昆虫細胞において産生される組換えＥ−セレクチン
本発明の特徴は、組換え哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチド、前記ペプチドをコードする核酸、これらの核酸を有するベクターおよび細胞、ならびにそのペプチドの産生方法を含む。さらに、本発明の特徴は、Ｅ−セレクチンに対する粘膜寛容を誘導する組換え哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチドを用いて炎症に関連する疾患および状態を治療する方法を含む。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本願は、２００５年３月１０日に出願された米国仮出願第６０／６６０，２５８号の利益を主張するものである。上記出願の教示全体が、本明細書中で参照により援用される。
【０００２】
発明の背景
Ｅ−セレクチンは、サイトカイン誘導性であり、内皮細胞のみに見られる細胞表面糖タンパク質細胞接着分子である。Ｅ−セレクチンは、活性化された内皮に対する、好中球、単球、好酸球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞の一部を含む、様々な白血球の接着を媒介する。Ｅ−セレクチンの発現は、ＩＬ−１およびＴＮＦαといった炎症関連サイトカインならびにリポ多糖（ｌｉｐｐｏｐｏｌｙｓａｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）に応答して、転写のアップレギュレーションを介して、ヒト内皮細胞において誘導される。
【０００３】
従来の抗炎症性の治療法としては、白血球の循環性貯留の除去、白血球機能の阻害ならびにシクロスポリンＡおよびＦＫ５０６などの免疫抑制性薬物の使用が挙げられる。しかしながら、ほとんどの利用可能な免疫抑制剤は、長期間にわたる使用を制限する全身性副作用を有する。
【０００４】
自己抗原の粘膜投与によって、脳卒中および動脈硬化症のモデルならびに自己免疫のいくつかのモデル（例えば、糖尿病、関節炎および実験上のアレルギー性脳脊髄炎）における炎症活性および疾患活性が抑制されることが示されている。経鼻／経口投与した低用量のＥ−セレクチンの複数回投与によって、Ｅ−セレクチンに対する粘膜寛容が誘導された。粘膜寛容は、確立されたモデルであり、それによって免疫寛容が、特定の抗原の経鼻点滴または摂食を通じてその抗原に対して誘導される。経鼻投与された抗原は、宿主を病原体の侵入から守るように進化し、吸入された非病原性のタンパク質に対しては宿主が反応するのを防ぐという固有の特性を発達させてきた鼻部関連リンパ系組織と接触する。低用量抗原の反復投与後に、制御性Ｔ細胞の産生による活発な寛容が起きる。
【０００５】
Ｅセレクチン発現は、恒常的ではなく、本質的に、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αまたはＬＰＳなどの炎症性刺激に応答して活性化されるようになる内皮に限定される。Ｅ−セレクチンは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて局所的な炎症部位に長期に亘って発現されることがあり、Ｅ−セレクチンは、Ｅ−セレクチンに対して寛容化された制御性Ｔ細胞を、活性化した内皮の局所的な部位に導く適切な寛容化分子として作用する。低用量レジメンで寛容化されたこれらの制御性Ｔ細胞は、抗原再刺激の際、ＴＨ１免疫応答を抑制するＩＬ−１０およびトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）ｂ１などのサイトカインを分泌する。これらのＴ細胞の活性化は、（このＥ−セレクチンの場合）寛容抗原に特異的であるにもかかわらず、活性化に応答して分泌される免疫調節性サイトカインは、非特異的な効果を有する。従って、どこに寛容抗原が存在しても、局所的な免疫抑制が生じることになる。
【０００６】
寛容化剤としてＥ−セレクチンを使用することにより、活性化された血管セグメントに対して免疫抑制を標的化することができる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明の特徴としては、組換え哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチド、これらのペプチドをコードする核酸、これらの核酸を有するベクターおよび細胞、ならびにそのペプチドの産生方法が挙げられる。さらに、本発明の特徴としては、組換え哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチドを使用してＥ−セレクチンに対する粘膜寛容を誘導する炎症性疾患の治療方法が挙げられる。
【０００８】
本発明は、一連の哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチドを提供する。あるＥ−セレクチンペプチドは、野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になる。このペプチドは、該ペプチドに結合された、カルボキシ末端のジペプチドＲＳを含む１個以上のＣ末端タグを有してもよい。さらに本発明は、Ｎ末端の分泌シグナルペプチドが結合された当該ペプチドを含む。ヒト組換えペプチドが好ましい一方で、好ましくは２００〜４００アミノ酸の、配列番号１と少なくとも６０％の同一性を有する、他の哺乳動物のペプチドを使用してもよい。哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチドの混合物および組み合わせもまた、企図される。
【０００９】
本発明のペプチドのＣ末端タグは、ｃ−ｍｙｃタグおよびヒスチジンタグなどの精製タグおよび安定タグを含む。Ｎ末端の分泌シグナルペプチドは、哺乳動物細胞および昆虫細胞の両方に由来するペプチドを含む。Ｎ末端の分泌シグナルペプチドは、ＡｃＭＮＰＶ ｇｐ６４ ｅｎｖ分泌配列ＭＧＷＳＷＩＦＬＦＬＬＳＧＴＡＳＶＨＳ（配列番号３）、シグナルペプチド配列ＭＧＷＳＷＩＦＬＦＬＬＳＧＴＡＳ（配列番号４）ならびに野生型ヒトシグナル配列ペプチドのＭＩＡＳＱＦＬＳＡＬＴＬＶＬＬＩＫＥＳＧＡ（配列番号２）を含む。本発明のペプチドは、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞および酵母を含む様々な細胞株において産生することができる。
【００１０】
本発明はまた、一連の哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチドをコードする核酸分子を特徴とする。この核酸分子は、本質的に、野生型ヒトＥ−セレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３からなるＥ−セレクチンペプチドをコードする。この核酸分子は、該ぺプチドに結合された、カルボキシ末端のジペプチドＲＳを含む１個以上のＣ末端タグを有し得るＥ−セレクチンペプチドもコードする。さらに本発明は、この基本的なＥ−セレクチンペプチドにＮ末端の分泌シグナルペプチドが結合したものをコードする核酸分子を含む。ヒト組換えペプチドをコードする核酸分子が好ましい一方で、好ましくは２００〜４００アミノ酸の、配列番号１と少なくとも６０％の同一性を有する他の哺乳動物のペプチドをコードするものを使用してもよい。哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチドの混合物および組み合わせもまた、企図される。
【００１１】
本発明はまた、ｃ−ｍｙｃタグおよびヒスチジンタグなどの精製タグおよび安定タグをコードする核酸分子を特徴とする。これらの核酸分子は、哺乳動物細胞および昆虫細胞の両方に由来するペプチドを含むＮ末端の分泌シグナルペプチドをコードすることができる。これらの核酸分子は、Ｎ末端の分泌シグナルペプチドをコードすることができる。そのペプチドとしては、ＡｃＭＮＰＶ ｇｐ６４ ｅｎｖ分泌配列ＭＧＷＳＷＩＦＬＦＬＬＳＧＴＡＳＶＨＳ（配列番号３）、シグナルペプチド配列ＭＧＷＳＷＩＦＬＦＬＬＳＧＴＡＳ（配列番号４）ならびに野生型ヒトシグナル配列ペプチドのＭＩＡＳＱＦＬＳＡＬＴＬＶＬＬＩＫＥＳＧＡ（配列番号２）、を含むＮ末端の分泌シグナルペプチドをコードすることができる。それらの核酸分子は、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞および酵母を含む様々な細胞株において本発明のペプチドを産生するために使用することができる。
【００１２】
本発明はまた、Ｅ−セレクチンペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｅ−セレクチンペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するベクター、またはＥ−セレクチンペプチドをコードする核酸に連結されたバキュロウイルスシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む組換えバキュロウイルストランスファーベクター、を有するバキュロウイルスを特徴とする。そのＤＮＡ配列は、コードされるＥ−セレクチンペプチドが、コードされるシグナルペプチドとインフレームで翻訳されるように位置している。この組換えバキュロウイルストランスファーベクターは、宿主細胞においてＥ−セレクチンペプチドをコードする核酸を発現させるために、好ましくはバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結される。宿主細胞は、昆虫細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞を含む。好ましくは、組換えバキュロウイルストランスファーベクターは、前記昆虫宿主細胞用の培地に本発明のＥ−セレクチンペプチドを分泌させるための配列を含む。
【００１３】
本発明はまた、１個以上のＥ−セレクチンペプチドまたはヌクレオチドおよびキャリア、好ましくは薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を特徴とする。Ｅ−セレクチンペプチドまたはＥ−セレクチンペプチドをコードするヌクレオチドを含む単離された細胞および細胞の組成物もまた、本発明の一部である。有用な細胞としては、哺乳動物細胞、細菌細胞および昆虫細胞を含み、好ましくは、昆虫細胞である。
【００１４】
本発明は、さらに、本発明のＥ−セレクチンペプチドの産生方法を特徴とする。この方法は、Ｅ−セレクチンペプチドをコードする核酸に連結されたバキュロウイルスシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む組換えトランスファーベクターを構築する工程によって開始し、そのシグナル配列およびＥ−セレクチンペプチドをコードする核酸は、インフレームで翻訳される。バキュロウイルスシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、昆虫細胞においてＥ−セレクチンペプチドを発現し分泌するために、バキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結される。第１の昆虫細胞に、組換えトランスファーベクターおよびバキュロウイルスＤＮＡをコトランスフェクションさせ、組換えバキュロウイルスを産生する。その組換えバキュロウイルスを回収する。第２の昆虫細胞に、この回収された組換えバキュロウイルスを感染させる。感染した昆虫細胞は、培地中で培養され、Ｅ−セレクチンペプチドを発現し、分泌する。その培地を回収し、精製することにより、Ｅ−セレクチンペプチドを回収する。
【００１５】
本発明はまた、可溶性Ｅ−セレクチンペプチドに対する粘膜寛容を誘導することによって個体における炎症を介した疾患または状態を治療する方法を含む。これは、低用量のＥ−セレクチンを個体に経鼻または経口により複数回投与することによって達成される。
【００１６】
本発明の目的および特徴は、以下の詳細な説明および図面を参照することにより、さらによく理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、組換えＥ−セレクチンペプチド、Ｅ−セレクチンペプチドをコードするＤＮＡならびにそのペプチドの産生方法および使用方法を提供する。以下の定義を、本明細書全体にわたって使用する。
【００１８】
定義：
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術の範囲内である、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来技術を使用する。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．ゲイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ）編、１９８４年）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ハーネス（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｎｅｓ）およびＳ．Ｊ．ヒギンズ（Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、１９８４年）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｂ．パーバル（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ）、１９８４年）；および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、１９９５年）を参照のこと。本明細書中に記載される、前出および後出両方のすべての特許、特許出願および出版物は、それらの全体が、本明細書中で参照により援用される。
【００１９】
本明細書中で使用する、ペプチドの「Ｎ末端」領域とは、遺伝子の内部またはその５’末端に位置するポリヌクレオチド配列（二本鎖または一本鎖）によってコードされるペプチド配列のことをいい、遺伝子の５’タンパク質コード領域が挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で使用する「アミノ末端」領域とは、あるペプチドの初めのアミノ酸から開始して、最初の３００アミノ酸までか、または当該ペプチドの１／３のアミノ末端のことをいう。ペプチドの「アミノ末端」領域は、３アミノ酸以上、かつ３５０アミノ酸以下の長さである。ペプチドの「アミノ末端」領域の他の可能性のある長さとしては、５、１０、２０、２５、５０、１００および２００アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書中で使用する、ペプチドの「カルボキシ末端」領域または「Ｃ末端」領域とは、遺伝子の内部またはその３’末端に位置するポリヌクレオチド配列（二本鎖または一本鎖）によってコードされるポリペプチド配列のことをいい、遺伝子の３’タンパク質コード領域が挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で使用する「カルボキシ末端」領域とは、ペプチドの最後のアミノ酸から、３００アミノ酸まで、または当該ぺプチドの１／３のカルボキシ末端のことをいう。「３’末端」とは、ポリＡテールが存在する場合、ポリＡテールを含まない。ポリペプチドの「カルボキシ末端」領域は、３アミノ酸以上、かつ３５０アミノ酸以下の長さである。ペプチドの「カルボキシ末端」領域の他の可能性のある長さとしては、５、１０、２０、２５、５０、１００および２００アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
第２のＥ−セレクチンペプチドに類似したアミノ酸配列を有するＥ−セレクチンペプチドとは、以下の少なくとも１つを満たすものである：（ａ）第２のＥ−セレクチンペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＥ−セレクチンペプチド；（ｂ）少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個連続したアミノ残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基または少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基の第２のタンパク質性物質をコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＥ−セレクチンペプチド；および（ｃ）第２のＥ−セレクチンペプチドをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＥ−セレクチンペプチド。
【００２２】
第２のＥ−セレクチンペプチドと類似の構造を有する第１のＥ−セレクチンペプチドとは、第２のＥ−セレクチンペプチドと同様の２次構造、３次構造または４次構造を有するＥ−セレクチンペプチドのことをいう。Ｅ−セレクチンペプチドの構造は、当業者に公知の方法によって決定することができる。それらの方法としては、ペプチド配列決定、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴、円偏光二色性および結晶学的電子顕微鏡観察が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性（％）（％ identity）を決定するために、それらの配列を最適な比較目的のためにアライメントを行う（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列と最適なアライメントを行うために、第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列内にギャップを導入することができる）。そして、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列において対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められているとき、その分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性（％）は、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性（％）＝同一で重なる位置の数／位置の総数×１００％）である。これら２つの配列は、同じ長さであり得る。
【００２４】
