日本脳炎ウイルス群感染症に対する不活化ワクチンのための増強免疫原およびその製造方法
【課題】マウスの代わりに細胞株を用いてウイルス粒子を量産する技術を提供すること。
【解決手段】本発明は、従来のワクチンに比べ、約２倍〜約１０倍に力価が増強された新規な不活化ウイルス粒子、増強免疫原およびその製造方法を提供する。本発明の不活化ウイルス粒子はまた、日本脳炎ウイルス群感染症の診断剤にも有用である。これにより、生産コストが大幅に低減されるだけではなく、バイオハザード対策、製造作業手順、精製工程、品質管理、製造計画等が省力化される。
【解決手段】本発明は、従来のワクチンに比べ、約２倍〜約１０倍に力価が増強された新規な不活化ウイルス粒子、増強免疫原およびその製造方法を提供する。本発明の不活化ウイルス粒子はまた、日本脳炎ウイルス群感染症の診断剤にも有用である。これにより、生産コストが大幅に低減されるだけではなく、バイオハザード対策、製造作業手順、精製工程、品質管理、製造計画等が省力化される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、フラビウイルス属の日本脳炎ウイルス群による感染症に対する不活化ワクチンおよび診断剤、特に、その有効成分として優れて有用な増強免疫原あるいは抗原およびその製造方法、並びに不活化日本脳炎ワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
日本脳炎ウイルス群による感染症の代表例として、以下、日本脳炎を挙げ、そのワクチンにつき説明する。最初の日本脳炎ワクチンは、１９５４年に実用化された。このワクチンは、マウス脳内で培養したウイルスから調製した抗原を有効成分とし、その精製度は低く、不純物が多いため、アレルギー性の中枢神経障害を誘発する危険性があった。その後、改良され、アルコール沈殿、硫酸プロタミン処理、および超遠心法等の組合せによる高度精製ワクチンが１９６５年に実用化され、品質が著しく向上した。そして、かかるワクチンおよびその製造技術が踏襲され現在に至っている（非特許文献１）。一方、マウス脳を使用しない不活化ワクチンの開発も試行された。即ち、１９６５年に日本脳炎ワクチン研究会が結成され、初代細胞培養による組織培養ワクチンが開発された。しかし、不活化ワクチン抗原の量産に要する膨大な量の初代細胞培養の確保が製造コストの点で実用上不可能であったので、このワクチンは実用化に至らなかった。これは、その当時、ワクチン製造用の認可細胞が初代培養細胞に限定され、継代細胞株の使用が危険視かつ否認されていたためである。組織培養の日本脳炎生ワクチンに関しては、中国で初代ハムスター腎細胞培養で増殖させた弱毒ウイルスを有効成分として用いる生ワクチンが１９９４年頃に実用化されている。しかし、中国以外の諸外国では、有効性および安全性が未確認であり、その使用は知られていない。更に、１９８６年頃から組換え遺伝子技術を駆使した日本脳炎ワクチン、例えば、エンベロープ（Ｅ）タンパク抗原、組換えウイルス等を用いる第二世代ワクチンが多種多様に報告されている。しかし、これ等のワクチンはいずれも、実験あるいは前臨床試験の段階にあり、未だ実用化されていない（非特許文献２）。
【０００３】
不活化ワクチン用の抗原あるいは免疫原の量産に細胞株を用いる技術としては、例えば、ポリオ（特許文献１）、狂犬病（特許文献２）、Ａ型肝炎（特許文献３）、ダニ媒介脳炎（特許文献４）等の各ウイルス抗原の量産におけるＶｅｒｏ細胞の使用が公知である。これ等のうち、前２者の実用化はそれぞれ衆知であるが、後２者については、量産された各抗原のワクチンとしての安全性および有効性の確認、並びに実用化は知られていない。
【０００４】
従来の日本脳炎ワクチンの有効成分は、マウス脳内で増殖させた日本脳炎ウイルスの不活化粒子である。かかるワクチン用抗原の量産には、膨大な数のマウスおよび感染動物のバイオハザード対策等を要するので、生産コストが非常に高くつく。また、製品中へのマウス脳の有害成分、例えば、脱髄を生じる塩基性タンパクの混入や、マウス由来ウイルスの迷入等の危険性を常に伴うため、精製工程および品質管理は複雑多岐にわたる。その上、最近では製造用マウスの入手が困難となり、計画的なワクチン製造に支障が生じていた。更に、マウスを犠牲にする従来技術は、動物愛護や宗教の観点から望まれなくなっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第4,525,349号明細書
【特許文献２】米国特許第4,664,912号明細書
【特許文献３】米国特許第4,783,407号明細書
【特許文献４】米国特許第5,719,051号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Vaccine Handbook", pp. 103-113, Researcher's Associates, National Institute of Health (Japan), Maruzen (Tokyo) 1996
【非特許文献２】“Vaccine”, 2nd ed., pp. 671-713, S.A.PlotokinおよびE.A.Mortimer著, W.B.Sauders Co. 1994；The Jordan Report, pp. 26-27, 1998
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の開示
この発明では、前記課題の解決のために、マウスの代わりに細胞株を用いてウイルス粒子を量産する。これにより、生産コストが大幅に低減されるだけではなく、バイオハザード対策、製造作業手順、精製工程、品質管理、製造計画等が省力化される。特筆すべきは、本発明が新規なウイルス粒子についての予測困難な驚くべき発見に基づいていることである。この発明により、従来の不活化ワクチンの免疫原に比べ、中和抗体価で表される力価が２倍〜１０倍増強された免疫原としての新規な不活化ウイルス粒子およびその製造方法が提供される。即ち、日本脳炎ウイルス群の感染症に対する不活化ワクチン、特に、不活化日本脳炎ワクチンの免疫原として、あるいは診断剤の抗原として、卓抜した免疫原性あるいは抗原性を有する新規な日本脳炎ウイルス粒子およびその製造方法が提供される。かかる粒子は、技術的には、日本脳炎ウイルス群に属するウイルス、例えば、日本脳炎ウイルスを細胞株で培養する工程および/またはその後の濃縮、精製、および不活化を含む一連の工程下で生成されるが、その純科学的な生成機構は未だ定かでない。以上に基づき、この発明により、次の（１）〜（１０）が提供される：
【０００８】
（１）日本脳炎ウイルス群に属するウイルスの感染細胞培養物から調製された不活化ウイルス粒子であって、該ウイルス粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価が、マウス脳内で培養されたウイルスから調製された不活化ウイルス粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価の２倍〜１０倍である、増強免疫原としての不活化ウイルス粒子。
【０００９】
（２）日本脳炎ウイルス群に属するウイルスを細胞株で培養する工程、ならびに細胞培養物を不活化および精製する工程を含む、不活化ウイルス粒子の製造方法。
【００１０】
（３）細胞株がＶｅｒｏ細胞である、上記２に記載の製造方法。
【００１１】
（４）不活化が精製の前に行われる、上記２または３に記載の製造方法。
【００１２】
（５）不活化が約４℃〜約１０℃で行われる、上記２〜４のいずれかに記載の製造方法。
【００１３】
（６）精製が、物理的方法により行われる、上記２〜５のいずれかに記載の製造方法。
【００１４】
（７）日本脳炎ウイルス群に属するウイルスが日本脳炎ウイルスの北京株またはＴｈＣＭＡｒ６７/９３株である上記２〜６のいずれかに記載の製造方法。
【００１５】
（８）上記２〜７のいずれかに記載の製造方法によって製造される、不活化ウイルス粒子。
【００１６】
（９）上記１または８に記載の不活化ウイルス粒子を含有する不活化ワクチン。
【００１７】
（１０）上記８に記載の不活化ウイルス粒子の全部または一部を抗原として含む、日本脳炎ウイルス群感染症の診断剤。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、北京株についての試作ワクチンに含まれる本発明のウイルス粒子（Ｒ粒子；Ａ）およびマウス脳由来の市販ワクチンに含まれる従来技術のウイルス粒子（ＭＢ粒子；Ｂ）の電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明を実施するための最良の形態
この発明の実施形態の特徴は、代表例としての従来の日本脳炎ワクチンの免疫原と本発明のそれとの間の物質および製造の両側面の比較において顕現される。これを考慮し、以下、上記両者の免疫原性および形態の相違、免疫原としてのウイルス粒子、ウイルス培養の宿主、ウイルスの精製、ウイルスの不活化、力価試験、および電子顕微鏡解析の順に説明する。
【００２０】
従来の日本脳炎ワクチンの免疫原：これは、現在市販の不活化日本脳炎ワクチンの有効成分（免疫原）を意味する。この免疫原は、薬事法（昭和３５年法律第１４５号）第４２条第１項の規定に基づく厚生省告示第２１７号「生物学的製剤基準」（英語版：Minimum Requirements for Biological Products, Association of Biologicals Manufacturers of Japan, 1986）に定める「日本脳炎ワクチン」または「乾燥日本脳炎ワクチン」の規程に準拠して製造され、かつ、安全性・有効性等に係る種々の試験を行い、その適格性が確認されたものである。このワクチンの有効成分すなわち免疫原は、日本脳炎ワクチン製造用株ウイルスをマウス脳内に接種して増殖・量産させた後、それに伴う発症マウス脳の磨砕物を出発材料とする。この材料を高度精製すると共に、不活化剤で不活化して得られる日本脳炎ウイルス粒子、即ち、マウス脳（ＭＢ）に由来の不活化ウイルス粒子が免疫原として用いられる。以下、これを「ＭＢ粒子」または「ＭＢ免疫原」と略記する。
【００２１】
