昆虫細胞で産生される改良されたＡＡＶベクター
本発明は、昆虫細胞でのアデノ随伴ウイルスベクターの作製に関する。したがって、前記昆虫細胞は、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンが非ＡＴＧ準最適な開始コドンである、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む。前記昆虫細胞は、少なくとも１個のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列、昆虫細胞での発現のために発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列を含む第３のヌクレオチド配列、及び、昆虫細胞での発現のために発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列を含む第４のヌクレオチド配列をさらに含む。本発明はさらに、ウイルス粒子の改良された感染力を提供するウイルスカプシドタンパク質の割合が改変されたアデノ随伴ウイルスベクターに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫細胞におけるアデノ随伴ウイルスの産生、及び、改良された感染力を提供するウイルスカプシドタンパク質の割合が改変されたアデノ随伴ウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子治療用の最も有望なウイルスベクターの１つとみなしてよい。ＡＡＶは、分裂中のヒト細胞はもちろん分裂していないヒト細胞にも効率的に感染する能力を有しており、前記ＡＡＶウイルスゲノムは宿主細胞ゲノムの単一の染色体部位に組み込まれ、及び、最も重要なことに、ＡＡＶは多くのヒトの中に存在するが、これまでいかなる疾病とも関連したことがない。こうした利点を考慮して、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、血友病Ｂ、悪性黒色腫、嚢胞性線維症、及びその他の疾病の遺伝子治療臨床試験において評価中である。
【０００３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＡＶ複製を維持する宿主細胞は、すべてが哺乳動物細胞型由来である。したがって、遺伝子治療で使用するためのｒＡＡＶは、たとえば、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞などの哺乳動物細胞系、及びその他の哺乳動物細胞系（たとえば、米国特許第６，１５６，３０３号、米国特許第５，３８７，４８４号、米国特許第５，７４１，６８３号、米国特許第５，６９１，１７６号、米国特許第５，６８８，６７６号、米国特許出願公開第２００２２００８１７２１号、国際特許公開第００／４７７５７号、国際特許公開第００／２４９１６号、及び、国際特許公開第９６／１７９４７号を参照されたい）でこれまで主に産生されてきた。ｒＡＡＶは、典型的には、ＡＡＶ複製起点（逆方向末端反復、すなわちＩＴＲ）に隣接する治療用遺伝子、ＡＡＶ複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０の遺伝子、並びに、ビリオン又は構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の遺伝子を含有するＤＮＡプラスミドを提供することにより、そのような哺乳動物細胞培養系において産生される。さらに、前記ＡＡＶ遺伝子の発現を増強し、ベクター収量を改良するために、アデノウイルス由来の初期遺伝子（Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、ＶＡＲＮＡ）を含有するプラスミドが提供される（Ｇｒｉｍｍら、１９９８年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、第９巻、２７４５頁〜２７６０頁を参照されたい）。しかし、これらの哺乳動物細胞培養系の大半において、細胞当たり産生されるＡＡＶ粒子数は約１０４粒子である（Ｃｌａｒｋ、２００２年、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、第６１巻（附録１）、９頁〜１５頁に掲載）。臨床研究のためには、ｒＡＡＶの１０１５以上の粒子が必要となるであろう。この数のｒＡＡＶ粒子を作製するためには、およそ１０１１の培養ヒト２９３細胞、すなわち５０００個の１７５ｃｍ２フラスコ相当量の細胞を使ったトランスフェクション及び培養が必要になると考えられ、最大１０１１の２９３細胞をトランスフェクトすることになる。したがって、臨床試験用の材料を獲得するための哺乳動物細胞培養系を使ったｒＡＡＶの大規模作製は、問題があることがすでに判明しており、工業規模での製造は実現可能ですらない可能性がある。さらに、哺乳動物細胞培養で産生される臨床用途のためのベクターは、前記哺乳動物宿主細胞に存在する望ましくない、おそらく病原性の物質に汚染される危険が常に存在する。
【０００４】
哺乳動物作製システムのこれらの問題を克服するために、最近、昆虫細胞を使ったＡＡＶ作製システムが開発された（Ｕｒａｂｅら、２００２年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、第１３巻、１９３５頁〜１９４３頁；米国特許出願公開第２００３０１４８５０６号、及び米国特許出願公開第２００４０１９７８９５号）。バキュロウイルス発現系システムからの昆虫細胞でのＡＡＶの産生のためには、いくつかの改変が必要であった。なぜならば、哺乳動物細胞では、前記３種類のＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）の正確な化学当量での発現は、２種類のスプライス受容部位の交互利用と、昆虫細胞により正確に産生されることがないＶＰ２のＡＣＧ開始コドンの準最適な利用を組み合わせることに頼っているからである。前記３種類のカプシドタンパク質の正確な化学当量は、前記ＡＡＶ粒子の感染力にとり重要である。量が減少したＶＰ１を含有するＡＡＶ粒子は感染力が低下し、ＶＰ１は、感染力においてある機能を有するホスホリパーゼＡ２活性を含有することは公知である（Ｇｉｒｏｄら、２００２年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、第８３巻、９７３頁〜８頁）。
【０００５】
したがって、前記３種類のカプシドタンパク質の発現のために、Ｕｒａｂｅら（２００２年、上記を参照）は、スプライシングを必要とせずに３種類のＶＰタンパク質をすべて発現することができる単一のポリシストロン性メッセンジャーに転写される構築物を使用している。前記３種類のカプシドタンパク質の正確な化学当量での作製を目指すため、前記ＶＰ１読取り枠、すなわちスキャニングリボソームにより読み取られる最初の開始コドンに、準最適な開始コドンＡＣＧが賦与されており、このコドンを取り囲む配列が最適化されている。Ｕｒａｂｅら（２００２年、上記を参照）は、昆虫細胞で読み通しをしているリボソームは、前記３種類のウイルスカプシドタンパク質の野生型ＡＡＶに近い化学当量をもたらすことを報告している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、本発明者らは、バキュロウイルス系で産生されるＡＡＶベクターでは、ＶＰ１はＶＰ２と比べてまだ準最適なレベルで発現されていること、並びに、このために、たとえば、哺乳動物２９３細胞で産生される従来のＡＡＶベクターと比較した場合、マウスでのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ研究では感染力が低下することを見出した。したがって、感染力が改良されたｒＡＡＶベクターのためのバキュロウイルスベースの作製システムの必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
定義
本明細書で使用するように、用語「作動可能に連結される」とは、ポリヌクレオチド（又は、ポリペプチド）エレメントが機能的関係で連結することである。核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係におかれると、「作動可能に連結されている」。たとえば、転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるとは、連結中のＤＮＡ配列は典型的に近接しており、２個のタンパク質コード化領域を結合させる必要がある場合には、読み枠が近接していることを意味する。
【０００８】
「発現制御配列」とは、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列のことである。発現制御配列は、それがヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御し調節する場合には、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結されている」。したがって、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード化遺伝子の前の開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び終止コドンを含むことができる。用語「発現制御配列」は、最小限、その存在が発現に影響を与えるように設計されている配列を含むことを意図されており、追加の有利な成分も含むことができる。たとえば、リーダー配列及び融合パートナー配列は発現制御配列である。この用語は、枠内及び枠外の望ましくない潜在的な開始コドンが配列から除去されるように、核酸配列を設計することも含むことができる。発現制御配列は、望ましくない潜在的スプライス部位が除去されるように、核酸配列を設計することも含むことができる。発現制御配列は、ポリＡテール、すなわち、ポリＡ配列と呼ばれる配列であるｍＲＮＡの３’末端の一連のアデニン残基の付加を指示する配列、すなわちポリアデニル化配列（ｐＡ）を含む。発現制御配列は、ｍＲＮＡの安定性を増強するように設計することもできる。転写及び翻訳安定性に影響を与える発現制御配列、たとえば、プロモーターも、翻訳を生じさせる配列、たとえば、コザック配列も、昆虫細胞においては公知である。発現制御配列は、より低い発現レベルでもより高い発現レベルでも実現されるように、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列を調節するような性質をもつことができる。
【０００９】
本明細書で使用するように、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」とは、１個又は複数個のコード配列の転写を制御するように機能し、前記コード配列の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置する核酸フラグメントのことであり、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、並びに、転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク質の結合部位、及び、前記プロモーターからの転写量を直接的に又は間接的に調節するよう作用することが当業者の公知の他のすべてのヌクレオチド配列を含むがこれに限定されるものではない他のすべてのＤＮＡ配列の存在により構造的に同定される。「構成的」プロモーターとは、大部分の生理学的及び発生上の条件の下で大半の組織で活性なプロモーターのことである。「誘導性」プロモーターとは、たとえば、化学的誘導因子の適用により生理学的に又は発生的に調節されるプロモーターのことである。「組織特異的」プロモーターは、特定型の組織又は細胞においてのみ活性である。
【００１０】
用語「実質的に同一の」、「実質的同一性」又は「基本的に類似している」若しくは「基本的類似性」とは、２個のペプチド又は２個のヌクレオチド配列が、デフォルトパラメータを使ったプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによりなど、最適に整列された場合、本明細書の別の場所で定義された少なくとも一定割合の配列同一性を共有することを意味する。ＧＡＰは、ニードルマンとブンシュのグローバル整列アルゴリズムを使って、２個の配列をその全長にわたって整列させ、適合数を最大限にし、ギャップ数を最小限にする。一般に、前記ＧＡＰデフォルトパラメータが使われ、ギャップ挿入ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドでは、使用されるデフォルトスコア行列はｎｗｓｇａｐｄｎａ、及びタンパク質では、デフォルトスコア行列はＢｌｏｓｕｍ６２である（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ 第８９巻、９１５頁〜９１９頁）。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と基本的に類似している又はある程度の配列同一性を有すると言われる場合、ＤＮＡ配列中のチミン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に相当することは明らかである。配列アラインメント及びパーセンテージ配列同一性の点数は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、９６５８ スクラントンロード、サンディエゴ、カリフォルニア ９２１２１−３７５２ 米国、から入手可能なＧＣＧウィスコンシンパッケージ、バージョン１０．３、又はウィンドウズ（登録商標）用のオープンソースソフトウェアエムボス（最新版２．７．１−０７）などのコンピュータプログラムを使って決定してよい。代わりに、パーセント類似性又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等などのデータベースを検索することにより決定してもよい。
【００１１】
本発明は、哺乳動物細胞における核酸の導入及び／又は発現のためのベクターとして使用するための、動物パルボウイルス、特に感染性ヒト又はサルＡＡＶなどのディペンドウイルス、及びその成分（たとえば、動物パルボウイルスゲノム）の使用に関する。特に、本発明は、昆虫細胞で産生される場合のそのようなパルボウイルスベクターの感染力の改良に関する。
【００１２】
パルボウイルス科のウイルスは、小型のＤＮＡ動物ウイルスである。パルボウイルス科は、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科と、昆虫に感染するデンソウイルス亜科の２つの亜科に分類される。パルボウイルス亜科のウイルスは本明細書ではパルボウイルスと呼ばれ、ディペンドウイルス属を含む。その属の名称から推定されるように、ディペンドウイルス属のウイルスは、細胞培養における増殖性感染のためには、アデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を通常必要とする点で独特である。ディペンドウイルス属には、通常はヒトに感染するＡＡＶ（たとえば、セロタイプ１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類に感染するＡＡＶ（たとえば、セロタイプ１及び４）、並びに、他の温血動物に感染する近縁ウイルス（たとえば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）がある。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のウイルスに関するそれ以上の情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第６９章（第３版、１９９６年）に記載されている。便宜のため、本発明は、ＡＡＶを参照することにより、本明細書でさらに例証され説明される。しかし、本発明はＡＡＶに限定されるものではなく、他のパルボウイルスにも等しく適用してよいと理解される。
【００１３】
すべての既知のＡＡＶセロタイプのゲノム構成は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造的複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質の独自のコードヌクレオチド配列に隣接している。前記ＶＰタンパク質はカプシドを形成する。末端１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ形ヘアピンを形成するエネルギー的に安定した分子内二本鎖を形成するように、組織化される。これらのヘアピン構造体は、ウイルスＤＮＡ複製のための起点として機能し、細胞性ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして働く。前記Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質、すなわちＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードしている。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、ｐ５プロモーターから転写され、並びに、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０はｐ１９プロモーターから転写される。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰタンパク質、すなわちＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードしている。ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから転写される。
【００１４】
第１の態様では、本発明は、動物パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む読取り枠を含み、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンがＡＴＧではなく、ＡＣＧではない準最適な開始コドンであるヌクレオチド配列に関する。準最適とは本明細書では、コドンが、正常なＡＴＧコドンと比べた場合、他の点では同一の状況において翻訳の開始の効率が低いことを意味すると理解される。好ましくは、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンが、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＧＴＧ、及びＣＴＧから選択され、さらに好ましくは、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンが、ＴＴＧ、ＧＴＧ、及びＣＴＧから選択され、最も好ましくは、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンがＣＴＧである。前記動物パルボウイルスは、好ましくは、ディペンドウイルス、さらに好ましくは、ヒト又はサルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
【００１５】
動物パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む読取り枠を含み、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンがＴＴＧ又はＧＴＧ開始コドンであるヌクレオチド配列では、ビリオンのＶＰ１対ＶＰ２タンパク質の量の割合はほぼ等しい、すなわち等モルであり、開始コドンがＣＴＧの場合には、ビリオンのＶＰ１タンパク質の量はＶＰ２の量よりも多い。開始コドンがＡＣＧの場合には、ビリオンのＶＰ１タンパク質の量は、ＶＰ２の量よりも少ない。ビリオンの感染力は、ビリオン中のＶＰ２に対するＶＰ１の割合とともに増加する。
【００１６】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための本発明の好ましいヌクレオチド配列は、配列番号７の９ヌクレオチド配列、又は配列番号７に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列を、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に含むヌクレオチド配列である。配列番号７のヌクレオチド配列と実質的な同一性を有し、ＶＰ１の発現を増加させるのに寄与するであろう配列は、たとえば、配列番号７の９ヌクレオチド配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％の同一性を有する配列である。
