ、例えばウイルス、細菌、寄生生物感染、および癌に対するあらゆる形態の罹病性の処置において使用され得る。
【０１０７】
例えば低分子量化合物(ＬＭＷ)またはアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、本発明の遺伝子の発現の刺激または阻害は、好ましくは、それぞれ、ＥＣまたはＤＣの生理／機能に対して、対応する本発明のポリペプチドおよびそのリガンドの効果を調節し得る。
【０１０８】
スクリーニング手順は、ＩＫＫ２−５５またはＬＬＲ−Ｊ２４の場合において、その表面に本発明のポリペプチドのレセプターを発現している適当な細胞の作成を含み得る。適当な細胞としては、例えば哺乳動物、酵母およびショウジョウバエからの細胞が挙げられる。ＩＫＫ２−５５の場合において、ＩＫＫ２−５５を発現している細胞；およびＬＬＲ−Ｊ２４の場合において、そのレセプターを発現している細胞(またはその発現レセプターを含む細胞膜)は、結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察するために、試験(候補)化合物と接触させられてもよい。
【０１０９】
スクリーニングアッセイは、候補化合物の結合を試験するために使用され得、ここで、それぞれ、ＩＫＫ２−５５またはＬＬＲ−Ｊ２４レセプターを担持する細胞が、候補化合物と直接的もしくは間接的に結合した標識により、または標識競合性物質での競合を含むアッセイにおいて、検出され得る。スクリーニングアッセイは、さらに、候補化合物が、それぞれ、表面にＩＫＫ２−５５またはＬＬＲ−Ｊ２４レセプターを担持する細胞に適した検出系を用いて、レセプターの活性化により産生されたシグナルをもたらすかどうかを試験するために使用され得る。活性化のインヒビターは、既知のアゴニストの存在下でアッセイされ得、そして、候補化合物の存在下でアゴニストによる活性化に対する効果が観察され得る。
【０１１０】
スクリーニングアッセイは、混合物を形成させるために、候補化合物を、本発明のポリペプチドを含有する溶液と混合する工程、該混合物中の該ポリペプチドの活性を測定する工程、および該混合物の活性を標準物質の活性と比較する工程を含み得る。
【０１１１】
本発明の遺伝子(ｃＤＮＡ)、本発明のポリペプチドおよび本発明のポリペプチドに対する抗体は、また、細胞における当該遺伝子(ｍＲＮＡ)および当該ポリペプチドの産生に対する候補化合物の効果を検出するためのスクリーニングアッセイを提供するために使用され得る。例えば、ＥＬＩＳＡは、慣用的方法にしたがって、例えばモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を用いて、該ポリペプチドの細胞結合レベルを測定するために作られ得、そしてＥＬＩＳＡは、適当に処理された細胞または組織中で、該ポリペプチドの産生または活性を、阻害し得るまたは増加し得る薬剤(アンタゴニストまたはアゴニスト)を発見するために使用され得る。スクリーニングのためのアッセイは、例えば慣用的方法にしたがって、実施され得る。
【０１１２】
本発明の遺伝子のアゴニスト(アンタゴニスト)候補物の例は、抗体、または幾つかの場合においては、該遺伝子のリガンド(該遺伝子のポリペプチドに結合するアンタゴニスト)に密接に関連した、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質(ポリペプチド)、例えば該リガンドのフラグメント、あるいは、レセプターに結合するが応答を誘発せず、その結果、レセプターの活性を妨げる小分子を含む。
【０１１３】
本発明のアゴニスト(アンタゴニスト)の候補物の例としては、例えばオリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ミメティクス、小分子、例えば低分子量(ＬＭＷ)化合物を含む、本発明のポリペプチドに結合する化合物が挙げられる。
【０１１４】
したがって、さらなる観点において、本発明は、本発明のポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイを提供し、該アッセイは、主な構成要素として、
ａ)本発明のポリペプチド；
ｂ)本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞；
ｃ)本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または
ｄ)本発明のポリペプチドに対する抗体；
および、例えば候補化合物と接触させる手段；例えば、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する候補化合物の効果を測定する手段；
例えば、候補化合物の存在下で、本発明のポリペプチドの産生および／または生物学的活性が、減退するかまたは増加するかを測定する手段、例えば候補化合物の存在下および非存在下での、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかの活性を比較することによる手段を含んでなり；そして
別の観点において、本発明のポリペプチドの産生および／または生物学的活性を、減退させるかまたは増加させる、例えばリガンド、レセプター、抗体、またはＬＭＷ分子を含む、アゴニストまたはアンタゴニスト、好ましくはアゴニストを同定する方法であって、該方法は、
Ａ)候補化合物と、
ａ)本発明のポリペプチド；
ｂ)本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞；
ｃ)本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または
ｄ)本発明のポリペプチドに対する抗体；
を接触させること；
Ｂ)ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する候補化合物の効果を測定すること；例えば、候補化合物の存在下で、本発明のポリペプチドの産生および／または生物学的活性が減退するかまたは増加するかを測定すること、例えば、候補化合物の存在下および非存在下での、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかの活性の比較によって測定すること；ならびに
Ｃ)工程Ｂ)で測定されたアゴニストまたはアンタゴニストを選択すること、
例えば、アゴニスト／アンタゴニストの効果が、工程Ｂ)においてポジティブに測定された適当な候補化合物を選択すること、
ことを含んでなる。
【０１１５】
任意のこのようなスクリーニングアッセイにおいて、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)は、本質的な構成要素を含み得る。候補化合物は、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する効果が未知である化合物(ライブラリー)を含む。化合物(ライブラリー)は、本発明のポリペプチドに対するアゴニスト(アンタゴニスト)として、上に示した化合物を含む。アゴニスト(アンタゴニスト)は、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する効果が、スクリーニングアッセイにおいて、または上記のアゴニスト(アンタゴニスト)を同定するための方法において、見出された候補化合物である。アゴニスト(アンタゴニスト)は、本発明のポリペプチドの産生および／または生物学的活性を減退させるかまたは増加させ得る。
【０１１６】
さらなる観点において、本発明は、本発明のポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニスト、好ましくはアンタゴニストを提供し、該アンタゴニストまたはアゴニストは、下記の工程：
Ａ)候補化合物と、
ａ)本発明のポリペプチド；
ｂ)本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞；
ｃ)本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または
ｄ)本発明のポリペプチドに対する抗体；
を接触させること；
Ｂ)ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する該候補化合物の効果を測定すること；例えば、候補化合物の存在下で、本発明のポリペプチドの産生および／または生物学的活性が減退するかまたは増加するかを測定すること；例えば、候補化合物の存在下および非存在下での、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかの活性の比較によって測定すること；ならびに
Ｃ)工程Ｂ)で測定されたアゴニストまたはアンタゴニストを選択すること、
例えば、アゴニスト／アンタゴニストの効果が、工程Ｂ)においてポジティブに測定された適当な候補化合物を選択すること、
により提供され得ることを特徴とする。
【０１１７】
本発明のＩＫＫ２−５５(ポリペプチド)のアゴニスト(アンタゴニスト)は、例えば、免疫または炎症関連疾患、例えば、炎症、動脈硬化症、再狭窄、再灌流障害、炎症性腸疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーおよび癌を含む疾患の処置において使用され得る。
【０１１８】
本発明のＤＩＮＯ(ポリペプチド)のアゴニスト(アンタゴニスト)は、免疫調節活性を有し得、そして、例えば、炎症性疾患、例えば、急性または慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、癌、アテローム性動脈硬化症および再狭窄を含む疾患の処置において使用され得る。
【０１１９】
本発明のＬＬＲ−Ｊ２４(ポリペプチド)のアゴニスト(アンタゴニスト)は、免疫調節活性を有し得、そして、例えば、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、例えば、炎症性皮膚疾患、例えば接触過敏症、アトピー性皮膚炎、またはウイルス誘発性免疫抑制、例えばＡＩＤＳ、例えばウイルス、細菌、寄生生物感染および癌のあらゆる形態の罹病性を含む疾患の処置において使用され得る。したがって、本発明のポリペプチドのアゴニスト(アンタゴニスト)は、医薬として有用であり得る。
【０１２０】
このような使用のために、いくつかの方法が利用可能である：
もし、本発明の遺伝子および／またはポリペプチドの活性が過剰であるならば、１つの方法は、ポリペプチドに対するリガンドの結合をブロックすることにより、またはセカンドシグナルを阻害することにより、本発明の遺伝子および／またはポリペプチドの活性化を阻害するのに有効な量で、例えば薬学的に許容される賦形剤と組み合せて、本発明のポリペプチドのアンタゴニストを対象に投与すること、そしてその結果、例えば、該遺伝子(またはその変異体)の過剰−、過少−または改変された発現により引き起こされる異常状態を緩和することを含んでなる。
【０１２１】
別の方法において、例えばＤＩＮＯまたはＬＬＲ−Ｊ２４の場合において、内因性ポリペプチドと競合的にリガンドに結合できる、可溶形態の対応する本発明のポリペプチドが、投与され得る。このような競合剤の典型的な実施態様は、本発明の当該ポリペプチドのフラグメントを含み得る。
【０１２２】
さらなる観点において、本発明は、Ｔ細胞または他の免疫細胞上でリガンドに結合し、そして免疫機能および例えばアレルギーを活性化できる、本発明の可溶性ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドを提供する。
【０１２３】
いっそうさらなる方法において、本発明は、発現ブロック技術(expression blocking technique)を用いる本発明の内因性ポリペプチドをコードする遺伝子の発現の阻害を含む。
【０１２４】
既知のこのような技術には、例えば O'Connor, J. Neurochem. 56 (1991) 560、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)にしたがって、内部に生じたかまたは別に投与した、アンチセンス配列の使用が含まれる。代わりに、オリゴマー、例えば本発明の遺伝子と三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドは、例えば Lee et al. Nucleic Acids Res. 6 (1979) 3073; Cooney et al. Science 241 (1988) 456; Dervan et al. Science 251 (1991) 1360 にしたがって供給され得る。このようなオリゴマーは、そのまま投与するか、または in vivo で発現させ得る。
【０１２５】
本発明のポリペプチドの過少発現およびその活性に関する異常状態の処置のために、１つの方法は、本発明のポリペプチドの発現を増やす必要がある対象に、本発明の遺伝子を活性化する治療上有効量の化合物(アゴニスト)を、例えば薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて投与し、それによって異常状態を緩和することを含む。
【０１２６】
代わって、遺伝子治療を行い、対象において、関連する細胞によって、本発明のポリペプチドの内因的産生に影響を与え得る。例えば、本発明の遺伝子は、例えば上記の方法にしたがって、複製欠損レトロウイルスベクターにおける発現のために操作され得る。得られたレトロウイルス発現構築物は、単離され、そして、本発明の該遺伝子に対応するポリペプチドをコードするＲＮＡを含む、レトロウイルス・プラスミド・ベクターで形質転換したパッケージング細胞に導入され得、その結果、パッケージング細胞は、目的の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する。これらの産生細胞は、 in vivo で細胞を操作し、 in vivo でポリペプチドを発現させるために、対象に投与され得る。遺伝子治療の概観については、例えば、Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches(およびこの中に引用された参考文献)in Human Molecular Genetics, T Strachan および A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd. (1996) を参照のこと。
【０１２７】
別の観点において、本発明は、医薬として使用するための、例えば上に示した疾患の処置または予防のための、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、好ましくはアンタゴニストを提供し、そして、別の観点において：
・上に示した疾患の処置または予防のための医薬の製造における本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの使用；および
・医薬として使用するための、例えば、それぞれ、ＩＫＫ２−５５またはＬＬＲ−Ｊ２４、本発明のアゴニスト(アンタゴニスト)が適当である同じ疾患の処置のための、それぞれ、可溶形態の、本発明のＩＫＫ２−５５ポリペプチドまたはＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチド
を提供する。
【０１２８】
本発明のポリペプチドの(アンタ)アンタゴニストは、医薬組成物の形態で投与され得る。
【０１２９】
別の観点において、本発明は、薬学的に許容される賦形剤(複数も可)／担体(複数も可)と組み合せて、活性成分として本発明のアゴニストまたはアンタゴニスト、好ましくはアンタゴニストを含んでなる医薬組成物；例えば、該アンタゴニストまたはアゴニストは、下記の工程：
Ａ)候補化合物と、
ａ)本発明のポリペプチド；
ｂ)本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞；
ｃ)本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または
ｄ)本発明のポリペプチドに対する抗体；
を接触させること、
Ｂ)ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する候補化合物の効果を測定すること；例えば、候補化合物の存在下で、本発明のポリペプチドの産生および／または生物学的活性が減退するかまたは増加するかを測定すること；例えば、候補化合物の存在下および非存在下での、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかの活性の比較によって測定すること；ならびに
Ｃ)工程Ｂ)で測定されたアゴニストまたはアンタゴニストを選択すること；例えば、アゴニスト／アンタゴニストの効果が、工程Ｂ)においてポジティブに測定された適当な候補化合物を選択すること、
により提供され得る、医薬組成物を提供する。
【０１３０】
このような医薬組成物は、適当に、例えば慣用的方法にしたがって、例えば工程Ａ)、Ｂ)およびＣ)により提供されたアゴニスト(アンタゴニスト)を賦形剤(複数も可)／担体(複数も可)と混合すること、およびさらに、得られた混合物を加工して適当な投与のための医薬組成物を得ることにより、製造され得る。
【０１３１】
さらなる観点において、本発明は、本発明の遺伝子の過剰または不十分なレベルの両方、好ましくは過剰、に関連する；または、本発明のポリペプチドの過剰なおよび不十分な、好ましくは過剰な、活性に関連する、異常状態を処置する方法を提供する。例えば、ＩＫＫ２−５５の場合において、免疫または炎症関連疾患、例えば、炎症、動脈硬化症、再狭窄、再灌流障害、炎症性腸疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーおよび癌を含む疾患を処置する方法；例えば、ＤＩＮＯの場合において、炎症性疾患、例えば、急性または慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、癌、アテローム性動脈硬化症および再狭窄を含む疾患を処置する方法；ＬＬＲ−Ｊ２４の場合において、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、例えば、炎症性皮膚疾患、例えば接触過敏症、アトピー性皮膚炎、またはウイルス誘発性免疫抑制、例えばＡＩＤＳ、例えばウイルス、細菌、寄生生物感染疾患および癌に対するあらゆる形態の罹病性を含む疾患を処置する方法が提供される。該方法は、例えば、上に示したＡ)、Ｂ)またはＣ)の工程により提供され得る、治療上有効量の本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを、例えば、薬学的に許容される賦形剤(複数も可)／担体(複数も可)と組み合せて、投与することを含んでなり；例えば、それぞれ、ＩＫＫ２−５５またはＬＬＲ−Ｊ２４の場合において、治療上有効量の可溶形態の、それぞれ、ＩＫＫ２−５５またはＬＬＲ−Ｊ２４、本発明のポリペプチドを、例えば薬学的に許容される賦形剤(複数も可)／担体(複数も可)と組み合せて；このような処置を必要とする対象に、投与することを含んでなる。
【０１３２】
別の観点において、本発明は、感染または癌の処置方法であって、そのような処置を必要とする対象に、抗原の取り込みならびにＤＣによるＴ細胞の提示および活性化を増加させることができる、有効量の本発明の二重特異性抗体または試薬を投与することよる方法を提供する。
【０１３３】
別の観点において、本発明は、感染または癌の処置方法であって、そのような処置を必要とする対象に、免疫機能を活性化することができる、有効量の可溶性ＬＬＲ−Ｊ２４タンパク質を投与することを含んでなる方法を提供する。
【０１３４】
ＩＫＫ２−５５は細胞内のタンパク質である。本発明の医薬組成物の全身的投与の好適な形態としては、注射、典型的には静脈注射が挙げられる。他の注射経路、例えば皮下注射、筋肉内注射、または腹膜内注射も使用され得る。全身投与のための他の手段として、例えば胆汁酸塩もしくはフジシン酸のような浸透剤または他の洗浄剤を用いる、経粘膜および経皮投与が挙げられる。さらに、腸溶性製剤またはカプセル製剤で適切に製剤化されれば、経口投与もまた可能であり得る。本発明の組成物の投与は、また、例えばクリーム剤、ペースト剤、ゲル剤などの形態で、局所的(topical)および／または局所限定的(localized)であり得る。
【０１３５】
必要な投与量の範囲は、本発明のポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニスト、投与経路、医薬組成物の性質、患者の状態の性質、診察した医者の判断に依存し得る。しかしながら、適当な投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ(対象の重量)の範囲であり得る。しかしながら、必要な投与量の変動が、利用された化合物の多様性および様々な投与経路の異なる効率を考慮すると、予期され得る。例えば、経口投与は、静脈注射による投与よりも、より高い投与量が必要であると予期される。これらの投与量の変化は、例えば最適化のための標準的な経験則にしたがって、調整され得る。
【０１３６】
処置に用いられるポリペプチドは、また、例えばこのような処置を必要とする対象において、例えば上記のような“遺伝子治療”としてしばしば述べられる処置様式において、内因的に生成され得る。したがって、例えば対象由来の細胞は、例えばレトロウイルスのプラスミド・ベクターを用いることによって、ＩＫＫ２−５５ポリペプチドをコードする、ＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドで、ex vivo で操作され得る。操作された細胞は、例えばこのような処置を必要とする対象に導入され得る。
【０１３７】
本発明にしたがって、抗原取り込みおよび提示を改善することができる、例えばＴ細胞および免疫系の活性化を改善することができる、ＬＬＲ−Ｊ２４構築物を発現する、遺伝子的に修飾されたＤＣが提供され得る。
【０１３８】
別の観点において、本発明は、抗原取り込みおよび提示を改善することができる、例えばＴ細胞および免疫系の活性化を改善することができる、ＬＬＲ−Ｊ２４構築物を発現する、遺伝子的に修飾された樹状細胞を提供する。
【０１３９】
ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドに結合する抗体、リガンドまたは試薬は、ＤＣ形成／成熟を阻害し得、そしてその結果、例えば免疫機能およびアレルギーを改善し得る。
別の観点において、本発明は、ＤＣ形成／成熟を阻害する、本発明のＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドに結合する抗体、リガンドまたは試薬を提供する。
【０１４０】
図１(ＩＫＫ２−５５)
ＩＫＫ２のＣｏＩＰとＩＫＫ２−５５との相互作用。Ｆｌａｇ−タグ化ＩＫＫ２−５５およびｍｙｃ−タグ化ＩＫＫ２を、示した通りにＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。溶解物を調製し、そしてＩＫＫ２−５５を抗−Ｆｌａｇ抗体で沈澱させ、そして沈澱物を、抗−Ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロッティングにより解析した(上側のパネル)。細胞抽出物におけるＦｌａｇ−ＩＫＫ２−５５およびｍｙｃ−ＩＫＫ２の存在が、ウエスタンブロッティングにより確認された(下側のパネル)。
【０１４１】
図２(ＩＫＫ２−５５)
ＩＫＫ２−５５の亜細胞性局在。ＨＵＶＥＣを、異なる細胞区画についてのＣＦＰ融合遺伝子とともに、ＹＦＰ−ＩＫＫ２−５５融合構築物でトランスフェクトし、そして蛍光顕微鏡下で観察した。左側の列は、イエローチャンネル(yellow channel)におけるＩＫＫ２−５５の局在を示し、右側の列はシアンチャンネル(cyan channel)におけるマーカーの局在を示す。上段のパネル：小胞体(ＥＲ)；中段のパネル：ミトコンドリア(ｍｉｔｏ)；下段のパネル：ゴルジ体。
【０１４２】
図３(ＩＫＫ２−５５)
ＮＦ−ｋＢ依存プロモーターに対するＩＫＫ２−５５の影響。ＨＵＶＥＣを、異なる量のＩＫＫ２−５５ならびに内部標準としてユビキチン−ｂｇａｌとともに、５ｘＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ構築物でトランスフェクトし、そして２日後に、１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦαで６時間刺激した。ルシフェラーゼ値(相対的な光度単位)を、ｂ−ｇａｌ発現に関して標準化した。
ｐｒｏｍ＝プロモーター；ｕｎｓｔｉｍ＝未刺激；ｓｔｉｍ＝刺激。
【０１４３】
図４(ＩＫＫ２−５５)
ＮＦ−ｋＢ依存プロモーターに対する(異なるキナーゼと組み合せた)ＩＫＫ２−５５の影響。ＨＵＶＥＣを、５ｘＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ構築物で、ＩＫＫ２−５５とともに、示した異なるキナーゼ(ＩＫＫ２、ＮＩＫ、ＴＡＫ１、ｐ３８)ならびに内部標準としてのユビキチン−ｂｇａｌで、トランスフェクトした。１つの場合において、細胞を１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦαで６時間刺激した。ルシフェラーゼ値を、相対的な光度単位として表し、そしてβ−ｇａｌ発現に関して標準化した。
濃色カラム：５００ｎｇ ＩＫＫ２−５５；斜線付きカラム：０ｎｇ ＩＫＫ２−５５
ＲＬＵ−βｇａｌ：β−ｇａｌあたりの相対光度単位。
【０１４４】
図５(ＬＬＲ−Ｊ２４)
ヒトＮＫレセプター複合体のすべての既知のレクチン様遺伝子を含む系統樹：
表された遺伝子のＣＴＬＤの配列をアラインし、そして実施例において記載したように、系統樹を作成した。すべての配列を、ドメインにおいて必ず保存されている最初のシステインの、２つ前のアミノ酸から開始するように選択した。ＮＫＧ２ＥおよびＨは、同じ遺伝子からの、２つの別々にスプライシングされた転写物である。ＬＹ４９Ｌについて、他の遺伝子と比較できるほどにスプライシングされたすべての３つのＣＴＬＤエキソンを含む仮定的配列を選択したが、異常型にスプライシングされた転写物のみが、この遺伝子に関して検出された。この遺伝子は、一貫して、アラインメントのための異なるパラメーター設定を用いて、互いにより近い関係にあることが見出され、そして樹構造は、右側のカッコにより示される。下のスケールは、置換事象の尺度である。ＮＫ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞(ＥＣ)、単球細胞(ＭＯ)、樹状細胞(ＤＣ)におけるまたはさらに広範に白血球(ＬＥＵＫ)におけるサブファミリーの選択的発現が示される。
【０１４５】
図６および７(ＬＬＲ−Ｊ２４)
ＨＵＶＥＣにおける組換えＬＯＸ−１、ＬＬＲ−Ｊ２４およびＣＬＥＣ−１の発現：
Ｃ末端をＦＬＡＧ−タグ化ＬＯＸ−１、ＬＬＲ−Ｊ２４およびＣＬＥＣ−１の発現プラスミドを、ＨＵＶＥＣ中にトランスフェクトした。タンパク質の発現を、抗−ＦＬＡＧ抗体および二次Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−標識抗体で染色した後に、感染の２４時間後に解析した。
【０１４６】
非浸透および浸透細胞の染色の比較。左列において、ホルムアルデヒドで固定した非浸透細胞(固定)、および右列において、浸透細胞(固定／浸透)を示す。上段は抗−ＦＬＡＧ抗体での染色を示し、下段は総細胞数を可視化するためのＨｏｅｃｈｓｔ３３３２５８でのＤＮＡの染色を示す。
【０１４７】
ｓｔａｌｋエキソンを含まないＬＬＲ−Ｊ２４構築物を、図２Ｂにおいて示す(ΔＬＬＲ−Ｊ２４−１)。より高い倍率での４つの発現構築物全てについての浸透細胞の染色の比較。
【０１４８】
図８(ＬＬＲ−Ｊ２４)
樹状細胞の成熟中のＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの下方調節：
図８Ａ：
未成熟ＭｏＤＣ、ならびにＴＮＦ−αおよびＩＬ−βと組み合せて１８時間刺激された培養物から単離された全ＲＮＡのノーザンブロット。対照として、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｃＤＮＡおよびβ−アクチンプローブのハイブリダイゼーションを示す。
【０１４９】
図８Ｂ：
未成熟ＭｏＤＣおよびＨＰＤＣから、抗−ＣＤ４０抗体で処理されたＭｏＤＣおよびＨＰＤＣから、または抗−ＣＤ４０抗体とザイモサンＡとの組合せで２４時間処理したＭｏＤＣから、単離されたＲＮＡでのノーザンブロット。該ブロットを、負荷対照(loading control)として、ＬＬＲ−Ｊ２４、ＭＤＣおよびＧＡＰＤＨのためのプローブと連続的にハイブリダイズさせた。１８ｓおよび２８ｓ ｒＲＮＡの位置が示されている。
【０１５０】
図９および図１０(ＬＬＲ−Ｊ２４)
ヒトＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡのフラクションは、ｓｔａｌｋエキソン配列を含む：
【０１５１】
ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ。ＭｏＤＣからのＲＮＡを、特異的ＬＬＲ−Ｊ２４プライマーを用いて逆転写し、そしてＰＣＲを、得られたｃＤＮＡ上で、示された異なるプライマー対を用いて行った。(ａ)は、ＭｏＤＣ ＲＮＡのためのｓｔａｌｋエキソンを有するおよび有さない転写物の増幅を示し、(ｂ)は５'−部分の増幅を示し、そして、(ｃ)は、図４Ａ中のＢで示されたＭｏＤＣおよびＨＬ６０ ＲＮＡのための転写物を含むｓｔａｌｋの３'−部分を示す。レーン６は、完全長ＬＬＲ−Ｊ２４ ｃＤＮＡを含むプラスミドから得られた生成物を示す。
【０１５２】
ＲＴ−ＰＣＲに使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーの概略図。第１のプライマー対(ａ)を、ｓｔａｌｋエキソンフラグメンを有するおよび有さない、それぞれ、予想された５０５ｂｐおよび３６７ｂｐのＰＣＲ生成物をもたらすｓｔａｌｋエキソンフラグメントの存在を試験するために設計した。第２のプライマー対(ｂ)により、５'−部分の正確なスプライシングを試験し、第３のプライマー対(ｃ)により、ｓｔａｌｋエキソンを含む転写物の３'−部分のスプライシングを訂正する。
ｃ＝細胞質性；ＴＭ＝膜貫通性；ＣＴＬＤ＝Ｃ型レクチン様ドメイン１；
ＣＴＬＤ２＝Ｃ型レクチン様ドメイン２；ＣＴＬＤ３＝Ｃ型レクチン様ドメイン３。
【０１５３】
下記の実施例において、すべての温度は、セ氏温度であり、そして補正していない。
【表１】
【実施例】
【０１５４】
実施例１：ＩＫＫ２−５５遺伝子
ＩＫＫ２−５５遺伝子の配列番号１を含んでなるｃＤＮＡクローンは、ＰＨＡ−活性化リンパ球ｍＲＮＡのライブラリーから、およびＧｅｎＢａｎｋデータベースとともにＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いる配列比較により、単離する。
【０１５５】
ベイト(bait)としてＩＫＫ２のＣ末端ＨＬＨドメインを用いる酵母ツーハイブリッドスクリーンにおいて、ＩＫＫ２−５５遺伝子が見出された。Ｃ末端フラグメントを含んでなる最初のクローンを、ＥＳＴｓ、およびさらなる２つのＩＭＡＧＥクローン(＃１：クローンＩＤ＝２０４８２８９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号＝ＡＩ３７５６８７および＃２：クローンＩＤ＝２３８２８６１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号＝ＡＩ７５９９８４)の配列を用いて伸張させる。核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１および配列番号２において与えられる。５８〜６０位のヌクレオチドの最初のＡＴＧは、１６〜１８位のインフレーム停止コドン(in-frame stop codon)により先行される。オープンリーディングフレームは、１１８９〜１１９１位の停止コドンまで伸張する。ＩＫＫ２−５５は、データベースの登録事項と有意な相同性を全く示さない３７７のアミノ酸タンパク質をコードする。
【０１５６】
それは、また、４５〜５８位のアミノ酸の低組成複雑性領域ならびに１１６〜２５９位および２８７〜３２３位の２つのコイルドコイル領域を除いて、ＰｆａｍおよびＰｒｏｓｉｔｅデータベースに存在する明確なタンパク質モチーフを含まない。ヒト遺伝子に似ているゲノム性クローンは、該データベース(AC013283.htgs)に存在する。ＥＳＴクローンでのヒトドラフトゲノム配列、例えばＡＩ３７５６８７の調査により、ＩＫＫ２−５５は染色体１２ｑ２３．１に位置することが判明した。その結果、ＩＫＫ２−５５転写開始部位は、ＡＰＡＦ１(アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１)の転写部位に対して２ｋｂ以内に位置し、このことは、これら２つの遺伝子の調節のクロストークを意味している。
【０１５７】
実施例２：ＩＫＫ２−５５遺伝子
Ｙ２ＨＳは２つのタンパク質間の相互作用に関する最初の情報を提供するが、これらの結果は生化学的手段により確認された。(Ｆｌａｇタグが結合した)ＩＫＫ２のおよび(ｍｙｃタグが結合した)ＩＫＫ２−５５の発現ベクターを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトする。２日後、抽出物を調製し、そしてＩＫＫ２を抗Ｆｌａｇ抗体で沈澱させる。沈澱を、抗ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロッティングにより解析する。図１のレーン３における特異的バンドの存在は、ＩＫＫ２でのＩＫＫ２−５５の共免疫沈澱を示唆する。下段のパネルにおいて、全細胞抽出物を、細胞がそれぞれの遺伝子を発現することを示すために、それぞれ、抗−Ｆｌａｇおよび抗−ｍｙｃ抗体を用いてＩＫＫ２−５５およびＩＫＫ２のためにプローブする。