２つの配列間の同一性（％）の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することもできる。２つの配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４〜２２６８頁のアルゴリズム、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３〜５８７７頁において改変されたアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同性のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータセット、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と一致するアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータセット、例えば、スコア−５０、ワード長＝３で実施することができる。比較目的でギャップを含んだアライメントを得るために、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁に記載されているようなＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを使用することができる。あるいは、分子間の遠縁関係を検出する反復検索を実施するために、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用することができる（同書）。ＢＬＡＳＴプログラム、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用するとき、（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴの）それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用することができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照のこと）。配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、１９８８年、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１〜１７頁のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用するとき、ＰＡＭ１２０残基重みづけ表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティー＝１２およびギャップペナルティー＝４を使用することができる。
【００２５】
２つの配列間の同一性（％）は、ギャップの有無により、先に記載したものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性（％）を算出する際、代表的には、正確な一致のみを計算する。
【００２６】
本明細書中で使用する、Ｅ−セレクチンペプチドアナログに関した用語「アナログ」とは、Ｅ−セレクチンペプチドと類似かまたは同一の機能を有し、そしてＥ−セレクチンペプチドと構造的に類似の第２の有機分子または無機分子のことをいう。用語「アナログ」は、そのコア構造がＥ−セレクチンペプチドのコア構造と同一か、またはよく似ている分子を含むが、その分子は、化学修飾または物理的修飾されている。用語「アナログ」は、他の原子または分子に結合することができるＥ−セレクチンペプチドの共重合体を含む。「生物学的に活性なアナログ」および「アナログ」は、本明細書中で交換可能に使用され、Ｅ−セレクチンペプチドの本質的に同じアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を示す有機分子または無機分子を網羅する。
【００２７】
本明細書中で使用する、Ｅ−セレクチンペプチドの「ヌクレオチドアナログ」とは、五炭糖および／または１個以上のリン酸エステルが、そのそれぞれのアナログで置換されているヌクレオチドのことをいう。例示的なリン酸エステルアナログとしては、アルキルホスホナート、メチルホスホナート、ホスホルアミダート、ホスホトリエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホロアニリダート、ホスホロアミダート、ボロノホスファートなどが挙げられるが、これらに限定されず、対イオンが存在する場合はそれらに関連した任意の対イオンを含む。ＤＮＡ／ＲＮＡリン酸エステル骨格および／または糖リン酸エステル骨格が、異なる型の結合で置換されているポリヌクレオチドアナログに重合され得る核酸塩基モノマーはまた、「ヌクレオチドアナログ」の定義内に含まれる。核酸塩基部分が、非従来型ヌクレオチド、すなわち、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＵまたはＣの１つと異なるヌクレオチドが、さらに「ヌクレオチドアナログ」内に含まれる。一般に非従来型核酸塩基は、隣接する反対方向のポリヌクレオチド鎖上に存在する少なくとも１つの核酸塩基部分と水素結合を形成するか、または相互作用せず、干渉しない塩基を提供する能力を有する。
【００２８】
本明細書中で使用する、用語「有効量」とは、炎症または１以上の症状の進行、重症度および／または持続期間を低減または回復させるか、炎症または１以上の症状の発症を予防するか、炎症または１以上の症状の悪化を予防するか、または別の治療法の予防的もしくは治療的な効果を向上または改善するのに十分なＥ−セレクチンペプチドまたはＥ−セレクチン核酸の量のことをいう。
【００２９】
本明細書中で使用する、用語「有効量」とは、経鼻投与を介してＥ−セレクチンに対する寛容を誘導するのに十分なＥ−セレクチンペプチドの量のことをいう。
【００３０】
本明細書中で使用する、Ｅ−セレクチンタンパク質に関連した文脈における用語「フラグメント」とは、哺乳動物Ｅ−セレクチンのアミノ酸配列の、少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも連続した８０個のアミノ酸残基、少なくとも連続した９０個のアミノ酸残基、少なくとも連続した１００個のアミノ酸残基、少なくとも連続した１２５個のアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも連続した１７５個のアミノ酸残基、少なくとも連続した２００個のアミノ酸残基または少なくとも連続した２５０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドのことをいう。本発明において有用なタンパク質またはポリペプチドのフラグメントは、哺乳動物のＥ−セレクチンの少なくとも１つの機能を保持する。タンパク質またはポリペプチドのフラグメントは、哺乳動物のＥ−セレクチンの２個、３個、４個またはそれ以上の機能を保持してもよい。
【００３１】
本明細書中で使用する、用語「組み合わせて」とは、治療的な処置のことをいう場合、２種以上の治療法（例えば、２つ以上の予防薬および／または治療薬）の使用のことをいう。用語「組み合わせて」の使用は、治療法（例えば、予防薬および／または治療薬）を、被験体に施す順序を限定しない。第１の治療法（例えば、第１の予防薬または治療薬）は、被験体に第２の治療法（例えば、第２の予防薬または治療薬）の実施の前（例えば、５分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、１２時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、８週間前または１２週間前）、第２の治療法と同時、または第２の治療法の後（例えば、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後または１２週間後）に実施することができる。
【００３２】
本明細書中で使用する、「単離された」または「精製された」とは、ペプチドまたは核酸に関して使用される場合、天然に存在する配列が、その通常の細胞内（例えば、染色体の）環境から取り出されているか、または非天然環境で合成されている（例えば、人工的に合成されている）ことを意味する。従って、「単離された」または「精製された」配列は、無細胞溶液中に存在してもよく、異なる細胞内環境におかれていてもよい。用語「精製された」は、その配列がヌクレオチドまたはペプチドのみで存在するということを示しているのではなく、その配列に天然に関連した、非ヌクレオチド物質または非ペプチド物質を本質的に含まず（約９０〜９５％の純度）、従って、単離された染色体と区別されることを示す。
【００３３】
本明細書中で使用する、タンパク質性物質（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または抗体）に関して、用語「単離された」および「精製された」とは、本質的に細胞物質を含まないタンパク質性物質のことをいい、いくつかの実施形態においては、由来する細胞源または組織源からの異種性タンパク質性物質（すなわち、混入タンパク質）を本質的に含まないか、または化学的に合成されるとき、化学前駆体または他の化学物質を本質的に含まないタンパク質性物質のことをいう。「本質的に細胞物質を含まない」との語法は、タンパク質性物質が、単離されるか、または組換えで産生される細胞の細胞成分から分離されているタンパク質性物質の調製物を含む。従って、本質的に細胞物質を含まないタンパク質性物質は、約３０％、約２０％、約１０％または約５％未満（乾燥重量）の異種性タンパク質性物質（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは抗体；「混入タンパク質」ともよばれる）を有するタンパク質性物質の調製物を含む。タンパク質性物質は、組換えで産生されるとき、好ましくは培地を本質的に含まないこと、すなわち、培地が、タンパク質調製物の容量の約２０％、約１０％または約５％未満であることを意味する。タンパク質性物質は、化学合成によって生成されるとき、好ましくは化学前駆体または他の化学物質を本質的に含まず、すなわち、タンパク質性物質の合成に関連する化学前駆体または他の化学物質から分離されている。従って、タンパク質性物質のこのような調製物は、約３０％、約２０％、約１０％、約５％（乾燥重量）未満の目的のタンパク質性物質以外の化学前駆体または化合物を有する。好ましくは、本明細書中で開示されるタンパク質性物質は、単離されている。
【００３４】
本明細書中で使用する、「核酸」は、用語「ポリヌクレオチド」と交換可能であり、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのことをいい、それらは、無修飾ＲＮＡもしくは無修飾ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくは修飾ＤＮＡあるいはそれらの任意の組み合わせであり得る。「核酸」としては、一本鎖核酸および二本鎖核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する、用語「核酸」はまた、１個以上の修飾塩基を含む、上記のようなＤＮＡまたはＲＮＡを含む。従って、安定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、「核酸」である。本明細書中で使用する、用語「核酸」は、このような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態の核酸だけでなく、ウイルスならびに例えば単純細胞および複雑型細胞を含む細胞の特徴である化学形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。「核酸」または「核酸配列」はまた、一本鎖または二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡの領域またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【００３５】
本明細書中で使用する、「核酸」は、９ヌクレオチド長以上の、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡを包含する。用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドの多量体型、プリン塩基およびピリミジン塩基を含むリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、あるいは他の天然のヌクレオチド塩基、化学的または生化学的に修飾された、天然でないか、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、ＲＮＡまたはＤＮＡに典型的に見られるような糖およびリン酸基または修飾された糖もしくは置換された糖または修飾されたリン酸基もしくは置換されたリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。
【００３６】
本明細書中で使用する、「患者」または「個体」とは、Ｅ−セレクチンペプチドを投与される、哺乳動物、好ましくは、ヒトのことをいう。
【００３７】
本明細書中で使用する、句「薬学的に許容可能なキャリア」としては、本発明の方法を使用して同定される化合物に存在し得る、酸性基または塩基性基の塩を含む水性組成物または非水生組成物が挙げられるが、これらに限定されない。本来は塩基性である化合物は、様々な無機酸および有機酸と多岐にわたる塩を形成することができる。このような塩基性化合物の薬学的に許容可能な酸付加塩を調製するために使用することができる酸は、無毒性の酸付加塩、すなわち、薬理学的に許容可能な陰イオンを含む塩を形成する酸である。それらの塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンシチン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩））が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ部分を含む化合物は、上記の酸に加えて様々なアミノ酸と薬学的に許容可能な塩を形成しうる。本来酸性である化合物は、様々な薬理学的に許容可能な陽イオンと塩基性塩を形成することができる。このような塩の例としては、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩および特にカルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、亜鉛塩、カリウム塩および鉄塩が挙げられる。
【００３８】
本明細書中で使用する、「によってコードされるポリペプチド配列」とは、本明細書中で定義されるような遺伝子のタンパク質コード領域の翻訳後に得られるアミノ酸配列のことをいう。
【００３９】
本明細書中で使用する、用語「タンパク質」および「ペプチド」および「ポリペプチド」は、交換可能に使用され、ペプチド結合によって共に連結されたアミノ酸の鎖のことをいう。特定の実施形態において、タンパク質は、ペプチド結合により共に連結された、２００未満、１７５未満、１５０未満、１２５未満、１００未満、５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満または５未満のアミノ酸から構成される。タンパク質は、ペプチド結合により共に連結された、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００以上のアミノ酸から構成される。
【００４０】
「タンパク質コード領域」とは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの部分のことをいう。
【００４１】
本発明は、Ｅ−セレクチンの細胞外ドメインの一定の部分またはドメインが、有益な効果を有し得るという認識に一部基づく。組換えペプチド、好ましくはヒトＥ−セレクチンペプチドの２０〜３０３フラグメント、ならびにこれらのペプチドをコードするかまたは産生するＤＮＡおよび細胞は、本発明において有用である。
【実施例】
【００４２】
実施例
寛容を誘導するように設計された可溶性Ｅ−セレクチンペプチドを含む組成物の実施例
Ｅ−セレクチンペプチドは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中で提供される透明な可溶性液状タンパク質溶液である。この医薬品成分は、アミノ末端におけるｇｐ６４分泌シグナルに融合したレクチン結合上皮成長因子（ＥＤＦ）ドメインと、カルボキシ末端におけるｃ−ｍｙｃタグおよびポリヒスチジンペプチドタグとを有するヒトＥ−セレクチンタンパク質の細胞外部分をコードする組換えＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスベクター（バキュロウイルス科のＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｉｃａ多角体病ウイルス）が感染したＳｆ−９Ｓ昆虫細胞（鱗翅目のツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｚｐｅｒｄａ））由来である（図１）。
【００４３】
組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子は、１９アミノ酸のＡｃＩＶｆＮＰＶバキュロウイルスｇｐ６４エンベロープタンパク質分泌シグナルペプチド、２９１アミノ酸のヒトＥ−セレクチンタンパク質（ａａ４０〜ａａ１２０レクチン結合ドメインおよびａａ２００〜ａｎ２７５のＥＧＦドメインを含むａａ２０〜ａａ３１０の細胞外部分）、９アミノ酸のｃ−ｍｙｃタンパク質、６アミノ酸の中性スペーサーペプチド、および６アミノ酸のポリヒスチジンタグ（６×ＨＩＳ）で構成される３３１アミノ酸ポリペプチドである。１つの代替型では、ｃ−ｍｙｃタグが省略され、そして別の代替型では、ｃ−ｍｙｃタグおよびＨｉｓタグの両方が省略される（図２）。ＡｃＭＩＮＰＶバキュロウイルスｇｐ６４エンベロープタンパク質由来である分泌シグナルペプチドは、標的ペプチドの細胞内輸送、プロセシングおよび組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質の分泌を促進する。この医薬品成分であるヒトＥ−セレクチン細胞外ポリペプチド部分は、卒中の病態において活性な炎症性および他の免疫応答の抑制を刺激する寛容原エフェクター分子として作用する。ｃ−ｍｙｃの非トランスフォーミングドメインに局在するモノクローナル抗体エピトープであるｃ−ｍｙｃペプチドは、タンパク質精製の間、組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質分子の識別タグとして作用する。ニッケル、コバルトその他の重金属に高い結合定数（Ｋｄ＞１０−９Ｍ）で結合する６×ＨＩＳペプチドは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質を精製するために使用される。