本発明に係る日本脳炎ワクチンの免疫原：これは、不活化日本脳炎ワクチンの有効成分（免疫原）であって、日本脳炎ウイルスの培養宿主として細胞株の培養細胞を用いること以外は、前述の日本脳炎ワクチンの規程に準拠して製造され、かつ、種々の品質管理試験を行い、その適格性が確認されたものを意味する。したがって、この免疫原は、日本脳炎ウイルスを細胞株の培養細胞に接種して増殖させ量産した後、その細胞培養物を出発材料とする。この材料を高度精製すると共に、不活化剤で不活化することにより調製された日本脳炎ウイルス粒子、即ち、組織培養に由来の不活化ウイルス粒子が免疫原として用いられる。この免疫原は、次の（１）に示す特徴を有し、さらに、通常、次の（２）に示す主な特徴をも併せて有する：
（１）上記粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価が、後述する力価試験により測定される場合、従来のＭＢ粒子またはＭＢ免疫原で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価の約２倍〜約１０倍である（以下、これを「増強免疫原」と呼び、「Ｒ粒子」または「Ｒ免疫原」と略記する）；および
（２）電子顕微鏡解析に基づく粒子構造、特に、粒子表面またはエンベロープ層の外観が、ＭＢ粒子が滑らかであるのに対し、Ｒ粒子は粗いか若しくは毛羽立っている。
【００２２】
以上の日本脳炎ワクチンの免疫原の説明は、本発明に係る日本脳炎ウイルス群により生じる感染症に対するワクチン用の免疫原の代表例として記載されたものである。本発明に係るワクチン、例えば、日本脳炎ワクチンは、液状または乾燥の形態で、密栓したバイアル瓶ないしは熔封したアンプルに入れて提供される。液状製剤はそのまま、乾燥製剤は溶解液で液状にもどした後、これを、例えば、ワクチン被接種者一人当たり０.２ｍｌ〜１.０ｍｌずつ、皮下接種することにより使用される。
【００２３】
免疫原としてのウイルス：この発明に係る日本脳炎ウイルス群には、例えば、日本脳炎、クンジン、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、ウェストナイル等のウイルスが含まれ、その詳細は、Archives of Virology, Supplement 10, pp. 415-427, 1995 (”Virus Taxonomy”, Classification and Nomenclature of Viruses; Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses）に記載の通りである。これ等のうち、日本脳炎ウイルスについては、例えば、マウス脳由来の北京−１株、この株を本発明者らが更にマウス脳内で継代することにより得たＪＷＳ−Ｐ−４（Ａｍ２９Ｓｍ１Ａｍ５；すなわち、成熟マウス（Ａｍ）において２９代、次いでは乳のみマウス（Ｓｍ）において１代、さらにＡｍにおいて５代継代して得られた株を意味する）、ＪＷＳ−Ｐ−４を更にＶｅｒｏ細胞で２代継代して得たマスターシードＪＭＳＶ００１（北京−１株、ＪＷＳ−Ｐ−４、およびＪＭＳＶ００１を以下「北京株」という）、中山−予研株（以下「中山株」という）、ＪａＯＡｒＳ９８２株、ＪａＯＨ０５６６株、また、９０年代に五十嵐らが新たに分離したＴｈＣＭＡｒ６７/９３およびＴｈＣＭＡｒ４４/９２両株（Aliら、Archives of Virology, 140, 1557-1575, 1995、ならびにAliおよびIgarashi、Microbiology and Immunology, 41, 241-252, 1977）等々を用いることができる。
【００２４】
この発明において、免疫原として使用する日本脳炎ウイルス株としては、北京株およびＴｈＣＭＡｒ６７/９３が特に好ましい。これらのウイルス株を用いると、抗原スペクトルの広いワクチン、即ち、ワクチン製造に用いたウイルス株以外の複数の株に対しても極めて良好な防御作用を有するワクチンを得ることができる。北京株はＪＭＳＶ００１が好ましい。
【００２５】
この発明において、２種類のウイルス株、例えば、北京株およびＴｈＣＭＡｒ６７/９３株から製造されるワクチンを混合することにより２価ワクチンを調製してもよい。混合比は、例えば、抗原タンパク量として、０.５：１〜１：０.５が好ましい。かかる混合により、従来の１価ワクチン単独に比べ、感染防御の抗原スペクトルが更に広いワクチンを得ることができる。
【００２６】
ウイルス培養は、宿主として適切な細胞株の培養細胞にウイルスを接種した後、感染細胞を維持培養することにより行う。培養方法は後述の細胞培養と同じである。以下、便宜的に、ウイルス培養物を低速遠心した上清を「細胞外ウイルス」と呼び、一方、遠心ペレットから集めた感染細胞を０.２％（Ｗ/Ｖ）ウシ血清アルブミン添加イーグル最少必須培地（ＭＥＭ）で元の体積に浮遊させて超音波処理した後、これを再度、低速遠心した上清を「細胞内ウイルス」と称する。細胞外ウイルスおよび細胞内ウイルスのいずれからも本発明の不活化ウイルス粒子を得ることができる。細胞外ウイルスが好ましい。その理由は、ウイルス粒子の収率が高く、しかも、成熟粒子であり、さらに細胞内ウイルスに比べ、細胞由来成分の取り込みが少ないので、精製が容易だからである。
【００２７】
ウイルス培養の宿主：ウイルス培養の宿主として既知の細胞株、例えば、二倍体細胞株であるＷＩ−３８、ＭＲＣ−５、ＦＲｈＬ−２等、また、連続継代細胞株であるＶｅｒｏ、ＢＨＫ−２１、ＣＨＯ等が使用できる。連続継代細胞が好ましい。その理由は、細胞の量産が容易かつ計画的に行えると共に、細胞の性状が明らかにされており、迷入ウイルスの存在が否定されているからである。更に、常用のＣＶ−１、ＢＳＣ−１、ＭＡ１０４、ＭＤＣＫ、ＣａＣ０−２等、ならびにウイルスワクチンの製造に従来から用いられているＤＢＳ−ＦＬＣ−１、ＤＢＳ−ＦＬＣ−２、ＤＢＳ−ＦＲｈＬ−２、ＥＳＫ−４、ＨＥＬ、ＩＭＲ−９０、ＷＲＬ６８等も使用できる（“ATCC Microbes & Cells at Work”,2nd ed., pp. 144, American Type Culture Collection (ATCC) 1991, USA）。前述の日本脳炎ウイルス株の培養宿主には、このウイルスの増殖が良好な許容細胞を選別して採用することが望ましい。例えば、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）、ＢＨＫ−２１［Ｃ−１３］（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１０）、Ｃ６/３６（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６６０）等の細胞の使用が好ましい。これ等の細胞株の使用に際しては、世界保健機構（ＷＨＯ）が勧告する生物学的製剤の製造用細胞に関する基準（Requirements for Biological Substances No. 50）に準拠して迷入因子および腫瘍原性等に関する種々の試験を行い、ワクチン製造用細胞としての適格性を確認する必要がある(WHO Technical Report Series, No. 878, pp.19-52,1998）。
【００２８】
細胞培養：上記細胞株の培養方法には、静置培養、灌流システム培養、振盪培養、ローラーチューブ培養、ローラーボトル培養、浮遊培養、マイクロキャリアー培養等を採用できる。例えば、細胞のマイクロキャリアーとして市販の種々の規格のＣｙｔｏｄｅｘ［ファルマシアバイオテク社（スウェーデン）製］を用い、市販の種々の動物細胞培養装置により行うことができる。
【００２９】
ウイルスの不活化：ホルマリン、β−プロピオラクトン、グルタルジアルデヒド等の不活化剤を、ウイルス浮遊液に添加混合し、ウイルスと反応させて不活化する。例えば、ホルマリンを使用の場合、その添加量は約０.００５％〜約０.１％（Ｖ/Ｖ）、不活化温度は約４℃〜約３８℃、不活化時間は主に不活化温度に依存し、例えば、３８℃では約５時間〜約１８０時間、４℃では約２０日〜約９０日である。
【００３０】
ウイルスの精製：精製方法には、物理学的方法および化学的方法がある。物理的方法とは、精製対象物の大きさ、密度、沈降係数などの物理的性質を利用する精製方法であって、例えば、ゾーナル超遠心、密度勾配遠心、濾過等を包含する。物理的方法は、通常、ｐＨ、塩濃度などの周囲環境を変化させることなく行うことができる。化学的方法とは、化学ないし物理化学反応による吸脱着を利用する精製方法であって、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトクロマトグラフィー、塩析等を包含する。かかる操作は、約４℃〜室温で行う。
【００３１】
ウイルスの濃縮：不活化および/または精製に先だって、低速遠心、限外濾過膜による濃縮を行ってもよい。
【００３２】
この発明によれば、Ｒ粒子の不活化は、約４℃〜約１０℃で、その精製前に行うことが望ましい。また、精製工程では、物理的方法の採用が望ましい。これにより、精製後に不活化した粒子あるいは化学的方法により精製された粒子に比べ、より高い免疫原性ないしは抗原性を確保することができる。
【００３３】
電子顕微鏡解析：例えば、２％(Ｗ/Ｖ）酢酸ウラニルを用いるネガティブ染色法により調製したウイルス標本を、電子顕微鏡（株式会社日立製作所製）で観察できる。ウイルス粒子の形状等を、写真撮影により得られる２万〜１０万倍に拡大したウイルス粒子画像について解析できる。
【００３４】
ワクチンの調製：本発明の不活化ウイルス粒子を、所望の力価を与えるように、適切な希釈剤で希釈することができる。公知の担体またはアジュバントをワクチンに添加しても良い。ワクチンはまた、必要に応じて、防腐剤、安定剤などを含み得る。
【００３５】
