新規リパーゼ及びこれを用いた機能性脂質の合成方法
【課題】グリセロールの２位に対して優先的に触媒作用を有し、２位に高度不飽和脂肪酸を結合させて機能性脂質の合成に資するリパーゼを提供する。
【解決手段】リパーゼは、モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６１）により生産されるリパーゼである。そして、このリパーゼは、グリセロールの２位に対し優先的にエステル結合を促進させる触媒作用を有する。高度不飽和脂肪酸とグリセロールとにこのリパーゼを介在させることで、グリセロールの２位に高度不飽和脂肪酸を結合させた機能性脂質を合成することができる。
【解決手段】リパーゼは、モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６１）により生産されるリパーゼである。そして、このリパーゼは、グリセロールの２位に対し優先的にエステル結合を促進させる触媒作用を有する。高度不飽和脂肪酸とグリセロールとにこのリパーゼを介在させることで、グリセロールの２位に高度不飽和脂肪酸を結合させた機能性脂質を合成することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規リパーゼ及びこれを用いた機能性脂質の合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含めた後生動物には自身の生理代謝過程に必須であっても、自身では合成できない脂肪酸の分子種がある。ヒトにとっては、高度不飽和脂肪酸が必須脂肪酸であり、自身では合成できない高度不飽和脂肪酸を合成する他の生物を食物として摂取することで補っている。
【０００３】
高度不飽和脂肪酸は、例えば魚油等、動物性油脂に多く存在しており、グリセロールの２位に高度不飽和脂肪酸が結合した油脂が生物に対して生理活性を与えている。この２位に高度不飽和脂肪酸が結合した油脂を工業的に合成することが望まれており、リパーゼ等の酵素を用いて、グリセロールの２位に高度不飽和脂肪酸が結合した油脂を合成することが試みられている。
【０００４】
リパーゼは油脂の分解、合成に作用する酵素として知られており、各種油脂の製造、加工分野では、微生物由来のリパーゼが広く用いられている。しかし、これまで用いられてきたリパーゼは、トリグリセリドがもつ３つの脂肪酸のうち、１位及び３位に特異的に作用するもの、或いは、非特異的に作用するものであった。このため、特に高い生理活性機能を有する高度不飽和脂肪酸の多くが位置する２位を交換・修飾することが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９８／３９４６８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、グリセロールの２位に対して優先的に触媒作用を有し、２位に高度不飽和脂肪酸を結合させて機能性脂質の合成に資するリパーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係るリパーゼは、
モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６１）により生産され、グリセロールの２位に対して優先的に触媒作用を有する。
【０００８】
また、分子量が１１ｋＤａであることが望ましい。
【０００９】
また、至適ｐＨが８〜１０であることが望ましい。
【００１０】
また、至適温度が４５〜５５℃であることが望ましい。
【００１１】
また、前記モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株を培養して１２０〜１６８時間後に回収し、精製して得られることが好ましい。
【００１２】
本発明に係る機能性脂質の合成方法は、
グリセロールと高度不飽和脂肪酸とに上記に記載のリパーゼを介在させ、２−モノグリセリドを合成する工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
また、前記高度不飽和脂肪酸としてアラキドン酸（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、エイコサペンタエン酸（Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ)及びジホモ−γ−リノレン酸（Ｄｉｈｏｍｏ−ｇａｍｍａ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）から選択される一種以上を用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るリパーゼは、グリセロールと脂肪酸とに介在させることで、グリセロールの２位に優先的に作用する特性を有しており、高い生理機能を有する機能性脂質を合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】リパーゼ活性の追跡結果を示すグラフである。
【図２】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００によるゲル濾過結果を示すグラフである。
【図３】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析図である。
【図４】リパーゼ活性とｐＨとの関係を示すグラフである。
【図５】リパーゼ活性と温度との関係を示すグラフである。
【図６】リパーゼの基質特異性を示すグラフである。
【図７】アシルグリセロールの合成反応経過を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本実施の形態に係るリパーゼは、糸状菌モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）亜属に属するＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６１）により生産されるリパーゼである。このリパーゼは、トリグリセロール（１，２，３−プロパントリオール）の２位に対し、優先的に触媒作用を発揮する。
【００１７】
また、このリパーゼは、以下の特徴を有する。
分子量：１１ｋＤａ
至適ｐＨ：８〜１０
至適温度：４５〜５５℃
【００１８】
本実施の形態に係るリパーゼは、ＳＡＭ２１９７株を培養することで生産されるが、ＳＡＭ２１９７株の培養は、一例として以下に示す培養条件及び培養方法で行うことができる。
【００１９】
ＳＡＭ２１９７株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた培養液を、液体培地又は固体培地に接種し培養することができる。液体培地の場合、炭素源としてはグルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール、クエン酸、コーンスターチ等の一般的に使用されているものがいずれも使用できるが、特にグルコース、フラクトース、マルトース、グリセロール、クエン酸、コーンスターチが好ましい。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源等の一般的に使用されているものを用いることができる。この他必要に応じて微量栄養源として用いる、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム等のリン酸塩、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、塩化マグネシウム、塩化カリウム等の無機塩及びビタミン等全て一般的に使用されているものが使用できる。
【００２０】
本実施の形態に係るリパーゼは、ＳＡＭ２１９７株を培地中で培養して１２０〜１６８時間経過後に回収し、精製されていることが好ましい。好ましくは、培養時間が１３２〜１５６時間、より好ましくは１４４時間である。
【００２１】