【００４４】
Ｅ−セレクチンペプチドをコードするウイルス原液
ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されるＤＮＡフラグメントの組換えＤＮＡクローニングでは、バキュロウイルス発現ベクターシステム（ＢＥＶＳ）で発現させるために、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ０００６５５で入手可能なヌクレオチド配列に基づいて、カルボキシ末端のｃ−ｍｙｃペプチドタグおよびポリヒスチジン（６×ＨＩＳ）ペプチドタグと融合したヒトＥ−セレクチン（アミノ酸残基２０〜３１０）の細胞外部分をコードするコドンが最適化された遺伝子を使用した。ヒトＥ−セレクチン遺伝子を含む９９９ｂｐのＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントを、まず、サブクローニングベクターであるｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトにクローニングし、続いてバクミドトランスファーベクターであるｐＦＡＳＴＢＡＣＩ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）の多角体遺伝子座内の多角体プロモーターの下流にクローニングした。Ｓｆ−９Ｓ昆虫細胞に、ＡｃＭＮＰＶゲノム内にヒトＥ−セレクチン遺伝子を含む組換えバクミドＤＮＡをトランスフェクトした。組換えバキュロウイルスを、トランスフェクトした細胞から単離し、そして高レベルに組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質を発現しているウイルスのクローンをプラーク精製により選抜した。
【００４５】
もとのマスターウイルス原液（９．６Ｌ）は、組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質を高レベルに発現し、そして高力価のウイルスを産出した、組換えバキュロウイルス単離物（Ｒ６１２）を増幅して、プラーク精製し、０．１ｐｆｕ／ｍｌのＭＯＩでＳｆ−９Ｓ昆虫細胞（継代数６０；ＷＣＢ＃３８）に感染させることによって確立した。もとのウイルス原液は、遺伝子のインテグリティおよび組換えタンパク質産生で特徴づけた。微生物の無菌性アッセイ、マイコプラズマ検出アッセイ、スピロプラズマ検出アッセイ、ＬＡＬエンドトキシン発色アッセイ、ｉｎ ｖｉｔｒｏの外来性物質試験（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ ｔｅｓｔｉｎｇ）およびｉｎ ｖｉｖｏの外来性物質試験（ＡｎＭｅｄ／Ｔａｃｏｎｉｃ）を含む特徴づけを、もとのウイルス原液のサンプルに実施した。外来性物質試験は、昆虫細胞に感染し得るか、またはキャリアウイルスであり得るＲＮＡウイルスの存在を検出することができた。
【００４６】
ｃ−ｍｙｃタグおよびポリヒスチジンペプチドタグに融合した組換えヒトＥ−セレクチン遺伝子配列の同一性は、もとのウイルス原液中の、組換えバキュロウイルスから単離されたヒトＥ−セレクチン遺伝子をコードするバキュロウイルスゲノムＤＮＡに由来する挿入ヌクレオチド配列およびフランキングヌクレオチド配列の両方のＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列決定および解析によって行われた。ヌクレオチド配列解析により、もとのウイルス原液由来のゲノムＤＮＡと、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、そしてこの遺伝子のクローニングに使用されたバキュロウイルストランスファーベクターであるｐＦＡＳＴＢＡＣｌとにおけるヒトＥ−セレクチン遺伝子配列が１００％一致することが明らかになった。ゲノムＤＮＡサンプル由来のヌクレオチド配列から予測されるアミノ酸配列は、ヒトＥ−セレクチンの予測されるアミノ酸配列と１００％一致した。このもとのウイルス原液は、同一性試験に合格した。
【００４７】
高力価でのウイルス複製を補助するもとのウイルス原液の能力を、細胞当たり０．１プラーク形成単位（ｐｆｕ）の感染効率（ＭＯＩ）で３日間に亘って感染させたＳｆ−９Ｓ昆虫細胞由来の浄化された培養上清のバキュロウイルスプラークアッセイによって判定した。５×１０７ｐｆｕ／ｍｌのウイルス力価を、Ｓｆ９Ｓ昆虫細胞に接種されたもとのウイルス原液のサンプルを使用してＳｆ−９Ｓ昆虫細胞におけるバキュロウイルスアガロースプラークアッセイによって測定した。もとのウイルス原液を、３〜５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでもとのウイルス原液で感染させたＳｆ−９Ｓ昆虫細胞由来の第１日目から第３日目の細胞可溶化物および培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析によって、組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質産生についてさらに評価した。細胞可溶化物および細胞培養上清は、分子量が５０ｋＤａであり、ヒトＥ−セレクチンタンパク質に対するモノクローナル抗体（ＢＢＡ２；Ｒ＆Ｄ）に特異的に結合する組換えタンパク質を含んでいた。
【００４８】
ウイルス原液の産生用として認められたもとのウイルス原液を、組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質産生の製造のために使用されることになる実際に使用するウイルス原液の産生に使用した。実際に使用するウイルス原液（９．６Ｌ）を、もとのウイルス原液を接種材料として、０．１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでＳｆ−９Ｓ昆虫細胞（継代数５２；ＷＣＢ＃３７）に感染させることにより、確立した。もとのウイルス原液および実際に使用するウイルス原液を、遮光包装のＰＥＴＧ瓶に入れて、遮光保冷容器（２〜８℃）内で短期間（３ヶ月未満）および７０℃以下の超低温冷凍庫内で長期間保存した。
【００４９】
細胞バンク
組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質の発現が、Ｓｆ−９Ｓ昆虫細胞において最も良好に実現された。Ｓｆ−９Ｓ昆虫細胞のもとの細胞バンクを、Ｓｆ−９Ｓ細胞の単一のバイアルから確立し、細胞懸濁培養液である無血清培地に順応させ、ＡＴＣＣから入手したＳｆ−９親細胞由来のバキュロウイルスベクターから発現される組換えタンパク質の分泌について選抜した。Ｓｆ−９Ｓのもとの細胞バンクを、ツマジロクサヨトウ卵巣上皮細胞にもともと由来するＳｆ−９細胞株を用いて確立したが、懸濁培養液として無血清培地を用いる大規模バイオリアクターにおいて組換えタンパク質発現を最大にするようないくつかの重要な調整を行った。
【００５０】
Ｓｆ−９Ｓのもとの細胞バンクは、昆虫細胞冷凍培地（７．５％ジメチルスルホキシド、４６％Ｓｆ−９００ＩＩ ＳＦＭ、４７％条件培地）中の細胞継代数４８のツマジロクサヨトウ細胞の５８６×３．５ｍｌクライオバイアルからなる。実際に使用する細胞バンクを、もとの細胞バンクからクライオバイアル（総計３．５×１０７細胞）を解凍することおよび振盪フラスコ（５００ｍｌ）内の新鮮ＨｙＱ ＳＦＸ無血清昆虫細胞培地（１００ｍｌ；ロット番号ＡＬＦ１４０５０）に細胞を播種することによって確立した。細胞を、数日間馴化させ、そして懸濁培養液として、２８℃および１２５ｒｐｍで生育した。細胞密度が、０．６×１０７細胞／ｍｌに達したとき、その培養物を１：２０の分割比で、さらなる振盪フラスコに２Ｌフラスコあたり８００ｍｌの最終容量で分割した。新しい培養物を数回の継代をして同様に継代培養し、細胞が最適に生育し、雑菌混入のないことを確認した。継代数４９でのＳｆ−９Ｓ細胞培養物が５．３６×１０６細胞／ｍｌの細胞密度および９４％の生存率に達し、その細胞を、低速遠心分離（５００×ｇ）により単離し、そして以下で構成される昆虫細胞冷凍培地に再懸濁した：
４６．５部 ＨｙＱ ＳＦＸ無血清昆虫細胞培地（条件化）
４６．５部 ＨｙＱ ＳＦＸ無血清昆虫細胞培地（新鮮）
７．０部 ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ ロット番号６８Ｈ１０９２）
【００５１】
その細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）を４９本のクライオバイアル（３．５ｍｌ／バイアル）および３０本のクライオバイアル（１．０ｍｌ／バイアル）に無菌的に分配し、そして保存するために−７０℃未満の超低温冷凍庫内で１℃／分でゆっくりと凍結した。
【００５２】
コドンが最適化された組換えヒトＥ−セレクチンのヌクレオチド配列
以下の配列は、組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質の産生のためのもとのウイルス原液中のバキュロウイルスゲノム由来のコドンが最適化された組換えヒトＥ−セレクチン遺伝子のヌクレオチド配列である。
【化１】
【００５３】
細胞増幅
組換えヒトＥ−セレクチンを含む細胞の細胞増幅は、２．０Ｌ コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）プラスチック振盪フラスコ（フラスコ１本あたり８００ｍｌのＨｙＱ ＳＦＸ無血清培地を含む２１本のフラスコ）中の１６．８リットルで構成されていた。培養フラスコを、バネ仕掛けのフラスコ留め具を備えたプラットホーム振盪インキュベーター（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））でインキュベーションした。細胞を２８±１℃、１２５±２５ｒｐｍでインキュベーションした。
【００５４】
ウイルス感染
Ｓｆ−９Ｓ細胞を最終細胞密度２．０×１０６細胞／ｍｉとなるように新鮮無血清培地で希釈し、２１本のフラスコ（２Ｌ）に８００ｍｌのアリコートとして分配した。昆虫細胞に、３ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでＨｕＥ−セレクチンペプチドを含むバキュロウイルスを感染させた。ウイルスを、ウイルス原液から回収し、クラス１００バイオセイフティーフード内でフラスコに分配した。感染した細胞培養物を、２８℃、１２５ｒｐｍに維持した。感染した細胞培養物を、ウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）、細胞密度および細胞生存率について定期的に監視した。ウイルス感染は、３日間行った。
【００５５】
感染の３日後、ウイルスのＣＰＥは、＋３（すなわち、封入体形成および膜ラフリング）に達し、細胞密度は、１．１×１０６細胞／ｍｌであり、細胞生存率は、５０％に低下した。感染した細胞培養物を、以下に記載するように回収した。
【００５６】
回収
感染した細胞懸濁液を、バイオセイフティーキャビネット内でフラスコから５００ｍｌ遠心瓶に移した。感染した細胞懸濁液を、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ−５Ｂ遠心機において２３００ｒｐｍおよび４℃で１０分に亘って低速遠心分離に供することにより、感染した細胞を除去した。細胞外組換えヒトＥ−セレクチンを含む感染した細胞培養上清を、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ−５Ｂ遠心機における７５００ｒｐｍおよび４℃で４５分に亘って遠心分離により浄化した。浄化された上清をクラス１００バイオセイフティーフード内で２０リットルガラス製カーボイにデカントし、２〜８℃において保冷容器内で一晩保存し、続いて濃縮および膜分離を行った。
【００５７】
限外濾過による濃縮および膜分離
さらなる精製に向けて管理しやすい容量を得るために、細胞外組換えヒトＥ−セレクチンペプチドを含む浄化された細胞培養上清（１６．０Ｌ）を、Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｆｌｅｘ Ｓｔａｎｄ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｐｉｌｏｔ限外濾過システムを使用して濃縮した。このシステムを用いて、浄化された細胞培養上清を、２０Ｌガラス製カーボイから１０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するＡ／Ｇ Ｔｅｃｈ ＵＦＰ−１０−Ｃ−９Ａ中空糸限外濾過カートリッジに、Ｍａｓｔｅｒｆｉｅｘ蠕動ポンプを備えた無菌化シリコーン管を通して２３０ｍｌ／ｍｍの流速で移した。組換えヒトＥ−セレクチンペプチドを含む保持液を、濾過液から別個に回収し、そして渦巻き型限外濾過カートリッジにもかかわらず連続した通過により０．８Ｌに濃縮（２０倍）した。濃縮後、濃縮された細胞培養上清を１０ＬのＱ緩衝液１で９０分膜分離した。濃縮された膜分離物（０．８Ｌ）およびカートリッジの２つのすすぎ液（各０．７Ｌ）を無菌ナルゲン瓶（総計３．２Ｌ）に回収し、そして一晩、保冷容器内（２〜８℃）で保存し、続いてＱ陰イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質精製を行った。
【００５８】
Ｑセファロース陰イオン交換クロマトグラフィー
組換えヒトＥ−セレクチンペプチド医薬品成分の後処理プロセスにおける最初のタンパク質捕捉工程は、強力な陰イオン交換樹脂であるＱセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗを使用した陰イオン交換クロマトグラフィー工程である。この工程は、エンドトキシン、プロセス賦形剤（ｐｒｏｃｅｓｓ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）および宿主タンパク質混入物を組換えヒトＥ−セレクチンペプチドから除去することを意図した。Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、Ｕｎｉｃｏｒｎ（登録商標）ソフトウェアによって制御される、検証されたＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｂｉｏｐｉｌｏｔ ＦＰＬＣシステムを使用して実施した。ＱセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（４００ｍｌ）を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＸ５０／３０クロマトグラフィーカラムに充填した。Ｑカラムを１０ｍｌ／分の流速で、Ｑ再生緩衝液［０．５Ｎの水酸化ナトリウムおよび１．０Ｍの塩化ナトリウム］を用いて衛生的にし、そして再生し、１０ｍｌ／分の流速でｐＨ７．１まで５カラム容量（２０００ｍｌ）のＷＦＩ水ですすぎ、そして１０ｍｌ／ｍｍの流速で５カラム容量（２０００ｍｌ）のＱ緩衝液１で平衡化した。
【００５９】
濃縮された膜分離物（３．２Ｌ）を２０ｍｌ／分の流速で装填した。（１３．６ｍｇのタンパク質／ｍｌＱ樹脂）。装填されたＱカラムを２０ｍｌ／分の流速で１０カラム容量（４０００ｍｌ）のＱ緩衝液１で洗浄した。Ｑカラム通過（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）画分（ＦＴ；３２００ｍｌ）および洗浄画分（１６００ｍｌ）を回収し、そして残った非結合性組換えヒトＥ−セレクチンペプチドについての処理中試験（ｉｎ−ｐｒｏｃｅｓｓ ｔｅｓｔｉｎｇ）のために４℃で保存した。Ｑカラムに結合したタンパク質を２０ｍｌ／分の流速で塩化ナトリウムの０〜１０００ｍＭの直線勾配を形成するＱ緩衝液２を用いて溶出した。ＵＶ２８０吸収性Ｑ溶出物の画分（２００×１０ｍｌ）を回収し、一時的に保冷容器内で４℃にて保存した。使用したＱカラムをＱ再生緩衝液で衛生的にした。
【００６０】
サンプル（０．１ｍｌ）のＱ溶出画分ならびに装填画分、通過画分および洗浄画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヒトＥ−セレクチン血清を使用したウエスタンブロット解析を含む処理中試験に供した。組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質を主成分として含むＱ溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析によって単一のピーク（画分８０〜１１２）として同定し、そして貯蔵した（３２０ｍｌ）。かなりの量の組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質が、Ｑカラムに結合していた；従って、ＦＴ画分の再処理は必要でなかった。
【００６１】
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースアフィニティークロマトグラフィー
