新規乳酸菌株および当該菌株によるサイレージ好気的変敗の抑制法
【課題】 サイレージの好気的変敗を抑制できる乳酸菌を分離・選抜し、当該乳酸菌をサイレージの調製に利用して、サイレージの安全性と利用性を高める技術を提供すること。
【解決手段】 低ｐＨ耐性と酢酸生成能に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス属乳酸菌（Lactobacillus sp．）、ＴＭ１株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３９）、及び低ｐＨ耐性と高温耐性に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有する乳酸菌、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）ＴＭ２株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１４０）；前記乳酸菌を含有するサイレージ調製用微生物製剤；前記乳酸菌もしくは請求項３記載の微生物製剤を材料草に添加することを特徴とするサイレージの調製方法。
【解決手段】 低ｐＨ耐性と酢酸生成能に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス属乳酸菌（Lactobacillus sp．）、ＴＭ１株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３９）、及び低ｐＨ耐性と高温耐性に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有する乳酸菌、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）ＴＭ２株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１４０）；前記乳酸菌を含有するサイレージ調製用微生物製剤；前記乳酸菌もしくは請求項３記載の微生物製剤を材料草に添加することを特徴とするサイレージの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規乳酸菌株および当該菌株によるサイレージ好気的変敗の抑制法に関し、詳しくは、サイレージの好気的変敗を効率的に抑制できる新規乳酸菌株、該菌株を含有するサイレージ用微生物製剤、並びに該製剤を用いるサイレージの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
家畜生産においては、牧草・飼料作物などの飼料が年間を通じて平準的に供給されることが要求されるが、植物の生長には季節性があることから、収穫された牧草・飼料作物を安定的に長期保存することが畜産業を安定的に発展させるために不可欠である。
収穫された牧草・飼料作物を長期保存するための方法の一つであるサイレージは、乾草としての乾燥保存と比べ、生草のまま栄養分の損失が少なく、天候にも支配されず、現在最も広く利用されている保存方法である。サイレージの発酵品質を改善するために、従来から多くの技術が開発されてきた。
【０００３】
サイレージの問題点として、サイロ開封後にサイレージ取り出し表面が長時間好気的状態になると、変敗が生じる現象（好気的変敗）がある（非特許文献１参照）。好気的変敗が起こると、サイレージは栄養価が低下し、家畜の摂取量が減少し、ひいては家畜健康の悪化、材料の完全廃棄など、畜産業において重大な損失が生じる。
好気的変敗の問題は、大型サイロでサイレージを保存する場合に特に深刻である。また、トウモロコシサイレージや低水分グラスサイレージ等は、発酵品質の良いものが得られやすいが、やはり開封後に好気的変敗が起こりやすい。
そこで、好気的変敗を防止するための手段の開発が進んでいる。例えば、プロピオン酸、プロピオン酸アンモニウム、四ギ酸アンモニウム、ギ酸カルシウム複合剤などの化学試薬は、好気的変敗の抑制に有効であることが知られている（非特許文献１参照）。しかし、これらの試薬はコストが高く、また、化学物質であるため家畜や人間に対する安全性の面で問題があり、取り扱いにあたり困難が伴うという問題もあった。
一方、乳酸菌の一種であるラクトバチルス・ブーケンライ（Lactobacillus buchneri）を用いて好気的変敗を防止する方法が開発された（非特許文献２参照）。しかしながら、この乳酸菌は高温条件における生育性が弱く、好気的変敗を抑制できない場合もあると指摘されている。
したがって、サイレージの利用性をより高めるため、実際の貯蔵環境や利用条件に合わせて好気的変敗を抑制できる菌剤の開発が要求されている。
【０００４】
【非特許文献１】内田 仙二編、サイレージ科学の進歩、デーリィ・ジャパン社、ｐｐ．１０６−１１２
【非特許文献２】大下 友子、飼料の好気的変敗とその防止対策、酪農ジャーナル２００１、６、１４−１６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記した従来の問題点を解消し、サイレージの好気的変敗を抑制できる乳酸菌を分離・選抜し、当該乳酸菌をサイレージの調製に利用して、サイレージの安全性と利用性を高める技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以上の課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた。すなわち、牧草・飼料作物およびサイレージから分離・培養した多数の乳酸菌株について、生理的、生化学的性状、糖発酵試験、およびサイレージの調製適性試験を行うことにより選抜した。さらに、既存乳酸菌基準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列との相同性を比較検討し、種の同定を行った。
その結果、ヘテロ発酵型乳酸菌で、低ｐＨ耐性と酢酸生成能に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株と同定した。同様に、ヘテロ発酵型乳酸菌で、低ｐＨ耐性と高温耐性に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有する乳酸菌、ラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株と同定した。
さらに、上記乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株をサイレージ材料草に添加すると、サイロ開封後にサイレージの温度上昇が抑制されると共に、好気的変敗による損失が少なく、また嗜好性にも優れるサイレージを調製できることを見出した。
本発明は係る知見に基づくものである。
【０００７】
請求項１記載の本発明は、低ｐＨ耐性と酢酸生成能に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス属乳酸菌（Lactobacillus sp.）、ＴＭ１株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３９）である。
請求項２記載の本発明は、低ｐＨ耐性と高温耐性に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有する乳酸菌、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）ＴＭ２株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１４０）である。
請求項３記載の本発明は、請求項１および／または２記載の乳酸菌を含有するサイレージ調製用微生物製剤である。