【００１７】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための本発明のさらに好ましいヌクレオチド配列は、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの周辺に、コザックコンセンサス配列を含む発現制御配列を含むヌクレオチド配列である。コザックコンセンサス配列は、本明細書では、ＧＣＣＲＣＣ（ＮＮＮ）Ｇ（配列番号８）と定義され、Ｒはプリン（すなわち、Ａ又はＧ）であり、（ＮＮＮ）は上の本明細書で定義された準最適な開始コドンのうちのいずれかを表す。好ましくは、本発明のヌクレオチド配列のコザックコンセンサス配列では、ＲはＧである。したがって、コザックコンセンサス配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための本発明のヌクレオチド配列は、好ましくは、ＧＣＣＡＣＣ（ＡＣＧ）Ｇ、ＧＣＣＧＣＣ（ＡＣＧ）Ｇ、ＧＣＣＡＣＣ（ＴＴＧ）Ｇ、ＧＣＣＧＣＣ（ＴＴＧ）Ｇ、ＧＣＣＡＣＣ（ＧＴＧ）Ｇ、ＧＣＣＧＣＣ（ＧＴＧ）Ｇ、ＧＣＣＡＣＣ（ＣＴＧ）Ｇ、及びＧＣＣＧＣＣ（ＣＴＧ）Ｇから選択され、さらに好ましくは、コザックコンセンサス配列を含むヌクレオチド配列は、ＧＣＣＡＣＣ（ＣＴＧ）Ｇ、及びＧＣＣＧＣＣ（ＣＴＧ）Ｇから選択され、最も好ましくは、コザックコンセンサス配列を含むヌクレオチド配列は、ＧＣＣＧＣＣ（ＣＴＧ）Ｇである。本明細書の括弧内のヌクレオチドは、ＶＰ１タンパク質の開始コドンの位置を示す。
【００１８】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための本発明のヌクレオチド配列は、さらに好ましくは、ヌクレオチドの１２位のＧ、ヌクレオチドの２１位のＡ、及びヌクレオチドの２４位のＣの中から選択される、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするにヌクレオチド配列の少なくとも１個の改変を含む。他のセロタイプのＶＰ１の翻訳のための考えられる誤った開始部位を除去することは、昆虫細胞で認識されることもある推定上のスプライス部位の除去と同じように、当業者によってよく理解されているであろう。昆虫細胞における適切な発現のための野生型ＡＡＶ配列の種々の改変は、たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークに記載されているような公知の遺伝子工学技術の適用により実現される。ＶＰ及びビリオンの収量を増加させる、又は、改変されたトロピズムなどの他の望ましい効果を有する、又は、前記ビリオンの抗原性を低下させることができると考えられるＶＰコード領域の種々の追加の改変は、当業者に公知である。これらの改変は本発明の範囲内である。
【００１９】
好ましくは、前記ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列は、昆虫細胞での発現のために、発現制御配列に作動可能に連結されている。これらの発現制御配列は、昆虫細胞で活性があるプロモーターを少なくとも含んでいるであろう。昆虫宿主細胞で外来遺伝子を発現するための当業者に公知の技術を使って、本発明を実行することができる。昆虫細胞におけるポリペプチドの分子工学及び発現の方法論は、たとえば、ＳｕｍｍｅｒｓとＳｍｉｔｈ、１９８６年、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘ；Ｌｕｃｋｏｗ、１９９１年、Ｉｎ Ｐｒｏｋｏｐら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ’Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、９７頁〜１５２頁；Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．とＲ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ、１９９２年、Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、英国、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ；Ｄ．Ｒ．、Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、１９９２年、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク；Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎとＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．、１９９５年、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３９巻；米国特許第４，７４５，０５１号、米国特許出願公開第２００３１４８５０６号、及び国際公開第０３／０７４７１４号に記載されている。前記ＡＡＶカプシドタンパク質をコードしている本発明のヌクレオチド配列の転写に特に適したプロモーターは、たとえば、多面体プロモーターである。しかし、昆虫細胞で活性である他のプロモーター、たとえば、ｐ１０、ｐ３５、又はＩＥ−１プロモーター、及び上の参考文献に記載の追加のプロモーターは当技術分野で公知である。
【００２０】
好ましくは、昆虫細胞での前記ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための核酸構築物は、昆虫細胞適合性ベクターである。「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」は、昆虫若しくは昆虫細胞の産生的形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子と理解されている。例となる生物学的ベクターには、プラスミド、直鎖状核酸分子、及び組換えウイルスがある。いかなるベクターも、それが昆虫細胞適合性がある限り用いることができる。このベクターは昆虫細胞ゲノムに組み込まれてもよいが、昆虫細胞内でのベクターの存在は永久である必要はなく、一過性のエピソームベクターも含まれる。このベクターは、既知のいかなる手段によっても、たとえば、細胞の化学的処理、エレクトロポレーション、又は感染によって導入することができる。好ましい実施形態では、このベクターは、バキュロウイルス、すなわちウイルスベクター、又はプラスミドである。さらに好ましい実施形態では、このベクターはバキュロウイルス、すなわち、この構築物はバキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びその使用のための方法は、昆虫細胞の分子工学に関して上に引用した参考文献に記載されている。
【００２１】
別の態様では、本発明は、上に定義した本発明の核酸構築物を含む昆虫細胞に関する。ＡＡＶの複製を可能にし、培養下で維持することができるいかなる昆虫細胞も、本発明に従って使用することができる。たとえば、使われる細胞系は、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞系、又はカ細胞系、たとえば、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来細胞系由来でよい。好ましい昆虫細胞、又は細胞系は、バキュロウイルス感染に感受性の昆虫種由来の細胞であり、たとえば、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＨｉｇｈ Ｆｉｖｅがある。
【００２２】
本発明に従った好ましい昆虫細胞は、（ａ）少なくとも１個のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列、（ｂ）昆虫細胞での発現のために発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２、又はＲｅｐ４０コード配列を含む第３のヌクレオチド配列、及び（ｃ）昆虫細胞での発現のために発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８、又はＲｅｐ６８コード配列を含む第４のヌクレオチド配列、をさらに含む。
【００２３】
本発明に照らして、「少なくとも１個のＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列」は、「Ａ」、「Ｂ」、及び「Ｃ」領域とも呼ばれる大部分が相補的で、対称的に配置された配列を含む回文配列を意味すると理解される。前記ＩＴＲは、複製起点、つまり複製において「シス」の役割を有する部位、すなわち、回文配列及び回文配列の内部の特定の配列を認識するトランス作動性の複製タンパク質（たとえば、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８）の認識部位である部位として機能する。前記ＩＴＲ配列の対称性の１つの例外は、前記ＩＴＲの「Ｄ」領域である。「Ｄ」領域は独特である（１つのＩＴＲ内に相補体をもたない）。一本鎖ＤＮＡのニッキングはＡとＤ領域間の接合部で起きる。ここは、新たなＤＮＡ合成が開始される領域である。前記Ｄ領域は通常、回文配列の一方の方向に位置し、核酸複製段階に方向性を与える。哺乳動物細胞で複製するＡＡＶは、典型的に２個のＩＴＲ配列を有する。しかし、結合部位が前記Ａ領域の両方の鎖に存在し、Ｄ領域は回文配列のそれぞれの側に１つずつ対称的に位置するようにＩＴＲを工学的に改変することは可能である。二本鎖環状ＤＮＡ鋳型（たとえば、プラスミド）上で、次にＲｅｐ７８−又はＲｅｐ６８−支援核酸複製が両方向に進行し、１個のＩＴＲで環状ベクターのＡＡＶ複製には十分である。したがって、１個のＩＴＲヌクレオチド配列を本発明に照らして使用することができる。しかし、好ましくは、２個の又はさらに別の数の規則的なＩＴＲが使われる。最も好ましくは、２個のＩＴＲ配列が使われる。ウイルスベクターの安全を考慮して、細胞内への最初の導入の後はさらに増殖することができないウイルスベクターを構築するのが好ましいであろう。移植患者での望ましくないベクター増殖を制限するためのそのような安全装置は、米国特許出願公開第２００３１４８５０６号に記載されたキメラＩＴＲを有するｒＡＡＶを使うことにより提供してもよい。
【００２４】
用いるベクター又は核酸構築物の数は本発明では制限はない。たとえば、１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のベクターを用いて、本発明の方法に従って昆虫細胞でＡＡＶを作製することができる。６個のベクターが用いられる場合、１個のベクターはＡＡＶ ＶＰ１をコードし、別のベクターはＡＡＶ ＶＰ２をコードし、さらに別のベクターはＡＡＶ ＶＰ３をコードし、さらに別のベクターはＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードし、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８は別のベクターにコードされ、最後のベクターは少なくとも１個のＡＡＶ ＩＴＲを含む。追加のベクターを用いて、たとえば、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０、並びに、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８を発現してもよい。使われるベクターが６個未満の場合、前記ベクターは、少なくとも１個のＡＡＶ ＩＴＲと、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、Ｒｅｐ５２／Ｒｅｐ４０、及びＲｅｐ７８／Ｒｅｐ６８のコード配列の種々の組合せを含むことができる。好ましくは、２個のベクター又は３個のベクターが使われ、上記のように２個のベクターのほうが好ましい。２個のベクターを使う場合、好ましくは、前記昆虫細胞は、（ａ）その構築物が、上の（ｂ）及び（ｃ）で定義された第３及び第４のヌクレオチド配列、すなわち、昆虫細胞での発現のために少なくとも１個の発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列を含む第３のヌクレオチド配列、及び、昆虫細胞での発現のために少なくとも１個の発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列を含む第４のヌクレオチド配列、をさらに含む、上記のＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための第１の核酸構築物、並びに（ｂ）少なくとも１個のＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含む上の（ａ）で定義された第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸構築物、を含む。３個のベクターが使われる場合、好ましくは、カプシドタンパク質の発現のためとＲｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ７８、及びＲｅｐ６８タンパク質の発現のために別個のベクターが使われる点を除いて、２個のベクターに使われるのと同じ配置が使われる。それぞれのベクター上の配列は、互いに対していかなる順序でもよい。たとえば、１個のベクターが、ＩＴＲ及びＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦを含む場合、前記ＶＰ ＯＲＦは、ＩＴＲ配列間のＤＮＡが複製されると、前記ＶＰ ＯＲＦが複製される、又は複製されないように、ベクター上に位置することができる。さらにたとえば、Ｒｅｐコード配列及び／又はＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、ベクター上でいかなる順序でもよい。第２、第３及びそれ以上の核酸構築物は好ましくは昆虫細胞適合性ベクターであり、好ましくは上記のバキュロウイルスベクターであることも理解される。代わりに、本発明の昆虫細胞では、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、及び第４のヌクレオチド配列、並びに随意にそれ以上のヌクレオチド配列のうちの１個又は複数個が、昆虫細胞のゲノムに安定的に組み込まれてもよい。当技術分野の通常技術の１つでは、ヌクレオチド配列を昆虫ゲノムに安定的に導入する方法、及びゲノム中にそのようなヌクレオチド配列を有する細胞を同定する方法が知られている。ゲノムへの組込みは、たとえば、昆虫ゲノムの領域に高度に相同なヌクレオチド配列を含むベクターの使用によって支援してもよい。トランスポゾンなどの特定の配列の使用は、ヌクレオチド配列をゲノムに導入する別の方法である。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の昆虫細胞に存在する第２のヌクレオチド配列、すなわち少なくとも１個のＡＡＶ ＩＴＲを含む配列は、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列をさらに含み、それにより、好ましくは対象の遺伝子産物をコードする前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が、昆虫細胞で産生されるＡＡＶのゲノムに組み込まれる。好ましくは、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞での発現のための配列である。好ましくは、第２のヌクレオチド配列は、２個のＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、その中では、対象の遺伝子産物をコードする前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が、前記２個のＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列の間に位置している。好ましくは、（哺乳動物細胞での発現のために）対象の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、その配列が２個の規則的ＩＴＲの間に位置している、又は２個のＤ領域で工学的に改変されたＩＴＲの一方の側に位置している場合には、昆虫細胞で産生されるＡＡＶゲノムに組み込まれる。
【００２６】
したがって、上の本明細書で定義された第２のヌクレオチド配列は、昆虫細胞で複製されるＡＡＶゲノムに組み込まれるように位置している、哺乳動物細胞での発現のために少なくとも１個の「対象の遺伝子産物」をコードするヌクレオチド配列を含んでいてよい。いかなるヌクレオチド配列も、本発明に従って産生されるＡＡＶをトランスフェクトした哺乳動物細胞での後の発現のために組み込むことができる。前記ヌクレオチド配列は、たとえば、ＲＮＡｉ剤、すなわち、たとえば、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）などのＲＮＡ干渉が可能なＲＮＡｉ医薬品を発現するように、タンパク質をコードしていてよい。「ｓｉＲＮＡ」とは、哺乳動物細胞では毒性のない短い二本鎖ＲＮＡである低分子干渉ＲＮＡを意味する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ 第４１１巻、４９４頁〜９８頁；Ｃａｐｌｅｎら、２００１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、第９８巻、９７４２頁〜４７頁）。好ましい実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、２個のヌクレオチド配列を含んでいてよく、それぞれが哺乳動物細胞での発現のために、１個の対象の遺伝子産物をコードしている。対象の産物をコードする前記２個のヌクレオチド配列はそれぞれ、昆虫細胞で複製されるｒＡＡＶゲノムに組み込まれるように位置している。
【００２７】
哺乳動物細胞での発現のための対象の産物は、治療用遺伝子産物でよい。治療用遺伝子産物は、ポリペプチド、若しくはＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）、又は、標的細胞で発現されると、たとえば、望ましくない活性の消失、たとえば、感染細胞の消失、若しくは、たとえば、酵素活性に欠損を引き起こす遺伝子異常の補完などの望ましい治療効果を提供する他の遺伝子産物でもよい。治療用ポリペプチド遺伝子産物の例には、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）、第ＩＸ因子、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、好ましくはＬＰＬ Ｓ４４７Ｘ；国際特許公開第０１／００２２０号を参照されたい）、アポリポタンパク質Ａ１、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節相互作用タンパク質（ＲＰ−ＧＲＩＰ）、及びサイトカイン又は、たとえば、ＩＬ−１０のようなインターロイキンがある。
【００２８】
代わりに、又はさらに第２の遺伝子産物として、上の本明細書に定義された第２のヌクレオチド配列は、細胞の形質転換及び発現を評価するためのマーカータンパク質として働くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいてよい。この目的に適したマーカータンパク質は、たとえば、蛍光タンパク質ＧＦＰ、及び選択可能なマーカー遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地上での選別のため）、細菌のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢ上での選別のため）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８上での選別のため）、及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（メトトレキサート上での選別のため）、ＣＤ２０、低親和性神経成長因子遺伝子である。これらのマーカー遺伝子とその使用方法を得るための情報源は、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークに提供されている。さらに、上の本明細書に定義された第２のヌクレオチド配列は、必要とみなされた場合には、本発明のｒＡＡＶを形質導入した細胞由来の、被験者の治療を可能にするフェイルセーフ機構として働く可能性のあるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含んでいてもよい。そのようなヌクレオチド配列は、自殺遺伝子と呼ばれることが多いが、プロドラックをタンパク質が発現されているトランスジェニック細胞を死滅させることができる有毒物質に変換することができるタンパク質をコードしている。そのような自殺遺伝子に適した例には、たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のシトシンデアミナーゼ遺伝子、又は単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び水痘帯状疱疹ウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子の１つがあり、その場合、ガンシクロビルを被験者のトランスジェニック細胞を死滅させるプロドラッグとして使用してよい（たとえば、Ｃｌａｉｒら、１９８７年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、第３１巻、８４４頁〜８４９頁を参照されたい）。
