新規７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびその使用
本発明は、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ属のバクテリア、特にＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ株から得られる新規な７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼと、前記酵素をコードする配列と、前記酵素を製造する方法と、コール酸化合物の酵素変換、特にウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造におけるそれらの使用に関する。本発明は新規なＵＤＣＡの合成方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ属のバクテリア、特にＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ株から得ることができる新規７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、これらの酵素をコードする配列、該酵素の生産、およびコール酸化合物の酵素変換における該酵素の使用、特にウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造における該酵素の使用に関し、また本発明の主題はＵＤＣＡの合成のための新規な方法である。
【背景技術】
【０００２】
活性物質ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）および対応するジアステレオマーであるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）は、胆石問題の薬剤処置のために長年使用されて来た。この二つの化合物は、７位の炭素原子上のヒドロキシ基の配位のみにおいて異なる（ＵＤＣＡ：β配位、ＣＤＣＡ：α配位）。ＵＤＣＡの生産のため先行技術には種々の方法が記載されており、これらは純粋に化学的に実施されるか、または化学的および酵素的プロセスステップの組合わせよりなる。どの場合でも出発点はコール酸（ＣＡ）かまたはコール酸から製造されたＣＤＣＡである。
【０００３】
このようにＵＤＣＡ製造のための古典的化学的方法は以下のように概略的に表すことができる。
ＣＡ→ＣＡメチルエステル→３，７−ジアセチル−ＣＡメチルエステル→１２−ケト−３，７−ジアセチル−ＣＡメチルエステル→ＣＤＣＡ→７−ケト−ＬＣＡ→ＵＤＣＡ
重大な欠点は、化学的酸化は選択的でないため、カルボキシ基と、３αおよび７α−ヒドロキシ基をエステル化によって保護しなければならないことである。
【０００４】
酵素１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤＨ）の使用に基づく代替的化学的／酵素的方法は次のように表わすことができ、そして例えば出願人のＰＣＴ／ＥＰ２００９／００２１９０に記載されている。
ＣＡ→１２−ケトＣＤＣＡ→ＣＤＣＡ→７−ケト−ＬＣＡ→ＵＤＣＡ
ここで１２α−ＨＳＤＨはＣＡを１２−ケトＣＤＣＡへ選択的に酸化する。古典的な化学的方法により必要な二つの保護ステップはこれによって不必要になる。
【０００５】
さらにＭｏｎｔｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（Ｏｎｅ−Ｐｏｔ Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ １２−Ｋｅｔｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ Ａｃｉｄ：Ｓｕｂｔｌｅ Ｃｏｆａｃｔｏｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ Ｒｕｌｅ ｔｈｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ ｏｆ Ｆｉｖｅ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ ｉｎ ａ Ｒｏｗ； Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＆ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，２００９）は、代替的酵素−化学的方法を記載し、これは以下のように概略的に表すことができる。
ＣＡ→７，１２−ジケトＬＣＡ→１２−ケトＵＤＣＡ→ＵＤＣＡ
【０００６】
ＣＡは、７，１２−ジケトＬＣＡへＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２５２８５からの７α−ＨＳＤＨ（Ｚｈｕ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ −ｋｅｔｏｅｓｔｅｒｓ ｂｙ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ７−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ； Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００６，６２（１８）：ｐ．４５３５−４５３９）と、１２α−ＨＳＤＨによって最初に酸化される。これら二つの酵素は各自ＮＡＤＨ依存性である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｂｓｏｎｕｍ ＡＴＣＣ ２７５５５（ＤＳＭ５９９）からの７β−ＨＳＤＨ（ＮＡＤＰＨ依存性）（ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｉ．Ａ．ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｒｏａｃｈ，Ｂｉｌｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ７−ａｌｐｈａ−ａｎｄ ７−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｂｓｏｎｕｍ；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １９８１，６６５（２）：ｐ．２６２−９）による還元後に１２−ケトＵＤＣＡが生成する。最終生成物はＷｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元によって得られる。この方法の欠点は、触媒反応の平衡位置のため完全変換が不可能なこと、および変換の最初のステップのため二つの異なる酵素を使用しなければならず、これは操作コストを増加させることである。助因子再生のため、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋の再生のためのＬＤＨ）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰＨの再生のためのＧｌｃＤＨ）が使用される。ここで使用される助因子再生における欠点は、生成した同時生産物を反応混合物から除去するのが非常に困難で、そのため反応平衡を有利に影響させることができず、原料の不完全変換となる。
【０００７】
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６（ＤＳＭ３９７９；以前Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）株からの７β−ＨＳＤＨがＨｉｒａｎｏおよびＭａｓｕｄａによって１９８２年に記載された（Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ａｎｄ Ｎ．Ｍａｓｕｄａ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ７−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｅｐｔｏｓｔｅｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８２，４５（５）：ｐ．１０５７−６３）。この酵素の配列情報は開示されていない。ゲル濾過によって決定された分子量は４５，０００Ｄａであった（Ｈｉｒａｎｏ，１０５９頁左欄を見よ）。さらにこの酵素では７−オキソ基の７β−ヒドロキシ基への還元は観察されなかった（Ｈｉｒａｎｏ，１０６１頁議論第１パラグラフを見よ）。同様に、Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．はＮＡＤＰ＋についてのみＫＭおよびＶｍａｘ値を記載し（それぞれ０．４および０．２）、しかしＮＡＤＰＨについては記載していない。このため当業者は、Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．によって記載された酵素は７位においてＤＨＣＡの３，１２−ジケト−７β−ＣＡへの還元の触媒には不適当であることを認識する。
【０００８】
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６のゲノムは２００７年にすでに配列決定されていたが、その中の解析された配列モチーフのどれも、酵素ファミリーＨＳＤＨ酵素群が属する可能性ある短鎖デヒドロゲナーゼへ帰属させることはできなかった。
【０００９】
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９２，１４，１２，１１３１−１１３５において、Ｃａｒｒｅａ ｅｔ ａｌ．は富化した７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨを使ってＣＡからのＵＤＣＡの製造方法を記載する。しかしながらこの方法の欠点は、病原性微生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｂｓｏｎｕｍからの７β−ＨＳＤＨの使用と、そして望まない７α−ＨＳＤＨ活性を余分に有するバクテリア抽出物からの酵素を調製的に精製する必要性である。
【００１０】
このため本発明の目的は、前述の欠点を回避するＵＤＣＡの新規な製造方法の提供である。特に、３，１２−ジケト−７β−ＣＡへ７位においてＤＨＣＡの立体特異性還元触媒を提供する新規な酵素を提供しなければならない。
【００１１】
さらなる目的は、例えばＵＤＣＡの製造に使用することができ、特に７位におけるコール酸誘導体の立体およびエナンチオ選択的酸化／還元を触媒する新規な７β−ＨＳＤＨの提供にある。
【発明の概要】
【００１２】
驚くべきことに、これらの課題はＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ属の好気性バクテリア、特にＣｏｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ株からの新規な位置および立体特異性７β−ＨＳＤＨの単離およびキャラクタリゼーションと、そしてコール酸化合物の変換、特にＵＤＣＡの製造におけるその使用を通じて解決することができた。
【００１３】
本発明によれば、ＵＤＣＡ製造のための新規な方法が特に提供され、該方法は概略的に以下のように表すことができる。
ＣＡ→ＤＨＣＡ→１２−ケトＵＤＣＡ→ＵＤＣＡ
ここでＣＡの酸化は古典的な化学的方法で簡単に実施される。ＤＨＣＡは７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨにより個々にまたは順次または同時に１２−ケトＵＤＣＡへ還元される。Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元と組合わせて、ＵＤＣＡはこのようにＣＡからたった３工程で合成することができる。
【００１４】
ここでの利益は、この酵素反応は高い転換を可能にし、高い選択性を示し、そして副生物を生成しないことである。組換え生産された酵素７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨは、驚くほど有利にＵＤＣＡの大規模生産を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１ａはＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓからの７β−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示し、図１ｂは、図１ａのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す。図１ｃはＣｏｍａｎｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉからの３α−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示し、図１ｄは図１ｂのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す。図１ｅはＲｕｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓからの３α−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示し、図１ｆは図１ｅのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す。
【図２】図２は本発明に従って調製した精製７β−ＨＳＤＨのＳＤＳゲルを示し、トラック１は精製細胞抽出物、トラック２は精製したタンパク質、トラックＭはＰａｇｅ ＲｏｕｌｅｒＴＭ、 分子量マーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，ドイツ）である。
【図３】図３は、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９から本発明に従って調製された７β−ＨＳＤＨと、選択されたＨＳＤＨタンパク質の配列アラインメントを示す。配列中の保存された残基を目立たせてある。以下の配列寄託番号が適用される。Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓからの１１β−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＮＰ−００５５１６；Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓからの１１β−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＮＰ−００１０３８２１６；Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓからの１１β−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＡＡＳ４７４９１；Ｂｒｕｃｅｌｌａｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓからの７α−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＮＰ−６９８６０８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからの７α−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＮＰ−２８８０５５；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｏｒｄｅｌｌｉからの７α−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＰ５０２００；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉｔｅｓからの３α／２０β−ＨＳＤＳ：スイスポートＰ１９９９２；Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｅｒｏｎｉからの３β／１１β−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＡＡＡ２５７４２；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．からの３α−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＢＡＡ０８８６１；Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉからの３α−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＹＰ−００３２７７３６４；Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからの１７β−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＮＰ−０００４０４；Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａからの２０β−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＮＰ−９９９２３８。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからの１７β−ＨＳＤＨの最後の１７アミノ酸およびＳｕｓ ｓｃｏｒｆａからの２０β−ＨＳＤＨの最後のアミノ酸は、それらから追加のアライメント情報が誘導されないのでアライメント中に示さない。
【図４】図４は、ＨＳＤＨタンパク質配列のアライメントをベースにした樹状図を示し、選んだＨＳＤＨタンパク質間の類縁関係を示す。
【図５】図５は、本発明に従った７β−ＨＳＤＨの活性に対するｐＨの影響を示す。以下のテスト条件が使用された。５０ｍＭリン酸カリウム中ｐＨ４ないし７；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中ｐＨ７ないし９、および５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ中ｐＨ９ないし１１；すべて２３℃。５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ中ｐＨ９ないし１１におけるＤＨＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡの活性値は重複する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の特定具体例
１．好気性バクテリア、特にＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９（ＡＴＣＣ２５９８６）株のようなＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ属から得ることができる７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）およびそれから誘導される機能性均等物：
本発明に従ってＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９から得ることができる７β−ＨＳＤＨは、特に以下の性質の少なくとも一つ、例えば２，３，４，５，６または７、またはこれら性質のすべてによって特徴化される。
ａ）分子量（ＳＤＳゲル電気泳動）約２８−３２ｋＤａ、特に約２９〜３１ｋＤａまたは約３０ｋＤａ。
ｂ）分子量（特にＳＤＳなしのような非変性条件下でのゲル濾過）約５３ないし６０ｋＤａ，特に約５５ないし５７ｋＤａ，例えば約５６．１ｋＤａ：これによって本発明に従った酵素は、Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（前出）によって記載されたＣ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６からの４５ｋＤａの７β−ＨＳＤＨと明らかに異なる。これはＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９からの７β−ＨＳＤＨのダイマー性格（４重構造）を確認する。
ｃ）７−ケトＬＣＡの７−カルボニル基の７β−ヒドロキシ基への立体選択的還元：
ｄ）ｐＨ８．５ないし１０．５、特に９ないし１０の範囲のＵＤＣＡの酸化のためのｐＨ最適条件。
ｅ）ｐＨ３．５ないし６．５、特にｐＨ４ないし６の範囲のＤＨＣＡおよび７−ケトＬＣＡの還元のためのｐＨ最適条件、これによりｐＨの選択により酸化プロセス（特徴ｄ）の）および還元プロセスに影響を与える驚くべき可能性がある。
ｆ）下表に特定的に示したそれぞれの値を中心にして±２０％、特に±１０％、±５％、±３％、±２％または±１％の範囲内の下表に示した物質／助因子の少なくとも一つに対する下表からの少なくとも一つの動力学的パラメータ。
【００１７】
【表１】
ａ）非常に低い活性のため測定できなかった。
ｂ）１Ｕ＝１μｍｏｌ／ｍｉｎ
ｃ）これにより本発明に従った酵素は、明らかに低いＫｍおよびＶｍａｘ値（それぞれ０．４および０．２）が記載され、そしてＮＡＤＰＨに対する活性が測定されなかったＨｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．によるＣ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６からの７β−ＨＳＤＨ酵素（前出）とは明らかに異なる。
ｇ）Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓおよびＭｕｓ ｍｕｓｕｌｕｓを含む動物１１β−ＨＳＤＨに対するＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９からの原核性７β−ＨＳＤＨの系統学的類縁性。
本発明に従った７β−ＨＳＤＨは、例えば以下の性質または性質の組合わせを示す。
ａ）；ｂ）；ａ）とｂ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）およびｆ）。
【００１８】
２．Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．によって記載されたＣ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６からの７β−ＨＳＤＨ（前出）と異なって、
ａ）７−ケトステロイドを対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的還元（水素化）、および／または
ｂ）７位にケト基と、そしてステロイド骨格上に少なくとも一つのさらなるケト基を含んでいるケトステロイドの対応する７β−ヒドロキシステロイドへの位置特異性水素化（還元）、特にデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）において例えばＮＡＤＰＨ依存性である７位のケト基の対応する３，１２−ジケト−７β−コラン酸への位置特異性還元を触媒する、具体例１で述べた７β−ＨＳＤＨまたはその機能的均等物。
【００１９】
３．配列同定Ｎｏ．２（アクセッションＮｏ．２Ｐ０１７７３０６１）に従ったアミノ酸配列を有する７β−ＨＳＤＨ、またはこの配列に対し少なくとも６０％、例えば少なくとも６５，７０，７５，８０，８５または９０％、例えば少なくとも９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９または９９．５％の同一度を有し、任意に上の定義に従った性質または性質の組合わせａ）；ｂ）；ａ）とｂ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）およびｆ）によって付加的に特徴化される、それらから誘導される配列。
【００２０】
４．例えば配列同定Ｎｏ．１（アクセッションＮｏ．Ｎ２ ＡＡＶＮ０２００００１０、領域５２００５．．５２７９６）のような前の具体例の一つで述べた定義に従った７β−ＨＳＤＨをコードする核酸配列。
【００２１】
５．少なくとも一つの制御核酸配列の遺伝子コントロールのもとにある、具体例４で述べた核酸配列を含む発現カセット。
【００２２】
６．具体例５で述べた少なくとも一つの発現カセットを含むベクター。
【００２３】
７．具体例４で述べた少なくとも一つの核酸配列、または具体例５で述べた少なくとも一つの発現カセットを有し、または具体例６で述べた少なくとも一つのベクターで形質転換された微生物。
【００２４】
８．具体例７で述べた微生物を培養し、発現された７β−ＨＳＤＨが培養物から単離される、具体例１ないし３の少なくとも一つに述べた７β−ＨＳＤＨの生産方法。
【００２５】
９．具体例１ないし４の一つの定義に従った７β−ＨＳＤＨの存在下、対応する７−ケトステロイドが変換され、そして生成した少なくとも一つの還元生成物が任意に反応システムから単離される、７β−ヒドロキシステロイドの酵素合成方法。
【００２６】
１０．還元されるケトステロイドが、
デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ），
７−ケト−リトコール酸（７−ケトＬＣＡ）．
７，１２−ジケトリトコール酸（７，１２−ジケトＬＣＡ）、および特に酸の塩、アミドまたはアルキルエステルのようなそれらの誘導体から選ばれる、具体例９に述べた方法。
【００２７】
１１．ＤＨＣＡまたはその誘導体が３，１２−ジケト−７β−コラン酸または対応する誘導体へ変換される、または
７−ケトＬＣＡまたはその誘導体がウルソデオキシコール酸または対応する誘導体へ変換される、または
７，１２−ジケトＬＣＡまたはその誘導体が１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケトＵＤＣＡ）へ変換される、具体例１０に述べた方法。
【００２８】
１２．還元はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下（かつ消費を伴って）生起する、具体例９ないし１１の一つに述べた方法。
【００２９】
１３．具体例１ないし３の一つの定義に従った７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下、ヒドロキシステロイドが反応させられ、そして生成した酸化生成物が任意に反応システムから単離される、７β−ヒドロキシステロイドの酵素酸化方法。
【００３０】
１４．７β−ヒドロキシステロイドが、３，１２−ジケト−７β−ＣＡまたは特に塩、アミドまたはアルキルエステルのようなその誘導体である、具体例１３に述べた方法。
【００３１】
１５．酸化はＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下（かつ消費を伴って）生起する、具体例１３および１４の一つに述べた方法。
【００３２】
１６．消費したレドックス均等物が特にその場で電気化学的にまたは酵素的に再生される、具体例１２および１５の一つで述べた方法。
【００３３】
１７．消費したＮＡＤ（Ｐ）ＨがＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼから選ばれたＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−再生酵素、特にアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）との組合わせにより、特にその場で再生される、具体例１６で述べた方法。
【００３４】
１８．ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生酵素が天然または組換えた単離されたまたは富化された、
ａ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ；ＥＣ１．１．１．２）および
ｂ）その機能的均等物（特に機能性ドメイン）から選ばれる、具体例１７で述べた方法。
【００３５】
１９．式（１）
【化１】
（ここでＲはアルキル、ＮＲ１Ｒ２，Ｈ，アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋であり、残基Ｒ３は同一または異なってＨまたはアルキルを意味する。）のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造方法であって；
ａ）任意に式（２）のコール酸を、
【化２】
（ここでＲは前記の意味を有する。）を式（３）のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）
【化３】
（ここでＲは前記の意味を有する。）へ化学的に酸化し；
ｂ）具体例１ないし３の一つの定義に従った７β−ＨＳＤＨの少なくとも一つの存在下、ＤＨＣＡを式（４）の３，１２−ジケト−７β−コラン酸（３，１２−ジケト−７β−ＣＡ）
【化４】
へＮＡＤＰＨ依存的に還元し；
ｃ）３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）の存在下、３，１２−ジケト−７β−ＣＡを式（５）の対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）
【化５】
（ここでＲは前記の意味を有する。）へＮＡＤＰＨ依存的にまたはＮＡＤＨ依存的に（使用した３α−ＨＳＤＨのタイプに依存して）還元し；そして次に
ｄ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡをＵＤＣＡへ化学的に還元し；そして次に
ｅ）反応生成物を任意にさらに精製する；
方法。
【００３６】
２０．ステップｂ）および／またはステップｃ）が還元均等物（ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨ）の存在下に実施される、具体例１９で述べた方法。
【００３７】
２１．ステップｂ）および／またはステップｃ）が（特に酵素的な）助因子再生ステップと組合わされる、具体例１９および２０で述べた方法。
【００３８】
２２．ステップｂ）が助因子再生ステップと特にその場で組合わされ、その中でＮＡＤＰＨが犠牲的なアルコール（特にイソプロパノールとアセトンの生成）の消費を伴ってアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によって再生され、そして任意に反応平衡からアセトンの除去が促進される（例えば昇温により）、具体例２１で述べた方法。
【００３９】
２３．ステップｃ）が助因子再生ステップと特にその場で組合わされ、その中で使用した３α−ＨＳＤＨのタイプに応じ、ホルメートの消費（およびＣＯ２ガスの生成）を伴ってホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）によって再生され、またはＮＡＤＰＨが犠牲的なアルコール（特にイソプロパノールとアセトンの生成）の消費を伴ってアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によって再生され、そして任意に反応平衡からアセトンの除去が促進される（例えば昇温により）、具体例２１または２２で述べた方法。
【００４０】
２４．反応が固定化された形の関与する酵素の少なくとも一つで実施される、具体例８ないし２３の一つで述べた方法。
【００４１】
２５．固定化された形の具体例１ないし３の一つで述べた７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含んでいるバイオリアクター。
本発明のさらなる具体例
１．一般的定義および使用した略号
下表に、表の形で構造式、その化学名および使用した略号を要約する。
【表２】
【００４２】
他に記述しない限り、用語“７β−ＨＳＤＨ”は、特にＮＡＤＰＨの化学量論的消費を伴ってＤＨＣＡの３，１２−ケト−７βＣＡへの立体特異性および位置特異性還元と、任意に対応する逆反応を少なくとも触媒するデヒドゲナーゼ酵素を指す。この酵素は天然のまたは組換え生産された酵素であることができる。原則としてこの酵素は、例えばタンパク質不純物のような細胞不純物と混合して存在するが、しかし好ましくは純粋形である。好適な検出方法は、例えば後記実験の部に記載されており、または文献（例えばＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＡＤＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ７β−ｈｙｄｒｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ ａｎｄ Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ；Ｓ．Ｈｉｒａｎｏ ａｎｄ Ｎ．Ｍａｓｕｄａ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８２；しかしながら、７−ケト基の還元を触媒するＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓからの７β−ＨＳＤＨは検出できなかった。）から公知である。この活性を有する酵素はＥＣＮｏ．１．１．１．２０１として分類されている。