組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質のカルボキシル末端にポリヒスチジン（６×ＨＩＳ）タグペプチドが存在するので、Ｎｉ＋＋ベースの樹脂を使用した固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、貯蔵されたＱ溶出画分中に残留する他のタンパク質からこれらの重金属結合タンパク質を精製することが可能であった。生成の後処理プロセスにおけるＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーの工程を、組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質を精製し、そして残存する宿主タンパク質混入物およびバキュロウイルスを除去するために使用した。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー工程を、Ｕｎｉｃｏｒｎ（登録商標）ソフトウェアによって制御される、検証されたＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｂｉｏｐｉｌｏｔ ＦＰＬＣシステムを使用して実施した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースＳｕｐｅｒｆｉｏｗ樹脂（３８ｍｌ）をＰｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ ２６クロマトグラフィーカラムに充填した。Ｎｉ−ＮＴＡを硫酸ニッケル六水和物（０．１Ｍ）で荷電し、３ｍｌ／分の流速で０．５ＮのＮａＯＨで衛生的にし、３ｍｌ／分の流速で５カラム容量のＷＦＩ水ですすぎ、そして３ｍｌ／分の流速で５カラム容量（１９０ｍｌ）のＮｉ−ＮＴＡ緩衝液１でｐＨ８．５に平衡化した。Ｑ貯蔵溶出画分を、３ｍｌ／分の流速で装填した。（１９．８タンパク質／ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂）。装填されたＮｉ−ＮＴＡカラムを３カラム容量（１１５ｍｌ）のＮｉ−ＮＴＡ緩衝液Ｉで、３ｍｌ／分の流速で洗浄した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムＦＴ画分（３２０ｍｌ）および洗浄画分（１１５ｍｌ）を回収し、残った非結合性の組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質についての処理中試験のために４℃で保存した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムに結合したタンパク質を３ｍｉ／ｍｍの流速で、イミダゾールナトリウムの０〜３００ｍＭの線形勾配を形成するＮｉ−ＮＴＡ緩衝液２を用いて溶出した。ＤＹ２８０吸収性Ｎｉ−ＮＴＡ溶出物の画分（４３×３ｍｌ）を回収し、そして一時的に保冷容器内で４℃にて保存した。使用したＮｉ−ＮＴＡカラムをＥＤＴＡ再生緩衝液で衛生的にした。
【００６２】
Ｎｉ−ＮＴＡ溶出画分のサンプル（０．１ｍｌ）ならびに装填画分、通過画分および洗浄画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヒトＥ−セレクチン血清を使用したウエスタンブロット解析を含む処理中試験に供した。組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質を主成分として含むＮｉ−ＮＴＡ溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析によって単一ピーク（画分１２〜２６）として同定し、そして貯蔵した（４３ｍｌ）。かなりの量の組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質が、ＮｉＮＴＡカラムに結合した；従って、ＦＴ画分の再処理は必要ではなかった。
【００６３】
貯蔵されたＮｉ−ＮＴＡ溶出カラム画分のサンプル（２ｍｌ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヒトＥ−セレクチン血清を使用したウエスタンブロット解析、ＢＣＡタンパク質アッセイならびにＬＡＬエンドトキシンアッセイを含む処理中試験に供した。さらに、精製プロセスのこの段階において存在するバキュロウイルスの量を数え上げるために、バキュロウイルスアガロースプラークアッセイをＮｉ−ＮＴＡ貯蔵溶出画分のアリコートにおいて実施した。ウイルス力価は、Ｑクロマトグラフィー工程およびＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー工程によって得られたウイルスにおいて３ｌｏｇ１０換算で合計２．７６×１０９ｐｆｕに対して６．４２×１０７ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００６４】
膜分離法
Ｎｉ−ＮＴＡ貯蔵溶出画分からプロセス賦形剤であるイミダゾールを除去するためおよび適切な緩衝液であるＰＢＳ溶液中に医薬品成分を処方するために、Ｎｉ−ＮＴＡ貯蔵溶出画分を低温室（２〜８℃）において膜分離に供した。貯蔵されたＮｉ−ＮＴＡ溶出画分を、２×９０容量（４Ｌ）のＰＢＳ溶液に対してそれぞれ１５時間および７時間、２２℃で透析した。最終的な透析液の容量は、４１ｍｌであった。透析液のサンプル（１ｍｌ）を、ＳＤＳＰＡＧＥ解析、ウエスタンブロット解析、ＢＣＡタンパク質アッセイおよびＬＡＬカイネティック比色アッセイを含む処理中試験のために取り出した。
【００６５】
最終的な濾過
混入微生物を除去するために、透析液（４１ｍｌ）をバイオセイフティーフード（クラス１００）内で無菌的に、０．２２〜ｉ ミリポア社製（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｓｔｅｒｉｃａｐ濾過膜に通して無菌Ｎａｌｇｅｎｅ瓶に入れた。使用した膜を、膜の完全性を判定するために泡立ち点アッセイに供した。その結果（５０ｐｓｉ）は、３２ｐｓｉという完全な膜の規格を上回るものであり、また、医薬品成分において微生物が排除されていることが確かめられた。濾液の最終容量は、３６．５ｍｌであった。０．２μ濾液を、−７０℃未満の超低温冷凍庫に保存した。０．２μ濾液を解凍し、前もって高くしておいたタンパク質濃度においてタンパク質凝集を防ぐために、最終容量が９５ｍｌとなるようＰＢＳ溶液で希釈し、そしてバイオセイフティーフード（クラス１００）内で無菌的に第２の０．２μ膜に通して濾過した。使用した第２の０．２μ膜の泡立ち点試験の結果は、その膜には傷がないことを示唆した。
【００６６】
第１の０．２μ濾液のサンプルをＢＣＡタンパク質試験およびＬＡＬ処理中試験に供した。第１の０．２μ濾液についてのＢＣＡタンパク質アッセイの結果は、総収量１９２．７２ｍｇに対して５．２８ｍｇ／ｍｌであった。第１の０．２μ濾液についてのＬＡＬエンドトキシンアッセイの結果は、総量６７ＥＵに対して１．８４ＥＵ／ｍｌであった。
【００６７】
総容量９５ｍｌを第２の最終的な濾過によって実現した。医薬品成分中の残留バキュロウイルスを除去するために、Ｐａｌｌ ＤＶ２Ｏ ｓｕｂ ０．１μ膜濾過カートリッジを薬物生成物の処方工程および濾過工程において使用した。最終的な大量生成物（医薬品成分）についての総エンドトキシン量は、４５．６ＥＵであった；確証されたＢＣＳタンパク質アッセイによって測定されたように、最終的な大量生成物についての総タンパク質収量は、１３３ｍｇであった。
【００６８】
遅延型過敏アッセイ
遅延型過敏試験を、様々な用量の組換えヒトＥ−セレクチンで鼻腔内処置した後の高血圧性ラットにおいて実施した。医薬品成分サンプル（１．０ｍｌ）の遅延型過敏アッセイは、高血圧性動物において卒中を寛容化および予防するヒトＥ−セレクチンの能力と相関する、ｉｎ ｖｉｖｏにおける生成物の効力を測定するために実施した。本研究におけるＤＴＨ抑制は、粘膜寛容の誘導に使用した様々な用量の組換えヒトＥ−セレクチンおよびプラセボの機能として、炎症によって引き起こされる動物の耳の厚さの測定と関連した。
【００６９】
自然発症的に高血圧性脳卒中を起こしやすい（ＳＲＲ−ＳＰ）ラット（ｎ＝２０）を４群に分け、５回の処置を１日おきで鼻腔内に（２０μｌ／鼻孔）接種した：
群１：ＰＢＳプラセボ、４０μｌ処置で寛容化、ｎ＝５、
群２：組換えヒトＥ−セレクチン５Ｖμｇ／４０μｌ処置、ｎ＝５
群３：組換えヒトＥ−セレクチンμｌ／４０μｌ処置、ｎ＝５
群４：組換えヒトＥ−セレクチン０．１μｇ／４０μｌ処置、ｎ＝５
【００７０】
寛容化スケジュールが終了した２週間後に、それらの動物を、３７５μｇ／ｍｌの最終抗原濃度でフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）とともに処方された組換えヒトＥ−セレクチンのアリコート（２００μｌ）で皮下に免疫（抗原感作）した。免疫の２週間後、処置動物の耳の厚さを標準的な皮下脂肪用ノギスを使用して測定した。その後、ＰＢＳ中５０μｇ／１００μｌの抗原濃度で組換えヒトＥ−セレクチンの耳垂注射（１００ｐ．１）を行った（抗原の再適用または抗原チャレンジ）。
【００７１】
チャレンジの４８時間後および７２時間後に耳の厚さの測定を繰り返し行い、遅延型過敏を評価した。
【００７２】
Ｅ−セレクチンに対するリンパ球の寛容化、特に、粘膜寛容は、以下を含む炎症性疾患の治療の有効な方法である：
【００７３】
高レベルの炎症促進性サイトカインもまた、自己免疫疾患を含む、数多くの疾患および状態に関連する。炎症関連疾患としては、毒素性ショック症候群、関節リウマチ、変形性関節症、糖尿病および炎症性腸疾患、ＨＩＶ感染関連認知症、緑内障、視神経症、視神経炎、網膜虚血、レーザー誘導性視覚障害、手術誘導性または外傷誘導性の増殖性硝子体網膜症、脳虚血、低酸素虚血、低血糖症、ドウモイ酸中毒、無酸素症、一酸化炭素中毒またはマンガン中毒またはシアン化物中毒、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、髄膜炎、多発性硬化症および他の脱髄性疾患、筋萎縮性側索硬化症、頭部外傷および脊髄外傷、癲癇、痙攣、オリーブ橋小脳萎縮症、神経障害性疼痛症候群、糖尿病性ニューロパシー、ＨＩＶ関連ニューロパシー、ＭＥＲＲＦ症候群およびＭＥＬＡＳ症候群、レーバー病、ウェミッケ脳症（Ｗｅｍｉｃｋｅ’ｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐｈａｔｈｙ）、レット症候群、ホモシステイン尿症（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｕｒｉａ）、高プロリン血症、高ホモシステイン血症、非ケトン性高グリシン血症、ヒドロキシ酪酸アミノ酸尿症（ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｍｉｎｏａｃｉｄｕｒｉａ）、亜硫酸酸化酵素欠損症、脊髄索状変性（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、鉛脳障害、トゥーレット症候群、肝性脳症、薬物嗜癖、薬剤耐性、薬物依存、うつ、不安および精神分裂病、外傷性関節炎、ギランバレー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、再灌流損傷、敗血症、骨粗鬆症を含む骨吸収疾患、慢性閉塞性肺疾患、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、毒素性ショック症候群、喘息、接触皮膚炎、経皮的経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）およびインスリン依存性真性糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載されたものの変形、改変および他の実施を思いつくだろう。以下に提供される参考文献は、それらの全体が本明細書中に参照により援用される。本明細書中で引用されたすべての特許、特許出願および公開された参考文献は、それらの全体が、本明細書中で参照により援用される。
【００７５】
本発明を、それらの好ましい実施形態を参照して、特に示し、そして記載したが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その形態および詳細の様々な変更がなされうることを当業者は理解するだろう。当該分野で公知の他の実施形態および構造が、本発明の精神および範囲内であることを当業者は理解するだろう。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
図面の簡単な説明
【図１】図１（配列番号８）は、組換えヒトＥ−セレクチンペプチドの予測されるアミノ酸配列およびタンパク質構造機能を示したものである。
【図２】図２は、野生型ヒトＥ−セレクチンに対する組換えＥ−セレクチンペプチドのアライメントを示す。
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本願は、２００５年３月１０日に出願された米国仮出願第６０／６６０，２５８号の利益を主張するものである。上記出願の教示全体が、本明細書中で参照により援用される。
【０００２】
発明の背景
Ｅ−セレクチンは、サイトカイン誘導性であり、内皮細胞のみに見られる細胞表面糖タンパク質細胞接着分子である。Ｅ−セレクチンは、活性化された内皮に対する、好中球、単球、好酸球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞の一部を含む、様々な白血球の接着を媒介する。Ｅ−セレクチンの発現は、ＩＬ−１およびＴＮＦαといった炎症関連サイトカインならびにリポ多糖（ｌｉｐｐｏｐｏｌｙｓａｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）に応答して、転写のアップレギュレーションを介して、ヒト内皮細胞において誘導される。
【０００３】
従来の抗炎症性の治療法としては、白血球の循環性貯留の除去、白血球機能の阻害ならびにシクロスポリンＡおよびＦＫ５０６などの免疫抑制性薬物の使用が挙げられる。しかしながら、ほとんどの利用可能な免疫抑制剤は、長期間にわたる使用を制限する全身性副作用を有する。
【０００４】
自己抗原の粘膜投与によって、脳卒中および動脈硬化症のモデルならびに自己免疫のいくつかのモデル（例えば、糖尿病、関節炎および実験上のアレルギー性脳脊髄炎）における炎症活性および疾患活性が抑制されることが示されている。経鼻／経口投与した低用量のＥ−セレクチンの複数回投与によって、Ｅ−セレクチンに対する粘膜寛容が誘導された。粘膜寛容は、確立されたモデルであり、それによって免疫寛容が、特定の抗原の経鼻点滴または摂食を通じてその抗原に対して誘導される。経鼻投与された抗原は、宿主を病原体の侵入から守るように進化し、吸入された非病原性のタンパク質に対しては宿主が反応するのを防ぐという固有の特性を発達させてきた鼻部関連リンパ系組織と接触する。低用量抗原の反復投与後に、制御性Ｔ細胞の産生による活発な寛容が起きる。
【０００５】
Ｅセレクチン発現は、恒常的ではなく、本質的に、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αまたはＬＰＳなどの炎症性刺激に応答して活性化されるようになる内皮に限定される。Ｅ−セレクチンは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて局所的な炎症部位に長期に亘って発現されることがあり、Ｅ−セレクチンは、Ｅ−セレクチンに対して寛容化された制御性Ｔ細胞を、活性化した内皮の局所的な部位に導く適切な寛容化分子として作用する。低用量レジメンで寛容化されたこれらの制御性Ｔ細胞は、抗原再刺激の際、ＴＨ１免疫応答を抑制するＩＬ−１０およびトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）ｂ１などのサイトカインを分泌する。これらのＴ細胞の活性化は、（このＥ−セレクチンの場合）寛容抗原に特異的であるにもかかわらず、活性化に応答して分泌される免疫調節性サイトカインは、非特異的な効果を有する。従って、どこに寛容抗原が存在しても、局所的な免疫抑制が生じることになる。
【０００６】
寛容化剤としてＥ−セレクチンを使用することにより、活性化された血管セグメントに対して免疫抑制を標的化することができる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明の特徴としては、組換え哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチド、これらのペプチドをコードする核酸、これらの核酸を有するベクターおよび細胞、ならびにそのペプチドの産生方法が挙げられる。さらに、本発明の特徴としては、組換え哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチドを使用してＥ−セレクチンに対する粘膜寛容を誘導する炎症性疾患の治療方法が挙げられる。
【０００８】
本発明は、一連の哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチドを提供する。あるＥ−セレクチンペプチドは、野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になる。このペプチドは、該ペプチドに結合された、カルボキシ末端のジペプチドＲＳを含む１個以上のＣ末端タグを有してもよい。さらに本発明は、Ｎ末端の分泌シグナルペプチドが結合された当該ペプチドを含む。ヒト組換えペプチドが好ましい一方で、好ましくは２００〜４００アミノ酸の、配列番号１と少なくとも６０％の同一性を有する、他の哺乳動物のペプチドを使用してもよい。哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチドの混合物および組み合わせもまた、企図される。
【０００９】
本発明のペプチドのＣ末端タグは、ｃ−ｍｙｃタグおよびヒスチジンタグなどの精製タグおよび安定タグを含む。Ｎ末端の分泌シグナルペプチドは、哺乳動物細胞および昆虫細胞の両方に由来するペプチドを含む。Ｎ末端の分泌シグナルペプチドは、ＡｃＭＮＰＶ ｇｐ６４ ｅｎｖ分泌配列ＭＧＷＳＷＩＦＬＦＬＬＳＧＴＡＳＶＨＳ（配列番号３）、シグナルペプチド配列ＭＧＷＳＷＩＦＬＦＬＬＳＧＴＡＳ（配列番号４）ならびに野生型ヒトシグナル配列ペプチドのＭＩＡＳＱＦＬＳＡＬＴＬＶＬＬＩＫＥＳＧＡ（配列番号２）を含む。本発明のペプチドは、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞および酵母を含む様々な細胞株において産生することができる。
【００１０】
本発明はまた、一連の哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチドをコードする核酸分子を特徴とする。この核酸分子は、本質的に、野生型ヒトＥ−セレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３からなるＥ−セレクチンペプチドをコードする。この核酸分子は、該ぺプチドに結合された、カルボキシ末端のジペプチドＲＳを含む１個以上のＣ末端タグを有し得るＥ−セレクチンペプチドもコードする。さらに本発明は、この基本的なＥ−セレクチンペプチドにＮ末端の分泌シグナルペプチドが結合したものをコードする核酸分子を含む。ヒト組換えペプチドをコードする核酸分子が好ましい一方で、好ましくは２００〜４００アミノ酸の、配列番号１と少なくとも６０％の同一性を有する他の哺乳動物のペプチドをコードするものを使用してもよい。哺乳動物Ｅ−セレクチンペプチドの混合物および組み合わせもまた、企図される。
【００１１】