請求項４記載の本発明は、請求項１および／または２記載の乳酸菌、もしくは請求項３記載の微生物製剤を材料草に添加することを特徴とするサイレージの調製方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、サイレージ中において、好気的変敗の原因となる酵母の増殖を顕著に抑制し、好気的条件下における品質の安定性に優れたサイレージを作るために有用な乳酸菌、およびこれを含有するサイレージ調製用微生物製剤が提供される。
また、本発明によれば、上記乳酸菌あるいは製剤を材料草に添加することにより、サイロ開封後にも好気的変敗の原因となる酵母の増殖がほとんどないサイレージの調製が可能である。得られるサイレージは、好気的条件下における変敗が顕著に抑制され、栄養の過損失や有毒物質の産生の心配がなく、安全性の高いものとなる。また、嗜好性も改善され、家畜の成長増進を図り、もって畜産業の発展に寄与するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明について詳しく説明する。
本発明に係る乳酸菌は、請求項１に記載するように、低ｐＨ耐性と酢酸生成能に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス属乳酸菌（Lactobacillus sp．）、ＴＭ１株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３９）と、請求項２に記載するように、低ｐＨ耐性と高温耐性に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有する乳酸菌、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ＴＭ２株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１４０）である。
【００１０】
このような本発明に係る乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株は、本発明者らが牧草・飼料作物およびサイレージから分離・培養した多数の乳酸菌株について、生理的、生化学的性状、及び糖発酵試験を行うことにより選抜されたものである。
尚、サイレージからの乳酸菌の分離・培養には、Lactobacilli MRS培地（DIFCO Laboratories，Detroit，USA）、ＧＹＰ白亜寒天培地（小崎ら、「乳酸菌実験マニュアル」、１９９２）等の乳酸菌用培地を利用することができる。
【００１１】
本発明に係るラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株は、低ｐＨ耐性と酢酸生成能に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有し、その一方でサイレージの品質上望ましくない酪酸の生成を抑制することができる。
ここで、低ｐＨ耐性とは、ｐＨ４．０以下において耐性を有する、すなわち生育可能であることを意味する。また、酢酸生成能に優れるとは、例えば、ＴＭ１株の添加が無添加よりサイレージ中の酢酸生成量を倍以上に高める能力を有していることを意味する。さらに、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母としては、Candida属、Cryptococcus属、Hansenula属、Pichia属、Saccharomyces属等の酵母を挙げることができる。
【００１２】
また、本発明に係るラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株は、低ｐＨ耐性と高温耐性が優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有し、その一方でサイレージの品質上望ましくない酪酸の生成を抑制することができる。
ここで、低ｐＨ耐性、および酵母に関しては、ＴＭ１株について上述したとおりである。高温耐性に優れるとは、２５〜３７℃、好ましくは、４５℃の温度下において耐性を有する、すなわち生育可能であることを意味する。
【００１３】
さらに、本発明に係る乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株は、いずれもヘテロ発酵型乳酸菌であるので、ホモ発酵型乳酸菌と比べサイレージの発酵損失を若干増加させる。しかしながら、上述したようにサイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有する等の諸特性を有することから、サイレージ開封後の好気的変敗による損失を顕著に低下させるため、全体的な損失を減少させることができる。
【００１４】
本発明に係るラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株は、グラム陽性及びカタラーゼ陰性を示すと共に、桿菌であることから、ラクトバチルス属であると判断したものの、その１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関し、ラクトバチルス属の既知乳酸菌のそれと比較すると相同性が低い（９７％以下）。そこで、本発明者らは、ラクトバチルス属であると同定した。
一方、本発明に係るラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株は、その１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関し、ラクトバチルス・ブレビス基準株のそれと９９．９％の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の相同性を示したため、本発明者らによりラクトバチルス・ブレビスの一種であると同定された。
【００１５】
上述した本発明に係るＴＭ１株およびＴＭ２株の生理的・生化学的性質は、近年サイレージ好気的変敗の防止に用いられているラクトバチルス・ブーケンライ（L．buchneri）とは明らかに相違し、その他、糖発酵特性、サイレージの品質等の点でも明らかに異なることが明らかである。この点は、実施例において証明されている。
【００１６】
このような、請求項１に係る本発明のラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株、および請求項２に係る本発明の乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＴＭ１株がＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３９であり、ＴＭ２株がＦＥＲＭ ＡＰ−２０１４０である。
【００１７】
このような優れた特徴を有する本発明に係る乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株は、請求項４に記載するように、それぞれ、あるいは両方をサイレージの調製に利用することができる。
サイレージの材料草としては、トウモロコシ、イタリアンライグラス等を挙げることができる。材料草の水分含量は特に限定されず、予乾させたものでも良いし、高水分のものであっても良い。
材料草への本発明に係る乳酸菌ＴＭ１株および／またはＴＭ２株の添加量としては、材料草１ｇあたり１．０×１０５〜１．０×１０６ｃｆｕ（ｃｆｕ：cell forming unit）とすることができる。また、ＴＭ１株およびＴＭ２株の両方を用いる場合、上記添加量の範囲で両者の配合割合を適宜定めることができる。
サイロは、バッグサイロ、バンカーサイロ、地下サイロなど、特に限定されない。
調製されたサイレージは、開封状態で発熱が抑制されると共に、５日間以上保存することができる。また、高水分の材料草を用いるなど発酵条件が悪い場合に得られたサイレージであっても、発酵品質に優れ、嗜好性も向上させることができる。
【００１８】