【００４３】
他に記述しない限り、用語“３α−ＨＳＤＨ”は、特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの化学量論的消費を伴って３，１２−ジケト−７βＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの立体特異性および位置特異性還元と、任意に対応する逆反応を少なくとも触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を指す。好適な検出方法は、例えば後記実験の部に記載されており、または文献から公知である。好適な酵素は、例えばＣｏｍａｎｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（例えばＡＴＣＣ１１９９６）から得ることができる。例えばＮＡＤＰＨ依存性３α−ＨＳＤＨはネズミから得られ、使用し得る（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ３−ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ／ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ｊ．Ｅ．Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｈｕｉｚｉｎｇａ ａｎｄ Ｔ．Ｍ．Ｐｅｎｎｉｎｇ， Ｍａｙ １５，１９９１，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６６，８８２０−８８２５）。この活性を有する酵素はＥＣＮｏ．１．１．１．５０のもとに分類されている。
【００４４】
本発明に従えば、“純粋形”または“純粋”または“本質的に純粋”な酵素とは、例えばビウレット法またはＬｏｗｒｅｙらの方法に従ったタンパク検出方法（Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８２）を見よ）のような通常のタンパク検出方法によって決定し、全タンパク質の８０％以上、好ましくは９０％以上、特に９５％以上、そして９９％以上の純度を有する酵素を意味するものと理解すべきである。
【００４５】
“レドックス均等物”とは、例えばＮＡＤ＋およびＮＡＤＨ＋のようなニコチンアミド誘導体、またはその還元形であるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのような電子供与体または電子受容体として使用し得る小分子有機化合物を意味するものと理解すべきである。
【００４６】
本発明に従えば、“コール酸化合物”とは、コール酸の基本炭素骨格、特にステロイド構造を有し、環位置７および任意に環位置３および／または１２にケトおよび／またはヒドロキシもしくはアシルオキシ基が存在する化合物を意味するものと理解すべきである。
【００４７】
例えば“コール酸化合物”または“ウルソデオキシコール酸”のような特定タイプの化合物は、出発化合物（例えばコール酸またはウルソデオキシコール酸のような）の誘導体をも意味するものと理解すべきである。
【００４８】
そのような誘導体は、例えば化合物のリチウム、ナトリウムおよびカリウム塩のようなアルカリ金属塩、およびアンモニウム塩のような“塩”を含む。ここでアンモニウム塩はＮＨ４＋塩、および少なくとも１個の水素原子をＣ１−Ｃ６アルキル基で置換したアンモニウム塩を含む。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル、ｎ−，ｓｅｃ−またはｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルおよび１回または複数回分岐したそれらの類縁体である。
【００４９】
本発明に従った“アルキルエステル”化合物は、例えばＣ１−Ｃ６アルキルエステルのような低級アルキルエステルである。非限定的な例として、メチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル、ｎ−，ｓｅｃ−またはｔｅｒｔ−ブチルエステル、または例えばｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルエステルおよびその１回または多数回分岐類縁体を挙げることができる。
【００５０】
“アミド”は、アンモニアまたは１級もしくは２級アミンによる、本発明に従った酸の変換生成物である。そのようなアミンは、例えばモノ−またはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミンであり、アルキル基は相互に独立し例えばカルボキシ、ヒドロキシ、ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩのような）、ニトロおよびスルホネート基で任意にさらに置換されることができる。
【００５１】
本発明に従った“アシル基”は、例えばアセチル、プロピオニルおよびブチリルのような炭素原子２ないし４個を有する非芳香基、および任意に置換された単環芳香環を有する芳香族基であり、ここで好適な置換基は、例えば、ヒドロキシ、ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩのような）、ニトロ、例えばＣ１−Ｃ６アルキル基であり、例えばベンゾイルまたはトルオイル基である。
【００５２】
例えばコール酸、ウルソデオキシコール酸、１２−ケト−ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸および７−ケト−リトコール酸のような本発明に従って使用され、または生産されるヒドロキシステロイド化合物は、立体異性的に純粋な形か、または他のまたはそれから得ることができる他の立体異性体との混合物の形で本発明方法に使用することができる。しかしながら好ましくは、使用または製造される化合物は、本質的に立体異性的に純粋な形で使用または単離される。
【００５３】
本発明に従えば、“固定化”とは、例えば７β−ＨＳＤＨのような本発明に従った生触媒を固体、例えば周囲の液体媒体に本質的に不溶な支持体へ共有または非共役的に結合することを意味するものと理解される。
【００５４】
２．タンパク質
本発明は、７β−ＨＳＤＨ活性または３α−ＨＳＤＨ活性を有する特定的に記載したタンパク質または酵素に制限されず、むしろその機能的均等物にも及ぶ。
【００５５】
本発明の文脈において、特定的に記載された酵素の“機能的均等物”または類縁体は、それとは異なり、さらに例えば７β−ＨＳＤＨ活性を有するポリペプチドである。
【００５６】
このため例えば“機能的均等物”とは、使用した１７β−ＨＳＤＨ試験において、ここに規定したアミノ酸配列を含む酵素の活性よりも少なくとも１％、例えば少なくとも１０％または２０％、例えば少なくとも５０％または７０％または９０％高いまたは低い活性を持つことを意味する。これとは別に、機能的均等物は、好ましくは、ｐＨ４と１１の間で安定であり、そして有利にはｐＨ４ないし６またはｐＨ６ないし１０、例えば、８．５ないし９．５の範囲に最適ｐＨを有し、そして１５℃ないし８０℃、または１５℃ないし４０℃、２０℃ないし３０℃、または例えば約４５℃ないし６０℃または約５０℃ないし５５℃のような２０℃ないし７０℃に最適温度を有する。
【００５７】
７β−ＨＳＤＨ活性は、種々の既知のテストによって検出することができる。限定するものではないが、例えばＣＡまたはＤＨＣＡのような参照物質を使用し、実験の部に規定した標準化条件下でのテストを挙げることができる。
【００５８】
本発明に従い、“機能的均等物”とは、前述のアミノ酸配列の少なくとも一つの配列位置において特定的に名を挙げた以外のアミノ酸を有し、しかしながら前述した生物学的活性の一つを有する“突然変異体”をも含む。このように“機能的均等物”は、一以上、例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４または１５のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位によって得ることができる突然変異体を含み、そのような変化はそれらが本発明に従った性質プロフィルを有する突然変異体へ導く限り、どの配列位置でも起こることができる。特に突然変異体と未変化ポリペプチドの間の反応パターンが定性的に一致する時、すなわち例えば同じ基質が異なる速度で変換される時にも機能的均等物が存在する。好適なアミノ酸置換の例は以下の表に要約されている。
【００５９】
【表３】
【００６０】
上の意味で“機能的均等物”は記載したポリペプチドおよび機能的均等物の“前駆体”および該ポリペプチドの“塩”でもある。
【００６１】
ここで“前駆体”は、所望の生物学的活性有り無しのポリペプチドの天然または合成前駆体である。
【００６２】
表現“塩”は、本発明に従ったタンパク分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は公知の態様で調製することができ、そして例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩のような無機塩、および例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン等のような有機塩基との塩を含む。同様に本発明は、塩酸または硫酸のような鉱酸との塩、および酢酸およびシュウ酸のような有機酸との塩のような酸付加塩にも関する。
【００６３】
本発明に従ったポリペプチドの“機能性誘導体”は、公知の技術によって機能性アミノ酸側鎖上またはそれらのＮ−またはＣ−末端に生成させることができる。そのような誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル；アンモニアまたは１級または２級アミンとの反応によって得られるカルボキシル基のアミド；アシル基との反応によって調製される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、またはアシル基との反応によって調製された遊離ヒドロキシ基のＯ−アシル誘導体を含む。
【００６４】
“機能的均等物”は、勿論他の生物からアクセスし得るポリペプチドと、天然に存在する変種をも含む。例えば、相同性配列領域の範囲は配列比較によって確立することができ、均等酵素は本発明の詳細な説明によって決定することができる。
【００６５】
同様に“機能的均等物”は、例えば所望の生物学的機能を有する、本発明に従ったポリペプチドのフラグメント、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフを含む。
【００６６】
“機能的均等物”はさらに、前述したポリペプチド配列の一つまたはそれからの機能的均等物と、機能的Ｎ−またはＣ−末端結合において機能的に異なる少なくとも一つのさらなる非相同性配列を含む融合タンパク（すなわち融合タンパク部分の相互に有意な損傷なしの）である。そのような非相同配列の非限定例は、シグナルペプチド、ヒスチジンアンカーまたは酵素である。
【００６７】
本発明に従って付加的に含まれた“機能的均等物”は、実際に開示されたタンパクの相同体である。これらは、実際に開示されたアミノ酸配列の一つに対して、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９８８，２４４４−２４４８のアルゴリズムに従って計算し、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％の相同性（同一性）を持っている。本発明に従った相同ペプチドの相同性または同一性は、特にここに実際に記載されたアミノ酸配列の一つの全長に対する、同一アミノ酸残基のパーセンテージを意味する。
【００６８】
パーセンテージ同定値は、ＢＬＡＳＴアライメント、アルゴリズムｂｌａｓｔｐ（タンパク−タンパクＢＬＡＳＴ）により、または後で示すＣｌｕｓｔａｌアジャストメントの使用によって決定とすることができる。
【００６９】
可能性あるタンパクグリコシル化の場合、本発明に従った“機能的均等物”は、脱グリコシル化したまたはグリコシル化した形およびグリコシル化パターンの変化によって得られる修飾形において上で指定したタイプのタンパクを含む。
【００７０】
本発明に従ったタンパクまたはポリペプチドの相同体は、突然変異生成により、例えば点突然変異、タンパクの伸長またはトランケーションによって生成させることができる。
【００７１】
本発明に従ったタンパクの相同体は、例えばトランケーション突然変異体のようなコンビナトリアルバンクのスクリーニングによって同定することができる。例えば、タンパク変種の斑入りバンクは、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的リゲーションにより、核酸レベルにおけるコンビナトリアル突然変異生成によって生成させることができる。退化オリゴヌクレオチド配列から可能性ある相同体のバンクの生成のために使用できる多数のプロセスが存在する。退化遺伝子配列の化学合成はＤＮＡシンセサイザー中で実施することができ、そして次に合成遺伝子は好適な発現ベクター中へリゲートすることができる。遺伝子の退化セットの使用は、可能性あるタンパク配列の所望のセットをコードする混合物中にすべての配列の生成を可能にする。退化オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：４７７）。
【００７２】
点突然変異またはトランケーションによって生成させたコンビナトリアルバンクの遺伝子生産物のスクリーニングのための、および選択された性質を有する遺伝子生産物のｃＤＮＡバンクのスクリーニングのためのいくつかの技術が先行技術において知られている。これらの技術は、本発明に従った相同体のコンビナトリアル突然変異生成によって生産された遺伝子バンクの急速スクリーニングに適応化させることができる。高いスループットで分析が行われる大きな遺伝子バンクのスクリーニングのために最も頻繁に使用される技術は、複製可能な発現ベクター中への遺伝子バンクのクローニング、生成したベクターバンクでの適当な細胞の形質転換、および所望の活性の検出がその生産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易化する条件下でコンビナトリアル遺伝子の発現を含む。バンク中の機能的突然変異体の頻度を増大させる技術である、Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｍｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｉｓ（ＲＥＭ）をスクリーニングテストと組み合わせて相同体を同定するために使用することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
【００７３】
３．核酸および構造体
３．１ 核酸
本発明はまた、７β−ＨＳＤＨまたは３α−ＨＳＤＨ活性を有する酵素をコードする核酸配列に関する。
【００７４】
本発明はまた、ここに記載した実際の配列に対し一定の程度の同一性を有する核酸に関する。
【００７５】
二つの核酸間の“同一性”は、各場合核酸全長にわたってヌクレオチドの同一性を意味し、特に以下のパラメータで調節した、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄを使用するＩｎｆｏｒｍａｘ社（ＵＳＡ）のＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ７．１ソフトウエア（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ，Ｓｈａｒｐ ＰＭ．Ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｎ ａ ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．Ｃｏｍｐｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９８９ Ａｐｒ；５（２）：１５１−１）の助けによる比較によって計算した同一性を意味する。
【００７６】
マルチプルアライメントパラメータ：
ギャップオープニングペナルティ １０
ギャップエキステンションペナルティ １０
ギャップセパレーションペナルティ範囲 ８
ギャップセパレーションペナルティ オフ
アライメント遅延のための％アイデンティティ ４０
残基特異性ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジション計量 ０
対アライメントパラメータ：
ＦＡＳＴ アルゴリズム オン
Ｋ−ｔｕｐｌｅ サイズ １
ギャップペナルティ ３
ウインドウサイズ ５
ベストダイアゴナルの数 ５
【００７７】
これに代って、同一性は以下のパラメータをもって、Ｃｈｅｎｎａ，Ｒａｍｕ，Ｓｕｇａｗａｒａ Ｈｉｄｅａｋｉ，Ｋｏｉｋｅ Ｔａｄａｓｈｉ，Ｌｏｐｅｚ，Ｒｏｄｏｒｉｇｏ，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔｏｂｙ Ｊ，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄｅｓｍｏｎｄ Ｇ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊｕｌｉｅ Ｄ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｃｌｕｓｔａｌ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｇａｍｓ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１（１３）：３４９７−５００；インターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＃に従って決定することができる。
【００７８】
ＤＮＡギャップオープンペナルティ １５．０
ＤＮＡギャップエキステンションペナルティ ６．６６
ＤＮＡマトリックス アイデンティティ
タンパクギャップオープンペナルティ １０．０
タンパクギャップエキステンションペナルティ ０．２
タンパクマトリックス Ｇｏｎｎｅｔ
タンパク／ＤＮＡ ＥＮＤＧＡＰ −１
タンパク／ＤＮＡ ＧＡＰＤＩＳＴ ４
【００７９】
ここで述べたすべての核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡのような１本鎖または２本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、例えば二重らせんの個々の重複する相補的核酸構造単位のフラグメント縮合によるような、ヌクレオチド構造単位からの化学合成によってそれ自体公知の態様で生産することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホアミダイト法（Ｖｏｅｔ，Ｖｏｅｔ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．８９６−８９７）に従って公知の態様で実施することができる。合成オリゴヌクレオチドの付加と、ＤＮＡポリメラーゼおよびリゲーション反応のＫｌｅｎｏｗフラグメントによるギャップの充填、および一般クローニング方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００８０】
本発明は、上記ポリペプチドの一つ、および例えば合成ヌクレオチドアナログを用いてアクセス可能なそれらの機能的均等物をコードする核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡのような１本鎖および２本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）に関する。
【００８１】
本発明は、本発明に従ったポリペプチドおよびタンパクまたは生物学的に活性なそれらのセクションをコードする単離された核酸分子と、例えば本発明に従ったコードする核酸の同定または増幅のためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用することができる核酸フラグメントの両方に関する。
【００８２】
本発明に従った核酸分子は、さらに暗号遺伝子領域の３’−および／または５’−端に翻訳されない配列を含むことができる。
【００８３】
さらに本発明は、実際に記載された核酸配列に対し相補的な核酸分子またはその部分を含む。
【００８４】
本発明に従ったヌクレオチド配列は、他の細胞タイプおよび生物中の相同性配列の同定および／またはクローニングに使用することができるプローブおよびプライマーの生産を可能にする。そのようなプローブまたはプライマーは、通常“厳格”な条件下、本発明に従った核酸配列のセンスストランドの、または対応するアンチセンスストランドの少なくとも約１２，好ましくは約２５，例えば４０，５０または７５の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含んでいる。
【００８５】
“単離”された核酸分子が核酸の天然源中に存在する他の核酸分子から分離され、そしてもしそれが組換え技術によって生産されるならば他の細胞物質または培地が実質上皆無にされるか、またはもしそれが化学的に合成されるならば化学的前駆体または他の化学品が実質上皆無にされることでできる。
【００８６】
本発明に従った核酸分子は、分子生物学的に標準技術によって単離されることができ、そして配列情報が本発明によって提供される。例えば、ｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして実際に開示した完成した配列の一つまたはその部分と、そして標準ハイブリダイゼーション技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｓｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９に記載されいるような）を使用することによって適当なｃＤＮＡバンクから単離することができる。さらに、開示した配列の一つまたはその部分を含んでいる核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができ、この配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。このようにして増幅された核酸は適当なベクターにクローンされ、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴化される。本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを使用して標準合成プロセスによって生産されることができる。
【００８７】
本発明に従った核酸配列またはその誘導体、これらの配列の相同体およびその部分は、他の細菌から、例えばゲノムまたはｃＤＮＡバンクを用い、慣用のハイブリダイゼーションプロセスまたはＰＣＲ技術を使用して単離することができる。
【００８８】
“ハイブリダイズ”とは、ポリマーまたはオリゴヌクレオチドが、標準条件下で大部分相補的な配列へ結合する能力を意味し、非相補的パートナー間の非特異性結合はこれら条件下では抑制される。このため、配列は９０〜１００％相補的であることができる。相互に特異的に結合し得る相補配列の性質は、例えばノーザンまたはサウザンブロット技術またはＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲにおいてプライマー結合において使用される。
【００８９】
ハイブリダイゼーションのため、保存された領域の短いオリゴヌクレオチドが有利に使用される。しかしながら、ハイブリダイゼーションのため、本発明に従った核酸のもっと長いフラグメントまたは完全な配列を使用することも可能である。これらの標準的条件は使用する核酸に従って（オリゴヌクレオチド、長いフラグメント、または完全な配列）変動し、またはどのタイプの核酸、ＤＮＡかＲＮＡが使用されるかによって変動する。このため、例えばＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのための溶融温度は、同じ長さのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのそれよりも約１０℃低い。
【００９０】
標準的条件は、例えば、核酸に従い、０．１ないし５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の濃度を有する水性緩衝溶液中４２ないし５８℃の温度、または付加的に５０％ホルムアミドの存在下、例えば５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中４２℃の温度を意味する。有利には、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣと約３０℃ないし４５℃の温度である。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドについては、ハイブリダイゼーション条件は、有利には０．１×ＳＳＣと約３０℃ないし５５℃、好ましくは４５℃ないし５５℃の温度である。ハイブリダイゼーションのためのこれらの規定した温度は、例示であって、約１００ヌクレオチドの長さと、Ｇ+Ｃ含量５０％の核酸のためのホルムアミド不存在下の計算された溶融温度である。ＤＮＡハイブリダイゼーションのための実験条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９のような遺伝子学の教科書に記載されており、そして例えば核酸の長さ、ハイブリッドの性格またはＧ+Ｃ含量に応じて当業者に知られた式に従って計算することができる。当業者はさらにハイブリダイゼーションについての情報を以下の教科書から推論することができる。
【００９１】
Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９８５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（ｅｄｓ），１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｂｒｏｗｎ（ｅｄ），１９９１，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ
【００９２】
“ハイブリダイゼーション”は特に、厳格な条件下で実施することができる。そのようなハイブリダイゼーション条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，９．３１−９．５またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。
【００９３】
“厳格な”ハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ，７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストランサルフェートおよび変性したサケ精子ＤＮＡ２０ｇ／ｍｌ中４２℃でのインキュベーションと、６５℃において、０．１×ＳＳＣを使用し、フィルター上の洗浄ステップを意味すると理解すべきである。
【００９４】
本発明はまた、実際に開示された、または誘導し得る核酸配列の誘導体に関する。
【００９５】
このように本発明に従った核酸配列のさらなる配列は、例えば配列同定Ｎｏ．１から、一以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失により、しかし所望の性質を有するポリペプチドをコードするように誘導することができる。
【００９６】
本発明にはさらに、実際に述べた配列に比較して、“ブラント”突然変異を含む、または特別の起源または宿主生物のコドン利用に対応するように修飾された核酸配列と、例えばスプライス変種または対立変種のような天然に存在する変種が含まれる。
【００９７】
同様に本発明は、保守的ヌクレオチド置換（すなわち関心あるアミノ酸の同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度のアミノ酸による置換）によって得ることができる配列に関する。
【００９８】
本発明はまた、実際に開示された核酸の配列多形によって誘導される分子に関する。これらの遺伝子多形は自然の変動のため集団中の個々の間に存在し得る。これらの自然の変動は遺伝子のヌクレオチド配列中通常１ないし５％の変動を生じさせる。
【００９９】
配列同定Ｎｏ．１について本発明に従った核酸配列の誘導体とは、例えば、誘導されたアミノ酸レベルにおいて少なくとも６０％相同性、好ましくは少なくとも８０％相同性、非常に好ましくは少なくとも９０％相同性を全配列範囲に亘って有する変種を意味するものとして理解すべきである（アミノ酸レベルにおける相同性に関しては、ポリペプチドのための上述の説明を参照）。配列の部分的領域に亘っては、相同性は有利にはより高くなることができる。
【０１００】
さらに誘導体は、特に配列同定Ｎｏ．１の本発明に従った核酸配列の相同体、例えばカビまたは細菌相同体、切端配列、コード化および非コード化ＤＮＡ配列の１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを意味するものと理解すべきである。このように、例えばＤＮＡレベルにおいて配列同定Ｎｏ．１の相同体は、配列同定Ｎｏ．１に示した全ＤＮＡ範囲にわたって少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、非常に好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する。
【０１０１】
さらに誘導体は、例えばプロモーターとの融合を意味するものと理解すべきである。示したヌクレオチド配列の前へ付加されるプロモーターは、プロモーターの機能性または活性が悪影響されることなく、少なくとも１個のヌクレオチド交換、少なくとも１個の挿入、逆位および／または失欠によって修飾することができる。加えて、プロモーターはそれらの活性を、外来生物のもっと活性なプロモーターによってそれらの配列を修飾または完全に置換することによって増強することができる。
【０１０２】
機能的突然変異体の生産方法は当業者には知られている。
【０１０３】
使用した技術に従って、当業者は遺伝子へ、または代って非コード化核酸配列領域（例えば発現の調節のために重要な領域）へ完全にランダムなまたはもっと特異的な突然変異体を導入し、その後遺伝子バンクを調製することができる。このために必要な分子生物学的方法は当業者には既知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１に記載されている。
【０１０４】
遺伝子の修飾およびそれによってコード化されるタンパクの修飾方法は、例えば以下のとおり長年にわたって当業者には既知である。
【０１０５】
−遺伝子の単一または多数ヌクレオチドが特異的に置換される部位特異性突然変異生成（Ｔｒｏｗｅｒ ＭＫ（ｅｄｉｔｏｒ）１９９６：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）；
−どんな所望アミノ酸のためのコドンも遺伝子のどんな部位に置換または付加されることができる飽和突然変異生成（Ｋｅｌｇｌｅｒ−Ｅｄｏ ＤＭ Ｄｏｃｋｔｏｒ ＣＭ，Ｄｉｍａｉｏ Ｄ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：１５９３；Ｂａｒｅｔｔｉｎｏ Ｄ，Ｆｅｉｇｅｎｂｕｔｚ Ｍ．Ｖａｌｃａｒｅｌ Ｒ，Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ ＨＧ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：５４１；Ｂａｒｉｋ Ｓ（１９９５）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：１）；
−ヌクレオシド配列が誤作動ＤＮＡポリメラーゼによって突然変異されるエラー発生ポリメラーゼ連鎖反応（エラー発生ＰＣＲ）（Ｅｃｋｅｒｔ ＫＡ，Ｋｕｎｋｅｌ ＴＡ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：３７３９）；
−例えば、ヌクレオチド配列の増加した突然変異率が欠陥ＤＮＡ修復メカニズムのために発生する突然変異化株への遺伝子の通過（Ｇｒｅｅｎｅｒ Ａ，Ｃａｌｌａｈａｎ Ｍ．Ｊｅｒｐｓｅｔｈ Ｂ（１９９６）Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｍｕｔａｔｏｒ ｓｔｒａｉｎ．Ｉｎ：Ｔｒｏｗｅｒ ＭＫ（ｅｄｉｔｏｒ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）；または
−密接に関連した遺伝子のプールが生成され、そして消化され、そしてフラグメントがポリメラーゼ連鎖反応において鋳型として使用され、その中で全長さのモザイク遺伝子が繰り返した鎖分離および再接近によって最終的に調製されるＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９；Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：１０７４７）
【０１０６】