なお、リパーゼの精製は一例として、以下のようにして行うことができる。培養後、培養物をフィルターで濾過し、菌体と培養上清を得る。菌体はヘキサンで軽く洗浄して、表面の油脂を除去した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０（以下、ＴＢと記す）に懸濁して、氷上でガラスビーズとともにホモジナイズして破砕する。不溶性成分を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）で除去し、その上清を新たな試験管に移し、冷アセトンを５０％となるように加えて４時間冷却し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）により活性成分を沈殿回収する。培養上清も同様に処理して、沈殿に活性成分を回収する。これらをＴＢに溶解させ、同緩衝液に対して透析する。不溶性物質を遠心分離で除去した後、ＴＢで平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（５ｍｌ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかける。０−２Ｍ ＮａＣｌを含むＴＢを用いてグラジエント溶出を行い、活性画分を集める。これを、１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＴＢで平衡化したｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（１ｍｌ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、カラムを十分に洗浄した後、０−１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＴＢでグラジエント溶出する。活性成分がまだ吸着している場合は、１−１．５％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を含むＴＢで溶出させる。集めた活性画分をＴＢに対して透析し、遠心した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＨＲ １０／３０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＴＢで溶出する。このようにしてリパーゼを精製することができる。
【００２２】
（機能性脂質の合成方法）
本実施の形態に係る機能性脂質の合成方法は、上述したリパーゼをグリセロールと脂肪酸とに介在させて２−モノグリセリドを合成する工程を含む。
【００２３】
機能性脂質として、例えば、グリセロールの２位にアラキドン酸（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＡＡ）、エイコサペンタエン酸（Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ＤＨＡ)等の高度不飽和脂肪酸が結合した２−モノグリセリドが挙げられる。
【００２４】
グリセロールと上記高度不飽和脂肪酸とにリパーゼを介在させることで、リパーゼがグリセロールの２位に位置する水酸基と、高度不飽和脂肪酸のカルボキシル基とのエステル結合を優先的に生じさせる。これにより、上述した２−モノグリセリドを合成することができる。
【００２５】
高度不飽和脂肪酸がグリセロールの２位に結合した機能性脂質は、生物に対して生理的活性を与えうる。
【００２６】
なお、グリセロールの２位のほか、１位及び３位に脂肪酸が結合した場合、特異的に１，３−リパーゼ等の酵素で、１位及び３位に結合した脂肪酸を加水分解し、２−モノグリセリドを得てもよい。
【００２７】
また、リパーゼを用いて低温でグリセロールの２位に高度不飽和脂肪酸を結合させた場合、生成するモノグリセリドが析出し、リパーゼ反応の系外に出されるため、２−モノグリセリドを得ることができる。
【００２８】
また、同様の反応において、減圧下で水分量を一定範囲に制限すると、モノグリセリドからジグリセリドを合成する活性が低下するため、２−モノグリセリドを選択的に得ることができる（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ，８２，６１９−６２３，２００５）。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例に基づいて、本実施の形態に係るリパーゼ、及び、これを用いた機能性脂質の合成方法について詳細に説明する。
【００３０】
以下の実施例において、ｍｏｎｏｃａｐｒｙｌｉｎ、ｍｏｎｏｐａｍｉｔｉｎ、ｍｏｎｏｏｌｅｉｎ、ｍｏｎｏｌｉｎｏｌｅｉｎ、ｍｏｎｏｌｉｎｏｌｅｎｉｎは、シグマ−アルドリッチ株式会社製を用いた。ｄｉｃａｐｒｙｌｉｎ、ｄｉｏｌｅｉｎ、ｄｉｌｉｎｏｌｅｉｎは、フナコシ株式会社製を用いた。その他のトリアシルグリセロール及び脂肪酸エステルは、和光純薬株式会社製を用いた。
【００３１】
まず、ＳＡＭ２１９７株を、５０ｍＬの基本培地（０．５％ｇｌｕｃｏｓｅ，１％ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ，０．３％ＫＨ２ＰＯ４，０．１％Ｎａ２ＳＯ４，０．０５％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，０．０５％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．０１％ａｎｔｉｆｏａｍ，ｐＨ７．０）を用い、２８℃、１６０ｒｐｍの条件下で培養した。
【００３２】
培養開始後７２時間後に１％となるようにアマニ油を加えた後、培養上清、菌体内可溶性画分及び膜画分のリパーゼ活性を追跡した。
【００３３】
リパーゼ活性は、以下のように、油水乳濁系で酢酸銅法によって測定した。まず、５％オリーブ油を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１０分間超音波処理した。この乳濁液１ｍＬを、適当な容量（４ｍＬ程度）の培養上清、細胞抽出液或いは精製酵素溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に加えて、３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。反応は、１ｍＬの塩酸と３．５ｍＬのイソオクタンを加え、５分間煮沸することによって停止させた。
【００３４】
遊離脂肪酸を含む上層のイソオクタン相（３．５ｍＬ）を新たな試験管に移し、１ｍＬの５％（ｗ／ｖ）酢酸銅水溶液（ピリジンでｐＨ６．１に調整）を加えてよく混合した。１分間遠心し、上層を新たな試験管に移して、溶媒を蒸発除去した。
【００３５】
脂肪酸は１００μＬのイソオクタンに溶解させ、７１５ｎｍにおける吸光度を測定して、オレイン酸標準物質との比較で、１μｍｏｌｅの脂肪酸が１時間に生成した場合を１Ｕとした。
【００３６】
図１にリパーゼ活性の追跡結果を示す。図１をみると、９６時間後には、培養上清、菌体内可溶性画分及び菌体内膜画分の全ての活性が消失したが、１４４時間後には上清で７５３Ｕ／ｍｌ、菌体可溶性画分で２７６Ｕ／ｍｌの最大活性が得られた。なお、菌体内膜画分には活性がわずかしか検出されなかった。
【００３７】
菌体内リパーゼに着目し、最大活性を示した培養時間に菌体を回収し、リパーゼを精製した。
【００３８】
精製リパーゼは以下のようにして得た。培養６日目（培養開始から１４４時間）の培養物をフィルター（東洋濾紙Ｎｏ．２）で濾過し、菌体と培養上清を得た。
【００３９】
菌体はヘキサンで軽く洗浄して、表面の油脂を除去した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０（以下、ＴＢと記す）に懸濁して、氷上でガラスビーズとともにホモジナイズして破砕した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）により不溶性成分を除去した。
【００４０】
