新規微生物
【課題】水素の生産に適した新規な微生物を提供する。
【解決手段】本発明に係る微生物は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７９３のサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム菌株又はその変異株である。
【解決手段】本発明に係る微生物は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７９３のサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム菌株又はその変異株である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規微生物に関し、特に、水素を生産できる新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
水素は、燃料電池等に利用可能なエネルギー源として注目されている。この水素を生産する方法の一つとして、水素を生産する微生物を用いた水素発酵がある（例えば、特許文献１）。
【特許文献１】特開平４−１６９１７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の水素発酵に用いられる微生物は、ｐＨが低い範囲での水素生産能力が十分なものとはいえなかった。また、従来の水素発酵においては、雑菌の混入等の問題により水素の生産性が低下することがあった。
【０００４】
これに対し、本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、水素の生産に適した新規な微生物を得て本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施形態に係る微生物は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに２００７年３月２日付けで受領された受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０７９３のサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）菌株であることを特徴とする。また、本発明の一実施形態に係る微生物は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０７９３のサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム菌株の変異株であって、ｐＨが４．５以上、６．５以下の範囲で培養した場合に、糖１ｇから２７０ｍＬ以上の水素を生産することを特徴とする。この微生物は、特に、ｐＨが５．０以上、６．０以下の範囲で培養した場合に、糖１ｇから２７０ｍＬ以上の水素を生産することを特徴とする。また、本発明の一実施形態に係る微生物は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０７９３のサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム菌株の変異株であって、糖源としてキシロースを用いて、ｐＨが４．５以上、６．５以下の範囲で培養した場合に、キシロースに対して２．１以上のモル比で水素を生産することを特徴とする。この微生物は、特に、糖源としてキシロースを用いて、ｐＨが４．８以上、５．５以下の範囲で培養した場合に、キシロースに対して２．１以上のモル比で水素を生産することを特徴とする。本発明によれば、水素の生産に適した新規な微生物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の一実施形態に係る微生物について以下に説明する。なお、本発明に係る微生物は、本実施形態に示すものに限られない。
【０００７】
本実施形態に係る微生物（以下、「本微生物」という）は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０７９３のサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム菌株（以下、「ＰＥＨ９株」という）及びその変異株である。本微生物は、グラム陽性であり、偏性嫌気性であり、その形態は桿菌様である。
【０００８】
そして、本微生物は、糖類を代謝することによって水素を生産することができる。すなわち、本微生物は、培養液中において、糖類から、酢酸、酪酸等の有機酸を生成するとともに、二酸化炭素と水素とを含むガス（以下、「発酵ガス」という）を生成することができる。
【０００９】
本微生物が水素を生産する上で利用できる糖類は特に限られないが、例えば、植物由来のバイオマスや食品廃棄物に含まれる糖類を利用することができ、具体的には、多糖（デンプン、セルロース等）、オリゴ糖、二糖、単糖（キシロース、グルコース等）を利用することができる。
【００１０】
また、本微生物は、広いｐＨ範囲で水素を生産することができ、また、低いｐＨ範囲で効率よく水素を生産することができる。すなわち、本微生物は、培養液のｐＨが４．５以上、７．０以下の範囲で水素を生産することができ、好ましくは４．８以上、５．５以下の範囲、特に好ましくは５．０以上、５．２以下の範囲で効率よく水素を生産することができる。ｐＨが４．５より低い場合、及びｐＨが７．０より高い場合には、本微生物による水素の生産効率が低下する。
【００１１】
一方、本微生物を用いた水素発酵においては、ｐＨを５．５以下とすることにより、水素を生産しない他の微生物が混入することによるコンタミネーションの発生を効果的に抑制することができる。例えば、メタン発酵菌は、ｐＨが７．０より低くなるとメタンの生産能力が低下するものが多いため、本微生物を用いることにより、水素発酵におけるメタン発酵菌のコンタミネーションを抑制することができる。
【００１２】
また、例えば、水素発酵を第一の培養槽で行い、当該第一の培養層における水素発酵後の残渣を利用したメタン発酵を第二の培養槽で行う二段階の発酵システムにおいては、当該第一の培養槽における水素発酵に本微生物を用いてｐＨを５．５以下とすることにより、当該第一の培養槽にメタン発酵菌が混入した場合であっても、当該第一の培養槽における当該メタン発酵菌によるメタンの生産を効果的に抑制し、当該第一の培養槽において水素の含有率が高い発酵ガスを生産することができる。
【００１３】
また、例えば、水素発酵の上流側に、植物由来のバイオマスを分解してエタノール等のバイオ燃料を生産する前処理工程を有する燃料生産システムにおいては、当該前処理工程において、当該バイオマスに含まれる植物繊維素を単糖や二糖にまで低分子化するため、酸が用いられることがある。この場合、前処理工程で酸性化された残渣を含む培養液が水素発酵に供されることになるが、当該水素発酵に本微生物を用いることにより、当該培養液に添加する中和剤の量を、従来に比して効果的に低減することができる。
【００１４】
また、本微生物を用いて低いｐＨ範囲で水素発酵を行う場合には、酸化還元電位との関係から、当該本微生物の細胞内で生産された水素の当該細胞外への放出が促進されることも期待できる。
【００１５】
また、本微生物は、特に、低いｐＨ範囲において、消費した糖に対する生産した水素の比率（生産水素量／消費糖量）（以下、「対糖収率」という）を高いレベルで達成することができる。すなわち、本微生物は、培養液に添加する糖類としてキシロースを用いた場合には、ｐＨが４．５以上、７．０以下の範囲において、培養液中の消費したキシロース量に対する対糖収率（ｍｏｌ−Ｈ２／ｍｏｌ−ｘｙｌｏｓｅ）が１．６以上で水素を生産することができる。
【００１６】
特に、本微生物は、ｐＨが４．５以上、６．５以下の範囲において、培養液に含まれる１モルのキシロースから２．１モル以上の水素を生産することができる（すなわち、２．１以上の対糖収率で水素を生産することができる）。
【００１７】