“指向された進化”を使用して（特にＲｅｅｔｚ ＭＴ ａｎｄ Ｊａｅｇｅｒ Ｋ−Ｅ（１９９９），Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ Ｃｈｅｍ ２００：３１；Ｚｈａｏ Ｈ，Ｍｏｏｒ ＪＣ，Ｖｏｌｋｏｖ ＡＡ，Ａｒｎｏｌｄ ＦＨ（１９９９），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ｉｎ：Ｄｅｍａｉｎ ＡＬ，Ｄａｖｉｅｓ ＪＥ（ｅｄｓ．）Ｍａｎｎｕａｌ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｙｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙに記載されている）、当業者は選択した態様でそして大規模に機能的突然変異体を製造することができる。ここでは、最初のステップにおいてそれぞれのタンパクの遺伝子バンクが生産され、これには上で示した方法を使用することができる。遺伝子バンクは適当な態様で、例えばバクテリアよりまたはファージディスプレーシステムによって発現される。
【０１０７】
望む性質に大部分一致する性質を有する機能的突然変異体を発現する宿主生物の関心ある遺伝子は突然変異のさらなるラウンドへ服されることができる。突然変異および選択またはスクリーニングのステップは、現在の突然変異体が適切な測定において望む性質を持つまで繰り返されることができる。この反復操作の結果として突然変異の限られた数、例えば１ないし５の突然変異が段階的に実施され、関心ある酵素性質に対するそれらの影響を評価し、選択することができる。次に選択された突然変異体は同じやり方でさらなる突然変異ステップへ服させることができる。これによって検討すべき個々の突然変異体の数を有意に減らすことができる。
【０１０８】
本発明に従った結果は、所望の修飾した性質を有するさらなる酵素を発生させるために必要な、関心ある酵素の構造および配列に関する重要な情報を取得する。特に、“ホットスポット”、すなわち特異的突然変異の導入によって酵素性質の修飾のために潜在的に適した配列部分を規定することができる。
【０１０９】
３．２． 構造体
本発明はさらに、調節核酸配列の遺伝子コントロールのもとに本発明に従ったポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構造体、および少なくとも一つのこれらの発現構造体を含むベクターに関する。
【０１１０】
“発現ユニット”とは、本発明に従って、ここで規定し、そして発現すべき核酸または遺伝子へ機能的に連結された後、発現を調節する、すなわちこの核酸またはこの遺伝子の転写および翻訳を調節するプロモーターを含んでいる、発現活性を有している核酸を意味するものと理解すべきである。それ故これを“調節核酸配列”ということもできる。プロモーターに加え、例えばエンハンサーのようなさらなる調節エレメントが存在することができる。
【０１１１】
本発明に従えば、“発現カセット”または“発現構造体”とは、発現すべき核酸または発現すべき遺伝子へ機能的に連結された発現ユニットを意味するものと理解すべきである。発現ユニットと対照的に、発現カセットはこのため、転写および翻訳を調節する核酸配列のみならず、転写および翻訳の結果タンパクとして発現される核酸配列をも含む。
【０１１２】
本発明の文脈において、術語“発現”または“過発現”は、対応するＤＮＡによってコード化される微生物中の一以上の酵素の細胞内活性の生産および増加を記載する。この目的で、例えば遺伝子を生物へ導入することができ、存在する遺伝子を他の遺伝子で置換することができ、遺伝子のコピー数を増加することができ、強力なプロモーターを使用することができ、または高い活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子を使用することができ、そしてこれらの方策は任意に組み合わせることができる。
【０１１３】
好ましくは、本発明に従ったそのような構造体は、それぞれのコード化配列の５’−上流のプロモーターと、３’−下流のターミネーター配列と、そして任意に慣用の調節エレメント、すなわち各場合コード化配列へ作用的に連結された調節エレメントを含む。
【０１１４】
本発明に従えば、“プロモーター”、“プロモーター活性を有する核酸”、または“プロモーター配列”は、転写すべき核酸との機能的連鎖において核酸の転写を調節する核酸の意味であると理解すべきである。
【０１１５】
“機能的”または“作用的”連鎖は、例えば核酸の転写を保証する核酸配列と、そして例えばターミネーターのように、プロモーター活性を有する核酸の一つと、転写すべき核酸配列と、そして任意の調節エレメントの配列とが、調節エレメントの各自が核酸配列の転写においてその機能を充足するように配置された配列を意味するものと理解すべきである。この目的のため、化学的意味での直接連結は絶対的に必要ではない。例えばエンハンサー配列のような遺伝子制御配列は、標的配列においてさらに除去された位置において、または他のＤＮＡ分子からそれらの機能を発揮することができる。転写される核酸配列がプロモーター配列の後に（すなわち３’−末端側に）配置され、そのため両方の配列が共有結合で連結されることが好ましい。ここでは、プロモーター配列と、発現すべき核酸配列の間の距離は、２００塩基対未満、または１００塩基対以下、または５０塩基対以下であることができる。
【０１１６】
プロモーターおよびターミネーターに加え、挙げることができるさらなる調節エレメントの例は、標的化配列、エンハンサー、ポリアデニル化信号、選択できるマーカー、増幅信号、複製起源等を含む。好適な調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。
【０１１７】
特に本発明に従った核酸構造体は、配列同定Ｎｏ．１、またはその誘導体および相同体と、そして有利には遺伝子発現の制御、例えば増大のための一以上の調節信号と作用的または機能的に連結されたそれから誘導し得る核酸配列を含む。
【０１１８】
これらの調節配列に加え、これら配列の天然の調節が実際の構造遺伝子以前に存在することができ、そして天然調節がスイッチオフされ、遺伝子発現が増大されるように任意に遺伝子的に修飾されることができる。しかしながら核酸構造体は、もっと簡単に、すなわち追加の調節信号がコード化配列の前に挿入されず、そしてその調節を有する天然プロモーターが除去されずに構築することができる。これに代って、天然調節配列は、もはや調節が行われず、そして遺伝子発現が増大されるように突然変異される。
【０１１９】
好ましい核酸構造体は、有利には、核酸配列の増大した発現を可能にするプロモーターへ機能的に連結された既に述べた“エンハンサー”の一つ以上を含んでいる。さらなる調節エレメントまたはターミネーターのような、追加的有益配列をＤＮＡ配列の３'−末端へ挿入することもできる。本発明に従った核酸は、構造体中に１以上のコピーで存在することができる。構造体の任意の選択のため、抗生物質耐性または栄養補給性を補足する遺伝子のようなさらなるマーカーが構造体中に存在することができる。
【０１２０】
ｃｏｓ，ｔａｃ，ｔｒｐ，ｔｅｔ，ｔｒｐ−ｔｅｔ，ｌｐｐ，ｌａｃ，ｌｐｐ−ｌａｃ，ｌａｃｌｑ，Ｔ７，Ｔ５，Ｔ３，ｇａｌ，ｔｒｃ，ａｒａ，ｒｈａＰ，（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６，ラムダ−ＰＲのようなプロモーター中に、またはラムダーＰＬプロモーター中に好適な調節配列の例が存在する。これらはグラム陰性細菌に有利に使用される。さらなる有利な調節配列は、イーストまたはカビプロモーターＡＤＣ１，ＭＦアルファ，ＡＣ，Ｐ−６０，ＣＹＣ１，ＧＡＰＤＨ，ＴＥＦ，ｒｐ２８およびＡＤＨ中のグラム陽性プロモーター中に存在する。人工プロモーターも調節のために使用し得る。
【０１２１】
宿主生物中に発現のため、核酸構造体は、有利には、例えば宿主中で遺伝子の最適で発現を可能にするプラスミドまたはファージのようなベクター中に挿入される。プラスミドおよびファージのほかに、ベクターは、当業者に知られたすべての他のベクター、例えばＳＶ４０，ＣＭＶ，バキュロウイルスおよびアデノウイルスのようなウイルス、トランスポソン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、および鎖状またはサークル状ＤＮＡを意味するものと理解すべきである。これらのベクターは宿主生物中で自発的に複製または染色体的に複製されることができる。これらのベクターは本発明のさらなる具体例を代表する。
【０１２２】
好適なプラスミドは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｐＥＴ２８ａ（＋），ｐＬＧ３３８，ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐＫＣ３０，ｐＲｅｐ４，ｐＨＳ１，ｐＫＫ２２３−３，ｐＤＨＥ１９．２，ｐＨＳ２，ｐＰＬｃ２３６，ｐＭＢＬ２４，ｐＬＧ２００，ｐＵＲ２９０，ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１，λｇｔ１１；ストレプトミセス中のｐＩＪ１０１，ｐＩＪ３６４，ｐＩＪ７０２またはｐＩＪ３６１；バチルス中のｐＵＢ１１０，ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム中のｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７；カビ中のｐＡＬＳ１，ｐＩＬ２またはｐＢＢ１１６；イースト中の２αＭ，ｐＡＧ−１，ＹＥｐ６，ＹＥｐ１３またはｐＥＭＢＬＹｅ２３；または植物中のｐＬＧＶ２３，ｐＧＨＩａｃ＋，ｐＢＩＮ１９，ｐＡＫ２００４またはｐＤＨ５１である。言及したプラスミドは可能性あるプラスミドの小さな選択である。さらなるプラスミドは当業者には既知であり、そして例えば専門書Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｅｄｓ．Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５，ＩＳＢＮ０４４４９０４０１８）から推論することができる。
【０１２３】
ベクターのさらなる具体例において、本発明に従った核酸構造体、または本発明に従った核酸は、直鎖状ＤＮＡの形で微生物に有利に導入され、そして同種または異種組み換えによって宿主生物中に集積されることができる。この直鎖状ＤＮＡはプラスミドのような直鎖状ベクターから、または単に本発明に従った核酸構造体または核酸のみから構成されることができる。
【０１２４】
生物中の異種遺伝子の最適発現のため、生物に使用される特異的"コドン利用"に対応して核酸を修飾するのが有利である。“コドン利用”は、関連する生物の既知の遺伝子のコンピューター分析によって容易に決定することができる。
【０１２５】
本発明に従った発現カセットの生産は、適当なコード化ヌクレオチド配列と、ターミネーターまたはポリアデニル化信号との適切なプロモーターの融合によって実施される。この目的のため、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されているような慣用の組み換えおよびクローニング技術が使用される。
【０１２６】
好適な宿主生物中の発現のため、組換え核酸構造体または遺伝子構造体が、宿主中に遺伝子の最適発現を可能にする宿主特異性ベクター中に有利に挿入されるベクターは当業者には良く知られ、そして例えば“Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ”（Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）から推論することができる。
【０１２７】
４． 微生物
文脈に応じて、用語“微生物”は出発微生物（野生タイプ）、または遺伝子的に修飾された組換え微生物、または両者を意味するとして理解できる。
【０１２８】
本発明に従ったベクターの助けにより、本発明に従った少なくとも一つのベクターで形質転換された組換え微生物が調製され、本発明に従ったポリペプチドの生産のために使用することができる。有利には、上に記載した本発明に従った組換え構造物が宿主システムに導入され、発現される。ここでは、例えば共沈澱、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等のような、当業者が熟知しているクローニングおよびトランスフェクション方法が前述した核酸をそれぞれの発現システム中に発現させるために好ましく使用される。好ましいシステムは、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９７またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。
【０１２９】
本発明に従った核酸または核酸構造体のための細換え宿主生物は原則として原核または真核生物である。有利には宿主生物としてバクテリア、カビまた酵母のような微生物が使用される。有利には、グラム陽性またはグラム陰性バクテリア、好ましくはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ，Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅまたはＮｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ科のバクテリア、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｎｏｒｃａｒｄｉａ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍまたはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属のバクテリアが使用される。特に好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。さらなる有利なバクテリアはアルファプロトバクテリア、ベータプロトバクテリアまたはガンマプロトバクテリアのグループ中に見出される。
本発明に従った宿主生物は、好ましくは上の定義に従った７β−ＨＳＤＨ活性を有する酵素をコードする本発明の核酸配列、核酸構造体またはベクターの少なくとも一つを含んでいる。
【０１３０】
本発明に従った方法に使用される生物は、宿主生物に応じて当業者に知られた態様で増殖または培養される。原則として微生物は通常糖の形の炭素源と、通常イースト抽出物のような有機窒素源または硫酸アンモニウムのような塩の形の窒素源と、鉄、マグネシウムおよびマンガン塩のような微量元素と、そして任意にビタミンを含む液体培地中で０℃および１００℃の間の、好ましくは１０℃および６０℃の間の温度において酸素通気下に培養される。この間栄養液のｐＨを固定値に保つことができる。すなわち培養の間調節し、または調節しないことができる。培養はバッチ式、半バッチ式または連続式に実施することができる。栄養分は発酵開始時に提供するか、または後で半連続的または連続的に供給することができる。
【０１３１】
５．ＵＤＣＡの生産
第１工程：ＣＡのＤＨＣＡへの化学変換
ＣＡのヒドロキシ基がそれ自体公知の態様で古典的化学ルートによりクロム酸または酸性溶液（例えばＨ２ＳＯ４）中のクロム酸塩でカルボニル基へ酸化される。
【０１３２】
第２工程：ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素変換
水溶液中、ＤＨＣＡがそれぞれＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの存在下、３α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨによって１２−ケト−ＵＤＡＣへ特異的に還元される。助因子ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨは、ＡＤＨまたはＦＤＨによってそれぞれイソプロパノールまたはギ酸ナトリウムから再生することができる。反応は緩和な条件のもとで進行する。例えば、反応はｐＨ＝４ないし９，６ないし９，または７ないし９，特にｐＨ＝８において、そして約１０ないし３０℃、１５ないし２５℃、または約２３℃において実施することができる。
【０１３３】
第３工程：１２−ケト−ＵＤＣＡのＵＤＣＡへの化学変換
１２−ケト−ＵＤＣＡの１２−カルボニル基がそれ自体公知の態様においてＷｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元によって除去され、そしてそれによって１２−ケト−ＵＤＣＡからＵＤＣＡが生成する。この反応において、カルボニル基は最初ヒドラジンによってヒドラゾンへ変換される。次にヒドラゾンは塩基（例えばＫＯＨ）の存在下２００℃へ加熱され、それによって窒素が分解除去され、ＵＤＣＡが生成する。
【０１３４】
６．ＨＳＤＨの組換え生産
さらに本発明は、ポリペプチド生産微生物が、培養され、ポリペプチドの発現が任意に誘発され、そして培養物からそれらが単離される、本発明に従ったポリペプチド、または機能的な、生物学的に活性なそのフラグメントの組換え生産方法に関する。このようにポリペプチドは、もし望むならば、工業的スケールで生産することもできる。
【０１３５】
本発明に従って調製される微生物はバッチプロセスで（バッチ式培養）において、または流加培養プロセスまたは反復流加培養プロセスにおいて連続的にまたは非連続的に培養することができる。公知の培養方法の要約はＣｈｍｉｅｌの教科書（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））またはＳｔｏｒｈａｓの教科書（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ （Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））に見られる。
【０１３６】
使用すべき培養培地はそれぞれの株の要求を好適に満たさなければならない。種々の微生物の培地は、ハンドブック“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”，Ａｍｅｒｉａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）に含まれている。
【０１３７】
本発明に従って使用し得るこれらの培地は、通常一以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含んでいる。
【０１３８】
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類である。非常に良い炭素源は、例えばグルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖は、糖蜜または製糖の他の副産物のような複合化合物として培地へ添加することもできる。種々の炭素源の混合物を添加することも有利である。他の可能性ある炭素源は、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油のような油脂、例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはリノレイン酸のような脂肪酸、例えばグリセロール、メタノールまたはエタノールのようなアルコールおよび例えば酢酸または乳酸のような有機酸である。
【０１３９】
窒素源は、通常有機または無機窒素化合物か、またはこれら化合物を含んでいる材料である。例示的窒素源は、アンモニアガスまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムのようなアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、またはコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク、イーストエキス、ミートエキス等の複合窒素源を含む。窒素源は個別にまたは混合物として使用することができる。
【０１４０】
培地中に存在することができる無機塩は、塩化物、またはカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄のリン酸または硫酸塩である。
【０１４１】
イオウ源として、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、ジチオナイト、テトラチオネート、チオ硫酸塩、硫化物のような無機イオウ含有化合物を使用することができるが、メルカプタンおよびチオールのような有機イオウ化合物を使用することもできる。
【０１４２】
リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウム、またはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を使用することができる。
【０１４３】
金属イオンを溶液中に保持するためキレート剤を媒地へ添加することができる。特に好適なキレート剤は、カテコールまたはプロトカテキュエートのようなジヒドロキシフェノール、クエン酸のような有機酸を含む。
【０１４４】
本発明に従って使用し得る発酵培地は、ビタミンのような他の発育因子または発育プロモーターを慣用的に含み、これらは、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩およびピリドキシンを含む。発育因子および塩は、イーストエキス、糖蜜、コーンスチープリカー等のような複合培地成分からしばしば誘導される。さらに培地へ好適な前駆体を添加することもできる。培地配合物の正確な組成は、詳細な実験に強く依存し、そしてそれぞれの特定のケースのために個別的に決定される。培地最適化のための情報は教科書“Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｅｄ．Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）ｐｐ．５３−７３，ＩＳＢＮ ０ １９ ９６３５７７ ３）から得られる。発育培地は、スタンダード１（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ＤＩＦＣＯ）等のような商業的サプライヤーからも得ることができる。
【０１４５】
すべての培地成分は熱（１．５バールおよび１２１℃において２０分）または無菌濾過によって滅菌される。成分は一所に、またはもし必要ならば別々に滅菌することができる。すべての培地成分は発育のスタートから存在することができ、または場合によって連続的またはバッチ式に添加することができる。
【０１４６】
培養物の温度は通常１５℃ないし４５℃、好ましくは２５℃ないし４０℃の間であり、そして実験の間コンスタントに保つか、または変えることができる。培地のｐＨは５ないし８．５の範囲内でなければならず、好ましくは７付近である。伝播のためのｐＨは、伝播の間、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水のような塩基性化合物の添加、またはリン酸または硫酸のような酸性化合物の添加によってコントロールすることができる。泡発生の制御のため、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用することができる。プラスミドの安定性の維持のため、例えば抗生物質のような好適な選択的に作用する物質を培地へ加えることができる。好気的条件を維持するため、酸素または環境空気のような酸素含有ガス混合物が培養物中に導入される。培養物の温度は通常２０℃ないし４５℃である。培養は所望の生成物が最大に生産されるまで継続される。この目的は通常１０時間ないし１６０時間で達成される。
【０１４７】
発酵ブロスはその後さらに処理される。要請に応じ、バイオマスは、例えば遠心、濾過、デカンテーションまたはこれらの組合せのような分離方法によって、または完全に放置することによって完全にまたは部分的に発酵ブロスから除去することができる。
【０１４８】
もしポリペプチドが培養培地中に分泌されないならば、細胞を破壊し、そして既知タンパク単離方法に従って溶解物から回収することもできる。代って細胞は、高周波数超音波により、例えばフレンチ圧力セル中のような高圧力により、オスモリシスにより、界面活性剤、分解酵素または有機溶媒の作用により、または言及したプロセスのいくつかの組合せによって破壊することができる。
【０１４９】
ポリペプチドの精製は、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーのような分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーのような既知のクロマトグラフィープロセスを使用し、および限外濾過、結晶化、塩析、透析および天然ゲル電気泳動のような他の慣用のプロセスを使用して達成することができる。好適プロセスは、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｅｒｌａｇ Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ ＹｏｒｋまたはＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【０１５０】
組換えタンパク単離のため、特異性ヌクレオチド配列を伸長し、そしてそのため例えばより簡単な精製のために役立つ修飾したポリペプチドまたは融合タンパクをコードするベクターシステムまたはオリゴヌクレオチドを使用することが組換えタンパクの単離のために有利であり得る。このタイプの好適な修飾は、例えば、ヘキサヒスチジンアンカーとして知られた修飾、または抗体によって抗原として認識されることができるエピトープのような（例えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓに記載されているような）アンカーとして機能する"タグ"である。これらのアンカーは、例えばクロマトグラフィーカラムへ充填することができる、またはマイクロタイタープレート上または他のキャリア上に使用されるポリマーマトリックスのような固体担体へのタンパクの付着のために役立つことができる。
【０１５１】
同時に、これらアンカーはタンパクの認識のためにも使用することができる。タンパクの認識のため蛍光染料のような慣用なマーカー、基質との反応後検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー、または放射性マーカーが単独で、またはタンパクの誘導体化のアンカーと組合せて使用されることができる。
【０１５２】
７． 酵素固定化
本発明に従った酵素は、ここに記載したプロセスにおいて遊離または固定形で使用することができる。固定化酵素とは、不活性担体へ固定される酵素の意味であると理解される。好適な担体材料およびその上に固定化された酵素は、ＥＰ−Ａ−１１４９８４９，ＥＰ−Ａ−１０６９１８３およびＤＥ−ＯＳ−１００１９３７７３およびそれらに引用された参照から知られている。この点に関し、これら明細書の開示全体が参照される。好適な担体材料は、例えばカオリナイト、ケイ藻土、パーライトのような粘土、粘土鉱物、シリカ、アルミナ、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉、アニオン交換材料、ポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタンおよびポリエチレンおよびポリプロピレンのような合成高分子を含む。担体材料は慣例的に固定された酵素のために微粉砕された粒子の形で使用され、多孔質形が好ましい。担体材料の粒子寸法は５ｍｍ以下、特に２ｍｍ以下（分布カーブ）である。同様に、全細胞触媒としてデヒドロゲナーゼの使用において、遊離または固定化形を選ぶことができる。担体材料は、例えばアルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。酵素それに細胞は、グルタルアルデヒドを用いて直接架橋する（ＣＬＥＡへの架橋）ことができる。対応してそしてさらなる固定化プロセスは、例えば、Ｊ．Ｌａｌｏｎｄｅ ａｎｄ Ａ．Ｍａｒｇｏｌｉｎ“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ”ｉｎ Ｋ．Ｄｒａｕｚ ａｎｄ Ｈ．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ２００２，ｖｏｌ．ＩＩＩ，９９１−１０３２，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍに記載されている。
【０１５３】
実験の部
他の情報が与えられなければ、例えば制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの精製、ニトロセルロースおよびナイロンメンブレンへのＤＮＡの移動、ＤＮＡフラグメントの連結、微生物の形質転換、微生物の伝播、ファージの複製、および組換えＤＮＡの配列分析のような、本発明の文脈において実施されるクローニングステップは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８８）前出に記載されているように実施することができる。
【０１５４】
１．一般的情報
材料
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９（ＡＴＣＣ２５９８６，以前の名称Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）からのゲノムＤＮＡは、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＤＳＭＺ）から得た。ＵＤＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡはそれ自体既知の出発化合物であり、文献に記載されている。すべての他の薬品はＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＦｌｕｋａ（ドイツ）から得た。すべての制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）はｑｅｒｍｅｎｔａｓ（ドイツ）から得た。
培地
培地リットル当りトリプトン１０ｇ、イースト抽出物５ｇおよびＮａＣｌ ５ｇを含有するＬＢ培地
発現ベクター
ｐＥＴ２２ｂ（＋）およびｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）
微生物
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を３７℃において適当な抗生物質を含んでいるＬＢ培地中で増殖させた。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を３７℃において適当な抗生物質を含んでいるＬＢ培地中で増殖させ、インキュベーション後０．５ｍＭ ＩＰＴＧでＯＤ６００＝０．８を２５℃および１４０ＲＰＭにおいて維持した。
【０１５５】
分析方法
１．７β−ＨＳＤＨ活性決定のための標準条件
反応混合物は全容積１ｍｌ中以下を含む。
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０ ８８０μｌ
１０ｍＭ ＵＤＣＡ（水に溶解、ｐＨ８） １０μｌ
酵素溶液（上の緩衝液中１ないし１０Ｕ／ｍｌの範囲） １０μｌ
１ｍＭ ＮＡＤＰ＋（上の緩衝液中） １００μｌ
３４０ｎｍにおける吸光の増加が測定され、そして活性は６．２２ｍＭ−１×ｃｍ−１のモル吸光係数を用いて酵素単位（Ｕ，すなわちμｍｏｌ／ｍｉｎ）として計算される。
２．ＢＣＡアッセイによるタンパク質測定
サンプルはＢＣＡ試薬（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍから）と混合され、そして３７℃において４５分間インキュベートされた。タンパク質含量は使用したアッセイの濃度範囲において較正曲線（ＢＳＡ）に対して５６２ｎｍにおいて決定された。
３．薄層クロマトグラフィー
サンプル５ないし１０μｇをＴＬＣフィルムＫｉｅｓｅｌｇｅｌ６０（Ｍｅｒｃｋ）へ適用した。参照として基準サンプルも適用された。ＴＬＣフィルムの一端を移動相がトップに到達するまで溶出液中に浸漬した。ＴＬＣフィルムを乾燥し、リンモリブデン酸で発色させた。
【０１５６】
２．実施例
製造実施例１：７β−ＨＳＤＨ活性の同定
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ ２５９８６のゲノムＤＮＡ配列は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒにより、ヒト消化管マイクロバイオーム計画のために２００７年ジーンバンクにおいて発表された。ＨＳＤＨは短鎖デヒドロゲナーゼに入る。Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓからの短鎖デヒドロゲナーゼの生化学的機能はジーンバンクに注釈されていなかったので、９つの候補がベクターｐＥＴ２２ｂ＋中にクローンされ、そしてＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中に発現された。
【０１５７】
このため７β−ＨＳＤＨをコードする配列がＰＣＲで増幅された。ＰＣＲ生成物は鋳型としてＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６（ＤＳＭ３９７９）のゲノムＤＮＡを使用し、プライマーとして