上清を新たな試験管に移し、冷アセトンを５０％となるように加えて４時間冷却し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）により活性成分を沈殿回収した。
【００４１】
培養上清も同様に処理して、沈殿に活性成分を回収した。
【００４２】
これらをＴＢに溶解し、同緩衝液に対して透析した。不溶性物質を遠心分離で除去した後、ＴＢで平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（５ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。０−２Ｍ ＮａＣｌを含むＴＢを用いてグラジエント溶出を行い、活性画分を集めた。
【００４３】
この活性画分を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＴＢで平衡化したｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（１ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、カラムを十分に洗浄した後、０−１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＴＢでグラジエント溶出した。この際に、活性成分はまだ吸着していたので、１−１．５％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を含むＴＢで溶出させた。
【００４４】
集めた活性画分をＴＢに対して透析し、遠心した。その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＨＲ １０／３０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＴＢで溶出した。
【００４５】
なお、精製ステップを表１に示す。精製の各段階において、回収した活性画分以外にはリパーゼ活性は認められなかった。
【表１】
【００４６】
上述のようにして得られた精製リパーゼについてゲル濾過を行った。その結果を図２に示す。図２中、Ｖｏはボイド容積、Ｔｖは全カラム容積、各数値はマーカータンパク質の分子量（ｋＤａ）である。図２をみると、破線で示すＵＶ吸収（２８０ｎｍ）の吸収ピークと一致する活性ピークがボイド画分（＞１，３００ｋＤａ）に認められる。
【００４７】
また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦ；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）解析を行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析は、精製リパーゼ１ｎｇを用い、以下の条件でおこなった。
リニアモード／ポジティブ，
加速電圧＝２５ｋＶ，
ＭＡＬＤＩマトリックス＝２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，
キャリブレーション＝外部
【００４８】
その結果を図３に示す。図３を見ると、マイナーなピークとともに、１０，９６５Ｄａのマスシグナルが認められる。
【００４９】
以上のゲル濾過及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析結果から、精製リパーゼの分子量は約１１ｋＤａであることがわかる。
【００５０】
続いて、精製リパーゼの活性及び安定性におけるｐＨの影響を検証した。
【００５１】
精製リパーゼ（３４μｇ／ｍＬ）の３７°Ｃにおけるリパーゼ活性を、オリーブ油を基質とする各種５０ｍＭ緩衝液（ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ２；ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ３−６；ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ６−７；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８−９；ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ，ｐＨ９−１２）中で、それぞれ測定した。
【００５２】
また、精製リパーゼのｐＨに対する安定性を検証するため、精製リパーゼを上記各緩衝液中で４°Ｃ，２４時間インキュベートした後に、リパーゼ活性を測定した。
【００５３】
その結果を図４に示す。図４をみると、精製リパーゼはｐＨ２−１２の範囲で酵素活性を維持している。また、至適ｐＨは８〜１０であり、特にｐＨ９で最も良好であった。このような幅広いｐＨで活性を維持する特性は、Ｐ．ｃａｓｅｉｃｏｌｕｍ、Ｐ．ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ、Ｐ．ｒｏｕｑｕｅｆｏｒｔｉ、Ｂｙｓｏｏｃｈｌａｍｙｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓａなどのわずかな例を除いては珍しく、ほとんどのリパーゼは酸性側が至適ｐＨである。このことから、精製リパーゼは広範囲のｐＨ条件下で用い得る。また、２４時間インキュベートした後の酵素活性（安定性）についても、上記とほぼ同様の傾向を示し、幅広いｐＨで活性を維持していることがわかる。
【００５４】
続いて、精製リパーゼの活性及び安定性に与える温度の影響を検証した。
【００５５】
精製リパーゼ（３４μｇ／ｍＬ）の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）におけるリパーゼ活性を、オリーブ油を基質として、種々の温度下で測定した。
【００５６】
また、精製リパーゼの温度に対する安定性を検証するため、精製リパーゼを各温度で１時間インキュベートした後、リパーゼ活性を測定した。
【００５７】
図５にその結果を示す。図５をみると、精製リパーゼは、２０−８０°Ｃの反応条件下で活性を維持していた。至適温度は４５〜５５℃であり、５０℃で最も良好な活性を示している。なお、７０°Ｃ以上で１時間以上保持した場合は失活した。これまでのほとんどのリパーゼは４０°Ｃ以下が至適温度であり、５０°Ｃ或いは６０°Ｃ以上ではリパーゼ活性がなかったことからすると、精製リパーゼは特徴的であり、広範囲の温度条件下で使用が可能である。
【００５８】
精製リパーゼの基質特異性を調べるため、異なるアシル鎖長や不飽和結合数の脂肪酸をもつモノアシルグリセロール（以下、ＭＡＧとも記す）、ジアシルグリセロール（以下、ＤＡＧとも記す）、トリアシルグリセロール（以下、ＴＡＧとも記す）、及び、脂肪酸エステルの加水分解活性を測定した。
【００５９】
１ｍＭのトリアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、天然植物油、リン脂質、及び、２ｍＭの脂肪酸メチルエステルに対する加水分解活性を、加水分解によって遊離した遊離脂肪酸を定量することにより行った。なお、それぞれの基質について、３０℃及び５０℃の条件下での活性を測定した。
【００６０】
その結果を図６に示す。３０℃又は５０°Ｃで、或いはその両方で、各種ＭＡＧやＴＡＧに対して活性が認められたが、ＤＡＧに関しては不図示の１，３−ｄｉｃａｐｒｙｌｉｎ、１，３−ｄｉｐａｌｍｉｔｉｎ、１，２−ｄｉｏｌｅｉｎ、１，３−ｄｉｏｌｅｉｎ、１，２−ｄｉｌｉｎｏｌｅｉｎにおいて、いずれの温度でも活性は検出されなかった。
【００６１】
飽和脂肪酸をもつＴＡＧに対して３０°Ｃで活性がなかったのは、基質の融点が低いことから同温度では溶解していないためと考えられる。不飽和脂肪酸の遊離活性はＴＡＧよりもＭＡＧにおいて高く、アシル鎖の不飽和度に依存していた。
【００６２】
なかでも、１−ｍｏｎｏｌｉｎｏｌｅｎｉｎが最も高い値を示した。２−ｍｏｎｏｏｌｅｉｎと２−ｍｏｎｏｌｉｎｏｌｅｉｎは、それぞれ１−ｍｏｎｏｏｌｅｉｎと１−ｍｏｎｏｌｉｎｏｌｅｉｎよりも高い活性を与えた。