【００２９】
別の実施形態では、対象の遺伝子産物は、ＡＡＶタンパク質、特に、Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８などのＲｅｐタンパク質、又はその機能的フラグメントでよい。Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列は、本発明のｒＡＡＶゲノム上に存在し、本発明のｒＡＡＶを形質導入された哺乳動物細胞で発現される場合、前記形質導入された哺乳動物細胞のゲノムへの前記ｒＡＡＶの組込みを可能にする。ｒＡＡＶ形質導入又は感染哺乳動物細胞でのＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８の発現は、前記ｒＡＡＶにより細胞に導入される他のいかなる対象の遺伝子産物も長期に又は永久に発現させることにより、前記ｒＡＡＶのある種の使用の利点を提供することができる。
【００３０】
本発明のｒＡＡＶベクターでは、哺乳動物細胞での発現のために対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列は、好ましくは、少なくとも１個の哺乳動物細胞適合性発現制御配列、たとえば、プロモーターに作動可能に連結されている。多くのそのようなプロモーターが当技術分野では公知である（ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌ、２００１年、上記を参照されたい）。ＣＭＶプロモーターなどの、多くの細胞型で広く発現される構成的プロモーターを使用してよい。しかし、誘導性、組織特異的、細胞型特異的、又は細胞周期特異的であるプロモーターがより好ましいであろう。たとえば、肝臓特異的発現では、プロモーターは、α１アンチトリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、ＬＰＳ（チロキシン結合グロブリン）プロモーター、ＨＣＲ−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターから選択してよい。他の例には、腫瘍選択的な、及び、特に、神経学的細胞腫瘍選択的な発現には、Ｅ２Ｆプロモーター（Ｐａｒｒら、１９９７年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、第３巻、１１４５頁〜９頁）、又は単核血液細胞での使用には、ＩＬ−２プロモーター（Ｈａｇｅｎｂａｕｇｈら、１９９７年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；第１８５巻、２１０１頁〜１０頁）がある。
【００３１】
ＡＡＶはいくつかの哺乳動物細胞に感染することができる。たとえば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５（１１）、３２５１頁〜３２６０頁（１９８５年）、及びＧｒｉｍｍら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０（１５）、２４４５頁〜２４５０頁（１９９９年）を参照されたい。しかし、ヒト滑膜線維芽細胞のＡＡＶ形質導入は、類似のマウス細胞よりも有意に効率的であり（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ、３：１（２００１年））、ＡＡＶの細胞トロピシティはセロタイプ間で異なる。たとえば、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、９７（７）、３４２８頁〜３４３２頁（２０００年）（哺乳動物ＣＮＳ細胞トロピズム及び形質導入効率に関して、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、及びＡＡＶ５間の相違を論じている）を参照されたい。
【００３２】
昆虫細胞でのＡＡＶの作製のために本発明で使用してよいＡＡＶ配列は、いかなるＡＡＶセロタイプのゲノム由来でもよい。一般に、ＡＡＶセロタイプは、アミノ酸及び核酸レベルで、顕著に相同なゲノム配列を有し、同一の一連の遺伝機能を提供し、基本的に物理的及び機能的に等価なビリオンを産生し、並びに実質的に同一の機構により複製し組み立てられる。種々のＡＡＶセロタイプのゲノム配列及びゲノム類似性の概観は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８９７９０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０１９０１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４３３０３，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６、Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９７年、Ｊ．Ｖｉｒ．、第７１巻、６８２３頁〜３３頁）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３年、Ｊ．Ｖｉｒ．、第４５巻、５５５頁〜６４頁）、Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒ．、第７３巻、１３０９頁〜１３１９頁）、Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒ．、第７２巻、３０９頁〜３１９頁）、及びＷｕら（２０００年、Ｊ．Ｖｉｒ．、第７４巻、８６３５頁〜４７頁）を参照されたい。ヒト又はサルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）セロタイプは、本発明に照らして使用するためのＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい供給源であり、さらに好ましくは、通常、ヒト（たとえば、セロタイプ１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類（たとえば、セロタイプ１及び４）に感染するＡＡＶセロタイプである。
【００３３】
好ましくは、本発明に照らして使用するためのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４に由来する。同様に、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ７８、及び／又はＲｅｐ６８コード配列は、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４由来である。しかし、本発明に照らして使用するためのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、既知の４２個のセロタイプのいずれからでも、さらに好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、若しくはＡＡＶ９、又は、たとえば、カプシドシャフリング技術により得られる新たに開発されたＡＡＶ様粒子、及びＡＡＶカプシドライブラリーから採用してよい。
【００３４】
ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列は、特に大半のセロタイプの間で保存されている。種々のＡＡＶセロタイプのＲｅｐ７８タンパク質は、たとえば、８９％超同一であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、及びＡＡＶ６間のゲノムレベルでの全ヌクレオチド配列同一性は約８２％である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３（２）９３９頁〜９４７頁）。さらに、多くのＡＡＶセロタイプのＲｅｐ配列及びＩＴＲは、哺乳動物細胞でのＡＡＶ粒子の産生の際に他のセロタイプ由来の相応する配列と効率的にクロス補完する（すなわち、機能的に置換する）ことが公知である。米国特許出願公開第２００３１４８５０６号では、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列も昆虫細胞で他のＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列に効率的にクロス補完することが報告されている。
【００３５】
前記ＡＡＶ ＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞トロピシティを決定することが公知である。前記ＶＰタンパク質コード化配列は、異なるＡＡＶセロタイプ間でＲｅｐタンパク質及び遺伝子に比べ有意に保存されていない。Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列が他のセロタイプの相応する配列にクロス補完する能力を備えているために、セロタイプ（たとえば、ＡＡＶ３）のカプシドタンパク質及び別のＡＡＶセロタイプ（たとえば、ＡＡＶ２）のＲｅｐ及び／又はＩＴＲ配列を含む偽型ＡＡＶ粒子の産生が可能になる。そのような偽型ＡＡＶ粒子は本発明の一部である。
【００３６】
改変された「ＡＡＶ」配列も、たとえば、昆虫細胞でのｒＡＡＶベクターの産生のために、本発明に照らして使用することができる。そのような改変された配列には、たとえば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、若しくはＡＡＶ９に対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、若しくはそれ以上のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性を有し（たとえば、約７５〜９９％ヌクレオチド配列同一性を有する配列）、そのＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰは野生型ＡＡＶ ＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰ配列に代わって使うことができる。
【００３７】
ＡＡＶ５は、多くの点で他のＡＡＶセロタイプに類似しているが、他の既知のヒト及びサルセロタイプ以上に、他のヒト及びサルＡＡＶセロタイプとは異なっている。それを考慮すると、ＡＡＶ５の産生は、昆虫細胞での他のセロタイプの産生とは異なっていてよい。本発明の方法を用いてｒＡＡＶ５を作製する場合、１個又は複数個のベクターが、ＡＡＶ５ ＩＴＲを含むヌクレオチド配列、ＡＡＶ５ Ｒｅｐ５２及び／又はＲｅｐ４０コード配列を含むヌクレオチド配列、並びに、ＡＡＶ５ Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８コード配列を含むヌクレオチド配列を、複数個のベクターの場合は集団的に、含むのが好ましい。そのようなＩＴＲ及びＲｅｐ配列は、昆虫細胞でｒＡＡＶ５又は偽型ｒＡＡＶ５ベクターを効率的に産生するように、要望通りに改変することができる。たとえば、昆虫細胞でのｒＡＡＶ５の産生が改良されるように、前記Ｒｅｐ配列の開始コドンを改変でき、ＶＰスプライス部位を改変する、若しくは除去することができ、並びに／又は前記ＶＰ１開始コドン及び近接するヌクレオチドを改変することができる。
【００３８】
追加の態様では、本発明は、ＡＡＶビリオンに関する。好ましくは、そのゲノムに対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が自然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質の化学量論において、ＶＰ１の量が（ａ）ＶＰ２の量の少なくとも１００、１０５、１１０、１２０、１５０、２００、若しくは４００％である、又は（ｂ）ＶＰ３の量の少なくとも８、１０、１０．５、１１、１２、１５、２０、若しくは４０％である、又は（ｃ）少なくとも（ａ）と（ｂ）両方で定義されるＡＡＶビリオンである。好ましくは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の量は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のそれぞれに共通のエピトープを認識する抗体を使って決定される。ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３の相対量を定量化することができる種々の免疫アッセイを、当技術分野では利用することができる（たとえば、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｅ．ＨａｒｌｏｗとＤ．Ｌａｎｅ、１９９９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、を参照されたい）。前記３種類のカプシドタンパク質に共通のエピトープを認識する適切な抗体は、たとえば、マウス抗Ｃａｐ Ｂ１抗体である（ドイツ、Ｐｒｏｇｅｎ社より市販されている）。
【００３９】
本発明に従った好ましいＡＡＶは、そのゲノムに対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が自然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶビリオンがアミノ酸の１位にロイシン又はバリンを含むＶＰ１カプシドタンパク質を含む、ビリオンである。本発明に従ったさらに好ましいＡＡＶビリオンは、上記の割合のカプシドタンパク質を有し、アミノ酸の１位にロイシン又はバリンを含むＶＰ１カプシドタンパク質を含む。たとえば、下の本明細書に定義する方法で、上記の昆虫細胞から得ることができるＡＡＶビリオンはさらに好ましい。
【００４０】
上記の割合のカプシドタンパク質を有する本発明のＡＡＶビリオンの利点は、その改良された感染力である。特に、感染力は、カプシドのＶＰ２及び／又はＶＰ３の量に対して、カプシドのＶＰ１タンパク質の量が増加するに従って、増加する。ＡＡＶビリオンの感染力は、本明細書では、トランス遺伝子の発現割合及びトランス遺伝子から発現される産物の量又は活性から推定される、ビリオンに含まれるトランス遺伝子の形質導入の効率を意味すると理解されている。
【００４１】
別の態様では、したがって、本発明は、昆虫細胞でのＡＡＶの作製方法に関する。好ましくは、前記方法は、（ａ）上の本明細書で定義された昆虫細胞を、ＡＡＶが産生されるような条件の下で培養する段階、及び（ｂ）前記ＡＡＶの回収の段階を含む。培養昆虫細胞の生育条件、及び培養昆虫細胞での異種産物の作製は、当技術分野では公知であり、たとえば、昆虫細胞の分子工学に関する上に引用した参考文献に記載されている。
【００４２】
好ましくは、前記方法は、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化された抗体を使った前記ＡＡＶの親和性精製の段階をさらに含む。前記抗ＡＡＶ抗体は、好ましくはモノクロナール抗体である。特に適切な抗体は、たとえば、ラクダ又はラマから得られる一本鎖ラクダ抗体又はそのフラグメントである（たとえば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第７４巻、２７７頁〜３０２頁を参照されたい）。ＡＡＶの親和性精製のための抗体は、好ましくはＡＡＶカプシドタンパク質上のエピトープに特異的に結合し、好ましくは前記エピトープが複数のＡＡＶセロタイプのカプシドタンパク質上に存在するエピトープである抗体である。たとえば、前記抗体は、ＡＡＶ２カプシドへの特異的結合に基づいて産生しても、又は選択してもよいが、同時に前記抗体はＡＡＶ１、ＡＡＶ３、及びＡＡＶ５カプシドに特異的に結合してもよい。
【００４３】
本文書及びその特許請求の範囲では、動詞「含む」及びその活用は、限定されない意味で用いて、前記単語に続く項目は含まれるが、具体的に言及されない項目は排除されることはないことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈がその要素が１個及び１個だけ存在することを明確に要求しているのでなければ、複数のその要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１個」を意味するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
（実施例）
１．材料と方法
１．１ バキュロウイルスプラスミド構築
ただ１つのポリシストロン性メッセンジャーＲＮＡからＶＰ１、２、３を発現するために、Ｕｒａｂｅら（２００２年、上記を参照されたい）により記載された通りに、バキュロウイルス−ＡＡＶ−Ｃａｐ構築物を設計した。手短に言えば、ＶＰ１のＡＴＧ開始コドンをＡＣＧに変異させた。１１位での潜在的ＡＴＧ開始コドンは、ＡＣＧに変えられている。前記ＶＰ１開始コドンの下流のスプライス受容部位は破壊した（２１位及び２４位の変異）。前記変異させたＣａｐ発現カセットを、バキュロウイルス発現構築物、すなわちＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩ制限部位のあるｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（ｐＦＢＤＡＡＶ１ＶＰｍ１１）にクローン化した。このプラスミド（ｐＦＢＤＡＡＶ１ＶＰｍ１１）は、ＶＰ１の交互開始コドンの導入のための出発物質であった。前記言及した変異体を導入するために、Ｕｒａｂｅら（２００２年、上記を参照されたい）が使用した順方向プライマーは、
【化１】
であった。
以下の順方向プライマーを使って、出発材料としてｐＦＢＤＡＡＶ１ＶＰｍ１１（Ｕｒａｂｅら、２００２年、上記を参照されたい）を使って発現構築物を作製した。
【化２】
さらに、２個の順方向プライマーを使って、ＡＣＧ及びＣＴＧコドンは、それぞれ、好ましい形のコザック配列「ＧＣＣＧＣＣ（ＮＮＮ）Ｇ」（配列番号８を参照されたい。（ＮＮＮ）は準最適な開始コドンを表す）が先行している構築物を調製した。
【化３】
【００４５】
上の順方向プライマーとともにＰＣＲ反応で使用した逆方向プライマーは、前記ＶＰ１開始コドンから〜２３０ｂｐ下流の位置に向け、独自のＳｔｕＩ部位（ＡＧＧＣＣＴ）を含有している。
【化４】
【００４６】
ＰＣＲにより上述の組の順方向及び逆方向プライマー対でフラグメントを増幅した。ＢａｍＨＩ及びＳｔｕＩでのＰＣＲ産物の消化に続いて、前記ＰＣＲ産物はｐＦＢＤＡＡＶ１ｖｐｍ１１のＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩ部位にサブクローン化して、種々の試料バキュロウイルス−ＡＡＶ−Ｃａｐ構築物が得られた。ＤＮＡ構築物は、Ｂａｓｅｃｌｅａｒ社、ライデン、オランダの配列分析により検証した。
【００４７】
１．２ 組換えバキュロウイルス作製
オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の組換えバキュロウイルスを、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（インビトロゲン社製）を使って作製した。ｒＢａｃ−Ｃａｐは、多重感染度０．１でｍｌ当たり２×１０６Ｓｆ９細胞に感染させることにより増幅した。感染の３日後、前記細胞は遠心沈澱させ、ウイルスを含有する上澄みを回収した。
【００４８】
ｒＡＡＶバッチを、Ｕｒａｂｅら、２００２年、に従って３種類の組換えバキュロウイルスを使って作製した。しかし、この研究のために、１種類のバキュロウイルスは、ＬＰＬＳ４４７Ｘ−トランス遺伝子の発現構築物を内部に有していた。前記トランス遺伝子から発現される治療上活性な物質は、ヒトリポタンパク質リパーゼの天然の変異体であり、４４８個のアミノ酸の一本鎖ポリペプチドである。前記ＬＰＬＳ４４７Ｘ変異体は、タンパク質のＣ末端に２個のアミノ酸の欠失がある。第２のバキュロウイルスは、ＡＡＶ複製遺伝子の発現構築物、すなわちＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２を内部に有している。第３のバキュロウイルスは、ＶＰ１のＡＣＧ又はＴＴＧ、ＣＴＧ、ＧＴＧ開始コドンの一方があるＡＡＶ１カプシド配列を内部に有していた。