また、本微生物は、広い温度範囲で水素を生産することができ、また、高い温度範囲で効率よく水素を生産することができる。すなわち、本微生物は、温度が３７℃以上、６５℃以下の範囲で水素を生産することができ、好ましくは４５℃以上、６０℃以下の範囲、より好ましくは５０℃以上、６０℃以下の範囲、特に好ましくは５５℃以上、６０℃以下の範囲で効率よく水素を生産することができる。温度が３７℃より低い場合、及び温度が６５℃より高い場合には、本微生物による水素の生産効率が低下する。
【００１８】
一方、温度が５５℃以上の範囲では、水素を生産しない他の微生物が混入することによるコンタミネーションを効果的に抑制しつつ、本微生物による水素発酵を効果的に行うことができる。また、温度が５０℃以上の範囲では、水素発酵の上流側で行われる工程で発生した熱の当該水素発酵への影響を低減することができる。
【００１９】
すなわち、例えば、上述のように、水素発酵の上流側にバイオマスからバイオ燃料を製造する前処理工程を有する燃料生産システムにおいては、当該前処理工程で植物繊維素を酸やアルカリなどの存在下、８０〜２３０℃に加熱して分解することがある。この場合、前処理工程で加熱された残渣を含む培養液が水素発酵に供されることになるが、当該水素発酵に本微生物を用いることにより、当該培養液に対する冷却操作を省略し、又は従来に比して効果的に軽減することができる。
【００２０】
また、本微生物は、広い範囲のｐＨと、広い範囲の温度と、を任意に組み合わせた条件で水素を生産することができ、特に、従来の水素発酵用微生物に比べて、低いｐＨと、高い温度と、を組み合わせた条件で効率よく水素を生産することができる。
【００２１】
すなわち、本微生物は、例えば、ｐＨが４．５以上、６．５以下の範囲であって、且つ温度が５５℃以上、６０℃以下の範囲の条件下で２．１以上の対糖収率で水素を生産することができる。
【００２２】
このように、本微生物を用いて、低ｐＨ、高温で水素発酵を行うことにより、上述のとおり、当該水素発酵において、雑菌によるコンタミネーションを極めて効果的に抑制することができるとともに、上流側に設けられたバイオ燃料製造工程の影響を解消するために行う培養液の中和操作や冷却操作を従来に比して効果的に低減することができる。
【００２３】
また、本微生物は、所定の条件において容易に自己溶解することができる。すなわち、本微生物は、例えば、培養液に含まれる所定の栄養成分の濃度が所定値を下回った場合には、その細胞体が容易に崩壊する。
【００２４】
具体的に、例えば、糖源にキシロースを用いた培養液中で本微生物を培養する場合には、当該培養液中のキシロース濃度を５００ｍｇ／Ｌ以下とすることにより、本微生物は自己溶解を開始する。したがって、本微生物を用いた水素発酵においては、水素発酵終了後に残存する汚泥の量を効果的に低減することができる。
【００２５】
次に、本微生物を用いて水素発酵を行った具体例について説明する。
【００２６】
［実施例１］
実施例１においては、様々なｐＨで水素発酵を行った。本微生物としては、ＰＥＨ９株を用いた。また、比較の対照として、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカムであってＰＥＨ９株とは異なる菌株であるＰＥＨ８株とＡＴＣＣ７９５６株とを用いた。培地としては、１．０％（ｗ／ｖ）のキシロース、０．４％（ｗ／ｖ）の酵母エキス（極東製薬）、０．２５％（ｗ／ｖ）のＭＯＰＳ、０．０９１％（ｗ／ｖ）のＫ２ＨＰＯ４、０．０３％（ｗ／ｖ）のＮａＨ２ＰＯ４、０．０２％（ｗ／ｖ）のＭｇＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）のＣａＣｌ２、０．０３％（ｗ／ｖ）の(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．００２％（ｗ／ｖ）のＦｅＳＯ４、０．０４％（ｗ／ｖ）のＬ−システイン、０．１１％（ｗ／ｖ）のレザズリンを含む水溶液を用いた。
【００２７】
ここで、ＰＥＨ９株とＰＥＨ８株の取得過程について簡単に説明する。すなわち、まず、下水処理施設から採取した高温嫌気消化汚泥をビール製造排水にて約一ヶ月間馴養し、水素５０〜６０％、二酸化炭素４０〜５０％を安定して生産する水素発酵フローラを得た。このフローラから変法ＧＡＭ培地（嫌気性菌分離用、日本水産株式会社製）を用いて２４の菌株を単離し、その中から最も高い水素生産性を示した菌株をＰＥＨ８株として取得した。次に、このＰＥＨ８株から、紫外線照射法により変異株を取得した。
【００２８】
そして、変異原処理を施した１０万の菌株の中から、ｐＨ５．０以下で生育する１２の菌株を選抜し、更にこの中から水素発酵性に優れた１つの菌株をＰＥＨ９株として取得した。
【００２９】
一方、ＡＴＣＣ７９５６株は、ＰＥＨ８株の１６ＳｒＤＮＡ全領域の配列を決定し、当該配列を基に系統解析を行った結果、当該ＰＥＨ８株と最も近縁と判断された既存の菌株である。ＰＥＨ８株とＡＴＣＣ７９５６との異同を決定する目的でＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験を行ったところ、３回の試験によるこれらの相同値の平均は７０％以上であることが確認された。
【００３０】
そして、容積が１Ｌの発酵槽（ＢＭＪ−０１、エイブル株式会社製）中で、５００ｍＬの培地にＰＥＨ９株、ＰＥＨ８株、又はＡＴＣＣ７９５６株を接種し、嫌気条件下、希釈率０．２〜０．４にて連続培養を実施した。
【００３１】
培養温度は、５５℃で一定に維持した。また、培養液への水酸化ナトリウム水溶液の自動添加により当該培養液のｐＨを４．５〜７．０の範囲で段階的に変化させた。
【００３２】
そして、ｐＨが４．５〜７．０の範囲内の様々な値になった場合におけるＰＥＨ９株、ＰＥＨ８株、又はＡＴＣＣ７９５６株による水素の生産量を評価した。すなわち、発生する発酵ガスをテドラーバックにて捕集して２４時間あたりに発生した発酵ガスの量を測定した。発酵ガスの組成は熱伝導度検出器（ＴＣＤ）付きガスクロマトグラフィー装置（ＧＣ−１４Ｂ、株式会社島津製作所製）によって分析し、当該発酵ガスに含まれる水素の割合から水素の生産量を算出した。このガスクロマトグラフィー分析は、キャリアガスとして高純度アルゴンガスを用い、カラム担体としてモレキュラーシーブ５Å及びポラパックＱを用い、注入口温度を６０℃とし、検出器温度を８０℃とし、カラムオーブン温度を６０℃として行った。また、培地及び培養液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）した後の上清をメンブランろ過（孔径０．２μｍ）して得られた試料を蛍光検出器付き高速液体クロマトグラフィー（還元糖分析システム、株式会社島津製作所製）を用いて分析することにより、当該培地及び培養液に含まれるキシロースの量を測定した。この高速液体クロマトグラフィー分析は、カラム（ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＩＳＡ−０７／Ｓ２５０４、長さ２５０ｍｍ×直径４．０ｍｍ、株式会社島津製作所製)を用い、移動相はＡ液（０．１Ｍホウ酸カリウム緩衝液）１００％からＢ液（０．４Ｍホウ酸カリウム緩衝液）１００％へのグラジエント溶離とし、液流量は０．６ｍＬ／分、温度は６５℃にて行った。また、キシロースの検出は、１％（ｗ／ｖ）のアルギニン及び３％（ｗ／ｖ）のホウ酸を含む反応試薬を用い、当該反応試薬の流量を０．５ｍＬ／分とし、反応温度を１５０℃とし、蛍光検出器の励起波長（Ｅｘ）は３２０ｎｍ、蛍光波長（Ｅｍ）は４３０ｎｍとして行った。また、水素生産量の測定時における培養液中の菌体密度は、およそ１０６〜１０７細胞個/ｍＬであった。
【００３３】
図１、図２、図３には、それぞれＰＥＨ９株、ＰＥＨ８株、ＡＴＣＣ７９５６株による水素の生産性についての測定結果を示す。図１〜図３において、横軸は培養液のｐＨ、縦軸は対糖収率（ｍｏｌ−Ｈ２／ｍｏｌ−ｘｙｌｏｓｅ）である。
【００３４】
図１に示すように、ＰＥＨ９株は、キシロースを糖源として含む培養液を用いた場合には、ｐＨが４．５〜７．０という広範な範囲において、良好に生育するとともに、１．６〜３．２ｍｏｌ−Ｈ２／ｍｏｌ−ｘｙｌｏｓｅという高い対糖収率で水素を生産することができた。特に、ＰＥＨ９株は、ｐＨが４．８以上、５．５以下という低い範囲においても、２．１以上という比較的高い対糖収率で水素を生産することができた。