本発明はまた、ｃ−ｍｙｃタグおよびヒスチジンタグなどの精製タグおよび安定タグをコードする核酸分子を特徴とする。これらの核酸分子は、哺乳動物細胞および昆虫細胞の両方に由来するペプチドを含むＮ末端の分泌シグナルペプチドをコードすることができる。これらの核酸分子は、Ｎ末端の分泌シグナルペプチドをコードすることができる。そのペプチドとしては、ＡｃＭＮＰＶ ｇｐ６４ ｅｎｖ分泌配列ＭＧＷＳＷＩＦＬＦＬＬＳＧＴＡＳＶＨＳ（配列番号３）、シグナルペプチド配列ＭＧＷＳＷＩＦＬＦＬＬＳＧＴＡＳ（配列番号４）ならびに野生型ヒトシグナル配列ペプチドのＭＩＡＳＱＦＬＳＡＬＴＬＶＬＬＩＫＥＳＧＡ（配列番号２）、を含むＮ末端の分泌シグナルペプチドをコードすることができる。それらの核酸分子は、昆虫細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞および酵母を含む様々な細胞株において本発明のペプチドを産生するために使用することができる。
【００１２】
本発明はまた、Ｅ−セレクチンペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｅ−セレクチンペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するベクター、またはＥ−セレクチンペプチドをコードする核酸に連結されたバキュロウイルスシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む組換えバキュロウイルストランスファーベクター、を有するバキュロウイルスを特徴とする。そのＤＮＡ配列は、コードされるＥ−セレクチンペプチドが、コードされるシグナルペプチドとインフレームで翻訳されるように位置している。この組換えバキュロウイルストランスファーベクターは、宿主細胞においてＥ−セレクチンペプチドをコードする核酸を発現させるために、好ましくはバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結される。宿主細胞は、昆虫細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞を含む。好ましくは、組換えバキュロウイルストランスファーベクターは、前記昆虫宿主細胞用の培地に本発明のＥ−セレクチンペプチドを分泌させるための配列を含む。
【００１３】
本発明はまた、１個以上のＥ−セレクチンペプチドまたはヌクレオチドおよびキャリア、好ましくは薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を特徴とする。Ｅ−セレクチンペプチドまたはＥ−セレクチンペプチドをコードするヌクレオチドを含む単離された細胞および細胞の組成物もまた、本発明の一部である。有用な細胞としては、哺乳動物細胞、細菌細胞および昆虫細胞を含み、好ましくは、昆虫細胞である。
【００１４】
本発明は、さらに、本発明のＥ−セレクチンペプチドの産生方法を特徴とする。この方法は、Ｅ−セレクチンペプチドをコードする核酸に連結されたバキュロウイルスシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む組換えトランスファーベクターを構築する工程によって開始し、そのシグナル配列およびＥ−セレクチンペプチドをコードする核酸は、インフレームで翻訳される。バキュロウイルスシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、昆虫細胞においてＥ−セレクチンペプチドを発現し分泌するために、バキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結される。第１の昆虫細胞に、組換えトランスファーベクターおよびバキュロウイルスＤＮＡをコトランスフェクションさせ、組換えバキュロウイルスを産生する。その組換えバキュロウイルスを回収する。第２の昆虫細胞に、この回収された組換えバキュロウイルスを感染させる。感染した昆虫細胞は、培地中で培養され、Ｅ−セレクチンペプチドを発現し、分泌する。その培地を回収し、精製することにより、Ｅ−セレクチンペプチドを回収する。
【００１５】
本発明はまた、可溶性Ｅ−セレクチンペプチドに対する粘膜寛容を誘導することによって個体における炎症を介した疾患または状態を治療する方法を含む。これは、低用量のＥ−セレクチンを個体に経鼻または経口により複数回投与することによって達成される。
【００１６】
本発明の目的および特徴は、以下の詳細な説明および図面を参照することにより、さらによく理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、組換えＥ−セレクチンペプチド、Ｅ−セレクチンペプチドをコードするＤＮＡならびにそのペプチドの産生方法および使用方法を提供する。以下の定義を、本明細書全体にわたって使用する。
【００１８】
定義：
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術の範囲内である、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来技術を使用する。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．ゲイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ）編、１９８４年）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ハーネス（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｎｅｓ）およびＳ．Ｊ．ヒギンズ（Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ）編、１９８４年）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｂ．パーバル（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ）、１９８４年）；および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、１９９５年）を参照のこと。本明細書中に記載される、前出および後出両方のすべての特許、特許出願および出版物は、それらの全体が、本明細書中で参照により援用される。
【００１９】
本明細書中で使用する、ペプチドの「Ｎ末端」領域とは、遺伝子の内部またはその５’末端に位置するポリヌクレオチド配列（二本鎖または一本鎖）によってコードされるペプチド配列のことをいい、遺伝子の５’タンパク質コード領域が挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で使用する「アミノ末端」領域とは、あるペプチドの初めのアミノ酸から開始して、最初の３００アミノ酸までか、または当該ペプチドの１／３のアミノ末端のことをいう。ペプチドの「アミノ末端」領域は、３アミノ酸以上、かつ３５０アミノ酸以下の長さである。ペプチドの「アミノ末端」領域の他の可能性のある長さとしては、５、１０、２０、２５、５０、１００および２００アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書中で使用する、ペプチドの「カルボキシ末端」領域または「Ｃ末端」領域とは、遺伝子の内部またはその３’末端に位置するポリヌクレオチド配列（二本鎖または一本鎖）によってコードされるポリペプチド配列のことをいい、遺伝子の３’タンパク質コード領域が挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で使用する「カルボキシ末端」領域とは、ペプチドの最後のアミノ酸から、３００アミノ酸まで、または当該ぺプチドの１／３のカルボキシ末端のことをいう。「３’末端」とは、ポリＡテールが存在する場合、ポリＡテールを含まない。ポリペプチドの「カルボキシ末端」領域は、３アミノ酸以上、かつ３５０アミノ酸以下の長さである。ペプチドの「カルボキシ末端」領域の他の可能性のある長さとしては、５、１０、２０、２５、５０、１００および２００アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
第２のＥ−セレクチンペプチドに類似したアミノ酸配列を有するＥ−セレクチンペプチドとは、以下の少なくとも１つを満たすものである：（ａ）第２のＥ−セレクチンペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＥ−セレクチンペプチド；（ｂ）少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個連続したアミノ残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基または少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基の第２のタンパク質性物質をコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるＥ−セレクチンペプチド；および（ｃ）第２のＥ−セレクチンペプチドをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＥ−セレクチンペプチド。
【００２２】
第２のＥ−セレクチンペプチドと類似の構造を有する第１のＥ−セレクチンペプチドとは、第２のＥ−セレクチンペプチドと同様の２次構造、３次構造または４次構造を有するＥ−セレクチンペプチドのことをいう。Ｅ−セレクチンペプチドの構造は、当業者に公知の方法によって決定することができる。それらの方法としては、ペプチド配列決定、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴、円偏光二色性および結晶学的電子顕微鏡観察が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性（％）（％ identity）を決定するために、それらの配列を最適な比較目的のためにアライメントを行う（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列と最適なアライメントを行うために、第１のアミノ酸配列または核酸配列の配列内にギャップを導入することができる）。そして、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列において対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められているとき、その分子は、その位置において同一である。２つの配列間の同一性（％）は、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性（％）＝同一で重なる位置の数／位置の総数×１００％）である。これら２つの配列は、同じ長さであり得る。
【００２４】
２つの配列間の同一性（％）の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することもできる。２つの配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４〜２２６８頁のアルゴリズム、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３〜５８７７頁において改変されたアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３頁のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同性のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータセット、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と一致するアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータセット、例えば、スコア−５０、ワード長＝３で実施することができる。比較目的でギャップを含んだアライメントを得るために、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁に記載されているようなＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを使用することができる。あるいは、分子間の遠縁関係を検出する反復検索を実施するために、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用することができる（同書）。ＢＬＡＳＴプログラム、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用するとき、（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴの）それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用することができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照のこと）。配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、１９８８年、ＣＡＢＩＯＳ ４：１１〜１７頁のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用するとき、ＰＡＭ１２０残基重みづけ表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティー＝１２およびギャップペナルティー＝４を使用することができる。
【００２５】
２つの配列間の同一性（％）は、ギャップの有無により、先に記載したものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性（％）を算出する際、代表的には、正確な一致のみを計算する。
【００２６】
本明細書中で使用する、Ｅ−セレクチンペプチドアナログに関した用語「アナログ」とは、Ｅ−セレクチンペプチドと類似かまたは同一の機能を有し、そしてＥ−セレクチンペプチドと構造的に類似の第２の有機分子または無機分子のことをいう。用語「アナログ」は、そのコア構造がＥ−セレクチンペプチドのコア構造と同一か、またはよく似ている分子を含むが、その分子は、化学修飾または物理的修飾されている。用語「アナログ」は、他の原子または分子に結合することができるＥ−セレクチンペプチドの共重合体を含む。「生物学的に活性なアナログ」および「アナログ」は、本明細書中で交換可能に使用され、Ｅ−セレクチンペプチドの本質的に同じアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用を示す有機分子または無機分子を網羅する。
【００２７】
本明細書中で使用する、Ｅ−セレクチンペプチドの「ヌクレオチドアナログ」とは、五炭糖および／または１個以上のリン酸エステルが、そのそれぞれのアナログで置換されているヌクレオチドのことをいう。例示的なリン酸エステルアナログとしては、アルキルホスホナート、メチルホスホナート、ホスホルアミダート、ホスホトリエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホロアニリダート、ホスホロアミダート、ボロノホスファートなどが挙げられるが、これらに限定されず、対イオンが存在する場合はそれらに関連した任意の対イオンを含む。ＤＮＡ／ＲＮＡリン酸エステル骨格および／または糖リン酸エステル骨格が、異なる型の結合で置換されているポリヌクレオチドアナログに重合され得る核酸塩基モノマーはまた、「ヌクレオチドアナログ」の定義内に含まれる。核酸塩基部分が、非従来型ヌクレオチド、すなわち、Ｇ、Ａ、Ｔ、ＵまたはＣの１つと異なるヌクレオチドが、さらに「ヌクレオチドアナログ」内に含まれる。一般に非従来型核酸塩基は、隣接する反対方向のポリヌクレオチド鎖上に存在する少なくとも１つの核酸塩基部分と水素結合を形成するか、または相互作用せず、干渉しない塩基を提供する能力を有する。
【００２８】
本明細書中で使用する、用語「有効量」とは、炎症または１以上の症状の進行、重症度および／または持続期間を低減または回復させるか、炎症または１以上の症状の発症を予防するか、炎症または１以上の症状の悪化を予防するか、または別の治療法の予防的もしくは治療的な効果を向上または改善するのに十分なＥ−セレクチンペプチドまたはＥ−セレクチン核酸の量のことをいう。
【００２９】
本明細書中で使用する、用語「有効量」とは、経鼻投与を介してＥ−セレクチンに対する寛容を誘導するのに十分なＥ−セレクチンペプチドの量のことをいう。
【００３０】
本明細書中で使用する、Ｅ−セレクチンタンパク質に関連した文脈における用語「フラグメント」とは、哺乳動物Ｅ−セレクチンのアミノ酸配列の、少なくとも２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも連続した８０個のアミノ酸残基、少なくとも連続した９０個のアミノ酸残基、少なくとも連続した１００個のアミノ酸残基、少なくとも連続した１２５個のアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも連続した１７５個のアミノ酸残基、少なくとも連続した２００個のアミノ酸残基または少なくとも連続した２５０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドのことをいう。本発明において有用なタンパク質またはポリペプチドのフラグメントは、哺乳動物のＥ−セレクチンの少なくとも１つの機能を保持する。タンパク質またはポリペプチドのフラグメントは、哺乳動物のＥ−セレクチンの２個、３個、４個またはそれ以上の機能を保持してもよい。
【００３１】
本明細書中で使用する、用語「組み合わせて」とは、治療的な処置のことをいう場合、２種以上の治療法（例えば、２つ以上の予防薬および／または治療薬）の使用のことをいう。用語「組み合わせて」の使用は、治療法（例えば、予防薬および／または治療薬）を、被験体に施す順序を限定しない。第１の治療法（例えば、第１の予防薬または治療薬）は、被験体に第２の治療法（例えば、第２の予防薬または治療薬）の実施の前（例えば、５分前、１５分前、３０分前、４５分前、１時間前、２時間前、４時間前、６時間前、１２時間前、２４時間前、４８時間前、７２時間前、９６時間前、１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、８週間前または１２週間前）、第２の治療法と同時、または第２の治療法の後（例えば、５分後、１５分後、３０分後、４５分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、８週間後または１２週間後）に実施することができる。