【００４９】
プラスミドトランスフェクションシステムで作製される哺乳動物ｒＡＡＶバッチは、Ｇｒｉｍｍら、１９９８年に従って作製した（「組換えアデノ随伴ウイルスベクターの作製及び精製のための新規の道具（Ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ）」、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８年 Ｄｅｃ １０；９（１８）：２７４５頁〜６０頁）。
【００５０】
１．３ ウェスタンブロット分析
昆虫細胞にバキュロウイルスＣａｐを感染させた。感染後３日目に、細胞を遠心分離にかけた（３０００ｇ；１５分）。上澄みは０．２２μｍ Ｍｉｌｌｅｘフィルターでろ過した。ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を前記上澄み試料に添加し、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに充填した。前記ゲルは１００Ｖで電気泳動を行った。タンパク質は１００Ｖ、３５０ｍＡで１時間ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社製）上にブロットした。１％マーベル乾燥脱脂粉乳で前記膜をブロックすることによりウェスタン免疫化学を実施し、続いてマウス抗Ｃａｐ（Ｂ１ Ｐｒｏｇｅｎ社製、ドイツ；１対５０に希釈）及びウサギ抗マウスＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製、１対１００に希釈）でインキュベートした。ＶＰ１、２及び３は、ルミライトプラスウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ社製）を使った化学蛍光染色により視覚化した。
【００５１】
１．４ 生化学的測定
ヒトＬＰＬＳ４４７Ｘ活性は、放射性トリオレオイルグリセロールエマルジョン基質を使って以前記載された通りにアッセイした（Ｎｉｌｓｓｏｎ−ＥｈｌｅとＳｃｈｏｌｔｚ、１９７６年）。ヒトＬＰＬＳ４４７Ｘ免疫反応質量は、ニワトリＩｇＹ及びマウス５Ｄ２抗ｈＬＰＬ抗体でサンドイッチＥＬＩＳＡを使ってアッセイした（Ｌｉｕら、２０００年）。血漿トリグリセリドレベルは、市販のキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、＃４５００３２）を使って製造業者のプロトコルに従って測定した。
【００５２】
２．結果
２．１ 組換えバキュロウイルスの構築
ＶＰ１発現のための異なる交互開始コドンを、Ｕｒａｂｅら（２００２年、上記を参照されたい）が設計したバキュロウイルスプラスミドに導入するために、ＢａｍＨＩ制限部位、及びＶＰ１のＡＣＧ開始コドンに代わってＴＴＧ、ＡＴＴ、ＧＴＧ、ＣＴＧコドンのうちのいずれかを含有する一連の上流プライマーを設計した。ＳｔｕＩ部位を含有する下流プライマーと組み合わせてこれらのプライマーを使うＰＣＲにより、ｐＦＢＤＶＰｍ１１（Ｂａｃ−Ｃａｐ）のＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩ部位にサブクローン化されたフラグメントが増幅された。こうして得られたバキュロウイルスプラスミドは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システムを使った組換えバキュロウイルスの調製のために使用した。調製された組換えバキュロウイルスは、ＡＡＶカプシドを作製するために昆虫細胞に感染させた。感染後の３日目に、異なるバキュロウイルスバッチのウイルスタンパク質発現をウェスタンブロットで決定した。前記ウェスタンブロットから、ＶＰ１のＴＴＧ開始コドンを含有するバキュロウイルス構築物は、以前使われたＡＣＧ開始コドンと比べて高いレベルでこのタンパク質を発現したことが明らかになった。ＴＴＧコドンを使用したＶＰ１とＶＰ２間の比は１対１であることがわかり、この比は野生型ＡＡＶで報告されている比に類似している（図１）。
【００５３】
２．２ ｒＡＡＶバッチの培養細胞への感染
ＴＴＧ開始コドンをもつ組換えバキュロウイルス由来のＡＡＶカプシドの感染力を調べるために、ｒＡＡＶを作製した。哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞へのプラスミドトランスフェクションによりｒＡＡＶバッチも作製した。両方のｒＡＡＶバッチのベクターゲノム力価はｑＰＣＲにより決定した。この力価を使って、マイクロタイタープレート中のＨＥＫ２９３細胞に多重感染度を高めながら感染させた。感染後の２日目に、トランス遺伝子産物（ＬＰＬＳ４４７Ｘ）の定量分析（ＬＰＬＳ４４７Ｘ質量アッセイ）を感染した細胞の培地上で実施した。前記アッセイにより、バキュロウイルス産生ｒＡＡＶにより産生されたＬＰＬＳ４４７Ｘの量は、プラスミド産生ｒＡＡＶにより産生したＬＰＬに類似していることが明らかになった（図２）。
【００５４】
２．３ マウスでのｒＡＡＶバッチの感染
バキュロウイルス産生システム及び従来の哺乳動物プラスミド産生システムで産生されたｒＡＡＶバッチを、マウスに筋肉内注入し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＬＰＬＳ４４７Ｘ−タンパク質活性及び空腹時トリグリセリドを追跡した。注入に続く３日目、７日目、及び２週間目に、血液試料を採取し評価した。ウイルス投与の３日後と７日後の間で、哺乳動物−ｒＡＡＶを注入した両方のマウスとバキュロ−ｒＡＡＶを注入した１匹のマウスから試料採取した血漿は、乳白色から完全に透明になった。１匹のバキュロ−ｒＡＡＶ注入マウス由来の血漿は比較的乳白色のままであったが、脂肪レベルは明らかに減少した。トリグリセリドレベルは、処理したマウスすべてでそれぞれ低下した（図３）。１４日目、哺乳動物−ＡＡＶ処理した両方のマウスのＴＧレベル、及びバキュロウイルス−（ＴＴＧ）−ＡＡＶ処理マウスのＴＧレベルは９６％低下した。ウイルス投与の２週間後に採取した血漿試料は、バキュロウイルス−ＡＡＶ及び哺乳動物−ＡＡＶで処理したマウスのＬＰＬＳ４４７Ｘ−活性は類似していた（図４）。
【００５５】
２．４ 異なるＶＰ１−開始コドンをもつ組換えＡＡＶバッチの作製
異なるＶＰ１−開始コドン（ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ、ＡＣＧ）をもつＡＡＶ−Ｃａｐ ｔｙｐｅ１発現ユニットを含有する組換えバキュロウイルスを使って、昆虫細胞でｒＡＡＶ１−ＬＰＬバッチを調製した。前記ウイルスバッチは、評価のために精製しＮｕＰａｇｅゲルに充填した（図５）。前記ゲルは種々のウイルスのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質間の化学量論を明らかにしている。先ず、我々は、ＨＥＫ２９３細胞で従来のプラスミドトランスフェクションシステム（ｐＰＤ１、ＤＫＦＺ（ドイツ癌センター）、ハイデルベルグ、ドイツ）を使って以前作製したｒＡＡＶ１−ＬＰＬを指摘する。我々の手により、このシステムは、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質間に、ＶＰ１がＶＰ２よりも多くの量存在する珍しい化学量論を生じている。この化学量論は、ｗｔＡＡＶ又は他の哺乳動物ＡＡＶベクター作製プラットホームに見える、１対１対１０として報告されているＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質の化学量論とはかなり異なっている。
【００５６】
バキュロウイルスシステムでは、ＣＴＧコドンをもつｒＡＡＶ構築物は、ＶＰ２のカプシドの量と比較してＶＰ１の量が有意に多いウイルスを産生している。この特定の実験では（図５）、ＢＡＣ−Ｃａｐ ＧＴＧ又はＡＣＧ構築物で作製したＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質の化学量論は、ゲル上で類似のＶＰ１対ＶＰ２の比を示しており、ＴＴＧ構築物はＶＰ２よりわずかに少ないＶＰ１を発現しているように思われる。しかし、ＴＴＧ及びＧＴＧ構築物は、ＶＰ１及びＶＰ２タンパク質がほぼ等量存在する類似の化学量論を示しているが、ＡＣＧ構築物は通常、ＶＰ１がＶＰ２タンパク質よりも少ない化学量論を生じていることが繰り返し見出された。ＣＴＧ構築物は、ＶＰ１がＶＰ２タンパク質よりも多い化学量論を一貫して生じている。
【００５７】
ｒＡＡＶの産生率をさらに改良するため、我々は、ＡＣＧ及びＣＴＧコドンが、それぞれコザックコンセンサス配列中「ＧＣＣＧＣＣ（ＮＮＮ）Ｇ」（配列番号８参照）に存在し、「（ＮＮＮ）」がＡＣＧ及びＣＴＧコドンそれぞれの位置を特定している構築物を調製した。ＣＴＧコドンにコザック配列が先行している構築物からの昆虫細胞でのＡＡＶ産生では、コザック配列のない構築物よりも有意に多くのＡＡＶが産生された（データは示されず）。これとは対照的に、ＡＣＧコドンにコザック配列が先行する構築物からの昆虫細胞でのＡＡＶ産生では、ＡＡＶがより多く産生されることはなかった（データは示されず）。
【００５８】
２．５ ｒＡＡＶバッチのマウスへの注入
ウイルスカプシド中のＶＰ１含有量がベクター感染力と関連していることを実証するために、バキュロウイルス産生ＡＡＶ１バッチ及びプラスミド産生ＡＡＶ１バッチをホモ接合型ＬＰＬ（−／−）マウスの筋肉に注入し、活性型ＬＰＬ発現の結果としてのトリグリセリド（ＴＧ）の低下を経時モニターした（図６）。その結果は、ＣＴＧ開始コドンで作製したＡＡＶ１−ＬＰＬバッチは、その他のＡＡＶ１バッチと比較して、予想通りＴＧレベルを速く大きく低下させることを示している。しかし、化学量論は類似しているが、バキュロ−ＣＴＧ変異体でのＴＧ低下は、プラスミド産生ＡＡＶ１（ｐＤＰ１で産生）と比べてはるかに大きいことは注目に値する。
【００５９】
ＣＴＧ構築物で作製したバキュロウイルス産生ＡＡＶは、その他の準最適な開始コドン構築物で作製したＡＡＶと比べて、特にＡＣＧコドンをもつ構築物と比較した場合には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも、よい成績を上げた、すなわち、より大きな感染力を示すことが繰り返し観察された。ＣＴＧ構築物で作製したＡＡＶビリオン中のＶＰ１含有量は、ＶＰ２と比べて多くのＶＰ１を含有し、他の構築物、特にＡＣＧではそうではないことも繰り返し観察された。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＶＰ１カプシドタンパク質に対する、ＴＴＧ又はＡＣＧ開始コドンを含有する組換えバキュロウイルスで産生したｒＡＡＶのウェスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図２】ＬＰＬ質量アッセイの結果を示す図である。マイクロタイタープレートのＨＥＫ２９３細胞に、バキュロウイルス産生システム及びプラスミド産生システムで作製したｒＡＡＶを、１００と２５０００の間の多重感染度で感染させた。感染後の２日目、ＬＰＬＳ４４７Ｘタンパク質を、ＬＰＬＳ４４７Ｘ質量ＥＬＩＳＡにより測定した。「ＤＫＦＺ／ラマ」（Ａ−０７９−０２４及びＡ−０９３−１３０／１３７）は、プラスミド産生システムで作製したｒＡＡＶ−ＬＰＬＳ４４７Ｘバッチを表す。「対照」は、ＬＰＬＳ４４７Ｘを発現していないが、細菌性タンパク質ＬａｃＺは発現しているｒＡＡＶ−ＬａｃＺウイルスバッチを表す。バキュロ／ラマは、ＴＴＧ開始コドンをもつｒＢａｃ−Ｃａｐウイルスを使ってバキュロウイルス産生システムで作製したｒＡＡＶ−ＬＰＬＳ４４７Ｘバッチを表す。
【図３】ＡＡＶベクターバッチの注入後の結果を示す図である。血漿中のトリグリセリド（ＴＧ）レベルを決定した。マウス（ｎ＝２）に、バキュロウイルス産生システム（ＤＪ１７ｊｕｎ０５）及び（ｎ＝２）哺乳動物産生システム（Ｃｌｉｎ）で作製したｒＡＡＶを注入した。前記ベクター投与後の３日目、７日目、及び１４日目に、血液試料を採取し、空腹時ＴＧをアッセイした。
【図４】血漿試料でＬＰＬＳ４４７Ｘ活性を測定した結果を示す図である。マウスに、バキュロウイルス産生システム（ＤＪ１７ｊｕｎ０５）及び哺乳動物産生システム（Ｃ−００４５）で作製したｒＡＡＶを注入した。前記ベクター投与後の１４日目に、血液試料を採取し、ＬＰＬＳ４４７Ｘ活性を決定した。
【図５】図１：昆虫細胞においてバキュロウイルス発現システムで作製した４種類のＡＡＶ１バッチをＮｕｐａｇｅゲルに充填して、ＶＰ１、２、３化学量論を評価した結果を示す図である。レーン：ＶＰ１開始コドンＣＴＧ（レーン１）、ＧＴＧ（レーン２）、ＡＣＧ（レーン３）、ＴＴＧ（レーン４）を含有するバキュロウイルスＣａｐ構築物で調製したＡＡＶ１バッチ。対照として、プラスミド産生ＡＡＶ１バッチ（ＦＳＢ−０２）を充填した（レーン５）。ＣＴＧ開始コドンを使ったＡＡＶ１の化学量論はＦＢＳ−０２バッチと同程度である。
【図６】ＡＡＶ１−ＬＰＬのバッチをＬＰＬ欠損（−／−）マウスの筋肉に、３×１０１２ｇｃ／ｋｇで注入した結果を示す図である。ＣＴＧ開始コドンを含有するｒＢａｃ−Ｃａｐ構築物で調製したＡＡＶ１−ＬＰＬバッチは、他のバッチと比べてトリグリセリド（ＴＧ）低下の点で有意に良好な成績を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、昆虫細胞におけるアデノ随伴ウイルスの産生、及び、改良された感染力を提供するウイルスカプシドタンパク質の割合が改変されたアデノ随伴ウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子治療用の最も有望なウイルスベクターの１つとみなしてよい。ＡＡＶは、分裂中のヒト細胞はもちろん分裂していないヒト細胞にも効率的に感染する能力を有しており、前記ＡＡＶウイルスゲノムは宿主細胞ゲノムの単一の染色体部位に組み込まれ、及び、最も重要なことに、ＡＡＶは多くのヒトの中に存在するが、これまでいかなる疾病とも関連したことがない。こうした利点を考慮して、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、血友病Ｂ、悪性黒色腫、嚢胞性線維症、及びその他の疾病の遺伝子治療臨床試験において評価中である。
【０００３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＡＶ複製を維持する宿主細胞は、すべてが哺乳動物細胞型由来である。したがって、遺伝子治療で使用するためのｒＡＡＶは、たとえば、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞などの哺乳動物細胞系、及びその他の哺乳動物細胞系（たとえば、米国特許第６，１５６，３０３号、米国特許第５，３８７，４８４号、米国特許第５，７４１，６８３号、米国特許第５，６９１，１７６号、米国特許第５，６８８，６７６号、米国特許出願公開第２００２２００８１７２１号、国際特許公開第００／４７７５７号、国際特許公開第００／２４９１６号、及び、国際特許公開第９６／１７９４７号を参照されたい）でこれまで主に産生されてきた。ｒＡＡＶは、典型的には、ＡＡＶ複製起点（逆方向末端反復、すなわちＩＴＲ）に隣接する治療用遺伝子、ＡＡＶ複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０の遺伝子、並びに、ビリオン又は構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の遺伝子を含有するＤＮＡプラスミドを提供することにより、そのような哺乳動物細胞培養系において産生される。さらに、前記ＡＡＶ遺伝子の発現を増強し、ベクター収量を改良するために、アデノウイルス由来の初期遺伝子（Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、ＶＡＲＮＡ）を含有するプラスミドが提供される（Ｇｒｉｍｍら、１９９８年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、第９巻、２７４５頁〜２７６０頁を参照されたい）。しかし、これらの哺乳動物細胞培養系の大半において、細胞当たり産生されるＡＡＶ粒子数は約１０４粒子である（Ｃｌａｒｋ、２００２年、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．、第６１巻（附録１）、９頁〜１５頁に掲載）。臨床研究のためには、ｒＡＡＶの１０１５以上の粒子が必要となるであろう。この数のｒＡＡＶ粒子を作製するためには、およそ１０１１の培養ヒト２９３細胞、すなわち５０００個の１７５ｃｍ２フラスコ相当量の細胞を使ったトランスフェクション及び培養が必要になると考えられ、最大１０１１の２９３細胞をトランスフェクトすることになる。したがって、臨床試験用の材料を獲得するための哺乳動物細胞培養系を使ったｒＡＡＶの大規模作製は、問題があることがすでに判明しており、工業規模での製造は実現可能ですらない可能性がある。さらに、哺乳動物細胞培養で産生される臨床用途のためのベクターは、前記哺乳動物宿主細胞に存在する望ましくない、おそらく病原性の物質に汚染される危険が常に存在する。
【０００４】
哺乳動物作製システムのこれらの問題を克服するために、最近、昆虫細胞を使ったＡＡＶ作製システムが開発された（Ｕｒａｂｅら、２００２年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、第１３巻、１９３５頁〜１９４３頁；米国特許出願公開第２００３０１４８５０６号、及び米国特許出願公開第２００４０１９７８９５号）。バキュロウイルス発現系システムからの昆虫細胞でのＡＡＶの産生のためには、いくつかの改変が必要であった。なぜならば、哺乳動物細胞では、前記３種類のＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）の正確な化学当量での発現は、２種類のスプライス受容部位の交互利用と、昆虫細胞により正確に産生されることがないＶＰ２のＡＣＧ開始コドンの準最適な利用を組み合わせることに頼っているからである。前記３種類のカプシドタンパク質の正確な化学当量は、前記ＡＡＶ粒子の感染力にとり重要である。量が減少したＶＰ１を含有するＡＡＶ粒子は感染力が低下し、ＶＰ１は、感染力においてある機能を有するホスホリパーゼＡ２活性を含有することは公知である（Ｇｉｒｏｄら、２００２年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、第８３巻、９７３頁〜８頁）。
【０００５】
したがって、前記３種類のカプシドタンパク質の発現のために、Ｕｒａｂｅら（２００２年、上記を参照）は、スプライシングを必要とせずに３種類のＶＰタンパク質をすべて発現することができる単一のポリシストロン性メッセンジャーに転写される構築物を使用している。前記３種類のカプシドタンパク質の正確な化学当量での作製を目指すため、前記ＶＰ１読取り枠、すなわちスキャニングリボソームにより読み取られる最初の開始コドンに、準最適な開始コドンＡＣＧが賦与されており、このコドンを取り囲む配列が最適化されている。Ｕｒａｂｅら（２００２年、上記を参照）は、昆虫細胞で読み通しをしているリボソームは、前記３種類のウイルスカプシドタンパク質の野生型ＡＡＶに近い化学当量をもたらすことを報告している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、本発明者らは、バキュロウイルス系で産生されるＡＡＶベクターでは、ＶＰ１はＶＰ２と比べてまだ準最適なレベルで発現されていること、並びに、このために、たとえば、哺乳動物２９３細胞で産生される従来のＡＡＶベクターと比較した場合、マウスでのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ研究では感染力が低下することを見出した。したがって、感染力が改良されたｒＡＡＶベクターのためのバキュロウイルスベースの作製システムの必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
定義
本明細書で使用するように、用語「作動可能に連結される」とは、ポリヌクレオチド（又は、ポリペプチド）エレメントが機能的関係で連結することである。核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係におかれると、「作動可能に連結されている」。たとえば、転写調節配列は、それがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるとは、連結中のＤＮＡ配列は典型的に近接しており、２個のタンパク質コード化領域を結合させる必要がある場合には、読み枠が近接していることを意味する。