【００３５】
具体的に、ＰＥＨ９株は、ｐＨが４．８６、５．０２、５．０６、５．０８、５．１０、５．１４、５．１５、５．３６、５．３８の場合において、それぞれ２．１３、２．２３、２．２３、２．３８、２．６２、２．６１、２．２４、２．４０、２．３１の対糖収率で水素を生産することができた。また、ＰＥＨ９株は、ｐＨが５．８６〜６．２５の場合においては２．１３〜３．１６の対糖収率で水素を生産することができ、ｐＨが６．５４の場合には１．７８の対糖収率で水素を生産することができた。
【００３６】
これに対し、図２に示すように、ＰＥＨ８株の対糖収率は、ｐＨ５．５以下において顕著に低下し、例えば、ｐＨ５．５０における対糖収率は０．８１であった。また、図３に示すように、ＡＴＣＣ７９５６株の対糖収率は、ｐＨが５．５、５．３２の場合において、それぞれ０．７３、０．３６であった。このように、ＰＥＨ９株は、低いｐＨ範囲（例えば、少なくともｐＨが４．８以上、６．３以下の範囲）において、水素を効率よく生産することが確認された。
【００３７】
［実施例２］
実施例２においては、ｐＨ５．０〜５．２の範囲における水素の生産性を１Ｌスケールで確認した。本微生物としては、ＰＥＨ９株を用いた。培地としては、１．０％（ｗ／ｖ）のキシロース、２％（ｗ／ｖ）のペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、１．０％（ｗ／ｖ）の麦芽エキス、０．３％（ｗ／ｖ）のＫ２ＨＰＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ４、０．０２％（ｗ／ｖ）のＬ−システイン、０．２％（ｗ／ｖ）のＬ−リンゴ酸、０．００３％（ｗ／ｖ）のオレイン酸、０．１％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０を含む水溶液を用いた。そして、容積が１Ｌの発酵槽（ＢＭＪ−０１、エイブル株式会社製）中で５００ｍＬの培地にＰＥＨ９株を接種し、嫌気条件下、希釈率０．３〜０．４にて連続培養を実施した。
【００３８】
培養温度は５５℃で一定に維持した。培養液のｐＨは、培養液への水酸化ナトリウム水溶液の自動添加により５．０〜５．２の範囲に制御した。
【００３９】
培養液中におけるＰＥＨ９株の増殖が安定したことを確認した後、５日間の培養期間における２４時間あたりの発酵ガスの生産量と、当該発酵ガスの組成と、を実施例１と同様にしてガスクロマトグラフィーにより測定し、当該測定結果から水素の生産量を算出した。また、本実施例で用いた培地は、キシロース以外に麦芽エキス由来の糖（マルトース、グルコースなど）を含むため、培地及び培養液についてフェノール硫酸法による全糖分析を行って糖消費量を求めた。また、水素の対糖収率は、消費された糖１ｇあたりの発生量を標準状態（標準環境温度と圧力：温度２５℃、気圧１ｂａｒ）における体積で示した。
【００４０】
図４には、ＰＥＨ９株の水素生産性の測定結果を示す。図４において、横軸は培養日数（日）、左縦軸は各培養日の１日間に生産された発酵ガスの量（ｍＬ／日）、右縦軸は当該発酵ガスに含まれる水素の体積比率（％）、をそれぞれ示し、白抜きの棒は発酵ガスの生産量、三角印は水素の体積比率を示す。
【００４１】
図４に示すように、ＰＥＨ９株は、水素を含む発酵ガスを５日間に亘り安定して生産することができた。具体的に、５日間の平均値として、発酵ガス生産量は１３１２ｍＬ／日、水素の体積比率は５６．４％、水素の生産量は７４０ｍＬ／日、培養液の供給量は１５４ｍＬ／日、供給された培養液に含まれていた糖の全量は１６２００ｍｇ／Ｌ、排出された培養液に含まれていた糖の全量は４６６ｍｇ／Ｌであった。
【００４２】
そして、ＰＥＨ９株は、ｐＨが５．０〜５．２の範囲において、２７７〜３２６（５日間の平均値で３０６）ｍＬ−Ｈ２／ｇ−糖の対糖収率で効率よく水素を生産することができた。すなわち、ＰＥＨ９株は、ｐＨが５．０〜５．２の範囲において少なくとも２７０ｍＬ−Ｈ２／ｇ−糖以上の対糖収率で水素を生産できることが確認された。
【００４３】
［実施例３］
実施例３においては、ｐＨ５．８〜６．０の範囲における水素の生産性を１Ｌスケールで確認した。ｐＨの範囲が異なる点を除き、上述の実施例２と同様の条件で水素発酵を行った。
【００４４】
図５には、ＰＥＨ９株の水素生産性の測定結果を示す。図５において、横軸は培養日数（日）、左縦軸は各培養日の１日間に生産された発酵ガスの量（ｍＬ／日）、右縦軸は当該発酵ガスに含まれる水素の体積比率（％）、をそれぞれ示し、白抜きの棒は発酵ガスの生産量、三角印は水素の体積比率を示す。
【００４５】
図５に示すように、ＰＥＨ９株は、水素を含む発酵ガスを５日間に亘り安定して生産することができた。具体的に、５日間の平均値として、発酵ガスの生成量は１６７６ｍＬ／日、水素の体積比率は５８．８％、水素の生産量は９８５ｍＬ／日、培養液の供給量は１７９ｍＬ／日、供給された培養液に含まれていた糖の全量は１６２００ｍｇ／Ｌ、排出された培養液に含まれていた糖の全量は３７２ｍｇ／Ｌであった。
【００４６】
そして、ＰＥＨ９株は、ｐＨが５．８〜６．０の範囲において、３１２〜３９３（５日間の平均値で３４８）ｍＬ−Ｈ２／ｇ−糖の対糖収率で効率よく水素を生産することができた。すなわち、実施例２の結果を併せると、ＰＥＨ９株は、ｐＨが少なくとも５．０〜６．０の範囲において少なくとも２７０ｍＬ−Ｈ２／ｇ−糖以上の対糖収率で水素を生産できることが確認された。
【００４７】
［実施例４］
実施例４においては、様々な温度で水素発酵を行った。本微生物としては、ＰＥＨ９株を用いた。培養液としては、０．５％（ｗ／ｖ）のキシロース、１．６％（ｗ／ｖ）のトリプトン、１．０％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、０．４％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムを含む水溶液を用いた。
【００４８】
そして、容積が２０ｍＬのバイアル中で、１０ｍＬの培養液にＰＥＨ９株を接種し、バイアルを密閉した後、嫌気条件下、３０℃、３７℃、４５℃、５５℃、６０℃、６５℃又は７０℃の温度でそれぞれ回分培養を実施した。
【００４９】
培養開始から２０時間後、９０時間後に、バイアルにシリンジを突き刺して発酵ガスの生産量を求め、また実施例１と同様にして当該発酵ガスの組成をガスクロマトグラフィーにより測定し、当該測定結果から水素の生産量を算出した。また、培養液中におけるＰＥＨ９株の菌密度を評価するため、ガス分析終了後、分光光度計を用いて、培養液の濁度（波長６６０ｎｍにおける吸光度）を測定した。なお、この実施例４において、培養液のｐＨは、培養開始時に６．０〜６．５の範囲であり、培養時間の経過に伴って徐々に低下し、９０時間の時点では４．５〜５．０となった。
【００５０】
図６には、各温度で培養した場合における培養液の濁度を測定した結果を示す。図６において、横軸は培養時間（時間）、縦軸は濁度を示し、白抜き丸印は３０℃、白抜き四角印は３７℃、黒塗り四角印は４５℃、白抜き三角印は５５℃、黒塗り三角印は６０℃、白抜き菱形印は６５℃、黒塗り菱形印は７０℃における測定結果をそれぞれ示す。
【００５１】
図６に示すように、ＰＥＨ９株は、４５℃、５５℃、６０℃、６５℃の各温度で、培養２０時間、９０時間の各時点で良好に生育し、特に、４５℃、５５℃、６０℃では良好に生育し、５５℃及び６０℃で最も良好に生育していた。また、ＰＥＨ９株は、３７℃においても、少なくとも培養９０時間の時点では、他の温度と同程度まで良好に生育していた。一方、ＰＥＨ９株は、３０℃、７０℃においては、培養２０時間、９０時間のいずれの時点においても良好に生育しなかった。
【００５２】
図７には、水素の生産量を測定した結果を示す。図７において、横軸は培養温度（℃）、縦軸は培養液の１ｍＬあたりに生産された水素の量（ｍＬ−Ｈ２／ｍＬ−培地）を示し、黒塗りの棒は培養開始から２０時間経過時点までに生産された水素量の測定結果、白抜きの棒は培養開始から９０時間経過時点までに生産された水素量の測定結果をそれぞれ示す。
【００５３】