【化６】
【化７】
を使用して得られた。プライマー配列中のＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ開裂部位はアンダーラインされている。ＰＣＲ生成物はＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製され、そして酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開裂された。適切なベクターもＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開裂された。生成物はアガロースゲル上に適用され、分離され、そしてこれから切り取られ、精製された。開裂したＰＣＲ生成物および開裂したベクターはＴ４リガーゼでリゲートされた。リゲートされた生成物はＥ．ＣｏｌｉＤＨ５ａ中に形質転換された。得られたベクター（７β−ＨＳＤＨの遺伝子を含んでいる）は配列決定によって確認され、Ｅ．ＣｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換され、そしてＩＰＴＧで誘発され、発現された。
【０１５８】
発現はＬＢ培地５０ｍｌ中で実施された。前培養物の調製のため、ＬＢアガープレート上の１コロニーを取り、ＬＢ培地（適切な抗生物質を含む）５ｍｌ中３７℃および１６０ＲＰＭで１夜インキュベートされた。ＬＢ培地（適切な抗生物質を含む）５０ｍｌが前培養物５００μｌで接種された。培養物は３７℃および１６０ＲＰＭでインキュベートされた。ＯＤ６００約０．８まで０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって発現が誘発された。６時間または一夜後、細胞が遠心沈下された。ペレットをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ含有）６ｍｌ中に懸濁され、超音波粉砕された。細胞断片は遠心により除去された。
【０１５９】
７β−ＨＳＤＨ活性の同定のため、光度計法によって活性がテストされた。このため酵素と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８）中のテスト物質が１ｍｌクベット中で混合された。ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＨ）またはＮＡＤＰ＋（ＮＡＤ＋）を添加した後、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの分解または生成を測定した。９候補からの１酵素がＮＡＤＰ＋の存在下ＵＤＣＡに対して活性（６０Ｕ／ｍｌ）を示したが、ＣＡに対しては活性を示さなかった。
【０１６０】
この光度計テストにおいて、７β−ＨＳＤＨは、ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤＰＨの存在下、ＵＤＣＡに対して６０Ｕ／ｍｌの活性を、７−ケト−ＬＣＡに対して３５Ｕ／ｍｌの活性を、そしてＤＨＣＡに対して１１９Ｕ／ｍｌの活性を示した。ＣＡに対する活性は検出できなかった。
【０１６１】
急速精製を可能とするため、７β−ＨＳＤＨをコードする遺伝子がＨｉｓ−ＴａｇでｐＥＴ２８＋中に再クローンされた。Ｈｉｓ−Ｔａｇを有する７β−ＨＳＤＨは、上に記載したようにＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中に活動的に発現された。精製はＴａｌｏｎカラムで実施された。カラムは最初リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８，３００ｍＭ ＮａＣｌ添加）で平衡化された。細胞溶解物を負荷した後、カラムをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８，３００ｍＭ ＮａＣｌ添加）で洗浄した。７β−ＨＳＤＨはリン酸仮無緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８，３０ｍＭ ＮａＣｌと２００ｍＭイミダゾール添加）で溶出された。溶出液中のイミダゾールは透析によって除去された。精製収率は７６％であり、純度は約９０％であった。
【０１６２】
変換実施例１：７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−ＬＣＡの酵素変換
７β−ＨＳＤＨの生化学的機能を調べるため、７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−ＬＣＡの変換を実施した。２０ｍｌの変換混合物は、７−ケト−ＬＣＡ５０ｍＭ（約０．４ｇ）と、７β−ＨＳＤＨ ５Ｕ／ｍｌと、そしてＮＡＤＰ＋０．０５ｍＭを含有する。ＮＡＤＰＨの再生のため、ＡＤＨ
４Ｕ／ｍｌと、イソプロパノール１％を使用した（スキーム１を見よ）。反応はフューム戸棚中攪拌下ｐＨ８および２４℃において実施された。アセトンはイソプロパノールより速く蒸発するので、反応はＵＤＣＡの生成へ向ってシフトする。１％イソプロパノールが２４時間後、４８時間後および７２時間後に再び添加された。生成物は、ＴＬＣによって分析された（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０，Ｍｅｒｃｋ，移動相石油エーテル：酢酸エチル＝１：１０ ｖｏｌ：ｖｏｌ）。ＴＬＣ上で生成物は真正参照７−ケト−ＬＣＡ，ＵＤＣＡおよびＣＤＣＡと比較された。ＴＬＣ分析はＵＤＣＡが７β−ＨＳＤＨによって７−ケト−ＬＣＡから生成したことを示した。エナンチオマーＵＤＣＡはＴＬＣ上で検出できなかった。
【０１６３】
スキーム１：７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−ＬＣＡの還元の概略的表現。ＡＤＨが助因子ＮＡＤＰＨを再生する。
【化８】
【０１６４】
変換実施例２：７β−ＨＳＤＨによるＤＨＣＡからの１２−ケト−ＵＤＣＡの酵素生産
ＤＨＣＡから１２−ケト−ＵＤＣＡの生産のため７β−ＨＳＤＨの使用可能性をテストするため、７β−ＨＳＤＨによるＤＨＣＡの変換を実施した。変換混合物５０ｍｌは、５０ｍＭ ＤＨＣＡ（１ｇ）、５Ｕ／ｍｌ ７β−ＨＳＤＨおよび０．０５ｍＭ ＮＡＤＰ＋を含有する。ＮＡＤＰＨの再生のため、４Ｕ／ｍｌ ＡＤＨと１％イソプロパノールが使用された（スキーム２を見よ）。反応はフューム戸棚中攪拌下ｐＨ８および２４℃において実施された。アセトンはイソプロパノールより速く蒸発するので、反応は１２−ケト−７β−ＣＡの生成へ向ってシフトする。１％イソプロパノールが２４時間後、４８時間後および７２時間後に再び添加された。中間体３，１２−ジケト−７β−ＣＡはＴＬＣによって分析された。ＤＨＣＡはもはやＴＬＣ上で検出できなかった（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，Ｍｅｒｃｋ，移動相クロロホルム：メタノール：酢酸＝１０：１：０．０８容積比）
スキーム２：７β−ＨＳＤＨによるＤＨＣＡの還元の概略的表現。ＡＤＨが助因子ＮＡＤＰＨを再生する。
【化９】
【０１６５】
変換実施例３：１２−ケト−ＵＤＣＡへの３，１２−ジケト−７β−ＣＡの酵素変換
中間体３，１２−ジケト−７β−ＣＡ（変換実施例２に従って製造された）がさらに１２−ケト−ＵＤＣＡへＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉからの３α−ＨＳＤＨ（配列同定Ｎｏ．５および６）（Ｍｏｂｕｓ，Ｅ ａｎｄ Ｅ．Ｍａｓｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｒｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ３ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｃａｒｂｏｎｙｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ；Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９８，２７３（４７）：ｐ．３０８８８−９６）によって変換された。この３α−ＨＳＤＨは助因子ＮＡＤＨを必要とし、これはＦＤＨによって再生される（図３を見よ）。３α−ＨＳＤＨ ４Ｕ／ｍｌと、ＦＤＨ（ＮＡＤＨ依存性、Ｃｏｄｅｘｉｓ）１Ｕ／ｍｌと、ギ酸ナトリウム２００ｍＭと、そしてＮＡＤ＋０．０５ｍＭとが反応へ加えられた。４０時間後、生成物は２Ｍ ＨＣｌでｐＨ２へ酸性化され、酢酸エチル１０ｍｌで６回抽出された。蒸発後、生成物１．０７ｇが得られた。生成物１２−ケト−ＵＤＣＡが分析され、ＴＬＣおよびＮＭＲによって確認された。３α−ＨＳＤＨは７β−ＨＳＤＨの生産と同様に生産されたが、しかしプラスミドｐＥＴ２２ｂ＋が使用され、それ以上精製することなく使用された。
【０１６６】
スキーム３：３α−ＨＳＤＨによる３，１２−ジケト−７β−ＣＡの還元の概略的表現。ＦＤＨが助因子ＮＡＤＨを再生する。
【化１０】
【０１６７】
変換実施例４：ＣＡのＤＨＣＡへの化学変換
氷酢酸１３２０Ｌを２０００Ｌ攪拌容器に入れ、コール酸（ＣＡ）１１０ｋｇ（２６０モル）をその中に溶解した。次亜塩素酸ナトリウム溶液（２．３モル濃度）４２２Ｌを２０ないし４０℃においてこの溶液中へ計量し、反応溶液を反応完結まで少なくとも１時間さらに攪拌した。デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）を遠心によって１００ｋｇ（９０％）の収量で単離する。
【０１６８】
変換実施例５：１２−ケト−ＵＤＣＡのＵＤＣＡへの化学変換
１２−ケト−ＵＤＣＡ１０５ｇ（０．２５８モル）をトリエチレングリコール３８４ｍｌに溶かし、水酸化ナトリウム５２．２ｇ（１．３０４モル）とヒドラジンヒドラート７５．９５ｍｌ（１．５６３モル）を加え、１８０℃へゆっくり加熱する。この時ヒドラゾンが生成するが、１６０℃を越えると窒素を放出してＵＤＣＡへ転位する。変換完了のため反応混合物を１８０℃に８時間維持する。反応混合物を１００℃以下に冷却し、水１５００ｍｌで処理する。次に塩酸で酸性することによってＵＤＣＡを沈澱させる。生成物は、９６．２ｇないし９９．２ｇ（９５％から９８％まで）の収量で得られる。
【０１６９】
製造実施例２：調製的スケールでＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６からの７β−ＨＳＤＨのクローニング、発現および精製と、この酵素のさらなるキャラクタリゼーション
【０１７０】
ａ）クローニングおよび発現構造体の生産
７β−ＨＳＤＨコーディング遺伝子をコードする遺伝子がＰＣＲにより、そして製造実施例１において記載したプライマーを使用したゲノムＤＮＡから再び増幅された。
ＰＣＲ生成物が前に記載したように再び精製され、制限エンドヌクレアーゼＨｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化された。消化されたＰＣＲ生成物は再び精製され、発現ベクターを作製するためＴ４リガーゼを用いてｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター中にクローンされた。得られた発現構造体は次にＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ細胞中に形質転換された。予期されるタンパク質は、信号ペプチドとＮ−末端６×Ｈｉｓ−Ｔａｇとトロンビン開裂部位を含んでいる２０アミノ酸残基を持つに違いない。挿入したＤＮＡの配列がシーケンシングによってチェックされた。
【０１７１】
ｂ）７β−ＨＳＤＨの過発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）が発現構造体で形質転換された。このため発現構造体を含んでいるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株がカナマイシン３０μｇ／ｍｌを含んでいるＬＢ培地中で（２Ｌシェーカーボトル中２×４００ｍｌ）増殖された。遠心（１０，０００×ｇ、５分、４℃）によって細胞が収穫された。ペレットをリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８，ＰＭＳＦ０．１ｍＭを含有）２０ｍｌ中に再懸濁した。細胞はＳｏｎｉｆｉｅｒ ２５０超音波デバイス（Ｂｒａｎｓｏｎ，ドイツ）を使ってコンスタントな冷却のもと１分間の超音波処理（４０Ｗパワー、４０％間隔および１分休止）によって粉砕された。粉砕は３回繰り返された。細胞抽出物は遠心された（２２，０００×ｇ、２０分、４℃）。上清が負荷緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）で平衡化したＴａｌｏｎカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）に負荷された。このプロセスは２４℃で実施された。非結合物質はカラムを負荷緩衝液（３カラム容積）で洗浄することによって洗い流した。弱く結合しているタンパク質は洗浄緩衝液（負荷緩衝液中２０ｍＭイミダゾール、３カラム容積）で洗うことによって除去された。Ｈｉｓ−Ｔａｇ−７β−ＨＳＤＨタンパク質は溶出緩衝液（負荷緩衝液中イミダゾール２００ｍＭ）で溶出された。溶出液は分子排除限界５ｋＤａの透析チューブ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）中リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８）２Ｌ中で４℃で一夜透析された。最後にサンプルを新しいチューブへ移し、さらなる透析のため−２０℃で貯蔵された。タンパク濃度は製造者の指示書に従ってＢＣＡテストキット（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）を使用して決定された。加えて、サンプルは１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、そしてＣｏｏｍａｓｓｉｅブリリアンドブルーによる染色によって分析された。たんぱく質の純度はＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｂｅｔａ ４．０．２（Ｓｃｉｏｎ，ＵＳＡ）を使用してデンシトメトリーによって決定された。
【０１７２】
ｃ）ゲル濾過
ゲル濾過は、７β−ＨＳＤＨの分子量を決定するためにＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＫＴＡタンパク質精製システム上で実施された。２００ｍＭ塩化ナトリウムを含んでいる５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）であらかじめ平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２００カラム上に精製した酵素が適用された。タンパク質は１ｍｌ／ｍｉｎの流量で同じ緩衝液で溶出された。７β−ＨＳＤＨの分子量は、タンパク質標準（血清アルブミン（６６ｋＤａ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅからのα−アミラーゼ（５２ｋＤａ）、ブタ膵臓からのトリプシン（２４ｋＤａ），およびニワトリ卵からのリゾチーム（１４．４ｋＤａ））との溶出容積の比較によって決定された。
【０１７３】
ｄ）酵素テストおよび動力学分析
酵素テストのための反応混合物は、全容積１ｍｌ中５０μｍｏｌリン酸カリウム（ｐＨ８）、０．１μｍｏｌ ＮＡＤ（Ｐ）ＨまたはＮＡＤ（Ｐ）＋、基質およびタンパク質を含んでいた。この反応混合物を光路長１ｃｍのクベットに入れた。７β−ＨＳＤＨ活性は分光光度計（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ３０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，イギリス）を使用して３４０ｎｍの吸光度におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度の変化を記録することによって決定された。酵素活性は２５℃における６．２２ｍＭ−１×ｃｍ−１のモル吸光係数を使用して酵素単位（Ｕ，すなわちμｍｏｌ／ｍｉｎ）として決定された。可変基質、補酵素、濃度、ｐＨ、緩衝液およびインキュベーション温度を使用していくつかの異なる測定が実施された。動力学的定数は標準方法を使用して決定された。
【０１７４】
ｅ）７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−リトコール酸のバイオ転換
７β−ＨＳＤＨの生化学的機能を検証するため、７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−ＬＣＡの変換を実施した。０．４ｇの７−ケト−ＬＣＡをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８）の１０ｍｌ中に懸濁し、２Ｍ水酸化ナトリウムの添加によってｐＨ８へ調節した。イソプロパノール０．２ｍｌ、７β−ＨＳＤＨ１００単位、およびＴｈｅｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓからのアルコールデビドロゲナーゼ（ＡＤＨ−ＴＥ）８０単位（Ｄｒ．Ｋ．Ｍｏｍｏｉ、ＩＴＢ大学、シュトゥットガルトからの寄贈）、およびＮＡＤＰ＋１μｍｏｌを加えた。２０ｍｌの全反応容積を得るため同じ緩衝液を加えた。反応混合物を２４℃でインキュベートし、そして２４時間攪拌した。この間ＮＡＤＰＨはＡＤＨにより２−プロパノールの酸化を介して再生された。生成物を２Ｍ塩酸１ｍｌで酸性化し、酢酸エチル５×５ｍｌで抽出した。有機溶液は次に蒸留された。
【０１７５】
ｆ）クロマトグラフ生成物決定
ＬＣ２０ＡＤ ＨＰＬＣシステム（島津、日本）上にＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴＴＭＳＴＡＲ ＲＰ１８タイプ（エンドキャップした、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）のプレカラムを備えたＰｕｒｏｓｐｈｅｒＴＭＳＴＡＲ ＲＰ−１８タイプのカラム（ＨｉｔｂａｒＴＭＲＴ１２５−４ プレパックしたカラム、ＰｕｒｏｓｐｈｅｒＴＭＳＴＡＲ ＲＰ−１８ エンドキャップした、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）上で１ｍｌ／ｍｉｎの流速においてＨＰＬＣ分析が実施された。移動相は２種の溶出液からなっていた。溶出液Ａはアセトニトリルを含有し、溶出液Ｂは蒸留水（ｐＨ２．６、オルトリン酸８５％で調節）であった。以下の勾配が使用された：Ａ３５％（８分）−３５％−４３％（１％ｍｉｎ−１）−４３％−７０％（１％ｍｉｎ−１）−７０％（５ｍｉｎ）−７０％−３５％（１７．５％ｍｉｎ−１）−３５％（５ｍｉｎ）；溶出液Ａ６５％（８ｍｉｎ）−６５％−５７％（１％ｍｉｎ−１）−５７％−３０％（１％ｍｉｎ−１）−３０％（５ｍｉｎ）−３０％−６５％（１７．５％ｍｉｎ−１）−６５％（５ｍｉｎ）。サンプル２０μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）が分析された。標準として真正ＵＤＣＡ，７−ケト−ＬＣＡおよびＣＤＣＡが同じ濃度で使用された。記録は２００ｎｍにおけるＵＶ検出によって実行された。
【０１７６】
ｇ）配列アラインメントおよび分子進化分析
Ｃｌａｓｔａｌ Ｘ ソフトウエア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２５：４８７６−８２）を使用して多数配列アラインメントが創出され、Ｊａｌｖｉｅｗ ソフトウエア（Ｃｌａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：４２６−７）を用いて修飾された。分子進化系統樹はプログラムＴｒｅｅＶｉｅｗ１．６．６（Ｒｏｄｅｒｉｃ ２００１，ｈｔｔｐ：／／ｔａｘｏｎｏｍｙ．ｚｏｏｌｏｇｙ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ．／ｒｏｄ．ｈｔｍｌ）を使用してつくられた。
【０１７７】
ｈ）テスト結果
１．調製用バイオ変換における７β−ＨＳＤＨ活性の同定
酵素の機能を確認するため、１０ｍｌスケールにおいて７−ケト−ＬＣＡのバイオ変換を実施した。ここでは既に記載したように、ＮＡＤＰＨの再生のためＡＤＨと２−プロパノールを組合わせて単離した酵素が使用された。ＨＰＬＣ分析は、ＵＤＣＡだけがこの酵素によって生産される反応生成物（９０％変換）であることを示した。ＣＤＣＡ（保持時間１９．４分）は反応混合物中に検出されなかった。この結果はＮＡＤＰＨ依存性７β−ＨＳＤＨであり、そして７−ケト−ＬＣＡの７−カルボニル基の７β−ヒドロキシル基への選択的還元ができることを示す。
ＵＤＣＡ保持時間 ：１５．５分
７−ケト−ＬＣＡ保持時間 ：１８．３分
【０１７８】
２．精製およびゲル濾過
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９からの７β−ＨＳＤＨ遺伝子を発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）にクローニングし、その後の過発現の後、Ｎ−末端にＨｉｓ−Ｔａｇを備えた融合タンパク質が培養物１ｈあたり３３２．５ｍｇ（５８２８Ｕ）の７β−ＨＳＤＨ収率で得られた。Ｈｉｓ−Ｔａｇを備えた７β−ＨＳＤＨは固定化した金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによる１工程で精製された（純度＞９０％、収率７６％、図２を見よ）。トラック１および２の主要バンドは、この遺伝子のアミノ酸配列から誘導される予知された分子量に相当する、３０ｋＤａの期待した発現生成物を代表する。しかしながら、ゲル濾過によって７β−ＨＳＤＨに対し５６．１ｋＤａの分子量が決定された。このことはＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９からの７β−ＨＳＤＨのダイマー性格を確認する。
【０１７９】
３．配列アラインメント
本発明に従った７β−ＨＳＤＨのアミノ酸配列が既知のＨＳＤＳ配列と比較された（図３を見よ）。観察された配列類似性は、本発明に従った酵素は短鎖デヒドロゲナーゼ（ＳＤＲ）のファミリーに属することを指示する。ＳＤＲは非常に低い相同性および配列同一性を示すことが知られている（Ｊｏｒｎｖａｌ，Ｈ．，Ｂ．Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｍ．Ｋｒｏｏｋ，Ｓ．Ａｔｒｉａｎ，Ｒ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｄｕａｒｔｅ，Ｊ．Ｊｅｆｆｒｅｙ，ａｎｄ Ｄ．Ｇｈｏｓｈ；Ｓｈｏｒｔ−Ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ（ＳＤＲ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：６００３−１３ ａｎｄ Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｍ．Ｋｒｏｏｋ，ａｎｄ Ｈ．Ｊｏｒｎｖａｌｌ，１９９１；Ｃｈａｒａｃｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｅｕｒ．Ｊ．ＢｉｏＣｈｅｍ ２００：５３７−４３）。しかしながら、配列アラインメントはＳＤＲ一次構造中の保存されたドメインを明瞭に示している。Ｎ−末端モチーフＧｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ―Ｇｌｙ（Ｇｌｙ−４１，Ｇｌｙ−４５およびＧｌｙ−４７に対応、アラインメントに対応するナンバリング）は、ＳＤＲスーパーファミリーの特徴的なジヌクレオチド結合モチーフに相当する。加えて、３つの強い保存された残基Ｓｅｒ−１７７，Ｔｒｉ−１９０およびＬｙｓ−１９４（アラインメントに従ったナンバリング）を識別することができ、これはＳＤＲ酵素の触媒性の３組に相当する。
【０１８０】
４．分子進化系統分析
図３のアラインメントに基づいた進化樹が図４に示されている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ，Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからの７α−ＨＳＤＨは同じグループに属する。３α−ＨＳＤＨの両方は他のＨＳＤＨよりももっと目立った関係を示す。興味あることに、原核７β−ＨＳＤＨは、Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓおよびＭｕｓ ｍｕｓｕｌｕｓを含む動物１１β−ＨＳＤＨサブグループに関係している。
【０１８１】
５．動力学定数
ＵＤＣＡ，７−ケト−ＬＣＡ、ＤＨＣＡ，ＮＡＤＰ＋およびＮＡＤＰＨのためのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを使ったＶｍａｘおよびＫｍの絶対値を決定するため、動力学的平衡分析が実施された。以下の表において、基質飽和曲線および逆数プロットから得た、テストした基質および補酵素のためのすべての動力学データが要約されている。すべての基質および補酵素のＶｍａｘ，ＫＭおよびｋｃａｔ値は同じ範囲にあるが、しかしＤＨＣＡのＫＭ値は、多分低い水中溶解度のため他の基質よりも有意に高い。酵素はＮＡＤＰＨ依存性であり、そしてＮＡＤ＋およびＮＡＤＨの動力学定数は非常に低い活性のため決定できなかった。
【０１８２】
【表４】
ａ）非常に低い活性のため決定不能
ｂ）１Ｕ＝１μｍｏｌ／ｍｉｎ
【０１８３】
６．ｐＨ最適値
さらに、精製した酵素を用いて、ｐＨの関数としての種々の基質に対する７β−ＨＳＤＨ活性が決定された（図５を見よ）。７β−ＨＳＤＨによるＵＤＣＡの酸化については、最適活性はｐＨ９ないし１０の範囲にあり、酸性側で徐々に低下することが観察された。これと対照的に、７β−ＨＳＤＨによるＤＨＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡの還元に対しては、最適活性はｐＨ４ないし６の範囲にあり、酸性側でシャープな下降およびアルカリ側で徐々に低下することが見られた。異なる緩衝液は、同じｐＨにおいて７β−ＨＳＤＨの活性に少ししか影響しなかった。
【０１８４】
７．熱安定性
本発明に従ったＮＡＤＰ依存性７β−ＨＳＤＨは以下の安定性挙動を示す。４００分後３０℃での活性は２３℃より約３０％低い。この酵素は３０℃で１５００分後完全に失活するが、しかし２３℃で１５００分後では残存活性は２０％であった。リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８）中−２０℃において多数回冷凍および解凍後数ヶ月にわたっての貯蔵中有意な活性損失は観察されなかった。
【０１８５】
【表５】
ＡＡ＝アミノ酸配列
ＮＡ＝核酸配列
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ属のバクテリア、特にＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ株から得ることができる新規７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、これらの酵素をコードする配列、該酵素の生産、およびコール酸化合物の酵素変換における該酵素の使用、特にウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造における該酵素の使用に関し、また本発明の主題はＵＤＣＡの合成のための新規な方法である。
【背景技術】
【０００２】
活性物質ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）および対応するジアステレオマーであるケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）は、胆石問題の薬剤処置のために長年使用されて来た。この二つの化合物は、７位の炭素原子上のヒドロキシ基の配位のみにおいて異なる（ＵＤＣＡ：β配位、ＣＤＣＡ：α配位）。ＵＤＣＡの生産のため先行技術には種々の方法が記載されており、これらは純粋に化学的に実施されるか、または化学的および酵素的プロセスステップの組合わせよりなる。どの場合でも出発点はコール酸（ＣＡ）かまたはコール酸から製造されたＣＤＣＡである。
【０００３】
このようにＵＤＣＡ製造のための古典的化学的方法は以下のように概略的に表すことができる。
ＣＡ→ＣＡメチルエステル→３，７−ジアセチル−ＣＡメチルエステル→１２−ケト−３，７−ジアセチル−ＣＡメチルエステル→ＣＤＣＡ→７−ケト−ＬＣＡ→ＵＤＣＡ
重大な欠点は、化学的酸化は選択的でないため、カルボキシ基と、３αおよび７α−ヒドロキシ基をエステル化によって保護しなければならないことである。
【０００４】
酵素１２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤＨ）の使用に基づく代替的化学的／酵素的方法は次のように表わすことができ、そして例えば出願人のＰＣＴ／ＥＰ２００９／００２１９０に記載されている。
ＣＡ→１２−ケトＣＤＣＡ→ＣＤＣＡ→７−ケト−ＬＣＡ→ＵＤＣＡ
ここで１２α−ＨＳＤＨはＣＡを１２−ケトＣＤＣＡへ選択的に酸化する。古典的な化学的方法により必要な二つの保護ステップはこれによって不必要になる。
【０００５】
さらにＭｏｎｔｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，（Ｏｎｅ−Ｐｏｔ Ｍｕｌｔｉｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ １２−Ｋｅｔｏｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ Ａｃｉｄ：Ｓｕｂｔｌｅ Ｃｏｆａｃｔｏｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ Ｒｕｌｅ ｔｈｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ ｏｆ Ｆｉｖｅ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ ｉｎ ａ Ｒｏｗ； Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＆ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，２００９）は、代替的酵素−化学的方法を記載し、これは以下のように概略的に表すことができる。
ＣＡ→７，１２−ジケトＬＣＡ→１２−ケトＵＤＣＡ→ＵＤＣＡ
【０００６】
ＣＡは、７，１２−ジケトＬＣＡへＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２５２８５からの７α−ＨＳＤＨ（Ｚｈｕ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ −ｋｅｔｏｅｓｔｅｒｓ ｂｙ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ７−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ； Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００６，６２（１８）：ｐ．４５３５−４５３９）と、１２α−ＨＳＤＨによって最初に酸化される。これら二つの酵素は各自ＮＡＤＨ依存性である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｂｓｏｎｕｍ ＡＴＣＣ ２７５５５（ＤＳＭ５９９）からの７β−ＨＳＤＨ（ＮＡＤＰＨ依存性）（ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｉ．Ａ．ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｒｏａｃｈ，Ｂｉｌｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ７−ａｌｐｈａ−ａｎｄ ７−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｂｓｏｎｕｍ；Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １９８１，６６５（２）：ｐ．２６２−９）による還元後に１２−ケトＵＤＣＡが生成する。最終生成物はＷｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元によって得られる。この方法の欠点は、触媒反応の平衡位置のため完全変換が不可能なこと、および変換の最初のステップのため二つの異なる酵素を使用しなければならず、これは操作コストを増加させることである。助因子再生のため、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ＋の再生のためのＬＤＨ）およびグルコースデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰＨの再生のためのＧｌｃＤＨ）が使用される。ここで使用される助因子再生における欠点は、生成した同時生産物を反応混合物から除去するのが非常に困難で、そのため反応平衡を有利に影響させることができず、原料の不完全変換となる。