このような本発明の乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株は、適宜製剤化して、請求項３に記載されるサイレージ調製用微生物製剤とすることができる。本発明のサイレージ調製用微生物製剤は、上記乳酸菌ＴＭ１株および／またはＴＭ２株を含有するものであれば、保存料、賦形剤等公知の成分を含んでいても良い。また、ラクトバチルス・プランタルム等の乳酸菌をはじめとする他の微生物や繊維分解酵素などを含むものであっても良い。剤形についても、粉剤、粒剤、液剤など任意とすることができる。
この微生物製剤も、本発明の乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株の場合と同様、サイレージの調製に利用することができ、その場合の条件は、上記ＴＭ１株およびＴＭ２株を直接利用する場合に準じるものとすることができる。
【実施例】
【００１９】
以下に、実施例により本発明を詳しく説明する。
実施例１〔ＴＭ１株およびＴＭ２株の分離、各菌株の諸特性の解析〕
独立行政法人 農業・生物系特定産業技術研究機構 畜産草地研究所やその周辺の酪農家から採取したイタリアンライグラス、オーチャードグラス、スーダングラスおよびトウモロコシなどの原材料ならびにサイレージ２０ｇずつを秤り、滅菌サンプルバッグ（Fisher Scientific，Canada）に入れ、滅菌した生理食塩水１８０ｍｌを加えて１０−1倍希釈液とした後、この液をさらに１０−８倍まで希釈した。この希釈液０．１ｍｌを乳酸菌用培地Lactobacilli ＭＲＳ寒天培地（DIFCO Laboratories，Detroit，USA）に塗布して、嫌気培養装置（ヒラサワ（株）製）にて、３７℃で２日間嫌気培養した。
【００２０】
培養物から分離した乳酸菌株について、グラム染色、カタラーゼ反応およびガス発生に関する試験を行った。
グラム染色陽性及びカタラーゼ反応陰性であり、ガス生成があり、低ｐＨ耐性や高温耐性に優れている菌株を選択して、生理的・生化学的性状、糖分解性状の解析を行うと共に、トウモロコシ材料に実際に添加して、サイレージの調製適性試験を行った。
比較のため、市販剤（パイオニアサイレージ調製用乳酸菌１１Ａ４４、パイオニア ハイブレッド社）から、上記のLactobacilli ＭＲＳ寒天培地によりラクトバチルス・ブーケンライを分離し、同様に試験を行った。
【００２１】
これらの結果に基づいて、ヘテロ発酵型乳酸菌で、低ｐＨ耐性と酢酸生成能力が優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株と、同様に、ヘテロ発酵型乳酸菌で、低ｐＨ耐性と高温耐性に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス・ブレビス ＴＭ２株を選抜した。
各乳酸菌株の特性を表１に示した。
【００２２】
【表１】
【００２３】
表１から明らかなように、ラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株は、ヘテロ発酵型乳酸菌であり、ｐＨ３．８という低ｐＨ条件で生育可能であった。また、ラクトバチルス・ブーケンライと比べ、ＴＭ１株はＭＲＳ液体培地において乳酸を比較的多量に生成し、培地のｐＨもより低下させた。
そして、ラクトバチルス・ブーケンライは４５℃で生育しなかったのに対し、ラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株は十分に生育可能であった。また、ＴＭ２株は、ヘテロ発酵型乳酸菌であり、ｐＨ３．８という低ｐＨ条件で生育可能であった点については、ＴＭ１株と同様であった。
一方、各菌株の糖分解性状を表２及び表３に示した。
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
表２及び表３の結果から、ＴＭ１株については、メリビオース、ラフィノースであり、また、ＴＭ２株については、リボース、ラクトースであるという糖発酵特性を有していることが明らかとなった。また、ＴＭ１株およびＴＭ２株の糖発酵特性は、互いに異なると共に、ラクトバチルス・ブーケンライのそれと比較しても異なることが明らかであった。
また、表１、表２及び表３の結果から、ＴＭ１株およびＴＭ２株は、サイレージ調製用微生物製剤として適していることが分かる。
【００２７】
次に、両菌株の全領域の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析を行った。
その結果、ＴＭ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、ラクトバチルス属の菌種のそれと比較して相同性が９５％以上であったことから、ラクトバチルス属の菌株であることが判明した。
そして、ＴＭ２株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、基準株であるラクトバチルス・ブレビスのものと９９．９％の相同性を示したことから、ラクトバチルス・ブレビスの一種であると同定された。
本実施例で同定されたラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株、および請求項２に係る本発明の乳酸菌ラクトバチルス・ブレビス ＴＭ２株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＴＭ１株がＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３９であり、ＴＭ２株がＦＥＲＭ ＡＰ−２０１４０である。
【００２８】
実施例２〔トウモロコシサイレージの好気的変敗に対する影響〕
実施例１で得られたラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株およびラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株のそれぞれを、トウモロコシサイレージに添加した場合に及ぼす影響を解析した。
すなわち、約１ｃｍの細断トウモロコシ（クミアイデント１１３）を供試し、上記２菌株のいずれかを添加して、パウチサイロ（飛龍Ｎ１１、旭化成（株）製）を用いてトウモロコシサイレージの調製を行った。
乳酸菌のトウモロコシ材料への添加は、各菌株を、Lactobacilli ＭＲＳ液体培地（DIFCO Laboratories，Detroit，USA）に接種して３０℃で１６時間培養して得られる各培養液を、トウモロコシ材料１ｇあたりの乳酸菌が約１．０×１０６ｃｆｕ（ｃｆｕ：cell forming unit）となるように調製して行った。添加後、脱気・密封（業務用卓上バキュームシーラー、シャープ（株）製）した後、室温で保存した。
一方、市販剤の乾燥粉末（パイオニアサイレージ調製用乳酸菌１１Ａ４４、パイオニア ハイブレッド社）を滅菌水に１００倍に溶かしたものを、乳酸菌の代わりに添加して同様に保存した。
更に、対照として、乳酸菌や市販剤を添加しないで同様に調製・保存した。
【００２９】
５ヶ月後にパウチサイロを開封し、トウモロコシサイレージ中の微生物組成、発酵品質、好気的安定性および貯蔵中と開封後の乾物損失率を調べた。
一方、対照として、乳酸菌や市販剤を添加しないで同様に分析を行った。
表４にトウモロコシサイレージの分析結果を示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】
表４から明らかなように、対照（無添加）のトウモロコシサイレージには酵母が３．２×１０４ｃｆｕ／ｇ原物生存していたのに対し、ＴＭ１株およびＴＭ２株のいずれを添加した場合も、サイレージから酵母は検出されなかった。また、ＴＭ１株を添加した場合には、市販剤を添加した場合と同様にｐＨの若干の上昇が見られたが、サイレージに望ましくない酪酸の生成はほとんど認められず、代わりに酢酸を多量に生成していた。
【００３２】
一方、各トウモロコシサイレージを好気的状態においてから（すなわち、パウチサイロを開封した直後から）１２０時間経過後までの間における温度の経時的変化を図１に示す。