【００３２】
本明細書中で使用する、「単離された」または「精製された」とは、ペプチドまたは核酸に関して使用される場合、天然に存在する配列が、その通常の細胞内（例えば、染色体の）環境から取り出されているか、または非天然環境で合成されている（例えば、人工的に合成されている）ことを意味する。従って、「単離された」または「精製された」配列は、無細胞溶液中に存在してもよく、異なる細胞内環境におかれていてもよい。用語「精製された」は、その配列がヌクレオチドまたはペプチドのみで存在するということを示しているのではなく、その配列に天然に関連した、非ヌクレオチド物質または非ペプチド物質を本質的に含まず（約９０〜９５％の純度）、従って、単離された染色体と区別されることを示す。
【００３３】
本明細書中で使用する、タンパク質性物質（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または抗体）に関して、用語「単離された」および「精製された」とは、本質的に細胞物質を含まないタンパク質性物質のことをいい、いくつかの実施形態においては、由来する細胞源または組織源からの異種性タンパク質性物質（すなわち、混入タンパク質）を本質的に含まないか、または化学的に合成されるとき、化学前駆体または他の化学物質を本質的に含まないタンパク質性物質のことをいう。「本質的に細胞物質を含まない」との語法は、タンパク質性物質が、単離されるか、または組換えで産生される細胞の細胞成分から分離されているタンパク質性物質の調製物を含む。従って、本質的に細胞物質を含まないタンパク質性物質は、約３０％、約２０％、約１０％または約５％未満（乾燥重量）の異種性タンパク質性物質（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは抗体；「混入タンパク質」ともよばれる）を有するタンパク質性物質の調製物を含む。タンパク質性物質は、組換えで産生されるとき、好ましくは培地を本質的に含まないこと、すなわち、培地が、タンパク質調製物の容量の約２０％、約１０％または約５％未満であることを意味する。タンパク質性物質は、化学合成によって生成されるとき、好ましくは化学前駆体または他の化学物質を本質的に含まず、すなわち、タンパク質性物質の合成に関連する化学前駆体または他の化学物質から分離されている。従って、タンパク質性物質のこのような調製物は、約３０％、約２０％、約１０％、約５％（乾燥重量）未満の目的のタンパク質性物質以外の化学前駆体または化合物を有する。好ましくは、本明細書中で開示されるタンパク質性物質は、単離されている。
【００３４】
本明細書中で使用する、「核酸」は、用語「ポリヌクレオチド」と交換可能であり、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのことをいい、それらは、無修飾ＲＮＡもしくは無修飾ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくは修飾ＤＮＡあるいはそれらの任意の組み合わせであり得る。「核酸」としては、一本鎖核酸および二本鎖核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で使用する、用語「核酸」はまた、１個以上の修飾塩基を含む、上記のようなＤＮＡまたはＲＮＡを含む。従って、安定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、「核酸」である。本明細書中で使用する、用語「核酸」は、このような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態の核酸だけでなく、ウイルスならびに例えば単純細胞および複雑型細胞を含む細胞の特徴である化学形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。「核酸」または「核酸配列」はまた、一本鎖または二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡの領域またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。
【００３５】
本明細書中で使用する、「核酸」は、９ヌクレオチド長以上の、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＲＮＡを包含する。用語「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドの多量体型、プリン塩基およびピリミジン塩基を含むリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、あるいは他の天然のヌクレオチド塩基、化学的または生化学的に修飾された、天然でないか、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、ＲＮＡまたはＤＮＡに典型的に見られるような糖およびリン酸基または修飾された糖もしくは置換された糖または修飾されたリン酸基もしくは置換されたリン酸基を含むことができる。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。
【００３６】
本明細書中で使用する、「患者」または「個体」とは、Ｅ−セレクチンペプチドを投与される、哺乳動物、好ましくは、ヒトのことをいう。
【００３７】
本明細書中で使用する、句「薬学的に許容可能なキャリア」としては、本発明の方法を使用して同定される化合物に存在し得る、酸性基または塩基性基の塩を含む水性組成物または非水生組成物が挙げられるが、これらに限定されない。本来は塩基性である化合物は、様々な無機酸および有機酸と多岐にわたる塩を形成することができる。このような塩基性化合物の薬学的に許容可能な酸付加塩を調製するために使用することができる酸は、無毒性の酸付加塩、すなわち、薬理学的に許容可能な陰イオンを含む塩を形成する酸である。それらの塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンシチン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩））が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ部分を含む化合物は、上記の酸に加えて様々なアミノ酸と薬学的に許容可能な塩を形成しうる。本来酸性である化合物は、様々な薬理学的に許容可能な陽イオンと塩基性塩を形成することができる。このような塩の例としては、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩および特にカルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、亜鉛塩、カリウム塩および鉄塩が挙げられる。
【００３８】
本明細書中で使用する、「によってコードされるポリペプチド配列」とは、本明細書中で定義されるような遺伝子のタンパク質コード領域の翻訳後に得られるアミノ酸配列のことをいう。
【００３９】
本明細書中で使用する、用語「タンパク質」および「ペプチド」および「ポリペプチド」は、交換可能に使用され、ペプチド結合によって共に連結されたアミノ酸の鎖のことをいう。特定の実施形態において、タンパク質は、ペプチド結合により共に連結された、２００未満、１７５未満、１５０未満、１２５未満、１００未満、５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満または５未満のアミノ酸から構成される。タンパク質は、ペプチド結合により共に連結された、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００以上のアミノ酸から構成される。
【００４０】
「タンパク質コード領域」とは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの部分のことをいう。
【００４１】
本発明は、Ｅ−セレクチンの細胞外ドメインの一定の部分またはドメインが、有益な効果を有し得るという認識に一部基づく。組換えペプチド、好ましくはヒトＥ−セレクチンペプチドの２０〜３０３フラグメント、ならびにこれらのペプチドをコードするかまたは産生するＤＮＡおよび細胞は、本発明において有用である。
【実施例】
【００４２】
実施例
寛容を誘導するように設計された可溶性Ｅ−セレクチンペプチドを含む組成物の実施例
Ｅ−セレクチンペプチドは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中で提供される透明な可溶性液状タンパク質溶液である。この医薬品成分は、アミノ末端におけるｇｐ６４分泌シグナルに融合したレクチン結合上皮成長因子（ＥＤＦ）ドメインと、カルボキシ末端におけるｃ−ｍｙｃタグおよびポリヒスチジンペプチドタグとを有するヒトＥ−セレクチンタンパク質の細胞外部分をコードする組換えＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスベクター（バキュロウイルス科のＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｉｃａ多角体病ウイルス）が感染したＳｆ−９Ｓ昆虫細胞（鱗翅目のツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｚｐｅｒｄａ））由来である（図１）。
【００４３】
組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子は、１９アミノ酸のＡｃＩＶｆＮＰＶバキュロウイルスｇｐ６４エンベロープタンパク質分泌シグナルペプチド、２９１アミノ酸のヒトＥ−セレクチンタンパク質（ａａ４０〜ａａ１２０レクチン結合ドメインおよびａａ２００〜ａｎ２７５のＥＧＦドメインを含むａａ２０〜ａａ３１０の細胞外部分）、９アミノ酸のｃ−ｍｙｃタンパク質、６アミノ酸の中性スペーサーペプチド、および６アミノ酸のポリヒスチジンタグ（６×ＨＩＳ）で構成される３３１アミノ酸ポリペプチドである。１つの代替型では、ｃ−ｍｙｃタグが省略され、そして別の代替型では、ｃ−ｍｙｃタグおよびＨｉｓタグの両方が省略される（図２）。ＡｃＭＩＮＰＶバキュロウイルスｇｐ６４エンベロープタンパク質由来である分泌シグナルペプチドは、標的ペプチドの細胞内輸送、プロセシングおよび組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質の分泌を促進する。この医薬品成分であるヒトＥ−セレクチン細胞外ポリペプチド部分は、卒中の病態において活性な炎症性および他の免疫応答の抑制を刺激する寛容原エフェクター分子として作用する。ｃ−ｍｙｃの非トランスフォーミングドメインに局在するモノクローナル抗体エピトープであるｃ−ｍｙｃペプチドは、タンパク質精製の間、組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質分子の識別タグとして作用する。ニッケル、コバルトその他の重金属に高い結合定数（Ｋｄ＞１０−９Ｍ）で結合する６×ＨＩＳペプチドは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質を精製するために使用される。
【００４４】
Ｅ−セレクチンペプチドをコードするウイルス原液
ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されるＤＮＡフラグメントの組換えＤＮＡクローニングでは、バキュロウイルス発現ベクターシステム（ＢＥＶＳ）で発現させるために、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ０００６５５で入手可能なヌクレオチド配列に基づいて、カルボキシ末端のｃ−ｍｙｃペプチドタグおよびポリヒスチジン（６×ＨＩＳ）ペプチドタグと融合したヒトＥ−セレクチン（アミノ酸残基２０〜３１０）の細胞外部分をコードするコドンが最適化された遺伝子を使用した。ヒトＥ−セレクチン遺伝子を含む９９９ｂｐのＥｃｏＲＩ ＤＮＡフラグメントを、まず、サブクローニングベクターであるｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトにクローニングし、続いてバクミドトランスファーベクターであるｐＦＡＳＴＢＡＣＩ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）の多角体遺伝子座内の多角体プロモーターの下流にクローニングした。Ｓｆ−９Ｓ昆虫細胞に、ＡｃＭＮＰＶゲノム内にヒトＥ−セレクチン遺伝子を含む組換えバクミドＤＮＡをトランスフェクトした。組換えバキュロウイルスを、トランスフェクトした細胞から単離し、そして高レベルに組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質を発現しているウイルスのクローンをプラーク精製により選抜した。
【００４５】
もとのマスターウイルス原液（９．６Ｌ）は、組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質を高レベルに発現し、そして高力価のウイルスを産出した、組換えバキュロウイルス単離物（Ｒ６１２）を増幅して、プラーク精製し、０．１ｐｆｕ／ｍｌのＭＯＩでＳｆ−９Ｓ昆虫細胞（継代数６０；ＷＣＢ＃３８）に感染させることによって確立した。もとのウイルス原液は、遺伝子のインテグリティおよび組換えタンパク質産生で特徴づけた。微生物の無菌性アッセイ、マイコプラズマ検出アッセイ、スピロプラズマ検出アッセイ、ＬＡＬエンドトキシン発色アッセイ、ｉｎ ｖｉｔｒｏの外来性物質試験（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ ｔｅｓｔｉｎｇ）およびｉｎ ｖｉｖｏの外来性物質試験（ＡｎＭｅｄ／Ｔａｃｏｎｉｃ）を含む特徴づけを、もとのウイルス原液のサンプルに実施した。外来性物質試験は、昆虫細胞に感染し得るか、またはキャリアウイルスであり得るＲＮＡウイルスの存在を検出することができた。
【００４６】
ｃ−ｍｙｃタグおよびポリヒスチジンペプチドタグに融合した組換えヒトＥ−セレクチン遺伝子配列の同一性は、もとのウイルス原液中の、組換えバキュロウイルスから単離されたヒトＥ−セレクチン遺伝子をコードするバキュロウイルスゲノムＤＮＡに由来する挿入ヌクレオチド配列およびフランキングヌクレオチド配列の両方のＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列決定および解析によって行われた。ヌクレオチド配列解析により、もとのウイルス原液由来のゲノムＤＮＡと、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、そしてこの遺伝子のクローニングに使用されたバキュロウイルストランスファーベクターであるｐＦＡＳＴＢＡＣｌとにおけるヒトＥ−セレクチン遺伝子配列が１００％一致することが明らかになった。ゲノムＤＮＡサンプル由来のヌクレオチド配列から予測されるアミノ酸配列は、ヒトＥ−セレクチンの予測されるアミノ酸配列と１００％一致した。このもとのウイルス原液は、同一性試験に合格した。
【００４７】
高力価でのウイルス複製を補助するもとのウイルス原液の能力を、細胞当たり０．１プラーク形成単位（ｐｆｕ）の感染効率（ＭＯＩ）で３日間に亘って感染させたＳｆ−９Ｓ昆虫細胞由来の浄化された培養上清のバキュロウイルスプラークアッセイによって判定した。５×１０７ｐｆｕ／ｍｌのウイルス力価を、Ｓｆ９Ｓ昆虫細胞に接種されたもとのウイルス原液のサンプルを使用してＳｆ−９Ｓ昆虫細胞におけるバキュロウイルスアガロースプラークアッセイによって測定した。もとのウイルス原液を、３〜５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでもとのウイルス原液で感染させたＳｆ−９Ｓ昆虫細胞由来の第１日目から第３日目の細胞可溶化物および培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析によって、組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質産生についてさらに評価した。細胞可溶化物および細胞培養上清は、分子量が５０ｋＤａであり、ヒトＥ−セレクチンタンパク質に対するモノクローナル抗体（ＢＢＡ２；Ｒ＆Ｄ）に特異的に結合する組換えタンパク質を含んでいた。
【００４８】
ウイルス原液の産生用として認められたもとのウイルス原液を、組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質産生の製造のために使用されることになる実際に使用するウイルス原液の産生に使用した。実際に使用するウイルス原液（９．６Ｌ）を、もとのウイルス原液を接種材料として、０．１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでＳｆ−９Ｓ昆虫細胞（継代数５２；ＷＣＢ＃３７）に感染させることにより、確立した。もとのウイルス原液および実際に使用するウイルス原液を、遮光包装のＰＥＴＧ瓶に入れて、遮光保冷容器（２〜８℃）内で短期間（３ヶ月未満）および７０℃以下の超低温冷凍庫内で長期間保存した。
【００４９】
細胞バンク
組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質の発現が、Ｓｆ−９Ｓ昆虫細胞において最も良好に実現された。Ｓｆ−９Ｓ昆虫細胞のもとの細胞バンクを、Ｓｆ−９Ｓ細胞の単一のバイアルから確立し、細胞懸濁培養液である無血清培地に順応させ、ＡＴＣＣから入手したＳｆ−９親細胞由来のバキュロウイルスベクターから発現される組換えタンパク質の分泌について選抜した。Ｓｆ−９Ｓのもとの細胞バンクを、ツマジロクサヨトウ卵巣上皮細胞にもともと由来するＳｆ−９細胞株を用いて確立したが、懸濁培養液として無血清培地を用いる大規模バイオリアクターにおいて組換えタンパク質発現を最大にするようないくつかの重要な調整を行った。
【００５０】
Ｓｆ−９Ｓのもとの細胞バンクは、昆虫細胞冷凍培地（７．５％ジメチルスルホキシド、４６％Ｓｆ−９００ＩＩ ＳＦＭ、４７％条件培地）中の細胞継代数４８のツマジロクサヨトウ細胞の５８６×３．５ｍｌクライオバイアルからなる。実際に使用する細胞バンクを、もとの細胞バンクからクライオバイアル（総計３．５×１０７細胞）を解凍することおよび振盪フラスコ（５００ｍｌ）内の新鮮ＨｙＱ ＳＦＸ無血清昆虫細胞培地（１００ｍｌ；ロット番号ＡＬＦ１４０５０）に細胞を播種することによって確立した。細胞を、数日間馴化させ、そして懸濁培養液として、２８℃および１２５ｒｐｍで生育した。細胞密度が、０．６×１０７細胞／ｍｌに達したとき、その培養物を１：２０の分割比で、さらなる振盪フラスコに２Ｌフラスコあたり８００ｍｌの最終容量で分割した。新しい培養物を数回の継代をして同様に継代培養し、細胞が最適に生育し、雑菌混入のないことを確認した。継代数４９でのＳｆ−９Ｓ細胞培養物が５．３６×１０６細胞／ｍｌの細胞密度および９４％の生存率に達し、その細胞を、低速遠心分離（５００×ｇ）により単離し、そして以下で構成される昆虫細胞冷凍培地に再懸濁した：