【０００８】
「発現制御配列」とは、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の発現を調節する核酸配列のことである。発現制御配列は、それがヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を制御し調節する場合には、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結されている」。したがって、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、転写ターミネーター、タンパク質コード化遺伝子の前の開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び終止コドンを含むことができる。用語「発現制御配列」は、最小限、その存在が発現に影響を与えるように設計されている配列を含むことを意図されており、追加の有利な成分も含むことができる。たとえば、リーダー配列及び融合パートナー配列は発現制御配列である。この用語は、枠内及び枠外の望ましくない潜在的な開始コドンが配列から除去されるように、核酸配列を設計することも含むことができる。発現制御配列は、望ましくない潜在的スプライス部位が除去されるように、核酸配列を設計することも含むことができる。発現制御配列は、ポリＡテール、すなわち、ポリＡ配列と呼ばれる配列であるｍＲＮＡの３’末端の一連のアデニン残基の付加を指示する配列、すなわちポリアデニル化配列（ｐＡ）を含む。発現制御配列は、ｍＲＮＡの安定性を増強するように設計することもできる。転写及び翻訳安定性に影響を与える発現制御配列、たとえば、プロモーターも、翻訳を生じさせる配列、たとえば、コザック配列も、昆虫細胞においては公知である。発現制御配列は、より低い発現レベルでもより高い発現レベルでも実現されるように、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列を調節するような性質をもつことができる。
【０００９】
本明細書で使用するように、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」とは、１個又は複数個のコード配列の転写を制御するように機能し、前記コード配列の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置する核酸フラグメントのことであり、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、並びに、転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク質の結合部位、及び、前記プロモーターからの転写量を直接的に又は間接的に調節するよう作用することが当業者の公知の他のすべてのヌクレオチド配列を含むがこれに限定されるものではない他のすべてのＤＮＡ配列の存在により構造的に同定される。「構成的」プロモーターとは、大部分の生理学的及び発生上の条件の下で大半の組織で活性なプロモーターのことである。「誘導性」プロモーターとは、たとえば、化学的誘導因子の適用により生理学的に又は発生的に調節されるプロモーターのことである。「組織特異的」プロモーターは、特定型の組織又は細胞においてのみ活性である。
【００１０】
用語「実質的に同一の」、「実質的同一性」又は「基本的に類似している」若しくは「基本的類似性」とは、２個のペプチド又は２個のヌクレオチド配列が、デフォルトパラメータを使ったプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによりなど、最適に整列された場合、本明細書の別の場所で定義された少なくとも一定割合の配列同一性を共有することを意味する。ＧＡＰは、ニードルマンとブンシュのグローバル整列アルゴリズムを使って、２個の配列をその全長にわたって整列させ、適合数を最大限にし、ギャップ数を最小限にする。一般に、前記ＧＡＰデフォルトパラメータが使われ、ギャップ挿入ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチドでは、使用されるデフォルトスコア行列はｎｗｓｇａｐｄｎａ、及びタンパク質では、デフォルトスコア行列はＢｌｏｓｕｍ６２である（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ 第８９巻、９１５頁〜９１９頁）。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と基本的に類似している又はある程度の配列同一性を有すると言われる場合、ＤＮＡ配列中のチミン（Ｔ）はＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に相当することは明らかである。配列アラインメント及びパーセンテージ配列同一性の点数は、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、９６５８ スクラントンロード、サンディエゴ、カリフォルニア ９２１２１−３７５２ 米国、から入手可能なＧＣＧウィスコンシンパッケージ、バージョン１０．３、又はウィンドウズ（登録商標）用のオープンソースソフトウェアエムボス（最新版２．７．１−０７）などのコンピュータプログラムを使って決定してよい。代わりに、パーセント類似性又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等などのデータベースを検索することにより決定してもよい。
【００１１】
本発明は、哺乳動物細胞における核酸の導入及び／又は発現のためのベクターとして使用するための、動物パルボウイルス、特に感染性ヒト又はサルＡＡＶなどのディペンドウイルス、及びその成分（たとえば、動物パルボウイルスゲノム）の使用に関する。特に、本発明は、昆虫細胞で産生される場合のそのようなパルボウイルスベクターの感染力の改良に関する。
【００１２】
パルボウイルス科のウイルスは、小型のＤＮＡ動物ウイルスである。パルボウイルス科は、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科と、昆虫に感染するデンソウイルス亜科の２つの亜科に分類される。パルボウイルス亜科のウイルスは本明細書ではパルボウイルスと呼ばれ、ディペンドウイルス属を含む。その属の名称から推定されるように、ディペンドウイルス属のウイルスは、細胞培養における増殖性感染のためには、アデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を通常必要とする点で独特である。ディペンドウイルス属には、通常はヒトに感染するＡＡＶ（たとえば、セロタイプ１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類に感染するＡＡＶ（たとえば、セロタイプ１及び４）、並びに、他の温血動物に感染する近縁ウイルス（たとえば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）がある。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のウイルスに関するそれ以上の情報は、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ、「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第６９章（第３版、１９９６年）に記載されている。便宜のため、本発明は、ＡＡＶを参照することにより、本明細書でさらに例証され説明される。しかし、本発明はＡＡＶに限定されるものではなく、他のパルボウイルスにも等しく適用してよいと理解される。
【００１３】
すべての既知のＡＡＶセロタイプのゲノム構成は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは、長さが約５０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子である。逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、非構造的複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造（ＶＰ）タンパク質の独自のコードヌクレオチド配列に隣接している。前記ＶＰタンパク質はカプシドを形成する。末端１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ形ヘアピンを形成するエネルギー的に安定した分子内二本鎖を形成するように、組織化される。これらのヘアピン構造体は、ウイルスＤＮＡ複製のための起点として機能し、細胞性ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして働く。前記Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐタンパク質、すなわちＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０をコードしている。Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８は、ｐ５プロモーターから転写され、並びに、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０はｐ１９プロモーターから転写される。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰタンパク質、すなわちＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードしている。ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから転写される。
【００１４】
第１の態様では、本発明は、動物パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む読取り枠を含み、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンがＡＴＧではなく、ＡＣＧではない準最適な開始コドンであるヌクレオチド配列に関する。準最適とは本明細書では、コドンが、正常なＡＴＧコドンと比べた場合、他の点では同一の状況において翻訳の開始の効率が低いことを意味すると理解される。好ましくは、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンが、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＧＴＧ、及びＣＴＧから選択され、さらに好ましくは、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンが、ＴＴＧ、ＧＴＧ、及びＣＴＧから選択され、最も好ましくは、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンがＣＴＧである。前記動物パルボウイルスは、好ましくは、ディペンドウイルス、さらに好ましくは、ヒト又はサルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。
【００１５】
動物パルボウイルスＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む読取り枠を含み、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳の開始コドンがＴＴＧ又はＧＴＧ開始コドンであるヌクレオチド配列では、ビリオンのＶＰ１対ＶＰ２タンパク質の量の割合はほぼ等しい、すなわち等モルであり、開始コドンがＣＴＧの場合には、ビリオンのＶＰ１タンパク質の量はＶＰ２の量よりも多い。開始コドンがＡＣＧの場合には、ビリオンのＶＰ１タンパク質の量は、ＶＰ２の量よりも少ない。ビリオンの感染力は、ビリオン中のＶＰ２に対するＶＰ１の割合とともに増加する。
【００１６】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための本発明の好ましいヌクレオチド配列は、配列番号７の９ヌクレオチド配列、又は配列番号７に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列を、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に含むヌクレオチド配列である。配列番号７のヌクレオチド配列と実質的な同一性を有し、ＶＰ１の発現を増加させるのに寄与するであろう配列は、たとえば、配列番号７の９ヌクレオチド配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％の同一性を有する配列である。
【００１７】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための本発明のさらに好ましいヌクレオチド配列は、前記ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの周辺に、コザックコンセンサス配列を含む発現制御配列を含むヌクレオチド配列である。コザックコンセンサス配列は、本明細書では、ＧＣＣＲＣＣ（ＮＮＮ）Ｇ（配列番号８）と定義され、Ｒはプリン（すなわち、Ａ又はＧ）であり、（ＮＮＮ）は上の本明細書で定義された準最適な開始コドンのうちのいずれかを表す。好ましくは、本発明のヌクレオチド配列のコザックコンセンサス配列では、ＲはＧである。したがって、コザックコンセンサス配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための本発明のヌクレオチド配列は、好ましくは、ＧＣＣＡＣＣ（ＡＣＧ）Ｇ、ＧＣＣＧＣＣ（ＡＣＧ）Ｇ、ＧＣＣＡＣＣ（ＴＴＧ）Ｇ、ＧＣＣＧＣＣ（ＴＴＧ）Ｇ、ＧＣＣＡＣＣ（ＧＴＧ）Ｇ、ＧＣＣＧＣＣ（ＧＴＧ）Ｇ、ＧＣＣＡＣＣ（ＣＴＧ）Ｇ、及びＧＣＣＧＣＣ（ＣＴＧ）Ｇから選択され、さらに好ましくは、コザックコンセンサス配列を含むヌクレオチド配列は、ＧＣＣＡＣＣ（ＣＴＧ）Ｇ、及びＧＣＣＧＣＣ（ＣＴＧ）Ｇから選択され、最も好ましくは、コザックコンセンサス配列を含むヌクレオチド配列は、ＧＣＣＧＣＣ（ＣＴＧ）Ｇである。本明細書の括弧内のヌクレオチドは、ＶＰ１タンパク質の開始コドンの位置を示す。
【００１８】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための本発明のヌクレオチド配列は、さらに好ましくは、ヌクレオチドの１２位のＧ、ヌクレオチドの２１位のＡ、及びヌクレオチドの２４位のＣの中から選択される、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするにヌクレオチド配列の少なくとも１個の改変を含む。他のセロタイプのＶＰ１の翻訳のための考えられる誤った開始部位を除去することは、昆虫細胞で認識されることもある推定上のスプライス部位の除去と同じように、当業者によってよく理解されているであろう。昆虫細胞における適切な発現のための野生型ＡＡＶ配列の種々の改変は、たとえば、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークに記載されているような公知の遺伝子工学技術の適用により実現される。ＶＰ及びビリオンの収量を増加させる、又は、改変されたトロピズムなどの他の望ましい効果を有する、又は、前記ビリオンの抗原性を低下させることができると考えられるＶＰコード領域の種々の追加の改変は、当業者に公知である。これらの改変は本発明の範囲内である。
【００１９】
好ましくは、前記ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする本発明のヌクレオチド配列は、昆虫細胞での発現のために、発現制御配列に作動可能に連結されている。これらの発現制御配列は、昆虫細胞で活性があるプロモーターを少なくとも含んでいるであろう。昆虫宿主細胞で外来遺伝子を発現するための当業者に公知の技術を使って、本発明を実行することができる。昆虫細胞におけるポリペプチドの分子工学及び発現の方法論は、たとえば、ＳｕｍｍｅｒｓとＳｍｉｔｈ、１９８６年、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘ；Ｌｕｃｋｏｗ、１９９１年、Ｉｎ Ｐｒｏｋｏｐら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ’Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、９７頁〜１５２頁；Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ．とＲ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ、１９９２年、Ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、英国、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ；Ｄ．Ｒ．、Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｖ．Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ、１９９２年、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク；Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎとＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．、１９９５年、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３９巻；米国特許第４，７４５，０５１号、米国特許出願公開第２００３１４８５０６号、及び国際公開第０３／０７４７１４号に記載されている。前記ＡＡＶカプシドタンパク質をコードしている本発明のヌクレオチド配列の転写に特に適したプロモーターは、たとえば、多面体プロモーターである。しかし、昆虫細胞で活性である他のプロモーター、たとえば、ｐ１０、ｐ３５、又はＩＥ−１プロモーター、及び上の参考文献に記載の追加のプロモーターは当技術分野で公知である。
【００２０】
好ましくは、昆虫細胞での前記ＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための核酸構築物は、昆虫細胞適合性ベクターである。「昆虫細胞適合性ベクター」又は「ベクター」は、昆虫若しくは昆虫細胞の産生的形質転換又はトランスフェクションが可能な核酸分子と理解されている。例となる生物学的ベクターには、プラスミド、直鎖状核酸分子、及び組換えウイルスがある。いかなるベクターも、それが昆虫細胞適合性がある限り用いることができる。このベクターは昆虫細胞ゲノムに組み込まれてもよいが、昆虫細胞内でのベクターの存在は永久である必要はなく、一過性のエピソームベクターも含まれる。このベクターは、既知のいかなる手段によっても、たとえば、細胞の化学的処理、エレクトロポレーション、又は感染によって導入することができる。好ましい実施形態では、このベクターは、バキュロウイルス、すなわちウイルスベクター、又はプラスミドである。さらに好ましい実施形態では、このベクターはバキュロウイルス、すなわち、この構築物はバキュロウイルスベクターである。バキュロウイルスベクター及びその使用のための方法は、昆虫細胞の分子工学に関して上に引用した参考文献に記載されている。
【００２１】
別の態様では、本発明は、上に定義した本発明の核酸構築物を含む昆虫細胞に関する。ＡＡＶの複製を可能にし、培養下で維持することができるいかなる昆虫細胞も、本発明に従って使用することができる。たとえば、使われる細胞系は、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞系、又はカ細胞系、たとえば、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来細胞系由来でよい。好ましい昆虫細胞、又は細胞系は、バキュロウイルス感染に感受性の昆虫種由来の細胞であり、たとえば、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲ１、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、ＭＧ−１、Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍ１、Ｈａ２３０２、Ｈｚ２Ｅ５、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＨｉｇｈ Ｆｉｖｅがある。