図１から明らかなように、対照（無添加）のトウモロコシサイレージでは、２４時間経過後に温度の上昇が認められたことから、好気的変敗が起きているものと考えられた。
一方、ＴＭ１株やＴＭ２株を添加した場合は、温度上昇の遅延効果が顕著であり、特にＴＭ１株の場合は、開封から１２０時間経っても温度上昇がほとんど認められなかったことから、好気的変敗が顕著に抑制されていることが明らかとなった。
【００３３】
次に、各トウモロコシサイレージの貯蔵損失（５ヶ月間）と開封後に好気的状態においてから４８時間経過後の変敗損失を測定した。
すなわち、貯蔵損失とは、植物細胞の残余呼吸や微生物の発酵などによるサイレージ貯蔵中の乾物損失（％）を意味し、貯蔵前の乾物量と開封時の乾物量を測定して算出した。また、変敗損失とは、サイロ開封後の好気的変敗による乾物損失（％）を意味し、開封時の乾物量と好気的状態においてからの乾物量を測定して算出した。
各トウモロコシサイレージの貯蔵損失と変敗損失を、図２に示す。
【００３４】
図２から明らかなように、ＴＭ１株やＴＭ２株を添加したトウモロコシサイレージは、対照（無添加）や市販剤を添加したものと比較して、貯蔵損失が近いレベルであったが、変敗損失が著しく低下したため、サイレージの総乾物損失（貯蔵損失＋変敗損失）を顕著に減少させたことが明らかである。
尚、総乾物損失に関しては、好気的状態においた時間が短い場合には、ＴＭ２株を添加したトウモロコシサイレージが最も優れていた。一方、好気的状態においた時間が長い場合では、ＴＭ１株を添加したトウモロコシサイレージが最も優れていた。
【００３５】
実施例３〔予乾イタリアンライグラスサイレージの好気的変敗に対する影響〕
実施例１で得られたラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株およびラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株のそれぞれを、予乾イタリアンライグラスサイレージに添加した場合に、サイレージに及ぼす影響を解析した。
すなわち、予乾したイタリアンライグラスの細断材料（乾物率約６８％）を供試した。実施例２と同様にして、上記２菌株のいずれか、または市販剤を添加した予乾イタリアンライグラスサイレージを調製すると共に、対照として無添加のサイレージを調製した。
４ヶ月後にパウチサイロを開封し、実施例２と同様にして予乾イタリアンライグラスサイレージ中の微生物組成、発酵品質および好気的安定性を調べた。
表５に予乾イタリアングラスサイレージの分析結果を示す。
【００３６】
【表５】
【００３７】
表５から明らかなように、対照（無添加）のイタリアンライグラスサイレージには酵母が５．０×１０５ｃｆｕ／ｇ生存していたのに対し、ＴＭ１株およびＴＭ２株のいずれを添加した場合も、サイレージから酵母は検出されなかった。また、ＴＭ１株を添加した場合には、市販剤を添加した場合と同様にｐＨの若干の上昇が見られたが、サイレージに望ましくない酪酸がほとんど認められず、代わりに酢酸を多量に生成していた。
【００３８】
一方、各イタリアンライグラスサイレージを好気的状態においてから（すなわち、パウチサイロを開封した直後から）１２０時間経過後までの間における温度の経時的変化を図３に示す。
図３から明らかなように、対照（無添加）のイタリアンライグラスサイレージでは、３６時間後に温度の上昇が認められたことから、好気的変敗が起きているものと考えられた。
ＴＭ１株やＴＭ２株を添加した場合は、温度上昇の遅延効果が顕著であり、特にＴＭ１株の場合は、開封後に試験期の１２０時間まで温度の上昇が認められなかったことから、好気的変敗が顕著に抑制されていることが明らかとなった。
【００３９】
実施例４〔高水分のグラスサイレージの好気的変敗に対する影響〕
一般に、高水分のグラスサイレージは、酪酸発酵が起こり易いために、好気的変敗は発生しにくい反面、サイレージ発酵品質は悪くなる。そこで、実施例１で得られたラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株およびラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株を高水分のサイレージ材料に添加した場合に、サイレージ品質に及ぼす影響を解析した。
すなわち、高水分（約７５％）のイタリアンライグラス材料を供試した。実施例２と同様にして、上記２菌株のいずれか、または市販剤を添加した高水分イタリアンライグラスサイレージを調製すると共に、対照として無添加のサイレージを調製した。
３ヶ月後にパウチサイロを開封し、実施例２と同様にして高水分イタリアンライグラスサイレージ中の微生物組成、発酵品質および好気的安定性を調べた。
【００４０】
一方、同様の高水分（約７５％）のイタリアンライグラスに、上記のＴＭ１菌株を容量５４ｍ３の地下サイロに添加して、高水分のイタリアンライグラスサイレージの調製を行った。一方、対照として無添加のサイレージを調製した。
３ヶ月後に無添加とＴＭ１株添加の地下サイロを同時に開封し、実施例２と同様にして高水分イタリアンライグラスサイレージ中の微生物組成、発酵品質、好気的安定性を調べると共に、乳牛の選択採食性を調べた。
【００４１】
その結果、高水分材料のため、無添加サイレージでは多量の酪酸（パウチサイロ：原物中０．２７％、地下サイロ：原物中０．４２％）が検出されたが、ＴＭ１株とＴＭ２株を添加したサイレージは、パウチサイロで作成したものおよび地下サイロで作成したもの（ＴＭ１菌株のみ）のいずれも、酢酸含量が高い反面、酪酸が検出されず、両菌株の添加によって発酵品質が改善された。
【００４２】
また、地下サイロで得られた無添加およびＴＭ１菌株の添加サイレージについて、乳牛の選択採食性を調べた。すなわち、対照である無添加サイレージとＴＭ１株添加サイレージを６頭の乾乳牛に５日間給餌し（毎日各牛に両サイレージの原物１４ｋｇずつ同時供給）、２０分間隔で１２０分間までそれぞれのサイレージの採食原物量を測定した。試験開始〜１２０分経過後の間の、各サイレージの採食原物量を図４に示す。
図４から明らかなように、ＴＭ１株を添加したサイレージの方が、無添加のサイレージよりも多く採食された。
本実施例の結果から、本発明の乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株は、サイレージに添加されることにより、発酵条件の悪い場合においても、発酵品質を改善し、さらに嗜好性を向上させることができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明により、サイレージ中において、好気的変敗の原因となる酵母の増殖を顕著に抑制し、好気的条件下における品質の安定性に優れたサイレージを作るために有用な乳酸菌、およびこれを含有するサイレージ調製用微生物製剤が提供される。
また、本発明によれば、上記乳酸菌あるいは製剤を材料草に添加することにより、サイロ開封後にも好気的変敗の原因となる酵母の増殖がほとんどないサイレージの調製が可能である。得られるサイレージは、好気的条件下における変敗が顕著に抑制され、栄養の過損失や有毒物質の産生の心配がなく、安全性の高いものとなる。また、嗜好性も改善され、家畜の成長増進を図り、もって畜産業の発展に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】トウモロコシサイレージを好気的状態においてから１２０時間経過後までの間における温度の経時的変化を示す図である。
【図２】トウモロコシサイレージの貯蔵損失（５ヶ月）および変敗損失（４８時間）を示す図である。
【図３】予乾イタリアンライグラスサイレージを好気的状態においてから１２０時間経過後までの間における温度の経時的変化を示す図である。