４６．５部 ＨｙＱ ＳＦＸ無血清昆虫細胞培地（条件化）
４６．５部 ＨｙＱ ＳＦＸ無血清昆虫細胞培地（新鮮）
７．０部 ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ ロット番号６８Ｈ１０９２）
【００５１】
その細胞（１×１０７細胞／ｍｌ）を４９本のクライオバイアル（３．５ｍｌ／バイアル）および３０本のクライオバイアル（１．０ｍｌ／バイアル）に無菌的に分配し、そして保存するために−７０℃未満の超低温冷凍庫内で１℃／分でゆっくりと凍結した。
【００５２】
コドンが最適化された組換えヒトＥ−セレクチンのヌクレオチド配列
以下の配列は、組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質の産生のためのもとのウイルス原液中のバキュロウイルスゲノム由来のコドンが最適化された組換えヒトＥ−セレクチン遺伝子のヌクレオチド配列である。
【化１】
【００５３】
細胞増幅
組換えヒトＥ−セレクチンを含む細胞の細胞増幅は、２．０Ｌ コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）プラスチック振盪フラスコ（フラスコ１本あたり８００ｍｌのＨｙＱ ＳＦＸ無血清培地を含む２１本のフラスコ）中の１６．８リットルで構成されていた。培養フラスコを、バネ仕掛けのフラスコ留め具を備えたプラットホーム振盪インキュベーター（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））でインキュベーションした。細胞を２８±１℃、１２５±２５ｒｐｍでインキュベーションした。
【００５４】
ウイルス感染
Ｓｆ−９Ｓ細胞を最終細胞密度２．０×１０６細胞／ｍｉとなるように新鮮無血清培地で希釈し、２１本のフラスコ（２Ｌ）に８００ｍｌのアリコートとして分配した。昆虫細胞に、３ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでＨｕＥ−セレクチンペプチドを含むバキュロウイルスを感染させた。ウイルスを、ウイルス原液から回収し、クラス１００バイオセイフティーフード内でフラスコに分配した。感染した細胞培養物を、２８℃、１２５ｒｐｍに維持した。感染した細胞培養物を、ウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）、細胞密度および細胞生存率について定期的に監視した。ウイルス感染は、３日間行った。
【００５５】
感染の３日後、ウイルスのＣＰＥは、＋３（すなわち、封入体形成および膜ラフリング）に達し、細胞密度は、１．１×１０６細胞／ｍｌであり、細胞生存率は、５０％に低下した。感染した細胞培養物を、以下に記載するように回収した。
【００５６】
回収
感染した細胞懸濁液を、バイオセイフティーキャビネット内でフラスコから５００ｍｌ遠心瓶に移した。感染した細胞懸濁液を、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ−５Ｂ遠心機において２３００ｒｐｍおよび４℃で１０分に亘って低速遠心分離に供することにより、感染した細胞を除去した。細胞外組換えヒトＥ−セレクチンを含む感染した細胞培養上清を、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ−５Ｂ遠心機における７５００ｒｐｍおよび４℃で４５分に亘って遠心分離により浄化した。浄化された上清をクラス１００バイオセイフティーフード内で２０リットルガラス製カーボイにデカントし、２〜８℃において保冷容器内で一晩保存し、続いて濃縮および膜分離を行った。
【００５７】
限外濾過による濃縮および膜分離
さらなる精製に向けて管理しやすい容量を得るために、細胞外組換えヒトＥ−セレクチンペプチドを含む浄化された細胞培養上清（１６．０Ｌ）を、Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｆｌｅｘ Ｓｔａｎｄ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｐｉｌｏｔ限外濾過システムを使用して濃縮した。このシステムを用いて、浄化された細胞培養上清を、２０Ｌガラス製カーボイから１０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するＡ／Ｇ Ｔｅｃｈ ＵＦＰ−１０−Ｃ−９Ａ中空糸限外濾過カートリッジに、Ｍａｓｔｅｒｆｉｅｘ蠕動ポンプを備えた無菌化シリコーン管を通して２３０ｍｌ／ｍｍの流速で移した。組換えヒトＥ−セレクチンペプチドを含む保持液を、濾過液から別個に回収し、そして渦巻き型限外濾過カートリッジにもかかわらず連続した通過により０．８Ｌに濃縮（２０倍）した。濃縮後、濃縮された細胞培養上清を１０ＬのＱ緩衝液１で９０分膜分離した。濃縮された膜分離物（０．８Ｌ）およびカートリッジの２つのすすぎ液（各０．７Ｌ）を無菌ナルゲン瓶（総計３．２Ｌ）に回収し、そして一晩、保冷容器内（２〜８℃）で保存し、続いてＱ陰イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質精製を行った。
【００５８】
Ｑセファロース陰イオン交換クロマトグラフィー
組換えヒトＥ−セレクチンペプチド医薬品成分の後処理プロセスにおける最初のタンパク質捕捉工程は、強力な陰イオン交換樹脂であるＱセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗを使用した陰イオン交換クロマトグラフィー工程である。この工程は、エンドトキシン、プロセス賦形剤（ｐｒｏｃｅｓｓ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）および宿主タンパク質混入物を組換えヒトＥ−セレクチンペプチドから除去することを意図した。Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィー工程は、Ｕｎｉｃｏｒｎ（登録商標）ソフトウェアによって制御される、検証されたＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｂｉｏｐｉｌｏｔ ＦＰＬＣシステムを使用して実施した。ＱセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂（４００ｍｌ）を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＸ５０／３０クロマトグラフィーカラムに充填した。Ｑカラムを１０ｍｌ／分の流速で、Ｑ再生緩衝液［０．５Ｎの水酸化ナトリウムおよび１．０Ｍの塩化ナトリウム］を用いて衛生的にし、そして再生し、１０ｍｌ／分の流速でｐＨ７．１まで５カラム容量（２０００ｍｌ）のＷＦＩ水ですすぎ、そして１０ｍｌ／ｍｍの流速で５カラム容量（２０００ｍｌ）のＱ緩衝液１で平衡化した。
【００５９】
濃縮された膜分離物（３．２Ｌ）を２０ｍｌ／分の流速で装填した。（１３．６ｍｇのタンパク質／ｍｌＱ樹脂）。装填されたＱカラムを２０ｍｌ／分の流速で１０カラム容量（４０００ｍｌ）のＱ緩衝液１で洗浄した。Ｑカラム通過（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）画分（ＦＴ；３２００ｍｌ）および洗浄画分（１６００ｍｌ）を回収し、そして残った非結合性組換えヒトＥ−セレクチンペプチドについての処理中試験（ｉｎ−ｐｒｏｃｅｓｓ ｔｅｓｔｉｎｇ）のために４℃で保存した。Ｑカラムに結合したタンパク質を２０ｍｌ／分の流速で塩化ナトリウムの０〜１０００ｍＭの直線勾配を形成するＱ緩衝液２を用いて溶出した。ＵＶ２８０吸収性Ｑ溶出物の画分（２００×１０ｍｌ）を回収し、一時的に保冷容器内で４℃にて保存した。使用したＱカラムをＱ再生緩衝液で衛生的にした。
【００６０】
サンプル（０．１ｍｌ）のＱ溶出画分ならびに装填画分、通過画分および洗浄画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヒトＥ−セレクチン血清を使用したウエスタンブロット解析を含む処理中試験に供した。組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質を主成分として含むＱ溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析によって単一のピーク（画分８０〜１１２）として同定し、そして貯蔵した（３２０ｍｌ）。かなりの量の組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質が、Ｑカラムに結合していた；従って、ＦＴ画分の再処理は必要でなかった。
【００６１】
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースアフィニティークロマトグラフィー
組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質のカルボキシル末端にポリヒスチジン（６×ＨＩＳ）タグペプチドが存在するので、Ｎｉ＋＋ベースの樹脂を使用した固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって、貯蔵されたＱ溶出画分中に残留する他のタンパク質からこれらの重金属結合タンパク質を精製することが可能であった。生成の後処理プロセスにおけるＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーの工程を、組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質を精製し、そして残存する宿主タンパク質混入物およびバキュロウイルスを除去するために使用した。Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー工程を、Ｕｎｉｃｏｒｎ（登録商標）ソフトウェアによって制御される、検証されたＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｂｉｏｐｉｌｏｔ ＦＰＬＣシステムを使用して実施した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースＳｕｐｅｒｆｉｏｗ樹脂（３８ｍｌ）をＰｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ ２６クロマトグラフィーカラムに充填した。Ｎｉ−ＮＴＡを硫酸ニッケル六水和物（０．１Ｍ）で荷電し、３ｍｌ／分の流速で０．５ＮのＮａＯＨで衛生的にし、３ｍｌ／分の流速で５カラム容量のＷＦＩ水ですすぎ、そして３ｍｌ／分の流速で５カラム容量（１９０ｍｌ）のＮｉ−ＮＴＡ緩衝液１でｐＨ８．５に平衡化した。Ｑ貯蔵溶出画分を、３ｍｌ／分の流速で装填した。（１９．８タンパク質／ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂）。装填されたＮｉ−ＮＴＡカラムを３カラム容量（１１５ｍｌ）のＮｉ−ＮＴＡ緩衝液Ｉで、３ｍｌ／分の流速で洗浄した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムＦＴ画分（３２０ｍｌ）および洗浄画分（１１５ｍｌ）を回収し、残った非結合性の組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質についての処理中試験のために４℃で保存した。Ｎｉ−ＮＴＡカラムに結合したタンパク質を３ｍｉ／ｍｍの流速で、イミダゾールナトリウムの０〜３００ｍＭの線形勾配を形成するＮｉ−ＮＴＡ緩衝液２を用いて溶出した。ＤＹ２８０吸収性Ｎｉ−ＮＴＡ溶出物の画分（４３×３ｍｌ）を回収し、そして一時的に保冷容器内で４℃にて保存した。使用したＮｉ−ＮＴＡカラムをＥＤＴＡ再生緩衝液で衛生的にした。
【００６２】
Ｎｉ−ＮＴＡ溶出画分のサンプル（０．１ｍｌ）ならびに装填画分、通過画分および洗浄画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヒトＥ−セレクチン血清を使用したウエスタンブロット解析を含む処理中試験に供した。組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質を主成分として含むＮｉ−ＮＴＡ溶出画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析によって単一ピーク（画分１２〜２６）として同定し、そして貯蔵した（４３ｍｌ）。かなりの量の組換えヒトＥ−セレクチンタンパク質が、ＮｉＮＴＡカラムに結合した；従って、ＦＴ画分の再処理は必要ではなかった。
【００６３】
貯蔵されたＮｉ−ＮＴＡ溶出カラム画分のサンプル（２ｍｌ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヒトＥ−セレクチン血清を使用したウエスタンブロット解析、ＢＣＡタンパク質アッセイならびにＬＡＬエンドトキシンアッセイを含む処理中試験に供した。さらに、精製プロセスのこの段階において存在するバキュロウイルスの量を数え上げるために、バキュロウイルスアガロースプラークアッセイをＮｉ−ＮＴＡ貯蔵溶出画分のアリコートにおいて実施した。ウイルス力価は、Ｑクロマトグラフィー工程およびＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー工程によって得られたウイルスにおいて３ｌｏｇ１０換算で合計２．７６×１０９ｐｆｕに対して６．４２×１０７ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００６４】
膜分離法
Ｎｉ−ＮＴＡ貯蔵溶出画分からプロセス賦形剤であるイミダゾールを除去するためおよび適切な緩衝液であるＰＢＳ溶液中に医薬品成分を処方するために、Ｎｉ−ＮＴＡ貯蔵溶出画分を低温室（２〜８℃）において膜分離に供した。貯蔵されたＮｉ−ＮＴＡ溶出画分を、２×９０容量（４Ｌ）のＰＢＳ溶液に対してそれぞれ１５時間および７時間、２２℃で透析した。最終的な透析液の容量は、４１ｍｌであった。透析液のサンプル（１ｍｌ）を、ＳＤＳＰＡＧＥ解析、ウエスタンブロット解析、ＢＣＡタンパク質アッセイおよびＬＡＬカイネティック比色アッセイを含む処理中試験のために取り出した。
【００６５】
最終的な濾過
混入微生物を除去するために、透析液（４１ｍｌ）をバイオセイフティーフード（クラス１００）内で無菌的に、０．２２〜ｉ ミリポア社製（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｓｔｅｒｉｃａｐ濾過膜に通して無菌Ｎａｌｇｅｎｅ瓶に入れた。使用した膜を、膜の完全性を判定するために泡立ち点アッセイに供した。その結果（５０ｐｓｉ）は、３２ｐｓｉという完全な膜の規格を上回るものであり、また、医薬品成分において微生物が排除されていることが確かめられた。濾液の最終容量は、３６．５ｍｌであった。０．２μ濾液を、−７０℃未満の超低温冷凍庫に保存した。０．２μ濾液を解凍し、前もって高くしておいたタンパク質濃度においてタンパク質凝集を防ぐために、最終容量が９５ｍｌとなるようＰＢＳ溶液で希釈し、そしてバイオセイフティーフード（クラス１００）内で無菌的に第２の０．２μ膜に通して濾過した。使用した第２の０．２μ膜の泡立ち点試験の結果は、その膜には傷がないことを示唆した。
【００６６】
第１の０．２μ濾液のサンプルをＢＣＡタンパク質試験およびＬＡＬ処理中試験に供した。第１の０．２μ濾液についてのＢＣＡタンパク質アッセイの結果は、総収量１９２．７２ｍｇに対して５．２８ｍｇ／ｍｌであった。第１の０．２μ濾液についてのＬＡＬエンドトキシンアッセイの結果は、総量６７ＥＵに対して１．８４ＥＵ／ｍｌであった。
【００６７】
総容量９５ｍｌを第２の最終的な濾過によって実現した。医薬品成分中の残留バキュロウイルスを除去するために、Ｐａｌｌ ＤＶ２Ｏ ｓｕｂ ０．１μ膜濾過カートリッジを薬物生成物の処方工程および濾過工程において使用した。最終的な大量生成物（医薬品成分）についての総エンドトキシン量は、４５．６ＥＵであった；確証されたＢＣＳタンパク質アッセイによって測定されたように、最終的な大量生成物についての総タンパク質収量は、１３３ｍｇであった。
【００６８】
遅延型過敏アッセイ
遅延型過敏試験を、様々な用量の組換えヒトＥ−セレクチンで鼻腔内処置した後の高血圧性ラットにおいて実施した。医薬品成分サンプル（１．０ｍｌ）の遅延型過敏アッセイは、高血圧性動物において卒中を寛容化および予防するヒトＥ−セレクチンの能力と相関する、ｉｎ ｖｉｖｏにおける生成物の効力を測定するために実施した。本研究におけるＤＴＨ抑制は、粘膜寛容の誘導に使用した様々な用量の組換えヒトＥ−セレクチンおよびプラセボの機能として、炎症によって引き起こされる動物の耳の厚さの測定と関連した。
【００６９】
自然発症的に高血圧性脳卒中を起こしやすい（ＳＲＲ−ＳＰ）ラット（ｎ＝２０）を４群に分け、５回の処置を１日おきで鼻腔内に（２０μｌ／鼻孔）接種した：
群１：ＰＢＳプラセボ、４０μｌ処置で寛容化、ｎ＝５、
群２：組換えヒトＥ−セレクチン５Ｖμｇ／４０μｌ処置、ｎ＝５
群３：組換えヒトＥ−セレクチンμｌ／４０μｌ処置、ｎ＝５
群４：組換えヒトＥ−セレクチン０．１μｇ／４０μｌ処置、ｎ＝５
【００７０】
寛容化スケジュールが終了した２週間後に、それらの動物を、３７５μｇ／ｍｌの最終抗原濃度でフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）とともに処方された組換えヒトＥ−セレクチンのアリコート（２００μｌ）で皮下に免疫（抗原感作）した。免疫の２週間後、処置動物の耳の厚さを標準的な皮下脂肪用ノギスを使用して測定した。その後、ＰＢＳ中５０μｇ／１００μｌの抗原濃度で組換えヒトＥ−セレクチンの耳垂注射（１００ｐ．１）を行った（抗原の再適用または抗原チャレンジ）。
【００７１】
チャレンジの４８時間後および７２時間後に耳の厚さの測定を繰り返し行い、遅延型過敏を評価した。
【００７２】
Ｅ−セレクチンに対するリンパ球の寛容化、特に、粘膜寛容は、以下を含む炎症性疾患の治療の有効な方法である：
【００７３】