【００２２】
本発明に従った好ましい昆虫細胞は、（ａ）少なくとも１個のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列、（ｂ）昆虫細胞での発現のために発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２、又はＲｅｐ４０コード配列を含む第３のヌクレオチド配列、及び（ｃ）昆虫細胞での発現のために発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８、又はＲｅｐ６８コード配列を含む第４のヌクレオチド配列、をさらに含む。
【００２３】
本発明に照らして、「少なくとも１個のＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列」は、「Ａ」、「Ｂ」、及び「Ｃ」領域とも呼ばれる大部分が相補的で、対称的に配置された配列を含む回文配列を意味すると理解される。前記ＩＴＲは、複製起点、つまり複製において「シス」の役割を有する部位、すなわち、回文配列及び回文配列の内部の特定の配列を認識するトランス作動性の複製タンパク質（たとえば、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８）の認識部位である部位として機能する。前記ＩＴＲ配列の対称性の１つの例外は、前記ＩＴＲの「Ｄ」領域である。「Ｄ」領域は独特である（１つのＩＴＲ内に相補体をもたない）。一本鎖ＤＮＡのニッキングはＡとＤ領域間の接合部で起きる。ここは、新たなＤＮＡ合成が開始される領域である。前記Ｄ領域は通常、回文配列の一方の方向に位置し、核酸複製段階に方向性を与える。哺乳動物細胞で複製するＡＡＶは、典型的に２個のＩＴＲ配列を有する。しかし、結合部位が前記Ａ領域の両方の鎖に存在し、Ｄ領域は回文配列のそれぞれの側に１つずつ対称的に位置するようにＩＴＲを工学的に改変することは可能である。二本鎖環状ＤＮＡ鋳型（たとえば、プラスミド）上で、次にＲｅｐ７８−又はＲｅｐ６８−支援核酸複製が両方向に進行し、１個のＩＴＲで環状ベクターのＡＡＶ複製には十分である。したがって、１個のＩＴＲヌクレオチド配列を本発明に照らして使用することができる。しかし、好ましくは、２個の又はさらに別の数の規則的なＩＴＲが使われる。最も好ましくは、２個のＩＴＲ配列が使われる。ウイルスベクターの安全を考慮して、細胞内への最初の導入の後はさらに増殖することができないウイルスベクターを構築するのが好ましいであろう。移植患者での望ましくないベクター増殖を制限するためのそのような安全装置は、米国特許出願公開第２００３１４８５０６号に記載されたキメラＩＴＲを有するｒＡＡＶを使うことにより提供してもよい。
【００２４】
用いるベクター又は核酸構築物の数は本発明では制限はない。たとえば、１個、２個、３個、４個、５個、６個又はそれ以上のベクターを用いて、本発明の方法に従って昆虫細胞でＡＡＶを作製することができる。６個のベクターが用いられる場合、１個のベクターはＡＡＶ ＶＰ１をコードし、別のベクターはＡＡＶ ＶＰ２をコードし、さらに別のベクターはＡＡＶ ＶＰ３をコードし、さらに別のベクターはＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０をコードし、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８は別のベクターにコードされ、最後のベクターは少なくとも１個のＡＡＶ ＩＴＲを含む。追加のベクターを用いて、たとえば、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０、並びに、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８を発現してもよい。使われるベクターが６個未満の場合、前記ベクターは、少なくとも１個のＡＡＶ ＩＴＲと、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、Ｒｅｐ５２／Ｒｅｐ４０、及びＲｅｐ７８／Ｒｅｐ６８のコード配列の種々の組合せを含むことができる。好ましくは、２個のベクター又は３個のベクターが使われ、上記のように２個のベクターのほうが好ましい。２個のベクターを使う場合、好ましくは、前記昆虫細胞は、（ａ）その構築物が、上の（ｂ）及び（ｃ）で定義された第３及び第４のヌクレオチド配列、すなわち、昆虫細胞での発現のために少なくとも１個の発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列を含む第３のヌクレオチド配列、及び、昆虫細胞での発現のために少なくとも１個の発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列を含む第４のヌクレオチド配列、をさらに含む、上記のＡＡＶカプシドタンパク質の発現のための第１の核酸構築物、並びに（ｂ）少なくとも１個のＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含む上の（ａ）で定義された第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸構築物、を含む。３個のベクターが使われる場合、好ましくは、カプシドタンパク質の発現のためとＲｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ７８、及びＲｅｐ６８タンパク質の発現のために別個のベクターが使われる点を除いて、２個のベクターに使われるのと同じ配置が使われる。それぞれのベクター上の配列は、互いに対していかなる順序でもよい。たとえば、１個のベクターが、ＩＴＲ及びＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦを含む場合、前記ＶＰ ＯＲＦは、ＩＴＲ配列間のＤＮＡが複製されると、前記ＶＰ ＯＲＦが複製される、又は複製されないように、ベクター上に位置することができる。さらにたとえば、Ｒｅｐコード配列及び／又はＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、ベクター上でいかなる順序でもよい。第２、第３及びそれ以上の核酸構築物は好ましくは昆虫細胞適合性ベクターであり、好ましくは上記のバキュロウイルスベクターであることも理解される。代わりに、本発明の昆虫細胞では、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、及び第４のヌクレオチド配列、並びに随意にそれ以上のヌクレオチド配列のうちの１個又は複数個が、昆虫細胞のゲノムに安定的に組み込まれてもよい。当技術分野の通常技術の１つでは、ヌクレオチド配列を昆虫ゲノムに安定的に導入する方法、及びゲノム中にそのようなヌクレオチド配列を有する細胞を同定する方法が知られている。ゲノムへの組込みは、たとえば、昆虫ゲノムの領域に高度に相同なヌクレオチド配列を含むベクターの使用によって支援してもよい。トランスポゾンなどの特定の配列の使用は、ヌクレオチド配列をゲノムに導入する別の方法である。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の昆虫細胞に存在する第２のヌクレオチド配列、すなわち少なくとも１個のＡＡＶ ＩＴＲを含む配列は、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列をさらに含み、それにより、好ましくは対象の遺伝子産物をコードする前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が、昆虫細胞で産生されるＡＡＶのゲノムに組み込まれる。好ましくは、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞での発現のための配列である。好ましくは、第２のヌクレオチド配列は、２個のＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、その中では、対象の遺伝子産物をコードする前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が、前記２個のＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列の間に位置している。好ましくは、（哺乳動物細胞での発現のために）対象の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、その配列が２個の規則的ＩＴＲの間に位置している、又は２個のＤ領域で工学的に改変されたＩＴＲの一方の側に位置している場合には、昆虫細胞で産生されるＡＡＶゲノムに組み込まれる。
【００２６】
したがって、上の本明細書で定義された第２のヌクレオチド配列は、昆虫細胞で複製されるＡＡＶゲノムに組み込まれるように位置している、哺乳動物細胞での発現のために少なくとも１個の「対象の遺伝子産物」をコードするヌクレオチド配列を含んでいてよい。いかなるヌクレオチド配列も、本発明に従って産生されるＡＡＶをトランスフェクトした哺乳動物細胞での後の発現のために組み込むことができる。前記ヌクレオチド配列は、たとえば、ＲＮＡｉ剤、すなわち、たとえば、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）などのＲＮＡ干渉が可能なＲＮＡｉ医薬品を発現するように、タンパク質をコードしていてよい。「ｓｉＲＮＡ」とは、哺乳動物細胞では毒性のない短い二本鎖ＲＮＡである低分子干渉ＲＮＡを意味する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ 第４１１巻、４９４頁〜９８頁；Ｃａｐｌｅｎら、２００１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、第９８巻、９７４２頁〜４７頁）。好ましい実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、２個のヌクレオチド配列を含んでいてよく、それぞれが哺乳動物細胞での発現のために、１個の対象の遺伝子産物をコードしている。対象の産物をコードする前記２個のヌクレオチド配列はそれぞれ、昆虫細胞で複製されるｒＡＡＶゲノムに組み込まれるように位置している。
【００２７】
哺乳動物細胞での発現のための対象の産物は、治療用遺伝子産物でよい。治療用遺伝子産物は、ポリペプチド、若しくはＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）、又は、標的細胞で発現されると、たとえば、望ましくない活性の消失、たとえば、感染細胞の消失、若しくは、たとえば、酵素活性に欠損を引き起こす遺伝子異常の補完などの望ましい治療効果を提供する他の遺伝子産物でもよい。治療用ポリペプチド遺伝子産物の例には、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）、第ＩＸ因子、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、好ましくはＬＰＬ Ｓ４４７Ｘ；国際特許公開第０１／００２２０号を参照されたい）、アポリポタンパク質Ａ１、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節相互作用タンパク質（ＲＰ−ＧＲＩＰ）、及びサイトカイン又は、たとえば、ＩＬ−１０のようなインターロイキンがある。
【００２８】
代わりに、又はさらに第２の遺伝子産物として、上の本明細書に定義された第２のヌクレオチド配列は、細胞の形質転換及び発現を評価するためのマーカータンパク質として働くポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいてよい。この目的に適したマーカータンパク質は、たとえば、蛍光タンパク質ＧＦＰ、及び選択可能なマーカー遺伝子ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地上での選別のため）、細菌のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢ上での選別のため）、Ｔｎ５アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Ｇ４１８上での選別のため）、及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（メトトレキサート上での選別のため）、ＣＤ２０、低親和性神経成長因子遺伝子である。これらのマーカー遺伝子とその使用方法を得るための情報源は、ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークに提供されている。さらに、上の本明細書に定義された第２のヌクレオチド配列は、必要とみなされた場合には、本発明のｒＡＡＶを形質導入した細胞由来の、被験者の治療を可能にするフェイルセーフ機構として働く可能性のあるポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含んでいてもよい。そのようなヌクレオチド配列は、自殺遺伝子と呼ばれることが多いが、プロドラックをタンパク質が発現されているトランスジェニック細胞を死滅させることができる有毒物質に変換することができるタンパク質をコードしている。そのような自殺遺伝子に適した例には、たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のシトシンデアミナーゼ遺伝子、又は単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、及び水痘帯状疱疹ウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子の１つがあり、その場合、ガンシクロビルを被験者のトランスジェニック細胞を死滅させるプロドラッグとして使用してよい（たとえば、Ｃｌａｉｒら、１９８７年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、第３１巻、８４４頁〜８４９頁を参照されたい）。
【００２９】
別の実施形態では、対象の遺伝子産物は、ＡＡＶタンパク質、特に、Ｒｅｐ７８若しくはＲｅｐ６８などのＲｅｐタンパク質、又はその機能的フラグメントでよい。Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８をコードするヌクレオチド配列は、本発明のｒＡＡＶゲノム上に存在し、本発明のｒＡＡＶを形質導入された哺乳動物細胞で発現される場合、前記形質導入された哺乳動物細胞のゲノムへの前記ｒＡＡＶの組込みを可能にする。ｒＡＡＶ形質導入又は感染哺乳動物細胞でのＲｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８の発現は、前記ｒＡＡＶにより細胞に導入される他のいかなる対象の遺伝子産物も長期に又は永久に発現させることにより、前記ｒＡＡＶのある種の使用の利点を提供することができる。
【００３０】
本発明のｒＡＡＶベクターでは、哺乳動物細胞での発現のために対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列は、好ましくは、少なくとも１個の哺乳動物細胞適合性発現制御配列、たとえば、プロモーターに作動可能に連結されている。多くのそのようなプロモーターが当技術分野では公知である（ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌ、２００１年、上記を参照されたい）。ＣＭＶプロモーターなどの、多くの細胞型で広く発現される構成的プロモーターを使用してよい。しかし、誘導性、組織特異的、細胞型特異的、又は細胞周期特異的であるプロモーターがより好ましいであろう。たとえば、肝臓特異的発現では、プロモーターは、α１アンチトリプシンプロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルブミンプロモーター、ＬＰＳ（チロキシン結合グロブリン）プロモーター、ＨＣＲ−ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ−ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター及びアポリポタンパク質Ｅプロモーターから選択してよい。他の例には、腫瘍選択的な、及び、特に、神経学的細胞腫瘍選択的な発現には、Ｅ２Ｆプロモーター（Ｐａｒｒら、１９９７年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、第３巻、１１４５頁〜９頁）、又は単核血液細胞での使用には、ＩＬ−２プロモーター（Ｈａｇｅｎｂａｕｇｈら、１９９７年、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；第１８５巻、２１０１頁〜１０頁）がある。
【００３１】
ＡＡＶはいくつかの哺乳動物細胞に感染することができる。たとえば、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５（１１）、３２５１頁〜３２６０頁（１９８５年）、及びＧｒｉｍｍら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０（１５）、２４４５頁〜２４５０頁（１９９９年）を参照されたい。しかし、ヒト滑膜線維芽細胞のＡＡＶ形質導入は、類似のマウス細胞よりも有意に効率的であり（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ、３：１（２００１年））、ＡＡＶの細胞トロピシティはセロタイプ間で異なる。たとえば、Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、９７（７）、３４２８頁〜３４３２頁（２０００年）（哺乳動物ＣＮＳ細胞トロピズム及び形質導入効率に関して、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、及びＡＡＶ５間の相違を論じている）を参照されたい。
【００３２】
昆虫細胞でのＡＡＶの作製のために本発明で使用してよいＡＡＶ配列は、いかなるＡＡＶセロタイプのゲノム由来でもよい。一般に、ＡＡＶセロタイプは、アミノ酸及び核酸レベルで、顕著に相同なゲノム配列を有し、同一の一連の遺伝機能を提供し、基本的に物理的及び機能的に等価なビリオンを産生し、並びに実質的に同一の機構により複製し組み立てられる。種々のＡＡＶセロタイプのゲノム配列及びゲノム類似性の概観は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８９７９０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０１９０１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４３３０３，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６、Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９７年、Ｊ．Ｖｉｒ．、第７１巻、６８２３頁〜３３頁）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら（１９８３年、Ｊ．Ｖｉｒ．、第４５巻、５５５頁〜６４頁）、Ｃｈｌｏｒｉｎｉら（１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒ．、第７３巻、１３０９頁〜１３１９頁）、Ｒｕｔｌｅｄｇｅら（１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒ．、第７２巻、３０９頁〜３１９頁）、及びＷｕら（２０００年、Ｊ．Ｖｉｒ．、第７４巻、８６３５頁〜４７頁）を参照されたい。ヒト又はサルアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）セロタイプは、本発明に照らして使用するためのＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい供給源であり、さらに好ましくは、通常、ヒト（たとえば、セロタイプ１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５、及び６）又は霊長類（たとえば、セロタイプ１及び４）に感染するＡＡＶセロタイプである。
【００３３】