【０１５８】
実施例３：ＩＫＫ２−５５遺伝子
細胞内局在化は、タンパク質の機能の証明を提供し得る。小胞体に似ているように見える異なる特異的マーカーの共トランスフェクションにより、ＹＦＰ−ＩＫＫ２−５５融合遺伝子のトランスフェクションは、核周囲領域(図２)への局在化をもたらす(ＥＲ；該構築物はＣＦＰに融合したカルレティキュリンの標的配列を含む；Clontech Living Colors ER Subcellular Localization Vector)。
【０１５９】
実施例４：ＩＫＫ２−５５遺伝子(発現パターン)
ＭＴＮ(マルチプル・ティシュー・ノーザンブロット(Multiple Tissue Northern Blot); Clontech)を、ＩＫＫ２−５５プローブとハイブリダイズさせ、そして、２．４および４．３ｋｂの２つのバンドが腎臓、肝臓、胎盤、脾臓および心臓において選択的に検出される。
【０１６０】
ＴＩＧＲヒト遺伝子インデックスを用いるＥＳＴの検索において、限定された発現が見出される：
【表２】
【０１６１】
Ｖｉｒｔｕａｌ ＳＡＧＥを行い(ａａａａｔａａｇｃｃ鎖が該プログラムにより選択される)、そしてＰＴＥＮ -/- であるヒト乳癌系ＭＤＡ−ＭＢ−４６８において高度の発現が検出される。ＲＴ−ＰＣＲを、ＩＫＫ２−５５特異的プライマーおよび刺激されかつ制御されたＥＣからのｍＲＮＡを用いて行う。増大したＩＫＫ２−５５発現が、ＩＬ−１で、ＬＰＳで、またはＶＥＧＦで刺激されたＥＣにおいて見出される。
【０１６２】
実施例５：ＩＫＫ２−５５遺伝子
ＩＫＫ２−５５は、遺伝的および生化学的手段により示されるようにＩＫＫ２と相互作用するので、ＮＦ−ｋＢ活性に対するＩＫＫ２−５５の影響を試験した。５コピーのＮＦ−ｋＢ結合部位を含む、ＮＦ−ｋＢ依存プロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物、すなわち５ｘＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃを、ＴＮＦα刺激有りまたは無しで、ＨＵＶＥＣの一過性トランスフェクションにおいて使用する。結果を図３に示し、そして、使用された量に依存して、ＩＫＫ２−５５は刺激性(低い、生理学的量)または阻害性(多量で)活性のいずれかを有することが示される。５ｘＮＦ−ｋＢプロモーターを用いると、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達に関与することが知られているキナーゼ、例えばＩＫＫ２、ＴＡＫ１、ＮＩＫ、ｐ３８とのＩＫＫ２−５５の共トランスフェクションは、レポーター遺伝子の発現をさらに誘発した(図４)。
【０１６３】
実施例６：ＤＩＮＯ遺伝子(相同性)
皮膚微小血管内皮細胞ｍＲＮＡのライブラリーから、およびＳＷＩＳＳＰＲＯＴ ＰｒｏｔｅｉｎデータベースとともにＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いる配列比較により、単離されたＤＩＮＯ遺伝子の配列番号３を含んでなるｃＤＮＡクローンが、ＨＥＲＣタンパク質(Ｅ６結合タンパク質Ｃ末端の相同ドメインおよびＲＣＣ１ドメイン)のファミリーに、特にＨＥＲＣ３(受託番号Ｄ２５２１５)およびＣｅｐ１(受託番号ＡＢ０２７２８９)に相同的であることが見出される。
【０１６４】
配列番号３のＤＩＮＯ遺伝子は、ＨＥＲＣ３およびＣｅｐ１に対して全体的な相同性は３７．８％であるが、該相同性は、規定されたタンパク質ドメインにおいて有意に高い(７０％まで)。ＤＩＮＯとＣｅｐ１との間には、Ｃｅｐ１が約１００アミノ酸のＮ末端伸展(N-terminal extension)を有するという特徴的な相違が存在する。ＨＥＲＣタンパク質のＨＥＣＴドメインは、分解またはプロセシングされることになる特異的細胞標的タンパク質へのユビキチンの移動に関与する。
【０１６５】
実施例７：ＤＩＮＯ遺伝子(経路プロファイリングシステム)
ｐ５３転写活性を誘導するＤＩＮＯの潜在能力を、in vivoでシグナル伝達経路プロファイリングシステム(signaling pathway profiling system)においてアッセイし得る。該システムは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子から上流のｃｉｓ作用性エレメント(cis-acting element)に基づく。経路が、トランスフェクトされたＨｅＬａまたは内皮細胞におけるＤＩＮＯの過剰発現により活性化される場合、ルシフェラーゼの発現が測定され得る。この方法で、さまざまな薬物、刺激または共トランスフェクトされた遺伝子の効果が、ルシフェラーゼ発現のアッセイにより研究され得る。
【０１６６】
実施例８：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(相同性)
配列番号５のＬＬＲ−Ｊ２４−１遺伝子を含んでなるｃＤＮＡクローンは、ＤＣ ｍＲＮＡのライブラリーから単離され、そしてＧｅｎＢａｎｋ発現配列タグ化データベース(ｄｂＥＳＴ)において検出される。ライブラリーを、ＮＫＧ２−Ａ、−Ｃ、−ＤおよびヒトＬｙ４９遺伝子から確立された短コンセンサス配列を用いて調べる(Houchins J.P. et al. J. Exp. Med. 173 [1991] 1017-1020; Bull C. et al. Genes and Immunity 1 [2000] 280-287)。スプライスバリアントＬＬＲ−Ｊ２４−２の配列番号７を含んでなるｃＤＮＡクローンは、単球由来のＤＣのｍＲＮＡから、逆転写ＰＣＲにより単離される。配列番号５および配列番号７を含んでなるｃＤＮＡクローンは、ＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いる配列比較により、ＣＴＬＤレセプターのスーパーファミリーと相同的であることが見出された。
【０１６７】
ＮＫＣの他の既知の遺伝子に対するＬＬＲ−Ｊ２４の関係を確立するために、ＣＴＬＤの予想アミノ酸配列を比較する。ＮＫレセプター複合体のすべての既知のレクチン様遺伝子のＣＴＬＤドメインのマルチプルアラインメントを、下記のパラメーターを有するＭａｃ Ｖｅｃｔｏｒ ６．５ソフトウエアのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法を用いて行う：Open gap penalty -7.0, extend gap penalty for pairwise alignment -2.5, および for multiple alignment -1.0。アラインメントにおいて使用された分子の受託番号は、ＮＫＧ２Ａ(Ｘ５４８６７)、ＮＫＧ２Ｃ(Ｘ５４８６９)、ＮＫＧ２Ｅ(Ｌ１４５４２)、ＮＫＧ２Ｈ(ＡＦ０７８５５０)、ＮＫＧ２Ｄ(Ｘ５４８７０)、ＬＯＸ−１(ＡＦ０３５７７６)、ＣＬＥＣ−１(ＡＦ２００９４９)、ＣＬＥＣ−２(ＡＦ１２４８４１)、ＤＣＩＲ(ＡＪ１３３５３２)、ＡＩＣＬ(Ｘ９６７１９)、ＬＬＴ−１(ＡＦ１３３２９９)、ＣＤ６９(Ｌ０７５５５)、ＫＬＲＦ１(ＡＦ１７５２０６)、ＭＡＦＡ(ＡＦ０８１６７５)、およびＮＫＲ−Ｐ１Ａ(Ｕ１１２７６)である。
【０１６８】
仮定的ＬＹ４９Ｌ(ｈｙｐＬｙ４９Ｌ)ＣＴＬＤ配列は、該遺伝子(ＡＦ２１３４５３)の対応する３つのエキソンを組み合せることにより得られたが、他のＣＴＬＤ遺伝子にしたがう正しくスプライシングされるＣＲＤエキソンを有する転写物は、ＬＹ４９Ｌについてこれまで検出されていない。系統樹を、ニアレスト・ネイバー法(nearest neighbor method)にしたがって、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア バージョン３．０のＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムにより構築する。
【０１６９】
ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いるマルチプルアラインメントにしたがって、系統樹を構築する(図５)。得られたデータにより、ＬＬＲ−Ｊ２４は、ＬＯＸ−１、ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２とともに、より関係が近いＮＫＣのレクチン様レセプターのサブファミリーを形成することが示される。ＬＬＲ−Ｊ２４の最高の相同性は、ＬＯＸ−１(４４％)で見られ、ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２は、幾分離れた関係(３７％)である。ＮＫＧ２およびＣＤ９４ ＮＫレセプターからなるＣＴＬＤ ＮＫレセプターのサブファミリーは、その次に近い関係のタンパク質である(ＮＫＧ２−Ｅについて２８％およびＮＫＧ２−Ｄについて３３％)。ＡＩＣＬ／ＬＬＴ−１／ＣＤ６９グループならびにＫＬＲＦ１、ＭＡＦＡおよびＮＫＲ−Ｐ１レセプターは、そのうえさらに幾分離れており、そしてマルチプルアラインメントにおいて別々の枝(branch)で示される。ＬＬＲ−Ｊ２４−１の配列は、ｓｔａｌｋエキソンがヒトｃＤＮＡから失われていることを除いて、近年報告されたネズミＤＥＣＴＩＮ−１ ｃＤＮＡと高い相同性を示した。ｓｔａｌｋエキソンは、配列番号７におけるスプライスバリアントＬＬＲ−Ｊ２４−２について示された約５〜１０％の転写物の細分画(図９および１０)においてスプライシングされていることが見出されると示され得る。
【０１７０】
ヒトＬＬＲ−Ｊ２４−２およびマウスＤＥＣＴＩＮ−１の対応する予想完全長タンパク質配列の比較により、５９％の同一性(相同性６９％)が示される。高い相同性が、細胞質、およびｓｔａｌｋドメインを含む細胞外ドメインにおいて保存されている。細胞質ドメインのＮ末端の近くに、ＩＴＡＭ様配列が、ＬＬＲ−Ｊ２４ならびにネズミＤＥＣＴＩＮ−１おいて存在する。この配列は、ＣＤ３−γ鎖またはＤＡＰ１２分子において見出されるような古典的ＩＴＡＭモチーフと少し異なる。モチーフにおける最初のチロシン(残基３)は、ロイシン(残基７)の４アミノ酸前の位置であるが、この距離は、古典的Ｙｘ２Ｌｘ６〜８Ｙｘ２Ｌモチーフにおいては３アミノ酸の位置である。該モチーフの次の残基は正しく配置されている。両タンパク質は、さらに、Ｎ−グリコシル化のためのコンセンサス部位を示す。ヒトおよびネズミのレクチン様ドメインは、非糖リガンドを提示するＣａ＋＋結合に関与すると記載された残基のほとんどを欠いている。膜貫通ドメインは、荷電アミノ酸を示さず、これはＤＡＰ分子のようなＩＴＡＭ含有アダプターとの会合が起きていないことを示している。
【０１７１】
他のレクチン様レセプターに対するＣＴＬＤにおけるＬＬＲ−Ｊ２４の相同性およびその発現プロフィール(下記参照)から、ＬＬＲ−Ｊ２４レセプターは、リポタンパク質、ＭＨＣクラスＩホモログまたは細胞もしくは寄生生物由来の別の膜貫通もしくは分泌性タンパク質のようなタンパク質性のリガンドを有すると考えられる。
【０１７２】
実施例９：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子
単離および配列決定：
配列番号５の遺伝子の完全ｃＤＮＡは、下記の方法のいずれかにより得られ得る：
ａ)ｃＤＮＡ末端の急速増幅(Rapid Amplification of cDNA Ends; RACE)法が、５'末端を得るために利用され得る(Frohman et al. Proc. Nat. Acad. Sci USA 85 [1988] 8998-9002参照)。簡便には、特異的オリゴヌクレオチドをｍＲＮＡにアニーリングさせ、そしてｃＤＮＡ鎖の合成を開始させるために使用する。ＲＮａｓｅＨでのｍＲＮＡの分解後に、ポリＣアンカー配列をｃＤＮＡの３'末端に付加し、そして得られたフラグメントを、アンチセンスプライマーおよびアンカー配列プライマーの入れ子状セット(nested set)を用いて、増幅する。増幅されたフラグメントを適当なベクター中にクローニングし、そして制限および配列解析にかける。
【０１７３】
ｂ)ポリメラーゼ連鎖反応は、２セットのプライマーとともにネステッドＰＣＲの連続的試行を用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡの５'末端を増幅するために使用され得る。一方のセットのアンチセンスプライマーは、部分的ｃＤＮＡの５'末端に特異的であり、そして他方のセットのプラ−マーは、ベクター特異的配列にアニーリングする。
【０１７４】
ＬＬＲ−Ｊ２４を得るために、ＲＴ−ＰＣＲを次のプロトコールにしたがって行った：最初に、４０ｐｇのＬＬＲ−Ｊ２４に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(５'−ＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＣＴＡＧＧＧＡＴＣＴＡＣ−３')を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．３)、７５ｍＭ ＫＣｌおよび３ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１０μｌの容積の３μｇの全ＲＮＡとともに、８５℃に加熱し、続いて３０〜６０分かけて４２℃まで冷却することにより、アニーリングさせる。次いで、第１鎖合成を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．３)、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２０ｍＭ ＤＴＴおよび１００Ｕ Superscript Reverse Transcriptase (GIBCO/BRL, Rockville, MD)を含有する２０μｌにおいて行う。次いで、１μｌの第１鎖反応混合物に含まれるｃＤＮＡを、標準的手順にしたがって、ＰＣＲ反応における鋳型として使用する。下記のプライマーが使用される：
【表３】
【０１７５】
増幅した生成物を適当なベクター中にクローニングし、そして制限および配列解析にかける。この方法において、配列番号５および配列番号６が得られる。
【０１７６】
細胞培養、細胞の単離およびＲＴ−ＰＣＲのためのＲＮＡ単離：
臍帯血前駆細胞由来ＤＣ(ＣＢＤＣ)：臍帯血(ＣＢ)サンプルを、母親のインフォームドコンセントを得て、産科(Lainzer Hospital, Vienna, Austria)にて、健康な満期産から収集した。単核細胞(ＭＮＣ)を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ(登録商標)(Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway)密度勾配遠心分離法により、収集の１０時間以内に単離する。ＣＤ３４＋細胞をＣＢ−ＭＮＣから、Ｍｉｔｅｎｙｉ社(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)のＭＡＣＳ ＣＤ３４＋細胞単離キットを用いて、製造者の指示にしたがって、ポジティブ免疫磁気細胞選別法により単離する。単離されたＣＤ３４＋細胞の純度は、９５〜９９％の範囲である。
【０１７７】
免疫磁気的に精製されたＣＤ３４＋前駆細胞を、６−ウェルプレート(Costar, Cambridge, MA, USA)において、５×１０４細胞／ｍｌの初期細胞密度にて播種し、そして、１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、２ｍＭグルタミンならびにそれぞれ５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよびペニシリンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地(Life Technologies Ltd., Paisley, UK)において培養する。このＣＭに、さらに、ＳＣＦ(５０Ｕ／ｍｌ)およびＦｌｔ３−Ｌ(２５Ｕ／ｍｌ)(これらはともに、R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USAから購入されたものである。)を補給する。６日目(day 6)に、細胞培養物を分けて、２×１０５細胞／ｍｌの細胞密度を得、そして、ＳＣＦ(２５Ｕ／ｍｌ)、Ｆｌｔ３−Ｌ(１２．５Ｕ／ｍｌ)、ＧＭ−ＣＳＦ(３００Ｕ／ｍｌ、Novartis, Basel, Switzerland)、ＴＮＦα(５０Ｕ／ｍｌ; R&D)およびＴＧＦβ(５ｎｇ／ｍｌ; R&D)を含有するＣＭを加える。
【０１７８】
単球由来ＤＣ(ＭｏＤＣ)：
向流洗浄(countercurrent elutriation)により得られたヒト単球を、Ｃｏｓｔａｒ６−ウェルプレート(Costar, Cambridge, MA, USA)に、ＧＭ−ＣＳＦ(３００Ｕ／ｍｌ)およびｒＩＬ−４(２００Ｕ／ｍｌ)を補ったＣＭ中で８×１０５細胞／ｍｌにて播種する。培養物は、３日目(day 3)に、上に示した最終濃度を達成するようにＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を補った新たなＣＭのために、培地の半分を交換することにより培養される。
【０１７９】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球細胞またはＤＣの刺激：
向流洗浄Ｔ細胞またはＢ細胞により得られたヒトＴ細胞、Ｂ細胞および単球細胞を、ＣＭ中で培養し、そして、それぞれ、ＰＨＡ(１０μｇ／ｍｌ、Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)またはＰＷＭ(１０μｇ／ｍｌ、Sigma, St. Louis, MO, USA)およびｒｈＩＬ−４(１００Ｕ／ｍｌ、Novartis Pharma, Basel, Switzerland)の存在下で２４時間刺激する。単球細胞、ＭｏＤＣまたはＨＰＤＣを、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ(Sigma)で、またはヤギ−抗マウスＩｇＧのＦ(ａｂ')２−フラグメント(Pierce Chemical Corp, Rockford, IL, USA)の２μｇ／ｍｌの添加により溶液中で３７℃で６時間さらに架橋された４μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４０ ｍＡｂ(ｍＡｂクローン６２６．２)の存在下で、刺激する。いくつかの場合において、ザイモサンＡ(２５μｇ／ｍｌ、Sigma)を、ヤギ−抗マウスＩｇＧのＦ(ａｂ')２−フラグメントにより架橋された抗−ＣＤ４０ ｍＡｂと結合させて使用する。代わりに、ＭｏＤＣの最終成熟を、「図面の簡単な説明」において示したように、ＴＮＦα(２００Ｕ／ｍｌ)およびＩＬ−１β(１００Ｕ／ｍｌ)のような炎症性サイトカインの存在下でのインキュベーションにより、１８〜２４時間誘導する。
【０１８０】
ＲＮＡの単離：
全細胞性ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬(GIBCO/BRL, Rockville, MD, USA)における細胞溶解、クロロホルムでのＤＮＡおよびタンパク質の抽出、ならびにイソプロパノールによるＲＮＡの沈澱後に、細胞から単離される。
【０１８１】
実施例１０：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子
哺乳動物細胞における発現：
配列番号５および配列番号６で示される遺伝子のレセプターは、ヒト胚性腎臓２９３(ＨＥＫ２９３)細胞または付着性ＣＣＬ３９またはｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞のいずれかにおいて発現し、そして、本発明のＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子は、ヒト胚性腎臓２９３(ＨＥＫ２９３)細胞または付着性ＣＣＬ３９またはｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞または組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞のいずれかにおいて発現する。発現ベクターは、典型的には、強力なプロモーター、例えばＣＭＶ−ＩＥおよびＫｏｓｃａｋ配列の下流の５'および３'ＵＴＲの無いコード領域ならびにネオマイシンまたはゼオシンなどの抗生物質抵抗遺伝子を含む。
【０１８２】
細胞を、リポフェクチンにより個々のレセプターのｃＤＮＡでトランスフェクトし、そして６００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８(ネオマイシン)の存在下で選択する。選択の３週間後、個々のクローンを取り出し、そして、さらなる解析のために増殖させる。ベクター単独でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞は、陰性対照(negative control)として機能する。個々のレセプターを安定的に発現している細胞株を単離するために、約９６のクローンが、典型的には、選択され、そしてＲＴ−ＰＣＲ解析により解析される。レセプターのｍＲＮＡは、一般的に、解析されたＧ４１８−耐性クローンの約５０％において検出可能である。該遺伝子の発現のための組換えバキュロウイルスを、標準的技術を用いて、作成し、選択し、精製し、そして増殖させる。
【０１８３】
細胞表面上のまたは細胞内分画におけるＬＬＲ−Ｊ２４の発現を試験するために、発現構築物を、サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーターを提供する修飾ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＡベクター(Invitrogen, Groningen, Netherlands)において得、そして一過性トランスフェクションにおいて試験した。ベクターを、Ｆｌａｇペプチドをコードする配列を含有するオリゴヌクレオチドの挿入により修飾する。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｎ−Ｆｌａｇ修飾ベクターにおいて、Ｆｌａｇコード配列を、多重クローニング部位のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位との間に挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｃ−Ｆｌａｇ修飾ベクターにおいて、ＸｈｏＩとＡｐａＩ部位との間に挿入する。
【０１８４】
２つの異なって修飾されたベクターが、それぞれ、Ｆｌａｇ配列の前または後に、対応する制限切断部位へとそれぞれのｃＤＮＡをクローニングすることにより、タンパク質に対するＮ末端またはＣ末端Ｆｌａｇエピトープを提供するために使用され得る。次いで、３つすべての遺伝子のコード領域を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｎ−Ｆｌａｇベクターへの挿入のためのＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ切断部位またはｐｃＤＮＡ３．１／Ｃ−Ｆｌａｇベクターへの挿入のためのＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ切断部位を提供する特異的オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲにより、ｃＤＮＡから増殖させる。ＰＣＲ、制限酵素消化、フラグメント精製、およびベクターへのライゲーションは、確立された手順にしたがって行われる。すべての構築物は、挿入されたＤＮＡフラグメントの完全配列決定により確かめられる。
【０１８５】
トランスフェクションの２４時間前に、６ウェル組織培養プレートにおいて、２９３細胞およびＨＵＶＥＣを播種すると、翌朝に８０〜９０％のコンフルエントに達する。２９３細胞を、哺乳動物トランスフェクションキット(Stratagene, La Jolla, CA, USA)を用いるリン酸カルシウム法によりトランスフェクトする。ＨＵＶＥＣ細胞の一過性トランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(商標)試薬(GIBCO/BRL, Rockville, MD)を用いることにより行う。
【０１８６】
免疫蛍光アッセイは、主として下記に記載したように行われる：トランスフェクションの２４時間後、適当な発現プラスミドでトランスフェクトされた細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド、２％スクロース(抗−Ｆｌａｇ Ｍ２モノクローナル抗体、Sigma, St. Louis, MO, USA)で室温にて１０分間固定し、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中で希釈し、そして該細胞を室温にて１時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄し、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−標識ロバ抗−マウスＩｇＧ(Accurate Chemical, Westbury, NY, USA)で室温にて１時間インキュベートし、そして再びＰＢＳで洗浄する。細胞核を可視化するために、ＤＮＡのための蛍光性溝結合プローブ(Hoechst 333258, Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA)を、５００ｎｇ／ｍｌにて二次抗体溶液に加える。結果を、冷却電荷結合デバイスカメラ(Kappa Gmbh, Gleichen, Germany)に接続したＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ＴＭＤ蛍光顕微鏡(Nikon Ltd.)において解析する。
【０１８７】
組換え後の発現ＬＬＲ−Ｊ２４−２は細胞表面上に見出されるが、ＬＬＲ−Ｊ２４−１は細胞内に蓄積する：
ＩＩ型レクチン様レセプターは、通常、ダイマーを形成し、そしてホモダイマーまたは２つの異なるレセプター鎖を組み合せたヘテロダイマーを形成することが示されている。一定の場合において、異種性レクチン様レセプター鎖とのダイマー形成は、表面発現に必要であることが示されている。このことは、例えば、ＮＫＧ２／ＣＤ９４レセプターについて当てはまる。したがって、それぞれの発現構築物での一過性トランスフェクションの後に、２９３細胞およびＨＵＶＥＣにおけるＣＬＥＣ−１およびＬＯＸ−１との比較において、ＦＬＡＧ−タグ化組換えＬＬＲ−Ｊ２４の表面発現を評価した。表面発現を評価するために、抗−ＦＬＡＧ抗体での非浸透細胞の染色を、染色手順の前にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を浸透させた細胞のパラレルサンプルと比較した。
【０１８８】
(ｓｔａｌｋエキソンを有するまたは有さない)ＬＬＲ−Ｊ２４−２およびＬＬＲ−Ｊ２４−１での構築物が使用された。ＬＯＸ−１および完全長ＬＬＲ−Ｊ２４は、非浸透細胞の強い染色により示されるＨＵＶＥＣの細胞表面に効果的に蓄積した(図６)。対照的に、検出可能なレベルの、ｓｔａｌｋを有さないＬＬＲ−Ｊ２４−１アイソフォームおよび完全長ＣＬＥＣ−１タンパク質は、非浸透細胞上で観察されないが、浸透細胞の有意な細胞内染色が得られる。より高い倍率での浸透細胞のより精密な解析により、ＬＯＸ−１およびＬＬＲ−Ｊ２４−２発現構築物でトランスフェクトされた細胞が、核周辺細胞構成成分の強い染色ならびに全細胞に及んで観察可能な表面発現を示すことが明らかにされた(図７)。ｓｔａｌｋのないＬＬＲ−Ｊ２４−１は、細胞質全体に均質に分配されることが観察されるが、表面上では観察されない。同様の結果が、２９３細胞に関して得られる。
【０１８９】
したがって、これらのデータから、配列番号１０で示されるｓｔａｌｋ配列がＬＬＲ−Ｊ２４の表面発現に必要とされることが示される。その理由は、おそらく、該配列が表面への輸送のためのシグナルを含み、そしてホモダイマー形成を促進し得ることである。これらのデータにより、ＬＬＲ−Ｊ２４−２は表面レセプターとして機能するが、ＬＬＲ−Ｊ２４−１は細胞内の機能を有し得ることが示される。
【０１９０】
実施例１１：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(組換え細胞および組換えタンパク質の調製)
ＮＫレセプターでの先の経験および組換えレクチン様レセプターの調製における経験に基づいて、発現構築物は、完全長膜貫通レセプターの発現のため、ならびに可溶性のもののために、調製され得る。完全長の形態の組換え発現を有する安定的にトランスフェクトされた細胞は、モノクロナール抗体の作成のため、および機能研究のために使用される。可溶性レセプターは、精製された形態で、より容易に、より大量に得られ得、したがって、免疫化のため、ならびにリガンドの同定および単離のために使用される。本計画の初期段階において、発現をモニターするための抗体が利用可能ではないので、該分子のＮ末端およびＣ末端にタグを供給する構築物が使用され得る。
【０１９１】
完全長発現のために、ｐＣＤＮＡベクター(InVitrogen)中にＦＬＡＧ−タグを有さないおよび有する構築物を調製した。これらの構築物は、２つの異なる細胞株を安定的にトランスフェクトするために使用される。安定的にトランスフェクトされた細胞は、モノクローナル抗体を得るために、マウスの免疫化に使用され得る。次に、マウスハイブリドーマとヒトＤＣとの間のハイブリッド細胞株が使用され得る。このようなハイブリッド細胞は、内因性ＬＬＲ−Ｊ２４を発現せず、したがって、ヒト由来の部分的樹状細胞的特性のために、安定トランスフェクタントでの機能研究の候補物質となり得る。
【０１９２】
さらに、構築物は、細胞外への輸送のためのシグナル配列と融合した細胞外部分をコードするｃＤＮＡを用いる、より大量の可溶性ＬＬＲ−Ｊ２４レセプターを調製するために設計され得る。この目的のために、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なバキュロウイルス系が使用され得る。公表されたデータに基づいて、このようなタンパク質は、また、ＮＫレセプターのＨＬＡ−Ｅリガンドと適切に結合する能力を有する。ｍｇの量のタンパク質が製造され、このことは、免疫化のため、ならびに単離実験およびＴ細胞のようなＤＣと相互作用する細胞型からの発現クローン潜在性リガンドの実験に有利である。代わりに、免疫グロブリン融合タンパク質が、免疫グロブリン部分のＣ末端と融合した細胞外ドメインを有するＣＯＳ細胞において製造される。これは、該レセプターがＩＩ型の方向性を有し、したがって、適切な結合のために遊離のカルボキシ末端を必要とし得るからである。
【０１９３】
実施例１２：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作成)
レクチン様レセプターに対する抗体は製造が困難な場合があるので、ＬＬＲ−Ｊ２４のＣ末端(最後の１５アミノ酸)からの合成ペプチドが使用される。その理由は、これが、組換え体の発現をモニターするのに役立つウエスタンブロットにおいてポリクローナルウサギ抗体の機能を得るための方法だからである。これらの抗体は、また、免疫化ペプチドでアフィニティー精製され得、そして、ＦＡＣＳ解析における細胞発現を研究するために使用され得る。さらに、ウサギの免疫化のための、およびアフィニティー精製抗体の調製のための、可溶性組換えレセプターが使用される。これは、フローサイトメトリーによるレセプターの表面発現を測定するのに有用な抗体を与え、そしてまた、レセプター−リガンド相互作用に対して中和作用を発揮し得る。
【０１９４】
さらに、モノクローナル抗体は、レセプターの構造−機能相関を研究するのに有用なエピトープ特異的試薬を最終的に入手するために得られ得る。リガンド結合を模倣するモノクローナル抗体、ならびにレセプター−リガンド相互作用をブロックする他のモノクローナル抗体が作成される。この目的は、ヒト遺伝子を安定的にトランスフェクトされたマウス細胞株を使用することにより達成され得る。ネズミＭＴ細胞のような細胞における発現は、適切な表面発現および分子の適切な抗原構造をもたらし、その結果、ヒト樹状細胞上のタンパク質に対して良好な結合特性を有する試薬が得られる。精製組換えタンパク質ならびに組換え細胞を使用する組合せ免疫化プロトコールが使用される。
【０１９５】
実施例１３：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(潜在的結合性タンパク質鎖の特徴付け)
いくつかの例において、レクチン様レセプターは、異なるレクチン様タンパク質とのジスルフィド結合性へテロダイマーおよびシグナル伝達アダプター分子との非共有結合性会合体を形成することが示された。例えば、ＮＫＧ２タンパク質のいくつかのアイソフォームは、ＣＤ９４タンパク質とへテロダイマー化して、阻害および活性ＮＫ細胞レセプターのいくつかの変異体を形成する。さらに、トリガー性ＮＫＧ２／ＣＤ９４レセプターは、それらのＮＫＧ２部分を介して、シグナル伝達アダプターＤＡＰ１２と会合する(Lanier L.L. et al. Immunity 8 [1998] 693-701)。ＤＡＰ１２はＩＴＡＭモチーフを含み、そして細胞に活性化シグナルを与える機能を有する。他方、阻害的形態のＮＫＧ２−Ａ／ＣＤ９４は、ＮＫＧ２−Ａの細胞質側テイル上にＩＴＩＭモチーフを含み、これは、ＳＨＰ−１および−２ホスファターゼを介して阻害性シグナルを補充しそして引き起こす(Palmieri G. et al., J. Immunol. 162 [1999] 7181-8)。ビオチンでの組換え細胞および一次ヒトＤＣの表面標識(ＥＺ−Ｌｉｎｋビオチン化試薬, Pierce)の後に、ＬＬＲ−Ｊ２４を免疫沈降させ、そして潜在的共免疫沈降鎖を、対応するアビジン−ＨＲＰ試薬を用いて沈降物のウエスタンブロットにおいてスコアをつける。表面に露出したタンパク質鎖を共免疫沈降させ、したがって、サイズの異なるＬＬＲ−Ｊ２４を本方法により検出しそして単離し得る。