【００６３】
一方、それぞれ不図示のｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｌａｕｒａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｐａｌｍｉｔａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｐａｍｉｔｏｌｅａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｓｔｅｒａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｌｉｎｏｌｅａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｌｉｎｏｌｅｎａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏａｔｅなどの脂肪酸メチルエステルに対しては、３０℃及び５０°Ｃにおいて活性が検出されず、ｍｅｔｈｙｌｃａｐｒｙｌａｔｅとｍｅｔｈｙｌｏｌｅａｔｅでは５０°Ｃでのみ検出された。
【００６４】
天然植物油では、キャメリア油（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｏｉｌ）が最も高い活性を与えた。これは不飽和脂肪酸を多く含む（〜８６％ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）ためであると考えられる。
【００６５】
オリーブ油（Ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ）とアマニ油（Ｌｉｎｓｅｅｄ ｏｉｌ）はほとんど差がなかった。興味深いことに、卵黄ホスファチジルコリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）に対して高い活性を示した。これは真菌由来リパーゼでは極めて珍しく、他起源のリパーゼではアシルグリセロールとリン脂質の両方に対して作用することはない。
【００６６】
（アシルグリセロールの加水分解）
オレイン酸のみを持つ種々のアシルグリセロールからのリパーゼ作用による加水分解物について、脂質組成を調べた。
【００６７】
１００ｍｇの各種基質と、１ｍＬの精製リパーゼ（１０Ｕ）と、１ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）とからなる反応液を３０°Ｃで１時間、１７０ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートした。生成物を以下のように分離し、定量した。
【００６８】
脂質の組成はシリカゲルプレート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０；Ｍｅｒｃｋ）を用いた薄層クロマトグラフィーによって同定及び定量した。ＭＡＧ異性体をより良く分離する場合は、プレートを３％シュウ酸に浸して、一晩乾燥したものを用いた。展開溶媒として、それぞれヘキサン／エーテル／酢酸（７０：３０：１，ｖ／ｖ）あるいはクロロホルム／アセトン／酢酸（９６：４：１，ｖ／ｖ）を用いた。脂質は２％硫酸銅／１３％硫酸溶液あるいは５０％硫酸メタノール溶液を噴霧して、１４０°Ｃで加熱することにより可視化した。
【００６９】
その結果を表２に示す。
【表２】
【００７０】
Ｔｒｉｏｌｅｉｎを基質とした場合、１，２−ＤＡＧ及び１，３−ＤＡＧ（それぞれ８．５％及び１．９％）ならびに遊離脂肪酸（ＦＦＡ：Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ）（９．８％）が生成したが、ＭＡＧはなかった。これは、精製リパーゼがＴＡＧの１／３位に対して効率的に作用すること、ならびに、ＤＡＧの加水分解が律速であることを示唆している。
【００７１】
１，２−Ｄｉｏｌｅｉｎ及び１，３−Ｄｉｏｌｅｉｎの加水分解では、Ｔｒｉｏｌｅｉｎで示したような脂肪酸は遊離されず、両ＤＡＧ間での異性化も認められなかった。しかし、１，２−Ｄｉｏｌｅｉｎに限っては、ＴＡＧの生成（４１％）が見られた。
【００７２】
１−Ｍｏｎｏｏｌｅｉｎは２−Ｍｏｎｏｏｌｅｉｎよりもよく加水分解され、脂肪酸遊離量の比はおよそ２：１であった。これは図６に示した結果とほぼ一致した。いずれの場合もＤＡＧは検出されなかったが、２−ｍｏｎｏｏｌｅｉｎの方だけにＴＡＧの生成（２９％）が認められた。
【００７３】
以上の結果は、２−Ｍｏｎｏｏｌｅｉｎから遊離された脂肪酸が２−ＭＡＧに再び取り込まれてＴＡＧを生成したことを示唆している。
【００７４】
（アシルグリセロールの合成）
精製リパーゼを触媒として、グリセロールとオレイン酸からアシルグリセロールの合成を、以下のようにして行った。１．８ｍｌのグリセロール／オレイン酸混合液（７：１，ｖ／ｖ）と０．２ｍｌの精製リパーゼ（２０Ｕ）からなる反応液を、１２０ｍｉｎ，３７°Ｃで振盪しながらインキュベートした。
【００７５】
生成物をクロロホルムで抽出して、薄層クロマトグラフィーで脂質組成の分析を行い、脂質組成の経時変化を追跡した。その結果を図７に示す。
【００７６】
図７を見ると、反応初期では、ほぼ同モル量の１−ＭＡＧ及び２−ＭＡＧが生成したが、１，２−ＤＡＧ及び１，３−ＤＡＧは少量蓄積した後、減少に転じた。１−ＭＡＧは最終的に１４．５％に達した。
【００７７】
一方、ＴＡＧは２−ＭＡＧの減少に対応して増加し、最終的に２２％となった。これは２−ＭＡＧの１，３位への脂肪酸付加によりＴＡＧが増加したものと考えられる。
【００７８】
また、２−ＭＡＧ、１，２−ＤＡＧ、１，３−ＤＡＧ、ＴＡＧの合計組成（２６％）は、１−ＭＡＧの組成（１５％）に対して２倍程度高く、精製リパーゼはグリセロールの２位に脂肪酸を直接付加する活性が高いことを示している。
【００７９】
精製リパーゼは２−ＭＡＧ及び１，２−ＤＡＧを主に経由する生合成経路にて作用しＴＡＧを生成しており、また、グリセロールに対しては、溶媒非存在下でも２位に強く作用するという、極めて特徴的な性質を有しているといえる。そして、精製リパーゼは加水分解よりも合成をより強く促進する傾向がある。このようなことから、機能性を付与するために構造設計して作られる構造脂質の合成にも有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株により生産されたリパーゼは、グリセロールの２位に位置する水酸基と脂肪酸とのエステル結合を優先的に促進させる触媒作用を有する。２位に高度不飽和脂肪酸を有する高い生理機能をもつ機能性脂質の合成が容易になるので、高い生理機能を備える食品や飼料、医薬品等の製造分野での利用が期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規リパーゼ及びこれを用いた機能性脂質の合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含めた後生動物には自身の生理代謝過程に必須であっても、自身では合成できない脂肪酸の分子種がある。ヒトにとっては、高度不飽和脂肪酸が必須脂肪酸であり、自身では合成できない高度不飽和脂肪酸を合成する他の生物を食物として摂取することで補っている。
【０００３】
高度不飽和脂肪酸は、例えば魚油等、動物性油脂に多く存在しており、グリセロールの２位に高度不飽和脂肪酸が結合した油脂が生物に対して生理活性を与えている。この２位に高度不飽和脂肪酸が結合した油脂を工業的に合成することが望まれており、リパーゼ等の酵素を用いて、グリセロールの２位に高度不飽和脂肪酸が結合した油脂を合成することが試みられている。
【０００４】