【０００７】
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６（ＤＳＭ３９７９；以前Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）株からの７β−ＨＳＤＨがＨｉｒａｎｏおよびＭａｓｕｄａによって１９８２年に記載された（Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．ａｎｄ Ｎ．Ｍａｓｕｄａ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＡＤＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ７−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｅｐｔｏｓｔｅｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８２，４５（５）：ｐ．１０５７−６３）。この酵素の配列情報は開示されていない。ゲル濾過によって決定された分子量は４５，０００Ｄａであった（Ｈｉｒａｎｏ，１０５９頁左欄を見よ）。さらにこの酵素では７−オキソ基の７β−ヒドロキシ基への還元は観察されなかった（Ｈｉｒａｎｏ，１０６１頁議論第１パラグラフを見よ）。同様に、Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．はＮＡＤＰ＋についてのみＫＭおよびＶｍａｘ値を記載し（それぞれ０．４および０．２）、しかしＮＡＤＰＨについては記載していない。このため当業者は、Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．によって記載された酵素は７位においてＤＨＣＡの３，１２−ジケト−７β−ＣＡへの還元の触媒には不適当であることを認識する。
【０００８】
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６のゲノムは２００７年にすでに配列決定されていたが、その中の解析された配列モチーフのどれも、酵素ファミリーＨＳＤＨ酵素群が属する可能性ある短鎖デヒドロゲナーゼへ帰属させることはできなかった。
【０００９】
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９２，１４，１２，１１３１−１１３５において、Ｃａｒｒｅａ ｅｔ ａｌ．は富化した７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨを使ってＣＡからのＵＤＣＡの製造方法を記載する。しかしながらこの方法の欠点は、病原性微生物Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｂｓｏｎｕｍからの７β−ＨＳＤＨの使用と、そして望まない７α−ＨＳＤＨ活性を余分に有するバクテリア抽出物からの酵素を調製的に精製する必要性である。
【００１０】
このため本発明の目的は、前述の欠点を回避するＵＤＣＡの新規な製造方法の提供である。特に、３，１２−ジケト−７β−ＣＡへ７位においてＤＨＣＡの立体特異性還元触媒を提供する新規な酵素を提供しなければならない。
【００１１】
さらなる目的は、例えばＵＤＣＡの製造に使用することができ、特に７位におけるコール酸誘導体の立体およびエナンチオ選択的酸化／還元を触媒する新規な７β−ＨＳＤＨの提供にある。
【発明の概要】
【００１２】
驚くべきことに、これらの課題はＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ属の好気性バクテリア、特にＣｏｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ株からの新規な位置および立体特異性７β−ＨＳＤＨの単離およびキャラクタリゼーションと、そしてコール酸化合物の変換、特にＵＤＣＡの製造におけるその使用を通じて解決することができた。
【００１３】
本発明によれば、ＵＤＣＡ製造のための新規な方法が特に提供され、該方法は概略的に以下のように表すことができる。
ＣＡ→ＤＨＣＡ→１２−ケトＵＤＣＡ→ＵＤＣＡ
ここでＣＡの酸化は古典的な化学的方法で簡単に実施される。ＤＨＣＡは７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨにより個々にまたは順次または同時に１２−ケトＵＤＣＡへ還元される。Ｗｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元と組合わせて、ＵＤＣＡはこのようにＣＡからたった３工程で合成することができる。
【００１４】
ここでの利益は、この酵素反応は高い転換を可能にし、高い選択性を示し、そして副生物を生成しないことである。組換え生産された酵素７β−ＨＳＤＨおよび３α−ＨＳＤＨは、驚くほど有利にＵＤＣＡの大規模生産を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１ａはＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓからの７β−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示し、図１ｂは、図１ａのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す。図１ｃはＣｏｍａｎｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉからの３α−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示し、図１ｄは図１ｂのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す。図１ｅはＲｕｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓからの３α−ＨＳＤＨのアミノ酸配列を示し、図１ｆは図１ｅのアミノ酸配列をコードする核酸配列を示す。
【図２】図２は本発明に従って調製した精製７β−ＨＳＤＨのＳＤＳゲルを示し、トラック１は精製細胞抽出物、トラック２は精製したタンパク質、トラックＭはＰａｇｅ ＲｏｕｌｅｒＴＭ、 分子量マーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，ドイツ）である。
【図３】図３は、Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９から本発明に従って調製された７β−ＨＳＤＨと、選択されたＨＳＤＨタンパク質の配列アラインメントを示す。配列中の保存された残基を目立たせてある。以下の配列寄託番号が適用される。Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓからの１１β−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＮＰ−００５５１６；Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓからの１１β−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＮＰ−００１０３８２１６；Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓからの１１β−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＡＡＳ４７４９１；Ｂｒｕｃｅｌｌａｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓからの７α−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＮＰ−６９８６０８；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからの７α−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＮＰ−２８８０５５；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｏｒｄｅｌｌｉからの７α−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＰ５０２００；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉｔｅｓからの３α／２０β−ＨＳＤＳ：スイスポートＰ１９９９２；Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｅｒｏｎｉからの３β／１１β−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＡＡＡ２５７４２；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．からの３α−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＢＡＡ０８８６１；Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉからの３α−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＹＰ−００３２７７３６４；Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからの１７β−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＮＰ−０００４０４；Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａからの２０β−ＨＳＤＨ：ジーンバンクＮＰ−９９９２３８。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからの１７β−ＨＳＤＨの最後の１７アミノ酸およびＳｕｓ ｓｃｏｒｆａからの２０β−ＨＳＤＨの最後のアミノ酸は、それらから追加のアライメント情報が誘導されないのでアライメント中に示さない。
【図４】図４は、ＨＳＤＨタンパク質配列のアライメントをベースにした樹状図を示し、選んだＨＳＤＨタンパク質間の類縁関係を示す。
【図５】図５は、本発明に従った７β−ＨＳＤＨの活性に対するｐＨの影響を示す。以下のテスト条件が使用された。５０ｍＭリン酸カリウム中ｐＨ４ないし７；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中ｐＨ７ないし９、および５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ中ｐＨ９ないし１１；すべて２３℃。５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ中ｐＨ９ないし１１におけるＤＨＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡの活性値は重複する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の特定具体例
１．好気性バクテリア、特にＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９（ＡＴＣＣ２５９８６）株のようなＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ属から得ることができる７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）およびそれから誘導される機能性均等物：
本発明に従ってＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９から得ることができる７β−ＨＳＤＨは、特に以下の性質の少なくとも一つ、例えば２，３，４，５，６または７、またはこれら性質のすべてによって特徴化される。
ａ）分子量（ＳＤＳゲル電気泳動）約２８−３２ｋＤａ、特に約２９〜３１ｋＤａまたは約３０ｋＤａ。
ｂ）分子量（特にＳＤＳなしのような非変性条件下でのゲル濾過）約５３ないし６０ｋＤａ，特に約５５ないし５７ｋＤａ，例えば約５６．１ｋＤａ：これによって本発明に従った酵素は、Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（前出）によって記載されたＣ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６からの４５ｋＤａの７β−ＨＳＤＨと明らかに異なる。これはＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９からの７β−ＨＳＤＨのダイマー性格（４重構造）を確認する。
ｃ）７−ケトＬＣＡの７−カルボニル基の７β−ヒドロキシ基への立体選択的還元：
ｄ）ｐＨ８．５ないし１０．５、特に９ないし１０の範囲のＵＤＣＡの酸化のためのｐＨ最適条件。
ｅ）ｐＨ３．５ないし６．５、特にｐＨ４ないし６の範囲のＤＨＣＡおよび７−ケトＬＣＡの還元のためのｐＨ最適条件、これによりｐＨの選択により酸化プロセス（特徴ｄ）の）および還元プロセスに影響を与える驚くべき可能性がある。
ｆ）下表に特定的に示したそれぞれの値を中心にして±２０％、特に±１０％、±５％、±３％、±２％または±１％の範囲内の下表に示した物質／助因子の少なくとも一つに対する下表からの少なくとも一つの動力学的パラメータ。
【００１７】
【表１】
ａ）非常に低い活性のため測定できなかった。
ｂ）１Ｕ＝１μｍｏｌ／ｍｉｎ
ｃ）これにより本発明に従った酵素は、明らかに低いＫｍおよびＶｍａｘ値（それぞれ０．４および０．２）が記載され、そしてＮＡＤＰＨに対する活性が測定されなかったＨｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．によるＣ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６からの７β−ＨＳＤＨ酵素（前出）とは明らかに異なる。
ｇ）Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓおよびＭｕｓ ｍｕｓｕｌｕｓを含む動物１１β−ＨＳＤＨに対するＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９からの原核性７β−ＨＳＤＨの系統学的類縁性。
本発明に従った７β−ＨＳＤＨは、例えば以下の性質または性質の組合わせを示す。
ａ）；ｂ）；ａ）とｂ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）およびｆ）。
【００１８】
２．Ｈｉｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．によって記載されたＣ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６からの７β−ＨＳＤＨ（前出）と異なって、
ａ）７−ケトステロイドを対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異的還元（水素化）、および／または
ｂ）７位にケト基と、そしてステロイド骨格上に少なくとも一つのさらなるケト基を含んでいるケトステロイドの対応する７β−ヒドロキシステロイドへの位置特異性水素化（還元）、特にデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）において例えばＮＡＤＰＨ依存性である７位のケト基の対応する３，１２−ジケト−７β−コラン酸への位置特異性還元を触媒する、具体例１で述べた７β−ＨＳＤＨまたはその機能的均等物。
【００１９】
３．配列同定Ｎｏ．２（アクセッションＮｏ．２Ｐ０１７７３０６１）に従ったアミノ酸配列を有する７β−ＨＳＤＨ、またはこの配列に対し少なくとも６０％、例えば少なくとも６５，７０，７５，８０，８５または９０％、例えば少なくとも９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９または９９．５％の同一度を有し、任意に上の定義に従った性質または性質の組合わせａ）；ｂ）；ａ）とｂ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）；ａ）および／またはｂ）およびｃ）およびｄ）およびｅ）およびｆ）によって付加的に特徴化される、それらから誘導される配列。
【００２０】
４．例えば配列同定Ｎｏ．１（アクセッションＮｏ．Ｎ２ ＡＡＶＮ０２００００１０、領域５２００５．．５２７９６）のような前の具体例の一つで述べた定義に従った７β−ＨＳＤＨをコードする核酸配列。
【００２１】
５．少なくとも一つの制御核酸配列の遺伝子コントロールのもとにある、具体例４で述べた核酸配列を含む発現カセット。
【００２２】
６．具体例５で述べた少なくとも一つの発現カセットを含むベクター。
【００２３】
７．具体例４で述べた少なくとも一つの核酸配列、または具体例５で述べた少なくとも一つの発現カセットを有し、または具体例６で述べた少なくとも一つのベクターで形質転換された微生物。
【００２４】
８．具体例７で述べた微生物を培養し、発現された７β−ＨＳＤＨが培養物から単離される、具体例１ないし３の少なくとも一つに述べた７β−ＨＳＤＨの生産方法。
【００２５】
９．具体例１ないし４の一つの定義に従った７β−ＨＳＤＨの存在下、対応する７−ケトステロイドが変換され、そして生成した少なくとも一つの還元生成物が任意に反応システムから単離される、７β−ヒドロキシステロイドの酵素合成方法。
【００２６】
１０．還元されるケトステロイドが、
デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ），
７−ケト−リトコール酸（７−ケトＬＣＡ）．
７，１２−ジケトリトコール酸（７，１２−ジケトＬＣＡ）、および特に酸の塩、アミドまたはアルキルエステルのようなそれらの誘導体から選ばれる、具体例９に述べた方法。
【００２７】
１１．ＤＨＣＡまたはその誘導体が３，１２−ジケト−７β−コラン酸または対応する誘導体へ変換される、または
７−ケトＬＣＡまたはその誘導体がウルソデオキシコール酸または対応する誘導体へ変換される、または
７，１２−ジケトＬＣＡまたはその誘導体が１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケトＵＤＣＡ）へ変換される、具体例１０に述べた方法。
【００２８】
１２．還元はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下（かつ消費を伴って）生起する、具体例９ないし１１の一つに述べた方法。
【００２９】
１３．具体例１ないし３の一つの定義に従った７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下、ヒドロキシステロイドが反応させられ、そして生成した酸化生成物が任意に反応システムから単離される、７β−ヒドロキシステロイドの酵素酸化方法。
【００３０】
１４．７β−ヒドロキシステロイドが、３，１２−ジケト−７β−ＣＡまたは特に塩、アミドまたはアルキルエステルのようなその誘導体である、具体例１３に述べた方法。
【００３１】
１５．酸化はＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下（かつ消費を伴って）生起する、具体例１３および１４の一つに述べた方法。
【００３２】
１６．消費したレドックス均等物が特にその場で電気化学的にまたは酵素的に再生される、具体例１２および１５の一つで述べた方法。
【００３３】
１７．消費したＮＡＤ（Ｐ）ＨがＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼから選ばれたＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−再生酵素、特にアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）との組合わせにより、特にその場で再生される、具体例１６で述べた方法。
【００３４】
１８．ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生酵素が天然または組換えた単離されたまたは富化された、
ａ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ；ＥＣ１．１．１．２）および
ｂ）その機能的均等物（特に機能性ドメイン）から選ばれる、具体例１７で述べた方法。
【００３５】
１９．式（１）
【化１】
（ここでＲはアルキル、ＮＲ１Ｒ２，Ｈ，アルカリ金属イオンまたはＮ（Ｒ３）４＋であり、残基Ｒ３は同一または異なってＨまたはアルキルを意味する。）のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造方法であって；
ａ）任意に式（２）のコール酸を、
【化２】
（ここでＲは前記の意味を有する。）を式（３）のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）
【化３】
（ここでＲは前記の意味を有する。）へ化学的に酸化し；
ｂ）具体例１ないし３の一つの定義に従った７β−ＨＳＤＨの少なくとも一つの存在下、ＤＨＣＡを式（４）の３，１２−ジケト−７β−コラン酸（３，１２−ジケト−７β−ＣＡ）
【化４】
へＮＡＤＰＨ依存的に還元し；
ｃ）３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）の存在下、３，１２−ジケト−７β−ＣＡを式（５）の対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）
【化５】
（ここでＲは前記の意味を有する。）へＮＡＤＰＨ依存的にまたはＮＡＤＨ依存的に（使用した３α−ＨＳＤＨのタイプに依存して）還元し；そして次に
ｄ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡをＵＤＣＡへ化学的に還元し；そして次に
ｅ）反応生成物を任意にさらに精製する；
方法。
【００３６】
２０．ステップｂ）および／またはステップｃ）が還元均等物（ＮＡＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨ）の存在下に実施される、具体例１９で述べた方法。
【００３７】
２１．ステップｂ）および／またはステップｃ）が（特に酵素的な）助因子再生ステップと組合わされる、具体例１９および２０で述べた方法。
【００３８】
２２．ステップｂ）が助因子再生ステップと特にその場で組合わされ、その中でＮＡＤＰＨが犠牲的なアルコール（特にイソプロパノールとアセトンの生成）の消費を伴ってアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によって再生され、そして任意に反応平衡からアセトンの除去が促進される（例えば昇温により）、具体例２１で述べた方法。
【００３９】
２３．ステップｃ）が助因子再生ステップと特にその場で組合わされ、その中で使用した３α−ＨＳＤＨのタイプに応じ、ホルメートの消費（およびＣＯ２ガスの生成）を伴ってホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）によって再生され、またはＮＡＤＰＨが犠牲的なアルコール（特にイソプロパノールとアセトンの生成）の消費を伴ってアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によって再生され、そして任意に反応平衡からアセトンの除去が促進される（例えば昇温により）、具体例２１または２２で述べた方法。
【００４０】
２４．反応が固定化された形の関与する酵素の少なくとも一つで実施される、具体例８ないし２３の一つで述べた方法。
【００４１】
２５．固定化された形の具体例１ないし３の一つで述べた７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを含んでいるバイオリアクター。
本発明のさらなる具体例
１．一般的定義および使用した略号
下表に、表の形で構造式、その化学名および使用した略号を要約する。
【表２】
【００４２】
他に記述しない限り、用語“７β−ＨＳＤＨ”は、特にＮＡＤＰＨの化学量論的消費を伴ってＤＨＣＡの３，１２−ケト−７βＣＡへの立体特異性および位置特異性還元と、任意に対応する逆反応を少なくとも触媒するデヒドゲナーゼ酵素を指す。この酵素は天然のまたは組換え生産された酵素であることができる。原則としてこの酵素は、例えばタンパク質不純物のような細胞不純物と混合して存在するが、しかし好ましくは純粋形である。好適な検出方法は、例えば後記実験の部に記載されており、または文献（例えばＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＡＤＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ７β−ｈｙｄｒｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ ａｎｄ Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ；Ｓ．Ｈｉｒａｎｏ ａｎｄ Ｎ．Ｍａｓｕｄａ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８２；しかしながら、７−ケト基の還元を触媒するＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓからの７β−ＨＳＤＨは検出できなかった。）から公知である。この活性を有する酵素はＥＣＮｏ．１．１．１．２０１として分類されている。
【００４３】
他に記述しない限り、用語“３α−ＨＳＤＨ”は、特にＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの化学量論的消費を伴って３，１２−ジケト−７βＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの立体特異性および位置特異性還元と、任意に対応する逆反応を少なくとも触媒するデヒドロゲナーゼ酵素を指す。好適な検出方法は、例えば後記実験の部に記載されており、または文献から公知である。好適な酵素は、例えばＣｏｍａｎｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（例えばＡＴＣＣ１１９９６）から得ることができる。例えばＮＡＤＰＨ依存性３α−ＨＳＤＨはネズミから得られ、使用し得る（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ３−ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ／ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ｊ．Ｅ．Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．Ｈｕｉｚｉｎｇａ ａｎｄ Ｔ．Ｍ．Ｐｅｎｎｉｎｇ， Ｍａｙ １５，１９９１，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６６，８８２０−８８２５）。この活性を有する酵素はＥＣＮｏ．１．１．１．５０のもとに分類されている。
【００４４】
本発明に従えば、“純粋形”または“純粋”または“本質的に純粋”な酵素とは、例えばビウレット法またはＬｏｗｒｅｙらの方法に従ったタンパク検出方法（Ｒ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８２）を見よ）のような通常のタンパク検出方法によって決定し、全タンパク質の８０％以上、好ましくは９０％以上、特に９５％以上、そして９９％以上の純度を有する酵素を意味するものと理解すべきである。
【００４５】
“レドックス均等物”とは、例えばＮＡＤ＋およびＮＡＤＨ＋のようなニコチンアミド誘導体、またはその還元形であるＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨのような電子供与体または電子受容体として使用し得る小分子有機化合物を意味するものと理解すべきである。
【００４６】
本発明に従えば、“コール酸化合物”とは、コール酸の基本炭素骨格、特にステロイド構造を有し、環位置７および任意に環位置３および／または１２にケトおよび／またはヒドロキシもしくはアシルオキシ基が存在する化合物を意味するものと理解すべきである。
【００４７】
例えば“コール酸化合物”または“ウルソデオキシコール酸”のような特定タイプの化合物は、出発化合物（例えばコール酸またはウルソデオキシコール酸のような）の誘導体をも意味するものと理解すべきである。
【００４８】
そのような誘導体は、例えば化合物のリチウム、ナトリウムおよびカリウム塩のようなアルカリ金属塩、およびアンモニウム塩のような“塩”を含む。ここでアンモニウム塩はＮＨ４＋塩、および少なくとも１個の水素原子をＣ１−Ｃ６アルキル基で置換したアンモニウム塩を含む。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル、ｎ−，ｓｅｃ−またはｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルおよび１回または複数回分岐したそれらの類縁体である。
【００４９】
本発明に従った“アルキルエステル”化合物は、例えばＣ１−Ｃ６アルキルエステルのような低級アルキルエステルである。非限定的な例として、メチル、エチル、ｎ−またはｉ−プロピル、ｎ−，ｓｅｃ−またはｔｅｒｔ−ブチルエステル、または例えばｎ−ペンチルおよびｎ−ヘキシルエステルおよびその１回または多数回分岐類縁体を挙げることができる。
【００５０】
“アミド”は、アンモニアまたは１級もしくは２級アミンによる、本発明に従った酸の変換生成物である。そのようなアミンは、例えばモノ−またはジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミンであり、アルキル基は相互に独立し例えばカルボキシ、ヒドロキシ、ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩのような）、ニトロおよびスルホネート基で任意にさらに置換されることができる。
【００５１】
本発明に従った“アシル基”は、例えばアセチル、プロピオニルおよびブチリルのような炭素原子２ないし４個を有する非芳香基、および任意に置換された単環芳香環を有する芳香族基であり、ここで好適な置換基は、例えば、ヒドロキシ、ハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，ＢｒまたはＩのような）、ニトロ、例えばＣ１−Ｃ６アルキル基であり、例えばベンゾイルまたはトルオイル基である。
【００５２】
例えばコール酸、ウルソデオキシコール酸、１２−ケト−ケノデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸および７−ケト−リトコール酸のような本発明に従って使用され、または生産されるヒドロキシステロイド化合物は、立体異性的に純粋な形か、または他のまたはそれから得ることができる他の立体異性体との混合物の形で本発明方法に使用することができる。しかしながら好ましくは、使用または製造される化合物は、本質的に立体異性的に純粋な形で使用または単離される。
【００５３】
本発明に従えば、“固定化”とは、例えば７β−ＨＳＤＨのような本発明に従った生触媒を固体、例えば周囲の液体媒体に本質的に不溶な支持体へ共有または非共役的に結合することを意味するものと理解される。
【００５４】
２．タンパク質
本発明は、７β−ＨＳＤＨ活性または３α−ＨＳＤＨ活性を有する特定的に記載したタンパク質または酵素に制限されず、むしろその機能的均等物にも及ぶ。
【００５５】
本発明の文脈において、特定的に記載された酵素の“機能的均等物”または類縁体は、それとは異なり、さらに例えば７β−ＨＳＤＨ活性を有するポリペプチドである。
【００５６】
このため例えば“機能的均等物”とは、使用した１７β−ＨＳＤＨ試験において、ここに規定したアミノ酸配列を含む酵素の活性よりも少なくとも１％、例えば少なくとも１０％または２０％、例えば少なくとも５０％または７０％または９０％高いまたは低い活性を持つことを意味する。これとは別に、機能的均等物は、好ましくは、ｐＨ４と１１の間で安定であり、そして有利にはｐＨ４ないし６またはｐＨ６ないし１０、例えば、８．５ないし９．５の範囲に最適ｐＨを有し、そして１５℃ないし８０℃、または１５℃ないし４０℃、２０℃ないし３０℃、または例えば約４５℃ないし６０℃または約５０℃ないし５５℃のような２０℃ないし７０℃に最適温度を有する。
【００５７】
７β−ＨＳＤＨ活性は、種々の既知のテストによって検出することができる。限定するものではないが、例えばＣＡまたはＤＨＣＡのような参照物質を使用し、実験の部に規定した標準化条件下でのテストを挙げることができる。
【００５８】