【０１９６】
十分には表面に露出していないシグナル伝達アダプターを検出するために、Ｓ３５メチオニンで代謝的に標識されたＤＣが使用され得、そして沈降したタンパク質のポリアクリルアミドゲル分離の後に、共免疫沈降したタンパク質に関してスコアをつけ得る。さらに、ＤＡＰ分子のようなレセプターと相互作用し得る既知のタンパク質が試験され得る。このようにして、活性的および阻害的シグナル伝達分子との潜在的相互作用が確立される。
【０１９７】
実施例１４：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(ＬＬＲ−Ｊ２４ポリヌクレオチドでのリガンドスクリーニング)
推定的レセプターリガンドのコレクションを、スクリーニングのために集める。該コレクションは：さまざまなｏｘＬＤＬ化合物および誘導体、炭水化物性化合物、寄生生物の膜、ＭＨＣクラスＩの可溶性化合物およびそのホモログ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ対立遺伝子形態、関係のあるＬＯＸ−１およびＮＫＧ２を介して作用することが知られているさまざまなＵＬ１６結合タンパク質または他のレクチン様レセプター；ヒトレクチン様レセプターの推定的アゴニスト、非哺乳動物性の、哺乳動物対応物がまだ同定されていない生物学的に活性なペプチドであり得る天然物；および自然において見出されていないが、未知の天然リガンドでレクチン様レセプターを活性化する化合物、を含んでなる。このコレクションは、機能的アッセイ(すなわち、カルシウムおよびｃＡＭＰの放出、チロシンおよびセリンキナーゼの活性化、ＳＨＰ−１および−２のようなホスファターゼ)ならびにさまざまな標識化合物での結合アッセイの両方を用いて、既知のリガンドのためのレセプターを最初にスクリーニングするために使用される。
【０１９８】
潜在的リガンドの探索は、組換え細胞および単離可溶性レセプターを用いて行われる。最初に、２つの潜在的リガンド源が調査され得る。ＬＯＸ−１およびＮＫレセプターに関するＬＬＲ−Ｊ２４の相同性および近接した染色体局在化に基づいて、糖リガンドはあり得ないと考えられるが、残余的な糖リガンド特性がいくつかのレクチン様レセプターにおいて見出されている。ＮＫレセプターまたはＬＯＸ−１との類推によって、タンパク質性リガンドまたはリポタンパク質が予想される。ＬＯＸ−１と同様に、酸化ＬＤＬが結合し得る。関係のあるマウスＤｅｃｔｉｎ−１での予備的実験により示唆されるように(Ariizumi K. et al. J. Biol. Chem. 275 [2000] 20157-20167)、ＬＬＲ−Ｊ２４は、さらに、むしろＴ細胞の表面分子と携わることが予想される。
【０１９９】
ＬＬＲ−Ｊ２４発現組換え細胞対ＬＬＲ−Ｊ２４陰性親細胞株の活性化が評価され得る。Ｃａ＋＋、ＮＦκＢおよびいくつかのＭＡｐキナーゼ経路の活性化が試験される。代わりに、ＬＬＲ−Ｊ２４組換え体を、活性化を評価するために、Ｔ細胞およびＴ細胞膜分画と組み合わせる。一方では、ｏｘＬＤＬに結合する性質は、また、アポトーシス細胞への結合を媒介し、そして、このような機能は、ＤＣの文脈において意味をなすと考えられる。エンドサイトーシスされたアポトーシス細胞物質は、さらに、Ｔ細胞に対してＭＨＣ分子を介して提示され、したがって、アポトーシスの原因の細胞の感染が認識される。寄生生物上のリポタンパク質への直接的結合が試験され得る。代わりに、ＬＬＲ−Ｊ２４は、Ｔ細胞、例えばＭＨＣホモログ上の表面タンパク質との相互作用に関与し得、そして、この相互作用は、Ｔ細胞の活性化のための補助的機能を有し得る。
【０２００】
可溶性レセプターは、リガンドを同定、単離およびクローニングするために使用される。これは、レトロウイルスベクターにおいてＴ細胞ｃＤＮＡの発現ライブラリーを使用することにより行われ、これは入手可能であり、そして可溶性レセプターが結合しない細胞においてｃＤＮＡライブラリーを発現させるために使用され得る。タグ化可溶性レセプターは、ＦＡＣＳソーティングにより適切なリガンドを発現している形質導入細胞を単離するために使用され得、そして、ｃＤＮＡはソートされた細胞から回収され得る。リガンドがさらに複雑な構造を有する場合、例えば、それが２本の鎖からなり、そしてこれらが記載した方法を用いて１つの細胞において発現され得ない場合には、可溶性レセプターでのアフィニティークロマトグラフィーを用いる生化学的精製および標準的タンパク質分離技術が使用され得る。
【０２０１】
実施例１５：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(リガンド結合アッセイ)
リガンド結合アッセイは、レセプター薬理を確かめるための直接的方法を提供し、そして、ハイスループットフォーマットに適用可能である。レセプターのための精製リガンドは、結合研究のために、高度に特異的な活性(５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ)に放射性標識される。次いで、放射性標識の過程において、レセプターに対するリガンドの活性が減少することのない測定を行う。緩衝液、イオン、ｐＨおよびヌクレオチドのような他のモジュレーターのためのアッセイ条件は、膜および全細胞レセプター源の両方についての実行可能なノイズに対するシグナル比を確立するために最適化される。これらのアッセイのために、特異的レセプター結合が、総結合放射活性から、過剰の非標識競合リガンドの存在下で測定された放射活性を引いたものとして定義される。可能な場合には、１を超える競合リガンドを使用して残りの非特異的結合を定義する。
【０２０２】
実施例１６：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(機能アッセイ)
ＬＬＲ−Ｊ２４を発現しない、組換えＤＣ様ＤＣ／Ｓｐ２０対非組換え細胞における細胞シグナル伝達の潜在的活性化または阻害を、評価する。第２の方法は、単球由来および臍帯血由来一次ＤＣならびにＣＤ４０リガンドでの誘導により成熟させた培養物の製剤を使用することであり、これらはＭＬＲを刺激する活性がある。第１の方法において、抗体、ならびに組換え細胞対その親細胞における細胞内シグナルの潜在的活性化のための、酸化ＬＤＬまたはアポトーシス細胞フラグメントのような潜在的可溶性リガンドの、スコアをつける。遊離のＣａ＋＋、ＮＦκＢの誘導および主要ＭＡＰキナーゼ経路ＭＥＫ／ＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮＫの増加を、試験する。トリガー化合物での抗体の妨害またはレセプターの阻害的機能の解消が試験され得る。
【０２０３】
ＤＣの成熟に対するおよびＴ細胞の活性化に対するレセプターの潜在的貢献は、次のように評価され得る。アッセイ１において、未成熟のランゲルハンス型ＤＣを調製し、そして、抗体を、それらがＣＤ４０リガンド刺激の間にＤＣ成熟／活性化を阻害または促進するかどうかについて試験する。この目的のために、ＣＤ８０／ＣＤ８６の上方調節がフローサイトメトリーにより測定される。アッセイ２において、抗体および調製された可溶性レセプターが、同種異系Ｔ細胞を刺激するＤＣの能力を改変するかどうかについて評価する。
【０２０４】
未成熟ならびに成熟ＤＣは、抗体での樹状細胞の、または可溶性レセプターでのＴ細胞の、プレインキュベーションの後の、同種異系Ｔ細胞の刺激剤として使用される。Ｔ細胞刺激の好適な読み取りは、５日後のチミジンの組み込みである。これらの実験により、ＤＣ成熟に対する、ならびに、Ｔ細胞活性化に対する、レセプターの影響が検出される。したがって、Ｔ細胞との相互作用におけるＬＬＲ−Ｊ２４の補助的機能が検出される。Ｔ細胞上でのリガンドとのＬＬＲ−Ｊ２４の潜在的相互作用をブロックし得る抗体および可溶性レセプターは、免疫応答を調節するために重要である。
【０２０５】
実施例１７：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(抽出／細胞上清スクリーニング)
同族の活性化リガンド(アゴニスト)がもう残っていない数多くのレクチン様レセプターが存在する。したがって、これらのレセプターの活性リガンドは、今日までに同定されたリガンドバンク(ligand bank)内に含まれ得ない。したがって、本発明のＣＴＬＤレセプターは、また、天然リガンドを同定するために組織抽出物に対して(カルシウム、ｃＡＭＰ、キナーゼ機能スクリーニングを用いて)機能的にスクリーニングされる。陽性の機能応答を産生する抽出物は、活性化リガンドが単離および同定されるまで、経時的にサブフラクション化され得る。
【０２０６】
実施例１８：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(カルシウムおよびｃＡＭＰ機能アッセイ)
ＨＥＫ２９３細胞内に発現されたレクチン様レセプターは、ＰＬＣおよびカルシウム移動の活性化、ｃＡＭＰ刺激および／またはチロシンおよびセリン／スレオニンキナーゼの活性化または阻害と機能的に共役していることが示される。レセプターがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞またはベクター制御細胞における基底カルシウムレベルは、通常では、１００ｎＭ〜２００ｎＭの範囲であると観察された。組換えレセプターを発現しているＨＥＫ２９３細胞に、ｆｕｒａ２を負荷し、そして、１日に１５０を超える選択リガンドまたは組織／細胞抽出物が、アゴニスト誘導性カルシウム移動について評価される。同様に、組換えレセプターを発現しているＨＥＫ２９３細胞は、標準的ｃＡＭＰ定量アッセイを用いて、ｃＡＭＰ産生の刺激または阻害について評価される。カルシウム過渡応答またはｃＡＭＰ変動を提供するアゴニストは、該応答がレセプターを発現しているトランスフェクト細胞に独特のものであるかどうかを測定するために、ベクター制御細胞において試験される。
【０２０７】
実施例１９：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子
本発明のＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子のＲＮＡ調節：
ＬＬＲ−Ｊ２４は、ＤＣにおいて選択的に発現する：
ＬＯＸ−１、ＬＬＲ−Ｊ２４およびＣＬＥＣ−１は１つのサブファミリーのメンバーであるので、一次ヒトＤＣ、単球、ＴおよびＢリンパ球ならびに内皮細胞におけるＬＬＲ−Ｊ２４およびＣＬＥＣ−１ ｍＲＮＡの発現を調べる。得られたデータにより、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡは、単球由来ＤＣ(ＭｏＤＣ)において、およびＣＤ３４＋造血前駆細胞由来ＤＣ(ＨＰＤＣ)において、豊富かつ選択的に発現していることが示される。少量のＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡが一次単球にも存在するが、さまざまな刺激で処理されたまたは処理されていない一次ＴおよびＢリンパ球ならびに内皮細胞は、検出可能なレベルでＬＬＲ−Ｊ２４転写物を発現していなかった。いくつかのさらなる細胞株、すなわち、Ｊｕｒｋａｔ、ＲＰＭＩ８８６６、ＮＫＬおよびＮＫ９２を含むノーザンブロットにおいて、発現は見られなかった。ＤＣにおけるＲＮＡのサイズは、ノーザンブロットから３．０〜３．５ｋｂと見積もられ、これは、停止コドンから１．６〜１．９ｋｂ下流の領域の遺伝子において検出された第１またはいくつかの連続的ポリアデニル化シグナルの使用から推定される転写物のサイズに相当する。
【０２０８】
ＬＬＲ−Ｊ２４の発現は、ＤＣの機能的成熟の間に下方調節される：
ＤＣの活性化および最終的成熟は、それらの移動および機能を調節する遺伝子の改変された発現と関連する。したがって、炎症性メディエーター、ＣＤ４０−リガンドまたはザイモサンＡによるＤＣの刺激が、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの発現レベルにおいて変化をもたらすかどうかについて試験された。図８Ａにおいて示されるように、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの組合せでのＭｏＤＣの１８〜２４時間の処理は、再生可能な、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの３〜５倍の減少をもたらした。代わりに、ＨＰＤＣを、酵母粒子のファゴサイトーシスを刺激するザイモサンＡの非存在または存在下で、ＣＤ４０レセプターに特異的なｍＡｂにより活性化する(図８Ｂ)。これらの結果に基づいて、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの下方調節は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのような強力な成熟誘導剤またはファゴサイトーシス刺激と組み合せたＣＤ４０ライゲーションで処理された培養物において特に表される。ＭＤＣケモカイン(ＣＣＬ２２)は、それらの成熟後にＤＣにおいて強力に誘導されることが知られているので、同じノーザンブロットを、ＭｏＤＣまたはＨＰＤＣの活性化の成功を確認するために、ＭＤＣの特異的プローブとハイブリダイズさせた。図８において示されるように、ＭＤＣの強力な誘導は、両方のタイプのＤＣにおけるＬＬＲ−Ｊ２４転写物の下方調節と平行する。
【０２０９】
ＬＬＲ−Ｊ２４転写物は、可変的にスプライシングされる：
ノーザンブロット解析では、ＬＬＲ−Ｊ２４−１および−２に関して、１４１塩基のみ異なることが予想された転写物を区別することができなかった。したがって、第２および第４のエキソンの間のフラグメントを増幅するためのプライマー対を用いる逆転写ＰＣＲが行われる。５０５ｂｐおよび３６７ｂｐの２つの生成物を得、これらは、それぞれ、ｓｔａｌｋエキソンを有するおよび有さない予想フラグメントのサイズに相当する(図９および図１０)。該生成物の約５〜１０％がｓｔａｌｋエキソンを含むサイズであると見積もられる。この上側のバンドをゲルから削り取り、サブクローニングし、２つの得られたクローンを配列決定する。両クローンは、配列番号７および配列番号９において示される、正しくスプライシングされたｓｔａｌｋエキソンを表した。得られたＰＣＲフラグメントを、さらに、それぞれ、５'−非翻訳領域からｓｔａｌｋエキソンまで、およびｓｔａｌｋエキソンから第６エキソンまでのｍＲＮＡのフラグメントを増幅するプライマー対で解析した(図８Ｂ参照)。両方の場合において、得られた主生成物は、正しくスプライシングされたエキソンについて予測されたサイズに対応していた。これらのデータにより、ＬＬＲ−Ｊ２４転写物のフラクションがｓｔａｌｋエキソンを含み、そしてまた、他のエキソンでも正しくスプライシングされることが示される。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】ＩＫＫ２のＣｏＩＰとＩＫＫ２−５５との相互作用。Ｆｌａｇ−タグ化ＩＫＫ２−５５およびｍｙｃ−タグ化ＩＫＫ２を、示した通りにＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。溶解物を調製し、そしてＩＫＫ２−５５を抗−Ｆｌａｇ抗体で沈澱させ、そして沈澱物を、抗−Ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロッティングにより解析した(上側のパネル)。細胞抽出物におけるＦｌａｇ−ＩＫＫ２−５５およびｍｙｃ−ＩＫＫ２の存在が、ウエスタンブロッティングにより確認された(下側のパネル)。
【図２】ＩＫＫ２−５５の亜細胞性局在。ＨＵＶＥＣを、異なる細胞区画についてのＣＦＰ融合遺伝子とともに、ＹＦＰ−ＩＫＫ２−５５融合構築物でトランスフェクトし、そして蛍光顕微鏡下で観察した。左側の列は、イエローチャンネル(yellow channel)におけるＩＫＫ２−５５の局在を示し、右側の列はシアンチャンネル(cyan channel)におけるマーカーの局在を示す。上段のパネル：小胞体(ＥＲ)；中段のパネル：ミトコンドリア(ｍｉｔｏ)；下段のパネル：ゴルジ体。
【図３】ＮＦ−ｋＢ依存プロモーターに対するＩＫＫ２−５５の影響。ＨＵＶＥＣを、異なる量のＩＫＫ２−５５ならびに内部標準としてユビキチン−ｂｇａｌとともに、５ｘＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ構築物でトランスフェクトし、そして２日後に、１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦαで６時間刺激した。ルシフェラーゼ値(相対的な光度単位)を、ｂ−ｇａｌ発現に関して標準化した。 ｐｒｏｍ＝プロモーター；ｕｎｓｔｉｍ＝未刺激；ｓｔｉｍ＝刺激。
【図４】ＮＦ−ｋＢ依存プロモーターに対する(異なるキナーゼと組み合せた)ＩＫＫ２−５５の影響。ＨＵＶＥＣを、５ｘＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ構築物で、ＩＫＫ２−５５とともに、示した異なるキナーゼ(ＩＫＫ２、ＮＩＫ、ＴＡＫ１、ｐ３８)ならびに内部標準としてのユビキチン−ｂｇａｌで、トランスフェクトした。１つの場合において、細胞を１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦαで６時間刺激した。ルシフェラーゼ値を、相対的な光度単位として表し、そしてβ−ｇａｌ発現に関して標準化した。 濃色カラム：５００ｎｇ ＩＫＫ２−５５；斜線付きカラム：０ｎｇ ＩＫＫ２−５５ ＲＬＵ−βｇａｌ：β−ｇａｌあたりの相対光度単位。
【図５】ヒトＮＫレセプター複合体のすべての既知のレクチン様遺伝子を含む系統樹： 表された遺伝子のＣＴＬＤの配列をアラインし、そして実施例において記載したように、系統樹を作成した。すべての配列を、ドメインにおいて必ず保存されている最初のシステインの、２つ前のアミノ酸から開始するように選択した。ＮＫＧ２ＥおよびＨは、同じ遺伝子からの、２つの別々にスプライシングされた転写物である。ＬＹ４９Ｌについて、他の遺伝子と比較できるほどにスプライシングされたすべての３つのＣＴＬＤエキソンを含む仮定的配列を選択したが、異常型にスプライシングされた転写物のみが、この遺伝子に関して検出された。この遺伝子は、一貫して、アラインメントのための異なるパラメーター設定を用いて、互いにより近い関係にあることが見出され、そして樹構造は、右側のカッコにより示される。下のスケールは、置換事象の尺度である。ＮＫ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞(ＥＣ)、単球細胞(ＭＯ)、樹状細胞(ＤＣ)におけるまたはさらに広範に白血球(ＬＥＵＫ)におけるサブファミリーの選択的発現が示される。
【図６】非浸透および浸透細胞の染色の比較。左列において、ホルムアルデヒドで固定した非浸透細胞(固定)、および右列において、浸透細胞(固定／浸透)を示す。上段は抗−ＦＬＡＧ抗体での染色を示し、下段は総細胞数を可視化するためのＨｏｅｃｈｓｔ３３３２５８でのＤＮＡの染色を示す。
【図７】ｓｔａｌｋエキソンを含まないＬＬＲ−Ｊ２４構築物を、図２Ｂにおいて示す(ΔＬＬＲ−Ｊ２４−１)。より高い倍率での４つの発現構築物全てについての浸透細胞の染色の比較。
【図８】樹状細胞の成熟中のＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの下方調節：
【図９】ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ。ＭｏＤＣからのＲＮＡを、特異的ＬＬＲ−Ｊ２４プライマーを用いて逆転写し、そしてＰＣＲを、得られたｃＤＮＡ上で、示された異なるプライマー対を用いて行った。(ａ)は、ＭｏＤＣ ＲＮＡのためのｓｔａｌｋエキソンを有するおよび有さない転写物の増幅を示し、(ｂ)は５'−部分の増幅を示し、そして、(ｃ)は、図４Ａ中のＢで示されたＭｏＤＣおよびＨＬ６０ ＲＮＡのための転写物を含むｓｔａｌｋの３'−部分を示す。レーン６は、完全長ＬＬＲ−Ｊ２４ ｃＤＮＡを含むプラスミドから得られた生成物を示す。
【図１０】ＲＴ−ＰＣＲに使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーの概略図。第１のプライマー対(ａ)を、ｓｔａｌｋエキソンフラグメンを有するおよび有さない、それぞれ、予想された５０５ｂｐおよび３６７ｂｐのＰＣＲ生成物をもたらすｓｔａｌｋエキソンフラグメントの存在を試験するために設計した。第２のプライマー対(ｂ)により、５'−部分の正確なスプライシングを試験し、第３のプライマー対(ｃ)により、ｓｔａｌｋエキソンを含む転写物の３'−部分のスプライシングを訂正する。ｃ＝細胞質性；ＴＭ＝膜貫通性；ＣＴＬＤ＝Ｃ型レクチン様ドメイン１；ＣＴＬＤ２＝Ｃ型レクチン様ドメイン２；ＣＴＬＤ３＝Ｃ型レクチン様ドメイン３。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＨＡ−活性化リンパ球、内皮細胞、または樹状細胞(ＤＣ)から単離されたポリペプチド(タンパク質)をコードするポリヌクレオチドに関する。本発明は、また、このようなポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド(タンパク質)の作用を阻害または活性化することに関する。
【背景技術】
【０００２】
内皮細胞(ＥＣ)は、大小の血管の内部表面を構成し、そして基底組織(underlying tissue)への免疫系細胞の遊出を仲介する。刺激されていないＥＣは、遮られていない血流を保証する抗凝血性表面を表す。ＴＮＦα、ＩＬ−１またはリポポリサッカライド(ＬＰＳ)のような炎症メディエーターで刺激すると、ＥＣは細胞接着分子(例えば、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１を含む。)、サイトカイン(ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８)、凝固系の構成成分(組織因子、ＰＡＩ−１)およびその他(ｉＮＯＳ)を含むさまざまな分子を発現する。これらの発現された分子は、ケモタキシス、免疫細胞の接着および遊出、ならびにいくつかの他の機能を仲介する(de Martin et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20 [2000] e83-e88.)。したがって、免疫応答は、例えば炎症、動脈硬化症、再狭窄、再灌流障害、炎症性腸疾患、乾癬およびアトピー性皮膚炎を含むさまざまな疾患の共通の基本メカニズムである。
【０００３】
上記の発現分子の大部分は、転写因子ＮＦ−ｋＢを含む誘導可能かつ一過性の方法で上方調節される。薬理学的または遺伝学的インヒビターによるＮＦ−ｋＢの阻害が、炎症およびＥＣ活性化の他の観点をブロックすることが示された(Wrighton et al. J. Exp. Med. 183 [1996] 1013-1022; Oitzinger et al. Blood 97 [2001] 1611-1617)。したがって、ＮＦ−ｋＢのインヒビターは、広い治療可能性を有する。
【０００４】
ＮＦ−ｋＢの活性化をもたらす調節工程の現在の理解は、次のものを含む：刺激後、ＮＦ−ｋＢ(例えば、ｐ６５／ｐ５０ヘテロダイマー)は、阻害サブユニットＩｋＢａ、−ｂまたは−ｅを含む不活性細胞質複合体から放出される。ＩｋＢサブユニットは、ＮＦ−ｋＢと結合した場合に、ＮＦ−ｋＢ核局在性シグナルをマスクし、したがってその核転座を妨げる。ＮＦ−ｋＢの遊離は、ＩｋＢａ中の２つのセリン残基Ｓｅｒ３２およびＳｅｒ３６のＩｋＢリン酸化により開始され、続いて、ＩｋＢｂ中の対応する部位が、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体のｂ−ＴｒＣＰ様構成成分(Ｓｋｐ１／Ｃｕｌ１／ＲＯＣ１／Ｆ−ｂｏｘタンパク質ＦＷＤ１)により認識され、ユビキチン化され、そして２６Ｓプロテアソームを介して分解される。
【０００５】
当分野における主要な飛躍的進歩は、ＩｋＢａを特異的にリン酸化する２つのキナーゼ(ＩＫＫ１／ＩＫＫａおよびＩＫＫ２／ＩＫＫｂ)の同定である。これらのキナーゼは、それらのロイシンジッパードメインを通じてホモ−およびヘテロダイマーを形成し、そして第３のタンパク質(ＮＥＭＯ／ＩＫＫｇ)に結合する。ＩＫＫ１、ＩＫＫ２およびＮＥＭＯからなる、このＩｋＢキナーゼ複合体(ＩＫＣ)は、シグナロソームと呼ばれる分子量の大きい(５００〜７００ｋＤ)複合体内に含まれ、これはＰＫＡの触媒サブユニット(ｃｓＰＫＡ)およびホスホ−チロシン含有タンパク質のような他のタンパク質を含み得る。ノックアウトマウスを用いる遺伝的証拠により、炎症のシグナル伝達におけるＩＫＫ２の顕著な役割が明らかにされたが、ＩＫＫ１は分化のプロセスに関与するようである。
【０００６】
ＩＫＫに加えて、ｐｐ９０ｒｓｋおよびＤＮＡ−ＰＫは、ＩｋＢを直接リン酸化および活性化できることが示された。さらに、２つの新規のＩＫＫが記載され、１つはマクロファージ(ＩＫＫ−ｉ)においてｍＲＮＡレベルでＬＰＳにより誘導可能なものであり、そして１つ(ＴＢＫ１)はＴＲＡＦ２およびＴＡＮＫと複合体を形成し、したがって、ＮＦ−ｋＢ活性化をもたらすＴＮＦａのための代替的シグナル伝達経路を表すものである。いくつかのグループにより、正または負のいずれかでＩＫＫ活性に影響するモジュレーターが記載され(例えば、ＴＡＫ１；Hofer-Warbinek et al. J. Biol. Chem. 275 [2000] 22064-22068)、これは、さらなる重要なレベルのＮＦ−ｋＢ活性の調節を示している。
【０００７】
さまざまな細胞型において、ＩＫＣの複数の上流アクチベーター(multiple upstream activator)が記載されている。これらには、ＭＡＰ３Ｋ型キナーゼＮＩＫ(ＮＦ−ｋＢ誘導キナーゼ)およびＭＥＫＫ１(ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ１)、ＴＧＦｂ誘導可能キナーゼＴＡＫ１ならびにＡｋｔおよびＰＫＣアイソフォームゼータおよびシータを含み、これは不均質性ならびに異なる細胞型および刺激に関してＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路の一定の程度の特異性の両方を反映している。これらの上流アクチベーターは、刺激、例えばＴＮＦ−Ｒに関してＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＤＤ、ならびにＩＬ−１ＲおよびＴｏｌｌファミリーレセプターに関してＴＲＡＦ６によりレセプターへ補充されたレセプター特異的細胞質性シグナル伝達複合体の異なる構成成分に結合する。したがって、ＩＫＫ２は、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達において中心的に重要であるように見える。
【０００８】
今回、単離ＰＨＡ−活性化リンパ球のｃＤＮＡライブラリーから、例えば配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有し、かつ、配列番号２で示されるアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも８０％の同一性の配列を有するポリペプチドをコードする、ＩＫＫ２−５５遺伝子が単離され得ることが示された。
【０００９】
内皮細胞(ＥＣ)は、脈管構造に局在化している。それらは接合部複合体によりつながっており、そして内皮を形成し、これは血管系全体を裏打ちしている。それらは、循環(circulation)と特定の器官との間の物質の流動を制御し、そして炎症応答の主要な部位である。さらに、それらは、体自体の免疫防御システムの循環細胞と特定の臓器の改変細胞との間の相互作用が起こる部位である。血流と体のさまざまな組織との間での物質、ペプチドおよび免疫細胞の交換は、ＥＣバリアーにより制御される。このＥＣバリアーの選択性は、それぞれの器官の完全性を維持するために不可欠ないくつかのいわゆる「血液−組織」バリアーの形成に非常に重要である。
【００１０】
さまざまな病理学的刺激に応答して、ＥＣはそれらの構成的機能を調整し得、内皮機能障害(endothelial dysfunction)と呼ばれる、それらの機能的状態のいくつかのタイプの可逆的変化がもたらされる。ＥＣは、適切な血流の維持に必須の多数の生理学的シグナルに対して釣合いの取れた方法で応答しなければならず、これはすべての組織に酸素および栄養を供給し、そして微生物、ウイルスおよび寄生生物感染と戦う。さらに、ＥＣは、また、新しい血管、癌の進行、およびアテローム性動脈硬化症の進行の増殖および後退の誘導により損傷修復に関与する(例えば、Cines et al. Blood 91 [1998] 3527-3561参照)。
【００１１】
キャピラリーＥＣは、特異的モノクローナル抗体を用いる免疫磁気ビーズにより、または、磁気ビーズを被覆しているＵｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓレクチン タイプ１により、ヒト組織から単離され得る(例えば、Manconi et al. Meth. Cell Science [2000] 22 89-99参照)。ＥＣのｃＤＮＡライブラリーを作成し得、そしてＥＣの遺伝子発現パターンが、オリゴヌクレオチドフィンガープリント、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションまたはＲＮＡプロファイリングのようなさまざまなハイブリダイゼーション技術により、および慣用的方法の配列決定により、得られ得る。
【００１２】
今回、単離ＥＣのｃＤＮＡライブラリーから、例えば配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有し、かつ、配列番号４で示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するＤＩＮＯポリペプチドをコードする、ＤＩＮＯ遺伝子が単離され得ることも見出された。
【００１３】
樹状細胞(ＤＣ)は、初期の免疫応答および免疫寛容の誘発に中心的な役割を果たす専門的な抗原提示白血球である。未分化の状態において、ＤＣは、侵入病原体の抗原を捕捉するために作られた体のさまざまな組織に存在し得る。抗原の捕捉後、ＤＣは抗原提示細胞へと成熟し、そしてリンパ器官へと移動してＴ細胞を活性化する(Banchereau, M. and R.M. Steinman Nature 329 [1998] 245-252)。例えば、皮膚に存在するランゲルハンス細胞(ＬＣ)は、皮膚において産生されたかまたは皮膚へと浸透し得るさまざまな抗原を提示することが示された。接触過敏症において、反応性ハプテンの局所投与はＬＣを活性化し、表皮の外に出て流入領域リンパ節(draining lymph node)の中へと移動し得、この部位でＬＣは、選択されたＴ細胞に対して抗原を提示し得る。ＬＣとＴ細胞との接触中、ＬＣは、Ｔ細胞に、増殖およびエフェクター細胞への分化を誘導するシグナルを提供し得る。
【００１４】
Ｔ細胞のタイプおよび相互作用する分子の種類に依存して、関与する細胞障害性、調節性およびヘルパーＴ細胞が形成され得る。ＤＣは、また、すべての種類のアポトーシス細胞を貪食し、したがって、自己抗原に対する寛容の維持において重大な役割を果たし得ることが示された(Steinman R.M. and K. Inaba J. Leukoc. Biol. 66 [1999] 205-208)。ＤＣが、免疫応答の主要な調節物質として、原因的または結果的役割を果たす疾患は、ＤＣ特異的な医薬的または医原性診療に関して、例えば慢性炎症性疾患、自己免疫疾患または移植拒絶において、ならびに接触過敏症またはアトピー性皮膚炎のような炎症性皮膚疾患を含む疾患、および有意な病理学的成分がＡＩＤＳおよび癌におけるように免疫抑制性である疾患または症候群において、標的化され得る。
【００１５】
ＤＣは、ネガティブセレクションにより、すなわち、特異的ｍＡＢ被覆マグネチックビーズ上で捕捉することまたは常法にしたがってパニングすることによる単球(ＣＤ１４＋)、Ｔ細胞(ＣＤ３＋)、Ｂ細胞(ＣＤ１９＋)およびＮＫ細胞(ＣＤ１６＋)からの単離により、末梢血から単離され得る。ＤＣのｃＤＮＡライブラリーを作成し得、そしてＤＣの遺伝子発現のパターンは、オリゴヌクレオチドフィンガープリント、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションまたはＲＮＡプロファイリングのようなさまざまなハイブリダイゼーション技術により、および慣用的方法にしたがう配列決定により、得られ得る。
【００１６】
ＤＣの膜貫通レセプターは重要である。何故なら、１つには、それらはＤＣによる抗原提示をもたらす寄生生物およびアポトーシス細胞の取り込みに関与するからである。他方には、これらのレセプターは、可溶性リガンド、ならびにＴ細胞および他の免疫細胞上の表面結合性リガンドと相互作用する。これらの相互作用は、ＤＣの機能ならびにＴ細胞のような相互作用性細胞の機能の調節に関与する。細胞の分化状態および相互作用性リガンドに依存する、これらの調節事象としては、ＤＣ、Ｔ細胞および他の免疫細胞の活性化および阻害が挙げられる。