リパーゼは油脂の分解、合成に作用する酵素として知られており、各種油脂の製造、加工分野では、微生物由来のリパーゼが広く用いられている。しかし、これまで用いられてきたリパーゼは、トリグリセリドがもつ３つの脂肪酸のうち、１位及び３位に特異的に作用するもの、或いは、非特異的に作用するものであった。このため、特に高い生理活性機能を有する高度不飽和脂肪酸の多くが位置する２位を交換・修飾することが困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９８／３９４６８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、グリセロールの２位に対して優先的に触媒作用を有し、２位に高度不飽和脂肪酸を結合させて機能性脂質の合成に資するリパーゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係るリパーゼは、
モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６１）により生産され、グリセロールの２位に対して優先的に触媒作用を有する。
【０００８】
また、分子量が１１ｋＤａであることが望ましい。
【０００９】
また、至適ｐＨが８〜１０であることが望ましい。
【００１０】
また、至適温度が４５〜５５℃であることが望ましい。
【００１１】
また、前記モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株を培養して１２０〜１６８時間後に回収し、精製して得られることが好ましい。
【００１２】
本発明に係る機能性脂質の合成方法は、
グリセロールと高度不飽和脂肪酸とに上記に記載のリパーゼを介在させ、２−モノグリセリドを合成する工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
また、前記高度不飽和脂肪酸としてアラキドン酸（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、エイコサペンタエン酸（Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ)及びジホモ−γ−リノレン酸（Ｄｉｈｏｍｏ−ｇａｍｍａ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）から選択される一種以上を用いることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るリパーゼは、グリセロールと脂肪酸とに介在させることで、グリセロールの２位に優先的に作用する特性を有しており、高い生理機能を有する機能性脂質を合成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】リパーゼ活性の追跡結果を示すグラフである。
【図２】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００によるゲル濾過結果を示すグラフである。
【図３】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析図である。
【図４】リパーゼ活性とｐＨとの関係を示すグラフである。
【図５】リパーゼ活性と温度との関係を示すグラフである。
【図６】リパーゼの基質特異性を示すグラフである。
【図７】アシルグリセロールの合成反応経過を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本実施の形態に係るリパーゼは、糸状菌モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）亜属に属するＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６１）により生産されるリパーゼである。このリパーゼは、トリグリセロール（１，２，３−プロパントリオール）の２位に対し、優先的に触媒作用を発揮する。
【００１７】
また、このリパーゼは、以下の特徴を有する。
分子量：１１ｋＤａ
至適ｐＨ：８〜１０
至適温度：４５〜５５℃
【００１８】
本実施の形態に係るリパーゼは、ＳＡＭ２１９７株を培養することで生産されるが、ＳＡＭ２１９７株の培養は、一例として以下に示す培養条件及び培養方法で行うことができる。
【００１９】
ＳＡＭ２１９７株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた培養液を、液体培地又は固体培地に接種し培養することができる。液体培地の場合、炭素源としてはグルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール、クエン酸、コーンスターチ等の一般的に使用されているものがいずれも使用できるが、特にグルコース、フラクトース、マルトース、グリセロール、クエン酸、コーンスターチが好ましい。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源等の一般的に使用されているものを用いることができる。この他必要に応じて微量栄養源として用いる、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム等のリン酸塩、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅、塩化マグネシウム、塩化カリウム等の無機塩及びビタミン等全て一般的に使用されているものが使用できる。
【００２０】
本実施の形態に係るリパーゼは、ＳＡＭ２１９７株を培地中で培養して１２０〜１６８時間経過後に回収し、精製されていることが好ましい。好ましくは、培養時間が１３２〜１５６時間、より好ましくは１４４時間である。
【００２１】
なお、リパーゼの精製は一例として、以下のようにして行うことができる。培養後、培養物をフィルターで濾過し、菌体と培養上清を得る。菌体はヘキサンで軽く洗浄して、表面の油脂を除去した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０（以下、ＴＢと記す）に懸濁して、氷上でガラスビーズとともにホモジナイズして破砕する。不溶性成分を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）で除去し、その上清を新たな試験管に移し、冷アセトンを５０％となるように加えて４時間冷却し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）により活性成分を沈殿回収する。培養上清も同様に処理して、沈殿に活性成分を回収する。これらをＴＢに溶解させ、同緩衝液に対して透析する。不溶性物質を遠心分離で除去した後、ＴＢで平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（５ｍｌ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかける。０−２Ｍ ＮａＣｌを含むＴＢを用いてグラジエント溶出を行い、活性画分を集める。これを、１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＴＢで平衡化したｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（１ｍｌ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、カラムを十分に洗浄した後、０−１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＴＢでグラジエント溶出する。活性成分がまだ吸着している場合は、１−１．５％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を含むＴＢで溶出させる。集めた活性画分をＴＢに対して透析し、遠心した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＨＲ １０／３０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＴＢで溶出する。このようにしてリパーゼを精製することができる。
【００２２】
（機能性脂質の合成方法）