図７に示すように、ＰＥＨ９株は、３７℃、４５℃、５５℃、６０℃、６５℃の各温度で効率よく水素を生産することができた。具体的に、培養２０時間の時点での水素生産量は、３７℃では僅かであったが、４５℃と６５℃とでは３７℃の場合より高く同程度であり、５５℃では更に高く、６０℃において最も高かった。
【００５４】
また、培養９０時間の時点での水素生産量は、３７℃と６５℃では同程度であり、６０℃はそれより高く、４５℃では更に高く、５５℃において最も高かった。３０℃、７０℃においては、培養２０時間、９０時間のいずれの時点においても水素はほとんど生産されなかった。
【００５５】
このように、ＰＥＨ９株は、３７℃以上、６５℃以下の広い温度範囲で効率よく水素を生産することができた。また、ＰＥＨ９株は、４５℃以上、６０℃以下の温度範囲で高い水素生産能力を示し、特に、５５℃では高い水素生産能力を示した。
【００５６】
［実施例５］
実施例５においては、本微生物の溶解性について確認した。本微生物としては、ＰＥＨ９株を用いた。また、対照として、排水処理に使用されているメタン菌（メタン発酵微生物群）を用いた。培養液としては、１Ｌの精製水に、１０．００ｇのキシロース、４．００ｇの酵母エキス、２．５０ｇのＭＯＰＳ、０．９１ｇのＫ２ＨＰＯ４、０．３０ｇのＮａＨ２ＰＯ４、０．２０ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２０、０．１０ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２０、０．３０ｇの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．０２ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４０ｇのＬ−システイン、１．１０ｍｇのレザズリンを溶解したＧＢＧ培地を用いた。
【００５７】
そして、容量が５Ｌの連続培養装置（エイブル株式会社製）に２．５ＬのＧＢＧ培地を入れ、ＰＥＨ９株を接種し、ｐＨ５．８〜６．０、温度５５℃に制御して培養を行った。一方、対照としたメタン菌は、ｐＨ７．４〜７．６、温度３７℃に制御して培養を行った。
【００５８】
培養液をサンプリングして全糖値を測定し、栄養源（糖質）が枯渇した時点（キシロース濃度が５００ｍｇ／Ｌ以下になった時点）を培養１日目として、その後、２日目、７日目に培養液中の菌体量を測定した。
【００５９】
菌体量の測定は、培養液３００ｍＬをサンプリングし、当該培養液を６０００ｒｐｍ（ｒｏｕｎｄ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）で２０分間遠心分離し、上澄みを除去した後、蒸留水にて菌体を洗浄し、再度同条件で遠心分離して得られた菌体を１５０℃で一晩乾熱した後の重量を測定した。菌体量は、１日目の菌体量を１００とした場合の相対値（以下、「残存率」という）で示した。
【００６０】
図８には、菌体量の測定結果を示す。図８において、横軸は培養日数（日）、縦軸は残存率（％）を示し、三角印はＰＥＨ９株、四角印はメタン菌の結果をそれぞれ示す。
【００６１】
図８に示すように、ＰＥＨ９株は、培養２日目、７日目において菌体量の減少がメタン菌と比較して大きく、自己溶菌しやすいことが確認された。具体的に、メタン菌の残存率は培養２日目で９４％、培養７日目で７７％であったのに対し、ＰＥＨ９株の残存率は、培養２日目では７２％、培養７日目では４８％であった。
【００６２】
[実施例６]
実施例６においては、様々な糖類を単一の糖源として添加して水素発酵を行った。本微生物としては、ＰＥＨ９株を用いた。培地としては、０．５％（ｗ／ｖ）のキシロース、１．６％（ｗ／ｖ）のトリプトン、１．０％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、０．４％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムを含み、グルコース、キシロース、アラビノース、マルトース、スクロース、セロビオース、可溶性デンプンのうちいずれか１種類を２％（ｗ／ｖ）添加した７種類の水溶液を用いた。
【００６３】
そして、容積が２０ｍＬのバイアル中で、１０ｍＬの各培地にＰＥＨ９株を接種し、バイアルを密閉した後、嫌気条件下、６０℃の温度でそれぞれ回分培養を実施した。
【００６４】
培養開始から４８時間後に、バイアルにシリンジを突き刺して発酵ガスの生産量を求め、また当該発酵ガスの組成を実施例１と同様にガスクロマトグラフィーにより測定し、当該測定結果から水素の生産量を算出した。
【００６５】
この結果、１０ｍＬの培養液あたり培養４８時間で生産された水素の量は、糖源としてグルコース、キシロース、アラビノース、マルトース、スクロース、セロビオース、可溶性デンプンを用いた場合にはそれぞれ、７．００ｍＬ、６．６６ｍＬ、１．７５ｍＬ、６．３２ｍＬ、７．００ｍＬ、６．７０ｍＬ、４．１０ｍＬであった。なお、糖源を含まない培養液中での水素の生産量は０．０８ｍＬであった。このように、ＰＥＨ９株は、様々な糖源を消費して水素を生産できることが確認された。
【００６６】
なお、本微生物は、上述の例に限られない。すなわち、例えば、本微生物としては、ＰＥＨ９株の変異株を用いることができる。変異株を取得するための変異原処理の方法としては、紫外線照射による変異原処理や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを含む培地中にて微生物を培養する変異原処理等を挙げることができる。この変異株としては、上述したようなＰＥＨ９株が備える低ｐＨ範囲、高温範囲で効率よく水素を生産する能力を継承したものを好ましく用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の一実施形態に係る微生物の様々なｐＨにおける水素生産性を示す図である。
【図２】対照とする他の微生物の様々なｐＨにおける水素生産性を示す図である。
【図３】対照とする更に他の微生物の様々なｐＨにおける水素生産性を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る微生物のｐＨ５．０〜５．２における水素生産性を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る微生物のｐＨ５．８〜６．０における水素生産性を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る微生物の様々な温度における生育を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態に係る微生物の様々な温度における水素生産性を示す図である。
【図８】本発明の一実施形態に係る微生物の自己溶解性を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規微生物に関し、特に、水素を生産できる新規微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
水素は、燃料電池等に利用可能なエネルギー源として注目されている。この水素を生産する方法の一つとして、水素を生産する微生物を用いた水素発酵がある（例えば、特許文献１）。
【特許文献１】特開平４−１６９１７８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の水素発酵に用いられる微生物は、ｐＨが低い範囲での水素生産能力が十分なものとはいえなかった。また、従来の水素発酵においては、雑菌の混入等の問題により水素の生産性が低下することがあった。
【０００４】