【００１７】
ＩＩ型膜貫通配向性および細胞外部分にＣ型レクチン様ドメインを有するレセプターが、さまざまな造血細胞上に頻繁に発現されることが見出され、そしていくつかのものは初期の免疫応答において重要な役割を果たすことが示された(Weis W.I., Taylor M.E. and Drickamer K. Immunol. Rev. 163 [1998] 19-34)。造血系の細胞において広く発現されるＣＤ６９およびＡＩＣＬ(Santis A.G. et al. Eur. J. Immunol. 24 [1994] 1692-7; Hamann et al., Immunogenetics 45 [1997] 295-300)のようなタンパク質は別として、いくつかのものは、細胞型発現、例えば近年集中的に研究されているレクチン様ＮＫ細胞レセプターにおいてさらに制限されている。
【００１８】
げっ歯類のＮＫ細胞において最初に検出されたレクチン様ＮＫＲ−Ｐ１およびＬｙ４９遺伝子(Yokoyama W.M. et al. J. Immunol. 147 [1991] 3229-3236)、ならびにヒトＮＫ細胞から最初に記載されたＣＤ９４およびＮＫＧ２遺伝子(Chang C. et al. Eur. J. Immunol 25 [1995] 2433-2437; Houchins J. P. et al. J. Exp. Med. 173 [1991] 1017-1020; Hofer E. et al. Immunol. Today 13 [1992] 429-430)は、マウス第６染色体(Brown M.G. et al. Genomics 42 [1997] 16-25)、ラット第４染色体およびヒト１２ｐ１２．３−ｐ１３．２染色体(Sobanov Y. et al. Immunogenetics 49 [1999] 99-105)の合成領域に現れる。したがって、これらの領域は、ＮＫ遺伝子複合体と呼ばれる。自然の免疫細胞の機能のために重要ないくつかの遺伝子を含む染色体領域(chromosomal area)の概念と矛盾することなく、ウイルス感染への抵抗を仲介するかまたは同種異系リンパ球の溶解を仲介する遺伝子座が、げっ歯類においてこの領域にマッピングされた。
【００１９】
今日において、レクチン様ＮＫレセプターが適切なＭＨＣクラスＩの発現をモニターするのに重要な役割を有することが十分に確立されている(Lopez-Botet M. et al. Semin. Immunol. 12 [2000] 109-119; Hoglund P. Immunol. Rev. 155 [1997] 11-28)。ヒトＮＫ細胞において、ＣＤ９４鎖は、異なるＮＫＧ２アイソフォームとヘテロダイマー性レセプターを形成し、これは非古典的ＭＨＣクラスＩｂ分子ＨＬＡ−Ｅと結合できる。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは阻害性レセプターとして機能し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＣレセプターはＮＫ細胞を活性化できる。ＨＬＡ−Ｅは、他のクラスＩａ分子のリーダー配列からペプチドを提示し、そして適当なペプチドが負荷された場合に表面上に輸送されるのみである。
【００２０】
したがって、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡレセプターによるＨＬＡ−Ｅの認識は、ＭＨＣクラスＩ分子の適切な生合成をモニターするための罹病性の高い機構であり、これは多くのウイルスにより下方調節され得る(Alcami A. and U.H. Koszinowski Immunol. Today 21 [2000] 447-55)。この文脈におけるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターを活性化する機能は、まだ理解されていない。他のＮＫＧ２分子とわずかしか関連がない活性化ＮＫＧ２Ｄレセプターはヘテロダイマーを形成し、そしてクラスＩ様分子ＭＩＣＡを認識し、これはストレス、例えばウイルス感染により、およびいくつかの腫瘍細胞上で上方調節される(Bauer S. et al., Science 285 [1999] 727-729)。マウスにおける対応するＣＤ９４およびＮＫＧ２レセプターは、同様の機能を有すると思われる。
【００２１】
ヒトＮＫレセプター遺伝子のゲノム構造および転写(Glienke J. et al. Immunogenetics 48 [1998] 163-173)ならびにそれらのタンパク質産物の機能(Duchler M. et al. Eur. J. Immunol. 25 [1995] 2923-31)は、従来から研究されてきた。ＮＫＧ２およびＣＤ９４レセプター遺伝子に対する進化および機能に関連する遺伝子を発見する試みにおいて、これらの研究は、約１Ｍｂの両側のこれらの遺伝子に隣接するＮＫ遺伝子複合体の領域を包含するように拡張されてきた。Ｌｙ４９Ｌ偽遺伝子以外に、動原体側でさらなるヒトＬｙ４９遺伝子を検出することはできなかったが(Bull C. et al. Genes and Immunity 1 [2000] 280-287)、今回、ＣＤ９４の４つの関連性レクチン様テロメア性遺伝子の新規クラスターが見出された。このクラスターは、ＬＯＸ−１(Sawamura T. et al. Nature 386 [1997] 73-77)、新規ヒトレクチン様レセプター(ＬＬＲ−Ｊ２４)遺伝子および最近報告されたＣｌｅｃ−１およびＣｌｅｃ−２遺伝子(Colonna M., Samaridis J., Angman L. Eur. J. Immunol. 30 [2000] 697-704)を含む。それらの染色体上の局在性、発現パターンおよびＮＫレセプター遺伝子に対する相同性は、ＤＣ、単球および内皮細胞における重要な固有の免疫機能を示唆している。
【００２２】
ＤＣは、リンパ性および非リンパ性器官における抗原提示細胞集団である(Hart D.N. Blood 90 [1997] 3245-87)。それらは、抗原特異的なＴ細胞の増殖の開始において重要な役割を果たす。未成熟なＤＣは末梢非リンパ性器官に現れ、ここで、それらの主要な機能は、外来性抗原および病原体に関して周囲組織を濾過することである。これらの未成熟ＤＣは抗原取り込みおよびプロセシングにおいて高度に分化し、そして非リンパ性組織に長期間滞在する。抗原取り込み後、これらのＤＣは、リンパ節または脾臓のような二次リンパ器官のＴ細胞に富む領域に移動することができる。これは、ＤＣ成熟(DC maturation)として知られる表現型および機能的変化と深く関連している。このプロセスにおいて、ＤＣは、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子ならびにＣＤ８０およびＣＤ８６のようなＴ細胞共刺激性分子を上方調節する。
【００２３】
成熟ＤＣは、ヘルパーＴ細胞および細胞障害性Ｔ細胞の強力な刺激物質である。ＤＣの分化を先導し、次に、リンパ球の分化をプログラムする分子シグナルを理解することは、ワクチン接種戦略(vaccination strategy)に関してより効果的な免疫応答の操作を可能にするため、または損傷を受けている免疫応答をスイッチオフにすることを可能にするために極めて重要である。ＤＣにおけるＬＬＲ−Ｊ２４の特異的発現および成熟プロセス中のその下方調節についての現在の知見に基づいて、このレセプターがＤＣ成熟またはＴ細胞刺激の間に役割を果たすと考えられる。
【００２４】
ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子は、今回、見出され、単離され、そして単球由来および臍帯血前駆細胞由来ＤＣ(ＭｏＤＣおよびＣＢＤＣ)において選択的に発現された。ヌクレオチド配列番号５で示されるＬＬＲ−Ｊ２４−１遺伝子およびヌクレオチド配列番号７で示されるそのスプライスバリアントＬＬＲ−Ｊ２４−２は、ＮＫＧ２およびＣＤ９４ ＮＫレセプター鎖に関係するが同一ではなく(Houchins J.P. et al., J. Exp. Med. 173 [1991] 1017-1020; Chang C. et al., Eur. J. Immunol. 25 [1995] 2433-7; GenBank受託番号: NKG2A [X54867], NKG2C [X54869], NKG2E [L14542], NKG2H [AF078550], NKG2D [54780])、ｏｘＬＤＬレセプターＬＯＸ−１(Sawamura T. et al. Nature 386 [1997] 73-77; GenBank受託番号 AF035776)および２つの他のレセプター遺伝子がＤＣ、ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２において選択的に発現することが最近見出された(Colonna M. et al. Eur. J. Immunol. 30 [2000] 697-704; GenBank受託番号 CLEC-1 [AF200949], CLEC-2 [AF124841])。
【００２５】
ヒト第１２染色体上のいわゆるＮＫレセプター遺伝子複合体の他のメンバーに対して、幾分さらに離れた関係のものが存在する(Sobanov Y. et al. Immunogenetics 49 [1999] 99-105)。ＬＬＲ−Ｊ２４−１遺伝子は、配列番号５で示されるヌクレオチド配列およびヌクレオチド３５７〜３５８の間に挿入されたｓｔａｌｋペプチドをコードしている追加的エキソンからなるスプライスバリアントＬＬＲ−Ｊ２４−２として単離ＤＣ中に現れ得る。したがって、配列番号５で示されるスプライスバリアントは、スプライスアウトされたヌクレオチド３５８〜４９５を欠くこと以外は、配列番号７と同じである。
【００２６】
ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子は、細胞外部分にＣ型レクチン様ドメイン(ＣＴＬＤ)を有するＩＩ型膜貫通レセプターのサブファミリーの新規メンバーをコードする(Weis W.I. et al. Immunol Rev. 163 [1998] 19-34)。その最も近い類縁体は、マウスＤＥＣＴＩＮ−１(５９％同一性、Ariizumi et al. J. Biol. Chem. 275 [2000] 20157-20167, 受託番号 AF262985)、ヒトＬＯＸ−１(ＣＴＬＤにおいて４４％相同性、Sawamura T. Nature 386 [1997] 73-77; 受託番号 AF035776)、ＣＬＥＣ−１(ＣＴＬＤにおいて３７％相同性、Colonna M. et al. Eur. J. Immunol. 30 [2000] 697-704, 受託番号 AF200949)、ＣＬＥＣ−２(ＣＴＬＤにおいて３７％相同性、Colonna M. et al. Eur. J. Immunol. 30 [2000] 697-704, 受託番号 AF124841)、ＮＫＧ２−Ｄ(ＣＴＬＤにおいて３３％相同性、Houchins J.P. et al. J. Exp. Med. 173 [1991] 1017-1020, 受託番号 X54870)、ＮＫＧ２−Ａ(ＣＴＬＤにおいて３０％相同性、受託番号 X54867)、ＮＧＫ２−Ｃ(ＣＴＬＤにおいて３０％相同性、受託番号 X54869)およびＣＤ９４レセプター(ＣＴＬＤにおいて３１％相同性、Chang C. et al. Eur. J. Immunol. 25 [1995] 2433-7)鎖である。
【００２７】
ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子は、ＮＫレセプター遺伝子複合体中の第１２染色体上に位置し、これはまた、上記のホモログおよび幾分さらに離れた関係の追加的遺伝子を含む。配列番号５で示されるＬＬＲ−Ｊ２４−１遺伝子および配列番号７は、典型的なＣＴＬＤおよびその細胞質側末端におけるＩＴＡＭ様配列をコードする。ＣＴＬＤの配列は、該スーパーファミリーの他のメンバーのすべてのＣＴＬＤと明らかに相同であり、細胞質側末端は他のファミリーのメンバーとあまり関係がないかまたは全く関係がないが、マウスのＤＥＣＴＩＮ−１配列とは明らかに相同性がある。配列番号７で示されるＬＬＲ−Ｊ２４−２遺伝子は、配列番号５と同一であるが、ｓｔａｌｋペプチドをコードする追加的エキソンを含む。ｓｔａｌｋペプチドを有する対応するタンパク質は、配列番号８において示される。ｓｔａｌｋエキソンヌクレオチド配列は、配列番号９で表され、そして対応するｓｔａｌｋペプチドは配列番号１０で表される。
【００２８】
これまでに、ｓｔａｌｋペプチドは細胞表面上のレセプターの発現に必要であり、ｓｔａｌｋのないレセプターは細胞内で発現することが見出された。ＣＴＬＤは、Ｔ細胞のような他の免疫細胞上の表面ペプチド構造に結合する。これは、Ｔ細胞活性化に調節性、例えば共刺激性シグナルを提供し得る。ＤＣ成熟の間、該レセプターは下方調節される。これは、また、Ｔ細胞活性化に対する阻害シグナルを軽減し得る。レセプターの細胞質側ドメインは、リガンドへのＣＴＬＤの結合によりＤＣ成熟を制御する。ＣＴＬＤは、例えば、寄生生物、ｏｘＬＤＬおよびアポトーシス細胞膜の膜構造のようなリポタンパク質構造に結合する。これらの構造を含む細胞および化合物は内在化されて、効率のよい抗原提示をもたらす。ＤＣの貪食作用が減少した場合、レセプターはＤＣ成熟の間、下方調節される。レセプターの細胞質側ドメインは、リガンドへのＣＴＬＤの結合により、ＤＣ成熟の内在化および活性化を仲介する。
【００２９】
ｓｔａｌｋペプチドのないレセプターの細胞内部分は、異常型細胞内構造および寄生生物のモニターに関与し、したがって、配列番号１０で示されるｓｔａｌｋペプチドを含む部分とは別の機能を有する。
【発明の開示】
【００３０】
したがって、本発明は、単離された、
・配列番号２で示されるＩＫＫ２−５５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＩＫＫ２−５５遺伝子；
・配列番号４で示されるＤＩＮＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＩＮＯ遺伝子；または
・配列番号１０で示されるＬＬＲ−Ｊ２４−ｓｔａｌｋペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＬＬＲ−Ｊ２４−ｓｔａｌｋヌクレオチド
を提供する。
【００３１】
さらに、本発明は、単離された、
・配列番号２で示されるＩＫＫ２−５５ポリペプチドをコードする、例えば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含んでなるＩＫＫ２−５５遺伝子；
・配列番号４で示されるＤＩＮＯポリペプチドをコードする、例えば、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含んでなるＤＩＮＯ遺伝子；または
・配列番号１０で示されるｓｔａｌｋペプチドをコードする、例えば、配列番号９で示されるヌクレオチド配列を含んでなるＬＬＲ−Ｊ２４−ｓｔａｌｋヌクレオチド
を提供する。
【００３２】
さらに、本発明は、単離された、
・配列番号２で示されるＩＫＫ２−５５ポリペプチド；
・配列番号４で示されるＤＩＮＯポリペプチド；または
・配列番号１０で示されるＬＬＲ−Ｊ２４−ｓｔａｌｋペプチド
を提供する。
【００３３】
ＩＫＫ２−５５遺伝子、ＤＩＮＯ遺伝子、ＬＬＲ−Ｊ２４−ｓｔａｌｋ遺伝子、膜貫通タンパク質ＬＬＲ−Ｊ２４をコードする単離ポリヌクレオチドおよびＬＬＲ−Ｊ２４の細胞外ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドを、本明細書において、「本発明の遺伝子(複数も可)」と称する。
【００３４】
ＩＫＫ２−５５ポリペプチド、ＤＩＮＯポリペプチド、ＬＬＲ−Ｊ２４−ｓｔａｌｋペプチド、ＬＬＲ−Ｊ２４の細胞外ドメインである単離ポリペプチドおよび膜貫通タンパク質ＬＬＲ−Ｊ２４である単離ポリペプチドを、本明細書において、「本発明のポリペプチド(複数も可)」と称する。
【００３５】
本発明のポリペプチドには、配列番号２、配列番号４および配列番号１０のアミノ酸配列のポリペプチドが含まれ、そして、それぞれ、配列番号２、配列番号４または配列番号１０の対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性、および対応する本発明のポリペプチドと同一の生物学的活性、を有するアミノ酸配列が含まれる。本発明のポリペプチドには、対応する本発明の遺伝子によりコードされたポリペプチドが含まれ、これには；例えば、遺伝コードの重複性(縮重)の結果として、また、対応する本発明のポリペプチドをコードする配列；あるいは、例えば、対立遺伝子変異体(allelic variant)および／または本発明の遺伝子の相補物を含む、本発明の遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、「成熟」ポリペプチド、例えばタンパク質の形態であってもよく、または、より大きいポリペプチド、例えばタンパク質、例えば融合タンパク質の部分であってもよい；例えば、分泌性またはリーダー配列、プロ配列、精製において役立つ配列、例えばマルチプルヒスチジン残基(multiple histidine residue)、または本発明のポリペプチドへの組換え産生中の安定性のための追加的配列を含むことは、有利であり得る。
【００３７】
本発明のポリペプチドは、また、本発明のポリペプチドのポリペプチドフラグメントも含む。このようなポリペプチドフラグメントは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列と一部が完全に同一であるが、全体は同じでないアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。このようなポリペプチドフラグメントは「独立(free-standing)」であってもよく、またはこのようなポリペプチドフラグメントが、最も好ましくは単一連続領域(single continuous region)として、部分または領域を形成するより大きいポリペプチドの部分であってもよい。好ましくは、このようなポリペプチドフラグメントは、対応する本発明のポリペプチドの生物学的活性を保持する。
【００３８】
本発明の定義されたポリペプチド(フラグメント)配列の変異体も、また、本発明の一部を形成する。好適な変異体は、保存的アミノ酸の置換により指示物から変化したもの、例えば、同様の特徴の別のものと残基を置換したものである。典型的には、このような置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間；ＳｅｒおよびＴｈｒの間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの間；ＡｓｎおよびＧｌｎの間；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの間；または、芳香族残基ＰｈｅおよびＴｈｒの間である。任意の組合せで、数個、５〜１０、１〜５、または１もしくは２のアミノ酸が、置換、欠失または追加された変異体が特に好ましい。
【００３９】
本発明のポリペプチド、またはそのフラグメントは、本発明の
・単離天然型ポリペプチド
・組換えにより製造されたポリペプチド
・合成的に製造されたポリペプチドおよび
・このようなポリペプチドの組合せ、
ならびにそれらのフラグメントを含む。
【００４０】
したがって、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントは、適当に、例えば慣用的方法で製造され得る。本明細書において特記しない限り、「単離(isolated)」は、「共存物質から分離された」、例えば天然の状態から「ヒトの手により改変された」という意味を含む。
【００４１】
本発明の遺伝子には、それぞれ、配列番号１、配列番号３および配列番号９で示される対応するヌクレオチド配列、およびそれらの対立遺伝子変異体、およびその相補物、ならびにそれらのスプライスバリアントが含まれ；例えばストリンジェント条件下で、例えば本発明の遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれ、例えば本発明の遺伝子の個々のヌクレオチド配列は、例えば遺伝コードの重複性(縮重)の結果として、本発明の遺伝子の配列と異なるが、本発明の対応するポリペプチドをコードするか、または、それぞれ、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列と少なくと８０％の同一性を有するアミノ酸配列の本発明のポリペプチドをコードし、そして本発明のポリペプチドと同じ生物学的活性を有する配列を含む。「ストリンジェント条件」は、本発明の遺伝子のヌクレオチド配列と、それとハイブリダイズする対応するポリヌクレオチド配列との間に、少なくとも８０％、例えば９０％、例えば９５％、９７％または９９％の同一性が存在する場合にのみハイブリダイゼーションが起きることを含む。
【００４２】
本発明の遺伝子は、対応するポリペプチド、もしくは本発明の対応するポリペプチドの部分(フラグメント)をコードするか、または本発明の対応するコードされたポリペプチドと、例えば該対応するアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも８０％の同一性；例えば８０％〜１００％、例えば９０％、例えば９５％、例えば９７％、例えば９９％または１００％の同一性；を有するアミノ酸配列のポリペプチドまたはポリペプチドの部分をコードし；該同一性は
【数１】
〔式中、ｎａはアミノ酸変更の数であり、ｘａは当該対応するアミノ酸配列中のアミノ酸の総数であり、そしてｙは１００で除した同一性パーセントである。〕
により計算され；例えば、該遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされたポリペプチド、または対応する遺伝子からの転写物の代替的スプライシングにより作成された対応するアミノ酸配列のアイソフォームを含む。「同一性」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度であり、そして、慣用的技術により、例えば市販のコンピュータープログラムを用いて、計算され得る。
【００４３】
本明細書において特記しない限り、「ポリペプチド」は、ペプチド結合により互いに結合した２またはそれ以上のアミノ酸を含んでなる任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書において特記しない限り、「ポリヌクレオチド」は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含み、これは、修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡであるか、あるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであり得、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ；ならびにＲＮＡハイブリッド分子を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００４４】
本発明の対応するポリペプチドをコードする本発明の遺伝子は、例えば、ＤＣのｍＲＮＡを用いる逆転写ＰＣＲにより、例えば、発現配列タグ(ＥＳＴ)解析を用いて、ＰＨＡ−活性化リンパ球もしくは内皮細胞、またはＤＣ中のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーから、標準的クローニングおよびスクリーニング法を用いて得られ得る(Adams M.D. et al. Science 252 [1991] 1651-1656; Adams M.D. et al. Nature 355 [1992] 632-634; Adams M.D. et al. Nature 377 Suppl.3 [1995] 174)。本発明の遺伝子は、天然の供給源、例えばゲノム性ＤＮＡライブラリーから得られ得るか、または慣用的方法にしたがって合成され得る。
【００４５】
本発明の遺伝子は、本発明の対応するポリペプチド(フラグメント)の組換えによる製造に有用であり、そして、このような組換えによる製造に用いられる場合、遺伝子配列はそれ自身で成熟ポリペプチド(フラグメント)のためのコード配列；あるいは他のコード配列、例えば、リーダーまたは分泌性配列、プレ−もしくはプロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列、または他の融合タンパク質の部分をコードする配列を有するリーディングフレーム中の成熟ポリペプチド(フラグメント)についてのコード配列、を含み得る。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコードされ得る。該マーカー配列は、適当な慣用的マーカー配列、例えばｐＱＥベクター(Qiagen, Inc.)において提供されそしてGentz et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 86 [1989] 821-824において記載されたようなＦＬＡＧ−ｔａｇ(Sigma)またはヘキサ−ヒスチジンペプチド、あるいはＨＡタグであり得る。本発明の任意の遺伝子は、また、非コード５'および３'配列、例えば転写され、翻訳されない配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位ならびにｍＲＮＡを安定化する配列を含み得る。
【００４６】
本発明の遺伝子のヌクレオチド配列と同一であるかまたは十分に同一であるヌクレオチド配列、例えばそのフラグメントまたはそのスプライスバリアントを含むものは、本発明の対応するポリヌクレオチド(フラグメント)をコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノム性クローンを単離するために；そして、例えば、本発明の遺伝子と高い配列相同性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノム性クローン(ヒト以外の種からのホモログおよびオーソログをコードする遺伝子を含む)を単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノム性ＤＮＡのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
【００４７】
ハイブリダイゼーションは、例えば、慣用的方法にしたがって行われ得る。典型的には、ある遺伝子配列に類似する配列は、本発明の遺伝子(フラグメント)の配列と８０％同一、好ましくは９０％同一、さらに好ましくは９５％同一である。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド、たとえば少なくとも３０ヌクレオチド、例えば少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約３０〜約５０ヌクレオチド；または全体のｃＤＮＡ配列のコード領域に相当するｃＤＮＡ配列もしくはその任意の部分を含み得る。ヒト以外の種からのホモログまたはオーソログを含む本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得るために、適当なハイブリダイゼーション技術、例えば、適当なライブラリーを、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、対応するポリヌクレオチド配列またはそのスプライスバリアントもしくはそのフラグメントの配列を有する標識プローブでスクリーニングする工程、および該ポリヌクレオチド配列を含有する完全長ｃＤＮＡおよびゲノム性クローンを単離する工程を含んでなる技術が使用され得る。
【００４８】
例えばストリンジェントの、ハイブリダイゼーション技術は、周知である。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、例えば上で定義された通りであるか、代わりに、適当な溶液、例えばホルムアミド、ＳＳＣ、リン酸ナトリウム、Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ溶液、デキストランおよびサケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液、例えば５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭ リン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ'ｓ溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性、切断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中にて、４０℃付近で一夜インキュベーションし、続いて０．１×ＳＳＣ中で約６５℃にてフィルターを洗浄するという条件である。
【００４９】
さらなる観点において、本発明は、本発明の遺伝子、例えば、ポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。
【００５０】
このようなベクターは、適当に、例えば慣用的方法で製造され得る。適当なベクターは、慣用的方法にしたがって提供され得る。本発明の遺伝子を含んでなるベクターは、例えば宿主細胞において、例えば適合性宿主細胞(compatible host cell)において本発明の遺伝子によりコードされたポリペプチドを組換え的に製造することができる発現系を得るために有用であり得る。本発明のポリペプチドの組換え的製造のために、宿主細胞を、例えば本発明の遺伝子、またはその部分を含んでなるベクターの使用により、例えば遺伝子操作をして、本発明のポリペプチド(フラグメント)を発現させるために、宿主細胞中に発現系を組み込み得る。細胞を使用しない翻訳系は、また、例えば慣用的方法で、例えば本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いて、本発明の遺伝子を製造するために使用され得る。
【００５１】
さらなる観点において、本発明は、例えば自然環境から単離された、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含んでなる発現系、例えば単離前の本発明の遺伝子を含んでなる発現系を提供し、当該発現系またはその部分が適合性宿主細胞中に存在する場合に、当該発現系またはその部分は本発明のポリペプチドを製造することができる。
【００５２】
さらなる観点において、本発明は、
・本発明の発現系を含んでなる単離宿主細胞；
・培養物中での本発明のポリペプチドの製造に十分な条件下で、本発明の発現系を含んでなる単離宿主細胞を培養すること、および培養物から本発明のポリペプチドを回収することを含んでなる本発明のポリペプチドの製造方法；
・適当な培養条件下で、宿主細胞が本発明のポリペプチドを製造するように、宿主細胞を本発明の発現系で形質転換またはトランスフェクトすることを含んでなる、本発明のポリペプチドを製造する組換え宿主細胞の製造方法；ならびに
・適当な培養条件下で、宿主細胞が本発明のポリペプチドを製造するように、宿主細胞を本発明の発現系で形質転換またはトランスフェクトすることにより製造された組換え宿主細胞、
を提供する。
【００５３】
組換え体製造に関して、宿主細胞は、本発明の遺伝子についての発現系またはその部分を組み込むために遺伝子操作され得る。
【００５４】
宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、適当に、例えば慣用的方法にしたがって、例えば、Davis et al. BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986); Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)にしたがって、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質介在性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、衝撃導入(ballistic introduction)もしくは感染、またはタンパク質形質導入にしたがって、行われ得る。適当な宿主細胞は、容易に見出され得る。適切な宿主細胞の例として、例えば連鎖球菌(streptococci)、ブドウ球菌(staphylococci)、大腸菌(E.coli)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、枯草菌(Bacillus subtilis)のような細菌類の細胞；酵母細胞(yeast cell)およびコウジカビ属の細胞(Aspergillus cell)のような真菌の細胞；Drosophila S2 および Spodoptera Sf9 細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、ＣＣＬ３９、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ ２９３、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞のような単離された動物細胞；および植物細胞が挙げられる。
【００５５】