本実施の形態に係る機能性脂質の合成方法は、上述したリパーゼをグリセロールと脂肪酸とに介在させて２−モノグリセリドを合成する工程を含む。
【００２３】
機能性脂質として、例えば、グリセロールの２位にアラキドン酸（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＡＡ）、エイコサペンタエン酸（Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ；ＤＨＡ)等の高度不飽和脂肪酸が結合した２−モノグリセリドが挙げられる。
【００２４】
グリセロールと上記高度不飽和脂肪酸とにリパーゼを介在させることで、リパーゼがグリセロールの２位に位置する水酸基と、高度不飽和脂肪酸のカルボキシル基とのエステル結合を優先的に生じさせる。これにより、上述した２−モノグリセリドを合成することができる。
【００２５】
高度不飽和脂肪酸がグリセロールの２位に結合した機能性脂質は、生物に対して生理的活性を与えうる。
【００２６】
なお、グリセロールの２位のほか、１位及び３位に脂肪酸が結合した場合、特異的に１，３−リパーゼ等の酵素で、１位及び３位に結合した脂肪酸を加水分解し、２−モノグリセリドを得てもよい。
【００２７】
また、リパーゼを用いて低温でグリセロールの２位に高度不飽和脂肪酸を結合させた場合、生成するモノグリセリドが析出し、リパーゼ反応の系外に出されるため、２−モノグリセリドを得ることができる。
【００２８】
また、同様の反応において、減圧下で水分量を一定範囲に制限すると、モノグリセリドからジグリセリドを合成する活性が低下するため、２−モノグリセリドを選択的に得ることができる（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ，８２，６１９−６２３，２００５）。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例に基づいて、本実施の形態に係るリパーゼ、及び、これを用いた機能性脂質の合成方法について詳細に説明する。
【００３０】
以下の実施例において、ｍｏｎｏｃａｐｒｙｌｉｎ、ｍｏｎｏｐａｍｉｔｉｎ、ｍｏｎｏｏｌｅｉｎ、ｍｏｎｏｌｉｎｏｌｅｉｎ、ｍｏｎｏｌｉｎｏｌｅｎｉｎは、シグマ−アルドリッチ株式会社製を用いた。ｄｉｃａｐｒｙｌｉｎ、ｄｉｏｌｅｉｎ、ｄｉｌｉｎｏｌｅｉｎは、フナコシ株式会社製を用いた。その他のトリアシルグリセロール及び脂肪酸エステルは、和光純薬株式会社製を用いた。
【００３１】
まず、ＳＡＭ２１９７株を、５０ｍＬの基本培地（０．５％ｇｌｕｃｏｓｅ，１％ｓｏｙｂｅａｎ ｐｏｗｄｅｒ，０．３％ＫＨ２ＰＯ４，０．１％Ｎａ２ＳＯ４，０．０５％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，０．０５％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，０．０１％ａｎｔｉｆｏａｍ，ｐＨ７．０）を用い、２８℃、１６０ｒｐｍの条件下で培養した。
【００３２】
培養開始後７２時間後に１％となるようにアマニ油を加えた後、培養上清、菌体内可溶性画分及び膜画分のリパーゼ活性を追跡した。
【００３３】
リパーゼ活性は、以下のように、油水乳濁系で酢酸銅法によって測定した。まず、５％オリーブ油を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１０分間超音波処理した。この乳濁液１ｍＬを、適当な容量（４ｍＬ程度）の培養上清、細胞抽出液或いは精製酵素溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）に加えて、３７℃で１時間振盪しながらインキュベートした。反応は、１ｍＬの塩酸と３．５ｍＬのイソオクタンを加え、５分間煮沸することによって停止させた。
【００３４】
遊離脂肪酸を含む上層のイソオクタン相（３．５ｍＬ）を新たな試験管に移し、１ｍＬの５％（ｗ／ｖ）酢酸銅水溶液（ピリジンでｐＨ６．１に調整）を加えてよく混合した。１分間遠心し、上層を新たな試験管に移して、溶媒を蒸発除去した。
【００３５】
脂肪酸は１００μＬのイソオクタンに溶解させ、７１５ｎｍにおける吸光度を測定して、オレイン酸標準物質との比較で、１μｍｏｌｅの脂肪酸が１時間に生成した場合を１Ｕとした。
【００３６】
図１にリパーゼ活性の追跡結果を示す。図１をみると、９６時間後には、培養上清、菌体内可溶性画分及び菌体内膜画分の全ての活性が消失したが、１４４時間後には上清で７５３Ｕ／ｍｌ、菌体可溶性画分で２７６Ｕ／ｍｌの最大活性が得られた。なお、菌体内膜画分には活性がわずかしか検出されなかった。
【００３７】
菌体内リパーゼに着目し、最大活性を示した培養時間に菌体を回収し、リパーゼを精製した。
【００３８】
精製リパーゼは以下のようにして得た。培養６日目（培養開始から１４４時間）の培養物をフィルター（東洋濾紙Ｎｏ．２）で濾過し、菌体と培養上清を得た。
【００３９】
菌体はヘキサンで軽く洗浄して、表面の油脂を除去した後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０（以下、ＴＢと記す）に懸濁して、氷上でガラスビーズとともにホモジナイズして破砕した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）により不溶性成分を除去した。
【００４０】
上清を新たな試験管に移し、冷アセトンを５０％となるように加えて４時間冷却し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）により活性成分を沈殿回収した。
【００４１】
培養上清も同様に処理して、沈殿に活性成分を回収した。
【００４２】
これらをＴＢに溶解し、同緩衝液に対して透析した。不溶性物質を遠心分離で除去した後、ＴＢで平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（５ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。０−２Ｍ ＮａＣｌを含むＴＢを用いてグラジエント溶出を行い、活性画分を集めた。
【００４３】
この活性画分を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＴＢで平衡化したｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（１ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、カラムを十分に洗浄した後、０−１Ｍ硫酸アンモニウムを含むＴＢでグラジエント溶出した。この際に、活性成分はまだ吸着していたので、１−１．５％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）を含むＴＢで溶出させた。
【００４４】
集めた活性画分をＴＢに対して透析し、遠心した。その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＨＲ １０／３０，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含むＴＢで溶出した。
【００４５】
なお、精製ステップを表１に示す。精製の各段階において、回収した活性画分以外にはリパーゼ活性は認められなかった。
【表１】
【００４６】
上述のようにして得られた精製リパーゼについてゲル濾過を行った。その結果を図２に示す。図２中、Ｖｏはボイド容積、Ｔｖは全カラム容積、各数値はマーカータンパク質の分子量（ｋＤａ）である。図２をみると、破線で示すＵＶ吸収（２８０ｎｍ）の吸収ピークと一致する活性ピークがボイド画分（＞１，３００ｋＤａ）に認められる。
【００４７】
また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦ；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）解析を行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析は、精製リパーゼ１ｎｇを用い、以下の条件でおこなった。