好ましくは、本発明に照らして使用するためのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４に由来する。同様に、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ７８、及び／又はＲｅｐ６８コード配列は、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ４由来である。しかし、本発明に照らして使用するためのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、既知の４２個のセロタイプのいずれからでも、さらに好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、若しくはＡＡＶ９、又は、たとえば、カプシドシャフリング技術により得られる新たに開発されたＡＡＶ様粒子、及びＡＡＶカプシドライブラリーから採用してよい。
【００３４】
ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列は、特に大半のセロタイプの間で保存されている。種々のＡＡＶセロタイプのＲｅｐ７８タンパク質は、たとえば、８９％超同一であり、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、及びＡＡＶ６間のゲノムレベルでの全ヌクレオチド配列同一性は約８２％である（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３（２）９３９頁〜９４７頁）。さらに、多くのＡＡＶセロタイプのＲｅｐ配列及びＩＴＲは、哺乳動物細胞でのＡＡＶ粒子の産生の際に他のセロタイプ由来の相応する配列と効率的にクロス補完する（すなわち、機能的に置換する）ことが公知である。米国特許出願公開第２００３１４８５０６号では、ＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列も昆虫細胞で他のＡＡＶ Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列に効率的にクロス補完することが報告されている。
【００３５】
前記ＡＡＶ ＶＰタンパク質は、ＡＡＶビリオンの細胞トロピシティを決定することが公知である。前記ＶＰタンパク質コード化配列は、異なるＡＡＶセロタイプ間でＲｅｐタンパク質及び遺伝子に比べ有意に保存されていない。Ｒｅｐ及びＩＴＲ配列が他のセロタイプの相応する配列にクロス補完する能力を備えているために、セロタイプ（たとえば、ＡＡＶ３）のカプシドタンパク質及び別のＡＡＶセロタイプ（たとえば、ＡＡＶ２）のＲｅｐ及び／又はＩＴＲ配列を含む偽型ＡＡＶ粒子の産生が可能になる。そのような偽型ＡＡＶ粒子は本発明の一部である。
【００３６】
改変された「ＡＡＶ」配列も、たとえば、昆虫細胞でのｒＡＡＶベクターの産生のために、本発明に照らして使用することができる。そのような改変された配列には、たとえば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、若しくはＡＡＶ９に対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、若しくはそれ以上のヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列同一性を有し（たとえば、約７５〜９９％ヌクレオチド配列同一性を有する配列）、そのＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰは野生型ＡＡＶ ＩＴＲ、Ｒｅｐ、又はＶＰ配列に代わって使うことができる。
【００３７】
ＡＡＶ５は、多くの点で他のＡＡＶセロタイプに類似しているが、他の既知のヒト及びサルセロタイプ以上に、他のヒト及びサルＡＡＶセロタイプとは異なっている。それを考慮すると、ＡＡＶ５の産生は、昆虫細胞での他のセロタイプの産生とは異なっていてよい。本発明の方法を用いてｒＡＡＶ５を作製する場合、１個又は複数個のベクターが、ＡＡＶ５ ＩＴＲを含むヌクレオチド配列、ＡＡＶ５ Ｒｅｐ５２及び／又はＲｅｐ４０コード配列を含むヌクレオチド配列、並びに、ＡＡＶ５ Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８コード配列を含むヌクレオチド配列を、複数個のベクターの場合は集団的に、含むのが好ましい。そのようなＩＴＲ及びＲｅｐ配列は、昆虫細胞でｒＡＡＶ５又は偽型ｒＡＡＶ５ベクターを効率的に産生するように、要望通りに改変することができる。たとえば、昆虫細胞でのｒＡＡＶ５の産生が改良されるように、前記Ｒｅｐ配列の開始コドンを改変でき、ＶＰスプライス部位を改変する、若しくは除去することができ、並びに／又は前記ＶＰ１開始コドン及び近接するヌクレオチドを改変することができる。
【００３８】
追加の態様では、本発明は、ＡＡＶビリオンに関する。好ましくは、そのゲノムに対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が自然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質の化学量論において、ＶＰ１の量が（ａ）ＶＰ２の量の少なくとも１００、１０５、１１０、１２０、１５０、２００、若しくは４００％である、又は（ｂ）ＶＰ３の量の少なくとも８、１０、１０．５、１１、１２、１５、２０、若しくは４０％である、又は（ｃ）少なくとも（ａ）と（ｂ）両方で定義されるＡＡＶビリオンである。好ましくは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の量は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のそれぞれに共通のエピトープを認識する抗体を使って決定される。ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３の相対量を定量化することができる種々の免疫アッセイを、当技術分野では利用することができる（たとえば、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｅ．ＨａｒｌｏｗとＤ．Ｌａｎｅ、１９９９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、を参照されたい）。前記３種類のカプシドタンパク質に共通のエピトープを認識する適切な抗体は、たとえば、マウス抗Ｃａｐ Ｂ１抗体である（ドイツ、Ｐｒｏｇｅｎ社より市販されている）。
【００３９】
本発明に従った好ましいＡＡＶは、そのゲノムに対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が自然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶビリオンがアミノ酸の１位にロイシン又はバリンを含むＶＰ１カプシドタンパク質を含む、ビリオンである。本発明に従ったさらに好ましいＡＡＶビリオンは、上記の割合のカプシドタンパク質を有し、アミノ酸の１位にロイシン又はバリンを含むＶＰ１カプシドタンパク質を含む。たとえば、下の本明細書に定義する方法で、上記の昆虫細胞から得ることができるＡＡＶビリオンはさらに好ましい。
【００４０】
上記の割合のカプシドタンパク質を有する本発明のＡＡＶビリオンの利点は、その改良された感染力である。特に、感染力は、カプシドのＶＰ２及び／又はＶＰ３の量に対して、カプシドのＶＰ１タンパク質の量が増加するに従って、増加する。ＡＡＶビリオンの感染力は、本明細書では、トランス遺伝子の発現割合及びトランス遺伝子から発現される産物の量又は活性から推定される、ビリオンに含まれるトランス遺伝子の形質導入の効率を意味すると理解されている。
【００４１】
別の態様では、したがって、本発明は、昆虫細胞でのＡＡＶの作製方法に関する。好ましくは、前記方法は、（ａ）上の本明細書で定義された昆虫細胞を、ＡＡＶが産生されるような条件の下で培養する段階、及び（ｂ）前記ＡＡＶの回収の段階を含む。培養昆虫細胞の生育条件、及び培養昆虫細胞での異種産物の作製は、当技術分野では公知であり、たとえば、昆虫細胞の分子工学に関する上に引用した参考文献に記載されている。
【００４２】
好ましくは、前記方法は、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化された抗体を使った前記ＡＡＶの親和性精製の段階をさらに含む。前記抗ＡＡＶ抗体は、好ましくはモノクロナール抗体である。特に適切な抗体は、たとえば、ラクダ又はラマから得られる一本鎖ラクダ抗体又はそのフラグメントである（たとえば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、２００１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第７４巻、２７７頁〜３０２頁を参照されたい）。ＡＡＶの親和性精製のための抗体は、好ましくはＡＡＶカプシドタンパク質上のエピトープに特異的に結合し、好ましくは前記エピトープが複数のＡＡＶセロタイプのカプシドタンパク質上に存在するエピトープである抗体である。たとえば、前記抗体は、ＡＡＶ２カプシドへの特異的結合に基づいて産生しても、又は選択してもよいが、同時に前記抗体はＡＡＶ１、ＡＡＶ３、及びＡＡＶ５カプシドに特異的に結合してもよい。
【００４３】
本文書及びその特許請求の範囲では、動詞「含む」及びその活用は、限定されない意味で用いて、前記単語に続く項目は含まれるが、具体的に言及されない項目は排除されることはないことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、文脈がその要素が１個及び１個だけ存在することを明確に要求しているのでなければ、複数のその要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１個」を意味するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
（実施例）
１．材料と方法
１．１ バキュロウイルスプラスミド構築
ただ１つのポリシストロン性メッセンジャーＲＮＡからＶＰ１、２、３を発現するために、Ｕｒａｂｅら（２００２年、上記を参照されたい）により記載された通りに、バキュロウイルス−ＡＡＶ−Ｃａｐ構築物を設計した。手短に言えば、ＶＰ１のＡＴＧ開始コドンをＡＣＧに変異させた。１１位での潜在的ＡＴＧ開始コドンは、ＡＣＧに変えられている。前記ＶＰ１開始コドンの下流のスプライス受容部位は破壊した（２１位及び２４位の変異）。前記変異させたＣａｐ発現カセットを、バキュロウイルス発現構築物、すなわちＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩ制限部位のあるｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（ｐＦＢＤＡＡＶ１ＶＰｍ１１）にクローン化した。このプラスミド（ｐＦＢＤＡＡＶ１ＶＰｍ１１）は、ＶＰ１の交互開始コドンの導入のための出発物質であった。前記言及した変異体を導入するために、Ｕｒａｂｅら（２００２年、上記を参照されたい）が使用した順方向プライマーは、
【化１】
であった。
以下の順方向プライマーを使って、出発材料としてｐＦＢＤＡＡＶ１ＶＰｍ１１（Ｕｒａｂｅら、２００２年、上記を参照されたい）を使って発現構築物を作製した。
【化２】
さらに、２個の順方向プライマーを使って、ＡＣＧ及びＣＴＧコドンは、それぞれ、好ましい形のコザック配列「ＧＣＣＧＣＣ（ＮＮＮ）Ｇ」（配列番号８を参照されたい。（ＮＮＮ）は準最適な開始コドンを表す）が先行している構築物を調製した。
【化３】
【００４５】
上の順方向プライマーとともにＰＣＲ反応で使用した逆方向プライマーは、前記ＶＰ１開始コドンから〜２３０ｂｐ下流の位置に向け、独自のＳｔｕＩ部位（ＡＧＧＣＣＴ）を含有している。
【化４】
【００４６】
ＰＣＲにより上述の組の順方向及び逆方向プライマー対でフラグメントを増幅した。ＢａｍＨＩ及びＳｔｕＩでのＰＣＲ産物の消化に続いて、前記ＰＣＲ産物はｐＦＢＤＡＡＶ１ｖｐｍ１１のＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩ部位にサブクローン化して、種々の試料バキュロウイルス−ＡＡＶ−Ｃａｐ構築物が得られた。ＤＮＡ構築物は、Ｂａｓｅｃｌｅａｒ社、ライデン、オランダの配列分析により検証した。
【００４７】
１．２ 組換えバキュロウイルス作製
オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の組換えバキュロウイルスを、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（インビトロゲン社製）を使って作製した。ｒＢａｃ−Ｃａｐは、多重感染度０．１でｍｌ当たり２×１０６Ｓｆ９細胞に感染させることにより増幅した。感染の３日後、前記細胞は遠心沈澱させ、ウイルスを含有する上澄みを回収した。
【００４８】
ｒＡＡＶバッチを、Ｕｒａｂｅら、２００２年、に従って３種類の組換えバキュロウイルスを使って作製した。しかし、この研究のために、１種類のバキュロウイルスは、ＬＰＬＳ４４７Ｘ−トランス遺伝子の発現構築物を内部に有していた。前記トランス遺伝子から発現される治療上活性な物質は、ヒトリポタンパク質リパーゼの天然の変異体であり、４４８個のアミノ酸の一本鎖ポリペプチドである。前記ＬＰＬＳ４４７Ｘ変異体は、タンパク質のＣ末端に２個のアミノ酸の欠失がある。第２のバキュロウイルスは、ＡＡＶ複製遺伝子の発現構築物、すなわちＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２を内部に有している。第３のバキュロウイルスは、ＶＰ１のＡＣＧ又はＴＴＧ、ＣＴＧ、ＧＴＧ開始コドンの一方があるＡＡＶ１カプシド配列を内部に有していた。
【００４９】
プラスミドトランスフェクションシステムで作製される哺乳動物ｒＡＡＶバッチは、Ｇｒｉｍｍら、１９９８年に従って作製した（「組換えアデノ随伴ウイルスベクターの作製及び精製のための新規の道具（Ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ）」、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８年 Ｄｅｃ １０；９（１８）：２７４５頁〜６０頁）。
【００５０】
１．３ ウェスタンブロット分析
昆虫細胞にバキュロウイルスＣａｐを感染させた。感染後３日目に、細胞を遠心分離にかけた（３０００ｇ；１５分）。上澄みは０．２２μｍ Ｍｉｌｌｅｘフィルターでろ過した。ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を前記上澄み試料に添加し、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに充填した。前記ゲルは１００Ｖで電気泳動を行った。タンパク質は１００Ｖ、３５０ｍＡで１時間ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ社製）上にブロットした。１％マーベル乾燥脱脂粉乳で前記膜をブロックすることによりウェスタン免疫化学を実施し、続いてマウス抗Ｃａｐ（Ｂ１ Ｐｒｏｇｅｎ社製、ドイツ；１対５０に希釈）及びウサギ抗マウスＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製、１対１００に希釈）でインキュベートした。ＶＰ１、２及び３は、ルミライトプラスウェスタンブロッティング基質（Ｒｏｃｈｅ社製）を使った化学蛍光染色により視覚化した。
【００５１】
１．４ 生化学的測定
ヒトＬＰＬＳ４４７Ｘ活性は、放射性トリオレオイルグリセロールエマルジョン基質を使って以前記載された通りにアッセイした（Ｎｉｌｓｓｏｎ−ＥｈｌｅとＳｃｈｏｌｔｚ、１９７６年）。ヒトＬＰＬＳ４４７Ｘ免疫反応質量は、ニワトリＩｇＹ及びマウス５Ｄ２抗ｈＬＰＬ抗体でサンドイッチＥＬＩＳＡを使ってアッセイした（Ｌｉｕら、２０００年）。血漿トリグリセリドレベルは、市販のキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、＃４５００３２）を使って製造業者のプロトコルに従って測定した。
【００５２】
２．結果
２．１ 組換えバキュロウイルスの構築
ＶＰ１発現のための異なる交互開始コドンを、Ｕｒａｂｅら（２００２年、上記を参照されたい）が設計したバキュロウイルスプラスミドに導入するために、ＢａｍＨＩ制限部位、及びＶＰ１のＡＣＧ開始コドンに代わってＴＴＧ、ＡＴＴ、ＧＴＧ、ＣＴＧコドンのうちのいずれかを含有する一連の上流プライマーを設計した。ＳｔｕＩ部位を含有する下流プライマーと組み合わせてこれらのプライマーを使うＰＣＲにより、ｐＦＢＤＶＰｍ１１（Ｂａｃ−Ｃａｐ）のＢａｍＨＩ／ＳｔｕＩ部位にサブクローン化されたフラグメントが増幅された。こうして得られたバキュロウイルスプラスミドは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システムを使った組換えバキュロウイルスの調製のために使用した。調製された組換えバキュロウイルスは、ＡＡＶカプシドを作製するために昆虫細胞に感染させた。感染後の３日目に、異なるバキュロウイルスバッチのウイルスタンパク質発現をウェスタンブロットで決定した。前記ウェスタンブロットから、ＶＰ１のＴＴＧ開始コドンを含有するバキュロウイルス構築物は、以前使われたＡＣＧ開始コドンと比べて高いレベルでこのタンパク質を発現したことが明らかになった。ＴＴＧコドンを使用したＶＰ１とＶＰ２間の比は１対１であることがわかり、この比は野生型ＡＡＶで報告されている比に類似している（図１）。
【００５３】
２．２ ｒＡＡＶバッチの培養細胞への感染
ＴＴＧ開始コドンをもつ組換えバキュロウイルス由来のＡＡＶカプシドの感染力を調べるために、ｒＡＡＶを作製した。哺乳動物ＨＥＫ２９３細胞へのプラスミドトランスフェクションによりｒＡＡＶバッチも作製した。両方のｒＡＡＶバッチのベクターゲノム力価はｑＰＣＲにより決定した。この力価を使って、マイクロタイタープレート中のＨＥＫ２９３細胞に多重感染度を高めながら感染させた。感染後の２日目に、トランス遺伝子産物（ＬＰＬＳ４４７Ｘ）の定量分析（ＬＰＬＳ４４７Ｘ質量アッセイ）を感染した細胞の培地上で実施した。前記アッセイにより、バキュロウイルス産生ｒＡＡＶにより産生されたＬＰＬＳ４４７Ｘの量は、プラスミド産生ｒＡＡＶにより産生したＬＰＬに類似していることが明らかになった（図２）。
【００５４】
２．３ マウスでのｒＡＡＶバッチの感染
バキュロウイルス産生システム及び従来の哺乳動物プラスミド産生システムで産生されたｒＡＡＶバッチを、マウスに筋肉内注入し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＬＰＬＳ４４７Ｘ−タンパク質活性及び空腹時トリグリセリドを追跡した。注入に続く３日目、７日目、及び２週間目に、血液試料を採取し評価した。ウイルス投与の３日後と７日後の間で、哺乳動物−ｒＡＡＶを注入した両方のマウスとバキュロ−ｒＡＡＶを注入した１匹のマウスから試料採取した血漿は、乳白色から完全に透明になった。１匹のバキュロ−ｒＡＡＶ注入マウス由来の血漿は比較的乳白色のままであったが、脂肪レベルは明らかに減少した。トリグリセリドレベルは、処理したマウスすべてでそれぞれ低下した（図３）。１４日目、哺乳動物−ＡＡＶ処理した両方のマウスのＴＧレベル、及びバキュロウイルス−（ＴＴＧ）−ＡＡＶ処理マウスのＴＧレベルは９６％低下した。ウイルス投与の２週間後に採取した血漿試料は、バキュロウイルス−ＡＡＶ及び哺乳動物−ＡＡＶで処理したマウスのＬＰＬＳ４４７Ｘ−活性は類似していた（図４）。
【００５５】
２．４ 異なるＶＰ１−開始コドンをもつ組換えＡＡＶバッチの作製
異なるＶＰ１−開始コドン（ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ、ＡＣＧ）をもつＡＡＶ−Ｃａｐ ｔｙｐｅ１発現ユニットを含有する組換えバキュロウイルスを使って、昆虫細胞でｒＡＡＶ１−ＬＰＬバッチを調製した。前記ウイルスバッチは、評価のために精製しＮｕＰａｇｅゲルに充填した（図５）。前記ゲルは種々のウイルスのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質間の化学量論を明らかにしている。先ず、我々は、ＨＥＫ２９３細胞で従来のプラスミドトランスフェクションシステム（ｐＰＤ１、ＤＫＦＺ（ドイツ癌センター）、ハイデルベルグ、ドイツ）を使って以前作製したｒＡＡＶ１−ＬＰＬを指摘する。我々の手により、このシステムは、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質間に、ＶＰ１がＶＰ２よりも多くの量存在する珍しい化学量論を生じている。この化学量論は、ｗｔＡＡＶ又は他の哺乳動物ＡＡＶベクター作製プラットホームに見える、１対１対１０として報告されているＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質の化学量論とはかなり異なっている。
【００５６】