【図４】無添加サイレージとＴＭ１株添加サイレージの採食原物量を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規乳酸菌株および当該菌株によるサイレージ好気的変敗の抑制法に関し、詳しくは、サイレージの好気的変敗を効率的に抑制できる新規乳酸菌株、該菌株を含有するサイレージ用微生物製剤、並びに該製剤を用いるサイレージの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
家畜生産においては、牧草・飼料作物などの飼料が年間を通じて平準的に供給されることが要求されるが、植物の生長には季節性があることから、収穫された牧草・飼料作物を安定的に長期保存することが畜産業を安定的に発展させるために不可欠である。
収穫された牧草・飼料作物を長期保存するための方法の一つであるサイレージは、乾草としての乾燥保存と比べ、生草のまま栄養分の損失が少なく、天候にも支配されず、現在最も広く利用されている保存方法である。サイレージの発酵品質を改善するために、従来から多くの技術が開発されてきた。
【０００３】
サイレージの問題点として、サイロ開封後にサイレージ取り出し表面が長時間好気的状態になると、変敗が生じる現象（好気的変敗）がある（非特許文献１参照）。好気的変敗が起こると、サイレージは栄養価が低下し、家畜の摂取量が減少し、ひいては家畜健康の悪化、材料の完全廃棄など、畜産業において重大な損失が生じる。
好気的変敗の問題は、大型サイロでサイレージを保存する場合に特に深刻である。また、トウモロコシサイレージや低水分グラスサイレージ等は、発酵品質の良いものが得られやすいが、やはり開封後に好気的変敗が起こりやすい。
そこで、好気的変敗を防止するための手段の開発が進んでいる。例えば、プロピオン酸、プロピオン酸アンモニウム、四ギ酸アンモニウム、ギ酸カルシウム複合剤などの化学試薬は、好気的変敗の抑制に有効であることが知られている（非特許文献１参照）。しかし、これらの試薬はコストが高く、また、化学物質であるため家畜や人間に対する安全性の面で問題があり、取り扱いにあたり困難が伴うという問題もあった。
一方、乳酸菌の一種であるラクトバチルス・ブーケンライ（Lactobacillus buchneri）を用いて好気的変敗を防止する方法が開発された（非特許文献２参照）。しかしながら、この乳酸菌は高温条件における生育性が弱く、好気的変敗を抑制できない場合もあると指摘されている。
したがって、サイレージの利用性をより高めるため、実際の貯蔵環境や利用条件に合わせて好気的変敗を抑制できる菌剤の開発が要求されている。
【０００４】
【非特許文献１】内田 仙二編、サイレージ科学の進歩、デーリィ・ジャパン社、ｐｐ．１０６−１１２
【非特許文献２】大下 友子、飼料の好気的変敗とその防止対策、酪農ジャーナル２００１、６、１４−１６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記した従来の問題点を解消し、サイレージの好気的変敗を抑制できる乳酸菌を分離・選抜し、当該乳酸菌をサイレージの調製に利用して、サイレージの安全性と利用性を高める技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以上の課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた。すなわち、牧草・飼料作物およびサイレージから分離・培養した多数の乳酸菌株について、生理的、生化学的性状、糖発酵試験、およびサイレージの調製適性試験を行うことにより選抜した。さらに、既存乳酸菌基準株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列との相同性を比較検討し、種の同定を行った。
その結果、ヘテロ発酵型乳酸菌で、低ｐＨ耐性と酢酸生成能に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株と同定した。同様に、ヘテロ発酵型乳酸菌で、低ｐＨ耐性と高温耐性に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有する乳酸菌、ラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株と同定した。
さらに、上記乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株をサイレージ材料草に添加すると、サイロ開封後にサイレージの温度上昇が抑制されると共に、好気的変敗による損失が少なく、また嗜好性にも優れるサイレージを調製できることを見出した。
本発明は係る知見に基づくものである。
【０００７】
請求項１記載の本発明は、低ｐＨ耐性と酢酸生成能に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス属乳酸菌（Lactobacillus sp.）、ＴＭ１株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３９）である。
請求項２記載の本発明は、低ｐＨ耐性と高温耐性に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有する乳酸菌、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）ＴＭ２株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１４０）である。
請求項３記載の本発明は、請求項１および／または２記載の乳酸菌を含有するサイレージ調製用微生物製剤である。
請求項４記載の本発明は、請求項１および／または２記載の乳酸菌、もしくは請求項３記載の微生物製剤を材料草に添加することを特徴とするサイレージの調製方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、サイレージ中において、好気的変敗の原因となる酵母の増殖を顕著に抑制し、好気的条件下における品質の安定性に優れたサイレージを作るために有用な乳酸菌、およびこれを含有するサイレージ調製用微生物製剤が提供される。
また、本発明によれば、上記乳酸菌あるいは製剤を材料草に添加することにより、サイロ開封後にも好気的変敗の原因となる酵母の増殖がほとんどないサイレージの調製が可能である。得られるサイレージは、好気的条件下における変敗が顕著に抑制され、栄養の過損失や有毒物質の産生の心配がなく、安全性の高いものとなる。また、嗜好性も改善され、家畜の成長増進を図り、もって畜産業の発展に寄与するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明について詳しく説明する。
本発明に係る乳酸菌は、請求項１に記載するように、低ｐＨ耐性と酢酸生成能に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス属乳酸菌（Lactobacillus sp．）、ＴＭ１株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３９）と、請求項２に記載するように、低ｐＨ耐性と高温耐性に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有する乳酸菌、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ＴＭ２株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１４０）である。
【００１０】
このような本発明に係る乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株は、本発明者らが牧草・飼料作物およびサイレージから分離・培養した多数の乳酸菌株について、生理的、生化学的性状、及び糖発酵試験を行うことにより選抜されたものである。
尚、サイレージからの乳酸菌の分離・培養には、Lactobacilli MRS培地（DIFCO Laboratories，Detroit，USA）、ＧＹＰ白亜寒天培地（小崎ら、「乳酸菌実験マニュアル」、１９９２）等の乳酸菌用培地を利用することができる。