力価試験：前述「生物学的製剤基準」に定める「日本脳炎ワクチン」に規定の「力価試験」に準拠して行う。例えば、４週齢のｄｄＹマウスを各群１５匹ずつ使用し、２倍階段希釈した各ワクチンを０.５ｍｌ/マウス、腹腔内に接種した後、その７日目に第２回接種を行い追加免疫する。第２回接種後、７日目に各マウスから個体別に採血して血清を分離した後、各群ごとにマウス血清を等量プールし、５６℃にて３０分間の非働化を行い、これを免疫血清として中和試験に供する。中和試験にはウイルス培養宿主としてニワトリ胚細胞培養を使用し、攻撃ウイルスには、ワクチン抗原あるいは免疫原に用いたウイルス、例えば、北京株、中山株、ＴｈＣＭＡｒ６７/９３株等を使用できる。中和抗体価は、攻撃ウイルスが形成するプラーク数を５０％減少させる上記免疫血清の最高希釈倍数を以て表わす。
【００３６】
別の局面において、この発明により得られるウイルス粒子（Ｒ粒子）は、診断用抗原、例えば、免疫沈降法、ＨＩ試験、ＣＦ反応、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法等の抗原として使用できる。かかる診断用抗原としての該Ｒ粒子の特徴は、ポリクローナル抗体および特定のモノクローナル抗体と反応する粒子あたりの感度が、ＭＢ粒子のそれに比べ、約２〜１０倍高いことにある。すなわち、本発明の不活化ウイルス粒子の全部または一部を用いると、日本脳炎ウイルス群の感染、特に日本脳炎ウイルスの感染を検出する高感度の診断剤が可能になる。ここで、不活化ウイルス粒子の「一部」とは、ウイルス粒子に由来する所望の抗原性を保持するウイルス粒子の画分である。これには、例えば、下記実施例１に記載の精製工程下で可溶化されたウイルスの構造タンパク質が含まれる。
【実施例】
【００３７】
以下、この発明の態様並びに構成および効果を実験例および実施例によって示し、具体的に説明する。但し、この発明は、これ等に限定されるものではない。
【００３８】
（参考例）
北京およびＴｈＣＭＡｒ６７/９３両株の遺伝子配列表：この発明での使用に特に適切な日本脳炎ウイルス北京株およびＴｈＣＭＡｒ６７/９３株の同定を容易にするため、これ等の両株のゲノムＲＮＡに相補的なエンベロープタンパク遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列と、それがコードする推定アミノ酸配列とを配列番号１〜４に示す。配列番号１および２はＴｈＣＭＡｒ６７/９３株（Archives of Virology, 140, 1557-1575, 1995）、配列番号３および４は北京株であるマスターシードウイルスＪＭＳＶ００１に関する。以下の実施例における「北京株」は、このＪＭＳＶ００１である。
【００３９】
ｃＤＮＡの塩基配列の決定は、上記Aliらの文献（1995）に記載の方法で行った。すなわち、Ｖｅｒｏ細胞によるウイルス培養物から、そのゲノムＲＮＡを抽出の後、エンベロープタンパクをコードする領域を、プライマーを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）で増幅し、得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシチェーンターミネーション法により決定した。また、塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ユニバーサルコードにより解読した。
【００４０】
（実験例１）
ウイルス感染価の測定：後述のＶｅｒｏ−Ｍ細胞を用いるプラーク法により、ウイルス感染価ＰＦＵ（プラーク形成単位）/ｍｌで計数した。
【００４１】
ウイルス抗原量の測定：日本脳炎ウイルス抗原量は、抗日本脳炎ウイルスモノクローナル抗体［Ｇｒｏｕｐ−８ Ｃｌｏｎｅ ５０３（東京都神経科学総合研究所保井博士から分与：K. Yasuiら、Journal of General Virology, 67, 2663-2672, 1986）］ＩｇＧを用いるＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡ値は、マウス脳由来自家標準品（北京株）を１００単位とし、その相対値を平行線検定法により算出した。
【００４２】
ＨＡ試験：試験にはＵ型マイクロプレートを使用した。至適ｐＨに調整したリン酸緩衝液による０.３３％（Ｖ/Ｖ）ガチョウ赤血球浮遊液とウイルス液とを等量混合の後、３７℃で６０分間、反応させ、赤血球凝集の有無を判定した。ＨＡ価は、赤血球凝集が陽性であるウイルス液の最高希釈倍数で表わした。
【００４３】
ウシ血清抗原量の測定：抗ウシ血清ヤギＩｇＧを用いるＥＬＩＳＡにより測定した。ウシ血清標準抗原におけるタンパク質含量に対する相対値を平行線検定法により算出し、その値を抗原量とした。
【００４４】
（実験例２）
ウイルス培養用の細胞株の増殖性：付着性の２系統のＶｅｒｏ細胞、Ｖｅｒｏ−Ａ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１に由来）およびＶｅｒｏ−Ｍ（国立感染症研究所から入手したＶｅｒｏに由来）、３系統のＢＨＫ−２１細胞、ＢＨＫ/ＷＩ２（大阪府立公衆衛生研究所から入手した付着性ＢＨＫ−２１に由来）、ＢＨＫ/ＪＨＩＨ（国立家畜衛生試験場から入手した浮遊性ＢＨＫ−２１に由来）およびＢＨＫ−２１［Ｃ−１３］（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１０に由来）、並びに蚊由来のＣ６/３６細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６６０に由来）をウイルス培養用の候補細胞株とし、これ等の各細胞株の増殖性を観察した。２系統のＶｅｒｏ、およびにＢＨＫ/ＷＩ２およびＢＨＫ−２１［Ｃ１３］は、各々１.５×１０５細胞/ｍｌになるよう増殖培地で調製し、これを３７℃で３日間、静置培養した後、それぞれ細胞数を計測した。上記と同様にして、浮遊性ＢＨＫ/ＪＮＩＨでは２.０×１０５細胞/ｍｌを調製し、これを３７℃で３日間、振盪培養の後、また、Ｃ６/３６では１.０×１０５細胞/ｍｌを調製し、これを２８℃で７日間静置培養の後、各々細胞数を計測した。尚、増殖培地には、最終濃度８％（Ｖ/Ｖ）ウシ血清を添加混合したＭＥＭを用いた。その結果、２系統のＶｅｒｏ、並びにＢＨＫ/ＷＩ２およびＢＨＫ−２１［Ｃ１３］は７.０〜９.０×１０５細胞/ｍｌ、浮遊性ＢＨＫ/ＡＮＩＨおよびＣ６/３６は、２.８×１０６細胞/ｍｌであった。
【００４５】
（実験例３）
候補細胞株における日本脳炎ウイルスの増殖性：実験例２で用いた候補細胞株につき、Ｃ６/３６細胞は２８℃で７日間、それ以外の細胞は３７℃で３日間培養の後、各細胞に北京株を感染多重度（ＭＯＩ）が０.１になるよう接種し、細胞外ウイルス量の経時的変移を、ウイルス感染価（ＰＦＵ）、ウイルス抗原量（ＥＬＩＳＡ価）およびＨＡ価で測定し比較した。その結果を表１に示す。数値は、２回実験した各細胞株でのウイルス増殖曲線における最高値の平均値であり、Ｃ６/３７では、ウイルス感染価は培養３日目に、ＥＬＩＳＡ価およびＨＡ価は共に、培養４日目に各々最高値であった。その他の細胞株では、ウイルス感染価は培養２日目に、ＥＬＩＳＡ価およびＨＡ価は培養３日目または４日目に各々最高値であった。
【００４６】
【表１】
（実験例４）
Ｃｙｔｏｄｅｘの種類およびＶｅｒｏ−Ａ細胞の増殖性：１.５×１０５細胞/ｍｌのＶｅｒｏ−Ａ細胞浮遊液を５００ｍｌずつ入れた細胞培養用フラスコ３本の各々に、Ｃｙｔｏｄｅｘ １、２または３のいずれか１種を１.５ｇ/Ｌになるように添加の後、３７℃にて回転数４０ｒｐｍによる攪拌下で７日間、培養した。その結果を以下に記載する：培養７日目の細胞数/ｍｌは、Ｃｙｔｏｄｅｘ １、２、および３について、それぞれ７.５×１０５、８.３×１０５、および９.４×１０５であった。また、Ｃｙｔｏｄｅｘ １での７日間培養により、全てのビーズの表面に１００個以上のＶｅｒｏ−Ａ細胞が隙間なく付着し増殖した。
【００４７】
（実験例５）
Ｃｙｔｏｄｅｘの濃度およびＶｅｒｏ−Ａ細胞の増殖性：１.５×１０５細胞/ｍｌの細胞浮遊液を５００ｍｌずつ入れた細胞培養用フラスコ４本（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）のうち、ＡおよびＢにはＣｙｔｏｄｅｘ １を各々１.５ｇ/Ｌ、Ｃには３.０ｇ/Ｌ、Ｄには４.５ｇ/Ｌになるようそれぞれ添加した後、３７℃にて回転数４０ｒｐｍによる攪拌下で７日間、培養し、細胞数および細胞が付着したビーズの割合（付着率）を計測した。付着率の算出には、２００個以上の各ビーズを観察し、５個以上の細胞が付着しているビーズを細胞付着ビーズとした。尚、Ｃｙｔｏｄｅｘ １を１.５ｇ/Ｌ添加したＡは、培養終了時まで同じ増殖培地で培養し、残りのＢ、ＣおよびＤの各フラスコについては、培養開始から３、４、および５日目の各日に、培養液の１/２量を新鮮な増殖培地と交換した。その結果を以下記載する：培養液の交換の有無（ＡおよびＢ）は細胞数には影響しなかった。７日間培養後の細胞数/ｍｌは、Ｂが９.１×１０５ 、Ｃが７.７×１０５ 、Ｄが８.０×１０５ であった。付着率は、ＡおよびＢが培養１日目から９８％以上で培養４日目には１００％に達し、培養１日目のＣは９３％、Ｄは８０％と低かった。しかし、培養６日目にはＡ、Ｂ、ＣおよびＤは共に１００％に達した。
【００４８】
（実験例６）
Ｃｙｔｏｄｅｘ １により高密度培養したＶｅｒｏ−Ａ細胞の増殖性：Ｃｙｔｏｄｅｘの濃度および細胞数をそれぞれ３倍にした高密度培養を行った。４.５×１０５細胞/ｍｌのＶｅｒｏ−Ａ細胞浮遊液に、Ｃｙｔｏｄｅｘ １を４.５ｇ/Ｌになるよう添加して、培養液量５０リットルの動物細胞培養装置を用いて培養した。回転数は最初の24時間が１５ｒｐｍ、それ以降は２０ｒｐｍ、ｐＨ７.０、溶存酸素を５ｐｐｍに設定した。培養３日目および５日目に培養液の１/２量を新鮮な増殖培地と交換した。その結果を以下に記載する：培養５日目の細胞数は２.０×１０６細胞/ｍｌ、７日目には２.６×１０６細胞/ｍｌであった。また。培養２日目における細胞のビーズへの付着率は１００％であった。
【００４９】
（実験例７）