適切な発現系は、例えば、染色体系、エピソーム系、およびウィルス由来系、例えばバクテリアプラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、イーストエピソーム、挿入エレメント、イースト染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウィルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、フォールポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどを由来とするベクター、ならびにそれらの組合せ由来のベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝エレメント由来のベクター、例えばコスミドやファージミドを含む。発現系は、発現を規定しそして発生させる制御領域を含む。一般的に、維持するか、増殖するか、または宿主細胞内でポリペプチドを生産するためのポリヌクレオチドを発現するのに適した、任意の系またはベクターが使用され得る。適当なヌクレオチド配列は、適当に、例えば慣用的方法にしたがって、例えば Sambrook et al., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL (supra) にしたがって、発現系に挿入され得る。
【００５６】
小胞体の内腔への、細胞膜周辺腔への、または細胞外環境への、翻訳されたタンパク質の分泌のために、適当な分泌シグナルが、所望のポリペプチドに組み込まれてもよい。これらは、異種性のシグナルであり得る。
【００５７】
本発明のポリペプチドをスクリーニングアッセイに使用するために発現させるのであれば、一般的に、ポリペプチドは細胞表面で作られ得る。この場合において、細胞は、スクリーニングアッセイに使用する前に採取され得る。代わって、ポリペプチドは細胞内で作られてもよい。
【００５８】
本発明のポリペプチドは、組換え細胞培地から、適当に、例えば洗剤抽出(detergent extraction)、超遠心、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー、例えば高速液体クロマトグラフィーなどを含む、慣用的方法にしたがって、回収され、そして精製され得る。本発明のポリペプチドが、単離および／または精製の間に変性した場合は、活性なコンホメーションの再生、例えば変性した本発明のポリペプチドのリフォールディングが、適当な方法、例えば慣用的方法にしたがって行われ得る。
【００５９】
本発明のポリペプチドが細胞内で産生される場合、該細胞を、ポリペプチドの回収前に、例えば溶解し得る。
【００６０】
本発明の遺伝子(フラグメント)、または本発明のポリペプチド(フラグメント)は、動物およびヒトの疾患に対して、処置の発見と診断のための、検査試薬および検査物質として使用され得る。
【００６１】
転写因子ＮＦ−ｋＢは、免疫性および炎症性遺伝子の発現の調節において重要な調節的役割を果たす。ＮＦ−ｋＢの活性化をもたらすシグナル伝達経路の中心的構成成分の１つは、ＩＫＫ２である。ＩＫＫ２と相互作用するタンパク質は、ＩＫＫ２活性に対する調節機能を有し得る。ＩＫＫ２−５５は、酵母ツーハイブリッドスクリーンおよび共免疫沈降においてＩＫＫ２と相互作用することが見出された。それは、ＮＦ−ｋＢ活性ならびに一定のプロモーターの活性を調節することが見出された。したがって、ＩＫＫ２−５５ならびにその薬理学的アゴニストまたはアンタゴニストは、例えば炎症、動脈硬化症、再狭窄、再灌流障害、炎症性腸疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーおよび癌を含む多様な免疫または炎症関連疾患を処置するために使用され得る。
【００６２】
本発明のＤＩＮＯ遺伝子は、約３５０のアミノ酸のＣ末端ＨＥＣＴドメインおよびＮ末端にさまざまな数のＲＣＣ１リピートを典型的に含むＨＥＲＣタンパク質ファミリーに属することが見出された。ＨＥＣＴドメインタンパク質は、ユビキチンを、Ｅ２結合酵素から、プロテアソームによる分解が運命付けられた特異的基質に、移動させるＥ３ユビキチンリガーゼのサブファミリーを構成する。ＨＥＲＣファミリーのメンバーのための基質は、細胞サイクルの制御(サイクリンＥ、ｐ２１およびｐ５３)、癌(Ｅ６−ＡＰ)およびＴＧＦ−βファミリーのメンバーのＢＭＰシグナル伝達の調節に関与することが示された(Mitsui et al. BBRC 266 [1999] 115-122; Cruz et al. FEBS letters 488 [2001] 74-80; Scheffner et al. Cell 75 [1993] 495-505; Zhu et al. Nature 400 [1999] 687-693)。
【００６３】
酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、ＤＩＮＯはＴＳＧ１０１遺伝子と相互作用できることが見出された。ＴＳＧ１０１は、ＴＳＧ１０１／ＭＤＭ２調節ループを形成することによりＭＤＭ２分解およびＭＤＭ２／ｐ５３フィードバック制御を調節する(Li et al. PNAS 98 [2000] 1619-1624)。さらに、レポーター遺伝子アッセイを用いて、ＤＩＮＯの発現はｐ５３転写活性を増大させることが見出された。ＤＩＮＯは、ＴＳＧ１０１とＭＤＭ２／ｐ５３ループとの間の機能的相互作用に深く関与し、したがって、細胞増殖、アポトーシスおよび炎症性応答のメディエーターであると考えられる。
【００６４】
ＤＩＮＯは、５つのＲＣＣ１リピートをＮ末端に有し、そして３つの完全および半分のリピートを有するＣｅｐ１と異なる。ＲＣＣ１は、低分子量ＧＴＰａｓｅ Ｒａｎのグアニンヌクレオチド交換因子(ＧＥＦ)である(Bischoff and Ponstingl Nature 354 [1991] 80-82)。ＤＩＮＯは、低分子量ＧＴＰａｓｅを同定するために今のところＧＥＦ活性を発揮すると考えられ得、したがって、細胞増殖、細胞骨格形態および細胞内輸送の調節に関与し得る。
【００６５】
ＤＩＮＯは、Ｈｅｒｃ３およびＣｅｐ１を含むクラスターとして染色体４．２１−２３上に位置し得る。
【００６６】
ＬＬＲ−Ｊ２４−１および−２遺伝子は、細胞外部分にＣＴＬＤを有するＩＩ型膜貫通レセプターのスーパーファミリーに属することが見出された(Weis W.I. et al. Immunol. Rev. 163 [1998] 19-34)。これらのレセプターの遺伝子の重要な部分は、ヒト第１２染色体上のＮＫレセプター複合体中に位置する(Sobanov, Y. et al. Immunogenetics 49 [1999] 99-105)。レセプターのＣＴＬＤは、典型的には、３つのエキソンによりコードされる。ＣＴＬＤは、進化の過程で、Ｃ型糖認識ドメイン(carbohydrate recognition domain)から発達した。これはレクチン折りたたみ結合Ｃａ＋＋を含み、そして肝アシアロ糖タンパク質レセプターのような糖リガンドを有していた。
【００６７】
ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子の結合ドメインは、ＣＴＬＤの修飾された特徴を有し、例えばそれはＣａ＋＋と独立して折りたたむことができ、そして非糖性リガンドと結合することができる。他のＣＴＬＤファミリーの遺伝子とＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子との関係を確立するために、ＣＴＬＤの予想アミノ酸配列を比較した。得られたデータにより、ＬＬＲ−Ｊ２４が、ＬＯＸ−１、ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２とともに、ＮＫＣのより近い関係のレクチン様レセプターのサブファミリーを形成することが示される。ＬＬＲ−Ｊ２４との最も高い相同性は、ＬＯＸ−１において見られ(４４％)、ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２は幾分さらに離れた関係である(３７％)。ＮＫＧ２およびＣＤ９４タンパク質からなるＣＴＬＤ ＮＫレセプターのサブファミリーは、その次に近い関係のタンパク質である(ＮＫＧ２−Ｅに関して２８％およびＮＫＧ２−Ｄに関して３３％)。ＡＩＣＬ／ＬＬＴ−１／ＣＤ６９グループならびにＫＬＲＦ１、ＭＡＦＡおよびＮＫＲ−Ｐ１レセプターは、さらに幾分、より離れており、そしてマルチプルアラインメントにおいて別々の枝に示される。
【００６８】
ＬＯＸ−１は、血管内皮細胞およびマクロファージにより発現されることが見出された。それは、ＴＮＦ−α、リポポリサッカライドおよびｏｘＬＤＬのような炎症性の刺激により、in vivo で動力学的に調節されるが、高血圧においてはＴＧＦ−β、アンギオテンシンＩＩおよび流体せん断力(fluid shear stress)によっても調節される。重要なことに、ＬＯＸ−１は、泡沫細胞形成および内皮機能障害に寄与すると信じられているアテローム性動脈硬化症の病変において上方調節されいることが見出された。ｏｘＬＤＬおよび陰イオン性リン脂質ならびに加齢赤血球細胞およびアポトーシス細胞を結びつけることが記載された(Sawamura T. et al. Nature 386 [1997] 73-77)。加齢またはアポトーシス細胞における最初の事象の１つは、細胞膜の外側のホスファチジルセリンの曝露であり、これはＬＯＸ−１により認識されそして結合する。したがって、ＬＯＸ−１は、血流からそれらの細胞を除去することに関与すると提案されている。ＣＤ９４／ＮＫＧ２レセプターのような他のレクチン様レセプターのリガンド結合により開始されたシグナル伝達事象とは対照的に、ＬＯＸ−１に結合した分子および細胞フラグメントは、エンドサイトーシスにより内面化される。
【００６９】
ＬＯＸ−１と同様に、ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子は、ｏｘＬＤＬのような酸化されたリポタンパク質、寄生生物の表面構造およびアポトーシス細胞のフラグメントと結合すると考えられ得る。
【００７０】
他の２つの密接に関係した遺伝子は、ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２と呼ばれ、対応するｃＤＮＡは、近年、ＥＳＴデータベースにおいて同定され、そして記載された(Colonna M. et al. Eur. J. Immunol. 30. [2000] 697-704)。ＣＬＥＣ−１ ｍＲＮＡはＤＣにおいて選択的に発現されることが示され、そして、胎盤、肺および胸腺においても見出される。ＣＬＥＣ−２ ｍＲＮＡも、ＤＣにおいて検出されるが、さらに、造血系においてさらに広範な発現を示した。さらに、ＣＬＥＣ−２ ｍＲＮＡレベルは、肝臓においてとりわけ高い。ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２のリガンドは、まだ、同定されていない。
【００７１】
その次に近い関係の遺伝子は、ＮＫＧ２ ＮＫレセプターの遺伝子である。今日においては、レクチン様ＮＫレセプターは、ミッシング−セルフ(missing-self)仮説にしたがって適切なＭＨＣクラスＩ発現をモニターするのに重要な役割を有することが十分に確立されている(Hoglund P. et al. Immunol. Rev. 155 [1997] 11-28)。ヒトＮＫ細胞において、ＣＤ９４鎖は異なるＮＫＧ２アイソフォームとヘテロダイマー性レセプターを形成し、これは非古典的ＭＨＣクラスＩｂ分子ＨＬＡ−Ｅと結合することができる(Lopez-Botet M. et al. Semin. Immunol. 12 [2000] 109-119)。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、阻害性レセプターとして機能し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターは、ＮＫ細胞を活性化することができる。ＨＬＡ−Ｅは、優勢的に、他のクラスＩ分子のリーダー配列からペプチドを提示し、そして、適当なペプチドとともに負荷された場合に、表面上に輸送されるのみである。したがって、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡレセプターによるＨＬＡ−Ｅの認識は、ＭＨＣクラスＩ分子の生合成をモニターするための感度の高いメカニズムであり、これは多くのウイルスにより下方調節され得る。この文脈における活性化ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃレセプターの機能は、まだ十分には理解されていない。
【００７２】
他のＮＫＧ２分子と少し離れた関係の、活性化ＮＫＧ２Ｄレセプターは、ホモダイマーを形成し、そしてクラスＩ様分子ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢを認識し、これはストレス、例えばウイルス感染により、およびいくつかの腫瘍細胞において、上方調節される(Bauer S. et al. Science 285 [1999] 727-729)。さらなるリガンドは、いわゆるＵＬ１６結合タンパク質であり、これはＣＭＶコードＵＬ１６タンパク質と結合し、そしてまた、腫瘍細胞において上方調節される。したがって、ＮＫＧ２−Ｄは、ウイルスに感染しそして形質転換した細胞の、ＮＫ介在性殺傷に直接関連する活性化レセプターである。ＮＫＧ２タンパク質の中で、ＬＬＲ−Ｊ２４がＮＫＧ２−Ｄに最も近く関係していることに注目すべきである。マウスにおける対応するＣＤ９４およびＮＫＧ２タンパク質は、比較可能な機能を有するように見える。さらに、マウスにおいて、Ｌｙ４９レセプターの１４を超えるアイソフォームが、さまざまなＭＨＣクラスＩ分子の発現のモニターに関係している。
【００７３】
ＮＫＧ２レセプターと同様に、ＬＬＲ−Ｊ２４は一定のＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体に、またはウイルス感染および腫瘍細胞で上方調節されたクラスＩ関連分子に、結合できると考えられている。
【００７４】
ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子の配列は、最初に単離されたヒトｃＤＮＡからｓｔａｌｋエキソンが失われていることを除いて、最近記載されたネズミＤＥＣＴＩＮ−１ ｃＤＮＡと高い相同性を示す。これは、約５〜１０％の転写物の細分画(subfraction)において正しくスプライシングされることが見出されると測定され得(図９および１０)、マウスおよびヒトＤＥＣＴＩＮ−１の対応する予想完全長タンパク質配列を比較した。両配列は、５９％の同一性(相同性６９％)を示す。高い相同性が、細胞質、およびｓｔａｌｋドメインを含む細胞外ドメインにおいて保存されている。細胞質ドメインのＮ末端の近くに、ＩＴＡＭ様配列が、ヒトならびにネズミのそれにおいて存在する。
【００７５】
この配列は、ＣＤ３−γ鎖またはＤＡＰ１２分子において見出された古典的ＩＴＡＭモチーフとは少し異なる(Lanier L.L. et al. Nature 391 [1998] 703-707)。該モチーフにおける最初のチロシン(残基３)は、ロイシン(残基７)の４アミノ酸前に位置するが、この距離は、古典的Ｙｘ２Ｌｘ６〜８Ｙｘ２Ｌモチーフにおける３アミノ酸の位置である。該モチーフの次の残基は正しく配置されている。両タンパク質は、さらに、Ｎ−グリコシル化のためのコンセンサス部位を示す。ヒトおよびネズミのレクチン様ドメインは、非糖リガンドを提示するＣａ＋＋結合に関与すると記載された残基のほとんどを欠いている。膜貫通ドメインは、荷電アミノ酸を示さず、これはＤＡＰ分子のようなＩＴＡＭ含有アダプターとの会合が起きていないことを示している。
【００７６】
一次ヒトＤＣ、単球、ＴおよびＢリンパ球ならびに内皮細胞におけるＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの発現も、また、調べられた。得られたデータにより、ヒトＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡは、単球由来ＤＣ(ＭｏＤＣ)においておよびＣＤ３４＋造血前駆細胞由来のＤＣ(ＨＰＤＣ)において、大量にそして選択的に発現している。少量のＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡが一次単球中に存在するが、さまざな刺激で処理されたまたは処理されていない、一次ＴおよびＢリンパ球ならびに内皮細胞は、検出可能なＬＬＲ−Ｊ２４転写物を発現しない。いくつかのさらなる細胞株、すなわちＪｕｒｋａｔ、ＲＰＭＩ８８６６、ＮＫＬおよびＮＫ９２を含むノーザンブロットにおいて、発現は見られない。ＤＣにおけるＲＮＡのサイズは、ノーザンブロットから３．０〜３．５ｋｂと見積もられ、これは、停止コドンから１．６〜１．９ｋｂ下流の領域の遺伝子において検出された第１のまたはいくつかの連続的ポリアデニル化シグナルの使用を仮定して期待される転写物のサイズに相当する。
【００７７】
ＤＣの活性化および最終的成熟は、それらの移動および機能を調節する遺伝子の改変された発現と関連する。したがって、炎症メディエーター、ＣＤ４０−リガンドまたはザイモサンＡによるＤＣの活性化がＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの発現レベルに変化をもたらすかどうかについて試験された。図８において示された通り、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αと組み合せたＭｏＤＣの１８〜２４時間の処理は、再生可能な、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの３〜５倍の減少をもたらした。代わって、ＨＰＤＣは、酵母粒子のファゴサイトーシスを刺激するザイモサンＡの非存在または存在下で、ＣＤ４０レセプターに特異的なｍＡｂにより活性化された。これらの結果に基づいて、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの下方調節が、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのような成熟の強力な誘発剤またはファゴサイトーシス刺激と組み合せたＣＤ４０ライゲーションで処理した培養物において特異的に表わされる。ＭＤＣケモカイン(ＣＣＬ２２)は、ＤＣにおいて成熟後に強力に誘導されることが知られているので、同じノーザンブロットを、ＭｏＤＣまたはＨＰＤＣの活性化の成功を確認するために、ＭＤＣのための特異的プローブとハイブリダイズさせた。図８において見られるように、ＭＤＣの強力な誘導は、両方のタイプのＤＣにおけるＬＬＲ−Ｊ２４転写物の下方調節と平行する。
【００７８】
ＬＬＲ−Ｊ２４−１は、ｓｔａｌｋエキソン領域を欠いているので、ＤＣからのＬＬＲ−Ｊ２４転写物中のｓｔａｌｋエキソンの存在が調べられた。ノーザンブロット解析では、１４１塩基のみ異なることが予想された転写物を区別することができなかった。したがって、第２および第４のエキソンの間のフラグメントを増幅するためのプライマー対を用いて、逆転写ＰＣＲを行った。５０５ｂｐおよび３６７ｂｐの２つの生成物を得、これらは、それぞれ、ｓｔａｌｋエキソンを有するおよび有さない予想フラグメントのサイズに対応する(図９および１０)。該生成物の約５〜１０％がｓｔａｌｋエキソンを含むサイズであると見積もられる。
【００７９】
この上側のバンドをゲルから削り取り、サブクローニングし、２つの得られたクローンを配列決定した。両クローンは、ゲノム配列から予想された通り、正しくスプライシングされたｓｔａｌｋエキソンを表した。プライマー対で得られたＰＣＲフラグメントをさらに解析し、これは、それぞれ、５'−非翻訳領域からｓｔａｌｋエキソンまで、およびｓｔａｌｋエキソンから第６エキソンまでのｍＲＮＡのフラグメントを増幅する。両方の場合において、得られた主生成物は、正しくスプライシングされたエキソンについて予想されたサイズに対応した。これらのデータにより、ＬＬＲ−Ｊ２４転写物がｓｔａｌｋエキソンを含み、そして他のエキソンの位置でも正しくスプライシングされることが示される。
【００８０】
ＩＩ型レクチン様レセプターは、通常、ダイマーを形成し、そしてホモダイマーまたは２つの異なるレセプター鎖を組み合せたヘテロダイマーのいずれかを形成することが示されている。一定の場合において、異種性レクチン様レセプター鎖とのダイマー形成は、表面発現に必要であることが示されている。このことは、例えば、ＮＫＧ２／ＣＤ９４レセプターについて当てはまる(Carretero M. et al. Eur J Immunol. 27 [1997] 563-567)。したがって、それぞれの発現構築物で一過性にトランスフェクトした後に、２９３細胞およびＨＵＶＥＣにおけるＦＬＡＧタグ化組換えＬＬＲ−Ｊ２４の表面発現を評価した。表面発現を評価するために、抗−ＦＬＡＧ抗体での非浸透細胞の染色を、染色手順の前にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を浸透させた細胞のサンプルと平行化するために比較した。ＬＬＲ−Ｊ２４について、ｓｔａｌｋエキソンを有するおよび有さない構築物が使用された。
【００８１】
完全長ＬＬＲ−Ｊ２４は、非浸透細胞の強い染色により示されるように、ＨＵＶＥＣの細胞表面に効率的に蓄積した(図６Ａ)。対照的に、ｓｔａｌｋを有さない検出可能なレベルのＬＬＲ−Ｊ２４アイソフォームは、非浸透細胞上で観察されなかったが、浸透細胞の有意な細胞内染色が得られた。より高い倍率での浸透細胞の、より精密な解析により、完全長ＬＬＲ−Ｊ２４−２発現構築物でトランスフェクトされた細胞が核周辺細胞構成成分ならびに全細胞に及んで観察可能な表面発現の強い染色を示すことが明らかにされた(図６Ｂ)。ｓｔａｌｋのないＬＬＲ−Ｊ２４−１は、細胞質全体に均質に分配されることが観察されるが、表面上では観察されない。同様の結果が、２９３細胞に関して得られた(データ示さず)。
【００８２】
さらなる観点において、本発明は、
・膜貫通タンパク質ＬＬＲ−Ｊ２４をコードする単離ポリヌクレオチド；
・ＬＬＲ−Ｊ２４の細胞外ドメインをコードする単離ポリヌクレオチド；
・ＬＬＲ−Ｊ２４の細胞外ドメインである単離ポリペプチド；および
・膜貫通タンパク質ＬＬＲ−Ｊ２４である単離ポリペプチド
を提供する。
【００８３】
本発明は、また、診断試薬としての、本発明の遺伝子の使用を提供する。
機能障害と関係する、本発明の遺伝子の変異形の検出は、例えば、加え得る、または対応する遺伝子もしくはその変異体、および／または本発明のポリペプチドの、過少発現、過剰発現、または改変された発現に起因する疾患の診断または疾患の罹病性(susceptability)を定義し得る、例えば診断アッセイにおける、診断ツールを提供する。対応する遺伝子において変異を有する個体は、慣用的方法にしたがって、ＤＮＡレベルで検出され得る。
【００８４】
診断のための核酸は、対象の細胞、例えば、血液、尿、唾液、細胞診の組織、または検死の試料から得られ得る。ゲノムＤＮＡは、検出に直接的に使用されるか、または分析の前にＰＣＲもしくは他の増幅技術を用いることによって、酵素的に増幅され得る。ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた、同様に分析において使用され得る。欠失と挿入は、通常の遺伝子型と比べて、増幅された生成物のサイズの変化によって検出され得る。点変異(point mutation)は、本発明の標識遺伝子ヌクレオチド配列に、増幅したＤＮＡをハイブリダイズさせることによって同定され得る。
【００８５】
完全に一致した配列は、ＲＮａｓｅ消化によって、または融点の違いによって、一致しない二重鎖と区別され得る。ＤＮＡ配列の違いは、また、変性試薬での、または変性試薬なしでの、ゲルにおけるＤＮＡフラグメントの電気泳動での移動度の変化によって、または例えば Myers et al. Science 230 (1985) 1242 にしたがって、直接ＤＮＡ配列決定によって検出され得る。特異的な位置での配列の変化は、また、ヌクレアーゼ保護アッセイにより、例えばＲＮａｓｅおよびＳ１保護法、または化学的切断方法、例えば、Cotton et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1985) 4397-4401 にしたがって、明らかにされ得る。本発明の遺伝子ヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含んでなるオリゴヌクレオチド・プローブのアレイは、例えば遺伝子の変異などの効果的なスクリーニングを実施するために構成され得る。アレイ技術方法は、例えば M. Chee et al. Science 274 (1996) 610-613 にしたがって、遺伝子発現、遺伝子結合、および遺伝子可変性を含む、分子遺伝子学における様々な問題を扱うために使用され得る。
【００８６】
本発明のＩＫＫ２−５５遺伝子の場合において、診断アッセイは、本発明の遺伝子における変異の検出を通して、疾患、例えば、炎症、動脈硬化症、再狭窄、再灌流障害、炎症性腸疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーおよび癌を含む、例えば免疫性または炎症性疾患の罹病性を診断または測定する方法を提供する。
【００８７】
本発明のＤＩＮＯ遺伝子の場合において、診断的アッセイは、例えば炎症性疾患、例えば急性または慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、癌、アテローム性動脈硬化症および再狭窄を含む疾患の罹病性を診断または測定する方法を提供する。
【００８８】
本発明のＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子の場合において、診断的アッセイは、例えば慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、接触過敏症およびアトピー性皮膚炎のような炎症性皮膚疾患、またはウイルス誘導性免疫抑制、例えばＡＩＤＳを含む不釣合いの、増加したまたは減少したＤＣ機能に関連する疾患の罹病性、例えばあらゆる形態のウイルス、細菌、寄生生物感染疾患および癌の罹病性を診断または測定する方法を提供する。
【００８９】
疾患は、例えば慣用的方法にしたがって、例えば、対象由来の試料から、異常に減少したまたは増加したレベルの本発明の遺伝子またはポリペプチドまたは遺伝子ｍＲＮＡを測定することを含んでなる方法により、診断され得る。減少したまたは増加した発現は、ＲＮＡレベルで、例えばポリヌクレオチドの定量のための慣用的方法にしたがって、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護法、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法にしたがって、測定され得る。宿主由来の試料において、タンパク質、例えば本発明のポリペプチドのレベルを測定するために使用され得るアッセイ技術は、例えば常法としての慣用的方法にしたがって行われ得る。このようなアッセイ技術としては、例えばラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ(competitive-binding assay)、ウエスタンブロット解析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【００９０】
したがって、さらなる観点において、本発明は、疾患または疾患の罹病性、例えば上記のもの、のための診断用キットであって；主な構成要素として、
ａ)本発明の遺伝子(例えば、その対立遺伝子変異体、またはそのフラグメント、またはスプライスバリアントを含む)；
ｂ)(ａ)のヌクレオチド配列に相補的な配列；
ｃ)本発明のポリペプチド(例えば、それと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチドを含み、例えば、本発明のポリペプチドのフラグメントもしくは変異体、または本発明の当該ポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列のポリペプチドのフラグメントまたは変異体を含む)；あるいは、
ｄ)本発明のポリペプチドに対する抗体；
を含んでなるキットを提供し、
例えば、いずれの該キット(ａ)、(ｂ)、(ｃ)、または(ｄ)も、例えば試験されるべき試料の適当な環境、例えば試験されるべき試料中のａ)、ｂ)、ｃ)もしくはｄ)のいずれかの効果を測定するのに適当な方法、を含む本質的構成要素を含み得る。
【００９１】
本発明の遺伝子は、また、染色体同定に有用である。配列は、特異的に標的化され、そして個々のヒト染色体上の特定の場所でハイブリダイズし得る。染色体に対する本発明の関連配列のマッピングは、それらの配列を、遺伝子関連疾患と相関させる重要な第１段階である。配列は、一旦正確な染色体の位置にマップされれば、染色体上の配列の天然の位置を、遺伝子マップデータに相関し得る。相当するデータは、例えば V. McKusick Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを通じてオンラインで利用可能である)に開示されている。同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係は、連鎖解析(物理的に隣接した遺伝子の同時受継)によって同定され得る。影響がある個体と影響がない個体の間の、ｃＤＮＡもしくはゲノム配列における相違もまた、測定され得る。変異が、幾つかのまたは全ての影響がある個体において観察されるが、普通の個体において全く観察されなければ、該変異は疾患を引き起こす原因である可能性がある。
【００９２】
したがって、例えばＩＫＫ２−５５は、長い形態のＡＰＡＦ１(アポトーシス性プロテアーゼ活性化因子１)に非常に近接して、染色体１２ｑ２３．１に位置し、そして本発明のＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子は、ＮＫレセプター遺伝子複合体の第１２染色体の短腕での染色体同定に使用され；ウイルス性疾患および関節炎の罹病性が、げっ歯類において同様の合成領域にマッピングされた。
【００９３】
本発明のポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいはこのような本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントを発現している細胞は、また、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を作成するための免疫原として使用され得る。「免疫特異的(immunospecific)」なる用語は、抗体が、他の関係のあるまたは関係のないポリペプチドとの親和性よりも、本発明のポリペプチドに関して実質的により大きい親和性を有することを意味する。
【００９４】
本発明のポリペプチドに対して作成された抗体は、例えば、このようなポリペプチド、またはエピトープ−担持フラグメント−アナログまたは細胞を、動物、好ましくは非ヒトに、通常の手順を用いて投与することにより得られ得る。モノクローナル抗体の調製のために、例えば連続継代細胞系培養(continuous cell line culture)により製造された、抗体を提供する適当な技術、例えばハイブリドーマ技術(Kohler, G. and C. Milstein Nature 256 [1975] 495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al. Immunology Today 4 [1983] 72)およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. [1985] 77-96)が使用され得る。
【００９５】
また、一本鎖抗体を製造するための技術(例えば、米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を製造するために適用され得る。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動物を含む他の生物が、ヒト化抗体を発現させるために使用され得る。上記の抗体は、例えば、本発明のポリペプチドを発現しているクローンの単離または同定において、あるいは、アフィニティークロマトグラフィーによる本発明のポリペプチド(フラグメント)の精製のために、使用され得る。
【００９６】
本発明のポリペプチドに対する抗体は、また、疾患の処置において、例えば、ＤＩＮＯ遺伝子に対する抗体の場合には、炎症性疾患、例えば急性または慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、癌、アテローム性動脈硬化症および再狭窄のような疾患において；あるいはＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子に対する抗体の場合には、例えば接触過敏症、アトピー性皮膚炎のような炎症性皮膚疾患を含む、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶において、またはウイルス誘導性免疫抑制、例えばＡＩＤＳ、例えばウイルス、細菌、寄生生物感染疾患および癌に対するあらゆる形態での罹病性において、有用であり得る。
【００９７】
さらなる観点において、本発明は、本発明のポリペプチドに対する抗体を提供する。本発明の抗体としては、ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドおよびウイルス、細菌または真核性寄生生物あるいは癌細胞に結合する二重特異性抗体(bispecific antibody)が挙げられる。