【００１１】
本発明に係るラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株は、低ｐＨ耐性と酢酸生成能に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有し、その一方でサイレージの品質上望ましくない酪酸の生成を抑制することができる。
ここで、低ｐＨ耐性とは、ｐＨ４．０以下において耐性を有する、すなわち生育可能であることを意味する。また、酢酸生成能に優れるとは、例えば、ＴＭ１株の添加が無添加よりサイレージ中の酢酸生成量を倍以上に高める能力を有していることを意味する。さらに、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母としては、Candida属、Cryptococcus属、Hansenula属、Pichia属、Saccharomyces属等の酵母を挙げることができる。
【００１２】
また、本発明に係るラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株は、低ｐＨ耐性と高温耐性が優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有し、その一方でサイレージの品質上望ましくない酪酸の生成を抑制することができる。
ここで、低ｐＨ耐性、および酵母に関しては、ＴＭ１株について上述したとおりである。高温耐性に優れるとは、２５〜３７℃、好ましくは、４５℃の温度下において耐性を有する、すなわち生育可能であることを意味する。
【００１３】
さらに、本発明に係る乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株は、いずれもヘテロ発酵型乳酸菌であるので、ホモ発酵型乳酸菌と比べサイレージの発酵損失を若干増加させる。しかしながら、上述したようにサイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有する等の諸特性を有することから、サイレージ開封後の好気的変敗による損失を顕著に低下させるため、全体的な損失を減少させることができる。
【００１４】
本発明に係るラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株は、グラム陽性及びカタラーゼ陰性を示すと共に、桿菌であることから、ラクトバチルス属であると判断したものの、その１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関し、ラクトバチルス属の既知乳酸菌のそれと比較すると相同性が低い（９７％以下）。そこで、本発明者らは、ラクトバチルス属であると同定した。
一方、本発明に係るラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株は、その１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に関し、ラクトバチルス・ブレビス基準株のそれと９９．９％の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の相同性を示したため、本発明者らによりラクトバチルス・ブレビスの一種であると同定された。
【００１５】
上述した本発明に係るＴＭ１株およびＴＭ２株の生理的・生化学的性質は、近年サイレージ好気的変敗の防止に用いられているラクトバチルス・ブーケンライ（L．buchneri）とは明らかに相違し、その他、糖発酵特性、サイレージの品質等の点でも明らかに異なることが明らかである。この点は、実施例において証明されている。
【００１６】
このような、請求項１に係る本発明のラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株、および請求項２に係る本発明の乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＴＭ１株がＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３９であり、ＴＭ２株がＦＥＲＭ ＡＰ−２０１４０である。
【００１７】
このような優れた特徴を有する本発明に係る乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株は、請求項４に記載するように、それぞれ、あるいは両方をサイレージの調製に利用することができる。
サイレージの材料草としては、トウモロコシ、イタリアンライグラス等を挙げることができる。材料草の水分含量は特に限定されず、予乾させたものでも良いし、高水分のものであっても良い。
材料草への本発明に係る乳酸菌ＴＭ１株および／またはＴＭ２株の添加量としては、材料草１ｇあたり１．０×１０５〜１．０×１０６ｃｆｕ（ｃｆｕ：cell forming unit）とすることができる。また、ＴＭ１株およびＴＭ２株の両方を用いる場合、上記添加量の範囲で両者の配合割合を適宜定めることができる。
サイロは、バッグサイロ、バンカーサイロ、地下サイロなど、特に限定されない。
調製されたサイレージは、開封状態で発熱が抑制されると共に、５日間以上保存することができる。また、高水分の材料草を用いるなど発酵条件が悪い場合に得られたサイレージであっても、発酵品質に優れ、嗜好性も向上させることができる。
【００１８】
このような本発明の乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株は、適宜製剤化して、請求項３に記載されるサイレージ調製用微生物製剤とすることができる。本発明のサイレージ調製用微生物製剤は、上記乳酸菌ＴＭ１株および／またはＴＭ２株を含有するものであれば、保存料、賦形剤等公知の成分を含んでいても良い。また、ラクトバチルス・プランタルム等の乳酸菌をはじめとする他の微生物や繊維分解酵素などを含むものであっても良い。剤形についても、粉剤、粒剤、液剤など任意とすることができる。
この微生物製剤も、本発明の乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株の場合と同様、サイレージの調製に利用することができ、その場合の条件は、上記ＴＭ１株およびＴＭ２株を直接利用する場合に準じるものとすることができる。
【実施例】
【００１９】
以下に、実施例により本発明を詳しく説明する。
実施例１〔ＴＭ１株およびＴＭ２株の分離、各菌株の諸特性の解析〕
独立行政法人 農業・生物系特定産業技術研究機構 畜産草地研究所やその周辺の酪農家から採取したイタリアンライグラス、オーチャードグラス、スーダングラスおよびトウモロコシなどの原材料ならびにサイレージ２０ｇずつを秤り、滅菌サンプルバッグ（Fisher Scientific，Canada）に入れ、滅菌した生理食塩水１８０ｍｌを加えて１０−1倍希釈液とした後、この液をさらに１０−８倍まで希釈した。この希釈液０．１ｍｌを乳酸菌用培地Lactobacilli ＭＲＳ寒天培地（DIFCO Laboratories，Detroit，USA）に塗布して、嫌気培養装置（ヒラサワ（株）製）にて、３７℃で２日間嫌気培養した。
【００２０】
培養物から分離した乳酸菌株について、グラム染色、カタラーゼ反応およびガス発生に関する試験を行った。
グラム染色陽性及びカタラーゼ反応陰性であり、ガス生成があり、低ｐＨ耐性や高温耐性に優れている菌株を選択して、生理的・生化学的性状、糖分解性状の解析を行うと共に、トウモロコシ材料に実際に添加して、サイレージの調製適性試験を行った。
比較のため、市販剤（パイオニアサイレージ調製用乳酸菌１１Ａ４４、パイオニア ハイブレッド社）から、上記のLactobacilli ＭＲＳ寒天培地によりラクトバチルス・ブーケンライを分離し、同様に試験を行った。
【００２１】