これに対し、本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、水素の生産に適した新規な微生物を得て本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施形態に係る微生物は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに２００７年３月２日付けで受領された受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０７９３のサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）菌株であることを特徴とする。また、本発明の一実施形態に係る微生物は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０７９３のサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム菌株の変異株であって、ｐＨが４．５以上、６．５以下の範囲で培養した場合に、糖１ｇから２７０ｍＬ以上の水素を生産することを特徴とする。この微生物は、特に、ｐＨが５．０以上、６．０以下の範囲で培養した場合に、糖１ｇから２７０ｍＬ以上の水素を生産することを特徴とする。また、本発明の一実施形態に係る微生物は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０７９３のサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム菌株の変異株であって、糖源としてキシロースを用いて、ｐＨが４．５以上、６．５以下の範囲で培養した場合に、キシロースに対して２．１以上のモル比で水素を生産することを特徴とする。この微生物は、特に、糖源としてキシロースを用いて、ｐＨが４．８以上、５．５以下の範囲で培養した場合に、キシロースに対して２．１以上のモル比で水素を生産することを特徴とする。本発明によれば、水素の生産に適した新規な微生物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の一実施形態に係る微生物について以下に説明する。なお、本発明に係る微生物は、本実施形態に示すものに限られない。
【０００７】
本実施形態に係る微生物（以下、「本微生物」という）は、受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０７９３のサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム菌株（以下、「ＰＥＨ９株」という）及びその変異株である。本微生物は、グラム陽性であり、偏性嫌気性であり、その形態は桿菌様である。
【０００８】
そして、本微生物は、糖類を代謝することによって水素を生産することができる。すなわち、本微生物は、培養液中において、糖類から、酢酸、酪酸等の有機酸を生成するとともに、二酸化炭素と水素とを含むガス（以下、「発酵ガス」という）を生成することができる。
【０００９】
本微生物が水素を生産する上で利用できる糖類は特に限られないが、例えば、植物由来のバイオマスや食品廃棄物に含まれる糖類を利用することができ、具体的には、多糖（デンプン、セルロース等）、オリゴ糖、二糖、単糖（キシロース、グルコース等）を利用することができる。
【００１０】
また、本微生物は、広いｐＨ範囲で水素を生産することができ、また、低いｐＨ範囲で効率よく水素を生産することができる。すなわち、本微生物は、培養液のｐＨが４．５以上、７．０以下の範囲で水素を生産することができ、好ましくは４．８以上、５．５以下の範囲、特に好ましくは５．０以上、５．２以下の範囲で効率よく水素を生産することができる。ｐＨが４．５より低い場合、及びｐＨが７．０より高い場合には、本微生物による水素の生産効率が低下する。
【００１１】
一方、本微生物を用いた水素発酵においては、ｐＨを５．５以下とすることにより、水素を生産しない他の微生物が混入することによるコンタミネーションの発生を効果的に抑制することができる。例えば、メタン発酵菌は、ｐＨが７．０より低くなるとメタンの生産能力が低下するものが多いため、本微生物を用いることにより、水素発酵におけるメタン発酵菌のコンタミネーションを抑制することができる。
【００１２】
また、例えば、水素発酵を第一の培養槽で行い、当該第一の培養層における水素発酵後の残渣を利用したメタン発酵を第二の培養槽で行う二段階の発酵システムにおいては、当該第一の培養槽における水素発酵に本微生物を用いてｐＨを５．５以下とすることにより、当該第一の培養槽にメタン発酵菌が混入した場合であっても、当該第一の培養槽における当該メタン発酵菌によるメタンの生産を効果的に抑制し、当該第一の培養槽において水素の含有率が高い発酵ガスを生産することができる。
【００１３】
また、例えば、水素発酵の上流側に、植物由来のバイオマスを分解してエタノール等のバイオ燃料を生産する前処理工程を有する燃料生産システムにおいては、当該前処理工程において、当該バイオマスに含まれる植物繊維素を単糖や二糖にまで低分子化するため、酸が用いられることがある。この場合、前処理工程で酸性化された残渣を含む培養液が水素発酵に供されることになるが、当該水素発酵に本微生物を用いることにより、当該培養液に添加する中和剤の量を、従来に比して効果的に低減することができる。
【００１４】
また、本微生物を用いて低いｐＨ範囲で水素発酵を行う場合には、酸化還元電位との関係から、当該本微生物の細胞内で生産された水素の当該細胞外への放出が促進されることも期待できる。
【００１５】
また、本微生物は、特に、低いｐＨ範囲において、消費した糖に対する生産した水素の比率（生産水素量／消費糖量）（以下、「対糖収率」という）を高いレベルで達成することができる。すなわち、本微生物は、培養液に添加する糖類としてキシロースを用いた場合には、ｐＨが４．５以上、７．０以下の範囲において、培養液中の消費したキシロース量に対する対糖収率（ｍｏｌ−Ｈ２／ｍｏｌ−ｘｙｌｏｓｅ）が１．６以上で水素を生産することができる。
【００１６】
特に、本微生物は、ｐＨが４．５以上、６．５以下の範囲において、培養液に含まれる１モルのキシロースから２．１モル以上の水素を生産することができる（すなわち、２．１以上の対糖収率で水素を生産することができる）。
【００１７】
また、本微生物は、広い温度範囲で水素を生産することができ、また、高い温度範囲で効率よく水素を生産することができる。すなわち、本微生物は、温度が３７℃以上、６５℃以下の範囲で水素を生産することができ、好ましくは４５℃以上、６０℃以下の範囲、より好ましくは５０℃以上、６０℃以下の範囲、特に好ましくは５５℃以上、６０℃以下の範囲で効率よく水素を生産することができる。温度が３７℃より低い場合、及び温度が６５℃より高い場合には、本微生物による水素の生産効率が低下する。
【００１８】
一方、温度が５５℃以上の範囲では、水素を生産しない他の微生物が混入することによるコンタミネーションを効果的に抑制しつつ、本微生物による水素発酵を効果的に行うことができる。また、温度が５０℃以上の範囲では、水素発酵の上流側で行われる工程で発生した熱の当該水素発酵への影響を低減することができる。
【００１９】
すなわち、例えば、上述のように、水素発酵の上流側にバイオマスからバイオ燃料を製造する前処理工程を有する燃料生産システムにおいては、当該前処理工程で植物繊維素を酸やアルカリなどの存在下、８０〜２３０℃に加熱して分解することがある。この場合、前処理工程で加熱された残渣を含む培養液が水素発酵に供されることになるが、当該水素発酵に本微生物を用いることにより、当該培養液に対する冷却操作を省略し、又は従来に比して効果的に軽減することができる。
【００２０】
また、本微生物は、広い範囲のｐＨと、広い範囲の温度と、を任意に組み合わせた条件で水素を生産することができ、特に、従来の水素発酵用微生物に比べて、低いｐＨと、高い温度と、を組み合わせた条件で効率よく水素を生産することができる。
【００２１】
すなわち、本微生物は、例えば、ｐＨが４．５以上、６．５以下の範囲であって、且つ温度が５５℃以上、６０℃以下の範囲の条件下で２．１以上の対糖収率で水素を生産することができる。
【００２２】
このように、本微生物を用いて、低ｐＨ、高温で水素発酵を行うことにより、上述のとおり、当該水素発酵において、雑菌によるコンタミネーションを極めて効果的に抑制することができるとともに、上流側に設けられたバイオ燃料製造工程の影響を解消するために行う培養液の中和操作や冷却操作を従来に比して効果的に低減することができる。