リニアモード／ポジティブ，
加速電圧＝２５ｋＶ，
ＭＡＬＤＩマトリックス＝２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ，
キャリブレーション＝外部
【００４８】
その結果を図３に示す。図３を見ると、マイナーなピークとともに、１０，９６５Ｄａのマスシグナルが認められる。
【００４９】
以上のゲル濾過及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ解析結果から、精製リパーゼの分子量は約１１ｋＤａであることがわかる。
【００５０】
続いて、精製リパーゼの活性及び安定性におけるｐＨの影響を検証した。
【００５１】
精製リパーゼ（３４μｇ／ｍＬ）の３７°Ｃにおけるリパーゼ活性を、オリーブ油を基質とする各種５０ｍＭ緩衝液（ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ２；ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ３−６；ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ６−７；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８−９；ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ，ｐＨ９−１２）中で、それぞれ測定した。
【００５２】
また、精製リパーゼのｐＨに対する安定性を検証するため、精製リパーゼを上記各緩衝液中で４°Ｃ，２４時間インキュベートした後に、リパーゼ活性を測定した。
【００５３】
その結果を図４に示す。図４をみると、精製リパーゼはｐＨ２−１２の範囲で酵素活性を維持している。また、至適ｐＨは８〜１０であり、特にｐＨ９で最も良好であった。このような幅広いｐＨで活性を維持する特性は、Ｐ．ｃａｓｅｉｃｏｌｕｍ、Ｐ．ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ、Ｐ．ｒｏｕｑｕｅｆｏｒｔｉ、Ｂｙｓｏｏｃｈｌａｍｙｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓａなどのわずかな例を除いては珍しく、ほとんどのリパーゼは酸性側が至適ｐＨである。このことから、精製リパーゼは広範囲のｐＨ条件下で用い得る。また、２４時間インキュベートした後の酵素活性（安定性）についても、上記とほぼ同様の傾向を示し、幅広いｐＨで活性を維持していることがわかる。
【００５４】
続いて、精製リパーゼの活性及び安定性に与える温度の影響を検証した。
【００５５】
精製リパーゼ（３４μｇ／ｍＬ）の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）におけるリパーゼ活性を、オリーブ油を基質として、種々の温度下で測定した。
【００５６】
また、精製リパーゼの温度に対する安定性を検証するため、精製リパーゼを各温度で１時間インキュベートした後、リパーゼ活性を測定した。
【００５７】
図５にその結果を示す。図５をみると、精製リパーゼは、２０−８０°Ｃの反応条件下で活性を維持していた。至適温度は４５〜５５℃であり、５０℃で最も良好な活性を示している。なお、７０°Ｃ以上で１時間以上保持した場合は失活した。これまでのほとんどのリパーゼは４０°Ｃ以下が至適温度であり、５０°Ｃ或いは６０°Ｃ以上ではリパーゼ活性がなかったことからすると、精製リパーゼは特徴的であり、広範囲の温度条件下で使用が可能である。
【００５８】
精製リパーゼの基質特異性を調べるため、異なるアシル鎖長や不飽和結合数の脂肪酸をもつモノアシルグリセロール（以下、ＭＡＧとも記す）、ジアシルグリセロール（以下、ＤＡＧとも記す）、トリアシルグリセロール（以下、ＴＡＧとも記す）、及び、脂肪酸エステルの加水分解活性を測定した。
【００５９】
１ｍＭのトリアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、天然植物油、リン脂質、及び、２ｍＭの脂肪酸メチルエステルに対する加水分解活性を、加水分解によって遊離した遊離脂肪酸を定量することにより行った。なお、それぞれの基質について、３０℃及び５０℃の条件下での活性を測定した。
【００６０】
その結果を図６に示す。３０℃又は５０°Ｃで、或いはその両方で、各種ＭＡＧやＴＡＧに対して活性が認められたが、ＤＡＧに関しては不図示の１，３−ｄｉｃａｐｒｙｌｉｎ、１，３−ｄｉｐａｌｍｉｔｉｎ、１，２−ｄｉｏｌｅｉｎ、１，３−ｄｉｏｌｅｉｎ、１，２−ｄｉｌｉｎｏｌｅｉｎにおいて、いずれの温度でも活性は検出されなかった。
【００６１】
飽和脂肪酸をもつＴＡＧに対して３０°Ｃで活性がなかったのは、基質の融点が低いことから同温度では溶解していないためと考えられる。不飽和脂肪酸の遊離活性はＴＡＧよりもＭＡＧにおいて高く、アシル鎖の不飽和度に依存していた。
【００６２】
なかでも、１−ｍｏｎｏｌｉｎｏｌｅｎｉｎが最も高い値を示した。２−ｍｏｎｏｏｌｅｉｎと２−ｍｏｎｏｌｉｎｏｌｅｉｎは、それぞれ１−ｍｏｎｏｏｌｅｉｎと１−ｍｏｎｏｌｉｎｏｌｅｉｎよりも高い活性を与えた。
【００６３】
一方、それぞれ不図示のｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｌａｕｒａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｐａｌｍｉｔａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｐａｍｉｔｏｌｅａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｓｔｅｒａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｌｉｎｏｌｅａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｌｉｎｏｌｅｎａｔｅ、ｍｅｔｈｙｌｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏａｔｅなどの脂肪酸メチルエステルに対しては、３０℃及び５０°Ｃにおいて活性が検出されず、ｍｅｔｈｙｌｃａｐｒｙｌａｔｅとｍｅｔｈｙｌｏｌｅａｔｅでは５０°Ｃでのみ検出された。
【００６４】
天然植物油では、キャメリア油（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｏｉｌ）が最も高い活性を与えた。これは不飽和脂肪酸を多く含む（〜８６％ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）ためであると考えられる。
【００６５】
オリーブ油（Ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ）とアマニ油（Ｌｉｎｓｅｅｄ ｏｉｌ）はほとんど差がなかった。興味深いことに、卵黄ホスファチジルコリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）に対して高い活性を示した。これは真菌由来リパーゼでは極めて珍しく、他起源のリパーゼではアシルグリセロールとリン脂質の両方に対して作用することはない。
【００６６】
（アシルグリセロールの加水分解）
オレイン酸のみを持つ種々のアシルグリセロールからのリパーゼ作用による加水分解物について、脂質組成を調べた。
【００６７】
１００ｍｇの各種基質と、１ｍＬの精製リパーゼ（１０Ｕ）と、１ｍＬの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）とからなる反応液を３０°Ｃで１時間、１７０ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートした。生成物を以下のように分離し、定量した。