本発明に従い、“機能的均等物”とは、前述のアミノ酸配列の少なくとも一つの配列位置において特定的に名を挙げた以外のアミノ酸を有し、しかしながら前述した生物学的活性の一つを有する“突然変異体”をも含む。このように“機能的均等物”は、一以上、例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４または１５のアミノ酸の付加、置換、欠失および／または逆位によって得ることができる突然変異体を含み、そのような変化はそれらが本発明に従った性質プロフィルを有する突然変異体へ導く限り、どの配列位置でも起こることができる。特に突然変異体と未変化ポリペプチドの間の反応パターンが定性的に一致する時、すなわち例えば同じ基質が異なる速度で変換される時にも機能的均等物が存在する。好適なアミノ酸置換の例は以下の表に要約されている。
【００５９】
【表３】
【００６０】
上の意味で“機能的均等物”は記載したポリペプチドおよび機能的均等物の“前駆体”および該ポリペプチドの“塩”でもある。
【００６１】
ここで“前駆体”は、所望の生物学的活性有り無しのポリペプチドの天然または合成前駆体である。
【００６２】
表現“塩”は、本発明に従ったタンパク分子のカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両方を意味する。カルボキシル基の塩は公知の態様で調製することができ、そして例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛塩のような無機塩、および例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン等のような有機塩基との塩を含む。同様に本発明は、塩酸または硫酸のような鉱酸との塩、および酢酸およびシュウ酸のような有機酸との塩のような酸付加塩にも関する。
【００６３】
本発明に従ったポリペプチドの“機能性誘導体”は、公知の技術によって機能性アミノ酸側鎖上またはそれらのＮ−またはＣ−末端に生成させることができる。そのような誘導体は、例えば、カルボキシル基の脂肪族エステル；アンモニアまたは１級または２級アミンとの反応によって得られるカルボキシル基のアミド；アシル基との反応によって調製される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、またはアシル基との反応によって調製された遊離ヒドロキシ基のＯ−アシル誘導体を含む。
【００６４】
“機能的均等物”は、勿論他の生物からアクセスし得るポリペプチドと、天然に存在する変種をも含む。例えば、相同性配列領域の範囲は配列比較によって確立することができ、均等酵素は本発明の詳細な説明によって決定することができる。
【００６５】
同様に“機能的均等物”は、例えば所望の生物学的機能を有する、本発明に従ったポリペプチドのフラグメント、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフを含む。
【００６６】
“機能的均等物”はさらに、前述したポリペプチド配列の一つまたはそれからの機能的均等物と、機能的Ｎ−またはＣ−末端結合において機能的に異なる少なくとも一つのさらなる非相同性配列を含む融合タンパク（すなわち融合タンパク部分の相互に有意な損傷なしの）である。そのような非相同配列の非限定例は、シグナルペプチド、ヒスチジンアンカーまたは酵素である。
【００６７】
本発明に従って付加的に含まれた“機能的均等物”は、実際に開示されたタンパクの相同体である。これらは、実際に開示されたアミノ酸配列の一つに対して、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９８８，２４４４−２４４８のアルゴリズムに従って計算し、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、特に９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８または９９％の相同性（同一性）を持っている。本発明に従った相同ペプチドの相同性または同一性は、特にここに実際に記載されたアミノ酸配列の一つの全長に対する、同一アミノ酸残基のパーセンテージを意味する。
【００６８】
パーセンテージ同定値は、ＢＬＡＳＴアライメント、アルゴリズムｂｌａｓｔｐ（タンパク−タンパクＢＬＡＳＴ）により、または後で示すＣｌｕｓｔａｌアジャストメントの使用によって決定とすることができる。
【００６９】
可能性あるタンパクグリコシル化の場合、本発明に従った“機能的均等物”は、脱グリコシル化したまたはグリコシル化した形およびグリコシル化パターンの変化によって得られる修飾形において上で指定したタイプのタンパクを含む。
【００７０】
本発明に従ったタンパクまたはポリペプチドの相同体は、突然変異生成により、例えば点突然変異、タンパクの伸長またはトランケーションによって生成させることができる。
【００７１】
本発明に従ったタンパクの相同体は、例えばトランケーション突然変異体のようなコンビナトリアルバンクのスクリーニングによって同定することができる。例えば、タンパク変種の斑入りバンクは、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的リゲーションにより、核酸レベルにおけるコンビナトリアル突然変異生成によって生成させることができる。退化オリゴヌクレオチド配列から可能性ある相同体のバンクの生成のために使用できる多数のプロセスが存在する。退化遺伝子配列の化学合成はＤＮＡシンセサイザー中で実施することができ、そして次に合成遺伝子は好適な発現ベクター中へリゲートすることができる。遺伝子の退化セットの使用は、可能性あるタンパク配列の所望のセットをコードする混合物中にすべての配列の生成を可能にする。退化オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：４７７）。
【００７２】
点突然変異またはトランケーションによって生成させたコンビナトリアルバンクの遺伝子生産物のスクリーニングのための、および選択された性質を有する遺伝子生産物のｃＤＮＡバンクのスクリーニングのためのいくつかの技術が先行技術において知られている。これらの技術は、本発明に従った相同体のコンビナトリアル突然変異生成によって生産された遺伝子バンクの急速スクリーニングに適応化させることができる。高いスループットで分析が行われる大きな遺伝子バンクのスクリーニングのために最も頻繁に使用される技術は、複製可能な発現ベクター中への遺伝子バンクのクローニング、生成したベクターバンクでの適当な細胞の形質転換、および所望の活性の検出がその生産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易化する条件下でコンビナトリアル遺伝子の発現を含む。バンク中の機能的突然変異体の頻度を増大させる技術である、Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｍｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｉｓ（ＲＥＭ）をスクリーニングテストと組み合わせて相同体を同定するために使用することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
【００７３】
３．核酸および構造体
３．１ 核酸
本発明はまた、７β−ＨＳＤＨまたは３α−ＨＳＤＨ活性を有する酵素をコードする核酸配列に関する。
【００７４】
本発明はまた、ここに記載した実際の配列に対し一定の程度の同一性を有する核酸に関する。
【００７５】
二つの核酸間の“同一性”は、各場合核酸全長にわたってヌクレオチドの同一性を意味し、特に以下のパラメータで調節した、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄを使用するＩｎｆｏｒｍａｘ社（ＵＳＡ）のＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ ７．１ソフトウエア（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ，Ｓｈａｒｐ ＰＭ．Ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｎ ａ ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｕｔｅｒ．Ｃｏｍｐｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９８９ Ａｐｒ；５（２）：１５１−１）の助けによる比較によって計算した同一性を意味する。
【００７６】
マルチプルアライメントパラメータ：
ギャップオープニングペナルティ １０
ギャップエキステンションペナルティ １０
ギャップセパレーションペナルティ範囲 ８
ギャップセパレーションペナルティ オフ
アライメント遅延のための％アイデンティティ ４０
残基特異性ギャップ オフ
親水性残基ギャップ オフ
トランジション計量 ０
対アライメントパラメータ：
ＦＡＳＴ アルゴリズム オン
Ｋ−ｔｕｐｌｅ サイズ １
ギャップペナルティ ３
ウインドウサイズ ５
ベストダイアゴナルの数 ５
【００７７】
これに代って、同一性は以下のパラメータをもって、Ｃｈｅｎｎａ，Ｒａｍｕ，Ｓｕｇａｗａｒａ Ｈｉｄｅａｋｉ，Ｋｏｉｋｅ Ｔａｄａｓｈｉ，Ｌｏｐｅｚ，Ｒｏｄｏｒｉｇｏ，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔｏｂｙ Ｊ，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄｅｓｍｏｎｄ Ｇ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊｕｌｉｅ Ｄ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｃｌｕｓｔａｌ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｇａｍｓ（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１（１３）：３４９７−５００；インターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＃に従って決定することができる。
【００７８】
ＤＮＡギャップオープンペナルティ １５．０
ＤＮＡギャップエキステンションペナルティ ６．６６
ＤＮＡマトリックス アイデンティティ
タンパクギャップオープンペナルティ １０．０
タンパクギャップエキステンションペナルティ ０．２
タンパクマトリックス Ｇｏｎｎｅｔ
タンパク／ＤＮＡ ＥＮＤＧＡＰ −１
タンパク／ＤＮＡ ＧＡＰＤＩＳＴ ４
【００７９】
ここで述べたすべての核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡのような１本鎖または２本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、例えば二重らせんの個々の重複する相補的核酸構造単位のフラグメント縮合によるような、ヌクレオチド構造単位からの化学合成によってそれ自体公知の態様で生産することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホアミダイト法（Ｖｏｅｔ，Ｖｏｅｔ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．８９６−８９７）に従って公知の態様で実施することができる。合成オリゴヌクレオチドの付加と、ＤＮＡポリメラーゼおよびリゲーション反応のＫｌｅｎｏｗフラグメントによるギャップの充填、および一般クローニング方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００８０】
本発明は、上記ポリペプチドの一つ、および例えば合成ヌクレオチドアナログを用いてアクセス可能なそれらの機能的均等物をコードする核酸配列（例えばｃＤＮＡおよびｍＲＮＡのような１本鎖および２本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）に関する。
【００８１】
本発明は、本発明に従ったポリペプチドおよびタンパクまたは生物学的に活性なそれらのセクションをコードする単離された核酸分子と、例えば本発明に従ったコードする核酸の同定または増幅のためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用することができる核酸フラグメントの両方に関する。
【００８２】
本発明に従った核酸分子は、さらに暗号遺伝子領域の３’−および／または５’−端に翻訳されない配列を含むことができる。
【００８３】
さらに本発明は、実際に記載された核酸配列に対し相補的な核酸分子またはその部分を含む。
【００８４】
本発明に従ったヌクレオチド配列は、他の細胞タイプおよび生物中の相同性配列の同定および／またはクローニングに使用することができるプローブおよびプライマーの生産を可能にする。そのようなプローブまたはプライマーは、通常“厳格”な条件下、本発明に従った核酸配列のセンスストランドの、または対応するアンチセンスストランドの少なくとも約１２，好ましくは約２５，例えば４０，５０または７５の連続するヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含んでいる。
【００８５】
“単離”された核酸分子が核酸の天然源中に存在する他の核酸分子から分離され、そしてもしそれが組換え技術によって生産されるならば他の細胞物質または培地が実質上皆無にされるか、またはもしそれが化学的に合成されるならば化学的前駆体または他の化学品が実質上皆無にされることでできる。
【００８６】
本発明に従った核酸分子は、分子生物学的に標準技術によって単離されることができ、そして配列情報が本発明によって提供される。例えば、ｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして実際に開示した完成した配列の一つまたはその部分と、そして標準ハイブリダイゼーション技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｓｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．１９８９に記載されいるような）を使用することによって適当なｃＤＮＡバンクから単離することができる。さらに、開示した配列の一つまたはその部分を含んでいる核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができ、この配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドプライマーが使用される。このようにして増幅された核酸は適当なベクターにクローンされ、そしてＤＮＡ配列分析によって特徴化される。本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを使用して標準合成プロセスによって生産されることができる。
【００８７】
本発明に従った核酸配列またはその誘導体、これらの配列の相同体およびその部分は、他の細菌から、例えばゲノムまたはｃＤＮＡバンクを用い、慣用のハイブリダイゼーションプロセスまたはＰＣＲ技術を使用して単離することができる。
【００８８】
“ハイブリダイズ”とは、ポリマーまたはオリゴヌクレオチドが、標準条件下で大部分相補的な配列へ結合する能力を意味し、非相補的パートナー間の非特異性結合はこれら条件下では抑制される。このため、配列は９０〜１００％相補的であることができる。相互に特異的に結合し得る相補配列の性質は、例えばノーザンまたはサウザンブロット技術またはＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲにおいてプライマー結合において使用される。
【００８９】
ハイブリダイゼーションのため、保存された領域の短いオリゴヌクレオチドが有利に使用される。しかしながら、ハイブリダイゼーションのため、本発明に従った核酸のもっと長いフラグメントまたは完全な配列を使用することも可能である。これらの標準的条件は使用する核酸に従って（オリゴヌクレオチド、長いフラグメント、または完全な配列）変動し、またはどのタイプの核酸、ＤＮＡかＲＮＡが使用されるかによって変動する。このため、例えばＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのための溶融温度は、同じ長さのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのそれよりも約１０℃低い。
【００９０】
標準的条件は、例えば、核酸に従い、０．１ないし５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の濃度を有する水性緩衝溶液中４２ないし５８℃の温度、または付加的に５０％ホルムアミドの存在下、例えば５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド中４２℃の温度を意味する。有利には、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣと約３０℃ないし４５℃の温度である。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドについては、ハイブリダイゼーション条件は、有利には０．１×ＳＳＣと約３０℃ないし５５℃、好ましくは４５℃ないし５５℃の温度である。ハイブリダイゼーションのためのこれらの規定した温度は、例示であって、約１００ヌクレオチドの長さと、Ｇ+Ｃ含量５０％の核酸のためのホルムアミド不存在下の計算された溶融温度である。ＤＮＡハイブリダイゼーションのための実験条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９のような遺伝子学の教科書に記載されており、そして例えば核酸の長さ、ハイブリッドの性格またはＧ+Ｃ含量に応じて当業者に知られた式に従って計算することができる。当業者はさらにハイブリダイゼーションについての情報を以下の教科書から推論することができる。
【００９１】
Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９８５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ（ｅｄｓ），１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｂｒｏｗｎ（ｅｄ），１９９１，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ
【００９２】
“ハイブリダイゼーション”は特に、厳格な条件下で実施することができる。そのようなハイブリダイゼーション条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，９．３１−９．５またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。
【００９３】
“厳格な”ハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ，７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％デキストランサルフェートおよび変性したサケ精子ＤＮＡ２０ｇ／ｍｌ中４２℃でのインキュベーションと、６５℃において、０．１×ＳＳＣを使用し、フィルター上の洗浄ステップを意味すると理解すべきである。
【００９４】
本発明はまた、実際に開示された、または誘導し得る核酸配列の誘導体に関する。
【００９５】
このように本発明に従った核酸配列のさらなる配列は、例えば配列同定Ｎｏ．１から、一以上のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失により、しかし所望の性質を有するポリペプチドをコードするように誘導することができる。
【００９６】
本発明にはさらに、実際に述べた配列に比較して、“ブラント”突然変異を含む、または特別の起源または宿主生物のコドン利用に対応するように修飾された核酸配列と、例えばスプライス変種または対立変種のような天然に存在する変種が含まれる。
【００９７】
同様に本発明は、保守的ヌクレオチド置換（すなわち関心あるアミノ酸の同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度のアミノ酸による置換）によって得ることができる配列に関する。
【００９８】
本発明はまた、実際に開示された核酸の配列多形によって誘導される分子に関する。これらの遺伝子多形は自然の変動のため集団中の個々の間に存在し得る。これらの自然の変動は遺伝子のヌクレオチド配列中通常１ないし５％の変動を生じさせる。
【００９９】
配列同定Ｎｏ．１について本発明に従った核酸配列の誘導体とは、例えば、誘導されたアミノ酸レベルにおいて少なくとも６０％相同性、好ましくは少なくとも８０％相同性、非常に好ましくは少なくとも９０％相同性を全配列範囲に亘って有する変種を意味するものとして理解すべきである（アミノ酸レベルにおける相同性に関しては、ポリペプチドのための上述の説明を参照）。配列の部分的領域に亘っては、相同性は有利にはより高くなることができる。
【０１００】
さらに誘導体は、特に配列同定Ｎｏ．１の本発明に従った核酸配列の相同体、例えばカビまたは細菌相同体、切端配列、コード化および非コード化ＤＮＡ配列の１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを意味するものと理解すべきである。このように、例えばＤＮＡレベルにおいて配列同定Ｎｏ．１の相同体は、配列同定Ｎｏ．１に示した全ＤＮＡ範囲にわたって少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、非常に好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する。
【０１０１】
さらに誘導体は、例えばプロモーターとの融合を意味するものと理解すべきである。示したヌクレオチド配列の前へ付加されるプロモーターは、プロモーターの機能性または活性が悪影響されることなく、少なくとも１個のヌクレオチド交換、少なくとも１個の挿入、逆位および／または失欠によって修飾することができる。加えて、プロモーターはそれらの活性を、外来生物のもっと活性なプロモーターによってそれらの配列を修飾または完全に置換することによって増強することができる。
【０１０２】
機能的突然変異体の生産方法は当業者には知られている。
【０１０３】
使用した技術に従って、当業者は遺伝子へ、または代って非コード化核酸配列領域（例えば発現の調節のために重要な領域）へ完全にランダムなまたはもっと特異的な突然変異体を導入し、その後遺伝子バンクを調製することができる。このために必要な分子生物学的方法は当業者には既知であり、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１に記載されている。
【０１０４】
遺伝子の修飾およびそれによってコード化されるタンパクの修飾方法は、例えば以下のとおり長年にわたって当業者には既知である。
【０１０５】
−遺伝子の単一または多数ヌクレオチドが特異的に置換される部位特異性突然変異生成（Ｔｒｏｗｅｒ ＭＫ（ｅｄｉｔｏｒ）１９９６：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）；
−どんな所望アミノ酸のためのコドンも遺伝子のどんな部位に置換または付加されることができる飽和突然変異生成（Ｋｅｌｇｌｅｒ−Ｅｄｏ ＤＭ Ｄｏｃｋｔｏｒ ＣＭ，Ｄｉｍａｉｏ Ｄ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：１５９３；Ｂａｒｅｔｔｉｎｏ Ｄ，Ｆｅｉｇｅｎｂｕｔｚ Ｍ．Ｖａｌｃａｒｅｌ Ｒ，Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ ＨＧ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：５４１；Ｂａｒｉｋ Ｓ（１９９５）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：１）；
−ヌクレオシド配列が誤作動ＤＮＡポリメラーゼによって突然変異されるエラー発生ポリメラーゼ連鎖反応（エラー発生ＰＣＲ）（Ｅｃｋｅｒｔ ＫＡ，Ｋｕｎｋｅｌ ＴＡ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：３７３９）；
−例えば、ヌクレオチド配列の増加した突然変異率が欠陥ＤＮＡ修復メカニズムのために発生する突然変異化株への遺伝子の通過（Ｇｒｅｅｎｅｒ Ａ，Ｃａｌｌａｈａｎ Ｍ．Ｊｅｒｐｓｅｔｈ Ｂ（１９９６）Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｕｓｉｎｇ ａｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｍｕｔａｔｏｒ ｓｔｒａｉｎ．Ｉｎ：Ｔｒｏｗｅｒ ＭＫ（ｅｄｉｔｏｒ）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）；または
−密接に関連した遺伝子のプールが生成され、そして消化され、そしてフラグメントがポリメラーゼ連鎖反応において鋳型として使用され、その中で全長さのモザイク遺伝子が繰り返した鎖分離および再接近によって最終的に調製されるＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９；Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰＣ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：１０７４７）
【０１０６】
“指向された進化”を使用して（特にＲｅｅｔｚ ＭＴ ａｎｄ Ｊａｅｇｅｒ Ｋ−Ｅ（１９９９），Ｔｏｐｉｃｓ Ｃｕｒｒ Ｃｈｅｍ ２００：３１；Ｚｈａｏ Ｈ，Ｍｏｏｒ ＪＣ，Ｖｏｌｋｏｖ ＡＡ，Ａｒｎｏｌｄ ＦＨ（１９９９），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ｉｎ：Ｄｅｍａｉｎ ＡＬ，Ｄａｖｉｅｓ ＪＥ（ｅｄｓ．）Ｍａｎｎｕａｌ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｙｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙに記載されている）、当業者は選択した態様でそして大規模に機能的突然変異体を製造することができる。ここでは、最初のステップにおいてそれぞれのタンパクの遺伝子バンクが生産され、これには上で示した方法を使用することができる。遺伝子バンクは適当な態様で、例えばバクテリアよりまたはファージディスプレーシステムによって発現される。
【０１０７】
望む性質に大部分一致する性質を有する機能的突然変異体を発現する宿主生物の関心ある遺伝子は突然変異のさらなるラウンドへ服されることができる。突然変異および選択またはスクリーニングのステップは、現在の突然変異体が適切な測定において望む性質を持つまで繰り返されることができる。この反復操作の結果として突然変異の限られた数、例えば１ないし５の突然変異が段階的に実施され、関心ある酵素性質に対するそれらの影響を評価し、選択することができる。次に選択された突然変異体は同じやり方でさらなる突然変異ステップへ服させることができる。これによって検討すべき個々の突然変異体の数を有意に減らすことができる。
【０１０８】
本発明に従った結果は、所望の修飾した性質を有するさらなる酵素を発生させるために必要な、関心ある酵素の構造および配列に関する重要な情報を取得する。特に、“ホットスポット”、すなわち特異的突然変異の導入によって酵素性質の修飾のために潜在的に適した配列部分を規定することができる。
【０１０９】
３．２． 構造体
本発明はさらに、調節核酸配列の遺伝子コントロールのもとに本発明に従ったポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現構造体、および少なくとも一つのこれらの発現構造体を含むベクターに関する。
【０１１０】
“発現ユニット”とは、本発明に従って、ここで規定し、そして発現すべき核酸または遺伝子へ機能的に連結された後、発現を調節する、すなわちこの核酸またはこの遺伝子の転写および翻訳を調節するプロモーターを含んでいる、発現活性を有している核酸を意味するものと理解すべきである。それ故これを“調節核酸配列”ということもできる。プロモーターに加え、例えばエンハンサーのようなさらなる調節エレメントが存在することができる。
【０１１１】
本発明に従えば、“発現カセット”または“発現構造体”とは、発現すべき核酸または発現すべき遺伝子へ機能的に連結された発現ユニットを意味するものと理解すべきである。発現ユニットと対照的に、発現カセットはこのため、転写および翻訳を調節する核酸配列のみならず、転写および翻訳の結果タンパクとして発現される核酸配列をも含む。
【０１１２】
本発明の文脈において、術語“発現”または“過発現”は、対応するＤＮＡによってコード化される微生物中の一以上の酵素の細胞内活性の生産および増加を記載する。この目的で、例えば遺伝子を生物へ導入することができ、存在する遺伝子を他の遺伝子で置換することができ、遺伝子のコピー数を増加することができ、強力なプロモーターを使用することができ、または高い活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子を使用することができ、そしてこれらの方策は任意に組み合わせることができる。
【０１１３】
好ましくは、本発明に従ったそのような構造体は、それぞれのコード化配列の５’−上流のプロモーターと、３’−下流のターミネーター配列と、そして任意に慣用の調節エレメント、すなわち各場合コード化配列へ作用的に連結された調節エレメントを含む。
【０１１４】
本発明に従えば、“プロモーター”、“プロモーター活性を有する核酸”、または“プロモーター配列”は、転写すべき核酸との機能的連鎖において核酸の転写を調節する核酸の意味であると理解すべきである。
【０１１５】
“機能的”または“作用的”連鎖は、例えば核酸の転写を保証する核酸配列と、そして例えばターミネーターのように、プロモーター活性を有する核酸の一つと、転写すべき核酸配列と、そして任意の調節エレメントの配列とが、調節エレメントの各自が核酸配列の転写においてその機能を充足するように配置された配列を意味するものと理解すべきである。この目的のため、化学的意味での直接連結は絶対的に必要ではない。例えばエンハンサー配列のような遺伝子制御配列は、標的配列においてさらに除去された位置において、または他のＤＮＡ分子からそれらの機能を発揮することができる。転写される核酸配列がプロモーター配列の後に（すなわち３’−末端側に）配置され、そのため両方の配列が共有結合で連結されることが好ましい。ここでは、プロモーター配列と、発現すべき核酸配列の間の距離は、２００塩基対未満、または１００塩基対以下、または５０塩基対以下であることができる。
【０１１６】
プロモーターおよびターミネーターに加え、挙げることができるさらなる調節エレメントの例は、標的化配列、エンハンサー、ポリアデニル化信号、選択できるマーカー、増幅信号、複製起源等を含む。好適な調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。
【０１１７】
特に本発明に従った核酸構造体は、配列同定Ｎｏ．１、またはその誘導体および相同体と、そして有利には遺伝子発現の制御、例えば増大のための一以上の調節信号と作用的または機能的に連結されたそれから誘導し得る核酸配列を含む。
【０１１８】
これらの調節配列に加え、これら配列の天然の調節が実際の構造遺伝子以前に存在することができ、そして天然調節がスイッチオフされ、遺伝子発現が増大されるように任意に遺伝子的に修飾されることができる。しかしながら核酸構造体は、もっと簡単に、すなわち追加の調節信号がコード化配列の前に挿入されず、そしてその調節を有する天然プロモーターが除去されずに構築することができる。これに代って、天然調節配列は、もはや調節が行われず、そして遺伝子発現が増大されるように突然変異される。
【０１１９】
好ましい核酸構造体は、有利には、核酸配列の増大した発現を可能にするプロモーターへ機能的に連結された既に述べた“エンハンサー”の一つ以上を含んでいる。さらなる調節エレメントまたはターミネーターのような、追加的有益配列をＤＮＡ配列の３'−末端へ挿入することもできる。本発明に従った核酸は、構造体中に１以上のコピーで存在することができる。構造体の任意の選択のため、抗生物質耐性または栄養補給性を補足する遺伝子のようなさらなるマーカーが構造体中に存在することができる。
【０１２０】
ｃｏｓ，ｔａｃ，ｔｒｐ，ｔｅｔ，ｔｒｐ−ｔｅｔ，ｌｐｐ，ｌａｃ，ｌｐｐ−ｌａｃ，ｌａｃｌｑ，Ｔ７，Ｔ５，Ｔ３，ｇａｌ，ｔｒｃ，ａｒａ，ｒｈａＰ，（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６，ラムダ−ＰＲのようなプロモーター中に、またはラムダーＰＬプロモーター中に好適な調節配列の例が存在する。これらはグラム陰性細菌に有利に使用される。さらなる有利な調節配列は、イーストまたはカビプロモーターＡＤＣ１，ＭＦアルファ，ＡＣ，Ｐ−６０，ＣＹＣ１，ＧＡＰＤＨ，ＴＥＦ，ｒｐ２８およびＡＤＨ中のグラム陽性プロモーター中に存在する。人工プロモーターも調節のために使用し得る。