【００２３】
また、本微生物は、所定の条件において容易に自己溶解することができる。すなわち、本微生物は、例えば、培養液に含まれる所定の栄養成分の濃度が所定値を下回った場合には、その細胞体が容易に崩壊する。
【００２４】
具体的に、例えば、糖源にキシロースを用いた培養液中で本微生物を培養する場合には、当該培養液中のキシロース濃度を５００ｍｇ／Ｌ以下とすることにより、本微生物は自己溶解を開始する。したがって、本微生物を用いた水素発酵においては、水素発酵終了後に残存する汚泥の量を効果的に低減することができる。
【００２５】
次に、本微生物を用いて水素発酵を行った具体例について説明する。
【００２６】
［実施例１］
実施例１においては、様々なｐＨで水素発酵を行った。本微生物としては、ＰＥＨ９株を用いた。また、比較の対照として、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカムであってＰＥＨ９株とは異なる菌株であるＰＥＨ８株とＡＴＣＣ７９５６株とを用いた。培地としては、１．０％（ｗ／ｖ）のキシロース、０．４％（ｗ／ｖ）の酵母エキス（極東製薬）、０．２５％（ｗ／ｖ）のＭＯＰＳ、０．０９１％（ｗ／ｖ）のＫ２ＨＰＯ４、０．０３％（ｗ／ｖ）のＮａＨ２ＰＯ４、０．０２％（ｗ／ｖ）のＭｇＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）のＣａＣｌ２、０．０３％（ｗ／ｖ）の(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．００２％（ｗ／ｖ）のＦｅＳＯ４、０．０４％（ｗ／ｖ）のＬ−システイン、０．１１％（ｗ／ｖ）のレザズリンを含む水溶液を用いた。
【００２７】
ここで、ＰＥＨ９株とＰＥＨ８株の取得過程について簡単に説明する。すなわち、まず、下水処理施設から採取した高温嫌気消化汚泥をビール製造排水にて約一ヶ月間馴養し、水素５０〜６０％、二酸化炭素４０〜５０％を安定して生産する水素発酵フローラを得た。このフローラから変法ＧＡＭ培地（嫌気性菌分離用、日本水産株式会社製）を用いて２４の菌株を単離し、その中から最も高い水素生産性を示した菌株をＰＥＨ８株として取得した。次に、このＰＥＨ８株から、紫外線照射法により変異株を取得した。
【００２８】
そして、変異原処理を施した１０万の菌株の中から、ｐＨ５．０以下で生育する１２の菌株を選抜し、更にこの中から水素発酵性に優れた１つの菌株をＰＥＨ９株として取得した。
【００２９】
一方、ＡＴＣＣ７９５６株は、ＰＥＨ８株の１６ＳｒＤＮＡ全領域の配列を決定し、当該配列を基に系統解析を行った結果、当該ＰＥＨ８株と最も近縁と判断された既存の菌株である。ＰＥＨ８株とＡＴＣＣ７９５６との異同を決定する目的でＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成試験を行ったところ、３回の試験によるこれらの相同値の平均は７０％以上であることが確認された。
【００３０】
そして、容積が１Ｌの発酵槽（ＢＭＪ−０１、エイブル株式会社製）中で、５００ｍＬの培地にＰＥＨ９株、ＰＥＨ８株、又はＡＴＣＣ７９５６株を接種し、嫌気条件下、希釈率０．２〜０．４にて連続培養を実施した。
【００３１】
培養温度は、５５℃で一定に維持した。また、培養液への水酸化ナトリウム水溶液の自動添加により当該培養液のｐＨを４．５〜７．０の範囲で段階的に変化させた。
【００３２】
そして、ｐＨが４．５〜７．０の範囲内の様々な値になった場合におけるＰＥＨ９株、ＰＥＨ８株、又はＡＴＣＣ７９５６株による水素の生産量を評価した。すなわち、発生する発酵ガスをテドラーバックにて捕集して２４時間あたりに発生した発酵ガスの量を測定した。発酵ガスの組成は熱伝導度検出器（ＴＣＤ）付きガスクロマトグラフィー装置（ＧＣ−１４Ｂ、株式会社島津製作所製）によって分析し、当該発酵ガスに含まれる水素の割合から水素の生産量を算出した。このガスクロマトグラフィー分析は、キャリアガスとして高純度アルゴンガスを用い、カラム担体としてモレキュラーシーブ５Å及びポラパックＱを用い、注入口温度を６０℃とし、検出器温度を８０℃とし、カラムオーブン温度を６０℃として行った。また、培地及び培養液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）した後の上清をメンブランろ過（孔径０．２μｍ）して得られた試料を蛍光検出器付き高速液体クロマトグラフィー（還元糖分析システム、株式会社島津製作所製）を用いて分析することにより、当該培地及び培養液に含まれるキシロースの量を測定した。この高速液体クロマトグラフィー分析は、カラム（ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＩＳＡ−０７／Ｓ２５０４、長さ２５０ｍｍ×直径４．０ｍｍ、株式会社島津製作所製)を用い、移動相はＡ液（０．１Ｍホウ酸カリウム緩衝液）１００％からＢ液（０．４Ｍホウ酸カリウム緩衝液）１００％へのグラジエント溶離とし、液流量は０．６ｍＬ／分、温度は６５℃にて行った。また、キシロースの検出は、１％（ｗ／ｖ）のアルギニン及び３％（ｗ／ｖ）のホウ酸を含む反応試薬を用い、当該反応試薬の流量を０．５ｍＬ／分とし、反応温度を１５０℃とし、蛍光検出器の励起波長（Ｅｘ）は３２０ｎｍ、蛍光波長（Ｅｍ）は４３０ｎｍとして行った。また、水素生産量の測定時における培養液中の菌体密度は、およそ１０６〜１０７細胞個/ｍＬであった。
【００３３】
図１、図２、図３には、それぞれＰＥＨ９株、ＰＥＨ８株、ＡＴＣＣ７９５６株による水素の生産性についての測定結果を示す。図１〜図３において、横軸は培養液のｐＨ、縦軸は対糖収率（ｍｏｌ−Ｈ２／ｍｏｌ−ｘｙｌｏｓｅ）である。
【００３４】
図１に示すように、ＰＥＨ９株は、キシロースを糖源として含む培養液を用いた場合には、ｐＨが４．５〜７．０という広範な範囲において、良好に生育するとともに、１．６〜３．２ｍｏｌ−Ｈ２／ｍｏｌ−ｘｙｌｏｓｅという高い対糖収率で水素を生産することができた。特に、ＰＥＨ９株は、ｐＨが４．８以上、５．５以下という低い範囲においても、２．１以上という比較的高い対糖収率で水素を生産することができた。
【００３５】
具体的に、ＰＥＨ９株は、ｐＨが４．８６、５．０２、５．０６、５．０８、５．１０、５．１４、５．１５、５．３６、５．３８の場合において、それぞれ２．１３、２．２３、２．２３、２．３８、２．６２、２．６１、２．２４、２．４０、２．３１の対糖収率で水素を生産することができた。また、ＰＥＨ９株は、ｐＨが５．８６〜６．２５の場合においては２．１３〜３．１６の対糖収率で水素を生産することができ、ｐＨが６．５４の場合には１．７８の対糖収率で水素を生産することができた。
【００３６】
これに対し、図２に示すように、ＰＥＨ８株の対糖収率は、ｐＨ５．５以下において顕著に低下し、例えば、ｐＨ５．５０における対糖収率は０．８１であった。また、図３に示すように、ＡＴＣＣ７９５６株の対糖収率は、ｐＨが５．５、５．３２の場合において、それぞれ０．７３、０．３６であった。このように、ＰＥＨ９株は、低いｐＨ範囲（例えば、少なくともｐＨが４．８以上、６．３以下の範囲）において、水素を効率よく生産することが確認された。
【００３７】
［実施例２］
実施例２においては、ｐＨ５．０〜５．２の範囲における水素の生産性を１Ｌスケールで確認した。本微生物としては、ＰＥＨ９株を用いた。培地としては、１．０％（ｗ／ｖ）のキシロース、２％（ｗ／ｖ）のペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、１．０％（ｗ／ｖ）の麦芽エキス、０．３％（ｗ／ｖ）のＫ２ＨＰＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）のＭｇＳＯ４、０．０２％（ｗ／ｖ）のＬ−システイン、０．２％（ｗ／ｖ）のＬ−リンゴ酸、０．００３％（ｗ／ｖ）のオレイン酸、０．１％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０を含む水溶液を用いた。そして、容積が１Ｌの発酵槽（ＢＭＪ−０１、エイブル株式会社製）中で５００ｍＬの培地にＰＥＨ９株を接種し、嫌気条件下、希釈率０．３〜０．４にて連続培養を実施した。