【００６８】
脂質の組成はシリカゲルプレート（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０；Ｍｅｒｃｋ）を用いた薄層クロマトグラフィーによって同定及び定量した。ＭＡＧ異性体をより良く分離する場合は、プレートを３％シュウ酸に浸して、一晩乾燥したものを用いた。展開溶媒として、それぞれヘキサン／エーテル／酢酸（７０：３０：１，ｖ／ｖ）あるいはクロロホルム／アセトン／酢酸（９６：４：１，ｖ／ｖ）を用いた。脂質は２％硫酸銅／１３％硫酸溶液あるいは５０％硫酸メタノール溶液を噴霧して、１４０°Ｃで加熱することにより可視化した。
【００６９】
その結果を表２に示す。
【表２】
【００７０】
Ｔｒｉｏｌｅｉｎを基質とした場合、１，２−ＤＡＧ及び１，３−ＤＡＧ（それぞれ８．５％及び１．９％）ならびに遊離脂肪酸（ＦＦＡ：Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ）（９．８％）が生成したが、ＭＡＧはなかった。これは、精製リパーゼがＴＡＧの１／３位に対して効率的に作用すること、ならびに、ＤＡＧの加水分解が律速であることを示唆している。
【００７１】
１，２−Ｄｉｏｌｅｉｎ及び１，３−Ｄｉｏｌｅｉｎの加水分解では、Ｔｒｉｏｌｅｉｎで示したような脂肪酸は遊離されず、両ＤＡＧ間での異性化も認められなかった。しかし、１，２−Ｄｉｏｌｅｉｎに限っては、ＴＡＧの生成（４１％）が見られた。
【００７２】
１−Ｍｏｎｏｏｌｅｉｎは２−Ｍｏｎｏｏｌｅｉｎよりもよく加水分解され、脂肪酸遊離量の比はおよそ２：１であった。これは図６に示した結果とほぼ一致した。いずれの場合もＤＡＧは検出されなかったが、２−ｍｏｎｏｏｌｅｉｎの方だけにＴＡＧの生成（２９％）が認められた。
【００７３】
以上の結果は、２−Ｍｏｎｏｏｌｅｉｎから遊離された脂肪酸が２−ＭＡＧに再び取り込まれてＴＡＧを生成したことを示唆している。
【００７４】
（アシルグリセロールの合成）
精製リパーゼを触媒として、グリセロールとオレイン酸からアシルグリセロールの合成を、以下のようにして行った。１．８ｍｌのグリセロール／オレイン酸混合液（７：１，ｖ／ｖ）と０．２ｍｌの精製リパーゼ（２０Ｕ）からなる反応液を、１２０ｍｉｎ，３７°Ｃで振盪しながらインキュベートした。
【００７５】
生成物をクロロホルムで抽出して、薄層クロマトグラフィーで脂質組成の分析を行い、脂質組成の経時変化を追跡した。その結果を図７に示す。
【００７６】
図７を見ると、反応初期では、ほぼ同モル量の１−ＭＡＧ及び２−ＭＡＧが生成したが、１，２−ＤＡＧ及び１，３−ＤＡＧは少量蓄積した後、減少に転じた。１−ＭＡＧは最終的に１４．５％に達した。
【００７７】
一方、ＴＡＧは２−ＭＡＧの減少に対応して増加し、最終的に２２％となった。これは２−ＭＡＧの１，３位への脂肪酸付加によりＴＡＧが増加したものと考えられる。
【００７８】
また、２−ＭＡＧ、１，２−ＤＡＧ、１，３−ＤＡＧ、ＴＡＧの合計組成（２６％）は、１−ＭＡＧの組成（１５％）に対して２倍程度高く、精製リパーゼはグリセロールの２位に脂肪酸を直接付加する活性が高いことを示している。
【００７９】
精製リパーゼは２−ＭＡＧ及び１，２−ＤＡＧを主に経由する生合成経路にて作用しＴＡＧを生成しており、また、グリセロールに対しては、溶媒非存在下でも２位に強く作用するという、極めて特徴的な性質を有しているといえる。そして、精製リパーゼは加水分解よりも合成をより強く促進する傾向がある。このようなことから、機能性を付与するために構造設計して作られる構造脂質の合成にも有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株により生産されたリパーゼは、グリセロールの２位に位置する水酸基と脂肪酸とのエステル結合を優先的に促進させる触媒作用を有する。２位に高度不飽和脂肪酸を有する高い生理機能をもつ機能性脂質の合成が容易になるので、高い生理機能を備える食品や飼料、医薬品等の製造分野での利用が期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６１）により生産され、グリセロールの２位に対して優先的に触媒作用を有するリパーゼ。
【請求項２】
分子量が１１ｋＤａである請求項１に記載のリパーゼ。
【請求項３】
至適ｐＨが８〜１０である請求項１又は２に記載のリパーゼ。
【請求項４】
至適温度が４５〜５５℃である請求項１乃至３のいずれか一項に記載のリパーゼ。
【請求項５】
前記モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株を培養して１２０〜１６８時間後に回収し、精製して得られた請求項１乃至４のいずれか一項に記載のリパーゼ。
【請求項６】
グリセロールと高度不飽和脂肪酸とに請求項１乃至５のいずれか一項に記載のリパーゼを介在させ、２−モノグリセリドを合成する工程を含む機能性脂質の合成方法。
【請求項７】
前記高度不飽和脂肪酸としてアラキドン酸（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、エイコサペンタエン酸（Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ)及びジホモ−γ−リノレン酸（Ｄｉｈｏｍｏ−ｇａｍｍａ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）から選択される一種以上を用いることを特徴とする請求項６に記載の機能性脂質の合成方法。
【請求項１】
モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６１）により生産され、グリセロールの２位に対して優先的に触媒作用を有するリパーゼ。
【請求項２】
分子量が１１ｋＤａである請求項１に記載のリパーゼ。
【請求項３】
至適ｐＨが８〜１０である請求項１又は２に記載のリパーゼ。
【請求項４】
至適温度が４５〜５５℃である請求項１乃至３のいずれか一項に記載のリパーゼ。
【請求項５】
前記モルティエレラ属ＳＡＭ２１９７株を培養して１２０〜１６８時間後に回収し、精製して得られた請求項１乃至４のいずれか一項に記載のリパーゼ。
【請求項６】
グリセロールと高度不飽和脂肪酸とに請求項１乃至５のいずれか一項に記載のリパーゼを介在させ、２−モノグリセリドを合成する工程を含む機能性脂質の合成方法。
【請求項７】
前記高度不飽和脂肪酸としてアラキドン酸（Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、エイコサペンタエン酸（Ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ドコサヘキサエン酸（Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ)及びジホモ−γ−リノレン酸（Ｄｉｈｏｍｏ−ｇａｍｍａ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）から選択される一種以上を用いることを特徴とする請求項６に記載の機能性脂質の合成方法。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図７】
【図３】
【図６】
【図２】
【図４】
【図５】
【図７】
【図３】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−２３４６９２（Ｐ２０１１−２３４６９２Ａ）
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１０６８４（Ｐ２０１０−１１０６８４）
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月２４日（２０１１．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]