さらなる観点において、本発明は、ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドおよびウイルス、細菌または真核性寄生生物に結合する二重特異性抗体を提供する。
【００９８】
さらなる観点において、本発明は、ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドおよび癌細胞に結合する二重特異性抗体を提供する。
二重特異性抗体の代わりに、ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドおよびウイルス、細菌または真核性寄生生物あるいは癌細胞に結合する能力を有する別の二重特異性試薬も使用され得る。
【００９９】
さらなる観点において、本発明は、抗体でなく、かつ、ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドおよびウイルス、細菌または真核性寄生生物あるいは癌細胞に結合する能力を有する、二重特異性試薬を提供する。
【０１００】
さらなる観点において、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、ベクターを介して本発明のポリペプチドを送達すること、該動物を疾患から保護するための抗体を産生する免疫応答を誘導するために、in vivo で対応する本発明の遺伝子の発現を指示することを含んでなる方法；ならびに、
いっそうさらなる観点において、哺乳動物の宿主に導入された場合に、その哺乳動物において本発明のポリペプチドに対する免疫応答を誘導する免疫／ワクチン製剤(組成物)であって、本発明のポリペプチドまたは本発明の遺伝子を含んでなる組成物；
を提供する。
【０１０１】
さらなる観点において、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、哺乳動物に、それぞれ、疾患、例えば上記の疾患から該動物を保護するための抗体および／またはＴ細胞免疫応答を産生するのに適当な、本発明のＤＩＮＯポリペプチドもしくはそのフラグメント、または本発明のＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドもしくはそのフラグメントを接種することを含んでなる方法を提供し、ここで、本発明のＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドは、好ましくは配列番号６または配列番号８で示されるもの、さらに好ましくは配列番号８で示されるものである。
【０１０２】
ワクチン製剤は、さらに、適当な担体を含み得る。本発明のポリペプチドは、胃において分解され得るので、好ましくは非経腸的に(皮下、筋肉内、静脈内、皮内などの注射を含む)投与され得る。非経腸投与に適した免疫／ワクチン製剤としては、例えば、レシピエントの血液と等張な製剤を与える抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および溶質を含み得る水性および非水性の滅菌注射用溶液；ならびに懸濁化剤または増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。該製剤は、単回投与または複数回投与容器、例えば密封アンプルおよびバイアルで提供され得、そして、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥条件で保存され得る。ワクチン製剤は、また、その製剤の免疫原性を増大させるアジュバントシステム、例えば水中油(oil-in-water)システムおよび他の適当なシステムを含み得る。投与量は、ワクチンの特定の活性に依存し、そして通常の実験により容易に決定され得る。
【０１０３】
本発明のポリペプチドは、多くの生物学的機能、例えば多くの病的状態の基礎をなす機能に関与し得る。したがって、例えば生物学的に適合して、例えば転写的に、活性化し、そして／または本発明のポリペプチドの活性を刺激するか、あるいは一方において本発明の遺伝子の発現を刺激し(アゴニスト)、そして他方において本発明のポリペプチドの機能または本発明の遺伝子の発現を阻害できる(アンタゴニスト)、化合物および薬物を発見することが望ましい。したがって、本発明のポリペプチドまたはその機能ミメティクス(functional mimetics)、例えば、Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2) Chapter 5 (1991)に記載のものは、例えば細胞、細胞の入っていない製剤、化学ライブラリー、および天然物の混合物において、例えばスクリーニングアッセイにおいて、本発明のレセプターポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの結合を評価するために使用され得る。
【０１０４】
本発明のＩＫＫ２−５５ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば免疫または炎症関連疾患を含む疾患、例えば炎症、動脈硬化症、再狭窄、再灌流障害、炎症性腸疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーおよび癌の処置において使用され得る。
【０１０５】
本発明のＤＩＮＯポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば炎症性疾患、急性または慢性、自己免疫疾患、移植拒絶、癌、アテローム性動脈硬化症および再狭窄の処置において使用され得る。
【０１０６】
本発明のＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストは、例えば慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶を含む疾患、例えば炎症性皮膚疾患、例えば接触過敏症、アトピー性皮膚炎、またはウイルス誘導性免疫抑制、例えばＡＩＤＳ、例えばウイルス、細菌、寄生生物感染、および癌に対するあらゆる形態の罹病性の処置において使用され得る。
【０１０７】
例えば低分子量化合物(ＬＭＷ)またはアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、本発明の遺伝子の発現の刺激または阻害は、好ましくは、それぞれ、ＥＣまたはＤＣの生理／機能に対して、対応する本発明のポリペプチドおよびそのリガンドの効果を調節し得る。
【０１０８】
スクリーニング手順は、ＩＫＫ２−５５またはＬＬＲ−Ｊ２４の場合において、その表面に本発明のポリペプチドのレセプターを発現している適当な細胞の作成を含み得る。適当な細胞としては、例えば哺乳動物、酵母およびショウジョウバエからの細胞が挙げられる。ＩＫＫ２−５５の場合において、ＩＫＫ２−５５を発現している細胞；およびＬＬＲ−Ｊ２４の場合において、そのレセプターを発現している細胞(またはその発現レセプターを含む細胞膜)は、結合、または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察するために、試験(候補)化合物と接触させられてもよい。
【０１０９】
スクリーニングアッセイは、候補化合物の結合を試験するために使用され得、ここで、それぞれ、ＩＫＫ２−５５またはＬＬＲ−Ｊ２４レセプターを担持する細胞が、候補化合物と直接的もしくは間接的に結合した標識により、または標識競合性物質での競合を含むアッセイにおいて、検出され得る。スクリーニングアッセイは、さらに、候補化合物が、それぞれ、表面にＩＫＫ２−５５またはＬＬＲ−Ｊ２４レセプターを担持する細胞に適した検出系を用いて、レセプターの活性化により産生されたシグナルをもたらすかどうかを試験するために使用され得る。活性化のインヒビターは、既知のアゴニストの存在下でアッセイされ得、そして、候補化合物の存在下でアゴニストによる活性化に対する効果が観察され得る。
【０１１０】
スクリーニングアッセイは、混合物を形成させるために、候補化合物を、本発明のポリペプチドを含有する溶液と混合する工程、該混合物中の該ポリペプチドの活性を測定する工程、および該混合物の活性を標準物質の活性と比較する工程を含み得る。
【０１１１】
本発明の遺伝子(ｃＤＮＡ)、本発明のポリペプチドおよび本発明のポリペプチドに対する抗体は、また、細胞における当該遺伝子(ｍＲＮＡ)および当該ポリペプチドの産生に対する候補化合物の効果を検出するためのスクリーニングアッセイを提供するために使用され得る。例えば、ＥＬＩＳＡは、慣用的方法にしたがって、例えばモノクローナル抗体とポリクローナル抗体を用いて、該ポリペプチドの細胞結合レベルを測定するために作られ得、そしてＥＬＩＳＡは、適当に処理された細胞または組織中で、該ポリペプチドの産生または活性を、阻害し得るまたは増加し得る薬剤(アンタゴニストまたはアゴニスト)を発見するために使用され得る。スクリーニングのためのアッセイは、例えば慣用的方法にしたがって、実施され得る。
【０１１２】
本発明の遺伝子のアゴニスト(アンタゴニスト)候補物の例は、抗体、または幾つかの場合においては、該遺伝子のリガンド(該遺伝子のポリペプチドに結合するアンタゴニスト)に密接に関連した、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質(ポリペプチド)、例えば該リガンドのフラグメント、あるいは、レセプターに結合するが応答を誘発せず、その結果、レセプターの活性を妨げる小分子を含む。
【０１１３】
本発明のアゴニスト(アンタゴニスト)の候補物の例としては、例えばオリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、ミメティクス、小分子、例えば低分子量(ＬＭＷ)化合物を含む、本発明のポリペプチドに結合する化合物が挙げられる。
【０１１４】
したがって、さらなる観点において、本発明は、本発明のポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイを提供し、該アッセイは、主な構成要素として、
ａ)本発明のポリペプチド；
ｂ)本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞；
ｃ)本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または
ｄ)本発明のポリペプチドに対する抗体；
および、例えば候補化合物と接触させる手段；例えば、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する候補化合物の効果を測定する手段；
例えば、候補化合物の存在下で、本発明のポリペプチドの産生および／または生物学的活性が、減退するかまたは増加するかを測定する手段、例えば候補化合物の存在下および非存在下での、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかの活性を比較することによる手段を含んでなり；そして
別の観点において、本発明のポリペプチドの産生および／または生物学的活性を、減退させるかまたは増加させる、例えばリガンド、レセプター、抗体、またはＬＭＷ分子を含む、アゴニストまたはアンタゴニスト、好ましくはアゴニストを同定する方法であって、該方法は、
Ａ)候補化合物と、
ａ)本発明のポリペプチド；
ｂ)本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞；
ｃ)本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または
ｄ)本発明のポリペプチドに対する抗体；
を接触させること；
Ｂ)ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する候補化合物の効果を測定すること；例えば、候補化合物の存在下で、本発明のポリペプチドの産生および／または生物学的活性が減退するかまたは増加するかを測定すること、例えば、候補化合物の存在下および非存在下での、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかの活性の比較によって測定すること；ならびに
Ｃ)工程Ｂ)で測定されたアゴニストまたはアンタゴニストを選択すること、
例えば、アゴニスト／アンタゴニストの効果が、工程Ｂ)においてポジティブに測定された適当な候補化合物を選択すること、
ことを含んでなる。
【０１１５】
任意のこのようなスクリーニングアッセイにおいて、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)は、本質的な構成要素を含み得る。候補化合物は、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する効果が未知である化合物(ライブラリー)を含む。化合物(ライブラリー)は、本発明のポリペプチドに対するアゴニスト(アンタゴニスト)として、上に示した化合物を含む。アゴニスト(アンタゴニスト)は、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する効果が、スクリーニングアッセイにおいて、または上記のアゴニスト(アンタゴニスト)を同定するための方法において、見出された候補化合物である。アゴニスト(アンタゴニスト)は、本発明のポリペプチドの産生および／または生物学的活性を減退させるかまたは増加させ得る。
【０１１６】
さらなる観点において、本発明は、本発明のポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニスト、好ましくはアンタゴニストを提供し、該アンタゴニストまたはアゴニストは、下記の工程：
Ａ)候補化合物と、
ａ)本発明のポリペプチド；
ｂ)本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞；
ｃ)本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または
ｄ)本発明のポリペプチドに対する抗体；
を接触させること；
Ｂ)ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する該候補化合物の効果を測定すること；例えば、候補化合物の存在下で、本発明のポリペプチドの産生および／または生物学的活性が減退するかまたは増加するかを測定すること；例えば、候補化合物の存在下および非存在下での、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかの活性の比較によって測定すること；ならびに
Ｃ)工程Ｂ)で測定されたアゴニストまたはアンタゴニストを選択すること、
例えば、アゴニスト／アンタゴニストの効果が、工程Ｂ)においてポジティブに測定された適当な候補化合物を選択すること、
により提供され得ることを特徴とする。
【０１１７】
本発明のＩＫＫ２−５５(ポリペプチド)のアゴニスト(アンタゴニスト)は、例えば、免疫または炎症関連疾患、例えば、炎症、動脈硬化症、再狭窄、再灌流障害、炎症性腸疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーおよび癌を含む疾患の処置において使用され得る。
【０１１８】
本発明のＤＩＮＯ(ポリペプチド)のアゴニスト(アンタゴニスト)は、免疫調節活性を有し得、そして、例えば、炎症性疾患、例えば、急性または慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、癌、アテローム性動脈硬化症および再狭窄を含む疾患の処置において使用され得る。
【０１１９】
本発明のＬＬＲ−Ｊ２４(ポリペプチド)のアゴニスト(アンタゴニスト)は、免疫調節活性を有し得、そして、例えば、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、例えば、炎症性皮膚疾患、例えば接触過敏症、アトピー性皮膚炎、またはウイルス誘発性免疫抑制、例えばＡＩＤＳ、例えばウイルス、細菌、寄生生物感染および癌のあらゆる形態の罹病性を含む疾患の処置において使用され得る。したがって、本発明のポリペプチドのアゴニスト(アンタゴニスト)は、医薬として有用であり得る。
【０１２０】
このような使用のために、いくつかの方法が利用可能である：
もし、本発明の遺伝子および／またはポリペプチドの活性が過剰であるならば、１つの方法は、ポリペプチドに対するリガンドの結合をブロックすることにより、またはセカンドシグナルを阻害することにより、本発明の遺伝子および／またはポリペプチドの活性化を阻害するのに有効な量で、例えば薬学的に許容される賦形剤と組み合せて、本発明のポリペプチドのアンタゴニストを対象に投与すること、そしてその結果、例えば、該遺伝子(またはその変異体)の過剰−、過少−または改変された発現により引き起こされる異常状態を緩和することを含んでなる。
【０１２１】
別の方法において、例えばＤＩＮＯまたはＬＬＲ−Ｊ２４の場合において、内因性ポリペプチドと競合的にリガンドに結合できる、可溶形態の対応する本発明のポリペプチドが、投与され得る。このような競合剤の典型的な実施態様は、本発明の当該ポリペプチドのフラグメントを含み得る。
【０１２２】
さらなる観点において、本発明は、Ｔ細胞または他の免疫細胞上でリガンドに結合し、そして免疫機能および例えばアレルギーを活性化できる、本発明の可溶性ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドを提供する。
【０１２３】
いっそうさらなる方法において、本発明は、発現ブロック技術(expression blocking technique)を用いる本発明の内因性ポリペプチドをコードする遺伝子の発現の阻害を含む。
【０１２４】
既知のこのような技術には、例えば O'Connor, J. Neurochem. 56 (1991) 560、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988)にしたがって、内部に生じたかまたは別に投与した、アンチセンス配列の使用が含まれる。代わりに、オリゴマー、例えば本発明の遺伝子と三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドは、例えば Lee et al. Nucleic Acids Res. 6 (1979) 3073; Cooney et al. Science 241 (1988) 456; Dervan et al. Science 251 (1991) 1360 にしたがって供給され得る。このようなオリゴマーは、そのまま投与するか、または in vivo で発現させ得る。
【０１２５】
本発明のポリペプチドの過少発現およびその活性に関する異常状態の処置のために、１つの方法は、本発明のポリペプチドの発現を増やす必要がある対象に、本発明の遺伝子を活性化する治療上有効量の化合物(アゴニスト)を、例えば薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて投与し、それによって異常状態を緩和することを含む。
【０１２６】
代わって、遺伝子治療を行い、対象において、関連する細胞によって、本発明のポリペプチドの内因的産生に影響を与え得る。例えば、本発明の遺伝子は、例えば上記の方法にしたがって、複製欠損レトロウイルスベクターにおける発現のために操作され得る。得られたレトロウイルス発現構築物は、単離され、そして、本発明の該遺伝子に対応するポリペプチドをコードするＲＮＡを含む、レトロウイルス・プラスミド・ベクターで形質転換したパッケージング細胞に導入され得、その結果、パッケージング細胞は、目的の遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する。これらの産生細胞は、 in vivo で細胞を操作し、 in vivo でポリペプチドを発現させるために、対象に投与され得る。遺伝子治療の概観については、例えば、Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches(およびこの中に引用された参考文献)in Human Molecular Genetics, T Strachan および A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd. (1996) を参照のこと。
【０１２７】
別の観点において、本発明は、医薬として使用するための、例えば上に示した疾患の処置または予防のための、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニスト、好ましくはアンタゴニストを提供し、そして、別の観点において：
・上に示した疾患の処置または予防のための医薬の製造における本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの使用；および
・医薬として使用するための、例えば、それぞれ、ＩＫＫ２−５５またはＬＬＲ−Ｊ２４、本発明のアゴニスト(アンタゴニスト)が適当である同じ疾患の処置のための、それぞれ、可溶形態の、本発明のＩＫＫ２−５５ポリペプチドまたはＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチド
を提供する。
【０１２８】
本発明のポリペプチドの(アンタ)アンタゴニストは、医薬組成物の形態で投与され得る。
【０１２９】
別の観点において、本発明は、薬学的に許容される賦形剤(複数も可)／担体(複数も可)と組み合せて、活性成分として本発明のアゴニストまたはアンタゴニスト、好ましくはアンタゴニストを含んでなる医薬組成物；例えば、該アンタゴニストまたはアゴニストは、下記の工程：
Ａ)候補化合物と、
ａ)本発明のポリペプチド；
ｂ)本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞；
ｃ)本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または
ｄ)本発明のポリペプチドに対する抗体；
を接触させること、
Ｂ)ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する候補化合物の効果を測定すること；例えば、候補化合物の存在下で、本発明のポリペプチドの産生および／または生物学的活性が減退するかまたは増加するかを測定すること；例えば、候補化合物の存在下および非存在下での、ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかの活性の比較によって測定すること；ならびに
Ｃ)工程Ｂ)で測定されたアゴニストまたはアンタゴニストを選択すること；例えば、アゴニスト／アンタゴニストの効果が、工程Ｂ)においてポジティブに測定された適当な候補化合物を選択すること、
により提供され得る、医薬組成物を提供する。
【０１３０】
このような医薬組成物は、適当に、例えば慣用的方法にしたがって、例えば工程Ａ)、Ｂ)およびＣ)により提供されたアゴニスト(アンタゴニスト)を賦形剤(複数も可)／担体(複数も可)と混合すること、およびさらに、得られた混合物を加工して適当な投与のための医薬組成物を得ることにより、製造され得る。
【０１３１】
さらなる観点において、本発明は、本発明の遺伝子の過剰または不十分なレベルの両方、好ましくは過剰、に関連する；または、本発明のポリペプチドの過剰なおよび不十分な、好ましくは過剰な、活性に関連する、異常状態を処置する方法を提供する。例えば、ＩＫＫ２−５５の場合において、免疫または炎症関連疾患、例えば、炎症、動脈硬化症、再狭窄、再灌流障害、炎症性腸疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、移植拒絶、自己免疫疾患、アレルギーおよび癌を含む疾患を処置する方法；例えば、ＤＩＮＯの場合において、炎症性疾患、例えば、急性または慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、癌、アテローム性動脈硬化症および再狭窄を含む疾患を処置する方法；ＬＬＲ−Ｊ２４の場合において、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、移植拒絶、例えば、炎症性皮膚疾患、例えば接触過敏症、アトピー性皮膚炎、またはウイルス誘発性免疫抑制、例えばＡＩＤＳ、例えばウイルス、細菌、寄生生物感染疾患および癌に対するあらゆる形態の罹病性を含む疾患を処置する方法が提供される。該方法は、例えば、上に示したＡ)、Ｂ)またはＣ)の工程により提供され得る、治療上有効量の本発明のアゴニストまたはアンタゴニストを、例えば、薬学的に許容される賦形剤(複数も可)／担体(複数も可)と組み合せて、投与することを含んでなり；例えば、それぞれ、ＩＫＫ２−５５またはＬＬＲ−Ｊ２４の場合において、治療上有効量の可溶形態の、それぞれ、ＩＫＫ２−５５またはＬＬＲ−Ｊ２４、本発明のポリペプチドを、例えば薬学的に許容される賦形剤(複数も可)／担体(複数も可)と組み合せて；このような処置を必要とする対象に、投与することを含んでなる。
【０１３２】
別の観点において、本発明は、感染または癌の処置方法であって、そのような処置を必要とする対象に、抗原の取り込みならびにＤＣによるＴ細胞の提示および活性化を増加させることができる、有効量の本発明の二重特異性抗体または試薬を投与することよる方法を提供する。
【０１３３】
別の観点において、本発明は、感染または癌の処置方法であって、そのような処置を必要とする対象に、免疫機能を活性化することができる、有効量の可溶性ＬＬＲ−Ｊ２４タンパク質を投与することを含んでなる方法を提供する。
【０１３４】
ＩＫＫ２−５５は細胞内のタンパク質である。本発明の医薬組成物の全身的投与の好適な形態としては、注射、典型的には静脈注射が挙げられる。他の注射経路、例えば皮下注射、筋肉内注射、または腹膜内注射も使用され得る。全身投与のための他の手段として、例えば胆汁酸塩もしくはフジシン酸のような浸透剤または他の洗浄剤を用いる、経粘膜および経皮投与が挙げられる。さらに、腸溶性製剤またはカプセル製剤で適切に製剤化されれば、経口投与もまた可能であり得る。本発明の組成物の投与は、また、例えばクリーム剤、ペースト剤、ゲル剤などの形態で、局所的(topical)および／または局所限定的(localized)であり得る。
【０１３５】
必要な投与量の範囲は、本発明のポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニスト、投与経路、医薬組成物の性質、患者の状態の性質、診察した医者の判断に依存し得る。しかしながら、適当な投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ(対象の重量)の範囲であり得る。しかしながら、必要な投与量の変動が、利用された化合物の多様性および様々な投与経路の異なる効率を考慮すると、予期され得る。例えば、経口投与は、静脈注射による投与よりも、より高い投与量が必要であると予期される。これらの投与量の変化は、例えば最適化のための標準的な経験則にしたがって、調整され得る。
【０１３６】
処置に用いられるポリペプチドは、また、例えばこのような処置を必要とする対象において、例えば上記のような“遺伝子治療”としてしばしば述べられる処置様式において、内因的に生成され得る。したがって、例えば対象由来の細胞は、例えばレトロウイルスのプラスミド・ベクターを用いることによって、ＩＫＫ２−５５ポリペプチドをコードする、ＤＮＡまたはＲＮＡのようなポリヌクレオチドで、ex vivo で操作され得る。操作された細胞は、例えばこのような処置を必要とする対象に導入され得る。
【０１３７】
本発明にしたがって、抗原取り込みおよび提示を改善することができる、例えばＴ細胞および免疫系の活性化を改善することができる、ＬＬＲ−Ｊ２４構築物を発現する、遺伝子的に修飾されたＤＣが提供され得る。
【０１３８】
別の観点において、本発明は、抗原取り込みおよび提示を改善することができる、例えばＴ細胞および免疫系の活性化を改善することができる、ＬＬＲ−Ｊ２４構築物を発現する、遺伝子的に修飾された樹状細胞を提供する。
【０１３９】
ＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドに結合する抗体、リガンドまたは試薬は、ＤＣ形成／成熟を阻害し得、そしてその結果、例えば免疫機能およびアレルギーを改善し得る。
別の観点において、本発明は、ＤＣ形成／成熟を阻害する、本発明のＬＬＲ−Ｊ２４ポリペプチドに結合する抗体、リガンドまたは試薬を提供する。
【０１４０】
図１(ＩＫＫ２−５５)
ＩＫＫ２のＣｏＩＰとＩＫＫ２−５５との相互作用。Ｆｌａｇ−タグ化ＩＫＫ２−５５およびｍｙｃ−タグ化ＩＫＫ２を、示した通りにＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。溶解物を調製し、そしてＩＫＫ２−５５を抗−Ｆｌａｇ抗体で沈澱させ、そして沈澱物を、抗−Ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロッティングにより解析した(上側のパネル)。細胞抽出物におけるＦｌａｇ−ＩＫＫ２−５５およびｍｙｃ−ＩＫＫ２の存在が、ウエスタンブロッティングにより確認された(下側のパネル)。
【０１４１】
図２(ＩＫＫ２−５５)
ＩＫＫ２−５５の亜細胞性局在。ＨＵＶＥＣを、異なる細胞区画についてのＣＦＰ融合遺伝子とともに、ＹＦＰ−ＩＫＫ２−５５融合構築物でトランスフェクトし、そして蛍光顕微鏡下で観察した。左側の列は、イエローチャンネル(yellow channel)におけるＩＫＫ２−５５の局在を示し、右側の列はシアンチャンネル(cyan channel)におけるマーカーの局在を示す。上段のパネル：小胞体(ＥＲ)；中段のパネル：ミトコンドリア(ｍｉｔｏ)；下段のパネル：ゴルジ体。
【０１４２】
図３(ＩＫＫ２−５５)
ＮＦ−ｋＢ依存プロモーターに対するＩＫＫ２−５５の影響。ＨＵＶＥＣを、異なる量のＩＫＫ２−５５ならびに内部標準としてユビキチン−ｂｇａｌとともに、５ｘＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ構築物でトランスフェクトし、そして２日後に、１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦαで６時間刺激した。ルシフェラーゼ値(相対的な光度単位)を、ｂ−ｇａｌ発現に関して標準化した。
ｐｒｏｍ＝プロモーター；ｕｎｓｔｉｍ＝未刺激；ｓｔｉｍ＝刺激。
【０１４３】
図４(ＩＫＫ２−５５)
ＮＦ−ｋＢ依存プロモーターに対する(異なるキナーゼと組み合せた)ＩＫＫ２−５５の影響。ＨＵＶＥＣを、５ｘＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ構築物で、ＩＫＫ２−５５とともに、示した異なるキナーゼ(ＩＫＫ２、ＮＩＫ、ＴＡＫ１、ｐ３８)ならびに内部標準としてのユビキチン−ｂｇａｌで、トランスフェクトした。１つの場合において、細胞を１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦαで６時間刺激した。ルシフェラーゼ値を、相対的な光度単位として表し、そしてβ−ｇａｌ発現に関して標準化した。
濃色カラム：５００ｎｇ ＩＫＫ２−５５；斜線付きカラム：０ｎｇ ＩＫＫ２−５５
ＲＬＵ−βｇａｌ：β−ｇａｌあたりの相対光度単位。
【０１４４】
図５(ＬＬＲ−Ｊ２４)
ヒトＮＫレセプター複合体のすべての既知のレクチン様遺伝子を含む系統樹：
表された遺伝子のＣＴＬＤの配列をアラインし、そして実施例において記載したように、系統樹を作成した。すべての配列を、ドメインにおいて必ず保存されている最初のシステインの、２つ前のアミノ酸から開始するように選択した。ＮＫＧ２ＥおよびＨは、同じ遺伝子からの、２つの別々にスプライシングされた転写物である。ＬＹ４９Ｌについて、他の遺伝子と比較できるほどにスプライシングされたすべての３つのＣＴＬＤエキソンを含む仮定的配列を選択したが、異常型にスプライシングされた転写物のみが、この遺伝子に関して検出された。この遺伝子は、一貫して、アラインメントのための異なるパラメーター設定を用いて、互いにより近い関係にあることが見出され、そして樹構造は、右側のカッコにより示される。下のスケールは、置換事象の尺度である。ＮＫ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞(ＥＣ)、単球細胞(ＭＯ)、樹状細胞(ＤＣ)におけるまたはさらに広範に白血球(ＬＥＵＫ)におけるサブファミリーの選択的発現が示される。
【０１４５】
図６および７(ＬＬＲ−Ｊ２４)
ＨＵＶＥＣにおける組換えＬＯＸ−１、ＬＬＲ−Ｊ２４およびＣＬＥＣ−１の発現：
Ｃ末端をＦＬＡＧ−タグ化ＬＯＸ−１、ＬＬＲ−Ｊ２４およびＣＬＥＣ−１の発現プラスミドを、ＨＵＶＥＣ中にトランスフェクトした。タンパク質の発現を、抗−ＦＬＡＧ抗体および二次Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−標識抗体で染色した後に、感染の２４時間後に解析した。
【０１４６】
非浸透および浸透細胞の染色の比較。左列において、ホルムアルデヒドで固定した非浸透細胞(固定)、および右列において、浸透細胞(固定／浸透)を示す。上段は抗−ＦＬＡＧ抗体での染色を示し、下段は総細胞数を可視化するためのＨｏｅｃｈｓｔ３３３２５８でのＤＮＡの染色を示す。
【０１４７】
ｓｔａｌｋエキソンを含まないＬＬＲ−Ｊ２４構築物を、図２Ｂにおいて示す(ΔＬＬＲ−Ｊ２４−１)。より高い倍率での４つの発現構築物全てについての浸透細胞の染色の比較。
【０１４８】
図８(ＬＬＲ−Ｊ２４)