これらの結果に基づいて、ヘテロ発酵型乳酸菌で、低ｐＨ耐性と酢酸生成能力が優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株と、同様に、ヘテロ発酵型乳酸菌で、低ｐＨ耐性と高温耐性に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス・ブレビス ＴＭ２株を選抜した。
各乳酸菌株の特性を表１に示した。
【００２２】
【表１】
【００２３】
表１から明らかなように、ラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株は、ヘテロ発酵型乳酸菌であり、ｐＨ３．８という低ｐＨ条件で生育可能であった。また、ラクトバチルス・ブーケンライと比べ、ＴＭ１株はＭＲＳ液体培地において乳酸を比較的多量に生成し、培地のｐＨもより低下させた。
そして、ラクトバチルス・ブーケンライは４５℃で生育しなかったのに対し、ラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株は十分に生育可能であった。また、ＴＭ２株は、ヘテロ発酵型乳酸菌であり、ｐＨ３．８という低ｐＨ条件で生育可能であった点については、ＴＭ１株と同様であった。
一方、各菌株の糖分解性状を表２及び表３に示した。
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
表２及び表３の結果から、ＴＭ１株については、メリビオース、ラフィノースであり、また、ＴＭ２株については、リボース、ラクトースであるという糖発酵特性を有していることが明らかとなった。また、ＴＭ１株およびＴＭ２株の糖発酵特性は、互いに異なると共に、ラクトバチルス・ブーケンライのそれと比較しても異なることが明らかであった。
また、表１、表２及び表３の結果から、ＴＭ１株およびＴＭ２株は、サイレージ調製用微生物製剤として適していることが分かる。
【００２７】
次に、両菌株の全領域の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析を行った。
その結果、ＴＭ１株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、ラクトバチルス属の菌種のそれと比較して相同性が９５％以上であったことから、ラクトバチルス属の菌株であることが判明した。
そして、ＴＭ２株の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、基準株であるラクトバチルス・ブレビスのものと９９．９％の相同性を示したことから、ラクトバチルス・ブレビスの一種であると同定された。
本実施例で同定されたラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株、および請求項２に係る本発明の乳酸菌ラクトバチルス・ブレビス ＴＭ２株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＴＭ１株がＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３９であり、ＴＭ２株がＦＥＲＭ ＡＰ−２０１４０である。
【００２８】
実施例２〔トウモロコシサイレージの好気的変敗に対する影響〕
実施例１で得られたラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株およびラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株のそれぞれを、トウモロコシサイレージに添加した場合に及ぼす影響を解析した。
すなわち、約１ｃｍの細断トウモロコシ（クミアイデント１１３）を供試し、上記２菌株のいずれかを添加して、パウチサイロ（飛龍Ｎ１１、旭化成（株）製）を用いてトウモロコシサイレージの調製を行った。
乳酸菌のトウモロコシ材料への添加は、各菌株を、Lactobacilli ＭＲＳ液体培地（DIFCO Laboratories，Detroit，USA）に接種して３０℃で１６時間培養して得られる各培養液を、トウモロコシ材料１ｇあたりの乳酸菌が約１．０×１０６ｃｆｕ（ｃｆｕ：cell forming unit）となるように調製して行った。添加後、脱気・密封（業務用卓上バキュームシーラー、シャープ（株）製）した後、室温で保存した。
一方、市販剤の乾燥粉末（パイオニアサイレージ調製用乳酸菌１１Ａ４４、パイオニア ハイブレッド社）を滅菌水に１００倍に溶かしたものを、乳酸菌の代わりに添加して同様に保存した。
更に、対照として、乳酸菌や市販剤を添加しないで同様に調製・保存した。
【００２９】
５ヶ月後にパウチサイロを開封し、トウモロコシサイレージ中の微生物組成、発酵品質、好気的安定性および貯蔵中と開封後の乾物損失率を調べた。
一方、対照として、乳酸菌や市販剤を添加しないで同様に分析を行った。
表４にトウモロコシサイレージの分析結果を示す。
【００３０】
【表４】
【００３１】
表４から明らかなように、対照（無添加）のトウモロコシサイレージには酵母が３．２×１０４ｃｆｕ／ｇ原物生存していたのに対し、ＴＭ１株およびＴＭ２株のいずれを添加した場合も、サイレージから酵母は検出されなかった。また、ＴＭ１株を添加した場合には、市販剤を添加した場合と同様にｐＨの若干の上昇が見られたが、サイレージに望ましくない酪酸の生成はほとんど認められず、代わりに酢酸を多量に生成していた。
【００３２】
一方、各トウモロコシサイレージを好気的状態においてから（すなわち、パウチサイロを開封した直後から）１２０時間経過後までの間における温度の経時的変化を図１に示す。
図１から明らかなように、対照（無添加）のトウモロコシサイレージでは、２４時間経過後に温度の上昇が認められたことから、好気的変敗が起きているものと考えられた。
一方、ＴＭ１株やＴＭ２株を添加した場合は、温度上昇の遅延効果が顕著であり、特にＴＭ１株の場合は、開封から１２０時間経っても温度上昇がほとんど認められなかったことから、好気的変敗が顕著に抑制されていることが明らかとなった。
【００３３】
次に、各トウモロコシサイレージの貯蔵損失（５ヶ月間）と開封後に好気的状態においてから４８時間経過後の変敗損失を測定した。
すなわち、貯蔵損失とは、植物細胞の残余呼吸や微生物の発酵などによるサイレージ貯蔵中の乾物損失（％）を意味し、貯蔵前の乾物量と開封時の乾物量を測定して算出した。また、変敗損失とは、サイロ開封後の好気的変敗による乾物損失（％）を意味し、開封時の乾物量と好気的状態においてからの乾物量を測定して算出した。
各トウモロコシサイレージの貯蔵損失と変敗損失を、図２に示す。
【００３４】
図２から明らかなように、ＴＭ１株やＴＭ２株を添加したトウモロコシサイレージは、対照（無添加）や市販剤を添加したものと比較して、貯蔵損失が近いレベルであったが、変敗損失が著しく低下したため、サイレージの総乾物損失（貯蔵損失＋変敗損失）を顕著に減少させたことが明らかである。
尚、総乾物損失に関しては、好気的状態においた時間が短い場合には、ＴＭ２株を添加したトウモロコシサイレージが最も優れていた。一方、好気的状態においた時間が長い場合では、ＴＭ１株を添加したトウモロコシサイレージが最も優れていた。
【００３５】
実施例３〔予乾イタリアンライグラスサイレージの好気的変敗に対する影響〕
実施例１で得られたラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株およびラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株のそれぞれを、予乾イタリアンライグラスサイレージに添加した場合に、サイレージに及ぼす影響を解析した。
すなわち、予乾したイタリアンライグラスの細断材料（乾物率約６８％）を供試した。実施例２と同様にして、上記２菌株のいずれか、または市販剤を添加した予乾イタリアンライグラスサイレージを調製すると共に、対照として無添加のサイレージを調製した。
４ヶ月後にパウチサイロを開封し、実施例２と同様にして予乾イタリアンライグラスサイレージ中の微生物組成、発酵品質および好気的安定性を調べた。