ワクチン製造用ウイルス候補株のＶｅｒｏ−Ａ細胞における増殖性：シャーレで３日間静置培養したＶｅｒｏ−Ａに、マウス脳由来の日本脳炎ウイルスの上記候補株、北京株、中山株、ＪａＯＨ０５６６、およびＪａＯＡｒＳ９８２の４株をそれぞれＭＯＩが０.１になるように接種し、ウイルスを９０分間吸着後、２％（Ｖ/Ｖ）ウシ血清を含むＭＥＭを加え３７℃で７日間培養した。そして、細胞外および細胞内ウイルスの感染価および抗原量の経時的変移を観察した。その結果を以下に記載する：感染価について、中山株を除く３株の細胞外ウイルスは培養２日目の値が最も高く１.０×１０８ＰＦＵ/ｍｌ以上、細胞内ウイルスのそれは細胞外ウイルスの１/３以下であり、中山株の細胞外ウイルスのそれは、培養３日目が最高であったが、他の３株の値の１/５以下であった。ＥＬＩＳＡ抗原価に関し、中山株を除く３株の細胞外ウイルスのそれは培養３〜５日目が最も高く、いずれも約７０単位、細胞内ウイルスのそれは細胞外ウイルスの１/５以下であり、中山株では培養５〜７日目にプラトーとなり、３０単位であった。ＨＡ価は、培養２〜４日目の細胞外ウイルスにつき、中山株が１６０、他の３株は６４０〜１２８０であった。
【００５０】
（実験例８）
Ｃｙｔｏｄｅｘ １によるＶｅｒｏ−Ａ細胞培養での北京株の増殖：Ｃｙｔｏｄｅｘ １を用いて培養した２０リットルのＶｅｒｏ−Ａ細胞（１.９６×１０６細胞/ｍｌ）に、Ｖｅｒｏ−Ａで４代継代した北京株ウイルスをＭＯＩが０.１になるよう接種し、ウシ血清を含まないＭＥＭで培養した。その結果を以下に記載する：細胞内ウイルスの感染価は培養２日目が最も高く１.３×１０８ＰＦＵ/ｍｌ、細胞外ウイルスは培養３日目が最も高く４.０×１０８ＰＦＵ/ｍｌであった。ＥＬＩＳＡ抗原価は細胞外ウイルスは培養４日目が最も高く６７単位、細胞内ウイルスは培養３日目が最も高く２６単位であった。細胞外ウイルスのＨＡ価は培養３日目で３２０であり、細胞内ウイルスは４０であった。
【００５１】
（実験例９）
株の遺伝学的安定性：マウス由来ウイルス（ＪＷＳ−Ｐ−４）をＶｅｒｏ細胞で２代継代することにより調製したマスターシード（ＪＭＳＶ００１）を、さらにＶｅｒｏ細胞で７代連続継代しても、コア、pre-M、およびエンベロープの各タンパク質の遺伝子の塩基配列に変異は見られず、マスターシードは遺伝学的に安定であった。また、これ等の遺伝子がコードするアミノ酸配列はＪＷＳ−Ｐ−４のそれと同一であった。なお、遺伝子解析は、参考例１に記載の方法で行った。
【００５２】
（実施例１）
試作ワクチンの調製：Ｃｙｔｏｄｅｘ １を用いて培養したＶｅｒｏ−Ａ細胞に、マウス由来ウイルス（ＪＷＳ−Ｐ−４）をＶｅｒｏ−Ａにおいて４代継代した北京株を、ＭＯＩが０.１になるように接種し、ウシ血清を含まないＭＥＭで３７℃にて４日間、培養した。培養上清（すなわち、細胞外ウイルス）を採取し、分画分子量が１００ｋＤａの限外濾過膜で１/１０量に濃縮した後、最終濃度１/１５００（Ｖ/Ｖ）量のホルマリンを添加混合し、ウイルスを不活化した。不活化条件は、４℃で５０日間であった。次に、不活化ウイルス浮遊液を、蔗糖密度勾配ゾーナル超遠心に２回かけ、ウイルスを精製した。２回超遠心の条件は共に、Ｐ３５ＺＴローター（日製産業社製）を用いる２５〜５０％（Ｗ/Ｗ）蔗糖密度勾配、３０,０００ｒｐｍ、１３時間であった。これよりウイルス画分（蔗糖密度４１％）を採取し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）透析の後、これをワクチン原液とした。この原液について、前記の「生物学的製剤基準」に準拠して安全性および有効性に関する各種試験を行い、ワクチンとしての適格性を確認した。次いで、この原液のタンパク質含量が７.８μｇ/ｍｌになるよう１９９培地（TC Medium 199: Difco Laboratories, USA）で希釈調整し、これを３ｍｌ容のバイアル瓶に１ｍｌずつ分注の後、各瓶を密栓し、試作ワクチンとした。タンパク質含量は、前述の「生物学的製剤基準」に規定の一般試験法（加熱トリクロル酢酸（ＴＣＡ）により沈殿するタンパク質をローリー法で定量する）に準拠して測定した。
【００５３】
（実施例２）
試作ワクチンの主な工程時の性状：実施例１に記載の試作ワクチンの主な製造工程の各々を終了した時点で採取した各検体について、実験例１に記載の各種試験を行った。その結果を以下に示す：ウイルスの培養上清、即ち、ウイルス浮遊液の感染価は２.２×１０８ＰＦＵ/ｍｌ、ＥＬＩＳＡ抗原価は７０単位、ＨＡ価は１６０であった。該ウイルス浮遊液を限外濾過膜を用いて１/１０容に濃縮したときの感染価および抗原量は共に１０倍高い値を示した。ゾーナル超遠心１回後のウイルス抗原について、蔗糖濃度４１％および３４％の２つの画分にその極大値が見られた。電子顕微鏡観察によれば、４１％の画分はウイルス粒子であり、３４％の画分はウイルス抗原活性を有するウイルス粒子より微細な粒子であった。また、細胞培養からの持ち込みウシ血清抗原は、蔗糖濃度２８％以下の画分に検出され、ウイルス粒子画分から分離された。上記のウイルス粒子画分を再度、ゾーナル超遠心により精製したウイルス粒子は、蔗糖濃度４０％の画分に単一性のピークとして確認された。この画分から試作ワクチンを調製した。試作ワクチンのＥＬＩＳＡ抗原価は４５単位、タンパク質含量は７.８μｇ/ｍｌであった。
【００５４】
（実施例３）
試作ワクチンの電子顕微鏡観察：試作ワクチンおよびマウス脳由来の市販ワクチンの両者について、前述の電子顕微鏡解析を行った（図１）。その結果、ウイルス粒子表面またはエンベローブ層の外観に関し、市販ワクチン中のＭＢ粒子が滑らかであるのに対し（図１Ｂ）、この発明に係る試作ワクチン中のＲ粒子は粗いか若しくは毛羽立っていた（図１Ａ）。
【００５５】
（実施例４）
中和反応に基づく試作ワクチンの力価：実施例１で得た試作ワクチン、マウス脳由来の市販ワクチン、および力価試験用参照ワクチンの３種類の各ワクチン（いずれも有効成分として不活化された北京株ウイルスを含有）の力価を、前述の「力価試験」により測定した。即ち、各ワクチンをＰＢＳで２倍階段希釈し、これ等をそれぞれ用いてマウスを免疫し、得られた各血清の北京株ウイルスに対する中和抗体価を比較した。ワクチンの希釈倍数と、中和抗体価の常用対数値との関係を表２に示す。
【００５６】
試作および市販の両ワクチン（同等タンパク質含量）を免疫することにより得られる抗血清中の中和抗体価の常用対数値の差は、ワクチンの希釈倍数８〜３２について、０.３８〜１.１１であった。即ち、試作ワクチン免疫原で得られる中和抗体価は、市販ワクチン免疫原によるそれの約２倍〜約１０倍であった。更に、これ等の測定値を平行線検定法に基づき推計した結果、試作ワクチン/市販ワクチンの力価、中和抗体価の算出倍率は約３倍であった。
【００５７】
【表２】
（実施例５）
交差中和反応に基づく試作ワクチン間の免疫原性の相違：Ｖｅｒｏ−Ａ細胞で４代継代した北京株、およびＶｅｒｏ−Ａ細胞で２代継代した、タイ国由来のＴｈＣＭＡｒ６７/９3およびＴｈＣＭＡｒ４４/９２の３株をそれぞれシードウイルスに用い、実施例１の記載と同様にして各株の不活化ウイルスを有効成分として含有する試作ワクチンを調製した。これら各ワクチンを免疫してマウスで得られる抗血清の中和抗体価を実施例４の記載と同様にして測定比較し、株間の交差反応性を解析した。比較対照として、北京株および中山株の各不活化ウイルスを有効成分として含有するマウス脳由来の市販ワクチン、および参照ワクチンとしてＴＣＡタンパク質含量が５.４μｇ/ｍｌのマウス脳由来ワクチン（北京株）を用いた。マウス免疫では、試作および市販の合計５種の各ワクチンのＴＣＡタンパク質含量が７.５μｇ/ｍｌになるよう調整の後、ＰＢＳで１６倍希釈した。中和試験における攻撃ウイルスには、前記４株ウイルス、即ち、北京株、中山株、ＴｈＣＭＡｒ６７/９３、およびＴｈＣＭＡｒ４４/９２の各ウイルスを用いた。結果を表３に示す。交差反応スペクトルの観点から、北京株およびＴｈＣＭＡｒ６７/９３株の両ウイルス抗原が、不活化日本脳炎ワクチンの免疫原として優れていた。
【００５８】
【表３】
（実施例６）
試作２価ワクチンの調製：北京株およびＴｈＣＭＡｒ６７/９３株の各ワクチン原液を、実施例１の記載と同様に調製後、これ等の原液の各タンパク質含量が１０μｇ/ｍｇになるようＰＢＳで希釈調整した。次いで両者を等量混合し、バイアル瓶に分注して、２価ワクチンを得た。この２価ワクチンは、それぞれの１価ワクチン単独よりさらに広い交差反応スペクトルを有した。
【００５９】
（実施例７）
診断剤の調製：実施例１で調製した北京株ワクチン原液中のＲ粒子を診断用抗原として使用し、その有効性を前述の「ウイルス抗原量の測定」と同様のＥＬＩＳＡにより検定した。比較対照抗原として市販の北京株ワクチン中のＭＢ粒子を用いた。抗体として、モノクローナル抗体５０３（ＭＡｂ５０３：全ての日本脳炎ウイルスに共通かつ特異的な中和エピトープに対する抗体）、ＭＡｂ３０２（日本脳炎ウイルス群に特異的なエピトープに対する抗体）、およびポリクローナル抗体（ＰＡｂ：マウスの過免疫血清）を用いた。抗原量を一定（タンパク量７.６μｇ/ｍｌ）に保ち、抗体を階段希釈しＥＬＩＳＡ価をそれぞれ測定した。（Ｒ粒子のＥＬＩＳＡ価/ＭＢ粒子のＥＬＩＳＡ価）は、Ｍａｂ５０３では、５３/４７、Ｍａｂ３０２では２２６/２２、およびＰＡｂでは１２０/５２であった。この結果に基づき、Ｍａｂ３０２およびＰＡｂに対するＲ粒子の感度は、ＭＢ粒子のそれに比べ、約２〜約１０倍高いと判断された。Ｍａｂ３０２についての結果から、本発明の抗原は、日本脳炎ウイルス群の予備的検出用の抗原として有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明では、飼育管理が繁雑かつ微妙な上に高価なマウスの代わりに、取扱いが容易かつ低廉な細胞株を用い、ウイルス粒子が量産される。従って、多数のマウスを犠牲にしないので、動物愛護の観点から望ましい。また、経済的には、生産コストが大幅に低減されるばかりなく、バイオハザード対策、製造に係る作業手順、精製工程、品質管理、製造計画等が著しく省力化される。特に、従来の不活化ワクチンに比べ、約２倍〜約１０倍の力価を発揮する、増強免疫原として新規なウイルス粒子、およびその製造方法が提供される。特に、この発明により、不活化日本脳炎ワクチン用の免疫原あるいは診断剤用の抗原として卓抜した免疫原性あるいは抗原性を有する新規な日本脳炎ウイルス粒子およびその製造方法が提供される。従って、この発明は、低廉でしかも優れた品質のワクチンや診断剤の提供を可能にし、日本脳炎ウイルス群感染症の予防および診断の全世界にわたる飛躍的な普及および向上をもたらす。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、フラビウイルス属の日本脳炎ウイルス群による感染症に対する不活化ワクチンおよび診断剤、特に、その有効成分として優れて有用な増強免疫原あるいは抗原およびその製造方法、並びに不活化日本脳炎ワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