【００３８】
培養温度は５５℃で一定に維持した。培養液のｐＨは、培養液への水酸化ナトリウム水溶液の自動添加により５．０〜５．２の範囲に制御した。
【００３９】
培養液中におけるＰＥＨ９株の増殖が安定したことを確認した後、５日間の培養期間における２４時間あたりの発酵ガスの生産量と、当該発酵ガスの組成と、を実施例１と同様にしてガスクロマトグラフィーにより測定し、当該測定結果から水素の生産量を算出した。また、本実施例で用いた培地は、キシロース以外に麦芽エキス由来の糖（マルトース、グルコースなど）を含むため、培地及び培養液についてフェノール硫酸法による全糖分析を行って糖消費量を求めた。また、水素の対糖収率は、消費された糖１ｇあたりの発生量を標準状態（標準環境温度と圧力：温度２５℃、気圧１ｂａｒ）における体積で示した。
【００４０】
図４には、ＰＥＨ９株の水素生産性の測定結果を示す。図４において、横軸は培養日数（日）、左縦軸は各培養日の１日間に生産された発酵ガスの量（ｍＬ／日）、右縦軸は当該発酵ガスに含まれる水素の体積比率（％）、をそれぞれ示し、白抜きの棒は発酵ガスの生産量、三角印は水素の体積比率を示す。
【００４１】
図４に示すように、ＰＥＨ９株は、水素を含む発酵ガスを５日間に亘り安定して生産することができた。具体的に、５日間の平均値として、発酵ガス生産量は１３１２ｍＬ／日、水素の体積比率は５６．４％、水素の生産量は７４０ｍＬ／日、培養液の供給量は１５４ｍＬ／日、供給された培養液に含まれていた糖の全量は１６２００ｍｇ／Ｌ、排出された培養液に含まれていた糖の全量は４６６ｍｇ／Ｌであった。
【００４２】
そして、ＰＥＨ９株は、ｐＨが５．０〜５．２の範囲において、２７７〜３２６（５日間の平均値で３０６）ｍＬ−Ｈ２／ｇ−糖の対糖収率で効率よく水素を生産することができた。すなわち、ＰＥＨ９株は、ｐＨが５．０〜５．２の範囲において少なくとも２７０ｍＬ−Ｈ２／ｇ−糖以上の対糖収率で水素を生産できることが確認された。
【００４３】
［実施例３］
実施例３においては、ｐＨ５．８〜６．０の範囲における水素の生産性を１Ｌスケールで確認した。ｐＨの範囲が異なる点を除き、上述の実施例２と同様の条件で水素発酵を行った。
【００４４】
図５には、ＰＥＨ９株の水素生産性の測定結果を示す。図５において、横軸は培養日数（日）、左縦軸は各培養日の１日間に生産された発酵ガスの量（ｍＬ／日）、右縦軸は当該発酵ガスに含まれる水素の体積比率（％）、をそれぞれ示し、白抜きの棒は発酵ガスの生産量、三角印は水素の体積比率を示す。
【００４５】
図５に示すように、ＰＥＨ９株は、水素を含む発酵ガスを５日間に亘り安定して生産することができた。具体的に、５日間の平均値として、発酵ガスの生成量は１６７６ｍＬ／日、水素の体積比率は５８．８％、水素の生産量は９８５ｍＬ／日、培養液の供給量は１７９ｍＬ／日、供給された培養液に含まれていた糖の全量は１６２００ｍｇ／Ｌ、排出された培養液に含まれていた糖の全量は３７２ｍｇ／Ｌであった。
【００４６】
そして、ＰＥＨ９株は、ｐＨが５．８〜６．０の範囲において、３１２〜３９３（５日間の平均値で３４８）ｍＬ−Ｈ２／ｇ−糖の対糖収率で効率よく水素を生産することができた。すなわち、実施例２の結果を併せると、ＰＥＨ９株は、ｐＨが少なくとも５．０〜６．０の範囲において少なくとも２７０ｍＬ−Ｈ２／ｇ−糖以上の対糖収率で水素を生産できることが確認された。
【００４７】
［実施例４］
実施例４においては、様々な温度で水素発酵を行った。本微生物としては、ＰＥＨ９株を用いた。培養液としては、０．５％（ｗ／ｖ）のキシロース、１．６％（ｗ／ｖ）のトリプトン、１．０％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、０．４％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムを含む水溶液を用いた。
【００４８】
そして、容積が２０ｍＬのバイアル中で、１０ｍＬの培養液にＰＥＨ９株を接種し、バイアルを密閉した後、嫌気条件下、３０℃、３７℃、４５℃、５５℃、６０℃、６５℃又は７０℃の温度でそれぞれ回分培養を実施した。
【００４９】
培養開始から２０時間後、９０時間後に、バイアルにシリンジを突き刺して発酵ガスの生産量を求め、また実施例１と同様にして当該発酵ガスの組成をガスクロマトグラフィーにより測定し、当該測定結果から水素の生産量を算出した。また、培養液中におけるＰＥＨ９株の菌密度を評価するため、ガス分析終了後、分光光度計を用いて、培養液の濁度（波長６６０ｎｍにおける吸光度）を測定した。なお、この実施例４において、培養液のｐＨは、培養開始時に６．０〜６．５の範囲であり、培養時間の経過に伴って徐々に低下し、９０時間の時点では４．５〜５．０となった。
【００５０】
図６には、各温度で培養した場合における培養液の濁度を測定した結果を示す。図６において、横軸は培養時間（時間）、縦軸は濁度を示し、白抜き丸印は３０℃、白抜き四角印は３７℃、黒塗り四角印は４５℃、白抜き三角印は５５℃、黒塗り三角印は６０℃、白抜き菱形印は６５℃、黒塗り菱形印は７０℃における測定結果をそれぞれ示す。
【００５１】
図６に示すように、ＰＥＨ９株は、４５℃、５５℃、６０℃、６５℃の各温度で、培養２０時間、９０時間の各時点で良好に生育し、特に、４５℃、５５℃、６０℃では良好に生育し、５５℃及び６０℃で最も良好に生育していた。また、ＰＥＨ９株は、３７℃においても、少なくとも培養９０時間の時点では、他の温度と同程度まで良好に生育していた。一方、ＰＥＨ９株は、３０℃、７０℃においては、培養２０時間、９０時間のいずれの時点においても良好に生育しなかった。
【００５２】
図７には、水素の生産量を測定した結果を示す。図７において、横軸は培養温度（℃）、縦軸は培養液の１ｍＬあたりに生産された水素の量（ｍＬ−Ｈ２／ｍＬ−培地）を示し、黒塗りの棒は培養開始から２０時間経過時点までに生産された水素量の測定結果、白抜きの棒は培養開始から９０時間経過時点までに生産された水素量の測定結果をそれぞれ示す。
【００５３】
図７に示すように、ＰＥＨ９株は、３７℃、４５℃、５５℃、６０℃、６５℃の各温度で効率よく水素を生産することができた。具体的に、培養２０時間の時点での水素生産量は、３７℃では僅かであったが、４５℃と６５℃とでは３７℃の場合より高く同程度であり、５５℃では更に高く、６０℃において最も高かった。
【００５４】
また、培養９０時間の時点での水素生産量は、３７℃と６５℃では同程度であり、６０℃はそれより高く、４５℃では更に高く、５５℃において最も高かった。３０℃、７０℃においては、培養２０時間、９０時間のいずれの時点においても水素はほとんど生産されなかった。
【００５５】
このように、ＰＥＨ９株は、３７℃以上、６５℃以下の広い温度範囲で効率よく水素を生産することができた。また、ＰＥＨ９株は、４５℃以上、６０℃以下の温度範囲で高い水素生産能力を示し、特に、５５℃では高い水素生産能力を示した。
【００５６】
［実施例５］
実施例５においては、本微生物の溶解性について確認した。本微生物としては、ＰＥＨ９株を用いた。また、対照として、排水処理に使用されているメタン菌（メタン発酵微生物群）を用いた。培養液としては、１Ｌの精製水に、１０．００ｇのキシロース、４．００ｇの酵母エキス、２．５０ｇのＭＯＰＳ、０．９１ｇのＫ２ＨＰＯ４、０．３０ｇのＮａＨ２ＰＯ４、０．２０ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２０、０．１０ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２０、０．３０ｇの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．０２ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４０ｇのＬ−システイン、１．１０ｍｇのレザズリンを溶解したＧＢＧ培地を用いた。
【００５７】