【０１２１】
宿主生物中に発現のため、核酸構造体は、有利には、例えば宿主中で遺伝子の最適で発現を可能にするプラスミドまたはファージのようなベクター中に挿入される。プラスミドおよびファージのほかに、ベクターは、当業者に知られたすべての他のベクター、例えばＳＶ４０，ＣＭＶ，バキュロウイルスおよびアデノウイルスのようなウイルス、トランスポソン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、および鎖状またはサークル状ＤＮＡを意味するものと理解すべきである。これらのベクターは宿主生物中で自発的に複製または染色体的に複製されることができる。これらのベクターは本発明のさらなる具体例を代表する。
【０１２２】
好適なプラスミドは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｐＥＴ２８ａ（＋），ｐＬＧ３３８，ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐＫＣ３０，ｐＲｅｐ４，ｐＨＳ１，ｐＫＫ２２３−３，ｐＤＨＥ１９．２，ｐＨＳ２，ｐＰＬｃ２３６，ｐＭＢＬ２４，ｐＬＧ２００，ｐＵＲ２９０，ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１，λｇｔ１１；ストレプトミセス中のｐＩＪ１０１，ｐＩＪ３６４，ｐＩＪ７０２またはｐＩＪ３６１；バチルス中のｐＵＢ１１０，ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム中のｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７；カビ中のｐＡＬＳ１，ｐＩＬ２またはｐＢＢ１１６；イースト中の２αＭ，ｐＡＧ−１，ＹＥｐ６，ＹＥｐ１３またはｐＥＭＢＬＹｅ２３；または植物中のｐＬＧＶ２３，ｐＧＨＩａｃ＋，ｐＢＩＮ１９，ｐＡＫ２００４またはｐＤＨ５１である。言及したプラスミドは可能性あるプラスミドの小さな選択である。さらなるプラスミドは当業者には既知であり、そして例えば専門書Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｅｄｓ．Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５，ＩＳＢＮ０４４４９０４０１８）から推論することができる。
【０１２３】
ベクターのさらなる具体例において、本発明に従った核酸構造体、または本発明に従った核酸は、直鎖状ＤＮＡの形で微生物に有利に導入され、そして同種または異種組み換えによって宿主生物中に集積されることができる。この直鎖状ＤＮＡはプラスミドのような直鎖状ベクターから、または単に本発明に従った核酸構造体または核酸のみから構成されることができる。
【０１２４】
生物中の異種遺伝子の最適発現のため、生物に使用される特異的"コドン利用"に対応して核酸を修飾するのが有利である。“コドン利用”は、関連する生物の既知の遺伝子のコンピューター分析によって容易に決定することができる。
【０１２５】
本発明に従った発現カセットの生産は、適当なコード化ヌクレオチド配列と、ターミネーターまたはポリアデニル化信号との適切なプロモーターの融合によって実施される。この目的のため、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｍ．Ｌ．Ｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４）、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に記載されているような慣用の組み換えおよびクローニング技術が使用される。
【０１２６】
好適な宿主生物中の発現のため、組換え核酸構造体または遺伝子構造体が、宿主中に遺伝子の最適発現を可能にする宿主特異性ベクター中に有利に挿入されるベクターは当業者には良く知られ、そして例えば“Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ”（Ｐｏｕｗｅｌｓ Ｐ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）から推論することができる。
【０１２７】
４． 微生物
文脈に応じて、用語“微生物”は出発微生物（野生タイプ）、または遺伝子的に修飾された組換え微生物、または両者を意味するとして理解できる。
【０１２８】
本発明に従ったベクターの助けにより、本発明に従った少なくとも一つのベクターで形質転換された組換え微生物が調製され、本発明に従ったポリペプチドの生産のために使用することができる。有利には、上に記載した本発明に従った組換え構造物が宿主システムに導入され、発現される。ここでは、例えば共沈澱、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等のような、当業者が熟知しているクローニングおよびトランスフェクション方法が前述した核酸をそれぞれの発現システム中に発現させるために好ましく使用される。好ましいシステムは、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９７またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている。
【０１２９】
本発明に従った核酸または核酸構造体のための細換え宿主生物は原則として原核または真核生物である。有利には宿主生物としてバクテリア、カビまた酵母のような微生物が使用される。有利には、グラム陽性またはグラム陰性バクテリア、好ましくはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ，Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅまたはＮｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ科のバクテリア、特に好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｎｏｒｃａｒｄｉａ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍまたはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属のバクテリアが使用される。特に好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。さらなる有利なバクテリアはアルファプロトバクテリア、ベータプロトバクテリアまたはガンマプロトバクテリアのグループ中に見出される。
本発明に従った宿主生物は、好ましくは上の定義に従った７β−ＨＳＤＨ活性を有する酵素をコードする本発明の核酸配列、核酸構造体またはベクターの少なくとも一つを含んでいる。
【０１３０】
本発明に従った方法に使用される生物は、宿主生物に応じて当業者に知られた態様で増殖または培養される。原則として微生物は通常糖の形の炭素源と、通常イースト抽出物のような有機窒素源または硫酸アンモニウムのような塩の形の窒素源と、鉄、マグネシウムおよびマンガン塩のような微量元素と、そして任意にビタミンを含む液体培地中で０℃および１００℃の間の、好ましくは１０℃および６０℃の間の温度において酸素通気下に培養される。この間栄養液のｐＨを固定値に保つことができる。すなわち培養の間調節し、または調節しないことができる。培養はバッチ式、半バッチ式または連続式に実施することができる。栄養分は発酵開始時に提供するか、または後で半連続的または連続的に供給することができる。
【０１３１】
５．ＵＤＣＡの生産
第１工程：ＣＡのＤＨＣＡへの化学変換
ＣＡのヒドロキシ基がそれ自体公知の態様で古典的化学ルートによりクロム酸または酸性溶液（例えばＨ２ＳＯ４）中のクロム酸塩でカルボニル基へ酸化される。
【０１３２】
第２工程：ＤＨＣＡの１２−ケト−ＵＤＣＡへの酵素変換
水溶液中、ＤＨＣＡがそれぞれＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨの存在下、３α−ＨＳＤＨおよび７β−ＨＳＤＨによって１２−ケト−ＵＤＡＣへ特異的に還元される。助因子ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨは、ＡＤＨまたはＦＤＨによってそれぞれイソプロパノールまたはギ酸ナトリウムから再生することができる。反応は緩和な条件のもとで進行する。例えば、反応はｐＨ＝４ないし９，６ないし９，または７ないし９，特にｐＨ＝８において、そして約１０ないし３０℃、１５ないし２５℃、または約２３℃において実施することができる。
【０１３３】
第３工程：１２−ケト−ＵＤＣＡのＵＤＣＡへの化学変換
１２−ケト−ＵＤＣＡの１２−カルボニル基がそれ自体公知の態様においてＷｏｌｆｆ−Ｋｉｓｈｎｅｒ還元によって除去され、そしてそれによって１２−ケト−ＵＤＣＡからＵＤＣＡが生成する。この反応において、カルボニル基は最初ヒドラジンによってヒドラゾンへ変換される。次にヒドラゾンは塩基（例えばＫＯＨ）の存在下２００℃へ加熱され、それによって窒素が分解除去され、ＵＤＣＡが生成する。
【０１３４】
６．ＨＳＤＨの組換え生産
さらに本発明は、ポリペプチド生産微生物が、培養され、ポリペプチドの発現が任意に誘発され、そして培養物からそれらが単離される、本発明に従ったポリペプチド、または機能的な、生物学的に活性なそのフラグメントの組換え生産方法に関する。このようにポリペプチドは、もし望むならば、工業的スケールで生産することもできる。
【０１３５】
本発明に従って調製される微生物はバッチプロセスで（バッチ式培養）において、または流加培養プロセスまたは反復流加培養プロセスにおいて連続的にまたは非連続的に培養することができる。公知の培養方法の要約はＣｈｍｉｅｌの教科書（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））またはＳｔｏｒｈａｓの教科書（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ （Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））に見られる。
【０１３６】
使用すべき培養培地はそれぞれの株の要求を好適に満たさなければならない。種々の微生物の培地は、ハンドブック“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”，Ａｍｅｒｉａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）に含まれている。
【０１３７】
本発明に従って使用し得るこれらの培地は、通常一以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含んでいる。
【０１３８】
好ましい炭素源は、単糖類、二糖類または多糖類である。非常に良い炭素源は、例えばグルコース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖は、糖蜜または製糖の他の副産物のような複合化合物として培地へ添加することもできる。種々の炭素源の混合物を添加することも有利である。他の可能性ある炭素源は、例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびココナッツ油のような油脂、例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはリノレイン酸のような脂肪酸、例えばグリセロール、メタノールまたはエタノールのようなアルコールおよび例えば酢酸または乳酸のような有機酸である。
【０１３９】
窒素源は、通常有機または無機窒素化合物か、またはこれら化合物を含んでいる材料である。例示的窒素源は、アンモニアガスまたは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムのようなアンモニウム塩、硝酸塩、尿素、アミノ酸、またはコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク、イーストエキス、ミートエキス等の複合窒素源を含む。窒素源は個別にまたは混合物として使用することができる。
【０１４０】
培地中に存在することができる無機塩は、塩化物、またはカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄のリン酸または硫酸塩である。
【０１４１】
イオウ源として、例えば硫酸塩、亜硫酸塩、ジチオナイト、テトラチオネート、チオ硫酸塩、硫化物のような無機イオウ含有化合物を使用することができるが、メルカプタンおよびチオールのような有機イオウ化合物を使用することもできる。
【０１４２】
リン源としては、リン酸、リン酸二水素カリウム、またはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を使用することができる。
【０１４３】
金属イオンを溶液中に保持するためキレート剤を媒地へ添加することができる。特に好適なキレート剤は、カテコールまたはプロトカテキュエートのようなジヒドロキシフェノール、クエン酸のような有機酸を含む。
【０１４４】
本発明に従って使用し得る発酵培地は、ビタミンのような他の発育因子または発育プロモーターを慣用的に含み、これらは、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩およびピリドキシンを含む。発育因子および塩は、イーストエキス、糖蜜、コーンスチープリカー等のような複合培地成分からしばしば誘導される。さらに培地へ好適な前駆体を添加することもできる。培地配合物の正確な組成は、詳細な実験に強く依存し、そしてそれぞれの特定のケースのために個別的に決定される。培地最適化のための情報は教科書“Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｅｄ．Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）ｐｐ．５３−７３，ＩＳＢＮ ０ １９ ９６３５７７ ３）から得られる。発育培地は、スタンダード１（Ｍｅｒｃｋ）またはＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ＤＩＦＣＯ）等のような商業的サプライヤーからも得ることができる。
【０１４５】
すべての培地成分は熱（１．５バールおよび１２１℃において２０分）または無菌濾過によって滅菌される。成分は一所に、またはもし必要ならば別々に滅菌することができる。すべての培地成分は発育のスタートから存在することができ、または場合によって連続的またはバッチ式に添加することができる。
【０１４６】
培養物の温度は通常１５℃ないし４５℃、好ましくは２５℃ないし４０℃の間であり、そして実験の間コンスタントに保つか、または変えることができる。培地のｐＨは５ないし８．５の範囲内でなければならず、好ましくは７付近である。伝播のためのｐＨは、伝播の間、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水のような塩基性化合物の添加、またはリン酸または硫酸のような酸性化合物の添加によってコントロールすることができる。泡発生の制御のため、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用することができる。プラスミドの安定性の維持のため、例えば抗生物質のような好適な選択的に作用する物質を培地へ加えることができる。好気的条件を維持するため、酸素または環境空気のような酸素含有ガス混合物が培養物中に導入される。培養物の温度は通常２０℃ないし４５℃である。培養は所望の生成物が最大に生産されるまで継続される。この目的は通常１０時間ないし１６０時間で達成される。
【０１４７】
発酵ブロスはその後さらに処理される。要請に応じ、バイオマスは、例えば遠心、濾過、デカンテーションまたはこれらの組合せのような分離方法によって、または完全に放置することによって完全にまたは部分的に発酵ブロスから除去することができる。
【０１４８】
もしポリペプチドが培養培地中に分泌されないならば、細胞を破壊し、そして既知タンパク単離方法に従って溶解物から回収することもできる。代って細胞は、高周波数超音波により、例えばフレンチ圧力セル中のような高圧力により、オスモリシスにより、界面活性剤、分解酵素または有機溶媒の作用により、または言及したプロセスのいくつかの組合せによって破壊することができる。
【０１４９】
ポリペプチドの精製は、Ｑ−セファロースクロマトグラフィーのような分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性クロマトグラフィーのような既知のクロマトグラフィープロセスを使用し、および限外濾過、結晶化、塩析、透析および天然ゲル電気泳動のような他の慣用のプロセスを使用して達成することができる。好適プロセスは、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｅｒｌａｇ Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ ＹｏｒｋまたはＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎに記載されている。
【０１５０】
組換えタンパク単離のため、特異性ヌクレオチド配列を伸長し、そしてそのため例えばより簡単な精製のために役立つ修飾したポリペプチドまたは融合タンパクをコードするベクターシステムまたはオリゴヌクレオチドを使用することが組換えタンパクの単離のために有利であり得る。このタイプの好適な修飾は、例えば、ヘキサヒスチジンアンカーとして知られた修飾、または抗体によって抗原として認識されることができるエピトープのような（例えばＨａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（Ｎ．Ｙ．）Ｐｒｅｓｓに記載されているような）アンカーとして機能する"タグ"である。これらのアンカーは、例えばクロマトグラフィーカラムへ充填することができる、またはマイクロタイタープレート上または他のキャリア上に使用されるポリマーマトリックスのような固体担体へのタンパクの付着のために役立つことができる。
【０１５１】
同時に、これらアンカーはタンパクの認識のためにも使用することができる。タンパクの認識のため蛍光染料のような慣用なマーカー、基質との反応後検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー、または放射性マーカーが単独で、またはタンパクの誘導体化のアンカーと組合せて使用されることができる。
【０１５２】
７． 酵素固定化
本発明に従った酵素は、ここに記載したプロセスにおいて遊離または固定形で使用することができる。固定化酵素とは、不活性担体へ固定される酵素の意味であると理解される。好適な担体材料およびその上に固定化された酵素は、ＥＰ−Ａ−１１４９８４９，ＥＰ−Ａ−１０６９１８３およびＤＥ−ＯＳ−１００１９３７７３およびそれらに引用された参照から知られている。この点に関し、これら明細書の開示全体が参照される。好適な担体材料は、例えばカオリナイト、ケイ藻土、パーライトのような粘土、粘土鉱物、シリカ、アルミナ、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉、アニオン交換材料、ポリスチレン、アクリル樹脂、フェノールホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタンおよびポリエチレンおよびポリプロピレンのような合成高分子を含む。担体材料は慣例的に固定された酵素のために微粉砕された粒子の形で使用され、多孔質形が好ましい。担体材料の粒子寸法は５ｍｍ以下、特に２ｍｍ以下（分布カーブ）である。同様に、全細胞触媒としてデヒドロゲナーゼの使用において、遊離または固定化形を選ぶことができる。担体材料は、例えばアルギン酸カルシウムおよびカラギーナンである。酵素それに細胞は、グルタルアルデヒドを用いて直接架橋する（ＣＬＥＡへの架橋）ことができる。対応してそしてさらなる固定化プロセスは、例えば、Ｊ．Ｌａｌｏｎｄｅ ａｎｄ Ａ．Ｍａｒｇｏｌｉｎ“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ”ｉｎ Ｋ．Ｄｒａｕｚ ａｎｄ Ｈ．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ２００２，ｖｏｌ．ＩＩＩ，９９１−１０３２，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍに記載されている。
【０１５３】
実験の部
他の情報が与えられなければ、例えば制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの精製、ニトロセルロースおよびナイロンメンブレンへのＤＮＡの移動、ＤＮＡフラグメントの連結、微生物の形質転換、微生物の伝播、ファージの複製、および組換えＤＮＡの配列分析のような、本発明の文脈において実施されるクローニングステップは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８８）前出に記載されているように実施することができる。
【０１５４】
１．一般的情報
材料
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９（ＡＴＣＣ２５９８６，以前の名称Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）からのゲノムＤＮＡは、Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＤＳＭＺ）から得た。ＵＤＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡはそれ自体既知の出発化合物であり、文献に記載されている。すべての他の薬品はＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＦｌｕｋａ（ドイツ）から得た。すべての制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）はｑｅｒｍｅｎｔａｓ（ドイツ）から得た。
培地
培地リットル当りトリプトン１０ｇ、イースト抽出物５ｇおよびＮａＣｌ ５ｇを含有するＬＢ培地
発現ベクター
ｐＥＴ２２ｂ（＋）およびｐＥＴ２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）
微生物
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を３７℃において適当な抗生物質を含んでいるＬＢ培地中で増殖させた。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を３７℃において適当な抗生物質を含んでいるＬＢ培地中で増殖させ、インキュベーション後０．５ｍＭ ＩＰＴＧでＯＤ６００＝０．８を２５℃および１４０ＲＰＭにおいて維持した。
【０１５５】
分析方法
１．７β−ＨＳＤＨ活性決定のための標準条件
反応混合物は全容積１ｍｌ中以下を含む。
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０ ８８０μｌ
１０ｍＭ ＵＤＣＡ（水に溶解、ｐＨ８） １０μｌ
酵素溶液（上の緩衝液中１ないし１０Ｕ／ｍｌの範囲） １０μｌ
１ｍＭ ＮＡＤＰ＋（上の緩衝液中） １００μｌ
３４０ｎｍにおける吸光の増加が測定され、そして活性は６．２２ｍＭ−１×ｃｍ−１のモル吸光係数を用いて酵素単位（Ｕ，すなわちμｍｏｌ／ｍｉｎ）として計算される。
２．ＢＣＡアッセイによるタンパク質測定
サンプルはＢＣＡ試薬（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍから）と混合され、そして３７℃において４５分間インキュベートされた。タンパク質含量は使用したアッセイの濃度範囲において較正曲線（ＢＳＡ）に対して５６２ｎｍにおいて決定された。
３．薄層クロマトグラフィー
サンプル５ないし１０μｇをＴＬＣフィルムＫｉｅｓｅｌｇｅｌ６０（Ｍｅｒｃｋ）へ適用した。参照として基準サンプルも適用された。ＴＬＣフィルムの一端を移動相がトップに到達するまで溶出液中に浸漬した。ＴＬＣフィルムを乾燥し、リンモリブデン酸で発色させた。
【０１５６】
２．実施例
製造実施例１：７β−ＨＳＤＨ活性の同定
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ ２５９８６のゲノムＤＮＡ配列は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒにより、ヒト消化管マイクロバイオーム計画のために２００７年ジーンバンクにおいて発表された。ＨＳＤＨは短鎖デヒドロゲナーゼに入る。Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓからの短鎖デヒドロゲナーゼの生化学的機能はジーンバンクに注釈されていなかったので、９つの候補がベクターｐＥＴ２２ｂ＋中にクローンされ、そしてＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中に発現された。
【０１５７】
このため７β−ＨＳＤＨをコードする配列がＰＣＲで増幅された。ＰＣＲ生成物は鋳型としてＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６（ＤＳＭ３９７９）のゲノムＤＮＡを使用し、プライマーとして
【化６】
【化７】
を使用して得られた。プライマー配列中のＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ開裂部位はアンダーラインされている。ＰＣＲ生成物はＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製され、そして酵素ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開裂された。適切なベクターもＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開裂された。生成物はアガロースゲル上に適用され、分離され、そしてこれから切り取られ、精製された。開裂したＰＣＲ生成物および開裂したベクターはＴ４リガーゼでリゲートされた。リゲートされた生成物はＥ．ＣｏｌｉＤＨ５ａ中に形質転換された。得られたベクター（７β−ＨＳＤＨの遺伝子を含んでいる）は配列決定によって確認され、Ｅ．ＣｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換され、そしてＩＰＴＧで誘発され、発現された。
【０１５８】
発現はＬＢ培地５０ｍｌ中で実施された。前培養物の調製のため、ＬＢアガープレート上の１コロニーを取り、ＬＢ培地（適切な抗生物質を含む）５ｍｌ中３７℃および１６０ＲＰＭで１夜インキュベートされた。ＬＢ培地（適切な抗生物質を含む）５０ｍｌが前培養物５００μｌで接種された。培養物は３７℃および１６０ＲＰＭでインキュベートされた。ＯＤ６００約０．８まで０．５ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって発現が誘発された。６時間または一夜後、細胞が遠心沈下された。ペレットをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ含有）６ｍｌ中に懸濁され、超音波粉砕された。細胞断片は遠心により除去された。
【０１５９】
７β−ＨＳＤＨ活性の同定のため、光度計法によって活性がテストされた。このため酵素と、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８）中のテスト物質が１ｍｌクベット中で混合された。ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＨ）またはＮＡＤＰ＋（ＮＡＤ＋）を添加した後、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの分解または生成を測定した。９候補からの１酵素がＮＡＤＰ＋の存在下ＵＤＣＡに対して活性（６０Ｕ／ｍｌ）を示したが、ＣＡに対しては活性を示さなかった。
【０１６０】
この光度計テストにおいて、７β−ＨＳＤＨは、ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤＰＨの存在下、ＵＤＣＡに対して６０Ｕ／ｍｌの活性を、７−ケト−ＬＣＡに対して３５Ｕ／ｍｌの活性を、そしてＤＨＣＡに対して１１９Ｕ／ｍｌの活性を示した。ＣＡに対する活性は検出できなかった。
【０１６１】
急速精製を可能とするため、７β−ＨＳＤＨをコードする遺伝子がＨｉｓ−ＴａｇでｐＥＴ２８＋中に再クローンされた。Ｈｉｓ−Ｔａｇを有する７β−ＨＳＤＨは、上に記載したようにＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中に活動的に発現された。精製はＴａｌｏｎカラムで実施された。カラムは最初リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８，３００ｍＭ ＮａＣｌ添加）で平衡化された。細胞溶解物を負荷した後、カラムをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８，３００ｍＭ ＮａＣｌ添加）で洗浄した。７β−ＨＳＤＨはリン酸仮無緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８，３０ｍＭ ＮａＣｌと２００ｍＭイミダゾール添加）で溶出された。溶出液中のイミダゾールは透析によって除去された。精製収率は７６％であり、純度は約９０％であった。
【０１６２】
変換実施例１：７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−ＬＣＡの酵素変換
７β−ＨＳＤＨの生化学的機能を調べるため、７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−ＬＣＡの変換を実施した。２０ｍｌの変換混合物は、７−ケト−ＬＣＡ５０ｍＭ（約０．４ｇ）と、７β−ＨＳＤＨ ５Ｕ／ｍｌと、そしてＮＡＤＰ＋０．０５ｍＭを含有する。ＮＡＤＰＨの再生のため、ＡＤＨ
４Ｕ／ｍｌと、イソプロパノール１％を使用した（スキーム１を見よ）。反応はフューム戸棚中攪拌下ｐＨ８および２４℃において実施された。アセトンはイソプロパノールより速く蒸発するので、反応はＵＤＣＡの生成へ向ってシフトする。１％イソプロパノールが２４時間後、４８時間後および７２時間後に再び添加された。生成物は、ＴＬＣによって分析された（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ６０，Ｍｅｒｃｋ，移動相石油エーテル：酢酸エチル＝１：１０ ｖｏｌ：ｖｏｌ）。ＴＬＣ上で生成物は真正参照７−ケト−ＬＣＡ，ＵＤＣＡおよびＣＤＣＡと比較された。ＴＬＣ分析はＵＤＣＡが７β−ＨＳＤＨによって７−ケト−ＬＣＡから生成したことを示した。エナンチオマーＵＤＣＡはＴＬＣ上で検出できなかった。
【０１６３】
スキーム１：７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−ＬＣＡの還元の概略的表現。ＡＤＨが助因子ＮＡＤＰＨを再生する。
【化８】
【０１６４】
変換実施例２：７β−ＨＳＤＨによるＤＨＣＡからの１２−ケト−ＵＤＣＡの酵素生産
ＤＨＣＡから１２−ケト−ＵＤＣＡの生産のため７β−ＨＳＤＨの使用可能性をテストするため、７β−ＨＳＤＨによるＤＨＣＡの変換を実施した。変換混合物５０ｍｌは、５０ｍＭ ＤＨＣＡ（１ｇ）、５Ｕ／ｍｌ ７β−ＨＳＤＨおよび０．０５ｍＭ ＮＡＤＰ＋を含有する。ＮＡＤＰＨの再生のため、４Ｕ／ｍｌ ＡＤＨと１％イソプロパノールが使用された（スキーム２を見よ）。反応はフューム戸棚中攪拌下ｐＨ８および２４℃において実施された。アセトンはイソプロパノールより速く蒸発するので、反応は１２−ケト−７β−ＣＡの生成へ向ってシフトする。１％イソプロパノールが２４時間後、４８時間後および７２時間後に再び添加された。中間体３，１２−ジケト−７β−ＣＡはＴＬＣによって分析された。ＤＨＣＡはもはやＴＬＣ上で検出できなかった（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０，Ｍｅｒｃｋ，移動相クロロホルム：メタノール：酢酸＝１０：１：０．０８容積比）
スキーム２：７β−ＨＳＤＨによるＤＨＣＡの還元の概略的表現。ＡＤＨが助因子ＮＡＤＰＨを再生する。
【化９】
【０１６５】
変換実施例３：１２−ケト−ＵＤＣＡへの３，１２−ジケト−７β−ＣＡの酵素変換