日本脳炎ウイルス群による感染症の代表例として、以下、日本脳炎を挙げ、そのワクチンにつき説明する。最初の日本脳炎ワクチンは、１９５４年に実用化された。このワクチンは、マウス脳内で培養したウイルスから調製した抗原を有効成分とし、その精製度は低く、不純物が多いため、アレルギー性の中枢神経障害を誘発する危険性があった。その後、改良され、アルコール沈殿、硫酸プロタミン処理、および超遠心法等の組合せによる高度精製ワクチンが１９６５年に実用化され、品質が著しく向上した。そして、かかるワクチンおよびその製造技術が踏襲され現在に至っている（非特許文献１）。一方、マウス脳を使用しない不活化ワクチンの開発も試行された。即ち、１９６５年に日本脳炎ワクチン研究会が結成され、初代細胞培養による組織培養ワクチンが開発された。しかし、不活化ワクチン抗原の量産に要する膨大な量の初代細胞培養の確保が製造コストの点で実用上不可能であったので、このワクチンは実用化に至らなかった。これは、その当時、ワクチン製造用の認可細胞が初代培養細胞に限定され、継代細胞株の使用が危険視かつ否認されていたためである。組織培養の日本脳炎生ワクチンに関しては、中国で初代ハムスター腎細胞培養で増殖させた弱毒ウイルスを有効成分として用いる生ワクチンが１９９４年頃に実用化されている。しかし、中国以外の諸外国では、有効性および安全性が未確認であり、その使用は知られていない。更に、１９８６年頃から組換え遺伝子技術を駆使した日本脳炎ワクチン、例えば、エンベロープ（Ｅ）タンパク抗原、組換えウイルス等を用いる第二世代ワクチンが多種多様に報告されている。しかし、これ等のワクチンはいずれも、実験あるいは前臨床試験の段階にあり、未だ実用化されていない（非特許文献２）。
【０００３】
不活化ワクチン用の抗原あるいは免疫原の量産に細胞株を用いる技術としては、例えば、ポリオ（特許文献１）、狂犬病（特許文献２）、Ａ型肝炎（特許文献３）、ダニ媒介脳炎（特許文献４）等の各ウイルス抗原の量産におけるＶｅｒｏ細胞の使用が公知である。これ等のうち、前２者の実用化はそれぞれ衆知であるが、後２者については、量産された各抗原のワクチンとしての安全性および有効性の確認、並びに実用化は知られていない。
【０００４】
従来の日本脳炎ワクチンの有効成分は、マウス脳内で増殖させた日本脳炎ウイルスの不活化粒子である。かかるワクチン用抗原の量産には、膨大な数のマウスおよび感染動物のバイオハザード対策等を要するので、生産コストが非常に高くつく。また、製品中へのマウス脳の有害成分、例えば、脱髄を生じる塩基性タンパクの混入や、マウス由来ウイルスの迷入等の危険性を常に伴うため、精製工程および品質管理は複雑多岐にわたる。その上、最近では製造用マウスの入手が困難となり、計画的なワクチン製造に支障が生じていた。更に、マウスを犠牲にする従来技術は、動物愛護や宗教の観点から望まれなくなっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第4,525,349号明細書
【特許文献２】米国特許第4,664,912号明細書
【特許文献３】米国特許第4,783,407号明細書
【特許文献４】米国特許第5,719,051号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Vaccine Handbook", pp. 103-113, Researcher's Associates, National Institute of Health (Japan), Maruzen (Tokyo) 1996
【非特許文献２】“Vaccine”, 2nd ed., pp. 671-713, S.A.PlotokinおよびE.A.Mortimer著, W.B.Sauders Co. 1994；The Jordan Report, pp. 26-27, 1998
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の開示
この発明では、前記課題の解決のために、マウスの代わりに細胞株を用いてウイルス粒子を量産する。これにより、生産コストが大幅に低減されるだけではなく、バイオハザード対策、製造作業手順、精製工程、品質管理、製造計画等が省力化される。特筆すべきは、本発明が新規なウイルス粒子についての予測困難な驚くべき発見に基づいていることである。この発明により、従来の不活化ワクチンの免疫原に比べ、中和抗体価で表される力価が２倍〜１０倍増強された免疫原としての新規な不活化ウイルス粒子およびその製造方法が提供される。即ち、日本脳炎ウイルス群の感染症に対する不活化ワクチン、特に、不活化日本脳炎ワクチンの免疫原として、あるいは診断剤の抗原として、卓抜した免疫原性あるいは抗原性を有する新規な日本脳炎ウイルス粒子およびその製造方法が提供される。かかる粒子は、技術的には、日本脳炎ウイルス群に属するウイルス、例えば、日本脳炎ウイルスを細胞株で培養する工程および/またはその後の濃縮、精製、および不活化を含む一連の工程下で生成されるが、その純科学的な生成機構は未だ定かでない。以上に基づき、この発明により、次の（１）〜（１０）が提供される：
【０００８】
（１）日本脳炎ウイルス群に属するウイルスの感染細胞培養物から調製された不活化ウイルス粒子であって、該ウイルス粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価が、マウス脳内で培養されたウイルスから調製された不活化ウイルス粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価の２倍〜１０倍である、増強免疫原としての不活化ウイルス粒子。
【０００９】
（２）日本脳炎ウイルス群に属するウイルスを細胞株で培養する工程、ならびに細胞培養物を不活化および精製する工程を含む、不活化ウイルス粒子の製造方法。
【００１０】
（３）細胞株がＶｅｒｏ細胞である、上記２に記載の製造方法。
【００１１】
（４）不活化が精製の前に行われる、上記２または３に記載の製造方法。
【００１２】
（５）不活化が約４℃〜約１０℃で行われる、上記２〜４のいずれかに記載の製造方法。
【００１３】
（６）精製が、物理的方法により行われる、上記２〜５のいずれかに記載の製造方法。
【００１４】
（７）日本脳炎ウイルス群に属するウイルスが日本脳炎ウイルスの北京株またはＴｈＣＭＡｒ６７/９３株である上記２〜６のいずれかに記載の製造方法。
【００１５】
（８）上記２〜７のいずれかに記載の製造方法によって製造される、不活化ウイルス粒子。
【００１６】
（９）上記１または８に記載の不活化ウイルス粒子を含有する不活化ワクチン。
【００１７】
（１０）上記８に記載の不活化ウイルス粒子の全部または一部を抗原として含む、日本脳炎ウイルス群感染症の診断剤。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、北京株についての試作ワクチンに含まれる本発明のウイルス粒子（Ｒ粒子；Ａ）およびマウス脳由来の市販ワクチンに含まれる従来技術のウイルス粒子（ＭＢ粒子；Ｂ）の電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明を実施するための最良の形態
この発明の実施形態の特徴は、代表例としての従来の日本脳炎ワクチンの免疫原と本発明のそれとの間の物質および製造の両側面の比較において顕現される。これを考慮し、以下、上記両者の免疫原性および形態の相違、免疫原としてのウイルス粒子、ウイルス培養の宿主、ウイルスの精製、ウイルスの不活化、力価試験、および電子顕微鏡解析の順に説明する。
【００２０】
従来の日本脳炎ワクチンの免疫原：これは、現在市販の不活化日本脳炎ワクチンの有効成分（免疫原）を意味する。この免疫原は、薬事法（昭和３５年法律第１４５号）第４２条第１項の規定に基づく厚生省告示第２１７号「生物学的製剤基準」（英語版：Minimum Requirements for Biological Products, Association of Biologicals Manufacturers of Japan, 1986）に定める「日本脳炎ワクチン」または「乾燥日本脳炎ワクチン」の規程に準拠して製造され、かつ、安全性・有効性等に係る種々の試験を行い、その適格性が確認されたものである。このワクチンの有効成分すなわち免疫原は、日本脳炎ワクチン製造用株ウイルスをマウス脳内に接種して増殖・量産させた後、それに伴う発症マウス脳の磨砕物を出発材料とする。この材料を高度精製すると共に、不活化剤で不活化して得られる日本脳炎ウイルス粒子、即ち、マウス脳（ＭＢ）に由来の不活化ウイルス粒子が免疫原として用いられる。以下、これを「ＭＢ粒子」または「ＭＢ免疫原」と略記する。
【００２１】
本発明に係る日本脳炎ワクチンの免疫原：これは、不活化日本脳炎ワクチンの有効成分（免疫原）であって、日本脳炎ウイルスの培養宿主として細胞株の培養細胞を用いること以外は、前述の日本脳炎ワクチンの規程に準拠して製造され、かつ、種々の品質管理試験を行い、その適格性が確認されたものを意味する。したがって、この免疫原は、日本脳炎ウイルスを細胞株の培養細胞に接種して増殖させ量産した後、その細胞培養物を出発材料とする。この材料を高度精製すると共に、不活化剤で不活化することにより調製された日本脳炎ウイルス粒子、即ち、組織培養に由来の不活化ウイルス粒子が免疫原として用いられる。この免疫原は、次の（１）に示す特徴を有し、さらに、通常、次の（２）に示す主な特徴をも併せて有する：
（１）上記粒子で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価が、後述する力価試験により測定される場合、従来のＭＢ粒子またはＭＢ免疫原で免疫して得られる抗血清中の中和抗体価の約２倍〜約１０倍である（以下、これを「増強免疫原」と呼び、「Ｒ粒子」または「Ｒ免疫原」と略記する）；および