樹状細胞の成熟中のＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの下方調節：
図８Ａ：
未成熟ＭｏＤＣ、ならびにＴＮＦ−αおよびＩＬ−βと組み合せて１８時間刺激された培養物から単離された全ＲＮＡのノーザンブロット。対照として、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｃＤＮＡおよびβ−アクチンプローブのハイブリダイゼーションを示す。
【０１４９】
図８Ｂ：
未成熟ＭｏＤＣおよびＨＰＤＣから、抗−ＣＤ４０抗体で処理されたＭｏＤＣおよびＨＰＤＣから、または抗−ＣＤ４０抗体とザイモサンＡとの組合せで２４時間処理したＭｏＤＣから、単離されたＲＮＡでのノーザンブロット。該ブロットを、負荷対照(loading control)として、ＬＬＲ−Ｊ２４、ＭＤＣおよびＧＡＰＤＨのためのプローブと連続的にハイブリダイズさせた。１８ｓおよび２８ｓ ｒＲＮＡの位置が示されている。
【０１５０】
図９および図１０(ＬＬＲ−Ｊ２４)
ヒトＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡのフラクションは、ｓｔａｌｋエキソン配列を含む：
【０１５１】
ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ。ＭｏＤＣからのＲＮＡを、特異的ＬＬＲ−Ｊ２４プライマーを用いて逆転写し、そしてＰＣＲを、得られたｃＤＮＡ上で、示された異なるプライマー対を用いて行った。(ａ)は、ＭｏＤＣ ＲＮＡのためのｓｔａｌｋエキソンを有するおよび有さない転写物の増幅を示し、(ｂ)は５'−部分の増幅を示し、そして、(ｃ)は、図４Ａ中のＢで示されたＭｏＤＣおよびＨＬ６０ ＲＮＡのための転写物を含むｓｔａｌｋの３'−部分を示す。レーン６は、完全長ＬＬＲ−Ｊ２４ ｃＤＮＡを含むプラスミドから得られた生成物を示す。
【０１５２】
ＲＴ−ＰＣＲに使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーの概略図。第１のプライマー対(ａ)を、ｓｔａｌｋエキソンフラグメンを有するおよび有さない、それぞれ、予想された５０５ｂｐおよび３６７ｂｐのＰＣＲ生成物をもたらすｓｔａｌｋエキソンフラグメントの存在を試験するために設計した。第２のプライマー対(ｂ)により、５'−部分の正確なスプライシングを試験し、第３のプライマー対(ｃ)により、ｓｔａｌｋエキソンを含む転写物の３'−部分のスプライシングを訂正する。
ｃ＝細胞質性；ＴＭ＝膜貫通性；ＣＴＬＤ＝Ｃ型レクチン様ドメイン１；
ＣＴＬＤ２＝Ｃ型レクチン様ドメイン２；ＣＴＬＤ３＝Ｃ型レクチン様ドメイン３。
【０１５３】
下記の実施例において、すべての温度は、セ氏温度であり、そして補正していない。
【表１】
【実施例】
【０１５４】
実施例１：ＩＫＫ２−５５遺伝子
ＩＫＫ２−５５遺伝子の配列番号１を含んでなるｃＤＮＡクローンは、ＰＨＡ−活性化リンパ球ｍＲＮＡのライブラリーから、およびＧｅｎＢａｎｋデータベースとともにＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いる配列比較により、単離する。
【０１５５】
ベイト(bait)としてＩＫＫ２のＣ末端ＨＬＨドメインを用いる酵母ツーハイブリッドスクリーンにおいて、ＩＫＫ２−５５遺伝子が見出された。Ｃ末端フラグメントを含んでなる最初のクローンを、ＥＳＴｓ、およびさらなる２つのＩＭＡＧＥクローン(＃１：クローンＩＤ＝２０４８２８９；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号＝ＡＩ３７５６８７および＃２：クローンＩＤ＝２３８２８６１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号＝ＡＩ７５９９８４)の配列を用いて伸張させる。核酸およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１および配列番号２において与えられる。５８〜６０位のヌクレオチドの最初のＡＴＧは、１６〜１８位のインフレーム停止コドン(in-frame stop codon)により先行される。オープンリーディングフレームは、１１８９〜１１９１位の停止コドンまで伸張する。ＩＫＫ２−５５は、データベースの登録事項と有意な相同性を全く示さない３７７のアミノ酸タンパク質をコードする。
【０１５６】
それは、また、４５〜５８位のアミノ酸の低組成複雑性領域ならびに１１６〜２５９位および２８７〜３２３位の２つのコイルドコイル領域を除いて、ＰｆａｍおよびＰｒｏｓｉｔｅデータベースに存在する明確なタンパク質モチーフを含まない。ヒト遺伝子に似ているゲノム性クローンは、該データベース(AC013283.htgs)に存在する。ＥＳＴクローンでのヒトドラフトゲノム配列、例えばＡＩ３７５６８７の調査により、ＩＫＫ２−５５は染色体１２ｑ２３．１に位置することが判明した。その結果、ＩＫＫ２−５５転写開始部位は、ＡＰＡＦ１(アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１)の転写部位に対して２ｋｂ以内に位置し、このことは、これら２つの遺伝子の調節のクロストークを意味している。
【０１５７】
実施例２：ＩＫＫ２−５５遺伝子
Ｙ２ＨＳは２つのタンパク質間の相互作用に関する最初の情報を提供するが、これらの結果は生化学的手段により確認された。(Ｆｌａｇタグが結合した)ＩＫＫ２のおよび(ｍｙｃタグが結合した)ＩＫＫ２−５５の発現ベクターを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトする。２日後、抽出物を調製し、そしてＩＫＫ２を抗Ｆｌａｇ抗体で沈澱させる。沈澱を、抗ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロッティングにより解析する。図１のレーン３における特異的バンドの存在は、ＩＫＫ２でのＩＫＫ２−５５の共免疫沈澱を示唆する。下段のパネルにおいて、全細胞抽出物を、細胞がそれぞれの遺伝子を発現することを示すために、それぞれ、抗−Ｆｌａｇおよび抗−ｍｙｃ抗体を用いてＩＫＫ２−５５およびＩＫＫ２のためにプローブする。
【０１５８】
実施例３：ＩＫＫ２−５５遺伝子
細胞内局在化は、タンパク質の機能の証明を提供し得る。小胞体に似ているように見える異なる特異的マーカーの共トランスフェクションにより、ＹＦＰ−ＩＫＫ２−５５融合遺伝子のトランスフェクションは、核周囲領域(図２)への局在化をもたらす(ＥＲ；該構築物はＣＦＰに融合したカルレティキュリンの標的配列を含む；Clontech Living Colors ER Subcellular Localization Vector)。
【０１５９】
実施例４：ＩＫＫ２−５５遺伝子(発現パターン)
ＭＴＮ(マルチプル・ティシュー・ノーザンブロット(Multiple Tissue Northern Blot); Clontech)を、ＩＫＫ２−５５プローブとハイブリダイズさせ、そして、２．４および４．３ｋｂの２つのバンドが腎臓、肝臓、胎盤、脾臓および心臓において選択的に検出される。
【０１６０】
ＴＩＧＲヒト遺伝子インデックスを用いるＥＳＴの検索において、限定された発現が見出される：
【表２】
【０１６１】
Ｖｉｒｔｕａｌ ＳＡＧＥを行い(ａａａａｔａａｇｃｃ鎖が該プログラムにより選択される)、そしてＰＴＥＮ -/- であるヒト乳癌系ＭＤＡ−ＭＢ−４６８において高度の発現が検出される。ＲＴ−ＰＣＲを、ＩＫＫ２−５５特異的プライマーおよび刺激されかつ制御されたＥＣからのｍＲＮＡを用いて行う。増大したＩＫＫ２−５５発現が、ＩＬ−１で、ＬＰＳで、またはＶＥＧＦで刺激されたＥＣにおいて見出される。
【０１６２】
実施例５：ＩＫＫ２−５５遺伝子
ＩＫＫ２−５５は、遺伝的および生化学的手段により示されるようにＩＫＫ２と相互作用するので、ＮＦ−ｋＢ活性に対するＩＫＫ２−５５の影響を試験した。５コピーのＮＦ−ｋＢ結合部位を含む、ＮＦ−ｋＢ依存プロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物、すなわち５ｘＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃを、ＴＮＦα刺激有りまたは無しで、ＨＵＶＥＣの一過性トランスフェクションにおいて使用する。結果を図３に示し、そして、使用された量に依存して、ＩＫＫ２−５５は刺激性(低い、生理学的量)または阻害性(多量で)活性のいずれかを有することが示される。５ｘＮＦ−ｋＢプロモーターを用いると、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達に関与することが知られているキナーゼ、例えばＩＫＫ２、ＴＡＫ１、ＮＩＫ、ｐ３８とのＩＫＫ２−５５の共トランスフェクションは、レポーター遺伝子の発現をさらに誘発した(図４)。
【０１６３】
実施例６：ＤＩＮＯ遺伝子(相同性)
皮膚微小血管内皮細胞ｍＲＮＡのライブラリーから、およびＳＷＩＳＳＰＲＯＴ ＰｒｏｔｅｉｎデータベースとともにＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いる配列比較により、単離されたＤＩＮＯ遺伝子の配列番号３を含んでなるｃＤＮＡクローンが、ＨＥＲＣタンパク質(Ｅ６結合タンパク質Ｃ末端の相同ドメインおよびＲＣＣ１ドメイン)のファミリーに、特にＨＥＲＣ３(受託番号Ｄ２５２１５)およびＣｅｐ１(受託番号ＡＢ０２７２８９)に相同的であることが見出される。
【０１６４】
配列番号３のＤＩＮＯ遺伝子は、ＨＥＲＣ３およびＣｅｐ１に対して全体的な相同性は３７．８％であるが、該相同性は、規定されたタンパク質ドメインにおいて有意に高い(７０％まで)。ＤＩＮＯとＣｅｐ１との間には、Ｃｅｐ１が約１００アミノ酸のＮ末端伸展(N-terminal extension)を有するという特徴的な相違が存在する。ＨＥＲＣタンパク質のＨＥＣＴドメインは、分解またはプロセシングされることになる特異的細胞標的タンパク質へのユビキチンの移動に関与する。
【０１６５】
実施例７：ＤＩＮＯ遺伝子(経路プロファイリングシステム)
ｐ５３転写活性を誘導するＤＩＮＯの潜在能力を、in vivoでシグナル伝達経路プロファイリングシステム(signaling pathway profiling system)においてアッセイし得る。該システムは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子から上流のｃｉｓ作用性エレメント(cis-acting element)に基づく。経路が、トランスフェクトされたＨｅＬａまたは内皮細胞におけるＤＩＮＯの過剰発現により活性化される場合、ルシフェラーゼの発現が測定され得る。この方法で、さまざまな薬物、刺激または共トランスフェクトされた遺伝子の効果が、ルシフェラーゼ発現のアッセイにより研究され得る。
【０１６６】
実施例８：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(相同性)
配列番号５のＬＬＲ−Ｊ２４−１遺伝子を含んでなるｃＤＮＡクローンは、ＤＣ ｍＲＮＡのライブラリーから単離され、そしてＧｅｎＢａｎｋ発現配列タグ化データベース(ｄｂＥＳＴ)において検出される。ライブラリーを、ＮＫＧ２−Ａ、−Ｃ、−ＤおよびヒトＬｙ４９遺伝子から確立された短コンセンサス配列を用いて調べる(Houchins J.P. et al. J. Exp. Med. 173 [1991] 1017-1020; Bull C. et al. Genes and Immunity 1 [2000] 280-287)。スプライスバリアントＬＬＲ−Ｊ２４−２の配列番号７を含んでなるｃＤＮＡクローンは、単球由来のＤＣのｍＲＮＡから、逆転写ＰＣＲにより単離される。配列番号５および配列番号７を含んでなるｃＤＮＡクローンは、ＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いる配列比較により、ＣＴＬＤレセプターのスーパーファミリーと相同的であることが見出された。
【０１６７】
ＮＫＣの他の既知の遺伝子に対するＬＬＲ−Ｊ２４の関係を確立するために、ＣＴＬＤの予想アミノ酸配列を比較する。ＮＫレセプター複合体のすべての既知のレクチン様遺伝子のＣＴＬＤドメインのマルチプルアラインメントを、下記のパラメーターを有するＭａｃ Ｖｅｃｔｏｒ ６．５ソフトウエアのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法を用いて行う：Open gap penalty -7.0, extend gap penalty for pairwise alignment -2.5, および for multiple alignment -1.0。アラインメントにおいて使用された分子の受託番号は、ＮＫＧ２Ａ(Ｘ５４８６７)、ＮＫＧ２Ｃ(Ｘ５４８６９)、ＮＫＧ２Ｅ(Ｌ１４５４２)、ＮＫＧ２Ｈ(ＡＦ０７８５５０)、ＮＫＧ２Ｄ(Ｘ５４８７０)、ＬＯＸ−１(ＡＦ０３５７７６)、ＣＬＥＣ−１(ＡＦ２００９４９)、ＣＬＥＣ−２(ＡＦ１２４８４１)、ＤＣＩＲ(ＡＪ１３３５３２)、ＡＩＣＬ(Ｘ９６７１９)、ＬＬＴ−１(ＡＦ１３３２９９)、ＣＤ６９(Ｌ０７５５５)、ＫＬＲＦ１(ＡＦ１７５２０６)、ＭＡＦＡ(ＡＦ０８１６７５)、およびＮＫＲ−Ｐ１Ａ(Ｕ１１２７６)である。
【０１６８】
仮定的ＬＹ４９Ｌ(ｈｙｐＬｙ４９Ｌ)ＣＴＬＤ配列は、該遺伝子(ＡＦ２１３４５３)の対応する３つのエキソンを組み合せることにより得られたが、他のＣＴＬＤ遺伝子にしたがう正しくスプライシングされるＣＲＤエキソンを有する転写物は、ＬＹ４９Ｌについてこれまで検出されていない。系統樹を、ニアレスト・ネイバー法(nearest neighbor method)にしたがって、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア バージョン３．０のＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムにより構築する。
【０１６９】
ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを用いるマルチプルアラインメントにしたがって、系統樹を構築する(図５)。得られたデータにより、ＬＬＲ−Ｊ２４は、ＬＯＸ−１、ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２とともに、より関係が近いＮＫＣのレクチン様レセプターのサブファミリーを形成することが示される。ＬＬＲ−Ｊ２４の最高の相同性は、ＬＯＸ−１(４４％)で見られ、ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２は、幾分離れた関係(３７％)である。ＮＫＧ２およびＣＤ９４ ＮＫレセプターからなるＣＴＬＤ ＮＫレセプターのサブファミリーは、その次に近い関係のタンパク質である(ＮＫＧ２−Ｅについて２８％およびＮＫＧ２−Ｄについて３３％)。ＡＩＣＬ／ＬＬＴ−１／ＣＤ６９グループならびにＫＬＲＦ１、ＭＡＦＡおよびＮＫＲ−Ｐ１レセプターは、そのうえさらに幾分離れており、そしてマルチプルアラインメントにおいて別々の枝(branch)で示される。ＬＬＲ−Ｊ２４−１の配列は、ｓｔａｌｋエキソンがヒトｃＤＮＡから失われていることを除いて、近年報告されたネズミＤＥＣＴＩＮ−１ ｃＤＮＡと高い相同性を示した。ｓｔａｌｋエキソンは、配列番号７におけるスプライスバリアントＬＬＲ−Ｊ２４−２について示された約５〜１０％の転写物の細分画(図９および１０)においてスプライシングされていることが見出されると示され得る。
【０１７０】
ヒトＬＬＲ−Ｊ２４−２およびマウスＤＥＣＴＩＮ−１の対応する予想完全長タンパク質配列の比較により、５９％の同一性(相同性６９％)が示される。高い相同性が、細胞質、およびｓｔａｌｋドメインを含む細胞外ドメインにおいて保存されている。細胞質ドメインのＮ末端の近くに、ＩＴＡＭ様配列が、ＬＬＲ−Ｊ２４ならびにネズミＤＥＣＴＩＮ−１おいて存在する。この配列は、ＣＤ３−γ鎖またはＤＡＰ１２分子において見出されるような古典的ＩＴＡＭモチーフと少し異なる。モチーフにおける最初のチロシン(残基３)は、ロイシン(残基７)の４アミノ酸前の位置であるが、この距離は、古典的Ｙｘ２Ｌｘ６〜８Ｙｘ２Ｌモチーフにおいては３アミノ酸の位置である。該モチーフの次の残基は正しく配置されている。両タンパク質は、さらに、Ｎ−グリコシル化のためのコンセンサス部位を示す。ヒトおよびネズミのレクチン様ドメインは、非糖リガンドを提示するＣａ＋＋結合に関与すると記載された残基のほとんどを欠いている。膜貫通ドメインは、荷電アミノ酸を示さず、これはＤＡＰ分子のようなＩＴＡＭ含有アダプターとの会合が起きていないことを示している。
【０１７１】
他のレクチン様レセプターに対するＣＴＬＤにおけるＬＬＲ−Ｊ２４の相同性およびその発現プロフィール(下記参照)から、ＬＬＲ−Ｊ２４レセプターは、リポタンパク質、ＭＨＣクラスＩホモログまたは細胞もしくは寄生生物由来の別の膜貫通もしくは分泌性タンパク質のようなタンパク質性のリガンドを有すると考えられる。
【０１７２】
実施例９：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子
単離および配列決定：
配列番号５の遺伝子の完全ｃＤＮＡは、下記の方法のいずれかにより得られ得る：
ａ)ｃＤＮＡ末端の急速増幅(Rapid Amplification of cDNA Ends; RACE)法が、５'末端を得るために利用され得る(Frohman et al. Proc. Nat. Acad. Sci USA 85 [1988] 8998-9002参照)。簡便には、特異的オリゴヌクレオチドをｍＲＮＡにアニーリングさせ、そしてｃＤＮＡ鎖の合成を開始させるために使用する。ＲＮａｓｅＨでのｍＲＮＡの分解後に、ポリＣアンカー配列をｃＤＮＡの３'末端に付加し、そして得られたフラグメントを、アンチセンスプライマーおよびアンカー配列プライマーの入れ子状セット(nested set)を用いて、増幅する。増幅されたフラグメントを適当なベクター中にクローニングし、そして制限および配列解析にかける。
【０１７３】
ｂ)ポリメラーゼ連鎖反応は、２セットのプライマーとともにネステッドＰＣＲの連続的試行を用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡの５'末端を増幅するために使用され得る。一方のセットのアンチセンスプライマーは、部分的ｃＤＮＡの５'末端に特異的であり、そして他方のセットのプラ−マーは、ベクター特異的配列にアニーリングする。
【０１７４】
ＬＬＲ−Ｊ２４を得るために、ＲＴ−ＰＣＲを次のプロトコールにしたがって行った：最初に、４０ｐｇのＬＬＲ−Ｊ２４に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(５'−ＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＣＴＡＧＧＧＡＴＣＴＡＣ−３')を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．３)、７５ｍＭ ＫＣｌおよび３ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する１０μｌの容積の３μｇの全ＲＮＡとともに、８５℃に加熱し、続いて３０〜６０分かけて４２℃まで冷却することにより、アニーリングさせる。次いで、第１鎖合成を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．３)、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２０ｍＭ ＤＴＴおよび１００Ｕ Superscript Reverse Transcriptase (GIBCO/BRL, Rockville, MD)を含有する２０μｌにおいて行う。次いで、１μｌの第１鎖反応混合物に含まれるｃＤＮＡを、標準的手順にしたがって、ＰＣＲ反応における鋳型として使用する。下記のプライマーが使用される：
【表３】
【０１７５】
増幅した生成物を適当なベクター中にクローニングし、そして制限および配列解析にかける。この方法において、配列番号５および配列番号６が得られる。
【０１７６】
細胞培養、細胞の単離およびＲＴ−ＰＣＲのためのＲＮＡ単離：
臍帯血前駆細胞由来ＤＣ(ＣＢＤＣ)：臍帯血(ＣＢ)サンプルを、母親のインフォームドコンセントを得て、産科(Lainzer Hospital, Vienna, Austria)にて、健康な満期産から収集した。単核細胞(ＭＮＣ)を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ(登録商標)(Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway)密度勾配遠心分離法により、収集の１０時間以内に単離する。ＣＤ３４＋細胞をＣＢ−ＭＮＣから、Ｍｉｔｅｎｙｉ社(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)のＭＡＣＳ ＣＤ３４＋細胞単離キットを用いて、製造者の指示にしたがって、ポジティブ免疫磁気細胞選別法により単離する。単離されたＣＤ３４＋細胞の純度は、９５〜９９％の範囲である。
【０１７７】
免疫磁気的に精製されたＣＤ３４＋前駆細胞を、６−ウェルプレート(Costar, Cambridge, MA, USA)において、５×１０４細胞／ｍｌの初期細胞密度にて播種し、そして、１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、２ｍＭグルタミンならびにそれぞれ５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよびペニシリンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地(Life Technologies Ltd., Paisley, UK)において培養する。このＣＭに、さらに、ＳＣＦ(５０Ｕ／ｍｌ)およびＦｌｔ３−Ｌ(２５Ｕ／ｍｌ)(これらはともに、R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USAから購入されたものである。)を補給する。６日目(day 6)に、細胞培養物を分けて、２×１０５細胞／ｍｌの細胞密度を得、そして、ＳＣＦ(２５Ｕ／ｍｌ)、Ｆｌｔ３−Ｌ(１２．５Ｕ／ｍｌ)、ＧＭ−ＣＳＦ(３００Ｕ／ｍｌ、Novartis, Basel, Switzerland)、ＴＮＦα(５０Ｕ／ｍｌ; R&D)およびＴＧＦβ(５ｎｇ／ｍｌ; R&D)を含有するＣＭを加える。
【０１７８】
単球由来ＤＣ(ＭｏＤＣ)：
向流洗浄(countercurrent elutriation)により得られたヒト単球を、Ｃｏｓｔａｒ６−ウェルプレート(Costar, Cambridge, MA, USA)に、ＧＭ−ＣＳＦ(３００Ｕ／ｍｌ)およびｒＩＬ−４(２００Ｕ／ｍｌ)を補ったＣＭ中で８×１０５細胞／ｍｌにて播種する。培養物は、３日目(day 3)に、上に示した最終濃度を達成するようにＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を補った新たなＣＭのために、培地の半分を交換することにより培養される。
【０１７９】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球細胞またはＤＣの刺激：
向流洗浄Ｔ細胞またはＢ細胞により得られたヒトＴ細胞、Ｂ細胞および単球細胞を、ＣＭ中で培養し、そして、それぞれ、ＰＨＡ(１０μｇ／ｍｌ、Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)またはＰＷＭ(１０μｇ／ｍｌ、Sigma, St. Louis, MO, USA)およびｒｈＩＬ−４(１００Ｕ／ｍｌ、Novartis Pharma, Basel, Switzerland)の存在下で２４時間刺激する。単球細胞、ＭｏＤＣまたはＨＰＤＣを、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ(Sigma)で、またはヤギ−抗マウスＩｇＧのＦ(ａｂ')２−フラグメント(Pierce Chemical Corp, Rockford, IL, USA)の２μｇ／ｍｌの添加により溶液中で３７℃で６時間さらに架橋された４μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４０ ｍＡｂ(ｍＡｂクローン６２６．２)の存在下で、刺激する。いくつかの場合において、ザイモサンＡ(２５μｇ／ｍｌ、Sigma)を、ヤギ−抗マウスＩｇＧのＦ(ａｂ')２−フラグメントにより架橋された抗−ＣＤ４０ ｍＡｂと結合させて使用する。代わりに、ＭｏＤＣの最終成熟を、「図面の簡単な説明」において示したように、ＴＮＦα(２００Ｕ／ｍｌ)およびＩＬ−１β(１００Ｕ／ｍｌ)のような炎症性サイトカインの存在下でのインキュベーションにより、１８〜２４時間誘導する。
【０１８０】
ＲＮＡの単離：
全細胞性ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬(GIBCO/BRL, Rockville, MD, USA)における細胞溶解、クロロホルムでのＤＮＡおよびタンパク質の抽出、ならびにイソプロパノールによるＲＮＡの沈澱後に、細胞から単離される。
【０１８１】
実施例１０：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子
哺乳動物細胞における発現：
配列番号５および配列番号６で示される遺伝子のレセプターは、ヒト胚性腎臓２９３(ＨＥＫ２９３)細胞または付着性ＣＣＬ３９またはｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞のいずれかにおいて発現し、そして、本発明のＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子は、ヒト胚性腎臓２９３(ＨＥＫ２９３)細胞または付着性ＣＣＬ３９またはｄｈｆｒ ＣＨＯ細胞または組換えバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞のいずれかにおいて発現する。発現ベクターは、典型的には、強力なプロモーター、例えばＣＭＶ−ＩＥおよびＫｏｓｃａｋ配列の下流の５'および３'ＵＴＲの無いコード領域ならびにネオマイシンまたはゼオシンなどの抗生物質抵抗遺伝子を含む。
【０１８２】
細胞を、リポフェクチンにより個々のレセプターのｃＤＮＡでトランスフェクトし、そして６００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８(ネオマイシン)の存在下で選択する。選択の３週間後、個々のクローンを取り出し、そして、さらなる解析のために増殖させる。ベクター単独でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞は、陰性対照(negative control)として機能する。個々のレセプターを安定的に発現している細胞株を単離するために、約９６のクローンが、典型的には、選択され、そしてＲＴ−ＰＣＲ解析により解析される。レセプターのｍＲＮＡは、一般的に、解析されたＧ４１８−耐性クローンの約５０％において検出可能である。該遺伝子の発現のための組換えバキュロウイルスを、標準的技術を用いて、作成し、選択し、精製し、そして増殖させる。
【０１８３】
細胞表面上のまたは細胞内分画におけるＬＬＲ−Ｊ２４の発現を試験するために、発現構築物を、サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーターを提供する修飾ｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＡベクター(Invitrogen, Groningen, Netherlands)において得、そして一過性トランスフェクションにおいて試験した。ベクターを、Ｆｌａｇペプチドをコードする配列を含有するオリゴヌクレオチドの挿入により修飾する。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｎ−Ｆｌａｇ修飾ベクターにおいて、Ｆｌａｇコード配列を、多重クローニング部位のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位との間に挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｃ−Ｆｌａｇ修飾ベクターにおいて、ＸｈｏＩとＡｐａＩ部位との間に挿入する。
【０１８４】
２つの異なって修飾されたベクターが、それぞれ、Ｆｌａｇ配列の前または後に、対応する制限切断部位へとそれぞれのｃＤＮＡをクローニングすることにより、タンパク質に対するＮ末端またはＣ末端Ｆｌａｇエピトープを提供するために使用され得る。次いで、３つすべての遺伝子のコード領域を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｎ−Ｆｌａｇベクターへの挿入のためのＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ切断部位またはｐｃＤＮＡ３．１／Ｃ−Ｆｌａｇベクターへの挿入のためのＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ切断部位を提供する特異的オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲにより、ｃＤＮＡから増殖させる。ＰＣＲ、制限酵素消化、フラグメント精製、およびベクターへのライゲーションは、確立された手順にしたがって行われる。すべての構築物は、挿入されたＤＮＡフラグメントの完全配列決定により確かめられる。
【０１８５】
トランスフェクションの２４時間前に、６ウェル組織培養プレートにおいて、２９３細胞およびＨＵＶＥＣを播種すると、翌朝に８０〜９０％のコンフルエントに達する。２９３細胞を、哺乳動物トランスフェクションキット(Stratagene, La Jolla, CA, USA)を用いるリン酸カルシウム法によりトランスフェクトする。ＨＵＶＥＣ細胞の一過性トランスフェクションを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(商標)試薬(GIBCO/BRL, Rockville, MD)を用いることにより行う。
【０１８６】
免疫蛍光アッセイは、主として下記に記載したように行われる：トランスフェクションの２４時間後、適当な発現プラスミドでトランスフェクトされた細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒド、２％スクロース(抗−Ｆｌａｇ Ｍ２モノクローナル抗体、Sigma, St. Louis, MO, USA)で室温にて１０分間固定し、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中で希釈し、そして該細胞を室温にて１時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで５分間３回洗浄し、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−標識ロバ抗−マウスＩｇＧ(Accurate Chemical, Westbury, NY, USA)で室温にて１時間インキュベートし、そして再びＰＢＳで洗浄する。細胞核を可視化するために、ＤＮＡのための蛍光性溝結合プローブ(Hoechst 333258, Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA)を、５００ｎｇ／ｍｌにて二次抗体溶液に加える。結果を、冷却電荷結合デバイスカメラ(Kappa Gmbh, Gleichen, Germany)に接続したＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ＴＭＤ蛍光顕微鏡(Nikon Ltd.)において解析する。
【０１８７】
組換え後の発現ＬＬＲ−Ｊ２４−２は細胞表面上に見出されるが、ＬＬＲ−Ｊ２４−１は細胞内に蓄積する：
ＩＩ型レクチン様レセプターは、通常、ダイマーを形成し、そしてホモダイマーまたは２つの異なるレセプター鎖を組み合せたヘテロダイマーを形成することが示されている。一定の場合において、異種性レクチン様レセプター鎖とのダイマー形成は、表面発現に必要であることが示されている。このことは、例えば、ＮＫＧ２／ＣＤ９４レセプターについて当てはまる。したがって、それぞれの発現構築物での一過性トランスフェクションの後に、２９３細胞およびＨＵＶＥＣにおけるＣＬＥＣ−１およびＬＯＸ−１との比較において、ＦＬＡＧ−タグ化組換えＬＬＲ−Ｊ２４の表面発現を評価した。表面発現を評価するために、抗−ＦＬＡＧ抗体での非浸透細胞の染色を、染色手順の前にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を浸透させた細胞のパラレルサンプルと比較した。
【０１８８】
(ｓｔａｌｋエキソンを有するまたは有さない)ＬＬＲ−Ｊ２４−２およびＬＬＲ−Ｊ２４−１での構築物が使用された。ＬＯＸ−１および完全長ＬＬＲ−Ｊ２４は、非浸透細胞の強い染色により示されるＨＵＶＥＣの細胞表面に効果的に蓄積した(図６)。対照的に、検出可能なレベルの、ｓｔａｌｋを有さないＬＬＲ−Ｊ２４−１アイソフォームおよび完全長ＣＬＥＣ−１タンパク質は、非浸透細胞上で観察されないが、浸透細胞の有意な細胞内染色が得られる。より高い倍率での浸透細胞のより精密な解析により、ＬＯＸ−１およびＬＬＲ−Ｊ２４−２発現構築物でトランスフェクトされた細胞が、核周辺細胞構成成分の強い染色ならびに全細胞に及んで観察可能な表面発現を示すことが明らかにされた(図７)。ｓｔａｌｋのないＬＬＲ−Ｊ２４−１は、細胞質全体に均質に分配されることが観察されるが、表面上では観察されない。同様の結果が、２９３細胞に関して得られる。