表５に予乾イタリアングラスサイレージの分析結果を示す。
【００３６】
【表５】
【００３７】
表５から明らかなように、対照（無添加）のイタリアンライグラスサイレージには酵母が５．０×１０５ｃｆｕ／ｇ生存していたのに対し、ＴＭ１株およびＴＭ２株のいずれを添加した場合も、サイレージから酵母は検出されなかった。また、ＴＭ１株を添加した場合には、市販剤を添加した場合と同様にｐＨの若干の上昇が見られたが、サイレージに望ましくない酪酸がほとんど認められず、代わりに酢酸を多量に生成していた。
【００３８】
一方、各イタリアンライグラスサイレージを好気的状態においてから（すなわち、パウチサイロを開封した直後から）１２０時間経過後までの間における温度の経時的変化を図３に示す。
図３から明らかなように、対照（無添加）のイタリアンライグラスサイレージでは、３６時間後に温度の上昇が認められたことから、好気的変敗が起きているものと考えられた。
ＴＭ１株やＴＭ２株を添加した場合は、温度上昇の遅延効果が顕著であり、特にＴＭ１株の場合は、開封後に試験期の１２０時間まで温度の上昇が認められなかったことから、好気的変敗が顕著に抑制されていることが明らかとなった。
【００３９】
実施例４〔高水分のグラスサイレージの好気的変敗に対する影響〕
一般に、高水分のグラスサイレージは、酪酸発酵が起こり易いために、好気的変敗は発生しにくい反面、サイレージ発酵品質は悪くなる。そこで、実施例１で得られたラクトバチルス属乳酸菌ＴＭ１株およびラクトバチルス・ブレビスＴＭ２株を高水分のサイレージ材料に添加した場合に、サイレージ品質に及ぼす影響を解析した。
すなわち、高水分（約７５％）のイタリアンライグラス材料を供試した。実施例２と同様にして、上記２菌株のいずれか、または市販剤を添加した高水分イタリアンライグラスサイレージを調製すると共に、対照として無添加のサイレージを調製した。
３ヶ月後にパウチサイロを開封し、実施例２と同様にして高水分イタリアンライグラスサイレージ中の微生物組成、発酵品質および好気的安定性を調べた。
【００４０】
一方、同様の高水分（約７５％）のイタリアンライグラスに、上記のＴＭ１菌株を容量５４ｍ３の地下サイロに添加して、高水分のイタリアンライグラスサイレージの調製を行った。一方、対照として無添加のサイレージを調製した。
３ヶ月後に無添加とＴＭ１株添加の地下サイロを同時に開封し、実施例２と同様にして高水分イタリアンライグラスサイレージ中の微生物組成、発酵品質、好気的安定性を調べると共に、乳牛の選択採食性を調べた。
【００４１】
その結果、高水分材料のため、無添加サイレージでは多量の酪酸（パウチサイロ：原物中０．２７％、地下サイロ：原物中０．４２％）が検出されたが、ＴＭ１株とＴＭ２株を添加したサイレージは、パウチサイロで作成したものおよび地下サイロで作成したもの（ＴＭ１菌株のみ）のいずれも、酢酸含量が高い反面、酪酸が検出されず、両菌株の添加によって発酵品質が改善された。
【００４２】
また、地下サイロで得られた無添加およびＴＭ１菌株の添加サイレージについて、乳牛の選択採食性を調べた。すなわち、対照である無添加サイレージとＴＭ１株添加サイレージを６頭の乾乳牛に５日間給餌し（毎日各牛に両サイレージの原物１４ｋｇずつ同時供給）、２０分間隔で１２０分間までそれぞれのサイレージの採食原物量を測定した。試験開始〜１２０分経過後の間の、各サイレージの採食原物量を図４に示す。
図４から明らかなように、ＴＭ１株を添加したサイレージの方が、無添加のサイレージよりも多く採食された。
本実施例の結果から、本発明の乳酸菌ＴＭ１株およびＴＭ２株は、サイレージに添加されることにより、発酵条件の悪い場合においても、発酵品質を改善し、さらに嗜好性を向上させることができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明により、サイレージ中において、好気的変敗の原因となる酵母の増殖を顕著に抑制し、好気的条件下における品質の安定性に優れたサイレージを作るために有用な乳酸菌、およびこれを含有するサイレージ調製用微生物製剤が提供される。
また、本発明によれば、上記乳酸菌あるいは製剤を材料草に添加することにより、サイロ開封後にも好気的変敗の原因となる酵母の増殖がほとんどないサイレージの調製が可能である。得られるサイレージは、好気的条件下における変敗が顕著に抑制され、栄養の過損失や有毒物質の産生の心配がなく、安全性の高いものとなる。また、嗜好性も改善され、家畜の成長増進を図り、もって畜産業の発展に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】トウモロコシサイレージを好気的状態においてから１２０時間経過後までの間における温度の経時的変化を示す図である。
【図２】トウモロコシサイレージの貯蔵損失（５ヶ月）および変敗損失（４８時間）を示す図である。
【図３】予乾イタリアンライグラスサイレージを好気的状態においてから１２０時間経過後までの間における温度の経時的変化を示す図である。
【図４】無添加サイレージとＴＭ１株添加サイレージの採食原物量を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低ｐＨ耐性と酢酸生成能に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス属乳酸菌（Lactobacillus sp.）、ＴＭ１株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３９）。
【請求項２】
低ｐＨ耐性と高温耐性に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有する乳酸菌、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）ＴＭ２株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１４０）。
【請求項３】
請求項１および／または２記載の乳酸菌を含有するサイレージ調製用微生物製剤。
【請求項４】
請求項１および／または２記載の乳酸菌、もしくは請求項３記載の微生物製剤を材料草に添加することを特徴とするサイレージの調製方法。
【請求項１】
低ｐＨ耐性と酢酸生成能に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有するラクトバチルス属乳酸菌（Lactobacillus sp.）、ＴＭ１株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１３９）。
【請求項２】
低ｐＨ耐性と高温耐性に優れ、サイレージの好気的変敗の原因となる酵母に対する抗菌性を有する乳酸菌、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）ＴＭ２株（ＦＥＲＭ ＡＰ−２０１４０）。
【請求項３】
請求項１および／または２記載の乳酸菌を含有するサイレージ調製用微生物製剤。
【請求項４】
請求項１および／または２記載の乳酸菌、もしくは請求項３記載の微生物製剤を材料草に添加することを特徴とするサイレージの調製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−４２６４７（Ｐ２００６−４２６４７Ａ）
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２２６２８０（Ｐ２００４−２２６２８０）
【出願日】平成１６年８月３日（２００４．８．３）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月３日（２００４．８．３）
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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