（２）電子顕微鏡解析に基づく粒子構造、特に、粒子表面またはエンベロープ層の外観が、ＭＢ粒子が滑らかであるのに対し、Ｒ粒子は粗いか若しくは毛羽立っている。
【００２２】
以上の日本脳炎ワクチンの免疫原の説明は、本発明に係る日本脳炎ウイルス群により生じる感染症に対するワクチン用の免疫原の代表例として記載されたものである。本発明に係るワクチン、例えば、日本脳炎ワクチンは、液状または乾燥の形態で、密栓したバイアル瓶ないしは熔封したアンプルに入れて提供される。液状製剤はそのまま、乾燥製剤は溶解液で液状にもどした後、これを、例えば、ワクチン被接種者一人当たり０.２ｍｌ〜１.０ｍｌずつ、皮下接種することにより使用される。
【００２３】
免疫原としてのウイルス：この発明に係る日本脳炎ウイルス群には、例えば、日本脳炎、クンジン、マレーバレー脳炎、セントルイス脳炎、ウェストナイル等のウイルスが含まれ、その詳細は、Archives of Virology, Supplement 10, pp. 415-427, 1995 (”Virus Taxonomy”, Classification and Nomenclature of Viruses; Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses）に記載の通りである。これ等のうち、日本脳炎ウイルスについては、例えば、マウス脳由来の北京−１株、この株を本発明者らが更にマウス脳内で継代することにより得たＪＷＳ−Ｐ−４（Ａｍ２９Ｓｍ１Ａｍ５；すなわち、成熟マウス（Ａｍ）において２９代、次いでは乳のみマウス（Ｓｍ）において１代、さらにＡｍにおいて５代継代して得られた株を意味する）、ＪＷＳ−Ｐ−４を更にＶｅｒｏ細胞で２代継代して得たマスターシードＪＭＳＶ００１（北京−１株、ＪＷＳ−Ｐ−４、およびＪＭＳＶ００１を以下「北京株」という）、中山−予研株（以下「中山株」という）、ＪａＯＡｒＳ９８２株、ＪａＯＨ０５６６株、また、９０年代に五十嵐らが新たに分離したＴｈＣＭＡｒ６７/９３およびＴｈＣＭＡｒ４４/９２両株（Aliら、Archives of Virology, 140, 1557-1575, 1995、ならびにAliおよびIgarashi、Microbiology and Immunology, 41, 241-252, 1977）等々を用いることができる。
【００２４】
この発明において、免疫原として使用する日本脳炎ウイルス株としては、北京株およびＴｈＣＭＡｒ６７/９３が特に好ましい。これらのウイルス株を用いると、抗原スペクトルの広いワクチン、即ち、ワクチン製造に用いたウイルス株以外の複数の株に対しても極めて良好な防御作用を有するワクチンを得ることができる。北京株はＪＭＳＶ００１が好ましい。
【００２５】
この発明において、２種類のウイルス株、例えば、北京株およびＴｈＣＭＡｒ６７/９３株から製造されるワクチンを混合することにより２価ワクチンを調製してもよい。混合比は、例えば、抗原タンパク量として、０.５：１〜１：０.５が好ましい。かかる混合により、従来の１価ワクチン単独に比べ、感染防御の抗原スペクトルが更に広いワクチンを得ることができる。
【００２６】
ウイルス培養は、宿主として適切な細胞株の培養細胞にウイルスを接種した後、感染細胞を維持培養することにより行う。培養方法は後述の細胞培養と同じである。以下、便宜的に、ウイルス培養物を低速遠心した上清を「細胞外ウイルス」と呼び、一方、遠心ペレットから集めた感染細胞を０.２％（Ｗ/Ｖ）ウシ血清アルブミン添加イーグル最少必須培地（ＭＥＭ）で元の体積に浮遊させて超音波処理した後、これを再度、低速遠心した上清を「細胞内ウイルス」と称する。細胞外ウイルスおよび細胞内ウイルスのいずれからも本発明の不活化ウイルス粒子を得ることができる。細胞外ウイルスが好ましい。その理由は、ウイルス粒子の収率が高く、しかも、成熟粒子であり、さらに細胞内ウイルスに比べ、細胞由来成分の取り込みが少ないので、精製が容易だからである。
【００２７】
ウイルス培養の宿主：ウイルス培養の宿主として既知の細胞株、例えば、二倍体細胞株であるＷＩ−３８、ＭＲＣ−５、ＦＲｈＬ−２等、また、連続継代細胞株であるＶｅｒｏ、ＢＨＫ−２１、ＣＨＯ等が使用できる。連続継代細胞が好ましい。その理由は、細胞の量産が容易かつ計画的に行えると共に、細胞の性状が明らかにされており、迷入ウイルスの存在が否定されているからである。更に、常用のＣＶ−１、ＢＳＣ−１、ＭＡ１０４、ＭＤＣＫ、ＣａＣ０−２等、ならびにウイルスワクチンの製造に従来から用いられているＤＢＳ−ＦＬＣ−１、ＤＢＳ−ＦＬＣ−２、ＤＢＳ−ＦＲｈＬ−２、ＥＳＫ−４、ＨＥＬ、ＩＭＲ−９０、ＷＲＬ６８等も使用できる（“ATCC Microbes & Cells at Work”,2nd ed., pp. 144, American Type Culture Collection (ATCC) 1991, USA）。前述の日本脳炎ウイルス株の培養宿主には、このウイルスの増殖が良好な許容細胞を選別して採用することが望ましい。例えば、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）、ＢＨＫ−２１［Ｃ−１３］（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１０）、Ｃ６/３６（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６６０）等の細胞の使用が好ましい。これ等の細胞株の使用に際しては、世界保健機構（ＷＨＯ）が勧告する生物学的製剤の製造用細胞に関する基準（Requirements for Biological Substances No. 50）に準拠して迷入因子および腫瘍原性等に関する種々の試験を行い、ワクチン製造用細胞としての適格性を確認する必要がある(WHO Technical Report Series, No. 878, pp.19-52,1998）。
【００２８】
細胞培養：上記細胞株の培養方法には、静置培養、灌流システム培養、振盪培養、ローラーチューブ培養、ローラーボトル培養、浮遊培養、マイクロキャリアー培養等を採用できる。例えば、細胞のマイクロキャリアーとして市販の種々の規格のＣｙｔｏｄｅｘ［ファルマシアバイオテク社（スウェーデン）製］を用い、市販の種々の動物細胞培養装置により行うことができる。
【００２９】
ウイルスの不活化：ホルマリン、β−プロピオラクトン、グルタルジアルデヒド等の不活化剤を、ウイルス浮遊液に添加混合し、ウイルスと反応させて不活化する。例えば、ホルマリンを使用の場合、その添加量は約０.００５％〜約０.１％（Ｖ/Ｖ）、不活化温度は約４℃〜約３８℃、不活化時間は主に不活化温度に依存し、例えば、３８℃では約５時間〜約１８０時間、４℃では約２０日〜約９０日である。
【００３０】
ウイルスの精製：精製方法には、物理学的方法および化学的方法がある。物理的方法とは、精製対象物の大きさ、密度、沈降係数などの物理的性質を利用する精製方法であって、例えば、ゾーナル超遠心、密度勾配遠心、濾過等を包含する。物理的方法は、通常、ｐＨ、塩濃度などの周囲環境を変化させることなく行うことができる。化学的方法とは、化学ないし物理化学反応による吸脱着を利用する精製方法であって、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトクロマトグラフィー、塩析等を包含する。かかる操作は、約４℃〜室温で行う。
【００３１】
ウイルスの濃縮：不活化および/または精製に先だって、低速遠心、限外濾過膜による濃縮を行ってもよい。
【００３２】
この発明によれば、Ｒ粒子の不活化は、約４℃〜約１０℃で、その精製前に行うことが望ましい。また、精製工程では、物理的方法の採用が望ましい。これにより、精製後に不活化した粒子あるいは化学的方法により精製された粒子に比べ、より高い免疫原性ないしは抗原性を確保することができる。
【００３３】
電子顕微鏡解析：例えば、２％(Ｗ/Ｖ）酢酸ウラニルを用いるネガティブ染色法により調製したウイルス標本を、電子顕微鏡（株式会社日立製作所製）で観察できる。ウイルス粒子の形状等を、写真撮影により得られる２万〜１０万倍に拡大したウイルス粒子画像について解析できる。
【００３４】
ワクチンの調製：本発明の不活化ウイルス粒子を、所望の力価を与えるように、適切な希釈剤で希釈することができる。公知の担体またはアジュバントをワクチンに添加しても良い。ワクチンはまた、必要に応じて、防腐剤、安定剤などを含み得る。
【００３５】
力価試験：前述「生物学的製剤基準」に定める「日本脳炎ワクチン」に規定の「力価試験」に準拠して行う。例えば、４週齢のｄｄＹマウスを各群１５匹ずつ使用し、２倍階段希釈した各ワクチンを０.５ｍｌ/マウス、腹腔内に接種した後、その７日目に第２回接種を行い追加免疫する。第２回接種後、７日目に各マウスから個体別に採血して血清を分離した後、各群ごとにマウス血清を等量プールし、５６℃にて３０分間の非働化を行い、これを免疫血清として中和試験に供する。中和試験にはウイルス培養宿主としてニワトリ胚細胞培養を使用し、攻撃ウイルスには、ワクチン抗原あるいは免疫原に用いたウイルス、例えば、北京株、中山株、ＴｈＣＭＡｒ６７/９３株等を使用できる。中和抗体価は、攻撃ウイルスが形成するプラーク数を５０％減少させる上記免疫血清の最高希釈倍数を以て表わす。
【００３６】
別の局面において、この発明により得られるウイルス粒子（Ｒ粒子）は、診断用抗原、例えば、免疫沈降法、ＨＩ試験、ＣＦ反応、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法等の抗原として使用できる。かかる診断用抗原としての該Ｒ粒子の特徴は、ポリクローナル抗体および特定のモノクローナル抗体と反応する粒子あたりの感度が、ＭＢ粒子のそれに比べ、約２〜１０倍高いことにある。すなわち、本発明の不活化ウイルス粒子の全部または一部を用いると、日本脳炎ウイルス群の感染、特に日本脳炎ウイルスの感染を検出する高感度の診断剤が可能になる。ここで、不活化ウイルス粒子の「一部」とは、ウイルス粒子に由来する所望の抗原性を保持するウイルス粒子の画分である。これには、例えば、下記実施例１に記載の精製工程下で可溶化されたウイルスの構造タンパク質が含まれる。