高レベルの炎症促進性サイトカインもまた、自己免疫疾患を含む、数多くの疾患および状態に関連する。炎症関連疾患としては、毒素性ショック症候群、関節リウマチ、変形性関節症、糖尿病および炎症性腸疾患、ＨＩＶ感染関連認知症、緑内障、視神経症、視神経炎、網膜虚血、レーザー誘導性視覚障害、手術誘導性または外傷誘導性の増殖性硝子体網膜症、脳虚血、低酸素虚血、低血糖症、ドウモイ酸中毒、無酸素症、一酸化炭素中毒またはマンガン中毒またはシアン化物中毒、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、髄膜炎、多発性硬化症および他の脱髄性疾患、筋萎縮性側索硬化症、頭部外傷および脊髄外傷、癲癇、痙攣、オリーブ橋小脳萎縮症、神経障害性疼痛症候群、糖尿病性ニューロパシー、ＨＩＶ関連ニューロパシー、ＭＥＲＲＦ症候群およびＭＥＬＡＳ症候群、レーバー病、ウェミッケ脳症（Ｗｅｍｉｃｋｅ’ｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐｈａｔｈｙ）、レット症候群、ホモシステイン尿症（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｕｒｉａ）、高プロリン血症、高ホモシステイン血症、非ケトン性高グリシン血症、ヒドロキシ酪酸アミノ酸尿症（ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ ａｍｉｎｏａｃｉｄｕｒｉａ）、亜硫酸酸化酵素欠損症、脊髄索状変性（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、鉛脳障害、トゥーレット症候群、肝性脳症、薬物嗜癖、薬剤耐性、薬物依存、うつ、不安および精神分裂病、外傷性関節炎、ギランバレー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、移植片対宿主病、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、再灌流損傷、敗血症、骨粗鬆症を含む骨吸収疾患、慢性閉塞性肺疾患、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、毒素性ショック症候群、喘息、接触皮膚炎、経皮的経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）およびインスリン依存性真性糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載されたものの変形、改変および他の実施を思いつくだろう。以下に提供される参考文献は、それらの全体が本明細書中に参照により援用される。本明細書中で引用されたすべての特許、特許出願および公開された参考文献は、それらの全体が、本明細書中で参照により援用される。
【００７５】
本発明を、それらの好ましい実施形態を参照して、特に示し、そして記載したが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その形態および詳細の様々な変更がなされうることを当業者は理解するだろう。当該分野で公知の他の実施形態および構造が、本発明の精神および範囲内であることを当業者は理解するだろう。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
図面の簡単な説明
【図１】図１（配列番号８）は、組換えヒトＥ−セレクチンペプチドの予測されるアミノ酸配列およびタンパク質構造機能を示したものである。
【図２】図２は、野生型ヒトＥ−セレクチンに対する組換えＥ−セレクチンペプチドのアライメントを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、１個以上のＣ末端タグに結合している野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、カルボキシ末端でジペプチドＲＳに結合している野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、Ｎ末端で分泌シグナルペプチドに結合している野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、および配列番号１と少なくとも６０％の同一性を有する２００〜４００アミノ酸のペプチド、ならびにこれらの混合物および組み合わせからなる群から選択される単離された哺乳動物ペプチド。
【請求項２】
前記１個以上のＣ末端タグが、精製タグおよび安定タグからなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記精製タグが、ｃｍｙｃタグおよびヒスチジンタグからなる群から選択される、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記Ｎ末端の分泌シグナルペプチドが、（配列番号３）および（配列番号４）からなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、昆虫細胞において産生される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、１個以上のＣ末端タグに結合している野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、カルボキシ末端でジペプチドＲＳに結合している野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、Ｎ末端で分泌シグナルペプチドに結合している野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、および配列番号１と少なくとも６０％の同一性を有する２００〜４００アミノ酸のペプチド、ならびにこれらの混合物および組み合わせからなる群から選択されるペプチドをコードする核酸。
【請求項７】
前記１個以上のＣ末端タグが、精製タグおよび安定タグからなる群から選択される、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
前記精製タグが、ｃｍｙｃタグおよびヒスチジンタグからなる群から選択される、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
前記Ｎ末端の分泌シグナルペプチドが、（配列番号３）および（配列番号４）からなる群から選択される、請求項６に記載の核酸。
【請求項１０】
前記ペプチドが、精製タグおよび安定タグからなる群から選択される１個以上のＣ末端タグからなり、前記Ｎ末端タグが、（配列番号３）および（配列番号４）からなる群から選択される、請求項６に記載の核酸。
【請求項１１】
前記精製タグが、ｃｍｙｃタグおよびヒスチジンタグからなる群から選択される、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルス。
【請求項１３】
請求項１に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸に連結されたバキュロウイルスシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む組換えバキュロウイルストランスファーベクターであって、前記核酸が、前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントと翻訳においてインフレームである、組換えバキュロウイルストランスファーベクター。
【請求項１５】
昆虫宿主細胞において、請求項１に記載のペプチドをコードする前記核酸を発現するための作動可能な連結を形成するようにバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１４に記載の組換えバキュロウイルストランスファーベクター。
【請求項１６】
請求項１に記載のペプチドを前記昆虫宿主細胞のための培地に分泌させるための配列を含む、請求項１５に記載の組換えバキュロウイルストランスファーベクター。
【請求項１７】
請求項１に記載のペプチドを含む、単離された細胞。
【請求項１８】
請求項１０に記載の核酸を含む、単離された細胞。
【請求項１９】
前記細胞が、哺乳動物細胞、細菌細胞および昆虫細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の単離された細胞。
【請求項２０】
前記細胞が、昆虫細胞である、請求項１９に記載の単離された細胞。
【請求項２１】
請求項１に記載のペプチドの産生方法であって、以下の工程：
ａ）請求項１０に記載の核酸に連結されたバキュロウイルスシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む組換えトランスファーベクターを構築する工程であって、前記核酸は、前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントと翻訳においてインフレームであり、昆虫細胞において、請求項１に記載のペプチドを発現し、該ペプチドを分泌させるためのバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結される工程と；
ｂ）組換えバキュロウイルスを産生するために、第１の昆虫細胞に組換えトランスファーベクターおよびバキュロウイルスＤＮＡをコトランスフェクションする工程；
ｃ）組換えバキュロウイルスを回収する工程；
ｄ）第２の昆虫細胞に、回収された前記組換えバキュロウイルスを感染させ、請求項１に記載のペプチドを発現、分泌するように、感染させた該昆虫細胞を培地中で培養する工程、および
ｅ）培地を回収し、分泌された請求項１に記載のペプチドを精製する工程
を含む、方法。
【請求項２２】
可溶性Ｅ−セレクチンペプチドに対する粘膜寛容を誘導することによって、炎症を介した疾患または状態を治療する必要がある個体を治療する方法であって、請求項１に記載のペプチドからなるＥ−セレクチンの低用量を複数回、経鼻投与によって前記個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２３】
前記Ｅ−セレクチンが、本質的に、請求項１に記載のペプチドからなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のペプチドおよびキャリアを含む、組成物。
【請求項２５】
請求項１０に記載の核酸およびキャリアを含む、組成物。
【請求項１】
野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、１個以上のＣ末端タグに結合している野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、カルボキシ末端でジペプチドＲＳに結合している野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、Ｎ末端で分泌シグナルペプチドに結合している野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、および配列番号１と少なくとも６０％の同一性を有する２００〜４００アミノ酸のペプチド、ならびにこれらの混合物および組み合わせからなる群から選択される単離された哺乳動物ペプチド。
【請求項２】
前記１個以上のＣ末端タグが、精製タグおよび安定タグからなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記精製タグが、ｃｍｙｃタグおよびヒスチジンタグからなる群から選択される、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記Ｎ末端の分泌シグナルペプチドが、（配列番号３）および（配列番号４）からなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが、昆虫細胞において産生される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、１個以上のＣ末端タグに結合している野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、カルボキシ末端でジペプチドＲＳに結合している野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、Ｎ末端で分泌シグナルペプチドに結合している野生型ヒトＥセレクチン（配列番号１）の残基＃２０〜３０３から本質的になるペプチド、および配列番号１と少なくとも６０％の同一性を有する２００〜４００アミノ酸のペプチド、ならびにこれらの混合物および組み合わせからなる群から選択されるペプチドをコードする核酸。
【請求項７】
前記１個以上のＣ末端タグが、精製タグおよび安定タグからなる群から選択される、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
前記精製タグが、ｃｍｙｃタグおよびヒスチジンタグからなる群から選択される、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
前記Ｎ末端の分泌シグナルペプチドが、（配列番号３）および（配列番号４）からなる群から選択される、請求項６に記載の核酸。
【請求項１０】
前記ペプチドが、精製タグおよび安定タグからなる群から選択される１個以上のＣ末端タグからなり、前記Ｎ末端タグが、（配列番号３）および（配列番号４）からなる群から選択される、請求項６に記載の核酸。
【請求項１１】
前記精製タグが、ｃｍｙｃタグおよびヒスチジンタグからなる群から選択される、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むバキュロウイルス。
【請求項１３】
請求項１に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸に連結されたバキュロウイルスシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む組換えバキュロウイルストランスファーベクターであって、前記核酸が、前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントと翻訳においてインフレームである、組換えバキュロウイルストランスファーベクター。
【請求項１５】
昆虫宿主細胞において、請求項１に記載のペプチドをコードする前記核酸を発現するための作動可能な連結を形成するようにバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１４に記載の組換えバキュロウイルストランスファーベクター。
【請求項１６】
請求項１に記載のペプチドを前記昆虫宿主細胞のための培地に分泌させるための配列を含む、請求項１５に記載の組換えバキュロウイルストランスファーベクター。
【請求項１７】
請求項１に記載のペプチドを含む、単離された細胞。
【請求項１８】
請求項１０に記載の核酸を含む、単離された細胞。
【請求項１９】
前記細胞が、哺乳動物細胞、細菌細胞および昆虫細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の単離された細胞。
【請求項２０】
前記細胞が、昆虫細胞である、請求項１９に記載の単離された細胞。
【請求項２１】
請求項１に記載のペプチドの産生方法であって、以下の工程：
ａ）請求項１０に記載の核酸に連結されたバキュロウイルスシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントを含む組換えトランスファーベクターを構築する工程であって、前記核酸は、前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントと翻訳においてインフレームであり、昆虫細胞において、請求項１に記載のペプチドを発現し、該ペプチドを分泌させるためのバキュロウイルスプロモーターに作動可能に連結される工程と；
ｂ）組換えバキュロウイルスを産生するために、第１の昆虫細胞に組換えトランスファーベクターおよびバキュロウイルスＤＮＡをコトランスフェクションする工程；
ｃ）組換えバキュロウイルスを回収する工程；
ｄ）第２の昆虫細胞に、回収された前記組換えバキュロウイルスを感染させ、請求項１に記載のペプチドを発現、分泌するように、感染させた該昆虫細胞を培地中で培養する工程、および
ｅ）培地を回収し、分泌された請求項１に記載のペプチドを精製する工程
を含む、方法。
【請求項２２】
可溶性Ｅ−セレクチンペプチドに対する粘膜寛容を誘導することによって、炎症を介した疾患または状態を治療する必要がある個体を治療する方法であって、請求項１に記載のペプチドからなるＥ−セレクチンの低用量を複数回、経鼻投与によって前記個体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２３】
前記Ｅ−セレクチンが、本質的に、請求項１に記載のペプチドからなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１に記載のペプチドおよびキャリアを含む、組成物。
【請求項２５】
請求項１０に記載の核酸およびキャリアを含む、組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５３２５１８（Ｐ２００８−５３２５１８Ａ）
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５００８９７（Ｐ２００８−５００８９７）
【出願日】平成１８年３月８日（２００６．３．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００８３４０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９９００６
【国際公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５０７３０１２４６）ノババックス，インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月８日（２００６．３．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００８３４０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９９００６
【国際公開日】平成１８年９月２１日（２００６．９．２１）
【出願人】（５０７３０１２４６）ノババックス，インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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