そして、容量が５Ｌの連続培養装置（エイブル株式会社製）に２．５ＬのＧＢＧ培地を入れ、ＰＥＨ９株を接種し、ｐＨ５．８〜６．０、温度５５℃に制御して培養を行った。一方、対照としたメタン菌は、ｐＨ７．４〜７．６、温度３７℃に制御して培養を行った。
【００５８】
培養液をサンプリングして全糖値を測定し、栄養源（糖質）が枯渇した時点（キシロース濃度が５００ｍｇ／Ｌ以下になった時点）を培養１日目として、その後、２日目、７日目に培養液中の菌体量を測定した。
【００５９】
菌体量の測定は、培養液３００ｍＬをサンプリングし、当該培養液を６０００ｒｐｍ（ｒｏｕｎｄ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ）で２０分間遠心分離し、上澄みを除去した後、蒸留水にて菌体を洗浄し、再度同条件で遠心分離して得られた菌体を１５０℃で一晩乾熱した後の重量を測定した。菌体量は、１日目の菌体量を１００とした場合の相対値（以下、「残存率」という）で示した。
【００６０】
図８には、菌体量の測定結果を示す。図８において、横軸は培養日数（日）、縦軸は残存率（％）を示し、三角印はＰＥＨ９株、四角印はメタン菌の結果をそれぞれ示す。
【００６１】
図８に示すように、ＰＥＨ９株は、培養２日目、７日目において菌体量の減少がメタン菌と比較して大きく、自己溶菌しやすいことが確認された。具体的に、メタン菌の残存率は培養２日目で９４％、培養７日目で７７％であったのに対し、ＰＥＨ９株の残存率は、培養２日目では７２％、培養７日目では４８％であった。
【００６２】
[実施例６]
実施例６においては、様々な糖類を単一の糖源として添加して水素発酵を行った。本微生物としては、ＰＥＨ９株を用いた。培地としては、０．５％（ｗ／ｖ）のキシロース、１．６％（ｗ／ｖ）のトリプトン、１．０％（ｗ／ｖ）の酵母エキス、０．４％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムを含み、グルコース、キシロース、アラビノース、マルトース、スクロース、セロビオース、可溶性デンプンのうちいずれか１種類を２％（ｗ／ｖ）添加した７種類の水溶液を用いた。
【００６３】
そして、容積が２０ｍＬのバイアル中で、１０ｍＬの各培地にＰＥＨ９株を接種し、バイアルを密閉した後、嫌気条件下、６０℃の温度でそれぞれ回分培養を実施した。
【００６４】
培養開始から４８時間後に、バイアルにシリンジを突き刺して発酵ガスの生産量を求め、また当該発酵ガスの組成を実施例１と同様にガスクロマトグラフィーにより測定し、当該測定結果から水素の生産量を算出した。
【００６５】
この結果、１０ｍＬの培養液あたり培養４８時間で生産された水素の量は、糖源としてグルコース、キシロース、アラビノース、マルトース、スクロース、セロビオース、可溶性デンプンを用いた場合にはそれぞれ、７．００ｍＬ、６．６６ｍＬ、１．７５ｍＬ、６．３２ｍＬ、７．００ｍＬ、６．７０ｍＬ、４．１０ｍＬであった。なお、糖源を含まない培養液中での水素の生産量は０．０８ｍＬであった。このように、ＰＥＨ９株は、様々な糖源を消費して水素を生産できることが確認された。
【００６６】
なお、本微生物は、上述の例に限られない。すなわち、例えば、本微生物としては、ＰＥＨ９株の変異株を用いることができる。変異株を取得するための変異原処理の方法としては、紫外線照射による変異原処理や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを含む培地中にて微生物を培養する変異原処理等を挙げることができる。この変異株としては、上述したようなＰＥＨ９株が備える低ｐＨ範囲、高温範囲で効率よく水素を生産する能力を継承したものを好ましく用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の一実施形態に係る微生物の様々なｐＨにおける水素生産性を示す図である。
【図２】対照とする他の微生物の様々なｐＨにおける水素生産性を示す図である。
【図３】対照とする更に他の微生物の様々なｐＨにおける水素生産性を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る微生物のｐＨ５．０〜５．２における水素生産性を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る微生物のｐＨ５．８〜６．０における水素生産性を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る微生物の様々な温度における生育を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態に係る微生物の様々な温度における水素生産性を示す図である。
【図８】本発明の一実施形態に係る微生物の自己溶解性を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０７９３のサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム菌株であることを特徴とする微生物。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物の変異株であって、ｐＨが４．５以上、６．５以下の範囲で培養した場合に、糖１ｇから２７０ｍＬ以上の水素を生産することを特徴とする微生物。
【請求項３】
ｐＨが５．０以上、６．０以下の範囲で培養した場合に、糖１ｇから２７０ｍＬ以上の水素を生産することを特徴とする請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
請求項１に記載の微生物の変異株であって、糖源としてキシロースを用いて、ｐＨが４．５以上、６．５以下の範囲で培養した場合に、キシロースに対して２．１以上のモル比で水素を生産することを特徴とする微生物。
【請求項５】
糖源としてキシロースを用いて、ｐＨが４．８以上、５．５以下の範囲で培養した場合に、キシロースに対して２．１以上のモル比で水素を生産することを特徴とする請求項４に記載の微生物。
【請求項１】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０７９３のサーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム菌株であることを特徴とする微生物。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物の変異株であって、ｐＨが４．５以上、６．５以下の範囲で培養した場合に、糖１ｇから２７０ｍＬ以上の水素を生産することを特徴とする微生物。
【請求項３】
ｐＨが５．０以上、６．０以下の範囲で培養した場合に、糖１ｇから２７０ｍＬ以上の水素を生産することを特徴とする請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
請求項１に記載の微生物の変異株であって、糖源としてキシロースを用いて、ｐＨが４．５以上、６．５以下の範囲で培養した場合に、キシロースに対して２．１以上のモル比で水素を生産することを特徴とする微生物。
【請求項５】
糖源としてキシロースを用いて、ｐＨが４．８以上、５．５以下の範囲で培養した場合に、キシロースに対して２．１以上のモル比で水素を生産することを特徴とする請求項４に記載の微生物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−２４５５５０（Ｐ２００８−２４５５５０Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８９４３０（Ｐ２００７−８９４３０）
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（３０３０４０１８３）サッポロビール株式会社 (150)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（３０３０４０１８３）サッポロビール株式会社 (150)
【Ｆターム（参考）】
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