【実施例】
【００３７】
以下、この発明の態様並びに構成および効果を実験例および実施例によって示し、具体的に説明する。但し、この発明は、これ等に限定されるものではない。
【００３８】
（参考例）
北京およびＴｈＣＭＡｒ６７/９３両株の遺伝子配列表：この発明での使用に特に適切な日本脳炎ウイルス北京株およびＴｈＣＭＡｒ６７/９３株の同定を容易にするため、これ等の両株のゲノムＲＮＡに相補的なエンベロープタンパク遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列と、それがコードする推定アミノ酸配列とを配列番号１〜４に示す。配列番号１および２はＴｈＣＭＡｒ６７/９３株（Archives of Virology, 140, 1557-1575, 1995）、配列番号３および４は北京株であるマスターシードウイルスＪＭＳＶ００１に関する。以下の実施例における「北京株」は、このＪＭＳＶ００１である。
【００３９】
ｃＤＮＡの塩基配列の決定は、上記Aliらの文献（1995）に記載の方法で行った。すなわち、Ｖｅｒｏ細胞によるウイルス培養物から、そのゲノムＲＮＡを抽出の後、エンベロープタンパクをコードする領域を、プライマーを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）で増幅し、得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシチェーンターミネーション法により決定した。また、塩基配列がコードするアミノ酸配列は、ユニバーサルコードにより解読した。
【００４０】
（実験例１）
ウイルス感染価の測定：後述のＶｅｒｏ−Ｍ細胞を用いるプラーク法により、ウイルス感染価ＰＦＵ（プラーク形成単位）/ｍｌで計数した。
【００４１】
ウイルス抗原量の測定：日本脳炎ウイルス抗原量は、抗日本脳炎ウイルスモノクローナル抗体［Ｇｒｏｕｐ−８ Ｃｌｏｎｅ ５０３（東京都神経科学総合研究所保井博士から分与：K. Yasuiら、Journal of General Virology, 67, 2663-2672, 1986）］ＩｇＧを用いるＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡ値は、マウス脳由来自家標準品（北京株）を１００単位とし、その相対値を平行線検定法により算出した。
【００４２】
ＨＡ試験：試験にはＵ型マイクロプレートを使用した。至適ｐＨに調整したリン酸緩衝液による０.３３％（Ｖ/Ｖ）ガチョウ赤血球浮遊液とウイルス液とを等量混合の後、３７℃で６０分間、反応させ、赤血球凝集の有無を判定した。ＨＡ価は、赤血球凝集が陽性であるウイルス液の最高希釈倍数で表わした。
【００４３】
ウシ血清抗原量の測定：抗ウシ血清ヤギＩｇＧを用いるＥＬＩＳＡにより測定した。ウシ血清標準抗原におけるタンパク質含量に対する相対値を平行線検定法により算出し、その値を抗原量とした。
【００４４】
（実験例２）
ウイルス培養用の細胞株の増殖性：付着性の２系統のＶｅｒｏ細胞、Ｖｅｒｏ−Ａ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１に由来）およびＶｅｒｏ−Ｍ（国立感染症研究所から入手したＶｅｒｏに由来）、３系統のＢＨＫ−２１細胞、ＢＨＫ/ＷＩ２（大阪府立公衆衛生研究所から入手した付着性ＢＨＫ−２１に由来）、ＢＨＫ/ＪＨＩＨ（国立家畜衛生試験場から入手した浮遊性ＢＨＫ−２１に由来）およびＢＨＫ−２１［Ｃ−１３］（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１０に由来）、並びに蚊由来のＣ６/３６細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６６０に由来）をウイルス培養用の候補細胞株とし、これ等の各細胞株の増殖性を観察した。２系統のＶｅｒｏ、およびにＢＨＫ/ＷＩ２およびＢＨＫ−２１［Ｃ１３］は、各々１.５×１０５細胞/ｍｌになるよう増殖培地で調製し、これを３７℃で３日間、静置培養した後、それぞれ細胞数を計測した。上記と同様にして、浮遊性ＢＨＫ/ＪＮＩＨでは２.０×１０５細胞/ｍｌを調製し、これを３７℃で３日間、振盪培養の後、また、Ｃ６/３６では１.０×１０５細胞/ｍｌを調製し、これを２８℃で７日間静置培養の後、各々細胞数を計測した。尚、増殖培地には、最終濃度８％（Ｖ/Ｖ）ウシ血清を添加混合したＭＥＭを用いた。その結果、２系統のＶｅｒｏ、並びにＢＨＫ/ＷＩ２およびＢＨＫ−２１［Ｃ１３］は７.０〜９.０×１０５細胞/ｍｌ、浮遊性ＢＨＫ/ＡＮＩＨおよびＣ６/３６は、２.８×１０６細胞/ｍｌであった。
【００４５】
（実験例３）
候補細胞株における日本脳炎ウイルスの増殖性：実験例２で用いた候補細胞株につき、Ｃ６/３６細胞は２８℃で７日間、それ以外の細胞は３７℃で３日間培養の後、各細胞に北京株を感染多重度（ＭＯＩ）が０.１になるよう接種し、細胞外ウイルス量の経時的変移を、ウイルス感染価（ＰＦＵ）、ウイルス抗原量（ＥＬＩＳＡ価）およびＨＡ価で測定し比較した。その結果を表１に示す。数値は、２回実験した各細胞株でのウイルス増殖曲線における最高値の平均値であり、Ｃ６/３７では、ウイルス感染価は培養３日目に、ＥＬＩＳＡ価およびＨＡ価は共に、培養４日目に各々最高値であった。その他の細胞株では、ウイルス感染価は培養２日目に、ＥＬＩＳＡ価およびＨＡ価は培養３日目または４日目に各々最高値であった。
【００４６】
【表１】
（実験例４）
Ｃｙｔｏｄｅｘの種類およびＶｅｒｏ−Ａ細胞の増殖性：１.５×１０５細胞/ｍｌのＶｅｒｏ−Ａ細胞浮遊液を５００ｍｌずつ入れた細胞培養用フラスコ３本の各々に、Ｃｙｔｏｄｅｘ １、２または３のいずれか１種を１.５ｇ/Ｌになるように添加の後、３７℃にて回転数４０ｒｐｍによる攪拌下で７日間、培養した。その結果を以下に記載する：培養７日目の細胞数/ｍｌは、Ｃｙｔｏｄｅｘ １、２、および３について、それぞれ７.５×１０５、８.３×１０５、および９.４×１０５であった。また、Ｃｙｔｏｄｅｘ １での７日間培養により、全てのビーズの表面に１００個以上のＶｅｒｏ−Ａ細胞が隙間なく付着し増殖した。
【００４７】
（実験例５）
Ｃｙｔｏｄｅｘの濃度およびＶｅｒｏ−Ａ細胞の増殖性：１.５×１０５細胞/ｍｌの細胞浮遊液を５００ｍｌずつ入れた細胞培養用フラスコ４本（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）のうち、ＡおよびＢにはＣｙｔｏｄｅｘ １を各々１.５ｇ/Ｌ、Ｃには３.０ｇ/Ｌ、Ｄには４.５ｇ/Ｌになるようそれぞれ添加した後、３７℃にて回転数４０ｒｐｍによる攪拌下で７日間、培養し、細胞数および細胞が付着したビーズの割合（付着率）を計測した。付着率の算出には、２００個以上の各ビーズを観察し、５個以上の細胞が付着しているビーズを細胞付着ビーズとした。尚、Ｃｙｔｏｄｅｘ １を１.５ｇ/Ｌ添加したＡは、培養終了時まで同じ増殖培地で培養し、残りのＢ、ＣおよびＤの各フラスコについては、培養開始から３、４、および５日目の各日に、培養液の１/２量を新鮮な増殖培地と交換した。その結果を以下記載する：培養液の交換の有無（ＡおよびＢ）は細胞数には影響しなかった。７日間培養後の細胞数/ｍｌは、Ｂが９.１×１０５ 、Ｃが７.７×１０５ 、Ｄが８.０×１０５ であった。付着率は、ＡおよびＢが培養１日目から９８％以上で培養４日目には１００％に達し、培養１日目のＣは９３％、Ｄは８０％と低かった。しかし、培養６日目にはＡ、Ｂ、ＣおよびＤは共に１００％に達した。
【００４８】
（実験例６）
Ｃｙｔｏｄｅｘ １により高密度培養したＶｅｒｏ−Ａ細胞の増殖性：Ｃｙｔｏｄｅｘの濃度および細胞数をそれぞれ３倍にした高密度培養を行った。４.５×１０５細胞/ｍｌのＶｅｒｏ−Ａ細胞浮遊液に、Ｃｙｔｏｄｅｘ １を４.５ｇ/Ｌになるよう添加して、培養液量５０リットルの動物細胞培養装置を用いて培養した。回転数は最初の24時間が１５ｒｐｍ、それ以降は２０ｒｐｍ、ｐＨ７.０、溶存酸素を５ｐｐｍに設定した。培養３日目および５日目に培養液の１/２量を新鮮な増殖培地と交換した。その結果を以下に記載する：培養５日目の細胞数は２.０×１０６細胞/ｍｌ、７日目には２.６×１０６細胞/ｍｌであった。また。培養２日目における細胞のビーズへの付着率は１００％であった。
【００４９】
（実験例７）
ワクチン製造用ウイルス候補株のＶｅｒｏ−Ａ細胞における増殖性：シャーレで３日間静置培養したＶｅｒｏ−Ａに、マウス脳由来の日本脳炎ウイルスの上記候補株、北京株、中山株、ＪａＯＨ０５６６、およびＪａＯＡｒＳ９８２の４株をそれぞれＭＯＩが０.１になるように接種し、ウイルスを９０分間吸着後、２％（Ｖ/Ｖ）ウシ血清を含むＭＥＭを加え３７℃で７日間培養した。そして、細胞外および細胞内ウイルスの感染価および抗原量の経時的変移を観察した。その結果を以下に記載する：感染価について、中山株を除く３株の細胞外ウイルスは培養２日目の値が最も高く１.０×１０８ＰＦＵ/ｍｌ以上、細胞内ウイルスのそれは細胞外ウイルスの１/３以下であり、中山株の細胞外ウイルスのそれは、培養３日目が最高であったが、他の３株の値の１/５以下であった。ＥＬＩＳＡ抗原価に関し、中山株を除く３株の細胞外ウイルスのそれは培養３〜５日目が最も高く、いずれも約７０単位、細胞内ウイルスのそれは細胞外ウイルスの１/５以下であり、中山株では培養５〜７日目にプラトーとなり、３０単位であった。ＨＡ価は、培養２〜４日目の細胞外ウイルスにつき、中山株が１６０、他の３株は６４０〜１２８０であった。
【００５０】
（実験例８）
Ｃｙｔｏｄｅｘ １によるＶｅｒｏ−Ａ細胞培養での北京株の増殖：Ｃｙｔｏｄｅｘ １を用いて培養した２０リットルのＶｅｒｏ−Ａ細胞（１.９６×１０６細胞/ｍｌ）に、Ｖｅｒｏ−Ａで４代継代した北京株ウイルスをＭＯＩが０.１になるよう接種し、ウシ血清を含まないＭＥＭで培養した。その結果を以下に記載する：細胞内ウイルスの感染価は培養２日目が最も高く１.３×１０８ＰＦＵ/ｍｌ、細胞外ウイルスは培養３日目が最も高く４.０×１０８ＰＦＵ/ｍｌであった。ＥＬＩＳＡ抗原価は細胞外ウイルスは培養４日目が最も高く６７単位、細胞内ウイルスは培養３日目が最も高く２６単位であった。細胞外ウイルスのＨＡ価は培養３日目で３２０であり、細胞内ウイルスは４０であった。