中間体３，１２−ジケト−７β−ＣＡ（変換実施例２に従って製造された）がさらに１２−ケト−ＵＤＣＡへＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉからの３α−ＨＳＤＨ（配列同定Ｎｏ．５および６）（Ｍｏｂｕｓ，Ｅ ａｎｄ Ｅ．Ｍａｓｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｒｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ３ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｃａｒｂｏｎｙｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ；Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９８，２７３（４７）：ｐ．３０８８８−９６）によって変換された。この３α−ＨＳＤＨは助因子ＮＡＤＨを必要とし、これはＦＤＨによって再生される（図３を見よ）。３α−ＨＳＤＨ ４Ｕ／ｍｌと、ＦＤＨ（ＮＡＤＨ依存性、Ｃｏｄｅｘｉｓ）１Ｕ／ｍｌと、ギ酸ナトリウム２００ｍＭと、そしてＮＡＤ＋０．０５ｍＭとが反応へ加えられた。４０時間後、生成物は２Ｍ ＨＣｌでｐＨ２へ酸性化され、酢酸エチル１０ｍｌで６回抽出された。蒸発後、生成物１．０７ｇが得られた。生成物１２−ケト−ＵＤＣＡが分析され、ＴＬＣおよびＮＭＲによって確認された。３α−ＨＳＤＨは７β−ＨＳＤＨの生産と同様に生産されたが、しかしプラスミドｐＥＴ２２ｂ＋が使用され、それ以上精製することなく使用された。
【０１６６】
スキーム３：３α−ＨＳＤＨによる３，１２−ジケト−７β−ＣＡの還元の概略的表現。ＦＤＨが助因子ＮＡＤＨを再生する。
【化１０】
【０１６７】
変換実施例４：ＣＡのＤＨＣＡへの化学変換
氷酢酸１３２０Ｌを２０００Ｌ攪拌容器に入れ、コール酸（ＣＡ）１１０ｋｇ（２６０モル）をその中に溶解した。次亜塩素酸ナトリウム溶液（２．３モル濃度）４２２Ｌを２０ないし４０℃においてこの溶液中へ計量し、反応溶液を反応完結まで少なくとも１時間さらに攪拌した。デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）を遠心によって１００ｋｇ（９０％）の収量で単離する。
【０１６８】
変換実施例５：１２−ケト−ＵＤＣＡのＵＤＣＡへの化学変換
１２−ケト−ＵＤＣＡ１０５ｇ（０．２５８モル）をトリエチレングリコール３８４ｍｌに溶かし、水酸化ナトリウム５２．２ｇ（１．３０４モル）とヒドラジンヒドラート７５．９５ｍｌ（１．５６３モル）を加え、１８０℃へゆっくり加熱する。この時ヒドラゾンが生成するが、１６０℃を越えると窒素を放出してＵＤＣＡへ転位する。変換完了のため反応混合物を１８０℃に８時間維持する。反応混合物を１００℃以下に冷却し、水１５００ｍｌで処理する。次に塩酸で酸性することによってＵＤＣＡを沈澱させる。生成物は、９６．２ｇないし９９．２ｇ（９５％から９８％まで）の収量で得られる。
【０１６９】
製造実施例２：調製的スケールでＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２５９８６からの７β−ＨＳＤＨのクローニング、発現および精製と、この酵素のさらなるキャラクタリゼーション
【０１７０】
ａ）クローニングおよび発現構造体の生産
７β−ＨＳＤＨコーディング遺伝子をコードする遺伝子がＰＣＲにより、そして製造実施例１において記載したプライマーを使用したゲノムＤＮＡから再び増幅された。
ＰＣＲ生成物が前に記載したように再び精製され、制限エンドヌクレアーゼＨｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化された。消化されたＰＣＲ生成物は再び精製され、発現ベクターを作製するためＴ４リガーゼを用いてｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター中にクローンされた。得られた発現構造体は次にＥ．Ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ細胞中に形質転換された。予期されるタンパク質は、信号ペプチドとＮ−末端６×Ｈｉｓ−Ｔａｇとトロンビン開裂部位を含んでいる２０アミノ酸残基を持つに違いない。挿入したＤＮＡの配列がシーケンシングによってチェックされた。
【０１７１】
ｂ）７β−ＨＳＤＨの過発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）が発現構造体で形質転換された。このため発現構造体を含んでいるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株がカナマイシン３０μｇ／ｍｌを含んでいるＬＢ培地中で（２Ｌシェーカーボトル中２×４００ｍｌ）増殖された。遠心（１０，０００×ｇ、５分、４℃）によって細胞が収穫された。ペレットをリン酸緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８，ＰＭＳＦ０．１ｍＭを含有）２０ｍｌ中に再懸濁した。細胞はＳｏｎｉｆｉｅｒ ２５０超音波デバイス（Ｂｒａｎｓｏｎ，ドイツ）を使ってコンスタントな冷却のもと１分間の超音波処理（４０Ｗパワー、４０％間隔および１分休止）によって粉砕された。粉砕は３回繰り返された。細胞抽出物は遠心された（２２，０００×ｇ、２０分、４℃）。上清が負荷緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）で平衡化したＴａｌｏｎカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）に負荷された。このプロセスは２４℃で実施された。非結合物質はカラムを負荷緩衝液（３カラム容積）で洗浄することによって洗い流した。弱く結合しているタンパク質は洗浄緩衝液（負荷緩衝液中２０ｍＭイミダゾール、３カラム容積）で洗うことによって除去された。Ｈｉｓ−Ｔａｇ−７β−ＨＳＤＨタンパク質は溶出緩衝液（負荷緩衝液中イミダゾール２００ｍＭ）で溶出された。溶出液は分子排除限界５ｋＤａの透析チューブ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）中リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８）２Ｌ中で４℃で一夜透析された。最後にサンプルを新しいチューブへ移し、さらなる透析のため−２０℃で貯蔵された。タンパク濃度は製造者の指示書に従ってＢＣＡテストキット（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）を使用して決定された。加えて、サンプルは１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、そしてＣｏｏｍａｓｓｉｅブリリアンドブルーによる染色によって分析された。たんぱく質の純度はＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ Ｂｅｔａ ４．０．２（Ｓｃｉｏｎ，ＵＳＡ）を使用してデンシトメトリーによって決定された。
【０１７２】
ｃ）ゲル濾過
ゲル濾過は、７β−ＨＳＤＨの分子量を決定するためにＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＫＴＡタンパク質精製システム上で実施された。２００ｍＭ塩化ナトリウムを含んでいる５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）であらかじめ平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２００カラム上に精製した酵素が適用された。タンパク質は１ｍｌ／ｍｉｎの流量で同じ緩衝液で溶出された。７β−ＨＳＤＨの分子量は、タンパク質標準（血清アルブミン（６６ｋＤａ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅからのα−アミラーゼ（５２ｋＤａ）、ブタ膵臓からのトリプシン（２４ｋＤａ），およびニワトリ卵からのリゾチーム（１４．４ｋＤａ））との溶出容積の比較によって決定された。
【０１７３】
ｄ）酵素テストおよび動力学分析
酵素テストのための反応混合物は、全容積１ｍｌ中５０μｍｏｌリン酸カリウム（ｐＨ８）、０．１μｍｏｌ ＮＡＤ（Ｐ）ＨまたはＮＡＤ（Ｐ）＋、基質およびタンパク質を含んでいた。この反応混合物を光路長１ｃｍのクベットに入れた。７β−ＨＳＤＨ活性は分光光度計（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ３０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，イギリス）を使用して３４０ｎｍの吸光度におけるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ濃度の変化を記録することによって決定された。酵素活性は２５℃における６．２２ｍＭ−１×ｃｍ−１のモル吸光係数を使用して酵素単位（Ｕ，すなわちμｍｏｌ／ｍｉｎ）として決定された。可変基質、補酵素、濃度、ｐＨ、緩衝液およびインキュベーション温度を使用していくつかの異なる測定が実施された。動力学的定数は標準方法を使用して決定された。
【０１７４】
ｅ）７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−リトコール酸のバイオ転換
７β−ＨＳＤＨの生化学的機能を検証するため、７β−ＨＳＤＨによる７−ケト−ＬＣＡの変換を実施した。０．４ｇの７−ケト−ＬＣＡをリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８）の１０ｍｌ中に懸濁し、２Ｍ水酸化ナトリウムの添加によってｐＨ８へ調節した。イソプロパノール０．２ｍｌ、７β−ＨＳＤＨ１００単位、およびＴｈｅｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓからのアルコールデビドロゲナーゼ（ＡＤＨ−ＴＥ）８０単位（Ｄｒ．Ｋ．Ｍｏｍｏｉ、ＩＴＢ大学、シュトゥットガルトからの寄贈）、およびＮＡＤＰ＋１μｍｏｌを加えた。２０ｍｌの全反応容積を得るため同じ緩衝液を加えた。反応混合物を２４℃でインキュベートし、そして２４時間攪拌した。この間ＮＡＤＰＨはＡＤＨにより２−プロパノールの酸化を介して再生された。生成物を２Ｍ塩酸１ｍｌで酸性化し、酢酸エチル５×５ｍｌで抽出した。有機溶液は次に蒸留された。
【０１７５】
ｆ）クロマトグラフ生成物決定
ＬＣ２０ＡＤ ＨＰＬＣシステム（島津、日本）上にＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴＴＭＳＴＡＲ ＲＰ１８タイプ（エンドキャップした、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）のプレカラムを備えたＰｕｒｏｓｐｈｅｒＴＭＳＴＡＲ ＲＰ−１８タイプのカラム（ＨｉｔｂａｒＴＭＲＴ１２５−４ プレパックしたカラム、ＰｕｒｏｓｐｈｅｒＴＭＳＴＡＲ ＲＰ−１８ エンドキャップした、Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）上で１ｍｌ／ｍｉｎの流速においてＨＰＬＣ分析が実施された。移動相は２種の溶出液からなっていた。溶出液Ａはアセトニトリルを含有し、溶出液Ｂは蒸留水（ｐＨ２．６、オルトリン酸８５％で調節）であった。以下の勾配が使用された：Ａ３５％（８分）−３５％−４３％（１％ｍｉｎ−１）−４３％−７０％（１％ｍｉｎ−１）−７０％（５ｍｉｎ）−７０％−３５％（１７．５％ｍｉｎ−１）−３５％（５ｍｉｎ）；溶出液Ａ６５％（８ｍｉｎ）−６５％−５７％（１％ｍｉｎ−１）−５７％−３０％（１％ｍｉｎ−１）−３０％（５ｍｉｎ）−３０％−６５％（１７．５％ｍｉｎ−１）−６５％（５ｍｉｎ）。サンプル２０μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）が分析された。標準として真正ＵＤＣＡ，７−ケト−ＬＣＡおよびＣＤＣＡが同じ濃度で使用された。記録は２００ｎｍにおけるＵＶ検出によって実行された。
【０１７６】
ｇ）配列アラインメントおよび分子進化分析
Ｃｌａｓｔａｌ Ｘ ソフトウエア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２５：４８７６−８２）を使用して多数配列アラインメントが創出され、Ｊａｌｖｉｅｗ ソフトウエア（Ｃｌａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：４２６−７）を用いて修飾された。分子進化系統樹はプログラムＴｒｅｅＶｉｅｗ１．６．６（Ｒｏｄｅｒｉｃ ２００１，ｈｔｔｐ：／／ｔａｘｏｎｏｍｙ．ｚｏｏｌｏｇｙ．ｇｌａ．ａｃ．ｕｋ．／ｒｏｄ．ｈｔｍｌ）を使用してつくられた。
【０１７７】
ｈ）テスト結果
１．調製用バイオ変換における７β−ＨＳＤＨ活性の同定
酵素の機能を確認するため、１０ｍｌスケールにおいて７−ケト−ＬＣＡのバイオ変換を実施した。ここでは既に記載したように、ＮＡＤＰＨの再生のためＡＤＨと２−プロパノールを組合わせて単離した酵素が使用された。ＨＰＬＣ分析は、ＵＤＣＡだけがこの酵素によって生産される反応生成物（９０％変換）であることを示した。ＣＤＣＡ（保持時間１９．４分）は反応混合物中に検出されなかった。この結果はＮＡＤＰＨ依存性７β−ＨＳＤＨであり、そして７−ケト−ＬＣＡの７−カルボニル基の７β−ヒドロキシル基への選択的還元ができることを示す。
ＵＤＣＡ保持時間 ：１５．５分
７−ケト−ＬＣＡ保持時間 ：１８．３分
【０１７８】
２．精製およびゲル濾過
Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９からの７β−ＨＳＤＨ遺伝子を発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）にクローニングし、その後の過発現の後、Ｎ−末端にＨｉｓ−Ｔａｇを備えた融合タンパク質が培養物１ｈあたり３３２．５ｍｇ（５８２８Ｕ）の７β−ＨＳＤＨ収率で得られた。Ｈｉｓ−Ｔａｇを備えた７β−ＨＳＤＨは固定化した金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによる１工程で精製された（純度＞９０％、収率７６％、図２を見よ）。トラック１および２の主要バンドは、この遺伝子のアミノ酸配列から誘導される予知された分子量に相当する、３０ｋＤａの期待した発現生成物を代表する。しかしながら、ゲル濾過によって７β−ＨＳＤＨに対し５６．１ｋＤａの分子量が決定された。このことはＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９からの７β−ＨＳＤＨのダイマー性格を確認する。
【０１７９】
３．配列アラインメント
本発明に従った７β−ＨＳＤＨのアミノ酸配列が既知のＨＳＤＳ配列と比較された（図３を見よ）。観察された配列類似性は、本発明に従った酵素は短鎖デヒドロゲナーゼ（ＳＤＲ）のファミリーに属することを指示する。ＳＤＲは非常に低い相同性および配列同一性を示すことが知られている（Ｊｏｒｎｖａｌ，Ｈ．，Ｂ．Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｍ．Ｋｒｏｏｋ，Ｓ．Ａｔｒｉａｎ，Ｒ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｄｕａｒｔｅ，Ｊ．Ｊｅｆｆｒｅｙ，ａｎｄ Ｄ．Ｇｈｏｓｈ；Ｓｈｏｒｔ−Ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ（ＳＤＲ），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：６００３−１３ ａｎｄ Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｍ．Ｋｒｏｏｋ，ａｎｄ Ｈ．Ｊｏｒｎｖａｌｌ，１９９１；Ｃｈａｒａｃｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｅｕｒ．Ｊ．ＢｉｏＣｈｅｍ ２００：５３７−４３）。しかしながら、配列アラインメントはＳＤＲ一次構造中の保存されたドメインを明瞭に示している。Ｎ−末端モチーフＧｌｙ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ―Ｇｌｙ（Ｇｌｙ−４１，Ｇｌｙ−４５およびＧｌｙ−４７に対応、アラインメントに対応するナンバリング）は、ＳＤＲスーパーファミリーの特徴的なジヌクレオチド結合モチーフに相当する。加えて、３つの強い保存された残基Ｓｅｒ−１７７，Ｔｒｉ−１９０およびＬｙｓ−１９４（アラインメントに従ったナンバリング）を識別することができ、これはＳＤＲ酵素の触媒性の３組に相当する。
【０１８０】
４．分子進化系統分析
図３のアラインメントに基づいた進化樹が図４に示されている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ，Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓおよびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからの７α−ＨＳＤＨは同じグループに属する。３α−ＨＳＤＨの両方は他のＨＳＤＨよりももっと目立った関係を示す。興味あることに、原核７β−ＨＳＤＨは、Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ，Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓおよびＭｕｓ ｍｕｓｕｌｕｓを含む動物１１β−ＨＳＤＨサブグループに関係している。
【０１８１】
５．動力学定数
ＵＤＣＡ，７−ケト−ＬＣＡ、ＤＨＣＡ，ＮＡＤＰ＋およびＮＡＤＰＨのためのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを使ったＶｍａｘおよびＫｍの絶対値を決定するため、動力学的平衡分析が実施された。以下の表において、基質飽和曲線および逆数プロットから得た、テストした基質および補酵素のためのすべての動力学データが要約されている。すべての基質および補酵素のＶｍａｘ，ＫＭおよびｋｃａｔ値は同じ範囲にあるが、しかしＤＨＣＡのＫＭ値は、多分低い水中溶解度のため他の基質よりも有意に高い。酵素はＮＡＤＰＨ依存性であり、そしてＮＡＤ＋およびＮＡＤＨの動力学定数は非常に低い活性のため決定できなかった。
【０１８２】
【表４】
ａ）非常に低い活性のため決定不能
ｂ）１Ｕ＝１μｍｏｌ／ｍｉｎ
【０１８３】
６．ｐＨ最適値
さらに、精製した酵素を用いて、ｐＨの関数としての種々の基質に対する７β−ＨＳＤＨ活性が決定された（図５を見よ）。７β−ＨＳＤＨによるＵＤＣＡの酸化については、最適活性はｐＨ９ないし１０の範囲にあり、酸性側で徐々に低下することが観察された。これと対照的に、７β−ＨＳＤＨによるＤＨＣＡおよび７−ケト−ＬＣＡの還元に対しては、最適活性はｐＨ４ないし６の範囲にあり、酸性側でシャープな下降およびアルカリ側で徐々に低下することが見られた。異なる緩衝液は、同じｐＨにおいて７β−ＨＳＤＨの活性に少ししか影響しなかった。
【０１８４】
７．熱安定性
本発明に従ったＮＡＤＰ依存性７β−ＨＳＤＨは以下の安定性挙動を示す。４００分後３０℃での活性は２３℃より約３０％低い。この酵素は３０℃で１５００分後完全に失活するが、しかし２３℃で１５００分後では残存活性は２０％であった。リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８）中−２０℃において多数回冷凍および解凍後数ヶ月にわたっての貯蔵中有意な活性損失は観察されなかった。
【０１８５】
【表５】
ＡＡ＝アミノ酸配列
ＮＡ＝核酸配列
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル濾過によって決定して約５３ないし６０ｋＤａの分子量を有し、バクテリア、特にＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９（ＡＴＣＣ２５９８６）のようなＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ属のバクテリアから得られる、７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）およびこの７β−ＨＳＤＨから誘導される機能的均等物。
【請求項２】
ａ）７−ケトステロイドの対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異性還元、および／または
ｂ）７位にある７−ケトステロイドの対応する７β−ヒドロキシステロイドへの位置特異性水素化
を触媒する、請求項１の７β−ＨＳＤＨまたはそれから誘導される機能的均等物。
【請求項３】
ゲル濾過によって決定して約５３ないし６０ｋＤａの分子量を有し、そして特に少なくとも７−ケトステロイドの対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異性還元を触媒する、配列同定Ｎｏ．２に従ったアミノ酸配列、またはこの配列に対し少なくとも８０％の同一度を有するそれから誘導された配列を含む、７β−ＨＳＤＨ。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれに従った７β−ＨＳＤＨの存在下、対応する７−ケトステロイドが変換され、そして少なくとも一つの還元生成物が任意に反応系から単離される、７β−ヒドロキシステロイドの酵素合成方法。
【請求項５】
還元されるケトステロイドが、
デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ），
７−ケト−リトコール酸（７−ケト−ＬＣＡ），
７，１２−ジケト−リトコール酸（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）、および
特に前記酸の塩、アミドまたはアルキルエステルのようなその誘導体から選ばれる、請求項４の方法。
【請求項６】
還元はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下（そして消費を伴って）実施される請求項４または５の方法。
【請求項７】
請求項１ないし３のいずれかに従った７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下、ヒドロキシステロイドが変換され、そして生成した酸化生成物が任意に反応系から単離される、７β−ヒドロキシステロイドの酵素酸化方法。
【請求項８】
７β−ヒドロキシステロイドは３，１２―ジケト−７β−ＣＡまたは塩、アミドまたはアルキルエステルのようなその誘導体である請求項７の方法。
【請求項９】
酸化はＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下（そして消費を伴って）実施される請求項７または８の方法。
【請求項１０】
消費されたレドックス均等物が電気化学的にまたは酵素的に再生される請求項６または９の方法。
【請求項１１】
消費されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈが、ＮＡＤ（Ｐ）デヒドロゲナーゼおよび特にアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）から選ばれるＮＡＤ（Ｄ）Ｈ−再生酵素とカップリングすることによって再生される請求項１０の方法。
【請求項１２】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−再生酵素は、単離または富化された、天然または組換えられた、
ａ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）および
ｂ）それから誘導された機能的均等物
から選ばれる請求項１１の方法。
【請求項１３】
式（１）
【化１１】
（式中、Ｒはアルキル、ＮＲ１Ｒ２，Ｈ，アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４＋を意味し、ここでＲ３は同一または異なってＨまたアルキルを意味する。）
のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造方法であって；
ａ）式（２）
【化１２】
（式中Ｒは前記の意味を有する。）のコール酸（ＣＡ）が任意に式（３）
【化１３】
（式中Ｒは前記の意味を有する。）のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）へ化学的に酸化され；
ｂ）ＤＨＣＡが請求項１ないし３のいずれかに従った少なくとも一つの７β−ＨＳＤＨの存在下、式（４）
【化１４】
の３，１２−ジケト−７β−コール酸（３，１２−ジケト−７β−ＣＡ）へ還元され；
ｃ）３，１２−ジケト−７β−ＣＡが少なくとも一つの３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）の存在下、式（５）
【化１５】
（式中Ｒは前記の意味を有する。）の対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）へ還元され；
ｄ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡがＵＤＣＡへ化学的に還元され；そして
ｅ）反応生成物が任意にさらに精製される、ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
ステップｂ）および／またはステップｃ）は（特に酵素的）助因子再生ステップと組合わされる請求項１３の方法。
【請求項１５】
ステップｂ）はＮＡＤＰＨが犠牲的アルコール消費を伴うアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）により再生される助因子再生ステップと組合わされる請求項１４の方法。
【請求項１６】
ステップｃ）は、ＮＡＤＨがホルメートの消費を伴うホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）により再生される、またはＮＡＤＰＨが犠牲的にアルコール消費を伴うアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）により再生される、助因子再生ステップと組合わされる請求項１４または１５の方法。
【請求項１】
ゲル濾過によって決定して約５３ないし６０ｋＤａの分子量を有し、バクテリア、特にＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ ＤＳＭ３９７９（ＡＴＣＣ２５９８６）のようなＣｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ属のバクテリアから得られる、７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（７β−ＨＳＤＨ）およびこの７β−ＨＳＤＨから誘導される機能的均等物。
【請求項２】
ａ）７−ケトステロイドの対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異性還元、および／または
ｂ）７位にある７−ケトステロイドの対応する７β−ヒドロキシステロイドへの位置特異性水素化
を触媒する、請求項１の７β−ＨＳＤＨまたはそれから誘導される機能的均等物。
【請求項３】
ゲル濾過によって決定して約５３ないし６０ｋＤａの分子量を有し、そして特に少なくとも７−ケトステロイドの対応する７β−ヒドロキシステロイドへの立体特異性還元を触媒する、配列同定Ｎｏ．２に従ったアミノ酸配列、またはこの配列に対し少なくとも８０％の同一度を有するそれから誘導された配列を含む、７β−ＨＳＤＨ。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれに従った７β−ＨＳＤＨの存在下、対応する７−ケトステロイドが変換され、そして少なくとも一つの還元生成物が任意に反応系から単離される、７β−ヒドロキシステロイドの酵素合成方法。
【請求項５】
還元されるケトステロイドが、
デヒドロコール酸（ＤＨＣＡ），
７−ケト−リトコール酸（７−ケト−ＬＣＡ），
７，１２−ジケト−リトコール酸（７，１２−ジケト−ＬＣＡ）、および
特に前記酸の塩、アミドまたはアルキルエステルのようなその誘導体から選ばれる、請求項４の方法。
【請求項６】
還元はＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下（そして消費を伴って）実施される請求項４または５の方法。
【請求項７】
請求項１ないし３のいずれかに従った７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下、ヒドロキシステロイドが変換され、そして生成した酸化生成物が任意に反応系から単離される、７β−ヒドロキシステロイドの酵素酸化方法。
【請求項８】
７β−ヒドロキシステロイドは３，１２―ジケト−７β−ＣＡまたは塩、アミドまたはアルキルエステルのようなその誘導体である請求項７の方法。
【請求項９】
酸化はＮＡＤ（Ｐ）＋の存在下（そして消費を伴って）実施される請求項７または８の方法。
【請求項１０】
消費されたレドックス均等物が電気化学的にまたは酵素的に再生される請求項６または９の方法。
【請求項１１】
消費されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈが、ＮＡＤ（Ｐ）デヒドロゲナーゼおよび特にアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）から選ばれるＮＡＤ（Ｄ）Ｈ−再生酵素とカップリングすることによって再生される請求項１０の方法。
【請求項１２】
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−再生酵素は、単離または富化された、天然または組換えられた、
ａ）アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）および
ｂ）それから誘導された機能的均等物
から選ばれる請求項１１の方法。
【請求項１３】
式（１）
【化１１】
（式中、Ｒはアルキル、ＮＲ１Ｒ２，Ｈ，アルカリ金属イオン、またはＮ（Ｒ３）４＋を意味し、ここでＲ３は同一または異なってＨまたアルキルを意味する。）
のウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の製造方法であって；
ａ）式（２）
【化１２】
（式中Ｒは前記の意味を有する。）のコール酸（ＣＡ）が任意に式（３）
【化１３】
（式中Ｒは前記の意味を有する。）のデヒドロコール酸（ＤＨＣＡ）へ化学的に酸化され；
ｂ）ＤＨＣＡが請求項１ないし３のいずれかに従った少なくとも一つの７β−ＨＳＤＨの存在下、式（４）
【化１４】
の３，１２−ジケト−７β−コール酸（３，１２−ジケト−７β−ＣＡ）へ還元され；
ｃ）３，１２−ジケト−７β−ＣＡが少なくとも一つの３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３α−ＨＳＤＨ）の存在下、式（５）
【化１５】
（式中Ｒは前記の意味を有する。）の対応する１２−ケト−ウルソデオキシコール酸（１２−ケト−ＵＤＣＡ）へ還元され；
ｄ）式（５）の１２−ケト−ＵＤＣＡがＵＤＣＡへ化学的に還元され；そして
ｅ）反応生成物が任意にさらに精製される、ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
ステップｂ）および／またはステップｃ）は（特に酵素的）助因子再生ステップと組合わされる請求項１３の方法。
【請求項１５】
ステップｂ）はＮＡＤＰＨが犠牲的アルコール消費を伴うアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）により再生される助因子再生ステップと組合わされる請求項１４の方法。
【請求項１６】
ステップｃ）は、ＮＡＤＨがホルメートの消費を伴うホルメートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）により再生される、またはＮＡＤＰＨが犠牲的にアルコール消費を伴うアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）により再生される、助因子再生ステップと組合わされる請求項１４または１５の方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５１１９７３（Ｐ２０１３−５１１９７３Ａ）
【公表日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４０４６２（Ｐ２０１２−５４０４６２）
【出願日】平成２２年１１月３０日（２０１０．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６８５７６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６４４０４
【国際公開日】平成２３年６月３日（２０１１．６．３）
【出願人】（５１０２５５１０７）ファルマツェル、ゲーエムベーハー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月３０日（２０１０．１１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６８５７６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６４４０４
【国際公開日】平成２３年６月３日（２０１１．６．３）
【出願人】（５１０２５５１０７）ファルマツェル、ゲーエムベーハー (2)
【Ｆターム（参考）】
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