【０１８９】
したがって、これらのデータから、配列番号１０で示されるｓｔａｌｋ配列がＬＬＲ−Ｊ２４の表面発現に必要とされることが示される。その理由は、おそらく、該配列が表面への輸送のためのシグナルを含み、そしてホモダイマー形成を促進し得ることである。これらのデータにより、ＬＬＲ−Ｊ２４−２は表面レセプターとして機能するが、ＬＬＲ−Ｊ２４−１は細胞内の機能を有し得ることが示される。
【０１９０】
実施例１１：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(組換え細胞および組換えタンパク質の調製)
ＮＫレセプターでの先の経験および組換えレクチン様レセプターの調製における経験に基づいて、発現構築物は、完全長膜貫通レセプターの発現のため、ならびに可溶性のもののために、調製され得る。完全長の形態の組換え発現を有する安定的にトランスフェクトされた細胞は、モノクロナール抗体の作成のため、および機能研究のために使用される。可溶性レセプターは、精製された形態で、より容易に、より大量に得られ得、したがって、免疫化のため、ならびにリガンドの同定および単離のために使用される。本計画の初期段階において、発現をモニターするための抗体が利用可能ではないので、該分子のＮ末端およびＣ末端にタグを供給する構築物が使用され得る。
【０１９１】
完全長発現のために、ｐＣＤＮＡベクター(InVitrogen)中にＦＬＡＧ−タグを有さないおよび有する構築物を調製した。これらの構築物は、２つの異なる細胞株を安定的にトランスフェクトするために使用される。安定的にトランスフェクトされた細胞は、モノクローナル抗体を得るために、マウスの免疫化に使用され得る。次に、マウスハイブリドーマとヒトＤＣとの間のハイブリッド細胞株が使用され得る。このようなハイブリッド細胞は、内因性ＬＬＲ−Ｊ２４を発現せず、したがって、ヒト由来の部分的樹状細胞的特性のために、安定トランスフェクタントでの機能研究の候補物質となり得る。
【０１９２】
さらに、構築物は、細胞外への輸送のためのシグナル配列と融合した細胞外部分をコードするｃＤＮＡを用いる、より大量の可溶性ＬＬＲ−Ｊ２４レセプターを調製するために設計され得る。この目的のために、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なバキュロウイルス系が使用され得る。公表されたデータに基づいて、このようなタンパク質は、また、ＮＫレセプターのＨＬＡ−Ｅリガンドと適切に結合する能力を有する。ｍｇの量のタンパク質が製造され、このことは、免疫化のため、ならびに単離実験およびＴ細胞のようなＤＣと相互作用する細胞型からの発現クローン潜在性リガンドの実験に有利である。代わりに、免疫グロブリン融合タンパク質が、免疫グロブリン部分のＣ末端と融合した細胞外ドメインを有するＣＯＳ細胞において製造される。これは、該レセプターがＩＩ型の方向性を有し、したがって、適切な結合のために遊離のカルボキシ末端を必要とし得るからである。
【０１９３】
実施例１２：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作成)
レクチン様レセプターに対する抗体は製造が困難な場合があるので、ＬＬＲ−Ｊ２４のＣ末端(最後の１５アミノ酸)からの合成ペプチドが使用される。その理由は、これが、組換え体の発現をモニターするのに役立つウエスタンブロットにおいてポリクローナルウサギ抗体の機能を得るための方法だからである。これらの抗体は、また、免疫化ペプチドでアフィニティー精製され得、そして、ＦＡＣＳ解析における細胞発現を研究するために使用され得る。さらに、ウサギの免疫化のための、およびアフィニティー精製抗体の調製のための、可溶性組換えレセプターが使用される。これは、フローサイトメトリーによるレセプターの表面発現を測定するのに有用な抗体を与え、そしてまた、レセプター−リガンド相互作用に対して中和作用を発揮し得る。
【０１９４】
さらに、モノクローナル抗体は、レセプターの構造−機能相関を研究するのに有用なエピトープ特異的試薬を最終的に入手するために得られ得る。リガンド結合を模倣するモノクローナル抗体、ならびにレセプター−リガンド相互作用をブロックする他のモノクローナル抗体が作成される。この目的は、ヒト遺伝子を安定的にトランスフェクトされたマウス細胞株を使用することにより達成され得る。ネズミＭＴ細胞のような細胞における発現は、適切な表面発現および分子の適切な抗原構造をもたらし、その結果、ヒト樹状細胞上のタンパク質に対して良好な結合特性を有する試薬が得られる。精製組換えタンパク質ならびに組換え細胞を使用する組合せ免疫化プロトコールが使用される。
【０１９５】
実施例１３：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(潜在的結合性タンパク質鎖の特徴付け)
いくつかの例において、レクチン様レセプターは、異なるレクチン様タンパク質とのジスルフィド結合性へテロダイマーおよびシグナル伝達アダプター分子との非共有結合性会合体を形成することが示された。例えば、ＮＫＧ２タンパク質のいくつかのアイソフォームは、ＣＤ９４タンパク質とへテロダイマー化して、阻害および活性ＮＫ細胞レセプターのいくつかの変異体を形成する。さらに、トリガー性ＮＫＧ２／ＣＤ９４レセプターは、それらのＮＫＧ２部分を介して、シグナル伝達アダプターＤＡＰ１２と会合する(Lanier L.L. et al. Immunity 8 [1998] 693-701)。ＤＡＰ１２はＩＴＡＭモチーフを含み、そして細胞に活性化シグナルを与える機能を有する。他方、阻害的形態のＮＫＧ２−Ａ／ＣＤ９４は、ＮＫＧ２−Ａの細胞質側テイル上にＩＴＩＭモチーフを含み、これは、ＳＨＰ−１および−２ホスファターゼを介して阻害性シグナルを補充しそして引き起こす(Palmieri G. et al., J. Immunol. 162 [1999] 7181-8)。ビオチンでの組換え細胞および一次ヒトＤＣの表面標識(ＥＺ−Ｌｉｎｋビオチン化試薬, Pierce)の後に、ＬＬＲ−Ｊ２４を免疫沈降させ、そして潜在的共免疫沈降鎖を、対応するアビジン−ＨＲＰ試薬を用いて沈降物のウエスタンブロットにおいてスコアをつける。表面に露出したタンパク質鎖を共免疫沈降させ、したがって、サイズの異なるＬＬＲ−Ｊ２４を本方法により検出しそして単離し得る。
【０１９６】
十分には表面に露出していないシグナル伝達アダプターを検出するために、Ｓ３５メチオニンで代謝的に標識されたＤＣが使用され得、そして沈降したタンパク質のポリアクリルアミドゲル分離の後に、共免疫沈降したタンパク質に関してスコアをつけ得る。さらに、ＤＡＰ分子のようなレセプターと相互作用し得る既知のタンパク質が試験され得る。このようにして、活性的および阻害的シグナル伝達分子との潜在的相互作用が確立される。
【０１９７】
実施例１４：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(ＬＬＲ−Ｊ２４ポリヌクレオチドでのリガンドスクリーニング)
推定的レセプターリガンドのコレクションを、スクリーニングのために集める。該コレクションは：さまざまなｏｘＬＤＬ化合物および誘導体、炭水化物性化合物、寄生生物の膜、ＭＨＣクラスＩの可溶性化合物およびそのホモログ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ対立遺伝子形態、関係のあるＬＯＸ−１およびＮＫＧ２を介して作用することが知られているさまざまなＵＬ１６結合タンパク質または他のレクチン様レセプター；ヒトレクチン様レセプターの推定的アゴニスト、非哺乳動物性の、哺乳動物対応物がまだ同定されていない生物学的に活性なペプチドであり得る天然物；および自然において見出されていないが、未知の天然リガンドでレクチン様レセプターを活性化する化合物、を含んでなる。このコレクションは、機能的アッセイ(すなわち、カルシウムおよびｃＡＭＰの放出、チロシンおよびセリンキナーゼの活性化、ＳＨＰ−１および−２のようなホスファターゼ)ならびにさまざまな標識化合物での結合アッセイの両方を用いて、既知のリガンドのためのレセプターを最初にスクリーニングするために使用される。
【０１９８】
潜在的リガンドの探索は、組換え細胞および単離可溶性レセプターを用いて行われる。最初に、２つの潜在的リガンド源が調査され得る。ＬＯＸ−１およびＮＫレセプターに関するＬＬＲ−Ｊ２４の相同性および近接した染色体局在化に基づいて、糖リガンドはあり得ないと考えられるが、残余的な糖リガンド特性がいくつかのレクチン様レセプターにおいて見出されている。ＮＫレセプターまたはＬＯＸ−１との類推によって、タンパク質性リガンドまたはリポタンパク質が予想される。ＬＯＸ−１と同様に、酸化ＬＤＬが結合し得る。関係のあるマウスＤｅｃｔｉｎ−１での予備的実験により示唆されるように(Ariizumi K. et al. J. Biol. Chem. 275 [2000] 20157-20167)、ＬＬＲ−Ｊ２４は、さらに、むしろＴ細胞の表面分子と携わることが予想される。
【０１９９】
ＬＬＲ−Ｊ２４発現組換え細胞対ＬＬＲ−Ｊ２４陰性親細胞株の活性化が評価され得る。Ｃａ＋＋、ＮＦκＢおよびいくつかのＭＡｐキナーゼ経路の活性化が試験される。代わりに、ＬＬＲ−Ｊ２４組換え体を、活性化を評価するために、Ｔ細胞およびＴ細胞膜分画と組み合わせる。一方では、ｏｘＬＤＬに結合する性質は、また、アポトーシス細胞への結合を媒介し、そして、このような機能は、ＤＣの文脈において意味をなすと考えられる。エンドサイトーシスされたアポトーシス細胞物質は、さらに、Ｔ細胞に対してＭＨＣ分子を介して提示され、したがって、アポトーシスの原因の細胞の感染が認識される。寄生生物上のリポタンパク質への直接的結合が試験され得る。代わりに、ＬＬＲ−Ｊ２４は、Ｔ細胞、例えばＭＨＣホモログ上の表面タンパク質との相互作用に関与し得、そして、この相互作用は、Ｔ細胞の活性化のための補助的機能を有し得る。
【０２００】
可溶性レセプターは、リガンドを同定、単離およびクローニングするために使用される。これは、レトロウイルスベクターにおいてＴ細胞ｃＤＮＡの発現ライブラリーを使用することにより行われ、これは入手可能であり、そして可溶性レセプターが結合しない細胞においてｃＤＮＡライブラリーを発現させるために使用され得る。タグ化可溶性レセプターは、ＦＡＣＳソーティングにより適切なリガンドを発現している形質導入細胞を単離するために使用され得、そして、ｃＤＮＡはソートされた細胞から回収され得る。リガンドがさらに複雑な構造を有する場合、例えば、それが２本の鎖からなり、そしてこれらが記載した方法を用いて１つの細胞において発現され得ない場合には、可溶性レセプターでのアフィニティークロマトグラフィーを用いる生化学的精製および標準的タンパク質分離技術が使用され得る。
【０２０１】
実施例１５：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(リガンド結合アッセイ)
リガンド結合アッセイは、レセプター薬理を確かめるための直接的方法を提供し、そして、ハイスループットフォーマットに適用可能である。レセプターのための精製リガンドは、結合研究のために、高度に特異的な活性(５０〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ)に放射性標識される。次いで、放射性標識の過程において、レセプターに対するリガンドの活性が減少することのない測定を行う。緩衝液、イオン、ｐＨおよびヌクレオチドのような他のモジュレーターのためのアッセイ条件は、膜および全細胞レセプター源の両方についての実行可能なノイズに対するシグナル比を確立するために最適化される。これらのアッセイのために、特異的レセプター結合が、総結合放射活性から、過剰の非標識競合リガンドの存在下で測定された放射活性を引いたものとして定義される。可能な場合には、１を超える競合リガンドを使用して残りの非特異的結合を定義する。
【０２０２】
実施例１６：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(機能アッセイ)
ＬＬＲ−Ｊ２４を発現しない、組換えＤＣ様ＤＣ／Ｓｐ２０対非組換え細胞における細胞シグナル伝達の潜在的活性化または阻害を、評価する。第２の方法は、単球由来および臍帯血由来一次ＤＣならびにＣＤ４０リガンドでの誘導により成熟させた培養物の製剤を使用することであり、これらはＭＬＲを刺激する活性がある。第１の方法において、抗体、ならびに組換え細胞対その親細胞における細胞内シグナルの潜在的活性化のための、酸化ＬＤＬまたはアポトーシス細胞フラグメントのような潜在的可溶性リガンドの、スコアをつける。遊離のＣａ＋＋、ＮＦκＢの誘導および主要ＭＡＰキナーゼ経路ＭＥＫ／ＥＲＫ、ｐ３８およびＪＮＫの増加を、試験する。トリガー化合物での抗体の妨害またはレセプターの阻害的機能の解消が試験され得る。
【０２０３】
ＤＣの成熟に対するおよびＴ細胞の活性化に対するレセプターの潜在的貢献は、次のように評価され得る。アッセイ１において、未成熟のランゲルハンス型ＤＣを調製し、そして、抗体を、それらがＣＤ４０リガンド刺激の間にＤＣ成熟／活性化を阻害または促進するかどうかについて試験する。この目的のために、ＣＤ８０／ＣＤ８６の上方調節がフローサイトメトリーにより測定される。アッセイ２において、抗体および調製された可溶性レセプターが、同種異系Ｔ細胞を刺激するＤＣの能力を改変するかどうかについて評価する。
【０２０４】
未成熟ならびに成熟ＤＣは、抗体での樹状細胞の、または可溶性レセプターでのＴ細胞の、プレインキュベーションの後の、同種異系Ｔ細胞の刺激剤として使用される。Ｔ細胞刺激の好適な読み取りは、５日後のチミジンの組み込みである。これらの実験により、ＤＣ成熟に対する、ならびに、Ｔ細胞活性化に対する、レセプターの影響が検出される。したがって、Ｔ細胞との相互作用におけるＬＬＲ−Ｊ２４の補助的機能が検出される。Ｔ細胞上でのリガンドとのＬＬＲ−Ｊ２４の潜在的相互作用をブロックし得る抗体および可溶性レセプターは、免疫応答を調節するために重要である。
【０２０５】
実施例１７：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(抽出／細胞上清スクリーニング)
同族の活性化リガンド(アゴニスト)がもう残っていない数多くのレクチン様レセプターが存在する。したがって、これらのレセプターの活性リガンドは、今日までに同定されたリガンドバンク(ligand bank)内に含まれ得ない。したがって、本発明のＣＴＬＤレセプターは、また、天然リガンドを同定するために組織抽出物に対して(カルシウム、ｃＡＭＰ、キナーゼ機能スクリーニングを用いて)機能的にスクリーニングされる。陽性の機能応答を産生する抽出物は、活性化リガンドが単離および同定されるまで、経時的にサブフラクション化され得る。
【０２０６】
実施例１８：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子(カルシウムおよびｃＡＭＰ機能アッセイ)
ＨＥＫ２９３細胞内に発現されたレクチン様レセプターは、ＰＬＣおよびカルシウム移動の活性化、ｃＡＭＰ刺激および／またはチロシンおよびセリン／スレオニンキナーゼの活性化または阻害と機能的に共役していることが示される。レセプターがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞またはベクター制御細胞における基底カルシウムレベルは、通常では、１００ｎＭ〜２００ｎＭの範囲であると観察された。組換えレセプターを発現しているＨＥＫ２９３細胞に、ｆｕｒａ２を負荷し、そして、１日に１５０を超える選択リガンドまたは組織／細胞抽出物が、アゴニスト誘導性カルシウム移動について評価される。同様に、組換えレセプターを発現しているＨＥＫ２９３細胞は、標準的ｃＡＭＰ定量アッセイを用いて、ｃＡＭＰ産生の刺激または阻害について評価される。カルシウム過渡応答またはｃＡＭＰ変動を提供するアゴニストは、該応答がレセプターを発現しているトランスフェクト細胞に独特のものであるかどうかを測定するために、ベクター制御細胞において試験される。
【０２０７】
実施例１９：ＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子
本発明のＬＬＲ−Ｊ２４遺伝子のＲＮＡ調節：
ＬＬＲ−Ｊ２４は、ＤＣにおいて選択的に発現する：
ＬＯＸ−１、ＬＬＲ−Ｊ２４およびＣＬＥＣ−１は１つのサブファミリーのメンバーであるので、一次ヒトＤＣ、単球、ＴおよびＢリンパ球ならびに内皮細胞におけるＬＬＲ−Ｊ２４およびＣＬＥＣ−１ ｍＲＮＡの発現を調べる。得られたデータにより、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡは、単球由来ＤＣ(ＭｏＤＣ)において、およびＣＤ３４＋造血前駆細胞由来ＤＣ(ＨＰＤＣ)において、豊富かつ選択的に発現していることが示される。少量のＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡが一次単球にも存在するが、さまざまな刺激で処理されたまたは処理されていない一次ＴおよびＢリンパ球ならびに内皮細胞は、検出可能なレベルでＬＬＲ−Ｊ２４転写物を発現していなかった。いくつかのさらなる細胞株、すなわち、Ｊｕｒｋａｔ、ＲＰＭＩ８８６６、ＮＫＬおよびＮＫ９２を含むノーザンブロットにおいて、発現は見られなかった。ＤＣにおけるＲＮＡのサイズは、ノーザンブロットから３．０〜３．５ｋｂと見積もられ、これは、停止コドンから１．６〜１．９ｋｂ下流の領域の遺伝子において検出された第１またはいくつかの連続的ポリアデニル化シグナルの使用から推定される転写物のサイズに相当する。
【０２０８】
ＬＬＲ−Ｊ２４の発現は、ＤＣの機能的成熟の間に下方調節される：
ＤＣの活性化および最終的成熟は、それらの移動および機能を調節する遺伝子の改変された発現と関連する。したがって、炎症性メディエーター、ＣＤ４０−リガンドまたはザイモサンＡによるＤＣの刺激が、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの発現レベルにおいて変化をもたらすかどうかについて試験された。図８Ａにおいて示されるように、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの組合せでのＭｏＤＣの１８〜２４時間の処理は、再生可能な、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの３〜５倍の減少をもたらした。代わりに、ＨＰＤＣを、酵母粒子のファゴサイトーシスを刺激するザイモサンＡの非存在または存在下で、ＣＤ４０レセプターに特異的なｍＡｂにより活性化する(図８Ｂ)。これらの結果に基づいて、ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの下方調節は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのような強力な成熟誘導剤またはファゴサイトーシス刺激と組み合せたＣＤ４０ライゲーションで処理された培養物において特に表される。ＭＤＣケモカイン(ＣＣＬ２２)は、それらの成熟後にＤＣにおいて強力に誘導されることが知られているので、同じノーザンブロットを、ＭｏＤＣまたはＨＰＤＣの活性化の成功を確認するために、ＭＤＣの特異的プローブとハイブリダイズさせた。図８において示されるように、ＭＤＣの強力な誘導は、両方のタイプのＤＣにおけるＬＬＲ−Ｊ２４転写物の下方調節と平行する。
【０２０９】
ＬＬＲ−Ｊ２４転写物は、可変的にスプライシングされる：
ノーザンブロット解析では、ＬＬＲ−Ｊ２４−１および−２に関して、１４１塩基のみ異なることが予想された転写物を区別することができなかった。したがって、第２および第４のエキソンの間のフラグメントを増幅するためのプライマー対を用いる逆転写ＰＣＲが行われる。５０５ｂｐおよび３６７ｂｐの２つの生成物を得、これらは、それぞれ、ｓｔａｌｋエキソンを有するおよび有さない予想フラグメントのサイズに相当する(図９および図１０)。該生成物の約５〜１０％がｓｔａｌｋエキソンを含むサイズであると見積もられる。この上側のバンドをゲルから削り取り、サブクローニングし、２つの得られたクローンを配列決定する。両クローンは、配列番号７および配列番号９において示される、正しくスプライシングされたｓｔａｌｋエキソンを表した。得られたＰＣＲフラグメントを、さらに、それぞれ、５'−非翻訳領域からｓｔａｌｋエキソンまで、およびｓｔａｌｋエキソンから第６エキソンまでのｍＲＮＡのフラグメントを増幅するプライマー対で解析した(図８Ｂ参照)。両方の場合において、得られた主生成物は、正しくスプライシングされたエキソンについて予測されたサイズに対応していた。これらのデータにより、ＬＬＲ−Ｊ２４転写物のフラクションがｓｔａｌｋエキソンを含み、そしてまた、他のエキソンでも正しくスプライシングされることが示される。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】ＩＫＫ２のＣｏＩＰとＩＫＫ２−５５との相互作用。Ｆｌａｇ−タグ化ＩＫＫ２−５５およびｍｙｃ−タグ化ＩＫＫ２を、示した通りにＨｅｌａ細胞にトランスフェクトした。溶解物を調製し、そしてＩＫＫ２−５５を抗−Ｆｌａｇ抗体で沈澱させ、そして沈澱物を、抗−Ｍｙｃ抗体を用いるウエスタンブロッティングにより解析した(上側のパネル)。細胞抽出物におけるＦｌａｇ−ＩＫＫ２−５５およびｍｙｃ−ＩＫＫ２の存在が、ウエスタンブロッティングにより確認された(下側のパネル)。
【図２】ＩＫＫ２−５５の亜細胞性局在。ＨＵＶＥＣを、異なる細胞区画についてのＣＦＰ融合遺伝子とともに、ＹＦＰ−ＩＫＫ２−５５融合構築物でトランスフェクトし、そして蛍光顕微鏡下で観察した。左側の列は、イエローチャンネル(yellow channel)におけるＩＫＫ２−５５の局在を示し、右側の列はシアンチャンネル(cyan channel)におけるマーカーの局在を示す。上段のパネル：小胞体(ＥＲ)；中段のパネル：ミトコンドリア(ｍｉｔｏ)；下段のパネル：ゴルジ体。
【図３】ＮＦ−ｋＢ依存プロモーターに対するＩＫＫ２−５５の影響。ＨＵＶＥＣを、異なる量のＩＫＫ２−５５ならびに内部標準としてユビキチン−ｂｇａｌとともに、５ｘＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ構築物でトランスフェクトし、そして２日後に、１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦαで６時間刺激した。ルシフェラーゼ値(相対的な光度単位)を、ｂ−ｇａｌ発現に関して標準化した。 ｐｒｏｍ＝プロモーター；ｕｎｓｔｉｍ＝未刺激；ｓｔｉｍ＝刺激。
【図４】ＮＦ−ｋＢ依存プロモーターに対する(異なるキナーゼと組み合せた)ＩＫＫ２−５５の影響。ＨＵＶＥＣを、５ｘＮＦ−ｋＢ−Ｌｕｃ構築物で、ＩＫＫ２−５５とともに、示した異なるキナーゼ(ＩＫＫ２、ＮＩＫ、ＴＡＫ１、ｐ３８)ならびに内部標準としてのユビキチン−ｂｇａｌで、トランスフェクトした。１つの場合において、細胞を１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦαで６時間刺激した。ルシフェラーゼ値を、相対的な光度単位として表し、そしてβ−ｇａｌ発現に関して標準化した。 濃色カラム：５００ｎｇ ＩＫＫ２−５５；斜線付きカラム：０ｎｇ ＩＫＫ２−５５ ＲＬＵ−βｇａｌ：β−ｇａｌあたりの相対光度単位。
【図５】ヒトＮＫレセプター複合体のすべての既知のレクチン様遺伝子を含む系統樹： 表された遺伝子のＣＴＬＤの配列をアラインし、そして実施例において記載したように、系統樹を作成した。すべての配列を、ドメインにおいて必ず保存されている最初のシステインの、２つ前のアミノ酸から開始するように選択した。ＮＫＧ２ＥおよびＨは、同じ遺伝子からの、２つの別々にスプライシングされた転写物である。ＬＹ４９Ｌについて、他の遺伝子と比較できるほどにスプライシングされたすべての３つのＣＴＬＤエキソンを含む仮定的配列を選択したが、異常型にスプライシングされた転写物のみが、この遺伝子に関して検出された。この遺伝子は、一貫して、アラインメントのための異なるパラメーター設定を用いて、互いにより近い関係にあることが見出され、そして樹構造は、右側のカッコにより示される。下のスケールは、置換事象の尺度である。ＮＫ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞(ＥＣ)、単球細胞(ＭＯ)、樹状細胞(ＤＣ)におけるまたはさらに広範に白血球(ＬＥＵＫ)におけるサブファミリーの選択的発現が示される。
【図６】非浸透および浸透細胞の染色の比較。左列において、ホルムアルデヒドで固定した非浸透細胞(固定)、および右列において、浸透細胞(固定／浸透)を示す。上段は抗−ＦＬＡＧ抗体での染色を示し、下段は総細胞数を可視化するためのＨｏｅｃｈｓｔ３３３２５８でのＤＮＡの染色を示す。
【図７】ｓｔａｌｋエキソンを含まないＬＬＲ−Ｊ２４構築物を、図２Ｂにおいて示す(ΔＬＬＲ−Ｊ２４−１)。より高い倍率での４つの発現構築物全てについての浸透細胞の染色の比較。
【図８】樹状細胞の成熟中のＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡの下方調節：
【図９】ＬＬＲ−Ｊ２４ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ。ＭｏＤＣからのＲＮＡを、特異的ＬＬＲ−Ｊ２４プライマーを用いて逆転写し、そしてＰＣＲを、得られたｃＤＮＡ上で、示された異なるプライマー対を用いて行った。(ａ)は、ＭｏＤＣ ＲＮＡのためのｓｔａｌｋエキソンを有するおよび有さない転写物の増幅を示し、(ｂ)は５'−部分の増幅を示し、そして、(ｃ)は、図４Ａ中のＢで示されたＭｏＤＣおよびＨＬ６０ ＲＮＡのための転写物を含むｓｔａｌｋの３'−部分を示す。レーン６は、完全長ＬＬＲ−Ｊ２４ ｃＤＮＡを含むプラスミドから得られた生成物を示す。
【図１０】ＲＴ−ＰＣＲに使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーの概略図。第１のプライマー対(ａ)を、ｓｔａｌｋエキソンフラグメンを有するおよび有さない、それぞれ、予想された５０５ｂｐおよび３６７ｂｐのＰＣＲ生成物をもたらすｓｔａｌｋエキソンフラグメントの存在を試験するために設計した。第２のプライマー対(ｂ)により、５'−部分の正確なスプライシングを試験し、第３のプライマー対(ｃ)により、ｓｔａｌｋエキソンを含む転写物の３'−部分のスプライシングを訂正する。ｃ＝細胞質性；ＴＭ＝膜貫通性；ＣＴＬＤ＝Ｃ型レクチン様ドメイン１；ＣＴＬＤ２＝Ｃ型レクチン様ドメイン２；ＣＴＬＤ３＝Ｃ型レクチン様ドメイン３。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４で示される単離されたＤＩＮＯポリペプチド、または配列番号４で示されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＩＮＯ遺伝子。
【請求項２】
配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含んでなる単離されたＤＩＮＯ遺伝子、またはストリンジェント条件下で配列番号３で示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号４で示される単離されたＤＩＮＯポリペプチド、または配列番号４で示されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
【請求項５】
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含んでなる発現系であって、該発現系またはその部分が適合性の宿主細胞中に存在する場合に、該発現系またはその部分が請求項３に記載のポリペプチドを産生することができる、発現系。
【請求項６】
宿主細胞が、適当な培養条件下で、請求項３に記載のポリペプチドを産生するように請求項５に記載の発現系で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることにより産生された組換え宿主細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の発現系を含んでなる単離宿主細胞。
【請求項８】
請求項３に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項９】
請求項３に記載のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイであって、主要な構成要素として、
ａ)請求項３に記載のポリペプチド、
ｂ)請求項３に記載のポリペプチドを発現する組換え細胞、
ｃ)請求項３に記載のポリペプチドを発現する細胞膜、または
ｄ)請求項３に記載のポリペプチドに対する抗体、
を含んでなるアッセイ。
【請求項１０】
請求項３に記載のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、
Ａ)ａ)請求項３に記載のポリペプチド、
ｂ)請求項３に記載のポリペプチドを発現する組換え細胞、
ｃ)請求項３に記載のポリペプチドを発現する細胞膜、または
ｄ)請求項３に記載のポリペプチドに対する抗体、
を候補化合物と接触させること、
Ｂ)ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する候補化合物の効果を測定すること；
Ｃ)工程Ｂ)において測定されたアゴニストまたはアンタゴニストを選択すること、
を含んでなる方法。
【請求項１】
配列番号４で示される単離されたＤＩＮＯポリペプチド、または配列番号４で示されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＤＩＮＯ遺伝子。
【請求項２】
配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含んでなる単離されたＤＩＮＯ遺伝子、またはストリンジェント条件下で配列番号３で示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号４で示される単離されたＤＩＮＯポリペプチド、または配列番号４で示されるポリペプチドと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
【請求項５】
ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含んでなる発現系であって、該発現系またはその部分が適合性の宿主細胞中に存在する場合に、該発現系またはその部分が請求項３に記載のポリペプチドを産生することができる、発現系。
【請求項６】
宿主細胞が、適当な培養条件下で、請求項３に記載のポリペプチドを産生するように請求項５に記載の発現系で宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることにより産生された組換え宿主細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の発現系を含んでなる単離宿主細胞。
【請求項８】
請求項３に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項９】
請求項３に記載のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイであって、主要な構成要素として、
ａ)請求項３に記載のポリペプチド、
ｂ)請求項３に記載のポリペプチドを発現する組換え細胞、
ｃ)請求項３に記載のポリペプチドを発現する細胞膜、または
ｄ)請求項３に記載のポリペプチドに対する抗体、
を含んでなるアッセイ。
【請求項１０】
請求項３に記載のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であって、
Ａ)ａ)請求項３に記載のポリペプチド、
ｂ)請求項３に記載のポリペプチドを発現する組換え細胞、
ｃ)請求項３に記載のポリペプチドを発現する細胞膜、または
ｄ)請求項３に記載のポリペプチドに対する抗体、
を候補化合物と接触させること、
Ｂ)ａ)、ｂ)、ｃ)またはｄ)のいずれかに対する候補化合物の効果を測定すること；
Ｃ)工程Ｂ)において測定されたアゴニストまたはアンタゴニストを選択すること、
を含んでなる方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【公開番号】特開２００８−２５３２６９（Ｐ２００８−２５３２６９Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１１８８２４（Ｐ２００８−１１８８２４）
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【分割の表示】特願２００２−５７６６５９（Ｐ２００２−５７６６５９）の分割
【原出願日】平成１４年３月２６日（２００２．３．２６）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【分割の表示】特願２００２−５７６６５９（Ｐ２００２−５７６６５９）の分割
【原出願日】平成１４年３月２６日（２００２．３．２６）
【出願人】（５９７０１１４６３）ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト (942)
【Ｆターム（参考）】
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