バキュロウイルスシステムでは、ＣＴＧコドンをもつｒＡＡＶ構築物は、ＶＰ２のカプシドの量と比較してＶＰ１の量が有意に多いウイルスを産生している。この特定の実験では（図５）、ＢＡＣ−Ｃａｐ ＧＴＧ又はＡＣＧ構築物で作製したＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質の化学量論は、ゲル上で類似のＶＰ１対ＶＰ２の比を示しており、ＴＴＧ構築物はＶＰ２よりわずかに少ないＶＰ１を発現しているように思われる。しかし、ＴＴＧ及びＧＴＧ構築物は、ＶＰ１及びＶＰ２タンパク質がほぼ等量存在する類似の化学量論を示しているが、ＡＣＧ構築物は通常、ＶＰ１がＶＰ２タンパク質よりも少ない化学量論を生じていることが繰り返し見出された。ＣＴＧ構築物は、ＶＰ１がＶＰ２タンパク質よりも多い化学量論を一貫して生じている。
【００５７】
ｒＡＡＶの産生率をさらに改良するため、我々は、ＡＣＧ及びＣＴＧコドンが、それぞれコザックコンセンサス配列中「ＧＣＣＧＣＣ（ＮＮＮ）Ｇ」（配列番号８参照）に存在し、「（ＮＮＮ）」がＡＣＧ及びＣＴＧコドンそれぞれの位置を特定している構築物を調製した。ＣＴＧコドンにコザック配列が先行している構築物からの昆虫細胞でのＡＡＶ産生では、コザック配列のない構築物よりも有意に多くのＡＡＶが産生された（データは示されず）。これとは対照的に、ＡＣＧコドンにコザック配列が先行する構築物からの昆虫細胞でのＡＡＶ産生では、ＡＡＶがより多く産生されることはなかった（データは示されず）。
【００５８】
２．５ ｒＡＡＶバッチのマウスへの注入
ウイルスカプシド中のＶＰ１含有量がベクター感染力と関連していることを実証するために、バキュロウイルス産生ＡＡＶ１バッチ及びプラスミド産生ＡＡＶ１バッチをホモ接合型ＬＰＬ（−／−）マウスの筋肉に注入し、活性型ＬＰＬ発現の結果としてのトリグリセリド（ＴＧ）の低下を経時モニターした（図６）。その結果は、ＣＴＧ開始コドンで作製したＡＡＶ１−ＬＰＬバッチは、その他のＡＡＶ１バッチと比較して、予想通りＴＧレベルを速く大きく低下させることを示している。しかし、化学量論は類似しているが、バキュロ−ＣＴＧ変異体でのＴＧ低下は、プラスミド産生ＡＡＶ１（ｐＤＰ１で産生）と比べてはるかに大きいことは注目に値する。
【００５９】
ＣＴＧ構築物で作製したバキュロウイルス産生ＡＡＶは、その他の準最適な開始コドン構築物で作製したＡＡＶと比べて、特にＡＣＧコドンをもつ構築物と比較した場合には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも、よい成績を上げた、すなわち、より大きな感染力を示すことが繰り返し観察された。ＣＴＧ構築物で作製したＡＡＶビリオン中のＶＰ１含有量は、ＶＰ２と比べて多くのＶＰ１を含有し、他の構築物、特にＡＣＧではそうではないことも繰り返し観察された。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】ＶＰ１カプシドタンパク質に対する、ＴＴＧ又はＡＣＧ開始コドンを含有する組換えバキュロウイルスで産生したｒＡＡＶのウェスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図２】ＬＰＬ質量アッセイの結果を示す図である。マイクロタイタープレートのＨＥＫ２９３細胞に、バキュロウイルス産生システム及びプラスミド産生システムで作製したｒＡＡＶを、１００と２５０００の間の多重感染度で感染させた。感染後の２日目、ＬＰＬＳ４４７Ｘタンパク質を、ＬＰＬＳ４４７Ｘ質量ＥＬＩＳＡにより測定した。「ＤＫＦＺ／ラマ」（Ａ−０７９−０２４及びＡ−０９３−１３０／１３７）は、プラスミド産生システムで作製したｒＡＡＶ−ＬＰＬＳ４４７Ｘバッチを表す。「対照」は、ＬＰＬＳ４４７Ｘを発現していないが、細菌性タンパク質ＬａｃＺは発現しているｒＡＡＶ−ＬａｃＺウイルスバッチを表す。バキュロ／ラマは、ＴＴＧ開始コドンをもつｒＢａｃ−Ｃａｐウイルスを使ってバキュロウイルス産生システムで作製したｒＡＡＶ−ＬＰＬＳ４４７Ｘバッチを表す。
【図３】ＡＡＶベクターバッチの注入後の結果を示す図である。血漿中のトリグリセリド（ＴＧ）レベルを決定した。マウス（ｎ＝２）に、バキュロウイルス産生システム（ＤＪ１７ｊｕｎ０５）及び（ｎ＝２）哺乳動物産生システム（Ｃｌｉｎ）で作製したｒＡＡＶを注入した。前記ベクター投与後の３日目、７日目、及び１４日目に、血液試料を採取し、空腹時ＴＧをアッセイした。
【図４】血漿試料でＬＰＬＳ４４７Ｘ活性を測定した結果を示す図である。マウスに、バキュロウイルス産生システム（ＤＪ１７ｊｕｎ０５）及び哺乳動物産生システム（Ｃ−００４５）で作製したｒＡＡＶを注入した。前記ベクター投与後の１４日目に、血液試料を採取し、ＬＰＬＳ４４７Ｘ活性を決定した。
【図５】図１：昆虫細胞においてバキュロウイルス発現システムで作製した４種類のＡＡＶ１バッチをＮｕｐａｇｅゲルに充填して、ＶＰ１、２、３化学量論を評価した結果を示す図である。レーン：ＶＰ１開始コドンＣＴＧ（レーン１）、ＧＴＧ（レーン２）、ＡＣＧ（レーン３）、ＴＴＧ（レーン４）を含有するバキュロウイルスＣａｐ構築物で調製したＡＡＶ１バッチ。対照として、プラスミド産生ＡＡＶ１バッチ（ＦＳＢ−０２）を充填した（レーン５）。ＣＴＧ開始コドンを使ったＡＡＶ１の化学量論はＦＢＳ−０２バッチと同程度である。
【図６】ＡＡＶ１−ＬＰＬのバッチをＬＰＬ欠損（−／−）マウスの筋肉に、３×１０１２ｇｃ／ｋｇで注入した結果を示す図である。ＣＴＧ開始コドンを含有するｒＢａｃ−Ｃａｐ構築物で調製したＡＡＶ１−ＬＰＬバッチは、他のバッチと比べてトリグリセリド（ＴＧ）低下の点で有意に良好な成績を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む読取り枠を含むヌクレオチド配列であって、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンがＴＴＧ、ＣＴＧ、及びＧＴＧから選択されるヌクレオチド配列。
【請求項２】
ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に、配列番号７の９ヌクレオチド配列、又は配列番号７に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列を含む、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの周辺にコザックコンセンサス配列を含む発現制御配列を含み、前記コザックコンセンサス配列がＧＣＣＲＣＣＮＮＮＧ（配列番号８）であり、Ｒはプリンであり、ＮＮＮはＴＴＧ、ＣＴＧ、及びＧＴＧから選択される準最適な開始コドンを表す、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
ヌクレオチドの１２位のＧ、ヌクレオチドの２１位のＡ、及びヌクレオチドの２４位のＣの中から選択される、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１個の改変をさらに含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が、昆虫細胞での発現のために発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項１から４までのいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が多面体プロモーターに作動可能に連結されている、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記構築物が昆虫細胞適合性ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターである、請求項５又は６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
請求項５から７までのいずれか一項に記載の核酸構築物を含む昆虫細胞。
【請求項９】
（ａ）少なくとも１個のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列、
（ｂ）昆虫細胞での発現のために発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列を含む第３のヌクレオチド配列、及び
（ｃ）昆虫細胞での発現のために発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列を含む第４のヌクレオチド配列
をさらに含む、請求項８に記載の昆虫細胞。
【請求項１０】
（ａ）請求項９の（ｂ）及び（ｃ）で定義される第３及び第４のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５から７までのいずれか一項に記載の第１の核酸構築物、及び
（ｂ）請求項９の（ａ）で定義される第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸構築物
を含む、請求項９に記載の昆虫細胞。
【請求項１１】
前記第２の核酸構築物が、昆虫細胞適合性ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターである、請求項１０に記載の昆虫細胞。
【請求項１２】
前記第２のヌクレオチド配列が、（哺乳動物細胞における発現のために）対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列をさらに含み、対象の遺伝子産物をコードする前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が前記昆虫細胞で産生されるＡＡＶのゲノムに組み込まれる、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
【請求項１３】
前記第２のヌクレオチド配列が、２個のＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、対象の遺伝子産物をコードする前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が、前記２個のＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列の間に位置している請求項１２に記載の昆虫細胞。
【請求項１４】
前記第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、及び第４のヌクレオチド配列が、昆虫細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項９に記載の昆虫細胞。
【請求項１５】
そのゲノムに、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が自然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質の化学量論において、ＶＰ１の量が、
（ａ）ＶＰ２の量の少なくとも１１０％である、又は
（ｂ）ＶＰ３の量の少なくとも１１％である、又は
（ｃ）ＶＰ２の量の少なくとも１１０％であり、且つＶＰ３の量の少なくとも１１％であり、
ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の量が、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のそれぞれに共通のエピトープを認識する抗体を使って決定される、ＡＡＶビリオン。
【請求項１６】
そのゲノムに、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が自然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶビリオンが、アミノ酸の１位にロイシン又はバリンを含むＶＰ１カプシドタンパク質を含む、ＡＡＶビリオン。
【請求項１７】
アミノ酸の１位にロイシン又はバリンを含むＶＰ１カプシドタンパク質を含む、請求項１５に記載のＡＡＶビリオン。
【請求項１８】
（ａ）請求項９から１４までのいずれか一項で定義される昆虫細胞を、ＡＡＶが産生されるような条件の下で培養する段階、及び（ｂ）前記ＡＡＶを回収する段階を含む、昆虫細胞でＡＡＶを産生するための方法。
【請求項１９】
抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化した抗体を使った前記ＡＡＶの親和性精製の段階をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗ＡＡＶ抗体が、一本鎖ラクダ抗体又はそのフラグメントである請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む読取り枠を含むヌクレオチド配列であって、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンがＴＴＧ、ＣＴＧ、及びＧＴＧから選択されるヌクレオチド配列。
【請求項２】
ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に、配列番号７の９ヌクレオチド配列、又は配列番号７に実質的に相同なヌクレオチド配列を含む発現制御配列を含む、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの周辺にコザックコンセンサス配列を含む発現制御配列を含み、前記コザックコンセンサス配列がＧＣＣＲＣＣＮＮＮＧ（配列番号８）であり、Ｒはプリンであり、ＮＮＮはＴＴＧ、ＣＴＧ、及びＧＴＧから選択される準最適な開始コドンを表す、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
ヌクレオチドの１２位のＧ、ヌクレオチドの２１位のＡ、及びヌクレオチドの２４位のＣの中から選択される、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１個の改変をさらに含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が、昆虫細胞での発現のために発現制御配列に作動可能に連結されている、請求項１から４までのいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が多面体プロモーターに作動可能に連結されている、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記構築物が昆虫細胞適合性ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターである、請求項５又は６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
請求項５から７までのいずれか一項に記載の核酸構築物を含む昆虫細胞。
【請求項９】
（ａ）少なくとも１個のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）ヌクレオチド配列を含む第２のヌクレオチド配列、
（ｂ）昆虫細胞での発現のために発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ５２又はＲｅｐ４０コード配列を含む第３のヌクレオチド配列、及び
（ｃ）昆虫細胞での発現のために発現制御配列に作動可能に連結されたＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８コード配列を含む第４のヌクレオチド配列
をさらに含む、請求項８に記載の昆虫細胞。
【請求項１０】
（ａ）請求項９の（ｂ）及び（ｃ）で定義される第３及び第４のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５から７までのいずれか一項に記載の第１の核酸構築物、及び
（ｂ）請求項９の（ａ）で定義される第２のヌクレオチド配列を含む第２の核酸構築物
を含む、請求項９に記載の昆虫細胞。
【請求項１１】
前記第２の核酸構築物が、昆虫細胞適合性ベクター、好ましくはバキュロウイルスベクターである、請求項１０に記載の昆虫細胞。
【請求項１２】
前記第２のヌクレオチド配列が、（哺乳動物細胞における発現のために）対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列をさらに含み、対象の遺伝子産物をコードする前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が前記昆虫細胞で産生されるＡＡＶのゲノムに組み込まれる、請求項９から１１までのいずれか一項に記載の昆虫細胞。
【請求項１３】
前記第２のヌクレオチド配列が、２個のＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列を含み、対象の遺伝子産物をコードする前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が、前記２個のＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列の間に位置している請求項１２に記載の昆虫細胞。
【請求項１４】
前記第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、及び第４のヌクレオチド配列が、昆虫細胞のゲノムに安定的に組み込まれている、請求項９に記載の昆虫細胞。
【請求項１５】
そのゲノムに、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が自然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質の化学量論において、ＶＰ１の量が、
（ａ）ＶＰ２の量の少なくとも１１０％である、又は
（ｂ）ＶＰ３の量の少なくとも１１％である、又は
（ｃ）ＶＰ２の量の少なくとも１１０％であり、且つＶＰ３の量の少なくとも１１％であり、
ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の量が、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３のそれぞれに共通のエピトープを認識する抗体を使って決定される、ＡＡＶビリオン。
【請求項１６】
そのゲノムに、対象の遺伝子産物をコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１個のヌクレオチド配列が自然のＡＡＶヌクレオチド配列ではなく、ＡＡＶビリオンが、アミノ酸の１位にロイシン又はバリンを含むＶＰ１カプシドタンパク質を含む、ＡＡＶビリオン。
【請求項１７】
アミノ酸の１位にロイシン又はバリンを含むＶＰ１カプシドタンパク質を含む、請求項１５に記載のＡＡＶビリオン。
【請求項１８】
（ａ）請求項９から１４までのいずれか一項で定義される昆虫細胞を、ＡＡＶが産生されるような条件の下で培養する段階、及び（ｂ）前記ＡＡＶを回収する段階を含む、昆虫細胞でＡＡＶを産生するための方法。
【請求項１９】
抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化した抗体を使った前記ＡＡＶの親和性精製の段階をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗ＡＡＶ抗体が、一本鎖ラクダ抗体又はそのフラグメントである請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５１２４３６（Ｐ２００９−５１２４３６Ａ）
【公表日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３６５３２（Ｐ２００８−５３６５３２）
【出願日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０５０２６２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４６７０３
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０６４２１６１１）アムステルダム モレキュラー セラピューティクス ビー．ブイ． (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０５０２６２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４６７０３
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５０６４２１６１１）アムステルダム モレキュラー セラピューティクス ビー．ブイ． (5)
【Ｆターム（参考）】
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