【００５１】
（実験例９）
株の遺伝学的安定性：マウス由来ウイルス（ＪＷＳ−Ｐ−４）をＶｅｒｏ細胞で２代継代することにより調製したマスターシード（ＪＭＳＶ００１）を、さらにＶｅｒｏ細胞で７代連続継代しても、コア、pre-M、およびエンベロープの各タンパク質の遺伝子の塩基配列に変異は見られず、マスターシードは遺伝学的に安定であった。また、これ等の遺伝子がコードするアミノ酸配列はＪＷＳ−Ｐ−４のそれと同一であった。なお、遺伝子解析は、参考例１に記載の方法で行った。
【００５２】
（実施例１）
試作ワクチンの調製：Ｃｙｔｏｄｅｘ １を用いて培養したＶｅｒｏ−Ａ細胞に、マウス由来ウイルス（ＪＷＳ−Ｐ−４）をＶｅｒｏ−Ａにおいて４代継代した北京株を、ＭＯＩが０.１になるように接種し、ウシ血清を含まないＭＥＭで３７℃にて４日間、培養した。培養上清（すなわち、細胞外ウイルス）を採取し、分画分子量が１００ｋＤａの限外濾過膜で１/１０量に濃縮した後、最終濃度１/１５００（Ｖ/Ｖ）量のホルマリンを添加混合し、ウイルスを不活化した。不活化条件は、４℃で５０日間であった。次に、不活化ウイルス浮遊液を、蔗糖密度勾配ゾーナル超遠心に２回かけ、ウイルスを精製した。２回超遠心の条件は共に、Ｐ３５ＺＴローター（日製産業社製）を用いる２５〜５０％（Ｗ/Ｗ）蔗糖密度勾配、３０,０００ｒｐｍ、１３時間であった。これよりウイルス画分（蔗糖密度４１％）を採取し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）透析の後、これをワクチン原液とした。この原液について、前記の「生物学的製剤基準」に準拠して安全性および有効性に関する各種試験を行い、ワクチンとしての適格性を確認した。次いで、この原液のタンパク質含量が７.８μｇ/ｍｌになるよう１９９培地（TC Medium 199: Difco Laboratories, USA）で希釈調整し、これを３ｍｌ容のバイアル瓶に１ｍｌずつ分注の後、各瓶を密栓し、試作ワクチンとした。タンパク質含量は、前述の「生物学的製剤基準」に規定の一般試験法（加熱トリクロル酢酸（ＴＣＡ）により沈殿するタンパク質をローリー法で定量する）に準拠して測定した。
【００５３】
（実施例２）
試作ワクチンの主な工程時の性状：実施例１に記載の試作ワクチンの主な製造工程の各々を終了した時点で採取した各検体について、実験例１に記載の各種試験を行った。その結果を以下に示す：ウイルスの培養上清、即ち、ウイルス浮遊液の感染価は２.２×１０８ＰＦＵ/ｍｌ、ＥＬＩＳＡ抗原価は７０単位、ＨＡ価は１６０であった。該ウイルス浮遊液を限外濾過膜を用いて１/１０容に濃縮したときの感染価および抗原量は共に１０倍高い値を示した。ゾーナル超遠心１回後のウイルス抗原について、蔗糖濃度４１％および３４％の２つの画分にその極大値が見られた。電子顕微鏡観察によれば、４１％の画分はウイルス粒子であり、３４％の画分はウイルス抗原活性を有するウイルス粒子より微細な粒子であった。また、細胞培養からの持ち込みウシ血清抗原は、蔗糖濃度２８％以下の画分に検出され、ウイルス粒子画分から分離された。上記のウイルス粒子画分を再度、ゾーナル超遠心により精製したウイルス粒子は、蔗糖濃度４０％の画分に単一性のピークとして確認された。この画分から試作ワクチンを調製した。試作ワクチンのＥＬＩＳＡ抗原価は４５単位、タンパク質含量は７.８μｇ/ｍｌであった。
【００５４】
（実施例３）
試作ワクチンの電子顕微鏡観察：試作ワクチンおよびマウス脳由来の市販ワクチンの両者について、前述の電子顕微鏡解析を行った（図１）。その結果、ウイルス粒子表面またはエンベローブ層の外観に関し、市販ワクチン中のＭＢ粒子が滑らかであるのに対し（図１Ｂ）、この発明に係る試作ワクチン中のＲ粒子は粗いか若しくは毛羽立っていた（図１Ａ）。
【００５５】
（実施例４）
中和反応に基づく試作ワクチンの力価：実施例１で得た試作ワクチン、マウス脳由来の市販ワクチン、および力価試験用参照ワクチンの３種類の各ワクチン（いずれも有効成分として不活化された北京株ウイルスを含有）の力価を、前述の「力価試験」により測定した。即ち、各ワクチンをＰＢＳで２倍階段希釈し、これ等をそれぞれ用いてマウスを免疫し、得られた各血清の北京株ウイルスに対する中和抗体価を比較した。ワクチンの希釈倍数と、中和抗体価の常用対数値との関係を表２に示す。
【００５６】
試作および市販の両ワクチン（同等タンパク質含量）を免疫することにより得られる抗血清中の中和抗体価の常用対数値の差は、ワクチンの希釈倍数８〜３２について、０.３８〜１.１１であった。即ち、試作ワクチン免疫原で得られる中和抗体価は、市販ワクチン免疫原によるそれの約２倍〜約１０倍であった。更に、これ等の測定値を平行線検定法に基づき推計した結果、試作ワクチン/市販ワクチンの力価、中和抗体価の算出倍率は約３倍であった。
【００５７】
【表２】
（実施例５）
交差中和反応に基づく試作ワクチン間の免疫原性の相違：Ｖｅｒｏ−Ａ細胞で４代継代した北京株、およびＶｅｒｏ−Ａ細胞で２代継代した、タイ国由来のＴｈＣＭＡｒ６７/９3およびＴｈＣＭＡｒ４４/９２の３株をそれぞれシードウイルスに用い、実施例１の記載と同様にして各株の不活化ウイルスを有効成分として含有する試作ワクチンを調製した。これら各ワクチンを免疫してマウスで得られる抗血清の中和抗体価を実施例４の記載と同様にして測定比較し、株間の交差反応性を解析した。比較対照として、北京株および中山株の各不活化ウイルスを有効成分として含有するマウス脳由来の市販ワクチン、および参照ワクチンとしてＴＣＡタンパク質含量が５.４μｇ/ｍｌのマウス脳由来ワクチン（北京株）を用いた。マウス免疫では、試作および市販の合計５種の各ワクチンのＴＣＡタンパク質含量が７.５μｇ/ｍｌになるよう調整の後、ＰＢＳで１６倍希釈した。中和試験における攻撃ウイルスには、前記４株ウイルス、即ち、北京株、中山株、ＴｈＣＭＡｒ６７/９３、およびＴｈＣＭＡｒ４４/９２の各ウイルスを用いた。結果を表３に示す。交差反応スペクトルの観点から、北京株およびＴｈＣＭＡｒ６７/９３株の両ウイルス抗原が、不活化日本脳炎ワクチンの免疫原として優れていた。
【００５８】
【表３】
（実施例６）
試作２価ワクチンの調製：北京株およびＴｈＣＭＡｒ６７/９３株の各ワクチン原液を、実施例１の記載と同様に調製後、これ等の原液の各タンパク質含量が１０μｇ/ｍｇになるようＰＢＳで希釈調整した。次いで両者を等量混合し、バイアル瓶に分注して、２価ワクチンを得た。この２価ワクチンは、それぞれの１価ワクチン単独よりさらに広い交差反応スペクトルを有した。
【００５９】
（実施例７）
診断剤の調製：実施例１で調製した北京株ワクチン原液中のＲ粒子を診断用抗原として使用し、その有効性を前述の「ウイルス抗原量の測定」と同様のＥＬＩＳＡにより検定した。比較対照抗原として市販の北京株ワクチン中のＭＢ粒子を用いた。抗体として、モノクローナル抗体５０３（ＭＡｂ５０３：全ての日本脳炎ウイルスに共通かつ特異的な中和エピトープに対する抗体）、ＭＡｂ３０２（日本脳炎ウイルス群に特異的なエピトープに対する抗体）、およびポリクローナル抗体（ＰＡｂ：マウスの過免疫血清）を用いた。抗原量を一定（タンパク量７.６μｇ/ｍｌ）に保ち、抗体を階段希釈しＥＬＩＳＡ価をそれぞれ測定した。（Ｒ粒子のＥＬＩＳＡ価/ＭＢ粒子のＥＬＩＳＡ価）は、Ｍａｂ５０３では、５３/４７、Ｍａｂ３０２では２２６/２２、およびＰＡｂでは１２０/５２であった。この結果に基づき、Ｍａｂ３０２およびＰＡｂに対するＲ粒子の感度は、ＭＢ粒子のそれに比べ、約２〜約１０倍高いと判断された。Ｍａｂ３０２についての結果から、本発明の抗原は、日本脳炎ウイルス群の予備的検出用の抗原として有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明では、飼育管理が繁雑かつ微妙な上に高価なマウスの代わりに、取扱いが容易かつ低廉な細胞株を用い、ウイルス粒子が量産される。従って、多数のマウスを犠牲にしないので、動物愛護の観点から望ましい。また、経済的には、生産コストが大幅に低減されるばかりなく、バイオハザード対策、製造に係る作業手順、精製工程、品質管理、製造計画等が著しく省力化される。特に、従来の不活化ワクチンに比べ、約２倍〜約１０倍の力価を発揮する、増強免疫原として新規なウイルス粒子、およびその製造方法が提供される。特に、この発明により、不活化日本脳炎ワクチン用の免疫原あるいは診断剤用の抗原として卓抜した免疫原性あるいは抗原性を有する新規な日本脳炎ウイルス粒子およびその製造方法が提供される。従って、この発明は、低廉でしかも優れた品質のワクチンや診断剤の提供を可能にし、日本脳炎ウイルス群感染症の予防および診断の全世界にわたる飛躍的な普及および向上をもたらす。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【公開番号】特開２００９−２２５８０９（Ｐ２００９−２２５８０９Ａ）
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６２２６１（Ｐ２００９−１６２２６１）
【出願日】平成２１年７月８日（２００９．７．８）
【分割の表示】特願２０００−５７４６６３（Ｐ２０００−５７４６６３）の分割
【原出願日】平成１１年６月２日（１９９９．６．２）
【出願人】（０００１７３６９２）財団法人阪大微生物病研究会 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月８日（２００９．７．８）
【分割の表示】特願２０００−５７４６６３（Ｐ２０００−５７４６６３）の分割
【原出願日】平成１１年６月２日（１９９９．６．２）
【出願人】（０００１７３６９２）財団法人阪大微生物病研究会 (23)
【Ｆターム（参考）】
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